CN116324408A - 分泌α-突触核蛋白靶向抗体、颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原及两者的复合物以及GDNF的细胞系 - Google Patents

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Abstract

一种包含哺乳动物细胞系的细胞培养物，所述细胞系被修饰以表达由颗粒蛋白前体多肽和鞘脂激活蛋白原多肽组成的异二聚体。

Description

分泌α-突触核蛋白靶向抗体、颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白 原及两者的复合物以及GDNF的细胞系
关于联邦政府资助的研究和开发中的发明权利的声明
本发明没有得到美国政府的赞助。
关于构成本申请的一部分的序列表的声明
本申请包含以电子形式提交的ASCII格式的序列表，其全部内容通过引用并入本文。所述创建于2020年5月15日的ASCII副本被命名为P9590US00_ST25.txt，大小为144,484字节。
技术领域
本发明涉及用于新的生物标志物和治疗的方法和组合物，包括但不限于重组蛋白和基因基和细胞基的疗法，特别是用于递送以不同方式组合的颗粒蛋白前体(progranulin)、鞘脂激活蛋白原(prosaposin)、颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物(本文也称为“颗粒蛋白前体/鞘脂激活蛋白原复合物”)、α-突触核蛋白靶向抗体及其神经修复因子(包括但不限于神经修复因子GDNF)的组合疗法，用于治疗神经退行性疾病和溶酶体贮积症。在另一方面，本发明涉及表达α-突触核蛋白靶向抗体、GDNF、颗粒蛋白前体、鞘脂激活蛋白原、颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物的细胞系，该细胞系的制备方法，在例如人血清和CSF中监测该细胞系的方法，以及这两种重组因子作为治疗剂或在作为用于将α-突触核蛋白靶向抗体、GDNF、颗粒蛋白前体、鞘脂激活蛋白原和颗粒蛋白前体/鞘脂激活蛋白原复合物递送至患者的可植入细胞装置内的细胞系的用途。
背景技术
额颞痴呆(FTD)是一种神经障碍，其特征在于通过结构性磁共振成像或正电子发射断层扫描可见到额叶和/或前颞叶萎缩。据估计，FTD占所有痴呆症病例的10％-20％。它被认为是最常见的老年前期痴呆之一，每100,000人中有15-22人患此病。体征和症状通常出现在成年后期，通常在45至65岁之间。体征和症状通常包括社会行为和品行的一种或多种变化、社会意识丧失和冲动控制能力差、言语理解能力受损、进行性非流利性失语症和行为的显著变化。随着疾病的发展，患者可能会出现与阿尔茨海默病类似的症状，例如执行功能和工作记忆的丧失。目前，除了控制行为症状(典型的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂)的治疗外，没有治愈FTD的方法。
FTD的一种机制是粒蛋白(GRN)基因的突变。GRN的单倍剂量不足(haploinsufficiency)很容易监测，因为颗粒蛋白的前体形式颗粒蛋白前体(PGRN)的细胞外水平降低，通常导致遗传形式的FTD，PGRN的完全丧失，也导致溶酶体贮积症，神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)。细胞外PGRN被神经元吸收并通过不同的机制转运至溶酶体。PGRN还促进神经元吸收和鞘脂激活蛋白原(PSAP)的溶酶体递送，鞘脂激活蛋白原是溶酶体鞘糖脂(glycosphingolipid)降解必不可少的皂化蛋白(saposin)肽的前体。此外，PGRN突变神经元具有降低的溶酶体GCase活性、脂质积聚和增加的不溶性α-突触核蛋白。来自FTD患者的脑组织样本显示，神经元中的PSAP水平降低。由于GRN突变，细胞吸收细胞外PGRN减少和PGRN介导的PSAP溶酶体运输减少可能是NCL和FTD潜在的疾病机制。为此，没有人监测到或表征到血浆或CSF中的PGRN/PSAP复合物，以及疾病中其表达水平可能改变到何种程度。本领域需要特定的测定法来确定分别作为单个流体生物标志物和途径生物标志物分布的PGRN、PSAP和/或PGRN/PSAP的绝对和相对水平，用于诊断、预后、治疗和监测治疗响应。
除了调节彼此的表达水平，PGRN和PSAP还在物理上相互作用，以促进彼此的溶酶体运输，PGRN-PSAP相互作用对维持大脑中正常的溶酶体功能很重要。然而，迄今为止，还没有人表明细胞外PGRN或PGRN-PSAP复合物的补充可以预防或治疗NCL和FTD。本领域需要有效的方法来产生PGRN-PSAP复合物，该方法还允许将这些分子实体转运至大脑，在那里它们可以防止神经退行性疾病。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及表达一种或多种α-突触核蛋白靶向抗体或抗体片段，和/或颗粒蛋白前体，和/或鞘脂激活蛋白原，和/或GDNF及其亚肽和衍生物的细胞系。在优选的实施方案中，细胞系被基因修饰以同时产生这些因子，例如，通过将质粒插入细胞系中。在各种实施方案中，α-突触核蛋白靶向抗体/片段、GDNF和颗粒蛋白前体以及鞘脂激活蛋白原被表达为多肽、亚肽、RNA或胞外RNA。
许多不同的细胞类型可以被包封在根据本发明的装置中。这些包括众所周知的、可公开获得的永生化细胞系、自发永生化细胞系以及分裂的原代细胞培养物。在一些实施方案中，由于要转染或转导细胞系，必须选择、扩增克隆并建立细胞库，优选地，细胞或细胞系能够经历大量分裂。
具有长期增殖潜力的细胞系可以由多种细胞产生，包括祖细胞和/或前体细胞。同样合适的是干细胞，包括多能和专能干细胞、胚胎干细胞、神经干细胞和造血干细胞。
本发明的细胞系包括小鼠骨髓瘤细胞(NS0)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)；CHO-K1；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠成纤维细胞-3T3细胞；非洲绿猴细胞系(包括COS-1、COS-7、BSC-1、BSC-40、BMT-10和Vero)；间叶性软骨肉瘤-1(MCS)；大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12和PC12A)；AT3，大鼠神经胶质肿瘤(C6)；大鼠神经元细胞系RN33b；大鼠海马细胞系HiB5；生长因子扩增的干细胞；表皮生长因子(EGF)-响应性神经球；衍生自哺乳动物CNS的碱性成纤维细胞生长因子-响应性(bFGF-响应性)神经干细胞；胎儿细胞；原代成纤维细胞；施旺细胞(Schwanncells)；星形胶质细胞；β-TC(ATCC CRL-11506)细胞；人肝癌细胞系Hep-G2纹状体细胞；少突胶质细胞及其前体；小鼠成肌细胞-C2C12；人神经胶质衍生细胞-Hs683；人神经胶质衍生细胞-A172；HEI193T细胞系；猪成胶质细胞；神经元细胞；神经元；星形胶质细胞；中间神经元；从人长骨分离的成软骨细胞；人胚肾细胞293(HEK293)；人细胞系HeLa；兔角膜衍生细胞(Statens Seruminstitut兔角膜(SIRC))；人角膜衍生细胞、人脉络丛细胞、人诱导多能干细胞(iPS)细胞衍生细胞系、人神经营养蛋白3(NT3)细胞、ARPE-19、CAC细胞、永生化人成纤维细胞(MDX细胞)、端粒酶永生化人RPE细胞系例如hTERT RPE-1、间充质干细胞(MSC)。
用于哺乳动物重组生产的优选细胞系包括ARPE-19、CHO、CHO-1、HEI193T、HEK293、COS、NS0、C2C12和BHK细胞。
在优选的实施方案中，细胞系包含至多四种表达构建体；表达编码颗粒蛋白前体的颗粒蛋白前体多肽、颗粒蛋白前体基因、颗粒蛋白前体RNA或胞外RNA的第一表达构建体，表达编码鞘脂激活蛋白原的鞘脂激活蛋白原多肽、鞘脂激活蛋白原基因、鞘脂激活蛋白原RNA或胞外RNA的第二表达构建体，以及表达编码α-突触核蛋白抗体或抗体片段的基因、RNA或胞外RNA的第三表达构建体，和表达编码GDNF的GDNF RNA或胞外RNA的第四表达构建体。在本发明的一个实施方案中，表达构建体包含质粒。在另一个实施方案中，质粒可以包含转座子系统，例如睡美人转座酶(Sleeping beauty transposase)。
由本发明的细胞系产生的颗粒蛋白前体或鞘脂激活蛋白原可进一步包含抗体的片段可结晶区(Fc区)，用于增强颗粒蛋白前体、鞘脂激活蛋白原和颗粒蛋白前体/鞘脂激活蛋白原复合物在中枢神经系统中的分布和吸收。在各种实施方案中，鞘脂激活蛋白原-Fc或颗粒蛋白前体-Fc区组合包含融合蛋白、融合基因或融合RNA。
由本发明的细胞系表达的颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原通常在从细胞系分泌之前或之后形成复合物。这种复合物可能是颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的异二聚体。
在本发明的一个实施方案中，本发明的细胞系进一步表达刺激从细胞系中分泌颗粒蛋白前体或鞘脂激活蛋白原的因子。
在优选的实施方案中，本发明的细胞系包含在可植入细胞装置中，然后将该可植入细胞装置插入需要治疗的患者体内。这种细胞装置的实例通常可以在美国专利8,741,340；9,121,037；9,364,427；9,669,154；9,884,023；10,835,664和10,888,526中找到，所有这些文献通过引用并入本文。当植入患者体内时，这种装置允许由细胞系分泌的α-突触核蛋白抗体或抗体片段、颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原以及GDNF被有效地递送给患者，而不需要重复的创伤。由于这些因子是连续生产的，因此不需要关注制剂缓冲液和蛋白质的稳定性。稳定的细胞系也被认为是单一的药物，同时分泌一种以上的效应分子，这允许在难以治疗的疾病中进行新的治疗干预。
在优选的实施方案中，可植入的细胞装置包括半渗透膜，所述半渗透膜允许位于所述可植入的细胞装置内的细胞系分泌的分子通过所述膜扩散。在另一个实施方案中，半渗透膜是免疫隔离的，以保护其中的细胞系免受患者免疫系统的影响。在另一个优选的实施方案中，可植入的细胞装置包括置于半渗透膜内的基质，以促进封闭在其中的细胞系的有效生长和存活。
在实施方案中，可植入细胞装置可进一步包括将该装置植入需要治疗的患者体内的构件。该植入构件可以是导管。该装置可植入患者体内不同的组织区室，优选鞘内、脑室内或脑内。植入的优选靶标包括患者的纹状体、椎管和蛛网膜下腔。
在实施方案中，可植入的细胞装置可进一步包含载体，以促进α-突触核蛋白抗体或抗体片段、颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原从细胞系递送至患者体内的所需位置。在各种实施方案中，载体是泵或注射器或相关的导管系统。
本发明的细胞系可用于治疗神经系统疾病或障碍，特别是溶酶体贮积症或神经退行性疾病，所述疾病是以多种病理为特征的障碍。可用本发明的细胞系治疗的神经障碍包括但不限于额颞痴呆(FTD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、边缘优势年龄相关TAR DNA结合蛋白-43(TDP-43)脑病(晚期)、路易体痴呆(LBD)、帕金森病(PD)、多系统萎缩(MSA)和溶酶体贮积症。可以使用本发明的细胞系治疗的溶酶体贮积症包括但不限于戈谢病、非典型戈谢病、异染性脑白质营养不良、克拉伯病、京都基因和基因组百科全书(KEGG)病、神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、粘多糖贮积症III和IV、泰-萨克斯病、Farber病及其组合。
由本发明的细胞系产生的α-突触核蛋白抗体或抗体片段和颗粒蛋白前体、鞘脂激活蛋白原以及颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物也可被纯化以用作治疗神经障碍的治疗剂。在该实施方案中，本发明的细胞系可以包含在生物反应器内，以产生大量的α-突触核蛋白抗体或抗体片段、颗粒蛋白前体、鞘脂激活蛋白原和颗粒蛋白前体/鞘脂激活蛋白原复合物。在另一个实施方案中，颗粒蛋白前体和颗粒蛋白前体/鞘脂激活蛋白原复合物通过几种生化和色谱方法纯化，包括但不限于盐沉淀、蛋白A亲和色谱、凝胶过滤和离子交换色谱。在另一个实施方案中，从本发明的细胞系中分离的重组蛋白可以作为治疗剂施用至需要如上定义的有治疗需要的神经障碍患者。在各种进一步的实施方案中，通过使用泵、注射器或导管系统施用治疗剂。
发明人还发现，颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物存在于体液中，因此使得用基于反向免疫的方法(例如识别该复合物的ELISA)进行监测成为可能。细胞外颗粒蛋白前体/鞘脂激活蛋白原复合物水平的绝对水平可能是诊断和监测药物暴露和治疗响应的有用生物标志物。此外，未复合的颗粒蛋白前体或未复合的鞘脂激活蛋白原与患者流体样本中存在的颗粒蛋白前体/鞘脂激活蛋白原复合物的比率可以提供重要的信息，并且可以作为诊断但不限于神经障碍的有用的生物标志物，或者作为评估神经障碍的预后和进展的手段，尤其是在治疗开始后。本申请的生物标志物也可以用于诊断和监测炎性疾病、癌症和肥胖相关的病理。炎性疾病包括但不限于胆石症、脂肪肝、子宫内膜异位症、炎性肠病、哮喘、类风湿性关节炎、慢性消化性溃疡、牙周炎、克罗恩病、鼻窦炎、肝炎、心血管疾病、关节炎、慢性阻塞性肺病、脑炎、脑膜炎、神经炎和胰腺炎。肥胖相关的病理包括但不限于2型糖尿病、1型糖尿病、高脂血症、胰岛素不敏感性、高血糖症、高胰岛素血症、低胰岛素血症、血脂异常、高血压和动脉粥样硬化。
在各种实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或任何其它基于免疫的测定原理，例如电化学发光(诸如Meso Scale
Figure GDA0004234429060000051
技术(Meso Scale/>
Figure GDA0004234429060000052
罗克维尔，MD)，/>
Figure GDA0004234429060000053
技术(QuanterixTM公司，比勒利卡，MA)，/>
Figure GDA0004234429060000054
(同质时间分辨荧光)(Cisbio Bioassays Societe Par Actions Simplifee a Associe Unique France ParcMarcel Boiteux B.P.，Codolet，FR)，/>
Figure GDA0004234429060000055
(/>
Figure GDA0004234429060000056
沃尔瑟姆，MA)和/或邻近连接测定，测定未复合的颗粒蛋白前体、未复合的鞘脂激活蛋白原和颗粒蛋白前体/鞘脂激活蛋白原复合物的浓度，然而，也可使用替代的分析方法。在各种实施方案中，流体样本可以是血浆、脑脊液、唾液、泪滴或尿液。
附图说明
图1说明了来自不同ECB细胞系的条件培养基的PGRN/PSAP和PSAP/PGRN ELISA测定的结果。该测定能够检测来自ARPE-PGRN、ARPE-PGRN+PSAP共转染细胞系和来自FLAGTM-PGRN转染细胞的PGRN/PSAP复合物的存在(黑色箭头)。
图2是来自以下ECB细胞系的交联条件培养基中的PGRN和PSAP的蛋白质印迹：ARPE-19亲代细胞系(A)、PGRN(56)、PSAP(#7)和PGRN+PSAP+scFv81共表达系(D5)。箭头表示存在PGRN/PSAP复合物，这与图1所示的ELISA结果一致。
图3描述了来自过表达人颗粒蛋白前体、人鞘脂激活蛋白原或人鞘脂激活蛋白原+颗粒蛋白前体(ARPE-19细胞/睡美人系统)的培养的包封细胞的条件培养基的ELISA样本。颗粒蛋白前体过表达装置主要分泌单体颗粒蛋白前体，但也分泌颗粒蛋白前体/鞘脂激活蛋白原复合物。鞘脂激活蛋白原过表达装置仅分泌鞘脂激活蛋白原。鞘脂激活蛋白原+颗粒蛋白前体过表达ECB装置主要分泌颗粒蛋白前体/鞘脂激活蛋白原复合物。cl56是颗粒蛋白前体分泌装置，D5是鞘脂激活蛋白原+颗粒蛋白前体+scFv81装置。
图4A-4C图解描绘了来自过表达颗粒蛋白前体或颗粒蛋白前体+鞘脂激活蛋白原+scFv81的ARPE-19细胞的条件培养基的体积排除色谱。将图4A中过表达颗粒蛋白前体+鞘脂激活蛋白原+scFv81的细胞和图4B中过表达颗粒蛋白前体的细胞的原数据合并，图4C显示了仅在来自过表达颗粒蛋白前体的细胞的级分中检测到游离的颗粒蛋白前体，而在来自过表达颗粒蛋白前体+鞘脂激活蛋白原的细胞的条件培养基中，所有分泌的颗粒蛋白前体都与鞘脂激活蛋白原复合。
图5是来自分别分泌FLAGTM标记的scFv和Fc-scFv抗α-突触核蛋白靶向抗体片段的培养装置和细胞系的条件培养基的直接ELISA，以及α-突触核蛋白靶向FLAGTM标记的scFV在选择用于过表达PGRN和PSAP以及α-突触核蛋白靶向FLAGTM标记的scFv81(右上)的细胞系和过表达α-突触核蛋白靶向肽scFv81、scFv113和scFv49的细胞系中的免疫细胞化学结果。对于过表达和分泌Fc-scFv-的细胞，有光亮的是FITC-抗FLAGTM和Alexa
Figure GDA0004234429060000061
647-抗hIgG(Molecular Probes有限公司，Eugene，OR)。
图6A-6E示出了PGRN/PSAP测定，(A)图示了由检测PGRN/PSAP复合物的夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)产生的数据，所述PGRN/PSAP复合物衍生自商业上可获得的体外组装的重组PGRN(研究和诊断系统，明尼阿波利斯，MN)和PSAP(
Figure GDA0004234429060000062
GmbH，台北，中国台湾)(图6B和图6C)，显示PGRN/PSAP复合物存在于人血浆(图6D)和人CSF(图6E)中，并且可以用这些测定监测。这些测定通过捕获PGRN第一图6B或PSAP第一图6C来检测这两种复合物，随后分别检测对PSAP和PGRN具有特异性的抗体。
图7是通过免疫细胞化学分析探测PGRN(左)、溶酶体蛋白GBAl(上中)和PSAP(下中)产生的图像。将人患者原代GBA1-突变体成纤维细胞(上排)和小鼠原代皮质神经元(下排)暴露于纯化的PGRN/PSAP复合物，该复合物来自培养的ARPE-PGRN+PSAP共表达细胞的条件培养基。合并(右栏)显示了PGRN对溶酶体蛋白GBAl的有效细胞内靶向和纯化的PGRN+PSAP复合物对皮质神经元的有效细胞内靶向。
图8A、8B和8C是来自ARPE-PGRN、ARPE-PSAP和ARPE-PGRN+PSAP细胞系的条件培养基和纯化分泌因子的活性的图示。将原代小鼠皮质神经元(图8A和8C)和人原代成纤维细胞(图8B)暴露于来自ARPE-19细胞系(图8A)的条件培养基中，并从来自ARPE-19细胞系(图8B和8C)的条件培养基中纯化PGRN和PGRN/PSAP复合物，并使用光谱法测定GBAl活性。
图9A和9B为植入后二十四(24)周组织病理学显示的PGRN-装置植入安全性的图像。图9A显示了PGRN在植入部位周围的广泛分布(箭头)。图9B显示，通过探测Ki67、GFAP、Ibal和CD3，与对照相比，没有细胞增殖、炎症反应或浸润的T细胞。
图10A-10D描绘了通过挽救纹状体中由α-突触核蛋白驱动的酪氨酸羟化酶阳性神经元损失和行为改善来测量的细胞装置植入的体内活性。图10A是与未经装置处理的大鼠相比，填充有PGRN、PSAP和PGRN-PSAP复合物的装置防止神经元损失的图像选集。图10B图示了TH免疫反应性的光密度分析，表示为同侧和对侧之间的差异。图10B显示TH和α-突触核蛋白IHC染色的实例(α-突触核蛋白过表达通过用携带人α-突触核蛋白基因的AAV9病毒在黑质中单侧注射来诱导)。图10C展示了在黑质中接受单侧AAV9-α-突触核蛋白基因注射的大鼠中，ECB-PGRN如何改善运动功能。图10D显示了在黑质中单侧注射AAV9-α-突触核蛋白基因的大鼠中，ECB-PSAP和ECB-PGRN-PSAP复合物如何改善运动功能。
图11A和图11B描绘了共表达和分泌GDNF+PGRN或GDNF+PSAP或任一单独因子的ARPE细胞的细胞系和体内活性。图11A显示了分别表达GDNF、PSAP和GDNF+PSAP的不同细胞系的GDNF和PSAP的ELISA分析。图11B图示了在6-OHDA模型中对大鼠使用行为测试的自发前肢放置的结果。将含有亲代细胞(安慰剂)或分泌PSAP、PGRN、GDNF和PGRN或GDNF和PSAP的细胞的ECB装置置于纹状体中。将大鼠四肢无支撑悬挂，身体长度与桌子边缘平行。然后，将大鼠提升到桌子的一侧，使所述大鼠的胡须与桌子接触。首次实验的
Figure GDA0004234429060000071
大鼠通常会反应为把前肢放在桌面上。星号表示用安慰剂装置治疗的大鼠。
图12A和12B图示了通过免疫细胞化学探测微管蛋白所观察到的神经突生长的增加，以及衍生自对照和GRN突变携带者的人原代成纤维细胞中颗粒蛋白、鞘脂激活蛋白原、皂化蛋白(saposin)C和GCase活性的增加。用PGRN或PGRN/PSAP补充的细胞培养基增加了每个神经元的平均分枝点数(图12A)和平均神经突长度(图12B)。用PGRN和PGRN/PSAP补充的对照和GRN-突变体衍生成纤维细胞的细胞培养基增加了细胞内颗粒蛋白(图12C)、鞘脂激活蛋白原(12D)、皂化蛋白C(图12E)和GCase活性(图12F)。
图13是来自注射了混合有PGRN-组氨酸的ARPE-PSAP细胞的浓缩条件培养基的大鼠的PGRN和PSAP的脑中的重叠扩散的图像选择。在更高的放大倍数下，在这些大脑中检测到PGRN和PSAP的细胞内共定位，以及组氨酸-样和PSAP-样免疫反应性的细胞内共定位，这表明侧脑室内(ICV)施用的PGRN/PSAP复合物扩散至大脑中并被脑细胞内化。
图14A-14F说明了在小鼠和大鼠中，在ICV施用来自混合有PGRN-组氨酸的ARPE-PSAP细胞的条件培养基后，在脑中的分布、内化和溶酶体靶向(图14A)。在大鼠中ICV施用纯化的PGRN、PGRN/PSAP复合物和PGRN-Fc(图14B-图14D)。在猪中ICV植入分泌PGRN和PGRN/PSAP复合物的装置，然后对脑裂解物进行ELISA分析(图E)，在猪中鞘内施用纯化的PGRN，然后对脑裂解物进行ELISA分析(图F)。通过在小鼠和大鼠中的免疫组织化学(图14A-图D)和通过PGRN ELISA(图14E和图14F)观察施用的PGRN和PSAP。
图15A-图15C图示了在AAV-α-突触核蛋白大鼠帕金森病模型中植入分泌相应治疗剂的包封细胞装置十二(12)周后，PGRN(图15A)、PSAP(图15B)和PGRN+PSAP(图15C)的产生。
图16是用于构建本申请中所用细胞系的pT2.CAn.PGRN质粒图谱的图示。将基因序列插入左侧和右侧反向重复/正向重复元件(IR/DR)之间，并通过睡美人转座酶系统整合至宿主基因组中。在这个实例中，待插入睡美人系统的基因是PGRN、Neo和启动子序列(CA)。质粒序列被描述为SEQ ID NO.1。
具体实施方式
在患有额颞痴呆(FTD)和GRN相关额颞痴呆、与GBAl突变相关的路易体痴呆(LBD/GBA1)、帕金森病(PD)和戈谢病的患者的脑中，由基因GBAl编码的溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCase)的活性降低。恢复GCase活性是这些适应症的主要治疗目标。此外，鞘脂激活蛋白原的突变与常染色体显性遗传的PD有关。类似地，颗粒蛋白前体编码基因的几个破坏性突变与PD相关。细胞外施用的重组颗粒蛋白前体(PGRN)、鞘脂激活蛋白原(PSAP)和重组PGRN+PSAP复合物在人成纤维细胞的溶酶体中被内化并与GCase共定位，并增加原代皮质神经元(FTD、LBD、晚期PD和ALS的靶细胞类型)中的GCase活性。此外，衍生自ARPE-PGRN、ARPE-PSAP和ARPE-PGRN+PSAP细胞的条件培养基，即ECB-PGRN、ECB-PSAP和ECB-PGRN+PSAP疗法的治疗制剂，增加了原代皮质神经元中的GCase活性。数据支持使用重组PGRN、PSAP或PGRN/PSAP或它们相应的ECB疗法来刺激和挽救不同人类疾病中的GCase活性。
对于共核蛋白病(synucleinopathy)LBD和PD，GCase活性降低与α-共核蛋白病理学/路易体病理学发展增加之间存在密切联系。在单一疗法中，将GCase刺激与靶向α-突触核蛋白错误折叠的免疫疗法相结合有很强的理由。重要的是，GCase活性受损的有害结果似乎不限于路易体(LB)的形成，还会以其他方式影响神经元健康，导致致命的后果。事实表明，除了加速路易体形成之外，与没有GBA1突变的PD相比，PD/GBAl中的疾病进展、痴呆发展甚至致死性更具侵袭性和更频繁。因此，作为增强GCase活性与α-突触核蛋白靶向免疫疗法相结合的结果，预期有多种治疗益处。本申请的新型α-突触核蛋白靶向抗体片段被设计成在几个水平上干扰α-突触核蛋白病理发展：抑制聚集、结合多种α-突触核蛋白种类(单体、寡聚体、原纤维)并展示广泛的表位覆盖，以便尽可能有效地阻断α-突触核蛋白病理发展并诱导汇效应(sink effect)。(见方法第7点，其证明了产生分泌PGRN、PSAP和抗α-突触核蛋白靶向抗体片段的克隆ARPE-19细胞系的可行性、证据)。该细胞系证明了在两种PD大鼠动物模型(帕金森α-突触核蛋白和6-OHDA模型)中的8-12周研究中的治疗效果。为此，PGRN、PSAP和PGRN+PSAP+抗α-突触核蛋白疗法对两种模型的行为都有积极影响。如上所述，GCase刺激因子颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原以及抗α-突触核蛋白免疫疗法在PD和LBD病理级联的不同水平上介导神经保护。除了这些活动之外，还需要恢复已经受损的神经元的功能。介导神经修复活性的治疗将补充上述神经保护治疗，以尽可能实现有临床意义的治疗。GDNF是一种分泌因子，已被证明在动物模型和一些患者中介导神经修复活性。所要求保护的发明的一个实施方案涉及一种独特的疗法，该疗法由多种神经保护活性与神经修复活性组合而成，所有这些都在单一疗法中。如图1-16中的数据所示，用下列ECB疗法治疗2-12周后，观察到6-OHDA帕金森病大鼠模型的行为改善：ARPE-PGRN、ARPE-PGRN+PSAP+抗α-突触核蛋白、ARPE-PGRN+GDNF和ARPE-PSAP+GDNF。因此，数据证明了基于共表达几种靶向溶酶体信号传导和神经修复的治疗因子的ARPE细胞系产生有效的ECB疗法的能力。此外，在帕金森氏病/共核蛋白病的大鼠模型、人α-突触核蛋白过表达模型中，也证明了ECB-PGRN、ECB-PSAP和PGRN+PSAP+抗α-突触核蛋白组合的治疗活性(行为改善)，为这五种不同的帕金森病和其它突触核蛋白病疗法提供了临床前概念证明，这得到了图1-16中列出的数据的支持。
GRN相关的额颞痴呆(FTD)是由分泌因子颗粒蛋白前体单倍不足引起的，颗粒蛋白前体通过不同的细胞表面受体介导细胞外和细胞内信号，在溶酶体水平调节多种因子，例如组织蛋白酶D、PSAP和GCase。恢复PGRN信号是GRN相关FTD的主要治疗目标。FTD/GRN中的PGRN缺陷伴随着神经元PSAP水平降低以及GCase活性降低。在FTD/GRN中，细胞内PGRN/PSAP复合物的水平受到何种程度的影响，或者该疾病对细胞外游离PSAP和PGRN/PSAP复合物水平的影响程度尚不清楚。图1-16表明，PGRN与人血浆和CSF中的PSAP复合，因此是与FTD/GRN和涉及PGRN、PSAP和GCase信号传导的其它障碍的诊断密切相关的生物标志物。可以想象，循环PGRN/PSAP的绝对水平和循环PGRN/PSAP与自由循环PGRN和自由循环PSAP的相对比率对于诊断、预后和监测药物暴露和治疗响应都是重要的。PGRN/PSAP存在于CSF中并与人类皮质直接接触的发现是重要的，并证明PGRN和PGRN/PSAP复合物都是主要受影响脑区中内源性细胞外表达的分子，该脑区因FTD/GRN发病机制中PGRN单倍体不足而遭受神经退行性疾病。PGRN和PGRN/PSAP复合物在IT或ICV施用重组蛋白或基于ECB的PGRN和PGRN/PSAP复合物递送后扩散至大脑中。此外，图1-16显示侧脑室内施用的PGRN/PSAP混合物与脑中的神经突共定位。总的来说，图1-16中列出的数据决定性地表明，IT和ICV施用的PGRN、PSAP和PGRN/PSAP复合物有效地从CSF区室扩散至脑和靶神经元中，挽救了细胞内颗粒蛋白、鞘脂激活蛋白原和皂化蛋白C水平以及GCase活性。这些数据支持了对PGRN、PSAP和PGRN/PSAP复合物具有特异性的特定测定的需求，作为旨在刺激和/或恢复疾病中PGRN和PSAP水平和信号的治疗的伴随生物标志物。
PGRN/PSAP复合物介导神经营养活性：图1-16证明了刺激啮齿类原代皮质神经元的轴突生长。PGRN和PSAP都被证明是神经营养因子。图1-16中列出的数据表明并支持使用PGRN/PSAP作为FTD/GRN、FTD/TDP(即患有一般TDP病变(不一定GRN单倍不足)、LBD/GBA1、PD和PD/GBAl和ALS的FTD)的神经保护治疗剂。
神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)是一种由PGRN缺陷(100％缺陷)引起的溶酶体贮积症。细胞外施用的PGRN或PGRN/PSAP复合物被胞内化并定位于溶酶体。此外，来自ARPE-PGRN和ARPE-PGRN+PSAP的条件培养基带来相同的活性，因此，基于ECB的PGRN或PGRN/PSAP的施用被用于挽救NCL中的溶酶体PGRN信号。
在ALS、FTD和AD中，TDP病理是最常见的蛋白质病(proteinopathy)。FTD/GRN中的PGRN缺陷导致TDP病理相关的神经退行性疾病。将ALS/TDP小鼠模型与过表达PGRN的小鼠杂交，得到不太严重的ALS样表型，即PGRN似乎可治疗TDP相关的ALS。基于该现有技术，PGRN/PSAP可用作ALS/TDP以及FTD/TDP和AD的治疗剂。特别是，IT施用PGRN或PGRN/PSAP，靶向脊髓管和皮质，ALS发病机理的关键区域(以及FTD、LBD和AD)，具有作为有效治疗的巨大前景。图1-16中列出的数据显示，IT施用的PGRN和ICV施用的PGRN和PGRN/PSAP复合物扩散至大脑中，并靶向与ALS、FTD、LBD和AD关键相关的区域。还没有人证明PGRN、PSAP或PGRN/PSAP在CSF至脑部的扩散。
实施方案
实施例1：ARPE-PGRN细胞系的产生。
将ARPE-19细胞(
Figure GDA0004234429060000101
马纳萨斯，VA)在F12/DMEM培养基(Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)：营养混合物F-12，Thermo Fisher
Figure GDA0004234429060000102
沃尔瑟姆，MA)(/>
Figure GDA0004234429060000103
产品目录编号31331-028，补充有10％FCS和青霉素/链霉素(PEST))(下文称为“完全培养基”)中生长至70％密度(confluency)。在转染当天，用无血清培养基替换细胞培养基，并用质粒转染细胞，所述质粒在鸡β-肌动蛋白启动子和CMV增强子下组成型表达共有的人颗粒蛋白前体基因。重组表达构建体还含有新霉素选择基因，其侧翼是睡美人转座因子。睡美人转座酶的瞬时表达用于稳定整合PGRN cDNA转基因构建体的拷贝(睡美人转座子系统)。使用/>
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Fugene/>
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转染试剂盒(/>
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公司，麦迪逊市，WI)根据制造商的说明导入质粒。转染后四十八(48)小时，将细胞以1:10的比例分开，并在补充有800μg/ml/>
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(Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000108
沃尔瑟姆，MA)的完全培养基存在下，将细胞接种于10cm2的组织培养皿中，以选择表达新霉素选择标记的克隆。十四(14)天后，收获单个菌落，并在补充有800μg/ml/>
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(Thermo Fisher/>
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沃尔瑟姆，MA)的完全培养基中进行扩增。使用R&D/>
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的抗人PGRN/>
Figure GDA00042344290600001012
试剂盒(R&D
Figure GDA00042344290600001013
明尼阿波利斯，MN)分析不同克隆细胞系的分泌性PGRN。此外，还分析了ARPE-PGRN细胞分泌PGRN/PSAP复合物的情况(见12和13节，PGRN/PSAP复合物监测方法)。包封的ARPE-PGRN细胞分泌PGRN和PGRN/PSAP复合物，如用前述的PGRN和PGRN/PSAP复合物测定(图1)以及通过条件培养基的交联，然后用PGRN-和PSAP-导向的抗体进行蛋白质印迹分析(图2)所确定的。选择ARPE-PGRN克隆#56用于进一步的体外表征，并包封用于体外和体内治疗评价。
实施例2：ARPE-PSAP细胞系的产生。
将ARPE-19细胞(
Figure GDA00042344290600001014
马纳萨斯，VA)在完全培养基中生长至70％密度。在转染当天，将细胞培养基丢弃并用无血清培养基代替。使用/>
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Fugene/>
Figure GDA00042344290600001016
转染试剂盒(
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公司，麦迪逊市，WI)，根据制造商的说明，用编码人PSAP cDNA的质粒(睡美人转座子系统)转染细胞。转染后四十八(48)小时，将细胞以1:10的比例分开，并在补充有800μg/ml/>
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(Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000112
沃尔瑟姆，MA)的完全培养基存在下，将细胞铺在10cm2的组织培养皿中。十四(14)天后，收获单个菌落，并在补充有800μg/ml/>
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(Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000114
沃尔瑟姆，MA)的完全培养基中进行扩增。使用ELISA测定(Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000115
沃尔瑟姆，MA)分析用于分泌PSAP的不同的克隆ARPE-PSAP细胞系，如第11节所述。包封的ARPE-PSAP细胞分泌PSAP，而PGRN和PGRN/PSAP复合物都不能被检测到(图3)。
实施例3：ARPE-PGRN+PSAP细胞系的产生。
将ARPE-19-PGRN#56细胞在完全培养基中生长至70％密度，然后用PSAP编码质粒转染，如第2节所述，不同之处在于PSAP编码质粒具有用潮霉素选择基因替换的G418选择基因。克隆细胞系的产生如上所述完成，除了培养基中包括
Figure GDA0004234429060000116
(Thermo Fisher
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沃尔瑟姆，MA)(800μg/ml)和HygromycinTM(/>
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St.Louis，MO)(500μg/ml)。用ELISA(Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000119
沃尔瑟姆，MA)鉴定表达PGRN和PSAP的克隆细胞系。通过对来自ARPE-PGRN+PSAP细胞的条件培养基的体积排除色谱的不同级分进行分析，评估了包封的ARPE-PGRN+PSAP细胞主要分泌PGRN/PSAP复合物(图4)。
实施例4：α-突触核蛋白靶向ARPE-scFv81细胞系的产生。
将ARPE-19细胞(
Figure GDA00042344290600001110
马纳萨斯，VA)在完全培养基中生长至70％密度。在转染当天，将细胞培养基丢弃并用无血清培养基代替。使用/>
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Figure GDA00042344290600001112
转染试剂盒(
Figure GDA00042344290600001113
公司，麦迪逊市，WI)，根据制造商的说明，用编码构建体(信号肽-scFv81-标记-组氨酸)3)的质粒(睡美人转座子系统)：
Figure GDA00042344290600001114
转染细胞。转染后四十八(48)小时，将细胞以1:10的比例分开，并在补充有800μg/ml
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(Thermo Fisher/>
Figure GDA00042344290600001116
沃尔瑟姆，MA)的完全培养基存在下，将细胞铺在10cm2的组织培养皿中。十四(14)天后，收获单个菌落，并在补充有800μg/ml/>
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(Thermo Fisher/>
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沃尔瑟姆，MA)的完全培养基中扩增(图5)。
实施例5：α-突触核蛋白靶向ARPE-scFv49细胞系的产生。
将ARPE-19细胞(
Figure GDA00042344290600001119
马纳萨斯，VA)在完全培养基中生长至70％密度。在转染当天，将细胞培养基丢弃并用无血清培养基代替。使用/>
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转染试剂盒(
Figure GDA0004234429060000123
公司，麦迪逊市，WI)，根据制造商的说明，用编码构建体(信号肽-scFv49-标记-组氨酸)4)的质粒(睡美人转座子系统)：
Figure GDA0004234429060000124
转染细胞。转染后四十八(48)小时，将细胞以1:10的比例分开，并在补充有800μg/ml
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(Thermo Fisher/>
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沃尔瑟姆，MA)的完全培养基存在下，将细胞铺在10cm2的组织培养皿中。十四(14)天后，收获单个菌落，并在补充有800μg/ml/>
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(Thermo Fisher/>
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沃尔瑟姆，MA)的完全培养基中扩增。观察到scFv49的表达和分泌(图5)。
实施例6：α-突触核蛋白靶向ARPE-scFv113细胞系的产生。
将ARPE-19细胞(
Figure GDA0004234429060000129
马纳萨斯，VA)在完全培养基中生长至70％密度。在转染当天，将细胞培养基丢弃并用无血清培养基代替。使用/>
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Figure GDA00042344290600001211
转染试剂盒(
Figure GDA00042344290600001212
公司，麦迪逊市，WI)，根据制造商的说明，用编码构建体(信号肽-scFv113-标记-组氨酸)5)的质粒(睡美人转座子系统)：
Figure GDA00042344290600001213
转染细胞。转染后四十八(48)小时，将细胞以1:10的比例分开，并在补充有800μg/ml
Figure GDA00042344290600001214
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Figure GDA00042344290600001215
