JP2001508754A

JP2001508754A - 移植可能なものとしての合成タンパク質

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Publication number: JP2001508754A
Application number: JP52357195A
Authority: JP
Inventors: カペロ，ジョセフ
Original assignee: プロテインポリマーテクノロジーズ，インコーポレイティド
Priority date: 1994-03-11
Filing date: 1995-03-10
Publication date: 2001-07-03
Anticipated expiration: 2018-02-17
Also published as: EP0804595B1; CA2183644A1; EP0804595A1; DE69535895D1; EP0804595A4; ATE417111T1; JP3378254B2; US6380154B1; US5606019A; WO1995024478A1; US20030176355A1; US20020045567A1

Abstract

(57)【要約】エラスチンとフィブロインの反復単位の変化比をもつコポリマーを提供する。エラスチンとフィブロイン反復単位のセグメントの長さを変えることにより、その吸収を大きく変化させることができる。引っ張り強さは、規定されたレンジ内でその組成に拘らず比較的一定のままである。本コポリマー組成物及び組換えフィブロインを、インプラントとしての使用のための多種多様な２次成型物品及び非晶質塊の製造のために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】移植可能なものとしての合成タンパク質導入技術分野本発明の分野は、生物学的吸収性ポリペプチド・ポリマーの製造及び使用である。背景移植された材料が体内に吸収され又は生物学的に分解する速さは、生体材料(b iomaterial)としてのその用途の決定において大きな要因であることができる。いわゆる、不活性材料、例えば、金属、セラミック及びプラスチックは、永久インプラントのために有用であることが示されている。しかしながら、デバイスが治癒のための助けとして又は外科手術修復における一次的な助けとして役立つような適用においては、再吸収性材料は、一旦、治癒が生じれば、除去される必要がないという利点をもつ。再吸収性縫合糸及びステープル、骨ピン及びスクリュー、外傷包帯、及び注射可能なドラッグ・デリバリー・システム又は貯蔵物（de pots）が、このようなデバイスの例である。有害な結果を伴わずに体内で分解・吸収されなければならない医療デバイスの製造に必要な物理的・化学的及び生物学的特性をもつ今日入手可能な材料は、ひじょうに少ない。さまざまな合成有機ポリマー、例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリアンヒドリド及びポリホルトエステルであって、加水分解により体内で分解するものが利用されてきた。コラーゲン、グリコサミノグリカン及びヒアルロン酸が、酵毒分解により少なくとも部分的に吸収される天然の移植可能な材料の例である。再吸収の速度は、特定の材料の性質に限定され、そして修飾が、再吸収の速度を変化させることができるが、同時に、その製品の所望の特性に悪影響を及ぼすかもしれない。組成の変更による再吸収特性を変化させる努力の例は、ラクチドとグリコリドとのコポリマーから成る合成再吸収性縫合糸である。乳酸対グリコール酸の比を変化させることにより、再吸収の速度を変化させることができる。不幸なことに、速い吸収性の組成物は、柔らかく、そして弱い傾向がある。遅い吸収性の組成物は、硬く、そして強い。しかしながら、加水分解性であるそれらの再吸収は、浸食がそのポリマー表面において生じる場合、その組織媒体により緩衝液化された酸を作り出す。さらに、しかしながら、その得られた酸がそのポリマーの分解を触媒し、そして加速する場合、加水分解は内部に生じることができる。従って、分解の内部のポケットは、機械特性の速く、かつ、突然の破壊（catastrophic failure）を導くことができる。それ故、移植可能なデバイスの製造において使用されることができる製品についての要求が存在する。このような製品は、引っ張り強さ、弾性、２次成形適性 (formability)その他の所望の機械特性をもち、制御された再吸収を提供し、そして生理学的に許容されるものでなければならない。関連文献米国特許第5,243,038号は、小さな反復単位の長いセグメントを含んで成る、高分子量の、タンパク質ポリマー及びコポリマーの製造について記載する。Bioa ctive Polymeric Systems，Gebelein，C.G．and Carraher，C.E.，eds.，Plenum Press，New York，1985； Contemporary Biomaterials，Boretos，John W．and Eden，Murray，eds.，Noye s Publications，New Jersey，1984；及びConcise Guide to Biomedical Polyme rs；Their Design，Fabrication and Molding，Boretos，John W.，Thomas pub. ，Illinois，1973は、生体材料の組成、特性、及び用途について記載している。発明の要約フィブロイン(fibroin)とエラスチン(elastin)に基づく、反復単位の数において変化するセグメントをもつタンパク質コポリマーを、提供する。