CN112442200B - 一种细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法，本发明采用的细菌纤维素是一种天然的生物高聚物，其本身具有较大的长度并呈超精细网状结构，细菌纤维素表面的多羟基活性基团与胶原蛋白以氢键结合，不仅能显著提高胶原蛋白的自组装进程、有效缩短制备时间，而且，胶原蛋白吸附在细菌纤维素表面以细菌纤维素为核进行自组装后，会在整体上呈现出网络状结构，提高胶原蛋白自组装材料的溶胀率、保水率、可塑性等性能；另外，本发明的细菌纤维素与胶原蛋白均为天然高分子材料，均具有优良的生物相容性和生物降解性，整个制备过程制备方法简单可控，无需经过表面修饰及化学改性，无残留、无毒性，绿色环保。
Description
技术领域
本发明涉及天然高分子材料的制备技术领域，具体指一种细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法。
背景技术
胶原蛋白是生物结缔组织中的主要组成部分，具有良好的生物相容性、可生物降解性和弱抗原性，在一定条件下，胶原蛋白能够在体外自发组装形成高度有序的网状结构，胶原蛋白的自组装对胶原蛋白的生物学性能、机械性能有改善作用，在耐酶降解性和生物力学性能等方面均显著优于胶原单体分子的性能表现，有利于细胞的黏附、增殖、扩散和迁移。
申请号为CN201611153878.4的中国发明专利申请《一种胶原蛋白自组装的方法》对分子量为250-350kDa的胶原蛋白进行了自组装，其加入聚乙二醇，调节pH值为8.0，在恒温条件下，采用红外辐照，在摇床摇动下进行自组装。上述方法虽然提高了胶原蛋白的自组装程度，但是，其属于单一的胶原蛋白自组装，不仅自组装条件苛刻，而且在性能上存在很大的不足，如成型性、力学性能、热稳定性较差，大大限制了其应用。
为了解决上述问题，专利号为ZL201410061432.3的中国发明专利《含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料制备方法》，通过微生物培养制得了含胶原蛋白的细菌纤维素复合羊膜细胞外基质材料；申请号为CN200910019951.2的中国发明专利申请《细菌纤维素复合材料的制备方法》，在细菌纤维素培养基中加入海藻酸钠、胶原蛋白、水溶性甲壳素、明胶或透明质酸高分子材料培养出细菌纤维素复合膜。
细菌纤维素具有高结晶度、高聚合度、超精细网状结构、高弹性模量和抗张强度等独特的物理化学性能，将胶原蛋白与细菌纤维素结合有利于提高胶原蛋白的性能。然而，上述现有制备方法主要是在细菌纤维素生物培养过程中加入胶原蛋白制备复合细菌纤维素膜，均是以生物培养法为主、细菌纤维素为基底制备膜材料，制备时间长、过程复杂、可控性较差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状，提供一种方法简单可控、能有效缩短制备时间的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法，该方法能有效提高胶原蛋白自组装材料的溶胀率及保水率。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将胶原蛋白粉溶于磷酸盐缓冲溶液配置成100～2000μg/mL的胶原蛋白溶液；
(2)将干粉状或匀浆状的细菌纤维素加入上述胶原蛋白溶液中，超声搅拌后，将混合溶液的pH调节至6.5～8.5，在25～45℃恒温条件下，自组装2～24h，得到细菌纤维素复合胶原蛋白自组装溶液；
(3)对步骤(2)得到的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装溶液进行透析处理；
(4)在步骤(3)透析后得到的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装溶液中加入甘油及纳米银颗粒，并进行超声分散处理；
(5)向步骤(4)所得溶液中加入交联剂，交联处理至成型后进行分离、水洗、冷冻干燥，即得到所述的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料。
上述步骤(2)中调节pH可采用1.5mol/L的稀盐酸或氢氧化钠水溶液。
在本发明中，所述细菌纤维素与胶原蛋白粉的质量比为1:(1～20)。
优选地，所述甘油以5％甘油水溶液的形式加入，甘油水溶液的加入量为步骤(1)中胶原蛋白溶液的2％～10％。由于本发明中的胶原蛋白在细菌纤维素上自组装之后会呈现较脆的特性，甘油以水溶液的形式加入，有利于提高甘油的分散速度及均匀性，从而提高细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的可塑性，使其具有更好的弹性及延展性，改善其原有的脆性。
优选地，所述纳米银颗粒的加入量为：每10mL胶原蛋白溶液中加入0.04～0.4mg。步骤(4)中，纳米银颗粒与甘油的加入顺序为先加入纳米银颗粒再加入甘油。加入上述纳米银颗粒，不仅可起到抗菌效果，而且其有利于提高甘油的分散效果。
