CN114196546B - DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用 - Google Patents

DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了DCMU在稳定微藻混养生长pH或提高微藻混养生长速度中的应用。本发明首次发现DCMU在微藻混养中具有稳定生长pH和促进微藻生长速度的作用。本发明为高效提高微藻的混养生长速度提供了一种方法；由于DCMU本身十分廉价，且使用浓度极低，几乎不产生额外的工业成本，使得本发明所提供的方法十分适合于微藻的工业化培养；本发明所提供的方法具有操作简便、实用性强的特点，有利于大规模的工业应用。

Description

DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的 应用
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，特别涉及DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用。
背景技术
微藻是一类单细胞光合微型生物的总称。微藻已经成为传统陆生植物的一个有吸引力的替代品，用于生产生物燃料和其他高价值产品，同时缓解耕地、二氧化碳排放和全球变暖的压力。然而，实现微藻产品的高生产率仍然是微藻商业应用的主要挑战。微藻的混养发酵是指微藻同时利用有机物和光照进行生长的一种培养模式，由于兼具光合自养生长与异养生长的优势，微藻的混养发酵可以成为一种提升微藻生长速度与产物产量的方法，如小球藻、衣藻、微拟球藻、斜生栅藻等微藻都被发现可以进行混养生长。混养发酵技术在微藻生成生物柴油、生物制品等方面的优势已经得到了广泛的研究。然而，实现微藻混养发酵的大规模工业化应用仍然需要克服许多障碍，如获得更加廉价和可持续的碳源、实现更加低成本的pH、温度、光照条件控制。然而，微藻在利用有机物生长时会使得培养基pH发生大幅度的波动，并因此降低微藻生长速度。诸如添加pH缓冲剂、人工调控发酵培养液pH等方法虽然可以在一定程度上稳定pH，提高微藻的生长速度，但是面临成本太高、操作繁琐等问题，无法在工业水平上得到应用。总之，为实现微藻混养发酵的工业化应用，微藻的混养生长速度需要得到进一步的提升，而相关的培养成本需要得到进一步的降低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：DCMU（二氯苯基二甲脲）在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用，是基于本发明发明人发现DCMU在微藻混养中具有稳定生长pH和促进微藻生长速度的作用得到的研究成果。
所述的DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用，具体包括如下步骤：将微藻接种于含有DCMU的混养培养基中进行光照培养。
所述的微藻为能进行混养生长的微藻，优选为小球藻、衣藻、微拟球藻或斜生栅藻。
所述的小球藻优选为凯氏拟小球藻。
所述的微藻优选为用自养培养基富集培养得到的微藻。
所述的自养培养基优选为BG11培养基。
所述的微藻的接种量优选按混养培养基体积百分比1～3%计算。
所述的微藻优选为细胞密度是1×108～1×109个/mL的微藻。
所述的DCMU在所述的混养培养基中的浓度为20～100 μg/L；优选为40～80 μg/L；更优选为60 μg/L。
所述的混养培养基为含有碳源的培养基。
所述的碳源优选为葡萄糖。
所述的培养基优选为BG11培养基。
所述的光照培养的条件优选如下：温度是25～35℃，光照强度是3500～4500Lux；更优选如下：温度是30℃，光照强度是4000Lux。
所述的光照的周期优选为16～24h光/0～8h暗。
所述的光照培养的时间优选为48小时以上；更优选为60小时。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
（1）DCMU（二氯苯基二甲脲）为一种常用除草剂，其可以通过抑制光合系统PSⅡ的电子传递从而抑制绿色植物的光合作用。本发明发明人首次发现了DCMU对于混养的微藻具有稳定生长pH和促进微藻生长速度的作用，从而为高效提高微藻的混养生长速度提供了一种方法。
（2）由于DCMU本身十分廉价，且使用浓度极低，几乎不产生额外的工业成本，使得本发明所提供的方法十分适合于微藻的工业化培养。
（3）本发明所提供的方法具有操作简便、实用性强的特点，有利于大规模的工业应用。
附图说明
图1是不同浓度的Tris 碱对凯氏拟小球藻混养生长的影响结果图。
图2是不同浓度的DCMU对凯氏拟小球藻混养生长的影响结果图。
图3是DCMU对凯氏拟小球藻在不同浓度葡萄糖的混养培养基中混养生长的影响结果图；其中，3G表示3 g/L 葡萄糖，4G表示4g/L 葡萄糖，5G表示5 g/L 葡萄糖，CK为对照组，DCMU为加入DCMU实验组。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：