このタンパク質コポリマー及び絹のホモポリマーは、多種多様な移植可能なデバイス及びその成分の製造において利用される。特定の態様の説明移植可能なデバイス及びその成分であって、エラスチンとの組合せにおけるフィブロイン（絹）に基づく反復単位の変更セグメントをもつ組換え新規コポリマーはフィブロインの組換えポリマーから成るものを提供する。特に、大部分についての単位は、それぞれ、GAGAGS（配列番号：１）とVPGVG(配列番号：２)である。但し、いくつかのバリエーション、例えば、その配列内でのアミノ酸の特定の順番及び保存的置換、例えば、非限定的であるが、セリンをトレオニンで置換し、そしてグリシンをアラニンで置換することが許容される。上記コポリマーにおいては、上記２つの異なる単位の比、上記単位の各々を含んで成るセグメントの長さ、分子量、いずれかの介在配列、個々の反復単位に対する修飾その他を変えることにより、ある者は、再吸収の速度を実質的に変化させることを可能にしながら、ある者は、ほんの中程度にその製品の引っ張り特性、例えば、弾性、剛性、硬度、加工容易性、及び柔軟性を変化させることができる。より速い再吸収は、個々に又は組合せにおいて、絹セグメント内の絹の反復単位の数を約８単位未満に減少させ、又はエラスチン・セグメント当りのエラスチン単位の数を８を超えて増加させることにより、達成されることができる。上記コポリマーについては、その反復単位のセグメント当りのエラスチン単位の平均数対絹単位の平均数の比は、約0.5、通常、約１〜５のレンジ内にあるであろう。大部分については、セグメント当り少なくとも２の、かつ、約12以下、通常、約10以下、好ましくは、約２〜８のレンジにあるフィブロイン単位が存在するであろう。エラスチン単位については、通常、少なくとも２、より普通には少なくとも約４、一般的には約６〜32、より普通には約6〜18、好ましくは約6〜 16のレンジにあるものが存在するであろう。この絹単位の一因となるアミノ酸のパーセントは、一般的には約15〜65％、より普通には約15〜60％、好ましくは約 20〜55％のレンジにあるであろう。本発明において利用されるコポリマーは、一般的に約15〜80％の、フィブロイン単位により提供されたアミノ酸のレンジにあり、エラスチンの平均数対絹単位の平均数は、約０〜８のレンジにあるであろう。これらのポリマーは、少なくとも約15kDaであり、そして一般的には約150kDa 以下、通常約125kDa以下、好ましくは約35〜100kDaのレンジにあるであろう。上記コポリマーを達成するために、セグメントの数が、所望の分子量を提供するであろう。それ故、セグメントの数は、それぞれの個々のセグメントのサイズに依存して、広く変化することができる。従って、セグメントの数は、約２〜40、より普通には約６〜20のレンジにあることができる。本製造方法に基づき、そのＮ−及びＣ−末端に非反復単位が存在することができる。通常、末端配列は、そのアミノ酸の10数パーセント末端、より普通には、そのアミノ酸の５数パーセント末端を占めるであろう。一般的に、この配列は、約０〜125アミノ酸、より普通には０〜60アミノ酸のレンジにあるであろう。ここで、アミノ酸の全体数は、一般的に約100アミノ酸を超えず、より普通には約5 0アミノ酸を超えないであろう。特別な用途のために、上記ポリマーは、セグメント又はセグメントのブロオク間に介在配列を導入することにより修飾されることができる。ここで、ブロック当りの反復単位の全体数は約４〜40において変化することができ、これ故、２以上のセグメントを含む。この介在配列は、約１〜60、通常約３〜40アミノ酸を含むことができ、そして多種多様な特性を提供することができる。例えば、化学的に反応性の側鎖をもつアミノ酸を含むことにより、ある者は、さまざまな化学的又は生理学的に活性な化合物を結合するための、架橋のための、再吸収の速度、引っ張り強さその他を変化させることができる共有結合化合物のための部位を提供することができる。従って、アミノ酸、例えばシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン及びアルギニンが、これらの介在配列内に取り込まれることができる。あるいは、この配列は、生理学的な活性、例えば細胞結合性、特異的タンパク質結合性、酵素異質性、特異的レセプター結合性その他をもつ配列を提供することができる。このやり方で、上記基本タンパク質の有用な特性が、特別な用途にあつらえられながら、意図された使用に従って大きく変えられることができる。上記ポリマーは、多種多様な製品を作るために良好な機械特性をもつ。タンパク質ポリマーは、製造物、例えばフィルム、２次成型物品、繊維、又は非成型構造物、例えば非晶質の塊その他の形成するための公知方法に従って、圧伸成型（drawn）、成型（molded）、注型（cast）、紡糸（spu n）、押出（extruded）、その他されることができる。また、ゲルであって、特定の用途に依存して、さまざまな方法で形状化されることができるものが、形成されることができる。上記組成物は、無菌製品を提供するために常法により滅菌されることができる。本組成物は、多種多様なデバイス、例えば、膜、縫合糸、ステープル、骨ピン、スクリュー、外傷包帯、及び医薬貯蔵物のようなものであって、移植前又はその場で形成されることができるようなものを提供するために使用されることができる。形成された組成物は、特定の用途のために必要な機械特性を提供することが見い出され、その再吸収時間は、構造の完全性のために必要な時間にわたり機械的メンテナンスを確保するように、そして同時に、その材料が再吸収を経験することによりそのデバイス又は材料が手で取り出される必要がないことを保証するように、制御されることができる。