TW201723180A - 用於ａ型血友病基因治療之編碼表現增加之重組ｆｖｉｉｉ變異體之病毒載體 - Google Patents

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Abstract

本發明尤其提供編碼因子VIII變異體之密碼子經改變聚核苷酸以在哺乳動物細胞中表現。在一些實施例中，本發明亦提供用於治療A型血友病之哺乳動物基因治療載體及方法。

Description

用於A型血友病基因治療之編碼表現增加之重組FVIII變異體之病毒載體
血液凝固經由稱作凝固級聯之相互依賴生物化學反應之複雜及動態生物路徑進行。在級聯中凝血因子VIII(FVIII)為一關鍵組分。因子VIII經招募至出血位點，且形成具有活化因子IX(FIXa)及因子X(FX)之Xase複合物。Xase複合物活化FX，其反過來將凝血酶原活化成凝血酶，該凝血酶隨後活化凝固級聯中之其他組分以產生穩定凝塊(綜述於Saenko等人，Trends Cardiovasc.Med.,9：185-192(1999)；Lenting等人，Blood,92：3983-3996(1998)中)。
A型血友病為先天性X連鎖出血病症，其特徵在於缺乏因子VIII活性。減弱之因子VIII活性抑制凝固級聯中之正反饋迴路。此造成不完全凝固，其顯示為持續時間增加之出血發作、廣泛擦傷、口腔及鼻自發性出血、關節僵硬及慢性疼痛，且在嚴重情況下可能顯示為內部出血及貧血(Zhang等人，Clinic.Rev.Allerg.Immunol.,37：114-124(2009))。
習知地，A型血友病由因子VIII替代治療來治療，該治療由向患有A 型血友病之個體投與因子VIII蛋白(例如，血漿衍生或重組產生之因子VIII)組成。因子VIII經預防性投與以回應於急性出血發作而預防或減少出血發作之頻率，及/或在手術前後投與以處理手術期間之出血。然而，因子VIII替代治療存在若干非所要特徵。
首先，因子VIII替代治療用以治療或處理A型血友病，但不治癒基本之因子VIII缺乏。歸因於此，患有A型血友病之個體在其生命週期裏需要因子VIII替代治療。連續治療為昂貴的且需要個體維持嚴格的順應性，因為對於患有嚴重A型血友病之個體而言，僅少許預防性劑量之缺失就可具有嚴重後果。
第二，因為因子VIII在活體內具有相對短之半衰期，習知預防性因子VIII替代治療需要每兩天或三天投與。此為個體帶來在其全部生命中維持順應性之負擔。雖然第三代「長效」因子VIII藥物可減少投與頻率，但使用此等藥物之預防性因子FVIII替代治療仍然需要永久地每月、每週或更頻繁地投與。舉例而言，使用ELOCTATETM[抗血友病因子(重組型)，Fc融合蛋白]之預防性治療需要每三至五天投與(ELOCTATETM Prescribing Information,Biogen Idec Inc.,(2015))。此外，尚未完全理解化學改性生物製品(例如，聚乙二醇化多肽)之長期作用。
第三，15%與30%之間的接受因子VIII替代治療之所有個體形成抗因子VIII抑制劑抗體，顯示該治療效率低下。因子VIII繞道治療(例如，投與血漿衍生或重組產生之凝血酶原複合物濃縮物)可用以治療形成抑制劑抗體之個體之血友病。然而，因子VIII繞道治療不如因子VIII替代治療有效(Mannucci P.M.,J Thromb Haemost.,1(7)：1349-55(2003))，且可能與增加之心臟血管併發症風險相關(Luu及Ewenstein,Haemophilia，增刊10 2：10-16(2004))。
體細胞基因治療對於治療A型血友病具有較大前景，因為其修補基本表現不足之功能因子VIII活性(例如，歸因於錯義或無義突變)，而非向個體提供因子VIII活性之單次劑量。由於此相較於因子VIII替代治療在作用機制方面存在差異，因此單次投與因子VIII基因治療載體可為個體提供因子VIII若干年，降低了治療成本且排除持續患者順應性之需要。
已有效地使用凝血因子IX(FIX)基因治療來治療患有B型血友病之個體，該B型血友病為相關血液凝固病狀，其特徵在於因子IX活性減弱(Manno C.S.等人，Nat Med.,12(3)：342-47(2006))。然而，因子VIII基因治療呈現若干獨特之難題。舉例而言，全長野生型因子VIII多肽(2351個胺基酸；UniProt寄存編號P00451)比全長野生型因子IX多肽(461個胺基酸；UniProt寄存編號P00740)大五倍。因而，野生型因子VIII之編碼序列為7053個鹼基對，其太大而不能封裝於習知AAV基因治療載體中。此外，據報導因子VIII之B域缺失變異體(BDD-FVIII)之重組表現較差。因而，若干小組已嘗試改變BDD-FVIII構築體之密碼子使用，但成功有限。
因此，需要因子VIII變異體，其編碼序列更有效封裝於基因治療載體中且經由基因治療載體傳遞。亦需要更有效表現因子VIII的合成之密碼子經改變核酸。此類因子VIII變異體及密碼子經改變核酸使得可改良因子VIII缺乏(例如，A型血友病)之治療。上文缺乏及與因子VIII缺乏(例如，A型血友病)之治療相關之其他問題由所揭示密碼子經改變因子VIII變異體降低或消除。
根據一些實施例，本發明提供編碼因子VIII變異體之核酸，其與因 子VIII重鏈(例如，CS01-HC-NA、CS04-HC-NA或CS23-HC-NA)及輕鏈(CS01-LC-NA、CS04-LC-NA或CS23-LC-NA)之所揭示密碼子經改變序列具有高序列一致性。在一些實施例中，此等核酸在編碼因子VIII重鏈及輕鏈之序列之間進一步包括編碼替代天然因子VIII B域之連接子序列(例如，包含弗林蛋白酶(furin)裂解位點之連接子序列)的序列。
在一個態樣中，本發明提供一種包括編碼因子VIII多肽之核苷酸序列之聚核苷酸。因子VIII多肽包括輕鏈、重鏈及接合重鏈C端與輕鏈N端之多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)具有至少95%一致性之第一核苷酸序列編碼。因子FVIII多肽之輕鏈由與CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)具有至少95%一致性之第二核苷酸序列編碼。多肽連接子包含弗林蛋白酶裂解位點。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，多肽連接子由與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少95%一致性之第三核苷酸序列編碼。
在一個態樣中，本發明提供一種包括編碼因子VIII多肽之核苷酸序列之聚核苷酸。因子VIII多肽包括輕鏈、重鏈及接合重鏈C端與輕鏈N端之多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)具有至少95%一致性之第一核苷酸序列編碼。因子FVIII多肽之輕鏈由與CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)具有至少95%一致性之第二核苷酸序列編碼。多肽連接子包含弗林蛋白酶裂解位點。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，多肽連接子由與BDLO01(SEQ ID NO：5)具有至少95%一致性之第三核苷酸序列編碼。
在一個態樣中，本發明提供一種包括編碼因子VIII多肽之核苷酸序列之聚核苷酸。因子VIII多肽包括輕鏈、重鏈及接合重鏈C端與輕鏈N端 之多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22)具有至少95%一致性之第一核苷酸序列編碼。因子FVIII多肽之輕鏈由與CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23)具有至少95%一致性之第二核苷酸序列編碼。多肽連接子包含弗林蛋白酶裂解位點。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，多肽連接子由與BDLO23(SEQ ID NO：7)具有至少95%一致性之第三核苷酸序列編碼。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，編碼因子VIII多肽之重鏈之第一核苷酸序列與各別重鏈序列(例如，CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)、CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)或CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22))具有至少96%一致性，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈之第二核苷酸序列與各別輕鏈序列(例如，CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)、CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)或CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23))具有至少96%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，編碼因子VIII多肽之重鏈之第一核苷酸序列與各別重鏈序列(例如，CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)、CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)或CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22))具有至少97%一致性，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈之第二核苷酸序列與各別輕鏈序列(例如，CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)、CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)或CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23))具有至少97%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，編碼因子VIII多肽之重鏈之第一核苷酸序列與各別重鏈序列(例如，CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)、CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)或CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22))具有至少98%一致性，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈之第二核苷酸序列與各別輕鏈序列(例如，CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)、CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)或CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23))具有至少98%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，編碼因子VIII多肽之重鏈之第一核苷酸序列與各別重鏈序列(例如，CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)、CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)或CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22))具有至少99%一致性，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈之第二核苷酸序列與各別輕鏈序列(例如，CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)、CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)或CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23))具有至少99%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，編碼因子VIII多肽之重鏈之第一核苷酸序列與各別重鏈序列(例如，CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)、CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)或CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22))具有至少99.5%一致性，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈之第二核苷酸序列與各別輕鏈序列(例如，CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)、CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)或CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23))具有至少99.5%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，編碼因子VIII多肽之重鏈之第一核苷酸序列與各別重鏈序列(例如，CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)、CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)或CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22))具有至少99.9%一致性，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈之第二核苷酸序列與各別輕鏈序列(例如，CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)、CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)或CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23))具有至少99.9%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，編碼因子VIII多肽之重鏈之第一核苷酸序列為CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈之第二核苷酸序列為CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，編碼因子VIII多肽之重 鏈之第一核苷酸序列為CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈之第二核苷酸序列為CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，編碼因子VIII多肽之重鏈之第一核苷酸序列為CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22)，且編碼因子FVIII多肽之輕鏈之第二核苷酸序列為CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23)。
在一個態樣中，本發明提供一種包含與CS04-FL-NA具有至少95%一致性之核苷酸序列之聚核苷酸，其中聚核苷酸編碼因子VIII多肽。
在一個態樣中，本發明提供一種包含與CS01-FL-NA具有至少95%一致性之核苷酸序列之聚核苷酸，其中聚核苷酸編碼因子VIII多肽。
在一個態樣中，本發明提供一種包含與CS23-FL-NA具有至少95%一致性之核苷酸序列之聚核苷酸，其中聚核苷酸編碼因子VIII多肽。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與各別全長聚核苷酸序列(例如，CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)、CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)或CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20))具有至少96%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與各別全長聚核苷酸序列(例如，CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)、CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)或CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20))具有至少97%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與各別全長聚核苷酸序列(例如，CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)、CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)或CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20))具有至少98%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與各別全長聚核苷酸序列(例如，CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)、CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)或CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20))具有至少99%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與各別全長聚核苷酸序列(例如，CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)、CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)或CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20))具有至少99.5%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列具有與各別全長聚核苷酸序列(例如，CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)、CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)或CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20))至少99.9%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列為CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列為CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，聚核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少95%一致性之胺基酸序列之因子VIII多肽。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，聚核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少96%一致性之胺基酸序列之因子VIII多肽。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，聚核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少97%一致性之胺基酸序列之因子VIII多肽。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，聚核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少98%一致性之胺基酸序列之因子 VIII多肽。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，聚核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少99%一致性之胺基酸序列之因子VIII多肽。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，聚核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少99.5%一致性之胺基酸序列之因子VIII多肽。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，聚核苷酸編碼包含與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少99.9%一致性之胺基酸序列之因子VIII多肽。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，聚核苷酸編碼包含CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列的因子VIII多肽。
