ES2286543T3 - Medios y metodos para diagnosticar y tratar transtornos afectivos. - Google Patents

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Abstract

Uso de (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo consistente en: (a) una secuencia de nucleótidos genómica que codifica un canal iónico de apertura por ATP P2X7R y que contiene una mutación en la región 5''UTR que corresponde a las posiciones 532, 1100, 1122, 1171 o 1702 de la secuencia genómica del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 1, donde en dicha posición dicho nucleótido se reemplaza por otro nucleótido; (b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de canal iónico de apertura por ATP P2X7R, donde en el exón indicado en la columna "Exón" de la siguiente Tabla A, el resto aminoacídico indicado en la columna "Resto aminoacídico" de la Tabla A que corresponde a la posición indicada en la columna "Posición en tipo silvestre" de la Tabla A de la secuencia de aminoácidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4 se reemplaza por otro resto aminoacídico.

Description

Medios y métodos para diagnosticar y tratar trastornos afectivos.
La presente invención se refiere al uso de moléculas de ácido nucleico, preferiblemente secuencias genómicas, que codifican un canal iónico de apertura por ATP P2X7R que contiene una mutación en las regiones 5'UTR o 3'UTR, una mutación en el exón 3, 5, 6, 8 ó 13 o en los intrones 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 o 12 o una deleción en el exón 13, para la obtención de una preparación de diagnóstico que permite diagnosticar trastornos afectivos. La invención además se refiere al uso de polipéptidos codificados por dichos vectores de moléculas de ácido nucleico, de células hospedadoras que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico, de anticuerpos dirigidos específicamente a polipéptidos codificados por dichas moléculas de ácido nucleico y de aptámeros que se unen específicamente a dichas moléculas de ácido nucleico para la preparación de una composición de diagnóstico para la detección de un trastorno afectivo.
Además, se usan cebadores para amplificar selectivamente dichas moléculas de ácido nucleico para la preparación de una composición de diagnóstico para la detección de un trastorno afectivo. Además, se proporcionan composiciones de diagnóstico que comprenden dichas moléculas de ácido nucleico, vectores, polipéptidos, aptámeros, anticuerpos y/o cebadores para uso en el diagnóstico de un trastorno afectivo. Además, la presente invención se refiere a métodos para diagnosticar trastornos afectivos asociados con una proteína P2X7R no funcional, con una alteración de la apertura por ATP de la proteína P2X7R o con una infraexpresión de la proteína P2X7R, o asociados con la presencia de una cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente o los polipéptidos codificados por ellas.
Hasta 10% de las personas que acuden a un médico padecen un trastorno afectivo (también conocido como trastorno del comportamiento o trastorno del estado de ánimo). Sin embargo, la mayoría de los casos siguen sin diagnóstico o se tratan de forma inadecuada. Los trastornos afectivos incluyen, entre otros, depresión, ansiedad y trastorno bipolar. Estas enfermedades están bien descritas en la bibliografía; véase, por ejemplo, Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-4th Edition Text Revision (DMS-IV-TR), American Psychiatric Press, 2000.
La depresión, también conocida como trastorno afectivo unipolar, se caracteriza por una combinación de síntomas tales como un estado de ánimo bajo, pérdida de energía, pérdida de interés, sensación de enfermedad física, pérdida de concentración, alteración del apetito, alteración del sueño y una ralentización de las funciones físicas y mentales que tienen como resultado una incesante sensación de desesperanza, impotencia, culpabilidad y ansiedad. Los subtipos principales de esta enfermedad son depresión mayor, distimia (depresión más leve) y depresión atípica. Otras formas importantes de depresión son el trastorno disfórico premenstrual y el trastorno afectivo estacional. El tratamiento actual de la depresión consiste en psicoterapia, fármacos antidepresivos o una combinación de ambos tratamientos. La mayoría de los fármacos antidepresivos se dirigen al transporte de los neurotransmisores serotonina y/o norepinefrina, o a la actividad de la enzima monoamina oxidasa. Incluyen: Inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (por ejemplo, fluoxetina, paroxetina, sertralina, fluvoxamina), antidepresivos tricíclicos (por ejemplo, amitriptilina, imipramina, desipramina, nortriptilina), inhibidores de la monoamina oxidasa (por ejemplo, fenelzina, isocarboxazid, tranilcipromina) y antidepresivos de diseño tales como mirtazapina, reboxetina y nefazodona. Sin embargo, todos los fármacos antidepresivos existentes poseen inconvenientes tales como una larga latencia hasta la respuesta, un alto grado de no respondedores y efectos secundarios indeseables (Holsboer, Biol. Psychol. 57 (2001), 47-65). Por lo tanto, en la comunidad médica existe la necesidad de nuevos fármacos antidepresivos con un mejor perfil farmacológico (Baldwin, Hum. Psychopharmacol. Clin. Exp. 16 (2001), S93-S99).
Los trastornos de ansiedad se definen por un estado de excitación excesiva o inapropiada caracterizado por sensación de aprensión, indecisión o miedo. Se clasifican de acuerdo con la gravedad y duración de sus síntomas y de las características afectivas específicas. Las categorías incluyen: (1) Trastorno de ansiedad generalizada, (2) trastorno de pánico, (3) fobias, (4) trastorno obsesivo-compulsivo, (5) trastorno de estrés postraumático y (6) trastorno de ansiedad de separación. El tratamiento convencional para la mayoría de los trastornos de ansiedad es una combinación de terapia cognitiva-conductual con medicación antidepresiva. Las medicaciones adicionales incluyen benzodiazepinas y buspirona.
El trastorno bipolar, también conocido como depresión maníaca, se caracteriza por oscilaciones del estado de ánimo entre periodos de manía (es decir, elevación del estado de ánimo incluyendo euforia exagerada, irritabilidad) y periodos de depresión. El trastorno bipolar se clasifica de acuerdo con la gravedad de los síntomas. Los pacientes a los que se les ha diagnosticado un trastorno bipolar de tipo I padecen episodios maníacos o mixtos con o sin depresión mayor. En el trastorno bipolar de tipo II, los pacientes tienen episodios de hipomanía y episodios de depresión mayor. Con hipomanía, los síntomas de manía (euforia o irritabilidad) aparecen en formas más leves y son de menor duración. Los fármacos actuales usados para tratar los trastornos bipolares son litio, valproato y lamotrigina, que estimula la liberación del neurotransmisor glutamato. Como ocurre con los fármacos antidepresivos, tardan semanas en ser eficaces y pueden producir efectos secundarios indeseables, por ejemplo, los altos niveles de litio en sangre pueden ser fatales.
Ciertas pruebas convincentes sugieren que los trastornos afectivos son enfermedades biológicas. Sin embargo, no hay ningún ensayo de laboratorio ni otro procedimiento que pueda usar un médico común para realizar un diagnóstico definitivo. En su lugar, un médico con formación especial o un psiquiatra debe diagnosticar la enfermedad basándose en varios síntomas que aparecen conjuntamente. Este proceso a menudo requiere tiempo y es laborioso, requiriendo varias visitas para que el médico realice una historia cuidadosa de los síntomas que está experimentando actualmente el paciente así como de cualquier síntoma que haya tenido en el pasado. Por lo tanto, para la comunidad médica tendría mucho interés un método fácil y eficaz para el diagnóstico preciso de trastornos afectivos (Wittchen et al., J. Clin. Psychiatry 62, suppl. 26 (2001), 23-28).