本組成物は、外傷包帯又は外科手術接着の防止のための膜の如き用途のために、より大きなレンジの物理的及び生物学的特性を提供するようにブレンドされた材料を作り出すために、他の材料、例えばコラーゲン、フィブリノーゲン、及び他の天然タンパク質；ヒアルロン酸、デキストラン、又は他の多糖類；又はポリエチレン・オキシド、ポリヒドロキシアルカノエート、又は他のポリエステルとの組合せにおいて使用されることができる。例えば、等重量比においてヒアルロン酸ナトリウムと組合されたタンパク質・ポリマーSELP３であって、純粋なヒアルロン酸塩ゲルと比較して、より大きな機械的靱性及び低下された吸収速度を示すフィルムを製造するために使用されることができる。本組成物は、米国特許第5,243,038号中に記載されているやり方に従って製造されることができる。この手順は、１のセグメント又は複数のセグメントを形成するように一緒にライゲートされることができる、付着末端をもつ複数の断片を提供するために約15〜150ヌクレオチドの１本鎖のDNAの小さなセグメントを合成することを含む。第１のds DNA断片が、適当な配列を確保するためにクローン化され、その後、連続断片の付加を行い、次にこれをその配列の完全性が保持されていることを確保するために、クローン化され、そして特徴付けされる。これらの断片が一緒に結合されて“モノマー”が作られ、これが次にそのポリマーの大きな反復構築ブロックとなる。あるいは、一般的に少なくとも100ヌクレオチド及び約300ヌクレオチドまでをもつ長い１本鎖が、調製、クローン化、そして特徴付けされ、ここで、その２つの１本鎖がハイブリダイズされ、クローン化され、そして特徴付けされ、そして次にそのモノマーは構築ブロックとして役立つことができる。次に、これらのモノマーは、そのポリマーについて２以上のモノマーが存在するであろうように、相補的末端、特に付着末端をもって、マルチマー化されることができる。これらのマルチマーは次に、適当なベクター内にクローン化され、モノマー数及びポリマーの選択された所望サイズを決定するために特徴付けされる。発現は、発現宿主内で機能的である転写調節領域を使用してその発現宿主内で達成されることができる。この発現宿主は、原核又は真核生物、特にバクテリア、例えば、大腸菌（E.coli）、枯草菌（B.subtitis）、等；酵母、例えばサッカロミセス（Saccha romyces ）、ニューロスポラ（Neurospora）、等；昆虫細胞、植物細胞その他であることができる。適宜、シグナル配列が、ポリマーの分泌のために提供されることができる。多種多様のシグナル配列が知られており、そしてその発現細胞によっては正常には分泌されないタンパク質を分泌させるために広く使用されてきた。発現完了後、そのタンパク質がその宿主内に保持される場合、それらの細胞は破壊され、そしてその生成物がその溶解物から抽出される。その生成物が分泌される場合、その生成物は、その上清から単離されることができる。いずれの場合においても、その生成物がその媒質中で可溶性であるか又は不溶性であるかに依存して、それらの生成物を精製するためのさまざまな技術を、使用することができる。不溶性である場合、不純物は、そのポリマーを傷付けることなく、そのポリマーから抽出されることができる。可溶性である場合には、そのポリマーは、常法、例えば抽出、クロマトグラフィーその他により精製されることができる。以下の実施例を、限定のためでなく、説明のために提供する。実施例実施例１．ポリマーの製造以下表１中に示す各ポリマーをコードする対応プラスミドを含む大腸菌（E.co li）株EC３を、米国特許第5,243,038号中に記載された方法に従って作出した。次に各株を、フェッド−バッチ法を使用して発酵させた。各ポリマーについてのバイオマスを、10℃において30分間の5,000rpmにおけるＨ6000Ａローターを使用したSorval RC3B内での遠心分離によりその発酵ブロスから収穫して、充填細胞ペーストを得た。500グラムの細胞ペーストを、２リッターの50mM Trisバッファー（pH＝8.0）中に再懸濁した。この細胞スラリーを、その液体の３つの全通過をもって７〜8,000psiにおけるManton Gaulin細胞ディストリビューターを使用してホモジェナイズした。この細胞ホモジェネートを、その温度を15℃以下に維持するために冷却された熱交換器を通過させた。膵臓DN Aseを、そのホモジェネートに１μｇ／mlの最終濃度まで添加し、そして２時間室温において撹拌した。このホモジェネートを、10℃において１時間5,000rpmにおいてＨ6000Ａローターを用いた遠心分離機内で遠心分離した。 SELP０，３，７、及び８のために、上記上清を、12−14,000分子量カット−オフ透析バッグ内に入れ、そして24時間、100倍容量の20mM酢酸ナトリウム・バッファー（pH＝4.7）の２回交換に対して透析した。これらのバッグの内容物を遠心分離機ボトルに移し、そして10℃において１時間5,000rpmにおいてＨ6000Ａローターを使用してSorval RC3B遠心分離機内で遠心分離した。この上清を、大きなビーカーに取り出し、そしてそのpHを30％水酸化アンモニウムの添加により8. 0に調節した。次に飽和硫酸アンモニウムを、SELP０について20％、SELP８について25％、そしてSELP７について33％の最終濃度に達するまで添加した。この溶液を１時間室温において撹拌した。この溶液を10℃において30分間5,000rpmにおいてＨ6000Ａローターを使用してSorval RC3B内で遠心分離した。