CN116925983B - 一种钝顶螺旋藻的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微藻培养技术领域，具体涉及一种钝顶螺旋藻的培养方法，所述方法包括将培养至指数生长期的钝顶螺旋藻转入发酵培养基中进行培养，发酵培养基pH为8‑10；发酵培养基组成为：葡萄糖15‑25g/L，碳酸氢钠4‑6g/L，硝酸钠0.5‑1.5g/L，尿素1‑3 g/L，磷酸氢二钾0.1‑0.3g/L，乙二胺四乙酸0.05‑0.15 g/L，豆粕酶解液8‑12g/L，玉米浸渍液8‑12g/L，β‑氨基丁酸0.1‑0.3g/L，5‑氨基乙酰丙酸0.1‑0.3g/L，四水合钼酸铵0.01‑0.05g/L和六水合硝酸钴0.005‑0.01g/L，本发明具有同时提高生物量和蛋白质、叶绿素含量的优点。
Description
技术领域
本发明涉及微藻培养技术领域，具体涉及一种钝顶螺旋藻的培养方法。
背景技术
螺旋藻为蓝藻门颤藻科螺旋藻属的一类原核微藻，具有生长繁殖速度快，细胞中蛋白质、氨基酸、维生素、不饱和脂肪酸、微量元素等营养丰富，促进免疫的特点，已广泛用于食品、医药、养殖动物饲料等领域。目前对螺旋藻高密度养殖的研究多集中在光照、温度、培养液pH、营养元素供给等方面，其生物量和营养成分含量的提高很难取得新的突破。
钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)属于螺旋藻中的一种，是一种营养成分丰富的微型蓝藻，富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素(β-胡萝卜素和玉米黄质)、叶绿素等，特别是β-胡萝卜素的含量是胡萝卜中β-胡萝卜素含量的15倍。钝顶螺旋藻光合效率高、生长繁殖快、对环境适应性强且易采收，是目前工业化规模培养的主要微藻之一。
钝顶螺旋藻的作用比较多，一般最常用也最主要的作用为提高机体免疫力、促进肠胃蠕动、补充机体的常规元素和微量元素。螺旋藻藻蓝蛋白是一种天然的食用色素、浴于水，不溶于油脂和醇类，是一种蓝色粉末。具有抗癌、促进细胞再生的功能、可作为高级的天然色素。螺旋藻多糖是螺旋藻细胞内的一种水溶性多糖，具有抗肿瘤、抗辐射、抗突变等生物活性，能提高机体细胞和体液的免疫功能，抵制癌细胞增殖，减轻辐射所引起的遗传损伤等，在防癌、抗衰老、增强机体免疫力等方面具有广阔的应用前景。研究可显著提高钝顶螺旋藻营养物质含量的方法具有潜在的应用空间。
申请号为CN201910625341.0的中国发明专利公开了一种可显著提高钝顶螺旋藻生长速度和营养物质含量的方法，包括1)以含有灭活的细菌发酵菌液的基础培养基培养钝顶螺旋藻至对数生长期后期，滤出藻液并获得藻泥；2)以含有乙醇和β-紫罗兰酮的优化培养基对上述藻泥进行第一阶段优化培养，采用单色光联合照射培养获得含有游动细胞的钝顶螺旋藻；3)另取优化培养基中加入富里酸，将步骤2)的钝顶螺旋藻以藻泥形式获取后在优化培养基中进行第二阶段培养，使至少部分游动细胞转化为不动细胞。本方法一定程度上促进了钝顶螺旋藻的生长繁殖，强化营养物质的富集，特别是诱导钝顶螺旋藻产β-胡萝卜素、多糖等营养物质，但并未进行提高蛋白质和叶绿素产量方面的研究。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足而提供一种同时提高生物量和蛋白质、叶绿素含量的钝顶螺旋藻的培养方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种钝顶螺旋藻的培养方法，包括以下步骤：
将培养至指数生长期的钝顶螺旋藻转入发酵培养基中进行培养，发酵培养基pH为8-10；
发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，碳酸氢钠4-6g/L，硝酸钠 0.5-1.5g/L，尿素1-3 g/L，磷酸氢二钾0.1-0.3g/L，乙二胺四乙酸0.05-0.15 g/L，豆粕酶解液8-12g/L，玉米浸渍液8-12g/L，β-氨基丁酸0.1-0.3g/L，5-氨基乙酰丙酸0.1-0.3g/L，四水合钼酸铵0.01-0.05g/L和六水合硝酸钴0.005-0.01g/L。
