CN108812702B - 一种植物免疫诱抗剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种植物免疫诱抗剂及其应用。本发明通过将深绿木霉T2蛋白激发子(TraT2A)作为主要有效活性成分与表面活性剂、增稠剂、稳定剂、防冻剂以及消泡剂按照特定比例配制成一种植物免疫诱抗剂，可用于诱导百合与抗病性相关的酶活性的提供，增强百合的抗病效果，该制剂对环境无污染，对人畜无危害，药效好。

Description

一种植物免疫诱抗剂及其应用

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，具体涉及一种植物免疫诱抗剂及其应用。

背景技术

木霉(Trichoderma spp.)属于真菌属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目的粘孢菌类，是一类普遍存在的真菌，常见于土壤中，是土壤微生物的重要群落，也见于植物残体及动物粪便中，经常可以从植物根围、叶围及种子、球茎表面分离到。据不完全资料统计，木霉菌至少对18属29种植物病原真菌有拮抗作用，深绿木霉是一种具有生防作用的木霉，据报道深绿木霉(Trichoderma aureoviride)对草坪根腐病病原菌具有生防作用，而且其产生的枯草杆菌丝氨酸蛋白酶基因SS42，其对尖镰孢菌、核盘菌、叶枯病菌、杨树烂皮病菌和立枯丝核菌五种病原菌具有生防作用。深绿木霉T2对百合疫霉菌和灰霉菌等具有显著的拮抗作用，其作用机理为竞争、寄生和溶菌作。木霉菌Sm1蛋白(small one protein)是从绿木霉(Trichoderma virens)中分离得到的一种低分子量、富含半胱氨酸的疏水性蛋白，属于蛋白类激发子，与Cerato-platanin基因家族有很高的同源性，具有诱导植物免疫抗性的作用。目前,生防木霉菌在温室和田间试验取得了较好的结果,国外已有多种商品化的木霉菌制剂问世,如美国的Topshield(哈茨木霉T22)和以色列的Tirchodex(哈茨木霉T39),国内木霉菌制剂已于2002年6月也通过专家组鉴定,其生防效果也获得了肯定，但是尚未见有关生防木霉蛋白激发子诱抗剂制剂的研究报道，尤其采用深绿木霉T2发酵液蛋白激发子(TraT2A)制备植物免疫诱抗剂来诱导增强百合的抗病效果。

发明内容

针对上述问题和现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种植物免疫诱抗剂，按重量百分数计，该制剂的有效活性成分包括20％的深绿木霉T2蛋白激发子(TraT2A)。

进一步地，按重量百分数计，该制剂还包括8％的表面活性剂、10％的增稠剂，2％的稳定剂，2％的防冻剂，8％的消泡剂。

进一步地，所述的表面活性剂为HSO1。

进一步地，所述的增稠剂为丙三醇。

进一步地，所述的稳定剂为戊二醇。

进一步地，所述的防冻剂为乙二醇或丙三醇。

进一步地，所述的消泡剂为JS-5115。

进一步地，按所述的植物免疫诱抗剂质量为1g计，各组分配比为：

本发明还提供了上述的植物免疫诱抗剂有效成分TraT2A在百合抗裂褶菌诱导抗病中的应用。

进一步地，所述的百合为兰州百合。

本发明的有益效果在于：

①发明属于生物农药制剂，对环境无污染，对人畜无危害，其有效成分TraT2A既可以诱导兰州百合抗生长期病害又可抗贮存期病害，药效好；

②该诱导剂有效成分TraT2A激发了百合中与抗病性相关的防御酶PPO、POD、PAL、CTH、GLU的活性。

③制备工艺简单。

附图说明

图1：不同稀释倍数下的实施例1植物免疫诱抗剂配方对兰州百合的诱导抗病效果图；

图2：TraT2A稀释100倍处理液对百合鳞片PPO酶活性影响；

图3：TraT2A稀释100倍处理液对百合鳞片POD酶活性影响；

图4：TraT2A稀释100倍处理液对百合鳞片PAL酶活性影响；

图5：TraT2A稀释100倍处理液对百合鳞片CHT酶活性影响；

图6：TraT2A稀释100倍处理液对百合鳞片GLU酶活性影响；

注：图2-图6中小写字母(abcd)分别表示在0.05水平不同处理同一时间酶活性差异。

具体实施例

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分，而不是发明的全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下列实施例所用到的试验材料和仪器包括：