このペレットを、２リッターの脱イオン水中に再懸濁し、透析バッグ内に入れ、そして48時間にわたり100倍容量の脱イオン水の３回交換に対して透析した。これらのバッグの内容物を棚凍結させ、そして凍結乾燥させた。 SELP4と５のために、遠心分離されたホモジェネート上清を、25％の濃度において硫酸アンモニウムを用いて直接的に沈殿させた。次にこの溶液を、10℃において１時間5,000rpmにおいてＨ6000Ａローターを用いてSorval RC3B内で遠心分離した。このペレットを５リッターの４Ｍ LiBr中に再懸濁し、そして16時間４ ℃において撹拌した。この溶液を１時間10℃において5,000rpmにおいてＨ6000Ａローターを用いてSorval RC3B遠心分離機内で遠心分離した。この上清のpHを、４℃において１Ｍ酢酸のゆっくりした添加によりpH3.7に調整した。この溶液を、１時間10℃ において5,000rpmにおいてＨ6000Ａローターを用いてSorval RC3B内で遠心分離した。この上清のpHを、水酸化アンモニウムの添加により8.0に調整し、そして次に48時間にわたり100倍容量の脱イオン水の３回交換に対して透析した。この溶液を、透析から取り出し、そして１時間10℃において5,000rpmにおいてＨ6000 Ａローターを用いてSorval RC3B内で遠心分離した。飽和硫酸アンモニウムを飽和の25％に達するまでその上清に添加し、そして１時間撹拌した。この溶液を、１時間10℃において5,000rpmにおいてＨ6000Ａローターを用いてSorval RC3B内で遠心分離した。このペレットを、4.5Ｍ LiBr中に溶解し、透析バッグ内に入れ、そして100倍容量の脱イオン水の３回交換に対して透析した。これらのバッグの内容物を、棚凍結し、そして凍結乾燥した。以下の手順において使用された全ての試薬溶液を、10,000公称分子量カット− オフ中空繊維カートリッジ(AG Technologies)を通しての濾過により使用前に脱発熱因子した。使用した全てのガラス容器及び器具を、４時間180℃において加熱することにより滅菌及び脱発熱因子した。４〜５グラムの全SELP乾燥ポリマーを、１，２リッターの10Ｍ尿素中に溶解した。20mlの２mlの２Ｍ Tris pH8.0 及び780mlのmilli-Ｑ水を添加した。この溶液を、上記タンパク質の完全な溶解を促進するために音波処理した。500ｇのWhatman DE 52イオン交換樹脂を、各々の使用前及びその間に製造者により推奨されるように酸及び塩基処理を通じての前サイクル化により調製した。この樹脂を、緩やかに撹拌しながらビーカー内で６Ｍ尿素、20 mMTris pH8.0を用いて最終的に平衡にした。この樹脂を過剰の液体が除去されるまで、ブフナー漏斗内で濾過した。樹脂のケーキをビーカー内に入れ、そして上記タンパク質溶液を添加した。このスラリーを、１時間緩やかに撹拌した。このスラリーをブフナー漏斗内で濾過し、そしてその液体をきれいな真空フラスコ内に集めた。500グラムの新たな前サイクル化し、そして平衡とされた樹脂をきれいなビーカーに添加し、そして上記の濾過された溶液を添加した。このスラリーを１時間緩やかに撹拌し、そして再び濾過した。この濾過さた濾液を、もう一度500グラムの新たに前サイクルされ、そして平衡化した樹脂と併合し、１時間撹拌し、そして濾過した。最後の濾過溶液を、少なくとも24時間0.5Ｎ NaOH中に浸潰された6,000分子量カット−オフ透析バッグ中に入れた。透析された溶液をこのバッグから取り出し、脱発熱因子された凍結乾燥フラスコ内に入れ、そして凍結乾燥した。上記手順を使用して、以下のポリマーを調製した。表１ ¹各ポリマーの最初と最後のブロック・ドメインは、両部分が合計して全ドメインになるように絹ブロック内で分割される。全ポリマーは、その全アミノ酸の約６％を構成する追加の頭及び尾配列をも含む。²反復ドメイン当りの連続ブロックの数を示す（Ｅ＝エラスチン様ブロック、Ｓ＝絹様ブロック） ³ポリマー当りのブロックの比 ⁴絹様ブロックの一因となるポリマー内の全アミノ酸の％調製された他のポリマーは、SELP６といわれる、〔(VPGVG)₃₂(GAGAGS)₈〕（配列番号：９）を含む。実施例２．SELPフィルム約0.05mm厚であったSELPフィルムを、溶媒蒸発により製造した。 1.05グラムだけを使用したSELP７を除き、約1.7グラムの各ポリマーを、347ml の88％ギ酸中に溶解した。この溶液を７時間室温において撹拌して完全な可溶化を確保した。次にこの溶液を、取外し可溶なポリエチレン底をもつ長方形のポリエチレン・トラフから本質的に成るフィルム注型装置内に注いだ。この注型装置を、大気に散布するため窒素ガス源に接続された真空オーブン内に入れた。このフィルムを、60〜75℃において窒素ガスの遅い連続流入により10〜15ミクロン真空を吸引しながら上記密閉オーブン内で乾燥させた。15〜18時間の乾燥後、この装置を解体し、そしてそのフィルムをそのポリエチレン底から剥離した。これらのフィルムを、残存ギ酸を中和するために塩基性雰囲気（密閉デシケーター内の水酸化アンモニウムの５％開溶液）に５分間晒した。上記タンパク質フィルムと同じ面積寸法のポリエチレン・シートを、細かいグリットのサンド・ペーパーを用いて手で粗くし、そしてシアノアクリレート糊の薄いフィルムをその表面上に広げた。このタンパク質フィルムを、その湿った表面上に適用した。テフロン・シートを、そのポリエチレンとタンパク質層の上下に置き、そしてステンレス・スチールのプレートをそれらの周りに置いた。そのアセンブリー全体を、室温において18時間0.8メートル法トンの力でCarver実験室プレス内で圧力をかけた。