优选地，发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，碳酸氢钠5g/L，硝酸钠 1g/L，尿素2 g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，乙二胺四乙酸0.1 g/L，豆粕酶解液10g/L，玉米浸渍液10g/L，β-氨基丁酸0.2g/L，5-氨基乙酰丙酸0.2g/L，四水合钼酸铵0.03g/L和六水合硝酸钴0.008g/L。
优选地，所述豆粕酶解液的制备工艺如下：
将豆粕加水后加入大豆水解酶进行酶解，灭酶后即得。
更优选地，豆粕加水后得到混合溶液，豆粕在混合溶液中的质量百分比为20-25%。
更优选地，大豆水解酶在混合溶液中的质量百分比为0.3-0.5%。
即豆粕与大豆水解酶的质量比为20-25:0.3-0.5。
更优选地，所述大豆水解酶包括木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶中的至少一种。
更优选地，所述大豆水解酶包括木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶。
更优选地，木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为1：3：1。
更优选地，酶解温度为54-56℃，酶解时间为8-10小时。
更优选地，灭酶温度为80-90℃，灭酶时间10-15分钟。
优选地，所述培养至指数生长期的具体操作包括藻种活化和扩大种瓶培养。
藻种活化和扩大种瓶培养阶段均采用种瓶培养基进行培养，区别仅在于两个阶段的装液量不同，藻种活化阶段采用200mL装液量的种瓶培养基进行培养，扩大种瓶培养阶段采用2L装液量的种瓶培养基进行培养。
更优选地，所述藻种活化的具体操作为：将钝顶螺旋藻细胞置于光照强度2000-4000lx，温度28-30℃条件下，在种瓶培养基中培养2-3d，得到活化好的藻细胞。
更优选地，所述藻种活化过程中，接种量为3-5%（体积百分比）。
更优选地，所述扩大种瓶培养的具体操作为：将活化好的藻细胞转接至种瓶培养基中扩大培养，培养至OD560值为0.6-1.5。
更优选地，所述扩大种瓶培养过程中，接种量为15-20%（体积百分比）。
更优选地，所述种瓶培养基的组成为：碳酸氢钠10-15g/L、硝酸钠1-3g/L，尿素1-3g/L、磷酸氢二钾0.2-0.5g/L，乙二胺四乙酸0.1-0.3g/L，豆粕酶解液10-20g/L，玉米浸渍液5-10g/L，四水合钼酸铵0.03-0.08g/L和六水合硝酸钴0.005-0.008g/L。
更优选地，所述种瓶培养基的组成为：碳酸氢钠15g/L、硝酸钠1g/L，尿素2g/L、磷酸氢二钾0.2g/L，乙二胺四乙酸0.1g/L，豆粕酶解液10g/L，玉米浸渍液10g/L，四水合钼酸铵0.03g/L和六水合硝酸钴0.008g/L。
本发明的有益效果是：
本发明在Zarrouk培养基的基础上进行改进，在发酵培养基中添加β-氨基丁酸和5-氨基乙酰丙酸，添加很少的量就可以促进钝顶螺旋藻的生长和光合作用，明显提高生物量、叶绿素含量和蛋白质含量。
本发明添加豆粕酶解液和玉米浸渍液，代替培养基中的中微量元素和维生素，如：硫酸镁、氯化锰、硫酸锌、硫酸铜、VB1、生物素等，降低了成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
以下各实施例和对比例中，木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶品牌为东恒华道。
玉米浸渍液购自济宁一泉生物制品有限公司。
实施例1