优选地，步骤(1)中所述胶原蛋白粉选自鼠尾胶原蛋白、鱼源胶原蛋白、牛胶原蛋白或猪胶原蛋白。
优选地，步骤(3)中所述透析的具体步骤为：将步骤(2)得到的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装溶液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，每隔2～4h换一次水透析12～36h。
优选地，步骤(5)中所述的交联剂选自甲醛、戊二醛或改性戊二醛。进一优选为其中两种的混合物。
优选地，步骤(5)中所述交联剂的体积浓度为0.5～5％。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明采用的细菌纤维素是由醋酸菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属和八叠球菌属等中的某种微生物合成的纤维素，是一种天然的生物高聚物，其本身具有较大的长度并呈超精细网状结构，细菌纤维素表面的多羟基活性基团与胶原蛋白以氢键结合，不仅能显著提高胶原蛋白的自组装进程、有效缩短制备时间，而且，胶原蛋白吸附在细菌纤维素表面进行自组装后，会在整体上呈现出网络状结构，提高胶原蛋白自组装材料的溶胀率、保水率、可塑性等性能；另外，本发明的细菌纤维素与胶原蛋白均为天然高分子材料，均具有优良的生物相容性和生物降解性，整个制备过程制备方法简单可控，无需经过表面修饰及化学改性，无残留、无毒性，绿色环保。
附图说明
图1为本发明实施例3所得产物的SEM图。
图2为本发明实施例2的紫外图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1：
本实施例的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法包括以下步骤：
(1)取鱼皮胶原蛋白粉溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中配置成2000μg/mL的鱼胶原蛋白溶液；
(2)将200mg细菌纤维素匀浆(固含量为10％)加入到10mL鱼皮胶原蛋白溶液中，调节溶液pH至8.5，超声搅拌10min后在37℃静置12h进行自组装；
(3)将制得的细菌纤维素复合鱼胶原蛋白自组装溶液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，透析12h，每隔4h换一次水；
(4)在透析后的细菌纤维素复合鱼胶原蛋白自组装溶液中加入5％的甘油1mL，纳米银颗粒0.1mg，超声搅拌分散30min；
(5)在步骤(4)得到的溶液中加入2％的戊二醛溶液1mL固定60min成型后，过滤分离，水洗3次，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥，即得到目标产物细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料。
实施例2：
本实施例的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法包括以下步骤：
(1)取适量牛血清胶原蛋白粉溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中配置成1000μg/mL的牛血清胶原蛋白溶液；
(2)将2.5mg细菌纤维素干粉和50mL牛血清胶原蛋白溶液混合，调节溶液pH至8.0，超声分散30min后在25℃静置24h进行自组装；
(3)将细菌纤维素复合牛血清胶原蛋白自组装溶液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，每隔4h换一次水透析24h；
(4)在透析后的细菌纤维素复合牛血清胶原蛋白自组装溶液中加入5％的甘油1.5mL，纳米银颗粒0.2mg，超声搅拌分散30min；
(5)在步骤(4)得到的细菌纤维素复合牛血清胶原蛋白自组装溶液中加入1.5％的甲醛溶液2.0mL，固定240min后离心分离，水洗3次，制得细菌纤维素复合牛血清胶原蛋白自组装凝胶材料。
自组装过程中的紫外吸光度如图2所示，结果表明，210min时自组装已完成，表明胶原蛋白的自组装进程得到显著提高、有效缩短了制备时间。
实施例3：
本实施例的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法包括以下步骤：
(1)取鼠尾胶原蛋白溶于pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液配置成100μg/mL的鼠尾胶原蛋白溶液；
(2)将0.2mg细菌纤维素干粉和10mL鼠尾胶原蛋白溶液混合，调节溶液pH至8.0，超声分散30min后在35℃静置4h进行自组装；
