CN101036458A - 一种利用表面活性剂提高绿色木霉生防活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用表面活性剂提高绿色木霉生防活性的方法。本发明以绿色木霉(Trichoderma viride Tr9701)生产其活孢子制剂，绿色木霉的发酵以食用菌废料为主，加入适量麦麸、无机营养盐、黄豆渣，以绿色木霉孢子、硅藻土、黄原胶、SDS、几丁质等配制成绿色木霉可湿性粉剂，将表面活性剂Tween－80(失水山梨醇油酸酯聚氧乙烯醚)的与绿色木霉可湿性粉剂复合施用，可以提高其对蔬菜灰霉病、白粉病等的防治效果，提高绿色木霉在植株的定殖能力。此方法简单、提高绿色木霉生防活性的幅度较大，且具有能显著降低表面和界面张力，对绿色木霉无毒性等诸多优点，应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及提高生防活性的方法，具体涉及一种利用表面活性剂提高绿色木霉防治植物地上部病害的方法。
背景技术
木霉是自然界中普遍存在的一类真菌，在土壤、植物根围、叶围及种子、球茎表面经常可以分离到。近些年人们发现某些木霉是植物病原真菌的寄生菌或拮抗菌，如哈茨木霉(T.harzianum)、钩状木霉(T.hamatum)、绿色木霉(T.viride)可以防治真菌病害。迄今为止有关木霉在生防方面的研究已开展近70年，在国外已经出现了商品化的木霉制剂。如以防治李属果树银叶病(Chondrostereum purpureum)的木霉制剂在西欧已商品化生产；以色列的Makhteshim Agan公司开发的以哈茨木霉T39菌株为发酵液的生防制剂，商品名Trichodex，剂型为25％可湿粉，它可以用于防治灰霉病菌(Botrytis cinerea)、菌核病菌(Scleratina sclerotiorum)、叶霉病(Cladosporium fulvum)、霜霉病(Pseudoperonasplra cubensis)和白粉病(Sphaerotheca fuliginea)等叶部病害，在国内也有研究利用木霉菌控制植物病害。
从公开报道的文献中可以看到人们对生防木霉菌的研究，大多集中在菌株的筛选、鉴定、发酵培养及其利用等方面。其中，绿色木霉(Trichoderma viride)是一种具有广谱抑病能力的真菌，可以通过拮抗、竞争、寄生、诱导抗性、促生等作用方式，对多种植物病害具有明显的防治作用。但是，由于绿色木霉菌制剂为活孢子制剂，易受外界各种因素的干扰，导致其生防活性下降，这一直是阻碍其大规模生产应用的瓶颈问题，因而有待于采用措施解决这一问题，用以提高绿色木霉的生防效果。
鉴于绿色木霉是活菌制剂，主要通过活菌孢子来实现其生防活性，因此提高绿色木霉孢子等的活性及其在田间的定殖能力，对于提高该制剂的田间施用效果有很好的作用。因此研究利用一种既能显著降低表面和界面张力，又对绿色木霉菌无毒性作用的表面活性剂，用以提高绿色木霉孢子的存活及其在田间的定殖能力，是提高绿色木霉生防活性的重要途径。
发明内容
本发明旨在研究一种利用表面活性剂提高绿色木霉生防活性的方法。
本发明是通过以下技术方案实现上述发明目的的。
主要内容包括由绿色木霉(Trichoderma viride)的抑菌活性、鉴定、安全性、人工发酵和制剂化及其与表面活性剂Tween-80(失水山梨醇油酸酯聚氧乙烯醚)的复合施用技术，本发明的特征在于在具防治植物病害的绿色木霉Tr9701的生物制剂中加入表面活性剂-Tween-80(失水山梨醇油酸酯聚氧乙烯醚)，Tween-80的加入量，配制和施用技术。
具体实施方式
下面进一步详述本发明。
1、绿色木霉Tr9701的抑菌活性、鉴定及其安全性
所筛选、利用的生防菌绿色木霉菌Tr9701属半知菌类、丛梗孢目、木霉菌属，为绿色木霉(Trichoderma viride)。
通过生防菌对病原菌拮抗活性的初步筛选，获得的绿色木霉Tr9701对立枯病菌、灰霉病菌有强拮抗活性，且对多种病原菌都有不同程度的抑制作用，是比较理想的生防菌株。当绿色木霉遇到病原菌时，受到刺激和诱导，可产生溶菌酶(如几丁质酶等)，抑制立枯病菌和灰霉病菌等的生长，并可降解菌丝。且其适应性广，生长和繁殖快，可迅速利用营养并占据空间，抑制病菌生长侵染。将所获绿色木霉Tr9701进行温室茄苗接种防病试验，绿色木霉菌剂对立枯菌的防治效果较好，子叶期防效达73.3％，真叶期达71.34％。