La mayoría de los pacientes que padecen trastornos afectivos tienen antecedentes familiares y los estudios realizados con gemelos idénticos sugieren un fuerte componente genético. Por ejemplo, el mapeo genético en una población aislada del valle central de Costa Rica sugiere un locus para el trastorno bipolar severo en el cromosoma 18q22-q23 (Freimer et al., Nature Genetics 12 (1996), 436-441). Además, los estudios genéticos realizados en la población Amish del Viejo Orden sugieren que ciertos genes en los cromosomas 6, 13 y 15 pueden contribuir a la susceptibilidad al trastorno bipolar afectivo (Ginns et al., Nature Genetics 12 (1996), 431-435). Recientemente, una investigación de todo el genoma en una población homogénea encontrada en la región de Saguenay/Lac-St-Jean de Quebec sugiere la presencia de un locus importante para el trastorno bipolar en el cromosoma 12-q23-q24 (Morissette et al., Am. J. Med. Genet. (Neuropsychiatr. Genet.) 88 (1999), 567-587). En este estudio también se encontraron loci de susceptibilidad en los cromosomas 5 y 21. Otros grupos informan sobre unas pruebas mínimas de asociación en la región de 12q23 (Kelsoe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 585-590; Sklar, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3 (2002), 371-413). Dado los diversos loci mencionados en los estudios anteriores (por ejemplo, asociaciones con los cromosomas 5, 6, 12, 13, 15, 18 y 21), aún no se ha encontrado una asociación genética definitiva para las enfermedades afectivas.
De esta manera, aunque se ha supuesto que varios genes están asociados con los trastornos afectivos mencionados anteriormente, sin embargo, hasta ahora no se ha demostrado ninguna correlación clara. Como no se dispone de ninguna medicación ni diagnóstico adecuado a nivel molecular para los trastornos afectivos, existe la necesidad de identificar un gen cuyas mutaciones produzcan el espectro entero de trastornos afectivos así como de proporcionar medicamentos y métodos para el diagnóstico y tratamiento de trastornos afectivos.
De esta manera, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar medios y métodos para diagnosticar trastornos afectivos.
La solución para dicho problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Por consiguiente, la presente invención se refiere al uso de (i) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo consistente en:
(a) una secuencia de nucleótidos genómica que codifica un canal iónico de apertura por ATP P2X7R y que contiene una mutación en la región 5'UTR que corresponde a la posición 532, 1100, 1122, 1171 ó 1702 de la secuencia genómica del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre como se representa en la SEC ID Nº: 1, donde en dicha posición dicho nucleótido se ha reemplazado por otro nucleótido;
(b) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R, donde en el exón que se indica en la columna "Exón" de la siguiente Tabla A, el resto aminoacídico que se indica en la columna "Resto aminoacídico" de la Tabla A que corresponde a la posición indicada en la columna "Posición en tipo silvestre" de la Tabla A de la secuencia de aminoácidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre como se representa en la SEC ID Nº: 3 ó 4 se ha reemplazado por otro resto aminoacídico.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA A
1
(c) una secuencia de nucleótidos que codifica un canal iónico de apertura por ATP P2X7R y que contiene una mutación en el exón 5 u 8 correspondiente a la posición 32548 o la posición 37633 de la secuencia de nucleótidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre que se representa en la SEC ID Nº: 1, donde en dicha posición dicho nucleótido se ha reemplazado por otro nucleótido;
(d) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un canal iónico de apertura por ATP P2X7R, donde los aminoácidos que corresponden a las posiciones 488 a 494 del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representado en la SEC ID Nº: 3 ó 4 se han delecionado;
(e) una secuencia de nucleótidos genómica que codifica un canal iónico de apertura por ATP P2X7R, donde en el intrón indicado en la columna "Intrón" de la siguiente Tabla B, el nucleótido indicado en la columna "Nucleótido reemplazado" de la Tabla B que corresponde a la posición indicada en la columna "Posición en tipo silvestre" de la Tabla B de la secuencia de nucleótidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 1 se ha reemplazado por otro nucleótido.
TABLA B
2
(f) una secuencia de nucleótidos genómica decodifica un canal iónico de apertura por ATP P2X7R y que contiene una mutación en la región 3'UTR que corresponde a la posición 55169, 55170, 55171, 55917 ó 54925 de la secuencia de nucleótidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 1, donde en dicha posición, dicho nucleótido se ha reemplazado por otro nucleótido;
(g) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 ó 21 nucleótidos y que comprende las mutaciones o deleciones definidas en una cualquiera de (a) a (f);
(h) una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de nucleótidos como la mostrada en una cualquiera de las SEC ID Nº: 13 a 51;
(j) una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº: 5 a 12;
(k) una secuencia de nucleótidos que hibrida con una secuencia de nucleótidos definida en una cualquiera de (a) a (g) o con la secuencia de nucleótidos de (h) y que tiene una mutación como se ha definido en una cualquiera de (a) a (f);
(l) una secuencia de ácido nucleico que está degenerada como resultado del código genético con respecto a la secuencia de ácido nucleico como se ha definido (k);
(m) una secuencia de nucleótidos genómica que tiene un reemplazo o deleción de nucleótidos seleccionado de la siguiente Tabla C que indica en la columna "Región de P2X7R" la región de la secuencia de nucleótidos genómica de P2X7R en la que se produce el reemplazo o la deleción, en la columna "Nucleótido" de la Tabla C el nucleótido que se reemplaza por otro nucleótido o los nucleótidos que se delecionan y en la columna "Posición en tipo silvestre" de la Tabla C la posición correspondiente en la secuencia de nucleótidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 1.
TABLA C
4
5
6
(ii) un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de (i);
(iii) un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de (i)(b) o (i)(d);
(iv) un anticuerpo dirigido específicamente al polipéptido de (iii);
(v) un aptámero que se une específicamente a la molécula de ácido nucleico de (i); y/o
(vi) un cebador o par de cebadores capaz de amplificar específicamente la molécula de ácido nucleico de (i)
para la preparación de una composición de diagnóstico para la detección de un trastorno afectivo.
Sorprendentemente, se ha descubierto que ciertas mutaciones en el gen P2X7R que codifican el canal iónico de apertura por ATP P2X7R pueden producir el espectro entero de trastornos afectivos. Se han identificado seis mutaciones diferentes en la 5'UTR del gen P2X7R, siete mutaciones diferentes en los exones 3, 5, 6, 8 y 13 del gen P2X7R que conducen al reemplazo del aminoácido correspondiente en la secuencia de tipo silvestre de P2X7R representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4 y dos mutaciones en los exones 5 y 8 de dicho gen, respectivamente, que conducen a un reemplazo de un nucleótido por otro nucleótido, una deleción de nucleótidos en el exón 13 de dicho gen, 18 mutaciones en los intrones 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 y 12 y 5 mutaciones en la 3'UTR del gen P2X7R, que se co-segregan con el estado de afección en 41 familias no relacionadas que padecen trastornos afectivos. La expresión "trastorno afectivo", cuando se usa en el contexto de la presente invención, pretende incluir, pero sin limitación, depresión, ansiedad, trastorno unipolar, trastorno bipolar de tipo I, trastorno bipolar de tipo II, manía, trastorno hiperactivo con déficit de atención, abuso de sustancias y cualquier otro trastorno que afecte al comportamiento normal o estado de ánimo de un
individuo.
Cada mutación produce alteraciones que pueden explicar trastornos afectivos como se muestra en los ejemplos presentados más adelante.
P2X7R es un canal iónico de apertura por ATP que pertenece a la familia de canales ionotrópicos P2X. El gen se aisló por primera vez a partir de cerebro de rata (Surprenant et al., (1996), 272, 735-738; número de acceso del GenBank NM_019256) y posteriormente a partir de una biblioteca de monocitos humanos (Rassendren et al., J. Biol. Chem. 272 (1997), 5482-5486; números de acceso del GenBank NM_002562, Y09561) gracias a su homología de secuencia con los otros miembros de la familia P2X. Posteriormente se descubrió que P2X7R correspondía al receptor P2Z no identificado que media la acción de permeabilización del ATP en mastocitos y macrófagos (Dahlqvist y Diamant, Acta Physiol. Scand. 34 (1974), 368-384; Steinberg y Silverstein, J. Biol. Chem. 262 (1987), 3118-3122; Gordon, Biochem. J. 233 (1986), 309-319). El P2X7R tiene dos dominios transmembrana hidrófobos, un bucle extracelular y forma canales iónicos transmembrana. Los receptores P2X7 parecen funcionar sólo en forma homooligomérica y tienen un perfil farmacológico notablemente diferente de otros homo- o heterómeros P2X (North y Surprenant, Annual. Rev. Pharmacology Toxicology 40 (2000), 563-580). P2X7R requiere niveles de ATP superiores a 1 mM para conseguir la activación, mientras que otros receptores P2X se activan a concentraciones de ATP \leq100 \muM (Steinberg et al., J. Biol. Chem. 262 (1987), 8884-8888; Greenberg et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 10337-10343) 32). Aunque todos los receptores P2X muestran propiedades semejantes a canales no selectivos después de la unión, los canales formados por el P2X7R pueden transformarse rápidamente en poros que pueden permitir el paso de moléculas de hasta 900 Dalton (Virginio et al., J. Physiol. 519 (1999), 335-346).
