CN103357060B - 一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料的制备方法。涉及一种生物材料制备技术。包括：选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30～90wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养3～7d后取出发酵产物。发酵产物经纯化处理、切割，得到细菌纤维素三维网络内部均匀分布有鱼胶原蛋白大分子的细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料。本发明制备过程简单易行、操作方便、成本低，得到的细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料具有止血、保湿、透气、吸收伤口渗出液、促进伤口修复等多重功效，可用于治愈烧伤、烫伤、手术切口等多种皮肤类创伤。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物材料制备技术，特别涉及一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料的制备方法。
背景技术
细菌纤维素是一种优良的生物材料，具有天然的三维纳米网络结构；高抗张强度和弹性模量；高亲水性，良好的透气、吸水、透水性能，非凡的持水性和高湿强度。另外，大量研究表明细菌纤维素具有良好的体内、体外生物相容性和生物可降解性，这使得细菌纤维素本身可以应用于生物医用领域。以细菌纤维素作为敷料的基体材料，利用其本身的吸水性能，可以在保证生物安全性的基础上持续有效的吸收伤口渗出液及代谢产物，并且能够提供给伤口湿润环境以促进伤口更好地愈合。
在细菌纤维素伤口敷料的应用中为了进一步提高细菌纤维素的性能，往往与其他材料复合得到细菌纤维素复合材料。胶原蛋白是结缔组织中一种具有丰富生理功能的重要结构蛋白，它具有独特的大分子三螺旋结构和聚集态结构，使其具有一定的热稳定性和很高的机械韧性和强度，很强的亲水、保湿性能，同时胶原蛋白所特有的极低的抗原性、极高的可生物降解性、生物吸收性、止血功能和促进细胞生长的功能使其成为伤口敷料较为理想的生物材料之一。
目前在细菌纤维素中添加胶原蛋白的方法主要有两种：一种是生物发酵得到细菌纤维素膜后通过表面处理、改性等方式，在细菌纤维素膜的表面复合胶原蛋白（如中国专利CN102352051A）。这种方法使胶原蛋白集中在细菌纤维素的表面，很难进入材料内部，有效加载量较低且影响材料的透气、持水等性能。另一种方法是在培养基中添加胶原蛋白，通过生物发酵得到细菌纤维素复合胶原蛋白膜，这种方法可以在细菌纤维素的生长过程中直接与胶原蛋白复合，使材料结构均匀。如中国专利CN101509025A，在细菌纤维素培养基中直接加入胶原蛋白。一般的胶原蛋白不易溶于水，而能够溶于水的低分子量胶原蛋白成本很高，加入培养基后最终与细菌纤维素复合的量很少。另外，传统的胶原蛋白来源是从猪、牛的皮和骨，以及禽类组织中提取。但近年来因疯牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆发，尤其是H5N1，H7N9等新亚型流感病毒的出现，使人们对牲畜与禽类胶原制品安全性产生严重疑虑。另外，由于宗教和习俗等原因，从猪皮牛皮中提取胶原蛋白受到很大限制，因此，寻找胶原蛋白的新来源显得愈来愈迫切。从海水或淡水鱼体废弃物提取安全性高、吸收率高、生物活性更强的胶原蛋白将成为胶原蛋白产品提取的主要来源。
本专利利用鱼胶原蛋白提取过程中产生的高分子量胶原蛋白水溶液作为培养基，采用微生物发酵技术制备细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料。制备过程简单易行、操作方便、成本低，得到的细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料具有止血、保湿、透气、吸收伤口渗出液、促进伤口修复等多重功效，可用于治愈烧伤、烫伤、手术切口等多种皮肤类创伤。
发明内容
本发明的目的是提供一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料的制备方法。涉及一种生物材料制备技术。本发明制备过程简单易行、操作方便、成本低，得到的细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料具有止血、保湿、透气、吸收伤口渗出液、促进伤口修复等多重功效，可用于治愈烧伤、烫伤、手术切口等多种皮肤类创伤。
本发明的公开了一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料的制备方法，包括：选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30～90wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养5～9d后取出发酵产物。发酵产物经纯化处理，切割，得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料。
所述的能分泌细菌纤维素的菌株是木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。
所述的含有鱼胶原蛋白水溶液是由鱼体废弃物经酶解处理得到的。目前鱼胶原蛋白的提取方法有酶解法、酸解法、碱解法、盐解法等，但是酸解法、碱解法和盐解法在提取过程中都需要加入大量的酸、碱或盐类试剂，得到的鱼胶原蛋白溶液不适于菌株的发酵培养。因此，本专利涉及的鱼胶原蛋白溶液来自于提取过程较为绿色的酶解法。
所述的酶解处理步骤为：
（1） 将干净鱼体废弃物剪切成50～200目的鱼粉，加入占鱼粉重量3～10倍的蒸馏水以及占鱼粉质量的0.1～1%的反应酶，混合制成浆液；其中反应酶由脂肪酶与蛋白酶组成且质量比为1:2～4；
（2） 浆液在反应温度为50～70℃，pH为7～9，搅拌0.5～2h；反应后浆液中加入少量氢氧化钠，并加热至80～90℃，搅拌20～30min；
（3） 过滤浆液，滤液由截留分子量为100～300kDa透析袋透析7天，透析后的保留液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白水溶液。
