KR20180070700A - A형 혈우병의 유전자 요법을 위한 증가된 발현을 갖는 재조합 fviii 변이체를 인코딩하는 바이러스 벡터 - Google Patents

A형 혈우병의 유전자 요법을 위한 증가된 발현을 갖는 재조합 fviii 변이체를 인코딩하는 바이러스 벡터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다른 양상 중에서, 포유류 세포에서 발현을 위한 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명은 또한, A형 혈우병을 치료하기 위한 포유류 유전자 요법 벡터 및 방법을 제공한다.

Description

A형 혈우병의 유전자 요법을 위한 증가된 발현을 갖는 재조합 FVIII 변이체를 인코딩하는 바이러스 벡터
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2015년 11월 13일자 제출된 US 특허가출원 번호 62/255,323에 우선권을 주장하고, 이것은 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다.
서열 목록
본 출원은 서열 목록을 내포하는데, 이것은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고 전체적으로 본원에 참조로서 편입된다. 2016년 11월 7일자에 창출된 상기 ASCII 사본은 008073_5115_WO_Sequence_Listing.txt로 명명되고 크기에서 183,311 바이트이다.
발명의 배경
혈액 응고는 응고 연쇄 반응으로서 지칭된, 상호의존성 생화학적 반응의 복합적이고 동적인 생물학적 경로를 통해 진행된다. 응고 인자 VIII (FVIII)는 이러한 연쇄 반응에서 핵심 성분이다. 인자 VIII는 출혈 부위로 모집되고, 그리고 활성화된 인자 IX (FIXa) 및 인자 X (FX)와 Xase 복합체를 형성한다. Xase 복합체는 FX를 활성화시키고, 이것은 차례로, 프로트롬빈을 트롬빈으로 활성화시키고, 이것은 이후, 응고 연쇄 반응에서 다른 성분을 활성화시켜 안정된 응괴를 산출한다 (Saenko et al., Trends Cardiovasc. Med., 9:185-192 (1999); Lenting et al., Blood, 92:3983-3996 (1998)에서 리뷰됨).
A형 혈우병은 인자 VIII 활성에서 결함에 의해 특징되는 선천성 X 연관된 출혈 장애이다. 축소된 인자 VIII 활성은 응고 연쇄 반응에서 양성 피드백 루프를 저해한다. 이것은 불완전 응고를 유발하고, 이것은 증가된 지속 기간을 갖는 출혈 에피소드, 광범위한 타박상, 자발적 입과 코 출혈, 관절 경직 및 만성 통증, 그리고 아마도 심각한 사례에서 내출혈 및 빈혈로서 현성한다 (Zhang et al., Clinic. Rev. Allerg. Immunol., 37:114-124 (2009)).
전통적으로, A형 혈우병은 인자 VIII 보상 요법에 의해 치료되는데, 이것은 인자 VIII 단백질 (가령, 혈장-유래된 또는 재조합적으로-생산된 인자 VIII)을 A형 혈우병을 앓는 개체에 투여하는 것으로 구성된다. 인자 VIII는 급성 출혈 에피소드에 대한 응답으로 및/또는 수술 동안 출혈을 관리하기 위해 수술전후에 출혈 에피소드의 빈도를 예방하거나 또는 감소시키기 위해 예방적으로 투여된다. 하지만, 인자 VIII 보상 요법의 여러 바람직하지 않은 특질이 있다.
첫 번째, 인자 VIII 보상 요법은 A형 혈우병을 치료하거나 또는 관리하는데 이용되지만, 근원적인 인자 VIII 결함을 치유하지 못한다. 이것 때문에, A형 혈우병을 앓는 개체는 그들의 삶의 지속 기간 동안 인자 VIII 보상 요법을 필요로 한다. 연속 치료는 값비싸고, 그리고 단지 몇 번의 예방적 용량의 결여도 중증도 A형 혈우병을 앓는 개체에게 심각한 결과를 초래할 수 있기 때문에, 개체가 엄격한 순응도를 유지하는 것을 필요로 한다.
두 번째, 인자 VIII가 생체내에서 상대적으로 짧은 반감기를 갖기 때문에, 전통적인 예방적 인자 VIII 보상 요법은 2 일 또는 3 일 마다 투여를 필요로 한다. 이것은 개체에게 그들의 일생 동안 순응도를 유지해야 하는 부담을 준다. 비록 3세대 "지속성" 인자 VIII 약물이 투여 빈도를 감소시킬 수 있긴 하지만, 이들 약물로 예방적 인자 FVIII 보상 요법은 여전히 영구적으로 월 1회, 주 1회, 또는 더욱 빈번한 투여를 필요로 한다. 가령, ELOCTATE™ [항혈우병 인자 (재조합), Fc 융합 단백질]로 예방적 처치는 3 일 내지 5 일 마다 투여를 필요로 한다 (ELOCTATE™ Prescribing Information, Biogen Idec Inc., (2015)). 게다가, 화학적으로 변형된 생물제제 (가령, 페길화된 폴리펩티드)의 장기간 효과는 아직 완전히 이해되지는 않고 있다.
세 번째, 인자 VIII 보상 요법을 제공받는 모든 개체 중에서 15% 및 30% 사이가 항-인자 VIII 저해제 항체를 형성하고, 상기 요법을 비효율적으로 만든다. 인자 VIII 우회로 요법 (가령, 혈장-유래된 또는 재조합적으로-생산된 프로트롬빈 복합체 농축물의 투여)이 저해제 항체를 형성하는 개체에서 혈우병을 치료하는데 이용될 수 있다. 하지만, 인자 VIII 우회로 요법은 인자 VIII 보상 요법보다 덜 효과적이고 (Mannucci P.M., J Thromb Haemost., 1(7):1349-55 (2003)), 그리고 심혈관 합병증의 증가된 위험과 연관될 수 있다 (Luu and Ewenstein, Haemophilia, 10 Suppl. 2:10-16 (2004)).
체세포 유전자 요법은 A형 혈우병의 치료에 대한 큰 희망을 여전히 주고 있는데, 그 이유는 이것이 인자 VIII 활성의 1회 용량을 개체에게 제공하기 보다는, 근원적인 과소발현 기능적 인자 VIII 활성 (가령, 미스센스 또는 넌센스 돌연변이로 인해)을 치료할 것이기 때문이다. 인자 VIII 보상 요법과 비교하여, 작용 기전에서 이러한 차이 때문에, 인자 VIII 유전자 요법 벡터의 1회 투여는 인자 VIII를 수년 동안 개체에 제공하고, 치료 비용을 감소시키고, 그리고 지속된 환자 순응도에 대한 요구를 제거할 수 있다.
응고 인자 IX (FIX) 유전자 요법은 축소된 인자 IX 활성에 의해 특징되는 관련된 혈액 응고 장애인 B형 혈우병을 앓는 개체를 치료하는데 효과적으로 이용되었다 (Manno C.S., et al., Nat Med., 12(3):342-47 (2006)). 하지만, 인자 VIII 유전자 요법은 여러 독특한 과제를 제시한다. 가령, 전장, 야생형 인자 VIII 폴리펩티드 (2351개 아미노산; UniProt 수탁 번호 P00451)는 전장, 야생형 인자 IX 폴리펩티드 (461개 아미노산; UniProt 수탁 번호 P00740)보다 5배 크다. 따라서, 야생형 인자 VIII의 코딩 서열은 7053개 염기쌍인데, 이것은 전통적인 AAV 유전자 요법 벡터에서 포장되기에는 너무 크다. 게다가, 인자 VIII의 B-도메인 결실된 변이체의 보고된 재조합 발현 (BDD-FVIII)이 불량하였다. 따라서, 여러 그룹이 BDD-FVIII 구조체의 코돈 사용빈도를 변경하는 것을 시도하였지만, 성공은 제한적이었다.
발명의 짧은 요약
따라서, 코딩 서열이 유전자 요법 벡터 내로 더욱 효율적으로 포장되고, 그리고 이들을 통해 전달되는 인자 VIII 변이체가 요구된다. 인자 VIII를 더욱 효율적으로 발현하는 합성, 코돈-변경된 핵산이 또한 필요하다. 이런 인자 VIII 변이체 및 코돈-변경된 핵산은 인자 VIII 결함 (가령, A형 혈우병)의 향상된 치료를 허용한다. 상기 결함 및 인자 VIII 결함 (가령, A형 혈우병)의 치료와 연관된 다른 문제는 개시된 코돈-변경된 인자 VIII 변이체에 의해 감소되거나 또는 제거된다.
일부 구체예에 따라서, 본 발명은 인자 VIII 중쇄 (가령, CS01-HC-NA, CS04-HC-NA, 또는 CS23-HC-NA) 및 경쇄 (CS01-LC-NA, CS04-LC-NA, 또는 CS23-LC-NA)의 개시된 코돈-변경된 서열에 높은 서열 동일성을 갖는 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 구체예에서, 이들 핵산은 인자 VIII 중쇄와 경쇄를 코딩하는 서열 사이에, 선천적 인자 VIII B-도메인을 대체하는 링커 서열 (가령, 퓨린 개열 부위를 포함하는 링커 서열)을 인코딩하는 서열을 더욱 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 인자 VIII 폴리펩티드는 경쇄, 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄는 CS04-HC-NA (서열 번호: 3)와 최소한 95% 동일성을 갖는 첫 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄는 CS04-LC-NA (서열 번호: 4)와 최소한 95% 동일성을 갖는 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 95% 동일성을 갖는 세 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
한 양상에서, 본 발명은 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 인자 VIII 폴리펩티드는 경쇄, 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄는 CS01-HC-NA (서열 번호: 24)와 최소한 95% 동일성을 갖는 첫 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄는 CS01-LC-NA (서열 번호: 25)와 최소한 95% 동일성을 갖는 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 BDLO01 (서열 번호: 5)과 최소한 95% 동일성을 갖는 세 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
한 양상에서, 본 발명은 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 인자 VIII 폴리펩티드는 경쇄, 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄는 CS23-HC-NA (서열 번호: 22)와 최소한 95% 동일성을 갖는 첫 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄는 CS23-LC-NA (서열 번호: 23)와 최소한 95% 동일성을 갖는 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 BDLO23 (서열 번호: 7)과 최소한 95% 동일성을 갖는 세 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄를 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 개별 중쇄 서열 (가령, CS04-HC-NA (서열 번호: 3), CS01-HC-NA (서열 번호: 24), 또는 CS23-HC-NA (서열 번호: 22))와 최소한 96% 동일성을 갖고, 그리고 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄를 인코딩하는 두 번째 뉴클레오티드 서열은 개별 경쇄 서열 (가령, CS04-LC-NA (서열 번호: 4), CS01-LC-NA (서열 번호: 25), 또는 CS23-LC-NA (서열 번호: 23))와 최소한 96% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄를 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 개별 중쇄 서열 (가령, CS04-HC-NA (서열 번호: 3), CS01-HC-NA (서열 번호: 24), 또는 CS23-HC-NA (서열 번호: 22))와 최소한 97% 동일성을 갖고, 그리고 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄를 인코딩하는 두 번째 뉴클레오티드 서열은 개별 경쇄 서열 (가령, CS04-LC-NA (서열 번호: 4), CS01-LC-NA (서열 번호: 25), 또는 CS23-LC-NA (서열 번호: 23))와 최소한 97% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄를 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 개별 중쇄 서열 (가령, CS04-HC-NA (서열 번호: 3), CS01-HC-NA (서열 번호: 24), 또는 CS23-HC-NA (서열 번호: 22))와 최소한 98% 동일성을 갖고, 그리고 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄를 인코딩하는 두 번째 뉴클레오티드 서열은 개별 경쇄 서열 (가령, CS04-LC-NA (서열 번호: 4), CS01-LC-NA (서열 번호: 25), 또는 CS23-LC-NA (서열 번호: 23))와 최소한 98% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄를 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 개별 중쇄 서열 (가령, CS04-HC-NA (서열 번호: 3), CS01-HC-NA (서열 번호: 24), 또는 CS23-HC-NA (서열 번호: 22))와 최소한 99% 동일성을 갖고, 그리고 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄를 인코딩하는 두 번째 뉴클레오티드 서열은 개별 경쇄 서열 (가령, CS04-LC-NA (서열 번호: 4), CS01-LC-NA (서열 번호: 25), 또는 CS23-LC-NA (서열 번호: 23))와 최소한 99% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄를 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 개별 중쇄 서열 (가령, CS04-HC-NA (서열 번호: 3), CS01-HC-NA (서열 번호: 24), 또는 CS23-HC-NA (서열 번호: 22))와 최소한 99.5% 동일성을 갖고, 그리고 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄를 인코딩하는 두 번째 뉴클레오티드 서열은 개별 경쇄 서열 (가령, CS04-LC-NA (서열 번호: 4), CS01-LC-NA (서열 번호: 25), 또는 CS23-LC-NA (서열 번호: 23))와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄를 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 개별 중쇄 서열 (가령, CS04-HC-NA (서열 번호: 3), CS01-HC-NA (서열 번호: 24), 또는 CS23-HC-NA (서열 번호: 22))와 최소한 99.9% 동일성을 갖고, 그리고 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄를 인코딩하는 두 번째 뉴클레오티드 서열은 개별 경쇄 서열 (가령, CS04-LC-NA (서열 번호: 4), CS01-LC-NA (서열 번호: 25), 또는 CS23-LC-NA (서열 번호: 23))와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄를 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 CS04-HC-NA (서열 번호: 3)이고, 그리고 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄를 인코딩하는 두 번째 뉴클레오티드 서열은 CS04-LC-NA (서열 번호: 4)이다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄를 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 CS01-HC-NA (서열 번호: 24)이고, 그리고 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄를 인코딩하는 두 번째 뉴클레오티드 서열은 CS01-LC-NA (서열 번호: 25)이다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄를 인코딩하는 첫 번째 뉴클레오티드 서열은 CS23-HC-NA (서열 번호: 22)이고, 그리고 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄를 인코딩하는 두 번째 뉴클레오티드 서열은 CS23-LC-NA (서열 번호: 23)이다.
한 양상에서, 본 발명은 CS04-FL-NA와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 CS01-FL-NA와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 CS23-FL-NA와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 개별 전장 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, CS04-FL-NA (서열 번호: 1), CS01-FL-NA (서열 번호: 13), 또는 CS23-FL-NA (서열 번호: 20))와 최소한 96% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 개별 전장 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, CS04-FL-NA (서열 번호: 1), CS01-FL-NA (서열 번호: 13), 또는 CS23-FL-NA (서열 번호: 20))와 최소한 97% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 개별 전장 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, CS04-FL-NA (서열 번호: 1), CS01-FL-NA (서열 번호: 13), 또는 CS23-FL-NA (서열 번호: 20))와 최소한 98% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 개별 전장 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, CS04-FL-NA (서열 번호: 1), CS01-FL-NA (서열 번호: 13), 또는 CS23-FL-NA (서열 번호: 20))와 최소한 99% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 개별 전장 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, CS04-FL-NA (서열 번호: 1), CS01-FL-NA (서열 번호: 13), 또는 CS23-FL-NA (서열 번호: 20))와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 개별 전장 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, CS04-FL-NA (서열 번호: 1), CS01-FL-NA (서열 번호: 13), 또는 CS23-FL-NA (서열 번호: 20))와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)이다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)이다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)이다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 96% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 97% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 98% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 CS04-SC1-NA (서열 번호: 9)와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 CS04-SC2-NA (서열 번호: 11)와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 CS01-SC1-NA (서열 번호: 26)와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 CS01-SC2-NA (서열 번호: 27)와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 CS23-SC1-NA (서열 번호: 28)와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
한 양상에서, 본 발명은 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29)와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 개별 전장 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, CS04-SC1-NA (서열 번호: 9), CS04-SC2-NA (서열 번호: 11), CS01-SC1-NA (서열 번호: 26), CS01-SC2-NA (서열 번호: 27), CS23-SC1-NA (서열 번호: 28), 또는 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29))와 최소한 96% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 개별 전장 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, CS04-SC1-NA (서열 번호: 9), CS04-SC2-NA (서열 번호: 11), CS01-SC1-NA (서열 번호: 26), CS01-SC2-NA (서열 번호: 27), CS23-SC1-NA (서열 번호: 28), 또는 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29))와 최소한 97% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 개별 전장 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, CS04-SC1-NA (서열 번호: 9), CS04-SC2-NA (서열 번호: 11), CS01-SC1-NA (서열 번호: 26), CS01-SC2-NA (서열 번호: 27), CS23-SC1-NA (서열 번호: 28), 또는 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29))와 최소한 98% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 개별 전장 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, CS04-SC1-NA (서열 번호: 9), CS04-SC2-NA (서열 번호: 11), CS01-SC1-NA (서열 번호: 26), CS01-SC2-NA (서열 번호: 27), CS23-SC1-NA (서열 번호: 28), 또는 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29))와 최소한 99% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 개별 전장 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, CS04-SC1-NA (서열 번호: 9), CS04-SC2-NA (서열 번호: 11), CS01-SC1-NA (서열 번호: 26), CS01-SC2-NA (서열 번호: 27), CS23-SC1-NA (서열 번호: 28), 또는 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29))와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 개별 전장 폴리뉴클레오티드 서열 (가령, CS04-SC1-NA (서열 번호: 9), CS04-SC2-NA (서열 번호: 11), CS01-SC1-NA (서열 번호: 26), CS01-SC2-NA (서열 번호: 27), CS23-SC1-NA (서열 번호: 28), 또는 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29))와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC1-NA (서열 번호: 9)이다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC2-NA (서열 번호: 11)이다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC1-NA (서열 번호: 26)이다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC2-NA (서열 번호: 27)이다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC1-NA (서열 번호: 28)이다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29)이다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2-NA 및 CS23-SC2-NA로 구성된 군에서 선택되는 서열과 최소한 95% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2-NA 및 CS23-SC2-NA로 구성된 군에서 선택되는 서열과 최소한 96% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2-NA 및 CS23-SC2-NA로 구성된 군에서 선택되는 서열과 최소한 97% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2-NA 및 CS23-SC2-NA로 구성된 군에서 선택되는 서열과 최소한 98% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2-NA 및 CS23-SC2-NA로 구성된 군에서 선택되는 서열과 최소한 99% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2-NA 및 CS23-SC2-NA로 구성된 군에서 선택되는 서열과 최소한 99.5% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2-NA 및 CS23-SC2-NA로 구성된 군에서 선택되는 서열과 최소한 99.5% 동일성을 갖는다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA, CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-FL-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-FL-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA, CS01-SC1-NA, CS04-SC1-NA, CS23-SC1-NA, CS01-SC2-NA, CS04-SC2-NA 및 CS23-SC2-NA로 구성된 군에서 선택된다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 인코딩된 인자 VIII 폴리펩티드는 2개 연속 아미노산 사이에 배치된 글리코실화 폴리펩티드를 포함한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 또한, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 요소를 포함한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 또한, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 인핸서 요소를 포함한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 또한, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 폴리아데닐화 요소를 포함한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 또한, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 인트론을 포함한다.
앞서 설명된 폴리뉴클레오티드의 한 구체예에서, 인트론은 프로모터 요소 및 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 번역 개시 부위 (가령, 첫 번째 코딩 ATG) 사이에 배치된다.
다른 양상에서, 본 발명은 앞서 설명된 바와 같은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 포유류 유전자 요법 벡터를 제공한다.
앞서 설명된 포유류 유전자 요법 벡터의 한 구체예에서, 포유류 유전자 요법 벡터는 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 벡터이다.
앞서 설명된 포유류 유전자 요법 벡터의 한 구체예에서, AAV 벡터는 AAV-8 벡터이다.
다른 양상에서, 본 발명은 A형 혈우병을 치료하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 앞서 설명된 바와 같은 포유류 유전자 요법 벡터를 치료가 필요한 환자에 투여하는 것을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 A형 혈우병을 치료하기 위한, 앞서 설명된 바와 같은 포유류 유전자 요법 벡터를 제공한다.
다른 양상에서, 본 발명은 A형 혈우병을 치료하기 위한 약제의 제조에서, 앞서 설명된 바와 같은 포유류 유전자 요법 벡터의 용도를 제공한다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 야생형 및 ReFacto-유형 인간 인자 VIII 단백질 구조체의 개략적 도해를 보여준다.
도면 2a 및 2b는 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CS04 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 1) (전장 코딩 서열의 경우 "CS04-FL-NA")을 보여준다.
도면 3은 일부 구체예에 따른 CS04 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체 아미노산 서열 (서열 번호: 2) (전장 아미노산 서열의 경우 "CS04-FL-AA")을 보여준다.
도면 4는 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체의 중쇄를 인코딩하는 CS04 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 3) ("CS04-HC-NA")의 부분을 보여준다.
도면 5는 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체의 경쇄를 인코딩하는 CS04 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 4) ("CS04-LC-NA")의 부분을 보여준다.
도면 6은 일부 구체예에 따라서 B-도메인 치환된 링커에 대한 예시적인 코딩 서열 (서열 번호 5-7)을 보여준다. BDLO01 (서열 번호: 5), BDLO04 (서열 번호: 6) 및 BDLO23 (서열 번호: 7)은 B-도메인 치환된 링커를 각각 인코딩하는 CS01, CS04 및 CS23 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열의 개별 부분이다.
도면 7a, 7b 및 7c는 일부 구체예에 따라서 CS04 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열을 내포하는 AAV 벡터 서열 (서열 번호: 8) ("CS04-AV-NA")을 보여준다.
도면 8a 및 8b는 일부 구체예에 따른 단일 사슬 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CS04△(760-1667) (SPI; CS04△(741-1648), SPE) 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 9) ("CS04-SC1-NA")을 보여준다.
도면 9는 일부 구체예에 따라서 CS01△(760-1667) (SPI; CS01△(741-1648), SPE), CS04△(760-1667) (SPI; CS04△(741-1648), SPE) 및 CS23△(760-1667) (SPI; CS23△(741-1648), SPE) 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체 아미노산 서열 (서열 번호: 10) (각각, "CS01-SC1-AA", "CS04-SC1-AA" 및 "CS23-SC1-AA")을 보여준다.
도면 10a 및 10b는 일부 구체예에 따른 단일 사슬 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CS04△(772-1667) (SPI; CS04△(753-1648), SPE) 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 11) ("CS04-SC2-NA")을 보여준다.
도면 11은 일부 구체예에 따른 CS01△(772-1667) (SPI; CS01△(753-1648), SPE), CS04△(772-1667) (SPI; CS04△(753-1648), SPE) 및 CS23△(772-1667) (SPI; CS23△(753-1648), SPE) 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체 아미노산 서열 (서열 번호: 12) (각각, "CS01-SC2-AA", "CS04-SC2-AA" 및 "CS23-SC2-AA")을 보여준다.
도면 12a 및 12b는 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CS01 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 13) ("CS01-FL-NA")을 보여준다.
도면 13a 및 13b는 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CS08 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 14) ("CS08-FL-NA")을 보여준다.
도면 14a 및 14b는 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CS10 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 15) ("CS10-FL-NA")을 보여준다.
도면 15a 및 15b는 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CS11 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 16) ("CS11-FL-NA")을 보여준다.
도면 16a 및 16b는 일부 구체예에 따른 CS40 야생형 ReFacto 코딩 서열 (서열 번호: 17) ("CS40-FL-NA")을 보여준다.
도면 17a 및 17b는 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CH25 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 18) ("CH25-FL-NA")을 보여준다.
도면 18은 일부 구체예에 따른 야생형 인간 인자 VIII 아미노산 서열 (서열 번호: 19) ("FVIII-FL-AA")을 보여준다.
도면 19는 AscI 및 NotI 제한 부위를 통해, 합성 Refacto-유형 BDD-FVIII DNA 서열을 벡터 중추 pCh-BB01 내로 삽입함으로써, pCS40, pCS01, pCS04, pCS08, pCS10, pCS11 및 pCh25 구조체를 클로닝하기 위한 반응식을 도해한다.
