CN105012158B - 含细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料支架及制造方法 - Google Patents
含细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料支架及制造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105012158B CN105012158B CN201510382732.6A CN201510382732A CN105012158B CN 105012158 B CN105012158 B CN 105012158B CN 201510382732 A CN201510382732 A CN 201510382732A CN 105012158 B CN105012158 B CN 105012158B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fibroin
- fibroin albumen
- biological material
- composite biological
- water
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明提供了一种新型细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料支架及其制造方法,包括细菌纤维素和丝素蛋白,所述复合生物材料支架是由能产生细菌纤维素的菌和丝素蛋白共同培养,细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白上的羧基或氨基发生原位聚合反应形成化学键而制得。本发明所述的复合生物材料中纤维素与丝素蛋白间的结合牢固稳定,不容易分开,能更好地保持复合生物材料支架的生物学功能,在生物医学领域有极广的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种复合生物材料,特别涉及细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物 材料支架及其制备方法。
背景技术
随着人民生活水平的提高,美容产品在人们的生活中占据了越来越重要的位 置。利用面膜保养面部皮肤的美容方式日益成为人们日常生活的一部分。
现在的面膜所用材质由单一走向多样化,包括面贴式面膜、膏泥状面膜、乳 霜型面膜等。在面贴式面膜的材质中主要采用无纺布面膜、蚕丝面膜和生物纤维 面膜。
无纺布面膜的基质材质是特定或随机的纤维组成的无纺布。无纺布面膜敷感 比较舒适,但透气性一般。而且当精华液少时面膜边缘会翘起来,不服帖,需要 躺下才能发挥其最大作用。因此这类材质的面膜与肌肤的亲和力较差,仅仅只是 具有精华液载体的功能,不具备仿生物智能的功效。
蚕丝面膜的主要材料是活性蚕丝蛋白。蚕丝蛋白是纤维状蛋白质,其分子结 构与构成皮肤的胶原纤维相似,可天然地增强皮肤的弹性,所含的氨基酸为大量 细胞裂变增殖所必须,进而加快皮肤代谢,防止皱纹天生,晋升紧致,令肌肤更 加柔滑细腻。而蚕丝丝素蛋白富含多种氨基酸和表皮生长因子,提供肌肤所需的 养分,保持肌肤代谢,修复受损的细胞,使肌肤逐渐恢复健康白净。同时蚕丝面 膜具有轻、软、薄、透气性好,吸水性强,服帖性好等特点。因此它比无纺布材 质的面膜好。但因为蚕丝面膜比较薄,其承载的精华液的量不是很大,容易造成 部分精华液留在面膜袋内造成浪费,或者因吸载过多,在敷面膜的过程中部分精 华液从这类面膜边缘流出。天然蚕丝持水量低,触感粗糙。
生物纤维面膜是由木醋杆菌自然发酵制成的纤维体。具有类似皮肤的功能, 能透氧隔离细菌,能使用于烧烫伤的披覆物。木醋杆菌(Acetobacter xylinum) 属于好氧革兰氏阴性菌,是产纤维素能力最好的菌株,它在正常的代谢条件下, 可以分泌出细菌纤维素。但这类面膜不具有蚕丝的天然美容功效,需要额外添加 更多的精华液。
目前出现了生物纤维素复合膜,该类面膜通常采用如下制备方法:首先将保存在斜面培养基上的木醋杆菌制成摇瓶种子,通过静态培养后获得纤维素。再将培养好的纤维素分离纯化,然后与天然多糖或蛋白质等混合,制成生物纤维素复合膜。现在制备复合膜是需要经过两步工艺,即先通过培养获得纤维素膜,然后再将纯化后的纤维素膜与蛋白质等混合。这样的两步法使得生产工艺复杂,需要更多的机器设备和人力投入,产品成本高。另外在纤维素膜和蛋白质的混合过程中常会出现混合不均匀的现象,所得复合膜中纤维素和蛋白质并没有有效地互相交织在一起,会出现纤维素主要集中在复合膜的一个区域,而蛋白主要集中在另一个区域,这就不能实现复合膜的功效。
现在也出现了具有生物学功能的人造复合生物材料来替代某些生物材料,例如人工皮肤、血管、角膜等,但现有的复合生物材料的使用效果都不理想。
发明内容
为克服现有技术的不足,本发明的目的在于提供了一种丝素蛋白复合生物材料支架,包括细菌纤维素和丝素蛋白,所述的细菌纤维素和丝素蛋白通过细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白的羧基或者氨基发生聚合而相互交联在一起。
进一步地,所述的细菌纤维素来自以下所列菌之一或它们的混合菌:木醋杆菌、葡糖酸醋杆菌属、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、无色杆菌属、固氮菌属、气杆菌属或产碱菌属。
进一步地,丝素蛋白占复合材料的50%(w/w)以上。
本发明还提供了一种丝素蛋白复合生物材料支架的制备方法,包括:将能产生细菌纤维素的菌接种在含有丝素蛋白的发酵培养基中,共同培养后获得丝素蛋白复合生物材料支架。
进一步地,发酵培养基以500ml计,包含选自以下之一:含4g-8g丝素蛋白的透析溶液,或经喷雾干燥获得的丝素蛋白粉末颗粒,或者丝素凝胶干燥后物理粉碎的粉末。