在一個態樣中，本發明提供一種包含與CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)具有至少95%一致性之核苷酸序列之聚核苷酸，其中聚核苷酸編碼單鏈因子VIII多肽。
在一個態樣中，本發明提供一種包含與CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)具有至少95%一致性之核苷酸序列之聚核苷酸，其中聚核苷酸編碼單鏈因子VIII多肽。
在一個態樣中，本發明提供一種包含與CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)具有至少95%一致性之核苷酸序列之聚核苷酸，其中聚核苷酸編碼單鏈因子VIII多肽。
在一個態樣中，本發明提供一種包含與CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)具有至少95%一致性之核苷酸序列之聚核苷酸，其中聚核苷酸編碼單 鏈因子VIII多肽。
在一個態樣中，本發明提供一種包含與CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)具有至少95%一致性之核苷酸序列之聚核苷酸，其中聚核苷酸編碼單鏈因子VIII多肽。
在一個態樣中，本發明提供一種包含與CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29)具有至少95%一致性之核苷酸序列之聚核苷酸，其中聚核苷酸編碼單鏈因子VIII多肽。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與各別全長聚核苷酸序列(例如，CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)、CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)、CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)、CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)、CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)或CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29))具有至少96%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與各別全長聚核苷酸序列(例如，CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)、CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)、CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)、CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)、CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)或CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29))具有至少97%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與各別全長聚核苷酸序列(例如，CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)、CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)、CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)、CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)、CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)或CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29))具有至少98%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與各別全長 聚核苷酸序列(例如，CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)、CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)、CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)、CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)、CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)或CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29))具有至少99%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與各別全長聚核苷酸序列(例如，CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)、CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)、CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)、CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)、CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)或CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29))具有至少99.5%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與各別全長聚核苷酸序列(例如，CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)、CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)、CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)、CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)、CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)或CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29))具有至少99.9%一致性。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列為CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列為CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列為CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列為CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列為CS23- SC1-NA(SEQ ID NO：28)。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列為CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29)。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與選自由以下各者組成之群之序列具有至少95%一致性：CS01-FL-NA、CS01-HC-NA、CS01-LC-NA、CS04-FL-NA、CS04-HC-NA、CS04-LC-NA、CS23-FL-NA、CS23-HC-NA、CS23-LC-NA、CS01-SC1-NA、CS04-SC1-NA、CS23-SC1-NA、CS01-SC2-NA、CS04-SC2-NA及CS23-SC2-NA。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與選自由以下各者組成之群之序列具有至少96%一致性：CS01-FL-NA、CS01-HC-NA、CS01-LC-NA、CS04-FL-NA、CS04-HC-NA、CS04-LC-NA、CS23-FL-NA、CS23-HC-NA、CS23-LC-NA、CS01-SC1-NA、CS04-SC1-NA、CS23-SC1-NA、CS01-SC2-NA、CS04-SC2-NA及CS23-SC2-NA。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與選自由以下各者組成之群之序列具有至少97%一致性：CS01-FL-NA、CS01-HC-NA、CS01-LC-NA、CS04-FL-NA、CS04-HC-NA、CS04-LC-NA、CS23-FL-NA、CS23-HC-NA、CS23-LC-NA、CS01-SC1-NA、CS04-SC1-NA、CS23-SC1-NA、CS01-SC2-NA、CS04-SC2-NA及CS23-SC2-NA。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與選自由以下各者組成之群之序列具有至少98%一致性：CS01-FL-NA、CS01-HC- NA、CS01-LC-NA、CS04-FL-NA、CS04-HC-NA、CS04-LC-NA、CS23-FL-NA、CS23-HC-NA、CS23-LC-NA、CS01-SC1-NA、CS04-SC1-NA、CS23-SC1-NA、CS01-SC2-NA、CS04-SC2-NA及CS23-SC2-NA。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與選自由以下各者組成之群之序列具有至少99%一致性：CS01-FL-NA、CS01-HC-NA、CS01-LC-NA、CS04-FL-NA、CS04-HC-NA、CS04-LC-NA、CS23-FL-NA、CS23-HC-NA、CS23-LC-NA、CS01-SC1-NA、CS04-SC1-NA、CS23-SC1-NA、CS01-SC2-NA、CS04-SC2-NA及CS23-SC2-NA。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與選自由以下各者組成之群之序列具有至少99.5%一致性：CS01-FL-NA、CS01-HC-NA、CS01-LC-NA、CS04-FL-NA、CS04-HC-NA、CS04-LC-NA、CS23-FL-NA、CS23-HC-NA、CS23-LC-NA、CS01m1-FL-NA、CS01m2-FL-NA、CS01m3-FL-NA、CS01m4-FL-NA、CS01-SC1-NA、CS04-SC1-NA、CS23-SC1-NA、CS01-SC2-NA、CS04-SC2-NA及CS23-SC2-NA。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列與選自由以下各者組成之群之序列具有至少99.5%一致性：CS01-FL-NA、CS01-HC-NA、CS01-LC-NA、CS04-FL-NA、CS04-HC-NA、CS04-LC-NA、CS23-FL-NA、CS23-HC-NA、CS23-LC-NA、CS01-SC1-NA、CS04-SC1-NA、CS23-SC1-NA、CS01-SC2-NA、CS04-SC2-NA及CS23-SC2-NA。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，核苷酸序列選自由以下各者組成之群：CS01-FL-NA、CS01-HC-NA、CS01-LC-NA、CS04-FL-NA、CS04-HC-NA、CS04-LC-NA、CS23-FL-NA、CS23-HC-NA、CS23-LC-NA、CS01-SC1-NA、CS04-SC1-NA、CS23-SC1-NA、CS01-SC2-NA、CS04-SC2-NA及CS23-SC2-NA。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，經編碼因子VIII多肽包含安置於兩種連續胺基酸之間的糖基化多肽。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，聚核苷酸亦包括可操作地連接至編碼因子VIII多肽之聚核苷酸的啟動子元件。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，聚核苷酸亦包括可操作地連接至編碼因子VIII多肽之聚核苷酸的強化子元件。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，聚核苷酸亦包括可操作地連接至編碼因子VIII多肽之聚核苷酸的聚腺苷酸化元件。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，聚核苷酸亦包括以操作方式連接至編碼因子VIII多肽之核苷酸序列的內含子。
在上文所描述之聚核苷酸之一個實施例中，內含子安置於編碼因子VIII多肽之核苷酸序列的啟動子元件與轉譯起始位點(例如，第一編碼ATG)之間。
在另一態樣中，本發明提供一種包括如上文所描述之聚核苷酸之哺乳動物基因治療載體。
在上文所描述之哺乳動物基因治療載體之一個實施例中，哺乳動物基因治療載體為腺相關病毒(AAV)載體。
在上文所描述之哺乳動物基因治療載體之一個實施例中，AAV載體 為AAV-8載體。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療A型血友病之方法，其包括向有需要之患者投與如上文所描述之哺乳動物基因治療載體。
在另一態樣中，本發明提供一種用於治療A型血友病之如上文所描述之哺乳動物基因治療載體。
在另一態樣中，本發明提供如上文所描述之哺乳動物基因治療載體之用途，其用於製造供治療A型血友病用之藥劑。
圖1展示野生型及ReFacto型人類因子VIII蛋白構築體之示意性說明。
圖2A及2B展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之CS04密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：1)(針對全長編碼序列，「CS04-FL-NA」)。
圖3展示根據一些實施例之由CS04密碼子經改變核苷酸序列編碼之因子VIII變異體胺基酸序列(SEQ ID NO：2)(針對全長胺基酸序列，「CS04-FL-AA」)。
圖4展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之重鏈的CS04密碼子經改變核苷酸序列之部分(SEQ ID NO：3)(「CS04-HC-NA」)。
圖5展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之輕鏈的CS04密碼子經改變核苷酸序列之部分(SEQ ID NO：4)(「CS04-LC-NA」)。
圖6展示根據一些實施例之用於B域經取代連接子之例示性編碼序列(SEQ ID NO：5-7)。BDLO01(SEQ ID NO：5)、BDLO04(SEQ ID NO：6)及BDLO23(SEQ ID NO：7)分別為編碼B域經取代連接子之CS01、 CS04及CS23密碼子經改變核苷酸序列的各別部分。
圖7A、7B及7C展示根據一些實施例之含有CS04密碼子經改變核苷酸序列之AAV載體序列(SEQ ID NO：8)(「CS04-AV-NA」)。
圖8A及8B展示根據一些實施例之編碼單鏈因子VIII變異體之CS04△(760-1667)(SPI；CS04△(741-1648),SPE)密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：9)(「CS04-SC1-NA」)。
圖9展示根據一些實施例之由CS01△(760-1667)(SPI；CS01△(741-1648),SPE)、CS04△(760-1667)(SPI；CS04△(741-1648),SPE)及CS23△(760-1667)(SPI；CS23△(741-1648),SPE)密碼子經改變核苷酸序列編碼的因子VIII變異體胺基酸序列(SEQ ID NO：10)(分別為「CS01-SC1-AA」、「CS04-SC1-AA」及「CS23-SC1-AA」)。
圖10A及10B展示根據一些實施例之編碼單鏈因子VIII變異體之CS04△(772-1667)(SPI；CS04△(753-1648),SPE)密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：11)(「CS04-SC2-NA」)。