도면 20은 아가로즈 겔 전기이동에 의해 분석될 때, AAV 벡터 유전체 제조물의 완전성을 보여준다. 레인 1, DNA 마커; 레인 2, vCS40; 레인 3, vCS01; 레인 4, vCS04. AAV 벡터는 모두 동일한-크기의 유전체를 갖고, 거의 5 kb에서 이동한다 (화살표, 오른쪽). 왼쪽 측면에서 척도는 킬로베이스 (kb)에서 DNA 단편의 크기를 지시한다.
도면 21은 PAGE 및 은 염색에 의한 AAV 벡터 제조물의 단백질 분석을 보여준다. 레인 1, 단백질 마커 (M); 레인 2, vCS40, 레인 3, vCS01; 및 레인 4, vCS04. 이들 구조체 모두 VP1, VP2 및 VP3으로 구성되는 동일한 AAV8 캡시드를 갖는다 (오른쪽 화살표). 왼쪽 측면에 척도는 킬로달톤 (kDa)에서 단백질 마커의 크기를 지시한다.
도면 22a 및 22b는 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CS23 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 20) ("CS23-FL-NA")을 보여준다.
도면 23은 일부 구체예에 따른 CS23 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체 아미노산 서열 (서열 번호: 21) ("CS23-FL-AA")을 보여준다.
도면 24는 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체의 중쇄를 인코딩하는 CS23 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 22) ("CS23-HC-NA")의 부분을 보여준다.
도면 25는 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체의 경쇄를 인코딩하는 CS23 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 23) ("CS23-LC-NA")의 부분을 보여준다.
도면 26은 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체의 중쇄를 인코딩하는 CS01 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 24) ("CS01-HC-NA")의 부분을 보여준다.
도면 27은 일부 구체예에 따른 인자 VIII 변이체의 경쇄를 인코딩하는 CS01 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 25) ("CS01-LC-NA")의 부분을 보여준다.
도면 28a 및 28b는 일부 구체예에 따른 단일 사슬 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CS01△(760-1667) (SPI; CS01△(741-1648), SPE) 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 26) ("CS01-SC1-NA")을 보여준다.
도면 29a 및 29b는 일부 구체예에 따른 단일 사슬 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CS01△(772-1667) (SPI; CS01△(753-1648), SPE) 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 27) ("CS01-SC2-NA")을 보여준다.
도면 30a 및 30b는 일부 구체예에 따른 단일 사슬 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CS23△(760-1667) (SPI; CS23△(741-1648), SPE) 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 28) ("CS23-SC1-NA")을 보여준다.
도면 31a 및 31b는 일부 구체예에 따른 단일 사슬 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 CS23△(772-1667) (SPI; CS23△(753-1648), SPE) 코돈-변경된 뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 29) ("CS23-SC2-NA")을 보여준다.
발명의 상세한 설명
I. 도입
AAV-기초된 유전자 요법은 혈우병 환자의 치료에 대한 큰 희망을 여전히 주고 있다. B형 혈우병의 경우에, 첫 번째 임상적 데이터는 약 10%의 FIX 수준이 1 년 이상 동안 최소한 일부 환자에서 유지될 수 있다는 점에서 고무적이다. 하지만, A형 혈우병의 경우에, AAV 벡터로 5-10%의 치료적 발현 수준을 달성하는 것이 다양한 이유로 인해 과제로 남아있다. 첫 번째, 인자 VIII 코딩 서열은 전통적인 AAV-기초된 벡터에게는 너무 크다. 두 번째, 가공된 B-도메인 결실되거나 또는 절두된 인자 VIII 구조체는 심지어 코돈-최적화될 때에도 생체내에서 불량한 발현을 겪는다. 세 번째, 이들 B-도메인 결실되거나 또는 절두된 인자 VIII 변이체 구조체는 생체내에서 짧은 반감기를 갖고, 불량한 발현의 효과를 악화시킨다. 네 번째, 심지어 발현될 때에도, FVIII는 다른 응고 인자, 예를 들면, 인자 IX처럼, 세포로부터 효율적으로 분비되지 않는다.
게다가, 이들 과제는 더욱 높은 용량의 유전자 요법 구조체를 단순히 투여함으로써 다뤄질 수 없다. 현재 지식에 따르면, AAV-기초된 유전자 요법 벡터의 벡터 용량은 2x1012 vg/kg 체중을 초과하여 증가되어야 한다. 이것은 이런 고용량에서 T 세포 면역 반응이 촉발되기 때문인데, 상기 반응은 형질도입된 세포를 파괴하고, 그리고 결과로서, 도입유전자 발현이 감소되거나 또는 심지어 제거된다. 이런 이유로, FVIII의 발현을 향상시키는 전략이 FVIII 유전자 요법을 A형 혈우병 환자에 대한 실행가능한 치료 옵션으로 만드는데 필요하다.
본 발명은 인자 VIII 유전자 요법과 연관된 이런 저런 문제를 해결하는 코돈-변경된 인자 VIII 변이체 코딩 서열의 발견에 관계한다. 가령, 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드는 포유류 세포에서 현저하게 향상된 발현을 제공하고, 그리고 안정된 패킹 상호작용으로 인해 향상된 비리온 포장을 전시한다. 일부 실행에서, 이들 이점은 코돈 변경된 CS01, CS04 및 CS23 구조체에 높은 서열 동일성 (가령, CS01-HC, CS04-HC 및 CS23-HC 중쇄 코딩 서열 중에서 한 가지에 높은 서열 동일성, 그리고 CS01-LC, CS04-LC 및 CS23-LC 경쇄 코딩 서열 중에서 한 가지에 높은 서열 동일성)을 갖는 인자 VIII의 중쇄와 경쇄에 대한 코딩 서열을 이용함으로써 실현된다.
일부 실행에서, 본원에서 설명된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 분자는 야생형 B-도메인을 절두시키거나, 결실시키거나, 또는 대체함으로써 단축되었다. 따라서, 이들 폴리뉴클레오티드는 더욱 큰 폴리펩티드, 예를 들면, 야생형 인자 VIII를 비효율적으로 발현하는 전통적인 유전자 요법 벡터를 통해 인자 VIII를 발현하는데 더욱 적합하다.
유리하게는, CS01, CS04 및 CS23 코돈-변경된 인자 VIII 변이체 코딩 서열은 생체내에서 B-도메인 결실된 인자 VIII 구조체의 우수한 발현을 제공하는 것으로 본원에서 밝혀진다. 가령, 실시예 2 및 표 4에서, CS01 (서열 번호: 13), CS04 (서열 번호: 1) 및 CS23 (서열 번호: 20) 코딩 서열을 갖는 AAV-기초된 유전자 요법 벡터의 정맥내 투여는 인자 VIII 녹아웃 생쥐에서, 야생형 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 번호: 17)로 인코딩된 상응하는 CS40 구조체에 비하여, 인자 VIII 발현에서 18-배, 74-배 및 30-배 증가를 제공하는 것으로 증명된다 (표 4).
게다가, CS01 및 CS04 코돈-변경된 인자 VIII 변이체 코딩 서열은 우수한 비리온 포장 및 바이러스 생산을 제공하는 것으로 본원에서 또한 밝혀진다. 가령, 실시예 1에서, CS01 및 CS04 구조체를 내포하는 AAV 벡터 구조체는 동일한 양의 세포 펠렛으로부터 단리될 때, 야생형 폴리뉴클레오티드 서열로 인코딩된 상응하는 CS40 구조체에 비하여, 5 내지 7-배 큰 바이러스 수율을 제공하는 것으로 증명된다.
II. 정의
본원에서 이용된 바와 같이, 다음의 용어는 달리 명시되지 않으면, 그들에 생득된 의미를 갖는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인자 VIII" 및 "FVIII"는 교체가능하게 이용되고, 그리고 인자 VIII 활성을 갖는 임의의 단백질 (가령, 활성 FVIII, FVIIIa로서 종종 지칭됨) 또는 인자 VIII 활성, 특히 인자 IXa 보조인자 활성을 갖는 단백질의 단백질 전구체 (가령, 프로-단백질 또는 프리-프로-단백질)를 지칭한다. 한 예시적인 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드는 야생형 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄와 경쇄에 높은 서열 동일성 (가령, 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상)을 갖는 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드의 B-도메인은 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 크기를 감소시키기 위해 결실되거나, 절두되거나, 또는 링커 폴리펩티드로 대체된다. 한 예시적인 구체예에서, CS04-FL-AA의 아미노산 20-1457은 인자 VIII 폴리펩티드를 구성한다.
야생형 인자 VIII 폴리펩티드의 무제한적 실례는 인간 프리-프로-인자 VIII (가령, GenBank 수탁 번호 AAA52485, CAA25619, AAA58466, AAA52484, AAA52420, AAV85964, BAF82636, BAG36452, CAI41660, CAI41666, CAI41672, CAI43241, CAO03404, EAW72645, AAH22513, AAH64380, AAH98389, AAI11968, AAI11970, 또는 AAB61261), 상응하는 프로-인자 VIII 및 이들의 자연 변이체; 돼지 프리-프로-인자 VIII (가령, UniProt 수탁 번호 F1RZ36 또는 K7GSZ5), 상응하는 프로-인자 VIII 및 이들의 자연 변이체; 생쥐 프리-프로-인자 VIII (가령, GenBank 수탁 번호 AAA37385, CAM15581, CAM26492, 또는 EDL29229), 상응하는 프로-인자 VIII 및 이들의 자연 변이체; 쥐 프리-프로-인자 VIII (가령, GenBank 수탁 번호 AAQ21580), 상응하는 프로-인자 VIII 및 이들의 자연 변이체; 쥐 프리-프로-인자 VIII; 그리고 다른 포유류 인자 VIII 동족체 (가령, 원숭이, 유인원, 햄스터, 기니 피그 등)를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 인자 VIII 폴리펩티드는 인자 IX 보조인자 활성을 갖는 자연 변이체 및 인공 구조체를 포함한다. 본 발명에서 이용된 바와 같이, 인자 VIII는 일부 기저 인자 IX 보조인자 활성 (가령, 상응하는 야생형 활성의 최소한 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 그 이상)을 유지하는 임의의 자연 변이체, 대안적 서열, 동종형, 또는 돌연변이체 단백질을 포괄한다. 인간 개체군에서 발견된 인자 VIII 아미노산 변이 (FVIII-FL-AA (서열 번호: 19)에 비하여)의 실례는 제한 없이, S19R, R22T, Y24C, Y25C, L26P/R, E30V, W33G, Y35C/H, G41C, R48C/K, K67E/N, L69P, E72K, D75E/V/Y, P83R, G89D/V, G92A/V, A97P, E98K, V99D, D101G/H/V, V104D, K108T, M110V, A111T/V, H113R/Y, L117F/R, G121S, E129V, G130R, E132D, Y133C, D135G/Y, T137A/I, S138R, E141K, D145H, V147D, Y155H, V159A, N163K, G164D/V, P165S, C172W, S176P, S179P, V181E/M, K185T, D186G/N/Y, S189L, L191F, G193R, L195P, C198G, S202N/R, F214V, L217H, A219D/T, V220G, D222V, E223K, G224W, T252I, V253F, N254I, G255V, L261P, P262L, G263S, G266F, C267Y, W274C, H275L, G278R, G280D, E284K, V285G, E291G/K, T294I, F295L, V297A, N299I, R301C/H/L, A303E/P, I307S, S308L, F312S, T314A/I, A315V, G323E, L326P, L327P/V, C329F, I331V, M339T, E340K, V345A/L, C348R/S/Y, Y365C, R391C/H/P, S392L/P, A394S, W401G, I405F/S, E409G, W412G/R, K427I, L431F/S, R437P/W, I438F, G439D/S/V, Y442C, K444R, Y450D/N, T454I, F455C, G466E, P470L/R/T, G474E/R/V, E475K, G477V, D478N, T479R, F484C, A488G, R490G, Y492C/H, Y492H, I494T, P496R, G498R, R503H, G513S/V, I522Y, K529E, W532G, P540T, T541S, D544N, R546W, R550C/G/H, S553P, S554C/G, V556D, R560T, D561G/H/Y, I567T, P569R, S577F, V578A, D579A/H, N583S, Q584H/K/R, I585R/T, M586V, D588G/Y, L594Q, S596P, N601D/K, R602G, S603I/R, W604C, Y605H/S, N609I, R612C, N631K/S, M633I, S635N, N637D/I/S, Y639C, L644V, L650F, V653A/M, L659P, A663V, Q664P, F677L, M681I, V682F, Y683C/N, T686R, F698L, M699T/V, M701I, G705V, G710W, N713I, R717L/W, G720D/S, M721I/L, A723T, L725Q, V727F, E739K, Y742C, R795G, P947R, V1012L, E1057K, H1066Y, D1260E, K1289Q, Q1336K, N1460K, L1481P, A1610S, I1698T, Y1699C/F, E1701K, Q1705H, R1708C/H, T1714S, R1715G, A1720V, E1723K, D1727V, Y1728C, R1740G, K1751Q, F1762L, R1768H, G1769R, L1771P, L1775F/V, L1777P, G1779E/R, P1780L, I1782R, D1788H, M1791T, A1798P, S1799H, R1800C/G/H, P1801A, Y1802C, S1803Y, F1804S, L1808F, M1842I, P1844S, T1845P, E1848G, A1853T/V, S1858C, K1864E, D1865N/Y, H1867P/R, G1869D/V, G1872E, P1873R, L1875P, V1876L, C1877R/Y, L1882P, R1888I, E1894G, I1901F, E1904D/K, S1907C/R, W1908L, Y1909C, A1939T/V, N1941D/S, G1942A, M1945V, L1951F, R1960L/Q, L1963P, S1965I, M1966I/V, G1967D, S1968R, N1971T, H1973L, G1979V, H1980P/Y, F1982I, R1985Q, L1994P, Y1998C, G2000A, T2004R, M2007I, G2013R, W2015C, R2016P/W, E2018G, G2022D, G2028R, S2030N, V2035A, Y2036C, N2038S, 2040Y, G2045E/V, I2051S, I2056N, A2058P, W2065R, P2067L, A2070V, S2082N, S2088F, D2093G/Y, H2101D, T2105N, Q2106E/P/R, G2107S, R2109C, I2117F/S, Q2119R, F2120C/L, Y2124C, R2135P, S2138Y, T2141N, M2143V, F2145C, N2148S, N2157D, P2162L, R2169C/H, P2172L/Q/R, T2173A/I, H2174D, R2178C/H/L, R2182C/H/P, M2183R/V, L2185S/W, S2192I, C2193G, P2196R, G2198V, E2200D, I2204T, I2209N, A2211P, A2220P, P2224L, R2228G/L/P/Q, L2229F, V2242M, W2248C/S, V2251A/E, M2257V, T2264A, Q2265R, F2279C/I, I2281T, D2286G, W2290L, G2304V, D2307A, P2319L/S, R2323C/G/H/L, R2326G/L/P/Q, Q2330P, W2332R, I2336F, R2339T, G2344C/D/S, 그리고 C2345S/Y를 포함한다. 인자 VIII 단백질은 또한, 번역후 변형을 내포하는 폴리펩티드를 포함한다.
일반적으로, 인자 VIII를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 활성 인자 VIII 단백질 (가령, FVIIIa)을 형성하는 번역후 처리를 겪는 비활성 단일 사슬 폴리펩티드 (가령, 프리-프로-단백질)을 인코딩한다. 가령, 도면 1을 참고하면, 야생형 인간 인자 VIII 프리-프로-단백질은 먼저 개열되어 인코딩된 신호 펩티드 (도시되지 않음)를 방출하고, 첫 번째 단일 사슬 프로-단백질 ("인간 야생형 FVIII로서 도시됨)을 형성한다. 프로-단백질은 이후, B 및 A3 도메인 사이에 개열되어, 인자 VIII 중쇄 (가령, A1 및 A2 도메인) 및 B-도메인을 포함하는 첫 번째 폴리펩티드, 그리고 인자 VIII 경쇄 (가령, A3, C1 및 C3 도메인 포함)를 포함하는 두 번째 폴리펩티드를 형성한다. 첫 번째 폴리펩티드는 B-도메인을 제거하고, 그리고 또한, 성숙 인자 VIIIa 단백질에서 인자 VIII 경쇄와 연관된 상태로 남아있는 A1 및 A2 도메인을 분리하기 위해 더욱 개열된다. 인자 VIII 성숙 과정의 리뷰를 위해, Graw et al., Nat Rev Genet., 6(6):488-501 (2005)을 참조하고, 이것의 내용은 모든 점에서 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
하지만, 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드이다. 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드는 자연 개열 부위를 제거하고, 그리고 임의선택적으로, 인자 VIII의 B-도메인을 제거하거나, 절두하거나, 또는 대체하도록 가공된다. 따라서, 이들은 개열 (임의선택적 신호 및/또는 리더 펩티드의 개열 제외)에 의해 성숙되지 않고, 그리고 단일 사슬로서 활성이다. 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드의 무제한적 실례는 Zollner et al. (Thromb Res, 134(1):125-31 (2014)) 및 Donath et al. (Biochem J., 312(1):49-55 (1995))에서 설명되고, 이들의 개시는 모든 점에서 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인자 VIII 중쇄" 또는 단순히 "중쇄"는 인자 VIII 폴리펩티드의 A1 및 A2 도메인의 응집체를 지칭한다. 한 예시적인 구체예에서, CS04-FL-AA (서열 번호: 2)의 아미노산 20-759는 인자 VIII 중쇄를 구성한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "인자 VIII 경쇄" 또는 단순히 "경쇄"는 인자 VIII 폴리펩티드의 A3, C1 및 C2 도메인의 응집체를 지칭한다. 한 예시적인 구체예에서, 아미노산 774-1457 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)는 인자 VIII 경쇄를 구성한다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 경쇄는 생체내에서 성숙 동안 방출되는 산성 a3 펩티드를 배제한다.
일반적으로, 인자 VIII 중쇄와 경쇄는 예로서, 임의선택적 B-도메인 또는 B-도메인 치환된 링커와 함께, 단일 폴리펩티드 사슬로서 발현된다. 하지만, 일부 구체예에서, 인자 VIII 중쇄 및 인자 VIII 경쇄는 별개의 폴리펩티드 사슬로서 발현되고 (가령, 공동발현되고), 그리고 재구성되어 인자 VIII 단백질을 형성한다 (가령, 생체내에서 또는 시험관내에서).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "B-도메인 치환된 링커" 및 "인자 VIII 링커"는 교체가능하게 이용되고, 그리고 야생형 인자 VIII B-도메인의 절두된 이형 (가령, FVIII-FL-AA (서열 번호: 19)의 아미노산 760-1667) 또는 인자 VIII 폴리펩티드의 B-도메인을 대체하도록 가공된 펩티드를 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 인자 VIII 링커는 일부 구체예에 따라서 인자 VIII 변이체 폴리펩티드에서 인자 VIII 중쇄의 C 말단 및 인자 VIII 경쇄의 N 말단 사이에 배치된다. B-도메인 치환된 링커의 무제한적 실례는 U.S. 특허 번호 4,868,112, 5,112,950, 5,171,844, 5,543,502, 5,595,886, 5,610,278, 5,789,203, 5,972,885, 6,048,720, 6,060,447, 6,114,148, 6,228,620, 6,316,226, 6,346,513, 6,458,563, 6,924,365, 7,041,635 및 7,943,374; U.S. 특허 출원 공개 번호 2013/024960, 2015/0071883 및 2015/0158930; 그리고 PCT 공개 번호 WO 2014/064277 및 WO 2014/127215에서 개시되고, 이들의 개시는 모든 점에서 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
본원에서 달리 특정되지 않으면, 인자 VIII 아미노산의 넘버링은 도면 18에서 서열 번호: 19로서 제공된, 전장, 야생형 인간 인자 VIII 서열에서 상응하는 아미노산 (FVIII-FL-AA)을 지칭한다. 따라서, 본원에서 개시된 인자 VIII 변이체 단백질에서 아미노산 치환을 지칭할 때, 언급된 아미노산 번호는 전장, 야생형 인자 VIII 서열에서 유사한 (가령, 구조적으로 또는 기능적으로 동등한) 및/또는 상동한 (가령, 일차 아미노산 서열에서 진화적으로 보존된) 아미노산을 지칭한다. 가령, T2105N 아미노산 치환은 전장, 야생형 인간 인자 VIII 서열 (FVIII-FL-AA; 서열 번호: 19)의 위치 2105에서 T에서 N으로 치환, 그리고 CS04에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체 단백질 (CS04-FL-AA; 서열 번호: 2)의 위치 1211에서 T에서 N으로 치환을 지칭한다.
본원에서 설명된 바와 같이, 인자 VIII 아미노산 넘버링 시스템은 인자 VIII 신호 펩티드 (가령, 전장, 야생형 인간 인자 VIII 서열의 아미노산 1-19)가 포함되는 지에 의존한다. 신호 펩티드가 포함되는 경우에, 넘버링은 "신호 펩티드 포함" 또는 "SPI"로서 지칭된다. 신호 펩티드가 포함되지 않는 경우에, 넘버링은 "신호 펩티드 배제" 또는 "SPE"로서 지칭된다. 가령, F328S는 SPE 넘버링에서 F309S와 동일한 아미노산에 대한 SPI 넘버링이다. 달리 지시되지 않으면, 모든 아미노산 넘버링은 도면 18에서 서열 번호: 19로서 제공된, 전장, 야생형 인간 인자 VIII 서열 (FVIII-FL-AA)에서 상응하는 아미노산을 지칭한다.
본원에서 설명된 바와 같이, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 선천적으로-코딩된 인자 VIII 구조체 (가령, 야생형 인간 코돈을 이용하여 동일한 인자 VIII 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)에 의해 제공된 인자 VIII 발현의 수준과 비교하여, 생체내에서 (가령, 유전자 요법 벡터의 일부로서 투여될 때) 유전자도입 인자 VIII의 증가된 발현을 제공한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "증가된 발현"은 선천적으로-코딩된 인자 VIII 구조체가 투여된 동물의 혈액 내에 유전자도입 인자 VIII 활성의 수준과 비교하여, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드 인코딩 인자 VIII이 투여된 동물의 혈액 내에 유전자도입 인자 VIII 활성의 증가된 수준을 지칭한다. 활성 수준은 당해 분야에서 공지된 임의의 인자 VIII 활성을 이용하여 계측될 수 있다. 인자 VIII 활성을 결정하기 위한 예시적인 검정은 Technochrome FVIII 검정 (Technoclone, Vienna, Austria)이다.
일부 구체예에서, 증가된 발현은 선천적으로 코딩된 인자 VIII 폴리뉴클레오티드가 투여된 동물의 혈액 내에 유전자도입 인자 VIII 활성의 수준과 비교하여, 코돈-변경된 인자 VIII 폴리뉴클레오티드가 투여된 동물의 혈액 내에 최소한 25% 큰 유전자도입 인자 VIII 활성을 지칭한다. 일부 구체예에서, 증가된 발현은 선천적으로 코딩된 인자 VIII 폴리뉴클레오티드가 투여된 동물의 혈액 내에 유전자도입 인자 VIII 활성의 수준과 비교하여, 코돈-변경된 인자 VIII 폴리뉴클레오티드가 투여된 동물의 혈액 내에 최소한 50% 큰, 최소한 75% 큰, 최소한 100% 큰, 최소한 3-배 큰, 최소한 4-배 큰, 최소한 5-배 큰, 최소한 6-배 큰, 최소한 7-배 큰, 최소한 8-배 큰, 최소한 9-배 큰, 최소한 10-배 큰, 최소한 15-배 큰, 최소한 20-배 큰, 최소한 25-배 큰, 최소한 30-배 큰, 최소한 40-배 큰, 최소한 50-배 큰, 최소한 60-배 큰, 최소한 70-배 큰, 최소한 80-배 큰, 최소한 90-배 큰, 최소한 100-배 큰, 최소한 125-배 큰, 최소한 150-배 큰, 최소한 175-배 큰, 최소한 200-배 큰, 최소한 225-배 큰, 또는 최소한 250-배 큰 유전자도입 인자 VIII 활성을 지칭한다.
