CN115487340B - 一种负载活性氧的细菌纤维素敷料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种负载活性氧的细菌纤维素敷料及其制备方法，分别使用酸性溶液和碱性溶液处理细菌纤维素膜，漂洗；然后浸入包含过氧化氢、过氧化氢保护剂和抗菌剂的活性溶液中，取出、分切包装。本发明制备获得的细菌纤维素敷料为湿性敷料产品，不仅可以轻松的贴敷于创面，而且贴敷料于创面可长达7天。即使在高温、辐照灭菌下，过氧化氢分解速率大大下降，使得敷料可持续输送ROS，降低创面感染，促进创面愈合。
Description
技术领域
本发明涉及医用敷料领域，具体地说涉及细菌纤维素敷料，特别涉及一种负载活性氧的细菌纤维素敷料及其制备方法。
背景技术
过氧化氢作为一种活性氧(Reactive oxygen species,ROS)起着十分重要的作用，其作为不依赖转录的可扩散损伤信号，可以调节依赖转录的细胞反应。活性氧家族的成员包括超氧阴离子·O2–，过氧化物O2 2-，过氧化氢H2O2。
复杂的伤口愈合过程需要大量的能量。如果伤口感染，则存在甚至更大的能量需求，这又意味着对氧的需求更大。氧涉及自然愈合过程的许多机制。其在代谢支持、基质修复、抗菌/感染控制以及信号传导和细胞反应的控制中具有关键作用。与没有足够氧合的那些伤口相比，接受足够氧的伤口通常愈合速度更快。缺血/缺氧可以直接抑制伤口愈合过程，诸如血管生成、胶原合成和上皮形成，并且还阻碍白细胞杀死细菌的能力。随着细菌繁殖，更多的白细胞迁移到伤口部位，进一步增加氧消耗。
新血管的形成是创面愈合所必需的条件。当产生伤口时，身体的自然防御被激活。中性粒细胞在创伤后不久聚集在创伤部位，释放杀菌活性氧(ROS)和过氧化氢(H2O2)以杀死细菌并预防感染。而新生血管的形成必须由适当的信号触发。在高氧环境中，巨噬细胞和白细胞可触发该信号。巨噬细胞响应于环境刺激到达伤口，吞噬外来颗粒，并释放血管内皮生长因子(VEGF)，VEGF是一种血管生成因子，对伤口愈合至关重要。从而引发坏死组织降解，新的胶原形成和组织内皮细胞迀移/定殖。
现阶段负载ROS的敷料产品较少，已上市应用的产品主要有以蜂蜜为主要原料的膏剂，在文献中报道的主要以凝胶剂型为主。膏剂和凝胶剂型存在难以均匀涂抹、容易变干，在创面中组织酶的作用下，凝胶降解吸收较快，无法持续输送ROS的缺陷。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种负载活性氧以提高抗菌效果且不易导致活性氧分解的细菌纤维素敷料的制备方法，本发明还有一个目的是提供前述方法制备获得的细菌纤维素敷料产品。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明的一种负载活性氧的细菌纤维素敷料制备方法，包括如下步骤：分别使用酸性溶液和碱性溶液处理细菌纤维素膜，漂洗；然后浸入活性溶液中，取出、分切包装；
其中，所述活性溶液包括过氧化氢、至少一种抗菌剂、以及至少一种过氧化氢稳定剂；所述过氧化氢稳定剂选自乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸、乙二胺五乙酸、磷酸钠、三聚磷酸钠、酒石酸、苹果酸、葡糖酸的任意一种或多种的组合。
作为本发明的优选方案，所述过氧化氢稳定剂可选择地选自乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸、乙二胺五乙酸的任意一种，最优选用乙二胺四乙酸二钠。乙二胺四乙酸二钠为白色粉末，易溶于水。因能与微生物生长所需的微量元素如镁等络合，具有协同防腐杀菌的作用。在与其他防腐杀菌剂联合使用时能起到协同增效的作用，特别是与山梨酸钾、尼泊金酯、PHMB等联合使用时能够提高杀菌作用，同时能降低防腐杀菌剂的用量。该类稳定剂主要针对细菌纤维素膜中存在的金属离子导致过氧化氢分解。
除此之外，本发明还可选择地提供一类羟基羧酸类过氧化氢稳定剂，含有羟基、羧基配位基团，在水中可以与金属离子形成不溶的螯合物，例如酒石酸、苹果酸、葡糖酸，其中优选酒石酸。羟基羧酸类稳定剂为有机酸类物质，利用羟基羧酸类稳定剂更有利于提供弱酸性的敷料产品，在临床上更有利于抑制细菌生长、控制感染，同时具备促进慢性创面愈合的效果。
除此之外，本发明还可选择地提供一类磷酸盐型过氧化氢稳定剂，值得注意的是，这一类稳定剂含有磷酸配位基团，在水中可与金属离子产生凝胶状沉淀，在特定场合上使用具有出色的效果。
