CN111337443A - 一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法 - Google Patents

Abstract

一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，包括以下步骤；(1)预处理及色素测定方法：将培养中的藻液离心后，冷冻干燥后备用。精确称取藻粉分别置于管①和管②，在管①中加乙醇，水浴后离心，取上清液用以测定色素含量，剩余藻沉淀用于下一步测定。管①和管②中分别加入乙醇，水浴后离心脱色，倒掉上清液，重复上述步骤，保留管①和管②底部藻沉淀；(2)破碎方法：取步骤(1)获得的藻沉淀，管①采用碱性加热法、管②采用超声破碎法，破碎完成后，离心，用于下一步测定；(3)测定方法：取管①中的上清液，测定多糖，蛋白质；取管②中的上清液测定脂质，离心去上清，剩余样品用于淀粉含量测定。本发明具有简单、高效、低成本的特点。

Description

一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法

技术领域

本发明涉及藻类分析研究技术领域，特别涉及一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法。

背景技术

微藻是广泛存在于地球生态系统中的微生物，他们可以吸收二氧化碳利用光能来进行细胞增殖，通过能量转换和物质平衡，产生叶绿素、蛋白质，脂质，多糖和淀粉等。首先，我们通过研究发现，随着外界环境变化以及营养供给的不同，藻类的细胞生物质组成也会发生明显的变化，从而进一步促进水体富营养化的研究。其次，近年来关于微藻处理高浓度有机生活污水和工业废水的案例也日渐成熟，处理末期的藻类回收利用，并作为可持续绿色能源—生物柴油得到了广泛的关注。最后，藻类的养殖和利用得到了较大的发展，人们开始试图通过人工培养微藻来提取高价值生物衍生物。因此，发明一种简单、高效的测定藻类细胞生物质组成的方法十分必要。

冷冻干燥法是目前常见的微藻样品处理方法，用于微藻干生物质的制备。可以最大限度的保存各种生物质组分，使样品损失降到最低。冷冻干燥法具有以下特点：(1)可保持样品中的各级营养成分和物质组成，对蛋白质的保存效果较好。(2)在真空和低温下操作，生物的生长和酶作用会受到抑制。(3)脱水较为彻底，干制品重量轻，体积小。(4)真空操作时氧气稀缺，因此一些可氧化物质(如脂质等)受到保护。

微藻一般为单细胞球形藻体，细胞壁较为坚韧，通常需采用预处理方式进行破碎，提取代谢产物。目前，常见的藻细胞破碎处理方法有物理破碎法、化学破碎法和溶剂提取法，本方法预实验中采用的超声破碎法属于物理破碎法，碱性破碎法属于化学破碎法，有机溶剂溶解法属于溶剂提取法。超声破碎法可以利用空化现象引起的冲击波和剪切力破碎细胞中细胞壁等结构，使得细胞中各组分游离在溶剂中；碱性破碎法是利用碱性作用使细胞失活，从而使内部成分溶解于溶剂中；而有机溶剂溶解法是利用扩散、润湿浸透等作用将细胞内各组分浸提出来。根据以上不同原理，三种破碎方法对细胞内成分提取有不同的效果，希望探究一种简便、易行、高效地将微藻细胞中有效成分提取出来的方法。

目前，用于指示藻类生长的指标过于单一，多数集中在生长过程中藻细胞数量，色素含量以及胞外产酶等的测定。对于制备藻粉生物质中的油脂，多糖，蛋白质和淀粉这类评估微藻生长的重要指标关注甚少。同时，关于藻类提取物组分定量分析的研究都并不完善，现有的传统方法多以单独测定某一种指标为主，提取效率较低，既不全面，也不综合。因此，浓缩并回收微藻细胞，制备藻类生物质，简便且高效测定其组成十分重要。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，具有简单、高效、低成本的特点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，包括以下步骤；

(1)预处理及色素测定方法：

将培养中的藻液离心后收获，冷冻干燥后备用，精确称取藻粉分别置于管①和管②，在管①中加乙醇，水浴后离心，取上清液用以测定色素含量，剩余藻沉淀用于下一步测定，管①和管②中分别加入乙醇，水浴后离心脱色，倒掉上清液，重复上述步骤，保留管①和管②底部藻沉淀；