沃尔瑟姆，MA)的完全培养基存在下，将细胞铺在10cm2的组织培养皿中。十四(14)天后，收获单个菌落，并在补充有800μg/ml/>
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沃尔瑟姆，MA)的完全培养基中扩增(图5)。/>
实施例7：ARPE-PGRN+PSAP+scFv81细胞系的产生。
将克隆ARPE-PGRN细胞在完全培养基中生长至70％密度，然后用第3节中所述的PSAP编码质粒和第5节中所述的编码构建体(信号肽-scFv81-标记-组氨酸)的质粒(睡美人转座子系统)转染。克隆细胞系的产生是通过在存在
Figure GDA00042344290600001218
(Thermo Fisher
Figure GDA00042344290600001219
沃尔瑟姆，MA)(800μg/ml)和HygromycinTM(/>
Figure GDA00042344290600001220
St.Louis，MO)(500μg/ml)的情况下培养转染子来完成的。用免疫细胞化学分析(ICC)鉴定表达PGRN、PSAP和scFv81的克隆细胞系。选择表达PGRN、PSAP和scFv81的克隆D5(#D5)用于进一步分析(图5)。
实施例8：α-突触核蛋白靶向ARPE-Fc-scFv81细胞系的产生。
将ARPE-19细胞(
Figure GDA0004234429060000131
马纳萨斯，VA)在完全培养基中生长至70％密度。在转染当天，将细胞培养基丢弃并用无血清培养基代替。使用/>
Figure GDA0004234429060000132
Fugene/>
Figure GDA0004234429060000133
转染试剂盒(
Figure GDA0004234429060000134
公司，麦迪逊市，WI)，根据制造商的说明，用第3节中描述的质粒(睡美人转座子系统，HygromycinTM(/>
Figure GDA0004234429060000135
St.Louis，MO)选择基因)和编码以下肽(信号肽-Fc-scFv81)6)的cDNA：
Figure GDA0004234429060000136
转染细胞。转染后四十八(48)小时，将细胞以1:10的比例分开，并在补充有500μg/ml HygromycinTM(
Figure GDA0004234429060000137
St.Louis，MO)的完全培养基存在下，将细胞铺在10cm2的组织培养皿中。十四(14)天后，收获单个菌落，并在补充有500μg/ml HygromycinTM(
Figure GDA0004234429060000138
St.Louis，MO)的完全培养基中扩增。
实施例9：α-突触核蛋白靶向ARPE-Fc-scFv49细胞系的产生。
将ARPE-19细胞(
Figure GDA0004234429060000139
马纳萨斯，VA)在完全培养基中生长至70％密度。在转染当天，将细胞培养基丢弃并用无血清培养基代替。使用/>
Figure GDA00042344290600001310
Fugene/>
Figure GDA00042344290600001311
转染试剂盒(
Figure GDA00042344290600001312
公司，麦迪逊市，WI)，根据制造商的说明，用第3节中描述的质粒(睡美人转座子系统，HygromycinTM(/>
Figure GDA00042344290600001313
St.Louis，MO)选择基因)和编码以下肽的cDNA(信号肽-Fc-scFv49)7)：
Figure GDA00042344290600001314
/>
转染细胞。转染后四十八(48)小时，将细胞以1:10的比例分开，并在补充有500μg/ml HygromycinTM(
Figure GDA0004234429060000141
St.Louis，MO)的完全培养基存在下，将细胞铺在10cm2的组织培养皿中。十四(14)天后，收获单个菌落，并在补充有500μg/ml HygromycinTM(
Figure GDA0004234429060000142
St.Louis，MO)的完全培养基中扩增，观察到Fc-scFv49的表达和分泌(图5)。
实施例10：α-突触核蛋白靶向ARPE-Fc-scFv113细胞系的产生。
将ARPE-19细胞(
Figure GDA0004234429060000143
马纳萨斯，VA)在完全培养基中生长至70％密度。在转染当天，将细胞培养基丢弃并用无血清培养基代替。使用/>
Figure GDA0004234429060000144
Fugene/>
Figure GDA0004234429060000145
转染试剂盒(
Figure GDA0004234429060000146
公司，麦迪逊市，WI)，根据制造商的说明，用第3节中描述的质粒(睡美人转座子系统，HygromycinTM(/>
Figure GDA0004234429060000147
St.Louis，MO)选择基因)和编码以下肽(信号肽-Fc-scFv113)8)的cDNA：
Figure GDA0004234429060000148
转染细胞。转染后四十八(48)小时，将细胞以1:10的比例分开，并在补充有500μg/ml HygromycinTM(
Figure GDA0004234429060000149
St.Louis，MO)的完全培养基存在下，将细胞铺在10cm2的组织培养皿中。十四(14)天后，收获单个菌落，并在补充有500μg/ml HygromycinTM(
Figure GDA00042344290600001410
St.Louis，MO)的完全培养基中扩增。
实施例11：ARPE-GDNF+PSAP细胞系的产生
将ARPE-19-GDNF细胞在完全培养基中生长至70％密度，然后用PSAP编码质粒转染，如第2节所述，不同之处在于PSAP编码质粒具有用潮霉素选择基因替换的G4 1 8选择基因。克隆细胞系的产生如前所述完成，除了培养基中包括
Figure GDA00042344290600001411
(Thermo Fisher
Figure GDA00042344290600001412
沃尔瑟姆，MA)(800μg/ml)和HygromycinTM(/>
Figure GDA00042344290600001413
St.Louis，MO)(500μg/ml)。如图11所示，用ELISA(Thermo Fisher/>
Figure GDA00042344290600001414
沃尔瑟姆，MA)鉴定了表达GDNF和PSAP的克隆细胞系。
实施例12：人PSAP ELISA测定。
将捕获抗体(小鼠mAb
Figure GDA00042344290600001415
产品目录编号H00005660-M01，0.43mg/ml(
Figure GDA00042344290600001416
股份有限公司，台北，中国台湾))在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(/>
Figure GDA00042344290600001417
实验室有限公司，South Logan，UT)中以1:500的比例稀释，并按50μl/孔添加至Nunc MaxiSorpTM平板(产品目录编号442404(Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000151
沃尔瑟姆，MA))。将平板在室温(RT)下孵育过夜(ON)。然后丢弃反应混合物，随后在向每个孔中加入150μl封闭溶液(PBS/吐温/BSA(2％))(Alfa/>
Figure GDA0004234429060000152
马塞诸塞州，MA)之前，用PBS/吐温20(0.1％)(/>
Figure GDA0004234429060000153
St.Louis，MO)将孔洗涤三(3)次。在室温下孵育两(2)小时后，在加入在PBS/吐温20(0.1％)/1％双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)(Me3SiNC(OSiMe3)Me)(Alfa/>
Figure GDA0004234429060000154
马塞诸塞州，MA)中稀释的样本之前，用PBS/吐温20(0.1％)(/>
Figure GDA0004234429060000155
St.Louis，MO)将平板洗涤两次。将结合反应物在RT下放置两(2)小时，然后移除，接着用PBS/吐温20 (0.1％)(
Figure GDA0004234429060000156
St.Louis，MO)洗涤三(3)次。然后，加入50μl/孔的检测抗体(Rb抗-PSAP，HPA004426，0.1mg/ml，在PBS/吐温20(0.1％)/BSA(1％)(Alfa/>
Figure GDA0004234429060000157
马塞诸塞州，MA)中以1:300的比例稀释)，并在RT下反应两(2)小时。在另外三(3)次洗涤后，加入50μl/孔的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗-Rb IgG抗体，并将平板在RT下孵育一(1)小时。最后，将平板用PBS/吐温20(0.1％)(/>
Figure GDA0004234429060000158
St.Louis，MO)洗涤三(3)次，使用1StepTM TMB超试剂(Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000159
沃尔瑟姆，MA)监测HRP活性，随后加入一(1)体积的2M H2SO4以终止反应。随后使用Molecular/>
Figure GDA00042344290600001510
酶标仪(microplate reader)(/>
Figure GDA00042344290600001511
公司，麦迪逊市，WI)监测450nm处的吸光度。将人重组PSAP用作标准品(/>
Figure GDA00042344290600001512
产品目录编号：203534(/>
Figure GDA00042344290600001513
PLC Co.，剑桥，UK))。
实施例13：人PGRN/PSAP复合物测定(如图6A所示)。
根据制造商的说明稀释捕获抗体、抗PGRN抗体(hPGRN ELISA
Figure GDA00042344290600001514
试剂盒(R&D
Figure GDA00042344290600001515
明尼阿波利斯，MN))，并以50μl/孔添加至Nunc MaxiSorpTM 96孔板(产品目录编号442404(Thermo Fisher/>
Figure GDA00042344290600001516
沃尔瑟姆，MA))。在室温(RT)下孵育反应。然后丢弃反应物，将平板用PBS/吐温20(0.1％)(/>
Figure GDA00042344290600001517
St.Louis，MO)洗涤三(3)次。随后加入约150μl封闭溶液(PBS/吐温/BSA(2％)(Alfa/>
Figure GDA00042344290600001518
马塞诸塞州，MA))并将平板在RT下孵育两(2)小时。然后在加入在PBS/吐温20(0.1％)/BSA(1％)(Alfa/>
Figure GDA00042344290600001519
马塞诸塞州，MA)中稀释的样本之前，用PBS/吐温20(0.1％)(/>
Figure GDA00042344290600001520
St.Louis，MO)洗涤该平板两次。在RT下孵育两(2)小时后，在加入识别PSAP(抗-PSAP，HPA004426，0.1mg/ml，在PBS/吐温20(0.1％)/BSA(1％)(Alfa/>
Figure GDA00042344290600001521
马塞诸塞州，MA)以1:300的比例稀释)的抗体之前，将平板洗涤三(3)次。将反应物在RT下孵育两(2)小时。在三(3)次洗涤后，加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗-Rb IgG抗体，将反应物在RT下孵育一(1)小时。最后，将平板洗涤三(3)次，使用1StepTM TMB超试剂(Thermo Fisher/>
Figure GDA00042344290600001522
沃尔瑟姆，MA)监测HRP活性，随后加入1体积的2M H2SO4以终止反应。最后在450nm处读取吸光度。作为标准，使用来自ARPE-PGRN/PSAP细胞条件培养基衍生的纯化的PGRN/PSAP复合物。将PGRN/PSAP在PBS/吐温20(0.1％)/BSA(1％)(Alfa/>
Figure GDA00042344290600001523
马塞诸塞州，MA)中稀释。如图6所示，监测衍生自体外组装的重组PGRN和PSAP的PGRN/PSAP复合物。通过这种PGRN/PSAP复合物ELISA(所有CSF样本在PBS/吐温20 (0.1％)/BSA(1％)(Alfa/>
Figure GDA0004234429060000161
马塞诸塞州，MA)以1:1的比例稀释)，可在人血浆和CSF中检测到从条件细胞培养基纯化的、从ARPE-PGRN和ARPE-PGRN+PSAP细胞和装置分泌的PGRN/PSAP复合物(图6)。
实施例14：人PSAP/PGRN复合物测定(如图6A所示)。
用PBS(
Figure GDA0004234429060000162
实验室有限公司，South Logan，UT)以1:500的比例稀释捕获抗体，小鼠mAb抗-PSAP抗体(/>
Figure GDA0004234429060000163
产品目录编号H00005660-M01，0.43mg/ml(/>
Figure GDA0004234429060000164
股份有限公司，台北，中国台湾))，并以50μl/孔添加至Nunc MaxiSorpTM 96-孔板(产品目录编号442404(Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000165
沃尔瑟姆，MA))。在室温(RT)下孵育平板后，丢弃反应混合物，用PBS/吐温20(0.1％)(/>
Figure GDA0004234429060000166
St.Louis，MO)洗涤平板三(3)次。然后，加入150μl封闭溶液(PBS/吐温/BSA(2％)(Alfa/>
Figure GDA0004234429060000167
马塞诸塞州，MA))并将平板在室温下孵育两(2)小时。然后在加入样本之前，用PBS/吐温20(0.1％)(/>
Figure GDA0004234429060000168
St.Louis，MO)洗涤平板两次，样本用PBS/吐温20(0.1％)/BSA(1％)(Alfa/>
Figure GDA0004234429060000169
马塞诸塞州，MA)稀释。将反应物在RT下放置两(2)小时，取出，然后用PBS/吐温20(0.1％)(/>
Figure GDA00042344290600001610
St.Louis，MO)洗涤三(3)次。然后，加入根据生产商的说明用PBS/吐温20(0.1％)/BSA(1％)(Alfa/>
Figure GDA00042344290600001611
马塞诸塞州，MA))稀释的50μl/孔的检测抗体(生物素化的抗-PGRN抗体，R&D
Figure GDA00042344290600001612
hPGRN ELISA/>
Figure GDA00042344290600001613
试剂盒(R&D/>
Figure GDA00042344290600001614
明尼阿波利斯，MN)，并将反应物在RT下放置两(2)小时。在另外三(3)次洗涤后，加入50μl/孔的HRP-缀合的链霉亲和素(Thermo Fisher/>
Figure GDA00042344290600001615
沃尔瑟姆，MA)，将平板在RT下孵育三十(30)分钟。最后，将平板洗涤3次，使用1StepTM TMB超试剂(Thermo Fisher/>
Figure GDA00042344290600001616
沃尔瑟姆，MA)监测HRP活性，随后加入一(1)体积的2M H2SO4以终止反应。最后在450nm处读取吸光度。图6显示了对衍生自体外组装的重组PGRN和PSAP的PSAP/PGRN复合物的监测。ARPE-PGRN和ARPE-PGRN+PSAP细胞分泌的PSAP/PGRN复合物也可通过这种PSAP/PGRN复合物ELISA检测(图1)。使用来自上述细胞系的条件培养基作为分析物，通过组合的交联/蛋白质印迹实验进一步分析来自ARPE、ARPE-PGRN、ARPE-PSAP和ARPE-PGRN+PSAP+scFv81细胞的颗粒蛋白前体/鞘脂激活蛋白原复合物的释放(图2)。汇合的细胞培养物在FreeStyleTM 293表达培养基(Invitrogen/ThermoFisher/>
Figure GDA00042344290600001617
卡尔斯巴德，CA)中处理九十六(96)小时。然后加入BS3交联剂(在H2O中的25mM存量)(Pierce Biotechnology/Thermo Fisher/>
Figure GDA00042344290600001618
沃尔瑟姆，MA)至1mM的最终浓度，并将反应在室温(RT)下保持一(1)小时。随后加入1M Tris-HCl(/>
Figure GDA00042344290600001619
St.Louis，MO)(pH 8.0)部分(5％v/v)以停止交联反应。在4-12％SDS-PAGE凝胶(ThermoFisher/>
Figure GDA00042344290600001620
沃尔瑟姆，MA)上运行反应和对照(没有添加交联剂的条件培养基)的等分试样，然后使用iBlot技术(Invitrogen/Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000171
卡尔斯巴德，CA)转移至PVDF膜(Millipore/>
Figure GDA0004234429060000172
伯灵顿，MA)。将膜浸泡在补充有5％牛奶(w/v)的TBS/吐温20(0.1％，v/v)(/>
Figure GDA0004234429060000173
St.Louis，MO)中，并在RT下放置一(1)小时。随后，将膜依次暴露于山羊抗-PGRN抗体(AF2420 1:500)(R&D/>
Figure GDA0004234429060000174
明尼阿波利斯，MN)和兔抗-PSAP抗体(HPA004426 1:200，HPA)。分别用HRP偶联的抗-山羊和抗-Rb抗体检测任一抗体的标记，并用发光底物(PierceTM ECL蛋白质科学印迹底物(Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000175
沃尔瑟姆，MA)或LuminataTM Forte ELISA HRP底物(/>
Figure GDA0004234429060000176
伯灵顿，MA))检测HRP活性。数据支持所有细胞系都表达PSAP，而PGRN只能在稳定表达PGRN的细胞中检测到。此外，用抗-PGRN和抗-PSAP抗体标记的在凝胶中以相同水平迁移的高分子量条带，仅在ARPE-PGRN和ARPE-PGRN+PSAP+scFv81细胞中检测到。因此，PGRN/PSAP复合物由稳定表达PGRN或PGRN和PSAP的ARPE细胞形成和分泌。
实施例15：包封的ARPE-PGRN、ARPE-PSAP和ARPE-PGRN+PSAP+scFv81过表达细胞的分泌治疗因子。
根据前述方法包封前述细胞系；在本文中，被包封的细胞系分别表示为PGRN-装置、PSAP-装置和PGRN+PSAP装置。所有装置都在37℃、5％CO2下，在Gibco HE-SFM培养基(Thermo Fisher
Figure GDA0004234429060000177
沃尔瑟姆，MA)中长时间培养，时间范围从两(2)周至五(5)个月。分析条件培养基的等分试样的PGRN、PSAP和PGRN+PSAP分泌。PGRN-装置分泌PGRN和PGRN/PSAP复合物，PSAP-装置仅分泌PSAP，PGRN+PSAP-装置仅分泌PGRN/PSAP复合物(图3)。
实施例16：来自ARPE-PGRN、ARPE-PSAP和ARPE-PGRN+PSAP细胞系的分泌因子的活性；靶向皮质神经元。
将细胞在完全培养基中、在225cm2组织培养皿中生长至一定的密度。然后用
Figure GDA0004234429060000178
FreeStyleTM 293表达培养基(Invitrogen/Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000179
卡尔斯巴德，CA)替换细胞培养基，并将细胞在37℃，5％CO2下培养七十二(72)小时。随后回收培养基，并使用截留分子量为30kDa的/>
Figure GDA00042344290600001710
Ultra-4离心过滤器(/>
Figure GDA00042344290600001711
伯灵顿，MA)浓缩。将由十七(17)天的胚胎制备并在37℃、5％CO2下培养十二至十四(12-14)天(Div12-14)的小鼠原代皮质神经元暴露于浓缩的条件培养基，使得最终的[PGRN]、[PSAP]或[PGRN/PSAP]为1μg/ml。将反应物放置过夜，随后将细胞固定，并使用对不同溶酶体标记物(包括PGRN、PSAP和LAMP1)具有特异性的抗体进行免疫细胞化学分析。图7示出了PGRN/PSAP复合物对皮质神经元的靶向，PGRN/PSAP复合物显示出与皮质神经元非常强的相互作用。
实施例17:来自ARPE-PGRN、ARPE-PSAP和ARPE-PGRN+PSAP细胞系的分泌因子的活性；刺激GBAl活性。
将不同的ARPE细胞系在完全培养基中、在225cm2组织培养皿中生长至一定的密度。然后用
Figure GDA0004234429060000181
FreeStyleTM 293表达培养基(Invitrogen/Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000182
卡尔斯巴德，CA)替换细胞培养基，并将细胞在37℃，5％CO2下再培养七十二(72)小时。然后回收条件培养基，并使用截留分子量为30kDa的/>
Figure GDA0004234429060000183
Ultra-4离心过滤器(
Figure GDA0004234429060000184
伯灵顿，MA)浓缩。随后将原代小鼠皮质神经元(Div 12-14)暴露于[PGRN]和[PGRN/PSAP]最终浓度为1μg/ml的浓缩条件培养基中。将反应物在37℃、5％CO2下放置二十(24)小时，然后通过丢弃来自Nunc MaxiSorpTM 96孔板(产品目录编号442404(ThermoFisher/>
Figure GDA0004234429060000185
沃尔瑟姆，MA))的培养基来终止反应，随后添加活性缓冲剂NaCitrateTM((柠檬酸三钠二水合物)(/>
Figure GDA0004234429060000186
St.Louis，MO)(pH5.4))、TritonTM X-100(
Figure GDA0004234429060000187
St.Louis，MO)(0.25％(v/v))、牛磺胆酸(2-{[(3α,5β,7α,12α)-3,7,12-三羟基-24-氧代胆烷-24-基]氨基}乙磺酸)(/>
Figure GDA0004234429060000188
St.Louis，MO)(0.25％(w/v))和1mM EDTA(2,2’,2”,2”’-(乙烷-1,2-二基二亚硝基(diyldinitrilo))四乙酸)(
Figure GDA0004234429060000189
St.Louis，MO)，之后将平板立即置于-85℃以允许有效裂解细胞。为了监测GBAl活性，首先将裂解物解冻并在冰上孵育二十(20)分钟，然后在4℃下以20000RCF离心二十(20)分钟以除去细胞碎片。收集上清液并分成两份，分别测试GBAl活性和测定蛋白质浓度。为了测试GBAl活性，将裂解物与50μl体积的1％BSA(Alfa/>
Figure GDA00042344290600001810
马塞诸塞州，MA)、1mM4-甲基伞形酮基b-吡喃葡萄糖苷(glucophyranoside)((4-MU)(#M3633)(
Figure GDA00042344290600001811
St.Louis，MO))混合，然后在37℃下孵育四十(40)分钟。用1体积的1M甘氨酸(/>
Figure GDA00042344290600001812
St.Louis，MO)终止反应，pH 12.5，用/>
Figure GDA00042344290600001813
D5系列多模式酶标仪(Molecular/>
Figure GDA00042344290600001814
圣何塞，CA)监测荧光(ex＝355nm，em＝460nm)。图8显示用来自ARPE-PGRN和ARPE-PGRN/PSAP细胞以及重组PSAP的条件培养基处理导致分化的小鼠原代皮质神经元中GBA活性增加。
实施例18：PGRN-装置、PSAP-装置和PGRN+PSAP+scFv81装置的体内功能。
该装置的体内功能通过以类似于之前描述的研究大纲的方式在大鼠中植入纹状体来测试(
Figure GDA00042344290600001817
J et al.，(2012)，Restor Neurol Neurosci，30(3):225-36)。将大鼠治疗四至二十四(4至24)周，然后取出装置，通过监测其PGRN、PSAP和PGRN/PSAP复合物释放进行功能测试。图15显示了在大鼠中治疗十二(12)周后，所有三种类型的装置的功能。在接下来的一系列实验中，在临床装置猪的纹状体内和侧脑室内(ICV)放置后，研究了PGRN-装置、PSAP-装置和PGRN+PSAP+scFv81装置的体内功能。在两至三(2至3)周的治疗后，对任一疗法进行测试，回收装置并评估其分泌因子的产生。
实施例19：PGRN-装置的体内安全性。
处死用PGRN-装置治疗了二十四(24)周的Sprague
Figure GDA00042344290600001815
原生大鼠(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)，威尔明顿，MA)，回收脑部，并进行固定和石蜡包埋(
Figure GDA00042344290600001816
PLC Co.，剑桥，UK)，用于组织病理学评估。将冠状切片(5um)与针对人PGRN、Ki67、GFAP、Ibal和CD3的抗体一起孵育，以分别监测暴露、增殖细胞、炎症反应和浸润的T细胞。如图9所示，用PGRN-装置治疗二十四(24)周导致脑中广泛分布有PGRN，但是除了由于神经外科手术本身所预期的以外(通过装置所在附近GFAP样和Iba样免疫反应性的增加所确定的有限星形胶质细胞增生)，没有观察到任何信号。
实施例20：PGRN-装置、PSAP-装置和PGRN+PSAP-装置治疗在两种不同的神经退行性大鼠模型中显示出治疗活性。
将PGRN-装置、PSAP-装置和PGRN+PSAP-scFv81装置植入大鼠的纹状体中，该大鼠还在黑质中注射了携带人α-突触核蛋白基因的AAV9病毒(Decressac M et al，(2012)，Neurobio Dis，45(3)：939-953)。在装置植入/病毒注射后四、八和十二(4、8和12)周，对大鼠进行行为测试。然后处死大鼠，回收脑部用于组织病理学评估(图10)。
如前所述，将PGRN-装置、PSAP-装置和PGRN+PSAP-装置植入大鼠的纹状体中(
Figure GDA00042344290600001911
J et al.，(2012)，Restor Neurol Neurosci，30(3):225-36)。手术后一周，对大鼠进行行为测试(图11)。行为测试后的那一天，在大鼠黑质致密部单侧注射6-OHDA，以触发PD样神经退行性级联反应。在注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，达拉斯，TX)约两(2)和五(5)周后，对大鼠进行如上所述的相同行为范例。然后处死大鼠，回收脑部，用于组织病理学评估。PGRN-装置和PGRN+PSAP-装置治疗显示了评估的行为的改善(图11)。
实施例21：GDNF+PGRN分泌装置，GDNF+PSAP分泌装置和GDNF+PGRN+PSAP分泌装置。
GDNF+PGRN分泌装置、GDNF+PSAP分泌装置和GDNF+PGRN+PSAP分泌装置在6-OHDA神经退行性大鼠模型中显示出治疗活性。如实施例12所述，测试填充有ARPE-GDNF和如上述实施例12所述的任一ARPE因子细胞系的装置的治疗活性。所有处理都显示出治疗活性(图11)。
实施例22：用于生产重组PGRN/PSAP复合物的细胞培养方法。
在完全培养基中培养ARPE-19-PGRN+PSAP克隆#D5细胞。将三个烧瓶(225cm2)用胰蛋白酶(TrypLETM表达酶，
Figure GDA0004234429060000191
12605-010(Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000192
沃尔瑟姆，MA))处理，将细胞重悬于550ml完全培养基中，然后接种于/>
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M细胞培养容器(1720cm2面积)(/>
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St.Louis，MO)。接种后三(3)天，除去培养基，用2×100mlPBS(/>
Figure GDA0004234429060000195
实验室有限公司，South Logan，UT)洗涤细胞。然后，加入补充有/>
Figure GDA0004234429060000196
青霉素-链霉素(PEST)(Thermo Fisher/>
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沃尔瑟姆，MA)、/>
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(G418)(Life
Figure GDA0004234429060000199
公司，卡尔斯巴德，CA)和HygromycinTM(/>
Figure GDA00042344290600001910
St.Louis，MO)的550ml/>
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FreeStyleTM 293表达培养基(Thermo Fisher/>
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沃尔瑟姆，MA)。将细胞在37℃、5％CO2下培养九十六(96)小时。收集条件培养基，并用补充/>
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青霉素-链霉素(PEST)(Thermo Fisher/>
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沃尔瑟姆，MA)、/>
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(G418)(Life
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公司，卡尔斯巴德，CA)和HygromycinTM(/>
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St.Louis，MO)的550ml新鲜550ml/>
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FreeStyleTM 293表达培养基(Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000209
沃尔瑟姆，MA)替换。将收集的条件培养基立即在-85℃冷冻，用于以后进一步的蛋白质纯化。
实施例23：收获和浓缩含有PGRN/PSAP复合物的条件培养基。
将冷冻的细胞培养基批次在4℃过夜缓慢解冻。然后将培养基在7200rcf下离心二十(20)分钟以沉淀死细胞和碎片。为了确保完全去除颗粒，在进一步处理之前，使用
Figure GDA00042344290600002010
过滤装置(0.22um过滤器，ref 83.3941.101)(/>
Figure GDA00042344290600002011
AG&Co.，Nuembrecht，DE)对上清液进行无菌过滤/脱气。随后，使用装载有30kDa截留过滤器的/>
Figure GDA00042344290600002012
细胞过滤搅拌技术(产品目录编号UFSC40001)(Millipore/>
Figure GDA00042344290600002013
伯灵顿，MA)将过滤的条件培养基浓缩十(10)倍。然后将得到的浓缩物用不同的色谱方法纯化。
实施例24：PGRN/PSAP复合物的纯化。
应用两种不同的色谱方法来纯化PGRN/PSAP复合物：分别为离子交换色谱和体积排除色谱(SEC)。首先，将浓缩的无菌过滤介质在6ml二乙氨基乙基纤维素(DEAE)柱(WatersTM技术公司，米尔福德，MA)上运行，并用0-50％梯度的2M NaCl溶液洗脱。随后用SDS-PAGE凝胶(Thermo Fisher
Figure GDA00042344290600002014
沃尔瑟姆，MA)和PGRN/PSAP复合物测定分析级分。PGRN/PSAP复合物被鉴定为三(3)个级分，将这些级分合并并进一步进行SEC。
为了确保有效分离，使用了
Figure GDA00042344290600002015
26/60/>
Figure GDA00042344290600002016
200PG柱(GE HealthcareProcess R&D AB，乌普萨拉，SE)。使用三(3)种不同的测定鉴定含有PGRN/PSAP复合物的级分：PSAP ELISA(见实施例5)、PGRN ELISA(hPGRN ELISA/>
Figure GDA00042344290600002017
试剂盒(#DY2420)(R&D
Figure GDA00042344290600002018
明尼阿波利斯，MN))和PGRN/PSAP测定(见实施例5)。通过这些测定以及SDS-PAGE分析(Thermo Fisher/>
Figure GDA00042344290600002019
沃尔瑟姆，MA)来分析每个级分的等分试样。PGRN/PSAP复合物以不同于游离PGRN的级分洗脱(图4)。此外，蛋白质印迹分析表明，PGRN和PSAP的化学计量是1:1的PGRN/PSAP复合物。合并并回收仅含有PGRN/PSAP复合物的级分。
实施例25：PGRN/PSAP的存储。
将合并的具有PGRN/PSAP复合物的级分在无菌PBS溶液(
Figure GDA00042344290600002020
实验室有限公司，South Logan，UT)中透析过夜，在无菌聚丙烯/>
Figure GDA00042344290600002021
管(/>
Figure GDA00042344290600002022
AG，汉堡，DE)中等分试样，快速冷冻，并储存在-85℃下。
实施例26：纯化的PGRN/PSAP复合物的活性；靶向皮质神经元。
细胞外施用的PGRN/PSAP与小鼠皮质原代神经元有效相互作用，被中间化并靶向溶酶体。在处理之前，将由十七(17)天的胚胎制备的小鼠原代皮质神经元在BD FalconTM 96孔细胞培养皿(BD Biosciences，贝德福德，MA)中在37℃，5％CO2下，培养十四(14)天。然后加入浓缩至1-5μg/ml的PGRN、PSAP或PGRN/PSAP的样本，并在37℃、5％CO2下培养。随后除去培养基，固定细胞，并使用对不同溶酶体标记物(包括PGRN、PSAP和GBA1)具有特异性的抗体进行免疫细胞化学分析。如图7所示，与GBA1共定位的PGRN/PSAP复合物对皮质神经元的有效靶向表明该复合物被内化并靶向溶酶体。
实施例27：纯化的PGRN/PSAP复合物的活性。刺激GBAl活性。
细胞外施用PGRN/PSAP复合物，PGRN或PSAP与小鼠原代皮质神经元和人原代成纤维细胞中的GBAl共定位，且每次处理都激活GBAl，所述GBAl衍生自杂合的GBA1 L444P突变携带者。在处理之前，将由第十七(17)天的胚胎制备的小鼠原代皮质神经元在BD FalconTM96孔细胞培养皿(BD Biosciences，贝德福德，MA)中在37℃、5％CO2下培养十四(14)天。然后加入PGRN、PSAP或PGRN/PSAP至10ng/ml的浓度，并将培养物在分析前孵育二十四(24)小时。将人成纤维细胞生长至一定的密度，然后用PGRN、PSAP或PGRN/PSAP GBAl处理，如上文针对小鼠原代神经元培养物所述。在37℃、5％CO2下处理二十四(24)小时后，通过从NuncMaxiSorpTM 96孔板中取出培养基并加入由下列物质组成的活性缓冲液来终止反应：NaCitrateTM((柠檬酸三钠二水合物)(pH 5.4)(
Figure GDA0004234429060000211
St.Louis，MO)、TritonTMX-100((0.25％(v/v)(/>
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St.Louis，MO))、牛磺胆酸((2-{[(3α,5β,7α,12α)-3,7,12-三羟基-24-氧代胆烷-24-基]氨基)乙磺酸)(0.25％(w/v))(/>
Figure GDA0004234429060000213
St.Louis，MO))，和加入1mM EDTA((2,2’,2”,2”’-(乙烷-1,2-二基二亚硝基)四乙酸)(
Figure GDA0004234429060000214
St.Louis，MO))，并将平板置于-85℃以允许细胞有效裂解和破碎。为了监测GBAl活性，首先将裂解物解冻并在冰上孵育二十(20)分钟，然后在4℃下以20000rcf离心二十(20)分钟以除去细胞碎片。收集上清液并分成两(2)等分试样，分别用于GBA1活性和蛋白质浓度测定。对于GBAl活性，将裂解物与50μl体积的1％BSA(Alfa/>
Figure GDA0004234429060000215
马塞诸塞州，MA)、1mM 4-甲基伞形酮基b-吡喃葡萄糖苷(4-MU，/>
Figure GDA0004234429060000216
#M3633)混合，然后在37℃下孵育四十(40)分钟。用一(1)体积的1M甘氨酸在pH 12.5下终止反应，并使用
Figure GDA0004234429060000217
D5酶标仪(Molecular/>
Figure GDA0004234429060000218
圣何塞，CA)监测荧光(ex＝355nm，em＝460nm)。图8显示，用PGRN、PSAP和PGRN/PSAP复合物处理增加了分化的小鼠原代皮质神经元中的GBAl活性，其是GBA1功能缺失突变杂合的人原代成纤维细胞。
实施例28：纯化的PGRN/PSAP复合物的活性。刺激神经突起生长。
细胞外施用的PGRN/PSAP刺激小鼠原代皮质神经元培养物中的神经突起生长。由十七(17)天的胚胎制备小鼠原代皮质神经元。根据已知方法收获脑部并制备皮质培养物(Merino-Serrais P et al，(2019)，Cereb Cortex，29(1):429-46)。将细胞接种在神经基础培养基(NeurobasalTM Plus培养基，(
Figure GDA0004234429060000221
Life/>
Figure GDA0004234429060000222
卡尔斯巴德，CA))中的BD FalconTM 96孔聚-L包被的细胞培养皿(BD FalconTM 96-孔细胞培养皿(BDBiosciences，贝德福德，MA))中，所述神经基础培养基补充有L-谷氨酰胺、/>
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青霉素-链霉素(PEST)(Thermo Fisher/>
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沃尔瑟姆，MA)和2％B27(抗人白细胞抗原B27抗体(/>
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PLC公司，剑桥，UK))。接种后六(6)小时，取出培养基，直接用补充有L-谷氨酰胺、/>
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青霉素-链霉素(PEST)(Thermo Fisher/>
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沃尔瑟姆，MA)和0％、0.5％或1％的B27(抗人白细胞抗原B27抗体(/>
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PLC公司，剑桥，UK)的90μl/孔的神经基础培养基(NeurobasalTM Plus培养基(/>
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Life/>
