CN110484593B - 通过改变微生物运动性强化微生物采油的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用改变微生物运动性强化微生物采油的方法。本发明提供了一种鉴定待测种属微生物是否为改变目的种属微生物运动性质种属的方法的方法，包括如下步骤：1)将目的种属微生物与待测种属微生物共培养，2)检测培养过程中所述目的种属微生物的表面运动性；若所述目的种属微生物表现出表面运动性，则所述待测种属微生物为或候选为改变目的种属微生物运动性质的种属。本发明的实验证明了，本发明寻找出一种利用特定微生物改变微生物的表面运动性，从而提高微生物的表面运动性，强化微生物采油，提高原油采收率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种通过改变微生物运动性强化微生物采油的方法。
背景技术
近年来，我国大部分主力油田都进入开发后期，采出液含水率上升，地下可采剩余储量不断减少，高含水油藏、油水过渡带和稠油油藏储量超过常规原油。由于油品性质明显变差，但是开采难度大，急需新型石油开采技术。
微生物采油技术由于其应用范围广、工艺简单、成本低、发挥功效时间长、绿色环保等优点受到了全世界各界的关注。微生物采油主要利用微生物自身的生物降解作用及其代谢产物来降低原油粘度、凝固点，提高原油的流动性，从而提高原油的产量和采收率。目前，微生物采油的目标微生物的筛选主要考虑其增殖迅速、运动性强、抗逆性好、降解能力强等。
但是有很多微生物采油功能微生物没有运动性能，无法在油藏中很好地运动迁移、接触原油、从而发挥采油功能。所以，获得表面运动性可使微生物沿岩石表面运移进入到其他采油技术难以进入的作业盲区，有效增大驱油范围，强化对原油的开采，提高原油采收率。
表面运动性是微生物在固体表面迁移运动的能力。
发明内容
为了改变采油微生物的运动性从而强化微生物采油，提高原油采收率，本发明提供如下技术方案：
本发明一个目的是提供能够确定待测种属微生物是否可改变目的种属微生物运动性质的分析以及应用于采油的技术手段。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)将目的种属微生物与待测种属微生物共培养，
2)检测培养过程中所述目的种属微生物的表面运动性；
若所述目的种属微生物表现出表面运动性，则所述待测种属微生物为或候选为改变目的种属微生物运动性质的种属；
若所述目的种属微生物未表现出表面运动性，则所述待测种属微生物不为或候选不为改变目的种属微生物运动性质的种属。
上述方法中，所述待测种属微生物为活细胞微生物。
上述方法中，所述共培养为接触培养。
上述方法中，所述改变目的种属微生物运动性质为提高所述目的种属微生物的表面运动性。
上述在改变目的种属微生物运动性质中的应用也是本发明保护的范围。
本发明还提供了一种改变目的种属微生物运动性质的方法，包括如下步骤：选取上述鉴定待测种属微生物是否为改变目的种属微生物运动性质种属的方法中的改变目的种属微生物运动性质的待测种属微生物，与所述目的种属微生物，进行接触培养，使所述目的种属微生物运动性质具有运动性。
上述中，所述待测种属微生物和所述目的种属微生物均为采油微生物；
或，所述目的种属微生物为烷烃降解菌，且所述待测种属微生物为二态性柄细菌。
上述方法或上述应用在强化微生物采油中的应用也是本发明保护的范围。
上述提高目的种属微生物的表面运动性在强化微生物采油中的应用也是本发明保护的范围。
烷烃降解菌和二态性柄细菌共培养在强化微生物采油中的应用也是本发明保护的范围。
烷烃降解菌和二态性柄细菌共培养在使所述烷烃降解菌具有表面运动性中的应用也是本发明保护的范围。
烷烃降解菌和二态性柄细菌共培养在提高所述烷烃降解菌表面运动性中的应用也是本发明保护的范围。
上述应用中，所述共培养为接触培养。
本发明还有个目的是提供一种强化微生物采油的产品。
本发明提供的产品，包括烷烃降解菌、二态性柄细菌和用于二者接触培养的培养基。
上述中的接触培养为将所述目的种属微生物接种在融合有待测种属微生物的固体培养基培养。
上述强化微生物采油为提高微生物采油率。
所述提高所述目的种属微生物的表面运动性为所述目的种属微生物与所述待测种属微生物共培养后的表面运动性大于所述目的种属微生物与所述待测种属微生物共培养前的表面运动性。
本发明的实验证明，本发明寻找出一种通过特定微生物改变微生物的表面运动性，从而提高微生物的表面运动性，强化微生物采油。