(2)破碎方法：

取步骤(1)获得的藻沉淀，管①采用碱性加热法、管②采用超声破碎法，破碎完成后，用于下一步测定；

(3)测定方法：

取管①中的上清液，测定多糖，测定蛋白质；取管②中的上清液测定脂质，离心，倒上清，剩余样品用于淀粉含量测定。

所述的步骤(1)中，所述藻粉为(但不限于)普通小球藻、水华鱼腥藻和铜绿微囊藻，可取在不同生长条件下，处于各生长时期的微藻藻液，离心收集藻沉淀，真空冷冻干燥制成。

所述的步骤(1)中，称取藻粉以锡舟为载体在精密天平进行，并记录具体数值。

所述的步骤(1)中，分别称取①：1-20mg和②：1-20mg藻粉(精确计重，优选10mg以内)，在管①中按照藻粉质量(mg)：95％无水乙醇体积(mL)＝1：2-1：5的比例，在75℃下水浴5-10min，取出后4000-8000r·min^-1下离心10-15min，取上清液用以测定色素含量，在管①和管②中分别加入藻粉质量(mg)：乙醇体积(mL)＝1：2-1：5的75％-95％的乙醇，65℃下水浴1-3h，取出后，重复离心步骤，用于藻粉脱色的乙醇浓度优选80％的无水乙醇进行。

所述的步骤(2)中碱性加热法具体步骤如下：往预处理完之后的管①藻沉淀中加入藻粉质量(mg)：溶液体积(mL)＝1：1的2M NaOH溶液，沸水浴10-15min分钟，取出冷却至室温，用2M HCl溶液调pH至7.1左右，4000-8000r·min^-1下离心10-15min。

所述的步骤(2)中超声破碎法具体步骤如下：往预处理完之后的管②藻沉淀中加入5-10mL的超纯水，在冰水浴的环境中用细胞破碎仪破碎，具体参数为破碎15-20min，功率180w，工作2s停2s，4000-8000r·min^-1下离心10-15min。

所述的步骤(3)取管①中的上清液，0.5mL测定多糖，1mL测定蛋白质；取管②中的上清液1mL测定脂质，4000-8000r·min^-1下离心10-15min，倒上清，剩余样品用于淀粉含量测定。

所述步骤(3)中测定多糖采用蒽酮比色法，具体步骤如下：取0.5mL管①上清液，在冰水浴环境中，加入2.5mL蒽酮溶液，摇匀后将比色管置于沸水浴中10-15min，取出于冰水浴中冷却，在紫外分光光度计下测定625nm波长处的吸光度。

所述的步骤(3)中测定蛋白质采用考马斯蓝比色法，具体步骤如下：取1mL管①上清液，加入5mL考马斯蓝溶液，混合摇匀后静置计时5min，在紫外分光光度计下测定595nm波长处的吸光度。

所述的步骤(3)中测定脂质采用尼罗红显色法，具体步骤如下：取1mL管②上清液，加入2mL超纯水，加入0.333mL浓度为100μg·mL^-1的尼罗红试剂，放入暗室，15分钟后利用荧光分光光度计测定在二维模式下激发波长为480nm发射波长区间为500nm～700nm之间的荧光值的峰值(其余参数：扫描速度为2400nm·min^-1，电压500V，激发发射波长间隔为5nm)。

所述的步骤(3)中测定淀粉方法具体步骤如下：取管②中去上清液后的藻沉淀，利用Megazyme试剂盒测定淀粉含量。

所述的步骤(3)中用紫外分光光度计测蛋白质时用玻璃比色皿，用荧光分光光度计测脂质时用四面透光的石英比色皿，而其余用紫外分光光度计的方法均用双面石英比色皿。

所有方法中加入液体都要沿着内壁缓慢加入，并摇匀完全溶解；而倒出上清液时要保持藻沉淀朝着手心，操作快速并防止晃动。

通过一系列预处理和破碎方法后，测定多糖，蛋白，脂质的取样体积，以及加入蒽酮，考马斯蓝和尼罗红溶液的体积与制作标准曲线的参数设计相关，可适当等比例放大或缩小。

本发明的有益效果：

微藻干生物质的制备过程采用可靠的方法，不会对其有效成分进行破坏；采用有效乙醇脱色方法，对藻类色素进行去除，减少对后续测样的干扰；根据不同组分的特征，选用不同的破壁提取方法，保证提取充分，效果显著。