进一步地,所述的丝素蛋白的制备方法包括取一定量的蚕茧,在0.5%(g/ml)的NaCO3溶液中,沸水1小时,脱胶丝,重复上述操作一次,脱胶丝风干即得丝素蛋白纤维,然后将丝素蛋白纤维在CaCl2:乙醇:水=2:1:8(摩尔比)的溶液中溶解,80℃水浴1小时,使丝素蛋白纤维完全溶解,丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析,获得的丝素蛋白在制备发酵培养基时采用高温灭菌的方式。
进一步地,所述的丝素蛋白的制备方法包括取一定量的蚕茧,在0.5%(g/ml)的NaCO3溶液中,100℃,30分钟,然后60℃水洗6次脱去丝胶,脱胶丝风干即得丝素蛋白纤维,然后将丝素蛋白纤维在CaCl2:乙醇:水=2:1:8(摩尔比)的溶液中溶解,65℃水浴1小时,使丝素蛋白纤维完全溶解,丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析,获得的丝素蛋白在制备发酵培养基时采用辐射灭菌的方式。
进一步地,所述的发酵培养基选自以下之一:(1)按500ml计算,30.0g-60.0g的蔗糖,5.0g-10.0g的蛋白胨,0.5g-2.0g的柠檬酸,0.5g-2.0g的Na2HPO4•12H2O,1.0g-2.5g的KH2PO4,0.05g-1.5g的MgSO4•7H2O和丝素蛋白,其中所述的丝素蛋白选自丝素蛋白的透析溶液或经喷雾干燥获得的丝素蛋白粉末颗粒4g-8g的丝素蛋白,其余为去离子水;或(2)按500ml计算,5.0g-13.0g的果糖,1.0g-4.0g的蛋白胨 ,0.1g-0.4g的柠檬酸,0.1g-0.4g的Na2HPO4•12H2O,0.5g-0.8g的KH2PO4,0.1g-0.5g的MgSO4•7H2O,4g-8g的丝素蛋白,其余为去离子水;或(3)按500ml计算,20g-30g的葡萄糖,2g-5g的蛋白胨 ,0.2g-0.6g的柠檬酸,0.2g-0.6g的Na2HPO4•12H2O,1.0g-1.8g的KH2PO4,0.5g-0.8g的MgSO4•7H2O,4g-8g的丝素蛋白,其余为去离子水。
进一步地,在将木醋杆菌接种到含有丝素蛋白的发酵培养基中培养前,先将木醋杆菌接种在斜面培养基中活化,取活化后的菌种接种于种子培养基中。
进一步地,纯化丝素蛋白复合生物材料支架的步骤包括:取出培养所得的丝素蛋白复合生物材料支架,去除膜表面的培养基和杂质,滤出水分后在蒸馏水中浸泡两天,滤干蒸馏水浸泡过的复合生物材料支架的外周水分后移至足够体积的 0.1至4%(g/ml)NaOH溶液中,于60℃水浴中加热1小时,水浴后将复合生物材料支架取出滤水后再次用蒸馏水浸泡清洗泡两天,清洗后的复合生物材料支架中加入蒸馏水,并滴入2至3滴1%的醋酸溶液,复合生物材料支架再用蒸馏水清洗3-4次,获得丝素蛋白复合生物材料支架。
制备方法进一步地包括以下步骤:
(1)将木醋杆菌于斜面培养基进行活化,取活化后的菌种接种于种子培养基中,放置在摇床上进行培养,获得种子;
(2)将步骤(1)培养所得的种子和液体培养基放入发酵培养基中继续培养,然后在28-30℃下静置培养7至15天,获得丝素蛋白复合生物材料支架初产物;
(3)纯化步骤(2)中的丝素蛋白复合生物材料支架初产物的丝素蛋白复合生物材料支架。
优选地,在发酵培养基中预先放入组织支架模型,使得在发酵培养过程中,丝素蛋白复合生物材料就会附着在这些模型上。
进一步地,所述的组织支架模型形状为血管或角膜的形状。
本发明的有益效果是:本发明是将能产生细菌纤维素的菌(例如木醋杆菌)添加在含有丝素蛋白培养基中共同培养的,因此在培养木醋杆菌的过程中细胞分泌细菌纤维素与丝素蛋白发生原位聚合就形成复合生物材料支架。因此利用本发明制备丝素蛋白复合生物材料支架与现有方法制造的复合膜相比,本发明所述的方法操作方法简便,减少了人的劳动量,使用的设备减少,生产成本降低。在培养基中添加丝素蛋白,使木醋杆菌与培养基中的丝素蛋白一起培养,木醋杆菌分泌的细菌纤维素纤维与天然的丝素蛋白通过化学反应相互交联在一起。所得丝素蛋白复合生物材料支架的含水量高,并且复合物是糖和蛋白的聚合物,因此具有特殊的生物功能,在生物矿化功能方面具有优良的生物学性能。所得的丝素蛋白复合生物材料支架是一种很好的丝素蛋白复合生物材料支架,在组织工程方面的具有广阔的应用前景,比如做为吸血棉、人工皮肤等组织工程材料支架、隐形面膜材料等。本发明制备得到的丝素蛋白复合生物材料支架是一种凝胶状,其光滑,触感好。本发明还根据不同的丝素蛋白制备工艺,在配制培养基时采用了不同的灭菌方式,保证了在培养过程中丝素蛋白和新生长出来的木醋杆菌的菌丝体有更多的接触面积,有效的通过化学反应相互交织在一起,形成牢固的丝素蛋白复合生物材料支架。
附图说明
图1是实施例3所的丝素蛋白复合生物材料支架的电镜图。
图 2是实施例4所的丝素蛋白复合生物材料支架的电镜图。
图 3是实施例5所的丝素蛋白复合生物材料支架的电镜图。
图 4是实施例8所的丝素蛋白复合生物材料支架的电镜图。
图 5是实施例11所的丝素蛋白复合生物材料支架的电镜图。
图 6是在含有丝素蛋白的发酵培养基在培养过程中的pH变化曲线图。
图 7各种类型材料的红外图谱。
图8 是图7在红外波数800至1500的放大图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图详细说明本发明。
实施例 1 制备丝素蛋白
方法一:取一定量的蚕茧,在0.5%(g/ml)的NaCO3溶液中,沸水1小时,脱胶丝,即得丝素蛋白纤维。然后将丝素蛋白纤维在CaCl2:乙醇:水=2:1:8(摩尔比)的溶液中溶解,80℃水浴1小时,使丝素蛋白纤维完全溶解。丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析,获得含有丝素蛋白的透析溶液。
方法二:取一定量的蚕茧,在5%(g/ml)的NaCO3溶液中,100℃,30分钟,然后60℃水洗6次,烘干脱胶丝,即得丝素蛋白纤维。然后将丝素蛋白纤维在CaCl2:乙醇:水=2:1:8(摩尔比)的溶液中溶解,65℃水浴1小时,使丝素蛋白纤维完全溶解。丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析,获得含有丝素蛋白的透析溶液。
