ES2376746T3

ES2376746T3 - Proteína de replicación Ciz1

Info

Publication number: ES2376746T3
Application number: ES03782605T
Authority: ES
Inventors: Coverley Dawn
Original assignee: Cizzle Biotechnology Ltd
Current assignee: Cizzle Biotechnology Ltd
Priority date: 2002-12-05
Filing date: 2003-12-05
Publication date: 2012-03-16
Anticipated expiration: 2023-12-05
Also published as: US20160011200A1; EP1570268A2; EP2316966B1; CA2507403A1; ATE534902T1; EP1570268B1; HUE028241T2; JP2006508659A; WO2004051269A2; EP2316966A1; US20060155113A1; WO2004051269A3; MXPA05006034A; CA2507403C; US9541555B2; US20110070591A1; GB0228337D0; CN1720442A; AU2003290240B2; US7833702B2

Abstract

Método diagnóstico in vitro para la identificación de un trastorno proliferativo, que comprende detectar la presencia o la expresión de un polipéptido o molécula de ácidos nucleicos de Ciz1 que presenta una de las secuencias mostradas en las figuras 20 y 21.

Description

Proteína de replicación Ciz1.

La presente invención se refiere a un método de cribado para la identificación de agentes que modulan la actividad de una proteína de replicación del ADN como diana para la intervención en la terapia del cáncer, e incluye agentes que modulan dicha actividad.

Asimismo, la invención se refiere a la utilización de la proteína de replicación del ADN, y los transcritos de ARN del mismo en la prognosis y el diagnóstico de las enfermedades proliferativas, por ejemplo el cáncer.

Introducción

El inicio de la replicación del ADN es uno de los principales puntos de control del ciclo celular en los mamíferos, además del punto de acción de muchos productos génicos que se encuentran desregulados en el cáncer (Hanahan y Weinberg, 2000). El proceso de inicio implica el ensamblaje de proteínas del complejo de prerreplicación, que incluye las proteínas Cdc6, Cdt1 y Mcm del complejo de reconocimiento de origen (ORC), en los orígenes de replicación durante la etapa G1 del ciclo celular. A continuación, actúa un segundo grupo de proteínas que facilita la carga de las ADN polimerasas y de sus factores accesorios, incluyendo el PCNA, y la transición a la etapa S. El proceso de inicio se encuentra regulado por la proteína quinasa 2 dependiente de ciclina (Cdk2), Cdc7-dbf4 y el inhibidor de Cdt1 llamado geminina (para una revisión ver Bell y Dutta, 2002). En el núcleo de las células en etapa S, las horquillas de replicación se agrupan formando cientos de "focos" o fábricas de replicación (Cook, 1999). Las fábricas de replicación se unen aparentemente a un marco estructural dentro del núcleo; sin embargo, la naturaleza de las moléculas que forman la unión y su papel en la actividad de las horquillas de replicación sigue sin conocerse con exactitud.

La identificación de las proteínas implicadas en la replicación del ADN eucariótico y el análisis de las rutas básicas que regulan su actividad durante el ciclo celular ha sido impulsada principalmente por la genética de las levaduras. Estas proteínas y rutas generalmente se encuentran conservadas en levaduras y ser humano. Sin embargo, en organismos multicelulares, que se diferencian a lo largo de diversas rutas de desarrollo, se están descubriendo capas adicionales de complejidad. Por ejemplo, en vertebrados, varias proteínas implicadas en la diferenciación neuronal también regulan la transición de fases G1 a S (Ohnuma et al., 2001). Comprenden el inhibidor de Cdk p21CIP1/WAF1/SDI1, que está implicado en la diferenciación de los oligodendrocitos tras la detención del crecimiento (Zezula et al., 2001) y en la diferenciación terminal de otros tipos celulares (Parker et al., 1995).

El inicio de la replicación del ADN puede reconstituirse in vitro con núcleos aislados y extractos citosólicos procedentes de células de mamífero (Krude, 2000; Krude et al., 1997; Laman et al., 2001; Stoeber et al., 1998). Además, utilizando Cdk2 recombinante acomplejado con las ciclinas E o A, pueden reconstituirse independientemente el ensamblaje del complejo de replicación y la activación de la síntesis del ADN (Coverley et al., 2002). Se ha estudiado la etapa de activación, catalizada in vitro por ciclina A-cdk2, y han demostrado que una proteína relativamente no estudiada, la proteína de dedo de cinc de interacción con p21-Cip1 (Ciz1) funciona durante la etapa del proceso de inicio. La Ciz1 humana fue identificada anteriormente utilizando una modificación del cribado de dos híbridos de levadura con ciclina E-p21, y el análisis bioquímico corroboró la existencia de una interacción con p21 (Mitsui et al., 1999). Se propuso, aunque no demostró, un papel potencial en la transcripción, y no se atribuyó ninguna otra función a Ciz1. Más recientemente, se ha aislado el gen Ciz1 a partir de una biblioteca de ADNc derivada de meduloblastoma humano utilizando un modelo de tumorigénesis in vivo (Warder y Keherly, 2003). El análisis de los presentes inventores demuestra por primera vez que Ciz1 ejerce una función positiva en el inicio de la replicación del ADN.

Se produce una serie de cambios en las proteínas unidas a la cromatina al activarse la síntesis de AND in vitro con ciclina A-cdk2 recombinante. La presente invención se refiere al resultado de que un antígeno relacionado con cdc6, p85, se correlaciona con el inicio de la replicación del ADN y de que se encuentra regulado por la ciclina A-cdk2. La proteína ha sido clonada a partir de una biblioteca embrionaria de ratón y ha sido identificada como Ciz1 de ratón.

El análisis in vitro ha demostrado que la proteína Ciz1 regula positivamente el inicio de la replicación del ADN y que su actividad se encuentra modulada por la fosforilación de cdk en la treonina 191/2, ligándola a las rutas dependientes de cdk que controlan el inicio. La forma embrionaria de Ciz1 de ratón es procesada alternativamente, en contraste con las formas predichas y somáticas. La Ciz1 humana también se procesa alternativamente, con variabilidad en los mismos exones que la Ciz1 de ratón. Se ha encontrado que la forma embrionaria recombinante de Ciz1 estimula el inicio de la replicación del ADN de mamífero y que los cánceres pediátricos expresan formas "de tipo embrionario" de Ciz1. Sin limitarse a ninguna teoría en particular, se propone que el corte y empalme erróneo de Ciz1 produce formas de tipo embrionario de Ciz1 en tiempos inadecuados del desarrollo. Esto estimula la replicación incorrectamente regulada del ADN y contribuye a la formación o avance de linajes de células de cáncer.

Se han desarrollado varias técnicas en los últimos años que pretenden eliminar específicamente genes y/o productos génicos. Por ejemplo, la utilización de moléculas de ácidos nucleicos antisentido para unirse y de esta manera bloquear o inactivar moléculas de ARNm diana es un medio efectivo para inhibir la producción de productos génicos.

Una técnica mucho más reciente para eliminar específicamente la función génica es la introducción de ARN de doble cadena, también denominado ARN inhibidor (ARNi), en una célula, resultando en la destrucción del ARNm complementario a la secuencia incluida en la molécula de ARNi. La molécula de ARNi comprende dos cadenas complementarias de ARN (una cadena de sentido y una cadena antisentido) hibridadas entre sí formando una molécula de ARN de doble cadena. La molécula de ARNi típicamente deriva de la secuencia exónica o codificante del gen que debe anularse.

Tanto los ácidos nucleicos como las proteínas presentan una estructura de secuencia lineal, definida por su secuencia de bases o de aminoácidos, y también una estructura tridimensional que en parte está determinada por la secuencia lineal y también el ambiente en el que se localizan dichas moléculas. Las moléculas terapéuticas convencionales son moléculas de tamaño reducido, por ejemplo péptidos, polipéptidos o anticuerpos, que se unen a moléculas diana, produciendo un efecto agonista o antagonista. Se ha puesto de manifiesto que las moléculas de ácidos nucleicos también presentan un potencial con respecto a la provisión de agentes con las propiedades de unión necesarias que podrían presentar utilidad terapéutica. Estas moléculas de ácidos nucleicos típicamente se denominan aptámeros. Los aptámeros son moléculas de ácidos nucleicos pequeñas, habitualmente estabilizadas, que comprenden un dominio de unión para una molécula diana.

Los aptámeros pueden comprender por lo menos una base nucleótida modificada. La expresión "base nucleótida modificada" comprende nucleótidos con una base y/o azúcar modificado covalentemente. Por ejemplo, entre los nucleótidos modificados se incluyen nucleótidos que presentan azúcares que se unen covalentemente a grupos orgánicos de bajo peso molecular diferentes de un grupo hidroxilo en la posición 3' y diferentes de un grupo fosfato en la posición 5'. De esta manera, los nucleótidos modificados también pueden incluir azúcares 2'-sustituidos, tales como 2'-O-metilo, 2-O-alquilo, 2-O-alilo, 2'-S-alquilo, 2'-S-alilo, 2'-fluoro, 2'-halo o 2-azido-ribosa, análogos carbocíclicos de azúcares, azúcares a-anómericos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares piranosa, azúcares furanosa y sedoheptulosa.

Los nucleótidos modificados son conocidos de la técnica y comprenden, a título de ejemplo no limitativo, purinas y/o pirimidinas alquiladas, purinas y/o pirimidinas aciladas, u otros heterociclos. Estas clases de pirimidinas y purinas son conocidas de la técnica y entre ellas se incluyen pseudoisocitosina, N4,N4'-etanocitosina, 8-hidroxi-N6metiladenina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopentiladenina, 1metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxi-aminometil-2tiouracilo, �-D-manosilqueosina, 5-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, metil-éster de ácido uracilo-5-oxiacético, pseudouracilo, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5metiluracilo, metil-éster de ácido N-uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, queosina, 2-tiocitosina, 5propiluracilo, 5-propilcitosina, 5-etiluracilo, 5-etilcitosina, 5-butiluracilo, 5-pentiluracilo, 5-pentilcitosina y 2,6diaminopurina, metilpseudouracilo, 1-metilguanina y 1-metilcitosina.

Pueden sintetizarse los aptámeros utilizando nucleótidos convencionales unidos mediante enlaces fosfodiéster, mediante técnicas de síntesis estándares de sólidos o en fase solución conocidas de la técnica. Los enlaces entre nucleótidos pueden utilizarse moléculas de unión alternativas. Por ejemplo, grupos de unión de fórmula P(O)S (tioato), P(S)S (ditioato), P(O)NR'2, P(O)R', P(O)OR6, CO o CONR'2, en los que R es H (o una sal) o alquilo (C1-12) y R6 es alquilo (C1-9) unido a nucleótidos contiguos mediante -O- o -S-.

Otras técnicas que pretenden anular específicamente genes y/o producto génicos se centran en modular la función o interferir en la actividad de las moléculas de proteína. Las proteínas pueden ser las dianas de inhibidores químicos, obtenidos de, por ejemplo, bibliotecas existentes de moléculas pequeñas.

Pueden cultivarse anticuerpos, preferentemente monoclonales, por ejemplo en ratones o ratas frente a diferentes isoformas de proteína. Los anticuerpos, también conocidos como inmunoglobulinas, son moléculas de proteína que presentan especificidad para moléculas foráneas (antígenos). Las inmunoglobulinas (Ig) son una clase de proteínas relacionadas estructuralmente que consisten de dos parejas de cadenas polipeptídicas, un par de cadenas ligeras

(L) (de bajo peso molecular) (K o A) y un par de cadenas pesadas (H) (y, a, 1, 5 y E), las cuatro unidas mediante enlaces disulfuro. Tanto las cadenas H como las L presentan regiones que contribuyen a la unión de antígenos y que son muy variables de una a otra molécula de Ig. Además, las cadenas H y L contienen regiones que son no variables o constantes.

Las cadenas L están constituidas por dos dominios. El dominio carboxi-terminal es esencialmente idéntico en las cadenas L de un tipo dado y se hace referencia al mismo como región "constante" (C). El dominio amino-terminal varía de una cadena L a otro y contribuye al sitio de unión del anticuerpo. Debido a su variabilidad, se denomina región "variable" (V).

Las cadenas H de las moléculas de Ig son de varias clases: a, 1, 0, a y y (de la que existen varias subclases). Una molécula de Ig ensamblada está constituida por una o más unidades de dos cadenas H y L idénticas, deriva su nombre de la cadena H que presenta. De esta manera, existen cinco isotipos de Ig: IgA, IgM, IgD, IgE e IgG (con cuatro subclases basadas en las diferencias entre las cadenas H, es decir, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). Puede encontrarse más información sobre la estructura del anticuerpo y sus diversas funciones en: Using Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos recombinantes en los que la totalidad de las regiones V de un anticuerpo de ratón o rata se combinan con regiones de anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados son anticuerpos híbridos recombinantes que fusionan las regiones determinantes de complementariedad de una región V de anticuerpo de roedor con las regiones de marco de las regiones V de anticuerpo humano. Las regiones C del anticuerpo humano también se utilizan. Las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) son las regiones en el dominio N-terminal de tanto la cadena pesada como la ligera del anticuerpo en la que se restringe la mayor parte de la variación de la región V. Estas regiones forman bucles en la superficie de la molécula de anticuerpo. Estos bucles proporcionan la superficie de unión entre el anticuerpo y el antígeno.

