CN112891608B - 一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料及其制备方法 - Google Patents

一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料及其制备方法，该伤口辅料为复合薄膜形态，该复合薄膜由细菌纤维素、丝胶和薄荷油组成；细菌纤维素是通过微生物发酵合成的3D网状生物高分子聚合物，有良好的透气、透水和持水性能，力学性能优异，满足伤口敷料的基本要求。丝胶是蚕茧中的天然亲水性蛋白，具有成为一种新型伤口敷料的潜力，它对成纤维细胞和角质形成细胞具有细胞保护和有丝分裂作用，能够促进纤维增值，使其对皮肤的发育有吸引力，此外，丝胶具有良好的亲水性、生物相容性、生物降解性和对生物分子的良好亲和力，使得丝胶的优异保湿性有利于加速伤口愈合。

Description

一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料及其制备 方法
【技术领域】
本发明属于伤口敷料技术领域，具体涉及一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料及其制备方法。
【背景技术】
皮肤作为人体的保护屏障，防止微生物入侵。据世界卫生组织统计，每年有30万人死于皮肤损伤，使皮肤损伤成为主要的社会和经济负担。目前，微生物感染仍然是临床实践中死亡的主要原因之一，且微生物的抗药性越来越强，因此，急迫的需要开发高效抗菌应用的新材料和新技术。
伤口敷料作为一种生物材料，旨在为细胞粘附和适当增殖创造合适的微环境，以恢复受伤皮肤的生理和结构特性。迄今已有许多伤口敷料，应无毒、无致敏、不附着在皮肤上，并具有抗菌能力，具有足够的透气性，吸收多余的渗出液，在潮湿的环境中保持伤口表面，并以最小的疼痛去除。传统的敷料，如棉绒线、合成和天然绷带、纱布等，具有一定的生物相容性和较弱的吸收能力，但在去除敷料时会对伤口组织造成继发性创伤，同时也无法保持创面湿润，创面愈合延迟。
目前大多数伤口敷料使用银，铜，金属离子，氧化物以及有机抑菌剂等传统抑菌剂，它们必须依赖液体环境进行药物释放，通过接触破坏细菌组织或者遗传物质来抑制细胞繁殖生长。
【发明内容】
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料及其制备方法，以解决现有技术中已有敷料难以保持创面湿润，创面愈合时间长的问题。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料，由细菌纤维素、丝胶和薄荷油纳米粒子组成的复合膜；部分细菌纤维素的端部和丝胶连接形成枝状物；所述枝状物和细菌纤维素相互交错形成网状结构，薄荷油纳米粒子镶嵌在网状结构中。
本发明的进一步改进在于：
优选的，所述网状结构的孔洞为20-90μm。
一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将无水葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨和磷酸氢二钠加入至水中，搅拌溶解后，加入冰醋酸调节pH值，灭菌冷却后制得细菌纤维素的BC液体培养基；
步骤2，将蚕茧至于碳酸钠溶液中，加热搅拌后抽滤，让经过抽滤后的蚕茧再次浸入至碳酸钠中，通过油浴煮沸后，将得到的溶液通过比色管减压抽滤，得到丝胶溶液；
步骤3，将加热的丝胶溶液加入至BC液体培养基中，得到液体培养基C，所述丝胶溶液和BC液体培养基的混合体积比为1:(5-15)，将液体培养基C震荡后接种木醋杆菌，得到液体培养基D，振荡液体培养基D后得到接种培养成接枝有丝胶的细菌纤维素复合膜；
步骤4，将接枝有丝胶的细菌纤维素复合膜冷冻干燥后，得到接枝有丝胶的细菌纤维素复合干燥膜；将所述复合干燥膜浸润在薄荷油纳米粒子中，然后将浸润有复合干燥膜薄荷油纳米粒子置于烘箱中，在40℃的烘箱中浸渍4-8小时后，得到镶嵌有薄荷油纳米粒子的接枝有丝胶的细菌纤维素复合膜，为所述的细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料。