附图说明

图1为简便、高效测定微藻生物质组成的实验流程图。

图2为简便、高效测定微藻生物质组成的工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步详细说明。

实施例：

1.样品制备：(如图1图2所示)

选择实验室培养的三种微藻：普通小球藻，水华鱼腥藻和铜绿微囊藻(均购自中科院武汉生物研究所)，经离心后，沉淀经超纯水冲洗3次后倒掉上清液，在-20℃冰箱中过夜保存，经真空冷冻干燥后制成藻粉。

2.样品预处理：

取冻干后的藻粉，以锡舟为载体用精密天平称取：实施例①：2mg左右；实施例②：10mg左右，记录数值用于计算，倒入10mL离心管底部，沿内壁缓慢加入5mL的95％乙醇，注意将粘在管壁上的藻粉冲洗掉。75℃恒温水浴5min，取出后离心，取上清液用以测定叶绿素。沿内壁往剩余藻沉淀中缓慢加入5mL的80％乙醇溶液，65℃下水浴3h，取出后离心，倒掉上清液，沿内壁缓慢加入5mL的80％乙醇溶液，在65℃下水浴3h，继续离心倒掉上清液，取底部藻沉淀作为实验对象。分别取三种藻种作为处理对象，每种方法设置3组平行样，采取3种破碎方法，所以共取27组样品(实施例②同样为27组样品)。

3.样品破碎：

(1)碱性加热法：

取预处理后含有藻沉淀的9组样品，分别加入2mL，2mol·L^-1的NaOH溶液，摇匀使其溶解完全，沸水浴10分钟(注意：因高温高压导致盖子弹开应及时压紧，避免沸水飞溅进入离心管影响实验结果)，取出后冷却至室温，在每组中加2mol·L^-1的HCl溶液中和至pH约为7.1，摇匀后离心，用移液枪吸取上清液待测。

(2)超声破碎法：

取预处理后含有藻沉淀的9组样品，加入5mL的超纯水，摇匀使藻沉淀完全溶解，将离心管置于超声破碎仪中冰浴破碎，直至破碎完全。待破碎完成后离心，用移液枪吸取上清液待测。

(3)有机溶剂溶解法：

取预处理后含有藻沉淀的9组样品，加入5mL体积比为2:1的氯仿-甲醇混合液(注意：操作迅速，因该有机溶剂易挥发且有剧毒)，超声1h后取出，放入通风橱中进行环绕式氮吹，观察液面下降速度，及时调整氮吹高度，直至吹干。加入5mL超纯水并离心，用移液枪吸取上清液待测。

(注意：上述方法中离心方法均按：6000r·min^-1，10min)

4.标准曲线制作：

(1)蛋白质标线：

称取50mg考马斯亮蓝G250，溶于25mL的90％乙醇中，加入85％的磷酸50mL，最后用超纯水定容至500mL，过滤后即为考马斯蓝溶液。按表一配制标准牛血清蛋白溶液和超纯水混合溶液，并向各管中加入5mL考马斯蓝溶液，混合后静置计时5min。以0号试管为空白对照，在595nm波长处测定各组吸光度。绘制标准曲线，求得线性回归方程。

表1考马斯蓝比色法标准曲线的制作

(2)多糖标线：

称取400mg蒽酮于烧杯中，加入10mL的无水乙醇，用75％浓硫酸定容至200mL得到蒽酮溶液。按表二配制标准葡萄糖溶液和超纯水混合溶液，混匀后，在冰水浴中加入2.5mL蒽酮溶液，摇匀后沸水浴10min，取出后冰水浴冷却。以0号试管为空白对照，在625nm波长处测定吸光度。绘制标准曲线，求得线性回归方程。

表2蒽酮比色法标准曲线的制作

(2)脂质标线：

称取10mg尼罗红，用丙酮定容至100mL，配成尼罗红试剂。按表三配制标准三油酸甘油酯溶液和超纯水混合溶液，混匀后，置于暗室中加入0.333mL的尼罗红试剂，15min后利用荧光分光光度计测样。绘制标准曲线，求得线性回归方程。

