CN108815578A - 一种人工生物硬脑膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物基材料技术领域，尤其涉及一种人工生物硬脑膜及其制备方法。本发明制备的人工生物硬脑膜的原料由细菌纤维素和胶原蛋白组成，二者质量比为0.1‑3.0:10，其中未添加任何交联剂，可减少交联剂对硬脑膜修复过程中的不利影响，提高硬脑膜产品临床使用安全性。本发明的人工生物硬脑膜通过静电纺丝的方法制备而成，严格控制工艺中pH、温度等条件，使得其具有良好的生物相容性及力学性能，满足临床使用过程中手术缝合，有效防止脑脊液渗漏。

Description

一种人工生物硬脑膜及其制备方法

技术领域

本发明属于生物基材料技术领域，尤其涉及一种人工生物硬脑膜及其制备方法。

背景技术

硬脑膜(dura mater)是介于颅骨和脑组织之间的一种厚而坚韧的双层膜性组织，构成脑组织的一道重要天然防护介质，而创伤、炎症、肿瘤侵蚀及手术操作等均能造成硬脑膜损伤，破坏其完整性，硬脑膜成形术在颅颌面整形外科中颅骨缺损的早期和二期修复均为重要操作步骤，对于维持其解剖学完整及保护脑组织不可或缺，而硬脑膜缺损的修复材料也直接影响着硬脑膜重建后颅内感染、癫痫、脑组织膨出、脑脊液漏等并发症的发生率以及后期颅骨损伤整形修复的美观。

一直以来，对理想硬脑膜替代物的课题研究从未间断，有关硬脑膜修复的新理念、新材料和新方法也与时俱进。FDA公布的理想硬脑膜替代材料应该具备以下条件：材料来源充足，制备工艺相对简单；化学性质稳定且具有生物学惰性，植入后机体炎症反应轻微，较少发生硬脑膜-脑组织粘连；组织相容性良好，不发生免疫排斥反应；安全性好，不传播病毒性疾病；物理性能优越，具有良好的致密性和一定的弹性和韧性。

目前临床上使用的硬脑膜替代材料有各自的优缺点，主要分为以下四个大类：(1)自体筋膜：其优点是是排异反应较少且组织相容性良好，缺点是不宜取材，且增加自体损伤，易与脑组织发生粘连引起癫痫；(2)同种异体组织：其优点是具有正常人体硬脑膜的解剖结构，能够起到一定的支撑和保护脑组织的作用，缺点是材料来源有限，并受到伦理道德的限制，而且具有潜在感染病毒性疾病的可能，现已禁用。(3)异种生物材料：是目前临床上使用较多的人工硬膜材料。其优点是材料来源充足，无伦理学限制；具有良好的致密性，可有效防止脑脊液漏。缺点是在去除异种蛋白抗原时使用的戊二醛可在材料中残留部分醛基，不易彻底清除，有碍于成纤维细胞长入替代材料内部，且存在一定的毒性，并具有潜在的异物反应可能。(4)人工合成替代材料，如丝素蛋白、高分子聚合材料等。这类材料的优点是制作方便，价格低廉，其缺点是作为永久性异物，有发生排异反应的可能，易导致无菌性炎症的发生形成肉芽肿等。

细菌纤维素(简称：BC)是一种以纯纤维素形式存在的，由木醋杆菌等合成的纤维素，是一种纯天然的生物材料，它具有由超微纤维构成的精致天然超微纤维网状结构，并且其化学纯度很高，基于细菌纤维素硬脑膜替代物与其它产品相比有如下优点：细菌纤维素为非动物来源，不会发生免疫排斥反应；细菌纤维素力学性能优异，能够满足临床缝合要求，能够有效防止脑脊液渗漏；细菌纤维素具有优异的生物相容性，引起炎症反应风险小，不与组织粘连，减少瘢痕形成；细菌纤维素是由数十纳米的纤维束组成，呈三维网状结构，含有丰富的孔隙，易于成纤维细胞的生长，促进硬脑膜修复；原料来源丰富，成本低，能够极大降低硬脑膜临床使用费用。

胶原蛋白是目前市场上应用最广泛的硬脑膜材料，其作为细胞生长的良好基质，有传递细胞化学信号的功能，在硬脑膜修复中促进硬脑膜再生，目前市场上胶原蛋白硬脑膜产品因其材料力学性能差，临床上不能进行手术缝合，不能有效地防止脑脊液泄漏。

中国发明专利200710015537.5公开了一种利用细菌纤维素制备人工硬脑膜的方法，其步骤是将细菌纤维素湿膜破碎，得细菌纤维素匀浆；将细菌纤维素匀浆与浓度为7％～15％的聚乙烯醇溶液按照1∶1-10的比例均匀混合,然后将混合物均匀的铺在模具中，置于-20℃--4℃条件下冷冻20小时-30小时,再于真空冷冻干燥机内冻干，得成形的人工硬脑膜，该发明制备的人工硬脑膜在湿态时有良好的弹性和柔韧性，缝合时不撕裂不脱边，但硬脑膜中包含的聚乙烯醇在3类致癌物清单中，将极大降低该发明安全性，制约了其临床使用范围；

