MX2014006983A - Enriquecimiento de fluidos de yacimientos de petroleo con shewanella. - Google Patents

Abstract

Se presentan métodos para enriquecer poblaciones microbianas que son autóctonas en fluidos de yacimientos de petróleo para obtener poblaciones enriquecidas con Shewanella y cepas aisladas de Shewanella útiles para mejorar la recuperación de petróleo de un yacimiento de petróleo. Adicionalmente, las poblaciones enriquecidas pueden contener bacterias que pertenecen al género Arcobacter.

Description

ENRIQUECIMIENTO DE FLUIDOS DE YACIMIENTOS DE PETROLEO CON SHEWANELLA CAMPO DE LA INVENCION La presente descripción se relaciona con el campo de microbiología ambiental. Más específicamente, en la presente descripción se presentan métodos para enriquecer poblaciones microbianas que son autóctonas en fluidos de yacimientos de petróleo a fin de obtener poblaciones enriquecidas con Shewanella y cepas aisladas de Shewanella útiles para mejorar la recuperación de petróleo de un yacimiento de petróleo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Durante la recuperación de petróleo de yacimientos petrolíferos, típicamente, solo se recupera una porción menor del petróleo original en los estratos que contienen petróleo por métodos de recuperación primaria, los cuales usan solamente las fuerzas naturales presentes en un yacimiento de petróleo. Para mejorar la recuperación de petróleo, se ha usado una variedad de técnicas de recuperación complementarias, tales como la inundación con agua, que involucra la inyección de agua a través de orificios en el pozo hacia el interior del yacimiento de petróleo. A medida que se desplaza hacia el yacimiento desde un pozo de inyección y se mueve a través de los estratos del yacimiento, el agua desplaza el petróleo a uno o más pozos de producción ef. 248434 en donde se recupera el petróleo. Uno de los problemas que se presenta, comúnmente, con las operaciones de inundación con agua es la poca eficiencia de barrido del agua de inyección. La poca eficiencia de barrido ocurre cuando el agua se canaliza, preferentemente, a través de zonas altamente permeables del yacimiento de petróleo a medida que se desplaza desde el (los) pozo(s) de inyección hacia el (los) pozo(s) de producción, sin entrar en contacto, así, con estratos que contienen petróleo y que son menos permeables. Por lo tanto, el petróleo de las zonas menos permeables no se recupera .

La recuperación de petróleo de formaciones subterráneas se puede mejorar por el efecto de microorganismos que tienen características tales como favorecer la liberación de petróleo por reducción de las tensiones superficiales e interfaciales y/o formar biotapones para reducir la canalización y mejorar la eficiencia de barrido. Un método para la recuperación mejorada de petróleo por vía microbiana (MEOR) es estimular el crecimiento de microorganismos que tienen estas propiedades y que son autóctonos o que se inoculan en las formaciones subterráneas de yacimientos de petróleo. Los procesos para fomentar el crecimiento de microbios autóctonos mediante la inyección de soluciones nutrientes en formaciones subterráneas se describen en la patente de los Estados Unidos núm. 4,558,739 y en la patente de los Estados Unidos núm. 5,083,611. Se aislaron microorganismos que pertenecen al género Shewanella a partir de muestras de yacimientos de petróleo con el uso de medios que contienen nitrato o Fe (III) como aceptor de electrones y se descubrió son útiles para procesos de MEOR, tal como se describe en las patentes de los Estados Unidos núms . 7,776,795 y 2011-0030956. Además, se aislaron microorganismos que pertenecen al género Arcojbacter y se descubrió son útiles para procesos de MEOR, como se describe en solicitud de patente copendiente y de propiedad mancomunada de los Estados Unidos núm. 13/280972.

Persiste la necesidad de contar con métodos para obtener poblaciones específicas de microorganismos o microorganismos aislados de fluidos de yacimientos de petróleo que incluyen microorganismos pertenecientes a los géneros Shewanella y Arccbacter, debido a que estos microorganismos son eficaces en procesos de MEOR.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se relaciona con métodos de enriquecimiento para microorganismos que pertenecen al género Shewanella, así como con métodos para aislar microorganismos que pertenecen al género Shewanella por crecimiento en medios que contienen tipos especificados de aceptores de electrones. Adicionalmente, pueden especificarse las concentraciones de sal.

Por consiguiente, la invención proporciona el enriquecimiento de una población microbiana; el enriquecimiento comprende: a) proporcionar una muestra ambiental de un fluido de un yacimiento de petróleo que comprende una población microbiana autóctona; y b) cultivar esa muestra en un medio que comprende sal, al menos una fuente de carbono y un aceptor de electrones seleccionado de aceptor de electrones orgánico y aceptor de electrones de ión metálico para obtener una población microbiana enriquecida; en donde la proporción de células de Shewanella en la población microbiana enriquecida de (b) es mayor que la proporción de células de Shewanella en la muestra ambiental de (a) .

En otra modalidad, la invención proporciona un método para aislar una cepa del género Shewanella, el método comprende : a) proporcionar una muestra ambiental de un fluido de un yacimiento de petróleo que comprende una población microbiana autóctona ; b) cultivar esa muestra en un medio que comprende sal, al menos una fuente de carbono y un aceptor de electrones seleccionado de aceptor de electrones orgánico y aceptor de electrones de ión metálico para obtener una población microbiana enriquecida; c) cultivar la población microbiana enriquecida de (b) en un medio que tiene una concentración de sal que está entre aproximadamente 10 ppt y 40 ppt para obtener colonias aisladas; y d) realizar el cribado de las colonias aisladas de (c) por análisis de secuencias de ADNr contra secuencias de ADNr microbiano conocidas; en donde se identifica al menos una cepa de Shewanella . En aún otra modalidad, la invención proporciona un método para mejorar la recuperación de petróleo de un yacimiento de petróleo; el método comprende: a) proporcionar una población microbiana enriquecida obtenida por el método de conformidad con la reivindicación 1 o 3; b) introducir la población microbiana enriquecida de (a) en un yacimiento de petróleo; c) introducir una solución de nutrientes que comprende al menos una fuente de carbono y al menos un aceptor de electrones en el yacimiento de petróleo; y d) recuperar petróleo del yacimiento de petróleo; en donde el cultivo de la población microbiana enriquecida mejora la recuperación de petróleo.

BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS La invención se comprenderá mejor a partir de la siguiente descripción detallada y las descripciones de secuencias anexas, las cuales forman parte de la presente solicitud.

Las siguientes secuencias cumplen con el Título 37 del §§ C.F.R., 1.821-1.825 ("Requisitos para solicitudes de patentes que contienen descripciones de secuencias de nucleótidos y/o secuencias de aminoácidos - Reglas de las secuencias") según la norma ST.25 (2009) de la Organización Mundial de Propiedad Intelectual (WIPO, por sus siglas en inglés) y los requisitos para listados de secuencias de la EPO y el PCT (Reglas 5.2 y 49.5(a-bis), y Sección 208 y Anexo C de las Instrucciones administrativas. Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos cumplen con las reglas que se exponen en el Título 37 del C.F.R., §1.822.

Sec . con núm. de ident . : 1 es la secuencia de nucleótidos del iniciador inverso de PCR 1492R.

Sec. con núm. de ident. :2 es la secuencia de nucleótidos del iniciador directo de PCR 8F .

Sec. con núm. de ident .: 3 es la secuencia de nucleótidos del ADNr 16S usado para identificar el grupo de homología de Shewanella .

Sec. con núm. de ident. :4 es la secuencia de nucleótidos del ADNr 16S usada para identificar el grupo de homología de Arcobacter.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los solicitantes incorporan específicamente todo el contenido de todas las referencias citadas en la presente descripción. A menos que se establezca de cualquier otra forma, todos los porcentajes, partes, relaciones, etc., se expresan en peso. Las marcas registradas se muestran en mayúsculas. Adicionalmente , cuando una cantidad, concentración u otro valor o parámetro se da ya sea como un intervalo, intervalo preferido o una lista de valores preferibles superiores y valores preferibles inferiores, esto se entenderá específicamente describiendo todos los intervalos formados de cualquier par de cualquier límite de intervalo superior o valor preferido y cualquier límite de intervalo inferior o valor preferido, sin considerar si los intervalos se describen separadamente. En los casos en que en la presente descripción se menciona un intervalo de valores numéricos, a menos que se establezca de cualquier otra forma, el intervalo pretende incluir los límites de éste y todos los números enteros y fracciones comprendidos dentro del intervalo. No está previsto que el alcance de la invención esté limitado a los valores específicos mencionados al definir un intervalo.