（1）以凯氏拟小球藻（Parachlorella kessleri）FACHB-4 （购自中国科学院淡水藻种库）为微藻藻种，首先用BG11培养液进行富集培养，当凯氏拟小球藻的细胞密度达到1×108～1×109个/mL时，获得凯氏拟小球藻种子液。BG11培养液的成分为：NaNO3 1.5 g/L、K2HPO4 40 mg/L、MgSO4·7H2O 70 mg/L，CaCl2·2H2O 40 mg/L、柠檬酸 6 mg/L、柠檬酸铁铵6 mg/L、EDTA Na2 1 mg/L、Na2CO3 20 mg/L、H3BO3 2.86 mg/L、MnCl2·4H2O 1.86 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.39 mg/L、CuSO4·5H2O 0.08 mg/L、Co(NO3)2·6H2O 0.05 mg/L，pH＝7.00。
（2）配置微藻葡萄糖混养培养基，培养基为BG11培养基外加2 g/L葡萄糖，pH＝7.00。
（3）将凯氏拟小球藻种子液按2%体积比接种至微藻葡萄糖混养培养基，添加不同终浓度的Tris 碱（0、0.2、0.5、1 g/L），将凯氏拟小球藻培养物置于光照培养箱中培养60小时，培养条件为：30℃，4000 Lux持续光照。
（4）每间隔12h取样，测量培养液的pH、葡萄糖含量以及凯氏拟小球藻的干重，结果如图1所示：
A、凯氏拟小球藻混养生长时，其pH会快速升高，在24h时pH接近9，36h达到9.6以上。葡萄糖的利用在培养基达到pH8以上时减慢，达到pH9以上时停止。发明人推测，这一现象的出现主要是由于小球藻的葡萄糖转运是通过同向质子通道实现的，当pH过高时，由于胞外质子的缺失，难以进行葡萄糖的转运，最终导致了小球藻混养生长时的低生长速度。
B、pH缓冲剂的加入会显著提高凯氏拟小球藻的混养生长速度，随着pH缓冲剂Tris碱添加量的增加，培养液pH呈现越来越稳定的趋势，加入0.5 g/L以上的Tris碱时，培养基pH在48小时内可以稳定在7.0-8.0之内，稳定的pH显著加快了葡萄糖的消耗速度，并最终提升了凯氏拟小球藻的生长速度，在48小时之后，随着培养基中的葡萄糖消耗殆尽，培养基pH开始出现大幅度的上升。最佳的Tris碱缓冲剂添加量为0.5 g/L，在此条件下，凯氏拟小球藻最终生物量为2.8 g/L，是空白对照的4.2倍。
C、虽然Tris碱添加量的增加可以进一步提高培养基pH的稳定性，但是过多的Tris碱会抑制小球藻的生长，反而会降低小球藻的生长速度。所以无法通过增加pH缓冲液的方式进一步稳定pH，提高小球藻生长速度。此外，高添加量的Tris碱增加了培养基成本，限制了其在工业生产中的应用。综合来看，需要一个更加廉价高效的pH调控方式以满足微藻快速混养生长的需求。
干重的测定方法：首先建立微藻OD680与微藻干重之间的标曲，通过测量微藻培养液OD680换算微藻干重。实施例中Parachlorella kessleri FACHB-4干重标曲为：干重（g/L）=0.423×OD680-0.005。
葡萄糖含量的测定使用3,5-二硝基水杨酸法：检测液成分（1 L）：3,5二硝基水杨酸6.3 g，NaOH 21g，KNaC4H12O10·4H2O 182g，苯酚 5g，Na2SO3 5g。将发酵液稀释20倍与检测液按体积比1：3混合，100℃水浴5min，检测540 nm吸光度，对照标准曲线计算得到葡萄糖含量。
实施例2：
（1）以凯氏拟小球藻（Parachlorella kessleri）FACHB-4 （购自中国科学院淡水藻种库）为微藻藻种，首先用BG11培养液进行富集培养，当凯氏拟小球藻的细胞密度达到1×108～1×109个/mL时，获得凯氏拟小球藻种子液。BG11培养液的成分为：NaNO3 1.5 g/L、K2HPO4 40 mg/L、MgSO4·7H2O 70 mg/L，CaCl2·2H2O 40 mg/L、柠檬酸 6 mg/L、柠檬酸铁铵6 mg/L、EDTA Na2 1 mg/L、Na2CO3 20 mg/L、H3BO3 2.86 mg/L、MnCl2·4H2O 1.86 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22 mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.39 mg/L、CuSO4·5H2O 0.08 mg/L、Co(NO3)2·6H2O 0.05 mg/L，pH＝7.00。
（2）配置微藻葡萄糖混养培养基，培养基为BG11培养基外加2 g/L葡萄糖，pH＝7.00。
（3）将凯氏拟小球藻种子液按2%体积比接种至微藻葡萄糖混养培养基，添加不同终浓度的DCMU（0、40、60、80、100 μg/L），将凯氏拟小球藻培养物置于光照培养箱中培养60小时，培养条件为：30℃，4000 Lux持续光照。
（4）每间隔12h取样，测量培养液的pH、葡萄糖含量以及凯氏拟小球藻的干重，结果如图2所示：
A、DCMU的添加极大的促进了凯氏拟小球藻的生长速度，尤以60 μg/L的DCMU促进效果最佳，经过60小时的培养，凯氏拟小球藻在含60 μg/L的DCMU培养基中混养生长的生物量为3.2 g/L，为空白对照的4.9倍；按促进凯氏拟小球藻的生长速度排序，从高到低依次是60 μg/L、40 μg/L、80 μg/L、100 μg/L、0μg/L（即control对照组）。
B、随着培养基时间的推移，培养液内的葡萄糖含量降低，可见，凯氏拟小球藻利用了培养液内的葡萄糖，是以混养方式进行生长。
