CN1415744A - 一种微生物驱油菌种的筛选分离方法 - Google Patents
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Abstract
一种微生物驱油菌种的筛选分离方法，包括：(1)样品采集；(2)增菌培养；(3)菌种纯化；(4)分离筛选；(5)性能检测。本发明筛选的菌种其生长周期一般是在24～72小时，菌数都能达到设计要求的107－8个/ml。用本发明方法筛选的菌种可用于油田增产增注和提高采收率。
Description
技术领域：
本发明属于一种微生物驱油菌种的培育方法，具体地说涉及一种以烃类为碳源的微生物驱油菌种的培育方法。
背景技术：
常规的采油工艺只能采出一个油藏中原始石油储量的三分之一，剩下的三分之二将成为提高石油采收率(EOR)研究及发展的目标。
用微生物提高石油采收率(MEOR)可提供一种新的增油措施。实践证明，微生物采油的主要特点是成本低、适应性强、施工方便、不污染环境。MEOR法的基础就是在于通过营养剂的供应控制微生物的个体、大小、增殖速度及生化活性，因而用MEOR法对油藏进行处理，以便使残余油成为可动与可采。但MEOR法采用的菌种为好氧与兼性菌的复配，且营养物是碳水化合物(糖蜜)，这种方法的主要问题是，菌种与油藏的还原环境不配伍，而且营养物糖蜜价格贵，来源少，无法满足提高采收率的需要。
由于上述原因，如何筛选分离以烃类为唯一碳源，并适应油藏厌气环境的菌种，是人们正在努力解决的问题。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种微生物驱油菌种的筛选分离方法，该方法可有效地筛选分离出以烃类为碳源的微生物驱油菌种。
为实现上述目的，本发明提供的一种微生物驱油菌种的筛选分离方法包括以下步骤：
(1)样品采集：用无菌取样瓶采集油田生产井中的油水混合液或回注的污水样，放入35-60℃的恒温箱中恒温0.5-1.5小时恒温箱中待用；
(2)增菌培养：在厌氧条件下将样品接种于无机盐培养基中培养，摇床温度35-45℃，转速100-150rpm，培养时间7-15天，同时做一不加菌的空白对照，选择菌数比增加者进行继续培养；
(3)菌种纯化：将增菌的培养液用接种针沾少许，在以原油为唯一碳源的选择性固体培养基上划线，放入厌氧工作站或干燥器中培养3-5天，挑取不同形态的单菌落在牛肉膏固体培养基上划线纯化，将纯化菌落接至以原油为唯一碳源的液体培养基内进行厌氧培养，将纯化的菌落移接斜面培养基中；
(4)分离筛选：在厌氧瓶中装入复配的培养基及原油，原油加入量为培养基体积比的4％，经高温灭菌后接种培养，培养条件为：摇床温度35-60℃，转速100-150rpm，培养时间7-15天，选择可以乳化原油的菌种作平行实验，进一步选择平行实验中原油均乳化的菌种；
(5)性能检测：经分离筛选的菌种进行下面各项指标的检测
①菌种的耐温性实验；
②菌种对原油组分的作用；
③菌种对原油粘度的影响；
④发酵液中活性物有机酸的含量；
⑤发酵液油水界面张力的变化；
⑥营养物对菌种生长的影响；
⑦菌种的驱油效果评价；
⑧菌种的扩大发酵实验。
附图说明：
以上给出了本发明的一种以烃类为碳源的微生物驱油菌种的培育方法。下面以具体实施方式并结合附图对本发明作详细描述，可以对本发明有更进一步的了解，其中：
图1：细菌发酵油全烃色谱曲线；
图2：细菌发酵油全烃色谱曲线；
图3：菌种YT5作用后原油色-质谱曲线图；
图4：菌种YT6作用后原油色-质谱曲线图；
图5：菌种YT7作用后原油色-质谱曲线图；
图6：细菌生长曲线；
图7：细菌生长曲线；
图8：配伍菌的长管模型驱油效果；
图9：配伍菌的长管模型驱油效果。
具体实施方式：
1、样品采集：用无菌取样瓶采集油田生产井中的采出液(油水混合液)样或联合站回注的污水样若干个，作标记送回实验室，放入45℃恒温箱中恒温1小时后待用；
2、增菌培养：取出采集的油水混合物，剧烈摇晃，使样品充分混合，取1ml样品接种于无机盐培养基中，在摇床温度为45℃，转速为100-150rpm下培养7-15天(摇床培养目的是原油和培养液及菌种之间能较好的混合)。同时要做一不加菌的空白对照，测定每瓶中的细菌数量，菌数比增加者，说明具有厌氧利用原油的能力，可进行继续培养，整个培养过程都是在厌氧条件下进行的；