La invención se relaciona con métodos para obtener, a partir de fluidos de yacimientos de petróleo, consorcios microbianos que tienen una proporción incrementada de microorganismos pertenecientes a la especie Shewanella con respecto a la proporción de Shewanella en los fluidos originales. Adicionalmente , se describen métodos para aislar cepas de Shewanella . Los consorcios obtenidos o cepas aisladas pueden usarse para aumentar la recuperación de petróleo .

Las siguientes definiciones se suministran para las abreviaturas y términos especiales que se usan en esta solicitud : Como se usa en la presente descripción, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "tiene", "que tiene", "contiene" o "que contiene", o cualquier otra variante de éstos, pretenden abarcar una inclusión no excluyente. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un proceso, método, artículo o aparato que comprende una lista de elementos no se limita necesariamente solo a esos elementos, sino que puede incluir otros que no estén expresamente listados o sean inherentes a tal composición, mezcla, proceso, método, artículo o aparato. Además, a menos que se especifique expresamente en contrario, la disyunción se relaciona con un "o" incluyente y no con un "o" excluyente. Por ejemplo, una condición A o B se satisface mediante cualquiera de los siguientes criterios: A es verdadero (o actual) y B es falso (o no actual) , A es falso (o no actual) y B es verdadero (o actual) , y tanto A como B son verdaderos (o actuales) .

Además, los artículos indefinidos wun(a)" y "unos (as)" que preceden a un elemento o componente de la invención están previstos para ser no restrictivos con respecto a la cantidad de instancias (es decir, ocurrencias) del elemento o componente. Por consiguiente, "un(a)" o "unos (as)" deben interpretarse para incluir uno o por lo menos uno, y la forma singular de la palabra del elemento o componente también incluye el plural, a menos que el número obviamente implique que es singular.

El término "invención" o "presente invención" , tal como se usa en la presente descripción, es un término no limitante y no está previsto para referirse a cualquier modalidad individual de la invención particular, sino que abarca todas las modalidades posibles según se describe en la descripción y en las reivindicaciones.

Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente", que modifica la cantidad de un ingrediente o reactivo empleados en la invención, se refiere a la variación que puede producirse en la cantidad numérica, por ejemplo, a través de procedimientos de manejo de líquidos y de mediciones típicos usados para preparar concentrados o soluciones de uso en el mundo real; a través de errores inadvertidos en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, procedencia o pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. Además, el término "aproximadamente" abarca cantidades que difieren debido a condiciones de equilibrio diferentes para una composición que resulta de una mezcla inicial específica. Estén o no modificadas por el término "aproximadamente", las reivindicaciones incluyen equivalentes para las cantidades. En una modalidad, el término "aproximadamente" significa una cantidad dentro del 10 % del valor numérico reportado, preferentemente, dentro del 5 % del valor numérico reportado.

"Petróleo" o "aceite" es un líquido inflamable de origen natural que se encuentra en formaciones rocosas y arenosas de la Tierra, el cual consiste en una mezcla compleja de hidrocarburos e hidrocarburos aromáticos policíclicos de varios pesos moleculares, más otros compuestos orgánicos.

Los términos "yacimiento de petróleo/petrolífero" y "estrato que contiene petróleo" pueden usarse intercambiablemente en la presente descripción, y se refieren a una formación subterránea o del lecho marino a partir de la cual puede recuperarse el petróleo. La formación es, generalmente, un cuerpo de rocas, arena consolidada y suelo con la porosidad y permeabilidad suficientes para almacenar y transmitir petróleo.

El término "orificio de pozo" se refiere a un canal que va desde la superficie hasta un estrato que contiene petróleo con tamaño suficiente para permitir el bombeo de fluidos bien sea desde la superficie hasta el estrato que contiene petróleo (pozo de inyección) o desde el estrato que contiene petróleo hasta la superficie (pozo de producción) .

La expresión "Recuperación mejorada de petróleo por vía microbiana" (MEOR, por sus siglas en inglés) es una tecnología con base biológica que consiste en modificar la función o estructura microbiana, o ambas, de ambientes microbianos o microbios, o ambos, existentes en yacimientos de petróleo. El objetivo final de MEOR es mejorar la recuperación del petróleo atrapado en medios porosos. MEOR es una tecnología de extracción de petróleo terciaria que permite la recuperación parcial de petróleo residual, lo cual aumenta, en efecto, la vida de los yacimientos de petróleo.

El término "corrección ambiental" se refiere al proceso usado para eliminar contaminantes de hidrocarburos del ambiente alterado por contaminantes.

El término "biorrecuperación" se refiere al uso de microorganismos para remediar o eliminar contaminantes de un ambiente alterado por contaminantes.

El término "donante de electrones" se refiere a un compuesto molecular que da o dona uno o más electrones durante la respiración celular.

El término "aceptor de electrones" se refiere a un compuesto molecular que recibe o acepta uno o más electrones durante la respiración celular. Los microorgan smos obtienen energía para crecer al transferir electrones de un "donante de electrones" a un "aceptor de electrones" . Durante este proceso, el aceptor de electrones se reduce y el donante de electrones se oxida. Algunos ejemplos de aceptores de electrones incluyen oxígeno, nitrato, fumarato, hierro (III) , manganeso (IV), sulfato y dióxido de carbono. Azúcares, ácidos orgánicos de bajo peso molecular, carbohidratos, ácidos grasos, hidrógeno y petróleo crudo o sus componentes, tales como hidrocarburos de petróleo o hidrocarburos aromáticos policíclicos , son ejemplos de compuestos que pueden actuar como donantes de electrones. Los términos "desnitrificante" y "desnitrificación" significan reducir el nitrato o nitrito para ser usado en la generación de energía respiratoria.

"Adherido a" se refiere al recubrimiento o la adsorción de un líquido en una superficie sólida de al menos 10 % de área cubierta.

El término "humedecimiento" se refiere a la capacidad de un líquido para mantener contacto con una superficie sólida, que resulta de las interacciones intermoleculares cuando los dos se unen. El grado de humedecimiento (expresado como "humectabilidad" ) se determina mediante un equilibrio de fuerzas entre las fuerzas adhesivas y cohesivas.

"Agente humectante" se refiere a una sustancia química, tal como un tensioactivo, que aumenta la humeetabilidad del agua de una superficie sólida o porosa mediante el cambio de una superficie hidrófoba a otra más hidrófila. Los agentes humectantes ayudan a esparcir la fase de humedecimiento (por ejemplo, agua) sobre la superficie, lo que hace que la superficie se humedezca más con agua.

"Interface", como se usa en la presente descripción, se refiere a la superficie de contacto entre una capa de agua y una capa de petróleo, una capa de agua y una capa de superficie sólida, y una capa de petróleo y una capa de superficie sólida.

"Recubierto de hidrocarburos" , como se usa en la presente descripción, se refiere a un recubrimiento de un hidrocarburo en una superficie sólida de al menos 10 % del área cubierta.

El término "componentes de una formación subterránea" se refiere a roca, suelo, salmuera, arena, arcilla o mezclas de estos, de formaciones subterráneas o del lecho marino, que han entrado en contacto con uno o más hidrocarburos . Estos componentes pueden ser parte de un pozo o yacimiento de petróleo. Al menos una porción de los componentes incluyen algunas superficies recubiertas con hidrocarburos, que incluyen partículas con superficies recubiertas.