中国发明专利CN101569765A公开了一种保持胶原特有三螺旋结构的I型医用胶原材料及其提取方法，采用该I型医用胶原材料制备的脑膜/脊膜生物膜片，以及该生物膜片的制备工艺及其在制备脑膜/脊膜组织修复材料中的应用，该专利申请涉及的I型胶原人工硬脑/脊膜发明特点着重在于对损伤缺损的脑膜或脊膜的缺损部位使用具有一定强度、具有高开放性三维孔隙结构的类海绵状脑膜或脊膜生物膜片进行覆盖包裹，这样不仅机械性的保护脑实质部位的组织不受外周其他组织的侵入干扰，同时还建立了受损脑膜或脊膜部位的纤维组织的再生内环境，防止脑脊液和其内的生长因子过度丢失，保持受损组织的内环境的相对稳定，为修复脑膜或脊膜和其再生提供最佳环境。但是这种具有多孔隙的海绵状膜在临床使用过程中由于其力学性能较弱、缝合的性能欠佳，导致在神经外科手术中受到了一定的限制。

在神经外科的手术中有相当部分的手术病例如颅底部位的病变在术中需要修补时必须需要紧密缝合缺损，为此发明一种具有良好的生物相容性、力学性能、缝合性能及临床使用便利性的人工脑膜成为了发展的必然趋势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种具有较低内毒素和较好的力学性能、缝合性能及临床使用便利性的人工生物硬脑膜及其制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

一方面，本发明提供了一种人工生物硬脑膜，人工生物硬脑膜原料由细菌纤维素和胶原蛋白组成。

进一步地，所述人工生物硬脑膜由细菌纤维素和胶原蛋白通过静电纺丝的方式组合而成。

进一步地，所述细菌纤维素膜上下表面均匀复合上胶原蛋白。

更进一步地，所述细菌纤维素膜与胶原蛋白含量质量比为0.1-3.0:10。

进一步地，所述产生细菌纤维素膜的由微生物菌种选自醋酸菌属、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属和土壤杆菌属中的一种。

更进一步地，所述产生细菌纤维素膜的由微生物菌种选自醋酸菌属、根瘤菌属和八叠球菌属中的一种。

再进一步地，所述产生细菌纤维素膜的由微生物菌种为醋酸杆菌。

再一方面，本发明提供了上述人工生物硬脑膜的制备方法，包括以下步骤：

1)细菌纤维素膜的发酵制备：微生物菌种活化，扩大培养，得到种子液，并将种子液接种至发酵培养基中培养，得到液面上层生成一层细菌纤维素膜的发酵液，将细菌纤维素膜取出待用；

2)细菌纤维素膜的纯化处理：清洗步骤1)得到的细菌纤维素膜，然后放入无机碱溶液中，搅拌后取出，再放入柠檬酸溶液中搅拌，再次取出，清洗，得到纯化的细菌纤维素膜；

3)将步骤2)得到的细菌纤维素膜干燥，得到硬脑膜基材，备用；

4)将牛跟腱酶解，酶解液离心取上清，盐析出胶原蛋白，透析，溶解，得到胶原蛋白溶液；

5)将步骤3)的硬脑膜基材固定于静电纺丝设备接收装置上，将步骤4)的胶原蛋白溶液转移到注射器中，进行静电纺丝得到细菌纤维素人工生物硬脑膜中间品；

6)将步骤5)得到的细菌纤维素人工生物硬脑膜中间品压缩并裁剪，经过内包、外包、灭菌、包装后，即得。

进一步地，所述步骤1)中发酵培养基的配方为每500mL中含有：葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、酵母膏2.5g、柠檬酸0.5g、磷酸氢二钠1g、磷酸氢二钾0.5g和蒸馏水余量。

进一步地，所述步骤2)中先用注射用水清洗步骤1)得到的细菌纤维素膜，直至所述细菌纤维素膜的pH为4.0-8.0。

更进一步地，使用注射用水清洗步骤1)得到的细菌纤维素膜，直至所述的细菌纤维素膜pH为5.5-7.0。

再进一步地，使用注射用水清洗步骤1)得到的细菌纤维素膜，直至所述的细菌纤维素膜pH为6.0-6.5。

进一步地，所述步骤2)中细菌纤维素膜放入无机碱溶液中，进行升温。

更进一步地，所述无机碱为氢氧化钠溶液，浓度0.01-5.0mol/L，温度为90-100℃。

再进一步地，所述无机碱的浓度为0.01-4.0mol/L。

再进一步地，所述无机碱的浓度为0.01-3.0mol/L。

再进一步地，所述无机碱的浓度为0.01-2.0mol/L。

进一步地，放入无机碱溶液中，所述升温为升温至60-120℃。

更进一步地，升温至80-110℃。

更进一步地，升温至85-105℃。

进一步地，所述步骤2)中所述的柠檬酸溶液浓度为0.05mol/L-20.0mol/L。

更进一步地，所述的柠檬酸溶液浓度为0.1mol/L-16.0mol/L。

更进一步地，所述的柠檬酸溶液浓度为0.01-2.0mol/L。

进一步地，所述细菌纤维素膜从柠檬酸溶液中取出后，用注射用水清洗至细菌纤维素膜的pH为4.0-8.0，同时细菌纤维素膜内的细菌内毒素的含量小于等于0.03EU/ml。