3、菌种纯化：将增菌的培养液用接种针沾少许，在以原油为唯一碳源的选择性固体培养基上划线，放入厌氧工作站或干燥器中培养3-5天，取出平板观察单菌落状态。然后挑取不同形态的单菌落在牛肉膏固体培养基上划线纯化，将纯化菌落接至以原油为唯一碳源的液体培养基内进行厌氧培养，将纯化的菌落移接斜面培养基中，4℃冰箱保存待用；
4、分离筛选：菌种采用淘汰方法筛选，在250ml的厌氧瓶中，装入复配的培养基及4％的原油，经高温灭菌后，接种，菌种的接入量按1/100ml，置摇床45℃，转速为100-150rpm下培养7-15天，每天观察细菌对原油的乳化情况，从所分离的可以乳化原油的菌种中，把其中的每一个菌种都采用相同的方法，平行接种若干个含定量油水样的摇瓶中，如果平行接种的摇瓶中原油均乳化，则为可选用的菌种之一，否则淘汰；
5、性能检测：经初步分离筛选的菌种需要进行下面各项指标的检测，才能判定其驱油作用效果的好坏，能否用于提高原油采收率试验：
①菌种的耐温性实验；
②菌种对原油组分的作用；
③菌种对原油粘度的影响；
④发酵液中活性物有机酸的含量；
⑤发酵液油水界面张力的变化；
⑥营养物对菌种生长的影响；
⑦菌种的驱油效果评价；
⑧菌种的扩大发酵实验。
按上述实施方式获得8株乳化原油效果较好的菌种，其形态为杆状、长杆状、短杆状，大小为(1.86-2.48×0.62--0.74)μm，按顺序编号为YT1、YT2、…、YT8，革兰氏染色呈阳性，经初步鉴定为拟杆菌属(Bacteriodes)。这8株菌在兼性厌氧条件下能以原油为碳源的培养基(其成分包括微量元素、氮源、碳源)中生长繁殖，具有降解原油，产生有机酸活性物的能力。
图1、图2是菌种YT1、2、3、5、7和8都能在油层的温度45℃条件下生长，60℃也能生长良好，超过75℃不生长。菌种YT1-8在固定营养液浓度、PH、45℃的条件下，生长菌数都能达到设计要求107-8个/ml，而且生长期较长，达到40天不变。
图3、图4是菌种YT-5和YT-7发酵原油后分析的全烃色谱图。其中用本发明方法筛选的菌种YT-5作用后的原油轻质组分C8-C11增加了30％，∑C21/C22增加了54％，作用后原油的姥鲛烷/nC17和植烷/nC18的比值分别增加了36％和19％；菌种YT-7作用后的原油的轻质组分C9-C11增加了20％，∑C21/C22增加了22％，姥鲛烷/nC17和植烷/nC18的比值分别增加了55％和75％。
表1是菌种对原油中的饱和烃、芳烃、菲烃、沥青质组分作用前后进行的族组分分析，得到不同组分的百分含量。其中用本发明方法筛选的菌种YT1-6、YT-7和YT-8发酵原油后饱和烃含量相对增加，芳烃、菲烃、沥青质含量相对减少，这说明原油经微生物作用后使重组分的含量减少，有利于原油在多孔介质中的流动被采出。
表1 原油经微生物作用前后的族组成分析
| 菌 种 | 族组成(％) | |||
| 饱和烃 | 芳烃 | 菲烃 | 沥青质 | |
| 空白油样 | 66.27 | 18.93 | 14.05 | 0.75 |
| YT-7 | 73.44 | 17.95 | 8.02 | 0.95 |
| YT-8 | 73.78 | 16.75 | 8.94 | 0.53 |
| YT1-6 | 74.28 | 17.84 | 7.43 | 0.45 |
图5至图7是色-质联机分析的细菌作用后原油结构变化。结果表明用本发明方法筛选的菌种作用前原油的饱和烃是由正构烷烃组成，而作用后原油的结构由烷烃转化成酸、酮、酯、醇、醚等物质。其中图5在谱图时间17-20.86min时是菌种YT-5作用后的原油中生成了丁酸、醋酸、二甲基乙基酯、N-乙酸环氧-3丙基酸、1-二醇二羟基乙酸等产物；在图谱时间5-5.10min时是菌种YT-6作用后的原油中生成了十四醇、十六醇、十九醇、二十醇、联癸基氧化醚、氮杂环二甲基乙酸等产物；在图谱时间5-5.102min时是菌种YT-7作用后的原油中生成了4-羟基-4甲基-2戊酮等产物。这表明用本发明筛选的菌种在与原油作用的过程中能同化原油，使原油组分结构发生变化，并转化成有利于驱油的各种代谢产物。
表2是菌种对原油粘度影响的测定结果。用本发明方法筛选的菌种对原油具有一定的降粘作用，但复合菌的降粘效果明显优于单一菌株，它使原油的粘度也由作用前的28.1mPa·S下降至18.06mPa·S，下降了36％。