圖11展示根據一些實施例之由CS01△(772-1667)(SPI；CS01△(753-1648),SPE)、CS04△(772-1667)(SPI；CS04△(753-1648),SPE)及CS23△(772-1667)(SPI；CS23△(753-1648),SPE)密碼子經改變核苷酸序列編碼之因子VIII變異體胺基酸序列(SEQ ID NO：12)(分別為「CS01-SC2-AA」、「CS04-SC2-AA」及「CS23-SC2-AA」)。
圖12A及12B展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之CS01密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：13)(「CS01-FL-NA」)。
圖13A及13B展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之CS08密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：14)(「CS08-FL-NA」)。
圖14A及14B展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之CS10密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：15)(「CS10-FL-NA」)。
圖15A及15B展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之CS11密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：16)(「CS11-FL-NA」)。
圖16A及16B展示根據一些實施例之CS40野生型ReFacto編碼序列(SEQ ID NO：17)(「CS40-FL-NA」)。
圖17A及17B展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之CH25密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：18)(「CH25-FL-NA」)。
圖18展示根據一些實施例之野生型人類因子VIII胺基酸序列(SEQ ID NO：19)(「FVIII-FL-AA」)。
圖19說明藉由將合成Refacto型BDD-FVIII DNA序列經由AscI及NotI限制位點插入載體主鏈pCh-BB01中，選殖pCS40、pCS01、pCS04、pCS08、pCS10、pCS11及pCh25構築體之方案。
圖20展示如藉由瓊脂糖凝膠電泳分析，AAV載體基因組製備物之完整性。色帶1，DNA標記；色帶2，vCS40；色帶3，vCS01；色帶4，vCS04。AAV載體均具有相同大小之基因組，遷移於大約5kb處(右側箭頭)。左側上之刻度指示以千鹼基(kb)為單位之DNA片段之大小。
圖21展示藉由PAGE及銀染色對AAV載體製備物之蛋白質分析。色帶1，蛋白質標記(M)；色帶2，vCS40，色帶3，vCS01；及色帶4，vCS04。構築體均具有相同之由VP1、VP2及VP3(右側箭頭)組成之AAV8衣殼。左側上之刻度指示以千道爾頓(kDa)為單位之蛋白質標記之大小。
圖22A及22B展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之CS23密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：20)(「CS23-FL-NA」)。
圖23展示根據一些實施例之由CS23密碼子經改變核苷酸序列編碼之因子VIII變異體胺基酸序列(SEQ ID NO：21)(「CS23-FL-AA」)。
圖24展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之重鏈的CS23密碼子經改變核苷酸序列之部分(SEQ ID NO：22)(「CS23-HC-NA」)。
圖25展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之輕鏈的CS23密碼子經改變核苷酸序列之部分(SEQ ID NO：23)(「CS23-LC-NA」)。
圖26展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之重鏈的CS01密碼子經改變核苷酸序列之部分(SEQ ID NO：24)(「CS01-HC-NA」)。
圖27展示根據一些實施例之編碼因子VIII變異體之輕鏈的CS01密碼子經改變核苷酸序列之部分(SEQ ID NO：25)(「CS01-LC-NA」)。
圖28A及28B展示根據一些實施例之編碼單鏈因子VIII變異體的CS01△(760-1667)(SPI；CS01△(741-1648),SPE)密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：26)(「CS01-SC1-NA」)。
圖29A及29B展示根據一些實施例之編碼單鏈因子VIII變異體的CS01△(772-1667)(SPI；CS01△(753-1648),SPE)密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：27)(「CS01-SC2-NA」)。
圖30A及30B展示根據一些實施例之編碼單鏈因子VIII變異體的CS23△(760-1667)(SPI；CS23△(741-1648),SPE)密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：28)(「CS23-SC1-NA」)。
圖31A及31B展示根據一些實施例之編碼單鏈因子VIII變異體的CS23△(772-1667)(SPI；CS23△(753-1648),SPE)密碼子經改變核苷酸序列(SEQ ID NO：29)(「CS23-SC2-NA」)。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2015年11月13日提交之美國臨時專利申請案第62/255,323號之優先權，其內容出於所有目的特此以全文引用之方式併入。
序列表
本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。2016年11月7日產生之該ASCII複本命名為008073-5115-WO_SL.txt且大小為183,311個位元組。
I. 引言
基於AAV之基因治療對於治療血友病患者具有較大前景。對於B型血友病，第一臨床資料令人鼓舞的為約10%之FIX水準可維持於至少一些患者中超過1年。然而對於A型血友病，出於多種原因獲得AAV載體之5-10%治療表現水準仍然具挑戰性。首先，因子VIII編碼序列太大而不能用於習知基於AAV之載體。第二，工程改造之B域缺失或截短之因子VIII構築體在活體內有較差表現，即使當密碼子最佳化時亦如此。第三，此等B域缺失或截短之因子VIII變異體構築體在活體內具有短半衰期，加重了較差表現之影響。第四，即使當表現時，FVIII亦不如其他凝血因子(諸如因子IX)般有效地自細胞分泌。
此外，此等難題不能藉由簡單地投與基因治療構築體之更高劑量來解決。根據當前知識，基於AAV之基因治療載體之載體劑量應增加高於2×1012vg/kg體重。此係由於在此類高劑量下，T細胞免疫反應經觸發，其破壞經轉導細胞且因此轉基因表現降低或甚至消除。因此，對於A型血友病患者而言，需要改良FVIII表現之策略來使得FVIII基因治療成為切實可 行之治療選擇。
本發明係關於對解決此等及與因子VIII基因治療相關之其他問題之密碼子經改變因子VIII變異體編碼序列的發現。舉例而言，本文中所揭示之聚核苷酸在哺乳動物細胞中提供明顯改良之表現，且歸因於穩定化之填充相互作用，呈現改良之病毒粒子封裝。在一些實施方案中，此等優勢藉由使用與密碼子經改變CS01、CS04及CS23構築體具有高序列一致性(例如，與CS01-HC、CS04-HC及CS23-HC重鏈編碼序列中之一者具有高序列一致性，且與CS01-LC、CS04-LC及CS23-LC輕鏈編碼序列中之一者具有高序列一致性)之用於因子VIII之重鏈及輕鏈的編碼序列來實現。
在一些實施方案中，由本文中所描述之聚核苷酸編碼之因子VIII分子已藉由截短、刪除或替換野生型B域而縮短。因而，聚核苷酸更適合於經由習知基因治療載體表現因子VIII，該等習知基因治療載體低效地表現更大之多肽，諸如野生型因子VIII。
有利地，本文中顯示CS01、CS04及CS23密碼子經改變因子VIII變異體編碼序列在活體內提供B域缺失之因子VIII構築體的優異表現。舉例而言，在實例2及(錯誤！未發現參考來源)中顯示在因子VIII基因敲除小鼠中，相對於用野生型聚核苷酸序列(SEQ ID NO：17)編碼之相對應CS40構築體，靜脈內投與具有CS01(SEQ ID NO：13)、CS04(SEQ ID NO：1)及CS23(SEQ ID NO：20)編碼序列之基於AAV之基因治療載體使得因子VIII之表現增加18倍、74倍及30倍(表4)。
此外，本文中亦展示CS01及CS04密碼子經改變因子VIII變異體編碼序列提供優異之病毒粒子封裝及病毒產生。舉例而言，在實例1中，當自相同量之細胞集結粒分離時，相對於用野生型聚核苷酸序列編碼之相對應 CS40構築體，顯示含有CS01及CS04構築體之AAV載體構築體提供大5至7倍之病毒產量。
II. 定義
如本文中所使用，除非另外規定，否則以下術語具有歸屬於其之含義。
如本文中所使用，術語「因子VIII」及「FVIII」可互換使用，且係指具有因子VIII活性之任何蛋白質(例如，活性FVIII，常常稱作FVIIIa)或具有因子VIII活性、尤其因子IXa輔因子活性之蛋白質之蛋白質前體(例如，原蛋白或前原蛋白)。在一例示性實施例中，因子VIII多肽係指序列與野生型因子VIII多肽之重鏈及輕鏈具有高序列一致性(例如，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更高)之多肽。在一些實施例中，因子VIII多肽之B域用連接子多肽缺失、截短或替換以減小編碼因子VIII多肽之聚核苷酸的大小。在一例示性實施例中，CS04-FL-AA之胺基酸20-1457構成因子VIII多肽。
野生型因子VIII多肽之非限制性實例包括人類前原因子VIII(例如，GenBank寄存編號AAA52485、CAA25619、AAA58466、AAA52484、AAA52420、AAV85964、BAF82636、BAG36452、CAI41660、CAI41666、CAI41672、CAI43241、CAO03404、EAW72645、AAH22513、AAH64380、AAH98389、AAI11968、AAI11970或AAB61261)、相對應原因子VIII及其天然變異體；豬前原因子VIII(例如，UniProt寄存編號F1RZ36或K7GSZ5)、相對應原因子VIII及其天然變異體；小鼠前原因子VIII(例如，GenBank寄存編號AAA37385、CAM15581、CAM26492或EDL29229)、相對應原因子VIII及其天然變異 體；大鼠前原因子VIII(例如，Genbank寄存編號AAQ21580)、相對應原因子VIII及其天然變異體；大鼠前原因子VIII；及其他哺乳動物因子VIII同系物(例如，猴、猿、倉鼠、天竺鼠等)。
如本文中所使用，因子VIII多肽包括具有因子IX輔因子活性之天然變異體及人工構築體。如本發明中所使用，因子VIII涵蓋保留一些基本因子IX輔因子活性(例如，相對應野生型活性之至少5%、10%、25%、50%、75%或更大)之任何天然變異體、替代序列、同功異構物或突變蛋白質。發現於人類群體中之因子VIII胺基酸變型(相對於FVIII-FL-AA(SEQ ID NO：19))之實例包括(但不限於)S19R、R22T、Y24C、Y25C、L26P/R、E30V、W33G、Y35C/H、G41C、R48C/K、K67E/N、L69P、E72K、D75E/V/Y、P83R、G89D/V、G92A/V、A97P、E98K、V99D、D101G/H/V、V104D、K108T、M110V、A111T/V、H113R/Y、L117F/R、G121S、E129V、G130R、E132D、Y133C、D135G/Y、T137A/I、S138R、E141K、D145H、V147D、Y155H、V159A、N163K、G164D/V、P165S、C172W、S176P、S179P、V181E/M、K185T、D186G/N/Y、S189L、L191F、G193R、L195P、C198G、S202N/R、F214V、L217H、A219D/T、V220G、D222V、E223K、G224W、T252I、V253F、N254I、G255V、L261P、P262L、G263S、G266F、C267Y、W274C、H275L、G278R、G280D、E284K、V285G、E291G/K、T294I、F295L、V297A、N299I、R301C/H/L、A303E/P、I307S、S308L、F312S、T314A/I、A315V、G323E、L326P、L327P/V、C329F、I331V、M339T、E340K、V345A/L、C348R/S/Y、Y365C、R391C/H/P、S392L/P、A394S、W401G、 I405F/S、E409G、W412G/R、K427I、L431F/S、R437P/W、I438F、G439D/S/V、Y442C、K444R、Y450D/N、T454I、F455C、G466E、P470L/R/T、G474E/R/V、E475K、G477V、D478N、T479R、F484C、A488G、R490G、Y492C/H、Y492H、I494T、P496R、G498R、R503H、G513S/V、I522Y、K529E、W532G、P540T、T541S、D544N、R546W、R550C/G/H、S553P、S554C/G、V556D、R560T、D561G/H/Y、I567T、P569R、S577F、V578A、D579A/H、N583S、Q584H/K/R、I585R/T、M586V、D588G/Y、L594Q、S596P、N601D/K、R602G、S603I/R、W604C、Y605H/S、N609I、R612C、N631K/S、M633I、S635N、N637D/I/S、Y639C、L644V、L650F、V653A/M、L659P、A663V、Q664P、F677L、M681I、V682F、Y683C/N、T686R、F698L、M699T/V、M701I、G705V、G710W、N713I、R717L/W、G720D/S、M721I/L、A723T、L725Q、V727F、E739K、Y742C、R795G、P947R、V1012L、E1057K、H1066Y、D1260E、K1289Q、Q1336K、N1460K、L1481P、A1610S、I1698T、Y1699C/F、E1701K、Q1705H、R1708C/H、T1714S、R1715G、A1720V、E1723K、D1727V、Y1728C、R1740G、K1751Q、F1762L、R1768H、G1769R、L1771P、L1775F/V、L1777P、G1779E/R、P1780L、I1782R、D1788H、M1791T、A1798P、S1799H、R1800C/G/H、P1801A、Y1802C、S1803Y、F1804S、L1808F、M1842I、P1844S、T1845P、E1848G、A1853T/V、S1858C、K1864E、D1865N/Y、H1867P/R、G1869D/V、G1872E、P1873R、L1875P、V1876L、C1877R/Y、L1882P、R1888I、E1894G、I1901F、 E1904D/K、S1907C/R、W1908L、Y1909C、A1939T/V、N1941D/S、G1942A、M1945V、L1951F、R1960L/Q、L1963P、S1965I、M1966I/V、G1967D、S1968R、N1971T、H1973L、G1979V、H1980P/Y、F1982I、R1985Q、L1994P、Y1998C、G2000A、T2004R、M2007I、G2013R、W2015C、R2016P/W、E2018G、G2022D、G2028R、S2030N、V2035A、Y2036C、N2038S、2040Y、G2045E/V、I2051S、I2056N、A2058P、W2065R、P2067L、A2070V、S2082N、S2088F、D2093G/Y、H2101D、T2105N、Q2106E/P/R、G2107S、R2109C、I2117F/S、Q2119R、F2120C/L、Y2124C、R2135P、S2138Y、T2141N、M2143V、F2145C、N2148S、N2157D、P2162L、R2169C/H、P2172L/Q/R、T2173A/I、H2174D、R2178C/H/L、R2182C/H/P、M2183R/V、L2185S/W、S2192I、C2193G、P2196R、G2198V、E2200D、I2204T、I2209N、A2211P、A2220P、P2224L、R2228G/L/P/Q、L2229F、V2242M、W2248C/S、V2251A/E、M2257V、T2264A、Q2265R、F2279C/I、I2281T、D2286G、W2290L、G2304V、D2307A、P2319L/S、R2323C/G/H/L、R2326G/L/P/Q、Q2330P、W2332R、I2336F、R2339T、G2344C/D/S及C2345S/Y。因子VIII蛋白亦包括含有轉譯後修飾之多肽。
一般而言，編碼因子VIII之聚核苷酸編碼非活性單鏈多肽(例如，前原蛋白)，其經歷轉譯後處理以形成活性因子VIII蛋白(例如，FVIIIa)。舉例而言，參看圖1，野生型人類因子VIII前原蛋白首先經裂解以釋放經編碼信號肽(未展示)，形成第一單鏈原蛋白(展示為「人類野生型FVIII」)。隨後原蛋白在B域與A3域之間裂解以形成包括因子VIII重鏈(例如，A1及 A2域)及B域之第一多肽，及包括因子VIII輕鏈(例如，包括A3、C1及C3域)之第二多肽。第一多肽進一步裂解以移除B域，且亦分離A1及A2域，其在成熟因子VIIIa蛋白中保持與因子VIII輕鏈相締合。對於因子VIII成熟方法之評述，參見Graw等人，Nat Rev Genet.,6(6)：488-501(2005)，其內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
然而，在一些實施例中，因子VIII多肽為單鏈因子VIII多肽。單鏈因子VIII多肽經工程改造以移除天然裂解位點，且視情況移除、截短或替換因子VIII之B域。因而，其因裂解(不為視情況選用之信號及/或前導肽之裂解)而不成熟，且作為單鏈為活性的。單鏈因子VIII多肽之非限制性實例描述於Zollner等人(Thromb Res,134(1)：125-31(2014))及Donath等人(Biochem J.,312(1)：49-55(1995))中，其揭示內容出於所有目的特此以全文引用之方式併入。
如本文中所使用，術語「因子VIII重鏈」或簡單地「重鏈」係指因子VIII多肽之A1及A2域之聚集體。在一例示性實施例中，CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸20-759構成因子VIII重鏈。
如本文中所使用，術語「因子VIII輕鏈」或簡單地「輕鏈」係指因子VIII多肽之A3、C1及C2域之聚集體。在一例示性實施例中，CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸774-1457構成因子VIII輕鏈。在一些實施例中，因子VIII輕鏈排除在活體內在成熟期間釋放之酸性a3肽。
一般而言，因子VIII重鏈及輕鏈表現為單一多肽鏈，例如連同視情況選用之B域或B域經取代連接子一起。然而在一些實施例中，因子VIII重鏈及因子VIII輕鏈表現為單獨的多肽鏈(例如，共表現)，且經重建以形成因子VIII蛋白(例如，活體內或活體外)。