P2X7R se expresa en células hematopoyéticas, mastocitos y macrófagos (Surprenant et al., Science 272 (1996), 3118-3122), donde se organiza en forma tetramérica o hexamérica (Kim et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 23262-23267). P2X7R está implicado, entre otras cosas, en la regulación de la función inmune y la respuesta inflamatoria.
La activación de P2X7R por ATP en los macrófagos está asociada con la estimulación mitogénica de células T (Baricordi et al., Blood 87 (1996), 682-690), la liberación de citoquinas tales como interleuquina-1\beta (Griffiths et al., J. Immol. 154 (1995), 2821-2828) y la formación de policariones de macrófagos (Falzoni et al., J. Clin. Invest. 95 (1995), 1207-1216). La estimulación del P2X7R con ATP también puede producir muerte celular al desencadenar flujos masivos de iones a través de la membrana (particularmente la entrada de Ca2 + y Na + y la salida de K +) y la formación de poros no selectivos de la membrana plasmática (Di Virgilio et al., Cell Death Differ. 5 (1998), 191-199).
En el cerebro, originalmente se pensó que P2X7R estaba restringido a la microglía (macrófagos residentes del cerebro) y a las células ependimales en lugar de a las neuronas (Collo et al., Neuropharmacology 36 (1997), 1277-1283) lo que sugiere un papel de P2X7R en la neurodegeneración. Sin embargo, desde entonces P2X7R también se ha encontrado en neuronas de retina de rata (Brandle et al., Brain Research Molecular Brain Res. 62 (1998), 106-109), células de ganglios cocleares (Brandle et al., Neuroscience Letters 273 (1999), 105-108) y terminales presinápticas de neuronas a lo largo del tronco cerebral y la médula espinal (Deuchards et al., J. Neurosci. 21 (2001), 7143-7152). Los estudios posteriores también sugieren que P2X7R regula la liberación de neurotransmisores tales como glutamato y GABA en neuronas del hipocampo (Armstrong et al., J. Neuroscience 22 (2002), 5938-5945, Sperlágh et al., J. Neurochem. 81 (2002), 1196-1211). La organización de P2X7R en células gliales y astrocitos del cerebro parece monomérica (Kim et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 23262-23267).
Se han identificado varios agonistas y antagonistas de P2X7R. El Azul Brillante (Brilliant Blue) (Jiang et al., Mol. Pharmacol. 58 (2000), 82-88), las isoquinolinas 1-[N,O-Bis(5-isoquinolinosulfonil)-N-metil-L-tirosil]-4-fenilpiperazina y N-[1-[N-metil-p-(5-isoquinolinosulfonil)bencil]-2-(4-fenilpiperazina)etil]-5-isoquinolinosulfonamida (Humphreys et al., Mol. Pharmacol., 54 (1998), 22-32), algunos derivados de adamantano (documentos WO 99/29660, WO 99/29661, WO 00/61569, WO 01/42194, WO 01/44170, WO 01/44213), ciertos compuestos de fenilo sustituidos (documento WO 00/71529) y ciertos derivados de piperidina y piperazina (documento WO 01/46200) son antagonistas de P2X7R mientras que el ATP oxidado (oATP) actúa como un inhibidor irreversible del receptor (Chen et al., J. Biol. Chem., 268 (1993), 8199-8203). Algunos de estos antagonistas actualmente se están evaluando para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, inmunes y cardiovasculares. BzATP (2'-3'-O-(4-benzoilbenzoil)adenosina 5'-trifosfato (C_{24}H_{24}N_{5}O_{15}P_{3})) actúa como agonista de P2X7R (North y Surprenant, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40 (2000), 563-580). El documento WO 99/55901 describe un método para identificar compuestos que modulan la actividad de un purinorreceptor de mamífero seleccionado entre el grupo compuesto por P2X2, P2X3, P2X4, P2X5, P2X6 y P2X7 y sugiere un papel de dichos purinorreceptores en la terapia de trastornos del comportamiento tales como epilepsia, depresión y enfermedades degenerativas asociadas con el envejecimiento.
Los ratones mutantes que carecen de P2X7R están sanos, son fértiles y no demuestran ningún fenotipo patente. Sin embargo, a diferencia de sus homólogos de tipo silvestre, los macrófagos peritoneales activados por LPS procedentes de animales P2X7R^{-/-} no pueden general interleuquina-1\beta madura (IL-1\beta) cuando se exponen al ATP, lo que sugiere una incapacidad de los macrófagos peritoneales de liberar IL-1 en respuesta al ATP (Solle et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 125-132). No se realizó un estudio detallado del comportamiento de los ratones P2X7R-/-. En seres humanos, un polimorfismo de Glu-496 a Ala conduce a la pérdida de función de P2X7 (Gu et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 11135-11142) y está asociado con leucemia linfocítica crónica de células B (Thunberg, et al. The Lancet 360 (2002), 1935-1939). Se han notificado polimorfismos adicionales en la supuesta región promotora de P2X7R, y en la región codificante (Li et al., FEBS Lett. 531 (2002), 127-131, EP 1199372).
A pesar de la abundante bibliografía en relación con P2X7R, nunca se ha sugerido o mencionado en la técnica anterior un papel en trastornos afectivos.
Antes de describir la presente invención con detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a la metodología, protocolos, líneas celulares, vectores y reactivos particulares descritos en este documento ya que éstos pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada tiene el fin de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente invención que se limitará sólo por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que se entienden comúnmente por un especialista habitual en la técnica.
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Preferiblemente, los términos usados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Kölbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza).
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que se presentan a continuación, a menos que el contexto requiera otra cosa, se entenderá que la palabra "comprender" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implican la inclusión de un número entero o etapa indicado o un grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.
A lo largo del texto de esta memoria descriptiva se citan varios documentos.
Debe indicarse que cuando se usan en este documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto indique claramente otra cosa. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un reactivo" incluye uno o más de estos reactivos diferentes, y la referencia a "el método" incluye la referencia a etapas equivalentes y métodos conocidos por los especialistas en la técnica que podrían modificar o sustituir a los métodos descritos en este documento.
De acuerdo con la presente invención, la expresión "secuencia de ácido nucleico" significa la secuencia de bases que comprenden bases de purina y pirimidina que constituyen moléculas de ácido nucleico, con lo que dichas bases representan la estructura primaria de una molécula de ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico incluyen ADN, ADNc, ADN genómico, ARN, formas sintéticas y polímeros mixtos, cadenas con sentido y antisentido, o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o modificadas, como apreciarán fácilmente los especialistas en la técnica.
Cuando se usa en este documento, el término "polipéptido" significa un péptido, una proteína o un polipéptido que incluye cadenas de aminoácidos de una longitud dada, donde los restos aminoacídicos se unen por enlaces peptídicos covalentes. Sin embargo, la invención también incluye peptidomiméticos de estas proteínas/polipéptidos donde ciertos aminoácidos y/o enlaces peptídicos se han reemplazado por análogos funcionales, así como aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos codificados por genes, tales como selenocisteína. Con el término polipéptidos se pueden designar péptidos, oligopéptidos y proteínas. Los términos polipéptido y proteína a menudo se usan indistintamente en este documento. El término polipéptido también se refiere a, y no excluye, modificaciones del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Estas modificaciones están bien descritas en textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una voluminosa bibliografía de investigación.