附图说明
图1为Glycocaulis sp.6B-8和Dietzia sp.DQ12-45-1b的表面运动性的研究。
图2为电子显微镜对Glycocaulis sp.6B-8和Dietzia sp.DQ12-45-1b接触培养的实时观察结果。
图3为Glycocaulis sp.6B-8悬浮液和Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液非接触培养组结果。
图4为研究二态性柄细菌使能使烷烃降解菌表现出典型的跳跃模式的表面运动性结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、改变微生物运动性质的方法
选取了从大庆油田分离的两个微生物菌株烷烃降解菌Dietzia sp.DQ12-45-1b和二态性柄细菌Glycocaulis sp.6B-8。
Dietzia sp.DQ12-45-1b，记载在如下文献中：Detection of Metabolites fromn-Hexadecane Degradation by Strain Dietzia sp.DQ12-45-1b。
Glycocaulis sp.6B-8，记载在如下文献中(文献中记作6B-8)：Glycocaulisalkaliphilus sp.nov.,a dimorphic prosthecate bacterium isolated from crudeoil)。
一、Dietzia sp.DQ12-45-1b和Glycocaulis sp.6B-8运动性研究
1、Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液和Glycocaulis sp.6B-8悬浮液的制备
1)Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液
a)将Dietzia sp.DQ12-45-1b菌株从甘油管接入平板活化，挑取单克隆细胞后再转接试管进行培养，最终接入装有300mL LB(500mL三角瓶)中培养获得种子液；
b)将a)得到的种子液培养至对数生长期后，于5000rpm，4℃离心10min收集细胞，并用无机盐培养基洗涤2次，再用无机盐培养基(MF培养基)混合均匀，使得菌液的浓度的为107个/ml，得到Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液。
上述MF培养基的配置方法：
MF培养基(1L)：Na2HPO4·12H2O，17.9g；NaH2PO4，7.8g；(NH4)2SO4，5g；KCl，5g，微量元素溶液SL-4(上海林渊生物科技有限公司产品目录号:A304-01)10mL，余量为水，pH调节至8.0。
MF培养基每100mL加入100μl无菌(5％)CaCl2溶液，100μl无菌(5％)MgSO4溶液。
LB培养基(1L)：蛋白胨，10g；酵母粉，5g；氯化钠，10g；余量为水，pH调节至7.4。
GPY培养基(1L)：蛋白胨，10g；酵母粉，5g；葡萄糖，10g；余量为水，pH调节至8.0。
2)Glycocaulis sp.6B-8悬浮液
制备方法同Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液，得到Glycocaulis sp.6B-8悬浮液，浓度为107个/ml。
2、运动性的研究
Glycocaulis sp.6B-8不能以烷烃和葡萄糖为碳源进行生长，因此它在LB培养基中进行培养。
分为如下3组：
组1：单独菌株的表面运动性
将Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液的一滴点在以十六烷为唯一碳源的添加0.5％琼脂的无机盐固体平板上24h后观察它的表面运动性。
以十六烷为唯一碳源的添加0.5％琼脂的无机盐固体平板为将0.5g十六烷加入100ml添加0.5％琼脂的无机盐固体培养基中，得到的无机盐固体平板；其中添加0.5％琼脂的无机盐培养基(即每100ml的无机盐培养基中加入0.5g琼脂)
将单独的Glycocaulis sp.6B-8悬浮液的一滴点在0.5％(质量体积百分比即100ml 加入0.5g十六烷)琼脂的无机盐固体平板上24h后观察它的表面运动性。