优选的，步骤1中，加入至水中的无水葡萄糖的浓度为25g/L、酵母浸粉的浓度为7.5g/L，蛋白胨的浓度为10g/L，磷酸氢二钠的浓度为10g/L。
优选的，步骤1中，pH值为4-5。
优选的，步骤1中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。
优选的，步骤2中，将蚕茧至于碳酸钠溶液中，加热至70℃并搅拌后抽滤；油浴煮沸温度为120℃，油浴煮沸时间为3h。
优选的，步骤3中，液体培养基C的震荡温度为30℃，震荡时间为2h。
优选的，步骤3中，木醋杆菌和液体培养基C体积比为200μL：33mL。
优选的，所述薄荷油纳米粒子和液体培养基D的体积比为(1-3):10。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料，该伤口辅料为复合薄膜形态，该复合薄膜由细菌纤维素、丝胶和薄荷油组成；细菌纤维素是通过微生物发酵合成的3D网状生物高分子聚合物，有良好的透气、透水和持水性能，力学性能优异，满足伤口敷料的基本要求。丝胶是蚕茧中的天然亲水性蛋白，具有成为一种新型伤口敷料的潜力，它对成纤维细胞和角质形成细胞具有细胞保护和有丝分裂作用，能够促进纤维增值，使其对皮肤的发育有吸引力，此外，丝胶具有良好的亲水性、生物相容性、生物降解性和对生物分子的良好亲和力，使得丝胶的优异保湿性有利于加速伤口愈合。该复合膜中的细菌纤维素与传统的敷料相比，它具有双重抑菌性。薄荷精油作为植物精油的一种，杀菌谱广，对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、病原真菌等均有一定的杀菌活性，植物精油气味芳香，对皮肤和粘膜刺激性小，具有很好的开发前景，除此之外，薄荷精油中酚类物质进攻微生物的细胞膜或细胞壁，导致了细胞膜功能受到影响，细胞内容物外泄，最终导致细菌死亡，薄荷精油的加入克服了细菌纤维素没有抑菌性，无法抑制伤口周围细菌生长的弊端，另一方面，作为敷料基材的丝胶自身就具有一定的抑菌性能，可以发挥协同抑菌作用。该复合膜具有优异的抑菌性能，对大肠杆菌具有优异的抑菌性能，与传统抑菌剂相比，安全高效，提供了湿润的环境，且不会使细菌产生抗药性。在经过7天的抑菌圈试验之后，与第一天相比依然能获得良好的抑菌效果。该复合膜具有有一定的抑菌性和促进伤口愈合的性能，与细菌纤维素结合改善了其机械性能差的缺点，加上植物精油优良的抑菌性能，对细胞无毒性，形成协同抑菌体系，达到了伤口敷料的要求，薄荷精油纳米粒子比起其他金属离子等抑菌剂，更安全可靠。
本发明还公开了一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料的制备方法，在此制备方法中提出了一种生物共混自生长的概念，使细菌纤维素和丝胶溶液通过生物自生长结合在一起。该制备方法在制备过程中通过将在液体培养基中加入木醋杆菌悬液和丝胶溶液，制备过程中限定的丝胶溶液和液体培养基的比例能够保证整个膜的制备均匀性好，且丝胶提取过程环保，浸渍薄荷油纳米粒子方法简单。
【附图说明】
图1为PONPS/BC/SS复合膜在制备过程中各阶段产物的SEM对比图；
其中，(a)图为BC(SS)；(b)图为BC/SS；(c)图为PO-BC/SS；(d)图为PO-BC/SS；(e)图为PONPS-BC/SS；(f)图为PONPS-BC/SS；
图2为不同复合膜的红外光谱图；
图3为不同浸渍时间复合膜的抑菌性能以及抑菌持久性；
其中，(a)(b)(c)图分别为浸渍薄荷油纳米粒子4h、6h、8h在24h后的抑菌圈；
(d)(e)(f)图分别为浸渍薄荷油纳米粒子4h、6h、8h在72h后的抑菌圈；
图4为BC和SS不同比例下复合膜的抑菌性以及持久性；
其中，(a)(b)(c)图分别为BC：SS＝1:5、1:10、1:15在24h后的抑菌圈