进一步地，所述步骤3)中干燥方式选自真空干燥成型技术、冷冻干燥成型技术及鼓风干燥成型技术中的一种。

进一步地，所述步骤3)中牛跟腱酶解在pH值1.0-3.0的条件下进行。

更进一步地，所述步骤3)中牛跟腱酶解所用酶为胃蛋白酶或胰蛋白酶。

进一步地，所述步骤4)中透析后的胶原蛋白用0.01mol/L-5.0mol/L柠檬酸溶液溶解，得到胶原蛋白含量为0.01％-2.0％的胶原蛋白柠檬酸溶液。

进一步地，所述步骤6)中利用小型压模机压到的厚度为0.1mm-0.8mm，所述的裁剪，裁剪的尺寸为2.0cm×2.0cm-15.0cm×15.0cm。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的人工生物硬脑膜内毒素含量低于0.2EU/件，有效保证了其安全性。同时，本发明提供的人工生物硬脑膜力学性能、缝合性能显著高于市售产品，具有更广泛的应用空间及临床使用便利性，可以满足作为人工硬脑膜或修补材料的基本要求。

(2)本发明无意中发现，当采用本发明中特定的细菌纤维素膜的纯化处理中的温度、柠檬酸钠浓度和细菌纤维素膜与胶原蛋白含量质量比的组合时，得到的人工生物硬脑膜分别在内毒素含量、力学性能和缝合性能方面最佳。

(3)本发明在细菌纤维素人工硬脑膜制备中未添加交联剂，减少交联剂对硬脑膜修复过程中的不利影响，提高硬脑膜产品临床使用安全性；同时本技术制备的硬脑膜细菌纤维素基材具有良好的生物相容性及力学性能，满足临床使用过程中手术缝合，有效防止脑脊液渗漏，细菌纤维素材料来源广泛，成本低，该产品将极大减轻患者的临床费用。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1一种人工生物硬脑膜及其制备方法

人工生物硬脑膜组成：细菌纤维素和胶原蛋白质量比为1:10，通过静电纺丝的方式，使细菌纤维素膜上下表面均匀复合上胶原蛋白。所述细菌纤维素膜由醋酸杆菌产生。

人工生物硬脑膜制备方法：

1)细菌纤维素膜的发酵制备：取产纤维素膜的醋酸杆菌活化，得活化菌种，将活化菌种扩大培养，得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中发酵得到细菌纤维素发酵液，经过8天发酵后，发酵液液面上层将生成一层细菌纤维素膜，取出待用；

其中，所述的发酵培养基的配方为每500mL中含有：葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、酵母膏2.5g、柠檬酸0.5g、磷酸氢二钠1g、磷酸氢二钾0.5g和蒸馏水余量；

2)细菌纤维素膜的纯化处理：使用注射用水清洗步骤1)得到的细菌纤维素膜，直至所述细菌纤维素膜的pH值为6；

将用注射用水清洗过的细菌纤维素膜放入温度为95℃，浓度为2.0mol/L的氢氧化钠溶液中，然后升温至100℃，搅拌2h后取出所述细菌纤维素膜，取出后再加入2mol/L柠檬酸溶液中搅拌2h后取出所述细菌纤维素膜，用注射用水清洗至所述细菌纤维素膜的pH为6.0以及所述细菌纤维素膜内的细菌内毒素的含量≤0.03EU/ml，得到纯化的细菌纤维素膜；

3)将纯化后的细菌纤维素膜放入冻干盘内-80℃下冷冻真空干燥24小制备得到硬脑膜基材；

4)胶原蛋白提取工艺：在pH值1.0的条件下，将牛跟腱在浓度为200mg/L胃蛋白酶水溶液中酶解120h；酶解液离心取上清，用饱和盐溶液盐析出胶原蛋白；将盐析出的胶原蛋白利用截留分子量5000规格的透析袋进行透析，透析后的胶原蛋白用2.0mol/L柠檬酸溶液溶解，得到胶原蛋白含量为1.0％的胶原蛋白柠檬酸溶液；

5)将细菌纤维素硬脑膜基材固定于静电纺丝设备接收装置上，将步骤4)得到胶原蛋白含量为1.0％的胶原蛋白柠檬酸溶液转移到注射器中，采用30KV的外加电场强度以及在10cm接收距离范围内进行静电纺丝得到细菌纤维素人工硬脑膜中间品；

6)将步骤4)得到的细菌纤维素人工硬脑膜中间品利用小型压膜机压缩到厚度为0.366mm并裁剪成尺寸为10.0cm×10.0cm，经过内包、外包后送至辐照灭菌机构进行产品钴-60射线灭菌，灭菌剂量为25kGy,灭菌后包装成最终人工生物硬脑膜成品。

实施例2一种人工生物硬脑膜及其制备方法

人工生物硬脑膜组成：细菌纤维素和胶原蛋白质量比为1:10，通过静电纺丝的方式，使细菌纤维素膜上下表面均匀复合上胶原蛋白。所述细菌纤维素膜由微八叠球菌产生。

制备方法：

1)细菌纤维素膜的发酵制备：取产纤维素膜的醋酸杆菌活化，得活化菌种，将活化菌种扩大培养，得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中发酵得到细菌纤维素发酵液，经过8天发酵后，发酵液液面上层将生成一层细菌纤维素膜，取出待用；