组2：Glycocaulis sp.6B-8活细胞和Dietzia sp.DQ12-45-1b的表面运动性
将Glycocaulis sp.6B-8悬浮液和添加0.5％琼脂的无机盐固体培养基(MF液体培养基的基础上每L溶液添加5g固体琼脂)在55度下融合(两者混合均衡)后形成固体平板，再将Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液的一滴点在该平板上，平板盖子加入有十六烷的滤纸培养(滤纸的大小取和平板一样的大小，直径90mm，加入1ml的十六烷)。
组3:Glycocaulis sp.6B-8死细胞和Dietzia sp.DQ12-45-1b的表面运动性
将Glycocaulis sp.6B-8灭活细胞液：将Glycocaulis sp.6B-8悬浮液进行高温灭菌，得到Glycocaulis sp.6B-8灭活细胞液。
将Glycocaulis sp.6B-8灭活细胞液和添加0.5％琼脂的无机盐固体培养基在55度下融合后形成固体平板，将Dietzia sp.DQ12-45-1b的一滴悬浮液点在该平板上，平板盖子加入有十六烷的滤纸培养。
上述三组培养24h后，检测微生物的生长状况(菌落大小)和运动性(菌落扩散大小)。
计算运动速度，扩散半径除以生长时间，得到运动速度。
结果如图1所示，a为单独Dietzia sp.DQ12-45-1b，b为单独Glycocaulis sp.6B-8，c为Glycocaulis sp.6B-8的活细胞和Dietzia sp.DQ12-45-1b，d为Glycocaulis sp.6B-8的死细胞和Dietzia sp.DQ12-45-1b；a-d每组有上下两个图，上图为菌落生长情况图，下图为运动速度情况图；
可以看出，
单独Dietzia sp.DQ12-45-1b没有表现出表面运动性(图1a)；
单独Glycocaulis sp.6B-8生长也没有表现出表面运动性(图1b)；
Glycocaulis sp.6B-8的活细胞下，Dietzia sp.DQ12-45-1b表现出了运动性，菌落以2.87±0.28μm/min的速度在移动(图1c)；
Glycocaulis sp.6B-8的死细胞下，Dietzia sp.DQ12-45-1b菌落未表现出表面运动性(图1d)。
上述结果表面，Glycocaulis sp.6B-8活细胞的存在导致了Dietzia sp. DQ12-45-1b出现了表面运动性。
2、Dietzia sp.DQ12-45-1b和Glycocaulis sp.6B-8相互作用的方式研究
分为如下2组：
非接触培养组：将Glycocaulis sp.6B-8悬浮液和Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液分别点在以十六烷为唯一碳源的添加0.5％琼脂的无机盐固体平板上(两个点相距 0.5cm、1cm和2cm)，对照组是只有Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液。两个点之间加了一个微孔膜使微生物之间不能相互接触，但是可以进行代谢物的相互交流(微孔滤膜的大小的0.22um，细菌的大小大于这尺寸，无法过去，而营养物质可以过去)。
接触培养组：将Glycocaulis sp.6B-8悬浮液和Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液分别点在以十六烷为唯一碳源的添加0.5％琼脂的无机盐固体平板上，两个点紧挨着。
培养培养24h后，检测2组两种微生物的生长状况(菌落大小)和运动性(菌落扩散大小)。
非接触培养组结果(图3)：两种微生物均有生长，但是均没有表现出表面运动性，说明缺失微生物的相互接触，两种微生物并不能表现出表面运动性。
接触培养组结果(与图1c无显著差异)：两种微生物均有生长，Glycocaulissp.6B-8的活细胞下，Dietzia sp.DQ12-45-1b表现出了运动性；说明微生物的相互接触，两种微生物表现出表面运动性。
通过电子显微镜对接触培养组的微生物细胞进行实时观察，结果如图2所示，发现二态性柄细菌Glycocaulis sp.6B-8通过和烷烃降解菌Dietzia sp.DQ12-45-1b 相接触，二态性柄细菌打破了烷烃降解菌的胶囊结构，从而导致了烷烃降解菌表现出典型的跳跃模式的表面运动性。