본원에서 설명된 바와 같이, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 선천적으로-코딩된 인자 VIII 구조체 (가령, 야생형 인간 코돈을 이용하여 동일한 인자 VIII 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)에 의해 제공된 벡터 생산의 수준과 비교하여 증가된 벡터 생산을 제공한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "증가된 바이러스 생산"은 선천적으로-코딩된 인자 VIII 구조체로 접종된 세포 배양액에서 벡터 수율과 비교하여, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드 인코딩 인자 VIII로 접종된 세포 배양액에서 증가된 벡터 수율 (가령, 배양액 리터당 역가)을 지칭한다. 벡터 수율은 당해 분야에서 공지된 임의의 벡터 역가 검정을 이용하여 계측될 수 있다. 벡터 수율 (가령, AAV 벡터의)을 결정하기 위한 예시적인 검정은 AAV2 반전된 말단 반복을 표적으로 하는 qPCR이다 (Aurnhammer, Human Gene Therapy Methods: Part B 23:18-28 (2012)).
일부 구체예에서, 증가된 바이러스 생산은 동일한 유형의 배양액에서 선천적으로-코딩된 인자 VIII 구조체의 수율과 비교하여, 최소한 25% 큰 코돈-변경된 벡터 수율을 지칭한다. 일부 구체예에서, 증가된 벡터 생산은 동일한 유형의 배양액에서 선천적으로-코딩된 인자 VIII 구조체의 수율과 비교하여, 최소한 50% 큰, 최소한 75% 큰, 최소한 100% 큰, 최소한 3-배 큰, 최소한 4-배 큰, 최소한 5-배 큰, 최소한 6-배 큰, 최소한 7-배 큰, 최소한 8-배 큰, 최소한 9-배 큰, 최소한 10-배 큰, 최소한 15-배 큰, 또는 최소한 20-배 큰 코돈-변경된 벡터 수율을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "혈우병"은 감소된 혈액 응고 또는 응고에 의해 광범위하게 특징되는 일군의 질환 상태를 지칭한다. 혈우병은 유형 A, 유형 B, 또는 유형 C 혈우병, 또는 3개 질환 유형 모두의 복합을 지칭할 수 있다. 유형 A 혈우병 (A형 혈우병)은 인자 VIII (FVIII) 활성의 감소 또는 상실에 의해 유발되고, 그리고 혈우병 아형 중에서 가장 두드러진다. 유형 B 혈우병 (B형 혈우병)은 인자 IX (FIX) 응고 기능의 상실 또는 감소로부터 발생한다. 유형 C 혈우병 (C형 혈우병)은 인자 XI (FXI) 응고 활성에서 상실 또는 감소의 결과이다. A형과 B형 혈우병은 X 연관된 질환이고, 반면 C형 혈우병은 상염색체 연관된 질환이다. 혈우병에 대한 전통적인 치료는 응고 인자, 예를 들면, FVIII, Bebulin®-VH를 비롯한 FIX 및 FXI뿐만 아니라 FEIBA-VH, 데스모프레신, 그리고 혈장 주입의 예방적 및 주문형 투여 둘 모두를 포함한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "FVIII 유전자 요법"은 혈우병과 연관된 하나 또는 그 이상의 증상 (가령, 임상적 인자)을 완화하거나, 축소하거나, 또는 이의 재발을 예방하기 위해, 인자 VIII를 인코딩하는 핵산을 환자에게 제공하는 임의의 치료적 접근법을 포함한다. 상기 용어는 혈우병을 앓는 개체의 건강을 유지하거나 또는 향상시키기 위해, 인자 VIII의 임의의 변형된 형태 (가령, 인자 VIII 변이체)를 비롯하여, 인자 VIII 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 화합물, 약물, 시술, 또는 섭생을 투여하는 것을 포괄한다. 당업자는 FVIII 요법의 코스 또는 FVIII 치료적 작용제의 용량이 예로서, 본 발명에 따라 획득된 결과에 근거하여 변화될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "우회로 요법"은 혈우병과 연관된 하나 또는 그 이상의 증상 (가령, 임상적 인자)을 완화하거나, 축소하거나, 또는 이의 재발을 예방하기 위해, 비-인자 VIII 지혈 작용제, 화합물 또는 응고 인자를 환자에게 제공하는 임의의 치료적 접근법을 포함한다. 비-인자 VIII 화합물 및 응고 인자는 인자 VIII 저해제 우회로 활성 (FEIBA), 재조합 활성화된 인자 VII (FVIIa), 프로트롬빈 복합체 농축물, 그리고 활성화된 프로트롬빈 복합체 농축물을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 이들 비-인자 VIII 화합물 및 응고 인자는 재조합이거나 또는 혈장-유래될 수 있다. 당업자는 우회로 요법의 코스 또는 우회로 요법의 용량이 예로서, 본 발명에 따라 획득된 결과에 근거하여 변화될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 인자 VIII 분자를 인코딩하는 핵산 및 전통적인 A형 혈우병 치료적 작용제를 투여하는 것을 포함하는 "복합 요법"은 혈우병과 연관된 하나 또는 그 이상의 증상 (가령, 임상적 인자)을 완화하거나, 축소하거나, 또는 이의 재발을 예방하기 위해, 인자 VIII 분자를 인코딩하는 핵산 및 인자 VIII 분자 및/또는 비-인자 VIII 지혈 작용제 (가령, 우회로 치료적 작용제) 둘 모두를 환자에게 제공하는 임의의 치료적 접근법을 포함한다. 상기 용어는 인자 VIII의 임의의 변형된 형태를 비롯하여, 인자 VIII 분자를 인코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 화합물, 약물, 시술, 또는 섭생을 투여하는 것을 포괄하는데, 이것은 혈우병을 앓는 개체의 건강을 유지하거나 또는 향상시키는데 유용하고 본원에서 설명된 치료적 작용제 중에서 한 가지를 포함한다.
용어 "치료 효과량 또는 용량" 또는 "치료적으로 충분한 양 또는 용량" 또는 "효과적인 또는 충분한 양 또는 용량"은 이것이 투여되면 치료 효과를 산출하는 용량을 지칭한다. 가령, 혈우병을 치료하는데 유용한 약물의 치료 효과량은 혈우병과 연관된 하나 또는 그 이상의 증상을 예방하거나 또는 완화할 수 있는 양일 수 있다. 정확한 용량은 치료의 목적에 의존할 것이고, 그리고 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다 (가령, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 13, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins를 참조한다).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 DNA 분자의 분절 (가령, 코딩 영역)을 지칭한다. 일부 구체예에서, 유전자는 폴리펩티드 사슬을 생산하는데 관련되는, 코딩 영역 직전에, 코딩 영역 이후에 및/또는 코딩 영역을 개재하는 영역 (가령, 조절 요소, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 서열, 5'-비번역 영역, 3'-비번역 영역, 또는 인트론)에 의해 배치된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "조절 요소"는 세포에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 종결인자, 폴리아데닐화 서열, 인트론 등을 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "프로모터 요소"는 코딩 서열의 발현을 제어하는데 보조하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일반적으로, 프로모터 요소는 유전자의 번역 시작 부위의 5'에 위치된다. 하지만, 일정한 구체예에서, 프로모터 요소는 인트론 서열, 또는 코딩 서열의 3' 내에 위치될 수 있다. 일부 구체예에서, 유전자 요법 벡터에 유용한 프로모터는 표적 단백질의 선천적 유전자로부터 유래된다 (가령, 인자 VIII 프로모터). 일부 구체예에서, 유전자 요법 벡터에 유용한 프로모터는 표적 생물체의 특정 세포 또는 조직에서 발현에 특이적이다 (가령, 간-특이적 프로모터). 또 다른 구체예에서, 복수의 충분히 특징된 프로모터 요소 중에서 한 가지가 본원에서 설명된 유전자 요법 벡터에서 이용된다. 충분히 특징된 프로모터 요소의 무제한적 실례는 CMV 초기 프로모터, β-액틴 프로모터 및 메틸 CpG 결합 단백질 2 (MeCP2) 프로모터를 포함한다. 일부 구체예에서, 프로모터는 구조성 프로모터인데, 이것은 표적 단백질의 실제적으로 일정한 발현을 주동한다. 다른 구체예에서, 프로모터는 유도성 프로모터인데, 이것은 특정 자극 (가령, 특정 치료 또는 작용제에 노출)에 대한 응답으로 표적 단백질의 발현을 주동한다. AAV-매개된 유전자 요법을 위한 프로모터 설계의 리뷰를 위해, Gray et al. (Human Gene Therapy 22:1143-53 (2011))을 참조하고, 이의 내용은 모든 점에서 전체적으로 명시적으로 참조로서 편입된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 핵산 (가령, 인자 VIII 유전자 요법 구조체를 인코딩하는)을 숙주 세포 내로 전달하는데 이용되는 임의의 운반제를 지칭한다. 일부 구체예에서, 벡터는 레플리콘을 포함하는데, 이것은 표적 핵산과 함께, 운반제를 복제하는 기능을 한다. 유전자 요법에 유용한 벡터의 무제한적 실례는 플라스미드, 파지, 코스미드, 인공 염색체 및 바이러스를 포함하는데, 이들은 생체내에서 복제의 자율적인 단위로서 기능한다. 일부 구체예에서, 벡터는 표적 핵산 (가령, 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드)을 도입하기 위한 바이러스 운반제이다. 유전자 요법에 유용한 많은 변형된 진핵 바이러스는 당해 분야에서 공지된다. 가령, 아데노 연관된 바이러스 (AAVs)가 인간 유전자 요법에서 이용하기 특히 충분히 적합한데, 그 이유는 인간이 상기 바이러스에 대한 자연 숙주이고, 선천적 바이러스가 임의의 질환에 기여하는 것으로 알려져 있지 않고, 그리고 상기 바이러스가 경미한 면역 반응을 유발하기 때문이다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "CpG 섬"은 CpG 디뉴클레오티드의 통계학적으로 상승된 밀도를 갖는, 폴리뉴클레오티드 내에 영역을 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 폴리뉴클레오티드 (가령, 코돈-변경된 인자 VIII 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 영역은 200-염기쌍 윈도우 위에서: (i) 상기 영역이 50%보다 큰 GC 함량을 갖고, 그리고 (ii) 예상된 CpG 디뉴클레오티드마다 관찰된 CpG 디뉴클레오티드의 비율이 아래의 관계에 의해 규정된 바와 같이, 최소한 0.6이면, CpG 섬이다:
Figure pct00001
≥ 0.6.
CpG 섬을 확인하기 위한 방법에 관한 추가 정보를 위해, Gardiner-Garden M. et al., J Mol Biol., 196(2):261-82 (1987)를 참조하고, 이것의 내용은 모든 점에서 명시적으로 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 단일- 또는 이중 가닥 형태에서 이들의 중합체, 그리고 이들의 보체를 지칭한다. 상기 용어는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 중추 잔기 또는 연쇄를 내포하는 핵산을 포괄하는데, 이들은 합성, 자연발생 및 비자연발생이고, 참고 핵산과 유사한 결합 성질을 갖고, 그리고 참고 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 물질대사된다. 이런 유사체의 실례는 제한 없이, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 그리고 펩티드-핵산 (PNAs)을 포함한다.
용어 "아미노산"은 자연발생 및 비자연 아미노산뿐만 아니라 자연발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 인코딩된 아미노산뿐만 아니라 추후 변형되는 아미노산, 예를 들면, 히드록시프롤린, y-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 자연발생 아미노산은 예로서, D- 및 L-아미노산을 포함할 수 있다. 본원에서 이용된 아미노산은 또한, 비자연 아미노산을 포함할 수 있다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 다시 말하면, 수소에 결합된 임의의 탄소, 카르복실 기, 아미노 기, 그리고 R 기를 갖는 화합물, 예를 들면, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 또는 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이런 유사체는 변형된 R 기 (가령, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 중추를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다. 아미노산은 본원에서, 그들의 통상적으로 알려진 3 문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에 의해 권장되는 1-문자 기호에 의해 지칭될 수 있다. 뉴클레오티드는 유사하게, 그들의 통상적으로 인정되는 1-문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
아미노산 서열에 관하여, 당업자는 인코딩된 서열 내에 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실하는 핵산 또는 펩티드 서열에 개별 치환, 결실 또는 부가가 이런 변경이 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 치환을 유발하는 경우에, "보존성으로 변형된 변이체"라는 것을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 치환 표는 당업자에게 알려져 있다. 이런 보존성으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동족체, 그리고 대립유전자에 더해지고 이들을 배제하지 않는다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 아미노산 치환은 당업자에게 알려져 있다. 특정 아미노산, 예를 들면, 촉매성, 구조적, 또는 입체적으로 중요한 아미노산의 기능성에 따라, 아미노산의 상이한 군화가 서로에 대해 보존성 치환인 것으로 고려될 수 있다. 표 1은 아미노산의 전하 및 극성, 아미노산의 소수성, 아미노산의 표면 노출/구조적 본성, 그리고 아미노산의 이차 구조 성향에 근거하여 보존성 치환인 것으로 고려되는 아미노산의 군화를 제공한다.
표 1. 단백질 내에 잔기의 기능성에 근거된 보존성 아미노산 치환의 군화.
중요한 특질 보존성 군화
전하/극성 1. H, R 및 K
2. D 및 E
3. C, T, S, G, N, Q 및 Y
4. A, P, M, L, I, V, F 및 W
소수성 1. D, E, N, Q, R 및 K
2. C, S, T, P, G, H 및 Y
3. A, M, I, L, V, F 및 W
구조/표면 노출 1. D, E, N, Q, H, R 및 K
2. C, S, T, P, A, G, W 및 Y
3. M, I, L, V 및 F
이차 구조 성향 1. A, E, Q, H, K, M, L 및 R
2. C, T, I, V, F, Y 및 W
3. S, G, P, D 및 N
진화적 보존 1. D 및 E
2. H, K 및 R
3. N 및 Q
4. S 및 T
5. L, I 및 V
6. F, Y 및 W
7. A 및 G
8. M 및 C
2개 또는 그 이상의 핵산 또는 펩티드 서열의 맥락에서 용어 "동일한," 또는 "동일성" 퍼센트는 예로서, 아래에 설명된 디폴트 파라미터를 갖는 BLAST 또는 BLAST 2.0 서열 비교 알고리즘을 이용하여, 또는 수동 정렬과 시각적 검사에 의해 계측될 때 동일하거나 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정된 백분율 (즉, 비교 윈도우 또는 지정된 영역에 걸쳐 최고 상응을 위해 비교되고 정렬될 때, 특정된 영역에 걸쳐 약 60% 동일성, 바람직하게는 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 더욱 높은 동일성)을 갖는 2개 또는 그 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다.
당해 분야에서 공지된 바와 같이, 다수의 상이한 프로그램이 단백질 (또는 아래에 논의된 바와 같이 핵산)이 공지된 서열에 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 지를 확인하는데 이용될 수 있다. 서열 동일성 및/또는 유사성은 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)의 국부 서열 동일성 알고리즘, Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)의 서열 동일성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444 (1988)의 유사성 방법, 이들 알고리즘의 컴퓨터화 실행 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI에서 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA), Devereux et al., Nucl. Acid Res., 12:387-395 (1984)에 의해 설명된 최고 적합 서열 프로그램 (바람직하게는, 디폴트 세팅을 이용), 또는 검사를 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 당해 분야에서 공지된 표준 기술을 이용하여 결정된다. 바람직하게는, 동일성 퍼센트는 다음의 파라미터에 근거하여 FastDB에 의해 계산된다: 1의 부정합 페널티; 1의 갭 페널티; 0.33의 갭 크기 페널티; 및 30의 연결 페널티, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc, 이들 모두 참조로서 편입됨.
유용한 알고리즘의 실례는 PILEUP이다. PILEUP는 진행성, 쌍별 정렬을 이용하여 일군의 관련된 서열로부터 복수 서열 정렬을 창출한다. 이것은 또한, 정렬을 창출하는데 이용된 군집화 관계를 보여주는 나무를 플롯팅할 수 있다. PILEUP는 Feng & Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360 (1987)의 진행성 정렬 방법의 단순화를 이용하고; 상기 방법은 Higgins & Sharp CABIOS 5:151-153 (1989)에 의해 설명된 방법과 유사한데, 이들 둘 모두 참조로서 편입된다. 유용한 PILEUP 파라미터는 3.00의 디폴트 갭 가중, 0.10의 디폴트 갭 길이 가중, 그리고 가중된 단부 갭을 포함한다.
유용한 알고리즘의 다른 실례는 참조로서 편입되는 Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); 및 Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787 (1993)에서 설명된 BLAST 알고리즘이다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/ README.html]으로부터 획득된 WU-BLAST-2 프로그램이다. WU-BLAST-2는 여러 검색 파라미터를 이용하는데, 이들 중에서 대부분은 디폴트 값에 세팅된다. 조정가능한 파라미터는 다음의 값으로 세팅된다: 중복 스팬 =1, 중복 분율 = 0.125, 단어 역치 (T) = 11. HSP S 및 HSP S2 파라미터는 동적 값이고, 그리고 특정 서열의 구성 및 관심되는 서열이 검색되는 특정 데이터베이스의 구성에 따라 프로그램 그 자체에 의해 확립된다; 하지만, 이들 값은 감수성을 증가시키기 위해 조정될 수 있다.
추가 유용한 알고리즘은 참조로서 편입되는 Altschul et al., Nucl. Acids Res., 25:3389-3402에 의해 보고된 바와 같은 갭트 BLAST이다. 갭트 BLAST는 BLOSUM-62 치환 점수; 9로 세팅된 역치 T 파라미터; 갭이 없는 연장을 촉발하기 위한 2-히트 방법; 10+k의 비용으로 k의 충전 갭 길이; 16에 세팅된 Xu, 그리고 데이터베이스 검색 시기의 경우 40 및 알고리즘의 출력 시기의 경우 67에 세팅된 Xg를 이용한다. 갭트 정렬은 ~22 비트에 상응하는 점수에 의해 촉발된다.
% 아미노산 서열 동일성 값은 정렬된 영역 내에 "더욱 긴" 서열의 잔기의 총수에 의해 나눗셈된 정합 동일한 잔기의 숫자에 의해 결정된다. "더욱 긴" 서열은 정렬된 영역 내에 가장 많은 실제 잔기를 갖는 것이다 (정렬 점수를 최대화하기 위해 WU-Blast-2에 의해 도입된 갭은 무시된다). 유사한 방식으로, 확인된 폴리펩티드의 코딩 서열에 대하여 "핵산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는 세포 주기 단백질의 코딩 서열 내에 뉴클레오티드 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 뉴클레오티드 잔기의 백분율로서 규정된다. 바람직한 방법은 각각, 1 및 0.125에 세팅된 중복 스팬 및 중복 분율을 갖는 디폴트 파라미터에 세팅된 WU-BLAST-2의 BLASTN 모듈을 활용한다.
정렬은 정렬되는 서열 내에 갭의 도입을 포함할 수 있다. 이에 더하여, 도면 2의 서열 (서열 번호:1)에 의해 인코딩된 단백질보다 더욱 많은 또는 더욱 적은 아미노산을 내포하는 서열의 경우에, 한 구체예에서, 서열 동일성의 백분율은 아미노산 또는 뉴클레오티드의 총수에 관계하여 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드의 숫자에 근거하여 결정될 것으로 이해된다. 따라서, 한 구체예에서, 예로서 도면 2에서 도시된 서열 (서열 번호:1)보다 짧은 서열의 서열 동일성은 아래에 논의된 바와 같이, 더욱 짧은 서열에서 뉴클레오티드의 숫자를 이용하여 결정될 것이다. 동일성 퍼센트 계산에서 상대적 가중은 서열 변이의 다양한 현성, 예를 들면, 삽입, 결실, 치환 등에 배정되지 않는다.
한 구체예에서, 단지 동일성만 양으로 (+1) 채점되고, 그리고 갭을 포함하는 서열 변이의 모든 형태는 "0"의 값이 배정되는데, 이것은 서열 유사성 계산을 위해 아래에 설명된 바와 같은 가중된 척도 또는 파라미터에 대한 필요를 배제시킨다. 서열 동일성 퍼센트는 예로서, 정합 동일한 잔기의 숫자를 정렬된 영역 내에 "더욱 짧은" 서열의 잔기의 총수로 나누고 100을 곱함으로써 계산될 수 있다. "더욱 긴" 서열은 정렬된 영역 내에 가장 많은 실제 잔기를 갖는 것이다.
용어 "대립형질 변이체"는 특정 유전자 좌위에서 유전자의 결정다형뿐만 아니라 이들 유전자의 mRNA 전사체로부터 유래된 cDNAs, 그리고 이들에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 지칭한다. 용어 "바람직한 포유류 코돈"은 다음의 목록에서 선택되는, 포유류 세포에서 발현되는 단백질에서 가장 빈번하게 이용되는, 아미노산을 인코딩하는 코돈의 세트 중에서 코돈의 부분집합을 지칭한다: Gly (GGC, GGG); Glu (GAG); Asp (GAC); Val (GTG, GTC); Ala (GCC, GCT); Ser (AGC, TCC); Lys (AAG); Asn (AAC); Met (ATG); Ile (ATC); Thr (ACC); Trp (TGG); Cys (TGC); Tyr (TAT, TAC); Leu (CTG); Phe (TTC); Arg (CGC, AGG, AGA); Gln (CAG); His (CAC); 및 Pro (CCC).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "코돈-변경된"은 폴리펩티드 (가령, 인자 VIII 변이체 단백질)를 인코딩하는 선천적 폴리뉴클레오티드의 최소한 하나의 코돈이 폴리뉴클레오티드 서열의 성질을 향상시키기 위해 변화된, 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 구체예에서, 향상된 성질은 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 증가된 전사, mRNA의 증가된 안정성 (가령, 향상된 mRNA 반감기), 폴리펩티드의 증가된 번역 및/또는 벡터 내에 폴리뉴클레오티드의 증가된 포장을 증진한다. 향상된 성질을 달성하는데 이용될 수 있는 변경의 무제한적 실례는 특정 아미노산에 대한 코돈의 사용빈도 및/또는 분포를 변화시키고, 전역 및/또는 국부 GC 함량을 조정하고, AT-풍부한 서열을 제거하고, 반복된 서열 요소를 제거하고, 전역 및/또는 국부 CpG 디뉴클레오티드 함량을 조정하고, 잠적 조절 요소 (가령, TATA 상자 및 CCAAT 상자 요소)를 제거하고, 인트론/엑손 스플라이스 부위를 제거하고, 조절 서열을 향상시키고 (가령, 코자크 공통 서열의 도입), 그리고 전사된 mRNA 내에 이차 구조 (가령, 스템-루프)를 형성할 수 있는 서열 요소를 제거하는 것을 포함한다.
본원에서 논의된 바와 같이, 본원에서 발명의 성분을 지칭하는 다양한 명명법이 있다. "CS-숫자" (가령, "CS04", "CS01", "CS23" 등)는 변이체를 비롯하여, FVIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈 변경된 폴리뉴클레오티드 및/또는 인코딩된 폴리펩티드를 지칭한다. 가령, CS01-FL은 CS01 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 전장 코돈 변경된 CS01 폴리뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 지칭한다 (때때로, 아미노산 서열의 경우 "CS01-FL-AA" 및 핵산 서열의 경우 "CS01-FL-NA"로서 본원에서 지칭됨). 유사하게, "CS01-LC"는 FVIII 폴리펩티드의 경쇄를 인코딩하는 코돈 변경된 핵산 서열 ("CS01-LC-NA") 또는 CS01 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 FVIII 경쇄의 아미노산 서열 (때때로, "CS01-LC-AA"로서 본원에서 또한 지칭됨)을 지칭한다. 유사하게, CS01-HC, CS01-HC-AA 및 CS01-HC-NA는 FVIII 중쇄에서와 동일하다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 단지 코돈-변경된 구조체, 예를 들면, CS01, CS04, CS23 등 (가령, 이들은 Refacto와 비교하여 추가 아미노산 치환을 내포하지 않는다)의 경우에, 아미노산 서열은 동일할 것인데, 그 이유는 아미노산 서열이 코돈 최적화에 의해 변경되지 않기 때문이다. 따라서, 본 발명의 서열 구조체는 CS01-FL-NA, CS01-FL-AA, CS01-LC-NA, CS01-LC-AA, CS01-HC-AA, CS01-HC-NA, CS04-FL-NA, CS04-FL-AA, CS04-LC-NA, CS04-LC-AA, CS04-HC-AA, CS04-HC-NA, CS23-FL-NA, CS23-FL-AA, CS23-LC-NA, CS23-LC-AA, CS23-HC-AA 및 CS23-HC-NA를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
III. 코돈-변경된 인자 VIII 변이체
일부 구체예에서, 본 발명은 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이들 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 AAV-기초된 유전자 요법 구조체에서 투여될 때, 인자 VIII의 현저하게 향상된 발현을 제공한다. 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 또한, 전통적으로 코돈-최적화된 구조체와 비교하여, 향상된 AAV-비리온 포장을 보여준다. 실시예 2 및 표 4에서 증명된 바와 같이, 출원인은 인간 야생형 인자 VIII 중쇄와 경쇄, 그리고 생체내에서 활성 FVIIIa 단백질의 성숙을 조장하는 퓨린 개열 부위를 내포하는 짧은, 14개 아미노산, B-도메인 치환된 링커 ("SQ" 링커)를 갖는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 3개의 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드 (CS01-FL-NA, CS04-FL-NA 및 CS23-FL-NA)의 발견을 통해 이들 이점을 달성하였다.
한 구체예에서, 본원에서 제공된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 최소한, 인자 VIII 중쇄 및 인자 VIII 경쇄를 인코딩하는 CS01, CS04 또는 CS23 내에 서열 (각각, 서열 번호 13, 1 및 20)과 높은 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 당해 분야에서 공지된 바와 같이, 인자 VIII의 B-도메인은 생체내 활성에 불필요하다. 따라서, 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 인자 VIII B-도메인을 완전하게 결여한다. 일부 구체예에서, 선천적 인자 VIII B-도메인은 퓨린 개열 부위를 내포하는 짧은 아미노산 링커, 예를 들면, CS01, CS04 또는 CS23의 아미노산 760-773으로 구성되는 "SQ" 링커 (각각, 서열 번호 2, 2 및 21) 구조체로 대체된다. "SQ" 링커는 BDLO04로서 또한 지칭된다 (아미노산 서열의 경우 -AA 및 뉴클레오티드 서열의 경우 -NA).
한 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 중쇄와 경쇄는 각각, 인간 인자 VIII 중쇄와 경쇄이다. 다른 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 중쇄와 경쇄는 다른 포유동물로부터 중쇄와 경쇄 서열 (가령, 돼지 인자 VIII)이다. 또 다른 구체예에서, 인자 VIII 중쇄와 경쇄는 키메라 중쇄와 경쇄 (가령, 인간 및 두 번째 포유류 서열의 조합)이다. 또 다른 구체예에서, 인자 VIII 중쇄와 경쇄는 다른 포유동물로부터 중쇄와 경쇄의 인간화 버전, 예를 들면, 인간에 투여될 때 결과의 펩티드의 면역원성을 감소시키기 위해 선별된 위치에서 인간 잔기가 치환되는 다른 포유동물로부터 중쇄와 경쇄 서열이다.
인간 유전자의 GC 함량은 25% 이하로부터 90% 이상까지 폭넓게 변한다. 하지만, 일반적으로, 더욱 높은 GC 함량을 갖는 인간 유전자는 더욱 높은 수준에서 발현된다. 가령, Kudla et al. (PLoS Biol., 4(6):80 (2006))은 유전자의 GC 함량을 증가시키는 것이 일차적으로, 전사를 증가시키고 mRNA 전사체의 더욱 높은 항정 상태 수준을 달성함으로써, 인코딩된 폴리펩티드의 발현을 증가시킨다는 것을 증명한다. 일반적으로, 코돈-최적화된 유전자 구조체의 원하는 GC 함량은 60%와 동등하거나 또는 이보다 크다. 하지만, 선천적 AAV 유전체는 대략 56%의 GC 함량을 갖는다.
따라서, 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 선천적 AAV 비리온의 GC 함량 (가령, 대략 56% GC)에 더욱 가깝게 정합하는 CG 함량을 갖는데, 이것은 포유류 세포에서 발현을 위해 전통적으로 코돈-최적화되는 폴리뉴클레오티드의 바람직한 CG 함량 (가령, 60% GC에서 또는 이를 초과)보다 낮다. 실시예 1에서 개설된 바와 같이, 약 56%의 GC 함량을 갖는 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)은 더욱 높은 GC 함량을 갖는 유사하게 코돈-변경된 코딩 서열과 비교하여, 향상된 비리온 포장을 갖는다.
따라서, 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 60%보다 적다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 59%보다 적다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 58%보다 적다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 57%보다 적다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 56% 이내이다.
일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 54% 내지 59%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 55% 내지 59%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 56% 내지 59%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 54% 내지 58%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 55% 내지 58%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 56% 내지 58%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 54% 내지 57%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 55% 내지 57%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 56% 내지 57%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 54% 내지 56%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 55% 내지 56%이다.
일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 56±0.5%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 56±0.4%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 56±0.3%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 56±0.2%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 56±0.1%이다. 일부 구체예에서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드의 전반적인 GC 함량은 56%이다.
A. 인자 VIII B-도메인 치환된 링커
일부 구체예에서, FVIII 중쇄 및 경쇄 사이에 연쇄 (가령, 야생형 인자 VIII에서 B-도메인)는 더욱 변경된다. AAV 포장 능력의 크기 제약으로 인해, B-도메인 결실된, 절두된, 및 또는 링커 치환된 변이체는 FVIII 유전자 요법 구조체의 효력을 향상시킬 것이다. 가장 전통적으로 이용되는 B-도메인 치환된 링커는 SQ FVIII의 링커인데, 이것은 B 도메인의 단지 14개 아미노산만 링커 서열로서 유지한다. 돼지 VIII의 다른 변이체 (U.S. 특허 번호 6,458,563에서 설명된 "OBI-1")는 CHO 세포에서 충분히 발현되고, 그리고 24개 아미노산의 약간 더욱 긴 링커를 갖는다. 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 구조체는 SQ-유형 B-도메인 링커 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 본원에서 설명된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 구조체는 OBI-1-유형 B-도메인 링커 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 인코딩된 인자 VIII 폴리펩티드는 야생형 인간 인자 VIII B-도메인 (FVIII-FL-AA; 서열 번호: 19)의 아미노산 760-762/1657-1667을 포함하는 SQ-유형 B-도메인 링커 (SFSQNPPVLKRHQR; BDL-SQ-AA; 서열 번호: 30)를 포함한다 (Sandberg et al. Thromb. Haemost. 85:93 (2001)). 일부 구체예에서, SQ-유형 B-도메인 링커는 상응하는 야생형 서열에 비하여, 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, SQ-유형 B-도메인 링커는 상응하는 야생형 서열에 비하여, 2개의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 인코딩된 인자 VIII 폴리펩티드는 야생형 인간 인자 VIII B-도메인 (FVIII-FL-AA; 서열 번호: 19)의 아미노산 760/1582-1667을 포함하는 Greengene-유형 B-도메인 링커를 포함한다 (Oh et al., Biotechnol. Prog., 17:1999 (2001)). 일부 구체예에서, Greengene-유형 B-도메인 링커는 상응하는 야생형 서열에 비하여, 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, Greengene-유형 B-도메인 링커는 상응하는 야생형 서열에 비하여, 2개의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 인코딩된 인자 VIII 폴리펩티드는 야생형 인간 인자 VIII B-도메인 (FVIII-FL-AA; 서열 번호: 19)의 아미노산 760-769/1657-1667을 포함하는 연장된 SQ-유형 B-도메인 링커를 포함한다 (Thim et al., Haemophilia, 16:349 (2010)). 일부 구체예에서, 연장된 SQ-유형 B-도메인 링커는 상응하는 야생형 서열에 비하여, 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 연장된 SQ-유형 B-도메인 링커는 상응하는 야생형 서열에 비하여, 2개의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 인코딩된 인자 VIII 폴리펩티드는 야생형 돼지 인자 VIII B-도메인으로부터 아미노산 SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR (서열 번호: 31)을 포함하는 돼지 OBI-1-유형 B-도메인 링커를 포함한다 (Toschi et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 12:517 (2010)). 일부 구체예에서, 돼지 OBI-1-유형 B-도메인 링커는 상응하는 야생형 서열에 비하여, 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 돼지 OBI-1-유형 B-도메인 링커는 상응하는 야생형 서열에 비하여, 2개의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 인코딩된 인자 VIII 폴리펩티드는 야생형 인간 인자 VIII B-도메인 (FVIII-FL-AA; 서열 번호: 19)의 아미노산 760-772/1655-1667을 포함하는 인간 OBI-1-유형 B-도메인 링커를 포함한다. 일부 구체예에서, 인간 OBI-1-유형 B-도메인 링커는 상응하는 야생형 서열에 비하여, 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 인간 OBI-1-유형 B-도메인 링커는 상응하는 야생형 서열에 비하여, 2개의 아미노산 치환을 갖는다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 인코딩된 인자 VIII 폴리펩티드는 야생형 돼지 인자 VIII B-도메인으로부터 아미노산 SFSQNSRHQAYRYRRG (서열 번호: 32)를 포함하는 O8-유형 B-도메인 링커를 포함한다 (Toschi et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 12:517 (2010)). 일부 구체예에서, 돼지 OBI-1-유형 B-도메인 링커는 상응하는 야생형 서열에 비하여, 하나의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 구체예에서, 돼지 OBI-1-유형 B-도메인 링커는 상응하는 야생형 서열에 비하여, 2개의 아미노산 치환을 갖는다.
인자 VIII 구조체로부터 B-도메인의 제거는 아마도 B-도메인이 활성화 동안 제거되기 때문에, 활성화된 효소 (가령, FVIIIa)의 활성에 영향을 주는 것으로 보이지 않는다. 하지만, 인자 VIII의 B-도메인은 예로서, N- 또는 O-연결된 글리코실화에 의해 번역후 변형되는 여러 잔기를 내포한다. 야생형 인자 VIII B-도메인의 인실리코 분석 (Prediction of N-glycosylation sites in human proteins, R. Gupta, E. Jung and S. Brunak, in preparation (2004))은 이들 부위 중에서 최소한 4개가 생체내에서 글리코실화되는 것으로 예측한다. B-도메인 내에 이들 변형은 생체내에서 인자 VIII의 번역후 조절 및/또는 반감기에 기여하는 것으로 생각된다.
인자 VIII B-도메인이 성숙 인자 VIIIa 단백질에서 부재하긴 하지만, 전구체 인자 VIII 분자의 B-도메인 내에 글리코실화는 활성화에 앞서 상기 단백질의 순환 반감기를 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 본원에서 설명된 인코딩된 인자 VIII 구조체의 폴리펩티드 링커는 생체내에서 글리코실화를 허용하는, 하나 또는 그 이상의 글리코실화 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 최소한 하나의 공통 글리코실화 서열 (가령, N- 또는 O-연결된 글리코실화 공통 서열)을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 최소한 2개의 공통 글리코실화 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 최소한 3개의 공통 글리코실화 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 최소한 4개의 공통 글리코실화 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 최소한 5개의 공통 글리코실화 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 최소한 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 공통 글리코실화 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 최소한 하나의 N-연결된 글리코실화 서열 N-X-S/T를 내포하고, 여기서 X는 P, S 또는 T 이외에 임의의 아미노산이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 최소한 2개의 N-연결된 글리코실화 서열 N-X-S/T를 내포하고, 여기서 X는 P, S 또는 T 이외에 임의의 아미노산이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 최소한 3개의 N-연결된 글리코실화 서열 N-X-S/T를 내포하고, 여기서 X는 P, S 또는 T 이외에 임의의 아미노산이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 최소한 4개의 N-연결된 글리코실화 서열 N-X-S/T를 내포하고, 여기서 X는 P, S 또는 T 이외에 임의의 아미노산이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 최소한 5개의 N-연결된 글리코실화 서열 N-X-S/T를 내포하고, 여기서 X는 P, S 또는 T 이외에 임의의 아미노산이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 링커는 최소한 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 N-연결된 글리코실화 서열 N-X-S/T를 내포하고, 여기서 X는 P, S 또는 T 이외에 임의의 아미노산이다.
B. 개열가능한 링커를 갖는 인자 VIII 변이체를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드
CS04 코돈 변경된 폴리뉴클레오티드
한 구체예에서, 본원에서 제공된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 생체내에서 개열가능한 링커를 갖는 인자 VIII 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드는 인자 VIII 경쇄, 인자 VIII 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄는 인자 VIII 중쇄를 인코딩하는 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)의 일부인 CS04-HC-NA (서열 번호: 3)와 높은 서열 동일성을 갖는 첫 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 인자 VIII 폴리펩티드의 경쇄는 인자 VIII 경쇄를 인코딩하는 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)의 일부인 CS04-LC-NA (서열 번호: 4)와 높은 서열 동일성을 갖는 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함하는데, 이것은 생체내에서 성숙을 허용한다 (가령, 전구체 폴리펩티드의 생체내 발현 또는 투여 후).
일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 99.5% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 99.9% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 동일하다.
일부 구체예에서, 인자 VIII 구조체의 폴리펩티드 링커는 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)의 아미노산 760-773에 상응하는 14개-아미노산 링커를 인코딩하는 BDLO04 (서열 번호: 6)와 높은 서열 동일성을 갖는 세 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 96% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)와 높은 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)와 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)와 최소한 96% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체는 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-FL-AA (서열 번호: 2)와 동일하다.
CS01 코돈 변경된 폴리뉴클레오티드
한 구체예에서, 본원에서 제공된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 생체내에서 개열가능한 링커를 갖는 인자 VIII 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드는 인자 VIII 경쇄, 인자 VIII 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄는 인자 VIII 중쇄를 인코딩하는 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)의 일부인 CS01-HC-NA (서열 번호: 24)와 높은 서열 동일성을 갖는 첫 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 인자 VIII 폴리펩티드의 경쇄는 인자 VIII 경쇄를 인코딩하는 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)의 일부인 CS01-LC-NA (서열 번호: 25)와 높은 서열 동일성을 갖는 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함하는데, 이것은 생체내에서 성숙을 허용한다 (가령, 전구체 폴리펩티드의 생체내 발현 또는 투여 후).
일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 99.5% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 99.9% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 동일하다.
일부 구체예에서, 인자 VIII 구조체의 폴리펩티드 링커는 CS01-FL-AA (서열 번호: 2)의 아미노산 760-773에 상응하는 14개-아미노산 링커를 인코딩하는 BDLO04 (서열 번호: 6)와 높은 서열 동일성을 갖는 세 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 96% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)와 높은 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)와 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)와 최소한 96% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체는 CS01-FL-AA (서열 번호: 2)와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-FL-AA (서열 번호: 2)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-FL-AA (서열 번호: 2)와 동일하다.
CS23 코돈 변경된 폴리뉴클레오티드
한 구체예에서, 본원에서 제공된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 생체내에서 개열가능한 링커를 갖는 인자 VIII 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드는 인자 VIII 경쇄, 인자 VIII 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄는 인자 VIII 중쇄를 인코딩하는 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)의 일부인 CS23-HC-NA (서열 번호: 22)와 높은 서열 동일성을 갖는 첫 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 인자 VIII 폴리펩티드의 경쇄는 인자 VIII 경쇄를 인코딩하는 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)의 일부인 CS23-LC-NA (서열 번호: 23)와 높은 서열 동일성을 갖는 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함하는데, 이것은 생체내에서 성숙을 허용한다 (가령, 전구체 폴리펩티드의 생체내 발현 또는 투여 후).
일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 99.5% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 99.9% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 동일하다.
일부 구체예에서, 인자 VIII 구조체의 폴리펩티드 링커는 CS23-FL-AA (서열 번호: 21)의 아미노산 760-773에 상응하는 14개-아미노산 링커를 인코딩하는 BDLO04 (서열 번호: 6)와 높은 서열 동일성을 갖는 세 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 96% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 세 번째 뉴클레오티드 서열은 BDLO04 (서열 번호: 6)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)와 높은 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)와 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)와 최소한 96% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체는 CS23-FL-AA (서열 번호: 21)와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-FL-AA (서열 번호: 21)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-FL-AA (서열 번호: 21)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-FL-AA (서열 번호: 21)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-FL-AA (서열 번호: 21)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-FL-AA (서열 번호: 21)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-FL-AA (서열 번호: 21)와 동일하다.
C. 단일 사슬 인자 VIII 단백질을 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드
B-도메인의 C 말단 단부에서 위치된 퓨린 개열 부위가 제거되는 인자 VIII 구조체는 인자 VIII 분자의 정상적인 성숙이 일어날 수 없음에도 불구하고, 단일 사슬 폴리펩티드로서 활성을 유지한다 (Leyte et al. (1991)). 유사하게, 약독화된 퓨린 부위를 갖는 B-도메인 결실된 인자 VIII 구조체 (R1664H 아미노산 치환을 내포)는 야생형 퓨린 개열 부위를 갖는 상응하는 인자 VIII 구조체보다 생물학적으로 더욱 활성이다 (Siner et al. (2013)). 따라서, 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드는 인자 VIII 경쇄, 인자 VIII 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 폴리펩티드 링커를 포함한다. 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함하지 않는다.
단일 사슬 CS04 코돈 변경된 폴리뉴클레오티드
한 구체예에서, 본원에서 제공된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드는 인자 VIII 경쇄, 인자 VIII 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 임의선택적 폴리펩티드 링커를 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄는 인자 VIII 중쇄를 인코딩하는 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)의 일부인 CS04-HC-NA (서열 번호: 3)와 높은 서열 동일성을 갖는 첫 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 인자 VIII 폴리펩티드의 경쇄는 인자 VIII 경쇄를 인코딩하는 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)의 일부인 CS04-LC-NA (서열 번호: 4)와 높은 서열 동일성을 갖는 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 임의선택적 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 99.5% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 최소한 99.9% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS04-HC-NA 및 CS04-LC-NA (서열 번호 3 및 4)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 CS04-SC1-NA (서열 번호: 9)와 높은 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC1-NA (서열 번호: 9)와 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC1-NA (서열 번호: 9)와 최소한 96% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC1-NA (서열 번호: 9)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC1-NA (서열 번호: 9)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC1-NA (서열 번호: 9)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC1-NA (서열 번호: 9)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC1-NA (서열 번호: 9)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC1-NA (서열 번호: 9)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 CS04-SC2-NA (서열 번호: 11)와 높은 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC2-NA (서열 번호: 11)와 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC2-NA (서열 번호: 11)와 최소한 96% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC2-NA (서열 번호: 11)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC2-NA (서열 번호: 11)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC2-NA (서열 번호: 11)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC2-NA (서열 번호: 11)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC2-NA (서열 번호: 11)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-SC2-NA (서열 번호: 11)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단일 사슬 인자 VIII 변이체는 CS04-SC1-AA (서열 번호: 10; 인간 인자 VIII△(760-1667) (SPI; HsFVIII△(741-1648), SPE))와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체는 CS04-SC1-AA (서열 번호: 10)와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-SC1-AA (서열 번호: 10)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단일 사슬 인자 VIII 변이체는 CS04-SC2-AA (서열 번호: 12; 인간 인자 VIII△(772-1667) (SPI; HsFVIII△ (753-1648), SPE))와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체는 CS04-SC2-AA (서열 번호: 12)와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS04-SC2-AA (서열 번호: 12)와 동일하다.
단일 사슬 CS01 코돈 변경된 폴리뉴클레오티드
한 구체예에서, 본원에서 제공된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드는 인자 VIII 경쇄, 인자 VIII 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 임의선택적 폴리펩티드 링커를 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄는 인자 VIII 중쇄를 인코딩하는 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)의 일부인 CS01-HC-NA (서열 번호: 24)와 높은 서열 동일성을 갖는 첫 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 인자 VIII 폴리펩티드의 경쇄는 인자 VIII 경쇄를 인코딩하는 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)의 일부인 CS01-LC-NA (서열 번호: 25)와 높은 서열 동일성을 갖는 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 임의선택적 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 99.5% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 최소한 99.9% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS01-HC-NA 및 CS01-LC-NA (서열 번호 24 및 25)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 CS01-SC1-NA (서열 번호: 26)와 높은 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC1-NA (서열 번호: 26)와 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC1-NA (서열 번호: 26)와 최소한 96% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC1-NA (서열 번호: 26)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC1-NA (서열 번호: 26)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC1-NA (서열 번호: 26)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC1-NA (서열 번호: 26)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC1-NA (서열 번호: 26)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC1-NA (서열 번호: 26)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 CS01-SC2-NA (서열 번호: 27)와 높은 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC2-NA (서열 번호: 27)와 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC2-NA (서열 번호: 27)와 최소한 96% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC2-NA (서열 번호: 27)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC2-NA (서열 번호: 27)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC2-NA (서열 번호: 27)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC2-NA (서열 번호: 27)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC2-NA (서열 번호: 27)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-SC2-NA (서열 번호: 27)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단일 사슬 인자 VIII 변이체는 CS01-SC1-AA (서열 번호: 10; 인간 인자 VIII△(760-1667) (SPI; HsFVIII△(741-1648), SPE))와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체는 CS01-SC1-AA (서열 번호: 10)와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-SC1-AA (서열 번호: 10)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단일 사슬 인자 VIII 변이체는 CS01-SC2-AA (서열 번호: 12; 인간 인자 VIII△(772-1667) (SPI; HsFVIII△(753-1648), SPE))와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체는 CS01-SC2-AA (서열 번호: 12)와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS01-SC2-AA (서열 번호: 12)와 동일하다.
단일 사슬 CS23 코돈 변경된 폴리뉴클레오티드
한 구체예에서, 본원에서 제공된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 변이체 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드는 인자 VIII 경쇄, 인자 VIII 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 임의선택적 폴리펩티드 링커를 포함한다. 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄는 인자 VIII 중쇄를 인코딩하는 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)의 일부인 CS23-HC-NA (서열 번호: 22)와 높은 서열 동일성을 갖는 첫 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 인자 VIII 폴리펩티드의 경쇄는 인자 VIII 경쇄를 인코딩하는 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)의 일부인 CS23-LC-NA (서열 번호: 23)와 높은 서열 동일성을 갖는 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 임의선택적 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함하지 않는다.
일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 96% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 97% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 98% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 99.5% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 최소한 99.9% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 뉴클레오티드 서열은 각각, CS23-HC-NA 및 CS23-LC-NA (서열 번호 22 및 23)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 CS23-SC1-NA (서열 번호: 28)와 높은 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC1-NA (서열 번호: 28)와 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC1-NA (서열 번호: 28)와 최소한 96% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC1-NA (서열 번호: 28)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC1-NA (서열 번호: 28)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC1-NA (서열 번호: 28)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC1-NA (서열 번호: 28)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC1-NA (서열 번호: 28)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC1-NA (서열 번호: 28)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29)와 높은 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29)와 최소한 95% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29)와 최소한 96% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-SC2-NA (서열 번호: 29)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단일 사슬 인자 VIII 변이체는 CS23-SC1-AA (서열 번호: 10; 인간 인자 VIII△(760-1667) (SPI; HsFVIII△(741-1648), SPE))와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체는 CS23-SC1-AA (서열 번호: 10)와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-SC1-AA (서열 번호: 10)와 동일하다.
일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 단일 사슬 인자 VIII 변이체는 CS23-SC2-AA (서열 번호: 12; 인간 인자 VIII△(772-1667) (SPI; HsFVIII△(753-1648), SPE))와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 인자 VIII 변이체는 CS23-SC2-AA (서열 번호: 12)와 높은 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 97% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 98% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 99% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 99.5% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 99.9% 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, 아미노산 서열은 CS23-SC2-AA (서열 번호: 12)와 동일하다.
D. 인자 VIII 발현 벡터
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내로 통합된다. 발현 벡터의 무제한적 실례는 바이러스 벡터 (가령, 유전자 요법에 적합한 벡터), 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드, 파지미드, 인공 염색체 등을 포함한다.
바이러스 벡터의 무제한적 실례는 다음을 포함한다: 레트로바이러스, 예를 들면, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MMLV), 하비 뮤린 육종 바이러스, 뮤린 유방 종양 바이러스 및 라우스 육종 바이러스; 아데노바이러스, 아데노 연관된 바이러스; SV40-유형 바이러스; 폴리오마바이러스; 엡스타인 바르 바이러스; 유두종 바이러스; 헤르페스 바이러스; 우두바이러스; 그리고 소아마비 바이러스.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 유전자 요법 벡터 내로 통합된다. 일부 구체예에서, 유전자 요법 벡터는 레트로바이러스, 그리고 특히, 복제-결함성 레트로바이러스이다. 복제-결함성 레트로바이러스의 생산을 위한 프로토콜은 당해 분야에서 공지된다. 리뷰를 위해, Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) 및 Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991)를 참조한다.
한 구체예에서, 유전자 요법 벡터는 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 기초된 유전자 요법 벡터이다. AAV 시스템은 앞서 설명되었고 전반적으로 당해 분야에서 널리 공지된다 (Kelleher and Vos, Biotechniques, 17(6):1110-17 (1994); Cotten et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89(13):6094-98 (1992); Curiel, Nat Immun, 13(2-3):141-64 (1994); Muzyczka, Curr Top Microbiol Immunol, 158:97-129 (1992); 및 Asokan A, et al., Mol. Ther., 20(4):699-708 (2012), 이들은 각각 모든 점에서 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다). rAAV 벡터의 산출 및 이용에 관련된 상세는 예로서, U.S. 특허 번호 5,139,941 및 4,797,368에서 설명되고, 이들은 각각 모든 점에서 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다. 특정한 구체예에서, AAV 벡터는 AAV-8 벡터이다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드는 레트로바이러스 발현 벡터 내로 통합된다. 이들 시스템은 앞서 설명되었고 전반적으로 당해 분야에서 널리 공지된다 (Mann et al., Cell, 33:153-159, 1983; Nicolas and Rubinstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt, eds., Stoneham: Butterworth, pp. 494-513, 1988; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), New York: Plenum Press, pp. 149-188, 1986). 특정한 구체예에서, 레트로바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다 (가령, Naldini et al., Science, 272(5259):263-267, 1996; Zufferey et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-875, 1997; Blomer et al., J Virol., 71(9):6641-6649, 1997; U.S. 특허 번호 6,013,516 및 5,994,136을 참조한다).
진핵 및 원핵 발현 벡터를 비롯하여, 매우 다양한 벡터가 세포 배양 동안 코돈-변경된 폴리펩티드로부터 인자 VIII 폴리펩티드의 발현에 이용될 수 있다. 일정한 구체예에서, 플라스미드 벡터가 세포 배양 동안 인자 VIII 폴리펩티드를 발현하는데 이용이 예기된다. 일반적으로, 숙주 세포와 양립성인 종으로부터 유래되는 레플리콘 및 제어 서열을 내포하는 플라스미드 벡터가 이들 숙주와 관련하여 이용된다. 벡터는 복제 부위뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형 선별을 제공할 수 있는 표지 서열을 보유할 수 있다. 플라스미드는 하나 또는 그 이상의 제어 서열, 예를 들면, 프로모터에 작동가능하게 연결된 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 코돈-변경된 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다.
원핵 발현을 위한 벡터의 무제한적 실례는 플라스미드, 예를 들면, pRSET, pET, pBAD 등을 포함하는데, 여기서 원핵 발현 벡터에서 이용된 프로모터는 lac, trc, trp, recA, araBAD 등을 포함한다. 진핵 발현을 위한 벡터의 실례는 다음을 포함한다: (i) 효모에서 발현의 경우, AOX1, GAP, GAL1, AUG1 등과 같은 프로모터를 이용하는, pAO, pPIC, pYES, pMET와 같은 벡터; (ii) 곤충 세포에서 발현의 경우, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64, polh 등과 같은 프로모터를 이용하는, pMT, pAc5, pIB, pMIB, pBAC 등과 같은 벡터, 그리고 (iii) 포유류 세포에서 발현의 경우, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV 및 β-액틴과 같은 프로모터를 이용하는, pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3, pBPV 등과 같은 벡터, 그리고 바이러스 시스템, 예를 들면, 우두바이러스, 아데노 연관된 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 등으로부터 유래된 벡터.
IV. 실시예
실시예 1 - 코돈-변경된 인자 VIII 변이체 발현 서열의 작제
A형 혈우병의 유전자 요법에 효과적인 인자 VIII 코딩 서열을 창출하기 위해, 2개의 장애물이 극복되어야 했다. 첫 번째, 전통적인 유전자 요법 전달 벡터 (가령, AAV 비리온)의 유전체 크기 제한 때문에, 인코딩된 인자 VIII 폴리펩티드는 상당히 단축되어야 했다. 두 번째, (i) 전달 벡터 내에 포장 상호작용을 안정시키고, (ii) mRNA 중간을 안정시키고, 그리고 (iii) mRNA의 전사/번역의 견고성을 향상시키기 위해 코딩 서열이 변경되어야 했다.
첫 번째 목적을 달성하기 위해, 출원인은 본원에서 "FVIII-BDD-SQ"로서 지칭되는 B-도메인 결실된 인자 VIII 변이체 구조체로 시작하였다. 이러한 구조체에서, B-도메인은 "SQ" 서열로서 지칭되는 14개 아미노산 서열로 대체된다. 재조합 FVIII-BDD-SQ는 상품명 REFACTO® 하에 판매되고, 그리고 A형 혈우병의 관리에 효과적인 것으로 나타났다. 하지만, 인자 VIII 중쇄와 경쇄에 대한 인간 야생형 핵산 서열을 포함하는, FVIII-BDD-SQ에 대한 선천적 코딩 서열은 유전자 요법 벡터에서 무효하게 발현된다.
선천적 FVIII-BDD-SQ의 불량한 발현을 다루기 위해, Ward et al. (Blood, 117:798 (2011)) 및 McIntosh et al. (Blood, 121, 3335-3344 (2013))에서 설명된 바와 같이 변형된, Fath et al. (PLoS ONE, 6:e17596 (2011))에서 설명된 코돈 최적화 알고리즘이 첫 번째 중간 코딩 서열 CS04a를 창출하기 위해 FVIII-BDD-SQ 서열에 적용되었다. 하지만, 출원인은 변형된 알고리즘을 이용하여 창출된 CS04a 서열이 상기 서열을 더욱 변형함으로써 향상될 수 있다는 것을 인식하였다. 따라서, 출원인은 CpG 섬, 그리고 AT-풍부한 및 GC-풍부한 스트레치의 국부 과다표현을 방지하면서, CpG 디뉴클레오티드를 재도입하고, 아르기닌에 대한 CGC 코돈을 재도입하고, 류신 및 세린 코돈 분포를 변화시키고, 고도로 보존된 코돈 쌍을 재도입하고, 그리고 잠적 TATA 상자, CCAAT 상자 및 스플라이스 부위 요소를 제거하였다.
첫 번째, 변형된 알고리즘은 CpG-디뉴클레오티드를 내포하는 코돈 (가령, 아르기닌 코돈)을 비-CpG-디뉴클레오티드 코돈으로 조직적으로 대체하고, 그리고 인접한 코돈에 의해 창출된 CpG-디뉴클레오티드를 제거하거나/방지한다. CpG 디뉴클레오티드의 이러한 엄격한 회피는 통상적으로, DNA 백신의 근육내 주사 후 TLR-유도된 면역성을 예방하기 위해 행위된다. 하지만, 이렇게 하는 것은 코돈 최적화 가능성을 제한한다. 가령, 변형된 알고리즘은 CGX 아르기닌 코돈의 완전한 세트의 이용을 배제한다. 이것은 인간 세포에서 발현을 위한 유전자의 코딩에서 특히 파괴적인데, 그 이유는 CGC가 고도로 발현된 인간 유전자에서 가장 빈번하게 이용되는 아르기닌 코돈이기 때문이다. 추가적으로, 인접한 코돈에 의한 CpGs의 창출을 방지하는 것은 최적화 가능성을 더욱 제한한다 (가령, 함께 이용될 수 있는 코돈 쌍의 숫자를 제한한다).
TLR-유도된 면역성이 간-지향된, AAV-기초된 유전자 요법과 연관된 문제점일 것으로 예상되지 않기 때문에, CpGs를 포함하는 코돈 및 CpGs를 창출하는 인접한 코돈은 우선적으로 인자 VIII 경쇄를 코딩하는 서열에서 중간 코딩 서열 CS04a 내로 (가령, FVIII-BDD-SQ 코딩 서열의 3' 단부에서) 재도입되었다. 이것은 바람직한 인간 코돈, 특히 아르기닌에 대한 것들의 더욱 빈번한 이용을 허용하였다. 하지만, CpG 부위의 높은 빈도를 갖는 코딩 서열의 영역인 CpG 섬의 창출을 방지하기 위해 주의를 기울였다. 이것은 전사 시작 부위의 하류에 CpG 도메인이 유전자 발현의 높은 수준을 증진한다는 것을 암시하는, Krinner et al. (Nucleic Acids Res., 42(6):3551-64 (2014))의 교시에 반한다.
두 번째, 변형된 알고리즘은 일정한 코돈, 예를 들면, 류신의 경우 CTG, 발린의 경우 GTG 및 글루타민의 경우 CAG를 배타적으로 적용한다. 하지만, 이것은 예로서, Haas et al. (Current Biology, 6(3):315-24 (1996))에서 제안된 바와 같이, 균형화된 코돈 이용의 원리를 위반한다. 변형된 알고리즘에 의한 바람직한 코돈의 과용을 설명하기 위해, 코돈 변경에 적용된 다른 규칙 (가령, CpG 빈도 및 GC 함량)에 의해 허용되는 경우에 대체 류신 코돈이 재도입되었다.
세 번째, 변형된 알고리즘은 일정한 규준 (가령, CG-디뉴클레오티드의 존재)이 부합될 때, 코돈 쌍이 자연에서 어떻게 보존되는 지에 대한 고려 없이 이들을 대체한다. 진화에 의해 보존되었을 수 있는 유익한 성질을 설명하기 위해, 상기 알고리즘에 의해 대체된 대부분의 보존된 코돈 쌍 및 대부분의 보존된 바람직한 코돈 쌍은 코돈 변경에 적용된 다른 규칙 (가령, CpG 빈도 및 GC 함량)에 의해 허용되는 경우에, 예로서 Tats et al. (BMC Genomics 9:463 (2008))에서 설명된 바와 같이 분석되고 조정되었다.
네 번째, 중간 코딩 서열에서 이용된 세린 코돈이 또한, 재가공되었다. 구체적으로, AGC, TCC 및 TCT 세린 코돈이 인간 코돈 사용빈도에 대해 전반적으로 더욱 우수하게 정합하도록, 더욱 높은 빈도에서 변형된 코딩 서열 내로 도입되었다 (Haas et al., 위와 같음).
다섯 번째, TATA 상자, CCAAT 상자 요소 및 인트론/엑손 스플라이스 부위가 선별검사되고, 그리고 변형된 코딩 서열로부터 제거되었다. 코딩 서열을 변형할 때, AT-풍부한 또는 GC 풍부한 스트레치의 국부 과다표현을 방지하기 위해 주의를 기울였다.
최종적으로, 코딩 서열 내에서 코돈 사용빈도를 최적화하는 것에 더하여, 중간 코딩 서열 CS04a를 더욱 정밀화할 때, 근원적인 AAV 비리온의 구조적 요건이 고려되었다. AAV 벡터 (가령, AAV 비리온의 핵산 부분)는 그들의 캡시드 내로 단일 가닥 DNA 분자로서 포장된다 (리뷰를 위해, Daya and Berns, Clin. Microbiol Rev., 21(4):583-93 (2008)을 참조한다). 벡터의 GC 함량은 이런 이유로, 유전체의 포장, 그리고 따라서, 생산 동안 벡터 수율에 영향을 줄 가능성이 높다. 많은 알고리즘과 유사하게, 여기에서 이용된 변형된 알고리즘은 최소한 60%의 GC 함량을 갖는 최적화된 유전자 서열을 창출한다 (Fath et al., PLoS One, 6(3):e17596 (2011) (erratum in: PLoS One, (6)3 (2011)을 참조한다). 하지만, AAV8 캡시드 단백질은 약 56%의 더욱 낮은 GC 함량을 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 따라서, 선천적 AAV8 캡시드 단백질 코딩 서열을 더욱 우수하게 모의하기 위해, 중간 코딩 서열 CS04a의 GC 함량은 56%까지 감소되었다.
도면 2에서 도시된 결과의 CS04 코딩 서열은 56%의 전체 GC 함량을 갖는다. 상기 서열의 CpG-디뉴클레오티드 함량은 중간이다. 하지만, CpG 디뉴클레오티드는 코딩 서열의 하류 부분, 예를 들면, 인자 VIII 경쇄를 코딩하는 부분 내에 지배적으로 존재한다. CS04 서열은 야생형 인자 VIII (Genbank 수탁 M14113)에서 상응하는 코딩 서열에 79.77% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는다.
비교 목적을 위해, 여러 다른 코돈-최적화된, ReFacto 구조체가 제조되었다. CS01은 CS04에 대해 행위된 바와 같이 Ward et al.,에 의해 변형된 바와 같은 Fath et al.,의 코돈-최적화 알고리즘을 적용함으로써 작제되었다. 하지만, CS04와 달리, CS01 구조체는 CpG 섬을 전혀 내포하지 않는다. CS08 ReFacto 구조체는 Radcliff P.M. et al., Gene Therapy, 15:289-97 (2008)에서 설명된 바와 같이 코돈 최적화되었는데, 이의 내용은 전체적으로 모든 점에서 본원에 명시적으로 참조로서 편입된다. CS10 코돈-최적화된 ReFacto 구조체는 Eurofins Genomics (Ebersberg, Germany)로부터 획득되었다. CS11 코돈-최적화된 ReFacto 구조체는 Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, USA)로부터 획득되었다. CH25 코돈-최적화된 ReFacto 구조체는 ThermoFischer Scientific의 GeneArt services (Regensburg, Germany)로부터 획득되었다. CS40 ReFacto 구조체는 야생형 인자 VIII 코딩 서열로 구성된다. CS23을 작제하는데 이용된 알고리즘은 코돈-최적화를 위한 온라인 도구인 JCAT 도구 (www.jcat.de)에 근거된다 (Grote et al., 2005; Nucl. Acids Res. W526-31). 상기 서열은 알부민 상과의 코돈 사용빈도를 더욱 반영하기 위해 더욱 변형되었다 (Mirsafian et al. 2014: Sc. Word Journal 2014, ID 639682). 각각의 ReFacto 코딩 서열 사이에 공유된 서열 동일성은 아래의 표 2에서 제시된다.
표 2 - 코돈-변경된 인자 VIII 구조체에 대한 동일성 퍼센트 매트릭스.
CS01 CS04 CS08 CS10 CS11 CS40 CH25 CS23
CS01 100%
CS04 93.0% 100%
CS08 80.7% 82.2.% 100%
CS10 79.1% 79.4% 78.4% 100%
CS11 78.3% 78.3% 78.1% 77.5% 100%
CS40 79.6% 79.8% 76.7% 77.6% 75.4% 100%
CH25 81.3% 85.1% 85.0% 79.9% 79.4% 75.8% 100%
CS23 84.3% 89.2% 85.1% 80.3% 79.9 76.5% 93.2% 100%
각 구조체의 플라스미드는 상이한 합성 DNA 단편을 동일한 벡터 중추 플라스미드 (pCh-BB01) 내로 클로닝함으로써 작제되었다. 측면에서 접하는 AscI 및 NotI 효소 제한 부위를 갖는 Refacto-유형 BDD-FVIII 단편의 DNA 합성은 ThermoFischer Scientific (Regensburg, Germany)에 의해 행위되었다. 벡터 중추는 간-특이적 뮤린 트렌스티레틴 유전자로부터 유래된 프로모터/ 인핸서 서열, 개별 Refacto-유형 BDD-FVIII의 삽입을 위한 AscI 및 NotI 효소 제한 부위, 그리고 합성 polyA 부위를 포괄하는 2개의 측면에서 접하는 AAV2-유래된 반전된 말단 반복 (ITRs)을 내포한다. AscI 및 NotI 부위를 통해, 제조된 벡터 중추 및 삽입물의 결찰 후, 결과의 플라스미드는 밀리그램 규모에서 증폭되었다. 이들 구조체의 Refacto-유형 BDD-FVIII 서열은 직접적인 염기서열결정 (Microsynth, Balgach, Switzerland)에 의해 실증되었다. 이러한 클로닝은 pCS40, pCS01, pCS04, pCS08, pCS10, pCS11, pCh25 및 pCS23으로 명명된 7개의 상이한 플라스미드 구조체를 유발하였다 (도면 19). 이들 구조체는 동일한 벡터 중추를 갖고, 그리고 동일한 B-도메인 결실된 FVIII 단백질 (Refacto-유형 BDD-FVIII)을 인코딩하지만, 그들의 FVIII 코딩 서열에 대해 다르다.
AAV8-기초된 벡터는 Grieger JC, et al. (Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector, Mol Ther., Oct 6. (2015) doi: 10.1038/mt.2015.187. [인쇄에 앞서 Epub])에서 설명된 바와 같이, 3가지 플라스미드 형질감염 방법에 의해 제조되었는데, 이의 내용은 전체적으로 모든 점에서 본원에 명시적으로 참조로서 편입된다. HEK293 현탁액 세포가 상응하는 FVIII 벡터 플라스미드, 보조 플라스미드 pXX6-80 (아데노바이러스 보조 유전자를 보유), 그리고 포장 플라스미드 pGSK2/8 (rep2 및 cap8 유전자를 기여)을 이용한 플라스미드 형질감염에 이용되었다. AAV8 구조체를 단리하기 위해, 1 리터 배양액의 세포 펠렛이 Grieger et al. (2015, 위와 같음)에서 설명된 바와 같이, 아이오딕사놀 구배를 이용하여 처리되었다. 이러한 절차는 vCS01, vCS04, vCS08, vCS10, vCS11 및 vCH25로 불리는 벡터 제조물을 유발하였다. 벡터는 AAV2 반전된 말단 반복을 표적으로 하는 보편적인 qPCR 절차를 이용한 qPCR에 의해 정량되었다 (Aurnhammer, Human Gene Therapy Methods: Part B 23:18-28 (2012)). AAV2 반전된 말단 반복을 보유하는 대조 벡터 플라스미드는 표준 곡선을 준비하는데 적합하였다. 결과의 vCS04 구조체는 도면 7a-7c에서 서열 번호: 8로서 표시된다.
벡터 유전체의 완전성은 AAV 아가로즈 겔 전기이동에 의해 분석되었다. 전기이동은 Fagone et al., Human Gene Therapy Methods 23:1-7 (2012)에서 설명된 바와 같이 수행되었다. 간단히 말하면, AAV 벡터 제조물은 0.5% SDS의 존재에서 75 ℃에서 10 분 동안 배양되고, 그리고 이후, 실온으로 식혀졌다. 거의 1.5E10 벡터 유전체 (vg)가 1% 1xTAE 아가로오스 겔 상에서 레인마다 부하되고, 그리고 7 V/cm의 겔 길이에서 60 분 동안 전기영동되었다. 겔은 이후, 2x GelRed (Biotium Cat# 41003) 용액에서 염색되고 ChemiDocTMMP (Biorad)에 의해 영상화되었다. 도면 20에서 도시된 결과는 vCS01, vCS04 및 vCS40 바이러스 벡터가 5kb 범위에서 상이한 띠에 의해 지시된, 동일한-크기산정된 유전체를 갖는다는 것을 증명한다 (도면 20, 레인 2-4). 대략 5.2 kb의 벡터 크기에도 불구하고, 상기 유전체는 다소간 과대 유전체 (4.7 kb의 AAV 야생형 유전체에 비하여)의 정확한 포장을 확증하는 균질한 띠이다. 모든 다른 vCS 벡터 제조물은 동일한 유전체 크기를 보여준다 (데이터 제시되지 않음).
캡시드 단백질의 예상된 패턴을 확증하기 위해, SDS PAGE, 그 이후에 은 염색이 벡터 vCS01, vCS04 및 vCS40으로 수행되었다 (도면 21). 상기 도면에서 보여 지는 바와 같이, 하류 정제 절차는 VP1, VP2 및 VP3의 예상된 단백질 패턴을 전시하는 고도로 정제된 물질을 유발하였다 (도면 21, 레인 2-4). 동일한 패턴이 모든 다른 바이러스 제조물에서 목격되었다 (도시되지 않음). AAV 제조물의 SDS-PAGE 절차는 표준 절차에 따라 행위되었다. 각 레인은 1E10 vg의 개별 바이러스 구조체를 내포하였고, 그리고 제조업체의 사용설명서에 따라서 4-12% Bis-Tris (NuPAGE® Novex, Life Technologies) 겔에서 분리되었다. 은 염색은 제조업체의 사용설명서에 따라서 SilverQuestTM 키트 (Novex, Life Technologies)로 수행되었다.
놀랍게도, AAV 벡터 vCS01 및 vCS04는 vCS40 야생형 코딩 구조체 및 다른 코돈-최적화된 구조체와 비교하여, AAV 바이러스 생산에서 더욱 높은 수율에 의해 계측된 더욱 높은 비리온 포장을 가졌다. 표 3에서 보여 지는 바와 같이, vCS01 및 vCS04 벡터는 vCS40보다 훨씬 우수하게 복제되고, AAV 역가에서 5-7 배 수율 증가를 제공하였다.
표 3 - 세포 펠렛으로부터 정제될 때, AAV 벡터 구조체 vCS01, vCS04 및 vCD40으로 획득된 세포 배양액 리터당 수율.
구조체 벡터 농도
[vg/ml]
x10E12 		수율
[vg /리터]
x10E12 		배수적 증가
wt와 대비하여
vCS40 2.0 11.0 -
vCS01 9.2 51.4 4.7
vCS04 - 표본 1 17.6 79.2 7.2
vCS04 - 표본 2 15.9 58.8 5.4
실시예 2 - 코돈-변경된 인자 VIII 변이체 발현 서열의 생체내 발현
코돈-변경된 인자 VIII 변이체 서열의 생물학적 효능을 시험하기 위해, 실시예 1에서 설명된 ReFacto-유형 FVIII 구조체가 인자 VIII을 결여하는 생쥐에게 투여되었다. 간단히 말하면, 이들 검정은 생쥐의 체중 킬로그램당 4E12 벡터 유전체 (vg)의 꼬리 정맥 주사에 의해 C57Bl/6 FVIII 녹아웃 (ko) 생쥐 (군마다 6-8마리 동물)에서 수행되었다. 혈액은 안와후방 천자에 의해 주사 후 14 일에 뽑혀졌고, 그리고 혈장이 표준 절차를 이용하여 준비되고 동결되었다. 14 일자에 발현 수준이 선택되었는데, 그 이유는 이러한 시점에서 저해성 항체의 영향이 최소이기 때문인데, 이들 항체는 추후 시점에 이러한 생쥐 모형의 일부 동물에서 목격된다. 생쥐 혈장에서 FVIII 활성은 제조업체 (Technoclone, Vienna, Austria)에 의해 제안된 바와 같이, 단지 약간만 변형되어 수행된 Technochrome FVIII 검정을 이용하여 결정되었다. 상기 검정을 위해, 혈장 표본은 적절하게 희석되고, 그리고 트롬빈, 활성화된 인자 IX (FIXa), 인지질, 인자 X 및 칼슘을 내포하는 검정 시약과 혼합되었다. 트롬빈에 의한 FVIII 활성화 이후에, FIXa, 인지질 및 칼슘과의 복합체가 형성된다. 이러한 복합체는 FX를 활성화된 FX (FXa)로 활성화시키고, 이것은 차례로, 발색 기질로부터 파라-니트로아닐리드 (pNA)를 개열한다. pNA 형성의 동역학은 405 nm에서 계측된다. 상기 비율은 표본 내에 FVIII 농도에 직접적으로 비례한다. FVIII 농도는 참고 곡선으로부터 판독되고, 그리고 결과는 IU FVIII/밀리리터에서 제공된다.