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卡尔斯巴德，CA))替换。具有完全培养基的培养物，即2％B27(抗人白细胞抗原B27抗体(/>
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PLC公司，剑桥，UK))，用作对照。然后加入补充有L-谷氨酰胺和/>
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青霉素-链霉素(PEST)(ThermoFisher/>
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沃尔瑟姆，MA)和10ng/ml PGRN或PGRN/PSAP的十(10)μl神经基础培养基(NeurobasalTM Plus培养基，(/>
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Life/>
Figure GDA00042344290600002215
卡尔斯巴德，CA))，并将培养物在37℃下进一步孵育四(4)天或约九十六(96)小时。然后丢弃培养基，将细胞在4％甲醛(O＝CH2)(Fisher Chemical，沃尔瑟姆，MA)中室温固定三十(30)分钟。随后丢弃固定溶液，在免疫细胞化学(ICC)分析之前，用PBS(/>
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实验室有限公司，South Logan，UT)洗涤孔三(3)次：首先在室温下用PBS(/>
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实验室有限公司，South Logan，UT)/TritonTM X-100(t-Oct-C6H4-(OCH2CH2)xOH，x＝9-10，(/>
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伯灵顿，MA)(0.25％)和BSA(Alfa/>
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马塞诸塞州，MA)(3％)处理固定的细胞一(1)小时以渗透细胞并阻断非特异性蛋白结合。去除封闭溶液后，将培养物暴露于补充有小鼠单克隆抗微管蛋白抗体((antaCruz，G8)(/>
Figure GDA00042344290600002220
PLC公司，剑桥，UK))的新鲜封闭溶液，稀释至1:200，然后在+4℃孵育。随后，用PBS(/>
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实验室有限公司，South Logan，UT)/TritonTM X-100(
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伯灵顿，MA)(0.25％)和BSA(Alfa/>
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马塞诸塞州，MA)(3％)洗涤细胞三(3)次，然后在室温下与补充有Alexa594山羊抗-小鼠IgG(1:1000)(Alexa fluorTM，Thermo Fisher/>
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沃尔瑟姆，MA)和10ug/ul双苯酰亚胺蓝色荧光染料，即赫斯特染色(Hoechst stain)(/>
Figure GDA00042344290600002225
法兰克福，DE)的封闭溶液一起孵育一(1)小时。去除反应混合物后，将BD FalconTM 96孔板用PBS/TritonTM x-100，即PBS(/>
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实验室有限公司，South Logan，UT)/TritonTM x-100(/>
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伯灵顿，MA)洗涤三(3)次，然后在分析前储存在+4℃的黑暗环境中。使用CellomicsTM技术(ArrayScanTM，Thermo Fisher
Figure GDA00042344290600002228
沃尔瑟姆，MA)的高含量筛选平台(HCS)部分和神经突形态学软件(/>
Figure GDA00042344290600002229
澳大利亚联邦科学与工业研究组织(CSIRO)，堪培拉，AU)监测神经元形态学。PGRN/PSAP，像PGRN一样，刺激神经突的生长，如图12所示。
实施例29：纯化的PGRN/PSAP复合物的活性。侧脑室内(ICV)施用后在脑部中的分布、内化和溶酶体靶向。
制备来自ARPE-PGRN和ARPE-PSAP细胞的条件培养基，浓缩，并将缓冲液更换为PBS。将重组PGRN-组氨酸(产品目录编号2420-PG(R&D
Figure GDA0004234429060000231
明尼阿波利斯，MN))与来自ARPE-PSAP细胞的浓缩条件培养基混合，形成PGRN/PSAP复合物，如图2蛋白质印迹分析所示。用蛋白质印迹分析鉴定了来自ARPE-PGRN细胞的ARPE衍生的PGRN和PGRN/PSAP复合物(图2)。使用蠕动泵(Thermo Fisher/>
Figure GDA0004234429060000232
沃尔瑟姆，MA)，以每分钟0.5μl的速率，通过侧脑室内(ICV)注射(/>
Figure GDA0004234429060000233
公司，Reno，NV)向受试者施用在PBS中制备的反应混合物，持续大约两(2)分钟。ICV注射后三(3)小时后处死小鼠，回收脑部，置于固定剂(PBS中的4％甲醛)中四十八(48)小时，然后储存在温度为+4℃的包含PBS/30％蔗糖的溶液中，直到需要。在免疫组织化学分析之前，随后将脑部用石蜡包埋(Weiss AThAet al.，(2011)，VetPathol，48(4):834-8)：使用以下PGRN抗体监测人PGRN样和PSAP样免疫反应性：MAB2420和AF2420(R&D/>
Figure GDA0004234429060000234
明尼阿波利斯，MN)、Penta-组氨酸(抗-组氨酸标签导向抗体(Qiagen，芬洛，NL))和PSAP抗体(/>
Figure GDA0004234429060000235
产品目录编号H00005660-M01，0.43mg/ml(
Figure GDA0004234429060000236
股份有限公司，台北，中国台湾)和(/>
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产品目录编号HPA004426，0.1mg/ml(/>
Figure GDA0004234429060000238
Rosemont，IL))。在与合适的HRP偶联的第二抗体一起孵育后，用DAB作为HRP的底物检测PGRN样和PSAP样和组氨酸样免疫反应性。图13显示了来自注射了ARPE-PGRN细胞的浓缩条件培养基和混合有PGRN-组氨酸的ARPE-PSAP条件培养基的小鼠的PGRN和PSAP在大脑的重叠扩散。在更高的放大倍数下，在这些大脑中检测到PGRN和PSAP的细胞内共定位，以及组氨酸样和PSAP样免疫反应性的细胞内共定位，这表明ICV施用的PGRN/PSAP复合物扩散至脑部中并被脑细胞内化。图14显示如实施例23所述纯化的重组PGRN-Fc、PGRN和PGRN/PSAP复合物被吸收并广泛分布于大鼠脑部。此外，纯化的PGRN通过导管IT施用至猪体内，并在猪体内进行为期两周的ICV ECB-PGRN治疗，使得脑部吸收PGRN。因此，IT和ICV输送的PGRN和PGRN/PSAP扩散至小鼠、大鼠和猪的脑部中。
定义
为了方便起见，这里收集了说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。这些定义应当根据公开内容来阅读，并且被本领域普通技术人员所理解。
如本文所用，术语“生物反应器”指支持生物活性环境的任何人造装置或系统。在各种实施方案中，生物反应器是在其中进行化学过程的容器，所述化学过程涉及生物体或衍生自这种生物体的生物化学活性物质。这个过程可以是有氧的，也可以是无氧的。在另一个实施方案中，生物反应器也可以指设计用于在细胞培养环境中生长细胞或组织的装置或系统。在另一个实施方案中，可以收获和纯化在生物反应器中生长的细胞分泌或产生的分子。
如本文所用，术语“胶囊”或“包封”或“包封的”是指包含细胞的封闭装置(或使用所述装置的方法)，优选通过半渗透膜，该半渗透膜允许分子的双向扩散，例如氧、营养物、生长因子等的流入，其对细胞新陈代谢和废物及治疗性蛋白质的向外扩散至关重要。同时，膜的半透性防止免疫细胞和抗体破坏被包封的细胞，将其视为外来入侵者。
如本文所用，术语“细胞系”是指衍生自单一祖细胞的细胞群，其可以重复或无限增殖。祖细胞可以衍生自较大动物或植物的器官或组织。
如本文所用，术语“表达(expression)”，或者“表达(express)”、“表达(expressing)”、“被表达(expressed)”或“待表达(to express)”是指衍生自核酸或多核苷酸的有义RNA(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。表达也可以指mRNA翻译成蛋白质或多肽。
如本文所用，术语“表达构建体”指设计用于将核酸或多核苷酸导入细胞以表达由该核酸或多核苷酸编码的蛋白质或RNA的任何分子、病毒或生物体。在优选的实施方案中，表达构建体可以是质粒。表达构建体也可以指表达载体，这些术语可以互换使用。
如本文所用，当应用于多核苷酸序列时，术语“片段”或“其片段”是指在共同部分包含与参考核酸相同的核苷酸序列的核苷酸序列，其长度相对于参考核酸缩短。根据本发明的这种核酸片段可以包含在更大的多核苷酸中，如果合适的话，这是其组成部分。
如本文所用，术语“异二聚体(heterodimer)”，或者“异二聚体(heterodimers)”或“异二聚体(heterodimerization)”，是指由两种蛋白质单体或单一蛋白质形成的大分子复合物，其中两种蛋白质单体包含两种不同的蛋白质序列。
如本文所用，术语“免疫隔离”是指保护植入材料例如生物聚合物、细胞或药物释放载体免受免疫反应或最小化免疫反应的方法或手段。在实施方案中，可植入装置可以是免疫隔离的，因为在将该装置植入宿主后，它保护装置内部的材料免受免疫反应。
如本文所用，术语“可植入的”，或者“植入”、“植入物”、“植入的”或“用于植入的”，是指设计用于长时间引入宿主体内的装置，目的是替代、增强或支持宿主的现有生物结构或功能。
如本文所用，术语“基质”是指细胞外大分子的三维网络，例如聚合物、胶原、酶、层粘连蛋白、纤连蛋白或糖蛋白，其为周围细胞提供结构和生化支持。
如本文所用，术语“修饰(modify)”或“修饰(modified)”、“修饰(modifies)”、“修饰(modification)”、“修饰(modifying)”或“修饰(to modify)”，是指直接或间接增强、减少、增加或去除所述物质的一种或多种性质的物质的任何改变。
如本文所用，术语“神经疾病”和“神经障碍”可互换使用，是指神经系统的任何功能异常或紊乱，不论是由脑、脊髓或其它神经的结构、生物化学或电气异常引起的。
如本文所用，术语“其它色谱方法”是指在提交时本领域已知的或此后发现的用于分离混合物的任何技术，不论是制备的还是分析的。
如本文所用，术语“前体多肽”、“蛋白质前体(protein precursor)”或“前体蛋白质(pro-protein)”可互换使用，是指无活性的蛋白质(或肽)，其可通过翻译后修饰转变成活性形式，例如断裂一段分子或添加另一分子。
如本文所用，术语“纯化的(purified)”，或者“纯化(purify)”、“纯化的(purified)”、“纯化(purification)”或“纯化(to purify)”是指浓度显著增加或不含污染物的物质。除非另有说明，该术语不一定表示绝对纯度。
如本文所用，术语“睡美人转座酶系统”指通过睡美人转座酶和转座子将DNA序列引入细胞基因组的方法，以及实施所述方法的材料。
如本文所用，术语“亚肽(subpeptide)”，或者“亚肽(subpeptides)”或“其亚肽(subpeptides)”是指衍生自较大蛋白质或多肽的一部分的多肽。在实施方案中，亚肽可以是较大蛋白质或多肽的片段。
如本文所用，术语“治疗剂(therapeutic)”，或者“治疗剂(a therapeutic)”、“治疗药物(a therapeutic drug)”、“治疗剂(a therapeutic agent)”、“疗法(therapy)”、“疗法(therapies)”、“治疗方案(a therapeutic regimen)”或“治疗方法(a therapeuticmethod)”是指赋予用所述分子治疗的受试者有益功能的任何分子(或使用所述分子的方法)。治疗剂可包括但不限于肽、多肽、单链或多链蛋白质、融合蛋白、反义寡核苷酸、小干扰RNA、核酶和RNA外部指导序列。治疗剂可以包括天然存在的序列、合成序列或天然和合成序列的组合。
如本文所用，术语“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(has)”、“具有(having)”或其任何其它变体旨在涵盖非排他性的包含。例如，包括一系列元素的过程、方法、物品或装置不一定仅限于这些元素，而是可以包括没有明确列出的或固有的这种过程、方法、物品或装置的其它元素。此外，除非有相反的明确说明，否则‘或’指的是包含性的或，而不是排他性的或。例如，条件A或B满足以下任一条件：A为真(或存在)且B为假(或不存在)，A为假(或不存在)且B为真(或存在)，A和B都为真(或存在)。此外，使用术语“一(a)”或“一(an)”来描述本发明的元件和组件。这样做仅仅是为了方便和给出本发明的一般意义。该描述应该被理解为包括一个或至少一个，并且单数也包括复数，除非它显然另有含义。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的方法和材料，但是合适的方法和材料已经在上文讨论。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均以引用方式全文并入本文。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。在以下描述中，提供了许多具体细节，例如各种系统组件的标识，以提供对本发明实施例的理解。然而，本领域技术人员将认识到，本发明的实施方案可以在没有一个或多个具体细节的情况下实施，或者利用其它方法、组件、材料等实施。在其它情况下，没有详细示出或描述公知的结构、材料或操作，以避免模糊本发明各种实施方案的方面。在整个说明书中，提到“一个实施方案(one embodiment)”或“实施方案(an embodiment)”意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，在说明书各处出现的短语“在一个实施方案中(in one embodiment)”或“在实施方案中(inan embodiment)”不一定都指同一实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定的特征、结构或特性可以以任何合适的方式组合。
本文使用的术语“和/或”被定义为具有一个或另一个或两者的可能性。例如，“A和/或B”提供仅具有A或仅具有B或A和B的组合的情况。如果权利要求为“A和/或B和/或C”，则组合物可包括单独的A、单独的B、单独的C、A和B但不包括C、B和C但不包括A、A和C但不包括B或包括所有三种A、B和C组分。
缩写词
为了方便起见，这里收集了说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。这些定义应当根据公开内容来阅读，并且被本领域普通技术人员所理解。
AAV 腺相关病毒载体
AD 阿尔茨海默病
ALS 肌萎缩性侧索硬化
APRE-19 成人视网膜色素上皮细胞系-19
bFGF 碱性成纤维细胞生长因子
BHK 幼仓鼠肾细胞
BMT 骨髓移植
BSA 双(三甲基硅基)乙酰胺
BSC 尾猿猴肾细胞
CAC 循环血管生成细胞
CD3 分化群3
CHO 中国仓鼠卵巢
CDNA1 互补DNA
CDNF 大脑多巴胺神经营养因子
CMV (人)巨细胞病毒
CNS 中枢神经系统
COS CV-1(猿猴)起源
CSF 脑脊髓液
DEAE 二乙氨基乙基纤维素
DMEM Dulbecco改良Eagle培养基
ECB 包封的细胞生物递送
EDTA 2,2’,2”,2”’-(乙烷)-1,2-二基二亚硝基)四乙酸
EGF 表皮生长因子
ELISA 酶联免疫吸附测定
FCS 胎牛血清
bFGF 碱性成纤维细胞生长因子
FITC 异硫氰酸荧光素
FTD 额颞痴呆
FUS 融合成肉瘤
GBA1 β-葡萄糖脑苷脂酶
GCase 葡萄糖脑苷脂酶
GCFN 胶质细胞衍生神经营养因子
GDNF 胶质细胞衍生神经营养因子a/k/a ARMET样蛋白1
GFAP 胶质纤维酸性蛋白
GRN 颗粒蛋白
HIV 人免疫缺陷病毒
HRP 辣根过氧化物酶
HEK 人胚胎肾
Ibal 离子化钙结合衔接分子1
ICC 免疫细胞化学
ICV 侧脑室内
iPS 诱导多能干细胞
IR/DR 反向重复/直接重复元件
KEGG 京都基因和基因组百科全书
LAMP1 溶酶体相关膜蛋白1a/k/a溶酶体相关膜糖蛋白1a/k/a分化簇107a
LATE 边缘优势年龄相关TAR DNA结合蛋白-43(TDP-43)脑病
LB 路易体
LBD 路易体痴呆
MANF 中脑星形胶质细胞衍生的神经营养因子
MCS 间叶性软骨肉瘤
MSA 多系统萎缩
MSC 间充质干细胞
MSO 间叶性软骨肉瘤-1
NCL 神经元蜡样脂褐质沉积症
NT 神经营养因子
NS0 小鼠骨髓瘤细胞
6-OHDA 6-羟基多巴胺
PBS 磷酸盐缓冲溶液
PC 嗜铬细胞瘤(12和12A)
PD 帕金森病
PEST 青霉素/链霉素
PGRN 颗粒蛋白前体
PROTAC 蛋白水解靶向嵌合体
PSAP 鞘脂激活蛋白原
RCF 相对离心力
RN 大鼠神经元
RNA 核糖核酸
RPE 视网膜色素上皮细胞
RT 室温
SCC 鳞状细胞癌
scFv 单链可变片段
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SEC 体积排除色谱
SIRC Startus Seruminstitu兔角膜
TAR 交互反应
TAT 转录反式激活子
TDP TAR DNA结合蛋白
hTERT 人端粒酶逆转录酶
TH 酪氨酸羟化酶
TMB 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺
等同物
本发明的全部范围应当通过参考权利要求及其等同物的全部范围、说明书及其变化来确定。
除非另有说明，否则说明书和权利要求中使用的表示成分数量、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下被术语“约”修饰，定义为±5％。因此，除非有相反的指示，否则在本说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据本发明寻求获得的希望性质而变化。
上述讨论旨在说明本发明的原理和各种实施方案。一旦充分理解了上述公开内容，许多变化、组合和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。以下权利要求旨在被解释为包含所有这些变化和修改。
序列表
<110> J·伦德奎斯特
H·比韦斯塔尔
L·U·瓦尔贝格
<120> 分泌α-突触核蛋白靶向抗体、颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原以及GDNF的细胞系
<130> P9590US00
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18146
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 60
ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt ggagctcgga tccctataca 120
gttgaagtcg gaagtttaca tacacttaag ttggagtcat taaaactcgt ttttcaacta 180
ctccacaaat gttccgctaa ttcaacccat tgcggtccca aaagggtcag tgctgcaaca 240
ttttgctgcc ggtcactcgc gcgcattatg ctgagtgata tcccgcttaa cctcgagcct 300
agggatatgt caacttcagc cttcaaatgt atgtgaattc aacctcagta attttgagca 360
aaaagttgat gaggtgttta ttcttgttaa caaacaatag ttttggcaag tcagttagga 420
catctacttt gtgcatgaca caagtcattt ttccaacaat tgtttacaga cagattattt 480
cacttataat tcactgtatc acaattccag tgggtcagaa gtttacatac actaagttga 540
ctgtgccttt aaacagcttg gaaaattcca aagaacaatt gtttgttatc aaaaccgttc 600
agtcaatcct gtagatgaaa cacgtactgt gttcagtaaa aaggttgtta acaaatgtct 660
gtctaataaa gtgaatatta agtgacatag tgttaaggtc acccagtctt caaatgtatg 720
tgattcaact gacacggaaa tttgtcgaac cttttaaggt gaaaatgatg tcatggcttt 780
agaagctaga tctagagtcg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg 840
gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc 900
ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac cttttactac 960
agtaccgaaa tcttcgatct agatctcagc tgtaactaat aactgatcaa taattatcat 1020
tagttaatgc cccagtaatc aagtatcggg tatatacctc aaggcgcaat gtattgaatg 1080
ccatttaccg ggcggaccga ctggcgggtt gctgggggcg ggtaactgca gttattactg 1140
gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt 1200
acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 1260
tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga 1320
ctttcctact catacaaggg tatcattgcg gttatccctg aaaggtaact gcagttaccc 1380
acctcataaa tgccatttga cgggtgaacc gtcatgtagt tcacatagta tacggttcat 1440
gcgggggata actgcagtta ctgccattta ccgggcggac cgtaatacgg gtcatgtact 1500
ggaataccct gaaaggatga tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg 1560
tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 1620
ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 1680
ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg accgtcatgt agatgcataa tcagtagcga 1740
taatggtacc agctccactc ggggtgcaag acgaagtgag aggggtagag gggggggagg 1800
ggtgggggtt aaaacataaa taaataaaaa attaataaaa cacgtcgcta cccccgcccc 1860
cccccccccc ccgcgcgcgg tccgccccgc cccgccccgc aggggcgggg cggggcgagg 1920
cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc ttttatggcg 1980
aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg gagtcgctgc 2040
gacgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg tccccgcccc 2100
gccccgctcc gcctctccac gccgccgtcg gttagtctcg ccgcgcgagg ctttcaaagg 2160
aaaataccgc tccgccgccg ccgccgccgg gatatttttc gcttcgcgcg ccgcccgccc 2220
ctcagcgacg ctgcgacgga agcggggcac ggggcgaggc ggcggcggag cgcggcgggc 2280
ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 2340
ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 2400
agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc 2460
gtgtgtgtgt ggggccgaga ctgactggcg caatgagggt gtccactcgc ccgccctgcc 2520
gggaagagga ggcccgacat taatcgcgaa ccaaattact gccgaacaaa gaaaagacac 2580
cgacgcactt tcggaactcc ccgaggccct cccgggaaac acgcccccct cgccgagccc 2640
cccacgcacg cacacacaca gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg 2700
ctgtgagcgc tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag 2760
cgcggccggg ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt 2820
gcggggtgtg tgcgtggggg ggtgagcagg cgcacccctc gcggcgcacg ccgaggcgcg 2880
acgggccgcc gacactcgcg acgcccgcgc cgcgccccga aacacgcgag gcgtcacacg 2940
cgctcccctc gcgccggccc ccgccacggg gcgccacgcc ccccccgacg ctccccttgt 3000
ttccgacgca cgccccacac acgcaccccc ccactcgtcc gggtgtgggc gcgtcggtcg 3060
ggctgcaacc ccccctgcac ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg 3120
cggggctccg tacggggcgt ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg 3180
tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg cccacacccg 3240
cgcagccagc ccgacgttgg gggggacgtg gggggagggg ctcaacgact cgtgccgggc 3300
cgaagcccac gccccgaggc atgccccgca ccgcgccccg agcggcacgg cccgcccccc 3360
accgccgtcc acccccacgg cccgccccgc cccggcggag cccggcccct cccgagcccc 3420
gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat 3480
tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg 3540
gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc 3600
ggcgccggca ctccccgcgc cgccgggggc ctcgcggccg ccgacagctc cgcgccgctc 3660
ggcgtcggta acggaaaata ccattagcac gctctcccgc gtccctgaag gaaacagggt 3720
ttagacacgc ctcggcttta gaccctccgc ggcggcgtgg gggagatcgc ccgcgccccg 3780
cttcgccacg ccgcggccgt ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg 3840
ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg cggggggacg gctgccttcg 3900
ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct ctagagcctc 3960
tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt ccttccttta cccgcccctc ccggaagcac 4020
gcagcggcgc ggcggcaggg gaagagggag aggtcggagc cccgacaggc gcccccctgc 4080
cgacggaagc cccccctgcc ccgtcccgcc ccaagccgaa gaccgcacac tggccgccga 4140
gatctcggag acgattggta caagtacgga agaagaaaaa cctacagctc ctgggcaacg 4200
tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt ctgcagtcga cggtaccgcg 4260
ggcccgggat ccgccaccat gtggaccctg gtgtcttggg tggccctgac agctggactg 4320
gtggccggca caagatgccc cgatggccag ttttgccctg tggcctgctg ggatgtcgag 4380
gacccgttgc acgaccaata acacgacaga gtagtaaaac cgtttcttaa gacgtcagct 4440
gccatggcgc ccgggcccta ggcggtggta cacctgggac cacagaaccc accgggactg 4500
tcgacctgac caccggccgt gttctacggg gctaccggtc aaaacgggac accggacgac 4560
tctggaccca ggcggagcca gctacagctg ctgcagaccc ctgctggaca agtggcctac 4620
caccctgagc agacacctgg gcggaccttg tcaggtggac gcccactgtt ctgccggaca 4680
cagctgcatc ttcaccgtgt ctggcacctc cagctgctgt ccattccctg aggctgtggc 4740
ttgtggcgac agacctgggt ccgcctcggt cgatgtcgac gacgtctggg gacgacctgt 4800
tcaccggatg gtgggactcg tctgtggacc cgcctggaac agtccacctg cgggtgacaa 4860
gacggcctgt gtcgacgtag aagtggcaca gaccgtggag gtcgacgaca ggtaagggac 4920
tccgacaccg aacaccgctg ggccaccact gttgccctag aggctttcac tgcagcgccg 4980
acggcagaag ctgcttccag agaagcggca acaacagcgt gggcgccatc cagtgcccag 5040
acagccagtt cgagtgcccc gacttcagca cctgttgcgt gatggtggat ggcagctggg 5100
gctgctgccc tatgcctcag gctagctgct ccggtggtga caacgggatc tccgaaagtg 5160
acgtcgcggc tgccgtcttc gacgaaggtc tcttcgccgt tgttgtcgca cccgcggtag 5220
gtcacgggtc tgtcggtcaa gctcacgggg ctgaagtcgt ggacaacgca ctaccaccta 5280
ccgtcgaccc cgacgacggg atacggagtc cgatcgacga gcgaggacag agtgcactgt 5340
tgtccccacg gcgccttttg cgacctggtg cacaccagat gcatcacccc taccggcaca 5400
caccccctgg ccaagaaact gcccgcccag aggaccaata gagccgtggc cctgtccagc 5460
tccgtgatgt gccctgacgc cagatccaga tgtcccgacg gctccacatg cgctcctgtc 5520
tcacgtgaca acaggggtgc cgcggaaaac gctggaccac gtgtggtcta cgtagtgggg 5580
atggccgtgt gtgggggacc ggttctttga cgggcgggtc tcctggttat ctcggcaccg 5640
ggacaggtcg aggcactaca cgggactgcg gtctaggtct acagggctgc cgaggtgtac 5700
ctgcgaactg cccagcggca aatacggctg ttgccccatg cccaacgcca cctgttgtag 5760
cgaccatctg cactgctgcc cacaagacac cgtgtgcgac ctgatccaga gcaagtgcct 5820
gagcaaagag aacgccacca ccgacctgct gaccaagctg cctgctcata ccgtgggcga 5880
cgtgaagtgc gacgcttgac gggtcgccgt ttatgccgac aacggggtac gggttgcggt 5940
ggacaacatc gctggtagac gtgacgacgg gtgttctgtg gcacacgctg gactaggtct 6000
cgttcacgga ctcgtttctc ttgcggtggt ggctggacga ctggttcgac ggacgagtat 6060
ggcacccgct gcacttcacg gacatggaag tgtcctgccc agacggctat acctgctgca 6120
ggctgcagtc tggcgcctgg ggctgttgtc cttttaccca ggccgtgtgt tgcgaggacc 6180
acatccattg ctgccctgcc ggcttcacct gtgacaccca gaagggaacc tgcgagcagg 6240
gccctcatca ggtgccctgg atggaaaaag ctgtaccttc acaggacggg tctgccgata 6300
tggacgacgt ccgacgtcag accgcggacc ccgacaacag gaaaatgggt ccggcacaca 6360
acgctcctgg tgtaggtaac gacgggacgg ccgaagtgga cactgtgggt cttcccttgg 6420
acgctcgtcc cgggagtagt ccacgggacc tacctttttc cccctgccca cctgagcctg 6480
cctgatcctc aggccctgaa gagggacgtg ccctgcgaca atgtgtccag ctgccccagc 6540
agcgatacct gttgccagct gacatctggc gagtggggat gctgtcctat ccccgaagcc 6600
gtgtgctgct ccgaccacca gcattgctgt ccacaaggct acacctgtgt ggggacgggt 6660
ggactcggac ggactaggag tccgggactt ctccctgcac gggacgctgt tacacaggtc 6720
gacggggtcg tcgctatgga caacggtcga ctgtagaccg ctcaccccta cgacaggata 6780
ggggcttcgg cacacgacga ggctggtggt cgtaacgaca ggtgttccga tgtggacaca 6840
ggccgagggc cagtgtcaga ggggctctga aattgtggcc ggcctggaaa agatgcccgc 6900
cagaagggcc agcctgagcc accctagaga catcggctgc gaccagcaca ccagctgtcc 6960
tgtgggccag acatgctgtc caagcctggg aggctcttgg gcttgctgcc agctgcctca 7020
cgctgtgtgc ccggctcccg gtcacagtct ccccgagact ttaacaccgg ccggaccttt 7080
tctacgggcg gtcttcccgg tcggactcgg tgggatctct gtagccgacg ctggtcgtgt 7140
ggtcgacagg acacccggtc tgtacgacag gttcggaccc tccgagaacc cgaacgacgg 7200
tcgacggagt gcgacacacg tgcgaagatc ggcagcactg ctgtcccgcc ggatacacct 7260
gtaacgtgaa ggcccggtcc tgcgagaaag aagtggtgtc tgcccagccc gccaccttcc 7320
tggccagatc acctcacgtg ggcgtgaagg acgtggaatg cggcgagggc cacttctgcc 7380
acgacaacca gacctgctgc cgggacaata acgcttctag ccgtcgtgac gacagggcgg 7440
cctatgtgga cattgcactt ccgggccagg acgctctttc ttcaccacag acgggtcggg 7500
cggtggaagg accggtctag tggagtgcac ccgcacttcc tgcaccttac gccgctcccg 7560
gtgaagacgg tgctgttggt ctggacgacg gccctgttat gacagggctg ggcctgttgc 7620
ccatacagac agggcgtgtg ctgtgccgac aggcggcact gttgcccagc cggctttaga 7680
tgtgccgcca gaggcaccaa gtgtctgcgg agagaagccc ccagatggga tgcccccctg 7740
agagatcctg ccctgagaca gctgctgtga ctcgagtcta gagggcccgt ctgtcccgac 7800
ccggacaacg ggtatgtctg tcccgcacac gacacggctg tccgccgtga caacgggtcg 7860
gccgaaatct acacggcggt ctccgtggtt cacagacgcc tctcttcggg ggtctaccct 7920