表2筛选菌种对原油粘度的影响
| 分析参数 | 空白对照 | YT-7 | YT-8 | YT-6 | YT1-8 |
| 粘度(mPa·s) | 28.1 | 24.88 | 23.96 | 22.91 | 18.06 |
表3是发酵液中油水界面张力变化结果。用本发明方法筛选的菌株YT1-6、YT-7、YT-8在以原油为碳源的发酵过程中，产生了活性物质，这些生化产物具有表面活性，能在油水界面上定向排列，降低油水界面张力。菌株YT-7、YT-8与原油的界面张力比空白样品的值低8mN/m，菌株YT-6与原油的界面张力是13.88mN/m，比空白值降低12mN/m，复合菌的界面张力是8.10mN/m，比空白值降低27.57mN/m。
表3细菌发酵液与原油的界面张力测定数据
| 分析参数 | 空白对照 | YT-7 | YT-8 | YT-6 | 复合菌 |
| 界面张力(mN/m) | 35.67 | 27.68 | 27.16 | 13.88 | 8.10 |
表4是发酵液中活性物有机酸含量的测定结果。用本发明方法筛选的菌种能分解利用石油中的烷烃组分，而产生脂肪酸，随着发酵时间的增长，有机酸含量也同时增加。经细菌发酵过的发酵液，pH值明显下降，一般可将发酵液的pH值由7降低到6～5.5。菌株YT1-6作用原油后的的发酵液中有机酸含量比YT-7和YT-8的有机酸含量高，特别是菌株YT-5培养的发酵液中的有机酸含量从原样的17.57mg/L增加到948.33mg/L。
表4细菌发酵液中有机酸测定数据
| 分析参数 | 空白对照 | YT-2 | YT-3 | YT-4 | YT-5 | YT-6 | YT-7 | YT-8 |
| PH值有机酸(mg/L) | 717.57 | 5.5785.2 | 6106.5 | 6.564.5 | 3948.3 | 5.5104.3 | 6.565.9 | 6.554.9 |
图8、图9是用本发明方法筛选的菌种在长管填充油砂模型中的驱油实验结果。下面分别给出用天然岩心和长管填充油砂来评价筛选菌株驱油效果的模型实验。
1.天然岩心驱油实验
①实验条件：
模型尺寸：长10cm，直径2.5cm；注菌液量：1PV；菌液中细菌密度：107个/ml；脱气原油，含油污水；岩心的孔隙度是23％～25％，渗透率1119～2938×10-3μm2。
②实验程序：
岩心抽空饱和地层水→饱和油→水驱至含水98％→注菌液→恒温45℃培养→水驱至含水98％结束。
③实验结果
使用天然岩心进行了三组微生物驱油物理模拟实验。
第一组模型实验是将菌液作为驱油剂，菌株YT-7、YT-8直接经摇床培养发酵，当细菌密度达到107个/mL时，将以上两种菌液按1∶1比例进行复配，直接进行岩心驱替，不进行封闭培养。
第二组模型实验将单菌种YT-7、YT-8分别配制成菌悬液，细菌密度是107个/mL，注入模型，然后关闭模型一周，使细菌在模型中发酵繁殖后进行水驱。
第三组模型实验是复合菌，将菌种YT1-6，按均等的比例复配，细菌的浓度达107个/mL，将配伍的菌悬浮液注入岩心，关闭模型一周，再后续水驱。实验结果表明复配的菌株得到了较好的驱油结果。
表5：微生物驱油天然岩心模型实验数据汇总表
| 编号 | 菌液配方 | 孔隙度(％) | 渗透率(×10-3μm2) | 含油饱和度(％) | 水驱采收率(％) | MEOR(OOIP)(％) |
| 1234 | YT1-6YT-7YT-8YT-7+YT-8 | 25.2024.9723.4624.48 | 1119293815742496 | 62.4576.7361.8279.35 | 54.239.357.146.1 | 11.410.68.65.4 |
2.长管填充油砂模型驱油实验
为了验证天然岩心微生物驱油物理模拟实验结果，又开展了长管填充油砂模型微生物驱油物理模拟实验。
①实验条件：
模型尺寸：长75cm，直径3.8cm；注菌液量：0.3～0.5PV；菌液中细菌密度：107个/mL；采油一厂脱气原油，含油污水。
②实验程序：
岩心抽空饱和地层水→饱和油→水驱含水98％→注菌液→恒温45℃培养→水驱含水98％结束。
③实验结果：
进行了四组微生物驱油物理模拟实验：