Los anticuerpos procedentes de animales no humanos provocan una respuesta inmunológica frente al anticuerpo extraño y su eliminación de la circulación. Los anticuerpos tanto quiméricos como humanizados presentan una antigenicidad reducida al inyectarlos en un sujeto humano debido que existe una cantidad reducida de anticuerpo de roedor (es decir, extraño) dentro del anticuerpo híbrido recombinante, mientras que las regiones de anticuerpo humano no inducen una respuesta inmunológico. Esto resulta en una respuesta inmunológica más débil y en una reducción de la eliminación del anticuerpo. Esto resulta claramente deseable al utilizar anticuerpos terapéuticos en el tratamiento de enfermedades humanas. Los anticuerpos humanizados están diseñados para presentar menos regiones de anticuerpo "extraño" y, por lo tanto, se cree que son menos inmunogénicas que los anticuerpos quiméricos.

Entre otras técnicas para la dianización al nivel de las proteínas se incluyen la utilización de péptidos generados aleatoriamente que se unen específicamente a proteínas, y cualquier otra molécula que se una a proteínas o variantes de proteína y modifique la función de las mismas.

La comprensión del proceso de replicación del ADN resulta de especial interés en el campo de la terapia del cáncer. Es conocido que las células de cáncer pueden adquirir resistencia frente a agentes quimioterapéuticos y pueden evitar la detección por parte del sistema inmunológico. Existe una necesidad continuada de identificación de dianas para la terapia del cáncer de manera que puedan identificarse nuevos agentes. El proceso de replicación del ADN representa una diana importante para la intervención farmacológica en la terapia del cáncer. Existe una necesidad de identificar productos génicos que modulen la replicación del ADN y que contribuyan a la formación o avance de linajes de células de cáncer y de desarrollar agentes que afectan a su función.

Descripción de la invención

Según la presente invención está previsto un método diagnóstico in vitro para la identificación de un trastorno proliferativo que comprende detectar la presencia o expresión de un polipéptido o molécula de ácido nucleico de Ciz1 que presenta una de las secuencias mostradas en las figuras 20 y 21.

Preferentemente, dicho método diagnóstico comprende las etapas siguientes:

(i): poner en contacto una muestra aislada a partir de un sujeto que debe someterse a ensayo, con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido Ciz1 que presenta una secuencia mostrada en la figura 20, y

(ii): detectar o medir la unión de dicho anticuerpo a dicho polipéptido Ciz1 en dicha muestra.

En una forma de realización, el polipéptido Ciz1 presenta la secuencia de aminoácidos etiquetada como "Exón 4 ausente" mostrada en la figura 20A.

En otra forma de realización, el polipéptido Ciz1 presenta la secuencia de aminoácidos denominada "variante sin exón 14" mostrada en la figura 20B.

En otra forma de realización, el polipéptido Ciz1 presenta la secuencia de aminoácidos denominada "variante sin exón 4 ni parcialmente exón 6" mostrada en la figura 20B.

En una forma de realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

En una forma de realización, la molécula de ácido nucleico de Ciz1 presenta la secuencia polinucleótida mostrada en la figura 21B.

En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico de Ciz1 presenta la secuencia polinucleótida mostrada en la figura 21G.

En otra forma de realización, la molécula de ácido nucleico de Ciz1 presenta la secuencia polinucleótida mostrada en la figura 21H.

En una forma de realización, el trastorno proliferativo es el cáncer.

En una forma de realización, el cáncer es un cáncer pediátrico seleccionado de entre el grupo que consiste de retinoblastoma, neuroblastoma, linfoma de Burkett, meduloblastoma y tumores de la familia del sarcoma de Ewings.

En otra forma de realización, el cáncer es carcinoma, adenocarcinoma, linfoma o leucemia.

En otra forma de realización, el cáncer es cáncer de hígado, pulmón o piel.

El diagnóstico puede proporcionar una medida cuantitativa del ARN o variantes de proteína de Ciz1 en una muestra.

Descripción detallada de la invención.

A continuación se describe únicamente a título de ejemplo y haciendo referencia a las figuras siguientes, una forma de realización de la invención:

Fig. 1. Ilustración del efecto de la ciclina A-cdk2 sobre los núcleos en el G1 tardío.

A) El anticuerpo V1 anti-Cdc6 detecta el Cdc6 de ratón y un segundo antígeno en transferencias western de extracto de células completas 3T3, que migra con una Mr aproximada de 100 kDa (basándose en la movilidad de la proteína Mcm3, se estimó previamente en un valor más próximo a 85 kDa, de manera que el antígeno se denominó p85; se ha mantenido el mismo nombre en la presente memoria en aras de la claridad). P85 se encuentra presente tanto en la fracción soluble con en la fracción nuclear insoluble (preparada para condiciones de replicación in vitro).

B) Inicio de la síntesis del ADN en núcleos en etapa G1 "competentes para la replicación" con extracto en etapa G1 suplementado con ciclina A-cdk2 recombinante. La columna de control muestra la proporción de núcleos ya en la etapa S (no sombreada), y aquéllas que han iniciado la replicación en el extracto de células en la etapa S (sombreada).

C) Tras 15 minutos bajo condiciones de replicación sin células, se lavaron los núcleos y se aisló nuevamente la fracción de cromatina y se separó mediante SDS-PAGE y se transfirió para identificar Mcm2 y Mcm3.

D) Mismos núcleos transferidos con anticuerpo V1. El antígeno p85 es más abundante en núcleos expuestos a concentraciones de ciclina A-cdk2 que inducen el inicio. Se utilizó anticuerpo V1 para clonar el gen de p85 a partir de una biblioteca de expresión procedente de embriones de ratón que se identificó que era de Ciz1.

Fig. 2. Alineación de variantes de Ciz1 de ratón. La secuencia de aminoácidos de Ciz1 de longitud completa predicha ("Completa") es idéntica a un clon de ADNc de tumor mamario de ratón (BC018483), mientras que la Ciz1 embrionaria ("ECiz1", AJ575057) y un clon derivado de melanoma (AK089986) no presentan dos secuencias internas discretas. Además, la primera metionina disponible en ECiz1 se encuentra en la parte central del exón 3 (Met84), que excluye una región rica en poliglutamina del extremo N-terminal. El AK089986 derivado de melanoma puede encontrarse incompleto, ya que finaliza 77 codones antes del extremo C-terminal de todos los demás clones de ratón y humanos. Los asteriscos indican los aminoácidos modificados mediante mutagénesis sitio-dirigida en los constructos mostrados en D. Los aminoácidos que corresponden a codones que son diana de los ARNip se encuentran subrayados.

B) La Ciz1 de ratón se encuentra codificada por, como mínimo, 17 exones. Los exones codificantes se muestran en gris, las regiones procesadas alternativamente se muestran en negro y las regiones no traducidas, en blanco. Se incluyen dos secuencias de exón 1 alternativas en algunos transcritos de Ciz1 (no representadas), pero todavía no se ha encontrado un sitio de inicio traduccional alternativo cadena arriba de los dos ilustrados en la presente memoria.

C) Características de secuencia y dominios putativos en ECiz1. Se muestran la secuencia predicha de localización nuclear (NLS), los sitios putativos de fosforilación de quinasa dependiente de ciclina, los dedos de cinc de tipo C2H2 y un dominio C-terminal con homología respecto a la proteína de matriz nuclear matrina 3 (Nakayasu y Berezney, 1991). Las posiciones de las secuencias ausentes de ECiz1 se indican mediante triángulos.

D) ECiz1 y mutantes derivados por truncado y puntuales utilizados en experimentos de replicación de ADN libres de células. Los números entre paréntesis se refieren a las posiciones aminoácidas en la forma de longitud completa de la Ciz1 de ratón, mostrada en A. Los asteriscos indican los sitios putativos de fosforilación anulados mediante mutágenesis sitio-dirigida.

Fig. 3. Muestra los efectos de la proteína Ciz1 y fragmentos derivados en experimentos de replicación del ADN libre de células e ilustra que ECiz1 estimula el inicio de la replicación del ADN de mamífero. A) La ECiz1 recombinante estimula el inicio de la replicación del ADN en núcleos en etapa G1 "competentes para la replicación" durante la incubación en extracto en etapa S. El histograma muestra el número medio de núcleos que incorporaron nucleótidos biotinilados in vitro (en negro), en presencia o en ausencia de ECiz1 ectópico, con desviaciones estándar calculadas a partir de cuatro experimentos independientes. El 17% de los núcleos que ya se encontraban en etapa S al crear la preparación nuclear se muestran en blanco. Las imágenes muestran núcleos en replicación in vitro, con o sin ECiz1 1 nM. Todos los núcleos se contratiñeron con yoduro de propidio (rojo).

B) La respuesta a ECiz1 recombinante era dependiente de la concentración, con un óptimo estrecho en el rango nM. En el presente experimento, y en todos aquellos mostrados en B-I, los resultados se expresan como % de inicio y no como % de replicación. Lo anterior se calcula a partir del número de núcleos con inicio in vitro y del número de núcleos que son "competentes" para el inicio in vitro (ver la sección de métodos).

C) Las treoninas 191/2 se encontraban implicadas en la regulación de la actividad de replicación del ADN de Ciz1, ya que el mutante T(191/2)A del sitio cdk de ECiz1 escapaba a la supresión a concentraciones elevadas.

D) El mutante T(293)A del sitio de Cdk estimulaba el inicio con un perfil similar a ECiz1 pero a concentraciones más bajas.

E) ECiz1 truncado (Nterm 442) no presentaba secuencias C-terminales, pero estimulaba el inicio in vitro en un grado similar a ECiz1.

F) Cterm 274 no conservaba ninguna actividad de replicación del ADN en el presente ensayo.

G, H, I) El análisis adicional de deleción en los dos tercios N-terminales de la proteína ECiz1 mostraba que una región corta situada 3' respecto al exón 8 resultaba necesaria para la función de Ciz1 al someterla a ensayo in vitro.

Fig. 4. Caracterización de anticuerpos policlonales anti-Ciz1 e identificación de las bandas relacionadas con Ciz1 de 125 kDa.

A) Gel de SDS-polacrilamida teñido con Coomassie que muestra el fragmento de ECiz1 recombinante purificado Nterm442, y filtros western de Nterm442 recombinante utilizando el anticuerpo V1 anti-Cdc6 y los anticuerpos 1793 y 1794 anti-Ciz1.

B) Transferencia western de extracto de células 3T3 completas. De las dos bandas detectadas por el anticuerpo 1793 anti-Ciz1, uno presentaba la misma movilidad que p85-Ciz1 (100 kDa) reconocida por el anticuerpo Z1 y el otro presentaba una Mr aparente de 125 kDa. El anticuerpo 1794 anti-Ciz1 reconoce únicamente la forma de 125 kDa de Ciz1 (y un segundo antígeno de aproximadamente 80 kDa).

C) Inmunoprecipitación a partir de extracto nuclear de células 3T3 utilizando anticuerpo V1 o 1793 anti-Ciz1. Ambos anticuerpos precipitaron p85, que se reconoce por el anticuerpo recíproco en filtros western. P125 resulta precipitado por el anticuerpo 1793, y en menor grado por el anticuerpo V1, y estos resultan reconocidos por 1793 en filtros western. Se muestra mcm3 a modo de control.

Fig. 5. Análisis de inmunofluorescencia de Ciz1 endógeno. La Ciz1 reside en focos subnucleares que se solapan con sitios de replicación del ADN.

A) Ciz1 endógena (en rojo) en células 3T3 fijadas antes (sin tratar) o después (tratadas con detergente) de la exposición a TritonX100, detectadas con anticuerpo 1793 anti-Ciz1. Los núcleos contratiñeron con Hoescht 33258 (azul). A título comparativo se muestra Cdc6 (en verde) detectado con anticuerpo monoclonal específico para Cdc6.

B) La inclusión de la Ciz1 recombinante bloquea la reactividad del anticuerpo 1793 con los núcleos tratados con detergente.

C) La Ciz1 resistente a detergente (en rojo) se encontraba presente en todos los núcleos en poblaciones ciclantes, mientras que el PCNA resistente a detergente (en verde) persistía únicamente en núcleos en etapa S.

D) Secciones confocales a alta magnificación de Ciz1 y PCNA resistentes a detergente, e imagen fusionada que muestra la colocalización de los focos (en amarillo).

E) Gráficos de línea de fluorescencias roja y verde de la imagen fusionada en D, en las posiciones indicadas (i e ii).

F) Gráfico de correlaciones cruzadas (Rubbi y Milner, 2000; van Steensel et al., 1996) para focos verdes en comparación con los rojos en la totalidad de la imagen fusionada en D, y (gráfico insertado) para la sección señalada tras la búsqueda de valores umbral ("thresholding") a los niveles mostrados en Eii. La línea roja en el gráfico insertado en F muestra la pérdida de correlación al rotar 90º la imagen de Ciz1 con respecto a PCNA. La barra indica 10 μM.

Fig. 6. Interferencia de ARN. La reducción de Ciz1 inhibe la etapa S.

A) Los ARNip con diana en transcritos de Ciz1 en cuatro sitios (ver la fig. 2A) se aplicaron individualmente a células 3T3 ciclantes en forma de una única dosis de 3 nM y se realizó un seguimiento del número de células en los tiempos indicados. Se muestran imágenes de poblaciones celulares a las 16 y 40 horas tras la transfección con ARNip 8 (silueta roja) o células tratadas con placebo (silueta azul).

B) Proteína Ciz1 detectada con 1793 anti-Ciz1 (en verde) 48 horas después de la exposición a ARNip de Ciz1 (4 y 8)

: o ARNip de GAPDH de control.

