CN103687938A - 微拟球藻中的dcmu抗性 - Google Patents

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S·百利
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Abstract

本文提供控制水生环境中生长的藻类密度的示例性方法。一些示例性方法包括向水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲(DCMU)应用于，其中所述藻类包括微拟球藻属。所述藻类还包括扁藻属和/或小球藻属藻类。有效量的施加可导致水生环境中DCMU的大致浓度为100纳摩尔-1500纳摩尔。此外，所述水生环境可包括海水、淡水或其混合物。

Description

微拟球藻中的DCMU抗性
发明人：B·维克(Bertrand Vick)，S·百利(Shaun Bailey)和J·莫斯利(Jeffrey Moseley)
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年6月7日提交的题为“DCMU Resistance inNannochloropsis(微拟球藻中的DCMU抗性)”的美国临时专利申请序列号61/494,330的权益和优先权，所述专利申请通过引用纳入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及生化，更具体地涉及藻类养殖。
发明内容
本文提供控制水生环境中生长的藻类密度的示例性方法。一些示例性方法包括向水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲(DCMU)，其中所述藻类包括微拟球藻(Nannochloropsis)属。所述藻类还可包括扁藻(Tetraselmis)属和/或小球藻(Chlorella)属。所述有效量的施加可引起水生环境中DCMU的大致浓度为100纳摩尔-1500纳摩尔。此外，水生环境可包括海水、淡水或其混合物。
控制水生环境中生长的藻类密度的其它示例性方法可包括向该水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的DCMU，其中所述藻类包括微拟球藻属，且其中所述有效量的施加引起水生环境中DCMU的大致浓度为100纳摩尔-1500纳摩尔，且其中所述有效量抑制不超过约20%的微拟球藻生长。
控制水生环境中生长的藻类密度的其它示例性方法可包括向该水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的DCMU，其中所述藻类包括微拟球藻属，且其中有效量的施加引起水生环境中DCMU的大致浓度为0.38微摩尔-1.55微摩尔，且其中所述有效量抑制不超过约20%的微拟球藻生长，且其中DCMU的有效量抑制超过约75%的扁藻生长。
附图简要说明
图1显示在微拟球藻属藻类(“W2”)上施加50微摩尔量子m-2s-1光化光。
图2显示在小球藻属藻类上施加50微摩尔量子m-2s-1光化光。
图3是对比图2所示的小球藻属藻类的污染物种百分比的相对荧光上升图。
图4显示微拟球藻(“W2”)中更高DCMU耐受程度的遗传基础。
图5显示向水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的DCMU的示例性方法的流程图。
图6显示扁藻属藻类在6个100万升开放池管道系统中的存在。
发明详述
如本文所证明，发明人已开发并创新了系统和方法以研究微拟球藻属藻类对3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲(DCMU)的高抗性。他们发明了用于从多种生长系统保持DCMU敏感性入侵光养生物的系统和方法。此外，发明人定量了培养物受入侵藻类物种污染的程度，包括证明在低水平DCMU存在下，培养物中入侵物种的分数与低光化辐照度下的荧光上升之间有线性关系。此外，发明人鉴定了微拟球藻对DCMU的更高耐受程度的遗传基础。
3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲(“DCMU”)是有效针对大部分已知产氧光养生物的宽范围植物除草剂。其作用模式是通过结合光系统II(“PSII”)上的QB结合口袋来抑制光合电子传递。一旦结合，DCMU阻碍质体醌结合，从而阻止电子从PSII传递出去。