供试材料：深绿木霉T2蛋白激发子(TraT2A)、裂褶菌(Schizophyl lumcommune)(均由甘肃农业大学植物保护学院农药实验室保存)；烧杯、250mL具塞量筒、100mL量筒，移液枪、蒸馏水、玻璃棒。

农药助剂：表面活性剂：HSO1(江苏擎宇化工科技有限公司)；增稠剂：丙三醇；消泡剂：JS-5115(江苏擎宇化工科技有限公司)；防冻剂：乙二醇；稳定剂：戊二醇(甘肃艾尔维科学仪器有限公司)；其余未作说明的材料均可通过市售获得；

供试仪器及设备：水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司)、酸度计(中国雷磁分析仪器厂)、液体表面张力系数测量试验仪(上海复旦欣科教仪器有限公司)、智能人工气候箱(上海跃进医疗器械有限公司)。

实施例1一种植物免疫诱抗剂配方及其质量评价

一、诱抗剂的配方确定

一种植物免疫诱抗剂配方按质量为1g计，各组分配比为：

二、诱抗剂的质量评价

上述配方确定后，测定其pH值、起泡性、热贮和低温贮存稳定性等，参照标准如下：

(1)低温稳定性测定：参照GB/T19137-2003低温稳定性测定方法进行，将试样在0℃保持1h，记录有无固体或油状物出现，继续在0℃贮存7d,进行离心分离，记录固体析出物的体积。

(2)热贮稳定性：参照GB/T 19136-2003农药热贮稳定性测定方法进行，。

(3)pH值测定：参照GB/T1601-1993pH测定方法进行测定。

(4)起泡性试验：量取2.5mL试样于250mL烧杯中，加入200mL 342mg/L标准硬水稀释、搅拌均匀，移入250mL具塞量筒内，盖上塞子，上下颠倒30次，放置1min。其液面泡沫低于60mL为合格。

测定结果如下表1所示，结果表明该诱抗剂各项理化性能指标均合格。

表1诱抗剂各项技术指标测定

实施例2实施例1中的植物免疫诱抗剂对兰州百合抗裂褶菌的诱导抗病效果测定

一、试验过程

1、孢子悬浮液的配置：取25℃活化培养7d的裂褶菌，加入10mL的灭菌水，用灭菌过的涂布器刮下培养皿上的裂褶菌孢子，然后将灭过菌的纱布折叠成4层过滤，将过滤后的孢子悬浮液转入50mL的烧杯，再将孢子悬浮液用血球计数板计数法算出孢子悬浮液的浓度后，稀释至所需浓度(1×10⁵个/mL孢子)。

2、百合鳞茎用75％酒精进行表面擦拭消毒，再用0.1％的升汞消毒30秒，再用灭菌蒸馏水冲洗3～5次，用稀释倍数分别为10、50、100的免疫诱抗剂浸泡百合鳞茎24h后，再转移至铺有灭菌滤纸的培养皿中，48h后接种裂褶菌孢子悬浮液并在15℃的培养箱内保湿培养，用无菌水处理为对照(CK)，每个处理重复3次、每个重复20个百合鳞片，7天后按以下分级标准进行病害发生情况调查，计算病情指数和诱抗效果。

分级标准：

0级：无病斑

1级：病斑面积占整个鳞片面积5％以下

2级：病斑面积占整个鳞片面积6％-10％

3级：病斑面积占整个鳞片面积11％-20％

4级：病斑面积占整个鳞片面积21％-50％

5级：病斑面积占整个鳞片面积大于(≥)50％

病情指数＝(∑(各级病叶数×对应级数)/(调查总叶数×总级数))×100％

诱导抗病效果(％)＝((对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数)×100％

二、试验结果

试验结果表明此诱抗剂在稀释10倍时对百合抗裂褶菌的诱导抗病效果最佳，诱抗效果达到61.21％。稀释100倍时诱抗效果最差，诱抗效果仅为32.44％，二者之间差异显著(P≤0.05，如表2和图1所示)。