このポリエチレン／タンパク質フィルム・ラミネート・シートを、カッティング・ボード上に置き、そして1.3cm直径のディスクを、ステンレス・スチール・パンチ及びゴム小槌を使用して穴開けにより得た。これらのディスクを、フタ付きガラス・バイアル内に個々に入れた。試料を、上記ポリマーの各々並びにSELPフィルムについて記載したのと同じように調製した変性コラーゲン・タンパク質(DCP)から調製した。ウシ・コラーゲン（フィブリルの形態、ロット番号921101）を、Colla-Tec，Inc．(Plainsboro ，NewJersey)から得た。それを、88％ギ酸中に完全に溶解して透明であるが粘性の溶液を作った。全試料を、2.5＋／−0.2Ｍラッドにおける電子線照射により滅菌した。各ディスクを、そのタンパク質フィルムが筋肉組織と直接接触するように、ラットの背中に皮下移植した。これらの試料を、異なる時間期間：移植後１，４、及び７週間にわたりその動物内に残した。各時間間隔において、ポリマー群当り６つの試料を、タンパク質分折のために回収した。各群からの追加の試料を、組織学により組織反応について評価した。非移植及び回収試料を、試料当りに含まれたSELPフィルムの質量を測定するために分折した。アミノ酸分折を、定常沸騰塩酸を含む加水分解バイアル内にそれらを別々に密封し、そして100〜110℃において24時間加熱することにより各試料について行った。加水分解後、その試料を抽出し、そしてその抽出物のアリコートを、PTCを用いて誘導体化した。誘導体化されたアミノ酸を逆相HPLCにより分離し、そしてHenrickson and Meredith（Anal．Biochem．137，65-74，1984）の方法に従って254nmにおけるそれらの吸収により定量した。各試料上に存在するSELPフィルムの質量を、測定した。このSELPタンパク質のアミノ酸寄与を、その純粋ポリマーについては＞95％である、アミノ酸Ｇ，Ａ，Ｓ，Ｖ及びＰの全含量に基づいて推定した。体内での残留の間にその試料上に沈着した外因タンパク質を潜在的に一因とする他のアミノ酸を、これらの分折から除外した。非移植試料についての平均SELPフィルム質量を、移植のために使用した同一バッチの試料から測定した。回収された試料についての平均SELPフィルム質量を同様に計算した。但し、平均から２標準偏差より大きな値をもつ２連値を廃棄した。多くの場合において偏差は、移植後にその組織内で断片化された試料の部分的修正に起因し、そして真の再吸収を反映することができない。再吸収分折及び結果再吸収分折を、４つの試料集団処理群を分折することにより統計的に行った。これらは、（１）非−移植；（２）移植後１週間後；（３）移植後４週間後；そして（４）移植後７週間後、であった。表２ (ミリグラムにおける)アミノ酸組成分析により測定されたポリマー・フィルムの残存質量表３非移植質量のパーセントとしての残存ポリマー・フィルム表２からの結果は、移植後の試料上に含まれるタンパク質フィルムの質量についての値である。各々の値は、アミノ酸組成により測定されるような少なくとも５つの試料質量の平均値である。表３は、非移植試料の６つの試料の平均質量により測定されるような移植前の開始重量のパーセントとしての上記と同じ値を表す。これらの結果は、移植の間、SELP０とDCPが、１週までに実質的に再吸収され、それらの非移植質量の５％未満に低下することを示している。SELP７は、ほんの5.8％残存をもって４週までに実質的に再吸収される。SELP８とSELP３は、それぞれ18.1％と58.2％残存の平均値をもて７週までに再吸収されている。SELP ４とSELP5は、７週目において全く再吸収の証拠を示さない。上記の結果から、ある者は、以下のように結論することができる。より速い再吸収は、８より少ない絹様ブロックのドメインを含む組成と相関関係にある。８つの絹様ブロックを含むポリマーは、実質的に減少された再吸収をもつ。しかしながら、このコポリマー成物中の絹様ブロックの全含量は、再吸収速度と相関関係にない。ひじょうに類似した組成をもつSELP7とSELP８は、速く再吸収されるけれども、SELP４とSELP５は、７週間以内に再吸収されない。移植後７週目におけるSELP４とSELP5フィルムの再吸収の欠如は、８より大きなエラスチン−様ブロックを含む反復ドメインと相関関係にある。それらの絹様ブロック長は８において同一であるけれども、12と16のエラスチン−様ブロック長をもつSELP4と５は、８のエラスチン−株ブロックをもつSELP３よりも小さな程度に再吸収される。本ポリマーは、それらの組成にも拘らず、容易な取扱いを許容するのに十分な長さをもって自耐性フィルムを形成する。SELP7とSELP４フィルムは、それぞれ、19＋／−１と21＋／−８MPaの引っ張り強さをもつ。SELP７が４週間以内に再吸収され、そしてSELP４が７週間を超えても残存することを生じさせるこれらの間の組成の相違は、それらの引っ張り特性における小さな見かけの相違を作り出す。これらの強さは、外科手術及び外傷治癒用途におけるそれらの使用のために適切なものである。これらのポリマーの観察された再吸収は、表面浸食を介して生じる。これは、体内のSELPタンパク質の分解のメカニズムに矛盾しない。生理学的条件においては、タンパク質は、プロテアーゼの作用を通じてのみ分解するであろう。内因性プロテアーゼは、約20kDa以上の高分子量化合物であり、密なSELPフィルム中へのそれらの拡散は、制限されるであろう。それ故、SELPフィルムの分解は、その材料の外部表面から進行する。それ故本材料は、質量において減少されながら機械的完全性の遅い損失を経験するはずである。実施例３．