CN111297741A

CN111297741A - 一种松花粉发酵提取液的制备及应用

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Publication number: CN111297741A
Application number: CN201911338444.5A
Authority: CN
Inventors: 王冬冬; 王钰涵; 王昌涛; 程小雪; 李萌; 贾冉宇; 赵丹
Original assignee: Kemufei Beijing International Cosmetics Co Ltd; Beijing Technology and Business University
Current assignee: Kemufei Beijing International Cosmetics Co Ltd; Beijing Technology and Business University
Priority date: 2019-12-23
Filing date: 2019-12-23
Publication date: 2020-06-19
Anticipated expiration: 2039-12-23
Also published as: CN111297741B

Abstract

本发明公开了一种松花粉发酵提取液的制备方法，其包括将松花粉与去离子水混合后灭菌，得到松花粉发酵培养基，将扩培好的黄酒酵母菌液接种到所述松花粉发酵培养基中，依次进行有氧发酵和无氧发酵，发酵完成后进行离心分离和灭菌。该方法利用发酵工程技术利用黄酒酵母发酵法从松花粉中提取活性物质，操作简单，且由于不添加任何化学添加剂，制备得到的松花粉发酵提取液可直接作为化妆品使用，具有很高的安全性和细胞修复能力。

Description

一种松花粉发酵提取液的制备及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种松花粉发酵提取液的制备及应用。

背景技术

松花粉为松科植物马尾松、油松或同属数种植物的干燥花粉。松花粉中含有大量的营养成分和生物活性物质,其中包括蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质、核酸以及卵磷脂等百余种成分。松花粉是药食兼用的纯天然材料,可以延缓衰老、抵抗疲劳、降低血脂、增强人体的免疫力,有较高的开发利用价值。

酵母菌在自然界中分布很广，尤其喜欢在偏酸性且含糖较多的环境中生长。例如，其在水果、蔬菜、花蜜的表面和果园土壤中最为常见。酵母菌在酿造、食品、医药等工业中占有重要的地位。早在4000多年前的殷商时代，中国就用酵母菌酿酒。酵母菌的维生素、蛋白质含量高，可作食用、药用和饲料用，又是提取核苷酸、辅酶A、细胞色素C、谷胱甘肽、三磷酸腺苷等多种生化产品的原料，还可用于生产维生素、氨基酸、有机酸等。

黄酒酵母是酵母菌大家族中的一员，是重要的发酵素，能分解碳水化合物产生酒精和二氧化碳等。黄酒酵母是从黄酒发酵醪中分离出来的，黄酒的主要酿造微生物是霉菌和酵母，而发酵的关键是酵母的选择。

本发明利用黄酒酵母对松花粉进行发酵，获得松花粉发酵提取液。通过黄酒酵母对松花粉的发酵，所得松花粉发酵提取液具有优异的抗氧化作用和细胞修复作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有细胞修复作用的松花粉发酵提取液的制备及应用，该方法通过发酵工程技术利用黄酒酵母发酵法从松花粉中提取活性物质，操作简单，且由于不添加任何化学添加剂，制备得到的松花粉发酵提取液可直接作为化妆品使用，具有很高的安全性、抗氧化能力和细胞修复能力。

根据本发明的第一方面，提供了一种松花粉发酵提取液的制备方法，其包括将松花粉与去离子水混合后灭菌，得到松花粉发酵培养基，将扩培好的黄酒酵母菌液接种到松花粉发酵培养基中，依次进行有氧发酵和无氧发酵，发酵完成后进行离心分离和灭菌。

根据本发明的第二方面，提供了一种由上述制备方法制备得到的松花粉发酵提取液。

根据本发明的第三方面，提供了上述松花粉发酵提取液在制备用于抗衰老的化妆品中的应用。

根据本发明的第四方面，提供了上述松花粉发酵提取液在直接作为用于抗衰老的化妆品中的应用。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的松花粉发酵提取液的制备方法采用发酵工程技术，通过选择合适发酵条件，利用黄酒酵母发酵法提取得到活性物质。一方面可最大程度保留松花粉中的活性成分，避免了传统提取方法中有机溶剂的引入，具有优越的环境友好性。另一方面，在发酵法提取活性物质的过程中不需要添加其他辅助物质，不仅节约生产成本，而且最大化地简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现大量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。

(2)本发明提供的松花粉发酵提取液具有优越的安全性，可以直接作为面膜液或精华液或爽肤水的成品化妆品使用，比现有市面上的其他产品更加简单安全，不会给肌肤造成任何副作用。