(d)(e)(f)图分别为BC：SS＝1:5、1:10、1:15在72h后的抑菌圈
图5为不同浸渍用量下抑菌性能以及抑菌持久性；
其中，(a)(b)(c)图分别为浸渍薄荷油纳米粒子1ml、2ml、3ml在24h后的抑菌圈(d)(e)(f)图分别为浸渍薄荷油纳米粒子1ml、2ml、3ml在72h后的抑菌圈
图6为小鼠14天的伤口感染模型；
其中，第一排为空白组、第二排(A组)为BC/SS；第三排(B组)为PONPS-BC/SS
图7为小鼠伤口尺寸随时间的闭合情况的示意图
【具体实施方式】
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制；术语“第一”、“第二”、“第三”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性；此外，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
本发明提供了一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料及其制备方法，该制备方法具体包括以下步骤：
步骤1，细菌纤维素(BC)的制备
在一定体积的去离子水中，按照以下浓度依次加入葡萄糖25g/L、酵母浸粉7.5g/L、蛋白胨10g/L和磷酸氢二钠10g/L，充分搅拌溶解，用冰醋酸调节培养基pH为4-5，以提供木醋杆菌生长的适宜环境，分装在锥形瓶中，用2-3层纱布封口后，放入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，保证木醋杆菌生长的环境绝对无菌。灭菌后冷却，制得细菌纤维素液体培养基，即为BC液体培养基；
步骤2，丝胶(SS)的提取
采用皂碱法提取丝胶，具体的工艺流程为：①蚕茧洗涤：将蚕茧剪成0.5cm乘以0.5cm的小正方形，称取5g置于0.02M，100ml碳酸钠溶液，以清洗蚕茧表面的杂质，将碳酸钠溶液加热至70℃并使用电动搅拌10min，冷却至室温，减压抽滤。②将上述抽滤后的蚕茧置于0.01M，100ml碳酸钠溶液中，在120℃油浴中煮沸3h，留下溶液。③将溶液用比色管减压抽滤3次，以得到纯净的丝胶溶液，得到丝胶溶液，即为SS溶液。
步骤3，BC/SS复合膜的制备
将步骤2制备好的丝胶(SS)溶液加热至40℃，使得丝胶在后续过程中能够以最佳的形式与细菌纤维素结合，在50mL锥形瓶中加入加热后的3mL的SS溶液和(15-45)mL的BC液体培养基混合，得到液体培养基C，该体积配比能够保证整个膜均匀性好；将液体培养基C放入恒温(30℃，120rpm/min)振荡器中振荡2小时，使细菌纤维素与丝胶溶液充分混合均匀，进一步进行生物自生长。然后接种木醋杆菌悬液200μL，得到液体培养基D，将液体培养基D振荡12小时，用移液枪取10mL，加入到六孔培养皿中，透气保存到生化培养箱中。约5天成膜，取出复合膜，并用2％NaOH溶液将表面培养基清洗干净，再用去离子水彻底清洗，得到接枝有丝胶的细菌纤维素复合膜，即为BC/SS复合膜。
步骤4，浸渍薄荷油纳米粒子-BC/SS复合膜的制备：
将培养好的BC/SS复合膜用冷冻干燥机冷冻干燥，得到有三维结构的BC/SS复合干燥膜，在10mL的小烧杯中加入(1-3)mL液体状的薄荷油纳米粒子，将制备好的BC/SS复合干膜放入其中，在40℃烘箱浸渍4-8h，该浸渍时间发现6小时为最佳的浸渍时间，浸渍时间短抑菌性能不好，温度高会影响纳米粒子活性。将复合膜表面的精油用滤纸吸干，然后用去离子水冲洗干净，常温保存，最后制得镶嵌有薄荷油纳米粒子的接枝有丝胶的细菌纤维素复合膜，简写为PONPS-BC/SS。
对比例1制备BC膜
在一定体积的去离子水中，按照以下浓度依次加入葡萄糖25g/L、酵母浸粉7.5g/L、蛋白胨10g/L和磷酸氢二钠10g/L，充分搅拌溶解，用冰醋酸调节培养基pH为4-5，分装在锥形瓶中，用2-3层纱布封口后，放入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，灭菌后冷却，制得BC液体培养基。