acggggggac tctctaggac gggactctgt cgacgacact gagctcagat ctcccgggca 7980
ttaaacccgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 8040
ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 8100
tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 8160
gcaggacagc aatttgggcg actagtcgga gctgacacgg aagatcaacg gtcggtagac 8220
aacaaacggg gagggggcac ggaaggaact gggaccttcc acggtgaggg tgacaggaaa 8280
ggattatttt actcctttaa cgtagcgtaa cagactcatc cacagtaaga taagaccccc 8340
caccccaccc cgtcctgtcg aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg 8400
atgcggtggg ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag aattctgtgg aatgtgtgtc 8460
agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc caggcaggca gaagtatgca aagcatgcat 8520
ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag ttccccctcc taacccttct gttatcgtcc 8580
gtacgacccc tacgccaccc gagataccga agactccgcc tttcttggtc ttaagacacc 8640
ttacacacag tcaatcccac acctttcagg ggtccgaggg gtccgtccgt cttcatacgt 8700
ttcgtacgta gagttaatca gtcgttggtc cacacctttc tccccaggct ccccagcagg 8760
cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc 8820
gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat 8880
tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctctgcctct gagctattcc aggggtccga 8940
ggggtcgtcc gtcttcatac gtttcgtacg tagagttaat cagtcgttgg tatcagggcg 9000
gggattgagg cgggtagggc ggggattgag gcgggtcaag gcgggtaaga ggcggggtac 9060
cgactgatta aaaaaaataa atacgtctcc ggctccggcg gagacggaga ctcgataagg 9120
agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctc ccgggagctt 9180
gtatatccat tttcggatct gatcagcacg tgttgacaat taatcatcgg catagtatat 9240
cggcatagta taatacgaca aggtgaggaa ctaaaccatg gtgattgaac aagatggatt 9300
gcacgcaggt tcttcatcac tcctccgaaa aaacctccgg atccgaaaac gtttttcgag 9360
ggccctcgaa catataggta aaagcctaga ctagtcgtgc acaactgtta attagtagcc 9420
gtatcatata gccgtatcat attatgctgt tccactcctt gatttggtac cactaacttg 9480
ttctacctaa cgtgcgtcca tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 9540
gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 9600
gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg 9660
cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg agaggccggc gaacccacct ctccgataag 9720
ccgatactga cccgtgttgt ctgttagccg acgagactac ggcggcacaa ggccgacagt 9780
cgcgtccccg cgggccaaga aaaacagttc tggctggaca ggccacggga cttacttgac 9840
gtcctgctcc gtcgcgccga tagcaccgac cggtgctgcc gcgttccttg cgcagctgtg 9900
ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag 9960
gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg 10020
cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc cgcaaggaac 10080
gcgtcgacac gagctgcaac agtgacttcg cccttccctg accgacgata acccgcttca 10140
cggccccgtc ctagaggaca gtagagtgga acgaggacgg ctctttcata ggtagtaccg 10200
actacgttac gccgccgacg tatgcgaact aggccgatgg acgggtaagc tggtggttcg 10260
gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 10320
tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 10380
catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 10440
ggtggaaaat ctttgtagcg tagctcgctc gtgcatgagc ctaccttcgg ccagaacagc 10500
tagtcctact agacctgctt ctcgtagtcc ccgagcgcgg tcggcttgac aagcggtccg 10560
agttccgcgc gtacgggctg ccgctcctag agcagcactg ggtaccgcta cggacgaacg 10620
gcttatagta ccacctttta ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg 10680
tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg 10740
gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca 10800
tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct ccggcgaaaa gacctaagta gctgacaccg 10860
gccgacccac accgcctggc gatagtcctg tatcgcaacc gatgggcact ataacgactt 10920
ctcgaaccgc cgcttacccg actggcgaag gagcacgaaa tgccatagcg gcgagggcta 10980
agcgtcgcgt agcggaagat agcggaagaa ctgctcaaga tctgagcggg actctggggt 11040
tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg 11100
ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc 11160
agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt agactcgccc 11220
tgagacccca agctttactg gctggttcgc tgcgggttgg acggtagtgc tctaaagcta 11280
aggtggcggc ggaagatact ttccaacccg aagccttagc aaaaggccct gcggccgacc 11340
tactaggagg tcgcgcccct agagtacgac ctcaagaagc gggtggggtt gaacaaataa 11400
gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt 11460
ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt 11520
agatccgcgt atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc 11580
cccgacaccc cgtcgaatat taccaatgtt tatttcgtta tcgtagtgtt taaagtgttt 11640
atttcgtaaa aaaagtgacg taagatcaac accaaacagg tttgagtagt tacatagaat 11700
agtacagaca tctaggcgca taccacgtga gagtcatgtt agacgagact acggcgtatc 11760
aattcggtcg gggctgtggg gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc 11820
ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga atcaagcttg tggaaggcta 11880
ctcgaaatgt ttgacccaag ttaaacaatt taaaggcaat gctaccaaat actaattgag 11940
tgtatgtaaa cttctgaccc actgggaatg cggttgtggg cgactgcgcg ggactgcccg 12000
aacagacgag ggccgtaggc gaatgtctgt tcgacactgg cagaggccct tagttcgaac 12060
accttccgat gagctttaca aactgggttc aatttgttaa atttccgtta cgatggttta 12120
tgattaactc acatacattt gaagactggg tgacccttac tgatgaaaga aataaaagct 12180
gaaatgaatc attctctcta ctattattct gatatttcac attcttaaaa taaagtggtg 12240
atcctaactg acctaagaca gggaattttt actaggatta aatgtcagga attgtgaaaa 12300
agtgagttta aatgtatttg gctaaggtgt atgtaaactt ccgacttcaa actactttct 12360
ttattttcga ctttacttag taagagagat gataataaga ctataaagtg taagaatttt 12420
atttcaccac taggattgac tggattctgt cccttaaaaa tgatcctaat ttacagtcct 12480
taacactttt tcactcaaat ttacataaac cgattccaca tacatttgaa ggctgaagtt 12540
ctgtataggg atcctctagc tagagtcgac ctcgaggggg ggcccggtac ccagcttttg 12600
ttccctttag tgagggttaa tttcgagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 12660
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 12720
agcctggggt gacatatccc taggagatcg atctcagctg gagctccccc ccgggccatg 12780
ggtcgaaaac aagggaaatc actcccaatt aaagctcgaa ccgcattagt accagtatcg 12840
acaaaggaca cactttaaca ataggcgagt gttaaggtgt gttgtatgct cggccttcgt 12900
atttcacatt tcggacccca gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 12960
cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 13020
gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 13080
tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg cggattactc actcgattga gtgtaattaa 13140
cgcaacgcga gtgacgggcg aaaggtcagc cctttggaca gcacggtcga cgtaattact 13200
tagccggttg cgcgcccctc tccgccaaac gcataacccg cgagaaggcg aaggagcgag 13260
tgactgagcg acgcgagcca gcaagccgac gccgctcgcc tatcagctca ctcaaaggcg 13320
gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc 13380
cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc 13440
ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa atagtcgagt 13500
gagtttccgc cattatgcca ataggtgtct tagtccccta ttgcgtcctt tcttgtacac 13560
tcgttttccg gtcgttttcc ggtccttggc atttttccgg cgcaacgacc gcaaaaaggt 13620
atccgaggcg gggggactgc tcgtagtgtt tttagctgcg agttcagtct ccaccgcttt 13680
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 13740
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 13800
gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 13860
gggctgtgtg gggctgtcct gatatttcta tggtccgcaa agggggacct tcgagggagc 13920
acgcgagagg acaaggctgg gacggcgaat ggcctatgga caggcggaaa gagggaagcc 13980
cttcgcaccg cgaaagagta tcgagtgcga catccataga gtcaagccac atccagcaag 14040
cgaggttcga cccgacacac cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 14100
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 14160
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 14220
ggcctaacta cggctacact agaaggacag gtgcttgggg ggcaagtcgg gctggcgacg 14280
cggaataggc cattgatagc agaactcagg ttgggccatt ctgtgctgaa tagcggtgac 14340
cgtcgtcggt gaccattgtc ctaatcgtct cgctccatac atccgccacg atgtctcaag 14400
aacttcacca ccggattgat gccgatgtga tcttcctgtc tatttggtat ctgcgctctg 14460
ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 14520
gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 14580
caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga ataaaccata 14640
gacgcgagac gacttcggtc aatggaagcc tttttctcaa ccatcgagaa ctaggccgtt 14700
tgtttggtgg cgaccatcgc caccaaaaaa acaaacgttc gtcgtctaat gcgcgtcttt 14760
ttttcctaga gttcttctag gaaactagaa aagatgcccc agactgcgag tcaccttgct 14820
aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 14880
tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 14940
cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 15000
catagttgcc tttgagtgca attccctaaa accagtactc taatagtttt tcctagaagt 15060
ggatctagga aaatttaatt tttacttcaa aatttagtta gatttcatat atactcattt 15120
gaaccagact gtcaatggtt acgaattagt cactccgtgg atagagtcgc tagacagata 15180
aagcaagtag gtatcaacgg tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 15240
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 15300
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 15360
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc actgaggggc agcacatcta ttgatgctat 15420
gccctcccga atggtagacc ggggtcacga cgttactatg gcgctctggg tgcgagtggc 15480
cgaggtctaa atagtcgtta tttggtcggt cggccttccc ggctcgcgtc ttcaccagga 15540
cgttgaaata ggcggaggta ggtcagataa ttaacaacgg gggaagctag agtaagtagt 15600
tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc 15660
tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 15720
tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt cccttcgatc 15780
tcattcatca agcggtcaat tatcaaacgc gttgcaacaa cggtaacgat gtccgtagca 15840
ccacagtgcg agcagcaaac cataccgaag taagtcgagg ccaagggttg ctagttccgc 15900
tcaatgtact agggggtaca acacgttttt tcgccaatcg aggaagccag gaggctagca 15960
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 16020
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 16080
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 16140
taccgcgcca acagtcttca ttcaaccggc gtcacaatag tgagtaccaa taccgtcgtg 16200
acgtattaag agaatgacag tacggtaggc attctacgaa aagacactga ccactcatga 16260
gttggttcag taagactctt atcacatacg ccgctggctc aacgagaacg ggccgcagtt 16320
atgccctatt atggcgcggt catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt 16380
cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca 16440
ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa 16500
aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gtatcgtctt gaaattttca cgagtagtaa 16560
ccttttgcaa gaagccccgc ttttgagagt tcctagaatg gcgacaactc taggtcaagc 16620
tacattgggt gagcacgtgg gttgactaga agtcgtagaa aatgaaagtg gtcgcaaaga 16680
cccactcgtt tttgtccttc cgttttacgg cgttttttcc gaataagggc gacacggaaa 16740
tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 16800
ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 16860
acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cttattcccg 16920
ctgtgccttt acaacttatg agtatgagaa ggaaaaagtt ataataactt cgtaaatagt 16980
cccaataaca gagtactcgc ctatgtataa acttacataa atctttttat ttgtttatcc 17040
ccaaggcgcg tgtaaagggg cttttcacgg tggactgcgc gggacatcgc cgcgtaattc 17100
cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc 17160
cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc 17220
tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa 17280
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gggcagttcg agatttagcc cccgagggaa atcccaaggc taaatcacga aatgccgtgg 17460
agctggggtt ttttgaacta tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga 17520
cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa 17580
ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga 17640
tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga atcccactac caagtgcatc acccggtagc 17700
gggactatct gccaaaaagc gggaaactgc aacctcaggt gcaagaaatt atcacctgag 17760
aacaaggttt gaccttgttg tgagttggga tagagccaga taagaaaact aaatattccc 17820
taaaacggct aaagccggat aaccaatttt ttactcgact tttaacaaaa atttaacgcg 17880
aattttaaca aaatattaac gcttacaatt tccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 17940
gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg 18000
ctgaaattgt ttttaaattg cgcttaaaat tgttttataa ttgcgaatgt taaaggtaag 18060
cggtaagtcc gacgcgttga caacccttcc cgctagccac gcccggagaa gcgataatgc 18120
ggtcgaccgc tttcccccta cacgac 18146
<210> 2
<211> 526
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Thr Arg Cys Pro Asp Gly Gln Phe Cys Pro Val Ala Cys Cys Leu Asp
1 5 10 15
Pro Gly Gly Ala Ser Tyr Ser Cys Cys Arg Pro Leu Leu Asp Lys Trp
20 25 30
Pro Thr Thr Leu Ser Arg His Leu Gly Gly Pro Cys Gln Val Asp Ala
35 40 45
His Cys Ser Ala Gly His Ser Cys Ile Phe Thr Val Ser Gly Thr Ser
50 55 60
Ser Cys Cys Pro Phe Pro Glu Ala Val Ala Cys Gly Asp Gly His His
65 70 75 80
Cys Cys Pro Arg Gly Phe His Cys Ser Ala Asp Gly Arg Ser Cys Phe
85 90 95
Gln Arg Ser Gly Asn Asn Ser Val Gly Ala Ile Gln Cys Pro Asp Ser
100 105 110
Gln Phe Glu Cys Pro Asp Phe Ser Thr Cys Cys Val Met Val Asp Gly
115 120 125
Ser Trp Gly Cys Cys Ala Leu Ser Ser Ser Val Met Cys Pro Asp Ala
130 135 140
Arg Ser Arg Cys Pro Asp Gly Ser Thr Cys Cys Glu Leu Pro Ser Gly
145 150 155 160
Lys Tyr Gly Cys Cys Pro Met Pro Asn Ala Thr Cys Cys Ser Asp His
165 170 175
Leu His Cys Cys Pro Gln Asp Thr Val Cys Asp Leu Ile Gln Ser Lys
180 185 190
Cys Leu Ser Lys Glu Asn Ala Thr Thr Asp Leu Leu Thr Lys Leu Pro
195 200 205
Ala His Thr Val Gly Asp Val Lys Cys Asp Met Glu Val Ser Cys Pro
210 215 220
Asp Gly Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gln Ser Gly Ala Trp Gly Cys Cys
225 230 235 240
Pro Phe Thr Gln Ala Val Cys Cys Glu Asp His Ile His Cys Cys Pro
245 250 255
Ala Gly Phe Thr Cys Asp Thr Gln Lys Gly Thr Cys Glu Gln Gly Pro
260 265 270
His Gln Val Pro Trp Met Glu Lys Ala Pro Ala His Leu Ser Leu Pro
275 280 285
Asp Pro Gln Ala Leu Lys Arg Asp Val Pro Cys Asp Asn Val Ser Ser
290 295 300
Cys Pro Ser Ser Asp Thr Cys Cys Gln Leu Thr Ser Gly Glu Trp Gly
305 310 315 320
Cys Cys Pro Ile Pro Glu Ala Val Cys Cys Ser Asp His Gln His Cys
325 330 335
Cys Pro Gln Gly Tyr Thr Cys Val Ala Glu Gly Gln Cys Gln Arg Gly
340 345 350
Ser Glu Ile Val Ala Gly Leu Glu Lys Met Pro Ala Arg Arg Ala Ser
355 360 365
Leu Ser His Pro Arg Asp Ile Gly Cys Asp Gln His Thr Ser Cys Pro
370 375 380
Val Gly Gln Thr Cys Cys Pro Ser Leu Gly Gly Ser Trp Ala Cys Cys
385 390 395 400
Gln Leu Pro His Ala Val Cys Cys Glu Asp Arg Gln His Cys Cys Pro
405 410 415
Ala Gly Tyr Thr Cys Asn Val Lys Ala Arg Ser Cys Glu Lys Glu Val
420 425 430
Val Ser Ala Gln Pro Ala Thr Phe Leu Ala Arg Ser Pro His Val Gly
435 440 445
Val Lys Asp Val Glu Cys Gly Glu Gly His Phe Cys His Asp Asn Gln
450 455 460
Thr Cys Cys Arg Asp Asn Arg Gln Gly Trp Ala Cys Cys Pro Tyr Arg
465 470 475 480
Gln Gly Val Cys Cys Ala Asp Arg Arg His Cys Cys Pro Ala Gly Phe
485 490 495
Arg Cys Ala Ala Arg Gly Thr Lys Cys Leu Arg Arg Glu Ala Pro Arg
500 505 510
Trp Asp Ala Pro Leu Arg Asp Pro Ala Leu Arg Gln Leu Leu
515 520 525
<210> 3
<211> 9109
<212> DNA
<213> 智人
<400> 3
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 60
ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt ggagctcgga tccctataca 120
gttgaagtcg gaagtttaca tacacttaag ttggagtcat taaaactcgt ttttcaacta 180
ctccacaaat ttcttgttaa caaacaatag ttttggcaag tcagttagga catctacttt 240
gtgcatgaca caagtcattt ttccaacaat tgtttacaga cagattattt cacttataat 300
tcactgtatc acaattccag tgggtcagaa gtttacatac actaagttga ctgtgccttt 360
aaacagcttg gaaaattcca gaaaatgatg tcatggcttt agaagctaga tctagagtcg 420
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 480
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 540
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 600
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 660
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 720
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 780
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 840
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 900
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 960
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 1020
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 1080
gagtcgctgc gacgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 1140
ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 1200
ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 1260
agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc 1320
gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc 1380
tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg 1440
ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg 1500
tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac 1560
ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt 1620
ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg 1680
gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc 1740
ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 1800
cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc 1860
ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag 1920
ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg 1980
cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg 2040
accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc 2100
ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt ctgcagtcga 2160
cggtaccgcg ggcccgggat ccgccaccat gtacgccctg tttctgctgg ccagcctgct 2220
gggcgccgct ctggctggac ctgttctggg actgaaggag tgcaccaggg gcagcgccgt 2280
gtggtgtcag aacgtgaaga ccgccagcga ttgcggcgcc gtgaagcact gcctgcagac 2340
agtgtggaac aagcctacag tgaagagcct gccttgtgat atctgcaagg atgtggtgac 2400
cgccgccgga gatatgctga aggacaacgc caccgaggag gagatcctgg tgtacctgga 2460
gaagacctgc gattggctgc ctaagcctaa tatgagcgcc agctgcaagg agatcgtgga 2520
cagctacctg cccgtgatcc tggacatcat caagggcgag atgtccagac ctggcgaggt 2580
gtgcagcgcc ctgaacctgt gtgagagcct gcagaagcac ctggccgagc tgaatcacca 2640
gaagcagctg gagagcaaca agatccctga gctggacatg accgaggtgg tggccccttt 2700
tatggccaac atccctctgc tgctgtaccc tcaggatggc cctaggagca agcctcagcc 2760
caaggacaat ggcgatgtgt gtcaggactg catccagatg gtgacagata tccagacagc 2820
cgtgaggacc aatagcacct tcgtgcaggc cctggtggag cacgtgaagg aggagtgtga 2880
taggctgggc cccggcatgg ccgacatctg taagaattac atcagccagt acagcgagat 2940
cgccatccag atgatgatgc acatgcagcc taaggagatc tgcgccctgg tgggcttttg 3000
cgatgaggtg aaggagatgc ccatgcagac cctggtgccc gccaaggtgg cctctaagaa 3060
cgtgatcccc gccctggagc tggtggagcc tatcaagaag cacgaggtgc ctgccaagtc 3120
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gtccctgagc gaggagtgcc aggaggtggt ggatacctac ggctccagca tcctgtccat 3300