其中，所述的发酵培养基的配方为每500mL中含有：葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、酵母膏2.5g、柠檬酸0.5g、磷酸氢二钠1g、磷酸氢二钾0.5g和蒸馏水余量；

2)细菌纤维素膜的纯化处理：使用注射用水清洗步骤1)得到的细菌纤维素膜，直至所述细菌纤维素膜的pH值为6.5；

将用注射用水清洗过的细菌纤维素膜放入温度为90℃，浓度为0.01mol/L的氢氧化钠溶液中，然后升温至60℃，搅拌2h后取出所述细菌纤维素膜，取出后再加入0.01mol/L柠檬酸溶液中搅拌2h后取出所述细菌纤维素膜，用注射用水清洗至所述细菌纤维素膜的pH为5.0以及所述细菌纤维素膜内的细菌内毒素的含量≤0.03EU/ml，得到纯化的细菌纤维素膜；

3)将纯化后的细菌纤维素膜放入冻干盘内-80℃下冷冻真空干燥24小制备得到硬脑膜基材；

4)胶原蛋白提取工艺：在pH值1.5的条件下，将牛跟腱在浓度为200mg/L胃蛋白酶水溶液中酶解120h；酶解液离心取上清，用饱和盐溶液盐析出胶原蛋白；将盐析出的胶原蛋白利用截留分子量5000规格的透析袋进行透析，透析后的胶原蛋白用0.01mol/L柠檬酸溶液溶解，得到胶原蛋白含量为2.0％的胶原蛋白柠檬酸溶液；

5)将细菌纤维素硬脑膜基材固定于静电纺丝设备接收装置上，将步骤4)得到胶原蛋白含量为2.0％的胶原蛋白柠檬酸溶液转移到注射器中，采用30KV的外加电场强度以及在10cm接收距离范围内进行静电纺丝得到细菌纤维素人工硬脑膜中间品；

6)将步骤4)得到的细菌纤维素人工硬脑膜中间品利用小型压膜机压缩到厚度为0.500mm并裁剪成尺寸为15.0cm×15.0cm，经过内包、外包后送至辐照灭菌机构进行产品钴-60射线灭菌，灭菌剂量为25kGy,灭菌后包装成最终人工生物硬脑膜成品。

实施例3一种人工生物硬脑膜及其制备方法

人工生物硬脑膜组成：细菌纤维素和胶原蛋白质量比为0.5:10，通过静电纺丝的方式，使细菌纤维素膜上下表面均匀复合上胶原蛋白。所述细菌纤维素膜由醋酸杆菌产生。

制备方法：

1)细菌纤维素膜的发酵制备：取产纤维素膜的醋酸杆菌活化，得活化菌种，将活化菌种扩大培养，得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中发酵得到细菌纤维素发酵液，经过8天发酵后，发酵液液面上层将生成一层细菌纤维素膜，取出待用；

其中，所述的发酵培养基的配方为每500mL中含有：葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、酵母膏2.5g、柠檬酸0.5g、磷酸氢二钠1g、磷酸氢二钾0.5g和蒸馏水余量；

2)细菌纤维素膜的纯化处理：使用注射用水清洗步骤1)得到的细菌纤维素膜，直至所述细菌纤维素膜的pH值为5.5；

将用注射用水清洗过的细菌纤维素膜放入温度为100℃，浓度为5.0mol/L的氢氧化钠溶液中，然后升温至120℃，搅拌2h后取出所述细菌纤维素膜，取出后再加入0.1mol/L柠檬酸溶液中搅拌2h后取出所述细菌纤维素膜，用注射用水清洗至所述细菌纤维素膜的pH为4.0以及所述细菌纤维素膜内的细菌内毒素的含量≤0.03EU/ml，得到纯化的细菌纤维素膜；

3)将纯化后的细菌纤维素膜放入冻干盘内-80℃下冷冻真空干燥24小制备得到硬脑膜基材；

4)胶原蛋白提取工艺：在pH值3.0的条件下，将牛跟腱在浓度为200mg/L胃蛋白酶水溶液中酶解120h；酶解液离心取上清，用饱和盐溶液盐析出胶原蛋白；将盐析出的胶原蛋白利用截留分子量5000规格的透析袋进行透析，透析后的胶原蛋白用0.1mol/L柠檬酸溶液溶解，得到胶原蛋白含量为0.01％的胶原蛋白柠檬酸溶液；

5)将细菌纤维素硬脑膜基材固定于静电纺丝设备接收装置上，将步骤4)得到胶原蛋白含量为0.01％的胶原蛋白柠檬酸溶液转移到注射器中，采用30KV的外加电场强度以及在10cm接收距离范围内进行静电纺丝得到细菌纤维素人工硬脑膜中间品；

6)将步骤4)得到的细菌纤维素人工硬脑膜中间品利用小型压膜机压缩到厚度为0.8mm并裁剪成尺寸为2.0cm×2.0cm，经过内包、外包后送至辐照灭菌机构进行产品钴-60射线灭菌，灭菌剂量为25kGy,灭菌后包装成最终人工生物硬脑膜成品。