(3)将细菌纤维素复合牛血清胶原蛋白自组装溶液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，每隔4h换一次水透析24h；
(4)在透析后的细菌纤维素复合鼠尾胶原蛋白自组装溶液中加入5％的甘油0.2mL，纳米银颗粒0.05mg，超声搅拌分散30min；
(5)将步骤(4)得到的鼠尾胶原蛋白自组装溶液中加入0.5％的改性戊二醛溶液0.2mL固定30min后离心分离，水洗3次，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥，得到直径为50～300nm的自组装胶原纤维。
如图1所示，可以看出，胶原蛋白以细菌纤维素为核进行自组装后得到了具有较长纤维长度且呈网络状结构的产物；经过测试，该产物的吸水率为150％～200％，溶胀率为50～150％，热变性温度比纯胶原蛋白提高了8℃。
实施例4：
本实施例的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法包括以下步骤：
(1)将猪胶原蛋白溶于磷酸盐缓冲溶液中配置成1500μg/mL的猪胶原蛋白溶液；
(2)将50mg细菌纤维素干粉和50mL鼠尾胶原蛋白溶液混合，调节溶液pH至6.5，超声分散45min后在35℃静置24h进行自组装；
(3)将细菌纤维素复合牛血清胶原蛋白自组装溶液装入截留分子量为8000～14000道尔顿的透析袋中，每隔4h换一次水透析24h；
(4)在透析后的细菌纤维素复合猪胶原蛋白自组装溶液中加入5％的甘油2mL，纳米银颗粒2mg，超声搅拌分散30min；
(5)在步骤(4)制得的溶液中加入0.5％的改性戊二醛溶液及1.5％的甲醛溶液各2mL固定200min后，离心分离，水洗3次，然后在冷冻干燥机中冷冻干燥，得自组装胶原复合材料，经测试其溶胀率为50～150％。
Claims (7)
1.一种细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将胶原蛋白粉溶于磷酸盐缓冲溶液配置成100 ~ 2000μg/mL的胶原蛋白溶液；所述胶原蛋白粉选自鼠尾胶原蛋白、鱼源胶原蛋白、牛胶原蛋白或猪胶原蛋白；
（2）将干粉状或匀浆状的细菌纤维素加入上述胶原蛋白溶液中，超声搅拌后，将混合溶液的pH调节至6.5 ~ 8.5，在25 ~ 45°C恒温条件下，自组装2 ~ 24h，得到细菌纤维素复合胶原蛋白自组装溶液；
所述细菌纤维素与胶原蛋白粉的质量比为1 : (1 ~ 20)；
（3）对步骤（2）得到的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装溶液进行透析处理；
（4）在步骤（3）透析后得到的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装溶液中加入甘油及纳米银颗粒，并进行超声分散处理；
（5）向步骤（4）所得溶液中加入交联剂，交联处理至成型后进行分离、水洗、冷冻干燥，即得到所述的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料。
2.根据权利要求1所述的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法，其特征在于：所述甘油以5%甘油水溶液的形式加入，甘油水溶液的加入量为步骤（1）中胶原蛋白溶液的2% ~ 10%。
3.根据权利要求1所述的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法，其特征在于：所述纳米银颗粒的加入量为：每10mL胶原蛋白溶液中加入0.04 ~ 0.4mg。
4.根据权利要求1或2或3所述的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述透析的具体步骤为：将步骤（2）得到的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装溶液装入截留分子量为8000~14000道尔顿的透析袋中，每隔2 ~ 4h换一次水透析12~36h。
5.根据权利要求1或2或3所述的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述的交联剂选自甲醛、戊二醛或改性戊二醛。
6.根据权利要求1或2或3所述的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述交联剂的体积浓度为0.5~5%。
7.根据权利要求1或2或3所述的细菌纤维素复合胶原蛋白自组装材料的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，纳米银颗粒与甘油的加入顺序为先加入纳米银颗粒再加入甘油。
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