cctgctggag gaggtgagcc ctgagctggt gtgctccatg ctgcacctgt gtagcggcac 3360
cagactgcct gccctgacag tgcacgtgac ccagcctaag gacggcggct tttgtgaggt 3420
gtgtaagaag ctggtgggct acctggatag gaatctggag aagaactcca ccaagcagga 3480
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tgatcagttc gtggccgagt acgagcctgt gctgatcgag atcctggtcg aggtcatgga 3600
cccttccttt gtgtgcctga agatcggcgc ctgcccttcc gcccacaagc ctctgctggg 3660
cacagagaag tgcatctggg gccccagcta ctggtgccag aacaccgaga cagccgccca 3720
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gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt 3840
ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta 3900
ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg 3960
ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc 4020
ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag aaccagaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt 4080
agggtgtgga aagtccccag gctccccagg caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca 4140
attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa 4200
gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc 4260
taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg 4320
cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg 4380
gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gagcttgtat atccattttc ggatctgatc 4440
agcacgtgtt gacaattaat catcggcata gtatatcggc atagtataat acgacaaggt 4500
gaggaactaa accatgaaaa agcctgaact caccgcgacg tctgtcgaga agtttctgat 4560
cgaaaagttc gacagcgtct ccgacctgat gcagctctcg gagggcgaag aatctcgtgc 4620
tttcagcttc gatgtaggag ggcgtggata tgtcctgcgg gtaaatagct gcgccgatgg 4680
tttctacaaa gatcgttatg tttatcggca ctttgcatcg gccgcgctcc cgattccgga 4740
agtgcttgac attggggaat tcagcgagag cctgacctat tgcatctccc gccgtgcaca 4800
gggtgtcacg ttgcaagacc tgcctgaaac cgaactgccc gctgttctgc agccggtcgc 4860
ggaggcaatg gatgcgattg ctgcggccga tcttagccag acgagcgggt tcggcccatt 4920
cggaccgcaa ggaatcggtc aatacactac atggcgtgat ttcatatgcg cgattgctga 4980
tccccatgtg tatcactggc aaactgtgat ggacgacacc gtcagtgcgt ccgtcgcgca 5040
ggctctcgat gagctgatgc tttgggccga ggactgcccc gaagtccggc acctcgtgca 5100
cgcggatttc ggctccaaca atgtcctgac ggacaatggc cgcataacag cggtcattga 5160
ctggagcgag gcgatgttcg gggattccca atacgaggtc gccaacatct tcttctggag 5220
gccgtggttg gcttgtatgg agcagcagac gcgctacttc gagcggaggc atccggagct 5280
tgcaggatcg ccgcggctcc gggcgtatat gctccgcatt ggtcttgacc aactctatca 5340
gagcttggtt gacggcaatt tcgatgatgc agcttgggcg cagggtcgat gcgacgcaat 5400
cgtccgatcc ggagccggga ctgtcgggcg tacacaaatc gcccgcagaa gcgcggccgt 5460
ctggaccgat ggctgtgtag aagtactcgc cgatagtgga aaccgacgcc ccagcactcg 5520
tggggatcgg gagatggggg aggctaactg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac 5580
caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg 5640
ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc 5700
atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa 5760
agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 5820
ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtagat ccgcgtatgg tgcactctca 5880
gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg 5940
acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 6000
ccgggaatca agcttgtgga aggctactcg aaatgtttga cccaagttaa acaatttaaa 6060
ggcaatgcta ccaaatacta attgagtgta tgtaaacttc tgacccactg ggaatgtgat 6120
gaaagaaata aaagctgaaa tgaatcattc tctctactat tattctgata tttcacattc 6180
ttaaaataaa gtggtgatcc taactgacct aagacaggga atttttacta ggattaaatg 6240
tcaggaattg tgaaaaagtg agtttaaatg tatttggcta aggtgtatgt aaacttccga 6300
cttcaactgt atagggatcc tctagctaga gtcgacctcg agggggggcc cggtacccag 6360
cttttgttcc ctttagtgag ggttaatttc gagcttggcg taatcatggt catagctgtt 6420
tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 6480
gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 6540
gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 6600
ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 6660
ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 6720
cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 6780
gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 6840
tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 6900
ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 6960
atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 7020
gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 7080
tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 7140
cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 7200
cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt 7260
tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 7320
cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 7380
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 7440
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 7500
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 7560
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 7620
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 7680
atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 7740
agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 7800
ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 7860
tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 7920
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 7980
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 8040
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 8100
atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 8160
accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 8220
aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 8280
gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 8340
tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 8400
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 8460
ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 8520
aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgcgccct gtagcggcgc 8580
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 8640
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 8700
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 8760
ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 8820
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 8880
aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 8940
ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 9000
attaacgctt acaatttcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg 9060
gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctg 9109
<210> 4
<211> 524
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Met Tyr Ala Leu Phe Leu Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Ala Leu Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Leu Gly Leu Lys Glu Cys Thr Arg Gly Ser Ala Val Trp
20 25 30
Cys Gln Asn Val Lys Thr Ala Ser Asp Cys Gly Ala Val Lys His Cys
35 40 45
Leu Gln Thr Val Trp Asn Lys Pro Thr Val Lys Ser Leu Pro Cys Asp
50 55 60
Ile Cys Lys Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Asp Met Leu Lys Asp Asn
65 70 75 80
Ala Thr Glu Glu Glu Ile Leu Val Tyr Leu Glu Lys Thr Cys Asp Trp
85 90 95
Leu Pro Lys Pro Asn Met Ser Ala Ser Cys Lys Glu Ile Val Asp Ser
100 105 110
Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Ile Ile Lys Gly Glu Met Ser Arg Pro
115 120 125
Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Glu Ser Leu Gln Lys His
130 135 140
Leu Ala Glu Leu Asn His Gln Lys Gln Leu Glu Ser Asn Lys Ile Pro
145 150 155 160
Glu Leu Asp Met Thr Glu Val Val Ala Pro Phe Met Ala Asn Ile Pro
165 170 175
Leu Leu Leu Tyr Pro Gln Asp Gly Pro Arg Ser Lys Pro Gln Pro Lys
180 185 190
Asp Asn Gly Asp Val Cys Gln Asp Cys Ile Gln Met Val Thr Asp Ile
195 200 205
Gln Thr Ala Val Arg Thr Asn Ser Thr Phe Val Gln Ala Leu Val Glu
210 215 220
His Val Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ala Asp Ile
225 230 235 240
Cys Lys Asn Tyr Ile Ser Gln Tyr Ser Glu Ile Ala Ile Gln Met Met
245 250 255
Met His Met Gln Pro Lys Glu Ile Cys Ala Leu Val Gly Phe Cys Asp
260 265 270
Glu Val Lys Glu Met Pro Met Gln Thr Leu Val Pro Ala Lys Val Ala
275 280 285
Ser Lys Asn Val Ile Pro Ala Leu Glu Leu Val Glu Pro Ile Lys Lys
290 295 300
His Glu Val Pro Ala Lys Ser Asp Val Tyr Cys Glu Val Cys Glu Phe
305 310 315 320
Leu Val Lys Glu Val Thr Lys Leu Ile Asp Asn Asn Lys Thr Glu Lys
325 330 335
Glu Ile Leu Asp Ala Phe Asp Lys Met Cys Ser Lys Leu Pro Lys Ser
340 345 350
Leu Ser Glu Glu Cys Gln Glu Val Val Asp Thr Tyr Gly Ser Ser Ile
355 360 365
Leu Ser Ile Leu Leu Glu Glu Val Ser Pro Glu Leu Val Cys Ser Met
370 375 380
Leu His Leu Cys Ser Gly Thr Arg Leu Pro Ala Leu Thr Val His Val
385 390 395 400
Thr Gln Pro Lys Asp Gly Gly Phe Cys Glu Val Cys Lys Lys Leu Val
405 410 415
Gly Tyr Leu Asp Arg Asn Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Gln Glu Ile
420 425 430
Leu Ala Ala Leu Glu Lys Gly Cys Ser Phe Leu Pro Asp Pro Tyr Gln
435 440 445
Lys Gln Cys Asp Gln Phe Val Ala Glu Tyr Glu Pro Val Leu Ile Glu
450 455 460
Ile Leu Val Glu Val Met Asp Pro Ser Phe Val Cys Leu Lys Ile Gly
465 470 475 480
Ala Cys Pro Ser Ala His Lys Pro Leu Leu Gly Thr Glu Lys Cys Ile
485 490 495
Trp Gly Pro Ser Tyr Trp Cys Gln Asn Thr Glu Thr Ala Ala Gln Cys
500 505 510
Asn Ala Val Glu His Cys Lys Arg His Val Trp Asn
515 520
<210> 5
<211> 8869
<212> DNA
<213> 智人
<400> 5
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 60
ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt ggagctcgga tccctataca 120
gttgaagtcg gaagtttaca tacacttaag ttggagtcat taaaactcgt ttttcaacta 180
ctccacaaat ttcttgttaa caaacaatag ttttggcaag tcagttagga catctacttt 240
gtgcatgaca caagtcattt ttccaacaat tgtttacaga cagattattt cacttataat 300
tcactgtatc acaattccag tgggtcagaa gtttacatac actaagttga ctgtgccttt 360
aaacagcttg gaaaattcca gaaaatgatg tcatggcttt agaagctaga tctagagtcg 420
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 480
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 540
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 600
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 660
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 720
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 780
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 840
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 900
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 960
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 1020
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 1080
gagtcgctgc gacgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 1140
ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 1200
ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 1260
agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc 1320
gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc 1380
tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg 1440
ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg 1500
tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac 1560
ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt 1620
ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg 1680
gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc 1740
ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 1800
cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc 1860
ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag 1920
ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg 1980
cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg 2040
accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc 2100
ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt ctgcagtcga 2160
cggtaccgcg ggcccgggat ccgccaccat gtacgccctg tttctgctgg ccagcctgct 2220
gggcgccgct ctggctggac ctgttctggg actgaaggag tgcaccaggg gcagcgccgt 2280
gtggtgtcag aacgtgaaga ccgccagcga ttgcggcgcc gtgaagcact gcctgcagac 2340
agtgtggaac aagcctacag tgaagagcct gccttgtgat atctgcaagg atgtggtgac 2400
cgccgccgga gatatgctga aggacaacgc caccgaggag gagatcctgg tgtacctgga 2460
gaagacctgc gattggctgc ctaagcctaa tatgagcgcc agctgcaagg agatcgtgga 2520
cagctacctg cccgtgatcc tggacatcat caagggcgag atgtccagac ctggcgaggt 2580
gtgcagcgcc ctgaacctgt gtgagagcct gcagaagcac ctggccgagc tgaatcacca 2640
gaagcagctg gagagcaaca agatccctga gctggacatg accgaggtgg tggccccttt 2700
tatggccaac atccctctgc tgctgtaccc tcaggatggc cctaggagca agcctcagcc 2760
caaggacaat ggcgatgtgt gtcaggactg catccagatg gtgacagata tccagacagc 2820
cgtgaggacc aatagcacct tcgtgcaggc cctggtggag cacgtgaagg aggagtgtga 2880
taggctgggc cccggcatgg ccgacatctg taagaattac atcagccagt acagcgagat 2940
cgccatccag atgatgatgc acatgcagcc taaggagatc tgcgccctgg tgggcttttg 3000
cgatgaggtg aaggagatgc ccatgcagac cctggtgccc gccaaggtgg cctctaagaa 3060
cgtgatcccc gccctggagc tggtggagcc tatcaagaag cacgaggtgc ctgccaagtc 3120
cgacgtgtac tgtgaggtgt gcgagttcct ggtgaaggag gtgaccaagc tgatcgacaa 3180
taataagacc gagaaggaga tcctggacgc ctttgacaag atgtgctcca agctgcccaa 3240
gtccctgagc gaggagtgcc aggaggtggt ggatacctac ggctccagca tcctgtccat 3300
cctgctggag gaggtgagcc ctgagctggt gtgctccatg ctgcacctgt gtagcggcac 3360
cagactgcct gccctgacag tgcacgtgac ccagcctaag gacggcggct tttgtgaggt 3420
gtgtaagaag ctggtgggct acctggatag gaatctggag aagaactcca ccaagcagga 3480
gatcctggcc gccctggaga agggctgcag ctttctgccc gatccttacc agaagcagtg 3540
tgatcagttc gtggccgagt acgagcctgt gctgatcgag atcctggtcg aggtcatgga 3600
cccttccttt gtgtgcctga agatcggcgc ctgcccttcc gcccacaagc ctctgctggg 3660
cacagagaag tgcatctggg gccccagcta ctggtgccag aacaccgaga cagccgccca 3720
gtgtaatgcc gtggagcact gcaagaggca cgtgtggaac tgatgactcg agtctagagg 3780
gcccgtttaa acccgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt 3840
ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta 3900
ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg 3960
ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc 4020
ggtgggctct atggcttctg aggcggaaag aaccagaatt ctgtggaatg tgtgtcagtt 4080
agggtgtgga aagtccccag gctccccagg caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca 4140
attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatgcaaa 4200
gcatgcatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc 4260
taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg 4320
cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg 4380
gaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gagcttgtat atccattttc ggatctgatc 4440
agcacgtgtt gacaattaat catcggcata gtatatcggc atagtataat acgacaaggt 4500
gaggaactaa accatggtga ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg 4560
ggtggagagg ctattcggct atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc 4620
cgtgttccgg ctgtcagcgc aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg 4680
tgccctgaat gaactgcagg acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt 4740
tccttgcgca gctgtgctcg acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg 4800
cgaagtgccg gggcaggatc tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat 4860
catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca 4920
ccaagcgaaa catcgcatcg agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca 4980
ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa 5040
ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa 5100
tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc 5160
ggaccgctat caggacatag cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga 5220
atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc 5280
cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg agcgggactc tggggttcga aatgaccgac 5340
caagcgacgc ccaacctgcc atcacgagat ttcgattcca ccgccgcctt ctatgaaagg 5400
ttgggcttcg gaatcgtttt ccgggacgcc ggctggatga tcctccagcg cggggatctc 5460
atgctggagt tcttcgccca ccccaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa 5520
agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt 5580
ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtagat ccgcgtatgg tgcactctca 5640
gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg 5700
acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 5760
ccgggaatca agcttgtgga aggctactcg aaatgtttga cccaagttaa acaatttaaa 5820
ggcaatgcta ccaaatacta attgagtgta tgtaaacttc tgacccactg ggaatgtgat 5880
gaaagaaata aaagctgaaa tgaatcattc tctctactat tattctgata tttcacattc 5940
ttaaaataaa gtggtgatcc taactgacct aagacaggga atttttacta ggattaaatg 6000
tcaggaattg tgaaaaagtg agtttaaatg tatttggcta aggtgtatgt aaacttccga 6060
cttcaactgt atagggatcc tctagctaga gtcgacctcg agggggggcc cggtacccag 6120
cttttgttcc ctttagtgag ggttaatttc gagcttggcg taatcatggt catagctgtt 6180
tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 6240
gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 6300
gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 6360
ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 6420
ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 6480
cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 6540
gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 6600
tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 6660
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cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 6960
cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt 7020
tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 7080
cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 7140
cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 7200
gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 7260
gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 7320
gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 7380
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 7440
atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 7500
agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 7560
ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 7620
tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 7680
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 7740
caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 7800
gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 7860
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aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 8040
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tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 8160
aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 8220
ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 8280
aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgcgccct gtagcggcgc 8340