C、DCMU未添加的对照组，凯氏拟小球藻混养生长会造成培养液pH的大幅度上升，减弱凯氏拟小球藻的生长速度。DCMU的添加极大的促进了凯氏拟小球藻混养培养液的pH稳定性，在48小时内，可以将培养基pH控制在7～7.8之间。稳定的pH提高了小球藻的葡萄糖消耗速度及凯氏拟小球藻的生长速度，经过60小时的培养，凯氏拟小球藻在含60 μg/L的DCMU培养基中混养生长的生物量为3.2 g/L，为空白对照的4.9倍。
D、根据文献报道，微藻利用葡萄糖混养生长时，微藻对葡萄糖的利用会使培养液pH下降；自身的光合作用及卡尔文循环的固碳作用会使得培养液pH上升。基于本发明研究的成果，发明人认为，当未添加DCMU时，微藻光合作用导致上升的pH强于葡萄糖利用导致下降的pH，使得培养基pH上升，而培养基的pH上升会促进微藻的光合作用并抑制微藻对葡萄糖的利用，从而进一步加剧了双方差距，最终导致了培养基pH的快速上升。DCMU作为一种光合作用抑制剂，可以专一性的抑制微藻的光合作用，而不会影响微藻对葡萄糖的利用。当添加合适剂量的DCMU时，微藻光合作用使得pH上升的作用等于葡萄糖的利用使得pH下降的作用，使得培养基pH维持稳定，并最终提高微藻的混养生长速度。
E、与普通pH缓冲剂Tris碱相比，DCMU的添加可以获得更高的凯氏拟小球藻生物量，又由于其本身价格低廉、使用浓度低（μg级别），极低的应用成本使其具有很强的工业应用潜力。
实施例3：
（1）以凯氏拟小球藻（Parachlorella kessleri）FACHB-4为微藻藻种，首先用BG11培养液进行富集培养，当凯氏拟小球藻的细胞密度达到1×108～1×109个/mL时，获得凯氏拟小球藻种子液。BG11培养液的成分为：NaNO3 (1.5 g/L)，K2HPO4 (40 mg/L)，MgSO4·7H2O(70 mg/L)，CaCl2·2H2O (40 mg/L)，柠檬酸(6 mg/L)，柠檬酸铁铵(6 mg/L)，EDTA Na2 (1mg/L)，Na2CO3 (20 mg/L)，H3BO3 (2.86 mg/L)，MnCl2·4H2O (1.86 mg/L)，ZnSO4·7H2O(0.22 mg/L)，Na2MoO4·2H2O (0.39 mg/L)，CuSO4·5H2O (0.08 mg/L)，Co(NO3)2·6H2O(0.05 mg/L)，pH＝7.00。
（2）配置不同葡萄糖含量的微藻混养培养基，培养基为BG11培养基外加3 g/L、4g/L、5 g/L的葡萄糖，pH＝7 .00。
（3）将凯氏拟小球藻种子液按2%体积比接种至不同葡萄糖含量的微藻混养培养基中，添加终浓度为60 μg/L的DCMU，将凯氏拟小球藻培养物置于光照培养箱中培养72 小时，培养条件为：30℃、4000 Lux光照，16/8小时光照周期。同时设置对照组（CK），对照组为不添加DCMU。
（4）通过测量凯氏拟小球藻的干重衡量凯氏拟小球藻的生长速度，结果如图3所示，葡萄糖含量越高，DCMU对凯氏拟小球藻混养生长的促进作用越显著。这说明DCMU对不同葡萄糖含量的混养培养基具有普遍适用性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用。
2.根据权利要求1所述的DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用，其特征在于包括如下步骤：将微藻接种于含有DCMU的混养培养基中进行光照培养。
3.根据权利要求1或2所述的DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用，其特征在于：所述的微藻为能进行混养生长的微藻。
4.根据权利要求3所述的DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用，其特征在于：所述的微藻为小球藻、衣藻、微拟球藻或斜生栅藻。
5.根据权利要求2所述的DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用，其特征在于：
所述的微藻的接种量按混养培养基体积百分比1～3%计算；
所述的微藻为细胞密度是1×108～1×109个/mL的微藻。
6.根据权利要求2所述的DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用，其特征在于：所述的DCMU在所述的混养培养基中的浓度为20～100 μg/L。
7.根据权利要求6所述的DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用，其特征在于：所述的混养培养基为含有碳源的培养基。
8.根据权利要求7所述的DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用，其特征在于：所述的碳源为葡萄糖。
9.根据权利要求7所述的DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用，其特征在于：所述的培养基为BG11培养基。
10.根据权利要求2所述的DCMU在稳定微藻混养生长pH和提高微藻混养生长速度中的应用，其特征在于：
所述的光照培养的条件如下：温度是25～35℃，光照强度是3500～4500Lux。
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