所述的含有鱼胶原蛋白水溶液中鱼胶原蛋白分子量为100～300kDa，鱼胶原蛋白含量为1～5wt%。胶原蛋白是人体烧伤、烫伤以及手术伤口重建过程中各阶段至关重要的物质之一，高分子量的鱼胶原蛋白具有与人体胶原蛋白相似的三螺旋结构，其能够促进成纤维素细胞的增殖，加快伤口组织的愈合，因此在本专利中选用分子量为100～300kDa的鱼胶原蛋白水溶液。本专利利用鱼胶原蛋白提取过程中产生的高分子量胶原蛋白水溶液作为培养基，来源广泛且成本低廉。
所述的发酵培养基为：每1L的鱼胶原蛋白水溶液中含有葡萄糖30～100g、磷酸氢二钠1～4g、磷酸二氢钾1～4g、酵母膏1～5g、蛋白胨1～5g。
所述的纯化处理方法为，发酵产物在质量百分含量为1～8%的NaOH水溶液中，在30～100℃的温度下加热3～6h，再用水反复冲洗至中性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本专利利用鱼胶原蛋白提取过程中产生的高分子量胶原蛋白水溶液作为培养基，来源广泛且成本低廉。采用微生物发酵技术制备细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料。制备过程简单易行、操作方便、成本低，由菌株发酵得到的细菌纤维素三维网络内部均匀分布有鱼胶原蛋白大分子，且细菌纤维素的直链分子与鱼胶原蛋白三螺旋结构分子链间存在氢键作用。这种结构提高了鱼胶原蛋白的热稳定性和力学性能，同时赋予了细菌纤维素伤口敷料止血功能，并且进一步促进了伤口愈合，并且具有保湿、透气、吸收伤口渗出液等多重功效，可用于治愈烧伤、烫伤、手术切口等多种皮肤类创伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：
1、将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成50目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为3倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由中性脂肪酶和菠萝蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.1%，且中性脂肪酶与菠萝蛋白酶的质量比1: 4。
2、配制好的浆液控制反应温度为50℃，pH为7，搅拌2h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.1%的氢氧化钠，加热至90℃，搅拌20min；过滤浆液，滤液由截留分子量为100kDa透析袋透析7天，透析后的保留液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白水溶液。
3、透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为1wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量为100～300kDa。每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖30g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾1g、酵母膏1g、蛋白胨1g配制发酵培养基。
4、选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养7d后取出发酵产物。
5、发酵产物在质量百分含量为3%的NaOH水溶液中，在80℃的温度下加热6h。再用水反复冲洗至中性。以除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料，细菌纤维素三维网络内部均匀分布有鱼胶原蛋白大分子，且细菌纤维素的直链分子与鱼胶原蛋白三螺旋结构分子链间存在氢键作用。
实施例2：
1、将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成100目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为5倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由中性脂肪酶和碱性蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.3%，且中性脂肪酶与碱性蛋白酶的质量比1: 4。
2、配制好的浆液控制反应温度为55℃，pH为7.5，搅拌1.5h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.2%的氢氧化钠，加热至80℃，搅拌30min；过滤浆液，滤液由截留分子量为150kDa透析袋透析7天，透析后的保留液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白水溶液。
3、透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为2wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量为150～300kDa。每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖100g、磷酸氢二钠4g、磷酸二氢钾4g、酵母膏5g、蛋白胨5g配制发酵培养基。
4、选取能分泌细菌纤维素的八叠球菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为50wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养5d后取出发酵产物。
5、发酵产物在质量百分含量为2%的NaOH水溶液中，在100℃的温度下加热6h。再用水反复冲洗至中性。以除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料，细菌纤维素三维网络内部均匀分布有鱼胶原蛋白大分子，且细菌纤维素的直链分子与鱼胶原蛋白三螺旋结构分子链间存在氢键作用。
实施例3：