El término "posición", usado de acuerdo con la presente invención, significa la posición de un aminoácido dentro de una secuencia de aminoácidos representada en este documento o la posición de un nucleótido dentro de una secuencia de ácido nucleico representada en este documento.
La expresión "canal iónico de apertura por ATP P2X7R" de acuerdo con esta invención indica un polipéptido que puede clasificarse como un miembro de la familia de receptores ionotrópicos P2X. También se conocen como receptores purinérgicos. Los receptores P2X son canales iónicos de apertura por ligando. El ligando para estos receptores puede ser ATP y/u otro nucleótido natural tal como ADP, UTP y UDP, o un nucleótido sintético tal como 2-metiltioATP. Los criterios para la clasificación son: (1) una homología de secuencia que es mayor de 39% en la familia o en diferentes especies; (2) un mecanismo de transducción de señales que implica conductancia de iones (Khakh et al., Pharmacol Rev. 253 (2001), 107-18). Por consiguiente, la expresión "canal iónico de apertura por ATP P2X7R" es equivalente a las expresiones "receptor ionotrópico" o "receptor purinérgico". Preferiblemente, la expresión "canal iónico de apertura por ATP P2X7R" indica un polipéptido que puede clasificarse como un canal iónico de apertura por ATP P2X7R basándose en una o más características estructurales y/o funcionales, preferiblemente las descritas anteriormente. Las características estructurales se refieren a ciertas características estructurales que permiten clasificar un polipéptido como una proteína P2X7R. Una de estas características es la secuencia de aminoácidos. En el contexto de la presente invención, un polipéptido se clasifica como un canal iónico de apertura por ATP P2X7R si muestra un cierto grado de identidad de secuencia a lo largo de su longitud con la secuencia de aminoácidos de la proteína P2X7R humana representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4. Este grado de identidad de secuencia es al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, incluso más preferiblemente al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% o al menos 95%. Se prefiere particularmente que el grado de identidad de secuencia sea de al menos 65%.
Además, las características estructurales de las proteínas P2X7R son dos dominios transmembrana hidrófobos y un bucle extracelular que podría analizarse usando el programa TMPRED (Hofmann Biol. Chem. 347 (1993), 166) o TMHMM (Krogh J. Mol. Bio. 305 (2001), 567-580). Además, P2X7R puede existir como un solo polipéptido, como un dímero, tetrámero o similar.
De esta manera, en el contexto de la presente invención, una proteína se clasifica preferiblemente como una proteína P2X7R si presenta al menos una de las características estructurales mencionadas anteriormente. Las características funcionales se refieren a las propiedades relacionadas con la actividad biológica de la proteína P2X7R. En particular, P2X7R es un canal iónico de apertura por ATP que permite que los iones de calcio y sodio pasen desde la solución extracelular a la solución intracelular, y permite que los iones de potasio pasen desde la solución intracelular a la solución extracelular. Además, el canal iónico de apertura por ATP P2X7R forma naturalmente una forma homooligomérica. Las características de las proteínas receptoras P2X7R pueden determinarse como se menciona más adelante en este documento. La expresión "canales iónicos de apertura por ATP P2X7R" comprende formas funcionales y no funcionales de los canales iónicos de apertura por ATP P2X7R. Se entiende que un canal iónico de apertura por ATP P2X7R funcional es una proteína P2X7R que tiene al menos una de las características funcionales mencionadas anteriormente que puede medirse por métodos conocidos en la técnica. Un canal iónico de apertura por ATP P2X7R no funcional es una proteína que puede clasificarse como una proteína P2X7R debido a las características estructurales que se han descrito anteriormente pero que ha perdido al menos una, preferiblemente todas las características funcionales de una proteína P2X7R como se ha descrito anteriormente. La no funcionalidad de la proteína P2X7R puede determinarse, por ejemplo, midiendo si los iones de calcio y sodio pueden entrar en las células o si los iones de potasio pueden salir de las células. De esta manera, es posible determinar la aparición de una mutación en el canal iónico de apertura por ATP P2X7R midiendo la entrada o salida de calcio y/o sodio de las células. Las células que llevan una mutación en el gen P2X7R muestran una entrada y/o salida alterada de iones en comparación con las células que llevan una proteína P2X7R de tipo silvestre.
Además, hay diferentes métodos que podrían usarse para determinar si P2X7R es funcional o no funcional, por ejemplo, está alterado. Un método consiste en medir la velocidad de incorporación inducida por ATP de etidio en las células, por ejemplo, células aisladas a partir de un individuo. El etidio se incorpora en las células a través de poros P2X7R, cuando la formación de los poros se activa por ATP. Las células después se incuban con o sin ATP en presencia de etidio, y después se analizan por citometría de flujo. La fluorescencia de etidio se mide y se compara en presencia o ausencia de ATP. Si P2X7R tiene menos actividad, la fluorescencia de etidio inducida por ATP será menor que en las células de control. Este método se usó para verificar la actividad de P2X7R en linfocitos B y linfocitos T aislados de pacientes con leucemia (Wiley et al., Lancet 359 (2002), 1114-1119). En resumen, se incuban células aisladas en 1 ml de cloruro potásico tamponado con Hepes a 37ºC con agitación continua. Después se añade etidio a una concentración de 25 mol/l, seguido 40 segundos después por la adición de 10 \mul de una solución madre de ATP a una concentración de 100 mmol/l. Las células se analizan a 1.000 acontecimientos/s por citometría de flujo usando un citómetro de flujo Coulter Elite (Coulter, Hialeah, FL) con una excitación láser de argón a 488 nm. La emisión fluorescente se recogió usando un filtro de paso largo de 590 nm. La intensidad lineal de fluorescencia del canal medio para cada subpoblación abierta en intervalos sucesivos de 5 s se analizó con el uso de un software Win-MDI (Joseph Trotter, versión 2.7) y se representó frente al tiempo.
Otro método para determinar la actividad de P2X7R es medir la entrada de calcio en células aisladas incubadas con colorantes fluorescentes que emiten sólo tras la unión al calcio. Las células tienen que cargarse con el colorante y después tiene que estimularse la entrada de calcio. Los ejemplos de estos colorantes incluyen Fura-2, Calcium green, calcium orange, calcium crimson (todos disponibles en Molecular Probes). Los métodos para medir el transporte de calcio son bien conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, Takahashi et al., Physiol Rev. 79 (1999), 1089-1125. Además, la entrada de calcio en las células produce cambios en el potencial eléctrico de la membrana. Estos cambios pueden medirse por electrofisiología (pinzamiento de voltaje) o usando colorantes que son sensibles al cambio de voltaje. Estos métodos también son bien conocidos en la técnica, véase por ejemplo, González et al., DDT 4 (1999), 431-439; González y Tsien, Chemistry & Biology 4 (1997), 269-277; González y Tsien, Biophysical Journal 69 (1995), 1272-1280.
Otro método es medir la captación de 133Ba21. Ba21 es un buen sustituto de Ca21 y una vez dentro de la célula ni se bombea ni se atrapa por ATPasas de transporte. La captación de Ba21 puede medirse durante 60 s usando 133BaCl2 (concentración final, 0,2 mM). A tiempo 0, se añade una solución madre precalentada de 133Ba21 (0,4 mM y 1 \muCi/ml) en volúmenes iguales a células aisladas precalentadas en KCl 150 mM con HEPES (pH 7,4) a 37ºC. Se añade ATP (1 mM) 10 minutos antes o simultáneamente con el isótopo 133Ba21. Se toman alícuotas de 0,8 ml en puntos de tiempo entre 0 y 60 s y se mezclan inmediatamente con 0,2 ml de MgCl2 50 mM enfriado con hielo (en medio KCl-HEPES) que previamente se había depositado en capas sobre 250 \mul de mezcla de aceite (ftalato de di-n-butilo y ftalato de di-iso-octilo, 7:3 vol/vol) y después se centrifugan a 8.000 g durante 30 s. Los sobrenadantes y el aceite se aspiran y los sedimentos celulares se cuentan en un contador gamma automático Wallac Wizard 3 o en cualquier otra unidad de medición gamma adecuada.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que ciertas mutaciones de diferentes tipos en el gen P2X7R están asociadas con la aparición de trastornos afectivos. El primer tipo de mutaciones son mutaciones en la 5'UTR. Son ejemplos de estas mutaciones reemplazos de un solo nucleótido en posiciones correspondientes a las posiciones 362, 532, 1100, 1122, 1171 o 1702 de la secuencia genómica del canal iónico de apertura por ATP de tipo silvestre P2X7R como se describe en la SEC ID Nº: 1.