所述的透析方法可以采用本实施例的方法,也可以采用其他的透析方法。本实施例所述的透析方法包括将丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中,放在4℃的去离子水中透析3天,且每天更换一次去离子水。透析结束后用两层纱布过滤,所得滤液在6000r/min的条件下离心15min,取上清获得丝素蛋白溶液,从而获得含有丝素蛋白的透析溶液。
透析后所得丝素蛋白溶液稀释至一定浓度后,通过喷雾干燥的方法获得丝素蛋白颗粒。
实施例2 培养基的配制
a)斜面培养基,按配置100ml计,包括:
葡萄糖 2.0g-10.g
酵母粉 0.5g-1.5g
柠檬酸 0.05g-0.5g
Na2HPO4·12H2O 0.05g-0.3g
KH2PO4 0.1g-0.5g
MgSO4·7H2O 0.1g-0.5g
琼脂 1.0g-2,0g
去离子水 100ml
pH值为6.8。
(2)种子培养,按配置100ml计,包括:
葡萄糖 1.0g-5.0g
蛋白胨 0.2g-1.0g
柠檬酸 0.1g-0.5g
Na2HPO4·12H2O 0.1g-0.5g
MgSO4·7H2O 0.01g-0.1g
去离子水 100ml
pH为6.8。
(3)发酵培养基,按配置500ml计,包括:
蔗糖 30.0g-60.0g
蛋白胨 5.0g-10.0g
柠檬酸 0.5g-2.0g
Na2HPO4·12H2O 0.5g-2.0g
KH2PO4 1.0g-2.5g
MgSO4·7H2O 0.05g-1.5g
含4g-8g 丝素蛋白的透析溶液
用去离子水加至500ml,并且调整pH为6.8。
发酵培养基中还可以选用果糖或葡萄糖等作为培养基的成分之一。
在果糖作为发酵培养基成分之一的培养基中,按配置500ml计,包括:
果糖 5.0g-13.0g
蛋白胨 1.0g-4.0g
柠檬酸 0.1g-0.4g
Na2HPO4·12H2O 0.1g-0.4g
KH2PO4 0.5g-0.8g
MgSO4·7H2O 0.1g-0.5g
含4g-8g 丝素蛋白的透析溶液
用去离子水加至500ml,并且调整pH为6.8。
在葡萄糖作为发酵培养基成分之一的培养基,按配置500ml计,包括:
葡萄糖 20g-30g
蛋白胨 2.0g-5.0g
柠檬酸 0.2g-0.6g
Na2HPO4·12H2O 0.2g-0.6g
KH2PO4 1.0g-1.8g
MgSO4·7H2O 0.5g-0.8g
含4g-8g 丝素蛋白的透析溶液
用去离子水加至500ml,并且调整pH为6.8。
所述培养可用4%NaOH缓冲液等缓冲溶液调整pH值为6.8。
当选用实施例1中的方法一制备的丝素蛋白I时,在制备发酵培养基时采用高温灭菌的方式。因为实验证明以实施例1中的方法一制备的丝素蛋白丝在高温时,丝素蛋白分子不容易聚集量,变性的蛋白就少,产生的沉淀也会很少,能保证丝素蛋白在发酵培养基中的稳定性。高温灭菌的方式是:121℃,15分钟。
当选用实施例1中的方法二制备的丝素蛋白I时,采用辐射灭菌。因为实验证明以实施例1中的方法二制备的丝素蛋白丝在高温灭菌会产生很多沉淀。而采用辐射灭菌时丝素蛋白的形态不变,一直保持处于水溶液状态,因此避免产生大量的沉淀,能保证丝素蛋白在发酵培养基中的稳定性。辐射灭菌的方式是:采用Co60辐照。
在配制培养基时采用了不同的灭菌方式,保证了在培养过程中丝素蛋白和新生长出来的木醋杆菌的细菌纤维素有更多的接触面积,通过化学反应相互交织在一起,形成牢固的丝素蛋白复合生物材料支架。
实施例3制备丝素蛋白复合生物材料支架1
(1)木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)为CGMCC No. 1.1812,来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
(2)将木醋杆菌接种于斜面培养基进行活化培养,该斜面培养基,按配置100ml计,配方组成如下:
葡萄糖 2.0g
酵母粉 0.5g
柠檬酸 0.01g
Na2HPO4·12H2O 0.05g
KH2PO4 0.05g
MgSO4·7H2O 0.1g
琼脂 1.0g
去离子水 100ml
用4%NaOH缓冲液调整培养基的pH值为6.8。然后将调好pH值的培养基盛在试管中,并在121℃下灭菌20min。灭菌后立刻取出试管,趁热摆好斜面。将木醋杆菌接种于该斜面培养基中进行活化,接种后的斜面培养基放入30℃的恒温电热培养箱中培养3至4天。
(3)将步骤(2)中活化后的木醋杆菌接种于种子培养基中进行种子培养,该种子培养基,按配置100ml计,配方组成如下:
葡萄糖 1.0g
蛋白胨 0.2g
柠檬酸 0.1g
Na2HPO4·12H2O 0.1g
MgSO4·7H2O 0.01g
去离子水 100ml
用4%NaOH缓冲液调整培养基的pH至6.8,将调好pH值的培养基盛在锥形瓶中,并在121℃下灭菌20min,灭菌完取出锥形瓶。将斜面培养基中培养出来的菌种接种至该种子培养基中,在30℃下150r/min的恒温振荡培养箱中,振荡培养24小时。
(4)将步骤(3)中培养获得的种子接种于木醋杆菌发酵培养基中进行发酵培养,该发酵培养基,按配置500ml计,配方组成如下:
蔗糖 30.0g
蛋白胨 5.0g
柠檬酸 0.5g
Na2HPO4·12H2O 0.5g
KH2PO4 1.0g
MgSO4·7H2O 0.05g
含4g丝素蛋白的透析溶液
用去离子水加至500ml,用4%NaOH缓冲液调pH至6.8,发酵培养基的配制和灭菌方式同实施例2。并按每瓶7%的接种量,培养温度30℃,静置培养约7至15天,获得丝素蛋白复合生物材料支架。
(5)纯化丝素蛋白复合生物材料支架
取出步骤(4)中培养所得的丝素蛋白复合生物材料支架,滤出水分后在蒸馏水中浸泡十分钟(或用蒸馏水清洗5-6次),去除膜表面的培养基和杂质。滤干蒸馏水浸泡过的复合生物材料支架的外周水分后移至足够体0.1至4%(g/ml)的NaOH溶液中,于60℃水浴中加热1小时。水浴后将复合生物材料支架取出滤水后再次用蒸馏水浸泡清洗泡十分钟,重复以上水浴步骤3次。清洗后的复合生物材料支架中加入蒸馏水,并滴入1%的醋酸溶液至溶液pH值为7,复合生物材料支架再用蒸馏水清洗3-4次。获得纯净的丝素蛋白复合生物材料支架,其结构如图1所示的扫描电镜图,图中片状部分就是蚕丝蛋白,其以化学键交联着细菌纤维素纤维。