DCMU通常在0.1微摩尔-50微摩尔的浓度范围即时有效。然而，本文中发明人发现微拟球藻属藻类一般需要更高浓度和相对较长孵育期以发生DCMU作用。浓度为100纳摩尔时，微拟球藻在24小时孵育期后似乎对DCMU完全耐受。
图1显示在微拟球藻属藻类(“W2”)上施加50微摩尔量子m-2s-1光化光。
图2显示在小球藻属藻类上施加50微摩尔量子m-2s-1光化光。
就发明人从墨西哥场地受入侵的池分离的小球藻而言，DCMU在100纳摩尔浓度时具有强除草作用。这在图2中得到证明，其中50微摩尔量子m-2s-1光化光完全关闭了小球藻中的PSII反应中心，但对微拟球藻几乎没有影响，如图1所示。
图3是对比图2所示的小球藻属藻类的污染物种百分比的相对荧光上升图。图3中，通过强饱和脉冲期间观察到的相比最大产出荧光的相对荧光上升发现光化光的影响，在用于小球藻培养物的低水平光化光处理期间，微拟球藻培养物中没有出现相同上升。在此，如图3所示，发明人观察到污染藻类程度和荧光上升之间的线性关系。
图4显示微拟球藻(“W2”)对DCMU的更高耐受程度的遗传基础。图4明确地显示相较其它生物而言的微拟球藻中PSII的D1多肽的氨基酸序列。该蛋白质负责结合质体醌并因此结合DCMU。如图4所示，所有产氧光养生物中的D1多肽在氨基酸水平极高度保守，所述产氧光养生物包括高等植物、藻类和蓝细菌。将微拟球藻肽序列与来自其它光养生物的D1序列对齐时，在227-231位明显具有四氨基酸取代(即EDGV)。已知此区域在D1多肽的QB结合口袋中。
图5显示向水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的DCMU的示例性方法500的流程图。
在步骤510中，对水生环境或藻类养殖系统接种微拟球藻(注：若已存在微拟球藻，例如有微拟球藻的现有池、容器、光生物反应器等，则可跳过步骤510)。根据不同的示例性实施方式，所述藻类养殖系统可以是开放池、封闭池和/或光生物反应器。此外，微拟球藻培养可包括一种或多种微拟球藻属种类。户外微拟球藻培养可由添加初始少量的微拟球藻的纯单种藻(几乎不含不需要的污染生物)来起始。如此接种物可在受控环境(如实验室或封闭系统)中产生。
在步骤515中，使微拟球藻在藻类养殖系统中生长。根据不同的实施方式，微拟球藻培养可需要光(天然或人工供给)以供生长和营养提供。其它参数如pH应在可接受范围内。微拟球藻生长通常需要的基本元素可包括碳、氧、氢、氮、硫、磷、钾、镁、铁和痕量的数种其它元素。
可使微拟球藻生长所需的营养物包含在水中，随后在稀释水中供给，或独立于稀释水来供给，所提供的浓度足以使微拟球藻生长并达到所需终密度。产生指定的微拟球藻密度所需的营养物的量可由该营养物的细胞份额确定。即，通过由营养物中所含元素组成的藻类干重百分比来确定。细胞份额的倒数称为该营养物或元素的藻类生长潜力。例如，若所需终密度是1克/升并且考虑微拟球藻种类在其生物质中包含百分之十(10%)的氮(即细胞份额为0.1)，则培养中的氮原子的初始浓度应至少为0.1克/升。可对所有营养物进行相同计算以确立其在培养中的初始浓度。
在不同的实施方式中，可就微拟球藻的生长对用于大量培养藻类的各种系统进行优化。微拟球藻可接触的时间平均光强度可通过设备的混合强度和光学深度变化来调整。在面板形模块光生物反应器中，后者可通过控制2个连续面板间的距离来实行。另一方面，开放池的光学深度可以是所述池的深度。类似地，封闭光生物反应器中的温度可通过间接热交换的方式来精确控制。开放池中，可通过调整培养深度来控制温度。2-10天后，根据光强度、温度和起始接种量，微拟球藻可达到生产操作密度。
一旦微拟球藻生长到所需密度，根据一些实施方式，其可被移出(并可用新接种物来开始新培养)，或可按指定方案或速率进行稀释。在所述第一种情况下，培养可以成批模式进行并可能需要频繁再接种。在所述后一种情况下，培养可根据稀释实行方式以连续或半连续方式进行。例如，假定所需稀释率是每天百分之五十(50%)的培养体积，培养稀释可在数种技术中的一种或多种中发生。培养稀释可以恒定或可变速率在一天(或一天的部分)中连续发生。或者，培养稀释能每天一次地半连续发生(即，每天移出百分之五十(50%)的培养物并在短时间内用新的生长培养基替代)；两天一次半连续发生(即，每天在两个不同时间移出培养物，每次移出百分之二十五(25%)的培养物)；或在一天内以任何其它所需的频率半连续发生。在一些实施方式中，培养稀释可包括从所述生长系统移出微拟球藻培养基(无论在开放池或是封闭光生物反应器中)，并用新鲜培养基替代该部分，所述培养基可包含两次连续稀释间足以供所述微拟球藻生长的全部营养物。