进一步地，所述活性溶液中过氧化氢的浓度为0.01-1wt％，优选的浓度为0.05-0.5wt％；所述过氧化氢稳定剂的浓度为0.001-0.5wt％，优选的浓度为0.01-0.1wt％。
进一步地，所述抗菌剂选自单胍类消毒剂、双胍类消毒剂、尼泊金酯类消毒剂、葡萄糖酸氯己定的任意一种或多种的组合。所述抗菌剂浓度为0.0001-0.1％。
其中，所述尼泊金酯类消毒剂选自包括但不限于尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯的任意一种或多种的组合，优选浓度范围为0.01-0.4％；所述葡萄糖酸氯己定，优选浓度范围为0.01-1％。单胍或双胍类消毒剂的优选浓度范围为0.0001-0.1％。
进一步地，所述细菌纤维素膜为利用木醋杆菌经静态培养发酵制备获得的发酵膜。常规工艺是在25-35℃的条件下，静态发酵3-7天制备获得。刚发酵完成的细菌纤维素膜吸收了大量剩余的发酵液、微生物代谢产物和微生物菌体，因此要经过一定处理才能用于伤口敷料。本领域技术人员可进一步对其进行改性，包括但不限于烷基化、羧甲基化、硝基化、氨基化、氨基甲酸酯等接枝或交联反应。
进一步地，在浸渍活性溶液之前，需要对细菌纤维素膜进行预处理，包括去除杂质、酸洗、碱洗、脱色等工艺，否则制备获得的纤维素膜颜色发黄，散发异味，且带有大量致热源，不利于作为伤口敷料的载体。
具体地说，所述细菌纤维素膜的处理依次包括：
浸入使用pH为10-12的氢氧化钠溶液，处理6-18小时；
浸入使用pH为7.5-10的次氯酸钠溶液，处理3-12小时；
浸入使用pH为2-4的草酸溶液处理，处理2-12小时。
其中，所述细菌纤维素膜的各个酸处理或碱处理工序中均使用15-30倍的酸液或碱液浸泡。
利用前述方法获得的细菌纤维素敷料，将敷料取出，挤压掉多余的水分，分切、分装、辐照灭菌，即获得成品。成品的外观呈白色半透明状，无杂质或黑点。膜片持液量不低于95％，细菌内毒素含量不超过1EU/cm2。
尽管细菌纤维素具有一定的吸附作用，可以吸附液体中游离的金属离子，有利于过氧化氢的稳定保存。但是低纯度过氧化氢水溶液在贮存过程中依然会发生缓慢的分解，因此需在配方体系中额外地加入过氧化氢稳定剂，以减缓过氧化氢的分解。
本发明制备获得的细菌纤维素敷料为湿性敷料产品，不仅可以轻松的贴敷于创面，而且贴敷料于创面可长达7天。在50℃加热25天，过氧化氢浓度降低率不超过15％。经20-40kGy辐照灭菌后过氧化氢浓度降低率不超过25％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。在未经特别说明的情况下，百分比均为质量百分比浓度。
实施例1
使用实验室的木醋杆菌菌种(Acetobacter Xylinum)，接种到斜面固体培养基上培养菌落，然后进行种子培养，再在30℃恒温静态培养7天，用镊子取出细菌纤维素膜，清洗，干燥备用。
用工具刮掉细菌纤维素膜表面杂质，然后加入膜片质量20倍的纯化水中，超声波清洗20分钟。先使用0.5％浓度的氢氧化钠进行脱脂处理，料液比1:20，温度40-50℃，处理时间10小时。再使用10％次氯酸钠进行氧化漂白处理，料液比1:20，常温处理，处理时间6小时。再使用1％草酸溶液进行还原漂白处理，料液比1:20，常规处理，处理时间6小时。然后将膜片加入纯化水漂洗5遍。
配制活性溶液：
过氧化氢 0.4％，
PHMB 0.0002％，
乙二胺四乙酸二钠 0.01％。
将上述处理后的细菌纤维素膜加入等重量的活性溶液中浸泡，一段时间后取出，挤压多余水分，分切，灭菌，包装。
实施例2
本实施例采用与实施例1相同的方法制备，其区别在于活性溶液的配方如下：
过氧化氢 1％，
葡萄糖酸氯己定 0.06％，
酒石酸 0.03％。
实施例3
本实施例采用与实施例1相同的方法制备，其区别在于活性溶液的配方如下：
实施例4
本实施例采用与实施例1相同的方法制备，其区别在于活性溶液的配方如下：
过氧化氢 0.8％，
PHMB 0.0001％，
磷酸钠 0.2％。
实施例5
本实施例采用与实施例1相同的方法制备，其区别在于活性溶液的配方如下：
过氧化氢 1％，
PHMB 0.05％，
酒石酸 0.1％。
实施例6
本实施例采用与实施例1相同的方法制备，其区别在于活性溶液的配方如下：
过氧化氢 0.01％，
PHMB 0.0002％，
苹果酸 0.005％。
实施例7
本实施例采用与实施例1相同的方法制备，其区别在于活性溶液的配方如下：
过氧化氢 0.4％，
PHMB 0.0002％。
实施例8
本实施例采用与实施例1相同的方法制备，其区别在于活性溶液的配方如下：
过氧化氢 1％，
葡萄糖酸氯己定 0.06％。