待液体培养基冷却后，在超净的工作台上(紫外灭菌2h)，用无菌接种环接种2-3mL已经活化的木醋杆菌悬液，接种到液体培养基中，用无菌纱布封口后，置于恒温生化培养箱中，30℃恒温静置培养7天。之后可在气-液面观察到有白色乳状薄膜产生，取出薄膜用去离子水冲洗干净，将冲洗干净的薄膜在2％NaOH溶液中加热去除附着物，再去离子水冲洗至中性，将冲洗后的薄膜放入蒸馏水中保存，为BC膜。实验过程中采用相同物料配比的培养基，对细菌生长无明显影响。在细菌纤维素膜成型的过程中，每一层都会独立存在。
对比例2，制备BC/SS膜
步骤1，细菌纤维素(BC)的制备
步骤1.1，BC液体培养基的配置：
在一定体积的去离子水中，按照以下浓度依次加入葡萄糖25g/L、酵母浸粉7.5g/L、蛋白胨10g/L和磷酸氢二钠10g/L，充分搅拌溶解，用冰醋酸调节培养基pH为4-5，分装在锥形瓶中，用2-3层纱布封口后，放入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，灭菌后冷却，制得BC液体培养基；
步骤2，丝胶(SS)的提取
采用皂碱法提取丝胶，具体的工艺流程为：①蚕茧洗涤：将蚕茧剪成0.5cm乘以0.5cm的小正方形，称取5g置于0.02M，100ml碳酸钠溶液，加热至70℃并使用电动搅拌10min，冷却至室温，减压抽滤。②将上述抽滤后的蚕茧置于0.01M，100ml碳酸钠溶液中，在120℃油浴中煮沸3h，留下溶液。③将溶液用比色管减压抽滤3次，得到丝胶溶液。
步骤3，BC/SS复合膜的制备
将步骤2制备好的丝胶(SS)溶液加热至40℃，在50Ml锥形瓶中加入加热后的3mL的ss溶液和30mL的BC液体培养基混合，得到液体培养基C，该体积配比能够保证整个膜均匀性好，放入恒温(30℃，120rpm/min)振荡器中振荡2小时，然后接种木醋杆菌200μl，得到液体培养基D，将液体培养基D振荡12小时,用移液枪取10mL，加入到六孔培养皿中，透气保存到生化培养箱中。约5天成膜，取出BC/SS复合膜，并用2％NaOH溶液将表面培养基清洗干净，再用去离子水彻底清洗，制得BC/SS复合膜。
对比例3浸渍薄荷油-BC/SS复合膜的制备：
步骤1，细菌纤维素(BC)的制备
在一定体积的去离子水中，按照以下浓度依次加入葡萄糖25g/L、酵母浸粉7.5g/L、蛋白胨10g/L和磷酸氢二钠10g/L，充分搅拌溶解，用冰醋酸调节培养基pH为4-5，分装在锥形瓶中，用2-3层纱布封口后，放入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，灭菌后冷却，制得BC液体培养基；
步骤2，丝胶(SS)的提取
采用皂碱法提取丝胶，具体的工艺流程为：①蚕茧洗涤：将蚕茧剪成0.5cm乘以0.5cm的小正方形，称取5g置于0.02M，100ml碳酸钠溶液，加热至70℃并使用电动搅拌10min，冷却至室温，减压抽滤。②将上述抽滤后的蚕茧置于0.01M，100ml碳酸钠溶液中，在120℃油浴中煮沸3h，留下溶液。③将溶液用比色管减压抽滤3次，得到丝胶溶液。
步骤3，BC/SS复合膜的制备
将步骤2制备好的丝胶(SS)溶液加热至40℃，在50Ml锥形瓶中加入加热后的3mL的ss溶液和30mL的BC液体培养基混合，得到液体培养基C，该体积配比能够保证整个膜均匀性好，放入恒温(30℃，120rpm/min)振荡器中振荡2小时，然后接种木醋杆菌200μl，得到液体培养基D，将液体培养基D振荡12小时,用移液枪取10mL，加入到六孔培养皿中，透气保存到生化培养箱中。约5天成膜，取出BC/SS复合膜，并用2％NaOH溶液将表面培养基清洗干净，再用去离子水彻底清洗。
步骤4，PO-BC/SS膜的制备