La posición con respecto a las secuencias de nucleótidos mencionadas en este documento se refiere a la secuencia mostrada en la SEC ID Nº: 1. Esta secuencia representa la secuencia de ácido nucleico del gen P2X7R que codifica el canal iónico de apertura por ATP P2X7R. Es posible que el especialista en la técnica identifique la posición en la secuencia genómica correspondiente a una posición en la SEC ID Nº: 1 alineando las secuencias. Además, las localizaciones exactas de los exones e intrones se indican en la SEC ID Nº: 1 presentada más adelante en este documento. Además, el especialista en la técnica puede identificar exones e intrones del gen P2X7R comparando la SEC ID Nº: 1 con la SEC ID Nº: 2 que muestra la secuencia de ADNc del gen P2X7R.
Por ejemplo, en la posición 362 de la 5'UTR de la secuencia genómica del gen P2X7R representada en la SEC ID Nº: 1, una timina (T) se reemplaza por otro nucleótido, preferiblemente una base de purina. Más preferiblemente, en dicha posición dicha timidina se reemplaza por una base de pirimidina. De una forma particularmente preferida, dicha timina se reemplaza por una citosina (C).
En la posición 532 de la 5'UTR de la secuencia genómica del gen P2X7R representada en la SEC ID Nº: 1, una timina (T) preferiblemente se reemplaza por otro nucleótido, preferiblemente una base de pirimidina. Más preferiblemente, en dicha posición dicha timina se reemplaza por una base de purina. De una forma particularmente preferida, dicha timina se reemplaza por una guanina (G).
Los restos de adenina (A) en las posiciones 1100 y 1122, respectivamente, en la 5'UTR de la secuencia genómica del gen P2X7R preferiblemente se reemplaza por una base de pirimidina. Más preferiblemente, dicha adenina se reemplaza por una base de purina y de una forma particularmente preferida dicha adenina se reemplaza por una guanina (G).
En la posición 1171 de la 5'UTR de la secuencia genómica del gen P2X7R representada en la SEC ID Nº: 1, una citidina (C) se reemplaza por otro nucleótido, preferiblemente por una base de pirimidina. Más preferiblemente, dicha citidina se reemplaza por una base de purina e incluso más preferiblemente dicha citidina se reemplaza por una guanina (G).
La guanina en la posición 1702 en la 5'UTR de la secuencia genómica del gen P2X7R representada en la SEC ID Nº: 1 se reemplaza por otro nucleótido, preferiblemente por una base de pirimidina. Más preferiblemente, dicha guanina se reemplaza por una base de purina y de una forma particularmente preferida se reemplaza por una adenina (A).
Un segundo tipo de mutación encontrada en el gen P2X7R son mutaciones en exones que conducen a sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos correspondiente. Éstas son las mutaciones indicadas en el punto (b) mostrado anteriormente. En este contexto, la expresión "un resto aminoacídico como se indica en la columna ``Resto aminoacídico" de la Tabla A que corresponde a la posición X del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre que se representa en la columna "Posición en tipo silvestre"'' tiene el siguiente significado: El resto aminoacídico en cuestión estaría localizado en la posición X en la secuencia de la SEC ID Nº: 3 ó 4 si la secuencia en la que aparece dicho resto aminoacídico se compara y alinea con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 3 ó 4. La secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 3 ó 4 es la secuencia de aminoácidos del gen P2X7R humano y se usa como secuencia de referencia en la presente invención.
Para determinar si un resto aminoacídico o un resto nucleotídico en una secuencia de P2X7R dada corresponde a cierta posición en la secuencia de aminoácidos o en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 1, 3 ó 4, el especialista puede usar medios y métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, alineamientos, de forma manual o usando programas informáticos tales como los mencionados más adelante en relación con la definición del término "hibridación" y grados de homología.
Por ejemplo, BLAST2.0, que son las siglas de Basic Local Alignment Search Tool (herramienta para búsqueda de alineamiento local básico) (Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402; Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410), puede usarse para buscar alineamientos de secuencia locales. BLAST produce alineamientos de secuencias de nucleótidos y aminoácidos para determinar similitudes de secuencia. Debido a la naturaleza local de los alineamientos, BLAST es especialmente útil para determinar correspondencias exactas o para identificar secuencias similares. La unidad fundamental de salida del algoritmo BLAST es el Par de Segmentos de Alta Puntuación (HSP). Un HSP consiste en dos fragmentos de secuencia de longitudes arbitrarias pero iguales, cuyo alineamiento es máximo localmente y para los cuales la puntuación de alineamiento satisface o excede una puntuación umbral o límite establecida por el usuario. La estrategia BLAST sirve para buscar HSP entre una secuencia problema y una secuencia de una base de datos, para evaluar el significado estadístico de cualquier correspondencia encontrada y para presentar sólo las correspondencias que satisfacen el umbral de significado seleccionado por el usuario. El parámetro E establece el umbral de significado estadístico para presentar correspondencias de secuencias de la base de datos. E se interpreta como límite superior de la secuencia esperada de probabilidad de aparición de un HSP (o serie de HSP) dentro del contexto de la búsqueda de la base de datos entera. Cualquier secuencia de la base de datos cuya correspondencia satisfaga E se presenta en el resultado del programa.
Se usan técnicas informáticas análogas que usan BLAST (Altschul (1997), loc. cit.; Altschul (1993), loc. cit.; Altschul (1990), loc. cit.) para buscar moléculas idénticas o relacionadas en bases de datos de nucleótidos tales como GenBank o EMBL. Este análisis es mucho más rápido que las hibridaciones múltiples basadas en la membrana. Además, la sensibilidad de la búsqueda informática puede modificarse para determinar si cualquier correspondencia particular se clasifica como exacta o similar. La base de la búsqueda es la puntuación del producto que se define como:
\frac{% \ identidad \ de \ secuencia \ x \ % \ puntuación \ BLAST \ máxima}{100}
y tiene en cuenta tanto el grado de similitud entre las dos secuencias como la longitud de la correspondencia de secuencia. Por ejemplo, con una puntuación de producto de 40, la correspondencia será exacta dentro de un error de 1-2%; y a 70, la correspondencia será exacta. Las moléculas similares normalmente se identifican seleccionando las que muestran puntuaciones de producto entre 15 y 40, aunque puntuaciones menores pueden identificar moléculas relacionadas.
Como se ha mencionado anteriormente, el segundo grupo de mutaciones identificadas en el gen P2X7R son mutaciones en los exones del gen P2X7R que conducen a sustituciones de aminoácidos. A este respecto, la SEC ID Nº: 2 muestra la secuencia de ADNc del gen P2X7R. En el exón 3, en la posición 117 de la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre correspondiente de P2X7R representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4, un resto de arginina (R) se reemplaza por otro resto aminoacídico, preferiblemente por un resto aminoacídico alifático, ácido o básico. Más preferiblemente, por un resto aminoacídico aromático que, de una forma particularmente preferida, es triptófano (W). El polipéptido resultante se muestra en la SEC ID Nº: 5.
En el exón 5, en la posición 150 de la secuencia de aminoácidos de P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4, un resto de glicina (G) se reemplaza por otro resto aminoacídico, preferiblemente por un resto aminoacídico alifático, aromático o ácido. Más preferiblemente, por un resto aminoacídico básico y de una forma particularmente preferida por una arginina (R). El polipéptido resultante se muestra en la SEC ID Nº: 6.
En la posición 186 en el exón 6 de la secuencia de aminoácidos de P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4, un resto de glutamato (E) se reemplaza por otro resto aminoacídico, preferiblemente por un resto aminoacídico alifático, aromático o ácido. Más preferiblemente, dicho glutamato se reemplaza por un resto aminoacídico básico que de una forma particularmente preferida es una lisina (K). El polipéptido resultante se muestra en la SEC ID Nº: 7.
En el exón 6 de la secuencia de aminoácidos de P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4 en la posición 191, un resto de leucina (L) se reemplaza por otro resto aminoacídico. Dicho resto aminoacídico preferiblemente es un resto aminoacídico alifático, ácido o básico. Más preferiblemente, dicho resto aminoacídico es un resto aminoacídico aromático que de una forma particularmente preferida es una prolina (P). El polipéptido resultante se muestra en la SEC ID Nº: 8.
En el exón 8 de la secuencia de aminoácidos de P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4, en la posición 270 un resto de arginina (R) se reemplaza por otro resto aminoacídico. Dicho resto aminoacídico preferiblemente es un resto aminoacídico aromático, ácido o básico. Más preferiblemente, dicho resto aminoacídico es un resto aminoacídico alifático que, de una forma particularmente preferida, es una cisteína (C). El polipéptido resultante se muestra en la SEC ID Nº: 9.
En la posición 568 en el exón 13 de la secuencia de aminoácidos de P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4, un resto de isoleucina (I) se reemplaza por otro resto aminoacídico. Más preferiblemente, dicha isoleucina se reemplaza por un resto aminoacídico aromático, básico o ácido. Incluso más preferiblemente, dicho isoleucina se reemplaza por un resto aminoacídico alifático que, de una manera particularmente preferida, es una asparagina (N). El polipéptido resultante se muestra en la SEC ID Nº: 10.
En el exón 13, en la posición 578 de la secuencia de aminoácidos de P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4, un resto de arginina (R) se reemplaza por otro resto aminoacídico. Dicho resto aminoacídico preferiblemente es un resto aminoacídico aromático, ácido o básico. Más preferiblemente es un resto aminoacídico alifático y particularmente se prefiere que sea un resto de glutamina (Q). El polipéptido resultante se muestra en la SEC ID Nº: 12.
Se prevé que las mutaciones mencionadas anteriormente en los exones del gen P2X7R se producen debido a mutaciones puntuales producidas, por ejemplo, por medios químicos y/o físicos o por una imprecisión del complejo de replicación seguido de un fallo de la maquinaria de reparación de una célula, que pueden dar como resultado un cambio de un solo codón. Son posible tipos de mutaciones puntuales transiciones, es decir el cambio de una base de purina o pirimidina por otra base de purina o pirimidina, por ejemplo, adenina por guanina o timidina por citosina, o transversiones, es decir, el cambio de una base de purina o pirimidina por otra base de pirimidina o purina, por ejemplo adenina por timidina o guanina por citosina. Además, una mutación puntual también puede deberse a una inserción o deleción de uno o más nucleótidos.
Las mutaciones que conducen al reemplazo de los aminoácidos mencionados anteriormente y más adelante se indican en la Tabla 1 mostrada posteriormente.
El tercer grupo de mutaciones en el gen P2X7R se ha identificado en los exones 5 y 8 del gen P2X7R representado en la SEC ID Nº: 1 y son silenciosas, es decir, no conducen a cambios de aminoácidos. En particular, en la posición 32548 del exón 5 de la secuencia genómica de tipo silvestre del gen P2X7R representada en la SEC ID Nº: 1, un resto de citidina se reemplaza por otro nucleótido. Dicho nucleótido preferiblemente es una base de pirimidina y de una forma particularmente preferida una timina. El cambio del resto de citidina en la posición 32548 en el exón 5 del gen P2X7R por otro nucleótido preferiblemente no conduce al reemplazo del aminoácido cisteína por otro resto aminoacídico.
En el exón 8 del gen P2X7R de tipo silvestre representado en la SEC ID Nº: 1, en la posición 37633 un resto de citidina se reemplaza por otro resto nucleotídico. Dicho resto nucleotídico preferiblemente es una base de pirimidina y de una forma particularmente preferida timina. Debido a este reemplazo, el aminoácido aspartato (D) codificado por el codón respectivo en el que ha tenido lugar en la posición 37633 un reemplazo, preferiblemente no se reemplaza por otro resto aminoacídico.
Las mutaciones mencionadas anteriormente en los exones 5 y 8 en las posiciones 32548 y 37633, respectivamente, del gen P2X7R de tipo silvestre representado en la SEC ID Nº: 1 son mutaciones en la tercera posición de un codón triplete, es decir, en la base oscilante (wobble), que conducen a las denominadas mutaciones silenciosas. Las mutaciones silenciosas normalmente no conducen a un cambio del aminoácido debido a la degeneración del código genético, es decir, 64 tripletes codifican los 20 aminoácidos naturales. Sin embargo, dichas mutaciones silenciosas conducen a un cambio en el codón que codifica sus aminoácidos respectivos en la medida en la que el codón recién generado puede no ajustarse tan bien al uso de codones de un organismo. Particularmente, el codón recién generado no se traduce por el ribosoma con la misma eficacia que el codón "antiguo". Esto puede producir cantidades insuficientes del polipéptido correspondiente produciendo un fenotipo distinto.
El cuarto grupo de mutaciones en el gen P2X7R descrito anteriormente en este documento en el punto (d) es una deleción de 7 aminoácidos que corresponden a las posiciones 488 a 494 de la secuencia de aminoácidos de P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4. De esta manera, la presente invención también se refiere a secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína P2X7R en la que se delecionan aminoácidos correspondientes a las posiciones 488 a 494 del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representado en la SEC ID Nº: 3 ó 4. Esto significa, de acuerdo con la presente invención, que se deleciona un fragmento que incluye las posiciones de aminoácidos 488 a 494 de la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre correspondiente representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4, con lo que se obtiene un polipéptido acortado. Se representa un ejemplo de este polipéptido acortado en la SEC ID Nº: 11. Este tipo de mutación como se describe en este documento preferiblemente codifica un canal iónico de apertura por ATP P2X7R no funcional. En la presente invención, la deleción de un fragmento que incluye los aminoácidos 488 a 494 de la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4 es el resultado de una deleción en el exón 13. La proteína resultante representada en la SEC ID Nº: 11 carece de los aminoácidos 488 a 494 de la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre correspondiente representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4, de tal forma que la posición de aminoácido 494 del polipéptido delecionado representado en la SEC ID Nº: 11 corresponde a la posición de aminoácido 502 de la secuencia de aminoácidos de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico de la invención codifica un polipéptido P2X7R en el que se han delecionado exactamente los aminoácidos que corresponden a las posiciones 488 a 494 de la SEC ID Nº: 3 ó 4. Sin embargo, también se incluyen mutantes en los que pueden estar delecionados más o menos aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos de P2X7R indicada en la SEC ID Nº: 3 ó 4 debido, por ejemplo, a un corte y empalme o deleción atípica de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que codifica P2X7R o procesos postraduccionales erróneos, siempre que el canal iónico de apertura por ATP P2X7R no sea funcional. Por ejemplo, también es posible que se delecionen aminoácidos adicionales que preceden a la posición de aminoácido 488 o aminoácidos posteriores a la posición de aminoácido 494, o que se delecionen menos aminoácidos.
Preferiblemente, se delecionan adicionalmente al menos uno, más preferiblemente al menos dos, incluso más preferiblemente al menos tres y aún más preferiblemente al menos 5 restos aminoacídicos cadena arriba de la posición que corresponde al resto aminoacídico 488 y/o cadena abajo de la posición que corresponde al resto aminoacídico 494 de la SEC ID Nº: 3 ó 4.