SELP多孔性スポンジ移植された材料の機能は、その形態、形態学、及び機械強度に大きく依存し、 SELPポリマーは、さまざまな形態；密なフィルム、多孔性スポンジ、及びフィブリル・マットに形づくられてきた。上記のような密なフィルム又はシートは、液体又は気体の流れを制限し、細胞転移を遮断し、組織分離を維持し、そして移植された臓器又はデバイスの輪郭を定め、そしてそれを保護することにより、外科手術修復における用途をもつことができる半透過性バリアである。それらの特性は、それらの透過性及び0.05mmから１mmを超えるまでのレンジにあることができるそれらの厚さに依存して変化するであろう。例えば、それらの厚さを変えることは、それらの機械強度、それらの摩耗抵抗性、及びそれらの最終的な再吸収に影響を及ぼすであろう。 SELPポリマーは、細胞及び組織の内成長を支持するであろう移植可能な材料として役立つように３次元の多孔性スポンジとして作られてきた。 SELP５スポンジの調製タンパク質ポリマーと接触する全てのガラス容器を、６時間180℃に加熱することにより脱発熱因子した。SELP5（0.978g）を溶解して1.0ｗ／ｖ％の水性溶液を得るまでLAL試薬グレード水中で撹拌した。この溶液を、100mlのSt24／40なし形フラスコに無菌的に移し、そして秤量した。このフラスコに、スプレー・トラップを固定し、ロータリー・エバポレーターに接続し、そして65.2ｇの水を、39 ℃の浴温度、42mbarの系圧、及び125rpmの回転速度を用いて蒸発させて、3.0ｗ／ｖ％濃度の溶液を得た。この溶液を６つの標準滅菌ペトリ皿（mm直径）内に深さ６mmまで注ぎ；標準蓋でカバーし；小さなプラスチック・トレー上に置き；そして一夜−８℃フリーザー内に置いた。冷凍後、それらの蓋をそのペトリ皿から外し；それらのペリ皿を1200mlの凍結乾燥フラスコ内に入れ、そして凍結乾燥した。凍結乾燥の完了後、スポンジをそれらのペトリ皿から取り出し、そして個々に、室温において75mlのメタノールを含む100ml幅口フラスコ内に入れた。そのヘッド・スペースを、沸騰を引き起こし、そしてメタノールによるそのスポンジ内に保持された空気の完全な置換を保証するために、メタノールの蒸気圧未満に排気した。メタノールにより湿らされたスポンジを、室温において５分間放置した。メタノールをLAL試薬グレード水（洗浄当り175ml）により６回洗浄することによりそのスポンジから除去し、そして各々を５分間放置せしめた。水により湿らされた水を、35mm直径のペトリ皿に戻し、−８℃において冷凍し、そして再び凍結乾燥した。この凍結乾燥スポンジを、新たな35mm直径のペトリ皿に入れ、蓋グ内に入れ、ヒート・シールし、そして2.8Mラッドにおける電子線照射を用いて滅菌した。これらのスポンジを、生理食塩水又は水中に浸漬するとき寸法的に安定していた。生理食塩水を吸収したとき、そのスポンジは、白色から灰色に変わり、そしていくぶん半透明であった。このふくらんだスポンジは、その元の形状（dimens ions）を保持していた。最小の膨潤が、観察された。その湿ったスポンジの幾何及び端は、変更されなかった。SELP５スポンジの観察された水性安定性は、液体に晒されるときほとんど直ちに崩壊するコラーゲン止血スポンジ（Helistat，Ma rion Laboratories，Kansas City，MO）の特性とは相違する。 SELP５スポンジを、２×２×0.4cmの試料に切断し、そしてブタにおける２× ２cmの充分な厚さの皮膚外傷に適用した。Helistatの２×２×0.3cmの試料を同様に外傷に適用した。出血が阻止され、そしてその外傷を生理食塩水で洗浄した後、その試料を、それらがその外傷床に密に接するであろうようにその組織空隙内に横たえた。Helistat試料は、その外傷内の血液の量に依存して適用後数秒〜数分以内に完全に又は部分的にふくらむようになった。このふくらんだHelistat 試料は、崩壊し、そして収縮し（Shrunk）、これはいくつかの場合にはその外傷床の部分を露出させながら、この外傷の非均質な被覆をもたらした。 SELP５スポンジは、適用後５分間の観察期間にわたり実質的に白色のままであり、ことことは、それらが直ちに血液を吸収しなかったことを示していた。１の試料の１の角が、適用後１分以内に赤に変った。それは、物理学的には変化しなかった。SELP５スポンジは、外傷床によく接着し、そして緩やかな張力を用いてピンセットによりその外傷からもち上げることができなかった。SELP５スポンジは、血液組織と接触する間に収縮せず、そして観察の間にその外傷を完全にカバーし続けた。全外傷を、ペトロラタム・ガーゼ・パッドでカバーし、そして包帯を巻いた。７日後、外傷の包帯をほどき、そして治癒の程度を測定するために観察した。SE LPスポンジを含む外傷は、材料が全く適用されなかった外傷に比較してその治癒過程を通じて正常に進行した。このスポンジ材料は、そのガーゼ・パッド上に余分な材料の証拠が全く存在しなかったので、その外傷から押し出されなかった。過度の炎症の証拠は全く観察されなかった。その外傷の上皮形成は、進行中であった。実施例３．SELP繊維メッシュ SELPポリマーは、柔軟性であり、良好な覆い性(drapability)をもち、そして湿った環境において安定であるフィブリルのマットを作るために不織繊維メッシュとして形づくられることができた。類似の物理特性をもつ繊維メッシュを、以下の手順を用いてSELP５，SELP７、及びSELPFから作った。１グラムのポリマーを、均一になるまで室温において撹拌しながら88％ギ酸中に溶解した。SELP５については、凍結乾燥ポリマーを溶解するために５mlのギ酸を使用した。SELP７と SELPFについては、４と３mlのギ酸をそれぞれ使用した。