1.藻种活化：在无菌条件下，用接种环挑取钝顶螺旋藻细胞接种到200mL含有种瓶培养基的液体种瓶中，置于光照强度4000lx，温度30℃的光照培养箱中，培养3d。
2.扩大种瓶培养：步骤1中活化好的藻细胞转接至2L含有种瓶培养基的液体种瓶扩大培养。培养至OD560值为1.0时，再转接到25L含发酵培养基的光照培养器中进行培养。光照4000lx、温度29℃，pH自然、通气量1vvm。
种瓶培养基：
碳酸氢钠（NaHCO3）15g/L、硝酸钠（NaNO3） 1g/L，尿素2 g/L、磷酸氢二钾（K2HPO4）0.2g/L，乙二胺四乙酸（EDTA）0.1 g/L，豆粕酶解液10g/L，玉米浸渍液10g/L，四水合钼酸铵（NH4)6Mo7O24· 4H2O）0.03g/L，六水合硝酸钴（Co(NO3)2·6H2O）0.008g/L。
发酵培养基：
葡萄糖20g/L，碳酸氢钠（NaHCO3）5g/L，硝酸钠（NaNO3） 1g/L，尿素2 g/L，磷酸氢二钾（K2HPO4）0.2g/L， 乙二胺四乙酸（EDTA）0.1 g/L，豆粕酶解液10g/L，玉米浸渍液10g/L，β-氨基丁酸0.2g/L，5-氨基乙酰丙酸0.2g/L，四水合钼酸铵（NH4)6Mo7O24· 4H2O）0.03g/L，六水合硝酸钴（Co(NO3)2·6H2O）0.008g/L，氢氧化钾调整pH至8.0。
豆粕酶解液制备流程：豆粕粉碎后加水至底物浓度20%，加入专用大豆水解酶（木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶，三者质量比为1：3：1）0.3%，保持55℃，连续搅拌水解9小时，升温到80℃灭酶15分钟。
实施例2
1.藻种活化：在无菌条件下，用接种环挑取钝顶螺旋藻细胞接种到200mL含有种瓶培养基的液体种瓶中，置于光照强度3000lx，温度26℃的光照培养箱中，培养2d。
2.扩大种瓶培养：步骤1中活化好的藻细胞转接至2L含有种瓶培养基的液体种瓶扩大培养。培养至OD560值为0.6时，再转接到25L含发酵培养基的光照培养器中进行培养。光照5000lx、温度30℃，pH自然、通气量1vvm。
种瓶培养基：
碳酸氢钠（NaHCO3）10g/L、硝酸钠（NaNO3） 3g/L，尿素1 g/L、磷酸氢二钾（K2HPO4）0.5g/L，乙二胺四乙酸（EDTA）0.3 g/L，豆粕酶解液20g/L，玉米浸渍液5g/L，四水合钼酸铵（NH4)6Mo7O24· 4H2O）0.08g/L，六水合硝酸钴（Co(NO3)2·6H2O）0.005g/L。
发酵培养基：
葡萄糖15g/L，碳酸氢钠（NaHCO3）4g/L，硝酸钠（NaNO3） 0.5g/L，尿素1 g/L，磷酸氢二钾（K2HPO4）0.1g/L， 乙二胺四乙酸（EDTA）0.05 g/L，豆粕酶解液8g/L，玉米浸渍液8g/L，β-氨基丁酸0.1g/L，5-氨基乙酰丙酸0.1g/L，四水合钼酸铵（NH4)6Mo7O24· 4H2O）0.01g/L，六水合硝酸钴（Co(NO3)2·6H2O）0.005g/L，氢氧化钾调整pH至10.0。
豆粕酶解液制备流程：豆粕粉碎后加水至底物浓度25%，加入专用大豆水解酶（木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶，三者质量比为1：3：1）0.5%，保持54℃，连续搅拌水解8小时，升温到90℃灭酶10分钟。
实施例3
1.藻种活化：在无菌条件下，用接种环挑取钝顶螺旋藻细胞接种到200mL含有种瓶培养基的液体种瓶中，置于光照强度4000lx，温度30℃的光照培养箱中，培养3d。
2.扩大种瓶培养：步骤1中活化好的藻细胞转接至2L含有种瓶培养基的液体种瓶扩大培养。培养至OD560值为1.5时，再转接到25L含发酵培养基的光照培养器中进行培养。光照4000lx、温度30℃，pH自然、通气量1vvm。
种瓶培养基：