通过伤口接种安全试验，绿色木霉Tr9701均未引起茄子、黄瓜和烟草萎蔫或猝到，未见其根部和叶部发生病变，植株生长正常，说明所筛选到的绿色木霉Tr9701对茄子和黄瓜等植株是安全的，无致病性。
对绿色木霉Tr9701进行生物学测定，其以小麦粉和豆粉浸出液培养基生长最适，在其上孢子生成最快、产生孢子量多，分生孢子在1％葡萄糖溶液中萌发效果最好；20℃～30℃为其菌落生长和分生孢子形成的适宜温度；木霉菌菌落生长和孢子可以耐受45℃的高温，致死温度为55℃持续15min；适宜pH为5～8；短时紫外线照射不会对绿色木霉菌的生长和孢子着生产生影响。
2、绿色木霉的人工发酵
1)绿色木霉Tr9701(Trichoderma viride)，菌株转接保存在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，培养基成分为：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000mL，pH6.5～7。扩繁斜面培养基采用小麦粉培养基斜面培养(小麦粉培养基：全麦粉20g、葡萄糖20g、酵母膏2g、琼脂20g，加水1000mL，pH6.8～7.0)，26℃、光照培养5天，培养绿色木霉产生孢子。
2)液态发酵
液态发酵培养基采用小麦粉培养液，成分包括：全麦粉20g、葡萄糖20g、酵母膏2g，加水1000mL，pH6.8～7.0。培养基灭菌后接种绿色木霉种子液(孢子浓度5×106个孢子/mL)，种子液与培养液的接种比例为1∶30，26℃、200rpm、光照震荡培养5天，培养绿色木霉产生菌丝球和孢子。
3)固态发酵
固体发酵培养基可选用小麦粒培养基和食用菌废料培养基培养。小麦粒培养基配方：小麦粒、葡萄糖、酵母浸膏以1000∶20∶10的比例混匀，使含水量达到80～100％，初始pH6.5～7；食用菌废料培养基配方：食用菌废料、麦麸、黄豆渣以500∶100∶20以的比例混匀，其中添加磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2％～0.4％、硫酸镁(MgSO4`7H2O)0.02％。培养基灭菌后接种绿色木霉种子液，按照孢子悬浮液∶固体基质＝2.5∶100，将孢子悬浮液均匀加入固体发酵基质中，24～26℃，光照培养6～8天，培养期间应定期震荡基料通气。
表1、不同时期绿色木霉菌孢子种群密度变化(小麦粒培养基)
| 时间 | 孢子密度计数(×106个孢子/g) | ||||
| 2d | 3d | 4d | 6d | 8d | |
| 平均 | 8.33 | 51.7 | 98.9 | 332.4 | 357.4 |
表2、不同时期生防木霉菌孢子种群密度变化(食用菌废料培养基)
| 时间 | 孢子密度计数(×106个孢子/g) | ||||
| 2d | 3d | 4d | 6d | 8d | |
| 平均 | 7.1 | 53.8 | 99.8 | 248.7 | 259.3 |
3、50％绿色木霉可湿性粉剂的配方及其贮存性能
50％绿色木霉可湿性粉剂配方：硅藻土或膨润土、绿色木霉菌培养孢子、黄原胶和SDS和几丁质分别按照46.7％、50％和3.3％的比例混合均匀，并进行细化细度95％以上可通过100目筛，制成品外观松散、流动性好。
绿色木霉活菌制剂应该在密闭条件下室温保存，有条件的可以低温保存，低温密闭条件更有利于延长绿色木霉制剂的保质期。
50％绿色木霉可湿性粉剂品质标准为：
有效成分含量：≥50％，(孢子数＞10×107孢子/克)；
水分：＜5％；
细度(过100目筛，％)：≥95％；
4、Tween-80(失水山梨醇油酸酯聚氧乙烯醚)的配制及其配合施用技术
50％绿色木霉可湿性粉剂对蔬菜灰霉病、白粉病等均有良好的防治效果，但田间施用过程中，由于环境或施用技术等因素，均会影响其防治效果，因此我们提出采用Tween-80(失水山梨醇油酸酯聚氧乙烯醚)与其混合施用，以提高其防治效果。具体方法：采用净化水将Tween-80(失水山梨醇油酸酯聚氧乙烯醚)按照10∶1的比例进行稀释，配制成10％Tween-80稀释液备用，将10％Tween-80(失水山梨醇油酸酯聚氧乙烯醚)与50％绿色木霉可湿性粉剂按照1∶1混合后，按照50％绿色木霉可湿性粉剂的施用剂量稀释施用，经验证该方法可明显提高绿色木霉在植株上的附着力和延展性能，提高施用效果。