实施例4制备丝素蛋白复合生物材料支架2
(1)木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)为CGMCC No. 1.1812,来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
(2)培养的方法按实施例3,培养基的配方包括
斜面培养基,按配置100ml计,包括:
葡萄糖 10.0g
蛋白胨 1.5g
柠檬酸 0.5g
Na2HPO4·12H2O 0.3g
KH2PO4 0.3g
MgSO4·7H2O 0.5g
琼脂 2.0g
去离子水 100ml
pH值为6.8。
种子培养,按配置100ml计,包括:
葡萄糖 5.0g
蛋白胨 1.0g
柠檬酸 0.5g
Na2HPO4·12H2O 0.5g
MgSO4·7H2O 0.1g
去离子水 100ml
pH为6.8。
发酵培养基,按配置500ml计,包括:
蔗糖 60.0g
蛋白胨 10.0g
柠檬酸 2.0g
Na2HPO4·12H2O 2.0g
KH2PO4 2.5g
MgSO4·7H2O 1.5g
含5.0g丝素蛋白的透析溶液
用去离子水加至500ml,并且调整pH为6.8。
按实施例3纯化丝素蛋白复合生物材料支架的方法获得复合生物材料支架,其结构如图2所示的扫描电镜图。图中片状部分是蚕丝蛋白并交联着细菌纤维素纤维。
实施例5制备丝素蛋白复合生物材料支架3
(1)木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)为CGMCC No. 1.1812,来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
(2)培养的方法按实施例3,培养基的配方包括
斜面培养基,按配置100ml计,包括:
葡萄糖 5.0g
蛋白胨 1.0g
柠檬酸 0.1g
Na2HPO4·12H2O 0.1g
KH2PO4 0.3g
MgSO4·7H2O 0.146g
琼脂 1.8g
去离子水 100ml
pH值为6.8。
种子培养基,按配置100ml计,包括:
葡萄糖 2.0g
蛋白胨 0.4g
柠檬酸 0.2g
Na2HPO4·12H2O 0.27g
MgSO4·7H2O 0.025g
去离子水 100ml
pH为6.8。
发酵培养基,按配置500ml计,包括:
蔗糖 40.0g
蛋白胨 8.0g
柠檬酸 1.0g
Na2HPO4·12H2O 1.0g
KH2PO4 1.5g
MgSO4·7H2O 0.0734g
含8g丝素蛋白的透析溶液
用去离子水加至500ml,并且调整pH为6.8。
按实施例3纯化丝素蛋白复合生物材料支架的方法获得复合生物材料支架,其结构如图3所示的扫描电镜图。图中片状部分是蚕丝蛋白并交联着细菌纤维素纤维。
实施例6
以木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)为CGMCC No. 1.1812作为菌种,采用实施例3中的斜面培养基、种子培养基和如下的发酵培养基A,获得丝素蛋白复合生物材料支架4。
发酵培养基A
果糖 5.0g
蛋白胨 1.0g
柠檬酸 0.1g
Na2HPO4·12H2O 0.1g
KH2PO4 0.5g
MgSO4·7H2O 0.1g
含4g丝素蛋白的透析溶液
用去离子水加至500ml,并且调整pH为6.8。
以木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)为CGMCC No. 1.1812作为菌种,采用实施例4中的斜面培养基、种子培养基和如下的发酵培养B,获得丝素蛋白复合生物材料支架5。
发酵培养基B
果糖 13.0g
蛋白胨 4.0g
柠檬酸 0.4g
Na2HPO4·12H2O 0.4g
KH2PO4 0.8g
MgSO4·7H2O 0.5g
含6g丝素蛋白的透析溶液
用去离子水加至500ml,并且用4%NaOH缓冲液调pH至6.8。
以木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)为CGMCC No. 1.1812作为菌种,采用实施例5中的斜面培养基、种子培养基和如下的发酵培养基C,获得丝素蛋白复合生物材料支架6。
发酵培养基C
果糖 6.0g
蛋白胨 2.0g
柠檬酸 0.1g
Na2HPO4·12H2O 0.5g
KH2PO4 0.6g
MgSO4·7H2O 0.3g
含8g丝素蛋白的透析溶液
用去离子水加至500ml,并且调整pH为6.8。
实施例7
以木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)为CGMCC No. 1.1812作为菌种,采用实施例3中的斜面培养基、种子培养基和如下的发酵培养基D,获得丝素蛋白复合生物材料支架7。
发酵培养基D
葡萄糖 25g
蛋白胨 5g
柠檬酸 0.5g
Na2HPO4·12H2O 0.5g
KH2PO4 1.5g
MgSO4·7H2O 0.73g
含5g丝素蛋白的透析溶液
用去离子水加至500ml,并且调整pH为6.8。
以木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)为CGMCC No. 1.1812作为菌种,采用实施例4中的斜面培养基、种子培养基和如下的发酵培养基E,获得丝素蛋白复合生物材料支架8。
发酵培养基E
葡萄糖 30g
蛋白胨 5g
柠檬酸 0.5g
Na2HPO4·12H2O 0.5g
KH2PO4 1.5g
MgSO4·7H2O 0.73g
含7g丝素蛋白的透析溶液丝素蛋白喷雾干燥颗粒
用去离子水加至500ml,并且调整pH为6.8。
以木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)为CGMCC No. 1.1812作为菌种,采用实施例5中的斜面培养基、种子培养基和如下的发酵培养基F,获得丝素蛋白复合生物材料支架9。