如本文中所使用，術語「B域經取代連接子」及「因子VIII連接子」可互換使用，且係指野生型因子VIII B域之截短型式(例如，FVIII-FL-AA(SEQ ID NO：19)之胺基酸760-1667)，或經工程改造來替換因子VIII多肽之B域之肽。如本文中所使用，在根據一些實施例之因子VIII變異體多肽中，因子VIII連接子安置於因子VIII重鏈之C端與因子VIII輕鏈之N端之間。B域經取代連接子之非限制性實例揭示於以下各者中：美國專利第4,868,112號、第5,112,950號、第5,171,844號、第5,543,502號、第5,595,886號、第5,610,278號、第5,789,203號、第5,972,885號、第6,048,720號、第6,060,447號、第6,114,148號、第6,228,620號、第6,316,226號、第6,346,513號、第6,458,563號、第6,924,365號、第7,041,635號及第7,943,374號；美國專利申請公開案第2013/024960號、第2015/0071883號及第2015/0158930號；及PCT公開案第WO 2014/064277號及第WO 2014/127215號，以上者之揭示內容出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
除非本文中另外規定，否則因子VIII胺基酸之編號係指全長野生型人類因子VIII序列(FVIII-FL-AA)(在圖18中呈現為SEQ ID NO：19)中之相對應胺基酸。因而，當提及本文中所揭示之因子VIII變異體蛋白中之胺基酸取代時，所敍述胺基酸編號係指全長野生型因子VIII序列中之類似(例如，結構上或功能上等效)及/或同源(例如，在一級胺基酸序列中進化保守的)胺基酸。舉例而言，T2105N胺基酸取代係指在全長野生型人類因子VIII序列(FVIII-FL-AA；SEQ ID NO：19)之位置2105處的T至N取代及在由CS04編碼之因子VIII變異體蛋白(CS04-FL-AA；SEQ ID NO：2)之位置1211處的T至N取代。
如本文中所描述，因子VIII胺基酸編號系統視是否包括因子VIII信號肽(例如，全長野生型人類因子VIII序列之胺基酸1至19)而定。在包括信號肽時，編號稱作「信號肽入選」或「SPI」。在不包括信號肽時，編號稱作「信號肽排除」或「SPE」。舉例而言，對於與SPE編號中之F309S相同之胺基酸，F328S為SPI編號。除非另有指示，否則所有胺基酸編號係指全長野生型人類因子VIII序列(FVIII-FL-AA)(在圖18中呈現為SEQ ID NO：19)中之相對應胺基酸。
如本文中所描述，相較於由天然編碼之因子VIII構築體(例如，使用野生型人類密碼子編碼相同因子VIII構築體之聚核苷酸)提供之因子VIII表現水準，密碼子經改變聚核苷酸提供活體內轉基因因子VIII之增加之表現(例如，當作為基因治療載體之部分投與時)。如本文中所使用，術語「增加之表現」係指相較於投與天然編碼之因子VIII構築體之動物血液中的轉基因因子VIII活性水準，投與編碼因子VIII之密碼子經改變聚核苷酸之動物血液中的轉基因因子VIII活性的增加水準。可使用此項技術中已知之任何因子VIII活性量測活性水準。用於確定因子VIII活性之一例示性分析為Technochrome FVIII分析(Technoclone,Vienna,Austria)。
在一些實施例中，增加之表現係指相較於投與天然編碼之因子VIII聚核苷酸之動物血液中的轉基因因子VIII活性水準，投與密碼子經改變因子VIII聚核苷酸之動物血液中的大至少25%之轉基因因子VIII活性。在一些實施例中，增加之表現係指相較於投與天然編碼之因子VIII聚核苷酸之動物血液中的轉基因因子VIII活性水準，投與密碼子經改變因子VIII聚核苷酸之動物血液中的大至少50%、大至少75%、大至少100%、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至 少9倍、大至少10倍、大至少15倍、大至少20倍、大至少25倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍、大至少125倍、大至少150倍、大至少175倍、大至少200倍、大至少225倍或大至少250倍之轉基因因子VIII活性。
如本文中所描述，相較於由天然編碼之因子VIII構築體(例如，使用野生型人類密碼子編碼相同因子VIII構築體之聚核苷酸)提供之載體產生水準，密碼子經改變聚核苷酸提供增加之載體產生。如本文中所使用，術語「增加之病毒產生」係指相較於接種有天然編碼之因子VIII構築體之細胞培養物中的載體產量，接種有編碼因子VIII之密碼子經改變聚核苷酸之細胞培養物中的增加之載體產量(例如，效價/公升培養物)。可使用此項技術中已知之任何載體效價分析量測載體產量。用於確定載體產量(例如，AAV載體之載體產量)之一例示性分析為靶向AAV2反向末端重複之qPCR(Aurnhammer,Human Gene Therapy Methods：部分B 23：18-28(2012))。
在一些實施例中，增加之病毒產生係指在相同類型培養物中，相較於天然編碼之因子VIII構築體之產量，大至少25%之密碼子經改變載體產量。在一些實施例中，增加之載體產生係指在相同類型之培養物中，相較於天然編碼之因子VIII構築體之產量，大至少50%、大至少75%、大至少100%、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少15倍或大至少20倍之密碼子經改變載體產量。
如本文中所使用，術語「血友病」係指廣泛藉由降低之血液凝結或 凝固表徵之疾病病況之群。血友病可指類型A、類型B或類型C血友病，或指所有三種疾病類型之複合。類型A血友病(A型血友病(hemophilia A))由因子VIII(FVIII)活性之降低或損失造成且為最重要之血友病子型。類型B血友病(B型血友病(hemophilia B))由因子IX(FIX)凝結功能之損失或降低造成。類型C血友病(C型血友病(hemophilia C))為因子XI(FXI)凝結活性之損失或降低之後果。A型及B型血友病為X連鎖疾病，而C型血友病為常染色體的。針對血友病之習知治療包括預防性及按需求投與凝結因子，諸如FVIII、FIX(包括Bebulin®-VH)及FXI，以及FEIBA-VH、去胺加壓素及血漿輸注。
如本文中所使用，術語「FVIII基因治療」包括向患者提供編碼因子VIII之核酸以減輕、減弱或預防與血友病相關之一或多種症狀(例如，臨床因素)的復發之任何治療方法。該術語涵蓋投與包含編碼因子VIII分子、包括因子VIII之任何修飾形式(例如，因子VIII變異體)之核酸的任何化合物、藥物、程序或方案，以維持或改善患有血友病之個體之健康。熟習此項技術者將瞭解可例如基於根據本發明獲得之結果來改變FVIII治療之過程或FVIII治療劑之劑量。
如本文中所使用，術語「繞道治療」包括向患者提供非因子VIII止血劑、化合物或凝血因子以減輕、減弱或預防與血友病相關之一或多種症狀(例如，臨床因素)的復發之任何治療方法。非因子VIII化合物及凝血因子包括(但不限於)因子VIII抑制劑繞道活性(FEIBA)、重組活化之因子VII(FVIIa)、凝血酶原複合物濃縮物及活化之凝血酶原複合物濃縮物。此等非因子VIII化合物及凝血因子可為重組或血漿衍生的。熟習此項技術者將瞭解可例如基於根據本發明獲得之結果改變繞道治療之過程或繞道治療之 劑量。
如本文中所使用，「組合治療」包括投與編碼因子VIII分子之核酸及習知A型血友病治療劑，包括向患者提供編碼因子VIII分子之核酸與因子VIII分子及/或非因子VIII止血劑(例如，繞道治療劑)以減輕、減弱或預防與血友病相關之一或多種症狀(例如，臨床因素)的復發之任何治療方法。該術語涵蓋投與包括編碼因子VIII分子(包括因子VIII之任何修飾形式)之核酸的任何化合物、藥物、程序或方案，其適用於維持或改善患有血友病之個體之健康，且包括本文中所描述之治療劑中之任一者。
術語「治療有效量或劑量」或「治療足夠量或劑量」或「有效或足夠量或劑量」係指產生其投與所欲產生的治療作用之劑量。舉例而言，適用於治療血友病之藥物之治療有效量可為能夠預防或減輕與血友病相關之一或多種症狀的量。準確劑量將視治療目的而定，且可將藉由熟習此項技術者使用已知技術確定(參見例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；及Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2003,Gennaro，編，Lippincott,Williams & Wilkins)。
如本文中所使用，術語「基因」係指編碼多肽鏈之DNA分子之片段(例如，編碼區)。在一些實施例中，基因藉由立即在編碼區之前、之後及/或介入編碼區之區域安置，該等區域涉及產生多肽鏈(例如，調節元件，諸如啟動子、強化子、聚腺苷酸化序列、5'非轉譯區、3'非轉譯區域或內含子)。
如本文中所使用，術語「調節元件」係指提供細胞中編碼序列之表 現之核苷酸序列，諸如啟動子、強化子、終止子、聚腺苷酸化序列、內含子等。
如本文中所使用，術語「啟動子元件」係指幫助控制編碼序列之表現之核苷酸序列。一般而言，啟動子元件位於基因轉譯起始位點之5'。然而，在某些實施例中，啟動子元件可位於內含子序列內或編碼序列之3'。在一些實施例中，適用於基因治療載體之啟動子來源於靶蛋白之內源基因(例如，因子VIII啟動子)。在一些實施例中，適用於基因治療載體之啟動子對目標生物體之特定細胞或組織中之表現具有特異性(例如，肝特異性啟動子)。在又其他實施例中，複數個充分表徵之啟動子元件中之一者用於本文中所描述之基因治療載體。充分表徵之啟動子元件之非限制性實例包括CMV早期啟動子、β-肌動蛋白啟動子及甲基CpG結合蛋白2(MeCP2)啟動子。在一些實施例中，啟動子為組成型啟動子，其實質上驅動靶蛋白之恆定表現。在其他實施例中，啟動子為誘導型啟動子，其回應於特定刺激物(例如，暴露於特定治療劑或藥劑)驅動靶蛋白之表現。針對AAV介導之基因治療之設計啟動子的綜述，參見Gray等人(Human Gene Therapy 22：1143-53(2011))，其內容出於所有目的明確地以全文引用之方式併入。
如本文中所使用，術語「載體」係指用以將核酸(例如，編碼因子VIII基因治療構築體)轉移於宿主細胞中之任何媒介。在一些實施例中，載體包括複製子，其用於連同靶核酸一起複製媒介。適用於基因治療之載體之非限制性實例包括質體、噬菌體、黏質體、人工染色體及病毒，其在活體內充當複製之自主單元。在一些實施例中，載體為用於引入靶核酸(例如，編碼因子VIII變異體之密碼子經改變聚核苷酸)之病毒媒介。許多 適用於基因治療之經修飾真核病毒在此項技術中已知。舉例而言，腺相關病毒(AAV)尤其較適用於人類基因治療，因為人類為病毒之天然宿主，天然病毒促成任何疾病不為人所知，且病毒激發輕度免疫反應。
如本文中所使用，術語「CpG島」係指具有統計學上升高密度之CpG二核苷酸之聚核苷酸內的區域。如本文中所使用，若在200個鹼基對窗內：(i)區域之GC含量大於50%，及(ii)如藉由以下關係所定義，所觀測CpG二核苷酸與預期CpG二核苷酸之比為至少0.6，則聚核苷酸(例如，編碼密碼子經改變因子VIII蛋白之聚核苷酸)之區域為CpG島：
針對鑑別CpG島之方法之額外資訊，參見Gardiner-Garden M.等人，J Mol Biol.,196(2)：261-82(1987)，其內容出於所有目的明確地以全文引入之方式併入本文中。
如本文中所使用，術語「核酸」係指呈單鏈或雙鏈形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物及其互補序列。該術語涵蓋含有合成的、天然存在的及非天然存在的已知核苷酸類似物或經修飾主鏈殘基或鍵之核酸，其具有與參考核酸類似之結合特性，且其以與參考核苷酸類似之方式代謝。此類類似物之實例包括(但不限於)硫代磷酸酯、胺基磷酸酯、膦酸甲酯、對掌性膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸及肽核酸(PNA)。
術語「胺基酸」係指天然存在及非天然之胺基酸，包括以類似於天然存在之胺基酸的方式發揮功能之胺基酸類似物及胺基酸模擬物。天然存在之胺基酸包括由遺傳密碼編碼之胺基酸，以及稍後經修飾之胺基酸，例如羥基脯胺酸、y-羧基麩胺酸及O-磷絲胺酸。天然存在之胺基酸可包括例如D-胺基酸及L-胺基酸。本文中所使用之胺基酸亦可包括非天然胺基 酸。胺基酸類似物係指基本化學結構與天然存在之胺基酸相同(亦即任何碳與氫、羧基、胺基及R基團結合)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸或甲硫胺酸甲基鋶。此類類似物具有經修飾R基團(例如，正白胺酸)或經修飾肽主鏈，但保留與天然存在之胺基酸相同之基本化學結構。胺基酸模擬物係指結構不同於胺基酸之一般化學結構，但以類似於天然存在之胺基酸的方式發揮功能之化學化合物。胺基酸在本文中可由其通常已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名法委員會(Biochemical Nomenclature Commission)所推薦之單字母符號來提及。同樣，核苷酸可由其通常可接受之單字母密碼來提及。
關於胺基酸序列，一般熟習此項技術者將認識到改變、添加或缺失編碼序列中之單個胺基酸或較小百分比之胺基酸之核酸或肽序列的個別取代、缺失或添加為「經保守修飾之變異體」，其中該改變引起一胺基酸經化學上類似之胺基酸取代。提供功能上類似之胺基酸的保守取代表在此項技術中已熟知。此類經保守修飾之變異體另外為且不排除本發明之多晶型變異體、種間同源物及對偶基因。
提供功能上類似之胺基酸之保守胺基酸取代在此項技術中已熟知。視特定胺基酸(例如催化、結構或空間重要之胺基酸)之功能性而定，胺基酸之不同分組可視為彼此保守取代的。基於胺基酸之電荷及極性、胺基酸之疏水性、胺基酸之表面暴露/結構性質及胺基酸之二級結構傾向，表1提供視為保守取代之胺基酸之分組。
在兩個或多於兩個核酸或肽序列的情形下，術語「一致」或百分比「一致性」係指相同或具有指定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即當在比較窗或指定區域內針對最大對應性進行比較且比對時，在指定區域內約60%一致性，較佳65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的一致性)之兩個或多於兩個序列或子序列，如使用例如具有預設參數之下文所描述之BLAST或BLAST 2.0序列比較演算法量測或藉由人工比對及目視檢查量測。
如此項技術中已知，許多不同程式可用以鑑別蛋白質(或如下文所論述之核酸)與已知序列是否具有序列一致性或相似性。使用此項技術中已知之標準技術、較佳使用預設設定或藉由檢查來確定序列一致性及/或相 似性，該等標準技術包括(但不限於)Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.,2：482(1981)之局部序列一致性演算法；Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.,48：443(1970)之序列一致性比對演算法；Pearson & Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85：2444(1988)之相似性方法之檢索；此等演算法之電腦化實施方案(Wisconsin Genetics套裝軟體，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)；由Devereux等人，Nucl.Acid Res.,12：387-395(1984)所描述之最好擬合序列程式。較佳地，藉由FastDB基於以下參數計算百分比一致性：錯配罰分1；空隙罰分1；空隙大小罰分0.33；及接合罰分30，「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,」Macromolecule Sequencing and Synthesis,Selected Methods and Applications，第127-149頁(1988),Alan R.Liss,Inc，以上所有者以引用之方式併入。
適用演算法之一實例為PILEUP。PILEUP使用漸進式成對比對來產生一組相關序列之多序列比對。其亦可繪製展示用以產生比對之叢集關係之樹形圖。PILEUP使用Feng & Doolittle,J.Mol.Evol.35：351-360(1987)之漸進式比對方法之簡化形式；該方法類似於由Higgins & Sharp CABIOS 5：151-153(1989)所描述之方法，以上者均以引用之方式併入。適用PILEUP參數包括預設空隙權重3.00、預設空隙長度權重0.10及加權末端空隙。
適用演算法之另一實例為BLAST演算法，其描述於以下者中：Altschul等人，J.Mol.Biol.215,403-410,(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)；及Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.90：5873-5787(1993)，以上者均以引用之方式併入。尤其適用之BLAST程式為WU-BLAST-2程式，其獲自Altschul等人，Methods in Enzymology,266：460-480(1996)；[http：//blast.wustl/edu/blast/README.html]。WU-BLAST-2使用數個檢索參數，其中之大多數設定成預設值。使用以下值設定可調節參數：重疊間隔=1、重疊分數=0.125、詞臨限值(T)=11。HSP S及HSP S2參數為動態值且藉由本身程式視特定序列之組成及相關序列檢索之特定資料庫之組成而確立；然而可調節該等值以提高敏感性。
如由以引用之方式併入之Altschul等人，Nucl.Acids Res.,25：3389-3402所報導，一額外適用之演算法為空隙BLAST。空隙BLAST使用BLOSUM-62取代得分；臨限值T參數設定為9；雙擊法用於觸發無空隙延伸部分，電荷空隙長度k，代價為10+k；Xu設定為16，且Xg對於資料庫檢索階段設定為40且對於演算法之輸出階段設定為67。空隙比對藉由對應於~22比特之得分觸發。
藉由匹配之一致殘基之數目除以比對區域中「更長」序列之殘基總數來確定%胺基酸序列一致性值。「更長」序列為比對區域中具有大多數實際殘基之一者(忽略藉由WU-Blast-2引入以最大化比對得分之空隙)。以類似方式，關於所鑑別多肽之編碼序列，「百分比(%)核酸序列一致性」定義為與細胞循環蛋白之編碼序列中之核苷酸殘基一致的候選序列中之核苷酸殘基之百分比。較佳方法使用設定為預設參數之WU-BLAST-2之BLASTN模組，其中重疊間隔及重疊分數分別設定為1及0.125。
比對可包括將空隙引入待比對之序列中。另外，針對含有比由圖2之序列(SEQ ID NO：1)編碼之蛋白更多或更少胺基酸的序列，應理解在一個 實施例中，序列一致性之百分比將基於相關於胺基酸或核苷酸之總數的一致胺基酸或核苷酸之數目確定。因此舉例而言，在一個實施例中，如下文所論述比圖2中所展示序列(SEQ ID NO：1)更短之序列之序列一致性將使用更短序列中之核苷酸之數目確定。在百分比一致性計算中，相對權重不經賦予序列變型之多種表現形式，諸如插入、缺失、取代等。
在一個實施例中，僅一致性打正分(+1)且包括空隙之序列變型之所有形式經指定「0」值，其避免用於序列相似性計算之如下文所描述之加權刻度或參數的需要。可例如藉由匹配之一致殘基之數目除以比對區域中「更短」序列之殘基總數且乘以100來計算百分比序列一致性。「更長」序列為比對區域中具有大多數實際殘基之一者。
術語「對偶基因變異體」係指特定基因座處基因以及來源於基因之mRNA轉錄物之cDNA及由其編碼之多肽的多晶型形式。術語「較佳之哺乳動物密碼子」係指自編碼最常用於哺乳動物細胞中所表現之蛋白質之胺基酸的密碼子集合當中之密碼子子集，如選自以下清單：Gly(GGC、GGG)；Glu(GAG)；Asp(GAC)；Val(GTG、GTC)；Ala(GCC、GCT)；Ser(AGC、TCC)；Lys(AAG)；Asn(AAC)；Met(ATG)；Ile(ATC)；Thr(ACC)；Trp(TGG)；Cys(TGC)；Tyr(TAT、TAC)；Leu(CTG)；Phe(TTC)；Arg(CGC、AGG、AGA)；Gln(CAG)；His(CAC)；及Pro(CCC)。