将培养好的BC/SS复合膜用冷冻干燥机冷冻干燥，得到有三维结构的BC/SS复合干燥膜，在10mL的小烧杯中加入2mL的薄荷精油，将制备好的BC/SS复合膜放入其中浸渍，在40℃烘箱浸渍6h，。浸渍完成后，将复合膜表面的精油用滤纸吸干，然后用去离子水冲洗干净，常温保存，最后制得镶嵌有薄荷精油的接枝有丝胶的细菌纤维素复合膜，简写为PO-BC/SS。
实施例1
步骤1，细菌纤维素(BC)的制备
在一定体积的去离子水中，按照以下浓度依次加入葡萄糖25g/L、酵母浸粉7.5g/L、蛋白胨10g/L和磷酸氢二钠10g/L，充分搅拌溶解，用冰醋酸调节培养基pH为4-5，分装在锥形瓶中，用2-3层纱布封口后，放入高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，灭菌后冷却，制得BC液体培养基；
步骤2，丝胶(SS)的提取
采用皂碱法提取丝胶，具体的工艺流程为：①蚕茧洗涤：将蚕茧剪成0.5cm乘以0.5cm的小正方形，称取5g置于0.02M，100ml碳酸钠溶液，加热至70℃并使用电动搅拌10min，冷却至室温，减压抽滤。②将上述抽滤后的蚕茧置于0.01M，100ml碳酸钠溶液中，在120℃油浴中煮沸3h，留下溶液。③将溶液用比色管减压抽滤3次，得到丝胶溶液。
步骤3，BC/SS复合膜的制备
将步骤2制备好的丝胶(SS)溶液加热至40℃，在50Ml锥形瓶中加入加热后的3mL的ss溶液和30mL的BC液体培养基混合，得到液体培养基C，该体积配比能够保证整个膜均匀性好，放入恒温(30℃，120rpm/min)振荡器中振荡2小时，然后接种木醋杆菌200μl，得到液体培养基D，将液体培养基D振荡12小时,用移液枪取10mL，加入到六孔培养皿中，透气保存到生化培养箱中。约5天成膜，取出BC/SS复合膜，并用2％NaOH溶液将表面培养基清洗干净，再用去离子水彻底清洗。
步骤4，浸渍薄荷油纳米粒子/BC/SS复合膜的制备：
将培养好的BC/SS复合膜用冷冻干燥机冷冻干燥，得到有三维结构的BC/SS复合干燥膜，加入至2mL的薄荷油纳米粒子中，然后将放置有BC/SS复合干燥膜的薄荷油纳米粒子放入40℃烘箱浸渍6h。将复合膜表面的精油用滤纸吸干，然后用去离子水冲洗干净，常温保存。
对该实施例中制备过程及最后材料的形貌及结构进行分析；
(1)SEM分析
图1为对比例1、对比例2和实施例1制得的PONPS/BC/SS复合膜的SEM对比图。图(a)是BC和BC/SS的扫描电镜照片，图(a)中可以显示出BC具有良好的3D网状结构，独特的纤维交织使其具有很高的比表面积。从图1中的(b)与丝胶共混生长后依旧具有良好的结构。从图1中的(a)图和(b)中可以看出BC/SS之中的丝胶蛋白分布在BC纤维之中，并且嵌合方式为交错穿插。复合膜经薄荷精油浸渍处理后，薄荷精油在复合膜上呈现了均匀的分布(图c)。图(d)为实施例1制得复合膜，可看到放大5万倍的PONPS-BC/SS复合膜，可以看到精油成功附着于细菌纤维素与丝胶的支架上，薄荷精油会少量团聚成花苞形状。薄荷油进一步脱水和去羟基化形成具有褶皱表面的球形薄荷油纳米粒子。图1中的(e)和(f)显示了实施例中薄荷油纳米粒子成功附着，可以看到BC/SS骨架上附着薄荷油纳米粒子。图(f)显示了放大10万倍的PONPS-BC/SS复合膜敷料的大孔结构，孔径为20-90μm，可以满足组织再生的要求。
(2)FITR分析
如图2为不同复合膜的红外光谱图，对比例2、对比例3和实施例1制备出的复合膜的红外光谱图。曲线1为BC/SS复合膜的红外光谱。从曲线1可以看出，细菌纤维素与丝胶蛋白的红外光谱中(丝胶蛋白长在细菌纤维素穿插在一起)，3347cm-1和2895cm-1附近都出现了对应BC与SS的O-H的振动峰，并且在1029cm-1附近出现了对应BC的羟基和C-O-C的特征振动峰。在曲线1中1648cm-1，1426cm-1和1312cm-1处与丝胶蛋白的C＝O、N-H、C-N的伸缩振动有关。曲线2与曲线3复合膜出现的峰大致相同，可能的原因是薄荷油与薄荷油纳米粒子的特征振动峰相似，薄荷油NP红外光谱显示甲基和亚甲基相关的特征带，峰值为2916cm-1为-CH3不对称拉伸代表，峰值为1611cm-1为C＝O的伸展代表。