发酵培养基F
葡萄糖 25g
蛋白胨 5g
柠檬酸 0.5g
Na2HPO4·12H2O 0.5g
KH2PO4 1.5g
MgSO4·7H2O 0.73g
含8g丝素蛋白的透析溶液丝素蛋白喷雾干燥颗粒
用去离子水加至500ml,并且调整pH为6.8。
实施例6和7所得的复合生物材料支架的扫描电镜图均显示蚕丝蛋白交联着细菌纤维素,是一种化学结合的方式。
实施例8 木醋杆菌发酵培养基中不加丝素蛋白,在培养结束获得木醋杆菌的产物后再外加入丝素蛋白,从而制备得到细菌纤维素复合膜。
其中发酵培养基不同于实施例5,其他的培养基都与实施例5相同。本实施例中的发酵培养基,按配置500ml计,包括:
蔗糖 40.0g
蛋白胨 8.0g
柠檬酸 1.0g
Na2HPO4·12H2O 1.0g
KH2PO4 1.5g
MgSO4·7H2O 0.0734g
去离子水 500ml
pH为6.8。
其结构如图4所示的扫描电镜图。虽然在培养处的细菌纤维素中也加入了丝素蛋白,但是本实施例的丝素蛋白是外加的,在电镜图中细菌纤维素间未见明显交联的片状丝素蛋白。由此可见,以这种方式结合的复合膜只是物理层面的结合,并没有有效地互相交织在一起,这样的结合方式是不牢固的。另一方面本实施例所得复合膜中会出现纤维素主要集中在复合膜的一个区域,而蛋白主要集中在另一个区域,这种纤维素和丝素蛋白的分布不均一会降低复合膜的功效。
实施例 9 制备面膜
除去实施例3至7所述的丝素蛋白复合生物材料支架表面的培养基、杂质、残留的菌体后,所得到的复合生物材料支架经过分片、挑选、压缩、防腐处理,包装成型,制备得到面膜。经过大量的试用实验,所制备得到的面膜表面光滑,触感好,人体感觉非常舒服,且对营养成分的锁住功能强,营养液也不会流出面膜。
实施例 10 制备丝素蛋白复合生物材料支架10
在实施例3至7所述的发酵培养基中预先放入一些组织支架模型。待发酵过程中丝素蛋白复合生物材料就会附着在这些预先放入的组织支架模型上,成为血管,角膜等组织支架等的形状。例如预先放入直径和血管相同的圆柱形模型,发酵过程中木醋杆菌和丝素蛋白的复合生物材料就会附着在模型的外表面生长,并覆盖在模型上。等发酵完成后,将模型从复合生物材料中抽出来,剩下的复合生物材料其形状如同血管,可作为血管的替代品。
实施例 11制备丝素蛋白复合生物材料支架11
以木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)作为菌种,采用实施例1和2所述方法和培养基进行培养,其中发酵培养基用4g-8g 经喷雾干燥获得的丝素蛋白颗粒代替丝素蛋白的透析溶液,其余组分不变。图5所示的丝素蛋白复合生物材料的电镜扫描图,该复合生物材料是在如下发酵培养基中培养所得,所述培养基包括13.0g果糖,4.0g蛋白胨,0.4g柠檬酸,0.4g Na2HPO4·12H2O,0.8g KH2PO4,0.5g MgSO4·7H2O和6g丝素蛋白喷雾干燥颗粒。图5中黑色箭头所示的即为丝素蛋白颗粒,该颗粒均匀而紧固定地交联着细菌纤维素纤维,是一种化学键的结合。在其他的实施方式中,例如每500ml发酵培养基中含有经喷雾干燥获得的丝素蛋白颗粒含量选自4g,5g,7g,8g之一,并进行复合生物材料支架地制备。经过电镜扫描图分析,所得到的丝素蛋白复合生物材料支架的电镜结构显示丝素蛋白颗粒均匀而紧固定地交联着细菌纤维素纤维,是一种化学键的结合。
实施例 12 本发明培养过程中的pH变化情况及红外图谱分析
图6是利用本发明所述的制备方法将木醋杆菌在含有丝素蛋白的发酵培基中进行发酵培养时的pH值日变化图,从图中可以看到培养基会逐渐呈现酸性,pH值可达到3。在酸性环境下,非常有利于细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白上的羧基发生缩合反应,从而使细菌纤维素和丝素蛋白间通过化学键形成稳定的结构。这进一步证实在含有丝素蛋白的培养基,木醋杆菌与培养基中的丝素蛋白一起培养,新生长出来的木醋杆菌的菌丝体会与天然的丝素蛋白通过化学反应相互交织在一起。所得丝素蛋白复合生物材料支架的含水量高,并且复合物是糖和蛋白的聚合物,因此具有特殊的生物功能,在生物矿化功能方面具有优良的生物学性能。
分别对本发明所述方法制备的丝素蛋白复合生物材料支架(例如实施例3制备得到的丝素蛋白复合生物材料支架,图中简称发酵复合膜(SF/BC))、蚕丝蛋白单体(即丝素蛋白,简称SF)、细菌纤维素(简称BC)、以物理方式将丝素蛋白和细菌纤维素混合的混合物(例如实施例8现有技术中所得复合膜,即图中蚕丝细菌纤维素混合物)。图 7是上述材料的红外图谱,图8 是图7在红外波数800至1500的放大。结果显示发酵复合膜(SF/BC)明显在1372cm-1出现了新的波峰,说明复合膜有新的聚合键的生成和复合材料中丝素蛋白酰胺III的波峰因原位聚合后受到两种材料间形成的氢键的影响而使原来1431-1和1337cm-1处的波峰发生位移,说明蚕丝蛋白与细菌纤维素在发酵过程中产生了交联聚合,形成了蚕丝蛋白细菌纤维素聚合物。即细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白上的羧基或氨基发生的聚合反应,从而使细菌纤维素和丝素蛋白之间通过化学键形成了稳定的结构。
利用本发明所述的制备丝素蛋白复合生物材料支架的方法,选用以下能够生产细菌纤维素的菌,能生产出本发明所述的丝素蛋白复合生物材料支架。所述的能生产细菌纤维素的菌选自以下所列菌之一或它们的混合菌:木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)、葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、八叠球菌属(Sarcina)、假单胞菌属(Preudomonas)、土壤杆菌属(Agrobaeterium)、无色杆菌属(Achromobacrer)、固氮菌属(Azotobacter)、气杆菌属(Aerobacter)或产碱菌属(Alcaligenes)。