在步骤520中，在所述藻类养殖系统被接种微拟球藻之后和/或所述微拟球藻生长到所需密度之后，可观察所述藻类养殖系统(如用肉眼目测、显微镜观察和/或分析观察，包括取样和样品分析)。可每分钟、每小时、每天、每隔一天、每周三次、每周和/或在任何其它合适的基础进行这种观察或取样。就此过程而言，可关于与实际和/或所需的微拟球藻密度或微拟球藻优势相比的捕食者和/或入侵者的相对水平或量来做出一个或多个确定。
在步骤525中，对藻类养殖系统中的微拟球藻优势是否受到捕食者和/或入侵者的挑战做出确定。根据此确定，可决定是否施加有效量的DCMU。如果捕食者和/或入侵者的水平或量少于指定水平，则可继续观察所述藻类养殖系统而不需施加DCMU。
在步骤530中，若捕食者和/或入侵者的水平或量超过了实际或所需水平，则对所述藻类养殖系统中生长的藻类的密集处施加有效量的DCMU。一个示例性方法是向所述水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲(DCMU)，其中所述藻类包括微拟球藻属。所述藻类还可包括扁藻属和/或小球藻属藻类。有效量的施加可导致所述水生环境中DCMU的大致浓度为100纳摩尔-1500纳摩尔。此外，水生环境可包括海水、淡水或其混合物。
控制水生环境中生长的藻类密度的其它示例性方法可包括对所述水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的DCMU，其中所述藻类包括微拟球藻属，且其中有效量的施加导致所述水生环境中DCMU的大致浓度为100纳摩尔-1500纳摩尔，且其中所述有效量抑制不超过约20%的微拟球藻生长。
控制水生环境中生长的藻类密度的其它示例性方法可包括对在所述水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的DCMU，其中所述藻类包括微拟球藻属，且其中有效量的施加导致所述水生环境中DCMU的大致浓度为0.38微摩尔-1.55微摩尔，且其中所述有效量抑制不超过约20%的微拟球藻生长，且其中DCMU的有效量抑制超过约75%的扁藻生长。
一般而言，如果微拟球藻的密度或优势增加，而同时捕食者和/或入侵者的存在减少，则可推定DCMU的施加有效(即有效方案)。
不同的实施方式可包括向水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的DCMU的系统。所述系统可包括通信接口、计算机可读存储介质和处理器。所述计算机可读存储介质还可包括由处理器执行的指令。所述由处理器执行的指令使处理器向藻类养殖系统中生长的藻类的密集处施加有效量的DCMU。所述处理器可执行本文所述的其它指令，并仍保持在所预期的实施方式的范围内。
另一个实施方式可包括具有计算机可读代码的计算机可读存储介质，所述计算机可读代码用于操作计算机向藻类养殖系统中生长的藻类的密集处施加有效量的DCMU。计算机可读存储介质的示例可包括磁盘、记忆卡、服务器和/或计算机光盘。指令可由处理器检索和执行。指令的一些示例包括软件、程序代码和固件。指令一般在由处理器执行时具有操作性，以指导处理器按本发明实施方式操作。尽管可设置多种模块来实施本文所述的一些或所有的各个步骤，可提供更少或更多的模块，并且仍落在不同实施方式的范围内。
实施例1
图6显示扁藻属藻类在6个100万升开放池管道系统中的存在。发明人在现场研究地使用市售可得的DCMU来杀死顽固性杂草扁藻属藻类。向6个100万升开放池管道系统给予DCMU，其中微拟球藻培养物以每升约270毫克的密度培养。所述池中的扁藻入侵如图6所示，并在表2中以质量百分比定量。所述质量百分比越高，扁藻入侵越高。所述6个100万升开放池管道系统在图6、表1和表2中标为池A1、池A2、池A3、池B1、池B2和池B3。在此时间段内观察到2次扁藻“爆发”，而表1显示有效杀死大部分(如果不是全部)攻击型扁藻的DCMU水平(以克计)。
表1
Figure BDA0000460252050000071
因此，需要少至100克，多至400克。市售DCMU来源是90%质量的DCMU，因此含90克和360克有效量DCMU(M.W.233amu)的100万升体积转换成DCMU浓度分别为0.38微摩尔和1.55微摩尔。
表2
Figure BDA0000460252050000072
Figure BDA0000460252050000081
Figure BDA0000460252050000091
Figure BDA0000460252050000101
注释“D”表示所述池的内容物倾空。