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ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 8760
attaacgctt acaatttcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg 8820
gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctg 8869
<210> 6
<211> 8974
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 60
ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt ggagctcgga tccctataca 120
gttgaagtcg gaagtttaca tacacttaag ttggagtcat taaaactcgt ttttcaacta 180
ctccacaaat ttcttgttaa caaacaatag ttttggcaag tcagttagga catctacttt 240
gtgcatgaca caagtcattt ttccaacaat tgtttacaga cagattattt cacttataat 300
tcactgtatc acaattccag tgggtcagaa gtttacatac actaagttga ctgtgccttt 360
aaacagcttg gaaaattcca gaaaatgatg tcatggcttt agaagctaga tctagagtcg 420
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 480
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 540
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 600
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 660
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 720
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 780
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 840
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 900
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 960
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 1020
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 1080
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ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 1200
ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 1260
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tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac 1560
ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt 1620
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cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg 2040
accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc 2100
ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt ctgcagtcga 2160
cggtaccgcg ggcccgggat ccgccaccat gccgctgctg ctactgctgc ccctgctgtg 2220
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cggaagcctc agactgagct gcgccgcttc cggctttacc ttcagcagct acgccatgag 2340
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cggatacaca tcctacgctg attccgtcaa aggaagattc accatcagca gagacaactc 2460
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ttctgaggcg gaaagaacca gaattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc 3960
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ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg 4200
cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt 4260
gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca ttttcggatc tgatcagcac gtgttgacaa 4320
ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga actaaaccat 4380
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20 25 30
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
35 40 45
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
50 55 60
Ser Ser Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val
65 70 75 80
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
85 90 95
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Arg Thr Tyr Gly Gly Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
115 120 125
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
145 150 155 160
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
165 170 175
Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
180 185 190
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
195 200 205
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
210 215 220
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr
225 230 235 240
Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val
260 265 270
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr
275 280 285
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu
290 295 300
Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln
305 310 315 320
Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
325 330 335
Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg
340 345 350
Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser
370 375 380
Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr
420 425 430
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu
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His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
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ctccacaaat ttcttgttaa caaacaatag ttttggcaag tcagttagga catctacttt 240
gtgcatgaca caagtcattt ttccaacaat tgtttacaga cagattattt cacttataat 300
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agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc 1320
gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc 1380
tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg 1440
ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg 1500
tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac 1560
ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt 1620
ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg 1680
gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc 1740
ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 1800
cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc 1860
ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag 1920
ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg 1980
cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg 2040
accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc 2100
ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt ctgcagtcga 2160
cggtaccgcg ggcccgggat ccgccaccat gccgctgctg ctactgctgc ccctgctgtg 2220
ggcaggggcg ctagctgaag tgcagctgct ggagagcggc ggaggactgg tgcaacccgg 2280
cggaagcctc agactgagct gcgccgcctc cggattcaca ttctacggca gcggcatgag 2340
ctgggtcaga caagcccccg gaaagggact cgaatgggtg tccggcatca gcagctacgg 2400
aggcagcaca tattacgccg acagcgtgaa gggaagattc accatctcta gagacaactc 2460
caagaacacc ctctatctgc agatgaattc tctgagggcc gaggacaccg ccgtgtatta 2520
ttgcgctagg gccaactact ggcactccag cctcgattat tggggccaag gcacactggt 2580
gacagtgagc tccggcggag gaggaagcgg aggaggagga tccggcggcg gaggcagcga 2640
tatccagatg acacaaagcc ccagcagcct ctccgcttcc gtgggagata gggtgaccat 2700
tacatgcaga gcttcccaga gcatctcctc ctacctcaac tggtatcagc agaaacccgg 2760
caaggctccc aagctgctga tctatgctgc cagctctctg cagagcggag tgcctagcag 2820
attctccggc tccggaagcg gaaccgactt cacactgaca atcagctccc tccagcccga 2880
ggacttcgcc acctattact gtcagcagag cgctggactg ctgaccttcg gccaaggcac 2940
caagctggag atcaagggag gcggcggctc caagccttgc atctgcaccg gaagcgaggt 3000
gagcagcgtg ttcattttcc ctcccaagcc caaggacgtg ctcaccatca cactcacacc 3060
caaagtgaca tgcgtggtgg tggatatctc ccaagacgac cccgaggtgc acttcagctg 3120
gttcgtggac gacgtggaag tgcatacagc tcagacaaga cctcccgagg agcagttcaa 3180
ctccaccttt aggtccgtca gcgaactccc tatcctccat caagactggc tgaatggaag 3240
aacatttaga tgcaaggtga ccagcgccgc cttcccttcc cccatcgaga agacaatcag 3300
caagcccgag ggaaggaccc aagtgcctca cgtctacaca atgagcccca ccaaggagga 3360
gatgacacag aacgaggtga gcatcacatg catggtcaag ggcttctatc ctcccgatat 3420
ctacgtcgaa tggcagatga acggccagcc ccaagaaaac tacaagaata ccccccccac 3480
catggacaca gacggcagct actttctgta cagcaaactg aacgtgaaga aagagaagtg 3540
gcagcaaggc aacacattca catgctccgt gctgcacgaa ggactgcaca accaccatac 3600
cgagaagtcc ctcagccata gccccggcaa gtgatgactc gagtctagag ggcccgttta 3660
aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 3720
ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 3780
ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 3840
ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 3900
tatggcttct gaggcggaaa gaaccagaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg 3960
aaagtcccca ggctccccag gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag 4020
caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 4080
tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc 4140
ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg 4200
aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 4260
gcttttgcaa aaagctcccg ggagcttgta tatccatttt cggatctgat cagcacgtgt 4320
tgacaattaa tcatcggcat agtatatcgg catagtataa tacgacaagg tgaggaacta 4380
aaccatgaaa aagcctgaac tcaccgcgac gtctgtcgag aagtttctga tcgaaaagtt 4440
cgacagcgtc tccgacctga tgcagctctc ggagggcgaa gaatctcgtg ctttcagctt 4500
cgatgtagga gggcgtggat atgtcctgcg ggtaaatagc tgcgccgatg gtttctacaa 4560
agatcgttat gtttatcggc actttgcatc ggccgcgctc ccgattccgg aagtgcttga 4620
cattggggaa ttcagcgaga gcctgaccta ttgcatctcc cgccgtgcac agggtgtcac 4680
gttgcaagac ctgcctgaaa ccgaactgcc cgctgttctg cagccggtcg cggaggcaat 4740
ggatgcgatt gctgcggccg atcttagcca gacgagcggg ttcggcccat tcggaccgca 4800
aggaatcggt caatacacta catggcgtga tttcatatgc gcgattgctg atccccatgt 4860
gtatcactgg caaactgtga tggacgacac cgtcagtgcg tccgtcgcgc aggctctcga 4920
tgagctgatg ctttgggccg aggactgccc cgaagtccgg cacctcgtgc acgcggattt 4980
cggctccaac aatgtcctga cggacaatgg ccgcataaca gcggtcattg actggagcga 5040
ggcgatgttc ggggattccc aatacgaggt cgccaacatc ttcttctgga ggccgtggtt 5100
ggcttgtatg gagcagcaga cgcgctactt cgagcggagg catccggagc ttgcaggatc 5160
gccgcggctc cgggcgtata tgctccgcat tggtcttgac caactctatc agagcttggt 5220
tgacggcaat ttcgatgatg cagcttgggc gcagggtcga tgcgacgcaa tcgtccgatc 5280
cggagccggg actgtcgggc gtacacaaat cgcccgcaga agcgcggccg tctggaccga 5340
tggctgtgta gaagtactcg ccgatagtgg aaaccgacgc cccagcactc gtggggatcg 5400
ggagatgggg gaggctaact gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg 5460
cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc 5520
ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag 5580
ttcttcgccc accccaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 5640
atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 5700
ctcatcaatg tatcttatca tgtctgtaga tccgcgtatg gtgcactctc agtacaatct 5760
gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 5820
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggaatc 5880
aagcttgtgg aaggctactc gaaatgtttg acccaagtta aacaatttaa aggcaatgct 5940
accaaatact aattgagtgt atgtaaactt ctgacccact gggaatgtga tgaaagaaat 6000
aaaagctgaa atgaatcatt ctctctacta ttattctgat atttcacatt cttaaaataa 6060
agtggtgatc ctaactgacc taagacaggg aatttttact aggattaaat gtcaggaatt 6120
gtgaaaaagt gagtttaaat gtatttggct aaggtgtatg taaacttccg acttcaactg 6180
tatagggatc ctctagctag agtcgacctc gagggggggc ccggtaccca gcttttgttc 6240
cctttagtga gggttaattt cgagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 6300
aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc 6360
ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 6420
ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 6480
cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 6540
tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 6600
aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 6660
aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 6720
tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 6780
ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 6840
cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 6900
ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 6960
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 7020
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 7080
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 7140
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 7200
aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 7260
aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 7320
ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 7380
aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 7440
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 7500
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 7560
cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 7620
ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 7680
gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 7740
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 7800
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 7860
ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 7920
catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 7980
tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 8040
ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 8100
catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 8160
cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 8220
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 8280
acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 8340
ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt 8400
tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 8460
ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc 8520
tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct 8580
aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa 8640
acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc 8700
tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact 8760
caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg 8820
gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgct 8880
tacaatttcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc 8940
tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg 8980
<210> 9
<211> 481
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
20 25 30
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Gly Ser
35 40 45
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
50 55 60
Ser Gly Ile Ser Ser Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
65 70 75 80
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
85 90 95
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Arg Ala Asn Tyr Trp His Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
145 150 155 160
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
165 170 175
Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
180 185 190
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
195 200 205
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
210 215 220
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
225 230 235 240
Ser Ala Gly Leu Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser
260 265 270
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr
275 280 285
Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp
290 295 300
Pro Glu Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr
305 310 315 320
Ala Gln Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser
325 330 335
Val Ser Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr
340 345 350
Phe Arg Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys
355 360 365
Thr Ile Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr
370 375 380
Met Ser Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr
385 390 395 400
Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln
405 410 415
Met Asn Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met
420 425 430
Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys
435 440 445
Glu Lys Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu
450 455 460
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
465 470 475 480
Lys
<210> 10
<211> 8974
<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 60
ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt ggagctcgga tccctataca 120
gttgaagtcg gaagtttaca tacacttaag ttggagtcat taaaactcgt ttttcaacta 180
ctccacaaat ttcttgttaa caaacaatag ttttggcaag tcagttagga catctacttt 240
gtgcatgaca caagtcattt ttccaacaat tgtttacaga cagattattt cacttataat 300
tcactgtatc acaattccag tgggtcagaa gtttacatac actaagttga ctgtgccttt 360
aaacagcttg gaaaattcca gaaaatgatg tcatggcttt agaagctaga tctagagtcg 420
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 480
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 540
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 600
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 660
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 720
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 780
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 840
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 900
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 960
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 1020
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 1080
gagtcgctgc gacgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 1140
ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 1200
ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 1260
agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc 1320
gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc 1380
tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg 1440
ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg 1500
tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac 1560
ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt 1620
ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg 1680
gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc 1740
ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 1800
cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc 1860
ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag 1920
ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg 1980
cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg 2040
accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc 2100
ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt ctgcagtcga 2160
cggtaccgcg ggcccgggat ccgccaccat gccgctgctg ctactgctgc ccctgctgtg 2220
ggcaggggcg ctagctgaag tccagctgct ggagtccgga ggaggactgg tgcaacccgg 2280
cggatctctg agactcagct gcgccgccag cggcttcaca tttagcagct acgccatgag 2340
ctgggtgaga caagcccccg gaaaaggact ggagtgggtg agcgccattt ccggaagcgg 2400
cggatccaca tattacgccg acagcgtcaa aggaagattt accatctcca gagacaactc 2460
caaaaacaca ctgtatctgc agatgaactc cctcagagcc gaggacaccg ccgtgtacta 2520
ctgcgccaga agctatagcg ccttcgacta ttggggccaa ggcacactgg tgacagtgag 2580
cagcggagga ggcggaagcg gaggaggagg atccggaggc ggaggaagcg atatccaaat 2640
gacacagagc cctagctccc tcagcgcttc cgtgggcgat agggtcacaa tcacatgtag 2700
ggctagccag tccatctcct cctatctgaa ctggtaccag cagaagcccg gcaaagcccc 2760
caagctgctg atctacgctg ctagctctct gcaaagcggc gtgccctcca gattctccgg 2820
cagcggatcc ggcaccgact tcacactgac aatcagctcc ctccagcccg aggactttgc 2880
cacatactac tgccagcaga tcaccggcta cctcttcacc tttggccaag gcacaaagct 2940
cgagattaag ggaggcggcg gcagcaagcc ttgcatctgt accggcagcg aggtgagcag 3000
cgtgttcatt ttccctccta agcccaagga cgtgctgaca atcacactga cacctaaggt 3060
cacatgcgtg gtcgtggaca tctcccaaga cgatcccgaa gtgcacttca gctggttcgt 3120
cgatgacgtc gaggtccata ccgcccagac aagacccccc gaggagcagt tcaacagcac 3180
cttcagaagc gtgtccgagc tccccattct gcaccaagac tggctcaatg gaagaacctt 3240
taggtgcaag gtcacctccg ctgccttccc ttcccccatc gagaagacaa tcagcaagcc 3300
cgagggcaga acccaagtgc cccatgtgta taccatgagc cccaccaagg aggagatgac 3360
ccagaacgag gtctccatca catgcatggt gaagggcttc taccctcccg atatctacgt 3420
ggaatggcag atgaacggcc aacctcaaga gaactacaag aacacccccc ccacaatgga 3480
taccgatggc agctactttc tgtactccaa gctcaacgtg aagaaggaga agtggcagca 3540
aggcaacacc ttcacatgct ccgtgctgca cgagggactg cataatcacc acaccgagaa 3600
gtctctgagc cactcccccg gcaaatgatg actcgagtct agagggcccg tttaaacccg 3660
ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt 3720
gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat 3780
tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag 3840
caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc 3900
ttctgaggcg gaaagaacca gaattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc 3960
cccaggctcc ccaggcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 4020
ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 4080
agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt 4140
ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg 4200
cctctgcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt 4260
gcaaaaagct cccgggagct tgtatatcca ttttcggatc tgatcagcac gtgttgacaa 4320
ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga actaaaccat 4380
gaaaaagcct gaactcaccg cgacgtctgt cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag 4440
cgtctccgac ctgatgcagc tctcggaggg cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt 4500
aggagggcgt ggatatgtcc tgcgggtaaa tagctgcgcc gatggtttct acaaagatcg 4560
ttatgtttat cggcactttg catcggccgc gctcccgatt ccggaagtgc ttgacattgg 4620
ggaattcagc gagagcctga cctattgcat ctcccgccgt gcacagggtg tcacgttgca 4680
agacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgt tctgcagccg gtcgcggagg caatggatgc 4740
gattgctgcg gccgatctta gccagacgag cgggttcggc ccattcggac cgcaaggaat 4800
cggtcaatac actacatggc gtgatttcat atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca 4860
ctggcaaact gtgatggacg acaccgtcag tgcgtccgtc gcgcaggctc tcgatgagct 4920
gatgctttgg gccgaggact gccccgaagt ccggcacctc gtgcacgcgg atttcggctc 4980
caacaatgtc ctgacggaca atggccgcat aacagcggtc attgactgga gcgaggcgat 5040
gttcggggat tcccaatacg aggtcgccaa catcttcttc tggaggccgt ggttggcttg 5100
tatggagcag cagacgcgct acttcgagcg gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg 5160
gctccgggcg tatatgctcc gcattggtct tgaccaactc tatcagagct tggttgacgg 5220
caatttcgat gatgcagctt gggcgcaggg tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc 5280
cgggactgtc gggcgtacac aaatcgcccg cagaagcgcg gccgtctgga ccgatggctg 5340
tgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccg acgccccagc actcgtgggg atcgggagat 5400
gggggaggct aactgagcgg gactctgggg ttcgaaatga ccgaccaagc gacgcccaac 5460
ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg aaaggttggg cttcggaatc 5520
gttttccggg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg atctcatgct ggagttcttc 5580
gcccacccca acttgtttat tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca 5640
aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc 5700
aatgtatctt atcatgtctg tagatccgcg tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 5760
atgccgcata gttaagccag ccccgacacc cgccaacacc cgctgacgcg ccctgacggg 5820
cttgtctgct cccggcatcc gcttacagac aagctgtgac cgtctccggg aatcaagctt 5880
gtggaaggct actcgaaatg tttgacccaa gttaaacaat ttaaaggcaa tgctaccaaa 5940
tactaattga gtgtatgtaa acttctgacc cactgggaat gtgatgaaag aaataaaagc 6000
tgaaatgaat cattctctct actattattc tgatatttca cattcttaaa ataaagtggt 6060
gatcctaact gacctaagac agggaatttt tactaggatt aaatgtcagg aattgtgaaa 6120
aagtgagttt aaatgtattt ggctaaggtg tatgtaaact tccgacttca actgtatagg 6180
gatcctctag ctagagtcga cctcgagggg gggcccggta cccagctttt gttcccttta 6240
gtgagggtta atttcgagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 6300
ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 6360
tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 6420
gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 6480
gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 6540
gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 6600
taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 6660
cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 6720
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 6780
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 6840
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 6900
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 6960
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 7020
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 7080
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct 7140
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 7200
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 7260
tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 7320
ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 7380
aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 7440
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 7500
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 7560
tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 7620
agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 7680
taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 7740
tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 7800
cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 7860
ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 7920
tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 7980
tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 8040
cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 8100
tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 8160
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 8220
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 8280
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 8340
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 8400
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 8460
tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 8520
cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 8580
ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 8640
ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 8700
gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 8760
tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa 8820
aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat 8880
ttccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg 8940
ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctg 8974
<210> 11
<211> 479
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
20 25 30
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
35 40 45
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
50 55 60
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
65 70 75 80
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
85 90 95
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Ala Arg Ser Tyr Ser Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
115 120 125
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
145 150 155 160
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
180 185 190
Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg
195 200 205
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser
210 215 220
Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Thr Gly
225 230 235 240
Tyr Leu Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val
260 265 270
Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr
275 280 285
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asp Asp Pro Glu
290 295 300
Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln
305 310 315 320
Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser
325 330 335
Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Arg Thr Phe Arg
340 345 350
Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser
370 375 380
Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr
420 425 430
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu
450 455 460
His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210> 12
<211> 8200
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 60
ccagtgagcg cgcgtaatac gactcactat agggcgaatt ggagctcgga tccctataca 120
gttgaagtcg gaagtttaca tacacttaag ttggagtcat taaaactcgt ttttcaacta 180
ctccacaaat ttcttgttaa caaacaatag ttttggcaag tcagttagga catctacttt 240
gtgcatgaca caagtcattt ttccaacaat tgtttacaga cagattattt cacttataat 300
tcactgtatc acaattccag tgggtcagaa gtttacatac actaagttga ctgtgccttt 360
aaacagcttg gaaaattcca gaaaatgatg tcatggcttt agaagctaga tctagagtcg 420
acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 480
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 540
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 600
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 660
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 720
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 780
agtcatcgct attaccatgg tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc 840
ccccccctcc ccacccccaa ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat 900
gggggcgggg gggggggggg ggcgcgcgcc aggcggggcg gggcggggcg aggggcgggg 960
cggggcgagg cggagaggtg cggcggcagc caatcagagc ggcgcgctcc gaaagtttcc 1020
ttttatggcg aggcggcggc ggcggcggcc ctataaaaag cgaagcgcgc ggcgggcggg 1080
gagtcgctgc gacgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg 1140
ccccggctct gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct 1200
ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa 1260
agccttgagg ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc 1320
gtgtgtgtgt gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc 1380
tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg 1440
ggcggtgccc cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg 1500
tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac 1560
ccccctcccc gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt 1620
ggcgcggggc tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg 1680
gggccgcctc gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc 1740
ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg 1800
cagggacttc ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc 1860
ccctctagcg ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag 1920
ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg 1980
cggggggacg gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg 2040
accggcggct ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc 2100
ctgggcaacg tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt ctgcagtcga 2160
cggtaccgcg ggcccgggat ccgccaccat gggcatcctg ccttcccccg gcatgcctgc 2220
cctgctgagc ctggtgagcc tgctgagcgt gctgctgatg ggctgcgtgg ccctgcctga 2280
ggtgcagctg ctggagagcg gcggcggact ggtgcagcca ggaggatccc tgagactgag 2340
ctgtgccgcc tccggcttta ccttcagcag ctacgccatg tcctgggtga ggcaggcccc 2400
cggaaagggc ctggagtggg tgagcgccat cagcggcagc ggcggatcca cctactacgc 2460
cgacagcgtg aagggcaggt tcacaatctc cagggacaat tccaagaaca ccctgtacct 2520
gcagatgaat agcctgaggg ccgaggacac cgccgtgtac tactgtgcca ggagctacag 2580
cgcctttgac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg agctccggcg gaggcggatc 2640
cggaggagga ggatccggcg gaggaggcag cgatatccag atgacccagt ccccttcctc 2700
cctgagcgcc tccgtgggcg acagggtgac catcacctgc agagccagcc agtccatcag 2760
ctcctacctg aactggtacc agcagaagcc tggcaaggcc cccaagctgc tgatctacgc 2820
cgccagctcc ctgcagagcg gcgtgcctag caggttttcc ggcagcggct ccggcaccga 2880
ttttacactg acaatcagct ccctgcaacc cgaggatttt gccacatact actgtcagca 2940
gatcaccggc tacctgttca ccttcggcca gggcacaaag ctggagatca agaggacaga 3000
ctacaaggat cacgacggcg attacaagga tcatgacatc gactacaagg acgatgacga 3060
taaggccgcc gcccaccacc accaccatca ctgatgactc gagtctagag ggcccgttta 3120
aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 3180
ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 3240
ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 3300
ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 3360
tatggcttct gaggcggaaa gaaccagaat tctgtggaat gtgtgtcagt tagggtgtgg 3420
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caaccaggtg tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc 3540
tcaattagtc agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc 3600
ccagttccgc ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg 3660
aggccgcctc tgcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag 3720
gcttttgcaa aaagctcccg ggagcttgta tatccatttt cggatctgat cagcacgtgt 3780
tgacaattaa tcatcggcat agtatatcgg catagtataa tacgacaagg tgaggaacta 3840
aaccatggtg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag 3900
gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg 3960
gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa 4020
tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc 4080
agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc 4140
ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga 4200
tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa 4260
acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct 4320
ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat 4380
gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt 4440
ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta 4500
tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga 4560
ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg 4620
ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga ccaagcgacg 4680
cccaacctgc catcacgaga tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag gttgggcttc 4740
ggaatcgttt tccgggacgc cggctggatg atcctccagc gcggggatct catgctggag 4800
ttcttcgccc accccaactt gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc 4860
atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa 4920
ctcatcaatg tatcttatca tgtctgtaga tccgcgtatg gtgcactctc agtacaatct 4980
gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 5040
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggaatc 5100
aagcttgtgg aaggctactc gaaatgtttg acccaagtta aacaatttaa aggcaatgct 5160
accaaatact aattgagtgt atgtaaactt ctgacccact gggaatgtga tgaaagaaat 5220
aaaagctgaa atgaatcatt ctctctacta ttattctgat atttcacatt cttaaaataa 5280
agtggtgatc ctaactgacc taagacaggg aatttttact aggattaaat gtcaggaatt 5340
gtgaaaaagt gagtttaaat gtatttggct aaggtgtatg taaacttccg acttcaactg 5400
tatagggatc ctctagctag agtcgacctc gagggggggc ccggtaccca gcttttgttc 5460
cctttagtga gggttaattt cgagcttggc gtaatcatgg tcatagctgt ttcctgtgtg 5520
aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc 5580
ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt 5640
ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg 5700
cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt 5760
tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc 5820
aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa 5880
aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa 5940
tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc 6000
ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc 6060
cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag 6120
ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga 6180
ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc 6240
gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac 6300
agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg 6360
cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca 6420
aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa 6480
aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa 6540
ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt 6600
aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag 6660
ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 6720
agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 6780
cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 6840
ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca 6900
gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 6960
cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 7020
cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 7080
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catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 7200
tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 7260
ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 7320
catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 7380
cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 7440
cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 7500
acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg 7560
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tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc 7680
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tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct 7800
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<212> PRT
<213> 智人
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1 5 10 15
Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Met Gly Cys Val Ala Leu Pro Glu Val
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Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
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Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala
65 70 75 80
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
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Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
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Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
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Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Thr Gly Tyr Leu
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Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Asp Tyr
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Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp
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Asp Asp Asp Lys Ala Ala Ala His His His His His His
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<212> DNA