本发明所述的方法制备丝素蛋白复合生物材料支架,其操作方法简便,劳动量少,使用的设备减少,降低了生产成本。通过强度试验、含水量试验、人体感知度试验等大量的验证试验,可以看出在培养基中添加丝素蛋白,使木醋杆菌与培养基中的丝素蛋白一起培养,因此新生长出来的木醋杆菌的菌丝体与天然的丝素蛋白通过化学反应相互交织在一起。所以用本发明所得丝素蛋白复合生物材料支架的含水量高,材料更牢固结实。所得复合生物支架是糖和蛋白的聚合物,因此又具有特殊的生物功能,在生物矿化功能方面具有优良的生物学性能。本发明制备得到的丝素蛋白复合生物材料支架是一种凝胶状,其光滑,触感好。本发明所得丝素蛋白复合生物材料支架的各种生物学功能均优于现有技术(培养基中不放丝素蛋白)所得的复合膜。
利用本发明所述的含有丝素蛋白的发酵培养基制备的丝素蛋白复合生物材料不仅可以用作面膜材料,并且具有特殊的生物学功能,在生物矿化等生物材料方面具有优良的生物学性能,可用于制备吸血棉、人工皮肤、血管等组织工程材料支架。
Claims (11)
1.一种含细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料支架,包括细菌纤维素和丝素蛋白,其特征在于,所述复合生物材料支架是由能产生细菌纤维素的菌和丝素蛋白共同培养,使细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白上的羧基或氨基发生原位聚合反应形成化学键而制得。
2.根据权利要求1所述的复合生物材料支架,其特征在于,所述的细菌纤维素来自以下所列菌之一或它们的混合菌:木醋杆菌、葡糖酸醋杆菌属、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、无色杆菌属、固氮菌属、气杆菌属或产碱菌属。
3.根据权利要求1所述的复合生物材料支架,其特征在于,以质量百分比计算,丝素蛋白的含量占复合生物材料支架的50%以上。
4.制造含有细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料支架的方法,包括:将能产生细菌纤维素的菌接种在含有丝素蛋白的发酵培养基中,所述菌与丝素蛋白共同培养,细菌纤维素中的羟基与丝素蛋白上的羧基或氨基发生原位聚合反应,使细菌纤维素与丝素蛋白之间形成化学键。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,发酵培养基以500ml计,包含选自以下之一:含4g-8g丝素蛋白的透析溶液、或经喷雾干燥获得的丝素蛋白粉末颗粒或者丝素凝胶干燥后物理粉碎的粉末。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的丝素蛋白的制备方法包括取一定量的蚕茧,在质量体积比为0.5%的Na2CO3溶液中,沸水1小时,脱胶丝,重复上述操作一次,风干即得丝素蛋白纤维,然后将丝素蛋白纤维在摩尔比为CaCl2:乙醇:水=2:1:8的溶液中溶解,80℃水浴1小时,使丝素蛋白纤维完全溶解,丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析,获得的丝素蛋白在制备发酵培养基时采用高温灭菌的方式。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的丝素蛋白的制备方法包括取一定量的蚕茧,在质量体积比0.5%的Na2CO3溶液中,100℃,30分钟,然后60℃水洗6次脱去丝胶,脱胶丝风干即得丝素蛋白纤维,然后将丝素蛋白纤维在摩尔比为CaCl2:乙醇:水=2:1:8的溶液中溶解,65℃水浴1小时,使丝素蛋白纤维完全溶解,丝素蛋白纤维溶解后装入透析袋中透析,获得的丝素蛋白在制备发酵培养基时采用辐射灭菌的方式。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的发酵培养基选自以下之一:(1)按500ml计算,30.0g-60.0g的蔗糖,5.0g-10.0g的蛋白胨,0.5g-2.0g的柠檬酸,0.5g-2.0g的Na2HPO4·12H2O,1.0g-2.5g的KH2PO4,0.05g-1.5g的MgSO4·7H2O和丝素蛋白,其中所述的丝素蛋白选自含有4g-8g丝素蛋白的透析溶液或含有4g-8g丝素蛋白的喷雾干燥颗粒,其余为去离子水;或(2)按500ml计算,5.0g-13.0g的果糖,1.0g-4.0g的蛋白胨,0.1g-0.4g的柠檬酸,0.1g-0.4g的Na2HPO4·12H2O,0.5g-0.8g的KH2PO4,0.1g-0.5g的MgSO4·7H2O,4g-8g的丝素蛋白,其余为去离子水;或(3)按500ml计算,20g-30g的葡萄糖,2g-5g的蛋白胨,0.2g-0.6g的柠檬酸,0.2g-0.6g的Na2HPO4·12H2O,1.0g-1.8g的KH2PO4,0.5g-0.8g的MgSO4·7H2O,4g-8g的丝素蛋白,其余为去离子水。
9.根据权利要求4至8之一所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将木醋杆菌于斜面培养基进行活化,取活化后的菌种接种于种子培养基中,放置在摇床上进行培养,获得种子;
(2)将步骤(1)培养所得的种子和液体培养基放入发酵培养基中继续培养,然后在28-30℃下静置培养7至15天,获得复合生物材料支架的初产物;
(3)纯化步骤(2)中的复合生物材料支架的初产物后得到细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料支架。
10.根据权利要求4至8之一所述的方法,其特征在于,所述的纯化步骤包括取出复合生物材料支架 的初产物,滤出水分后在蒸馏水中浸泡十分钟,去除表面的培养基和杂质,滤干蒸馏水浸泡过的复合生物材料支架的初产物的外周水分后移至足够质量体积比为0.1至4%的NaOH溶液中,于60℃水浴中加热1小时,水浴后将复合生物材料支架的初产物取出滤水后再次用蒸馏水浸泡清洗泡十分钟,重复以上水浴步骤3次,清洗后的复合生物材料支架的初产物中加入蒸馏水,并滴入1%的醋酸溶液至溶液pH值为7,再用蒸馏水清洗3-4次。