表3尼罗红显色法标准曲线的制作

5.样品测定：

(1)测定样品中色素含量：

取离心后倒出来的95％乙醇上清液5mL，在紫外分光光度计下测定664nm、649nm、470nm波长处的吸光度。

(2)测定样品中蛋白质含量：

取1mL样品上清液于10mL比色管中，测定方法同蛋白质标线。

(3)测定样品中多糖含量：

取0.5mL样品上清液于10mL比色管中，测定方法同多糖标线。

(4)测定样品中脂质含量：

取1mL样品上清液于5mL离心管中，测定方法同脂质标线。

(5)测定样品中淀粉含量：

取预处理后的藻沉淀，按照Megazyme试剂盒的说明书进行淀粉含量测定(也可以用其他方法代替)。

6.各生物质相对含量计算

叶绿素含量通过以下公式计算：

C_a＝13.36OD₆₆₄－5.91OD₆₄₉

C_b＝27.43OD₆₄₉－8.12OD₆₆₄

C_x+c＝(1000OD₄₇₀－2.13C_a－97.64C_b)/209

蛋白质、多糖、脂质和淀粉根据其标线所在浓度范围内的标准方程求其含量。再将计算出来的各组分含量除以之前称重藻粉的质量，即为各组分相对含量。

7.具体结果：

实例①中三种破碎方法的蛋白质、多糖、脂质占比分别见表4、5、6。

表4实例①不同破碎方法测定的微藻蛋白质组分含量

表5实例①不同破碎方法测定的微藻多糖组分含量

表6实例①不同破碎方法测定的微藻脂质组分含量

实例②三种破碎方法的蛋白质、多糖、脂质占比分别见表7、8、9。

表7实例②不同破碎方法测定的微藻蛋白质组分含量

表8实例②不同破碎方法测定的微藻多糖组分含量

表9实例②不同破碎方法测定的微藻脂质组分含量

(注：以上表格中数值均为百分数)

综合上述实验结果，得出结论：碱性加热法对藻类中蛋白质和多糖的提取效率最高，超声破碎法对藻类中脂质的提取效率最高。所以本专利采用乙醇提取法测定色素含量，通过热乙醇脱色后，一部分样品经碱性加热法测定蛋白质和多糖的含量，另一部分通过低温超声破碎法进行脂质和淀粉的测定。

本发明采用冷冻干燥法对微藻样品进行预处理，浓缩制成藻粉。随后通过乙醇提取法测定色素含量。通过热乙醇脱色进一步去除所有色素后，一部分样品经碱性加热法处理后测定蛋白质和多糖的含量，另一部分则通过低温超声破碎法进行脂质和淀粉的测定。

使用紫外分光光度法测定色素含量，考马斯蓝比色法测定蛋白质含量，蒽酮比色法测定多糖含量，尼罗红显色法测定脂质含量，最后采用Megazyme试剂盒所述方法测定淀粉含量。

本发明选择普通小球藻、水华鱼腥藻和铜绿微囊藻作为目标藻种。微藻生物质中各组分相对含量是评估其生长特性的重要指标。本发明分析对比了碱性加热法、超声破碎法、有机溶剂溶解法这三种破碎方法对目标藻种叶绿素、蛋白质、多糖、脂质和淀粉的提取率，找出了一套能达到各组分最高提取率的综合方法。本发明专利的优点主要体现在：(1)需样量少，最少仅需几mg微藻样品即可测定所需全部指标；(2)操作简便，成本低廉，耗时较短；(3)对微藻各生物质组分提取充分，更为综合、全面地分析生物质组成。

表10为本专利方法采用实例①中测定的三种微藻生物质组分含量(％)。

表11为本专利方法采用实例②中测定的三种微藻生物质组分含量(％)。

表10实例①中三种微藻的生物质组成含量

表11实例②中三种微藻的生物质组成含量

以上所述实例仅表达了本发明的两种实施方式，其描述较为具体和详细，但不能因此理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于熟悉本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以将实验步骤中的部分数值按等比例扩大或缩小(如在不影响实验结果的条件下，保持浓度等一定)，也可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，包括以下步骤；