本文的系统和方法可在开放池系统或封闭系统如容器中使用DCMU以杀死或另外抑制微拟球藻以外的光合生物。另外，DCMU可与荧光成像和/或检测联用以定量和/或测定微拟球藻培养物中的污染。DCMU还可用于针对微拟球藻以外的光合生物进行选择，从而能从包含多个藻类物种的水样品中建立微拟球藻培养物。此外，可使微拟球藻D1蛋白的227-231位氨基酸变成进化上保守的序列以改善微拟球藻生长。最后，通过改变光养生物D1蛋白的氨基酸来匹配微拟球藻中的进化部分的变化，光合生物可获得增强的DCMU抗性。
尽管上文已描述了多个实施方式，应理解它们仅通过举例方式呈现，而非构成限制。因此，优选实施方式的广度和范围不应受任何上述示例性实施方式限制。

Claims (20)

1.一种控制水生环境中生长的藻类密度的方法，所述方法包括：
向所述水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲(DCMU)，其中所述藻类包括微拟球藻(Nannochloropsis)属。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藻类包括扁藻(Tetraselmis)属。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述藻类包括小球藻(Chlorella)属。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有效量的施加导致所述水生环境中DCMU的大致浓度为100纳摩尔-1500纳摩尔。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境包括海水。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境包括淡水。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境包括海水和淡水的混合物。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境中DCMU的有效量约为100纳摩尔。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述DCMU的有效量抑制超过约75%的小球藻生长。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述DCMU的有效量抑制超过约75%的扁藻生长。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水生环境是开放池。
12.一种控制水生环境中生长的藻类密度的方法，所述方法包括：
向所述水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的DCMU，其中所述藻类包括微拟球藻属，其中所述有效量的施加导致所述水生环境中DCMU的大致浓度为100纳摩尔-1500纳摩尔，且其中所述有效量抑制不超过约20%的微拟球藻生长。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述水生环境包括海水。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述水生环境包括淡水。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述水生环境包括海水和淡水的混合物。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述DCMU的有效量抑制超过约75%的小球藻生长。
17.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述DCMU的有效量抑制超过约75%的扁藻生长。
18.一种控制水生环境中生长的藻类密度的方法，所述方法包括：
向所述水生环境中生长的藻类的密集处施加有效量的DCMU，其中所述藻类包括微拟球藻属，其中所述有效量的施加导致所述水生环境中DCMU的大致浓度为0.38微摩尔-1.55微摩尔，且其中所述有效量抑制不超过约20%的微拟球藻生长，且其中所述DCMU的有效量抑制超过约75%的扁藻生长。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述水生环境包括海水。
20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述水生环境包括淡水。
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