上記ポリマー濃厚溶液（dope）を、75mm×20ゲージのステンレス・スチール皮下針を付けた１ccポリエチレン・シリンジ内に吸引し、そしてSage Instruments シリンジ・ポンプ（model 341B）上にマウントした。このポンプを、約0.05〜0. 07cc／分をデリバリーするように設定した。この針の先端をステンレス・スチール針（25mm×20ゲージ）からデリバリーされたガス流に対し90°において配置した。より鋭角な角度も使用した。この濃厚溶液デリバリー針とガス・デリバリー針を、１mmの隙間がそれらの先端を分けるように、ミニチュア“Ｃ ”−フランプとネオプレン・ゴムのパッドを使用したステンレス“Ｌ”−ブラケット上にマウントした。これらの先端を、上記ガス流が上記皮下針のフランジ端の僅かに上を通過するように0.5mm程垂直方向に変位させた。このガス流を、圧縮ガス又は高純度（過乾燥）窒素ガスのいずれかにより供給した。圧縮空気を、ダイアフラム・ポンプを使用してオレイス・コンプレッサーにより供給した。そのリザーバー内の空気は、約８atmの圧力であり、そしてスプレー装置にフィードされる前に約２〜６atmまで減圧された。窒素を使用したとき、それは20psiにおいてデリバリーされた。相対湿度は47％未満であった。針先端から約７〜12インチにある標的として使用された長方形の、１／16インチのポリエチレン・メッシュの端の上及び周囲に、細いフィラメントを形成した。フィラメントは、その標的の端から流れ、そしてそれらが約５cmの長さであったとき、それらを直径38mmの環状の金属ワイヤー・ループ上に集めた。フィラメントを上記ループを横切って集め、その中心に垂れ下がったフィラメントのウェブを形成した。このウェブを２つの35mmのポリエチレン・ディスクの間にそのウェブを狭み、そしてそのワイヤー・フレームを通じてそのウェブに圧力をかけることにより、そのループから取り外した。繊維メッシュを上記と同じディスク間に５〜８ウェブを圧縮することにより構築した。上記メッシュを１mlの100％メタノール又は100％エタノールのいずれかでそれらをフラッディングすることにより安定化させ、そして周囲条件下でそれらを蒸発させる。これらのメッシュを2.5Ｍラッドの線量において電子線照射により滅菌した。顕微鏡観察下、これらのメッシュは、直径0.1〜10μｍに変動する細いフィラメントから成っていた。これらのメッシュは、24時間以上にわたり生理食塩水に置かれるとき安定であった。これらのメッシュをこれらの生物学的適合性及び治癒組織内に取り込まれるそれらの能力について調べるために、ブタにおける２×２cmの部分的及び十分な厚さの皮膚外傷に適用した。これらのメッシュをピンセットを用いてポリスチレン・ディスクから取り出し、そしてその外傷床に適用した。これらのメッシュの端を、そのメッシュがその外傷上に広がり、そして／又は再配置されることを許容しながらその組織を横切って引っ張ることができた。これらの外傷を、カバーしそして生物学的適合性の徴候について２日毎に検査した。SELP繊維メッシュを含む外傷内に悪影響は全く観察されなかった。14日後、これらの外傷は完全に上皮形成された。SELPF繊維ウェブが適用された外傷からの組織の組織学的検査は、フィラメントの形態における外来材料が、その治癒組織内に取り込まれていたことを示した。これらのデータは、SELP繊維メッシュが、治癒組織内でよく耐えることを示している。それらの存在は、正常な治癒を妨害しない。１のケースにおいては、SE LPフィラメントは、その治癒された組織内に残ることがはっきりと示された。 SELPフィルム、メッシュ、及びスポンジは、外傷的損傷又は外科手術切開の間に生じる柔組織の損失を増強するために使用されることができる再吸収可能な充填材料として役立つことができる。損傷時におけるそれらの適用は、浸潤、過成長、そしてその後の健常組織とのそれらの材料の置換を促進することができる。移植された材料の質量は、その組織が損失した体部位の幾何外形を維持するのに十分な安定性を提供することができる。これらの存在は、デリケートな治癒組織がさらなる物理的損傷から保護されながら形成されることができるようにその外傷部位を機械的に強化することもできる。上記の結果から、本組成物がインプラントにおける使用のために特に望ましい特性をもつことは明らかである。組成比を変化させることにより、引っ張り強さにおける有意な変化を伴わずに、再吸収の速さをかなり変化させることができる。本組成物は、インプラントとしてのさまざまな目的及び情況(context)のために広く利用されるために、多種多様なデバイス又は物品に形成されることができる。本明細書に引用した全ての刊行物及び特許明細書を、あたかも個々の刊行物又は特許明細書を特別に、かつ、個々に引用により取り込むことを意図される如くに、引用により本明細書中に取り込む。これまで理解の明瞭さを目的として説明及び実施例によりいくぶん詳細に本発明を記載してきたが、特定の変更及び修正が添付クレームの本質又は範囲から逸脱せずに本発明に対し行われることができることは、本願発明の教示の視点において当業者にとって自明であろう。