实施例9
本实施例采用与实施例1相同的方法制备，其区别在于活性溶液的配方如下：
过氧化氢 0.6％，
尼泊金甲酯 0.02％，
尼铂金乙酯 0.05％。
试验例1
将实施例1-9获取的样品放置于50℃的烘箱中，分别于第0天、5天、10天、15天、20天、25天取样测试样品中过氧化氢的浓度。观察过氧化氢浓度的变化趋势。
具体操作：打开样品包装，用力挤出样品中的液体，收集于玻璃烧杯中。使用高锰酸钾滴定法检测试样过氧化氢含量。检测结果如表1所示：
表1高温老化对过氧化氢分解速度的影响
结论：上述试验表明，本发明提供的基于细菌纤维素薄膜负载过氧化氢及其稳定剂的技术方案能达到50℃加热25天过氧化氢浓度降低率(或分解速度)不超过15％的效果，氧化氢稳定剂浓度的降低会导致上述分解速度的增加，当浓度低于0.01％时，分解速度会超过50％。其中以EDTA-Na作为稳定剂的效果最好，特别是与尼泊金酯类杀菌剂的结合，可大幅降低过氧化氢分解速率；除此之外，酒石酸与胍类杀菌剂的配合也可有效降低分解速率。相对于实施例1-6，实施例7-9由于未加入过氧化氢稳定剂，无论是尼泊金酯类、有机酸类还是胍类消毒剂，5天后的分解速率已经超过15％，25天后的分解速率达到70％以上。
试验例2
将实施例1-9获取的样品分别测试辐照灭菌前后的过氧化氢浓度，辐照剂量为20-40kGy。
对于辐照或未经辐照的样品，用力挤出样品中的液体，收集于玻璃烧杯中。使用高锰酸钾滴定法检测试样过氧化氢含量。结果如表2所示：
表2辐照灭菌前后过氧化氢分解速度
上述数据表明，含有过氧化氢稳定剂可显著降低辐照对过氧化氢分解的影响。过氧化氢稳定剂浓度对辐照灭菌后样品中过氧化氢分解速度无显著影响。
试验例3
本试验基于实施例1-3和实施例7-9进行抑菌防腐试验。取样品挤出液，分别加入菌落浓度为105-106CFU/ml的细菌和真菌，参照防腐效能评价的方法，分别在第1天、第7天、第14天、第28天测试微生物的菌落总数，结果如表3和表4所示：
表3试样对金黄色葡萄球菌的抑制作用
表4试样对白色念珠菌的抑制作用
以上试验可以看出，本发明所述的过氧化氢稳定剂也具有一定的抑菌增效作用，其中以乙二胺四乙酸二钠和酒石酸对抑菌的增效作用最为显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1. 一种负载活性氧的细菌纤维素敷料制备方法，其特征在于包括如下步骤：分别使用酸性溶液和碱性溶液处理细菌纤维素膜，漂洗；然后浸入活性溶液中，取出，挤压多余水分，分切，经20-40kGy辐照灭菌后包装，辐照灭菌后过氧化氢浓度降低率不超过25%；
其中，所述活性溶液包括过氧化氢、尼泊金酯类消毒剂和乙二胺四乙酸二钠，或
所述活性溶液包括过氧化氢、PHMB和酒石酸；
所述过氧化氢的浓度为0.05-1 wt%。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述乙二胺四乙酸二钠或所述酒石酸的浓度为0.001-0.5 wt%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述尼泊金酯类消毒剂或PHMB的浓度为0.5-5000ppm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细菌纤维素膜为利用木醋杆菌经静态培养发酵制备获得的发酵膜。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述细菌纤维素膜的处理依次包括：
浸入使用pH为10-12的氢氧化钠溶液，处理6-18小时；
浸入使用pH为7.5-10的次氯酸钠溶液，处理3-12小时；
浸入使用pH为2-4的草酸溶液处理，处理2-12小时。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述细菌纤维素膜的各个酸处理或碱处理工序中均使用15-30倍的酸液或碱液浸泡。
7.如权利要求1-6任意一项所述的制备方法获得的细菌纤维素敷料，其特征在于：所述敷料的外观呈白色半透明状，无杂质或黑点；膜片持液量不低于95%，细菌内毒素含量不超过1EU/cm2。
8.根据权利要求7所述的细菌纤维素敷料，其特征在于：在50℃加热25天，过氧化氢浓度降低率不超过15%。
9.根据权利要求8所述的细菌纤维素敷料，其特征在于：经20-40kGy辐照灭菌后过氧化氢浓度降低率不超过25%。
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