C) Niveles de transcritos de Ciz1, GAPDH y �-actina en células expuestas durante 24 horas a ARNip de Ciz1 (4 y 8)

: o a ARNip de GAPDH de control. Los números entre paréntesis reflejan la intensidad de las bandas en unidades arbitrarias, y la reducción global de los transcritos de Ciz1 y GAPDH (normalizados frente a la �-actina) se expresa en porcentaje.

D) La proporción de células que incorporaron BrdU en el ADN (en verde) se redujo significativamente en las células con niveles reducidos de Ciz1 48 horas después del tratamiento con ARNip de Ciz1. El histograma muestra los resultados de medias de cuatro experimentos independientes.

E) El número de núcleos con Mcm3 resistente a detergente (en verde) se incrementa en poblaciones tratadas con ARNip de Ciz1.

F) La proporción de núcleos con PCNA resistente a detergente (en verde) también se incrementa bajo estas condiciones. Todos los núcleos han sido contrateñidos y se muestran en color falso (rojo).

Fig. 7. Análisis de RT-PCR de la expresión de una variante de procesamiento alternativo de los exones 3/4 de Ciz1 en células germinales primordiales de ratón y en células madre embrionarias. Los exones 3 y/o 4 se procesan alternativamente en estos tipos celulares, pero no en el corazón neonatal. Estos datos son consistentes con la hipótesis de que La Ciz1 de longitud completa es la forma predominante en el tejido somático neonatal, y que las variantes se observan más frecuentemente antes durante el desarrollo y en tejidos de la línea germinal.

Fig. 8. Transfección transitoria de células 3T3 de ratón.

A) Se transfectaron constructos de Ciz1 etiquetados con GFP en células NIH3T3, o B) se microinyectaron en el pronúcleo macho de huevos de ratón fertilizados en la etapa unicelular. A las 24 horas, Ciz1 y ECiz1 se habían localizado en el núcleo formando un patrón moteado subnuclear, mientras que GFP solo se encontraba presente tanto en el núcleo como en el citoplasma.

C) Imágenes de alta magnificación de núcleos de células 3T3 vivas 24 horas después de la transfección que muestran la organización subnuclear de Ciz1 y ECiz1 etiquetados con EGFP y fragmentos derivados en los que se ha eliminado el fragmento C-terminal (equivalente a Cterm274). En ausencia de los dominios C-terminales, GFP-ECiz1 se localiza difusamente en el núcleo 24 horas después de la transfección, mientras que GFP-Ciz1 se agrega formando uno o dos agregados de gran tamaño en el interior del núcleo.

D) El dominio 274 C-terminal solo es citoplasmático hasta después de que las células hayan pasado la mitosis (muy probablemente debido a la falta de secuencias de localización nuclear y a la entrada pasiva al núcleo), aunque una vez dentro se une a estructuras nucleares y se condensa con cromosomas.

E) Se muestran imágenes representativas de GFP-Ciz1 (verde), BrdU (rojo) y núcleos totales (azul) en una población marcada con BrdU durante las primeras 12 horas tras la transfección. Los histogramas muestran la proporción de células transfectadas (en verde) que han incorporado BrdU en comparación con el número de células no transfectadas (gris) en tres ventanas de marcaje separadas. Durante el periodo de 0 a 22 horas posterior a la transfección, las células en ciclado rápido mostraron un incremento consistente de la fracción marcada con BrdU al ser transfectadas con Ciz1 o ECiz1. Se obtuvieron resultados similares con cultivos densos en los que la mayoría de células había salido del ciclo celular y había entrado en quiescencia. Sin embargo, al exponer las células en ciclado rápido a BrDu durante un pulso corto (de 20 minutos) 22 horas después de la transfección, el número de células en las que se producía síntesis de ADN se redujo en las poblaciones transfectadas con Ciz1 y ECiz1 en comparación con los controles no transfectados y con células transfectadas con GFP solo. Lo anterior indica que, a las 22 horas, la síntesis de ADN había cesado en células que expresaban Ciz1.

Fig. 9. Potencial de proliferación y morfología celular alterados en poblaciones transfectadas. Agrupaciones celulares que aparecen en las poblaciones transfectadas de células 3T3.

A) Las células se transfectaron con los dos tercios N-terminales de Ciz1 o ECiz1 (Nterm442) etiquetados con GFP y se mantuvieron bajo selección con 50 μg/ml de G418. Tras tres semanas bajo selección, los agregados celulares eran visibles con células positivas para GFP en el interior.

Fig. 10. Variantes de procesamiento de la Ciz1 humana en cánceres pediátricos. Existen siete ADNc de Ciz1 humana en las bases de datos públicas, pero sólo uno se deriva de tejido adulto normal (células B) y contiene todos los exones predichos. Los otros seis se derivan de células embrionarias o de cánceres pediátricos. Cinco de ellos han sido procesados alternativamente con variabilidad en los exones 2, 3, 6 y 8 (por ejemplo la ECiz1 de ratón) y también en el exón 4 (tal como las células ES de ratón, las células germinales primordiales y testiculares). El sexto (AF159025) no presenta la primera metionina y contiene polimorfismos de un único nucleótido que dan lugar a sustituciones de aminoácidos. Todas las diferencias respecto a la secuencia predicha (AB030835) han sido señaladas.

Fig. 11. Análisis de las secuencias EST. En cada mapa se incluye una representación esquemática de la proteína Ciz1 como referencia, que muestra las posiciones de los exones alternativamente procesados (en negro), los dominios putativos de interacción con la cromatina (en gris) y los dedos de cinc predichos (líneas verticales negras). Todas las secuencias EST están acompañadas de su número de acceso Genbank con la indica la biblioteca a partir de la que se derivaron entre paréntesis. Las secuencias ausentes de las ESTs de Ciz1 debido al procesamiento alternativo se muestran en amarillo, los desplazamientos de marco en rojo y las deleciones putativas en gris. Los polimorfismos de un único nucleótido que dan lugar a sustituciones de aminoácidos se indican con puntos negros y algunos de ellos se producen en un sitio de fosforilación cdk de consenso que los presentes inventores han demostrado que resulta importante para la regulación de la actividad de Ciz1 (puntos azules). La posición de la secuencia insertada en la línea celular de carcinoma MGC102 se indica con un triángulo.

A) ESTs traducidas procedentes de cánceres pediátricos y de cánceres neurales adultos.

B) ESTs traducidas procedentes de diversas células y tejidos no cancerosos.

C) ESTs traducidas procedentes de leucemias, linfomas y de células hematopoyéticas y linfocíticas normales.

D) ESTs traducidas procedentes de carcinomas.

E) ESTs traducidas procedentes de un abanico de otros cánceres.

F) Resumen de las regiones alternativamente procesadas en la Ciz1 humana que muestra secuencias incluidas condicionalmente.

Fig. 12. Expresión de variante de procesamiento de Ciz1 en las líneas celulares tumorales de sarcoma de Ewings (ESFT) y en líneas celulares de neuroblastoma.

A) Se sometieron a análisis de RT-PCR con 4 conjuntos de cebadores diferentes muestras de ARN completo procedente de seis líneas celulares ESFT independientes, de dos neuroblastomas y de una línea celular de control (células HEK293). Las líneas celulares ESFT eran: 1) A673, 2) RDES, 3) SKES1, 4) SKN-MC, 5) TC3 y 6) TTC466. Las líneas celulares de neuroblastoma eran: 1) IMR32 y 2) SKNSH.

B) Análisis de productos de PCR de los exones 3/4/5 de Ciz1 en ESFTs y neuroblastoma. Los productos de los cebadores h3 y h4 (que comprendían los exones potencialmente variables 4 y 6) se analizaron con mayor detalle. Se purificaron los fragmentos de PCR a partir de geles de agarosa mediante procedimientos estándares, se subclonaron y se secuenciaron para identificar la fuente de las variaciones de tamaño de los fragmentos. Se secuenciaron entre uno y once clones individuales para cada una de las siete líneas celulares y se resumen los resultados en forma de tabla. Ciz1 de las líneas celulares ESFT no presenta exón 4 en 31% de los transcritos globalmente, y en algunas líneas ESFT este nivel es más próximo a 50%. DSSSQ más frecuentemente se encuentra ausente en las dos líneas celulares de neuroblastoma sometidas a ensayo en la presente memoria.

Fig. 13. Isoformas de Ciz1 en fibroblastos humanos normales (Wi38) y en líneas celulares de cáncer de próstata metastásico (PC3 y LNCAP). Ambas líneas celulares de cáncer de próstata contienen un exceso de de la variante p125 de Ciz1 de mayor tamaño en la fracción nuclear, en comparación con la línea celular no de cáncer.

B) Modelos para la producción de p85 (100) a partir de variantes de p125 mediante procesamiento de las proteínas durante el inicio de la replicación del ADN.

Fig. 14. Ilustra la secuencia de ARNm de ratón de longitud completa.

Fig. 15. Ilustra la secuencia de ARNm humano de longitud completa.

Fig. 16. Ilustra la secuencia de proteína de ratón de longitud completa.

Fig. 17. Ilustra la secuencia de la proteína humana de longitud completa.

Fig. 18. Ilustra las secuencias de proteína procesadas alternativamente. Las secuencias mostradas se encuentran ausentes en las secuencias de proteína procesadas.

Fig. 19. Ilustra las secuencias de ARNm humanas alternativamente procesadas. Las secuencias mostradas se encuentran ausentes en las secuencias de proteína procesadas.

Figs. 20A y B. Ilustran las secuencias de unión únicas creadas en las proteínas Ciz1 humanas por exones faltantes. Las secuencias de unión representan los sitios diana principales para agentes terapéuticos.

Fig. 21A a H. Ilustran las secuencias de unión creadas en ARNm de la Ciz1 humana.

Identificación de Ciz1. Se ha aprovechado un anticuerpo policlonal (anticuerpo V1) cultivado contra la Cdc6 humana recombinante (Coverley et al., 2000; Stoeber et al., 1998; Williams et al., 1998) con el fin de identificar y estudiar un antígeno desconocido cuyo comportamiento se correlaciona con el inicio de la replicación del ADN in vitro. El antígeno presenta una Mr aparente de 100 kDa (denominado p85) y es fácilmente detectable en extractos procedentes de células 3T3 (fig. 1A).

La síntesis de ADN puede activarse en experimentos de replicación libres de células utilizando núcleos en etapa G1 tardía "competentes para la replicación", en extractos en G1 y ciclina A-cdk2 recombinante. Bajo estas condiciones, los núcleos incorporan nucleótidos marcados en el ADN naciente, de un modo estrictamente dependiente de la concentración de proteína quinasa activa (fig. 1B). En valores superiores e inferiores a la concentración óptima no tiene lugar inicio de la replicación del ADN. Sin embargo, se producen otros sucesos inversamente correlacionados con el inicio (Coverley et al., 2002). Los presentes inventores utilizan en la presente invención la activación de la síntesis del ADN (fig. 1B) y la fosforilación de Mcm2 (que resulta en una movilidad incrementada, fig. 1C), con el fin de calibrar los efectos de la ciclina A-cdk2 recombinante en experimentos de replicación libres de células, y correlacionan el comportamiento de p85 con la activación de la síntesis de ADN.

En los núcleos en G1 aislados nuevamente a partir de reacciones que contienen concentraciones inductoras de inicio de ciclina A-cdk2, el antígeno p85 es más prevalente en comparación con los núcleos expuestos a concentraciones más bajas o más altas de quinasa (fig. 1D). Lo anterior sugiere que p85 se encuentra regulada a cierto nivel por la ciclina A-cdk2 de una manera que es coincidente con la activación de la síntesis del ADN. Ningún otro antígeno se correlaciona de modo tan estrecho con esta etapa en el proceso de inicio libre de células, por lo tanto los presentes inventores utilizaron anticuerpo V1 para clonar el gen para p85 de ratón.

Al aplicarlo a una biblioteca de expresión de ADNc derivada de embriones de ratón de 11 días, el anticuerpo V1 seleccionó dos clones que sobrevivieron múltiples rondas de cribado (ver la sección de métodos). Uno codificaba la Cdc6 de ratón, mientras que la otra codificaba 716 aminoácidos del homólogo murino de la Ciz1 humana (Mitsui et al., 1999). La Ciz1 humana y de ratón de longitud completa presentan una homología global de aproximadamente 70% al nivel de los aminoácidos, con una homología máxima (>80%) en las regiones N-terminales y C-terminales. Ciz1 se encuentra conservado entre los vertebrados debido a que existen homólogos en la rata y el fugu, pero no han podido identificarse proteínas con un grado elevado de homología o con una estructura de dominios similar en los eucariotas inferiores, planteando la posibilidad de que Ciz1 evolucionó para llevar a cabo una función especializada en el desarrollo de los vertebrados.

Una publicación anterior sobre la Ciz1 humana (Mitsui et al., 1999) ha demostrado que interactúa con la proteína de ciclo celular p21-CIP1, llevando a que se investigase la proposición de que actúa como factor de transcripción, no como factor de replicación del ADN. Un segundo artículo (Warder y Keherly, 2003) publicado tras la fecha de prioridad de la presente solicitud de patente sugiere un papel para Ciz1 en la tumorigénesis, pero no demuestra ninguna función en la replicación del ADN ni reconoce la importancia de la expresión de variantes de procesamiento de Ciz1.