Sin embargo, se prefiere que no más de 20, preferiblemente no más de 15, incluso más preferiblemente no más de 10 y aún más preferiblemente no más de 7 restos aminoacídicos se delecionen adicionalmente cadena arriba de la posición que corresponde al resto aminoacídico 488 de la SEC ID Nº: 3 ó 4 o cadena abajo de la posición que corresponde al resto aminoacídico 494 de la SEC ID Nº: 3 ó 4.
Otro grupo de mutación (mencionada en el punto (e), anteriormente) reside en los intrones 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 ó 12 de la secuencia genómica de tipo silvestre de P2X7R representada en la SEC ID Nº: 1. Dichas mutaciones en dichos intrones son mutaciones puntuales como las mostradas en la Tabla B presentada anteriormente en este documento y en la Tabla 1 mostrada más adelante.
En la posición respectiva indicada en la columna "Posición en tipo silvestre" en la Tabla B o indicada en la columna "Polimorfismo" en la Tabla 1, se muestra la posición del resto nucleotídico en el intrón respectivo que se reemplaza por otro resto nucleotídico. Por consiguiente, la expresión "un nucleótido como se indica en la columna "Intrón" de la Tabla B que corresponde a la posición indicada en la columna "Nucleótido reemplazado" de la Tabla B que corresponde a la posición indicada en la columna "Posición en tipo silvestre" de la Tabla B se reemplaza por otro nucleótido" significa que un resto nucleotídico en una secuencia codificante de P2X7R estaría localizado en la posición Y en la SEC ID Nº: 1 cuando la secuencia P2X7R se compara y se alinea con la secuencia de la SEC ID Nº: 1. Si el nucleótido en la posición respectiva es una base de purina tal como adenina o guanina, se prefiere que debido a una transición se reemplace por otra base de purina. Por ejemplo, una adenina se reemplaza por una guanina o una guanina se reemplaza por una adenina. Si el nucleótido en la posición respectiva es una base de pirimidina, se prefiere que debido a una transición se reemplace por otra base de pirimidina. Por ejemplo, timina se reemplaza por una citidina y una citidina se reemplaza por un timina.
También se prefiere que debido a una transversión, una base de purina se reemplace por una base de pirimidina o viceversa. Por ejemplo, una adenina se reemplaza por una timina y una guanina se reemplaza por una citidina. De una forma particularmente preferida, dicho nucleótido en los intrones 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 ó 12 del gen P2X7R representado en la SEC ID Nº: 1 se reemplaza por el nucleótido representado en la columna "Polimorfismo" de la Tabla 1, presentada más adelante.
Un último grupo de mutaciones que se han identificado se refiere a las mutaciones que residen en la 3'UTR del gen P2X7R de tipo silvestre representado en la SEC ID Nº: 1. Las mutaciones se encontraron en las posiciones 54925, 55169, 55170, 55171 ó 55917 respectivamente, del gen P2X7R de tipo silvestre representado en la SEC ID Nº: 1.
Se descubrió que en la posición 54925 un resto de guanina se reemplazaba por otro nucleótido. Preferiblemente, dicho resto de guanina se reemplaza por una base de pirimidina, más preferiblemente por una base de purina y de una forma particularmente preferida por una adenina.
En la posición 55169, un resto de citidina se reemplaza por otro nucleótido, preferiblemente por una base de pirimidina. Más preferiblemente, se reemplaza por una base de purina y de una forma particularmente preferida se reemplaza por una adenina.
En las posiciones 55170 y 55171, un resto de adenina se reemplaza por otro resto nucleotídico, preferiblemente por una base de purina. Más preferiblemente, dicho resto de adenina se reemplaza por una base de pirimidina y de una forma particularmente preferida dicho resto de adenina se reemplaza por un resto de citidina. También se descubrió que en la posición 55917, un resto de citidina se reemplaza por otro nucleótido. Preferiblemente, dicho resto nucleotídico es una base de purina, más preferiblemente una base de pirimidina y de una forma particularmente preferida una timina.
Como es evidente por lo anterior, no todas las mutaciones identificadas están localizadas en exones o conducen a un cambio en la secuencia de aminoácidos. Algunas de las mutaciones están localizadas en la 5'UTR, en la 3'UTR o en intrones.
Se sabe que los polimorfismos en regiones promotoras y potenciadoras pueden afectar a la función del gen por medio de la modulación de la transcripción, particularmente si están situados en sitios de reconocimiento para proteínas de unión al ADN (Fishman et al., J. Clin. Invest. 102 (1998), 1369-1376). El término "polimorfismo", que se usa en la presente invención, significa la sustitución de un solo nucleótido, la inserción de nucleótidos y la deleción de nucleótidos que, en el caso de la inserción y deleción, incluye la inserción o deleción de uno o más nucleótidos en una posición de un gen y las alteraciones correspondientes en las proteínas expresadas. Los polimorfismos en la región 5' no traducida (5'UTR) de genes puede afectar a la eficacia con la que se traducen las proteínas. Un ejemplo representativo de esto es el gen c-myc, donde un SNP C-G que crea un sitio interno de entrada de ribosomas está asociado con una mayor eficacia de traducción de c-myc y con mieloma (Chappell et al., Oncogene 19 (2000), 4437-4440). Los polimorfismos en la 3'UTR pueden afectar a la función del gen por medio de la alteración de la estructura secundaria del ARN y la eficacia de la traducción o por medio de su efecto sobre motivos en el ARN que se une a proteínas que regulan la degradación del ARN. Los polimorfismos dentro de intrones pueden afectar a la función del gen por medio de su efecto sobre el corte y empalme del ARN dando como resultado polipéptidos aberrantes. Otra forma en la que los polimorfismos intrónicos pueden afectar a la función del gen es cuando afectan a motivos reguladores dentro de intrones. Son ejemplos el polimorfismo del sitio de unión Sp1 dentro del intrón 1 del gen COLIA1 (Mann et al., J. Clin. Invest 107 (2001), 899-907) y polimorfismos de repetición dentro del gen IL-1Ra (Keen et al., Bone 23 (1998), 367-371). En Caceres y Komblihtt, Trends Genet. 4 (2002), 186-93 se describen ejemplos adicionales entre SNP intrónicos y la función génica. El ejemplo 4 en la página 52, línea 30 a la página 53, línea 51 del texto describe posibles sucesos de
corte y empalme alternativos y la producción de proteínas aberrante asociadas con tres SNP descritos en la solicitud.
Las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente en este documento pueden comprender al menos 56580 nucleótidos, preferiblemente al menos 10000 nucleótidos, al menos 5000 nucleótidos, al menos 1000 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 100 nucleótidos. Más preferiblemente, dichas secuencias de ácido nucleico comprenden al menos 50 nucleótidos y de una forma particularmente preferida comprenden al menos 20 ó 21 nucleótidos que comprenden las mutaciones o deleciones descritas anteriormente en este documento. Más preferiblemente, dicha secuencia de ácido nucleico tiene una secuencia como la representada en una cualquiera de las SEC ID Nº: 13 a 51.
Las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente en este documento que comprenden mutaciones en exones que conducen al reemplazo de la secuencia de aminoácidos correspondiente del polipéptido P2X7R de tipo silvestre representado en la SEC ID Nº: 3 ó 4, codifican polipéptidos mostrados en las SEC ID Nº: 5 a 10 y 12.
Además, las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente en este documento que comprenden una deleción que conduce a un polipéptido truncado en comparación con el polipéptido de longitud completa del polipéptido P2X7R de tipo silvestre mostrado en la SEC ID Nº: 3 ó 4 se muestran en la SEC ID Nº: 11.
Como se ha descrito anteriormente, la presente invención también se refiere a usos de moléculas de ácido nucleico que hibridan con una de las moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente y que muestran una mutación como se ha descrito anteriormente para la preparación de una composición de diagnóstico para detectar un trastorno afectivo.