实施例2
本实施例中，所有的步骤同实施例1，但是在步骤4中，加入薄荷油纳米粒子后的浸渍时间为4h。
实施例3
本实施例中，所有的步骤同实施例1，但是在步骤4中，加入薄荷油纳米粒子后的浸渍时间为8h。
实施例4
本实施例中，所有的步骤同实施例1，但是步骤3中，ss溶液的加入量为3mL，BC液体培养基的加入量为15mL。
实施例5
本实施例中，所有的步骤同实施例1，但是步骤3中，ss溶液的加入量为3mL，BC液体培养基的加入量为45mL。
实施例6
本实施例中，所有的步骤同实施例1，但是步骤4中，薄荷油纳米粒子的加入量为1mL。
实施例7
本实施例中，所有的步骤同实施例1，但是步骤4中，薄荷油纳米粒子的加入量为3mL。
下面对上述实施例进行抑菌试验。
本实验中，涉及到的抑菌实验具体方法如下：
1)抑菌实验开始前准备工作
实验台清洁干净后，用紫外灯杀菌消毒1h。
固体培养基的配置(500mL)：5.0g蛋白胨、2.5g氯化钠、1.5g牛肉膏、6g琼脂，加热溶解于500mL去离子水中，调节pH在7.5左右。
将固体培养基以及实验所用玻璃仪器等置入高压灭菌蒸汽锅中处理20分钟左右。
菌种的活化：适量固体培养基倒入已灭菌试管并放置斜面使其冷却，取冷藏的细菌菌种，用灭菌的接种环刮取斜面菌种呈W字涂至新的试管斜面，并在恒温培养箱中(37℃，24h)活化细菌。待长出一层细菌后将斜面用0.9％的生理盐水刚好没过斜面，刮下斜面菌种溶于生理盐水中，最后将此液体倒入灭菌的锥形试管中，得到菌悬液。
2)平板计数法抑菌实验过程
配置固体培养基，同50mL离心管、若干培养皿、若干3mL和1mL移液枪枪头一起置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌20分钟。待灭菌完毕，趁热将培养基分别倒入无菌培养皿中，使其静置冷却凝固。
用移液枪移取0.25mL菌悬液放入离心管中，添加10mL无菌水，此即为108菌悬液浓度，并做标记108。将108离心管充分震荡，使菌液混合均匀。另取一支1mL枪头，取108中菌悬液0.25mL置于新的离心管中，添加10mL无菌水稀释10倍，此即为107菌悬液，标记为107。重复上述过程直至得到103菌悬液。
取若干支1mL无菌移液枪头，分别吸取103的菌悬液0.1mL加入到若干固体培养基中，并用涂布器进行均匀涂布。最后将培养皿置于生化培养箱中(37℃)培养数小时，直至固体培养基上的菌液干燥。
抑菌测试结果
(1)不同浸渍时间下复合膜的抑菌性
实验中使用3个不同浸渍时间制得的复合膜，分别为实施例2的PONPS-BC/SS(4h)、实施例1制备的PONPS-BC/SS(6h)和实施例3制备的PONPS-BC/SS(8h)。将上述复合膜以接触式放置于含有大肠杆菌的培养基上，移至生化培养箱中(37℃)，进行72h的抑菌测试。实验情况如图3所示，又图可知均有明显的抑菌圈，其中实施例1制备的图b和图e经过72h的抑菌测试抑菌圈由5.32mm缩小至5.03mm，依然具有优于其他浸渍时间的抑菌性能，可得浸渍6h最佳。
(2)不同基材比例下复合膜的抑菌性
实验中使用BC和SS的不同比例制得的复合膜，分别为实施例4的PONPS-BC/SS(1:5)、实施例1的PONPS-BC/SS(1:10)和实施例5的PONPS-BC/SS(1:15)，将上述复合膜以接触式放置于含有大肠杆菌的培养基上，移至生化培养箱内(37℃)，进行72h的抑菌测试。实验如图4清晰可见BC：SS＝1:15的抑菌性能以及持久性均匀性最佳。
(3)不同浸渍用量下复合膜的抑菌性
实验中使用不同浸渍用量制得复合膜，分别为实施例6的PONPS-BC/SS(1ml)、实施例1的PONPS-BC/SS(2ml)和实施例7的PONPS-BC/SS(3ml)，将上述复合膜以接触式放置于含有大肠杆菌的培养基上，移至生化培养箱内(37℃)，进行72h的抑菌测试。由图5可见24h时，浸渍用量为2ml的抑菌性能最优，经过72h的抑菌持久性研究表明浸渍2ML持久性最佳。