아래 표 4에서 제시된 결과는 상업적인 알고리즘을 이용하여 설계된 코돈-변경된 서열 (CS10, CS11 및 CH25)이 야생형 BDD-인자 VIII 구조체 (CS40)와 비교하여 BDD-인자 VIII에서 단지 근소한 증가 (3-4 배)만을 제공한다는 것을 증명한다. 유사하게, Radcliffe et al.에서 설명된 바와 같이 제조된 코돈-변경된 BDD-인자 VIII 구조체 (CS08)는 BDD-FVIII 발현에서 단지 3-4 배 증가만을 제공하였다. 이러한 결과는 Radcliff et al.에서 보고된 결과와 일치한다. 놀랍게도, CS01, CS04 및 CS23 구조체는 생체내 생물효능 검정에서 훨씬 높은 BDD-FVIII 발현 (각각, 18-, 74- 및 30-배 증가)을 제공하였다.
표 4 - 상이한 AAV 벡터 구조체에 의해 유도된 FVIII-녹아웃 생쥐의 혈장에서 FVIII의 발현.
구조체 코돈 알고리즘 평균 FVIII
14 일자에 발현 [IU/ml] 		표준 편차 생쥐의 숫자 배수적 증가
wt와 대비하여
vCS40 인간 야생형 0.03 0.03 12 -
vCS01 출원인' 0.55 0.28 22 18.3
vCS04 출원인' 2.21 1.20 55 73.7
vCS08 Radcliffe et al. 0.11 0.01 6 3.6
vCS10 Eurofins 0.09 0.01 7 3.0
vCS11 IDT 0.08 0.02 8 2.7
vCH25 GeneArt 0.13 0.12 18 4.3
vCS23 출원인' 0.91 0.32 5 30.3
본 명세서에 기재된 실시예와 구체예는 단지 예시적인 목적을 위한 것이고, 그리고 이에 비추어 다양한 개변은 당해 분야의 당업자에게 제시되고 본원의 기술적 사상과 이해범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본원에서 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
SEQUENCE LISTING <110> BAXALTA INCORPORATED BAXALTA GMBH <120> VIRAL VECTORS ENCODING RECOMBINANT FVIII VARIANTS WITH INCREASED EXPRESSION FOR GENE THERAPY OF HEMOPHILIA A <130> 008073-5115-WO <140> <141> <150> 62/255,323 <151> 2015-11-13 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4374 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc 60 accaggagat actacctggg ggctgtggag ctttcttggg actacatgca gtctgacctg 120 ggggagctgc ctgtggatgc caggttccca cccagagtgc ccaaatcctt cccattcaac 180 acctctgtgg tctacaagaa gaccctcttt gtggagttca ctgaccacct gttcaacatt 240 gccaaaccca ggccaccctg gatgggactc ctgggaccca ccattcaggc tgaggtgtat 300 gacactgtgg tcatcaccct caagaacatg gcctcccacc ctgtgagcct gcatgctgtg 360 ggggtcagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac ctcccagagg 420 gagaaggagg atgacaaagt gttccctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtcctc 480 aaggagaatg gccccatggc ctctgaccca ctctgcctga cctactccta cctttctcat 540 gtggacctgg tcaaggacct caactctgga ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag 600 ggctccctgg ccaaagagaa gacccagacc ctgcacaagt tcattctcct gtttgctgtc 660 tttgatgagg gcaagagctg gcactctgaa accaagaact ccctgatgca ggacagggat 720 gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atggctatgt gaacaggagc 780 ctgcctggac tcattggctg ccacaggaaa tctgtctact ggcatgtgat tggcatgggg 840 acaacccctg aggtgcactc cattttcctg gagggccaca ccttcctggt caggaaccac 900 agacaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctca ctgcccagac cctgctgatg 960 gacctcggac agttcctgct gttctgccac atcagctccc accagcatga tggcatggag 1020 gcctatgtca aggtggacag ctgccctgag gagccacagc tcaggatgaa gaacaatgag 1080 gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt ccgctttgat 1140 gatgacaaca gcccatcctt cattcagatc aggtctgtgg ccaagaaaca ccccaagacc 1200 tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggact atgccccact ggtcctggcc 1260 cctgatgaca ggagctacaa gagccagtac ctcaacaatg gcccacagag gattggacgc 1320 aagtacaaga aagtcaggtt catggcctac actgatgaaa ccttcaagac cagggaggcc 1380 attcagcatg agtctggcat cctgggccca ctcctgtatg gggaggtggg ggacaccctg 1440 ctcatcatct tcaagaacca ggcctccagg ccctacaaca tctacccaca tggcatcact 1500 gatgtcaggc ccctgtacag ccgcaggctg ccaaaggggg tgaaacacct caaggacttc 1560 cccattctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tcactgtgga ggatggacca 1620 accaaatctg accccaggtg cctcaccaga tactactcca gctttgtgaa catggagagg 1680 gacctggcct ctggcctgat tggcccactg ctcatctgct acaaggagtc tgtggaccag 1740 aggggaaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgattc tgttctctgt ctttgatgag 1800 aacaggagct ggtacctgac tgagaacatt cagcgcttcc tgcccaaccc tgctggggtg 1860 cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgc actccatcaa tggctatgtg 1920 tttgacagcc tccagctttc tgtctgcctg catgaggtgg cctactggta cattctttct 1980 attggggccc agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gctacacctt caaacacaag 2040 atggtgtatg aggacaccct gaccctcttc ccattctctg gggagactgt gttcatgagc 2100 atggagaacc ctggcctgtg gattctggga tgccacaact ctgacttccg caacaggggc 2160 atgactgccc tgctcaaagt ctcctcctgt gacaagaaca ctggggacta ctatgaggac 2220 agctatgagg acatctctgc ctacctgctc agcaagaaca atgccattga gcccaggagc 2280 ttcagccaga atccacctgt cctgaaacgc caccagaggg agatcaccag gaccaccctc 2340 cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacaccattt ctgtggagat gaagaaagag 2400 gactttgaca tctatgacga ggacgagaac cagagcccaa ggagcttcca gaagaagacc 2460 aggcactact tcattgctgc tgtggagcgc ctgtgggact atggcatgag ctccagcccc 2520 catgtcctca ggaacagggc ccagtctggc tctgtgccac agttcaagaa agtggtcttc 2580 caagagttca ctgatggcag cttcacccag cccctgtaca gaggggagct gaatgagcac 2640 ctgggactcc tgggcccata catcagggct gaggtggagg acaacatcat ggtgaccttc 2700 cgcaaccagg cctccaggcc ctacagcttc tacagctccc tcatcagcta tgaggaggac 2760 cagaggcagg gggctgagcc acgcaagaac tttgtgaaac ccaatgaaac caagacctac 2820 ttctggaaag tccagcacca catggccccc accaaggatg agtttgactg caaggcctgg 2880 gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tggcccactc 2940 ctggtctgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggaa ggcaagtgac tgtgcaggag 3000 tttgccctct tcttcaccat ctttgatgaa accaagagct ggtacttcac tgagaacatg 3060 gagcgcaact gcagggcccc atgcaacatt cagatggagg accccacctt caaagagaac 3120 taccgcttcc atgccatcaa tggctacatc atggacaccc tgcctgggct tgtcatggcc 3180 caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctt tctatgggct ccaatgagaa cattcactcc 3240 atccacttct ctgggcatgt cttcactgtg cgcaagaagg aggagtacaa gatggccctg 3300 tacaacctct accctggggt ctttgagact gtggagatgc tgccctccaa agctggcatc 3360 tggagggtgg agtgcctcat tggggagcac ctgcatgctg gcatgagcac cctgttcctg 3420 gtctacagca acaagtgcca gacccccctg ggaatggcct ctggccacat cagggacttc 3480 cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggccccca agctggccag gctccactac 3540 tctggatcca tcaatgcctg gagcaccaag gagccattca gctggatcaa agtggacctg 3600 ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttctccagc 3660 ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatg gcaagaaatg gcagacctac 3720 agaggcaact ccactggaac actcatggtc ttctttggca atgtggacag ctctggcatc 3780 aagcacaaca tcttcaaccc cccaatcatc gccagataca tcaggctgca ccccacccac 3840 tacagcatcc gcagcaccct caggatggag ctgatgggct gtgacctgaa ctcctgcagc 3900 atgcccctgg gcatggagag caaggccatt tctgatgccc agatcactgc ctccagctac 3960 ttcaccaaca tgtttgccac ctggagccca agcaaggcca ggctgcacct ccagggaagg 4020 agcaatgcct ggaggcccca ggtcaacaac ccaaaggagt ggctgcaggt ggacttccag 4080 aagaccatga aggtcactgg ggtgaccacc cagggggtca agagcctgct caccagcatg 4140 tatgtgaagg agttcctgat cagctccagc caggatggcc accagtggac cctcttcttc 4200 cagaatggca aggtcaaggt gttccagggc aaccaggaca gcttcacccc tgtggtgaac 4260 agcctggacc cccccctcct gaccagatac ctgaggattc acccccagag ctgggtccac 4320 cagattgccc tgaggatgga ggtcctggga tgtgaggccc aggacctgta ctga 4374 <210> 2 <211> 1457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 180 185 190 Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr 195 200 205 Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly 210 215 220 Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp 225 230 235 240 Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr 245 250 255 Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val 260 265 270 Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile 275 280 285 Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser 290 295 300 Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met 305 310 315 320 Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His 325 330 335 Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro 340 345 350 Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp 355 360 365 Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser 370 375 380 Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr 385 390 395 400 Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro 405 410 415 Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn 420 425 430 Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met 435 440 445 Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu 450 455 460 Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu 465 470 475 480 Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro 485 490 495 His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys 500 505 510 Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe 515 520 525 Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp 530 535 540 Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg 545 550 555 560 Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu 565 570 575 Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val 580 585 590 Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu 595 600 605 Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp 610 615 620 Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val 625 630 635 640 Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp 645 650 655 Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe 660 665 670 Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr 675 680 685 Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro 690 695 700 Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly 705 710 715 720 Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp 725 730 735 Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys 740 745 750 Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu 755 760 765 Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln 770 775 780 Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu 785 790 795 800 Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe 805 810 815 Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp 820 825 830 Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln 835 840 845 Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr 850 855 860 Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His 865 870 875 880 Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile 885 890 895 Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser 900 905 910 Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg 915 920 925 Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val 930 935 940 Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp 945 950 955 960 Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu 965 970 975 Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His 980 985 990 Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe 995 1000 1005 Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn 1010 1015 1020 Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys 1025 1030 1035 Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr 1040 1045 1050 Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr 1055 1060 1065 Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe 1070 1075 1080 Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met 1085 1090 1095 Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met 1100 1105 1110 Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly 1115 1120 1125 Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser 1130 1135 1140 Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg 1145 1150 1155 Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro 1160 1165 1170 Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser 1175 1180 1185 Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro 1190 1195 1200 Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe 1205 1210 1215 Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp 1220 1225 1230 Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu 1235 1240 1245 Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn 1250 1255 1260 Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro 1265 1270 1275 Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly 1280 1285 1290 Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys 1295 1300 1305 Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn 1310 1315 1320 Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln 1325 1330 1335 Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu 1340 1345 1350 Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val 1355 1360 1365 Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys 1370 1375 1380 Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu 1385 1390 1395 Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp 1400 1405 1410 Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr 1415 1420 1425 Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala 1430 1435 1440 Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr 1445 1450 1455 <210> 3 <211> 2220 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 3 gccaccagga gatactacct gggggctgtg gagctttctt gggactacat gcagtctgac 60 ctgggggagc tgcctgtgga tgccaggttc ccacccagag tgcccaaatc cttcccattc 120 aacacctctg tggtctacaa gaagaccctc tttgtggagt tcactgacca cctgttcaac 180 attgccaaac ccaggccacc ctggatggga ctcctgggac ccaccattca ggctgaggtg 240 tatgacactg tggtcatcac cctcaagaac atggcctccc accctgtgag cctgcatgct 300 gtgggggtca gctactggaa ggcctctgag ggggctgagt atgatgacca gacctcccag 360 agggagaagg aggatgacaa agtgttccct gggggcagcc acacctatgt gtggcaggtc 420 ctcaaggaga atggccccat ggcctctgac ccactctgcc tgacctactc ctacctttct 480 catgtggacc tggtcaagga cctcaactct ggactgattg gggccctgct ggtgtgcagg 540 gagggctccc tggccaaaga gaagacccag accctgcaca agttcattct cctgtttgct 600 gtctttgatg agggcaagag ctggcactct gaaaccaaga actccctgat gcaggacagg 660 gatgctgcct ctgccagggc ctggcccaag atgcacactg tgaatggcta tgtgaacagg 720 agcctgcctg gactcattgg ctgccacagg aaatctgtct actggcatgt gattggcatg 780 gggacaaccc ctgaggtgca ctccattttc ctggagggcc acaccttcct ggtcaggaac 840 cacagacagg ccagcctgga gatcagcccc atcaccttcc tcactgccca gaccctgctg 900 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gagaacagga gctggtacct gactgagaac attcagcgct tcctgcccaa ccctgctggg 1800 gtgcagctgg aggaccctga gttccaggcc agcaacatca tgcactccat caatggctat 1860 gtgtttgaca gcctccagct ttctgtctgc ctgcatgagg tggcctactg gtacattctt 1920 tctattgggg cccagactga cttcctttct gtcttcttct ctggctacac cttcaaacac 1980 aagatggtgt atgaggacac cctgaccctc ttcccattct ctggggagac tgtgttcatg 2040 agcatggaga accctggcct gtggattctg ggatgccaca actctgactt ccgcaacagg 2100 ggcatgactg ccctgctcaa agtctcctcc tgtgacaaga acactgggga ctactatgag 2160 gacagctatg aggacatctc tgcctacctg ctcagcaaga acaatgccat tgagcccagg 2220 <210> 4 <211> 2052 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 4 gagatcacca ggaccaccct ccagtctgac caggaggaga ttgactatga tgacaccatt 60 tctgtggaga tgaagaaaga ggactttgac atctatgacg aggacgagaa ccagagccca 120 aggagcttcc agaagaagac caggcactac ttcattgctg ctgtggagcg cctgtgggac 180 tatggcatga gctccagccc ccatgtcctc aggaacaggg cccagtctgg ctctgtgcca 240 cagttcaaga aagtggtctt ccaagagttc actgatggca gcttcaccca gcccctgtac 300 agaggggagc tgaatgagca cctgggactc ctgggcccat acatcagggc tgaggtggag 360 gacaacatca tggtgacctt ccgcaaccag gcctccaggc cctacagctt ctacagctcc 420 ctcatcagct atgaggagga ccagaggcag ggggctgagc cacgcaagaa ctttgtgaaa 480 cccaatgaaa ccaagaccta cttctggaaa gtccagcacc acatggcccc caccaaggat 540 gagtttgact gcaaggcctg ggcctacttc tctgatgtgg acctggagaa ggatgtgcac 600 tctggcctga ttggcccact cctggtctgc cacaccaaca ccctgaaccc tgcccatgga 660 aggcaagtga ctgtgcagga gtttgccctc ttcttcacca tctttgatga aaccaagagc 720 tggtacttca ctgagaacat ggagcgcaac tgcagggccc catgcaacat tcagatggag 780 gaccccacct tcaaagagaa ctaccgcttc catgccatca atggctacat catggacacc 840 ctgcctgggc ttgtcatggc ccaggaccag aggatcaggt ggtacctgct ttctatgggc 900 tccaatgaga acattcactc catccacttc tctgggcatg tcttcactgt gcgcaagaag 960 gaggagtaca agatggccct gtacaacctc taccctgggg tctttgagac tgtggagatg 1020 ctgccctcca aagctggcat ctggagggtg gagtgcctca ttggggagca cctgcatgct 1080 ggcatgagca ccctgttcct ggtctacagc aacaagtgcc agacccccct gggaatggcc 1140 tctggccaca tcagggactt ccagatcact gcctctggcc agtatggcca gtgggccccc 1200 aagctggcca ggctccacta ctctggatcc atcaatgcct ggagcaccaa ggagccattc 1260 agctggatca aagtggacct gctggccccc atgatcatcc atggcatcaa gacccagggg 1320 gccaggcaga agttctccag cctgtacatc agccagttca tcatcatgta cagcctggat 1380 ggcaagaaat ggcagaccta cagaggcaac tccactggaa cactcatggt cttctttggc 1440 aatgtggaca gctctggcat caagcacaac atcttcaacc ccccaatcat cgccagatac 1500 atcaggctgc accccaccca ctacagcatc cgcagcaccc tcaggatgga gctgatgggc 1560 tgtgacctga actcctgcag catgcccctg ggcatggaga gcaaggccat ttctgatgcc 1620 cagatcactg cctccagcta cttcaccaac atgtttgcca cctggagccc aagcaaggcc 1680 aggctgcacc tccagggaag gagcaatgcc tggaggcccc aggtcaacaa cccaaaggag 1740 tggctgcagg tggacttcca gaagaccatg aaggtcactg gggtgaccac ccagggggtc 1800 aagagcctgc tcaccagcat gtatgtgaag gagttcctga tcagctccag ccaggatggc 1860 caccagtgga ccctcttctt ccagaatggc aaggtcaagg tgttccaggg caaccaggac 1920 agcttcaccc ctgtggtgaa cagcctggac ccccccctcc tgaccagata cctgaggatt 1980 cacccccaga gctgggtcca ccagattgcc ctgaggatgg aggtcctggg atgtgaggcc 2040 caggacctgt ac 2052 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 5 agcttctctc agaatccacc tgtcctgaag agacaccaga ga 42 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 6 agcttcagcc agaatccacc tgtcctgaaa cgccaccaga gg 42 <210> 7 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 7 agcttcagcc agaacccccc cgtgctgaag aggcaccaga gg 42 <210> 8 <211> 7827 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 8 tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60 cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120 ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180 accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240 attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300 tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360 tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cctcgagatt taaatgacgt 420 tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc 480 gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcaga gagggagtgg 540 ccaactccat cactaggggt tcctgagttt aaacttcgtc gacgattcga gcttgggctg 600 caggtcgagg gcactgggag gatgttgagt aagatggaaa actactgatg acccttgcag 660 agacagagta ttaggacatg tttgaacagg ggccgggcga tcagcaggta gctctagagg 720 atccccgtct gtctgcacat ttcgtagagc gagtgttccg atactctaat ctccctaggc 780 aaggttcata tttgtgtagg ttacttattc tccttttgtt gactaagtca ataatcagaa 840 tcagcaggtt tggagtcagc ttggcaggga tcagcagcct gggttggaag gagggggtat 900 aaaagcccct tcaccaggag aagccgtcac acagactagg cgcgccaccg ccaccatgca 960 gattgagctg agcacctgct tcttcctgtg cctgctgagg ttctgcttct ctgccaccag 1020 gagatactac ctgggggctg tggagctttc ttgggactac atgcagtctg acctggggga 1080 gctgcctgtg gatgccaggt tcccacccag agtgcccaaa tccttcccat tcaacacctc 1140 tgtggtctac aagaagaccc tctttgtgga gttcactgac cacctgttca acattgccaa 1200 acccaggcca ccctggatgg gactcctggg acccaccatt caggctgagg tgtatgacac 1260 tgtggtcatc accctcaaga acatggcctc ccaccctgtg agcctgcatg ctgtgggggt 1320 cagctactgg aaggcctctg agggggctga gtatgatgac cagacctccc agagggagaa 1380 ggaggatgac aaagtgttcc ctgggggcag ccacacctat gtgtggcagg tcctcaagga 1440 gaatggcccc atggcctctg acccactctg cctgacctac tcctaccttt ctcatgtgga 1500 cctggtcaag gacctcaact ctggactgat tggggccctg ctggtgtgca gggagggctc 1560 cctggccaaa gagaagaccc agaccctgca caagttcatt ctcctgtttg ctgtctttga 1620 tgagggcaag agctggcact ctgaaaccaa gaactccctg atgcaggaca gggatgctgc 1680 ctctgccagg gcctggccca agatgcacac tgtgaatggc tatgtgaaca ggagcctgcc 1740 tggactcatt ggctgccaca ggaaatctgt ctactggcat gtgattggca tggggacaac 1800 ccctgaggtg cactccattt tcctggaggg 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ctgctacaag gagtctgtgg accagagggg 2700 aaaccagatc atgtctgaca agaggaatgt gattctgttc tctgtctttg atgagaacag 2760 gagctggtac ctgactgaga acattcagcg cttcctgccc aaccctgctg gggtgcagct 2820 ggaggaccct gagttccagg ccagcaacat catgcactcc atcaatggct atgtgtttga 2880 cagcctccag ctttctgtct gcctgcatga ggtggcctac tggtacattc tttctattgg 2940 ggcccagact gacttccttt ctgtcttctt ctctggctac accttcaaac acaagatggt 3000 gtatgaggac accctgaccc tcttcccatt ctctggggag actgtgttca tgagcatgga 3060 gaaccctggc ctgtggattc tgggatgcca caactctgac ttccgcaaca ggggcatgac 3120 tgccctgctc aaagtctcct cctgtgacaa gaacactggg gactactatg aggacagcta 3180 tgaggacatc tctgcctacc tgctcagcaa gaacaatgcc attgagccca ggagcttcag 3240 ccagaatcca cctgtcctga aacgccacca gagggagatc accaggacca ccctccagtc 3300 tgaccaggag gagattgact atgatgacac catttctgtg gagatgaaga aagaggactt 3360 tgacatctat gacgaggacg agaaccagag cccaaggagc ttccagaaga agaccaggca 3420 ctacttcatt gctgctgtgg agcgcctgtg ggactatggc atgagctcca gcccccatgt 3480 cctcaggaac agggcccagt ctggctctgt gccacagttc aagaaagtgg tcttccaaga 3540 gttcactgat ggcagcttca cccagcccct gtacagaggg gagctgaatg agcacctggg 3600 actcctgggc ccatacatca gggctgaggt ggaggacaac atcatggtga ccttccgcaa 3660 ccaggcctcc aggccctaca gcttctacag ctccctcatc agctatgagg aggaccagag 3720 gcagggggct gagccacgca agaactttgt gaaacccaat gaaaccaaga cctacttctg 3780 gaaagtccag caccacatgg cccccaccaa ggatgagttt gactgcaagg cctgggccta 3840 cttctctgat gtggacctgg agaaggatgt gcactctggc ctgattggcc cactcctggt 3900 ctgccacacc aacaccctga accctgccca tggaaggcaa gtgactgtgc aggagtttgc 3960 cctcttcttc accatctttg atgaaaccaa gagctggtac ttcactgaga acatggagcg 4020 caactgcagg