实施例4一种人工生物硬脑膜及其制备方法

人工生物硬脑膜组成：细菌纤维素和胶原蛋白质量比为3:10，通过静电纺丝的方式，使细菌纤维素膜上下表面均匀复合上胶原蛋白。所述细菌纤维素膜由醋酸杆菌产生。

制备方法：

1)细菌纤维素膜的发酵制备：取产纤维素膜的醋酸杆菌活化，得活化菌种，将活化菌种扩大培养，得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中发酵得到细菌纤维素发酵液，经过8天发酵后，发酵液液面上层将生成一层细菌纤维素膜，取出待用；

其中，所述的发酵培养基的配方为每500mL中含有：葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、酵母膏2.5g、柠檬酸0.5g、磷酸氢二钠1g、磷酸氢二钾0.5g和蒸馏水余量；

2)细菌纤维素膜的纯化处理：使用注射用水清洗步骤1)得到的细菌纤维素膜，直至所述细菌纤维素膜的pH值为8.0；

将用注射用水清洗过的细菌纤维素膜放入温度为100℃，浓度为3.0mol/L的氢氧化钠溶液中，然后升温至80℃，搅拌2h后取出所述细菌纤维素膜，取出后再加入16.0mol/L柠檬酸溶液中搅拌2h后取出所述细菌纤维素膜，用注射用水清洗至所述细菌纤维素膜的pH为8.0以及所述细菌纤维素膜内的细菌内毒素的含量≤0.03EU/ml，得到纯化的细菌纤维素膜；

3)将纯化后的细菌纤维素膜放入冻干盘内-80℃下冷冻真空干燥24小制备得到硬脑膜基材；

4)胶原蛋白提取工艺：在pH值3.0的条件下，将牛跟腱在浓度为200mg/L胃蛋白酶水溶液中酶解120h；酶解液离心取上清，用饱和盐溶液盐析出胶原蛋白；将盐析出的胶原蛋白利用截留分子量5000规格的透析袋进行透析，透析后的胶原蛋白用5.0mol/L柠檬酸溶液溶解，得到胶原蛋白含量为0.1％的胶原蛋白柠檬酸溶液；

5)将细菌纤维素硬脑膜基材固定于静电纺丝设备接收装置上，将步骤4)得到胶原蛋白含量为0.1％的胶原蛋白柠檬酸溶液转移到注射器中，采用30KV的外加电场强度以及在10cm接收距离范围内进行静电纺丝得到细菌纤维素人工硬脑膜中间品；

6)将步骤4)得到的细菌纤维素人工硬脑膜中间品利用小型压膜机压缩到厚度为0.1mm并裁剪成尺寸为7.0cm×7.0cm，经过内包、外包后送至辐照灭菌机构进行产品钴-60射线灭菌，灭菌剂量为25kGy,灭菌后包装成最终人工生物硬脑膜成品。

实施例5一种人工生物硬脑膜及其制备方法

人工生物硬脑膜组成：细菌纤维素和胶原蛋白质量比为2:10，通过静电纺丝的方式，使细菌纤维素膜上下表面均匀复合上胶原蛋白。所述细菌纤维素膜由豌豆根瘤菌产生。

制备方法：

1)细菌纤维素膜的发酵制备：取产纤维素膜的醋酸杆菌活化，得活化菌种，将活化菌种扩大培养，得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中发酵得到细菌纤维素发酵液，经过8天发酵后，发酵液液面上层将生成一层细菌纤维素膜，取出待用；

其中，所述的发酵培养基的配方为每500mL中含有：葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、酵母膏2.5g、柠檬酸0.5g、磷酸氢二钠1g、磷酸氢二钾0.5g和蒸馏水余量；

2)细菌纤维素膜的纯化处理：使用注射用水清洗步骤1)得到的细菌纤维素膜，直至所述细菌纤维素膜的pH值为4.0；

将用注射用水清洗过的细菌纤维素膜放入温度为98℃，浓度为4.0mol/L的氢氧化钠溶液中，然后升温至105℃，搅拌2h后取出所述细菌纤维素膜，取出后再加入20mol/L柠檬酸溶液中搅拌2h后取出所述细菌纤维素膜，用注射用水清洗至所述细菌纤维素膜的pH为7.0以及所述细菌纤维素膜内的细菌内毒素的含量≤0.03EU/ml，得到纯化的细菌纤维素膜；

3)将纯化后的细菌纤维素膜放入冻干盘内-80℃下冷冻真空干燥24小制备得到硬脑膜基材；

4)胶原蛋白提取工艺：在pH值2.0的条件下，将牛跟腱在浓度为200mg/L胃蛋白酶水溶液中酶解120h；酶解液离心取上清，用饱和盐溶液盐析出胶原蛋白；将盐析出的胶原蛋白利用截留分子量5000规格的透析袋进行透析，透析后的胶原蛋白用3.5mol/L柠檬酸溶液溶解，得到胶原蛋白含量为1.0％的胶原蛋白柠檬酸溶液；