Múltiples isoformas de Ciz1. El marco de lectura abierto de Ciz1 de ratón predicho y un ADNc derivado de una biblioteca de tumor mamario de ratón (BC018483) contiene tres regiones que no se encuentran presentes en el clon embrionario de la presente invención (AJ575057), en lo sucesivo denominado ECiz1 (fig. 2A). Las regiones regiones variables en ECiz1 aparentemente son el resultado del procesamiento alternativo de los exones 2/3, 6 y 8 (fig. 2B). el clon de melanoma de ratón AK089986 no presenta dos de las tres regiones de ECiz1 (fig. 2A), mientras que la tercera codifica un tramo poliglutamina N-terminal que también se encuentra ausente de los clones derivados de meduloblastoma humano. Un cuarto bloque de secuencia derivado de los exones 3/4 se encuentra ausente de los transcritos de Ciz1 derivados de las células ES de ratón y del exón 4 en las células germinales primordiales de ratón (fig. 7). La Ciz1 humana también se procesa alternativamente al nivel del ARN, rindiendo transcritos que excluyen combinaciones de los mismos cuatro bloques de secuencia que Ciz1 de ratón (ver posteriormente). De hecho, todas las variaciones conocidas de los ADNc de Ciz1 de ratón presentan paralelos humanos estrechamente similares, algunos de los cuales son idénticos al nivel de los aminoácidos. Esto sugiere que las diferentes isoformas de Ciz1 presentan un significado funcional. Una quinta región variable (todavía no observada en el ratón) se procesa alternativamente en los transcritos de Ciz1 humana derivados principalmente de carcinomas.

Los datos sugieren que las formas más cortas de Ciz1 (que no presentan los exones alternativamente procesados) son más prevalentes precozmente durante el desarrollo y en linajes celulares que dan lugar a la línea germinal. En el análisis mostrado en la fig. 7, únicamente Ciz1 procedente de corazón neonatal totalmente desarrollado no mostraba ningún procesamiento alternativo, mientras que todos los tipos embrionarios embrionarios contienen formas alternativamente procesadas. Además, los únicos ADNc de Ciz1 completos en las bases de datos públicos (humanos o de ratón) se derivan de tipos celulares no embrionarios y los únicos derivados de fuentes embrionarias se procesan alternativamente. Por lo tanto, la expresión de una variante de procesamiento de Ciz1 aparentemente se produce diferencialmente en tipos celulares que todavía no se han diferenciado por completo.

Notablemente, los ADNc de Ciz1 procedentes de cánceres pediátricos también se procesan alternativamente (ver posteriormente). Esto conduce a la hipótesis de que la expresión de la isoforma de Ciz1 correcta en el punto correcto del desarrollo conduce a una actividad de Ciz1 incorrectamente regulada. Esto podría contribuir a una proliferación y transformación celular no programadas.

ECiz1 estimula la replicación del ADN in vitro. Tras la exposición a extracto citosólico procedente de células en etapa S, los núcleos en etapa G1 tardía inician la replicación del ADN e inician la síntesis de ADN naciente (Krude et al., 1997). Se utilizó este ensayo libre de células para someter a ensayo el efecto de ECiz1, y fragmentos recombinantes derivados, sobre la síntesis del ADN (fig. 3). La proteína ECiz1 de longitud completa consistentemente incrementó el número de núcleos que se replicaban in vitro, de 30% (+/-0,9%) a 46% (+/-5,5%), lo que sugiere que Ciz1 eslimitante para el inicio en extractos en etapa S (fig. 3A). Únicamente dos otras clases de proteína (las quinasas dependientes de ciclina, Coverley et al., 2002; Krude et al., 1997; Laman et al., 2001, y la proteína Cdc6, Coverley et al., 2002; Stoeber et al., 1998) se ha encontrado previamente que estimulan el inicio libre de células. De esta manera, ECiz1 es la primera proteína que presentando esta actividad no se conocía ya su participación en el proceso de la replicación. El efecto positivo de ECiz1 recombinante sobre el inicio libre de células apoya que la Ciz1 endógena desempeñe un papel positivo en la replicación del ADN en las células de mamífero.

La estimulación libre de células del inicio es dependiente de la concentración, con actividad máxima en el extracto en etapa S en aproximadamente 1 nM (fig. 3B). Este resultado es similar al obtenido en análisis libres de células anteriores con otras proteínas recombinantes (Coverley et al., 2002; Krude et al., 1997), en los que la estimulación del inicio típicamente alcanza un máximo y después cae nuevamente al nivel no estimulado a concentraciones altas. Para ECiz1, el motivo de la caída de actividad a concentraciones altas todavía se desconoce. Sin embargo, los estudios de mutagénesis (ver posteriormente) sugieren que el mecanismo de restricción probablemente se encuentra activo y es específico, y no que se debe a un desequilibrio general de la composición de los complejos de proteínas de orden más alto.

La regulación negativa de ECiz1 implica las treoninas 191/192. Probablemente Ciz1 es una fosfoproteína in vivo, ya que contiene numerosos sitios putativos de fosforilación y muestra una movilidad alterada al tratar extractos de células 3T3 con fosfatasa lambda (no mostrado). La Ciz1 murina contiene dos motivos de unión de RXL-ciclina y cinco sitios putativos de fosforilación de cdk, que se encuentran presentes en todas las variantes conocidas. Cuatro de ellas se encuentran localizadas en el fragmento N-terminal de ECiz1 que contiene actividad de replicación in vitro (ver posteriormente) y uno es contiguo al sitio en el que el exón 6 se procesa alternativamente para excluir un motivo de secuencia DSSSQ corto (fig. 2A, C). Debido a que este motivo es 100% idéntico y procesado alternativamente tanto en el ratón como en el ser humano, se consideró que la inclusión condicional podría servir para regular la actividad de Ciz1, identificando esta región de la proteína como potencialmente importante. Por lo tanto, se eligió centrarse en el sitio cdk, que se encuentra cuatro residuos cadena arriba y que también se encuentra conservado en el ratón y en el ser humano, mediante la combinación de un enfoque genético y ensayos de replicación libres de células. Partiendo de ECiz1, se cambiaron las treoninas en 191 y 192 por dos alaninas, generando ECiz1T(191/2)A (fig. 2D). Al someterla a ensayo in vitro para la actividad de replicación del ADN, ECiz1T(191/2)A estimuló el inicio en núcleos en G1 tardía en un grado similar a ECiz1 (fig. 3C). Sin embargo, al contrario que ECiz1, la estimulación del inicio se mantuvo a través de un abanico amplio de concentraciones que se extendía abrazando por lo menos tres órdenes de magnitud. Por lo tanto, existe un mecanismo que restringe la actividad del exceso de ECiz1 y que funciona en un ambiente libre de células. En un constructo separado, la treonina en la posición 293 también se cambió por alanina, generando ECiz1T(293)A (fig. 2D), aunque esta alteración presentó poco efecto sobre la actividad de ECiz1 según el ensayo in vitro (fig. 3D).

Estos resultados demuestran que la regulación negativa de la actividad de ECiz1 implica la treonina 191/2 y probablemente está causada por la fosforilación mediada por quinasa dependiente de ciclina en este sitio. Esto liga la actividad de Ciz1 a las rutas dependientes de cdk que controlan todos los sucesos principales del ciclo celualr, incluyendo el inicio de la replicación del ADN.

La mayoría de proteínas del complejo de prerreplicación y muchas proteínas de la horquilla de replicación se encuentran fosforiladas in vivo, con frecuencia por quinasas dependientes de ciclina (Bell y Dutta, 2002; Fujita, 1999). Los datos sugieren que la acumulación nuclear de antígeno p85-Ciz1 se encuentra regulada (directa o indirectamente) por ciclina A-cdk2, y demuestra que un sitio de fosforilación de cdk de consenso en la treonina 191/192 participa en el control de la actividad de Ciz1. Al provocar que este sitio no sea fosforilable, se mantiene la actividad de Ciz1 en un abanico más amplio de concentraciones en ensayos libres de células. Por lo tanto, la actividad de Ciz1 normalmente se encuentra regulada negativamente por la modificación en este sitio. Las funciones de los demás sitios de fosforilación de cdk conservados, y el efecto de la inclusión condicional de un motivo de unión de RXL-ciclina en la parte N-terminal procesada alternativamente de Ciz1, todavía no han sido determinados. De esta manera, la simple relación negativa entre la actividad de Ciz1 y la fosforilación dependiente de cdk que se ha descubierto en la presente memoria es improbable que sea la historia completa. Sin embargo, el análisis de los presentes inventores hasta el momento relaciona Ciz1 con las rutas dependientes de cdk que controlan todas las transiciones principales del ciclo celular, y por lo tanto concuerda con la conclusión principal de que Ciz1 participa en el inicio de la replicación del ADN.

La actividad de replicación in vitro reside en el extremo N-terminal. Ciz1 presenta varias actividades C-terminales que podrían anclar la proteína dentro del núcleo. El dominio de matrina 3 sugiere la interacción con la matriz nuclear y los tres dedos de cinc implican la interacción con ácidos nucleicos. En efecto, datos recientes sugieren que la Ciz1 humana se une a ADN de una manera débilmente específica de secuencia (Warder y Keherley, 2003). Para determinar si los dominios C-terminales resultan importantes para la actividad de replicación de ECiz1 se dividió la proteína en dos fragmentos (fig. 2D). Nterm442 (que contiene el NLS, dos sitios cdk conservados, un dedo de cinc y todos los sitios conocidos en los que se ha observado procesamiento variable) estimula el inicio en un grado similar y a la misma concentración que ECiz1 (fig. 3E). En contraste, la parte C-terminal (Cterm274) no contiene ninguna actividad de replicación residual (fig. 3F). Por lo tanto, el dominio de matrina 3, uno de los sitios de fosforilación de la quinasa dependiente de ciclina, y dos de los dedos de cinc no resultan necesarios para la actividad de replicación del ADN de ECiz1, al someterlos a ensayo in vitro. Sin embargo, debe indicarse que dicho análisis mide la actividad de ECiz1 in trans bajo condiciones en las que las consecuencias de la localización incorrecta resulta improbable que se detecten. Por lo tanto, sigue siendo una posibilidad que el dominio de matrina 3 y los dedos de cinc actúen in vivo dirigiendo la actividad de Cz1 a sitios específicos en el núcleo y limitando de esta manera el alcance de la actividad de Ciz1.

Ciz1 endógeno. El anticuerpo V1 reconoce Cdc6, así como p85-Ciz1 (fig. 1A), de manera que no resulta adecuado para experimentos de inmunofluorescencia destinados a visualizar la localización subcelular de la Ciz1 endógena. Por lo tanto, se generaron dos nuevos antisueros policlonales de conejo contra el fragmento recombinante de ECiz1 llamado Nterm442, denominados 1793 and 1794 anti-Ciz1. Tal como se esperaba, Nterm442 purificado resulta reconocido por los anticuerpos 1793 y 1794 anti-Ciz1 en filtros western, aunque también resulta reconocido por el anticuerpo V1 (fig. 4A), apoyando la conclusión de que p85 (p100) es en efecto Ciz1.

Al aplicarse en extractos de proteínas derivados de células 3T3 en cultivo el anticuerpo 1793 anti-Ciz1 reconocía dos antígenos, con Mr de 125 y 100 kDa (fig. 4B), cuyas proporciones relativas varían de preparación a preparación. La banda de 100 kDa comigra con el antígeno sensible a ciclina A que resulta reconocido por el anticuerpo V1 (figs. 1 y 4B), lo que sugiere que ambos anticuerpos reconocen la misma proteína in vivo. Se confirmó mediante inmunoprecipitación que las bandas de p100-Ciz1 reconocidas por los anticuerpos V1 y 1793 son la misma proteína (fig. 4C). El anticuerpo V1 precipitó una banda de 100 kDa que resultó reconocido en filtros western por 1793, y viceversa. Además, en el mismo experimento, 1793, y en menor grado el anticuerpo V1, precipitaron un antígeno de 125 kDa, que se fue reconocido en los filtros western como 1793. Conjuntamente, las observaciones de los presentes inventores demuestran que la banda de 100 kDa en efecto es Ciz1 (previamente conocida como p85) y sugieren que la proteína Ciz1 existe en por lo menos dos formas en las células ciclantes.

Además de la evidencia de inmunoprecipitación proporcionada anteriormente, otras observaciones llevan a la conclusión de que p125 también es una forma de Ciz1. En primer lugar, los dos anticuerpos anti-Ciz1 de la presente invención (1793 y 1794) presentan dicha banda en común. Ambos anticuerpos producen el mismo patrón de tinción nuclear en experimentos de inmunofluorescencia, el cual resulta alterado en células tratadas con ARNip de Ciz1 (ver posteriormente). En segundo lugar, las proporciones relativas de p100 y p125 varían entre preparaciones, y por lo tanto podrían ser el resultado del corte proteolítico. En tercer lugar, los resultados de los presentes inventores son inesperadamente similares a los de Mitsui et al. (1999), cuyo anticuerpo monoclonal anti-Ciz1 humano detectó dos antígenos con Mr aparente de 120 kDa y 95 kDa en células HEK293. Propusieron que la forma de 120 kDa de la proteína Ciz1 humana se procesa produciendo la forma de 95 kDa y los resultados de la presente invención son consistentes con este resultado.

La banda de 125 kDa reconocida por el anticuerpo 1793 en células de ratón y humanas se resuelve en tres bandas relacionadas con Ciz1 durante la electroforesis de alta resolución de material derivado de células humanas no transformadas (Wi38, ver posteriormente) y de células de ratón (NIH3T3, no mostradas). Lo anterior podría ser el resultado de la modificación post-traduccional de la proteína Ciz1 o del procesamiento alternativo del transcrito de Ciz1.