碳酸氢钠（NaHCO3）15g/L、硝酸钠（NaNO3） 1g/L，尿素3 g/L、磷酸氢二钾（K2HPO4）0.2g/L，乙二胺四乙酸（EDTA）0.1 g/L，豆粕酶解液10g/L，玉米浸渍液10g/L，四水合钼酸铵（NH4)6Mo7O24· 4H2O）0.03g/L，六水合硝酸钴（Co(NO3)2·6H2O）0.008g/L。
发酵培养基：
葡萄糖25g/L，碳酸氢钠（NaHCO3）6g/L，硝酸钠（NaNO3） 1.5g/L，尿素3 g/L，磷酸氢二钾（K2HPO4）0.3g/L， 乙二胺四乙酸（EDTA）0.15 g/L，豆粕酶解液12g/L，玉米浸渍液12g/L，β-氨基丁酸0.3g/L，5-氨基乙酰丙酸0.3g/L，四水合钼酸铵（NH4)6Mo7O24· 4H2O）0.05g/L，六水合硝酸钴（Co(NO3)2·6H2O）0.01g/L，氢氧化钾调整pH至9.0。
豆粕酶解液制备流程：豆粕粉碎后加水至底物浓度23%，加入专用大豆水解酶（木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶，三者质量比为1：3：1）0.4%，保持56℃，连续搅拌水解10小时，升温到85℃灭酶12分钟。
对比例1
与实施例1的区别仅在于发酵培养基中不添加豆粕酶解液和玉米浸渍液，其余条件均相同。
对比例2
与实施例1的区别仅在于发酵培养基中不添加豆粕酶解液，其余条件均相同。
对比例3
与实施例1的区别仅在于发酵培养基中不添加玉米浸渍液，其余条件均相同。
对比例4
与实施例1的区别仅在于发酵培养基替换为Zarrouk培养基，其余条件均相同。Zarrouk培养基成分：NaHCO316.8g/L、NaNO32.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、K2HPO40.5g/L 、NaCl 1.0g/L 、K2SO41.0g/L、 FeSO4·7H2O 0.01g/L、EDTA 0.08 g/L、CaCl20.08g/L、H3BO30.006g/L、(NH4)6Mo7O240.00004g/L、MnCl2·4H2O 0.0036g/L、CuSO4·5H2O 0.00016g/L、 ZnSO4·7H2O 0.00044g/L。
对比例5
与实施例1的区别仅在于发酵培养基中不添加β-氨基丁酸和5-氨基乙酰丙酸，其余条件均相同。
测试例1生物量测试
取实施例1-3、对比例1-4发酵培养0、2、4、6、8、10h时得到的发酵藻液测定OD560值，结果如表1所示，对比例4作为对照组。
表1
由表1可知，对比例4作为对照组采用Zarrouk培养基进行发酵，0h的OD560值为0.35，10h的OD560值为2.98。
实施例1-实施例3的OD560值在0h和10h分别高于对照组，说明本发明的发酵培养基在提高生物量方面效果明显。
对比例1与实施例1相比同时不添加豆粕酶解液和玉米浸渍液，结果对比例1的OD560值在0h和10h分别明显低于实施例1，说明豆粕酶解液和玉米浸渍液可能对提高生物量具有显著影响。
本发明通过设置对比例2-对比例3与实施例1对比，来进一步分析豆粕酶解液和玉米浸渍液的作用。对比例2与实施例1相比不添加豆粕酶解液，对比例3与实施例1相比不添加玉米浸渍液，结果对比例2和对比例3的OD560值在0h和10h均明显低于实施例1，说明豆粕酶解液和玉米浸渍液对提高生物量均具有显著影响。
测试例2研究5-氨基乙酰丙酸的添加量对叶绿素含量的影响
各试验组与对比例5的区别仅在于发酵培养基中5-氨基乙酰丙酸的添加量不同，分别为0g/L（对比例5，记为对照组）、0.1g/L（试验组1）、0.2g/L（试验组2）、0.3g/L（试验组3）、0.4g/L（试验组4），其余条件均相同，发酵培养3天后，测得叶绿素含量如表2所示。
表2
由表2可知，对比例5作为对照组没有添加β-氨基丁酸和5-氨基乙酰丙酸，叶绿素含量仅为0.6%。