gccccatgca acattcagat ggaggacccc accttcaaag agaactaccg 4080 cttccatgcc atcaatggct acatcatgga caccctgcct gggcttgtca tggcccagga 4140 ccagaggatc aggtggtacc tgctttctat gggctccaat gagaacattc actccatcca 4200 cttctctggg catgtcttca ctgtgcgcaa gaaggaggag tacaagatgg ccctgtacaa 4260 cctctaccct ggggtctttg agactgtgga gatgctgccc tccaaagctg gcatctggag 4320 ggtggagtgc ctcattgggg agcacctgca tgctggcatg agcaccctgt tcctggtcta 4380 cagcaacaag tgccagaccc ccctgggaat ggcctctggc cacatcaggg acttccagat 4440 cactgcctct ggccagtatg gccagtgggc ccccaagctg gccaggctcc actactctgg 4500 atccatcaat gcctggagca ccaaggagcc attcagctgg atcaaagtgg acctgctggc 4560 ccccatgatc atccatggca tcaagaccca gggggccagg cagaagttct ccagcctgta 4620 catcagccag ttcatcatca tgtacagcct ggatggcaag aaatggcaga cctacagagg 4680 caactccact ggaacactca tggtcttctt tggcaatgtg gacagctctg gcatcaagca 4740 caacatcttc aaccccccaa tcatcgccag atacatcagg ctgcacccca cccactacag 4800 catccgcagc accctcagga tggagctgat gggctgtgac ctgaactcct gcagcatgcc 4860 cctgggcatg gagagcaagg ccatttctga tgcccagatc actgcctcca gctacttcac 4920 caacatgttt gccacctgga gcccaagcaa ggccaggctg cacctccagg gaaggagcaa 4980 tgcctggagg ccccaggtca acaacccaaa ggagtggctg caggtggact tccagaagac 5040 catgaaggtc actggggtga ccacccaggg ggtcaagagc ctgctcacca gcatgtatgt 5100 gaaggagttc ctgatcagct ccagccagga tggccaccag tggaccctct tcttccagaa 5160 tggcaaggtc aaggtgttcc agggcaacca 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acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 6060 agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 6120 tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 6180 cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 6240 ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 6300 ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 6360 ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 6420 ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 6480 cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 6540 gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 6600 atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 6660 ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 6720 gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 6780 tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 6840 ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 6900 taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 6960 gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 7020 gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 7080 ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 7140 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 7200 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 7260 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 7320 actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 7380 caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 7440 gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 7500 ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 7560 caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 7620 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 7680 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 7740 cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 7800 ataggcgtat cacgaggccc tttcgtc 7827 <210> 9 <211> 4332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 9 atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc 60 accaggagat actacctggg ggctgtggag ctttcttggg actacatgca gtctgacctg 120 ggggagctgc ctgtggatgc caggttccca cccagagtgc ccaaatcctt cccattcaac 180 acctctgtgg tctacaagaa gaccctcttt gtggagttca ctgaccacct gttcaacatt 240 gccaaaccca ggccaccctg gatgggactc ctgggaccca ccattcaggc tgaggtgtat 300 gacactgtgg tcatcaccct caagaacatg gcctcccacc ctgtgagcct gcatgctgtg 360 ggggtcagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac ctcccagagg 420 gagaaggagg atgacaaagt gttccctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtcctc 480 aaggagaatg gccccatggc ctctgaccca ctctgcctga cctactccta cctttctcat 540 gtggacctgg tcaaggacct caactctgga ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag 600 ggctccctgg ccaaagagaa gacccagacc ctgcacaagt tcattctcct gtttgctgtc 660 tttgatgagg gcaagagctg gcactctgaa accaagaact ccctgatgca ggacagggat 720 gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atggctatgt gaacaggagc 780 ctgcctggac tcattggctg ccacaggaaa tctgtctact ggcatgtgat tggcatgggg 840 acaacccctg aggtgcactc cattttcctg gagggccaca ccttcctggt caggaaccac 900 agacaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctca ctgcccagac cctgctgatg 960 gacctcggac agttcctgct gttctgccac atcagctccc accagcatga tggcatggag 1020 gcctatgtca aggtggacag ctgccctgag gagccacagc tcaggatgaa gaacaatgag 1080 gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt ccgctttgat 1140 gatgacaaca gcccatcctt cattcagatc aggtctgtgg ccaagaaaca ccccaagacc 1200 tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggact atgccccact ggtcctggcc 1260 cctgatgaca ggagctacaa gagccagtac ctcaacaatg gcccacagag gattggacgc 1320 aagtacaaga aagtcaggtt catggcctac actgatgaaa ccttcaagac cagggaggcc 1380 attcagcatg agtctggcat cctgggccca ctcctgtatg gggaggtggg ggacaccctg 1440 ctcatcatct tcaagaacca ggcctccagg ccctacaaca tctacccaca tggcatcact 1500 gatgtcaggc ccctgtacag ccgcaggctg ccaaaggggg tgaaacacct caaggacttc 1560 cccattctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tcactgtgga ggatggacca 1620 accaaatctg accccaggtg cctcaccaga tactactcca gctttgtgaa catggagagg 1680 gacctggcct ctggcctgat tggcccactg ctcatctgct acaaggagtc tgtggaccag 1740 aggggaaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgattc tgttctctgt ctttgatgag 1800 aacaggagct ggtacctgac tgagaacatt cagcgcttcc tgcccaaccc tgctggggtg 1860 cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgc actccatcaa tggctatgtg 1920 tttgacagcc tccagctttc tgtctgcctg catgaggtgg cctactggta cattctttct 1980 attggggccc agactgactt cctttctgtc ttcttctctg gctacacctt caaacacaag 2040 atggtgtatg aggacaccct gaccctcttc ccattctctg gggagactgt gttcatgagc 2100 atggagaacc ctggcctgtg gattctggga tgccacaact ctgacttccg caacaggggc 2160 atgactgccc tgctcaaagt ctcctcctgt gacaagaaca ctggggacta ctatgaggac 2220 agctatgagg acatctctgc ctacctgctc agcaagaaca atgccattga gcccagggag 2280 atcaccagga ccaccctcca gtctgaccag 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atcaggtggt acctgctttc tatgggctcc 3180 aatgagaaca ttcactccat ccacttctct gggcatgtct tcactgtgcg caagaaggag 3240 gagtacaaga tggccctgta caacctctac cctggggtct ttgagactgt ggagatgctg 3300 ccctccaaag ctggcatctg gagggtggag tgcctcattg gggagcacct gcatgctggc 3360 atgagcaccc tgttcctggt ctacagcaac aagtgccaga cccccctggg aatggcctct 3420 ggccacatca gggacttcca gatcactgcc tctggccagt atggccagtg ggcccccaag 3480 ctggccaggc tccactactc tggatccatc aatgcctgga gcaccaagga gccattcagc 3540 tggatcaaag tggacctgct ggcccccatg atcatccatg gcatcaagac ccagggggcc 3600 aggcagaagt tctccagcct gtacatcagc cagttcatca tcatgtacag cctggatggc 3660 aagaaatggc agacctacag aggcaactcc actggaacac tcatggtctt ctttggcaat 3720 gtggacagct ctggcatcaa gcacaacatc ttcaaccccc caatcatcgc cagatacatc 3780 aggctgcacc ccacccacta cagcatccgc agcaccctca ggatggagct gatgggctgt 3840 gacctgaact cctgcagcat gcccctgggc atggagagca aggccatttc tgatgcccag 3900 atcactgcct ccagctactt caccaacatg tttgccacct ggagcccaag caaggccagg 3960 ctgcacctcc agggaaggag caatgcctgg 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aaaccaagac ctacttctgg 2820 aaagtccagc accacatggc ccccaccaag gatgagtttg actgcaaggc ctgggcctac 2880 ttctctgatg tggacctgga gaaggatgtg cactctggcc tgattggccc actcctggtc 2940 tgccacacca acaccctgaa ccctgcccat ggaaggcaag tgactgtgca ggagtttgcc 3000 ctcttcttca ccatctttga tgaaaccaag agctggtact tcactgagaa catggagcgc 3060 aactgcaggg ccccatgcaa cattcagatg gaggacccca ccttcaaaga gaactaccgc 3120 ttccatgcca tcaatggcta catcatggac accctgcctg ggcttgtcat ggcccaggac 3180 cagaggatca ggtggtacct gctttctatg ggctccaatg agaacattca ctccatccac 3240 ttctctgggc atgtcttcac tgtgcgcaag aaggaggagt acaagatggc cctgtacaac 3300 ctctaccctg gggtctttga gactgtggag atgctgccct ccaaagctgg catctggagg 3360 gtggagtgcc tcattgggga gcacctgcat gctggcatga gcaccctgtt cctggtctac 3420 agcaacaagt gccagacccc cctgggaatg gcctctggcc acatcaggga cttccagatc 3480 actgcctctg gccagtatgg ccagtgggcc cccaagctgg ccaggctcca ctactctgga 3540 tccatcaatg cctggagcac caaggagcca ttcagctgga tcaaagtgga cctgctggcc 3600 cccatgatca tccatggcat caagacccag ggggccaggc 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ccggttcccc cccagagtgc ccaagagctt ccccttcaac 180 accagcgtgg tgtacaagaa aaccctgttc gtggagttca ccgaccacct gttcaacatc 240 gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccca ccatccaggc cgaggtgtac 300 gacaccgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ccgtgagcct gcacgccgtg 360 ggcgtgagct actggaaggc ctccgagggc gccgagtacg acgaccagac cagccagcgg 420 gagaaagagg acgacaaagt ctttcctggc ggcagccaca cctacgtgtg gcaggtcctg 480 aaagaaaacg gccccatggc ctccgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccac 540 gtggacctgg tgaaggacct gaacagcggg ctgattgggg ccctgctggt ctgccgggag 600 ggcagcctgg ccaaagagaa aacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gttcgccgtg 660 ttcgacgagg gcaagagctg gcacagcgag accaagaaca gcctgatgca ggaccgggac 720 gccgcctctg ccagagcctg gcccaagatg cacaccgtga acggctacgt gaacagaagc 780 ctgcccggcc tgattggctg ccaccggaag agcgtgtact ggcacgtgat cggcatgggc 840 accacacccg aggtgcacag catctttctg gaagggcaca cctttctggt gcggaaccac 900 cggcaggcca gcctggaaat cagccctatc accttcctga ccgcccagac actgctgatg 960 gacctgggcc agttcctgct gttttgccac 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cagcggtttc tgcccaaccc tgccggggtg 1860 cagctggaag atcccgagtt ccaggccagc aacatcatgc actccatcaa tggctacgtg 1920 ttcgacagcc tgcagctgtc cgtgtgtctg cacgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980 atcggcgccc agaccgactt cctgagcgtg ttcttcagcg gctacacctt caagcacaag 2040 atggtgtacg aggacaccct gaccctgttc cctttcagcg gcgagaccgt gttcatgagc 2100 atggaaaacc ccggcctgtg gatcctgggc tgccacaaca gcgacttccg gaaccggggc 2160 atgaccgccc tgctgaaggt gtccagctgc gacaagaaca ccggcgacta ctacgaggac 2220 agctacgagg atatcagcgc ctacctgctg tccaagaaca acgccatcga gcccagaagc 2280 ttcagccaga acccccctgt gctgaagcgg caccagagag agatcacccg gaccaccctg 2340 cagtccgacc aggaagagat cgattacgac gacaccatca gcgtggagat gaaaaaagaa 2400 gatttcgaca tctacgacga ggacgagaac cagagccccc ggtccttcca gaagaaaacc 2460 cggcactact ttatcgccgc cgtggagcgg ctgtgggact acggcatgag cagcagcccc 2520 cacgtgctgc ggaaccgggc ccagagcggc agcgtgcccc agttcaagaa agtggtgttc 2580 caggaattca ccgacggcag cttcacccag cccctgtacc ggggcgagct gaacgagcac 2640 ctggggctgc tggggcccta catcagggcc 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe 1 5 10 15 Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser 20 25 30 Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val 50 55 60 Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile 65 70 75 80 Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser 100 105 110 His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser 115 120 125 Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp 130 135 140 Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu 145 150 155 160 Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser 165 170 175 Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile 180 185 190 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600 gtgttcgatg agggcaagag ctggcacagc gagaccaaga acagcctgat gcaggacagg 660 gatgccgcct ctgccagggc ctggcccaag atgcacaccg tgaacggcta cgtgaacagg 720 agcctgcccg gcctgatcgg ctgccacagg aagtctgtgt actggcacgt gatcggcatg 780 ggcaccaccc ccgaggtgca cagcatcttc ctggagggcc acaccttcct ggtgaggaac 840 cacaggcagg ccagcctgga gatcagcccc atcaccttcc tgaccgccca gaccctgctg 900 atggacctgg gccagttcct gctgttctgc cacatcagca gccaccagca cgacggcatg 960 gaggcctacg tgaaggtgga cagctgcccc gaggagcccc agctgaggat gaagaacaac 1020 gaggaggccg aggactatga tgatgacctg accgactctg agatggacgt ggtgaggttt 1080 gatgatgaca acagccccag cttcatccag atcaggtctg tggccaagaa gcaccccaag 1140 acctgggtgc actacatcgc cgccgaggag gaggactggg actacgcccc cctggtgctg 1200 gcccccgacg acaggagcta caagagccag tacctgaaca acggccccca gaggatcggc 1260 aggaagtaca agaaggtcag attcatggcc tacaccgacg agaccttcaa gaccagggag 1320 gccatccagc acgagtctgg catcctgggc cccctgctgt acggcgaggt gggcgacacc 1380 ctgctgatca tcttcaagaa ccaggccagc aggccctaca acatctaccc ccacggcatc 1440 accgatgtga ggcccctgta cagcaggagg ctgcccaagg gcgtgaagca cctgaaggac 1500 ttccccatcc tgcccggcga gatcttcaag tacaagtgga ccgtgaccgt ggaggatggc 1560 cccaccaagt ctgaccccag gtgcctgacc aggtactaca gcagcttcgt gaacatggag 1620 agggacctgg cctctggcct gatcggcccc ctgctgatct gctacaagga gagcgtggac 1680 cagaggggca accagatcat gtctgacaag aggaacgtga tcctgttctc tgtgttcgat 1740 gagaacagga gctggtatct gaccgagaac atccagaggt tcctgcccaa ccccgccggc 1800 gtgcagctgg aggaccccga gttccaggcc agcaacatca tgcacagcat caacggctac 1860 gtgttcgaca gcctgcagct gtctgtgtgc ctgcacgagg tggcctactg gtacatcctg 1920 agcatcggcg cccagaccga cttcctgtct gtgttcttct ctggctacac cttcaagcac 1980 aagatggtgt acgaggacac cctgaccctg ttccccttca gcggcgagac cgtgttcatg 2040 agcatggaga accccggcct gtggatcctg ggctgccaca acagcgactt caggaacagg 2100 ggcatgaccg ccctgctgaa agtcagcagc tgcgacaaga acaccggcga ctactacgag 2160 gacagctacg aggacatcag cgcctacctg ctgagcaaga acaacgccat cgagcccagg 2220 <210> 23 <211> 2052 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 23 gagatcacca ggaccaccct gcagagcgac caggaggaga tcgactatga tgacaccatc 60 agcgtggaga tgaagaagga ggacttcgac atctacgacg aggacgagaa ccagagcccc 120 aggagcttcc agaagaagac caggcactac ttcatcgccg ccgtggagag gctgtgggac 180 tatggcatga gcagcagccc ccacgtgctg aggaacaggg cccagagcgg cagcgtgccc 240 cagttcaaga aggtggtgtt ccaggagttc accgacggca gcttcaccca gcccctgtac 300 agaggcgagc tgaacgagca cctgggcctg ctgggcccct acatcagggc cgaggtggag 360 gacaacatca tggtgacctt caggaaccag gccagcaggc cctacagctt ctacagcagc 420 ctgatcagct acgaggagga ccagaggcag ggcgccgagc ccaggaagaa cttcgtgaag 480 cccaacgaga ccaagaccta cttctggaag gtgcagcacc acatggcccc caccaaggac 540 gagttcgact gcaaggcctg ggcctacttc tctgatgtgg acctggagaa ggacgtgcac 600 agcggcctga tcggccccct gctggtgtgc cacaccaaca ccctgaaccc cgcccacggc 660 aggcaggtga ccgtgcagga gttcgccctg ttcttcacca tcttcgacga gaccaagagc 720 tggtacttca ccgagaacat ggagaggaac tgcagggccc cctgcaacat ccagatggag 780 gaccccacct tcaaggagaa ctacaggttc cacgccatca acggctacat catggacacc 840 ctgcccggcc tggtgatggc ccaggaccag aggatcaggt ggtatctgct gagcatgggc 900 agcaacgaga acatccacag catccacttc agcggccacg tgttcaccgt gaggaagaag 960 gaggagtaca agatggccct gtacaacctg taccccggcg tgttcgagac cgtggagatg 1020 ctgcccagca aggccggcat ctggagggtg gagtgcctga tcggcgagca cctgcacgcc 1080 ggcatgagca ccctgttcct ggtgtacagc aacaagtgcc agacccccct gggcatggcc 1140 agcggccaca tcagggactt ccagatcacc gcctctggcc agtacggcca gtgggccccc 1200 aagctggcca ggctgcacta cagcggcagc atcaacgcct ggagcaccaa ggagcccttc 1260 agctggatca aggtggacct gctggccccc atgatcatcc acggcatcaa gacccagggc 1320 gccaggcaga agttcagcag cctgtacatc agccagttca tcatcatgta cagcctggac 1380 ggcaagaagt ggcagaccta caggggcaac agcaccggca ccctgatggt gttcttcggc 1440 aacgtggaca gcagcggcat caagcacaac atcttcaacc cccccatcat cgccaggtac 1500 atcaggctgc accccaccca ctacagcatc aggagcaccc tgcggatgga actgatgggc 1560 tgcgacctga acagctgcag catgcccctg ggcatggaga gcaaggccat ctctgacgcc 1620 cagatcaccg ccagcagcta cttcaccaac atgttcgcca cctggagccc cagcaaggcc 1680 aggctgcacc tgcagggcag gagcaacgcc tggaggcccc aggtgaacaa ccccaaggag 1740 tggctgcagg tggacttcca gaagaccatg aaggtgaccg gcgtgaccac ccagggcgtg 1800 aagagcctgc tgaccagcat gtacgtgaag gagttcctga tcagcagcag ccaggacggc 1860 caccagtgga ccctgttctt ccagaacggc aaagtgaagg tgttccaggg caaccaggac 1920 agcttcaccc ccgtggtgaa cagcctggac ccccccctgc tgaccaggta tctgaggatc 1980 cacccccaga gctgggtgca ccagatcgcc ctgagaatgg aagtgctggg atgcgaggcc 2040 caggacctgt ac 2052 <210> 24 <211> 2220 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 24 gccaccagga gatactacct gggggctgtg gaactttctt gggactacat gcagtctgac 60 ctgggagagc tgcctgtgga tgccaggttc ccacccagag tgcccaagtc cttcccattc 120 aacacctctg tggtctacaa gaagacactc tttgtggaat tcactgacca cctgttcaac 180 attgcaaaac ccagaccacc ctggatggga ctcctgggac ccaccattca ggctgaggtg 240 tatgacactg tggtcatcac cctcaagaac atggcatccc accctgtgtc tctgcatgct 300 gtgggagtct catactggaa agcctctgaa ggggctgagt atgatgacca gacatcccag 360 agagagaaag aggatgacaa ggtgttccct gggggatctc acacctatgt gtggcaagtc 420 ctcaaggaga atggacccat ggcatctgac ccactctgcc tgacatactc ctacctttct 480 catgtggacc tggtcaagga cctcaactct ggactgattg gggcactgct ggtgtgcagg 540 gaaggatccc tggccaagga gaaaacccag acactgcaca agttcattct cctgtttgct 600 gtctttgatg agggcaagtc ttggcactct gaaacaaaga actccctgat gcaagacagg 660 gatgctgcct ctgccagggc atggcccaag atgcacactg tgaatggcta tgtgaacaga 720 tcactgcctg gactcattgg ctgccacagg aaatctgtct actggcatgt gattggcatg 780 gggacaaccc ctgaagtgca ctccattttc ctggagggac acaccttcct ggtcaggaac 840 cacagacaag cctctctgga gatctctccc atcaccttcc tcactgcaca gacactgctg 900 atggaccttg gacagttcct gctgttctgc cacatctctt cccaccagca tgatggcatg 960 gaagcctatg tcaaggtgga ctcatgccct gaggaaccac agctcaggat gaagaacaat 1020 gaggaggctg aggactatga tgatgacctg actgactctg agatggatgt ggtcagattt 1080 gatgatgaca actctccatc cttcattcag atcaggtctg tggcaaagaa acaccccaag 1140 acatgggtgc actacattgc 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gtccagcacc acatggcacc caccaaggat 540 gagtttgact gcaaggcctg ggcatacttc tctgatgtgg acctggagaa agatgtgcac 600 tctggcctga ttggcccact cctggtctgc cacaccaaca ccctgaaccc tgcacatgga 660 aggcaagtga ctgtgcagga gtttgccctc ttcttcacca tctttgatga aaccaagtca 720 tggtacttca ctgagaacat ggagagaaac tgcagagcac catgcaacat tcagatggaa 780 gaccccacct tcaaggagaa ctacaggttc catgccatca atggctacat catggacacc 840 ctgcctgggc ttgtcatggc acaggaccag agaatcagat ggtacctgct ttctatggga 900 tccaatgaga acattcactc catccacttc tctgggcatg tcttcactgt gagaaagaag 960 gaggaataca agatggccct gtacaacctc taccctgggg tctttgagac tgtggagatg 1020 ctgccctcca aagctggcat ctggagggtg gaatgcctca ttggggagca cctgcatgct 1080 ggcatgtcaa ccctgttcct ggtctacagc aacaagtgcc agacacccct gggaatggcc 1140 tctggccaca tcagggactt ccagatcact gcctctggcc agtatggcca gtgggcaccc 1200 aaactggcca ggctccacta ctctggctcc atcaatgcat ggtcaaccaa ggagccattc 1260 tcttggatca aggtggacct gctggcaccc atgatcattc atggcatcaa gacacagggg 1320 gcaagacaga aattctcctc tctgtacatc tcacagttca 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gagaattcac 4260 ccccagtctt gggtccacca gattgccctg agaatggaag tcctgggatg tgaggcacaa 4320 gacctgtact ga 4332 <210> 27 <211> 4368 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 27 atgcagattg agctgtccac ctgcttcttt ctgtgcctgc tgagattctg cttctctgcc 60 accaggagat actacctggg ggctgtggaa ctttcttggg actacatgca gtctgacctg 120 ggagagctgc ctgtggatgc caggttccca cccagagtgc ccaagtcctt cccattcaac 180 acctctgtgg tctacaagaa gacactcttt gtggaattca ctgaccacct gttcaacatt 240 gcaaaaccca gaccaccctg gatgggactc ctgggaccca ccattcaggc tgaggtgtat 300 gacactgtgg tcatcaccct caagaacatg gcatcccacc ctgtgtctct gcatgctgtg 360 ggagtctcat actggaaagc ctctgaaggg gctgagtatg atgaccagac atcccagaga 420 gagaaagagg atgacaaggt gttccctggg ggatctcaca cctatgtgtg gcaagtcctc 480 aaggagaatg gacccatggc atctgaccca ctctgcctga catactccta cctttctcat 540 gtggacctgg tcaaggacct caactctgga ctgattgggg cactgctggt gtgcagggaa 600 ggatccctgg ccaaggagaa aacccagaca ctgcacaagt tcattctcct 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1500 gatgtcaggc ccctgtacag caggagactg ccaaaagggg tgaaacacct caaggacttc 1560 cccattctgc ctggagagat cttcaagtac aagtggactg tcactgtgga ggatggacca 1620 acaaagtctg accccaggtg cctcaccaga tactactcct cttttgtgaa catggagaga 1680 gacctggcat ctggactgat tggaccactg ctcatctgct acaaggagtc tgtggaccag 1740 agaggcaacc agatcatgtc tgacaagaga aatgtgattc tgttctctgt ctttgatgag 1800 aacagatcat ggtacctgac tgagaacatt cagagattcc tgcccaaccc tgctggggtg 1860 caactggaag accctgagtt ccaggcaagc aacatcatgc actccatcaa tggctatgtg 1920 tttgactctc tccagctttc tgtctgcctg catgaggtgg cctactggta cattctttct 1980 attggggcac aaactgactt cctttctgtc ttcttctctg gatacacctt caagcacaag 2040 atggtgtatg aggacaccct gacactcttc ccattctctg gggaaactgt gttcatgagc 2100 atggagaacc ctggactgtg gattctggga tgccacaact ctgacttcag aaacagggga 2160 atgactgcac tgctcaaagt ctcctcctgt gacaagaaca ctggggacta ctatgaggac 2220 tcttatgagg acatctctgc ctacctgctc agcaagaaca atgccattga gcccagaagc 2280 ttctctcaga attccagaca ccccagcacc agggagatca ccaggacaac cctccagtct 2340 gaccaggaag agattgacta tgatgacacc atttctgtgg agatgaagaa ggaggacttt 2400 gacatctatg atgaggacga gaaccagtct ccaagatcat tccagaagaa gacaagacac 2460 tacttcattg ctgctgtgga aagactgtgg gactatggca tgtcttcctc tccccatgtc 2520 ctcaggaaca gggcacagtc tggctctgtg ccacagttca agaaagtggt cttccaggag 2580 ttcactgatg gctcattcac ccagcccctg tacagagggg aactgaatga gcacctggga 2640 ctcctgggac catacatcag ggctgaggtg gaagacaaca tcatggtgac attcagaaac 2700 caggcctcca ggccctacag cttctactct tccctcatca gctatgagga agaccagaga 2760 caaggggctg agccaagaaa gaactttgtg aaacccaatg aaaccaagac ctacttctgg 2820 aaagtccagc accacatggc acccaccaag gatgagtttg actgcaaggc ctgggcatac 2880 