跳跃模式的表面运动性为一种特殊的表面运动性，两种细菌相接触，通过细菌结构的改变而获得运动性。
二、二态性柄细菌使烷烃降解菌表现出典型的跳跃模式的表面运动性
研究二态性柄细菌使能使烷烃降解菌表现出典型的跳跃模式的表面运动性：
将二态性柄细菌悬浮液和添加0.5％琼脂的无机盐固体培养基(MF液体培养基的基础上每L溶液添加5g固体琼脂)在55度下融合(两者混合均衡)后形成固体平板，再将烷烃降解菌悬浮液的一滴点在该平板上，平板盖子加入有十六烷的滤纸倒置培养。
为了验证这个二态性柄细菌和烷烃降解菌表现出的跳跃模式的表面运动性，又做了下面的实验：
1.选择了Glycocaulis abyssi MCS33、Glycocaulis albus SLG210-30A1T、Glycocaulis sp.6B-8、Escherichia coli DH5α的悬浮液和添加0.5％琼脂的无机盐固体培养基(MF液体培养基的基础上每L溶液添加5g固体琼脂)在55度下融合(两者混合均衡)后形成固体平板，再将Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液的一滴点在该平板上，平板盖子加入有十六烷的滤纸倒置培养。
对照组：单独0.5％琼脂的无机盐固体培养基，将Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液的一滴点在该平板上。
2.选择了Glycocaulis sp.6B-8的悬浮液和添加0.5％琼脂的无机盐固体培养基(MF液体培养基的基础上每L溶液添加5g固体琼脂)在55度下融合(两者混合均衡) 后形成固体平板，再将Dietzia sp.DQ12-45-1b、Dietzia psychralcaliphila ILA-1T和Dietziatimorensis DSM 45568T悬浮液的一滴点在该平板上，平板盖子加入有十六烷的滤纸倒置培养。以不加入Glycocaulis sp.6B-8为对照。
上述二态性柄细菌为Glycocaulis abyssi MCS33T、Glycocaulis albus SLG210-30A1T、Glycocaulis sp.6B-8；Glycocaulis abyssi MCS33T、Glycocaulis albus SLG210-30A1T均记载在如下文献中：Xiang-Lin L,Bai-Sheng X,Man C,et al. Glycocaulisalbus sp.nov.A moderately halophilic dimorphic prosthecate bacterium isolatedfrom petroleum-contaminated saline soil[J].International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology,2014,64(Pt 9).
上述烷烃降解菌Dietzia sp.DQ12-45-1b、Dietzia psychralcaliphila ILA-1T和Dietzia timorensis DSM 45568T。
Dietzia psychralcaliphila ILA-1T记载在如下文献中：
Yumoto I,Nakamura A,Iwata H,et al.Dietzia psychralcaliphila sp.nov.anovel,facultatively psychrophilic alkaliphile that grows on hydrocarbons.[J].International Journal of Systematic &Evolutionary Microbiology,2002,52(Pt1):85.
Dietzia timorensis DSM 45568T记载在如下文献中：
Bell M E,Bernard K A,Harrington S M,et al.Lawsonella clevelandensisgen.nov.sp.nov. a new member of the suborder Corynebacterineae isolated fromhuman abscesses[J].International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology,2016,66(8).