配合施用Tween-80可明显提高绿色木霉菌在黄瓜叶面的定殖能力(结果见表3)。混合及单独喷雾后取样调查绿色木霉在黄瓜叶面上种群数量消长，绿色木霉在叶面上的定殖情况，混合喷雾后1h取样，绿色木霉菌量为3.69×104cfu/g叶片，而单独喷雾的仅为1.18×104cfu/g叶片，绿色木霉的接种量混合喷雾明显较单独喷雾为高。3d～28d检测结果也显示同样结果，混合喷雾下绿色木霉在植株表面存活的数量，明显较单独喷雾的大。可以得出结论，通过添加Tween-80可显著提高绿色木霉在植株的附着和定殖能力。
表3、绿色木霉孢子在黄瓜叶片上定殖情况
| 孢子着生量(×104个孢子/g) | 重复 | 调查时间 | |||||
| 1h | 3d | 7d | 14d | 21d | 28d | ||
| 50％绿色木霉可湿性粉剂+10％Tween-80 | 1 | 3.52 | 3.22 | 2.65 | 2.87 | 2.38 | 1.96 |
| 2 | 3.68 | 3.65 | 2.49 | 3.02 | 2.26 | 1.83 | |
| 3 | 3.72 | 3.49 | 2.54 | 2.95 | 2.37 | 1.72 | |
| 4 | 3.85 | 3.32 | 2.64 | 2.99 | 2.28 | 1.89 | |
| 平均 | 3.69 | 3.42 | 2.58 | 2.96 | 2.32 | 1.85 | |
| 50％绿色木霉可湿性粉剂 | 1 | 1.24 | 1.21 | 0.94 | 1.15 | 0.83 | 0.18 |
| 2 | 0.96 | 0.95 | 0.81 | 0.92 | 0.66 | 0.08 | |
| 3 | 1.15 | 1.08 | 0.86 | 0.98 | 0.79 | 0.14 | |
| 4 | 1.37 | 1.40 | 0.95 | 1.03 | 0.72 | 0.10 | |
| 平均 | 1.18 | 1.16 | 0.89 | 1.02 | 0.75 | 0.12 | |
表4、绿色木霉可湿粉剂协同10％Tween-80防治番茄灰霉病
| 供试药剂 | 处理(倍) | 药前平均病指 | 1次药后7天调查 | 3次药后7天调查 | ||
| 平均病指 | 防治效果(％) | 平均病指 | 防治效果(％) | |||
| 50％绿色木霉可湿性粉剂+10％Tween-80 | 600 | 1.03 | 2.46 | 77.31 a | 3.07 | 84.74 a |
| 800 | 1.05 | 3.03 | 72.67 b | 3.63 | 82.15 ab | |
| 1000 | 0.95 | 3.10 | 68.98 bc | 4.17 | 78.24 cd | |
| 50％绿色木霉可湿性粉剂 | 600 | 1.10 | 3.45 | 69.80 bc | 4.24 | 79.89 bc |
| 800 | 1.04 | 3.62 | 66.69 c | 4.99 | 75.00 d | |
| 1000 | 0.90 | 3.55 | 62.88 d | 5.67 | 68.71 e | |
| 50％速克灵WP | 1000 | 0.93 | 2.82 | 71.25 b | 3.55 | 80.39 bc |
| 空白对照 | - | 1.03 | 10.43 | 19.36 | ||
5、Tween-80(失水山梨醇油酸酯聚氧乙烯醚)与绿色木霉制剂的田间配合施用防病效果
对所研制的绿色木霉可湿粉剂与10％Tween-80(失水山梨醇油酸酯聚氧乙烯醚)进行了防治番茄灰霉病药效试验，结果见表4。3次药后7天调查，其中50％绿色木霉可湿性粉剂与10％Tween-80混合稀释600、800、1000倍，混合施用的防效分别为84.74％、82.15％、78.24％，50％绿色木霉可湿性粉剂600、800、1000倍液单独进行喷雾的防效分别为79.89％、75.00％、68.71％，对照药剂50％速克灵可湿性粉剂1000倍液的防效为80.39％。
此外，我们还针对黄瓜霜霉病、黄瓜白粉病进行了药效试验，结果见表5、6。
表5、绿色木霉可湿粉剂协同10％Tween-80防治黄瓜霜霉病药效试验
| 供试药剂 | 处理(倍) | 药前平均病指 | 1次药后7天调查 | 3次药后7天调查 | ||
| 平均病指 | 防治效果(％) | 平均病指 | 防治效果(％) | |||
| 50％绿色木霉可湿性粉剂+10％Tween-80 | 600 | 1.22 | 3.51 | 65.15 a | 4.08 | 80.97 a |
| 800 | 1.32 | 4.25 | 61.52 ab | 5.34 | 76.89 b | |
| 1000 | 1.15 | 4.18 | 55.97 cd | 5.57 | 72.84 cd | |
| 50％绿色木霉可湿性粉剂 | 600 | 1.35 | 4.64 | 58.39 bc | 5.82 | 75.41 bc |
| 800 | 1.19 | 4.75 | 52.94 de | 5.98 | 71.58 d | |
| 1000 | 1.07 | 4.68 | 49.56 e | 6.55 | 65.58 e | |
| 80％代森锰锌WP | 500 | 1.11 | 4.11 | 57.12 bcd | 4.76 | 75.86 bc |
| 空白对照 | - | 1.16 | 9.29 | 19.70 | ||
表6、绿色木霉可湿粉剂协同10％Tween-80防治黄瓜白粉病药效试验
| 供试药剂 | 处理(倍) | 药前平均病指 | 1次药后7天调查 | 3次药后7天调查 | ||
| 平均病指 | 防治效果(％) | 平均病指 | 防治效果(％) | |||
| 50％绿色木霉可湿性粉剂+10％Tween-80 | 600 | 1.44 | 4.17 | 65.15 a | 4.22 | 84.63 a |
| 800 | 1.42 | 4.64 | 61.52 ab | 5.18 | 80.93 b | |
| 1000 | 1.35 | 4.98 | 55.97 cd | 6.06 | 77.05 cd | |
| 50％绿色木霉可湿性粉剂 | 600 | 1.64 | 5.63 | 58.39 bc | 6.79 | 78.06 c |
| 800 | 1.44 | 5.68 | 52.94 de | 7.02 | 74.34 e | |
| 1000 | 1.29 | 5.68 | 49.56 e | 7.57 | 70.10 f | |
| 70％甲基硫菌灵WP | 800 | 1.39 | 4.99 | 58.41 bc | 6.36 | 75.80 de |
| 空白对照 | - | 1.37 | 10.88 | 24.93 | ||
研制的50％绿色木霉可湿粉剂混合10％Tween-80喷雾处理防治黄瓜霜霉病、白粉病有较好的效果，3次药后调查，将10％Tween-8混合50％绿色木霉可湿粉剂施用的防效明显较绿色木霉单独施用为佳，与对照药剂的防效相当或优于对照药剂。
可以得出结论，采用10％Tween-8混合50％绿色木霉可湿粉剂配合施用技术，可明显提高绿色木霉在植株的定殖和存活能力，同时对于其防病效果有显著的增效作用。
Claims (1)
1、一种利用表面活性剂提高绿色木霉(Trichoderma viride)生防活性的方法，包括绿色木霉的人工发酵和制剂化，及表面活性剂Tween-80(失水山梨醇油酸酯聚氧乙烯醚)的复合施用技术，本发明的特征在于将具防治植物病害的绿色木霉Tr9701的生物制剂中加入表面活性剂——Tween-80(失水山梨醇油酸酯聚氧乙烯醚)，用以提高绿色木霉的生防活性，具体涉及Tween-80的配制及其协同施用技术。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Liu Xiaolin Document name: Notification that Application Deemed to be Withdrawn |
|
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20070919 |