(3)本发明提供的松花粉发酵提取液中含有黄酮、蛋白、多酚、多糖等活性物质，具有较强的抗氧化能力,可修复紫外线照射对细胞造成的一系列损伤，具有较强的细胞损伤修复作用。

附图说明

下文将仅以举例的方式并参照附图描述本发明的实施方案，其中：

图1示出根据本发明一实施方案制备的松花粉发酵提取液对成纤维细胞增殖率的影响。

图2示出根据本发明一实施方案制备的松花粉发酵提取液对紫外照射下成纤维细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响。

图3示出根据本发明一实施方案制备的松花粉发酵提取液对紫外照射下成纤维细胞脂质氧化(MDA)的影响。

具体实施方式

在以下的说明中，包括某些具体的细节以对各个公开的实施方案提供全面的理解。然而，相关领域的技术人员会认识到，不采用一个或多个这些具体的细节，而采用其它方法、部件、材料等的情况下可实现实施方案。

根据本发明的第一方面，提供了一种松花粉发酵提取液的制备方法，其包括将松花粉与去离子水混合后灭菌，得到松花粉发酵培养基，将扩培好的黄酒酵母菌液接种到所述松花粉发酵培养基中，依次进行有氧发酵和无氧发酵，发酵完成后进行离心分离和灭菌。

在某些具体的实施方案中，松花粉与去离子水的混合重量比为1:10～1:60。在某些优选的实施方案中，松花粉与去离子水的混合重量比为1:20～1:40。在某些更优选的实施方案中，松花粉与去离子水的混合重量比为1:30。

在某些具体的实施方案中，黄酒酵母为黄酒酵母21392。

在某些具体的实施方案中，黄酒酵母菌液的浓度为10⁵～10⁹CFU/mL。在某些优选的实施方案中，黄酒酵母菌液的浓度为10⁶～10⁸CFU/mL。在某些更优选的实施方案中，黄酒酵母菌液的浓度为10⁷CFU/mL。

在某些具体的实施方案中，黄酒酵母菌液与松花粉发酵培养基的体积重量比(mL:g)为1:5～1:50。在某些优选的实施方案中，黄酒酵母菌液与松花粉发酵培养基的体积重量比(mL:g)为1:10～1:30。在某些更优选的实施方案中，黄酒酵母菌液与松花粉发酵培养基的体积重量比(mL:g)为1:20。

在某些具体的实施方案中，有氧发酵温度为20～40℃，恒温振荡箱转速为100～260r/min，发酵时间为4-24h。在某些优选的实施方案中，有氧发酵温度为25～35℃，恒温振荡箱转速为150～210r/min，发酵时间为8-16h。在某些更优选的实施方案中，有氧发酵温度为30℃，恒温振荡箱转速为180r/min，发酵时间为12h。

在某些具体的实施方案中，无氧发酵通过在恒温培养箱中静置培养来进行，温度为15～35℃，发酵时间为24-72h。在某些优选的实施方案中，无氧发酵的温度为20～30℃，发酵时间为36-60h。在某些更优选的实施方案中，无氧发酵的温度为25℃，发酵时间为48h。

在某些具体的实施方案中，离心分离条件为转速3000～8000r/min，离心时间为5～35min，离心半径为5～15cm。在某些优选的实施方案中，离心分离条件为转速4000～6000r/min，离心时间为15～25min，离心半径为7～11cm。在某些更优选的实施方案中，离心分离条件为转速5000r/min，离心时间为20min，离心半径为9cm。

在某些具体的实施方案中，灭菌的条件为温度100～130℃，灭菌时间为15～40min。在某些优选的实施方案中，灭菌的条件为温度110～121℃，灭菌时间为25～35min。在某些更优选的实施方案中，灭菌的条件为温度115℃，灭菌时间为30min。

在某些具体的实施方案中，化妆品包括但不限于：面膜、精华液或爽肤水。

下文中，本发明将通过如下实施例进行详细解释以便更好地理解本发明的各个方面及其优点。然而，应当理解，以下的实施例是非限制性的而且仅用于说明本发明的某些实施方案。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的黄酒酵母扩培培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为马铃薯提取液，溶质为葡萄糖并且在溶剂中的浓度为20g/L。