表2诱抗剂对百合诱导抗病效果测定

实施例3 20％TraT2A诱抗剂有效成分TraT2A对兰州百合抗裂褶菌诱导抗病后植物体内酶活性检测

一、试验过程

1.孢子悬浮液的配置：取25℃活化培养7d的裂褶菌，加入10ml的灭菌水，用灭菌过的涂布器刮下培养皿上的裂褶菌孢子，然后将灭过菌的纱布折叠成4层过滤，将过滤后的孢子悬浮液转入50ml的烧杯，再将孢子悬浮液用血球计数板计数法算出孢子悬浮液的浓度后，稀释至所需浓度(1×10⁵个/mL孢子)。

2.百合鳞茎用75％酒精进行表面擦拭消毒，再用0.1％的升汞消毒30秒，再用灭菌蒸馏水冲洗3～5次，分为两组，一组用20％TraT2A诱抗剂100倍液浸泡(TraT2A)，一组用等量的灭菌水浸泡(CK)，24h后，这两组各分为两组置于培养皿中灭菌湿滤纸上，培养24h后用诱抗剂处理的一组和灭菌水处理的一组均接种裂褶菌孢子悬浮液，记为TraT2A+BS(BS:接种裂褶菌)、CK+BS(BS:接种裂褶菌)，转移至铺有灭菌湿滤纸的培养皿中继续培养，百合鳞茎处理共设置CK、Ck+BS、TraT2A、TraT2A+BS 4个处理，每组30个鳞片，每个处理重复3次，并于接菌处理前1d、接菌后第1d、3d、5d、7d采集处理的百合鳞片，利用生物化学方法测定苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)，总酚和类黄酮，木质素，几丁质酶和葡聚糖含量，所有测定重复三次。

3.TraT2A对兰州百合诱导抗病后植物体内酶活性检测

(1)POD活性测定：酶液提取：称取0.5g处理百合鳞片，加0.05M磷酸盐缓冲液(pH7.8)2.5mL(含0.1g聚乙烯吡咯烷酮)冰浴研磨，10000r/min离心15min，取上清液，4℃冰箱贮存备用。反应体系：为0.1mL酶液加2.9mL0.05磷酸缓冲液(pH5.5)，1mL2％H2O2，1mL0.05M愈创木酚，总体积5mL，用加热煮沸5min钟的酶液作为对照。于37℃恒温反应15min，立即冰浴，并加2mL20％三氯乙酸终止反应，测定470nm处的吸光值。以每分钟470nm处吸光值变化0.01为1个酶活单位U。

(2)PPO活性测定：酶液提取同POD，反应体系为：10μL酶液加1.5mL0.02M邻苯二酚和1.5mL磷酸缓冲液，总体积3mL，以不加酶液作为对照。30℃恒温反应2min，并于反应前后分别测定398nm处的吸光值。酶活单位U定义为在398nm处吸光值变化0.01所需的酶量。

(3)PAL活性测定：酶液提取：取0.5克百合鳞片,加0.05mol/LPh为8.8的硼酸盐缓冲液5ml(含5mmol/L巯基乙醇和0.1g聚乙烯比咯烷酮)冰浴研磨后4000r/min离心15min，取上清液4℃备用。反应体系为1mL酶液加1mL0.02M的L-苯丙氨酸和2mL蒸馏水，总体积4mL，以1mL蒸馏水代替底物作为对照。30℃恒温反应30min，并于反应前后分别测定290nm处的吸光值。酶活单位U定义为在290nm处吸光值变化0.01所需的酶量。