Distribución subcelular de Ciz1. Se utilizó 1793 anti-Ciz1 para visualizar la distribución subcelular de la proteína Ciz1 (p85 y p125) en células 3T3 (fig. 5A) y en células HeLa (no mostradas). En ambos tipos celulares, 1793 reaccionó con un antígeno específico nuclear y éste resultó bloqueado por la inclusión del fragmento recombinante Nterm442 (fig. 5B). Al contrario que Cdc6, que se muestra a título comparativo (fig. 5A), Ciz1 es claramente detectable en todas las células 3T3 en esta población ciclante. Por lo tanto, Ciz1 se encuentra presente en el núcleo durante toda la interfase, aunque variaciones menores de cantidad o isoforma no resultarían detectables mediante este método. Tras el tratamiento con detergente, se redujo la tinción nuclear total de Ciz1 en todos los núcleos, lo que sugiere que Ciz1 se encuentra presente en el núcleo tanto en forma de fracción soluble como también unido a estructuras nucleares insolubles.

Al lavar la proteína soluble, el antígeno inmovilizado insoluble se resuelve en un patrón moteado subnuclear de puntos a alta magnificación (fig. 5C,D). Las manchas de Ciz1 muestran un intervalo y distribución de tamaños similares a los de los "focos" o "fábricas" de replicación, los sitios en los que tiene lugar la síntesis del ADN en la etapa S. Para saber si Ciz1 era coincidente con los sitios de las fábricas de replicación, se compararon la posición de las manchas de Ciz1 con la posición de el PCNA, un componente de los complejos de replicación en las células en etapa S (fig. 5C). En una sección confocal, los focos de PCNA eran menos abundantes que los focos de Ciz1, aunque prácticamente todos eran coincidentes con Ciz1 (fig. 5D,E,F). Esto resulta particularmente inesperado para los focos en el intervalo de tamaños intermedios. En las imágenes fusionadas, el solapamiento entre las posiciones de los focos de PCNA y de Ciz1 resulta en manchas amarillas, mientas que lo focos de Ciz1 restantes que no son coincidentes con PCNA son rojos. Los focos verdes (sólo PCNA) se encuentran prácticamente ausentes, lo que sugiere que Ciz1 se encuentra presente en todos los sitios en los que se han formado fábricas de replicación de ADN.

Ciz1 también se encuentra presente en sitios que no contienen PCNA (fig. 5D) y al contrario que PCNA, los focos de Ciz1 persisten durante toda la interfase (fig. 5A). Una interpretación de estas observaciones que Ciz1 marca las posiciones en el núcleo en las que las fábricas de replicación que contienen PCNA pueden formarse en la etapa S, pero que no todos estos sitios son utilizados simultáneamente. Todavía no se ha determinado si diferentes focos de Ciz1 se convierten en sitios activos de replicación del ADN en diferentes tiempos en la etapa S, o si también se producen otras actividades nucleares en sitios en los que se encuentra unido Ciz1. En efecto, en esta etapa también sigue siendo posible que las variantes de 100 kDa y de 125 kDa de Ciz1 presenten diferentes actividades y que residan en sitios nucleares con diferentes funciones.

Ciz1 resulta esencial para la proliferación celular. Hasta el momento se ha demostrado que el comportamiento de p85 (p100)-Ciz1 correlaciona con el inicio de la replicación del ADN en ensayos libres de células, que la Ciz1 recombinante estimula la frecuencia del inicio y que Ciz1 reside en los mismos sitios nucleares que la maquinaria de replicación del ADN. Sin embargo, estos datos no muestran que Ciz1 presente una función esencial en las células en proliferación. Con el fin de someter a ensayo esta posibilidad, se utilizó la interferencia de ARN (ARNi) para reducir selectivamente los niveles de transcritos de Ciz1 en células NIH3T3. Se seleccionaron cuatro secuencias diana dentro de Ciz1 (ver la fig. 2A) y se produjeron in vitro moléculas de ARN interfiriente pequeñas (ip). Al aplicarlas en las células, la totalidad de los cuatro ARNip de Ciz1 restringió el crecimiento (fig. 6A) y provocó una reducción visible del nivel de la proteína Ciz1 tras 48 horas (fig. 6B). El efecto de la reducción de Ciz1 sobre la proliferación se pone de manifiesto entre las 23 y las 40 horas después de la transfección, lo que sugiere que el primer ciclo celular sin ARN de Ciz1 resulta relativamente no afectado. A las 40 horas, los controles y las células tratadas con ARNip de Ciz1 divergieron significativamente, sin proliferación adicional en poblaciones con niveles reducidos de Ciz1. Para verificar la especificidad de la reducción de los niveles de Ciz1, se realizó un seguimiento de los niveles de transcrito a las 24 horas, antes de que la proliferación resultase inhibida significativamente (fig. 6C). En este punto, los transcritos de Ciz1 se habían reducido a 42% del nivel observado en las células de control tratadas con ARNip de GAPDH. Estos experimentos demuestran que Ciz1 resulta necesario para la proliferación celular y son consistentes con la existencia de una función primaria en la replicación del ADN.

Para someter a ensayo adicionalmente lo anterior, las células se marcaron con un pulso de BrdU 48 horas después del tratamiento de ARNip con el fin de determinar la fracción de células en las que se está produciendo la síntesis de ADN (fig. 6D). Al reducir los niveles de Ciz1, la fracción marcada con BrdU también se reduce, sugiriendo que la síntesis del ADN se encuentra inhibida bajo estas condiciones. Además, las células en la población con nivel reducido de Ciz1 que había incorporado BrdU (aproximadamente 15% de la población) se encontraban marcadas menos intensamente. Por lo tanto, en algunas células con Ciz1 tratadas con ARNip, la etapa S se enlentece en lugar de encontrarse inhibida por completo, posiblemente debido a una reducción incompleta de los niveles.

La inhibición de la síntesis de ADN por parte de los ARNip de Ciz1 podría ser una consecuencia secundaria de una disrupción general de la función nuclear. Por lo tanto, se investigó en mayor detalle un abanico de otras proteínas de replicación cuyos niveles se encuentran regulados de un modo dependiente del ciclo celular, para averiguar si las células con niveles reducidos detienen el ciclo aleatoriamente, o si produce una acumulación en un punto particular del ciclo.

Durante el inicio de la replicación del ADN eucariótico, las proteínas del complejo Mcm se ensamblan en los orígenes de replicación en la etapa G1 tardía de un modo dependiente de Cdc6. Cierto tiempo después, las ADN polimerasas y los factores accesorios de las mismas (incluyendo el PCNA) se unen a la cromatina y se activan los orígenes. Lo anterior se asocia a la exportación nuclear y a la proteólisis de la mayoría de Cdc6 y, a medida que se produce la síntesis del ADN, al desplazamiento gradual del complejo Mcm respecto de la cromatina (Bell y Dutta, 2002). Con el fin de identificar el punto de acción de Ciz1, se utilizó inmunofluorescencia para realizar un seguimiento de Mcm3 y del PCNA. En las células con niveles reducidos de Ciz1 (figs. 6E, F), ambas proteínas eran detectables dentro del núcleo unidas a estructuras nucleares resistentes a detergente. Por lo tanto, dichos factores es improbable que se unan directamente a Ciz1, o que sean dependientes de Ciz1 para su ensamblaje. De hecho, en cuatro experimentos independientes, el número medio de células con Mcm3 unido a cromatina y resistente a detergente se incrementó de 31% (+/-6%) a 51% (+/-5%) (fig. 6E). Un nivel incrementado de Mcm3 indica que la etapa dependiente de Ciz1 se produce tras el ensamblaje del complejo de prerreplicación (aunque antes de que se complete la etapa S). En las mismas poblaciones celulares, también se incrementó la fracción positiva para PCNA, de 32% (+/-5%) a 49% (+/-6%) (fig. 6F), localizando el punto de acción de Ciz1 en un periodo posterior al ensamblaje del PCNA. De esta manera, Ciz1 muy probablemente actúa facilitando la replicación del ADN durante una etapa tardía del proceso de inicio, mientras que su inacción inhibe el avance a través de la etapa S, dejando en su sitio a Mcm3 y PCNA.

Conjuntamente, las investigaciones libres de células o con células de los presentes inventores dibujan un sólido esquema de la función primaria de Ciz1. Sugieren que Ciz1 es un nuevo componente de las fábricas de replicación del ADN, y demuestran que Ciz1 desempeña un papel positivo en el ciclo celular de los mamíferos, actuando en la promoción del inicio de la replicación del ADN.

Tres de las líneas de investigación sugieren que Ciz1 resulta necesario durante una etapa tardía del proceso de inicio posteriormente a la formación del complejo de prerreplicación. En primer lugar, el antígeno p85 (p100)-Ciz1 se acumula en los núcleos expuestos a concentraciones de ciclina A-cdk2 que activan la síntesis de ADN, lo que implica que Ciz1 actúa durante esta etapa y no durante etapas más tempranas de ensamblaje del complejo de replicación (Coverley et al., 2002). En segundo lugar, los estudios funcionales con núcleos en la etapa G1 tardía demuestran que el ECiz1 recombinante incrementa el número de núcleos que incorporan nucleótidos marcados in vitro. Por lo tanto, Ciz1 debe encontrarse activo en una etapa que convierte los núcleos preparados para iniciar la síntesis del ADN en núcleos en síntesis activa de ADN. En tercer lugar, los estudios de interferencia de ARN apuntan a la existencia de una etapa dependiente de Ciz1 posterior a la formación del complejo Mcm y tras el ensamblaje de PCNA sobre el ADN, aunque anterior al desplazamiento de estas proteínas. Estas diferentes líneas de investigación conducen a conclusiones inesperadamente similares acerca del punto de acción de Ciz1, situándolo en las etapas posteriores del proceso de inicio.

ARNip anti-Ciz1 como estrategia terapéutica. El análisis demuestra que Ciz1 resulta esencial para la proliferación celular, y que apuntar a Ciz1 como diana es una estrategia viable para limitar la proliferación. Las formas alternativamente procesadas de Ciz1 que se observan en diversos cánceres (ver posteriormente) implican que Ciz1 podría seleccionarse como diana de un modo selectivo para limitar la proliferación en un subconjunto de células dentro de una población.

A título de ejemplo, lo anterior podría llevarse a cabo dirigiendo los ARNip a la secuencia de unión creada en los transcritos de Ciz1 en el caso de que falte la secuencia C-terminal GTTGAGGAGGAACTCTGCAAGCAG, en células de carcinoma pulmonar de células pequeñas, o mediante la utilización de proteína Ciz1 que no presenta la secuencia VEEELCKQ correspondiente, para seleccionar inhibidores químicos específicos.

De acuerdo con lo expuesto anteriormente, la presente invención también proporciona la utilización de secuencias de unión creadas en los transcritos y proteínas de Ciz1 en el caso de que no se encuentren presentes secuencias alternativamente procesadas, a modo de marcador diagnóstico, indicador pronóstico o diana terapéutica.

La forma embrionaria de Ciz1 se localiza en el núcleo. El análisis de RT-PCR de exones potencialmente variables sugiere que las células 3T3 expresan predominantemente Ciz1 de longitud completa, de modo que el trabajo de los presentes inventores de inmunolocalización de la Ciz1 endógena (fig. 5) no refleja necesariamente el comportamiento de ECiz1, el cual no presenta varios bloques de secuencia y posiblemente, por lo tanto, información que se utiliza para localizar la proteína. Con el fin de comparar directamente la localización de ECiz1 y la Ciz1 de longitud completa, se transfectaron constructos etiquetados con GFP mejorada en células 3T3 (fig. 8A) y se microinyectaron en pronúcleos de ratón (fig. 8B). En todos los casos, los Ciz1 y ECiz1 etiquetados eran exclusivamente nucleares, mientras que un constructo de control que expresaba GFP solo se encontraba presente en el núcleo y en el citoplasma. Tanto GFP-Ciz1 como GFP-ECiz1 eran visibles en células vivas en forma de focos subnucleares, similares a los focos de replicación observados mediante inmunofluorescencia en células fijadas. De esta manera, los tres bloques de secuencia que se encuentran ausentes de ECiz1 aparentemente no contribuyen a la localización nuclear de Ciz1.

Durante el periodo de tres días posterior a la transfección no se observó división celular en las células transfectadas con GFP-Ciz1 y con GFP-ECiz1. Estos datos sugieren que la sobreexpresión de la Ciz1 funcional presenta un efecto inhibidor del ciclo celular (en células que presentan rutas reguladoras intactas).

Coalescencia. Al transfectar células 3T3 con constructos etiquetados con GFP en los que el tercio C-terminal de Ciz1 había sido eliminado, se observaron diferencias entre ECiz1 y Ciz1 de longitud completa (fig. 8C). A las 48 horas, FL Ciz1 N-term(equivalente a 442) se había fusionado formando grandes agregados intranucleares que sólo resultaron aparentes en la población transfectada con ECiz1 N-term442 el día 3 ó después. Antes de este tiempo, ECiz1 N-term442 se localizaba en forma de patrón específicamente nuclear pero difuso. De esta manera, la capacidad de coalescencia es cuantificablemente diferente en el caso de Ciz1 y de ECiz1, y por lo tanto resulta afectada por uno de los tres exones procesados alternativamente (2/3, 6 ó 8).

Al igual que las células transfectadas con Ciz1 de longitud completa y ECiz1, no se observó que las células transfectadas con constructos en los que el tercio C-terminal había sido eliminado se multiplicasen durante el periodo de seguimiento de tres días.