试验组1-试验组4在对照组的基础上分别添加了不同量的5-氨基乙酰丙酸，结果叶绿素含量与对照组相比均有所提升，说明5-氨基乙酰丙酸对叶绿素含量影响显著。在0.1g/L-0.3g/L添加量范围内，叶绿素含量随着5-氨基乙酰丙酸添加量的提高而提高。但是当5-氨基乙酰丙酸添加量提高到0.4g/L时，叶绿素含量不再增长。
实施例1-实施例3在对照组的基础上同时添加了不同量的5-氨基乙酰丙酸和β-氨基丁酸，叶绿素含量与对照组相比均有所提升。同时，在5-氨基乙酰丙酸添加量相同的条件下，实施例1-实施例3与试验组1-试验组3的区别分别仅在于实施例1-实施例3还添加了β-氨基丁酸，结果实施例1-实施例3的叶绿素含量分别高于相同5-氨基乙酰丙酸添加量的试验组，说明除了5-氨基乙酰丙酸外，β-氨基丁酸对叶绿素含量也有一定的影响。
测试例3研究β-氨基丁酸的添加量对蛋白质含量的影响
各组与对比例5的区别仅在于发酵培养基中β-氨基丁酸的添加量不同，分别为0g/L（对比例5，记为对照组）、0.05g/L（试验组1）、0.1g/L（试验组2）、0.15g/L（试验组3）、0.2g/L（试验组4）、0.25g/L（试验组5），其余条件均相同，发酵培养3天后，测得蛋白质含量如表3所示。
表3
由表3可知，对比例5作为对照组没有添加β-氨基丁酸和5-氨基乙酰丙酸，蛋白质含量仅为41%。
试验组1-试验组5在对照组的基础上分别添加了不同量的β-氨基丁酸，结果蛋白质含量与对照组相比均有所提升，说明β-氨基丁酸对蛋白质含量影响显著。在0.05g/L-0.2g/L添加量范围内，蛋白质含量随着β-氨基丁酸添加量的提高而提高。但是当β-氨基丁酸添加量提高到0.25g/L时，蛋白质含量不再增长。
实施例1-实施例3在对照组的基础上同时添加了不同量的β-氨基丁酸和5-氨基乙酰丙酸，蛋白质含量与对照组相比均有所提升。同时，在β-氨基丁酸添加量相同的条件下，实施例1-实施例2与试验组4、试验组2的区别分别仅在于实施例1-实施例2还添加了5-氨基乙酰丙酸，结果实施例1-实施例2的蛋白质含量分别高于相同β-氨基丁酸添加量的试验组4、试验组2，说明除了β-氨基丁酸外，5-氨基乙酰丙酸对蛋白质含量也有一定的影响。
测试例4研究5-氨基乙酰丙酸的添加量对叶绿素含量的影响
各试验组与对比例4的区别仅在于发酵培养基中5-氨基乙酰丙酸的添加量不同，分别为0g/L（对照组，即对比例4）、0.1g/L（试验组1）、0.2g/L（试验组2）、0.3g/L（试验组3）、0.4g/L（试验组4），其余条件均相同，发酵培养3天后，测得叶绿素含量如表4所示。
表4
由表4可知，对比例4作为对照组采用Zarrouk培养基进行发酵，叶绿素含量仅为0.6%。
试验组1-试验组4在对照组的基础上分别添加了不同量的5-氨基乙酰丙酸，结果叶绿素含量与对照组相比均有所提升，说明5-氨基乙酰丙酸对叶绿素含量影响显著。在0.1g/L-0.3g/L添加量范围内，叶绿素含量随着5-氨基乙酰丙酸添加量的提高而提高。但是当5-氨基乙酰丙酸添加量提高到0.4g/L时，叶绿素含量不再增长。
测试例5研究β-氨基丁酸的添加量对蛋白质含量的影响
各组与对比例4的区别仅在于发酵培养基中β-氨基丁酸的添加量不同，分别为0g/L（对照组，即对比例4）、0.05g/L（试验组1）、0.1g/L（试验组2）、0.15g/L（试验组3）、0.2g/L（试验组4）、0.25g/L（试验组5），其余条件均相同，发酵培养3天后，测得蛋白质含量如表5所示。
表5
由表5可知，对比例4作为对照组采用Zarrouk培养基进行发酵，蛋白质含量仅为41%。
试验组1-试验组5在对照组的基础上分别添加了不同量的β-氨基丁酸，结果蛋白质含量与对照组相比均有所提升，说明β-氨基丁酸对蛋白质含量影响显著。在0.05g/L-0.25g/L添加量范围内，蛋白质含量随着β-氨基丁酸添加量的提高而提高。
测试例6研究对比例1-3对蛋白质含量、叶绿素含量的影响
发酵培养3天后，测得蛋白质含量和叶绿素含量如表6所示。
表6
表6中，对比例1与实施例1相比同时不添加豆粕酶解液和玉米浸渍液，结果对比例1的蛋白质含量和叶绿素含量明显低于实施例1，说明豆粕酶解液和玉米浸渍液可能对提高蛋白质含量和叶绿素含量具有显著影响。