(1)预处理及色素测定方法：

将培养中的藻液离心后收获，冷冻干燥后备用，精确称取藻粉分别置于管①和管②，在管①中加乙醇，水浴后离心，取上清液用以测定色素含量，剩余藻沉淀用于下一步测定。管①和管②中分别加入乙醇，水浴后离心脱色，倒掉上清液，重复上述步骤，保留管①和管②底部藻沉淀；

(2)破碎方法：

取步骤(1)获得的藻沉淀，管①采用碱性加热法、管②采用超声破碎法，破碎完成后，用于下一步测定；

(3)测定方法：

取管①中的上清液，测定多糖，测定蛋白质；取管②中的上清液测定脂质，离心，倒上清，剩余样品用于淀粉含量的测定。

2.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，藻粉为(但不限于)普通小球藻、水华鱼腥藻和铜绿微囊藻，选取在不同生长条件下，处于各生长时期的微藻藻液，离心收集藻沉淀，真空冷冻干燥制成。

3.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，分别称取①：1-20mg和②：1-20mg藻粉，在管①中按照藻粉质量(mg)：95％无水乙醇体积(mL)＝1：2-1：5的比例，在75℃下水浴5-10min，取出后4000-8000r·min^-1下离心10-15min，取上清液用以测定色素含量，在管①和管②中分别加入藻粉质量(mg)：乙醇体积(mL)＝1：2-1：5的75％-95％的乙醇，65℃下水浴1-3h，取出后，重复离心步骤，用于藻粉脱色的乙醇浓度优选80％的无水乙醇进行。

4.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中碱性加热法具体步骤如下：往预处理完之后的管①藻沉淀中加入藻粉质量(mg)：溶液体积(mL)＝1：1的2M NaOH溶液，，沸水浴10-15min分钟，取出冷却至室温，用2MHCl溶液调pH至7.1，4000-8000r·min^-1下离心10-15min。

5.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中超声破碎法具体步骤如下：往预处理完之后的管②藻沉淀中加入5-10mL的超纯水，在冰水浴的环境中用细胞破碎仪破碎，具体参数为破碎15-20min，功率180w，工作2s停2s，4000-8000r·min^-1下离心10-15min。

6.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，所述的步骤(3)取管①中的上清液，0.5mL测定多糖，1mL测定蛋白质；取管②中的上清液1mL测定脂质，4000-8000r·min^-1下离心10-15min，倒上清，剩余样品用于淀粉含量测定。

7.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定藻类生物质组成的方法，其特征在于：步骤(3)中测定多糖采用蒽酮比色法，具体步骤如下：取0.5mL管①上清液，在冰水浴环境中，加入2.5mL蒽酮溶液，摇匀后将比色管置于沸水浴中10-15min，取出于冰水浴中冷却，在紫外分光光度计下测定625nm波长处的吸光度。

8.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中测定蛋白质采用考马斯蓝比色法，具体步骤如下：取1mL管①上清液，加入5mL考马斯蓝溶液，混合摇匀后静置计时5min，在紫外分光光度计下测定595nm波长处的吸光度。

9.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中测定脂质采用尼罗红显色法，具体步骤如下：取1mL管②上清液，加入2mL超纯水，加入0.333mL浓度为100μg·mL^-1的尼罗红试剂，放入暗室，15分钟后利用荧光分光光度计测定在二维模式下激发波长为480nm发射波长区间为500nm～700nm之间的荧光值的峰值(其余参数：扫描速度为2400nm·min^-1，电压500V，激发发射波长间隔为5nm)。

10.根据权利要求1所述的一套简便、高效测定微藻生物质组成的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中测定淀粉方法具体步骤如下：取管②中去上清液后的藻沉淀，利用Megazyme试剂盒测定淀粉含量；

所述的步骤(3)中用紫外分光光度计测蛋白质时用玻璃比色皿，用荧光分光光度计测脂质时用四面透光的石英比色皿，而其余用紫外分光光度计的方法均用双面石英比色皿；

所有方法中加入液体都要沿着内壁缓慢加入，并摇匀完全溶解；而倒出上清液时要保持藻沉淀朝着手心，操作快速并防止晃动。

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