Los dominios C-terminales anclan Ciz1 a las estructuras nucleares. Tal como se ha indicado anteriormente, la diferencia entre Ciz1 y ECiz1 N-term se encuentra enmascarada cuando los dominios C-terminales también se encuentran presentes (fig. 8A). Además, el fragmento C-terminal solo dirige la etiqueta GFP a la cromatina, formando un patrón irregular que no es tan moteado (focal) como Ciz1 o ECiz1, pero que sigue unido a los cromosomas durante la mitosis (fig. 8D). Lo anterior sugiere que los dominios C-terminales se encuentran implicados en la inmovilización de Ciz1 sobre un marco estructural en el núcleo. Notablemente, las células transfectadas transitoriamente con fragmento C-terminal siguieron dividiéndose, resultando en la dilución gradual de la fluorescencia verde.

La Ciz1 ectópica promueve la entrada prematura en la etapa S. Se analizaron los sucesos que se producían durante el primer día después de la transfección. La fracción en etapa S de células transfectadas (verde) se comparó con la fracción en etapa S de células no transfectadas mediante el marcaje con BrdU en diversos intervalos. Durante largas ventanas de marcaje, incluyendo 0 a 22 horas (fig. 8E), 0 a 12 horas y 0 a 7 horas (no mostrado), se estaba produciendo la síntesis de ADN consistentemente en más células transfectadas con Ciz1 y con ECiz1 que en células no transfectadas. Lo anterior sugiere que Ciz1 y ECiz1 presentan un efecto positivo sobre la transición G1-S, promoviendo la entrada no programada en la etapa S. Se obtuvieron resultados similares con poblaciones de células 3T3 densamente sembradas en placas antes de la transfección. Esto se llevó a cabo con el fin de minimizar la fracción de la población no transfectada que se encontraba en la etapa S como parte del ciclo celular normal. Bajo estas condiciones, la diferencia entre las poblaciones transfectadas y no transfectadas era máxima, demostrando claramente el efecto de la Ciz1 ectópica sobre el inicio de la replicación del ADN.

A la inversa, al marcar células con un pulso corto de BrdU administrado a las 22 horas (fig. 8E), o 10 ó 12 horas después de la transfección (no mostrado), la fracción marcada se había reducido consistentemente en las poblaciones transfectadas con Ciz1 y con ECiz1. Lo anterior sugiere que la etapa S que resulta inducida por Ciz1 ó ECiz1 ectópicos es anormal, con una síntesis del ADN lenta o nula que no resulta suficiente para marcar las células durante ventanas cortas de exposición a BrdU.

Por lo tanto, Ciz1 y ECiz1 ectópicos presentan dos efectos sobre la etapa S en las células en cultivo. Promueven la replicación del ADN, pero resultando en una síntesis del ADN lenta o nula.

Clones con potencial de proliferación alterado. Se realizó asimismo un seguimiento de poblaciones transfectadas de células 3T3 durante un periodo de tres semanas. En células transfectadas con GFP-Nterm442 o el equivalente no procesado alternativamente y mantenido bajo selección con G418, se observaron grandes focos que contenían cientos de células (fig. 9A). Estas agrupaciones contenían un gran número de células que expresaban GFp, demostrando que la sobreexpresión de la parte N-terminal de ECiz1 (en la que reside la actividad de replicación) no es lenta, y sugiriendo que la sobreexpresión conduce a un fenotipo de proliferación alterado, en comparación con las células no transfectadas, incluyendo la pérdida de inhibición por contacto y la incapacidad para formar una monocapa. Este comportamiento alterado dependiente de Ciz1 podría contribuir a la formación de tumores. Una versión truncada de Ciz1 de ratón que no presentaba los dominios de interacción putativos con la cromatina ha sido aislada anteriormente a partir de un melanoma de ratón (fig. 2).

Ciz1 humana y cáncer

ADNc de Ciz1 en bases de datos públicas. Tal como se ha indicado anteriormente, la Ciz1 humana se procesa alternativamente al nivel del ARN, rindiendo transcritos que no presentan tres de los mismos exones que la Ciz1 embrionaria de ratón. Se han registrado siete ADNc de Ciz1 humanos en las bases de datos públicas (fig. 10), presentadas por Mitsui et al. (1999), Warder y Keherly (2003) y proyectos a gran escala de análisis del genoma(proyecto NIH-MGC, proyecto NEDO de secuenciación del ADNc humano). Únicamente uno deriva de tejido adulto normal y éste contiene todos los exones predichos (AB030835). El resto deriva de células embrionarias (AK027287),

o notablemente de cuatro tipos diferentes de cáncer pediátrico (meduloblastoma, AF159025, aAF0234161, retinoblastoma, AK023978, neuroblastoma, BC004119 y linfoma de Burkitt, BC021163). La forma embrionaria y las formas derivadas del cáncer no presentan bloques de secuencia de las mismas tres regiones que el clon embrionario de ratón de los presentes inventores y de una cuarta región que corresponde al exón 4. Por lo tanto, los limitados datos sugieren que las formas procesadas alternativamente son más prevalentes en etapas tempranas del desarrollo. Esta correlación no ha sido observada anteriormente en la literatura científica. La presencia de Ciz1 alternativamente procesado en cánceres pediátricos plantea la posibilidad de que el procesamiento incorrecto de Ciz1 esté asociado a una proliferación celular exagerada.

Por ejemplo, uno de los exones variables codifica un motivo de secuencia DSSSQ conservado corto que se encuentra ausente en la ECiz1 de ratón y en un meduloblastoma humano. Dicho exón es directamente contiguo al sitio de fosforilación de cdk de consenso que los presentes inventores han demostrado que se encuentra implicado en la regulación de la función de EGiz1. La inclusión condicional de la secuencia DSSSQ podría convertir a Ciz1 en el objeto de la regulación por parte de la familia ATM/ATR de proteína quinasas, las cuales fosforilan las proteínas en las secuencias SQ, limitando de esta manera la función de inicio de Ciz1 en respuesta al daño al ADN.

Análisis de las etiquetas de secuencia expresada. La presencia de Ciz1 alternativamente procesada en cánceres pediátricos ha motivado un análisis detallado de las ESTs de Ciz1. Existen 567 etiquetas de secuencia expresada (ESTs) dentro de la Unigene cluster del NCBI nº Hs.23476 (Ciz1 humana). Éstas se derivan de un amplio abanico de tejidos y líneas celulares normales y enfermas. Se han traducido y mapeado secuencias frente a la secuencia de aminoácidos de longitud completa predicha de la Ciz1 humana. Se han registrado alteraciones de secuencias que dan lugar a sustituciones o deleciones de aminoácidos, a desplazamientos de marco o a la terminación prematura de la traducción.

También se han observado variantes de Ciz1 alternativamente procesadas en estos datos de ESTs y se incorporan como referencia en la presente memoria. Los cuatro bloques de secuencia que los presentes inventores habían informado anteriormente que se procesaban alternativamente en la Ciz1 humana y de ratón (fig. 2) han sido observadas en las secuencias de EST, así como la variante previamente no detectada que no presenta la secuencia VEEELCKQ derivada del exón 14. Todos estos bloques de secuencia recurrentemente variantes se encuentran limitados por sitios de procesamiento apropiados. Se ha identificado un sexto bloque de secuencia variable en una biblioteca derivada de carcinoma, causado por la inclusión de GCCACCCACACCACGAAGAGATGTGTTTGCCCACGTTCCAGTGCAGGGGTG GAGCACAGCCCGGCTTGTTACAGATAT.

Las ESTs se agrupan según el tipo celular a partir del que se derivaron, con las divisiones primarias presentes entre las células neoplásicas de origen adulto, infantil o embrionario. Las ESTs de tejido normal de origen embrionario o adulto se incluyen a título comparativo. Los mapas de la proteína Ciz1 derivada de EST se muestran en la fig. 11A-E y los exones alternativamente procesados se resumen en la fig. 11F.

Tres bloques de secuencia en el extremo N-terminal de la Ciz1 humana no se encuentran presentes en transcritos procedentes de meduloblastomas y neuroblastoma (fig. 11A) y ocasionalmente no se encuentran en transcritos de Ciz1 procedentes de otros cánceres. Los presentes inventores también encontraron un procesamiento alternativo similar en un tercer cáncer pediátrico, el sarcoma de Ewings (ver posteriormente). Las secuencias alternativamente procesadas asociadas a cáncer pediátrico procedente de los exones 2/3 (por lo menos dos versiones), del exón 4 y del exón 6.

Las variantes del exón 8 en las que no se encuentran presentes una o más copias de una repetición degenerada rica en Q han sido observadas en transcritos derivados de células normales (de origen neural embrionario o adulto) y de diversos cánceres. El procesamiento alternativo en dicha región podría producir Ciz1 con una actividad inapropiada; por lo tanto, la expresión de variante del exón 8, o la presencia de mutaciones puntuales que influyan sobre el procesamiento en esta región, podrían resultar útiles como marcadores diagnósticos o pronósticos de cáncer. Las repeticiones degeneradas en el exón 8 procesadas alternativamente se detallan posteriormente y se resumen en la fig. 11F.

En la mitad C-terminal de la proteína Ciz1 humana, dos bloques de secuencia se procesan de modo variable. Una de éstas no se encuentra presente en los transcritos derivados de tres de cada cinco bibliotecas de carcinoma pulmonar y de carcinoide pulmonar, y de tres otras bibliotecas de carcinoma (pero muy raramente de transcritos de otros tipos celulares).

El segundo bloque de secuencia variante se debe a la inclusión incorrecta de secuencia adicional en transcritos procedentes de la biblioteca del carcinoma epidermoide (MGC102).

Dichas secuencias y las secuencias de unión formadas en las proteínas Ciz1, y los transcritos de Ciz1 en el caso de que estos segmentos sean excluidos o incluidos, son dianas potenciales para la inhibición selectiva de la proliferación celular en un amplio abanico de cánceres diferentes. Las secuencias no variantes restantes son dianas potenciales para la inhibición no selectiva de la proliferación celular.

Además de variantes de procesamiento, se ha observado la presencia en algunos cánceres de otros transcritos de Ciz1 no típicos. En los rabdomiosarcomas, Ciz1 se termina prematuramente, conduciendo a una proteína predicha que no presenta dominios de unión nuclear C-terminales. Esto podría conducir a una replicación incorrecta del ADN y por lo tanto podría ser una diana terapéutica o un marcador en este tipo de cáncer.

Varios transcritos contienen mutaciones puntuales que conducen a sustituciones de aminoácidos en sitios putativos de fosforilación de quinasa (cdk) dependiente de ciclina. En la biblioteca MGC12 del carcinoma cervical, lo anterior se produce dos veces. Los presentes inventores han demostrado que se encuentran implicados dos sitios de fosforilación cdk en la limitación de la actividad de Ciz1 (fig. 3C y D), implicando a estas mutaciones en la desregulación de la proliferación en las células de cáncer. Uno de ellos es el mismo que el mutante derivado del carcinoma mencionado anteriormente (fig. 11E). Los transcritos derivados de cáncer con mutaciones puntuales en Ciz1 también podrían ser dianas para la interferencia de ARN, o presentar un valor como indicadores diagnósticos o pronósticos.

Investigación de la expresión de variantes de Ciz1 en los cánceres pediátricos Se ha investigado la expresión de variantes de Ciz1 en 6 líneas celulares tumorales de la familia del sarcoma de Ewings (ESFTs) y en dos líneas celulares de neuroblastoma, utilizando RT-PCR con conjuntos de cebadores que comprenden tres regiones de variabilidad conocida de Ciz1 (fig. 12A). Este análisis ha demostrado que el patrón de expresión variante de Ciz1 es diferente en las células ESFT y en las células del neuroblastoma y en células no transformadas, aunque aparentemente es muy similar en conjuntos de líneas celulares del mismo tumor. Por lo tanto, la expresión variante de Ciz1 podría presentar un potencial pronóstico o diagnóstico para estos cánceres. Algunas variaciones menores dentro de un conjunto de líneas del mismo tipo tumoral podrían presentar valor pronóstico.

Mediante la subclonación y secuenciación de transcritos amplificados, los presentes inventores encontraron que la totalidad de las seis líneas ESFT sometidas a ensayo expresaban una forma exón 4 menos de Giz1. Debido a que Ciz1 resulta esencial para la proliferación celular (ver posteriormente), ofrece una posible vía para la limitación selectiva de las células ESFT. Los transcritos de las dos líneas celulares de neuroblastoma sometidas a ensayo raramente carecen de exón 4 pero frecuentemente carecen de secuencias con el motivo DSSSQ codificado por el exón 6 (fig. 12B).

Dicho análisis experimental confirma que los cánceres pediátricos expresan formas de Ciz1 con inclusión variable de los exones 4, 6 y probablemente de los exones 2/3.

Dos versiones de la secuencia que comprende el exón 8 y una forma de la secuencia que comprende VEEELCKQsecuencia codificante se detectaron en ESFTs, neuroblastomas y control, sugiriendo que estas regiones no contribuyen a la desregulación de Ciz1 en dichos cánceres pediátricos.

En todos los casos, los productos de RT-PCR de Ciz1 eran más abundantes en reacciones llevadas a cabo con muestras de ARN procedentes de líneas celulares de cáncer, comparado con los controles (Wi38, HEK293, NIH3T3 y osteoblastos humanos primarios). Esto es consistente con que se encuentre incrementada la expresión de las variantes de Ciz1 en los tumores.