1、将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成150目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为7倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由中性脂肪酶和胰蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.5%，且中性脂肪酶与胰蛋白酶的质量比1:3。
2、配制好的浆液控制反应温度为70℃，pH为7.5，搅拌1h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.3%的氢氧化钠，加热至90℃，搅拌30min；过滤浆液，滤液由截留分子量为200kDa透析袋透析7天，透析后的保留液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白水溶液。
3、透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为3wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量为200～300kDa。每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖50g、磷酸氢二钠2g、磷酸二氢钾2g、酵母膏3g、蛋白胨2g配制发酵培养基。
4、选取能分泌细菌纤维素的无色杆菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为70wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养9d后取出发酵产物。
5、发酵产物在质量百分含量为1%的NaOH水溶液中，在90℃的温度下加热3h。再用水反复冲洗至中性。以除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料，细菌纤维素三维网络内部均匀分布有鱼胶原蛋白大分子，且细菌纤维素的直链分子与鱼胶原蛋白三螺旋结构分子链间存在氢键作用。
实施例4：
1、将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成200目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为9倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由碱性脂肪酶和菠萝蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.7%，且碱性脂肪酶与菠萝蛋白酶的质量比1:3。
2、配制好的浆液控制反应温度为65℃，pH为8，搅拌0.5h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.4%的氢氧化钠，液加热至80℃，搅拌20min；过滤浆液，滤液由截留分子量为250kDa透析袋透析7天，透析后的保留液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白水溶液。
3、透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为4wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量为250～300kDa。每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖80g、磷酸氢二钠3g、磷酸二氢钾3g、酵母膏4g、蛋白胨3g配制发酵培养基。
4、选取能分泌细菌纤维素的气杆菌属和固氮菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为90wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养8d后取出发酵产物。
5、发酵产物在质量百分含量为5%的NaOH水溶液中，在50℃的温度下加热4h。再用水反复冲洗至中性。以除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料，细菌纤维素三维网络内部均匀分布有鱼胶原蛋白大分子，且细菌纤维素的直链分子与鱼胶原蛋白三螺旋结构分子链间存在氢键作用。
实施例5：
1、将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成50目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为10倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由碱性脂肪酶和碱性蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.9%，且碱性脂肪酶与碱性蛋白酶的质量比1:2。
2、配制好的浆液控制反应温度为60℃，pH为8.5，搅拌1h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.5%的氢氧化钠，加热至90℃，搅拌30min；过滤浆液，滤液由截留分子量为300kDa透析袋透析7天，透析后的保留液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白水溶液。
3、透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为5wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量约为300kDa。每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖70g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾1g、酵母膏5g、蛋白胨1g配制发酵培养基。
4、选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌和产碱菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为80wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养6d后取出发酵产物。