5)将细菌纤维素硬脑膜基材固定于静电纺丝设备接收装置上，将步骤4)得到胶原蛋白含量为1.5％的胶原蛋白柠檬酸溶液转移到注射器中，采用30KV的外加电场强度以及在10cm接收距离范围内进行静电纺丝得到细菌纤维素人工硬脑膜中间品；

6)将步骤4)得到的细菌纤维素人工硬脑膜中间品利用小型压膜机压缩到厚度为0.125mm并裁剪成尺寸为6.0cm×6.0cm，经过内包、外包后送至辐照灭菌机构进行产品钴-60射线灭菌，灭菌剂量为25kGy,灭菌后包装成最终人工生物硬脑膜成品。

实施例6一种人工生物硬脑膜及其制备方法

人工生物硬脑膜组成：细菌纤维素和胶原蛋白质量比为0.1:10，通过静电纺丝的方式，使细菌纤维素膜上下表面均匀复合上胶原蛋白。所述细菌纤维素膜由苜蓿根瘤菌产生。

制备方法：

1)细菌纤维素膜的发酵制备：取产纤维素膜的醋酸杆菌活化，得活化菌种，将活化菌种扩大培养，得到种子液，将种子液接种至发酵培养基中发酵得到细菌纤维素发酵液，经过8天发酵后，发酵液液面上层将生成一层细菌纤维素膜，取出待用；

其中，所述的发酵培养基的配方为每500mL中含有：葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、酵母膏2.5g、柠檬酸0.5g、磷酸氢二钠1g、磷酸氢二钾0.5g和蒸馏水余量；

2)细菌纤维素膜的纯化处理：使用注射用水清洗步骤1)得到的细菌纤维素膜，直至所述细菌纤维素膜的pH值为7.0；

将用注射用水清洗过的细菌纤维素膜放入温度为95℃，浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，然后升温至85℃，搅拌2h后取出所述细菌纤维素膜，取出后再加入0.05mol/L柠檬酸溶液中搅拌2h后取出所述细菌纤维素膜，用注射用水清洗至所述细菌纤维素膜的pH为6.0以及所述细菌纤维素膜内的细菌内毒素的含量≤0.03EU/ml，得到纯化的细菌纤维素膜；

3)将纯化后的细菌纤维素膜放入冻干盘内-80℃下冷冻真空干燥24小制备得到硬脑膜基材；

4)胶原蛋白提取工艺：在pH值2.5的条件下，将牛跟腱在浓度为200mg/L胃蛋白酶水溶液中酶解120h；酶解液离心取上清，用饱和盐溶液盐析出胶原蛋白；将盐析出的胶原蛋白利用截留分子量5000规格的透析袋进行透析，透析后的胶原蛋白用0.05mol/L柠檬酸溶液溶解，得到胶原蛋白含量为1.5％的胶原蛋白柠檬酸溶液；

5)将细菌纤维素硬脑膜基材固定于静电纺丝设备接收装置上，将步骤4)得到胶原蛋白含量为1.5％的胶原蛋白柠檬酸溶液转移到注射器中，采用30KV的外加电场强度以及在10cm接收距离范围内进行静电纺丝得到细菌纤维素人工硬脑膜中间品；

6)将步骤4)得到的细菌纤维素人工硬脑膜中间品利用小型压膜机压缩到厚度为0.789mm并裁剪成尺寸为10.0cm×10.0cm，经过内包、外包后送至辐照灭菌机构进行产品钴-60射线灭菌，灭菌剂量为25kGy,灭菌后包装成最终人工生物硬脑膜成品。

对比例1一种人工生物硬脑膜及其制备方法

人工生物硬脑膜组成：同实施例1。

制备方法：除步骤2)中升温至55℃，其余同实施例1。

对比例2一种人工生物硬脑膜及其制备方法

人工生物硬脑膜组成：同实施例1。

制备方法：除步骤2)中升温至125℃，其余同实施例1。

对比例3一种人工生物硬脑膜及其制备方法

人工生物硬脑膜组成：同实施例1。

制备方法：除步骤4)中将透析后的胶原蛋白加入0.03mol/L的柠檬酸溶液中溶解，其余同实施例1。

对比例4一种人工生物硬脑膜及其制备方法

人工生物硬脑膜组成：同实施例1。

制备方法：除步骤4)中将透析后的胶原蛋白加入22mol/L的柠檬酸溶液中溶解，其余同实施例1。

对比例5一种人工生物硬脑膜及其制备方法

人工生物硬脑膜组成：细菌纤维素和胶原蛋白质量比为0.05:10，通过静电纺丝的方式，使细菌纤维素膜上下表面均匀复合上胶原蛋白。

制备方法：同实施例1。

对比例6一种人工生物硬脑膜及其制备方法

人工生物硬脑膜组成：细菌纤维素和胶原蛋白质量比为3.5:10，通过静电纺丝的方式，使细菌纤维素膜上下表面均匀复合上胶原蛋白。

制备方法：同实施例1。

对比例7按照现有技术制备主要成分为细菌纤维素与聚乙烯醇的人工生物硬脑膜

1)菌株选择：选择木醋杆菌，中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)编号No.1.1812；