本发明通过设置对比例2-对比例3与实施例1对比，来进一步分析豆粕酶解液和玉米浸渍液的作用。对比例2与实施例1相比不添加豆粕酶解液，对比例3与实施例1相比不添加玉米浸渍液，结果对比例2和对比例3的蛋白质含量和叶绿素含量均明显低于实施例1，说明豆粕酶解液和玉米浸渍液对提高蛋白质含量和叶绿素含量均具有显著影响。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种钝顶螺旋藻的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
将培养至指数生长期的钝顶螺旋藻转入发酵培养基中进行培养，发酵培养基pH为8-10；
发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，碳酸氢钠4-6g/L，硝酸钠 0.5-1.5g/L，尿素1-3g/L，磷酸氢二钾0.1-0.3g/L，乙二胺四乙酸0.05-0.15 g/L，豆粕酶解液8-12g/L，玉米浸渍液8-12g/L，β-氨基丁酸0.1-0.2g/L，5-氨基乙酰丙酸0.1-0.3g/L，四水合钼酸铵0.01-0.05g/L和六水合硝酸钴0.005-0.01g/L；
所述豆粕酶解液的制备工艺如下：将豆粕加水后加入大豆水解酶进行酶解，灭酶后即得；所述大豆水解酶由木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶和风味蛋白酶组成，三者质量比为1：3：1；酶解温度为54-56℃，酶解时间为8-10小时；所述豆粕与大豆水解酶的质量比为20-25:0.3-0.5；灭酶温度为80-90℃，灭酶时间10-15分钟。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养至指数生长期的具体操作包括藻种活化和扩大种瓶培养。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述藻种活化的具体操作为：将钝顶螺旋藻细胞置于光照强度2000-4000lx，温度28-30℃条件下，按照接种量3-5%在种瓶培养基中培养2-3d，得到活化好的藻细胞。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述扩大种瓶培养的具体操作为：将活化好的藻细胞按照接种量15-20%转接至种瓶培养基中扩大培养，培养至OD560值为0.6-1.5。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述种瓶培养基的组成为：碳酸氢钠10-15g/L、硝酸钠1-3g/L，尿素1-3g/L、磷酸氢二钾0.2-0.5g/L，乙二胺四乙酸0.1-0.3g/L，豆粕酶解液10-20g/L，玉米浸渍液5-10g/L，四水合钼酸铵0.03-0.08g/L和六水合硝酸钴0.005-0.008g/L。
6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，碳酸氢钠5g/L，硝酸钠 1g/L，尿素2 g/L，磷酸氢二钾0.2g/L，乙二胺四乙酸0.1 g/L，豆粕酶解液10g/L，玉米浸渍液10g/L，β-氨基丁酸0.2g/L，5-氨基乙酰丙酸0.2g/L，四水合钼酸铵0.03g/L和六水合硝酸钴0.008g/L。
7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述种瓶培养基的组成为：碳酸氢钠15g/L、硝酸钠1g/L，尿素2g/L、磷酸氢二钾0.2g/L，乙二胺四乙酸0.1g/L，豆粕酶解液10g/L，玉米浸渍液10g/L，四水合钼酸铵0.03g/L和六水合硝酸钴0.008g/L。
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