"Humectabilidad" se refiere a la preferencia de un sólido para entrar en contacto con un liquido, conocido como fase de humedecimiento, más que con otro. Las superficies sólidas pueden estar humedecidas con agua, humedecidas con petróleo o humedecidas en forma intermedia. La "humectabilidad de agua" corresponde a la adhesión del agua a la superficie de un sólido. En condiciones de humedecimiento con agua, una película delgada de agua recubre la superficie sólida, condición que resulta deseable para lograr que el petróleo se transporte eficazmente.

El término "fuerzas adhesivas" se refiere a las fuerzas entre un líquido y un sólido que hacen que una gota de líquido se extienda por la superficie.

El término "fuerzas cohesivas" se refiere a las fuerzas dentro del líquido que hacen que la gota forme una bola y evite el contacto con la superficie.

El término "inundación con agua" se refiere a la inyección de agua a través de orificios en el pozo hacia el interior del yacimiento de petróleo. La inundación con agua (recuperación de petróleo secundaria) se lleva a cabo para hacer salir el petróleo de un yacimiento de petróleo cuando el petróleo ya no fluye por sí solo del yacimiento.

El término "eficacia de barrido" se refiere a la fracción de un estrato que contiene petróleo por el que ha pasado fluido o agua, para mover el petróleo a los pozos de producción durante la inundación con agua. Un problema que puede surgir con los procesos de inundación con agua es la eficiencia relativamente pobre del barrido del agua, es decir, el agua se puede canalizar a través de ciertas porciones de un yacimiento a medida que se desplaza desde el (los) pozo(s) de inyección hacia el (los) pozo(s) de producción, por lo tanto, pasa por alto otras porciones del yacimiento. La eficiencia pobre del barrido puede deberse, por ejemplo, a diferencias en la movilidad del agua en comparación con la movilidad del petróleo, así como a las variaciones de permeabilidad dentro del reservorio que promueven el flujo a través de ciertas porciones del reservorio y no a través de otras.

El término "agua de inyección" se refiere al fluido inyectado en los reservorios de petróleo para la recuperación secundaria de petróleo. El agua de inyección se puede suministrar desde cualquier fuente apropiada y puede incluir, por ejemplo, agua de mar, salmuera, agua de producción, agua recuperada de un acuífero subterráneo, incluso de los acuíferos en contacto con el petróleo, o agua superficial de un arroyo, río, laguna o lago. Como se conoce en la técnica, es posible que sea necesario retirar del agua materia particulada, incluido polvo, pedazos de roca o arena y productos de la corrosión, tales como herrumbre, antes de la inyección en uno o más orificios del pozo. Los métodos para retirar la materia particulada incluyen filtración, sedimentación y centrifugación.

El término "agua de producción" significa agua recuperada de fluidos de producción extraídos de un yacimiento de petróleo. Los fluidos de producción contienen tanto agua natural asociada con el yacimiento y/o agua usada en la recuperación de petróleo secundaria, y petróleo crudo producido en el yacimiento petrolífero.

El término "biopelícula" significa una película o "capa de biomasa" de microorganismos. Frecuentemente, las biopelículas están incrustadas en polímeros extracelulares , los cuales se adhieren a superficies sumergidas en, o sometidas a, ambientes acuáticos. Las biopelículas consisten en una matriz de una masa compacta de microorganismos con heterogeneidad estructural, que pueden tener diversidad genética, interacciones complejas de comunidad y una matriz extracelular de sustancias poliméricas.

El término "biopelícula obturadora" significa una biopelícula que es capaz de alterar la permeabilidad de un material poroso y retardar, de este modo, el movimiento de un fluido a través de un material poroso que está relacionado con la biopelícula.

Los términos "nitratos simples" y "nitritos simples" se refieren a nitrato (N03) y nitrito (N02) , respectivamente.

El término "biotaponamiento" se refiere a hacer menos permeable el material permeable debido a la actividad biológica, particularmente, mediante un microorganismo.

El término "microorganismos autóctonos" se refiere a microorganismos que son naturales en los fluidos del yacimiento de petróleo y matrices subterráneas.

El término "microorganismos inoculados" se refiere a los microorganismos que se introducen en los fluidos del yacimiento de petróleo y matrices subterráneas al inyectar microbios a través de un orificio en el pozo hacia la subestructura del yacimiento de petróleo.

"Especie Shewanella" o ^Shewanella spp" se refiere a microorganismos filogenéticamente clasificados por tipificación del ADNr para el género Shewanella. Los miembros de Shewanella son proteobacterias gamma reductoras de metales gramnegativas que son capaces de reducir una amplia variedad de aceptores de electrones terminales. Estos microorganismos obtienen energía para apoyar el crecimiento anaerobio al acoplar la oxidación de H2 o materia orgánica a la transformación de reacción-oxidación de una variedad de metales multivalentes , lo que conduce a la precipitación, transformación o disolución de minerales.

El término "sal" incluye cualquier compuesto iónico que pueda crear iones en agua e incluye, pero no se limita a, KC1, SrCl, NaBr, NaCI , CaCl2 y MgCl2.

Obtención de poblaciones enriquecidas con Shewanella en fluidos de yacimientos de petróleo En la presente descripción se describen métodos para aumentar la proporción de microorganismos pertenecientes al género Shewanella entre las poblaciones totales de microorganismos autóctonos de fluidos de yacimientos de petróleo. Se desean las cepas de Shewanella por sus propiedades que son útiles para aumentar la recuperación de petróleo, como se describe a continuación. Los fluidos de yacimientos de petróleo (es decir, una "muestra ambiental") pueden ser aguas de producción o aguas de inyección y contienen mezclas heterogéneas de microorganismos. Los géneros a los que pertenecen estos microorganismos pueden identificarse por análisis de secuencias de ADN ribosómico 16S, y puede determinarse la proporción de microorganismos de cada género en la población de una muestra de fluidos de yacimientos de petróleo, como se describe en los ejemplos de la presente descripción.

Las muestras de fluidos de yacimientos de petróleo que proporcionan las muestras ambientales evaluadas en la presente descripción fueron de yacimientos del campo Senlac, situado en la provincia de Saskatchewan, Canadá, y del campo Wainwright, en la provincia de Alberta, Canadá. El agua de estos yacimientos tiene salinidad alta: en el intervalo de 30 a 38 ppt y en el intervalo de 60 a 68 ppt, respectivamente. El análisis de la presente descripción, en los Ejemplos 1 y 2, de los microorganismos autóctonos en estas muestras de fluidos de yacimientos de petróleo no detectó ningún microorganismo perteneciente al género Shewanella. Se desarrollaron métodos que incluyeron el crecimiento de poblaciones autóctonas de las muestras de fluidos de yacimientos de petróleo en medios que contienen receptores de electrones especificados, en virtud de lo cual los microorganismos pertenecientes al género Shewanella se volvieron detectables como una proporción de la población. Por lo tanto, estos métodos enriquecen con microorganismos Shewanella una población microbiana.

En los presentes métodos, los microorganismos en una muestra del yacimiento de petróleo se cultivan en un medio que contiene sal, al menos una fuente de carbono, y un aceptor de electrones seleccionado de aceptor de electrones orgánicos y aceptor de electrones de iones metálicos. Adicionalmente , el medio contiene otros componentes para apoyar el crecimiento de microorganismos y que pueden incluir componentes tales como vitaminas, metales traza, nitrógeno, fósforo, magnesio, calcio y/o sustancias químicas para soluciones reguladoras. La fuente de carbono puede ser materia orgánica compleja, tal como peptona, licor de maíz macerado o extracto de levadura. En otra modalidad, la fuente de carbono es un compuesto simple, tal como citrato, fumarato, maleato, butirato, piruvato, succinato, acetato, formato o lactato.

Los aceptores de electrones orgánicos que pueden usarse incluyen compuestos tales como fumarato, N-óxido de trimetilamina, sulfóxido de dimetilo, piruvato, glicina, y mezclas de estos compuestos. El fumarato puede estar en la forma de cualquier sal de ácido fumárico, o el ácido fumárico propiamente el puede incluirse, en este contexto, en el término fumarato. Las sales de fumarato pueden incluir una sal monosódica o disódica, sal de calcio, sal de magnesio, sal de amonio o diamonio, sal de potasio o dipotasio, sal clorhidrato, o formas hidratadas de cualquier sal ácida de fumarato. En una modalidad, la composición contiene fumarato disódico (DSF) .