(4)几丁质酶活性测定：取保存于-20℃的百合鳞片样品1g放入预冷的研钵中，,加入5.0mL预先预冷的0.1mol/L、pH值为5.2的乙酸-乙酸钠缓冲溶液(1mmol/L乙二胺四乙酸和5mmol/L的β-巯基乙醇)于含有冰块的容器中研磨，将其研磨成匀浆后呈匀浆后于4℃、12000r/min离心30min，上清液即为粗酶提取液。取2支试管，分别加入0.5mL、50mmol/L、pH5.2乙酸-乙酸钠缓冲液，0.5mL、10g/L胶状几丁质悬浮液。然后一支试管加入0.5mL的粗酶提取液，另一支加入煮沸5min失活的粗酶提取液作为对照，并将其混合均匀，放于37℃的水浴锅中1h，然后加入0.1mL、30g/L的脱盐蜗牛酶并混均，继续放于在37℃的水浴锅中1h，以生成N-乙酰葡萄糖胺(Glc-NAc)单体，1h立即加入0.2mL、0.6mol/L的四硼酸钾溶液，在沸水中煮3min后取出并迅速冷却，再加入2mL质量分数为2％的二甲氨基苯甲醛溶液，再在37℃的水浴锅中保温20min让其显色，最后在585nm的波长处测定反应液的吸光度，用煮沸的酶液作对照，计算Glc-NAc的生成量，以每秒钟每克样品中酶分解胶状几丁质产生的1×10^{- 9}mol Glc-NAc为1个酶活力单位(U/g)，重复3次。

标准曲线的制作：取6只试管，编号，按下表4加入各成分。

表3 N-乙酰葡萄糖胺标准曲线制作试剂量

加入0.2ml 0.6mol/L的四硼酸钾溶液，将试管置于沸水中煮5min，迅速冷却后加入2ml冰醋酸稀释5倍的对二甲基苯甲醛溶液，再在37℃保温培养20min进行显色反应，以0号试管为参比对照，于波长585nm处测定显色液的吸光度，以吸光度为横坐标，N-乙酰葡萄糖胺物质的量(μmol)为纵坐标，制作标准曲线，求得回归方程。

(5)葡聚糖含量测定：GLU活性测定：称取3g处理百合鳞片，加入5mL经预冷的乙酸-乙酸钠缓冲液(pH＝5.2)(含1mmol/LEDTA和5mmol/Lβ-巯基乙醇和0.1g/L抗坏血酸)，冰浴下充分研磨成匀浆，于4℃、12000×g离心30min，收集上清液备用。准确吸取1mL样品酶提取液置于10mL试管中，依次加入2.5mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 4.8)，0.5mL 1％昆布多糖，30℃水浴锅中保温1h，用蒽酮法测定糖生成量，以每小时形成1mg葡萄糖表示1个酶活单位(U)。

标准曲线的制作：取7支具塞刻度试管(25ml)，编号，按下表5所示的量准确加入1g/L的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。

表4绘制葡萄糖标准曲线的试剂量

将各试管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入装有冷水的烧杯中冷却至室温，再用蒸馏水稀释至25ml刻度处，摇匀，在540nm的波长下，用0号试管作为参比调零，测定显色液的吸光值，以吸光值为纵坐标，葡萄糖质量为横坐标，绘制标准曲线，求得回归方程，。

二、试验结果

1、多酚氧化酶(PPO)活性测定

TraT2A处理明显提高了兰州百合多酚氧化酶(PPO)活性测(图1)，处理期间CK、BS、TraT2A、TraT2A+BS四个处理的PPO酶活性大体呈先上升后下降的趋势，且TraT2A+BS诱导处理组在处理期间其PPO酶活性均高于对照组CK、BS、TraT2A，方差分析结果表明整个处理时间内TraT2A+BS诱导处理组的PPO酶活性较其他三组处理差异显著，而且在接菌后第5d天TraT2A+BS诱导处理组的PPO酶活性达到最大值，为41.00U，分别比CK、BS、TraT2A高出41.04％、87.00％、18.05％(P≤0.05)(图2)。

2、过氧化物酶活性测定(POD)

TraT2A处理明显提高了兰州百合鳞片中过氧化氢酶(POD)的活性，从接菌后第1d到接菌后第7d，CK、BS、TraT2A、TraT2A+BS四组处理的POD酶活性均呈先上升后下降的趋势，但在整个处理期间内，用TraT2A处理的两组(TraT2A和TraT2A+BS)百合鳞片的POD酶活性均高于用无菌水处理(CK和BS)的两组，但在在接菌后第5d、7d时TraT2A+BS诱导处理组的POD酶活性显著高于其他三组处理地酶活性，并且较这三组处理具有显著差异，并且在接菌后第5dTraT2A+BS诱导处理组的POD酶活性达到最大值，为1.94U，分别比CK、BS、TraT2A高出193.93％、234.48％、8.99％，(P≤0.05)(图3)。