如本文中所使用，術語密碼子經改變係指編碼多肽(例如，因子VIII變異體蛋白)之聚核苷酸序列，其中編碼多肽之天然聚核苷酸之至少一個密碼子已經變化以改良聚核苷酸序列之特性。在一些實施例中，經改良特性促進編碼多肽之mRNA之轉錄增加，mRNA之穩定性增加(例如，改良 之mRNA半衰期)、多肽之轉譯增加及/或聚核苷酸於載體內之封裝增加。可用以獲得經改良特性之更改之非限制性實例包括改變用於特定胺基酸之密碼子之用法及/或分佈；調節總體及/或局部GC含量；移除富AT序列；移除重複序列元件，調節總體及/或局部CpG二核苷酸含量；移除隱藏的調節元件(例如，TATA框及CCAAT框元件)；移除內含子/外顯子剪接位點，改良調節序列(例如，引入Kozak共同序列)；及移除能夠在經轉錄mRNA中形成二級結構(例如，莖環)之序列元件。
如本文所論述，本文中存在多種命名法來係指本發明之組分。「CS-號」(例如，「CS04」、「CS01」、「CS23」等)係指編碼FVIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸及/或經編碼多肽，包括變異體。舉例而言，CS01-FL係指全長密碼子經改變CS01聚核苷酸序列或由CS01聚核苷酸序列編碼之胺基酸序列(在本文中有時稱作「CS01-FL-AA」(針對胺基酸序列)及「CS01-FL-NA」(針對核酸序列))。類似地，「CS01-LC」係指編碼FVIII多肽之輕鏈之密碼子經改變核酸序列(「CS01-LC-NA」)，或由CS01聚核苷酸序列編碼之FVIII輕鏈之胺基酸序列(有時在本文中亦稱作「CS01-LC-AA」)。同樣，對於FVIII重鏈，CS01-HC、CS01-HC-AA及CS01-HC-NA相同。如將由此項技術者所瞭解，對於僅密碼子經改變之構築體，諸如CS01、CS04、CS23等(例如，其相較於Refacto不含有額外胺基酸取代)，胺基酸序列將一致，因為胺基酸序列不因密碼子最佳化而改變。因此，本發明之序列構築體包括(但不限於)CS01-FL-NA、CS01-FL-AA、CS01-LC-NA、CS01-LC-AA、CS01-HC-AA、CS01-HC-NA、CS04-FL-NA、CS04-FL-AA、CS04-LC-NA、CS04-LC-AA、CS04-HC-AA、CS04-HC-NA、CS23-FL-NA、CS23-FL-AA、CS23-LC-NA、 CS23-LC-AA、CS23-HC-AA及CS23-HC-NA。
III. 密碼子經改變因子VIII變異體
在一些實施例中，本發明提供編碼因子VIII變異體之密碼子經改變聚核苷酸。當在基於AAV之基因治療構築體中投與時，此等密碼子經改變聚核苷酸提供明顯改良之因子VIII表現。相較於習知之密碼子最佳化構築體，密碼子經改變聚核苷酸亦顯示改良之AAV病毒粒子封裝。如實例2及(錯誤！未發現參考來源)中所顯示，申請者已經由發現編碼因子VIII多肽之三種密碼子經改變聚核苷酸(CS01-FL-NA、CS04-FL-NA及CS23-FL-NA)而獲得此等優勢，該因子VIII多肽具有人類野生型因子VIII重鏈及輕鏈，及含有弗林蛋白酶裂解位點以促進活性FVIIIa蛋白在活體內成熟之短的14個胺基酸之B域經取代連接子(「SQ」連接子)。
在一個實施例中，本文中所提供之密碼子經改變聚核苷酸的核苷酸序列與至少編碼因子VIII重鏈及因子VIII輕鏈之CS01、CS04或CS23(分別為SEQ ID NO 13、1及20)內之序列具有高序列一致性。如此項技術中已知，因子VIII之B域對於活體內活性非必需。因此，在一些實施例中，本文中所提供之密碼子經改變聚核苷酸完全缺乏因子VIII B域。在一些實施例中，天然因子VIII B域用含有弗林蛋白酶裂解位點之短胺基酸連接子替換，該短胺基酸連接子例如由CS01、CS04或CS23(分別為SEQ ID NO 2、2及21)構築體之胺基酸760-773組成之「SQ」連接子。「SQ」連接子亦稱作BDLO04(針對胺基酸序列為BDLO04-AA，且針對核苷酸序列為BDLO04-NA)。
在一個實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之因子VIII重鏈及輕鏈分別為人類因子VIII重鏈及輕鏈。在其他實施例中，由密碼子經改變 聚核苷酸編碼之因子VIII重鏈及輕鏈為來自另一哺乳動物之重鏈及輕鏈序列(例如，豬因子VIII)。在又其他實施例中，因子VIII重鏈及輕鏈為嵌合重鏈及輕鏈(例如，人類及第二哺乳動物序列之組合)。在又其他實施例中，因子VIII重鏈及輕鏈為來自另一哺乳動物之重鏈及輕鏈之人類化型式，例如來自其中人類殘基在選擇位置處經取代以在投與人類時減少所得肽之免疫原性的另一哺乳動物之重鏈及輕鏈序列。
人類基因之GC含量自小於25%至大於90%廣泛變化。然而一般而言，具有更高GC含量之人類基因以更高水準表現。舉例而言，Kudla等人(PLoS Biol.,4(6)：80(2006))證實增加基因之GC含量主要藉由增加轉錄且實現更高穩態水準之mRNA轉錄增加了經編碼多肽之表現。一般而言，密碼子最佳化基因構築體之所需GC含量等於或大於60%。然而，天然AAV基因組之GC含量大約為56%。
因此，在一些實施例中，本文中所提供之密碼子經改變聚核苷酸之CG含量更接近地符合天然AAV病毒粒子之GC含量(例如，大約56% GC)，其低於密碼子習知經最佳化以用於在哺乳動物細胞中表現之聚核苷酸的較佳CG含量(例如，處於或高於60% GC)。如實例1中所概述，相較於具有更高GC含量之類似的密碼子經改變編碼序列，GC含量為約56%之CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有改良之病毒粒子封裝。
因此，在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量小於60%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量小於59%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量小於58%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量小於57%。在一 些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量不大於56%。
在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為54%至59%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為55%至59%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為56%至59%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為54%至58%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為55%至58%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為56%至58%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為54%至57%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為55%至57%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為56%至57%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為54%至56%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為55%至56%。
在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為56±0.5%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為56±0.4%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為56±0.3%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為56±0.2%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸之總GC含量為56±0.1%。在一些實施例中，編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷 酸之總GC含量為56%。
A. 因子VIII B域經取代連接子
在一些實施例中，進一步改變FVIII重鏈與輕鏈之間的連接(例如，野生型因子VIII中之B域)。歸因於AAV封裝能力之大小限制，B域缺失、截短及或連接子經取代之變異體應改良FVIII基因治療構築體之功效。最習知使用之B域經取代連接子為SQ FVIII之連接子，其僅保留B域之14個胺基酸作為連接子序列。豬VIII之另一變異體(描述於美國專利第6,458,563號中之「OBI-1」)在CHO細胞中良好表現，且具有24個胺基酸之稍微更長的連接子。在一些實施例中，由本文中所描述之密碼子經改變聚核苷酸編碼之因子VIII構築體包括SQ型B域連接子序列。在其他實施例中，由本文中所描述之密碼子經改變聚核苷酸編碼之因子VIII構築體包括OBI-1-型B域連接子序列。
在一些實施例中，本文中所描述之經編碼因子VIII多肽包括SQ型B域連接子(SFSQNPPVLKRHQR；BDL-SQ-AA；SEQ ID NO：30)，包括野生型人類因子VIII B域(FVIII-FL-AA；SEQ ID NO：19)之胺基酸760-762/1657-1667(Sandberg等人Thromb.Haemost.85：93(2001))。在一些實施例中，相對於相對應野生型序列，SQ型B域連接子具有一個胺基酸取代。在一些實施例中，相對於相對應野生型序列，SQ型B域連接子具有兩個胺基酸取代。
在一些實施例中，本文中所描述之經編碼因子VIII多肽包括Greengene型B域連接子，包括野生型人類因子VIII B域(FVIII-FL-AA；SEQ ID NO：19)之胺基酸760/1582-1667(Oh等人，Biotechnol.Prog.,17：1999(2001))。在一些實施例中，相對於相對應野生型序列， Greengene型B域連接子具有一個胺基酸取代。在一些實施例中，相對於相對應野生型序列，Greengene型B域連接子具有兩個胺基酸取代。
在一些實施例中，本文中所描述之經編碼因子VIII多肽包括延長之SQ型B域連接子，包括野生型人類因子VIII B域(FVIII-FL-AA；SEQ ID NO：19)之胺基酸760-769/1657-1667(Thim等人，Haemophilia,16：349(2010))。在一些實施例中，相對於相對應野生型序列，延長之SQ型B域連接子具有一個胺基酸取代。在一些實施例中，相對於相對應野生型序列，延長之SQ型B域連接子具有兩個胺基酸取代。
在一些實施例中，本文中所描述之經編碼因子VIII多肽包括豬OBI-1-型B域連接子，包括來自野生型豬因子VIII B域之胺基酸SFAQNSRPPSASAPKPPVLRRHQR(SEQ ID NO：31)(Toschi等人，Curr.Opin.Mol.Ther.12：517(2010))。在一些實施例中，相對於相對應野生型序列，豬OBI-1型B域連接子具有一個胺基酸取代。在一些實施例中，相對於相對應野生型序列，豬OBI-1型B域連接子具有兩個胺基酸取代。
在一些實施例中，本文中所描述之經編碼因子VIII多肽包括人類OBI-1型B域連接子，包括野生型人類因子VIII B域(FVIII-FL-AA；SEQ ID NO：19)之胺基酸760-772/1655-1667。在一些實施例中，相對於相對應野生型序列，人類OBI-1型B域連接子具有一個胺基酸取代。在一些實施例中，相對於相對應野生型序列，人類OBI-1型B域連接子具有兩個胺基酸取代。
在一些實施例中，本文中所描述之經編碼因子VIII多肽包括O8型B域連接子，包括來自野生型豬因子VIII B域之胺基酸SFSQNSRHQAYRYRRG(SEQ ID NO：32)(Toschi等人，Curr.Opin. Mol.Ther.12：517(2010))。在一些實施例中，相對於相對應野生型序列，豬OBI-1型B域連接子具有一個胺基酸取代。在一些實施例中，相對於相對應野生型序列，豬OBI-1型B域連接子具有兩個胺基酸取代。
B域自因子VIII構築體之移除似乎不影響活化酶(例如，FVIIIa)之活性，此大概因為B域在活化期間移除。然而，因子VIII之B域含有例如藉由N-或O-連接之糖基化而轉譯後修飾之若干殘基。野生型因子VIII B域之電子雜交分析(Prediction of N-glycosylation sites in human proteins,R.Gupta,E.Jung and S.Brunak,in preparation(2004))預測此等位點中之至少四者在活體內經糖基化。認為B域內之此等修飾有助於活體內因子VIII之轉譯後調節及/或半衰期。
雖然因子VIII B域在成熟因子VIIIa蛋白中不存在，但前體因子VIII分子之B域內之糖基化可在活化之前增加蛋白質的循環半衰期。因此在一些實施例中，本文中所描述之經編碼因子VIII構築體之多肽連接子包括一或多個糖基化序列以允許活體內之糖基化。在一些實施例中，多肽連接子包括至少一個共同糖基化序列(例如，N-或O-連接之糖基化共同序列)。在一些實施例中，多肽連接子包括至少兩個共同糖基化序列。在一些實施例中，多肽連接子包括至少三個共同糖基化序列。在一些實施例中，多肽連接子包括至少四個共同糖基化序列。在一些實施例中，多肽連接子包括至少五個共同糖基化序列。在一些實施例中，多肽連接子包括至少6、7、8、9、10個或更多個共同糖基化序列。
在一些實施例中，多肽連接子含有至少一個N-連接之糖基化序列N-X-S/T，其中X為不為P、S或T之任何胺基酸。在一些實施例中，多肽連接子含有至少兩個N-連接之糖基化序列N-X-S/T，其中X為不為P、S或T 之任何胺基酸。在一些實施例中，多肽連接子含有至少三個N-連接之糖基化序列N-X-S/T，其中X為不為P、S或T之任何胺基酸。在一些實施例中，多肽連接子含有至少四個N-連接之糖基化序列N-X-S/T，其中X為不為P、S或T之任何胺基酸。在一些實施例中，多肽連接子含有至少五個N-連接之糖基化序列N-X-S/T，其中X為不為P、S或T之任何胺基酸。在一些實施例中，多肽連接子含有至少6、7、8、9、10個或更多個N-連接之糖基化序列N-X-S/T，其中X為不為P、S或T之任何胺基酸。
B. 編碼具有可裂解連接子之因子VIII變異體之密碼子經改變聚核苷酸 CS04密碼子經改變聚核苷酸
在一個實施例中，本文中所提供之密碼子經改變聚核苷酸包括編碼具有連接子(活體內可斷裂)之因子VIII變異體多肽之核苷酸序列。因子VIII多肽包括因子VIII輕鏈、因子VIII重鏈及接合重鏈C端與輕鏈N端之多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)具有高序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)為編碼因子VIII重鏈之CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)之部分。因子VIII多肽之輕鏈由與CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)具有高序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)為編碼因子VIII輕鏈之CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)之部分。多肽連接子包括弗林蛋白酶裂解位點，其允許活體內成熟(例如，在活體內表現或投與前體多肽後)。
在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少96%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核 苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少97%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少98%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少99.5%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少99.9%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)一致。
在一些實施例中，因子VIII構築體之多肽連接子由與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有高序列一致性之第三核苷酸序列編碼，該BDLO04(SEQ ID NO：6)編碼對應於CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸760-773之14-胺基酸連接子。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少95%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少96%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少97%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少98%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)一致。
在一些實施例中，密碼子經改變聚核苷酸具有與CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有高序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少95%一致性。在一些實施例 中，核苷酸序列與CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少96%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少97%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少98%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少99%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)一致。
在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之因子VIII變異體具有與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少97%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少98%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少99%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少99.5%一致性在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-FL-AA(SEQ ID NO：2)一致。
CS01密碼子經改變聚核苷酸
在一個實施例中，本文中所提供之密碼子經改變聚核苷酸包括編碼具有連接子(活體內可斷裂)之因子VIII變異體多肽之核苷酸序列。因子VIII多肽包括因子VIII輕鏈、因子VIII重鏈及接合重鏈C端與輕鏈N端之多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)具有高序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24) 為編碼因子VIII重鏈之CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)之部分。因子VIII多肽之輕鏈由與CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)具有高序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)為編碼因子VIII輕鏈之CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)之部分。多肽連接子包括弗林蛋白酶裂解位點，其允許活體內成熟(例如，在活體內表現或投與前體多肽後)。
在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少96%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少97%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少98%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少99.5%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少99.9%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)一致。
在一些實施例中，因子VIII構築體之多肽連接子由與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有高序列一致性之第三核苷酸序列編碼，該BDLO04(SEQ ID NO：6)編碼對應於CS01-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸760-773之14-胺基酸連接子。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少95%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少96%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少97%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少98%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)一致。
在一些實施例中，密碼子經改變聚核苷酸具有與CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)具有高序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)具有至少95%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)具有至少96%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)具有至少97%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)具有至少98%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)具有至少99%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)一致。
在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之因子VIII變異體具有與CS01-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少97%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少98%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少99%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-FL-AA(SEQ ID NO：2)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-FL-AA(SEQ ID NO：2)一致。
CS23密碼子經改變聚核苷酸
在一個實施例中，本文中所提供之密碼子經改變聚核苷酸包括編碼具有連接子(活體內可斷裂)之因子VIII變異體多肽之核苷酸序列。因子VIII多肽包括因子VIII輕鏈、因子VIII重鏈及接合重鏈C端與輕鏈N端之多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22)具有高序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22)為編碼因子VIII重鏈之CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)之部分。因子VIII多肽之輕鏈由與CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23)具有高序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23)為編碼因子VIII輕鏈之CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)之部分。多肽連接子包括弗林蛋白酶裂解位點，其允許活體內成熟(例如，在活體內表現或投與前體多肽後)。
在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少96%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少97%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少98%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC- NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少99.5%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少99.9%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)一致。
在一些實施例中，因子VIII構築體之多肽連接子由與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有高序列一致性之第三核苷酸序列編碼，該BDLO04(SEQ ID NO：6)編碼對應於CS23-FL-AA(SEQ ID NO：21)之胺基酸760-773的14-胺基酸連接子。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少95%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少96%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少97%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少98%一致性。在一些實施例中，第三核苷酸序列與BDLO04(SEQ ID NO：6)一致。
在一些實施例中，密碼子經改變聚核苷酸具有與CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)具有高序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)具有至少95%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)具有至少96%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)具有至少97%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)具有至少98%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-FL-NA (SEQ ID NO：20)具有至少99%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)一致。
在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之因子VIII變異體具有與CS23-FL-AA(SEQ ID NO：21)具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-FL-AA(SEQ ID NO：21)具有至少97%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-FL-AA(SEQ ID NO：21)具有至少98%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-FL-AA(SEQ ID NO：21)具有至少99%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-FL-AA(SEQ ID NO：21)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-FL-AA(SEQ ID NO：21)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-FL-AA(SEQ ID NO：21)一致。
C. 編碼單鏈因子VIII蛋白之密碼子經改變聚核苷酸
儘管不能出現正常成熟之因子VIII分子，但位於B域C末端處之弗林蛋白酶裂解位點經移除之因子VIII構築體作為單鏈多肽保留活性(Leyte等人(1991))。類似地，具有減毒弗林蛋白酶位點之B域經缺失因子VIII構築體(含有R1664H胺基酸取代)比具有野生型弗林蛋白酶裂解位點之相對應因子VIII構築體更具有生物學活性(Siner等人(2013))。因此在一些實施例中，本文中所提供之密碼子經改變聚核苷酸包括編碼單鏈因子VIII變異體多肽之核苷酸序列。單鏈因子VIII多肽包括因子VIII輕鏈、因子VIII重鏈 及接合重鏈C端與輕鏈N端之多肽連接子。多肽連接子不包括弗林蛋白酶裂解位點。
單鏈CS04密碼子經改變聚核苷酸
在一個實施例中，本文中所提供之密碼子經改變聚核苷酸包括編碼單鏈因子VIII變異體多肽之核苷酸序列。因子VIII多肽包括因子VIII輕鏈、因子VIII重鏈及視情況選用之接合重鏈C端與輕鏈N端之多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)具有高序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)為編碼因子VIII重鏈之CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)之部分。因子VIII多肽之輕鏈由與CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)具有高序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)為編碼因子VIII輕鏈之CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)之部分。視情況選用之多肽連接子不包括弗林蛋白酶裂解位點。
在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少96%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少97%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少98%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少99.5%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)具有至少99.9%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS04-HC-NA及CS04-LC-NA(SEQ ID NO 3及4)一致。
在一些實施例中，密碼子經改變聚核苷酸具有與CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)具有高序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)具有至少95%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)具有至少96%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)具有至少97%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)具有至少98%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)具有至少99%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)一致。
在一些實施例中，密碼子經改變聚核苷酸具有與CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)具有高序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)具有至少95%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)具有至少96%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)具有至少97%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)具有至少98%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與 CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)具有至少99%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)一致。
在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之單鏈因子VIII變異體具有與CS04-SC1-AA(SEQ ID NO：10；人類因子VIII△(760-1667)(SPI；HsFVIII△(741-1648),SPE))具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之因子VIII變異體具有與CS04-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少97%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少98%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少99%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-SC1-AA(SEQ ID NO：10)一致。
在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之單鏈因子VIII變異體具有與CS04-SC2-AA(SEQ ID NO：12；人類因子VIII△(772-1667)(SPI；HsFVIII△(753-1648),SPE))具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之因子VIII變異體具有與CS04-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有高序列一致性之胺基酸序列。在一 些實施例中，胺基酸序列與CS04-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少97%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少98%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少99%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS04-SC2-AA(SEQ ID NO：12)一致。
單鏈CS01密碼子經改變聚核苷酸
在一個實施例中，本文中所提供之密碼子經改變聚核苷酸包括編碼單鏈因子VIII變異體多肽之核苷酸序列。因子VIII多肽包括因子VIII輕鏈、因子VIII重鏈及視情況選用之接合重鏈C端與輕鏈N端之多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)具有高序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)為編碼因子VIII重鏈之CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)之部分。因子VIII多肽之輕鏈由與CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)具有高序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)為編碼因子VIII輕鏈之CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)之部分。視情況選用之多肽連接子不包括弗林蛋白酶裂解位點。
在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少96%序列一致性。在一些實施例中，第一 及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少97%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少98%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少99.5%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)具有至少99.9%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS01-HC-NA及CS01-LC-NA(SEQ ID NO 24及25)一致。
在一些實施例中，密碼子經改變聚核苷酸具有與CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)具有高序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)具有至少95%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)具有至少96%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)具有至少97%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)具有至少98%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)具有至少99%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)一致。
在一些實施例中，密碼子經改變聚核苷酸具有與CS01-SC2-NA (SEQ ID NO：27)具有高序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)具有至少95%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)具有至少96%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)具有至少97%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)具有至少98%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)具有至少99%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)一致。
在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之單鏈因子VIII變異體具有與CS01-SC1-AA(SEQ ID NO：10；人類因子VIII△(760-1667)(SPI；HsFVIII△(741-1648),SPE))具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之因子VIII變異體具有與CS01-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少97%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少98%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少99%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-SC1-AA(SEQ ID NO： 10)一致。
在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之單鏈因子VIII變異體具有與CS01-SC2-AA(SEQ ID NO：12；人類因子VIII△(772-1667)(SPI；HsFVIII△(753-1648),SPE))具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之因子VIII變異體具有與CS01-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少97%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少98%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少99%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS01-SC2-AA(SEQ ID NO：12)一致。
單鏈CS23密碼子經改變聚核苷酸
在一個實施例中，本文中所提供之密碼子經改變聚核苷酸包括編碼單鏈因子VIII變異體多肽之核苷酸序列。因子VIII多肽包括因子VIII輕鏈、因子VIII重鏈及視情況選用之接合重鏈C端與輕鏈N端之多肽連接子。因子VIII多肽之重鏈由與CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22)具有高序列一致性之第一核苷酸序列編碼，該CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22)為編碼因子VIII重鏈之CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)之部分。因子VIII多肽之輕鏈由與CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23)具有高序列一致性之第二核苷酸序列編碼，該CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23)為編碼因子VIII輕鏈之 CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)之部分。視情況選用之多肽連接子不包括弗林蛋白酶裂解位點。
在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少95%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少96%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少97%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少98%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少99%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少99.5%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)具有至少99.9%序列一致性。在一些實施例中，第一及第二核苷酸序列分別與CS23-HC-NA及CS23-LC-NA(SEQ ID NO 22及23)一致。
在一些實施例中，密碼子經改變聚核苷酸具有與CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)具有高序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)具有至少95%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)具有至少96%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)具有至少97%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)具有至少98%一致性。在一些實施例中，核苷 酸序列與CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)具有至少99%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC1-NA(SEQ ID NO：28)一致。
在一些實施例中，密碼子經改變聚核苷酸具有與CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29)具有高序列一致性之核苷酸序列。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29)具有至少95%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29)具有至少96%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29)具有至少97%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29)具有至少98%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29)具有至少99%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，核苷酸序列與CS23-SC2-NA(SEQ ID NO：29)一致。
在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之單鏈因子VIII變異體具有與CS23-SC1-AA(SEQ ID NO：10；人類因子VIII△(760-1667)(SPI；HsFVIII△(741-1648),SPE))具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之因子VIII變異體具有與CS23-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少 97%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少98%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少99%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-SC1-AA(SEQ ID NO：10)一致。
在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之單鏈因子VIII變異體具有與CS23-SC2-AA(SEQ ID NO：12；人類因子VIII△(772-1667)(SPI；HsFVIII△(753-1648),SPE))具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，由密碼子經改變聚核苷酸編碼之因子VIII變異體具有與CS23-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有高序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少97%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少98%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少99%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少99.5%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少99.9%一致性。在一些實施例中，胺基酸序列與CS23-SC2-AA(SEQ ID NO：12)一致。
D. 因子VIII表現載體
在一些實施例中，本文中所描述之密碼子經改變聚核苷酸整合於表現載體中。表現載體之非限制性實例包括病毒載體(例如，適用於基因治 療之載體)、質體載體、噬菌體載體、黏質體、噬菌粒、人工染色體及其類似物。
病毒載體之非限制性實例包括：反轉錄病毒，例如莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MMLV)、哈維(Harvey)鼠肉瘤病毒、鼠乳腺腫瘤病毒及勞斯(Rous)肉瘤病毒；腺病毒、腺相關病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；艾巴氏(Epstein-Barr)病毒；乳頭瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒及脊髓灰質炎病毒。
在一些實施例中，本文中所描述之密碼子經改變聚核苷酸整合於基因治療載體中。在一些實施例中，基因治療載體為反轉錄病毒，且特定言之複製缺陷型反轉錄病毒。用於產生複製缺陷型反轉錄病毒之方案在此項技術中已知。針對綜述，參見Kriegler,M.,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,W.H.Freeman Co.,New York(1990)及Murry,E.J.,Methods in Molecular Biology，第7卷，Humana Press,Inc.,Cliffton,N.J.(1991)。
在一個實施例中，基因治療載體為基於腺相關病毒(AAV)之基因治療載體。AAV系統先前已經描述且一般在此項技術中熟知(Kelleher及Vos,Biotechniques,17(6)：1110-17(1994)；Cotten等人，Proc Natl Acad Sci USA,89(13)：6094-98(1992)；Curiel,Nat Immun,13(2-3)：141-64(1994)；Muzyczka,Curr Top Microbiol Immunol,158：97-129(1992)；及Asokan A，等人，Mol.Ther.,20(4)：699-708(2012)，各者出於所有目的以全文引用之方式併入本文中)。關於產生及使用rAAV載體之細節描述於例如美國專利第5,139,941號及第4,797,368號中，各者出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。在特定實施例中，AAV載體為AAV-8載體。
在一些實施例中，本文中所描述之密碼子經改變聚核苷酸整合於反轉錄病毒表現載體中。此等系統先前已經描述且一般在此項技術中熟知(Mann等人，Cell,33：153-159,1983；Nicolas及Rubinstein，於Vectors：A survey of molecular cloning vectors and their uses,Rodriguez及Denhardt編，Stoneham：Butterworth，第494-513頁，1988中；Temin，於Gene Transfer,Kucherlapati(編)，New York：Plenum Press，第149-188頁，1986中)。在一具體實施例中，反轉錄病毒載體為豆狀病毒載體(參見例如Naldini等人，Science,272(5259)：263-267,1996；Zufferey等人，Nat Biotechnol,15(9)：871-875,1997；Blomer等人，J Virol.,71(9)：6641-6649,1997；美國專利第6,013,516號及第5,994,136號)。
廣泛多種載體可用於在細胞培養物中自密碼子經改變多肽表現因子VIII多肽，包括真核及原核表現載體。在某些實施例中，涵蓋質體載體以用於在細胞培養物中表現因子VIII多肽。一般而言，將含有衍生自與宿主細胞相容之物種之複製子及控制序列的質體載體結合此等宿主使用。載體可攜帶複製位點以及能夠在轉型細胞中提供表型選擇之標記序列。質體將包括可操作地連接至一或多個控制序列(例如啟動子)之編碼因子VIII多肽之密碼子經改變聚核苷酸。
用於原核表現之載體之非限制性實例包括質體，諸如pRSET、pET、pBAD等，其中用於原核表現載體之啟動子包括lac、trc、trp、recA、araBAD等。用於真核表現之載體之實例包括：(i)針對酵母中之表現，使用諸如AOX1、GAP、GAL1、AUG1等之啟動子之載體，諸如pAO、pPIC、pYES、pMET；(ii)針對昆蟲細胞中之表現，使用諸如PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh等之啟動子之載體，諸如 pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC等；及(iii)針對哺乳動物細胞中之表現，使用諸如CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV及β-肌動蛋白之啟動子之諸如pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV等的載體及來源於病毒系統之載體，諸如牛痘病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、反轉錄病毒等。
IV. 實例 實例1-構築密碼子經改變因子VIII變異體表現序列
必須解決兩個障礙以便產生對A型血友病之基因治療有效之因子VIII編碼序列。第一，歸因於習知基因治療遞送載體(例如，AAV病毒粒子)之基因組大小限制，必須大大縮短經編碼因子VIII多肽。第二，必須改變編碼序列以：(i)穩定化遞送載體內之封裝相互作用，(ii)穩定化mRNA中間物，及(iii)改良mRNA之轉錄/轉譯之穩固性。
為實現第一目標，申請者自在本文中稱作「FVIII-BDD-SQ」之B域經缺失因子VIII變異體構築體開始。在此構築體中，用稱作「SQ」序列之十四個胺基酸序列替換B域。重組型FVIII-BDD-SQ以商標名REFACTO®出售，且已經展示對控制A型血友病有效。然而，FVIII-BDD-SQ之天然編碼序列，其包括用於因子VIII重鏈及輕鏈之人類野生型核酸序列，不能在基因治療載體中有效地表現。
為解決天然FVIII-BDD-SQ之較差表現，將描述於Fath等人(PLoS ONE,6：e17596(2011))中之密碼子最佳化演算法，其如Ward等人(Blood,117：798(2011))及麥金托什等人(Blood,121,3335-3344(2013))中所描述經修改，應用於FVIII-BDD-SQ序列，以產生第一中間編碼序列CS04a。然而，申請者認識到使用經修改演算法產生之CS04a序列可藉由進一步修 飾該序列而改良。因此，申請者重新引入CpG二核苷酸，重新引入用於精胺酸之CGC密碼子，改變白胺酸及絲胺酸密碼子分佈，重新引入高度保守之密碼子對，且移除隱藏TATA框、CCAAT框及剪接位點元件，同時避免CpG島且避免富AT及富GC延伸部之局部比例過高。
第一，經修改演算法用非CpG二核苷酸密碼子系統地替換含有CpG二核苷酸之密碼子(例如，精胺酸密碼子)，且消除/避免由相鄰密碼子產生之CpG二核苷酸。通常進行對CpG二核苷酸之此嚴格避免以防止肌肉內注射DNA疫苗後之TLR誘導免疫。然而，如此限制了密碼子最佳化之可能性。舉例而言，經修改演算法排除使用CGX精胺酸密碼子之完整集合。此在用於人類細胞中之表現之基因編碼中尤其具有破壞性，因為在高度表現之人類基因中CGC為最常使用的精胺酸密碼子。另外，避免由相鄰密碼子形成CpG進一步限制了最佳化可能性(例如，限制可共同使用之密碼子對的數目)。
由於不預期TLR誘導免疫為與基於AAV之肝定向基因治療相關的問題，因此將包括CpG之密碼子及產生CpG之相鄰密碼子重新引入中間編碼序列CS04a中，優先引入編碼因子VIII輕鏈之序列(例如，在FVIII-BDD-SQ編碼序列之3'端處)中。此允許更頻繁地使用較佳人類密碼子，尤其用於精胺酸之密碼子。然而注意避免形成CpG島，其為具有高頻率CpG位點之編碼序列之區域。此與Krinner等人(Nucleic Acids Res.,42(6)：3551-64(2014))之教示內容相反，Krinner等人提出轉錄起始位點下游之CpG域促進高水準之基因表現。
第二，經修改演算法排他性地應用某些密碼子，諸如用於白胺酸之CTG、用於纈胺酸之GTG及用於麩醯胺酸之CAG。然而，例如如Haas等 人(Current Biology,6(3)：315-24(1996))所提議，此冒犯了平衡密碼子使用之原則。為對經修改演算法過度使用較佳密碼子做出解釋，在由應用於密碼子更改(例如，CpG頻率及GC含量)之其他法則允許時重新引入交替白胺酸密碼子。
第三，當符合某些準則(例如，存在CG二核苷酸)時，經修改演算法替換密碼子對而不考慮其在自然界中有多麼保守。為對可能已因進化而保守之有益特性做出解釋，在由應用於密碼子更改(例如，CpG頻率及GC含量)之其他法則允許時，分析且調節由演算法替換之最保守密碼子對及最保守之較佳密碼子對，例如如Tats等人(BMC Genomics 9：463(2008))中所描述。
第四，亦重新工程改造用於中間編碼序列之絲胺酸密碼子。具體而言，將AGC、TCC及TCT絲胺酸密碼子以更高頻率引入經修飾編碼序列中以更好地整體匹配來用於人類密碼子使用(Haas等人，前述)。
第五，篩選且自經修飾編碼序列移除TATA框、CCAAT框元件及內含子/外顯子剪接位點。當修飾編碼序列時，注意避免富AT或富GC延伸部之局部比例過高。
最後，除在編碼序列內最佳化密碼子使用以外，當進一步改進中間編碼序列CS04a時考慮基本AAV病毒粒子之結構要求。AAV載體(例如，AAV病毒粒子之核酸部分)作為單股DNA分子封裝於其衣殼中(針對綜述，參見Daya及Berns,Clin.Microbiol Rev.,21(4)：583-93(2008))。因而載體之GC含量有可能影響基因組之封裝且因此在產生期間影響載體產量。如同許多演算法，此處使用之經修改演算法產生GC含量為至少60%之最佳化基因序列(參見Fath等人，PLoS One,6(3)：e17596(2011)(勘誤表在 PLoS One,(6)3(2011)中)。然而，AAV8衣殼蛋白由具有約56%之更低GC含量之核苷酸序列編碼。因此，為更好地模仿天然AAV8衣殼蛋白編碼序列，將中間編碼序列CS04a之GC含量減少至56%。
圖2中所展示之所得CS04編碼序列之總GC含量為56%。該序列之CpG二核苷酸含量為中等的。然而，CpG二核苷酸主要在編碼序列之部分(例如編碼因子VIII輕鏈之部分)的下游中。CS04序列與野生型因子VIII(Genbank寄存號M14113)中之相對應編碼序列具有79.77%核苷酸序列一致性。
針對比較目的，製備若干其他密碼子最佳化ReFacto構築體。如針對CS04所進行，藉由應用Fath等人之密碼子最佳化演算法-如由Ward等人修改-來構築CS01。然而，不同於CS04，CS01構築體不含有任何CpG島。如Radcliff P.M.等人，Gene Therapy,15：289-97(2008)中所描述，對CS08 ReFacto構築體進行密碼子最佳化，該文獻之內容出於所有目的特此明確地以全文引用之方式併入本文中。CS10密碼子最佳化ReFacto構築體獲自Eurofins Genomics(Ebersberg,Germany)。CS11密碼子最佳化ReFacto構築體獲自Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville,USA)。CH25密碼子最佳化ReFacto構築體獲自ThermoFischer Scientific之GeneArt服務(Regensburg,Germany)。CS40 ReFacto構築體由野生型因子VIII編碼序列組成。用以構築體CS23之演算法係基於JCAT工具(www.jcat.de)，一種用於密碼子最佳化之在線工具(Grote等人，2005；Nucl.Acids Res.W526-31)。進一步修飾序列以更加反映白蛋白超家族之密碼子使用(Mirsafian等人2014：Sc.Word Journal 2014,ID 639682)。在每一ReFacto編碼序列之間共用之序列一致性展示於下表2中。
各構築體之質體藉由將不同合成DNA片段選殖於相同載體主鏈質體(pCh-BB01)中來構築。由ThermoFischer Scientific(Regensburg,Germany)進行具有側接AscI及NotI酶限制位點之Refacto型BDD-FVIII片段之DNA合成。載體主鏈含有兩個側接之AAV2衍生反向末端重複(ITR)，其涵蓋來源於肝特異性鼠甲狀腺素運載蛋白基因之啟動子/強化子序列；用於插入各別Refacto型BDD-FVIII之AscI及NotI酶限制位點及合成多聚腺苷酸位點。連接所製備載體主鏈且經由AscI及NotI位點插入後，以毫克規模擴增所得質體。藉由直接定序(Microsynth,Balgach，Switzerland)檢驗構築體之Refacto型BDD-FVIII序列。選殖產生命名為pCS40、pCS01、pCS04、pCS08、pCS10、pCS11、pCh25及pCS23之七種不同的質體構築體(圖19)。構築體具有相同載體主鏈且編碼相同B域經缺失FVIII蛋白(Refacto型BDD-FVIII)，但其FVIII編碼序列不同。
如Grieger JC等人(Virus Vectors Using Suspension HEK293 Cells and Continuous Harvest of Vector From the Culture Media for GMP FIX and FLT1 Clinical Vector,Mol Ther.,Oct 6.(2015)doi：10.1038/mt.2015.187.[列印之前以電子文檔出版])中所描述，藉由三種質體轉染方法製備基於AAV8之載體，該文獻之內容出於所有目的特此明確地以全文引用之方式併入本文中。將HEK293懸浮液細胞用於使用相對應FVIII載體質體、輔助質體pXX6-80(攜帶腺病毒輔助基因)及封裝質體pGSK2/8(貢獻rep2及cap8基因)的質體轉染。為分離AAV8構築體，如Grieger等人(2015，前述)中所描述，使用碘克沙醇梯度處理一公升培養物之細胞集結粒。程序產生稱作vCS01、vCS04、vCS08、vCS10、vCS11及vCH25之載體製備物。藉由qPCR使用靶向AAV2反向末端重複之通用qPCR程序定量載體(Aurnhammer,Human Gene Therapy Methods：部分B 23：18-28(2012))。攜帶AAV2反向末端重複之對照載體質體用於製備標準曲線。所得vCS04構築體在圖7A-7C中呈現為SEQ ID NO：8。
藉由AAV瓊脂糖凝膠電泳分析載體基因組之完整性。如Fagone等人，Human Gene Therapy Methods 23：1-7(2012)中所描述，進行電泳。簡言之，在75℃下在0.5% SDS存在下培育AAV載體製備物10分鐘且隨後將其冷卻至室溫。在1% 1×TAE瓊脂糖凝膠上每色帶負載大約1.5E10載體基因組(vg)，且在7V/cm凝膠長度下電泳60分鐘。隨後將凝膠在2×GelRed(Biotium目錄號41003)溶液中染色且藉由ChemiDocTMMP(Biorad)成像。藉由5kb範圍內之相異條帶所指示，圖20中所展示之結果顯示vCS01、vCS04及vCS40病毒載體具有相同大小之基因組(圖20，色帶2-4)。儘管載體大小為大約5.2kb，但基因組為均勻條帶，確認略微過大基因組(相對於4.7kb之AAV野生型基因組)之正確封裝。所有其他vCS載體製備物展示相同的基因組大小(資料未展示)。
為了確認衣殼蛋白之預期模式，銀染色後用載體vCS01、vCS04及vCS40進行SDS PAGE(圖21)。如圖中所展示，下游純化程序產生呈現VP1、VP2及VP3之預期蛋白模式之高度純化物質(圖21，色帶2-4)。在所有其他病毒製備物下看到相同模式(未展示)。根據標準程序進行AAV製備物之SDS-PAGE程序。各色帶含有1E10 vg之各別病毒構築體，且在4-12% Bis-Tris(NuPAGE® Novex,Life Technologies)凝膠上按照製造商之說明書分離。用SilverQuestTM套組(Novex,Life Technologies)根據製造商之說明書進行銀染色。
出人意料地，相較於vCS40野生型編碼構築體及其他密碼子最佳化構築體，藉由AAV病毒產生中之更高產量來量測，AAV載體vCS01及vCS04具有更高之病毒粒子封裝。如表3中所展示，vCS01及vCS04載體實質上比vCS40複製地更好，在AAV效價方面提供5-7倍的產量增加。
實例2-密碼子經改變因子VIII變異體表現序列之活體內表現
為測試密碼子經改變因子VIII變異體序列之生物效能，向缺乏因子VIII之小鼠投與實例1中所描述之ReFacto型FVIII構築體。簡言之，在C57BL/6 FVIII基因敲除(ko)小鼠(每組具有6-8隻動物)中藉由對每公斤體 重之小鼠尾靜脈注射4E12載體基因組(vg)來進行分析。注射後14天藉由眶後穿刺抽出血液，且使用標準程序製備並冷凍血漿。選擇第14天時之表現水準，因為在此時在稍後時間見於此小鼠模型之一些動物中的抑制性抗體之影響最小。如製造商(Technoclone,Vienna,Austria)所提出，使用僅有微小修改之所進行Technochrome FVIII分析確定小鼠血漿中之FVIII活性。針對分析，將血漿樣品適當稀釋且與含有凝血酶、活化因子IX(FIXa)、磷脂、因子X及鈣之分析試劑混合。藉由凝血酶之FVIII活化後，形成具有FIXa、磷脂及鈣之複合物。此複合物將FX活化成活化FX(FXa)，其反過來自顯色受質裂解對硝基苯胺(pNA)。在405nm下量測pNA形成之動力學。速率與樣品中之FVIII濃度成正比。自參考曲線讀取FVIII濃度且結果以IU FVIII/毫升給出。
呈現於下表4中之結果顯示相較於野生型BDD-因子VIII構築體(CS40)，使用商業演算法設計之密碼子經改變序列(CS10、CS11及CH25)僅使BDD-因子VIII適度增加(3-4倍)。類似地，如Radcliffe等人中所描述製備之密碼子經改變BDD-因子VIII構築體(CS08)僅使BDD-FVIII表現增加3-4倍。此結果與Radcliff等人中所報導之結果一致。出人意料地，在活體內生物效能分析中，CS01、CS04及CS23構築體提供高得多的BDD-FVIII表現(分別為18、74及30倍的增加)。
應理解，本文中所描述之實例及實施例僅用於說明之目的，且根據其之各種修改或變化將由熟習此項技術者提出且包括在本申請案之精神及範圍內及所附申請專利範圍之範疇內。本文中所引用之所有公開案、專利及專利申請案出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
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Claims (49)

  1. 一種聚核苷酸，其包含與CS01-FL-NA具有至少95%一致性之核苷酸序列，其中該聚核苷酸編碼因子VIII多肽。
  2. 如請求項1之聚核苷酸，其中該核苷酸序列與CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)具有至少99%一致性。
  3. 如請求項1之聚核苷酸，其中該核苷酸序列為CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)。
  4. 一種聚核苷酸，其包含編碼因子VIII多肽之核苷酸序列，該因子VIII多肽包含輕鏈、重鏈及接合該重鏈之C端與該輕鏈之N端的多肽連接子，其中該因子VIII多肽之該重鏈由與CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)具有至少95%一致性之第一核苷酸序列編碼；其中該因子FVIII多肽之該輕鏈由與CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)具有至少95%一致性之第二核苷酸序列編碼；且其中該多肽連接子包含弗林蛋白酶裂解位點。
  5. 如請求項4之聚核苷酸，其中該多肽連接子由與BDLO01(SEQ ID NO：5)具有至少95%一致性之第三核苷酸序列編碼。
  6. 如請求項4或5之聚核苷酸，其中： 該第一核苷酸序列與CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)具有至少99%一致性；且該第二核苷酸序列與CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)具有至少99%一致性。
  7. 如請求項4或5之聚核苷酸，其中：該第一核苷酸序列為CS01-HC-NA(SEQ ID NO：24)；且該第二核苷酸序列為CS01-LC-NA(SEQ ID NO：25)。
  8. 一種聚核苷酸，其包含與CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少95%一致性之核苷酸序列，其中該聚核苷酸編碼因子VIII多肽。
  9. 如請求項8之聚核苷酸，其中該核苷酸序列與CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)具有至少99%一致性。
  10. 如請求項8之聚核苷酸，其中該核苷酸序列為CS04-FL-NA(SEQ ID NO：1)。
  11. 一種聚核苷酸，其包含編碼因子VIII多肽之核苷酸序列，該因子VIII多肽包含輕鏈、重鏈及接合該重鏈之C端與該輕鏈之N端的多肽連接子，其中該因子VIII多肽之該重鏈由與CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)具有至少95%一致性之第一核苷酸序列編碼；其中該因子FVIII多肽之該輕鏈由與CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)具 有至少95%一致性之第二核苷酸序列編碼；且其中該多肽連接子包含弗林蛋白酶裂解位點。
  12. 如請求項11之聚核苷酸，其中該多肽連接子由與BDLO04(SEQ ID NO：6)具有至少95%一致性之第三核苷酸序列編碼。
  13. 如請求項11或12之聚核苷酸，其中：該第一核苷酸序列與CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)具有至少99%一致性；且該第二核苷酸序列與CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)具有至少99%一致性。
  14. 如請求項11或12之聚核苷酸，其中：該第一核苷酸序列為CS04-HC-NA(SEQ ID NO：3)；且該第二核苷酸序列為CS04-LC-NA(SEQ ID NO：4)。
  15. 一種聚核苷酸，其包含與CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)具有至少95%一致性之核苷酸序列，其中該聚核苷酸編碼因子VIII多肽。
  16. 如請求項15之聚核苷酸，其中該核苷酸序列與CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)具有至少99%一致性。
  17. 如請求項15之聚核苷酸，其中該核苷酸序列為CS23-FL-NA(SEQ ID NO：20)。
  18. 一種聚核苷酸，其包含編碼因子VIII多肽之核苷酸序列，該因子VIII多肽包含輕鏈、重鏈及接合該重鏈之C端與該輕鏈之N端的多肽連接子，其中該因子VIII多肽之該重鏈由與CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22)具有至少95%一致性之第一核苷酸序列編碼；其中該因子FVIII多肽之該輕鏈由與CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23)具有至少95%一致性之第二核苷酸序列編碼；且其中該多肽連接子包含弗林蛋白酶裂解位點。
  19. 如請求項11之聚核苷酸，其中該多肽連接子由與BDLO23(SEQ ID NO：7)具有至少95%一致性之第三核苷酸序列編碼。
  20. 如請求項18或19之聚核苷酸，其中：該第一核苷酸序列與CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22)具有至少99%一致性；且該第二核苷酸序列與CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23)具有至少99%一致性。
  21. 如請求項18或19之聚核苷酸，其中：該第一核苷酸序列為CS23-HC-NA(SEQ ID NO：22)；且該第二核苷酸序列為CS23-LC-NA(SEQ ID NO：23)。
  22. 如請求項1至21中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼包含與CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)具有至少95%一致性之胺基酸序列之因子VIII多肽。
  23. 如請求項1至21中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼包含CS01-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列之因子VIII多肽。
  24. 一種聚核苷酸，其包含與CS01-SC1-NA(SEQ ID NO：26)具有至少95%一致性之核苷酸序列，其中該聚核苷酸編碼單鏈因子VIII多肽。
  25. 一種聚核苷酸，其包含與CS04-SC1-NA(SEQ ID NO：9)具有至少95%一致性之核苷酸序列，其中該聚核苷酸編碼單鏈因子VIII多肽。
  26. 如請求項24或25之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼包含與CS01-SC1-AA(SEQ ID NO：10)具有至少95%一致性之胺基酸序列之單鏈因子VIII多肽。
  27. 如請求項24或25之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼包含CS01-SC1-AA(SEQ ID NO：10)之胺基酸序列之單鏈因子VIII多肽。
  28. 一種聚核苷酸，其包含與CS01-SC2-NA(SEQ ID NO：27)具有至少95%一致性之核苷酸序列，其中該聚核苷酸編碼單鏈因子VIII多肽。
  29. 一種聚核苷酸，其包含與CS04-SC2-NA(SEQ ID NO：11)具有至少95%一致性之核苷酸序列，其中該聚核苷酸編碼單鏈因子VIII多肽。
  30. 如請求項28或29之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼包含與CS01-SC2-AA(SEQ ID NO：12)具有至少95%一致性之胺基酸序列之單鏈因子VIII多肽。
  31. 如請求項28或29之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼包含CS01-SC2-AA(SEQ ID NO：12)之胺基酸序列之單鏈因子VIII多肽。
  32. 一種聚核苷酸，其包含與選自由以下各者組成之群的序列具有至少95%一致性之序列：CS01-HC-NA、CS01-LC-NA、CS04-HC-NA、CS04-LC-NA、CS23-HC-NA、CS23-LC-NA。
  33. 一種聚核苷酸，其包含與選自由以下各者組成之群的序列具有至少99%一致性之序列：CS01-HC-NA、CS01-LC-NA、CS04-HC-NA、CS04-LC-NA、CS23-HC-NA、CS23-LC-NA。
  34. 一種聚核苷酸，其包含選自由以下各者組成之群的序列：CS01-HC-NA、CS01-LC-NA、CS04-HC-NA、CS04-LC-NA、CS23-HC-NA、CS23-LC-NA。
  35. 如請求項32至34中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼包含與 CS01-FL-NA(SEQ ID NO：13)具有至少95%一致性之胺基酸序列之因子VIII多肽。
  36. 如請求項32至34中任一項之聚核苷酸，其中該聚核苷酸編碼包含CS01-FL-AA(SEQ ID NO：2)之胺基酸序列之因子VIII多肽。
  37. 如請求項1至36中任一項之聚核苷酸，其中該經編碼因子VIII多肽包含置於兩個連續胺基酸之間的糖基化多肽。
  38. 如請求項1至37中任一項之聚核苷酸，其進一步包含可操作地連接至編碼該因子VIII多肽之該聚核苷酸的啟動子元件。
  39. 如請求項38之聚核苷酸，其中該啟動子元件為在編碼該因子VIII多肽之該核苷酸序列上游的肝特異性啟動子序列。
  40. 如請求項39之聚核苷酸，其進一步包含安置於該肝特異性啟動子序列與編碼該因子VIII多肽之該核苷酸序列之間的內含子序列。
  41. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含如請求項1至40中任一項之聚核苷酸。
  42. 一種腺相關病毒(AAV)顆粒，其包含如請求項1至40中任一項之聚核苷酸。
  43. 一種宿主細胞，其感染有包含如請求項1至40中任一項之聚核苷酸之腺相關病毒(AAV)顆粒。
  44. 一種用於產生腺相關病毒(AAV)顆粒之方法，其包含將如請求項1至40中任一項之聚核苷酸引入哺乳動物宿主細胞中，其中該聚核苷酸能夠在該哺乳動物宿主細胞中複製。
  45. 一種用於治療A型血友病之方法，其包含向有需要之患者投與如請求項42之腺相關病毒(AAV)顆粒。
  46. 一種用於轉導宿主細胞之方法，其包含使該宿主細胞與如請求項42之腺相關病毒(AAV)顆粒接觸。
  47. 如請求項42之腺相關病毒(AAV)顆粒，其係用於治療A型血友病。
  48. 如請求項42之腺相關病毒(AAV)顆粒，其係用於轉導宿主細胞。
  49. 一種如請求項42之腺相關病毒(AAV)顆粒之用途，其係用於製造用於治療A型血友病之藥物。
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