第一组是水驱空白对比实验，将模型饱和油后，水驱至含水达98％，关闭模型二周，然后再注水至与其它组注入量相同时结束，计量出油量。
第二组实验将菌株YT1-6、YT-7-YT-8分别配制成复合菌悬液，细菌密度为107个/mL，分别注入模型，关闭模型二周后水驱至注入量与对照试验相同。
第三组模型实验是配伍菌种的平行实验，是将YT1-6、YT-7、YT-8等8种菌株按等体积混合，细菌密度是107个/mL，进行两组平行试验，关闭模型二周，然后水驱。
第四组模型与第三组实验所用的配伍菌液相同，不同的是菌液放置一周后再注入模型。
岩心驱油实验结果表明，用本发明方法筛选的菌种在天然岩心中可提高采收率约5.4％～11.4％(OOIP)，在长管物理模型中可提高采收率约7.25％～12.1％(OOIP)。
表6：微生物驱油长管填充砂模型物理模拟实验数据
| 编号 | 菌液配方 | 孔隙度(％) | 渗透率(10-3μm2) | 含油饱和度(％) | 水驱采收率(％) | MEOR(OOIP)(％) |
| 12345678 | YT1-6 0.5PVYT-7+YT-80.5PV配伍菌0.5PV配伍菌0.5PV配伍菌0.5PV配伍菌0.3PV配伍菌0.3PV配伍菌0.3PV | 37.6437.8838.8236.9336.4638.0537.2837.05 | 880890876880886866860855 | 73.7569.4772.7275.2574.9765.6070.0173.40 | 47.750.247.948.149.360.960.852.9 | 10.412.17.2510.510.17.88.98.2 |
菌种扩大发酵实验
根据本发明方法筛选的菌种生长特点，其生长周期一般是在24～72小时，菌数都能达到设计要求的107-8个/ml。培养基是无机盐与油层中采出的脱水原油。为达到预期的发酵结果，将菌种YT1-6、YT7、YT8分开发酵，发酵时检验菌种的生长情况，镜检菌态，计活菌数，同时分析菌种生长过程中各项生化指标，如产酸，PH值和活性物含量等。
用本发明方法筛选的菌种可用于油田增产增注试验和微生物提高采收率的现场试验，如单井吞吐、油井清防蜡、解堵以及微生物驱油和调剖等。
Claims (6)
1、一种微生物驱油菌种的筛选分离方法，包括以下步骤：
(1)样品采集：用无菌取样瓶采集油田生产井中的油水混合液或回注的污水样，放入恒温箱中待用；
(2)增菌培养：在厌氧条件下将样品接种于无机盐培养基中培养，同时做一不加菌的空白对照，选择菌数比增加者进行继续培养；
(3)菌种纯化：将增菌的培养液用接种针沾少许，在以原油为唯一碳源的选择性固体培养基上划线，放入厌氧工作站或干燥器中培养，挑取不同形态的单菌落在牛肉膏固体培养基上划线纯化，将纯化菌落接至以原油为唯一碳源的液体培养基内进行厌氧培养，将纯化的菌落移接斜面培养基中；
(4)分离筛选：在厌氧瓶中装入复配的培养基及原油，经高温灭菌后接种培养，选择可以乳化原油的菌种作平行实验，进一步选择平行实验中原油均乳化的菌种；
(5)对分离筛选的菌种进行性能检测。
2、根据权利要求1所述的微生物驱油菌种的筛选分离方法，其特征在于，其中步骤(1)所述的恒温条件为：35-45℃的恒温箱中恒温0.5-1.5小时。
3、根据权利要求1所述的微生物驱油菌种的筛选分离方法，其特征在于，其中步骤(2)所述的培养条件为：摇床温度35-60℃，转速100-150rpm，培养时间7-15天。
4、根据权利要求1所述的微生物驱油菌种的筛选健康方法，其特征在于，其中步骤(3)所述的放入厌氧工作站或干燥器中培养时间为3-5天。
5、根据权利要求1所述的微生物驱油菌种的筛选分离方式，其特征在于，其中步骤(4)所述的原油加入量为培养基体积比的4％，培养条件为：摇床温度35-60℃，转速100-150rpm，培养时间7-15天。
6、根据权利要求1所述的微生物驱油菌种的筛选分离方式，其特征在于，其中性能检测是进行下面各项指标的检测：
①菌种的耐温性实验；
②菌种对原油组分的作用；
③菌种对原油粘度的影响；
④发酵液中活性物有机酸的含量；
⑤发酵液油水界面张力的变化；
⑥营养物对菌种生长的影响；
⑦菌种的驱油效果评价；
⑧菌种的扩大发酵实验。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |