CN102058897A - 用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜及其制备方法和应用 - Google Patents

用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜，其组分包括：细菌纤维素干膜和抗菌剂，细菌纤维素基抗菌干膜的载药量为0.0114～0.2027mg/cm2；其制备包括：将细菌纤维素生产菌株接入种子培养基扩培后转接到发酵培养基静置培养，收获细菌纤维素湿膜，然后进行浸泡和水浴处理，再将其切成膜片，干燥后，浸渍于预先配制好的抗菌剂溶液中，经二次干燥制得。本发明的细菌纤维素抗菌干膜具有质地轻便柔软、生物相容性好、吸湿性高、透气性好，抗菌性持久等优点；且制备方法简便易行，成本低廉；在实际应用过程中，可剪裁成任意形状，不粘连也不刺激皮肤，丢弃后在环境中能迅速降解，可作为一种绿色环保的功能性抗菌敷料。

Description

用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于细菌纤维素基抗菌膜及其制备方法和应用领域，特别涉及一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜及其制备方法和应用。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial Cellulose，BC)是一种由微生物合成的天然纤维素，从化学分子式看，BC与普通植物纤维素没有什么差别，但因独特的物理、化学结构而赋予其极高的机械强度和生物相容性。成形的BC由带状超细纤维组成高度结晶体和高度单导向的纤维，复杂地缠绕在一起形成独特的三维网状结构，BC独特三维网状结构内部有很多“孔道”，有良好的透气、透水性能，能吸收60～700倍于其干重的水份，这些水分是以自由水的形式存在。使用BC作为伤口贴料能够迅速吸收伤口血液和组织液，防止伤口感染化脓，又能为慢性伤口附近的组织再生提供湿润的环境促进伤口愈合和减轻疼痛。同时纤维素不会和伤口粘连，不会造成二次伤害，剥离时也不会有残留。
目前报道的以细菌纤维素膜制备创伤敷料主要是以湿膜为主，并且大都应用于慢性创伤，譬如褥疮、烫伤、冻伤等。一种商品名叫Biofill的BC创伤敷料已经上市。它实际上是将湿的BC膜中的纤维含量调控至某种程度，使BC膜既能吸收伤口组织液防止化脓感染，又能为慢性伤口提供湿润的环境促进伤口愈合的一种含水率不同的细菌纤维素材料。研究显示这种BC敷料在慢性创伤的应用方面较之其他材料的敷料能够更有效地促进伤口愈合。另外一种叫做Xcell的BC创伤敷料也被用来促进慢性创伤的愈合，同样也表现出很好的治疗效果。但是以上这些BC敷料本身都不具有抗菌性能来防止伤口感染。Xylos公司在原产品Xcell的基础上推出一种名为抗菌Xcell的改进BC敷料，并且于2003年在美国上市。同时也有一些研究通过在BC上复合纳米银或者壳聚糖等抗菌剂来赋予BC抗菌性能。
但是在日常生活中发生更为频繁的急性创伤方面，BC敷料的应用和研究则很少。而且在用于急性创伤方面，BC湿膜的应用受到较大的限制，如透气性能、血液和组织液等液体吸收性能较之干膜都有不同程度的下降。同时相比较于湿膜，干膜的携带更为方便，而且对急性伤口的舒适度也优于湿膜。目前，国内外尚未见到用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜的研究开发报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜及其制备方法和应用，该BC抗菌干膜具有质地轻便柔软、生物相容性好、吸湿性高、透气性好，抗菌性持久等优点；且制备方法简便易行，成本低廉，可作为一种绿色环保的功能性抗菌敷料，具有良好的应用前景。
本发明的一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜，其组分包括：细菌纤维素干膜和阳离子表面活性剂类抗菌剂，细菌纤维素基抗菌干膜的载药量为0.0114～0.2027mg/cm2。
所述的阳离子表面活性剂类抗菌剂选自苯扎氯铵(十二烷基二甲基苄基氯化铵)、苯扎溴铵(十二烷基二甲基苄基溴化铵)、度米芬(又名消毒宁，化学名称为十二烷基二甲基苯氧乙基溴化铵)、消毒净(十四烷基二甲基吡啶溴化铵)等中的一种或几种的混合物；
所述的细菌纤维素基抗菌干膜能吸收自身干重25～30倍的水份；
所述的细菌纤维素基抗菌干膜在37℃时能持续释放24～96小时；
所述的细菌纤维素基抗菌干膜对革兰氏阳性菌(如枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等)能达到97.7-99.8％的抑菌率。
本发明的一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜的制备方法，包括：
(1)BC膜的制备及处理
将BC生产菌株按2～3接种环的接种量接入液体种子培养基，于30℃条件下种子培养24小时后，再按3～15％的接种量转接到发酵培养基中，20-30℃静置培养1-10天，收获细菌纤维素BC湿膜，然后浸泡于0.5～2wt％的NaOH溶液中，70-100℃水浴处理30-120min，除去BC湿膜中残余的培养基及菌体，使BC湿膜变为白色半透明，再将BC湿膜切成不同直径的圆片或者不同面积不同形状的膜片，经蒸发、压榨、干燥或不做任何处理，备用；
(2)抗菌剂溶液的制备
将阳离子表面活性剂类抗菌剂溶于去离子水中，配成浓度为0.01wt％～0.1785wt％的抗菌剂溶液；
(3)BC抗菌干膜的制备
将步骤(1)制备的BC膜片浸渍于上述抗菌剂溶液24～30h，再经干燥制得到BC抗菌干膜。
所述步骤(1)中的BC生产菌株为醋酸菌属(Acetobacter sp.)、葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter sp.)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter sp.)、根瘤菌属(Rhizobium sp.)、八叠球菌属(Sarcina sp.)、假单胞菌属(Pseudomounas sp.)、无色杆菌属(Achromobactersp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、固氮菌属(Azotobacter sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、洋葱假单胞菌(Seudomonas cepacia)或空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)；
所述步骤(1)中的种子培养基和发酵培养基的组分为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖25g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min；或者为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20g，酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO4 2.7g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min；
所述步骤(2)中的抗菌剂溶液为质量百分比浓度为0.01％～0.1785％；
优选浓度为0.102％～0.1785wt％的苯扎氯铵的水溶液；
所述步骤(3)的替代方法为将抗菌剂溶液直接涂布于BC膜片表面，再经干燥制得到BC抗菌干膜；
所述步骤(1)和(3)中的干燥为常温干燥、真空干燥或冷冻干燥。
本发明的一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜在制备急性创伤医用材料中的应用。
有益效果
(1)本发明的BC抗菌干膜具有质地轻便柔软、生物相容性好、吸湿性高、透气性好，抗菌性持久等优点；且制备方法简便易行，成本低廉，可工业化生产；
(2)在实际应用过程中，可根据伤口的情况和特点任意剪裁成各种形状，不粘连也不刺激皮肤，安全环保，丢弃后在环境中能迅速降解，可作为一种性能良好的且绿色环保的功能性抗菌敷料。
附图说明
图1为不同浓度的苯扎氯铵溶液制备的BC抗菌膜对三种常见细菌的抑制作用图；
图2为浓度0.102％的苯扎氯铵溶液制备的BC抗菌膜的药物缓释图；
图3为浓度0.102％的苯扎氯铵溶液制备的BC抗菌膜对金黄色葡萄球菌的抑制作用图；
图4为浓度0.102％的苯扎氯铵溶液制备的BC抗菌膜对枯草芽孢杆菌的抑制作用图；
图5为浓度0.102％的苯扎氯铵溶液制备的BC抗菌膜对大肠杆菌的抑制作用图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)BC膜的制备及处理
木醋杆菌(Acetobacter xylinum)按2～3接种环的接种量于液体种子培养基中30℃扩培24小时后，再按6％的接种量转接到发酵培养基中30℃静置培养7天，收获细菌纤维素(BC)湿膜；制备好的BC膜浸泡在1％的NaOH溶液中在80℃水浴直至BC膜变白色半透明，然后将制得的BC膜切成直径为15mm的圆片，经冷冻干燥仪冻干后，称量干重，备用；
其中，种子培养基和发酵培养基的组分为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖25g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH5.0，121℃灭菌20min；
(2)抗菌剂溶液的制备
苯扎氯铵溶液的制备：分别吸取85％的苯扎氯铵溶液5.9～105μL，定容到50mL，得到浓度为0.01wt％～0.1785wt％的苯扎氯铵溶液；
(3)BC抗菌膜的载药量分析
将冻干的BC膜浸渍在25mL浓度为0.102％的苯扎氯铵溶液中平衡24小时后，然后吸干表面浮水，称量湿重。
BC膜对苯扎氯铵的载药量根据如下公式计算：载药量＝(Ww-Wd)*C，
其中，Ww是BC膜吸收苯扎氯铵后的湿重，Wd是BC膜的干重，C是抗菌剂的浓度，实验结果见表1。
表1  一次冻干后BC膜的载药量
Figure BDA0000044116500000041
实验结果表明，直径为15mm的BC膜经过冻干后能载上约0.2046mg苯扎氯铵。而BC膜材料的面积为1.7663cm2，因此经二次冻干后，BC膜中苯扎氯铵的含量为0.1158mg/cm2。
实施例2
(1)BC膜的制备及处理
木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)按2～3接种环的接种量于液体种子培养基中30℃扩培24小时后，再按10％的接种量转接到发酵培养基中25℃静置培养10天，收获细菌纤维素(BC)湿膜；制备好的BC膜浸泡在1.5％的NaOH溶液中在90℃水浴直至BC膜变白色半透明，然后将制得的BC膜切成直径为15mm的圆片，备用；
其中，种子培养基和发酵培养基的组分为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20g，酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨5g，柠檬酸115g，Na2HPO4 2.7g，水1L，pH7.0，121℃灭菌20min
(2)抗菌剂溶液的制备
苯扎氯铵溶液的制备：分别吸取85％的苯扎氯铵溶液5.9～105μL，定容到50mL，得到浓度为0.01wt％～0.1785wt％的苯扎氯铵溶液；
(3)BC抗菌干膜的制备
将湿的BC膜直接浸渍在25mL浓度为0.01％～0.1785％的苯扎氯铵溶液中24h后，经冷冻干燥或者常温干燥或者真空干燥得到BC抗菌干膜。
平板扩散法测定抗菌材料的抑菌作用
试验菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；
培养基：
(1)大肠杆菌：胰蛋白胨10g、酵母浸膏5g、NaCl 10g，水1L，pH 7；
(2)金黄色葡萄球菌：牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 50g，水1L，pH 7.4；
(3)枯草芽孢杆菌：葡萄糖20g、蛋白胨15g、牛肉膏0.5g、NaCl 5g、水1L，pH 7；
若为固体培养基，则添加20g的琼脂。
实验方法
制备液体培养基和固体平板培养基，然后将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌从斜面种子接种到液体种子培养基中，37℃恒温培养12小时得种子液；吸取0.1mL种子液至固体平板培养基上，涂布均匀；将制备好的BC抗菌膜平铺在平板中央，37℃恒温倒置培养24小时，测量抑菌圈的径差，结果见图1。
实验表明：BC抗菌干膜在苯扎氯铵浓度为0.102％～0.1785％时均有较好的抑菌效果，且在苯扎氯铵的浓度为0.102％时，对皮肤的刺激最小。
实施例3
(1)BC膜的制备及处理
氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)按2～3接种环的接种量于液体种子培养基30℃扩培24小时后，再按15％的接种量转接到发酵培养基中20℃静置培养10天，收获细菌纤维素(BC)湿膜；制备好的BC膜浸泡在1％的NaOH溶液中在80℃水浴直至BC膜变白色半透明，然后将制得的BC膜切成直径为15mm的圆片，压榨除去70-80％的水份备用；
其中，种子培养基和发酵培养基的组分为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖25g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH4.0，121℃灭菌20min；
(2)抗菌剂溶液的制备
度米芬溶液的制备：分别吸取85％的度米芬溶液5.9～105μL，定容到50mL，得到浓度为0.01wt％～0.1785wt％的度米芬溶液；
(3)BC抗菌干膜的制备
将压榨后的BC膜浸渍在25mL浓度为0.01％～0.1785％的度米芬溶液中24h后，再次冷冻干燥得到抗菌干膜。
BC抗膜的吸水性能测试
将二次冻干的BC抗菌材料称重后，浸泡在去离子水中24h，然后吸干表面浮水，称重。BC抗菌膜的膨胀率根据如下公式计算：膨胀率＝(Ws-Wd)/Wd，其中Ws是BC膜膨胀后的湿重，Wd是BC膜的原始干重，实验结果见表2。
表2  二次冻干后BC膜的膨胀率
Figure BDA0000044116500000061
实验结果表明：直径为15mm的BC膜经过二次冻干后其吸收能力约为自己干重的26.20倍。
实施例4
(1)BC膜的制备及处理
木醋杆菌(Acetobacter xylinum)按2～3接种环的接种量在液体种子培养基中30℃扩培24小时后，再按6％的接种量转接到发酵培养基中30℃静置培养7天，收获细菌纤维素(BC)湿膜；制备好的BC膜浸泡在1％的NaOH溶液中在80℃水浴直至BC膜变白色半透明，然后将制得的BC膜切成直径为15mm的圆片，经冷冻干燥仪冻干后备用；
(2)抗菌剂溶液的制备
苯扎氯铵溶液的制备：分别吸取85％的苯扎氯铵溶液5.9～105μL，定容到50mL，得到浓度为0.01wt％～0.1785wt％的苯扎氯铵溶液；
(3)BC抗菌干膜的制备
将冻干的BC膜浸渍在25mL浓度为0.01％～0.1785％的苯扎氯铵溶液中24小时后，再次冷冻干燥得到抗菌干膜。
BC抗菌膜的药物缓释测定
通过对苯扎氯铵进行紫外光谱扫描，选取263nm作为测定波长；
药物缓释：将制备好的BC抗菌膜浸渍在装有25mL去离子水的烧杯中，37℃恒温水浴，每隔2小时取样测263nm吸光值，结果见图2。
实验结果表明：通过二次冻干浸渍法制备的BC抗菌干膜能有效释放苯扎氯铵24小时以上，在24h时，苯扎氯铵的缓释率约为66％。
实施例5
(1)BC膜的制备及处理
木醋杆菌(Acetobacter xylinum)按2～3接种环的接种量于液体种子培养基中30℃扩培24小时后，再按10％的接种量转接到发酵培养基中30℃静置培养7天，收获细菌纤维素(BC)湿膜；制备好的BC膜浸泡在1％的NaOH溶液中在100℃水浴直至BC膜变白色半透明，然后将制得的BC膜切成直径为15mm的圆片，经冷冻干燥仪冻干后备用；
(2)抗菌剂溶液的制备
苯扎氯铵溶液的制备：分别吸取85％的苯扎氯铵溶液5.9～105μL，定容到50mL，得到浓度为0.01wt％～0.1785wt％的苯扎氯铵溶液；
(3)BC抗菌干膜的制备
将冻干的BC膜浸渍在25mL浓度为0.01％～0.1785％的苯扎氯铵溶液中24h后，再次冷冻干燥得到抗菌干膜。
BC抗菌膜对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的生长抑制作用的检测
试验菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；
培养基：
(1)大肠杆菌：胰蛋白胨10g、酵母浸膏5g、NaCl 10g，水1L，pH 7；
(2)金黄色葡萄球菌：牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 50g，水1L，pH 7.4；
(3)枯草芽孢杆菌：葡萄糖20g、蛋白胨15g、牛肉膏0.5g、NaCl 5g、水1L，pH 7。
实验方法