11.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述菌与丝素蛋白在酸性环境下共同培养。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510382732.6A CN105012158B (zh) | 2013-11-06 | 2014-03-26 | 含细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料支架及制造方法 |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2013105442329 | 2013-11-06 | ||
CN201310544232 | 2013-11-06 | ||
CN201510382732.6A CN105012158B (zh) | 2013-11-06 | 2014-03-26 | 含细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料支架及制造方法 |
CN201410114764.3A CN103893820B (zh) | 2013-11-06 | 2014-03-26 | 丝素蛋白复合生物材料支架及其制备方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410114764.3A Division CN103893820B (zh) | 2013-11-06 | 2014-03-26 | 丝素蛋白复合生物材料支架及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105012158A CN105012158A (zh) | 2015-11-04 |
CN105012158B true CN105012158B (zh) | 2018-06-22 |
Family
ID=50985598
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510382732.6A Active CN105012158B (zh) | 2013-11-06 | 2014-03-26 | 含细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料支架及制造方法 |
CN201410114764.3A Active CN103893820B (zh) | 2013-11-06 | 2014-03-26 | 丝素蛋白复合生物材料支架及其制备方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201410114764.3A Active CN103893820B (zh) | 2013-11-06 | 2014-03-26 | 丝素蛋白复合生物材料支架及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (2) | CN105012158B (zh) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104225669B (zh) * | 2014-08-25 | 2016-04-20 | 华南理工大学 | 生物活性细菌纤维素-玉米醇溶蛋白复合膜及其制备方法 |
CN104845382A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-08-19 | 复旦大学 | 一种蚕丝蛋白/纤维素衍生物共混水凝胶及其制备方法 |
CN108601675A (zh) * | 2015-07-20 | 2018-09-28 | 塔夫茨大学 | 生物可降解的丝质耳管 |
CN105770982A (zh) * | 2016-03-09 | 2016-07-20 | 苏州市贝克生物科技有限公司 | 一种外科手术用粘合剂及其制备方法 |
CN106267370B (zh) * | 2016-08-16 | 2020-01-03 | 东华大学 | 丝素蛋白/纤维素3d打印墨水 |
CN106492286B (zh) * | 2016-09-19 | 2019-04-16 | 盐城工业职业技术学院 | 一种蚕丝蛋白/细菌纤维素复合水凝胶及其制备方法和应用 |
CN110944654B (zh) * | 2017-07-14 | 2023-09-12 | 武汉市康创科技有限公司 | 一种包含脱细胞羊膜的复合膜及其制备方法 |
CN108853594A (zh) * | 2018-06-25 | 2018-11-23 | 东莞市联洲知识产权运营管理有限公司 | 一种纳米蚕丝蛋白粉末增强的纤维素多孔医用支架敷料的制备方法 |
CN108685722A (zh) * | 2018-07-06 | 2018-10-23 | 佛山皖阳生物科技有限公司 | 一种面膜基材的制备方法 |
CN109081933B (zh) * | 2018-08-15 | 2020-07-10 | 华中科技大学 | 一种原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶及其制备方法 |
CN112891608B (zh) * | 2021-01-29 | 2022-05-24 | 西安建筑科技大学 | 一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料及其制备方法 |
CN113230413A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-08-10 | 浙江理工大学 | 一种抗菌丝素蛋白及其制备方法 |