Análisis de la expresión de la proteína Ciz1 en líneas celulares de cáncer prostático

Los fibroblastos pulmonares humanos no transformados normales (y las células NIH3T3 de ratón) expresan dos formas mayores de Ciz1 que se detectan con el anticuerpo policlonal anti-Ciz1 1793 en transferencias western (fig. 13A). La banda más grande (aproximadamente 125 kDa) se resuelve en tres bandas diferentes que se encuentran presentes en proporciones iguales en células Wi38, pero en proporciones muy desiguales en las líneas celulares de cáncer prostático PC3 y LNCAP (y en líneas de células ESFT, no mostradas). Los presentes inventores postulan que estas isoformas de proteína se generan mediante la expresión de exones procesados variablemente. Ambas líneas celulares tumorales también contienen más antígeno Ciz1 que las células Wi38, lo que es consistente con la sobreexpresión de Ciz1 en dichas líneas celulares de cáncer.

Conjuntamente, los resultados de los presentes inventores (experimentales y el análisis bioinformático de los datos genómicos) apoyan la conclusión de que Ciz1 se encuentra incorrectamente regulado en un amplio abanico de cánceres humanos. Los presentes inventores han demostrado que la proteína Ciz1 desempeña un papel positivo en el proceso de la replicación del ADN; por lo tanto, una Ciz1 mutante podría contribuir a la transformación celular y no ser una consecuencia de la misma. En el caso de que la desregulación de Ciz1 sea una etapa común en este proceso, representaría una diana muy atractiva para el desarrollo de agentes terapéuticos.

Se han relacionado asimismo cambios particulares con cánceres específicos, con lo que es una posibilidad real que Ciz1 resulte útil como marcador diagnóstico o pronóstico.

Dichos cambios comprenden:

•: Procesamiento alternativo en la parte N-terminal de la proteína (que contiene actividad de replicación in vitro) en cánceres pediátricos.

•: Mutaciones puntuales en sitios de fosforilación de quinasa dependiente de ciclina, las cuales es conocido que se encuentran implicadas en la limitación de la actividad de replicación de Ciz1.

•: Expresión no típica y propiedades de unión nuclear de formas de Ciz1-p125 en líneas celulares de carcinoma prostático, posiblemente debido al procesamiento incorrectamente regulado de las repeticiones degeneradas en el exón 8, o en otros exones.

•: Exclusión condicional de un motivo discreto (VEEELCKQ) en el extremo C-terminal de Ciz1 (que probablemente participa en la localización de la proteína Ciz1 dentro del núcleo) en el carcinoma pulmonar de células pequeñas y en otros carcinomas.

•: Niveles incrementados de proteína y ARN de Ciz1 (detectados mediante transferencia western y mediante RT-PCR) en todas las líneas celulares derivadas de cáncer sometidas a ensayo hasta el momento, en comparación con los niveles en fibroblastos pulmonares embrionarios normales Wi38, de ARN de osteoblastos humanos y en fibroblastomas NIH3T3 de ratón.

Las secuencias mostradas en las figuras 14 a 21 resultan útiles para el desarrollo de reactivos terapéuticos, diagnósticos o pronósticos.

Materiales y métodos

Clonación. Se utilizó una biblioteca de expresión de ADNc enriquecida de longitud completa del tramo 5' triplEx de lambda, derivada de embriones de ratón de 11 días (Clontech nº ML5015t) para infectar E. coli X11blue según el protocolo recomendado (Clontech). Se levantaron las placas sobre filtros de nitrocelulosa de 0,45 micrómetros presumergidos en IPTG 10 mM (Sigma). Se aplicó anticuerpo V1 purificado mediante afinidad , en aproximadamente 3x106 placas a una dilución de 1/1.000 en PBS, leche en polvo desnatada al 10%, Tween-20 al 0,4%, tras bloquear durante 30 minutos en ausencia del anticuerpo. Tras dos horas, se lavaron tres veces los filtros con el mismo tampón y las placas reactivas se visualizaron con anticuerpo secundario anticonejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma) y quimioluminiscencia mejorada (ECL, Amersham) siguiendo procedimientos estándares. Se recolectaron 43 placas independientes, pero sólo dos cepas de fago sobrevivieron tres rondas adicionales decribado. Éstas se convirtieron en pTriplEX mediante transformación en BM25.8 y se secuenciaron. Una codifica para la Cdc6 de ratón (clon P) y la otra (clon L) para una proteína de ratón desconocida que es homóloga de la Ciz1 humana. Se hace referencia a esta Ciz1 embrionaria (ECiz1) y se presentó al EMBL bajo el número de acceso AJ575057.

Expresión bacteriana. Se utilizaron constructos de expresión bacteriana basados en pGEX (Amersham) para producir proteínas ECiz1 para el análisis in vitro. Se generó pGEX-ECiz1 mediante la inserción de un fragmento SmaI-XbaI (extremos romos) de 2,3 kb procedente del clon L en el sitio SmaI de pGEX-6P-3. Se generó pGEX-Nterm442 mediante la inserción del fragmento XmaI-XhoI de 1,35 kb en pGEX-6P-3 digerido con XmaI-XhoI y pGEX-Cterm274 mediante la inserción del fragmento XhoI de 0,95 kb en pGEX-6P-3 digerido con XhoI. Se generó pGEX-T(191/2)A a partir de pGEX-ECiz1 mediante mutagénesis sitio-dirigida (Stratagene Quikchange) utilizando los cebadores AACCCCCTCTTCCGCCGCCCCCAATCGCAAGA y TCTTGCGATTGGGGGCGGCGGAAGAGGGGGTT. Se generó pGEX-T(293)A a partir de pGEX-ECiz1 utilizando los cebadores AAGCAGACACAGGCCCCGGATCGGCTGCCT y AGGCAGCCGATCCGGGGCCTGTGTCTGCTT. La integridad y marco de lectura de todos los clones se verificaron mediante secuenciación.

Se produjeron Ciz1 recombinante, fragmentos de Ciz1 y mutantes puntuales en BL21-pLysS (Stratagene) en forma de proteína etiquetada con glutatión-S-transferasa. La proteína se purificó a partir de lisados bacterianos sonicados y clarificados mediante la unión a glutatión-sefarosa 4B (Amersham). La proteína recombinante se eluyó mediante escisión de la etiqueta GST utilizando proteasa de precisión (tal como recomienda el fabricante, Amersham) en tampón (Tris-HCl 50 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM, DTT 1 mM). Esto proporcionó preparaciones de proteína de entre 0,2 y 2,0 mg/ml. Para las réplicas de ensayo, se prepararon diluciones en serie en Hepes 100 mM, pH 7,8, DTT 1 mM y glicerol al 50%, de manera que no se añadiese más de 1 ml de solución de proteína a 10 ml de ensayo de replicación, rindiendo las concentraciones mostradas. Consistente con las observaciones anteriores (Mitsui et al., 1999; Warder y Keherly, 2003), la Ciz1 recombinante y el fragmento derivado N-term442 migraron en el SDS-PAGE con un peso molecular anómalamente elevado. Se produjo ciclina A-cdk2 en bacterias tal como se ha descrito anteriormente (Coverley et al., 2002).

Anticuerpos anti-Ciz1. Se cultivó anticuerpo V1 policlonal de conejo (Coverley et al., 2000; Stoeber et al., 1998; Williams et al., 1998) contra un fragmento interno del Cdc6 humano expresado en bacterias, correspondiente a los aminoácidos 145 a 360, y se purificó mediante afinidad siguiendo procedimientos estándares (Harlow y Lane, 1988). Este anticuerpo reacciona fuertemente con p100-Ciz1 endógeno y también con el fragmento Nterm442 de ECiz1. La alineación de Nterm442 con Cdc6 aminoácidos 145 a 360 sugiere que el epítopo compartido podría encontrarse en 294-298 ó en 304-312 en la Ciz1 de ratón. Se utilizó Nterm442 recombinante para generar dos antisueros policlonales específicos de Ciz1 denominados 1793 y 1794 (Abcam). Se utilizó rutinariamente 1793 en los experimentos descritos en la presente memoria. Su especificidad se verificó mediante inmunoprecipitación recíproca y análisis de transferencia western con anticuerpo V, mediante inclusión de Nterm442 (25 μg/ml en tampón para anticuerpo, BSA 10 mg/ml, SDS al 0,02%, Triton X100 al 0,1% en PBS), que bloqueó la reactividad con epítopos endógenos, y mediante reducción mediada por ARNip de Ciz1 que redujo específicamente la tinción nuclear de 1793.

Inmunoprecipitación. Se lavaron en PBS células 3T3 en crecimiento asíncrono, se enjuagaron en tampón de extracción (Hepes 20 mM, pH 7,8, acetato potásico 5 mM, cloruro magnésico 0,5 mM) suplementado con cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche) y se recolectaron mediante raspado al igual que los extractos de replicación. Las células se lisaron con Triton X100 al 0,1% y la fracción de pellet resistente a detergente se extrajo con NaCl 0,3 M en tampón de extracción. Se utilizaron 5 μl de 1793 ó 2 μl de anticuerpo V por cada 100 μl de extracto y se incubaron durante 1 hora a 4ºC. Se extrajeron los complejos de antígeno-anticuerpo con 100 μl de proteína Gsefarosa (Sigma) y las perlas se lavaron cinco veces con Tris 50 mM, pH 7,8, EDTA 1 mM, NP40 al 0,1%, NaCl 150 mM. Los complejos se sometieron a ebullición en tampón de carga (DTT 100 mM, SDS al 2%, Tris 60 mM, pH 6,8, azul bromofenol al 0,001%) y se resolvieron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 6,5%.

Inmunofluorescencia. Se cultivaron células sobre cubreobjetos y se fijaron en paraformaldehído al 4%, con o sin una breve preexposición a Triton X100 al 0,05% en PBS. Se detectó Ciz1 endógeno con suero 1793 diluido 1/2.000 en tampón para anticuerpo siguiendo procedimientos estándares. Se detectó Mcm3 con el anticuerpo monoclonal sc9850 (1/1.000), Cdc6 con el anticuerpo monoclonal sc9964 (1/100) y PCNA con el anticuerpo monoclonal PC100 (1/100, todos de Santa Cruz Biotechnology). El análisis de colocalización de imágenes confocales fluorescentes doblemente teñidas se llevó a cabo tal como se ha descrito (Rubbi y Milner, 2000; van Steensel et al., 1996).

Sincronía celular. Se sincronizaron células 3T3 de ratón mediante salida de la quiescencia tal como se ha descrito anteriormente (Coverley et al., 2002). Los núcleos preparados a partir de células recolectadas 17 horas después de la salida (denominadas "de G1 tardío") se utilizaron en todos los experimentos de replicación libres de células descritos en la presente memoria. Esto proporcionó poblaciones que contenían núcleos en etapa S, núcleos en G1 tardío competentes para la replicación y núcleos en G1 temprano/G0 no sensibles, en proporciones variables. Los extractos de 3T3 receptores en plena etapa G1 se prepararon a las 15 horas (típicamente contienen aproximadamente 5% de células en etapa S). La serie de experimentos de replicación libres de células descritos en la presente memoria requirió grandes cantidades de extracto estandarizado; por lo tanto, se utilizaron células HeLa debido a que se sincronizan fácilmente en masa. Se prepararon extractos de HeLa en etapa S a partir de células que habían salido de la quiescencia durante dos horas procedentes de dos bloqueos secuenciales en etapa S inducidos con timidina, tal como se ha descrito (Krude et al., 1997).

Replicación del ADN libre de células. Se llevaron a cabo ensayos de replicación del ADN tal como se ha descrito (Coverley et al., 2002; Krude et al., 1997). Brevemente, se incubaron 10 μl de extracto en plena etapa G1 o S (suplementado con sistema regenerador de energía, nucleótidos y dUTP biotinilado) y 5x104 núcleos en etapa G1 tardía, durante 60 minutos a 37ºC. Las reacciones se suplementaron con lisado baculovírico que contenía ciclina Acdk2 (fig. 1B y C), en el que 0,1 μl de lisado presentaba la misma actividad específica que 1 nM de quinasa purificada (Coverley et al., 2002). Todas las proteínas recombinantes se diluyeron en serie en Hepes 100 mM, pH 7,8, DTT 1 mM, glicerol al 50%, de manera que no se añadiesen más de 1 μl por cada 10 μl de ensayo de replicación, generando las concentraciones indicadas. Las reacciones se detuvieron con 50 μl de Triton X100 al 0,5% y se fijaron mediante la adición de 50 μl de paraformaldehído al 8% durante 5 minutos. Todas las transferencias a los núcleos en cubreobjetos se tiñeron con estreptavidina-FITC (Amersham) y se contratiñeron con Toto-3-yoduro (Molecular Probes). Se cuantificó la proporción de núcleos marcados mediante inspección a una magnificación de 1.000X, y todos los núcleos con focos fluorescentes o marcaje uniforme intenso se consideraron positivas. Las imágenes de los núcleos en replicación in vitro se generaron mediante microscopía confocal a una magnificación de 600X, de muestras contrateñidas con yoduro de propidio. Para el análisis de las proteínas nucleares, los núcleos se aislaron nuevamente tras la exposición durante 15 minutos a condiciones iniciadoras, mediante dilución de dos veces de las reacciones con PBS frío y centrifugación suave.

Análisis y presentación de los datos. Antes de la utilización en los ensayos de inicio, cada preparación de núcleos en etapa G sincronizados se sometió a ensayo para determinar la proporción de núcleos que ya se encontraba en etapa S ("% en S"). Para ello, dichos núcleos se incubaron en un extracto que era incapaz de inducir el inicio de la síntesis de ADN (procedente de células en plena etapa G1 recolectadas 15 horas después de su salida de la quiescencia) pero que permitían eficientemente la síntesis de elongación del ADN a partir de orígenes iniciados in vivo. La fracción de núcleos en elongación incorporaba nucleótidos eficientemente durante los ensayos de inicio in vitro pero no proporciona ninguna información. Rutinariamente esta fracción se preestableció y restó de los datos crudos. Las poblaciones sincronizadas en las que 20% o menos de las células se encontraban en etapa S se utilizaron para los ensayos de inicio.