制备液体培养基：将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌斜面种子接种到液体种子培养基中，37℃恒温培养12h得种子液。在100mL液体培养集基中分别加入空白BC膜、0.102％苯扎氯铵BC抗菌膜。然后分别吸取5mL种子液接入其中，混匀后，37℃恒温培养24h，定时取样测定培养液的光密度值OD600，然后作出生长曲线并计算抑菌率，实验结果见图3-5。
Figure BDA0000044116500000081
实验结果表明：通过二次冻干浸渍法制备的BC抗菌膜能强烈抑制金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌24小时以上，分别达到了99.8％和97.7％的抑菌率；而对大肠杆菌的抑制效果并不显著。

Claims (10)

1.一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜，其组分包括：细菌纤维素干膜和阳离子表面活性抗菌剂，细菌纤维素基抗菌干膜的载药量为0.0114～0.2027mg/cm2。
2.根据权利要求1所述的一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜，其特征在于：所述的阳离子表面活性抗菌剂选自苯扎氯铵、苯扎溴铵、度米芬、消毒净中的一种或几种的混合物。
3.根据权利要求1所述的一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜，其特征在于：所述的细菌纤维素基抗菌干膜能吸收自身干重25～30倍的水份，在37℃时能持续释放24～96小时；对革兰氏阳性菌能达到97.7～99.8％的抑菌率。
4.一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜的制备方法，包括：
(1)BC膜的制备及处理
将BC生产菌株按2～3接种环的接种量接入液体种子培养基，于30℃条件下种子培养24小时后，再按3～15％的接种量转接到发酵培养基中，20-30℃静置培养1-10天，收获细菌纤维素BC湿膜，然后浸泡于0.5～2wt％的NaOH溶液中，70-100℃水浴处理30-120min，使BC湿膜变为白色半透明，再将其切成膜片，经蒸发、压榨、干燥或不做任何处理，备用；
(2)抗菌剂溶液的制备
将上述阳离子表面活性抗菌剂溶于去离子水中，配成浓度为0.01wt％～0.1785wt％的抗菌剂溶液；
(3)BC抗菌干膜的制备
将步骤(1)制备的BC膜片浸渍于上述抗菌剂溶液24～30h，再经干燥制得到BC抗菌干膜。
5.根据权利要求4所述的一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的BC生产菌株为醋酸菌属、葡萄糖酸杆菌属、葡糖酸醋杆菌属、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属、土壤杆菌属、洋葱假单胞菌或空肠弯曲菌。
6.根据权利要求4所述的一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的种子培养基和发酵培养基的组分为：甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖25g、蛋白胨或胰蛋白胨3g、酵母浸膏5g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min；或甘露醇、葡萄糖、蔗糖或果糖20g，酵母浸膏5g，蛋白胨或胰蛋白胨5g，柠檬酸1.15g，Na2HPO42.7g，水1L，pH3.5-7.5，121℃灭菌20min。
7.根据权利要求4所述的一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的抗菌剂溶液为质量百分比浓度为0.01％～0.1785％。
8.根据权利要求4所述的一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)的替代方法为将抗菌剂溶液直接涂布于BC膜片表面，再经干燥制得到BC抗菌干膜。
9.根据权利要求4所述的一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)和(3)中的干燥为常温干燥、真空干燥或冷冻干燥。
10.一种用于急性创伤的细菌纤维素基抗菌干膜在制备急性创伤医用材料中的应用。
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