2)含海藻酸钠种子及液体培养基制备：在以重量百分比计含2％的果糖、0.5％的酵母粉、0.5％胰蛋白胨、0.5％Na2HPO4、0.2％柠檬酸和2％碳酸钙的液体培养基中添加0.5g/L的海藻酸钠，然后调节培养基的pH值为6，在121℃的温度下灭菌20min，冷却至30℃后备用；

3)种子细胞培养：取1环活化好的斜面种子接入含海藻酸钠的液体培养基中，30℃振荡培养24小时，摇床转速为160r/min，得种子液；

4)静态液体发酵生产细菌纤维素：以体积百分比为6％的接种量将种子液接种到含海藻酸钠的液体培养基中，充分振荡使菌液均匀，30℃静置培养8天，有生成的细菌纤维素膜浮于液面；

5)细菌纤维素膜纯化：取生成的细菌纤维素膜，用水冲洗8次，除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液中，100℃煮20min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.0时，冲洗停止，得细菌纤维素湿膜；

6)将细菌纤维素湿膜切成1cm2的小块，置于盛有水的容器中，采用超声波破碎，得细菌纤维素匀浆；

7)测定细菌纤维素匀浆的含水量为95％(V/V)；

8)将水溶性高分子助剂聚乙烯醇(PVA，分子量为3.5万，聚合度为600，醇解度为97％)配制成质量浓度为15％的溶液；

9)以细菌纤维素匀浆的含水量为95％计，将所述细菌纤维素匀浆与浓度为15％的聚乙烯醇溶液按照1∶2的比例均匀混合；

10)将混合物均匀的铺在模具中，并使其厚度为0.26mm～0.90mm，然后置于-20℃条件下冷冻20小时；

11)然后放在真空冷冻干燥机内冻干24小时，得成形的人工硬脑膜。

对比例8按照现有技术制备具有三螺旋结构的胶原材料的人工生物硬脑膜

1)将1kg的牛跟腱组织冷冻并切割成厚度为1毫米的薄片，经筛选，在搅拌条件下将其浸泡在0.1％的氢氧化钠溶液中浸泡1小时，使其酸碱度保持中性，将1∶5(w/w)的无花果酶加入上述处理的物质溶液中充分反应，伴有定时搅拌，其后用1％的硝酸铵处理6小时，然后清洗，再加入1mol/L的氯化钠再处理并控制温度，调节酸碱度，4℃下静置过夜，然后用2mol/L的氢氧化钠溶液反应，再用50％硫酸中和缓冲并调节酸碱度使其呈偏酸性，取出沉淀物，水洗浸泡6小时，然后去除水份，通过冷冻干燥得到保持胶原特有三螺旋结构的I型医用胶原材料；

2)取步骤1)制备的具有三螺旋结构的I型医用胶原材料，将3.6克胶原溶于720毫升0.1mol/L的冰醋酸中，制成0.5％浓度的胶原悬浊液，在高速低温搅拌条件下(20,000转/分；4℃)在2小时内加入6-硫酸软骨素，得到0.5％的复合悬浊液；

3)将720毫升步骤2)制备的复合悬浊液倒入30×150厘米的冷冻托盘中，放入冷冻干燥机冷柜进行冷冻干燥；

冷冻的程序设置为：-7℃，30分钟，呈持续状态；-40℃，200分钟，呈曲线状态；-40℃，70分钟，呈持续状态，过程中冷冻干燥机冷柜的温度保持-80℃；干燥阶段的温度设置为0℃，保持18小时；二次升温的温度设置为20℃，时间为40分钟；上述所有程序进行过程中真空度设置在200毫托；

4)将步骤3)冷冻干燥得到的产品放入真空烤箱内，其设置负1个大气压，在温度105℃下处理24小时；

5)将步骤4)得到产品进一步在消毒器内使用30％纯环氧乙烷加70％的二氧化碳进行灭菌，灭菌温度为54℃，灭菌湿度为60％RH，预真空为-20Kpa，换气真空度为-40Kpa，换气次数为8次，灭菌3.5小时，制备得到孔隙275微米、5毫米厚的人工生物硬脑膜。

实验例1人工硬脑膜产品内毒素含量测试

临床上内毒素含量高低是衡量产品使用安全与否的指标之一，产品内毒素含量越低，引起临床不良反应的机率越小，产品临床使用更加安全。

本实验例对实施例1-6和对比例1-8分别制备的人工硬脑膜产品的内毒素含量进行了测试，根据FDA要求，接触脑脊液的医疗器械限值为低于2.15EU/件或0.06EU/ml。具体测试过程如下：

测试对象：实施例1-6和对比例1-6制备的人工硬脑膜。

测试原理：利用《药典》2015版方法对产品内毒素含量进行检测，确定产品内毒素含量。

具体测试过程如下：

分别取各系样品准确称量，按照GB/T 16886.12-2005医疗器械生物学评价第12部分：样品制备与参照样品中方法进行浸提(按6cm²/mL比例进行浸提)，按照《中华人民共和国药典》2015版四部1143细菌内毒素法进行检测,含量越低表明产品生物安全性越好,每组检测5个样品后求平均值并记录，测试结果如表1所示：

表1人工硬脑膜产品内毒素含量

可见，与对比例1-6和现有技术(对比例7和对比例8)相比，本发明(实施例1-6)提供的人工生物硬脑膜的内毒素含量更低，产品使用更安全，并且采用实施例1中的方法制备的人工生物硬脑膜的内毒素含量最低，为0.125EU/件。

实验例2人工生物硬脑膜产品力学性能测试

本实验例对实施例1-6和对比例1-8制备的人工硬脑膜产品的力学性能进行测试，具体测试过程如下：

测试原理：根据相关行业标准和产品技术要求测试产品各项力学性能是否满足临床应用需求；

力学性能具体包括：拉伸强度不低于3.0MPa，断裂伸长率不低于20.0％，顶破强度不低于32.0kPa和缝合强度不低于10.0N；

具体测试过程如下：

2.1按照产品技术要求分别从每组抽取5个样品检测产品拉伸强度并记录平均值，测试结果如表2所示：

表2各人工硬脑膜产品拉伸强度结果

2.2断裂伸长率具体测试过程如下：

按照产品技术要求分别从每组抽取5个样品检测产品断裂伸长率并记录平均值，测试结果如表3所示：

表3各人工硬脑膜产品断裂伸长率结果

组别	断裂伸长率	检测结果
			实施例1	30.5％	合格
实施例2	26.4％	合格
			实施例3	27.3％	合格
实施例4	27.8％	合格
			实施例5	24.3％	合格
实施例6	27.6％	合格
			对比例1	18.1％	不合格
对比例2	19.6％	不合格
			对比例3	17.2％	不合格
对比例4	18.1％	不合格
			对比例5	12.7％	不合格
对比例6	10.8％	不合格
			对比例7	20.1％	合格
对比例8	21.6％	合格

2.3顶破强度具体测试过程如下：

按照产品技术要求分别从每组抽取5个样品检测产品顶破强度并记录平均值，测试结果如表4所示：

表4各人工硬脑膜产品顶破强度结果

2.4缝合强度具体测试过程如下：

按照产品技术要求分别从每组抽取5个样品检测产品缝合强度并记录平均值，测试结果如表5所示：

表5各人工硬脑膜产品缝合强度结果

综合表2-5可见，相比对比例1-6和现有技术制备的人工生物硬脑膜，本发明提供的人工生物硬脑膜力学性能(具体包括拉伸强度、断裂伸长率、顶破强度和缝合强度四个方面)具有显著的优势，能够满足临床使用需求。

以上所述仅为本发明具体实施方式，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人工生物硬脑膜，其特征在于，所述的人工生物硬脑膜的原料由细菌纤维素和胶原蛋白组成。

2.根据权利要求1所述的人工生物硬脑膜，其特征在于，所述人工生物硬脑膜由细菌纤维素和胶原蛋白通过静电纺丝的方式组合而成。

3.根据权利要求2所述的人工生物硬脑膜，其特征在于，所述细菌纤维素膜上下表面均匀复合上胶原蛋白。

4.根据权利要求3所述的人工生物硬脑膜，其特征在于，所述细菌纤维素膜与胶原蛋白质量比为0.1-3.0:10。

5.根据权利要求4所述的人工生物硬脑膜，其特征在于，产生细菌纤维素膜的由微生物菌种选自醋酸菌属、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属和土壤杆菌属中的一种。

6.根据权利要求5所述的人工生物硬脑膜，其特征在于，产生细菌纤维素膜的由微生物菌种选自醋酸菌属、根瘤菌属和八叠球菌属中的一种。

7.一种权利要求1-6任一项所述的人工生物硬脑膜的制备方法，包括以下步骤：

1)细菌纤维素膜的发酵制备：微生物菌种活化，扩大培养，得到种子液，并将种子液接种至发酵培养基中培养，得到液面上层生成一层细菌纤维素膜的发酵液，将细菌纤维素膜取出待用；

2)细菌纤维素膜的纯化处理：清洗步骤1)得到的细菌纤维素膜，然后放入无机碱溶液中，搅拌后取出，再放入柠檬酸溶液中搅拌，再次取出，清洗，得到纯化的细菌纤维素膜；

3)将步骤2)得到的细菌纤维素膜干燥，得到硬脑膜基材，备用；

4)将牛跟腱酶解，酶解液离心取上清，盐析出胶原蛋白，透析，溶解，得到胶原蛋白溶液；

5)将步骤3)的硬脑膜基材固定于静电纺丝设备接收装置上，将步骤4)的胶原蛋白溶液转移到注射器中，进行静电纺丝得到细菌纤维素人工生物硬脑膜中间品；

6)将步骤5)得到的细菌纤维素人工生物硬脑膜中间品压缩并裁剪，经过内包、外包、灭菌、包装后，即得。

8.根据权利要求7所述的人工生物硬脑膜的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中细菌纤维素放入无机碱溶液中后，升温至70-120℃。

9.根据权利要求7所述的人工生物硬脑膜的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中无机碱溶液为氢氧化钠溶液，浓度为0.01-5.0mol/Lol/L。

10.根据权利要求7所述的人工生物硬脑膜的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中透析后的胶原蛋白加入0.01mol/L-5.0mol/L的柠檬酸溶液中溶解，胶原蛋白含量范围为0.01％-2.0％。