下述实施例中的黄酒酵母21392从中国食品酿造研究所购买得到。

实施例1、黄酒酵母菌液的扩培

挑取黄酒酵母21392菌落接种到200mL黄酒酵母扩培培养基中，于25℃振荡培养箱中180r/min培养48h，获得黄酒酵母菌液。

实施例2、松花粉发酵培养基的制备

将10g松花粉加入到300g去离子水中，115℃灭菌30min后取出，静置温度低于30℃后即为松花粉发酵培养基。

实施例3、松花粉发酵提取液的制备

按照如下步骤制备松花粉发酵提取液：

(1)将15mL浓度为10⁷CFU/mL的黄酒酵母21392菌液接种到300g松花粉发酵培养基中；

(2)将上述发酵体系在温度为30℃、转速为180r/min的恒温振荡箱中培养12h；有氧发酵结束后，在温度为25℃的恒温培养箱静置培养48h进行无氧发酵，得到松花粉发酵液；

(3)将步骤(2)中得到的松花粉发酵液进行离心，离心转速为5000r/min，离心时间为20min，离心半径为9cm；

(4)将步骤(3)中得到的离心上清液进行灭菌，温度为115℃，灭菌时间为30min，静置至室温后即为松花粉发酵提取液。

实施例4、松花粉发酵提取液的表征

对实施例3制备所得的松花粉发酵提取液进行理化性质分析。其外观为粘稠液体、颜色为淡黄色至棕黄色。pH值4.5-7.0，粘度100-800cP，可溶性固含物含量1.0-5.7％，菌落总数小于50CFU/mL，无致病菌检出。根据化妆品卫生标准GB7916-87，化妆品细菌总数不能高于1000CFU/ml，因此该松花粉发酵提取液符合化妆品质量要求。

对该松花粉发酵提取液进行成分分析，蛋白质检测方法参照GB5009.5-2010，粗多糖检测方法参照GB/T 5009.8-2008，黄酮检测方法参照GB/T 5009.124-2003，总酚检测方法参照GB/T 8313-2008。所得结果如下：

实施例3制得的松花粉发酵提取液含蛋白质1.98g/kg、粗多糖6.93g/kg、总黄酮1.04g/kg(以芦丁计)、总酚13.6g/kg。

实施例5、松花粉发酵提取液的安全性检测

人体斑贴试验主要是用于检测化妆品终产品或原料的刺激性。本发明对实施例3中获得的松花粉发酵提取液进行人体封闭式斑贴试验，旨在对其潜在皮肤刺激性进行评估。

1、试验对象

选择合适的志愿者30人，年龄范围在18-60岁随机选择。

2、试验方法

称取0.020g-0.025g固体样品或半固体样品放入斑试器中备用。将液体样品0.2mL到0.025mL滴加在滤纸片上，再将滤纸片置于斑试器内。每个样品均设置空白对照，在对照斑试器孔内加入与样品等量的蒸馏水。

试验部位选为人体背部，利用无刺激性的胶带将斑试器固定贴敷于受试者背部。测试周期持续24h。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则在斑贴试验后24h和48h分别再观察一次。

3、试验结果

斑贴试验结果如表1所示，表1中各符号表示的含义如下：

"-"＝阴性反应；

"±"＝可疑反应：仅有微弱红斑；

"+"＝弱阳性反应(红斑反应)：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；

"++"＝强阳性反应(疱疹反应)；红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹；反应可超出受试区；

"+++"＝极强阳性反应(融合性疱疹反应)；明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹；反应超出受试区。

表1、实施例3获得的松花粉发酵提取液的斑贴试验结果

从表1可以看出，实施例3得到的松花粉发酵提取液未产生可疑反应，说明本发明提供的松花粉发酵提取液具有很高的安全性，不会给人体带来不良反应。

实施例6、松花粉发酵提取液的抗氧化作用和细胞修复作用检测

1、检测方法

1.1成纤维细胞增殖试验(MTT)

试剂：DMEM培养基(Life Technologies Corporation)、胰酶(碧云天)、PBS、MTT(Merck Millipore)、DMSO(Biotopped)。

仪器与设备：细胞培养箱(上海一恒)、6孔板(康宁)、96孔板(康宁)、UV紫外灯箱(SPECTRONICS)、冷冻高速离心机(TGL-16，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、荧光酶标仪(infinite M200 PRO TECAN)、制冰机(AF 103 Scotsman)。

松花粉发酵提取液样品稀释：用DMEM配制体积分数为40％、20％、10％、5％、2.5％、0％的样品。

将对数生长期状态良好的成纤维细胞接种于96孔培养板中，37℃，5％CO₂环境中培养过夜。吸弃培养液，加入不同浓度样品，每个样品做五个平行，细胞对照组未做处理，培养24小时。加入100uL MTT(1mg/ml)溶液，放入37℃、5％CO₂环境中培养，4小时后终止培养；弃液后加入150uL DMSO，缓慢振荡10min后于490nm波长测定各孔吸光度值。细胞活率＝(测定孔OD值-空白对照OD值)/(细胞对照组OD值-空白对照OD值)*100％。