Al hacer salir de la quiescencia las células 3T3 utilizando el protocolo utilizado en la presente memoria, una proporción no superior al 70% de la población total entra en la etapa S (Coverley et al., 2002). Sin embargo, la frecuencia de replicación máxima observada in vitro se aproxima más a 50%; habitualmente obtenida mediante incubación con ECiz1. Para la población en G1 de núcleos 3T3 utilizada en la presente memoria, el 17% se encontraba en etapa S (% en S) y el número máximo que se replicaba en cualquier ensayo in vitro era de 51% (% en replicación). Por lo tanto, el 34% de esta población es competente para iniciar la replicación in vitro (% de C). De esta manera, para cada punto de datos en las figs. 3B a F, % en inicio = (% en replicación - % en S)/% de C x 100.

Interferencia de ARN. Se utilizó como diana Ciz1 endógeno en células NIH3T3 proliferantes utilizando ARNip transcritos in vitro (kit Ambion Silencer) dirigido contra cuatro regiones de la Ciz1 de ratón. Las secuencias oligonucleótidas que se utilizaron para generar los ARNip fueron: AAGCACAGTCACAGGAGCAGACCTGT CTC y AATCTGCTCCTGTGACTGTGCCCTGTCTC para ARNip 4, AATCTGTCAC AAGTTCTACGACCTGTCTC y AATCGTAGAACTTGTGACAGACCTGTCTC para ARNip 8, AATCGCAAGG ATTCTTCTTCTCCTGTCTC y AAAGAAGAAGAA TCCTTGCGACCTGTCTC para ARNip 9, y AATCTGCAGCAGTTCTTTCCCCCTGTCTC y AAGGGAAAGAACTGCTGCAGACCTGTCTC para ARNip 11. Las secuencias diana que se encuentran distribuidas en todo el transcrito de Ciz1 se seleccionaron basándose en predicciones reducidas de estructura secundaria y en localizaciones dentro de los exones que se expresan consistentemente en todas las formas conocidas de Ciz1 (secuencias 4, 8 y 11), con la excepción de una (ARNip 9) que es conocido que se procesa alternativamente. Los controles negativos no se trataron, se trataron falsamente (reactivos de transfección pero no ARNip) y las células se trataron con ARNip de GAPDH (Ambion). Se utilizaron ARNip marcados con Cy3 (Ambion) para estimar la eficiencia de transfección, que se encontró que era superior al 95%. Los experimentos de interferencia de ARN se llevaron a cabo en un formato de 24 pocillos partiendo de 2x104 células por pocillo en 500 μl de medio (DMEM con glutamax suplementado con FCS al 4%). Los ARNip se añadieron 12 horas después de la siembra en placa utilizando reactivo oligofectamina para la introducción (Invitrogen). A menos que se indique lo contrario, los ARNip se utilizaron por parejas (a una concentración total de 2 nM en medio),en forma de dos dosis, administrando la segunda dosis en medio fresco 24 horas después de la primera. Los resultados se evaluaron 48 horas después de la primera exposición, mediante recuento del número de células, marcaje en la etapa S e inmunotinción. Se llevaron a cabo transferencias northern de ARNs aislados a partir de células tratadas durante 24 horas con una única dosis de ARNip, en reacciones que se ampliaron en 5 veces. Se preparó ARN utilizando reactivo Trizol (Invitrogen) y las muestras se sometieron a electroforesis a través de agarosa al 1%, se transfirieron a membrana de nilón Hybon N+ (Amersham) y se hibridaron secuencialmente a 50ºC con sondas de ADNc utilizando reactivos del kit NorthernMax (Ambion), siguiendo las instrucciones del fabricante. La membrana se enjuagó entre cada hibridación utilizando solución de SDS al 0,5% a 90ºC, se dejó que se enfriase lentamente hasta la temperatura ambiente. Las sondas se marcaron con [32P]-dCTP utilizando el sistema de marcaje de ADN de cebadores aleatorios (Gibco BRL) y se utilizaron en el orden siguiente: i. un fragmento XmaI-XhoI de 1,35 kb derivado a partir de ECiz1, ii. ADNc de actina humana (Clontech), e iii. ADNc de GAPDH de ratón (RNWAY Laboratories). La membrana se lavó dos veces en 2X SSC SDS al 0,2% durante 30 a 60 minutos cada vez, seguido de un lavado en 0,2X SSC SDS al 0,2% durante 30 minutos, a una temperatura de entre 55ºC y 65ºC dependiendo de la sonda utilizada. Las señales de hibridación se cuantificaron utilizando un aparato de captura de imágenes Amersham Biosciences Typhon 9410 en modo variable y software Image Quant TL (v2002). Las intensidades de banda se expresan en unidades arbitrarias (entre paréntesis) y los resultados para Ciz1 y GAPDH se normalizaron respecto a los de la �-actina y se expresaron en %.

Marcaje de la etapa S. La fracción de núcleos en los que se estaba produciendo síntesis de ADN in vivo se siguió mediante la suplementación del medio de cultivo con bromodesoxiuridina 20 μM (BrdU, Sigma) durante 20 minutos. La BrdU incorporada se visualizó tras el tratamiento ácido con anticuerpo monoclonal anti-BrdU conjugado con FITC (Alexis Biochemicals) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los núcleos se contratiñeron con un aparato Hoescht 33258 y se contaron bajo magnificación elevada (1.000X).

Ciz1 etiquetado con proteína fluorescente verde

Se obtuvo ADNc de Ciz1 de ratón de longitud completa del UK HGMP Resource Centre (MGC clon nº 27988) y se verificó por completo la secuencia. Se ligaron en el mismo marco con proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) un fragmento SmaI-XbaI (de extremos romos) de 2,8 kb de longitud completa de Ciz1 a partir de dicho clon y un fragmento SmaI-XbaI (de extremos romos) de 2,3 kb de ECiz1 a partir de pTrip1Ex-clon L, en el sitio SmaI de pEGFP-C3 (Clontech). Se utilizó pEGFP-C3 sin inserción a modo de control. Los constructos se transfectaron en células NIH3T3 utilizando TransIT-293 (Mirus), siguiendo instrucciones del fabricante o se microinyectaron en el pronúcleo macho de huevos de ratón fertilizados en el estadio unicelular. Las células 3T3 en crecimiento transfectadas con EGFP-Ciz1 de longitud completa o EGFP-ECiz1 se analizaron mediante microscopía fluorescente de células vivas hasta tres días después de la transfección. Se realizó un seguimiento de la síntesis del ADN durante las primeras 24 horas después de la transfección, mediante la inclusión del análogo de nucleótido BrdU en el medio de cultivo celular durante diversos periodos de tiempo tal como se indica en las leyendas de las figuras. Tal como se ha indicado anteriormente, cualquier célula en la que se esté produciendo síntesis de ADN mientras se encuentra expuesta a tinción de BrdU con anticuerpo monoclonal anti-BrdU genera núcleos rojos.

Las células transfectadas con Ciz1 también se mantuvieron bajo selección con 50 μg/ml de G418 en medio de cultivo estándar (DMEM Glutamax más suero de feto bovino al 10%) durante como máximo un mes, rindiendo poblaciones celulares de morfología alterada.

Análisis de las secuencias de EST

Se tradujeron etiquetas de secuencia expresada (ESTs) individuales localizadas en el Unigene cluster del NCBI nº Hs.23476 (Ciz1 humana), utilizando Genejockey y la secuencia de aminoácidos predicha se comparó con la secuencia predicha para la Ciz1 de longitud completa, con el fin de identificar los cambios recurrentes en las células cancerosas. Con el fin de excluir errores reflejo de una secuenciación de ADN de mala calidad, tal como la que se produce al final de análisis largos de secuenciación, únicamente se han incluido en este análisis aquellos cambios situados más de 8 aminoácidos del final de la secuencia ininterrumpida. Los desplazamientos de marco restaurados por una segunda alteración posteriormente en la lectura y los desplazamientos de marco seguidos de un codón de parada únicamente se incluyen en el caso de que a continuación se encuentre una secuencia ininterrumpida. De esta manera, se excluyen de este análisis la mayoría de los errores de secuenciación. Sin embargo, se espera que muchas de las mutaciones puntuales que queden (incluyendo los desplazamientos de marco y las paradas) reflejen errores introducidos durante la secuenciación. Por lo tanto, este análisis pretende descubrir tendencias, ponderando las mutaciones puntuales únicamente en el caso de que aparezcan en más de una ocasión.

De las 567 secuencias, localizadas en el Unigene cluster de Ciz1, se han analizado la mayor parte (todos los cánceres pediátricos, los carcinomas de próstata y de pulmón, las leucemias y los linfomas y un amplio abanico de tejidos no enfermos). Algunos no se mapearon debido a que son lecturas extremadamente cortas o porque proporcionaban secuencias de aminoácidos muy cortas tras realizarse la traducción, y para un número pequeño los presentes inventores detectaron una falta de homología con la secuencia codificante de Ciz1. Se excluyó un número pequeño de ESTs del análisis debido a múltiples desplazamientos de marco que produjeron tramos de homología en la totalidad de los tres marcos, sin indicaciones de que se utilice el marco de lectura in vivo. Todos ellos procedían de material derivado de cáncer, habitualmente de adenocarcinomas.

Análisis de RT-PCR de la expresión de isoformas de Ciz1.

Se aisló el ARN utilizando reactivo Trizol siguiendo los procedimientos recomendados, se trataron con ADNasa y se transcribieron inversamente utilizando hexámeros aleatorios y Superscript II, amplificando seguidamente con cebadores específicos para Ciz1:

h/m5 CAGTCCCCACCACAGGCC,

h/m2 GGCTTCCTCAGACCCCTCTG.

H/m3 ACACAGACCTCTCCAGAGCACTTAG

H/m4 ATGGTGACCTTCAGGGAGC

H4 TCCTTGGCGA TGTCCTCTGG GCAGG

H3 TCCCTCCTCA ACGGCTCCAT GCTGC

H6 CG TGGGGGCGAC TTGAGCGTTG AGG

H1 GATGCCAGGGGT ATGGGGCGCC GGG

H2 TCCGAGCCCT TCCACTCCTC TCTGG

29 30

Análisis de las isoformas de la proteína Ciz1 en líneas celulares de cáncer

Se cultivaron células en DMEM con FCS al 10% hasta la subconfluencia, se enjugaron en solución salina tamponada con Hepes frío suplementado con cóctel inhibidor de proteasa sin EDTA (Roche) y después se recolectaron y se suplementaron con Triton X100 al 0,1%. El material insoluble en detergente (incluyendo los núcleos) se peletizó mediante centrifugación suave, rindiendo fracciones de sobrenadante (SN) y de pellet (P). Estas fracciones se sometieron a ebullición en tampón para muestras de SDS-PAGE reductor y las proteínas se resolvieron mediante electroforesis en SDS-PAGE al 8%. Tras la transferencia a nitrocelulosa, las isoformas de Ciz1 se detectaron con anticuerpo anti-Ciz1 1793. Todos los métodos utilizados en dicho análisis han sido bien documentados en la literatura.

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1.

Método diagnóstico in vitro para la identificación de un trastorno proliferativo, que comprende detectar la presencia o la expresión de un polipéptido o molécula de ácidos nucleicos de Ciz1 que presenta una de las secuencias mostradas en las figuras 20 y 21.
2.

Método diagnóstico según la reivindicación 1, en el que dicho método comprende las etapas siguientes:

(i)

poner en contacto una muestra aislada de un sujeto que debe someterse a ensayo con un anticuerpo que se une específicamente a dicho polipéptido Ciz1 según la reivindicación 1; y

(ii)

detectar o medir la unión de dicho anticuerpo a dicho polipéptido Ciz1 en dicha muestra.
3.

Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polipéptido Ciz1 presenta la secuencia de aminoácidos etiquetada como "Exón 4 ausente" mostrada en la figura 20A.
4.

Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polipéptido Ciz1 presenta la secuencia de aminoácidos etiquetada como "variante sin exón 14" mostrada en la figura 20B.
5.

Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho polipéptido Ciz1 presenta la secuencia de aminoácidos etiquetada como "variante sin exón 4 ni parcialmente exón 6" mostrada en la figura 20B.
6.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
7.

Método según la reivindicación 1, en el que dicha molécula de ácidos nucleicos de Ciz1 presenta la secuencia polinucleotídica mostrada en la figura 21B.
8.

Método según la reivindicación 1, en el que dicha molécula de ácidos nucleicos de Ciz1 presenta la secuencia polinucleotídica mostrada en la figura 21G.
9.

Método según la reivindicación 1, en el que dicha molécula de ácidos nucleicos de Ciz1 presenta la secuencia polinucleotídica mostrada en la figura 21H.
10.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho trastorno proliferativo es el cáncer.
11.

Método según la reivindicación 10, en el que el cáncer es un cáncer pediátrico seleccionado de entre el grupo constituido por retinoblastoma, neuroblastoma, linfoma de Burkitt, meduloblastoma y tumores de la familia del sarcoma de Ewings.
12.

Método según la reivindicación 10, en el que el cáncer es carcinoma, adenocarcinoma, linfoma o leucemia.
13.

Método según la reivindicación 10, en el que el cáncer es cáncer hepático, pulmonar o de la piel.