ttctctgatg tggacctgga gaaagatgtg cactctggcc tgattggccc actcctggtc 2940 tgccacacca acaccctgaa ccctgcacat ggaaggcaag tgactgtgca ggagtttgcc 3000 ctcttcttca ccatctttga tgaaaccaag tcatggtact tcactgagaa catggagaga 3060 aactgcagag caccatgcaa cattcagatg gaagacccca ccttcaagga gaactacagg 3120 ttccatgcca tcaatggcta catcatggac accctgcctg ggcttgtcat ggcacaggac 3180 cagagaatca gatggtacct gctttctatg ggatccaatg agaacattca ctccatccac 3240 ttctctgggc atgtcttcac tgtgagaaag aaggaggaat acaagatggc cctgtacaac 3300 ctctaccctg gggtctttga gactgtggag atgctgccct ccaaagctgg catctggagg 3360 gtggaatgcc tcattgggga gcacctgcat gctggcatgt caaccctgtt cctggtctac 3420 agcaacaagt gccagacacc cctgggaatg gcctctggcc acatcaggga cttccagatc 3480 actgcctctg gccagtatgg ccagtgggca cccaaactgg ccaggctcca ctactctggc 3540 tccatcaatg catggtcaac caaggagcca ttctcttgga tcaaggtgga cctgctggca 3600 cccatgatca ttcatggcat caagacacag ggggcaagac agaaattctc ctctctgtac 3660 atctcacagt tcatcatcat gtactctctg gatggcaaga agtggcagac atacagaggc 3720 aactccactg gcaccctcat ggtcttcttt ggcaatgtgg acagctctgg catcaagcac 3780 aacatcttca accctcccat cattgccaga tacatcaggc tgcaccccac ccactactca 3840 atcagatcaa ccctcaggat ggaactgatg ggatgtgacc tgaactcctg ctcaatgccc 3900 ctgggaatgg agagcaaggc catttctgat gcccagatca ctgcatcctc ttacttcacc 3960 aacatgtttg ccacctggtc accatcaaaa gccaggctgc acctccaggg aagaagcaat 4020 gcctggagac cccaggtcaa caacccaaag gaatggctgc aagtggactt ccagaagaca 4080 atgaaagtca ctggggtgac aacccagggg gtcaagtctc tgctcacctc aatgtatgtg 4140 aaggagttcc tgatctcttc ctcacaggat ggccaccagt ggacactctt cttccagaat 4200 ggcaaagtca aggtgttcca gggcaaccag gactctttca cacctgtggt gaactcactg 4260 gacccccccc tcctgacaag atacctgaga attcaccccc agtcttgggt ccaccagatt 4320 gccctgagaa tggaagtcct gggatgtgag gcacaagacc tgtactga 4368 <210> 28 <211> 4332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 28 atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc 60 accaggagat actacctggg cgccgtggag ctgagctggg actacatgca gtctgacctg 120 ggcgagctgc ctgtggacgc caggttcccc cccagagtgc ccaagagctt ccccttcaac 180 acctcagtgg tgtacaagaa gaccctgttc gtggagttca ccgaccacct gttcaacatc 240 gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccca ccatccaggc cgaggtgtac 300 gacaccgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ccgtgagcct gcacgccgtg 360 ggcgtgagct actggaaggc ctctgagggc gccgagtatg acgaccagac cagccagagg 420 gagaaggagg acgacaaggt gttccccggc ggcagccaca cctacgtgtg gcaggtgctg 480 aaggagaacg gccccatggc cagcgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccac 540 gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgatcggcg ccctgctggt gtgcagggag 600 ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gttcgccgtg 660 ttcgatgagg gcaagagctg gcacagcgag accaagaaca gcctgatgca ggacagggat 720 gccgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacaccgtga acggctacgt gaacaggagc 780 ctgcccggcc tgatcggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcacgtgat cggcatgggc 840 accacccccg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca ccttcctggt gaggaaccac 900 aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctga ccgcccagac cctgctgatg 960 gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc accagcacga cggcatggag 1020 gcctacgtga aggtggacag ctgccccgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaacgag 1080 gaggccgagg actatgatga tgacctgacc gactctgaga tggacgtggt gaggtttgat 1140 gatgacaaca gccccagctt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca ccccaagacc 1200 tgggtgcact acatcgccgc cgaggaggag gactgggact acgcccccct ggtgctggcc 1260 cccgacgaca ggagctacaa gagccagtac ctgaacaacg gcccccagag gatcggcagg 1320 aagtacaaga aggtcagatt catggcctac accgacgaga ccttcaagac cagggaggcc 1380 atccagcacg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtacg gcgaggtggg cgacaccctg 1440 ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tctaccccca cggcatcacc 1500 gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaagggcg tgaagcacct gaaggacttc 1560 cccatcctgc ccggcgagat cttcaagtac aagtggaccg tgaccgtgga ggatggcccc 1620 accaagtctg accccaggtg cctgaccagg tactacagca gcttcgtgaa catggagagg 1680 gacctggcct ctggcctgat cggccccctg ctgatctgct acaaggagag cgtggaccag 1740 aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aacgtgatcc tgttctctgt gttcgatgag 1800 aacaggagct ggtatctgac cgagaacatc cagaggttcc tgcccaaccc cgccggcgtg 1860 cagctggagg accccgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa cggctacgtg 1920 ttcgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg cacgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980 atcggcgccc agaccgactt cctgtctgtg ttcttctctg gctacacctt caagcacaag 2040 atggtgtacg aggacaccct gaccctgttc cccttcagcg gcgagaccgt gttcatgagc 2100 atggagaacc ccggcctgtg gatcctgggc tgccacaaca gcgacttcag gaacaggggc 2160 atgaccgccc tgctgaaagt cagcagctgc gacaagaaca ccggcgacta ctacgaggac 2220 agctacgagg acatcagcgc ctacctgctg agcaagaaca acgccatcga gcccagggag 2280 atcaccagga ccaccctgca gagcgaccag gaggagatcg actatgatga caccatcagc 2340 gtggagatga agaaggagga cttcgacatc tacgacgagg acgagaacca gagccccagg 2400 agcttccaga agaagaccag gcactacttc atcgccgccg tggagaggct gtgggactat 2460 ggcatgagca gcagccccca cgtgctgagg aacagggccc agagcggcag cgtgccccag 2520 ttcaagaagg tggtgttcca ggagttcacc gacggcagct tcacccagcc cctgtacaga 2580 ggcgagctga acgagcacct gggcctgctg ggcccctaca tcagggccga ggtggaggac 2640 aacatcatgg tgaccttcag gaaccaggcc agcaggccct acagcttcta cagcagcctg 2700 atcagctacg aggaggacca gaggcagggc gccgagccca ggaagaactt cgtgaagccc 2760 aacgagacca agacctactt ctggaaggtg cagcaccaca tggcccccac caaggacgag 2820 ttcgactgca aggcctgggc ctacttctct gatgtggacc tggagaagga cgtgcacagc 2880 ggcctgatcg gccccctgct ggtgtgccac accaacaccc tgaaccccgc ccacggcagg 2940 caggtgaccg tgcaggagtt cgccctgttc ttcaccatct tcgacgagac caagagctgg 3000 tacttcaccg agaacatgga gaggaactgc agggccccct gcaacatcca gatggaggac 3060 cccaccttca aggagaacta caggttccac gccatcaacg gctacatcat ggacaccctg 3120 cccggcctgg tgatggccca ggaccagagg atcaggtggt atctgctgag catgggcagc 3180 aacgagaaca tccacagcat ccacttcagc ggccacgtgt tcaccgtgag gaagaaggag 3240 gagtacaaga tggccctgta caacctgtac cccggcgtgt tcgagaccgt ggagatgctg 3300 cccagcaagg ccggcatctg gagggtggag tgcctgatcg gcgagcacct gcacgccggc 3360 atgagcaccc tgttcctggt gtacagcaac aagtgccaga cccccctggg catggccagc 3420 ggccacatca gggacttcca gatcaccgcc tctggccagt acggccagtg ggcccccaag 3480 ctggccaggc tgcactacag cggcagcatc aacgcctgga gcaccaagga gcccttcagc 3540 tggatcaagg tggacctgct ggcccccatg atcatccacg gcatcaagac ccagggcgcc 3600 aggcagaagt tcagcagcct gtacatcagc cagttcatca tcatgtacag cctggacggc 3660 aagaagtggc agacctacag gggcaacagc accggcaccc tgatggtgtt cttcggcaac 3720 gtggacagca gcggcatcaa gcacaacatc ttcaaccccc ccatcatcgc caggtacatc 3780 aggctgcacc ccacccacta cagcatcagg agcaccctgc ggatggaact gatgggctgc 3840 gacctgaaca gctgcagcat gcccctgggc atggagagca aggccatctc tgacgcccag 3900 atcaccgcca gcagctactt caccaacatg ttcgccacct ggagccccag caaggccagg 3960 ctgcacctgc agggcaggag caacgcctgg aggccccagg tgaacaaccc caaggagtgg 4020 ctgcaggtgg acttccagaa gaccatgaag gtgaccggcg tgaccaccca gggcgtgaag 4080 agcctgctga ccagcatgta cgtgaaggag ttcctgatca gcagcagcca ggacggccac 4140 cagtggaccc tgttcttcca gaacggcaaa gtgaaggtgt tccagggcaa ccaggacagc 4200 ttcacccccg tggtgaacag cctggacccc cccctgctga ccaggtatct gaggatccac 4260 ccccagagct gggtgcacca gatcgccctg agaatggaag tgctgggatg cgaggcccag 4320 gacctgtact ga 4332 <210> 29 <211> 4368 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 29 atgcagattg agctgagcac ctgcttcttc ctgtgcctgc tgaggttctg cttctctgcc 60 accaggagat actacctggg cgccgtggag ctgagctggg actacatgca gtctgacctg 120 ggcgagctgc ctgtggacgc caggttcccc cccagagtgc ccaagagctt ccccttcaac 180 acctcagtgg tgtacaagaa gaccctgttc gtggagttca ccgaccacct gttcaacatc 240 gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccca ccatccaggc cgaggtgtac 300 gacaccgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ccgtgagcct gcacgccgtg 360 ggcgtgagct actggaaggc ctctgagggc gccgagtatg acgaccagac cagccagagg 420 gagaaggagg acgacaaggt gttccccggc ggcagccaca cctacgtgtg gcaggtgctg 480 aaggagaacg gccccatggc cagcgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccac 540 gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgatcggcg ccctgctggt gtgcagggag 600 ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gttcgccgtg 660 ttcgatgagg gcaagagctg gcacagcgag accaagaaca gcctgatgca ggacagggat 720 gccgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacaccgtga acggctacgt gaacaggagc 780 ctgcccggcc tgatcggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcacgtgat cggcatgggc 840 accacccccg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca ccttcctggt gaggaaccac 900 aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctga ccgcccagac cctgctgatg 960 gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc accagcacga cggcatggag 1020 gcctacgtga aggtggacag ctgccccgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaacgag 1080 gaggccgagg actatgatga tgacctgacc gactctgaga tggacgtggt gaggtttgat 1140 gatgacaaca gccccagctt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca ccccaagacc 1200 tgggtgcact acatcgccgc cgaggaggag gactgggact acgcccccct ggtgctggcc 1260 cccgacgaca ggagctacaa gagccagtac ctgaacaacg gcccccagag gatcggcagg 1320 aagtacaaga aggtcagatt catggcctac accgacgaga ccttcaagac cagggaggcc 1380 atccagcacg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtacg gcgaggtggg cgacaccctg 1440 ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tctaccccca cggcatcacc 1500 gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaagggcg tgaagcacct gaaggacttc 1560 cccatcctgc ccggcgagat cttcaagtac aagtggaccg tgaccgtgga ggatggcccc 1620 accaagtctg accccaggtg cctgaccagg tactacagca gcttcgtgaa catggagagg 1680 gacctggcct ctggcctgat cggccccctg ctgatctgct acaaggagag cgtggaccag 1740 aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aacgtgatcc tgttctctgt gttcgatgag 1800 aacaggagct ggtatctgac cgagaacatc cagaggttcc tgcccaaccc cgccggcgtg 1860 cagctggagg accccgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa cggctacgtg 1920 ttcgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg cacgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980 atcggcgccc agaccgactt cctgtctgtg ttcttctctg gctacacctt caagcacaag 2040 atggtgtacg aggacaccct gaccctgttc cccttcagcg gcgagaccgt gttcatgagc 2100 atggagaacc ccggcctgtg gatcctgggc tgccacaaca gcgacttcag gaacaggggc 2160 atgaccgccc tgctgaaagt cagcagctgc gacaagaaca ccggcgacta ctacgaggac 2220 agctacgagg acatcagcgc ctacctgctg agcaagaaca acgccatcga gcccaggagc 2280 ttcagccaga actccagaca ccccagcacc agggagatca ccaggaccac cctgcagagc 2340 gaccaggagg agatcgacta tgatgacacc atcagcgtgg agatgaagaa ggaggacttc 2400 gacatctacg acgaggacga gaaccagagc cccaggagct tccagaagaa gaccaggcac 2460 tacttcatcg ccgccgtgga gaggctgtgg gactatggca tgagcagcag cccccacgtg 2520 ctgaggaaca gggcccagag cggcagcgtg ccccagttca agaaggtggt gttccaggag 2580 ttcaccgacg gcagcttcac ccagcccctg tacagaggcg agctgaacga gcacctgggc 2640 ctgctgggcc cctacatcag ggccgaggtg gaggacaaca tcatggtgac cttcaggaac 2700 caggccagca ggccctacag cttctacagc agcctgatca gctacgagga ggaccagagg 2760 cagggcgccg agcccaggaa gaacttcgtg aagcccaacg agaccaagac ctacttctgg 2820 aaggtgcagc accacatggc ccccaccaag gacgagttcg actgcaaggc ctgggcctac 2880 ttctctgatg tggacctgga gaaggacgtg cacagcggcc tgatcggccc cctgctggtg 2940 tgccacacca acaccctgaa ccccgcccac ggcaggcagg tgaccgtgca ggagttcgcc 3000 ctgttcttca ccatcttcga cgagaccaag agctggtact tcaccgagaa catggagagg 3060 aactgcaggg ccccctgcaa catccagatg gaggacccca ccttcaagga gaactacagg 3120 ttccacgcca tcaacggcta catcatggac accctgcccg gcctggtgat ggcccaggac 3180 cagaggatca ggtggtatct gctgagcatg ggcagcaacg agaacatcca cagcatccac 3240 ttcagcggcc acgtgttcac cgtgaggaag aaggaggagt acaagatggc cctgtacaac 3300 ctgtaccccg gcgtgttcga gaccgtggag atgctgccca gcaaggccgg catctggagg 3360 gtggagtgcc tgatcggcga gcacctgcac gccggcatga gcaccctgtt cctggtgtac 3420 agcaacaagt gccagacccc cctgggcatg gccagcggcc acatcaggga cttccagatc 3480 accgcctctg gccagtacgg ccagtgggcc cccaagctgg ccaggctgca ctacagcggc 3540 agcatcaacg cctggagcac caaggagccc ttcagctgga tcaaggtgga cctgctggcc 3600 cccatgatca tccacggcat caagacccag ggcgccaggc agaagttcag cagcctgtac 3660 atcagccagt tcatcatcat gtacagcctg gacggcaaga agtggcagac ctacaggggc 3720 aacagcaccg gcaccctgat ggtgttcttc ggcaacgtgg acagcagcgg catcaagcac 3780 aacatcttca acccccccat catcgccagg tacatcaggc tgcaccccac ccactacagc 3840 atcaggagca ccctgcggat ggaactgatg ggctgcgacc tgaacagctg cagcatgccc 3900 ctgggcatgg agagcaaggc catctctgac gcccagatca ccgccagcag ctacttcacc 3960 aacatgttcg ccacctggag ccccagcaag gccaggctgc acctgcaggg caggagcaac 4020 gcctggaggc cccaggtgaa caaccccaag gagtggctgc aggtggactt ccagaagacc 4080 atgaaggtga ccggcgtgac cacccagggc gtgaagagcc tgctgaccag catgtacgtg 4140 aaggagttcc tgatcagcag cagccaggac ggccaccagt ggaccctgtt cttccagaac 4200 ggcaaagtga aggtgttcca gggcaaccag gacagcttca cccccgtggt gaacagcctg 4260 gacccccccc tgctgaccag gtatctgagg atccaccccc agagctgggt gcaccagatc 4320 gccctgagaa tggaagtgct gggatgcgag gcccaggacc tgtactga 4368 <210> 30 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His Gln Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 24 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 31 Ser Phe Ala Gln Asn Ser Arg Pro Pro Ser Ala Ser Ala Pro Lys Pro 1 5 10 15 Pro Val Leu Arg Arg His Gln Arg 20 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Sus sp. <400> 32 Ser Phe Ser Gln Asn Ser Arg His Gln Ala Tyr Arg Tyr Arg Arg Gly 1 5 10 15

Claims (49)

  1. CS01-FL-NA와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)와 최소한 99% 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 청구항 1에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 인자 VIII 폴리펩티드는 경쇄, 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 폴리펩티드 링커를 포함하고,
    여기서 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄는 CS01-HC-NA (서열 번호: 24)와 최소한 95% 동일성을 갖는 첫 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고;
    여기서 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄는 CS01-LC-NA (서열 번호: 25)와 최소한 95% 동일성을 갖는 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고; 그리고
    여기서 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 청구항 4에 있어서, 폴리펩티드 링커는 BDLO01 (서열 번호: 5)과 최소한 95% 동일성을 갖는 세 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 청구항 4 또는 5에 있어서,
    첫 번째 뉴클레오티드 서열은 CS01-HC-NA (서열 번호: 24)와 최소한 99% 동일성을 갖고; 그리고
    두 번째 뉴클레오티드 서열은 CS01-LC-NA (서열 번호: 25)와 최소한 99% 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  7. 청구항 4 또는 5에 있어서,
    첫 번째 뉴클레오티드 서열은 CS01-HC-NA (서열 번호: 24)이고; 그리고
    두 번째 뉴클레오티드 서열 CS01-LC-NA (서열 번호: 25)인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  8. CS04-FL-NA (서열 번호: 1)와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 청구항 8에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)와 최소한 99% 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 청구항 8에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 CS04-FL-NA (서열 번호: 1)인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 인자 VIII 폴리펩티드는 경쇄, 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 폴리펩티드 링커를 포함하고,
    여기서 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄는 CS04-HC-NA (서열 번호: 3)와 최소한 95% 동일성을 갖는 첫 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고;
    여기서 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄는 CS04-LC-NA (서열 번호: 4)와 최소한 95% 동일성을 갖는 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고; 그리고
    여기서 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 청구항 11에 있어서, 폴리펩티드 링커는 BDLO04 (서열 번호: 6)와 최소한 95% 동일성을 갖는 세 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  13. 청구항 11 또는 12에 있어서,
    첫 번째 뉴클레오티드 서열은 CS04-HC-NA (서열 번호: 3)와 최소한 99% 동일성을 갖고; 그리고
    두 번째 뉴클레오티드 서열은 CS04-LC-NA (서열 번호: 4)와 최소한 99% 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  14. 청구항 11 또는 12에 있어서,
    첫 번째 뉴클레오티드 서열은 CS04-HC-NA (서열 번호: 3)이고; 그리고
    두 번째 뉴클레오티드 서열은 CS04-LC-NA (서열 번호: 4)인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  15. CS23-FL-NA (서열 번호:20)와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  16. 청구항 15에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)와 최소한 99% 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 청구항 15에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 CS23-FL-NA (서열 번호: 20)인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  18. 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 인자 VIII 폴리펩티드는 경쇄, 중쇄, 그리고 중쇄의 C 말단을 경쇄의 N 말단에 연결하는 폴리펩티드 링커를 포함하고,
    여기서 인자 VIII 폴리펩티드의 중쇄는 CS23-HC-NA (서열 번호: 22)와 최소한 95% 동일성을 갖는 첫 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고;
    여기서 인자 FVIII 폴리펩티드의 경쇄는 CS23-LC-NA (서열 번호: 23)와 최소한 95% 동일성을 갖는 두 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되고; 그리고
    여기서 폴리펩티드 링커는 퓨린 개열 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 청구항 11에 있어서, 폴리펩티드 링커는 BDLO23 (서열 번호: 7)과 최소한 95% 동일성을 갖는 세 번째 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  20. 청구항 18 또는 19에 있어서,
    첫 번째 뉴클레오티드 서열은 CS23-HC-NA (서열 번호: 22)와 최소한 99% 동일성을 갖고; 그리고
    두 번째 뉴클레오티드 서열은 CS23-LC-NA (서열 번호: 23)와 최소한 99% 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  21. 청구항 18 또는 19에 있어서,
    첫 번째 뉴클레오티드 서열은 CS23-HC-NA (서열 번호: 22)이고; 그리고
    두 번째 뉴클레오티드 서열은 CS23-LC-NA (서열 번호: 23)인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  22. 청구항 1 내지 21 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)와 최소한 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  23. 청구항 1 내지 21 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 CS01-FL-AA (서열 번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  24. CS01-SC1-NA (서열 번호: 26)와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  25. CS04-SC1-NA (서열 번호: 9)와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  26. 청구항 24 또는 25에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 CS01-SC1-AA (서열 번호: 10)와 최소한 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  27. 청구항 24 또는 25에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 CS01-SC1-AA (서열 번호: 10)의 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  28. CS01-SC2-NA (서열 번호: 27)와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  29. CS04-SC2-NA (서열 번호: 11)와 최소한 95% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  30. 청구항 28 또는 29에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 CS01-SC2-AA (서열 번호: 12)와 최소한 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  31. 청구항 28 또는 29에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 CS01-SC2-AA (서열 번호: 12)의 아미노산 서열을 포함하는 단일 사슬 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  32. CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA로 구성된 군에서 선택되는 서열과 최소한 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  33. CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA로 구성된 군에서 선택되는 서열과 최소한 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  34. CS01-HC-NA, CS01-LC-NA, CS04-HC-NA, CS04-LC-NA, CS23-HC-NA, CS23-LC-NA로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  35. 청구항 32 내지 34 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 CS01-FL-NA (서열 번호: 13)와 최소한 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  36. 청구항 32 내지 34 중에서 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 CS01-FL-AA (서열 번호: 2)의 아미노산 서열을 포함하는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  37. 청구항 1 내지 36 중에서 어느 한 항에 있어서, 인코딩된 인자 VIII 폴리펩티드는 2개 연속 아미노산 사이에 배치된 글리코실화 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  38. 청구항 1 내지 37 중에서 어느 한 항에 있어서, 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터 요소를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  39. 청구항 38에 있어서, 프로모터 요소는 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 상류에 간-특이적 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  40. 청구항 39에 있어서, 간-특이적 프로모터 서열 및 인자 VIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 사이에 배치된 인트론 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  41. 청구항 1 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 벡터.
  42. 청구항 1 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 입자.
  43. 청구항 1 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 입자로 감염된 숙주 세포.
  44. 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 입자를 생산하기 위한 방법에 있어서, 청구항 1 내지 40 중에서 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포유류 숙주 세포 내로 도입하는 것을 포함하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드는 포유류 숙주 세포에서 복제에 적격성인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. A형 혈우병을 치료하기 위한 방법에 있어서, 청구항 42에 따른 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 입자를 치료가 필요한 환자에 투여하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 숙주 세포를 형질도입하기 위한 방법에 있어서, 숙주 세포를 청구항 42에 따른 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 입자와 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. A형 혈우병을 치료하기 위한 청구항 42에 따른 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 입자.
  48. 숙주 세포를 형질도입하기 위한 청구항 42에 따른 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 입자.
  49. A형 혈우병을 치료하기 위한 약제의 제조에서 청구항 42에 따른 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 입자의 용도.
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