【手続補正書】【提出日】平成９年９月１６日（１９９７．９．１６）【補正内容】請求の範囲１．少なくとも15KDを有し、そして各々VPGVG(配列番号：２)とGAGAGS（配列番号：１）の少なくとも２単位の択一的ブロックを含んで成る、タンパク質ポリマー。２．VPGVG(配列番号：２)のブロックが、２〜32単位をもち、GAGAGS（配列番号：１）のブロックが、２〜12単位をもつ、請求項１に記載のタンパク質ポリマー。３．VPGVG(配列番号：２)のブロックが、８〜20単位をもつ、請求項２に記載のタンパク質ポリマー。４．タンパク質ポリマーが、８：２；８：４；８：６；12：８；16：８；又は 32：８の単位比をもつVPGVG(配列番号：２)とGAGAGS（配列番号：１）のブロックをもつ、請求項３に記載のタンパク質ポリマー。５．少なくとも15KDを有し、そして各々VPGVG(配列番号：２)とGAGAGS（配列番号：１）の少なくとも２単位の択一的ブロックを含んで成るタンパク質ポリマーを含んで成る２次成型物品。６．VPGVG(配列番号：２)のブロックが、２〜32単位をもち、GAGAGS（配列番号：１）のブロックが、２〜12単位をもつ、請求項５に記載の２次成型物品。７．少なくとも15KDを有し、そして各々VPGVG(配列番号：２)とGAGAGS（配列番号：１)の少なくとも２単位の択一的ブロックを含んで成るタンパク質ポリマーを含んで成る非晶質塊。８．VPGVG(配列番号：２)のブロックが、２〜32単位をもち、GAGAGS（配列番号：１）のブロックが、２〜12単位をもつ、請求項７に記載の非晶質塊。９．少なくとも15KDを有し、そして各々VPGVG(配列番号：２)とGAGAGS（配列番号：１）の少なくとも２単位の択一的ブロックを含んで成るタンパク質ポリマーを含んで成るフィルム。 10．VPGVG(配列番号：２)のブロックが、２〜32単位をもち、GAGAGS（配列番号：１）のブロックが、２〜12単位をもつ、請求項９に記載のフィルム。 11．少なくとも15KDを有し、そして各々VPGVG(配列番号：２)とGAGAGS（配列番号：１）の少なくとも２単位の択一的ブロックを含んで成るタンパク質ポリマー又はGAGAGS（配列番号：１）の反復単位のホモポリマーを含んで成る滅菌された移植可能なデバイス。 12．VPGVG(配列番号：２)のブロックが、２〜32単位をもち、GAGAGS（配列番号：１）のブロックが、２〜12単位をもつ、請求項11に記載の滅菌された移植可能なデバイス。 13．デバイスが、縫合糸、ピン、糸、ゲル、又はフィルムである、請求項11又は12に記載のデバイス。 14．吸収性の移植可能な製品としての用途をもつ、請求項１に記載のタンパク質ポリマー。 15．吸収性の移植可能な製品としての用途をもっ、請求項５に記載の２次成型物品。 16．吸収性の移植可能な製品としての用途をもつ、請求項７に記載の非晶質塊。 17．吸収性の移植可能な製品としての用途をもつ、請求項９に記載のフィルム。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０８Ｊ 5/18 ＣＦＪＣ０８Ｊ 5/18 ＣＦＪＣ０８Ｌ 89/00 Ｃ０８Ｌ 89/00 // Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ０８Ｌ 89:00

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも15KDを有し、そして各々VPGVG(配列番号：２)とGAGAGS（配列番号：１）の少なくとも２単位の択一的ブロックを含んで成る、タンパク質ポリマー。２．VPGVG(配列番号：２)のブロックが、２〜32単位をもち、GAGAGS（配列番号：１）のブロックが、２〜12単位をもつ、請求項１に記載のタンパク質ポリマー。３．VPGVG(配列番号：２)のブロックが、８〜20単位をもつ、請求項２に記載のタンパク質ポリマー。４．タンパク質ポリマーが、８：２；８：４；８：６；12：８；16：８；又は 32：８の単位比をもつVPGVG(配列番号：２)とGAGAGS（配列番号：１）のブロックをもつ、請求項３に記載のタンパク質ポリマー。５．少なくとも15KDを有し、そして各々VPGVG(配列番号：２)とGAGAGS（配列番号：１）の少なくとも２単位の択一的ブロックを含んで成るタンパク質ポリマーを含んで成る２次成型物品。６．VPGVG(配列番号：２)のブロックが、２〜32単位をもち、GAGAGS（配列番号：１）のブロックが、２〜12単位をもつ、請求項５に記載の２次成型物品。７．少なくとも15KDを有し、そして各々VPGVG(配列番号：２)とGAGAGS（配列番号：１）の少なくとも２単位の択一的ブロックを含んで成るタンパク質ポリマーを含んで成る非晶質塊。８．VPGVG(配列番号：２)のブロックが、２〜32単位をもち、GAGAGS（配列番号：１）のブロックが、２〜12単位をもっ、請求項７に記載の非晶質塊。９．少なくとも15KDを有し、そして各々VPGVG(配列番号：２)と GAGAGS（配列番号：１）の少なくとも２単位の択一的ブロックを含んで成るタンパク質ポリマーを含んで成るフィルム。 10．VPGVG(配列番号：２)のブロックが、２〜32単位をもち、GAGAGS（配列番号：１）のブロックが、２〜12単位をもつ、請求項９に記載のフィルム。 11．少なくとも15KDを有し、そして各々VPGVG(配列番号：２)とGAGAGS（配列番号：１）の少なくとも２単位の択一的ブロックを含んで成るタンパク質ポリマー又はGAGAGS（配列番号：１）の反復単位のホモポリマーを含んで成る滅菌された移植可能なデバイス。 12．VPGVG(配列番号：２)のブロックが、２〜32単位をもち、GAGAGS（配列番号：１）のブロックが、２〜12単位をもつ、請求項11に記載の滅菌された移植可能なデバイス。 13．分離された生きた組織を一緒に維持する方法であって：その組織を一緒に保持するためのデバイスを用いてその分離された組織を一にし、そのデバイスが、請求項１に記載の組成物又はGAGAGS（配列番号：１）の反復単位のホモポリマーを含んで成る、ことを含んで成る方法。 14．デバイスが、縫合糸、ピン、糸、ゲル、又はフィルムである、請求項13に記載の方法。