Los aceptores de electrones de iones metálicos que pueden usarse incluyen compuestos tales como Fe(III), n(IV), Cr(IV) y mezclas de estos compuestos.

Cuando el crecimiento de poblaciones de microorganismos autóctonos en fluidos de yacimientos de petróleo se realiza con el uso de medios que contienen estos aceptores de electrones, la proporción de la población que pertenece al género Shewanella (que son células de Shewanella) aumenta en contraposición al crecimiento en medios que contienen nitrato como aceptor de electrones. La proporción de la población que pertenece al género Shewanella aumenta a por lo menos aproximadamente 1 %. El aumento en la proporción de células de Shewanella depende de factores tales como la distribución de microorganismos en la población autóctona en la muestra de fluidos, el aceptor de electrones específico usado y la concentración de sal del medio. La proporción de la población que pertenece al género Shewanella puede incrementarse a por lo menos aproximadamente 1 %, 2 %, 5 %,10 %,15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, o más, que incluye a por lo menos aproximadamente 90 %.

La concentración de sales del medio se puede ajustar para favorecer el crecimiento de microorganismos pertenecientes al género Shewanella . Como puede verse en el Ejemplo 3 de la presente descripción, los microorganismos Shewanella crecen en medios que tienen un intervalo amplio de concentraciones de sal que incluye una concentración de sal baja (11 ppt) o concentración de sal alta (60 ppt) , pero se desarrollan mejor en concentraciones de sal de aproximadamente 15 - 20 ppt. En una modalidad del presente método, la concentración de sal está entre aproximadamente 10 y 55 ppt. En otras modalidades, la concentración de sal está entre aproximadamente 10 y 40 ppt, o aproximadamente 15 y 35 ppt.

Cuando se usa el presente método, la población de microorganismos enriquecida puede contener microorganismos pertenecientes al género Arcoiacte . La proporción de la población que pertenece al género Arcobacter depende de factores tales como la distribución de microorganismos en la población autóctona de la muestra de fluidos, el aceptor de electrones específico usado y la concentración de sales del medio. Particularmente, con el uso de un aceptor de electrones orgánico, una gran proporción de la población pertenece al género Arcobacter, tal como mayor que 20 %. La concentración de sales del medio se puede ajustar para favorecer el crecimiento de microorganismos pertenecientes a los géneros Arcobacter y Shewanella. Por ejemplo, la especie Arcojbacter disminuirá y es posible que no se detecte al usar concentraciones de sal más bajas, tal como de aproximadamente 34 ppt . Pueden usarse concentraciones de sal que son de al menos aproximadamente 40 ppt para obtener poblaciones que contienen niveles detectables de células de Arcobacter. En una modalidad, la concentración de sal está entre aproximadamente 40 y 55 ppt, y las células de Shewanella y Arcobacter están presentes en la población obtenida. En otra modalidad, la concentración de sal es de al menos aproximadamente 50 ppt, y la proporción de células de Arcobacter es al menos aproximadamente 20 %.

Aislamiento de cepas de Shewanella Pueden aislarse cepas de microorganismos pertenecientes al género Shewanella a partir de poblaciones enriquecidas con células de Shewanella que se obtienen al seguir los presentes métodos, tal como se describió anteriormente. Después del enriquecimiento, las muestras se cultivan en un medio que tiene una concentración de sal de entre aproximadamente 10 ppt y 40 ppt para aislar colonias individuales a partir de las cuales se cultivan cepas. Se obtiene la secuencia de ADN ribosómico (ADNr) 16S para una cepa aislada y se compara con secuencias en la base de datos de ADNr del NCBI (-260,000 secuencias de ADNr) con el algoritmo de BLAST (Altschul et al., Journal of Molecular Biology, 1990). Una cepa se identifica como una cepa de Shewanella cuando el acierto para identidad de secuencias con puntaje más alto es de una especie conocida de Shewanella .

El presente método de enriquecimiento que usa un aceptor de electrones orgánico o de iones métalicos y cultivo en medio que tiene una concentración de sal que favorece el crecimiento de células de Shewanella permite aislar cepas de Shewanella con alta frecuencia. De las cepas analizadas, al menos una de diez, o nueve, u ocho, o siete, o seis, o cinco, o cuatro, o tres, o dos, o una de las cepas analizadas es una cepa de Shewanella .

Uso de células de Shewanella y Arcobacter para MEOR Las presentes poblaciones microbianas enriquecidas con Shewanella son útiles para mejorar la recuperación de petróleo. Se ha demostrado que las células de Shewanella tienen propiedades que son benéficas para mejorar la recuperación de petróleo de yacimientos de petróleo. Por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos núm. 7,776,795, que se incorpora en la presente descripción como referencia, se describe el aislamiento de la cepa de Shewanella putrefaciens, LH4 : 18 (núm. ATCC. PTA-8822) a partir de muestras de agua de pozos de producción y de inyección de campos petrolíferos de North Slope en Alaska mediante el cultivo de petróleo crudo destilado en medio que contiene nitrato y sales en un reactor de columna. Se demostró que esta cepa aumenta la liberación de petróleo de la arena. Adicionalmente , en la patente de los Estados Unidos núm. 2011-0030956, que se incorpora en la presente descripción como referencia, se describe la capacidad de las células de Shewanella o materiales o biomoléculas producidos por Shewanella para alterar la humectabilidad de una superficie recubierta de hidrocarburos y liberar, de este modo, petróleo de la superficie. El petróleo liberado de esta manera de superficies en un yacimiento de petróleo se puede recuperar por métodos de recuperación secundaria de petróleo, tales como la inundación con agua.

En algunas modalidades, adicionalmente a las células de Shewanella, las presentes poblaciones microbianas enriquecidas contienen células de Arcobacte . Se ha demostrado que las células de Arcojbacter tienen propiedades que son benéficas para mejorar la recuperación de petróleo de yacimientos de petróleo. Como se describe en la solicitud de patente copendiente y de propiedad mancomunada de los Estados Unidos núm. 13/280972, la cual se incorpora en la presente descripción como referencia, las cepas aisladas de Arcobacter que incluyen 97AE3-3 (Núm. ATCC. PTA-11410) y 97AE3-12 (Núm. ATCC. PTA- 11409) son capaces de formar biopelículas obturadoras . La cepa 97AE3-12 creció en presencia de aceite de petróleo, en condiciones desnitrificantes tanto de baja (15 ppt) como de alta (64 ppt) salinidad. Las biopelículas obturadoras se produjeron en medios de baja (15 ppt) y alta (35 ppt y 68 ppt) salinidad. Las biopelículas obturadoras se formaron con alimentación de nutrientes continua o por lotes. Adicionalmente, la conglomeración de partículas de sílice se demostró en medios de alta (64 ppt) salinidad. Estas propiedades demuestran el uso de las cepas de Arcobacter para formar biopelículas para obturar zonas hiperpermeables en arena o roca permeable de yacimientos de petróleo. La obturación de zonas hiperpermeables puede redirigir el agua hacia áreas menos permeables y más ricas en petróleo, para mejorar, así, la eficiencia de barrido, lo que conlleva un aumento en la recuperación de petróleo.

Métodos para mejorar la recuperación de petróleo Las presentes poblaciones microbianas enriquecidas con Shewanella, en algunas modalidades, que contienen, adicionalmente, células de Arcobacter se pueden introducir en un yacimiento de petróleo para producir una mejora en la recuperación de petróleo. La población inyectada está, típicamente, en un fluido, tal como el medio usado para cultivar los microorganismos. Además, el yacimiento de petróleo se inyecta, simultáneamente con o después de la inyección de la población microbiana, con una solución de nutrientes. La solución de nutrientes es una solución que favorece el crecimiento de células de Shewanella en la población, y de las células de Arcobacter, cuando están presentes. La solución de nutrientes contiene al menos una fuente de carbono y un aceptor de electrones. En algunas modalidades, el aceptor de electrones es un aceptor de electrones orgánico o un aceptor de electrones de iones metálicos, como se describió anteriormente. En algunas modalidades, la fuente de carbono es acetato, lactato, succinato, butirato o formato. Adicionalmente, la solución de nutrientes puede contener componentes de los medios, tal como se describió anteriormente.