5、发酵产物在质量百分含量为8%的NaOH水溶液中，在30℃的温度下加热6h。再用水反复冲洗至中性。以除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料，细菌纤维素三维网络内部均匀分布有鱼胶原蛋白大分子，且细菌纤维素的直链分子与鱼胶原蛋白三螺旋结构分子链间存在氢键作用。
实施例6：
1、将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成100目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为7倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由碱性脂肪酶和胰蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的1%，且碱性脂肪酶与胰蛋白酶的质量比1:2。
2、配制好的浆液控制反应温度为55℃，pH为7，搅拌0.5h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.1%的氢氧化钠，加热至90℃，搅拌30min；过滤浆液，滤液由截留分子量为100kDa透析袋透析7天，透析后的保留液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白水溶液。
3、透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为3wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量为100～300kDa。每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖40g、磷酸氢二钠2g、磷酸二氢钾2g、酵母膏1g、蛋白胨5g配制发酵培养基。
4、选取能分泌细菌纤维素的根瘤菌属和假单胞菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为60wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养6d后取出发酵产物。
5、发酵产物在质量百分含量为4%的NaOH水溶液中，在60℃的温度下加热6h。再用水反复冲洗至中性。以除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料，细菌纤维素三维网络内部均匀分布有鱼胶原蛋白大分子，且细菌纤维素的直链分子与鱼胶原蛋白三螺旋结构分子链间存在氢键作用。
具体试验效果如下：
1.机械性能测试
实施例1、2、3、4、5、6所得敷料的物理-机械性能如表1所示。参照《GB/T 14335-2008化学纤维短纤维线密度试验方法》测试纤维的线密度，参照《GB/T14337-2008化学纤维短纤维拉伸性能试验方法》测试纤维的断裂强度和断裂延伸率。
表1细菌纤维素与天然多糖共混纤维的物理-机械性能
2.透湿率和吸湿性测试
表2
| 样品 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 医用纱布 |
| 透湿率（g/m2.h） | 60.25+1.25 | 56.52+1.23 | 57.12+1.51 | 63.37+1.61 | 60.46+1.73 | 59.95+1.47 | 65.42+1.02 |
| 吸收性 | 10.65+0.98 | 13.70+0.84 | 12.95+1.13 | 10.81+2.01 | 11.46+0.74 | 10.19+1.50 | 10.33+0.74 |
3. 潮湿条件下的阻菌性
按照YY/T 0471.5接触性创面敷料试验方法第5部分阻菌性潮湿条件下的阻菌性步骤测定。半固体敷料：样品处理方法取医用湿性烧伤伤口敷料若干，厚度3mm为阻菌样品备用。片状敷料：样品制备方法取医用水凝胶敷料剪切为5cm×5cm阻菌样品备用。试验中的肉汤瓶中应无粘质沙雷菌生长。
表3
Claims (1)
1.一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料的制备方法，其特征是：（1）将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成200目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为9倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由碱性脂肪酶和菠萝蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.7%，且碱性脂肪酶与菠萝蛋白酶的质量比1:3；
（2）配制好的浆液控制反应温度为65℃，pH为8，搅拌0.5h进行酶解反应，反应后的浆液中加入占其质量0.4%的氢氧化钠，加热至80℃，搅拌20min；过滤浆液，滤液由截留分子量为250kDa透析袋透析7天，透析后的保留液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白水溶液；
（3）透析后的保留液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白水溶液，含4wt%的鱼胶原蛋白，其中鱼胶原蛋白分子量为250～300kDa，每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖80g、磷酸氢二钠3g、磷酸二氢钾3g、酵母膏4g、蛋白胨3g配制发酵培养基；
（4）选取能分泌细菌纤维素的气杆菌属和固氮菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为90wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养8d后取出发酵产物；
（5）发酵产物在质量百分含量为5%的NaOH水溶液中，在50℃的温度下加热4h，再用水反复冲洗至中性，以除去菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基，切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白伤口敷料。
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