CN116473872B (zh) * | 2023-05-26 | 2023-11-07 | 微赛生物技术(广州)有限公司 | 一种生物纤维面膜基材及其制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005051262A (ja) * | 2004-09-09 | 2005-02-24 | Ube Ind Ltd | 金属張積層板 |
CN101302486A (zh) * | 2008-05-21 | 2008-11-12 | 华中科技大学 | 木醋杆菌及用其制备纳米纤维素皮肤组织修复材料的方法 |
CN102516777A (zh) * | 2011-11-29 | 2012-06-27 | 苏州大学 | 一种丝素蛋白水溶液及其制备方法 |
CN103357060A (zh) * | 2013-07-23 | 2013-10-23 | 海南光宇生物科技有限公司 | 一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料的制备方法 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103007335A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-04-03 | 海南大学 | 壳寡糖/细菌纤维素海绵的制备方法 |
CN103059333A (zh) * | 2012-12-28 | 2013-04-24 | 天津市工业微生物研究所 | 利用植物蛋白及其水解物制备复水性细菌纤维素膜的方法 |
-
2014
- 2014-03-26 CN CN201510382732.6A patent/CN105012158B/zh active Active
- 2014-03-26 CN CN201410114764.3A patent/CN103893820B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005051262A (ja) * | 2004-09-09 | 2005-02-24 | Ube Ind Ltd | 金属張積層板 |
CN101302486A (zh) * | 2008-05-21 | 2008-11-12 | 华中科技大学 | 木醋杆菌及用其制备纳米纤维素皮肤组织修复材料的方法 |
CN102516777A (zh) * | 2011-11-29 | 2012-06-27 | 苏州大学 | 一种丝素蛋白水溶液及其制备方法 |
CN103357060A (zh) * | 2013-07-23 | 2013-10-23 | 海南光宇生物科技有限公司 | 一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103893820B (zh) | 2015-08-05 |
CN103893820A (zh) | 2014-07-02 |
CN105012158A (zh) | 2015-11-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105012158B (zh) | 含细菌纤维素和丝素蛋白的复合生物材料支架及制造方法 | |
CN102250378B (zh) | 一种细菌纤维素/聚合物复合膜及其制备方法 | |
CN103211715B (zh) | 一种具有梯度结构的细菌纤维素面膜及其制备方法 | |
CN102886063A (zh) | 一种纳米微晶纤维素增强胶原复合基质的制备与应用 | |
CN104963094A (zh) | 一种利用微生物产细菌纤维素复合纤维制备的非织造布及其制备方法 | |
CN107049800A (zh) | 一种含有植物提取液的纳米纤维素功面膜的制备方法 | |
CN103059333A (zh) | 利用植物蛋白及其水解物制备复水性细菌纤维素膜的方法 | |
CN107556377A (zh) | 重组人源胶原蛋白及其医用纳米纤维膜 | |
KR20140129509A (ko) | 콜라겐과 코코넛을 이용한 바이오셀룰로오스 마스크시트 제조방법 | |
CN110115347A (zh) | 一种酶解协同发酵改性制备高起泡性蛋清粉的方法 | |
WO2021000589A1 (zh) | 一种生物外科补片的制备方法及基于该方法制备的生物外科补片及其应用 | |
CN103357060B (zh) | 一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料的制备方法 | |
CN108315382A (zh) | 一种利用豆腐黄浆水制备细菌纤维素的方法 | |
CN103083136B (zh) | 一种三明治结构的细菌纤维素液体吸收性材料及其制备方法 | |
CN103041446B (zh) | 一种具有生物相容性的细菌纤维素/胶原复合材料及其制备方法 | |
CN106267310A (zh) | 一种复合细菌纤维素医用敷料的制备方法 | |
CN109554430A (zh) | 一种全发酵细菌纤维素膜及其生产方法与应用 | |
CN106265474B (zh) | 一种利用微生物菌株发酵生产面膜的方法 | |
CN102764451B (zh) | 一种多孔性生物纤维素凝胶材料的制备方法及其应用 | |
CN103222932B (zh) | 一种激光治疗术后修复面膜及其制备方法 | |
CN107177048A (zh) | 一种细菌纤维素‑聚乳酸复合膜及其制备方法和基于该复合膜的载药纱布及制备方法 | |
US20210140100A1 (en) | Bio-cellulose sheet and preparation method thereof | |
KR101583058B1 (ko) | 미생물 발효 셀룰로오스 다공성 필터 및 그 제조방법 | |
CN106214499A (zh) | 一种面膜基材的制备方法 | |
CN108451791A (zh) | 一种丝胶蛋白/透明质酸-细菌纤维素复合生物面膜的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |