JP2006508659A - Ciz1複製タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
DNA複製の開始は、哺乳動物細胞周期における主要な制御点であり、癌において誤調節される多くの遺伝子産物の作用点である(HanahanおよびWeinberg,2000)。この開始プロセスは、プレ複製複合体タンパク質のアセンブリを伴い、この複合体は、細胞周期のG1期の間に、複製起点において、起点認識複合体(ORC)、Cdc6、Cdt1およびMcmタンパク質を含む。この後、第2のタンパク質群の作用が生じる。この作用により、DNAポリメラーゼおよびその補助因子(PCNAを含む)のローディング、およびS期への遷移が促進される。この開始プロセスは、サイクリン依存性プロテインキナーゼ2(Cdk2)、Cdc7−dbf4およびCdt1インヒビターであるゲミニンによって調節される(概説については、BellおよびDutta,2002を参照)。S期の細胞の核において、複製フォークが、一緒にクラスター形成して、数百個の複製「焦点」すなわち複製工場を形成する(Cook、1999)。複製因子は、核中の構造フレームワークと連結しているようであるが、この連結を形成する分子の性質および複製フォーク活性におけるこれらの役割は、不明のままである。
本発明の1つの局面に従って、DNA複製を調節する因子の同定のための標的としての、Ciz1ヌクレオチド配列もしくはCiz1ポリペプチド配列、またはその任意のフラグメントもしくは改変体の使用が提供される。
a)図14、15、または21のいずれかに示される核酸配列を含む核酸分子;
b)(a)中の核酸配列にハイブリダイズし、かつCiz1活性またはその改変体の活性を有する核酸分子;
c)遺伝暗号が原因でa)およびb)中の配列、ならびに試験されるべき候補因子に対して縮重している核酸配列を有する核酸分子;
d)Ciz1遺伝子座でのゲノム配列に由来する核酸分子、または該ゲノム配列にハイブリダイズする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子に対する因子の効果を検出または測定する工程
を包含する。
(i)以下:
a)図14、15、または21のいずれかに示される核酸配列を含む核酸分子;
b)(a)の核酸配列にハイブリダイズし、かつCiz1活性またはその改変体の活性を有する核酸分子;
c)遺伝暗号が原因でa)およびb)中の配列、ならびに試験されるべき候補因子に対して縮重している核酸配列を有する核酸分子;
d)Ciz1遺伝子座でのゲノム配列に由来する核酸分子、または該ゲノム配列にハイブリダイズする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子によってコードされるポリペプチド分子、またはその活性フラグメントを含む調製物を形成する工程;ならびに
(ii)該ポリペプチドの活性に対する前記因子の効果を検出または測定する工程
を包含する。
a)図14、図15、および図21に示されるCiz1アミノ酸配列をコードする核酸配列;
b)(a)の核酸配列にハイブリダイズする核酸分子;
c)遺伝コードが原因でa)およびb)中の配列ならびに上記配列のうちのいずれかと相補的な任意の配列に対して縮重している核酸配列を有する、核酸分子;
d)Ciz1プレmRNAをコードする核酸配列(すなわち、ゲノム配列);
からなる群より選択され、上記発現カセットは、プロモーター配列に対して転写的に連結されている。
プロモーターエレメントはまた、代表的には、所謂TATAボックス、および転写開始部位を選択するように機能するRNAポリメラーゼ開始選択配列を含む。これらの配列はまた、特に、RNAポリメラーゼによる転写開始選択を促進するように機能するポリペプチドに結合する。
(i)試験されるべき被験体から単離したサンプルを、Ciz1活性を有するポリペプチドまたはCiz1活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に特異的に結合する因子と、接触させる工程;ならびに
(ii)上記サンプル中の上記ポリペプチドまたは核酸に対する上記因子の結合を検出または測定する工程;
(iii)逆転写PCRまたはリアルタイムPCRを使用して、Ciz1アイソフォーム発現をモニターし、発現レベルを測定する工程;
(iv)上記分子の変化した立体構造特性に基づいて、核酸変異またはアミノ酸変異の存在を測定する工程;
のうちの1つ以上を包含する。
ここで、本発明の実施形態は、以下の図を参照して単なる例として記載される。
本発明者らは、その挙動がインビトロでのDNA複製の開始に関連する未知の抗原を同定し、そして研究するための組換えヒトCdc6に対して惹起させたポリクローナル抗体(抗体V1)を発見した(Coverleyら、2000;Stoeberら、1998;Williamsら、1998)。この抗原は、100kDaの見かけの分子量を有し(p85と呼ばれる)、3T3細胞からの抽出物において容易に検出可能である(図1A)。
予測されたマウスCiz1のオープンリーディングフレームおよびマウス乳腫瘤ライブラリー(BC018483)由来のcDNAは、本発明者らの胚クローン(AJ575057)(本明細書中以下でECiz1と称される(図2A))には存在しない3つの領域を含む。ECiz1におけるこれらの3つの可変領域は、エキソン2/3、6および8の選択的スプライシングの結果であるようである(図2B)。マウス黒色腫クローンAK089986は、ECiz1と同じ3つの領域のうちの2つを欠き(図2A)、一方で、第三のものは、N末端ポリグルタミン伸長部(これもまた、ヒト骨髄芽球腫由来のクローンに存在しない)をコードする。エキソン3/4由来の第四の配列ブロックは、マウスES細胞由来のCiz1転写産物、およびマウス原始生殖細胞におけるエキソン4に存在しない(図7)。ヒトCiz1はまた、RNAレベルで選択的にスプライシングされて、マウスCiz1と同じ4つの配列ブロックの組み合わせを排除する転写産物を与える(以下を参照のこと)。実際に、マウスCiz1 cDNAにおける全ての公知のバリエーションは、ヒトにおける密接な類似物を有し、これらのいくつかは、アミノ酸レベルで同一である。このことは、異なるCiz1アイソフォームが、機能的重要性を有することを示唆する。第五の可変領域(マウスにおいてはまだ観察されていない)は、主として癌腫由来のヒトCiz1転写産物において選択的にスプライシングされる。
S期の細胞からの細胞質ゾル抽出物へと曝露すると、G1後期の核は、DNA複製を開始し、そして新生DNAを合成し始める(Krudeら、1997)。本発明者らは、この無細胞アッセイを使用して、ECiz1および誘導される組換えフラグメントの、DNA合成に対する効果を試験した(図3)。全長ECiz1タンパク質は、インビトロで複製される核の数を、30%(+/−0.9%)から46%(+/−5.5%)へと一貫して増加させた。このことは、Ciz1が、S期抽出物中の開始の制限物であることを示唆する(図3A)。2つのみの他のクラスのタンパク質(サイクリン依存性キナーゼ、Coverleyら、2002;Krudeら、1997;Lamanら、2001、およびCdc6タンパク質、Coverleyら、2002;Stoeberら、1998)が、無細胞開始を刺激することが以前に見出された。従って、ECiz1は、複製プロセスに関与することがまだ公知ではなかったタンパク質で、この特性を有する最初のタンパク質である。組換えECiz1の、無細胞開始に対するポジティブな効果は、内因性Ciz1が、哺乳動物細胞中でのDNA複製においてポジティブな役割を果たすことを立証する。
Ciz1は、インビボにおいて、リンタンパク質であるようである。なぜなら、Ciz1は、多数の推定リン酸化部位を含み、そして3T3細胞抽出物がλホスファターゼで処理された場合に、変化した移動度を示すからである(図示せず)。マウスCiz1は、2つのRXLサイクリン結合モチーフおよび5つの推定cdkリン酸化部位を含み、これらは、全ての公知の改変体に存在する。これらのうちの4つは、ECiz1の、インビトロ複製活性を含むN末端フラグメントに存在し(以下を参照のこと)、そして1つは、エキソン6が短いDSSSQ配列モチーフを排除するように選択的にスプライシングされた部位に隣接する(図2A、C)。このモチーフは、マウスとヒトとの両方において、100%同一であり、そして選択的にスプライシングされるので、本発明者らは、条件的封入が、Ciz1活性を調節するように働き得ると判断し、このタンパク質のこの領域を、潜在的に重要であると同定した。従って、本発明者らは、遺伝アプローチを無細胞複製アッセイと組み合わせることによって、4残基上流であり、そしてまた、マウスおよびヒトにおいて保存されるcdk部位に焦点を合わせることを選択した。ECiz1から開始して、191位および192位の2つのスレオニンを、2つのアラニンに変化させて、Eciz1T(191/2)A(図2D)を生成した。インビトロにおいて、DNA複製活性について試験される場合、ECiz1T(191/2)Aは、ECiz1と同程度に、後期G1核の開始を刺激した(図3C)。しかし、ECiz1とは異なり、開始の刺激は、少なくとも3桁に及ぶ広範な濃度にわたって維持された。従って、過剰のECiz1の活性を制限する機構は、無細胞環境において存在し、そして作動する。別の構築物において、293位のスレオニンもまた、アラニンに変化させて、ECiz1T(293)Aを生成したが(図2D)、この変化は、インビトロにおいてアッセイされたECiz1活性に対してほとんど影響を有さなかった(図3D)。
Ciz1は、タンパク質を核内に繋留し得る、いくつかのC末端特徴を保有する。matrin3ドメインは、核マトリックスとの相互作用を示唆し、そして3つのジンクフィンガーは、核酸との相互作用を示唆する。実際に、最近の証拠は、ヒトCiz1が、弱い配列特異的様式で、DNAを結合することを示唆する(WarderおよびKeherley,2003)。C末端ドメインがECiz1複製活性のために重要であるか否かを決定するために、本発明者らは、このタンパク質を2つのフラグメントに分割した(図2D)。Nterm442(これは、NLS、2つの保存されたcdk部位、1つのジンクフィンガー、および可変スプライシングが観察された全ての公知の部位を含む)は、ECiz1と同程度に、そして同じ濃度で、開始を刺激する(図3E)。対照的に、C末端部分(Cterm274)は、残余の複製活性を含まない(図3F)。従って、matrin3ドメイン、サイクリン依存性キナーゼリン酸化部位のうちの1つおよびジンクフィンガーのうちの2つは、インビトロにおいてアッセイされる場合、ECiz1のDNA複製活性のために必要とはされない。しかし、この分析は、ECiz1の活性を、トランスで、誤局在化の結果が検出されにくい条件下で測定することが注目されるべきである。従って、matrin3ドメインおよびジンクフィンガーが、インビボで作用して、Ciz1活性を、核における特定の部位に指向し、これによって、Ciz1活性の範囲を制限することは、可能なままである。
抗体V1は、Cdc6ならびにp85−Ciz1を認識(図1A)し、それゆえ、内因性Ciz1の細胞内局在を可視化することを目的とする免疫蛍光実験には適切ではない。それゆえ、本発明者らは、組換えECiz1フラグメントNterm442に対する2つの新たなウサギポリクローナル抗血清(抗Ciz1 1793および抗Ciz1 1794と命名された)を作製した。予想されたように、精製されたNterm442は、ウエスタンブロットにおいて抗Ciz1抗体1793および抗Ciz1抗体1794によって認識されるが、これはまた、抗体V1によっても認識され(図4A)、このことは、p85(p100)が実際にCiz1であるという結論を支持する。
抗Ciz1 1793を用いて、3T3細胞(図5A)およびHeLa細胞(示さず)中のCiz1タンパク質(p85およびp125)の細胞内分布を可視化した。両方の細胞型において、1793は、核特異的抗原と反応し、そしてこれは、組換えNterm442フラグメントを含めることによってブロックされた(図5B)。比較のために示したCdc6(図5A)とは異なり、Ciz1は、この細胞周期進行中の集団の全ての3T3細胞において明確に検出可能である。それゆえ、量のわずかな変動またはアイソフォームは、この方法によっては検出されないが、Ciz1は、中期を通して核中に存在する。界面活性剤での処理後、全体的核Ciz1染色は、全ての核において減少した。このことは、Ciz1が、可溶性画分として、および不溶性核構造体に結合しての両方で核に存在することを示唆する。
これまでに、本発明者らは、p85(p100)−Ciz1の挙動が無細胞アッセイにおけるDNA複製の開始と相関すること、組換えCiz1が開始頻度を刺激すること、およびCiz1がDNA複製機構と同じ核部位に存在することを示した。しかし、これらのデータは、Ciz1が増殖中の細胞において必須の機能を有することを示さない。これを試験するために、本発明者らは、RNA干渉(RNAi)を用いて、NIH3T3細胞中のCiz1転写産物レベルを選択的に減少させた。Ciz1内の4つの標的配列を選択し(図2を参照のこと)そして短鎖干渉(si)RNA分子をインビトロで生成した。細胞に適用した場合、4つ全てのCiz1 siRNAは、増殖を制限し(図6A)、そして48時間後にCiz1タンパク質レベルの明らかな減少を引き起こした(図6B)。増殖に対するCiz1低減の効果は、トランスフェクションの23時間後と40時間後との間で明らかになる。このことは、Ciz1 RNAなしでの最初の細胞周期が比較的影響を受けないことを示唆する。40時間までに、コントロール細胞およびCiz1 siRNA処理細胞は有意に異なり、Ciz1低減集団においてはさらなる増殖がなかった。Ciz1低減の特異性を確認するために、増殖が有意に阻害される前に、転写産物レベルを24時間においてモニタリングした(図6C)。この時点で、Ciz1転写産物は、GAPDH siRNAで処理したコントロール細胞において42%のレベルまで低下した。これらの実験は、Ciz1が細胞増殖に必要とされ、そしてDNA複製の主な機能と一致することを示す。
本発明者らの分析は、Ciz1が細胞増殖に必須であり、しかも、Ciz1を標的にすることが、増殖を抑制するための実行可能な戦略であることを示す。種々の癌で本発明者らが観察するCiz1の選択的スプライス形態(以下を参照のこと)は、Ciz1が、集団内の細胞のサブセット中の増殖を抑制するために選択的な方法で標的され得ることを意味している。
潜在的に可変であるエキソン全域にわたるRT−PCR分析は、3T3細胞が全長Ciz1を優勢に発現することを示唆し、そこで、内因性Ciz1に関する本発明者らの免疫局在化研究(図5)は、いくつかの配列ブロックを欠き、そしておそらくそれ故、そのタンパク質を局在化するために用いられる情報を欠く、ECiz1の挙動を必ずしも反映しない。ECiz1と全長Ciz1との局在化を直接比較するために、増大されたGFPタグ構築物を、3T3細胞中にトランスフェクトし(図8A)、そしてマウスの前核中にマイクロインジェクトした(図8B)。すべての場合において、タグ化Ciz1およびタグ化ECiz1は専ら核にあり、その一方、GFP単独を発現するコントロール構築物は、核および細胞質中に存在した。GFP−Ciz1およびGFP−Ciz1は両者とも、生存細胞中で、免疫蛍光によって固定された細胞中で観察された複製中心に類似する副核中心として見えた。従って、ECiz1から存在しない3つの配列ブロックは、Ciz1の核局在化に寄与するように見えなかった。
Ciz1のC末端の1/3が除去されたGFPタグ化構築物が3T3細胞中にトランスフェクトされたとき、ECiz1と全長Ciz1との間の差異が観察された(図8C)。48時間までに、FL Ciz1 N末端(442相当)は、大きな核内斑点(blob)へと融合し、これは、3日目までまたそれより遅く、ECiz1 N末端442トランスフェクション集団中でのみ見えるようになった。この時点より前は、ECiz1 N末端442は、核に特異的であるが拡散したパターンとして局在化した。従って、融合する能力は、Ciz1とECiz1との間で定量可能に異なり、そしてそれ故、3つの選択的にスプライスされたエキソンのうちの1つ(2/3、6または8)によって影響される。
上記で説明したように、Ciz1とECiz1 N末端との間の差異は、C末端ドメインもまた存在するときマスクされる(図8A)。さらに、C末端フラグメント単独は、GFPタグをクロマチンに向け、Ciz1またはECiz1のようなスポット状(中心)ではない不規則パターンを形成するが、これは、有糸分裂の間に染色体に付着したままである(図8D)。これは、C末端ドメインが、核中の構造的フレームワーク上にCiz1を固定化することに関与していることを示唆する。注目すべきことに、C末端フラグメントで一時的にトランスフェクトした細胞は、分裂し続け、緑の蛍光の段階的な希釈を生じた。
本発明者らは、トランスフェクション後、最初の日の間に生じる事象を調べた。トランスフェクトされた細胞(緑)中のS期の画分を、非トランスフェクション細胞中のS期の画分と、BrdUで種々の間隔で標識することにより比較した。0〜22時間(図8E)、0〜12時間および0〜7時間(示さず)を含む長い標識時間体の間、一致して、非トランスフェクション細胞に比較して、より多くのCiz1トランスフェクション細胞およびECiz1トランスフェクション細胞がDNA合成に従事した。これは、Ciz1およびECiz1が、G1→S遷移に対して正の影響を有し、S期へのスケジュールされないエントリーを促進することを示唆する。類似の結果が、トランスフェクション前に密にプレートされた3T3細胞集団で得られた。これは、正常細胞周期の一部としてS期に従事した非トランスフェクション集団にある画分を最小にするためになされた。これらの条件の下、トランスフェクション集団と非トランスフェクション集団との間の差異は最大になり、DNA複製の開始に対する異所性Ciz1の効果を明瞭に示した。
本発明者らはまた、3週間の期間に亘り3T3細胞のトランスフェクション集団をモニターした。GFP−N末端442または非選択的スプライス等価物でトランスフェクションされ、かつG418での選択下で維持された細胞では、数百の細胞を含む大きな増殖巣が観察された(図9A)。これらのクラスターは多数のGFP発現細胞を含み、このことは、(複製活性が存在する)ECiz1のN末端部分の過剰発現が致死的ではないことを示し、そしてこの過剰発現が、非トランスフェクション細胞と比較して、接触阻害の損失および単層形成の不能を含む、改変された増殖表現型に至ることを示唆している。このCiz1依存性の改変された挙動は、腫瘍形成に寄与し得る。推定のクロマチン相互作用ドメインを欠く、マウスCiz1の類似する短縮型バージョンは、マウス黒色腫から先に単離された(図2)。
(公開データベース中のCiz1 cDNA)
上記で述べたように、ヒトCiz1は、RNAレベルで選択的にスプライスされ、マウス胚Ciz1と同じ3つのエキソンを欠く転写物を生じる。7つのヒトCiz1 cDNAが、Mitsuiら(1999)、WarderおよびKeherly(2003)および大規模ゲノム分析プロジェクト(NIH−MGCプロジェクト、NEDOヒトcDNA配列決定プロジェクト)によって提出された公開データベースに記録されている(図10)。1つだけが正常成体組織由来であり、そしてこれは、すべての推定されたエキソンを含む(AB030835)。残りは、胚細胞由来である(AK027287)か、または特に4つの異なるタイプの小児癌由来である(髄芽細胞腫、AF159025、AF0234161、網膜芽細胞腫、AK023978、神経芽細胞腫、BC004119およびバーキットリンパ腫、BC021163)。この胚形態および癌由来形態は、本発明者らの胚マウスクローンと同じ3つの領域から、およびエキソン4に対応する第4の領域からの、配列ブロックを欠く。従って、この制限されたデータは、選択的スプライス形態が、発生の初期により優勢であることを示唆する。この相関関係は、先には科学的文献には記載されていない。小児癌における選択的にスプライスされたCiz1の存在は、Ciz1誤スプライシングが不適切な細胞増殖に関連し得る可能性を挙げる。
小児癌における選択的にスプライシングされたCiz1の存在は、Ciz1 ESTの詳細な分析を促進した。NCBI ユニジーンクラスターHs.23476(ヒトCiz1)に含まれる567個の発現配列タグ(EST)が存在する。これらは、幅広い範囲の正常および疾患の組織および細胞株に由来する。配列は、翻訳されて、ヒトCiz1の予測全長アミノ酸配列に対してマッピングされた。アミノ酸置換、欠失、フレームシフトおよび翻訳の早期の終了を生じる配列の変化が記録された。
Ciz1改変体発現を、公知のCiz1可変性の3つの領域にわたるプライマーセットを用いるRTPCRを使用して、6つのユーイング肉腫ファミリー腫瘍細胞株(ESFT)および2つの神経芽細胞株において調査した(図12A)。この分析は、Ciz1改変体発現のパターンが、神経芽細胞と比較して、非形質転換株と比較して、ESFT細胞において異なるが、同じ腫瘍由来の細胞株のセットにおいて明らかに非常に類似していることを示した。従って、Ciz1改変体発現は、これらの癌についての診断の可能性または予後の可能性を有し得る。同じ腫瘍型由来の株のセット内のより小さな改変は、予後的価値を有し得る。
正常非形質転換ヒト肺線維芽細胞(およびマウスNIH3T3細胞)は、ウエスタンブロットにおいて抗Ciz1ポリクローナル抗体1793によって検出されるCiz1の2つの主要な形態を発現する(図13A)。より大きな(約125kDa)バンドは、Wi38細胞において等しい割合で存在する3つの異なるバンドに分解するが、前立腺癌細胞株PC3およびLNCAP(およびESFT細胞株−示さない)において非常に一様でない割合で存在する。本発明者らは、これらのタンパク質アイソフォームが、可変にスプライシングされるエキソンの発現によって生成することを推定する。両方の腫瘍細胞株がまた、Wi38細胞よりもCiz1抗原を含み、これは、これらの癌細胞株におけるCiz1の過剰発現と一致する。
・小児癌におけるタンパク質のN末端部分(インビトロにおける複製活性を有する)における可変スプライシング。
(クローニング)
11日齢マウス胚由来のlamba triplEx 5’伸長全長富化cDNA発現ライブラリー(Clonetech ML5015t)を、推奨プロトコール(Clonetech)に従ってE.coli Xl1blueに感染させるために使用した。プラークを、10mM IPTG(Sigma)に事前に浸した0.45ミクロンのニトロセルロースフィルター上に乗せた。抗体非存在下での30分間のブロッキング後、アフィニティ精製抗体V1を、約3×106個のプラークに、PBS、10%無脂肪乳粉末、0.4% Tween20中1/1000希釈で適用した。2時間後、フィルターを同じ緩衝液で3回洗浄し、反応性プラークを、標準的手順に従い、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化した抗ウサギ二次抗体(Sigma)を用い、化学発光を増強して(ECL,Amersham)、可視化した。43個の独立したプラークを調べたが、2株のファージのみが、さらなる3周のスクリーニングで残った。これらを、BM25.8内への形質転換によってpTrip1Exへ変換して、配列決定した。1つは、マウスCdc6(クローンP)をコードし、他方(クローンL)は、ヒトCiz1に相同な未知のマウスタンパク質をコードしていた。本発明者らは、これを胚性Ciz1(ECiz1)と呼び、これを、EMBLに登録番号AJ575057の下で登録した。
pGEXベースの細菌発現構築物(Amersham)を使用し、インビトロ分析のためにECiz1タンパク質を産生した。pGEX−ECiz1を、クローンL由来の2.3kbのSmaI−XbaI(平滑末端)フラグメントをpGEX−6P−3のSmaI部位内に挿入することによって産生した。pGEX−Nterm442を、1.35kbのXmaI−XhoIフラグメントをXmaI−XhoI切断したpGEX−6P−3内に挿入することによって産生し、そしてpGEX−Cterm274を、0.95kbのXhoIフラグメントをXhoI切断したpGEX−6P−3内に挿入することによって産生した。pGEX−T(191/2)Aを、pGEX ECiz1から、以下のプライマーを用いた部位特異的変異誘発(Stratagene Quikchange)によって産生した:
ウサギポリクローナル抗体V1(Coverleyら,2000;Stoeberら,1998;Williamsら,1998)を、細菌的に発現されたヒトCdc6の内部フラグメント(アミノ酸145〜360に対応する)に対して惹起し、標準的手順(HarlowおよびLane,1988)によりアフィニティ精製した。この抗体は、内在性p100−Ciz1およびまたECiz1 Nterm442フラグメントに対して強く反応する。Nterm442とCdc6アミノ酸145〜360とのアラインメントは、共有エピトープがマウスCiz1における294〜298または304〜312であり得ることを示唆する。組換えNterm442を使用し、1793および1794と名付けられた2つのCiz1特異的ポリクローナル抗血清(Abcam)を生成した。1793は、本明細書中に記載される実験において慣用的に使用されている。その特異性を、抗体Vを用いた相反免疫沈降およびウエスタンブロット分析、内在性エピトープの反応性をブロックするNterm442の取り込み(抗体緩衝液(PBS中10mg/ml BSA、0.02% SDS、0.1% Triton X100)中25μg/ml)、およびsiRNA媒介性のCiz1欠乏(1793核染色を特異的に低下させる)によって評価した。
非同時性増殖中の3T3細胞を、複製抽出物について、PBS中で洗浄し、抽出緩衝液(20mM Hepes(pH7.8)、5mM酢酸カリウム、0.5mM塩化マグネシウム)中ですすぎ、EDTA非含有プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)で補強し、そして掻きとって回収した。細胞を、0.1% TritonX100で溶解し、そして界面活性剤耐性ペレット画分を、抽出緩衝液中0.3M NaClに抽出した。100μlの抽出物につき、5μlの1793または2μlの抗体Vを使用し、1時間4℃でインキュベートした。抗原−抗体複合体を、100μlのタンパク質G−セファロース(Sigma)で抽出し、ビーズを、50mM Tris(pH7.8)、1mM EDTA、0.1% NP40、150mM NaClで5回洗浄した。複合体を、ローディング緩衝液(100mM DTT、2% SDS、60mM Tris(pH6.8)、0.001%ブロモフェノールブルー)中で煮沸し、そして6.5% SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した。
細胞を、カバーガラス上で増殖させ、PBS中0.05% Triton X100への短い事前曝露を行うかまたは行わずに、4%パラホルムアルデヒド中で固定した。内在性Ciz1を、標準的手順に従い、抗体緩衝液中1/2000に希釈した1793血清で検出した。Mcm3を、モノクローナル抗体sc9850(1/1000)で、Cdc6をモノクローナルsc9964(1/100)で、そしてPCNAをモノクローナル抗体PC10(1/100)(全てSanta Cruz Biotechnology)で、検出した。二重染色蛍光共焦点画像の共局在分析を、記載されるように実施した(RubbiおよびMilner,2000;van Steenselら,1996)。
マウス3T3細胞を、以前に記載されるように(Coverleyら,2002)、静止状態からの解放によって同期させた。解放の17時間後(「後期G1」と呼ぶ)に回収した細胞から調製した核を、本明細書中に記載される全ての無細胞複製実験において使用した。これにより、S期の核、複製能のある後期G1の核および非応答性初期G1/G0の核を、異なる割合で含む集団を得た。レシピエント、中期G1 3T3抽出物を、15時間目に調製した(これらは代表的に、約5%のS期細胞を含む)。本明細書中に記載される一連の無細胞複製実験は、大量の標準化抽出物を必要とするため、HeLa細胞を使用した。何故なら、HeLa細胞は、大量に、容易に同期化するからである。S期HeLa抽出物を、2回の連続的チミジン誘導性S期ブロックから2時間解放された細胞(Krudeら,1997に記載される)から調製した。
DNA複製アッセイを、記載されるように実施した(Coverleyら,2002;Krudeら,1997)。簡潔に言うと、10μlの中期G1期またはS期の抽出物(エネルギー再生系、核酸およびビオチン化dUTPで補充される)および5×104後期G1期核を、60分間37℃でインキュベートした。反応物を、サイクリンA−cdk2(図1BおよびC)を含むバキュロウイルス溶解物で補強した。ここで、0.1μlの溶解物は、1nM精製キナーゼと同じ特異的活性を有する(Coverleyら,2002)。全ての組換えタンパク質を、100mM Hepes(pH7.8)、1mM DTT、50%グリセロール中で連続希釈し、それにより、1μl以下を10μlの複製アッセイに添加し、示した濃度を得た。反応を、50μlの0.5% Triton X100で停止し、50μlの8%パラホルムアルデヒドの添加によって5分間固定した。カバーガラスへ移した後、核をストレプトアビジン−FITC(Amersham)で染色し、Toto−3−ヨウ化物(Molecular Probes)で対比染色した。標識化した核の割合を、1000×解像度で観察することによって定量し、蛍光焦点または激しい一様な標識を有する全ての核を、ポジティブとして記録した。ヨウ化プロピジウムで対比染色したサンプルのインビトロ複製する核の画像を、600×解像度での共焦点顕微鏡検査により作製した。核タンパク質の分析のために、開始条件への15分間の曝露(冷PBSでの2倍の希釈反応および穏やかな遠心分離による)後、核を再度単離した。
開始アッセイにおいて使用する前に、同期したG1期の核の各調製物を試験し、既にS期にある核の割合を確立する(「%S」)。これを行うために、核を抽出物中でインキュベートする。この抽出物は、(静止状態からの解放の15時間後に回収されるG1中期細胞からの)DNA合成の開始を誘導し得ないが、(インビボで開始される)起点からの伸長DNA合成を効率的に支持する。核の伸長画分は、インビトロ開始アッセイ中に、標識されたヌクレオチドを効率的に取り込むが、有益ではない。慣用的には、この画分は、予め確立され、生データから減算される。20%未満がS期である同期した集団を、開始アッセイのために使用する。
内因性Ciz1を、増殖するNIH3T3細胞において、インビトロ転写されたsiRNA(Ambion Silencerキット)を用いて、マウスCiz1の4つの領域に対して標的化した。siRNAを生成するために使用されるオリゴヌクレオチド配列は、以下である:
インビボでDNA合成を行う核の画分を、20μMのブロモデオキシウリジン(BrdU、Sigma)を培養培地に補充することによって、20分間モニターした。酸処理後、取り込まれたBrdUを、製造業者の指示書に従ってFITC結合体化抗BrdUモノクローナル抗体(Alexis Biochemicals)によって可視化した。核を、Hoescht 33258を用いて対比染色し、そして高(1000×)解像度下で記録した。
全長マウスCiz1 cDNAを、UK HGMP Resource Centreから入手し(MGCクローン27988)、配列を完全に検証した。このクローン由来の2.8kbのSmaI−XbaI(平滑末端)全長Ciz1フラグメント、およびpTrip1ExクローンL由来の2.3kbのSmaI−XbaI(平滑末端)ECiz1フラグメントを、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)を用いて、pEGFP−C3(Clontech)のSmaI部位にインフレームで切断した。挿入のないpEGFP−C3を、コントロールとして使用した。構築物を、製造業者の指示書に従ってTransIT−293(Mirus)を用いてNIH3T3細胞内にトランスフェクトするか、またはある細胞期の受精マウス卵の雄性前核内に微量注入した。全長EGFP−Ciz1またはEGFP−ECiz1でトランスフェクトした増殖中の3T3細胞を、生細胞蛍光顕微鏡検査によって、トランスフェクション3日後まで分析した。DNA合成を、細胞培養培地中にヌクレオチドアナログBrdUを含めることによって、図面の説明において示されるような種々の時点について、トランスフェクション後最初の24時間の間にモニターした。上述のように、BrdUに曝される間にDNA合成を行う任意の細胞を、抗BrdUモノクローナル抗体で染色し、赤色の核を生成した。
癌細胞における再発性の変化を同定する目的で、NCBIユニジーンクラスターHs.23476(ヒトCiz1)に対する個々の発現配列タグ(EST)マッピングを、Genejockeyを使用して翻訳し、予測アミノ酸配列を全長Ciz1についての予測配列と比較した。品質の低いDNA配列を反映する誤差(例えば、長い配列決定の終わりに生じる誤差)を除外するために、中断されない配列の末端から8アミノ酸より遠くに位置する変化のみを、この分析に含めた。読み取りの後半における二度目の変化により回復したフレームシフト、および終止コドンが後に続くフレームシフトを、中断されない配列が後に続く場合にのみ含めた。従って、配列誤差の大部分は、この分析から除外される。しかし、残存する多くの点変異(フレームシフトおよび終止を含む)が、配列決定の間に導入された誤差を反映することが予測される。従って、この分析は、点変異が1より多く出現した場合にのみ点変異に重点が与えられる、明らかな傾向を目指す。
推奨される手順に従ってトリゾール(trizol)試薬を用いて、RNAを単離し、DNase処理し、そしてランダムヘキサマーおよびsuperscript IIを用いて逆転写し、次いで以下のCiz1特異的プライマーを用いて増幅した:
細胞を、10% FCSを含むDMEM中でサブコンフルエントまで増殖させ、EDTAを含まないプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)を補充した冷hepes緩衝化生理食塩水中でリンスし、次いで掻きとって回収し、0.1% Triton X100を補充した。界面活性剤不溶性物質(核を含む)を、穏やかな遠心分離によってペレット化して、上清画分(SN)とペレット画分(P)とを得た。これらを、還元SDS−PAGEサンプル緩衝液中で煮沸し、そしてタンパク質を、8% SDS−PAGEでの電気泳動によって解析した。ニトロセルロースへの転写後、Ciz1アイソフォームを、抗Ciz1抗体1793で検出した。この分析において使用した全ての方法は、他で十分に記載されている。
Claims (30)
- DNA複製を調節する因子の同定のための標的としての、Ciz1ヌクレオチド配列もしくはCiz1ポリペプチド配列、またはその任意のフラグメントもしくは改変体の、使用。
- DNA複製を調節する因子の同定のためのスクリーニング方法であって、該スクリーニング方法は、Ciz1ヌクレオチド配列もしくはCiz1ポリペプチド配列、またはその任意のフラグメントもしくは改変体の使用を包含する、スクリーニング方法。
- 請求項2に記載のスクリーニング方法であって、該方法は、以下:
a)図14、15、または21のいずれかに示される核酸配列を含む核酸分子;
b)(a)中の核酸配列にハイブリダイズし、かつCiz1活性またはその改変体の活性を有する核酸分子;
c)遺伝暗号が原因でa)およびb)中の配列、ならびに試験されるべき候補因子に対して縮重している核酸配列を有する核酸分子;
d)Ciz1遺伝子座でのゲノム配列に由来する核酸分子、または該ゲノム配列にハイブリダイズする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子に対する因子の効果を検出または測定する工程
を包含する、方法。 - 前記核酸分子が、前記核酸配列のうちの少なくとも1つの核酸残基の欠失、置換または付加によって改変されている、請求項3に記載の方法。
- 前記方法が、以下:
(i)以下:
a)図14、15、または21のいずれかに示される核酸配列を含む核酸分子;
b)(a)の核酸配列にハイブリダイズし、かつCiz1活性またはその改変体の活性を有する核酸分子;
c)遺伝暗号が原因でa)およびb)中の配列、ならびに試験されるべき候補因子に対して縮重している核酸配列を有する核酸分子;
d)Ciz1遺伝子座でのゲノム配列に由来する核酸分子、または該ゲノム配列にハイブリダイズする核酸分子
からなる群より選択される核酸分子によってコードされるポリペプチド分子、またはその活性フラグメントを含む調製物を形成する工程;ならびに
(ii)該ポリペプチドの活性に対する前記因子の効果を検出または測定する工程
のうちの1つ以上を包含する、請求項2に記載のスクリーニング方法。 - 前記ポリペプチドが、前記ポリペプチド配列のうちの少なくとも1つのアミノ酸残基の欠失、置換または付加によって改変されている、請求項5に記載の方法。
- 前記スクリーニング方法が、細胞ベースのスクリーニング方法である、請求項3〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記細胞が、前記Ciz1ポリペプチドを天然に発現する、請求項7に記載の方法。
- 前記細胞が、Ciz1またはそのフラグメントもしくは改変体をコードする核酸分子でトランスフェクトされている、請求項7に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の方法によって同定される、因子。
- 前記因子が、Ciz1媒介性DNA複製のアンタゴニストである、請求項10に記載の因子。
- 前記因子が、Ciz1媒介性DNA複製のアゴニストである、請求項10に記載の因子。
- 前記因子が、以下:ポリペプチドプローブもしくは核酸プローブ;ポリペプチド;ペプチド;アプタマー;化学物質;抗体;核酸からなる群より選択される、請求項10〜12のいずれかに記載の因子。
- 前記因子が、抗体分子であり、そして図16、17、または20に示される配列のうちのいずれかに結合する、請求項12に記載の因子。
- 前記因子が、アンチセンス核酸分子またはRNAiであり、該因子は、Ciz1またはその任意の改変体のmRNA配列に結合し、それによって、該Ciz1またはその任意の改変体のmRNA配列をブロックまたは不活性化する、請求項12に記載の因子。
- 前記因子が、図14、15、または21、あるいは請求項3の(i)b〜dの部分に示される配列の任意の部分に結合する、請求項15に記載の因子。
- アンチセンス分子またはRNAi分子を細胞に送達するための送達手段としての、ベクター。
- 請求項17に記載のベクターであって、該ベクターは、以下:
a)図14、図15、および図21に示されるCiz1アミノ酸配列をコードする核酸配列;
b)(a)の核酸配列にハイブリダイズする核酸分子;
c)遺伝暗号が原因でa)およびb)中の配列ならびに該配列のうちのいずれかと相補的な任意の配列に対して縮重している核酸配列を有する、核酸分子;
d)Ciz1プレmRNAをコードする核酸配列(すなわち、ゲノム配列);
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む、ベクター。 - 前記発現カセットが、プロモーター配列に対して転写的に連結されている、請求項18に記載のベクター。
- 増殖性障害の同定のための診断方法であって、該方法は、そのゲノム配列またはタンパク質配列における、Ciz1遺伝子、Ciz1スプライス改変体および変異の存在または発現を検出する工程を包含する、診断方法。
- 請求項20に記載の診断方法であって、該方法は、以下の工程:
(i)試験されるべき被験体から単離されたサンプルを、Ciz1活性を有するポリペプチドまたはCiz1活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子に特異的に結合する因子と、接触させる工程;
(ii)該サンプル中の該ポリペプチドまたは核酸に対する該因子の結合を検出または測定する工程;
(iii)逆転写PCRまたはリアルタイムPCRを使用して、Ciz1発現およびCiz1アイソフォーム発現をモニターし、発現レベルを測定する工程;ならびに
(iv)該分子の変化した立体構造特性に基づいて、核酸変異またはアミノ酸変異の存在を測定する工程
のうちの1以上を包含する、診断方法。 - 薬剤として、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、もしくは希釈剤を伴う、請求項1〜9のいずれかに記載の方法によって同定される因子の、使用。
- 増殖性疾患の処置における使用のための医薬の製造のための、請求項1〜9のいずれかに記載の方法によって同定される因子の、使用。
- 前記増殖性疾患が癌である、請求項23に記載の使用。
- 前記癌が、小児癌であり、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ユーイング肉腫家族腫瘍(ESFT)からなる群より選択される、請求項24に記載の使用。
- 前記癌が、癌腫、腺癌、リンパ腫または白血病である、請求項24に記載の使用。
- 前記疾患が、肝臓癌、肺癌、もしくは皮膚癌、または肝臓転移、肺転移、もしくは皮膚転移である、請求項23に記載の使用。
- 増殖性疾患を処置するための方法であって、該方法は、動物に、請求項1〜9のいずれかに記載の方法によって同定される因子を投与する工程を包含する、方法。
- 細胞分裂または細胞増殖を遅くするための医薬の製造のための、請求項1〜9のいずれかに記載の方法によって同定される因子の、使用。
- 請求項1〜9のいずれかの方法によって同定される診断剤、予後剤または治療剤を含む、キット。
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