3、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定

TraT2A处理明显提高了兰州百合苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性，从接菌后第1d到第7d，CK、BS、TraT2A、TraT2A+BS四组处理的酶活性的变化基本呈先上升后下降的趋势，在接菌后第1d TraT2A、TraT2A+BS处理的酶活性与CK处理组的酶活性基本接近且无显著差异，但是与BS处理组的酶活性相比较具差异显著，除此之外，在其他处理时间内TraT2A和TraT2A+BS两组的PAL酶活性均显著高于CK和BS两组处理，且除接菌后第7d之外，诱导处理组TraT2A+BS处理组在其他处理时间的PAL酶活性均高于其他处理组，并在接菌后第3d酶活性达到最大值，为42.78U，分别比CK、BS、TraT2A高出31.63％、198.11％、31.03％，且与这三组处理相比较具有显著差异(P≤0.05)(图4)。

4、几丁质酶(CHT)活性测定

TraT2A处理兰州百合鳞片后，CK、BS、TraT2A三组处理的几丁质酶(CHT)活性的变化趋势基本都是先上升后下降，且这三组处理的酶活性从接菌后第1d开始一直处于下降趋势，从接菌后第5d开始，这三组处理的CHT酶活性值低于诱导处理组TraT2A+BS，而TraT2A+BS诱导处理组的CHT酶活性呈先下降后上升再下降的趋势，在接菌后第5d CHT的活性值达到最大值，为0.61U，分别比CK、BS、TraT2A高出28.57％、21.15％、21.15％，方差分析表明其较CK、BS、TraT2A三组差异显著(P≤0.05)(图5)。

5、β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活性测定

葡萄糖和吸光值的标准曲线方程为：Y＝3.6761X-0.0414，其中X为糖含量，Y为吸光值，R＝0.996

TraT2A处理兰州百合后，其β-1,3-葡聚糖酶(GLU)活性变化如下图所示，CK、BS两组处理从接菌后第1d开始其酶活呈先上升后下降的趋势，并在接菌后第1d和第3d酶活性均高于TraT2A和TraT2A+BS两组，TraT2A处理组呈先上升后下降再上升的趋势，并在接菌后第5d和7dGLU酶活性值超过CK、BS两组处理，而诱导处理组TraT2A+BS处理组酶活性则呈先下降后上升趋势，并在第5d两组处理酶活性值反超CK、BS、TraT2A三组处理，并在接菌后第7d酶活性达到最大值，其值为640.10U，并且分别比CK、BS、TraT2A高出145.46％、309.01％、22.88％，且与这三组处理相比较具有显著差异(P≤0.05)(图6)。

Claims (9)

1.一种植物免疫诱抗剂，其特征在于，按重量百分数计，该制剂的有效活性成分包括20%的深绿木霉T2蛋白激发子（TraT2A），该制剂还包括8%的表面活性剂、10%的增稠剂，2%的稳定剂，2%的防冻剂， 8%的消泡剂。

2.如权利要求1所述的一种植物免疫诱抗剂，其特征在于，所述的表面活性剂为HSO1。

3.如权利要求1所述的一种植物免疫诱抗剂，其特征在于，所述的增稠剂为丙三醇。

4.如权利要求1所述的一种植物免疫诱抗剂，其特征在于，所述的稳定剂为戊二醇。

5.如权利要求1所述的一种植物免疫诱抗剂，其特征在于，所述的防冻剂为乙二醇或丙三醇。

6.如权利要求1所述的一种植物免疫诱抗剂，其特征在于，所述的消泡剂为JS-5115。

7.如权利要求1所述的一种植物免疫诱抗剂，其特征在于，按所述的植物免疫诱抗剂质量为1g计，各组分配比为：

深绿木霉T2蛋白激发子（TraT2A） 0.20g

表面活性剂HSO1 0.08g

增稠剂丙三醇 0.10g

稳定剂戊二醇 0.02g

防冻剂乙二醇或丙三醇 0.02g

消泡剂JS-5115 0.08g

余量为水。

8.权利要求1所述的一种植物免疫诱抗剂在百合抗裂褶菌诱导抗病中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的百合为兰州百合。

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