La población microbiana se puede introducir en un yacimiento de petróleo con cualquier método conocido para un experimentado en la técnica. Típicamente, se introduce en un yacimiento de petróleo por inyección en un pozo de inyección, pero la inyección puede hacerse, además, en un pozo de producción. Los fluidos inyectados fluyen a través del pozo y hacia los sitios subterráneos adyacentes al pozo. Después de la introducción, se deja transcurrir un período de tiempo para el crecimiento de los microorganismos introducidos. Este período de tiempo para el crecimiento microbiano puede ser una semana o más. En una modalidad, este período es aproximadamente de dos a tres semanas. Después de este período, se introduce agua de inyección en el orificio del pozo, y esta fluye a través del pozo y hacia los sitios subterráneos adyacentes al pozo. Sin embargo, en este punto, la roca permeable se encuentra poblada de microorganismos para que el agua desplace el petróleo en el yacimiento de petróleo. El agua que contiene petróleo se recupera de por lo menos un pozo de producción.

Métodos generales El significado de las abreviaturas se usa en esta solicitud de la siguiente forma: "h" significa hora(s), "min" significa minuto (s), "día" significa día(s), "mi" significa mililitros, "mg/ml" significa miligramo por mililitro, "1" significa litros, "µ?" significa microlitros, "mM" significa milimolar, "µ?" significa micromolar, "nM" significa nanomolar, ^g/l" significa microgramo por litro, "pmol" significa picomol(es), ¾0C" significa grados centígrados, "°F" significa grados Fahrenheit, "bp" significa par de bases, "bps" significa pares de bases, "mm" significa milímetro, "ppm" significa partes por millón, "ppt" significa partes por mil, "g/1" significa gramo por litro, "ml/min" significa mililitro por minuto, "ml/h" significa mililitro por hora, "cfu/ml" significa unidades formadoras de colonias por mililitro, "g" significa gramo, "mg/1" significa miligramo por litro, "Kev" significa kilo o miles de voltios de electrón, "psig" significa por pulgada cuadrada por gramo, "LB" significa caldo de cultivo Luria, "rpm" significa revoluciones por minuto, "NIC" significa control no inoculado.

Crecimiento de microorganismos Las técnicas para cultivo y mantenimiento de cultivos anaerobios se describen en "Isolation of Biotechnological Organisms from Nature", (Labeda, D. P. ed. 117-140, McGraw-Hill Publishers, 1990) . El fumarato se usa como aceptor de electrones primario en las condiciones de crecimiento usadas en la presente descripción. El nitrato se usó en algunos enriquecimientos como control de aceptor de electrones alternativo. Con desnitrificación, el cultivo anaerobio se mide por reducción de nitrato del medio de cultivo en el tiempo. La reducción de nitrato a nitrógeno se ha descrito previamente (Moreno-Vivían, C. , et al., J. Bacteriol . , 181, 6573 - 6584, 1999). En algunos casos, los procesos de reducción de nitrato conllevan una acumulación de nitrito que, posteriormente, se reduce aún más a nitrógeno. Consecuentemente, la acumulación y, algunas veces, la disipación de nitrito también se consideran, por lo tanto, una prueba del metabolismo y crecimiento activo de microorganismos. El incremento de turbidez debido al aumento en la concentración de células bacterianas y/o la formación de biopelícula en el fondo de los viales con suero para anaerobios o en la interface de agua y gas se consideraron, además, indicadores de crecimiento microbiano.

Cromatografía de iones Para cuantificar los iones de nitrato y nitrito en medios acuosos, los solicitantes usaron una unidad de cromatografía ICS2000 (Dionex, Banockburn, IL) . El intercambio de iones se realizó en una columna de intercambio de aniones AS15 mediante el uso de un gradiente de 2 a 50 mM de hidróxido potásico. Se generaron curvas estándar mediante el uso de cantidades conocidas de soluciones de nitrito sódico o nitrato sódico, y estas se usaron para calibrar las concentraciones de nitrato y nitrito.

Medición del total de sales disueltas por refractómetro El total de sal disuelta se midió con un refractómetro manual (Modelo RHS 10ATC, Huake Instrument Co., Ltd) .

Muestras de agua de inyección y de agua de producción del yacimiento de petróleo En este estudio, se tomaron muestras de dos sistemas de pozos de petróleo. Uno se denomina Sistema de pozos núm. 1, que está en el campo Senlac, situado en la provincia de Saskatche an, Canadá, y el otro se denomina Sistema de pozos núm. 2, situado en el campo Wainwright, en la provincia de Alberta, Canadá. El agua del yacimiento tomada del Sistema de pozos núm. 1 tiene una salinidad cercana al agua de mar, en el intervalo de 30 a 38 ppt, y el Sistema de pozos núm. 2 tiene una salinidad de aproximadamente el doble del agua de mar, en el intervalo de 60 a 68 ppt. Se obtuvieron muestras de agua de cabezales de pozos de inyección y de producción como líquidos mezclados de petróleo/agua en botellas de vidrio marrón de 1.0 1, llenadas hasta el tope, tapadas y selladas con cinta para impedir la fuga de gas. El gas de los procesos anaeróbicos inherentes fue suficiente para mantener las condiciones anaerobias durante el transporte. Las botellas se transportaron en enfriadores plásticos grandes llenos con bloques de hielo hacia las instalaciones de las pruebas y llegaron dentro de las 48 h de la toma de muestras. Extracciones de ADN genómico de cultivos bacterianos Para extraer ADN genómico de las aguas de inyección y de producción de yacimientos y cultivos de enriquecimiento bacteriano líquidos, se recolectaron células y se concentraron por filtración sobre un filtro Supor® de 0.2 mieras (Pall Corp, Ann Arbor, MI). Una alícuota (2-5 mi) de un cultivo bacteriano se hizo pasar a través de un disco de filtro de 25 mm, 0.2 mieras, en un soporte de cartucho removible mediante el uso de presión de vacío o jeringa. Se retiraron los filtros y se colocaron en una solución reguladora de lisis (Tris-HCL 100 mM, NaCl 50 mM, EDTA 50 mM, pH de 8.0) seguido de agitación con un mezclador Vortex.

Después, se agregaron reactivos a una concentración final de 2.0 mg/ml de lisozima, 10 mg/ml de SDS, y 10 mg/ral de Sarkosyl para lisar las células. Después de mezclar adicionalmente con un mezclador Vortex, se agregó 0.1 mg/ml de ARNasa y 0.1 mg/ml de proteinasa K para eliminar el ARN y contaminantes de proteínas, y la mezcla se incubó a 37 °C por 1.0- 2.0 h. Después de la incubación, se retiraron los filtros y se extrajeron las muestras dos veces con un volumen igual de fenol : cloroformo : alcohol isoamílico (25:24:1, v/v/v) y una vez con cloroformo : alcohol isoamílico (24:1, v/v) . Una décima parte del volumen de NaCl 5.0 M y dos volúmenes de etanol al 100 % se agregaron a la capa acuosa y se mezclaron. Los tubos se congelaron a -20 °C durante toda la noche y, después, se centrifugaron a 15,000 x g por 30 min a temperatura ambiente para producir gránulos de ADN cromosómico. Los gránulos se lavaron una vez con etanol al 70 %, se centrifugaron a 15,000 x g por 10 min, se secaron, resuspendieron en 100 µ? de agua desionizada y se almacenaron a -20 °C. Se analizó una alícuota del ADN extraído sobre un gel de agarosa para determinar la calidad y la cantidad del ADN extraído.

Análisis poblacional de las poblaciones de microorganismos mediante el uso de genotecas genómicas microbianas de ADNr 16S de clones con identificación de ADNr Se generaron genotecas genómicas de ADNr 16S a partir de muestras de aguas de inyección y de producción de yacimientos petrolíferos de ambos sistemas de pozos y de muestras de cultivos de enriquecimiento. Se seleccionaron conjuntos de iniciadores de Lañe, ((1991) 16S/23S rRNA sequencing, págs . 115-175. In Stackebrandt , E. y M. Goodfellow (ed.), Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. John Wiley y Sons, New York, NY) para generar fragmentos de ADNr 16S amplificados por PCR de especies microbianas presentes en las muestras de ADN preparadas a partir de las muestras de pozos o los cultivos de enriquecimiento. Se seleccionó la combinación de iniciador directo (sec. con núm. de ident.:l) e iniciador inverso (sec. con núm. de ident.:2) para amplificar específicamente las secuencias de ADNr 16S bacteriano .

La mezcla de amplificación de PCR incluyó: solución reguladora para PCR 1.0X Go Taq® (Promega) , 0.25 mM de los dNTP, 25 pmoles de cada iniciador, en un volumen de reacción de 50 µ? . Se agregó 0.5 µ? de ADN polimerasa Go Taq® (Promega) y 1.0 µ? (20 ng) del ADN de la muestra. El protocolo de ciclación térmica de la reacción de PCR usado fue 5.0 min a 95 °C seguido de 30 ciclos de: 1.5 min a 95 °C, 1.5 min a 53 °C, 2.5 min a 72 °C y una extensión final de 8 min a 72 °C en un termociclador GeneAmp® 9700 de Applied Biosystems® (LifeTenchnologies , Corp, Grand Island, NY) . Este protocolo se usó, además, con células de colonias purificadas o combinación de especies de cultivos de enriquecimiento.

Los productos de amplificación de 1400 pares de bases para un conjunto de ADN dado se visualizaron en geles de agarosa al 0.8 %. La mezcla de reacción de PCR se usó directamente para clonación en el vector pCR® -TOP04® al usar el sistema de clonación TOPO® TA, (Invitrogen™, LifeTenchnologies , Corp, Carlsbad, CA) según las recomendaciones del fabricante. El ADN se transformó en células TOP10® químicamente competentes seleccionadas por su resistencia a la ampicilina. Se seleccionaron colonias individuales (~48-96 colonias) y se cultivaron en placas de microtitulación para análisis de secuencias.

Preparación de la plantilla del plásmido Los sistemas de purificación de plantillas automatizadas a gran escala usaron la inmovilización reversible de fase sólida (SPRI®, Agencourt, Beverly, MA; DeAngelis, M. M., et al., Nucleic Acid Res., 23: 4742 - 4743, 1995). La tecnología de SPRI® usa partículas paramagnéticas de núcleo de hierro recubiertas con carboxilato para capturar ADN de una longitud de fragmento deseada en función de las condiciones reajustadas de la solución reguladora. Cuando se captura el ADN deseado en las partículas, estas pueden concentrarse magnéticamente y separarse para que los contaminantes se puedan eliminar por lavado.

Las plantillas del plásmido se purificaron con un protocolo optimizado SprintPrep™ SPRI (Agencourt) . Este procedimiento recolecta ADN plasmídico directamente de cultivos bacterianos lisados al atrapar tanto el plásmido como el ADN genómico en las partículas de perlas funcionalizadas y eluir selectivamente solo el ADN plasmídico. Brevemente, el procedimiento de purificación involucra la adición de la solución reguladora de lisis alcalina (que contiene ARNasa A) al cultivo bacteriano, la adición del reactivo de precipitación a base de alcohol que incluye partículas paramagnéticas , la separación de las partículas magnéticas con placas separadoras magnéticas basadas en un anillo especialmente diseñado, lavado 5x de las perlas con ETOH al 70 %, y elución del ADN plasmídico con agua .

Secuenciacion de ADNr, ensamblaje de clones y análisis filogenético de ADN Se secuenciaron plantillas de ADN en un formato de 384 pocilios con reacciones de secuenciacion BigDye® Versión 3.1 en instrumentos ABI®3730 (Applied Biosystems®, Foster City, CA) . La ciclación térmica se realizó con un termociclador de 384 pocilios. Las reacciones de secuenciacion se purificaron con el estuche de eliminación de terminadores CleanSeq® Dye-Terminator de Agencourt según las recomendaciones del fabricante. Las reacciones se analizaron con un secuenciador capilar modelo ABI3730XL que usa un módulo de ejecución extendida desarrollado en Agencourt. Todos los análisis de secuencias y llamadas se procesaron con el software de llamado de bases Phred (Ewing et al., Genome Res., 8: 175 -185, 1998) y se monitorearon constantemente contra los estándares de medición de calidad.

Ensamblaje de clones de ADNr Se generó un archivo para cada clon de ADNr. El ensamblaje de los datos de secuencias generados para los clones de ADNr se realizó con el programa de ensamblaje de secuencias PHRAP (Ewing, et al., supra) . Se generaron archivos de calidad consenso y secuencias consenso para más de una lectura de secuencias superpuestas.

Análisis de secuencias de ADNr Cada secuencia ensamblada se comparó con el banco del NCBI (base de datos de ADNr; -260,000 secuencias de ADNr) con el programa del algoritmo de BLAST® (Altschul, supra). Los aciertos de BLAST® se usaron para agrupar las secuencias en grupos de homología, y cada uno contiene secuencias con =90 % de identidad para el mismo fragmento de ADNr del NCBI. La secuencia de nucleótidos del ADNr 16S usada para identificar el grupo de homología de Shewanella fue la sec . con núm. de ident.:3. La secuencia de nucleótidos del ADNr 16S usada para identificar el grupo de homología de Arcobacter fue la sec. con núm. de ident.:4. Los grupos de homología se usaron para calcular proporciones de especies particulares en cualquier muestra. Debido a que los protocolos de amplificación y clonación fueron idénticos para el análisis de cada muestra, las proporciones pudieron compararse de muestra a muestra. Esto permitió comparaciones de diferencias de población en muestras tomadas para selecciones de enriquecimientos diferentes o en momentos de muestreo diferentes para el mismo cultivo de enriquecimiento del consorcio.

Preparación de ADN de aislados de colonias bacterianas para análisis de secuencias Se aisló el ADN genómico de colonias bacterianas sembradas en agar marino al diluir colonias bacterianas en 50 µ? de agua o solución reguladora de Tris-HCL con un pH de 7-8. Los ADN de las colonias diluidas se amplificaron con ADN polimerasa Phi 29 antes de la secuenciación (estuche de amplificación GenomiPHI, GE Life Sciences, New Brunswick, NJ) . Se adicionó una alícuota (1.0 µ?) de una colonia diluida a 9.0 µ? del reactivo de lisis (del estuche de amplificación GenomiPHI®) y se calentó a 95 °C durante 3 min seguido de enfriamiento inmediato a 4 °C. Nueve (9.0) µ? de solución reguladora enzimática y 1.0 µ? de la enzima Phi 29 se agregaron a cada muestra sometida a lisis y, después, se incubó a 30 °C durante 18 horas. La polimerasa se inactivo por calentamiento a 65 °C durante 10 minutos seguido de enfriamiento a 4 °C.

Análisis de secuencias de ADN Las reacciones de secuenciación de ADN se establecieron de la siguiente forma: Se agregó 8.0 µ? de muestra amplificada de GenomiPHI a 8.0 µ? de reactivo de secuenciación BigDye® v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) seguido de 3.0 µ? de 10 µ? de iniciadores de sec . con núms . de iden . :1, 2, 3 o 4 (preparados por Sigma Genosys, Woodlands, TX) , 4.0 µ? de solución reguladora de dilución 5X BigDye® (Applied Biosystems™) y 17 µ? de agua, grado biología molecular (Mediatech, Inc., Herndon, VA).

Las reacciones de secuenciación se sometieron a calentamiento durante 3.0 min a 96 °C seguido de 200 termociclos (de 95 °C por 30 s; 55 °C por 20 s; 60 °C por 2 min) y se almacenaron a 4 °C. Los dNTP no incorporados se retiraron mediante el uso de placas de limpieza de Edge Biosystems (Gaithersburg, MD) . Las reacciones amplificadas se colocaron con pipeta en un pocilio de una placa de limpieza precentrifugada de 96 pocilios. La placa se centrifugó durante 5.0 min a 5,000x g en un Sorvall RT-7® (Sorvall®, Thermo Scientific®, Newtown, CT) a 25 °C. Las reacciones purificadas se colocaron directamente sobre un secuenciador de ADN 3730 de Applied Biosystems y se secuenciaron con llamada automática de bases.

Cada una de las secuencias de ADNr ensambladas se comparó con la base de datos de ADNr del NCBI (~ 260,000 secuencias de ADNr) con el algoritmo de BLAST® (Altschul et al., Journal of Molecular Biology, 1990) . El acierto de identidad de secuencia con la puntuación más alta se usó como identificador de la especie conocida más estrechamente relacionada para la identificación de cepas.

Alternativamente, para generar fragmentos amplificados de ADNr a partir de cepas individuales, se seleccionaron los mismos conjuntos de iniciadores de Lañe, D. J. (supra) . La combinación de iniciador con sec . con núm. de ident . : 1 e iniciador con sec. con núm. de ident .: 2 se escogió específicamente para amplificar secuencias de ADNr bacteriano.

La mezcla de amplificación de PCR incluyó: solución reguladora para PCR 1. OX Go Taq® (Promega) , 0.25 mM de los dNTP, 25 pmoles de cada iniciador, en un volumen de reacción de 50 µ?. Se agregó 0.5 µ? de ADN polimerasa Go Taq® (Promega) y 1.0 µ? (20 ng) del ADN de la muestra. El protocolo de termociclos para la reacción de PCR fue 5.0 minutos a 95 °C seguido de 30 ciclos de: 1.5 min a 95 °C, 1.5 min a 53 °C, 2.5 min a 72 °C y una extensión final de 8 min a 72 °C en un termociclador GeneAmp® 9700 de Applied Biosystems™. Los productos de amplificación de 1400 pares de bases se visualizaron en geles de agarosa al 1.0 %. La secuenciación de los fragmentos amplificados y la identificación de cepas fue según lo descrito anteriormente. Ejemplo 1 Enriquecimiento anaerobio para microbios autóctonos a partir de muestras de yacimientos de petróleo con salinidad alta Se usaron tres aceptores de electrones diferentes en enriquecimientos de muestras de yacimientos de petróleo. Un (1) mi de agua de producción o de agua de inyección del Sistema de pozos núm. 1 o núm . 2, descrito en la sección de Métodos generales, se inoculó en 9 mi de medio mínimo de sales (Tabla 1) en viales de suero para anaerobios de 20 mi. Adicionalmente , el medio mínimo de sales se complementó con 43 ppt de cloruro de sodio para llevar la salinidad a 53 ppt. Después, el medio de crecimiento se complementó con 2000 ppm de lactato de sodio para servir de fuente de carbono y 3.7 g/1 de fumarato de sodio como aceptor de electrones. Los cultivos separados se complementaron con 1600 ppm de nitrato de sodio o 2500 ppm de Fe (III) agregado como sal de sodio férrica del ácido etilendiaminotetraacético (EDTA (C10Hi2FeN2NaO8 ; E6760-100G, Sigma-Aldrich, St Louis Mo.) en lugar de fumarato. El medio se desoxigenó (anaerobio) al inyectar por burbujeó en los viales llenos una mezcla de nitrógeno y dióxido de carbono (80 %/20 %) y, después, se introdujo en un autoclave. Todas las manipulaciones de las muestras de agua de campos de petróleo, que contenían microbios autóctonos del yacimiento, se realizaron en una cámara anaerobia (Coy Laboratories Products, Inc., Grass Lake , MI) . Las botellas con cultivos inoculados se incubaron a temperatura ambiente.

Tabla 1. Medio mínimo de sales El pH del medio se ajustó a 6.8, el pH aproximado del yacimiento Los cultivos de enriquecimiento que contenían nitrato se monitorearon y se tomaron muestras de ellos de forma regular para la reducción de nitrato y la acumulación de nitrito o, en algunos casos, la reducción de nitrito. Cuando el nitrato se redujo en la muestra (usualmente antes de 14 días) , se agregó lactato y nitrato a las concentraciones finales originales. Al mismo tiempo, se agregó, además, lactato y fumarato en cada uno de los otros enriquecimientos a las concentraciones finales originales.

Todos los viales se incubaron durante otros 14 a 20 días a temperatura ambiente. Se observaron cambios visibles en los cultivos, que indicaron el crecimiento de lactato y el aceptor de electrones, en cada una de las muestras de enriquecimiento. Los cambios incluyeron turbidez visible en el medio y/o la presencia de biopelículas en los viales de vidrio o en la interface gaseosa-acuosa, así como una reducción de nitrato y nitrito en viales que contenían nitrato como aceptor de electrones. La turbidez fue similar en cada vial, lo que indica que hubo una población diversa de microorganismos tanto en el agua de inyección como en el agua de producción .

Ejemplo 2 Análisis de poblaciones en cultivos de enriquecimiento anaerobios Antes de comenzar los cultivos de enriquecimiento, se determinaron las distribuciones de los valores de referencia de las poblaciones de microbios autóctonos en el Sistema de pozos núm . 1 y el Sistema de pozos nüm . 2 por identificación de poblaciones de ADNr, que se realizaron al usar el agua de inyección y de producción del yacimiento de ambos sistemas con el método descrito anteriormente en la sección de Métodos generales. Después de 4 semanas de crecimiento, se prepararon perfiles de todos los cultivos de enriquecimiento al usar las distribuciones de secuencias de ADNr, como se describe en la sección de Métodos generales, para ver las diferencias en los perfiles de las poblaciones en comparación con las poblaciones autóctonas.

Resultados del análisis de secuencias de ADNr 16S para el Sistema de pozos núm. 1 Para el Sistema de pozos núm. 1, se compilaron los perfiles de ADNr 16S para el agua de producción y para una muestra de los cultivos de enriquecimiento del agua de producción. Los grupos de homología, cada uno con = 90 % de identidad con el mismo archivo de secuencias del fragmento de ADNr del NCBI como se describe en la sección de Métodos generales, obtenidos para la muestra de agua de producción original para el cultivo de enriquecimiento con fumarato y para el cultivo de enriquecimiento con Fe (III) se usaron para calcular las proporciones de tipos diferentes de bacterias en cada muestra. Los resultados se muestran en la Tabla 2. El cultivo de enriquecimiento con nitratos no se evaluó en esta muestra.

Tabla 2. Distribuciones filogenéticas en el agua de producción del Sistema de pozos núm. 1 y cultivos de enriquecimiento nd* significa no detectado Los resultados mostraron que las bacterias que pertenecen al género Arcojbacter de la clase de proteobacterias Epsilon proteobacteria fueron el tipo predominante de bacterias presentes en el agua de producción del Sistema de pozos núm. 1 (aproximadamente 72 %) , y con el enriquecimiento con fumarato, el género Arcojbacter siguió siendo el tipo predominante de bacterias presentes con aproximadamente 65 % de la población. Además, con el enriquecimiento con fumarato, el porcentaje de bacterias pertenecientes al género Shewanella de la clase Gamma proteobacteria se incrementó a aproximadamente 2 % cuando antes era indetectable .

Con el enriquecimiento con Fe (III), el porcentaje de bacterias pertenecientes a Shewanella aumentó, en tanto que el porcentaje de bacterias pertenecientes a Arcobacter disminuyó .

El cultivo de enriquecimiento con fumarato se incubó durante otros 14 días a temperatura ambiente, una alícuota de 100 µ? del enriquecimiento se sembró en estrías sobre una placa con agar y caldo marino (preparado según receta, Difco™ 2216, Becton-Dickenson, Sparks, D) , y la placa se incubó a temperatura ambiente durante dos días. El caldo marino tiene una salinidad de aproximadamente 34 ppm (con 19.5 ppm de NaCl) . Los aceptores de electrones en el caldo marino incluyen sulfato, nitrato y aceptores de electrones orgánicos no especificados de peptona y extracto de levadura.

Se volvieron a sembrar por estrías sobre placas con agar y caldo marino colonias seleccionadas al azar y se cultivaron para purificar los aislados. Para caracterizar la identidad de los aislados, las colonias se cribaron para identificación por amplificación de PCR al usar el método directo de ADNr de colonias descrito en la sección de Métodos generales mediante el uso de ambos iniciadores de Lañe (supra) , el iniciador inverso de PCR, 1492R (sec. con núm. de ident . :1) y el iniciador directo de PCR SF (sec. con núm. de ident.:2). El análisis y la secuenciación de ADN descritos en la sección de Métodos generales se usaron para obtener las secuencias de ADNr 16S para identificación microbiana .

Las bacterias pertenecientes al género Shewanella fueron las colonias aisladas predominantes del enriquecimiento con fumarato que después se sembraron por estrías sobre placas con medio sólido de agar y caldo marino. Después de este proceso, aproximadamente 52 % de la población se clasificó como Shewanella. Las células de Arcobacter no se aislaron con este procedimiento particular.

La concentración de sal reducida en el caldo marino puede haber favorecido el crecimiento de Shewanella y otros géneros bacterianos sobre el crecimiento de Arcobacter.

Tabla 3. Distribución filogenética de colonias aisladas cultivadas en agar y caldo marino después del enriquecimiento con fumarato del agua de producción del Sistema de pozos núm. nd* significa no detectado Resultados del análisis de secuencias de ADNr 16S para el Sistema de pozos núm. 2 Para las muestras de agua de producción y de inyección del Sistema de pozos núm. 2, los cultivos de enriquecimiento se prepararon como se describió anteriormente con fumarato, nitrato o Fe (III) como aceptor de electrones. Se compilaron los perfiles de poblaciones basados en secuencias de ADNr 16S, obtenidos como se describe en la sección de Métodos generales, para el agua de producción, el agua de inyección y los cultivos de enriquecimiento que se muestran en las Tablas 4 y 5.

En el agua de producción del Sistema de pozos núm. 2 no se detectaron células de, Shewanella, y las células de Arcobac er a no estuvieron bien representadas : 4 % (Tabla 4). En ambos enriquecimientos con fumarato y nitrato, la proporción de bacterias pertenecientes a Arcojbacter se incrementó para convertirse en el tipo predominante: aproximadamente 89 % y 85 % de la población, respectivamente. La población de Arcobacter tuvo un pequeño incremento con el enriquecimiento con Fe (III) . Con los enriquecimientos con fumarato y Fe (III) , la población de Shewanella aumentó, en tanto que con el enriquecimiento con nitratos, las células de Shewanella permanecieron no detectadas.

Tabla 4. Distribución filogenética en el agua de producción del Sistema de pozos núm. 2 y sus enriquecimientos nd* significa no detectado En el agua de inyección del Sistema de pozos núm . 2, nuevamente, las células de Shewanella no estuvieron representadas, en tanto que las células de Arcobacter fueron los microorganismos predominantes. En el cultivo de enriquecimiento con fumarato, la proporción de células de Shewanella se incrementó desde indetectable a 21 % de la población. La proporción de células de Arcobacter disminuyó, pero permaneció como la especie más predominante con un 26 %. En el enriquecimiento con Fe(III) , la proporción de células de Arcobacer disminuyó hasta ser no detectable, en tanto que la proporción de células de Shewanella aumentó a aproximadamente 90 %. En el enriquecimiento con nitrato, las células de Shewanella tampoco fueron detectadas, en tanto que las células de Arcobacter disminuyeron, pero estuvieron bien representadas con aproximadamente 22 % .

Tabla 5. Distribución filogenética en el enriquecimiento con fumarato del agua de inyección del Sistema de pozos núm. 2 5 10 nd* significa no detectado Ejemplo 3 Tolerancia de shewanella a la sal Una cepa de Shewanella aislada del enriquecimiento con fumarato del agua de inyección del pozo núm. 2 se cultivó a 32 °C en medio Bacto-triptona al 1 % que contiene cantidades variables de NaCl . La salinidad real fue aproximadamente 10 ppt más alta que la concentración de NaCl debido a la contribución de la triptona en el medio, según lo medido por lecturas refractrométricas actuales. Se determinó el índice de crecimiento para la cepa en cada concentración de NaCl al medir la OD600, y se muestra en la Tabla 6, en donde índice de crecimiento k = log2/T y en donde T = tiempo de duplicación. Tabla 6. índices de crecimiento de la cepa de Shewanella del pozo núm. 2 con cantidades diferentes de NaCl La cepa aislada de Shewanella creció mejor con una salinidad de aproximadamente 15 ppt (5 ppt de NaCl + 10 ppt de triptona) , y el índice de crecimiento decayó con concentraciones de sal más altas. El índice de crecimiento se redujo considerablemente con salinidades de 11 y 60 ppt.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (11)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para enriquecer una población microbiana; caracterizado porque comprende: a) proporcionar una muestra ambiental de un fluido de un yacimiento de petróleo que comprende una población microbiana autóctona; y b) cultivar esa muestra en un medio que comprende sal, al menos una fuente de carbono y un aceptor de electrones seleccionado de aceptor de electrones orgánico y aceptor de electrones de ión metálico para obtener una población microbiana enriquecida; donde la proporción de células de Shewanella en la población microbiana enriquecida de (b) es mayor que la proporción de células de Shewanella en la muestra ambiental de (a) .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de (b) tiene una concentración de sal que está entre aproximadamente 10 ppt y 55 ppt.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una etapa después de (b) para cultivar la población microbiana enriquecida de (b) en un medio que tiene una concentración de sal que está entre aproximadamente 15 ppt y 35 ppt para obtener una segunda población microbiana enriquecida.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el aceptor de electrones es un aceptor de electrones orgánico y caracterizado porque las células de Arcobacter están presentes en la población microbiana enriquecida de (b) .

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la concentración de sal es de al menos aproximadamente 40 ppt.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos una fuente de carbono de (b) se selecciona del grupo que consiste en acetato, lactato, piruvato, butirato, y formato.

7. Un método para aislar una cepa del género Shewanella; caracterizado porque comprende: a) proporcionar una muestra ambiental de un fluido de un yacimiento de petróleo que comprende una población microbiana autóctona; b) cultivar esa muestra en un medio que comprende sal, al menos una fuente de carbono y un aceptor de electrones seleccionado de aceptor de electrones orgánico y aceptor de electrones de ión metálico para obtener una población microbiana enriquecida; c) cultivar la población microbiana enriquecida de (b) en un medio que tiene una concentración de sal que está entre aproximadamente 10 ppt y 40 ppt para obtener colonias aisladas; y d) realizar el cribado de las colonias aisladas de (c) por análisis de secuencias de ADNr contra secuencias de ADNr microbiano conocidas; caracterizado porque se identifica al menos una cepa de Shewanella .

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el medio de (b) tiene una concentración de sal que está entre aproximadamente 10 ppt y 40 ppt.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 7, caracterizado porque el ion metálico se selecciona del grupo que consiste en Fe(III), Mn(IV), Cr(IV), y mezclas de estos.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 7, caracterizado porque el aceptor de electrones orgánico se selecciona del grupo que consiste en fumarato, N-óxido de trimetilamina, sulfóxido de dimetilo, piruvato, glicina, y mezclas de estos.

11. Un método para mejorar la recuperación de petróleo de un yacimiento de petróleo; caracterizado porque comprende: a) proporcionar una población microbiana enriquecida obtenida por el método de conformidad con la reivindicación 1 o 3; b) introducir la población microbiana enriquecida de (a) en un yacimiento de petróleo; c) introducir una solución de nutrientes que comprende al menos una fuente de carbono y al menos un aceptor de electrones en el yacimiento de petróleo; y d) recuperar petróleo del yacimiento de petróleo; donde el cultivo de la población microbiana enriquecida mejora la recuperación de petróleo.