1.2细胞裂解液上清液制备

仪器与设备：细胞培养箱(上海一恒)、6孔板(康宁)、96孔板(康宁)、UV紫外灯箱(SPECTRONICS)、冷冻高速离心机(TGL-16，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)、荧光酶标仪(infinite M200 PRO TECAN)、制冰机(AF 103Scotsman)、细胞刮刀(康宁)。

取对数生长期状态良好的成纤维细胞计数并接种于6孔培养板中，控制每孔细胞数5x10⁵个细胞。在37℃、5％CO₂环境下培养过夜，弃培养基，加入少量的PBS(pH＝7.4)以刚好覆盖细胞为宜，随后以UVA刺激细胞，UV辐射量为12J/cm²，空白组不照射。吸弃PBS，加入松花粉发酵提取液作用细胞24小时(模型组以及空白对照组加入无血清DMEM培养液，阳性对照组-VC浓度为0.1mg/mL)。取出，置于冰上，PBS洗涤2次；以细胞刮刀刮下细胞，收集至离心管中，5000r/min离心5min弃上清得到细胞沉淀，后加入200μL裂解液裂解细胞，12000g 4℃下离心5min，取上清得到细胞裂解上清液，-80℃保存以备后续试剂盒测定。

1.3抗氧化能力检测

试剂：谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒、脂质氧化(MDA)检测试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)。

将细胞裂解上清液置于冰上，根据试剂盒说明书进行测定。

2、检测结果

2.1成纤维细胞增殖影响检测

检测结果见图1。由图1可以看出，松花粉发酵提取液对成纤维细胞没有细胞毒性，且具有一定的增殖作用。最终选择体积分数为20％的松花粉发酵提取液进行后续的抗氧化实验。

2.2谷胱甘肽过氧化物酶活力的检测

模型组是只通过UVA照射、未添加样品的细胞组，空白组为未照射且未添加样品的细胞组。结果见图2。由图2可以看出，UVA照射会降低细胞的谷胱甘肽过氧化物酶的活力；将样品组与模型组、空白组以及阳性对照组对比，可以看出松花粉发酵提取液能显著提高成纤维细胞谷胱甘肽过氧化物酶的活力。

2.3脂质氧化(MDA)检测

模型组是只通过UVA照射、未添加样品的细胞组，空白组为未照射且未添加样品的细胞组。结果见图3。由图3可以看出，UVA照射会提高细胞内MDA的含量；将样品组与模型组、空白组以及阳性对照组对比，松花粉发酵提取液能显著降低成纤维细胞内MDA的含量。

从前述中可以理解，尽管为了示例性说明的目的描述了本申请的具体实施方案，但是在不偏离本申请的精神和范围的条件下，本领域所述技术人员可以作出各种变形或改进。这些变形或修改都应落入本申请所附权利要求的范围。

Claims

1.一种松花粉发酵提取液的制备方法，其包括将松花粉与去离子水混合后灭菌，得到松花粉发酵培养基，将扩培好的黄酒酵母菌液接种到所述松花粉发酵培养基中，依次进行有氧发酵和无氧发酵，发酵完成后进行离心分离和灭菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述松花粉与去离子水的混合重量比为1:10～1:60，优选1:20～1:40，更优选1:30。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述黄酒酵母为黄酒酵母21392。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述黄酒酵母菌液的浓度为10⁵～10⁹CFU/mL，优选10⁶～10⁸CFU/mL，更优选10⁷CFU/mL。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述黄酒酵母菌液与松花粉发酵培养基的体积重量比(mL:g)为1:5～1:50，优选1:10～1:30，更优选1:20。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述有氧发酵温度为20～40℃，优选25～35℃，更优选30℃；恒温振荡箱转速为100～260r/min，优选150～210r/min，更优选180r/min；发酵时间为4-24h，优选8-16h，更优选12h。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法制备的松花粉发酵提取液。

8.权利要求7所述的松花粉发酵提取液在制备用于抗衰老的化妆品中的应用。

9.权利要求8所述的应用，其中所述化妆品包括但不限于：面膜、精华液或爽肤水。

10.权利要求7所述的松花粉发酵提取液在直接作为用于抗衰老的化妆品中的应用。