<213> 智人
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cggcaccgat ttcacactga ccatcagctc cctgcagcct gaggatttcg ccacatacta 2940
ctgccagcag agcgccggcc tgctgacctt cggccaggga accaagctgg agatcaagag 3000
aacagactac aaggatcacg acggcgacta caaggaccac gatatcgatt acaaggatga 3060
tgacgacaag gccgccgccc accaccacca ccatcactga tgactcgagt ctagagggcc 3120
cgtttaaacc cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 3180
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 3240
aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 3300
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 3360
gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagaattctg tggaatgtgt gtcagttagg 3420
gtgtggaaag tccccaggct ccccaggcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt 3480
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca 3540
tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa 3600
ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag 3660
aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag 3720
gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcgga tctgatcagc 3780
acgtgttgac aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg acaaggtgag 3840
gaactaaacc atggtgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt 3900
ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt 3960
gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc 4020
cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc 4080
ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc tattgggcga 4140
agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat 4200
ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct acctgcccat tcgaccacca 4260
agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga 4320
tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc 4380
gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat 4440
catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga 4500
ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg 4560
ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt 4620
ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa 4680
gcgacgccca acctgccatc acgagatttc gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg 4740
ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg 4800
ctggagttct tcgcccaccc caacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 4860
aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 4920
tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tgtagatccg cgtatggtgc actctcagta 4980
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg 5040
cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg 5100
ggaatcaagc ttgtggaagg ctactcgaaa tgtttgaccc aagttaaaca atttaaaggc 5160
aatgctacca aatactaatt gagtgtatgt aaacttctga cccactggga atgtgatgaa 5220
agaaataaaa gctgaaatga atcattctct ctactattat tctgatattt cacattctta 5280
aaataaagtg gtgatcctaa ctgacctaag acagggaatt tttactagga ttaaatgtca 5340
ggaattgtga aaaagtgagt ttaaatgtat ttggctaagg tgtatgtaaa cttccgactt 5400
caactgtata gggatcctct agctagagtc gacctcgagg gggggcccgg tacccagctt 5460
ttgttccctt tagtgagggt taatttcgag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 5520
tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg 5580
taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 5640
cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 5700
gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 5760
ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 5820
agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 5880
ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 5940
caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 6000
gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 6060
cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 6120
tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 6180
gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 6240
cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 6300
tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 6360
tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 6420
caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 6480
aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 6540
cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 6600
ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 6660
tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 6720
atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 6780
tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 6840
aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 6900
catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 6960
gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 7020
ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 7080
aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 7140
atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 7200
cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 7260
gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 7320
agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 7380
gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 7440
caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 7500
ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 7560
tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 7620
aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gcgccctgta gcggcgcatt 7680
aagcgcggcg ggtgtggtgg ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc 7740
gcccgctcct ttcgctttct tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca 7800
agctctaaat cgggggctcc ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc 7860
caaaaaactt gattagggtg atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt 7920
tcgccctttg acgttggagt ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac 7980
aacactcaac cctatctcgg tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc 8040
ctattggtta aaaaatgagc tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt 8100
aacgcttaca atttccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 8160
cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctg 8206
<210> 17
<211> 303
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Met Gly Ile Leu Pro Ser Pro Gly Met Pro Ala Leu Leu Ser Leu Val
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Met Gly Cys Val Ala Leu Pro Glu Val
20 25 30
Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
35 40 45
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Gly Ser Gly Met
50 55 60
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly
65 70 75 80
Ile Ser Ser Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
85 90 95
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
100 105 110
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
115 120 125
Ala Asn Tyr Trp His Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
165 170 175
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser
180 185 190
Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
195 200 205
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
210 215 220
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
225 230 235 240
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala
245 250 255
Gly Leu Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
260 265 270
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
275 280 285
Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala Ala His His His His His His
290 295 300

Claims (126)

1.颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物是颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的异二聚体。
3.根据权利要求1所述的复合物，其中所述复合物是融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的复合物，其中所述融合蛋白是重组形成的。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17或其片段。
6.一种细胞培养物，其包含哺乳动物细胞系，所述哺乳动物细胞系表达或被修饰以表达颗粒蛋白前体多肽和鞘脂激活蛋白原多肽。
7.根据权利要求6所述的细胞培养物，其中所述哺乳动物细胞系被遗传修饰。
8.根据权利要求6所述的细胞培养物，其包含哺乳动物细胞系，所述哺乳动物细胞系经修饰以表达颗粒蛋白前体亚肽和鞘脂激活蛋白原前体多肽。
9.根据权利要求6所述的细胞培养物，其中所述颗粒蛋白前体是用于神经胶质细胞衍生神经营养因子(GCase)相互作用的颗粒蛋白前体C-末端。
10.一种细胞培养物，其包含哺乳动物细胞系，所述哺乳动物细胞系包含表达颗粒蛋白前体的基因和表达鞘脂激活蛋白原的基因，或者被修饰为包含表达颗粒蛋白前体的基因和表达鞘脂激活蛋白原的基因。
11.根据权利要求10所述的细胞培养物，其中所述颗粒蛋白前体基因是cDNA。
12.根据权利要求10所述的细胞培养物，其中所述鞘脂激活蛋白原基因是cDNA。
13.一种细胞培养物，其包含哺乳动物细胞系，所述哺乳动物细胞系表达颗粒蛋白前体基因和鞘脂激活蛋白原基因。
14.根据权利要求13所述的细胞培养物，其中所述颗粒蛋白前体基因是cDNA。
15.根据权利要求13所述的细胞培养物，其中所述鞘脂激活蛋白原基因是cDNA。
16.根据权利要求6或10中任一项所述的细胞培养物，其中所述哺乳动物细胞系选自由以下项组成的组：小鼠骨髓瘤细胞(NS0)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO)-Kl；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠成纤维细胞-3T3细胞，非洲绿猴细胞系；间叶性软骨肉瘤-1(MCS)；大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC)-12；大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC)-12A；AT3，大鼠神经胶质肿瘤(C6)细胞；大鼠神经元细胞系RN33b；大鼠海马细胞系HiB5；生长因子扩增的干细胞；表皮生长因子(EGF)-响应性神经球；衍生自哺乳动物中枢神经系统(CNS)的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-响应性神经干细胞；胎儿细胞；原代成纤维细胞；施旺细胞；星形胶质细胞；β-TC细胞；Hep-G2纹状体细胞；少突胶质细胞及其前体；小鼠成肌细胞-C2C12；人神经胶质衍生细胞-Hs683；人神经胶质衍生细胞-A172；HEI193T细胞系；猪成胶质细胞；神经元细胞；神经元；星形胶质细胞；中间神经元；从人长骨分离的成软骨细胞；人胚肾细胞HEK293；人细胞系HeLa；兔角膜衍生细胞(Startus Seruminstitut兔角膜细胞(SIRC))；人角膜衍生细胞、人脉络丛细胞、人诱导多能干细胞(iPs)衍生细胞系、人神经营养蛋白3(NT3)细胞、成人视网膜色素上皮细胞系-10(ARPE-19)、循环血管生成细胞(CAC)、永生化人成纤维细胞(MDX细胞)、端粒酶永生化人视网膜色素上皮(RPE)细胞系和间充质干细胞(MSC)。
17.根据权利要求16所述的细胞培养物，其中所述非洲绿猴细胞系选自由COS-1、COS-7、SCC-1、BSC-40、BMT-10和Vero细胞系组成的组。
18.根据权利要求16所述的细胞培养物，其中所述人视网膜色素上皮(RPE)细胞系是人端粒酶逆转录酶(hTERT)视网膜色素上皮-1(RPE-1)。
19.根据权利要求16所述的细胞培养物，其中用于哺乳动物重组生产的优选细胞系包括ARPE-19、CHO、CHO-1、HEI193T、HEK293、COS、NS0和BHK细胞。
20.根据权利要求6或10中任一项所述的细胞培养物，其中所述颗粒蛋白前体多肽包含SEQ ID NO:2或其片段。
21.根据权利要求6或10中任一项所述的细胞培养物，其中所述颗粒蛋白前体基因包含SEQ ID NO:1或其片段。
22.根据权利要求6或10中任一项所述的细胞培养物，其中所述鞘脂激活蛋白原多肽包含SEQ ID NO:4或其片段。
23.根据权利要求6或10中任一项所述的细胞培养物，其中所述鞘脂激活蛋白原基因包含SEQ ID NO:3或EQ ID NO:5或其片段。
24.根据权利要求6或10中任一项所述的细胞培养物，其中所述细胞系包含：
表达颗粒蛋白前体的第一表达构建体，或
表达鞘脂激活蛋白原的第二表达构建体。
25.根据权利要求24所述的细胞培养物，其中所述第一表达构建体包含质粒。
26.根据权利要求24所述的细胞培养物，其中所述第二表达构建体包含质粒。
27.根据权利要求25所述的细胞培养物，其中所述第一表达构建体还包含转座子系统。
28.根据权利要求27的细胞培养物，其中转座子系统是睡美人转座酶系统。
29.根据权利要求27的细胞培养物，其中转座子系统是背负式转座酶系统。
30.根据权利要求24所述的细胞培养物，其中所述第二表达构建体还包含转座子系统。
31.根据权利要求30的细胞培养物，其中转座子系统是睡美人转座酶系统。
32.根据权利要求30的细胞培养物，其中转座子系统是背负式转座酶系统。
33.根据权利要求10所述的细胞培养物，其中所述颗粒蛋白前体多肽包含颗粒蛋白前体-抗体片段融合蛋白或表达颗粒蛋白前体-抗体片段融合蛋白的基因。
34.根据权利要求10所述的细胞培养物，其中所述鞘脂激活蛋白原包含鞘脂激活蛋白原-抗体片段融合蛋白或表达鞘脂激活蛋白原-抗体片段融合蛋白的基因。
35.根据权利要求33或34中任一项所述的细胞培养物，其中所述颗粒蛋白前体-抗体片段或所述鞘脂激活蛋白原-抗体片段的抗体片段增加颗粒蛋白前体、鞘脂激活蛋白原或其复合物的脑部分布和细胞吸收。
36.根据权利要求10所述的细胞培养物，其中所述颗粒蛋白前体基因表达颗粒蛋白前体-抗体片段融合基因。
37.根据权利要求10所述的细胞培养物，其中所述鞘脂激活蛋白原基因表达鞘脂激活蛋白原-抗体片段融合。
38.根据权利要求36或37中任一项所述的融合基因，其中所述融合基因包含SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16或其片段。
39.根据权利要求36、37或38中任一项所述的细胞培养物，其中所述颗粒蛋白前体-抗体片段融合基因编码肽序列，所述肽序列增加颗粒蛋白前体、鞘脂激活蛋白原或其复合物的脑部分布和细胞吸收；此外，其中所述鞘脂激活蛋白原-抗体片段融合基因编码肽序列，所述肽序列增加颗粒蛋白前体、鞘脂激活蛋白原或其复合物的脑部分布和细胞吸收。
40.根据权利要求6或10中任一项所述的细胞培养物，其中所述表达的颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原在从细胞分泌之前形成复合物。
41.根据权利要求6或10中任一项所述的细胞培养物，其中所述表达的颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原在从细胞分泌后形成复合物。
42.根据权利要求40或41中任一项所述的细胞培养物，其中所述复合物包含颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的异二聚体。
43.根据权利要求6或10中任一项所述的细胞培养物，其还包含刺激从所述细胞系分泌颗粒蛋白前体、鞘脂激活蛋白原或颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的异二聚体的因子。
44.一种治疗神经障碍患者的装置，包括：
可植入的细胞装置；以及
由权利要求6或10中任一项的细胞培养物产生的细胞系，其中所述细胞系被设计为分泌治疗剂。
45.根据权利要求44所述的装置，其中所述可植入的细胞装置包括含有所述细胞系的胶囊。
46.根据权利要求44所述的装置，其中所述可植入的细胞装置还包括半渗透膜，所述半渗透膜允许位于所述可植入的细胞装置内的所述细胞系分泌的所述治疗剂通过所述膜扩散。
47.根据权利要求46所述的装置，其中所述半渗透膜是免疫隔离的。
48.根据权利要求46所述的装置，其中所述装置还包括置于所述半渗透膜内的基质。
49.根据权利要求44所述的装置，还包括将所述细胞装置植入需要治疗的患者体内的构件。
50.根据权利要求49所述的装置，其中植入构件包括导管。
51.根据权利要求50所述的装置，其中所述导管设计成鞘内植入患者的纹状体、椎管或蛛网膜下腔。
52.根据权利要求44所述的装置，其还包含用于从所述细胞装置递送治疗剂的一种或多种载体。
53.根据权利要求52所述的装置，其中所述载体包括泵或注射器。
54.根据权利要求44所述的装置，其中所述装置通过口服、鞘内、脑室内或脑内植入。
55.根据权利要求44所述的装置，其中所述神经障碍为神经退行性疾病。
56.根据权利要求44所述的装置，其中所述神经障碍为溶酶体贮积病。
57.根据权利要求55所述的装置，其中所述神经退行性疾病选自由额颞痴呆(FTD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、边缘优势年龄相关TAR DNA结合蛋白-43(TDP-43)脑病(晚期)、路易体痴呆、帕金森病(PD)、多系统萎缩(MSA)和溶酶体贮积症组成的组。
58.根据权利要求56所述的装置，其中所述溶酶体贮积病选自由戈谢病、非典型戈谢病、异染性脑白质营养不良、克拉伯病、京都基因和基因组百科全书(KEGG)病、神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、粘多糖贮积病III和IV、泰-萨克斯病、Farber病及其组合组成的组。
59.一种生产颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物的方法，所述方法包括以下插入步骤：
将表达颗粒蛋白前体的第一表达构建体插入细胞系；和
将表达鞘脂激活蛋白原的第二表达构建体插入同一细胞系中。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述细胞系选自由以下项组成的组：小鼠骨髓瘤细胞(NS0)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO)-K1；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠成纤维细胞-3T3细胞；非洲绿猴细胞系；间叶性软骨肉瘤-1(MCS)；大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC)-12；大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC)-12A；AT3，大鼠神经胶质肿瘤(C6)细胞；大鼠神经元细胞系RN33b；大鼠海马细胞系HiB5；生长因子扩增的干细胞；表皮生长因子(EGF)响应性神经球；衍生自哺乳动物中枢神经系统(CNS)的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)-响应性神经干细胞；胎儿细胞；原代成纤维细胞；施旺细胞；星形胶质细胞；β-TC细胞；Hep-G2纹状体细胞；少突胶质细胞及其前体；小鼠成肌细胞-C2C12；人神经胶质源性细胞-Hs683；人神经胶质源性细胞-A172；HEI193T细胞系；猪成胶质细胞；神经元细胞；神经元；星形胶质细胞；中间神经元；从人长骨分离的成软骨细胞；人胚肾293细胞(HEK293)；人细胞系HeLa细胞；兔角膜衍生细胞(Statens Seruminstitut兔角膜(SIRC))；人角膜衍生细胞、人脉络丛细胞、人诱导多能干细胞(iPS)衍生细胞系、人神经营养蛋白3(NT3)细胞、成人视网膜色素上皮细胞系-10(ARPE-19)、循环血管生成细胞(CAC)、永生化人成纤维细胞(MDX细胞)、端粒酶永生化人视网膜色素上皮(RPE)细胞系和间充质干细胞(MSC)。
61.根据权利要求60所述的细胞培养物，其中所述非洲绿猴细胞系选自由COS-1、COS-7、SCC-1、BSC-40、BMT-10和Vero细胞系组成的组。
62.根据权利要求60所述的细胞培养物，其中所述人视网膜色素上皮(RPE)细胞系是人端粒酶逆转录酶(hTERT)视网膜色素上皮-1(RPE-1)。
63.根据权利要求60所述的细胞培养物，其中用于哺乳动物重组生产的优选细胞系包括ARPE-19、CHO、CHO-1、HEI193T、HEK293、COS、NS0和BHK细胞。
64.根据权利要求59所述的方法，其中所述第一表达构建体包含质粒。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述第一表达构建体还包含睡美人转座酶系统。
66.根据权利要求59所述的方法，其中所述第二表达构建体包含质粒。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述第二表达构建体还包含睡美人转座酶系统。
68.根据权利要求59所述的方法，其中所述细胞系包含在生物反应器中。
69.根据权利要求59所述的方法，还包括纯化颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物的步骤。
70.根据权利要求69所述的方法，其中通过离子交换色谱纯化颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述离子交换色谱不使用聚丙烯塑料。
72.根据权利要求69所述的方法，其中通过凝胶过滤纯化所述颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物。
73.一种用于治疗神经障碍的治疗剂，其包含根据权利要求40或41中任一项所述的方法的颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物。
74.根据权利要求73所述的治疗剂，其中将所述治疗剂施用至需要治疗神经障碍的患者。
75.根据权利要求74所述的治疗剂，其中所述神经障碍是神经退行性疾病。
76.根据权利要求74所述的治疗剂，其中所述神经障碍为溶酶体贮积病。
77.根据权利要求57所述的治疗剂，其中所述神经退行性疾病选自由额颞痴呆(FTD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、边缘优势年龄相关TAR DNA结合蛋白-43(TDP-43)脑病(晚期)、路易体痴呆、帕金森病(PD)和多系统萎缩(MSA)组成的组。
78.根据权利要求76所述的治疗剂，其中所述溶酶体贮积病选自由戈谢病、非典型戈谢病、异染性脑白质营养不良、克拉伯病、京都基因和基因组百科全书(KEGG)病、神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、粘多糖贮积症III和IV、泰-萨克斯病和Farber病组成的组。
79.根据权利要求73所述的治疗剂，其中所述治疗剂通过注射施用至所述患者。
80.根据权利要求73所述的治疗剂，其中所述治疗剂通过导管施用至所述患者。
81.一种测试来自患者的流体样本中的颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的相对浓度的方法，所述方法包括以下步骤：
检测颗粒蛋白前体的浓度；
检测鞘脂激活蛋白原的浓度；
检测颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原复合物的浓度；
比较颗粒蛋白前体的浓度与颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物的浓度之比；以及
比较鞘脂激活蛋白原的浓度与颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物的浓度之比。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述测试包括酶联免疫吸附测定(ELISA)或邻近连接测定。
83.根据权利要求81所述的方法，其中来自所述患者的所述流体样本选自由人脑脊液、血浆、血清、唾液、泪液、母乳、尿液及其组合组成的组。
84.根据权利要求81所述的方法，其还包括诊断患有神经障碍的所述患者的步骤。
85.根据权利要求81所述的方法，其还包括评估所述患者的神经障碍进展的步骤。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述神经障碍是神经退行性疾病。
87.根据权利要求84所述的方法，其中所述神经障碍是溶酶体贮积病。
88.根据权利要求86所述的方法，其中所述神经退行性疾病选自由额颞痴呆(FTD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、路易体痴呆、帕金森病(PD)、戈谢病、神经元蜡样脂褐质沉积症及其组合组成的组。
89.根据权利要求87所述的方法，其中所述溶酶体贮积病选自由戈谢病、非典型戈谢病、异染性脑白质营养不良、克拉伯病、京都基因和基因组百科全书(KEGG)病、神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、粘多糖贮积病III和IV、泰-萨克斯病和Farber病组成的组。
90.一种用于确定患者体内PGRN、PSAP和/或PGRN/PSAP复合物的绝对和相对水平的测定。
91.根据权利要求90所述的测定，其中所述测定用于诊断神经障碍。
92.根据权利要求90所述的测定，其中所述测定用于评估患者神经障碍的进展。
93.根据权利要求90所述的测定，其中所述神经障碍是神经退行性疾病。
94.根据权利要求90所述的测定，其中所述神经障碍是溶酶体贮积病。
95.根据权利要求93所述的测定，其中所述神经退行性疾病选自由额颞痴呆(FTD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、边缘优势年龄相关TAR DNA结合蛋白-43(TDP-43)脑病(晚期)、路易体痴呆、帕金森病(PD)和多系统萎缩(MSA)组成的组。
96.根据权利要求94所述的测定，其中所述溶酶体贮积病选自由戈谢病、非典型戈谢病、异染性脑白质营养不良、克拉伯病、京都基因和基因组百科全书(KEGG)病、神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、粘多糖贮积病III和IV、泰-萨克斯病和Farber病组成的组。
97.一种生物标志物，其包含颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原复合物。
98.根据权利要求97所述的生物标志物，其中所述生物标志物用于检测神经障碍和/或评估神经障碍的预后和进展。
99.根据权利要求98所述的生物标志物，其中所述神经障碍是神经退行性疾病。
100.根据权利要求98所述的生物标志物，其中所述神经障碍是溶酶体贮积病。
101.根据权利要求99所述的生物标志物，其中所述神经退行性疾病选自由额颞痴呆(FTD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、边缘优势年龄相关TAR DNA结合蛋白-43(TDP-43)脑病(晚期)、路易体痴呆、帕金森病(PD)和多系统萎缩(MSA)组成的组。
102.根据权利要求100所述的生物标志物，其中所述溶酶体贮积病选自由戈谢病、非典型戈谢病、异染性脑白质营养不良、克拉伯病、京都基因和基因组百科全书(KEGG)病、神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、粘多糖贮积症III和IV、泰-萨克斯病和Farber病组成的组。
103.根据权利要求97所述的生物标志物，其中所述生物标志物用于检测、诊断和/或监测患者中的炎性疾病、癌症和肥胖相关病理。
104.根据权利要求103的生物标志物，其中所述炎性疾病选自由胆石症、脂肪肝疾病、子宫内膜异位症、炎性肠病、哮喘、类风湿性关节炎、慢性消化性溃疡、牙周炎、克罗恩病、鼻窦炎、肝炎、心血管疾病、关节炎、慢性阻塞性肺病、脑炎、脑膜炎、神经炎和胰腺炎组成的组。
105.根据权利要求103所述的生物标志物，其中所述肥胖相关病理选自由2型糖尿病、l型糖尿病、高脂血症、胰岛素不敏感性、高血糖症、高胰岛素血症、低胰岛素血症、血脂异常、高血压和动脉粥样硬化组成的组。
106.一种克隆细胞培养物，其中所述克隆细胞培养物表达和释放因子的组合。
107.根据权利要求106所述的克隆细胞培养物，其中所述因子是神经修复因子。
108.根据权利要求106所述的克隆细胞培养物，其中所述因子是溶酶体靶向因子。
109.根据权利要求106所述的克隆细胞培养物，其中所述因子是错误折叠的蛋白靶向因子。
110.根据权利要求107所述的克隆细胞培养物，其中所述神经修复因子选自由神经营养蛋白、神经胶质细胞衍生的神经营养因子蛋白、大脑多巴胺神经营养因子蛋白和中脑星形胶质细胞衍生的神经营养因子蛋白组成的组。
111.根据权利要求108所述的克隆细胞培养物，其中所述溶酶体靶向因子选自由颗粒蛋白前体、颗粒蛋白前体衍生物、鞘脂激活蛋白原、鞘脂激活蛋白原衍生物、颗粒蛋白前体/鞘脂激活蛋白原复合物、葡萄糖脑苷脂酶、溶酶体相关膜蛋白1和组织蛋白酶组成的组。
112.根据权利要求109所述的克隆细胞培养物，其中所述错误折叠的蛋白质靶向因子是选自由α-突触核蛋白、淀粉样β(Aβ)tau、TAR DNA-结合蛋白43、融合成肉瘤、亨廷顿蛋白和C9orf衍生的二肽组成的组的肽、抗体或抗体片段。
113.根据权利要求109所述的克隆细胞培养物，其中所述错误折叠的蛋白质靶向因子与功能肽缀合。
114.根据权利要求113所述的克隆细胞培养物，其中所述功能性肽增强细胞吸收。
115.根据权利要求114所述的克隆细胞培养物，其中所述功能肽是人免疫缺陷病毒(HIV)的转录反式激活子(TAT)。
116.根据权利要求113所述的克隆细胞培养物，其中所述功能性肽增强触发降解途径。
117.根据权利要求116所述的克隆细胞培养物，其中所述功能性肽是蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)。
118.向有需要的患者施用的组合疗法，其中所述疗法包括递送颗粒蛋白前体、鞘脂激活蛋白原、颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物、α-突触核蛋白靶向抗体和α-突触核蛋白靶向神经修复因子。
119.根据权利要求118所述的组合疗法，其中所述颗粒蛋白前体、鞘脂激活蛋白原、颗粒蛋白前体和鞘脂激活蛋白原的复合物、α-突触核蛋白靶向抗体和α-突触核蛋白靶向神经修复因子以不同的组合形式施用至患者。
120.根据权利要求118所述的组合疗法，其中所述α-突触核蛋白靶向神经修复因子是神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GCNF)。
121.根据权利要求118所述的组合疗法，其中所述组合疗法治疗神经障碍。
122.根据权利要求121所述的组合疗法，其中所述神经障碍是神经退行性疾病。
123.根据权利要求121所述的组合疗法，其中所述神经障碍是溶酶体贮积病。
124.根据权利要求122所述的组合疗法，其中所述神经退行性疾病选自由额颞痴呆(FTD)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、阿尔茨海默病(AD)、边缘优势年龄相关TAR DNA结合蛋白-43(TDP-43)脑病(晚期)、路易体痴呆、帕金森病(PD)和多系统萎缩(MSA)组成的组。
125.根据权利要求123所述的组合疗法，其中所述溶酶体贮积病选自由戈谢病、非典型戈谢病、异染性脑白质营养不良、克拉伯病、京都基因和基因组百科全书(KEGG)病、神经元蜡样脂褐质沉积症(NCL)、粘多糖贮积症III和IV、泰-萨克斯病和Farber病组成的组。
126.一种细胞系，其中所述细胞系表达或被修饰以表达颗粒蛋白前体肽、鞘脂激活蛋白原肽或颗粒蛋白前体肽和鞘脂激活蛋白原肽的复合物。
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