检测两种微生物的生长状况和运动性。
结果如图4所示：
图4A显示，二态性柄细菌Glycocaulis sp.6B-8、Glycocaulis abyssi MCS33T和Glycocaulis albus SLG210-30A1T均使烷烃降解菌Dietzia sp.DQ12-45-1b表现出了表面运动性，非二态性柄细菌Escherichia coli DH5α未使烷烃降解菌Dietzia sp. DQ12-45-1b表现出表面运动性。
图4B显示，二态性柄细菌Glycocaulis sp.6B-8使烷烃降解菌DietziapsychralcaliphilaILA-1T、Dietzia timorensis DSM 45568T和Dietzia sp.DQ12-45-1b表现出了表面运动性。
因此，在选择微生物采油的时候可以同时选择二态性柄细菌和烷烃降解菌作为采油微生物，两者相互作用，使其具备表面运动性，可以使扩大微生物波及范围，接触更多的剩余油，从而强化微生物原油。
实施例2、二态性柄细菌和烷烃降解菌相互运动中的应用
天然岩心提高采收率物模实验：岩心孔隙度为22.6％,孔隙体积为23.8cm3、水相渗透率为178×10-3μm 2。
注入水中加入1g/l NH4H2PO4、1g/l(NH4)2SO4、1g/l K2HPO4、1.2g/l KNO3、 0.5g/l蛋白胨、和0.5g/l酵母粉，注水体积为天然岩心体积V的0.6倍。
分为如下几组：
A组加入1ml 107个/ml Dietzia sp.DQ12-45-1b悬浮液，B组加入1ml 107个 /mlGlycocaulis sp.sp.6B-8悬浮液，C组加入0.5ml 107个/ml Dietzia sp. DQ12-45-1b悬浮液和107个/ml的Glycocaulis sp.6B-8悬浮液,D组为不添加菌液的对照组。
静置培养18h后，将岩心每隔0.5cm的岩心进行切片后用无菌水进行洗涤，然后用洗涤液进行涂布平板，培养36h后，观察新菌的运动情况。
结果如表1所示，可以看出，C组加入0.5ml 107个/ml Dietzia sp.DQ12-45-1b 悬浮液和107个/ml的Glycocaulis sp.6B-8悬浮液，二态性柄细菌Glycocaulis sp.6B-8使烷烃降解菌Dietzia sp.DQ12-45-1b表现出了表面运动性。
表1
Claims (5)
1.一种鉴定待测种属微生物是否为改变目的种属微生物运动性质的候选种属微生物的方法，包括如下步骤：
1）将目的种属微生物与待测种属微生物接触培养，
2）检测培养过程中所述目的种属微生物的表面运动性；
当所述目的种属微生物在所述待测种属微生物存在下表现出表面运动性，则所述待测种属微生物为候选改变目的种属微生物运动性质的候选种属微生物；
当所述目的种属微生物在所述待测种属微生物存在下未表现出表面运动性，则所述待测种属微生物不为候选改变目的种属微生物运动性质的候选种属微生物；
所述待测种属微生物为活细胞微生物；
所述改变目的种属微生物运动性质为使所述目的种属微生物具有表面运动性；
所述待测种属微生物为二态性柄细菌属（Glycocaulis）；
所述目的种属微生物为烷烃降解菌迪茨氏菌属(Dietzia)。
2.一种改变目的种属微生物运动性质的方法，包括如下步骤：选取通过权利要求1所述方法鉴定出的候选改变目的种属微生物运动性质的候选种属微生物，与所述目的种属微生物进行接触培养，使所述目的种属微生物运动性质具有运动性；
所述目的种属微生物为烷烃降解菌迪茨氏菌属(Dietzia)。
3.权利要求1或2所述方法在强化微生物采油率中的应用；所述应用为同时选择烷烃降解菌Dietzia sp. DQ12-45-1b和二态性柄细菌Glycocaulis sp.6B-8作为采油微生物，使二者接触培养，两者相互作用，使所述烷烃降解菌Dietzia sp. DQ12-45-1b具备表面运动性，扩大微生物波及范围，接触更多的剩余油，从而强化微生物原油，实现强化微生物采油率；
所述二态性柄细菌Glycocaulis sp.6B-8为活细胞微生物。
4.烷烃降解菌Dietzia sp. DQ12-45-1b和二态性柄细菌Glycocaulis sp.6B-8接触培养在强化微生物采油中的应用；所述应用为同时选择烷烃降解菌Dietzia sp. DQ12-45-1b和二态性柄细菌Glycocaulis sp.6B-8作为采油微生物，两者相互作用，使烷烃降解菌Dietzia sp. DQ12-45-1b具备表面运动性，扩大微生物波及范围，接触更多的剩余油，从而强化微生物原油，实现强化微生物采油；
所述二态性柄细菌Glycocaulis sp.6B-8为活细胞微生物。
5.一种强化微生物采油的产品，包括烷烃降解菌Dietzia sp.DQ12-45-1b、二态性柄细菌Glycocaulis sp.6B-8和用于二者接触培养的培养基。
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