(3)小鼠生物感染模型
用小鼠皮肤创面模型评估复合膜对创面的修复效果。图6为治疗后对伤口愈合过程进行照相监测。图6为小鼠14天的伤口感染模型，分别为对照组，A组：对比例2的BC/SS、B组：实施例1的PONPS-BC/SS，可以清楚地看到伤口愈合的一个过程，图7为小鼠伤口尺寸随时间的闭合情况的示意图。与对照组和A组相比，BC/SS复合膜明显加速了伤口愈合。治疗4d后，对照组和A组创面大小开始出现差异，第8天B组与对照组和A组相比创面有明显的闭合。治疗10d后，B组与对照组相比无开放创面。治疗14d后，B组处理的创面无开放创面，表皮组织新生，光滑。对照组和A组伤口开放率分别为20％和8％，创面不平整。结果表明，加入的丝胶与薄荷油纳米粒子复合膜能加速伤口愈合和皮肤再生。通过计算伤口愈合时间以及尺寸进一步证实了PONPS-BC/SS的抗菌活性最好，且有良好的生物相容性，无细胞毒性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将无水葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨和磷酸氢二钠加入至水中，搅拌溶解后，加入冰醋酸调节pH值，灭菌冷却后制得细菌纤维素的BC液体培养基；
步骤2，将蚕茧至于碳酸钠溶液中，加热搅拌后抽滤，让经过抽滤后的蚕茧再次浸入至碳酸钠中，通过油浴煮沸后，将得到的溶液通过比色管减压抽滤，得到丝胶溶液；
步骤3，将加热的丝胶溶液加入至BC液体培养基中，得到液体培养基C，所述丝胶溶液和BC液体培养基的混合体积比为1:(5-15)，将液体培养基C震荡后接种木醋杆菌，得到液体培养基D，振荡液体培养基D后得到接种培养成接枝有丝胶的细菌纤维素复合膜；
步骤4，将接枝有丝胶的细菌纤维素复合膜冷冻干燥后，得到接枝有丝胶的细菌纤维素复合干燥膜；将所述复合干燥膜浸润在薄荷油纳米粒子中，然后将浸润有复合干燥膜薄荷油纳米粒子置于烘箱中，在40℃的烘箱中静置4-8小时后，得到镶嵌有薄荷油纳米粒子的接枝有丝胶的细菌纤维素复合膜，为所述的细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料。
2.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤1中，加入至水中的无水葡萄糖的浓度为25g/L、酵母浸粉的浓度为7.5g/L，蛋白胨的浓度为10g/L，磷酸氢二钠的浓度为10g/L。
3.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤1中，pH值为4-5。
4.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤1中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。
5.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤2中，将蚕茧至于碳酸钠溶液中，加热至70℃并搅拌后抽滤；油浴煮沸温度为120℃，油浴煮沸时间为3h。
6.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤3中，液体培养基C的震荡温度为30℃，震荡时间为2h。
7.根据权利要求1所述的一种细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料的制备方法，其特征在于，步骤3中，木醋杆菌和液体培养基C体积比为200μL：33mL。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的细菌纤维素基丝胶薄荷油纳米粒子的伤口敷料的制备方法，其特征在于，所述薄荷油纳米粒子和液体培养基D的体积比为(1-3):10。
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