El término "hibrida", como se usa de acuerdo con la presente invención, puede referirse a hibridaciones en condiciones rigurosas o no rigurosas. Si no se especifica, las condiciones son preferiblemente no rigurosas. Dichas condiciones de hibridación pueden establecerse de acuerdo con protocolos convencionales descritos, por ejemplo, en Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), o Higgins y Hames (Eds.) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985). El establecimiento de las condiciones está dentro de la experiencia del especialista y puede determinarse de acuerdo con protocolos descritos en la técnica. De esta manera, la detección de únicamente secuencias de hibridación específica normalmente requerirá condiciones rigurosas de hibridación y lavado tales como 0,1xSSC, SDS al 0,1% a 65ºC. Las condiciones de hibridación no rigurosas para la detección de secuencias homólogas o no exactamente complementarias pueden ser 6xSSC, SDS al 1% a 65ºC. Como es bien conocido, la longitud de la sonda y la composición del ácido nucleico a determinar constituyen parámetros adicionales de las condiciones de hibridación. Debe tenerse en cuenta que pueden realizarse variaciones en las condiciones anteriores por medio de la inclusión y/o sustitución de reactivos de bloqueo alternativos usados para eliminar el efecto de fondo en los experimentos de hibridación. Los reactivos de bloqueo típicos incluyen reactivo de Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN de esperma de salmón desnaturalizado y formulaciones patentadas disponibles en el mercado. La inclusión de reactivos de bloqueo específicos puede requerir la modificación de las condiciones de hibridación descritas anteriormente debido a problemas de compatibilidad. Las moléculas de ácido nucleico que hibridan también comprenden fragmentos de las moléculas descritas anteriormente. Estos fragmentos pueden representar secuencias de ácido nucleico que codifican un canal iónico de apertura por ATP P2X7R no funcional o un fragmento no funcional del mismo, y que tienen una longitud de al menos 12 nucleótidos, preferiblemente de al menos 15, más preferiblemente de al menos 18, aún más preferiblemente de al menos 21 nucleótidos, aún más preferiblemente de al menos 30 nucleótidos, incluso más preferiblemente de al menos 40 nucleótidos y todavía más preferiblemente de al menos 60 nucleótidos. Además, las moléculas de ácido nucleico que hibridan con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente también incluyen fragmentos complementarios, derivados y variantes alélicas de estas moléculas. Además, un complejo de hibridación se refiere a un complejo entre dos secuencias de ácido nucleico gracias a la formación de enlaces de hidrógeno entre bases G y C complementarias y entre bases A y T complementarias; estos enlaces de hidrógeno pueden estabilizarse adicionalmente por interacciones de apilamiento de bases. Las dos secuencias de ácido nucleico complementarias forman enlaces de hidrógeno en una configuración antiparalela. Un complejo de hibridación puede formarse en solución (por ejemplo, análisis Cot o Rot) o entre una secuencia de ácido nucleico presente en solución y otra secuencia de ácido nucleico inmovilizada en un soporte sólido (por ejemplo, membranas, filtros, chips, pasadores o portaobjetos de vidrio a los que, por ejemplo, se han fijado células). Los términos complementario o complementariedad se refieren a la unión natural de polinucleótidos en condiciones permisivas de sal y temperatura por la formación de pares de bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" se une a la secuencia complementaria "T-C-A". La complementariedad entre dos moléculas monocatenarias puede ser "parcial", en la que sólo se unen algunos de los ácidos nucleicos, o puede ser completa cuando existe una complementariedad total entre las moléculas monocatenarias. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficacia y fuerza de hibridación entre cadenas de ácido nucleico. Esto tiene una importancia particular en reacciones de amplificación, que dependen de la unión entre cadenas de ácido nucleico.
La expresión "secuencias de hibridación" preferiblemente se refiere a secuencias que presentan una identidad de secuencia de al menos 40%, preferiblemente de al menos 50%, más preferiblemente de al menos 60%, incluso más preferiblemente de al menos 70%, de una forma particularmente preferida de al menos 80%, de una forma particularmente más preferida de al menos 90%, de una forma incluso más particularmente preferida de al menos 95% y aún más preferiblemente de al menos 97% con una secuencia de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente, que codifica una proteína P2X7R con una mutación descrita. Además, la expresión "secuencias de hibridación" preferiblemente se refiere a secuencias que codifican una proteína P2X7R que tiene una identidad de secuencia de al menos 40%, preferiblemente de al menos 50%, más preferiblemente de al menos 60%, incluso más preferiblemente de al menos 70%, de una forma particularmente preferida de al menos 80%, de una forma particularmente más preferida de al menos 90%, de una forma incluso particularmente más preferida de al menos 95% y aún más preferiblemente de al menos 97% con una secuencia de aminoácidos de un mutante de P2X7R como se ha descrito anteriormente en este documento.
De acuerdo con la presente invención, la expresión "idéntica" o "porcentaje de identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico o aminoácidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de restos aminoacídicos o nucleótidos que son iguales (por ejemplo, identidad de 60% o 65%, preferiblemente identidad de 70-95%, más preferiblemente identidad de al menos 95%) cuando se comparan y se alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación, sobre una región designada, midiéndose dicha identidad usando un algoritmo de comparación de secuencias conocido en la técnica, o por alineamiento manual e inspección visual. Las secuencias que tienen, por ejemplo, una identidad de secuencia de 60 a 95% o mayor se consideran sustancialmente idénticas. Esta definición también se aplica al complemento de una secuencia de ensayo. Preferiblemente, la identidad descrita existe en una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 15 a 25 aminoácidos o nucleótidos, más preferiblemente en una región que tiene una longitud de aproximadamente 50 a 100 aminoácidos o nucleótidos. Los especialistas en la técnica sabrán cómo determinar el porcentaje de identidad entre secuencias usando, por ejemplo, algoritmos tales como los basados en el programa informático CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) o FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245) como se conoce en la técnica.
Aunque el algoritmo FASTDB típicamente no considera adiciones o deleciones internas sin correspondencia en las secuencias, es decir, huecos, en su cálculo, esto puede corregirse manualmente para evitar una sobreestimación del porcentaje de identidad. CLUSTALW, sin embargo, no tiene en cuenta los huecos de secuencia en sus cálculos de identidad. Los especialistas en la técnica también disponen de algoritmos BLAST y BLAST 2.0 (Altschul Nucl. Acids Res. 25 (1977), 3389-3402). El programa BLASTN para secuencias de ácido nucleico usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4 y una comparación de las dos cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, y una expectativa (E) de 10. La matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, (1989), 10915) usa alineamientos (B) de 50, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4, y una comparación de las dos cadenas.
Además, como se ha descrito anteriormente, la presente invención también se refiere al uso de moléculas de ácido nucleico cuya secuencia está degenerada en comparación con la secuencia de una molécula de hibridación descrita anteriormente, para la preparación de una composición de diagnóstico para detectar un trastorno afectivo. Cuando se usa de acuerdo con la presente invención, la expresión "que está degenerada como resultado del código genético" significa que debido a la redundancia del código genético diferentes secuencias de nucleótidos codifican el mismo aminoácido.
También se describen en este documento moléculas de ácido nucleico que comprenden una o más de las mutaciones o deleciones descritas anteriormente.
Las moléculas de ácido nucleico aplicadas en los usos de la invención pueden proceder de cualquier organismo que codifique canales iónicos de apertura por ATP P2X7R correspondientes. Por ejemplo, se ha informado sobre la existencia de canales iónicos de apertura por ATP P2X7R en diversos organismos, por ejemplo, rata (véase, Suprenant (1996), loc. cit), ratón (Número de acceso del Genbank AJ 489297), xenopus (Número de acceso del Genbank AJ 345114), pollo (Número de acceso del Genbank BM 491404) o Bos taurus (Número de acceso del Genbank AF 083073). En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico de la invención procede de un vertebrado, preferiblemente de un mamífero, incluso más preferiblemente la molécula de ácido nucleico procede de un conejo o cobaya, y aún más preferiblemente el ácido nucleico procede de ratón, rata o ser humano.
La molécula de ácido nucleico aplicada en los usos de la invención puede ser cualquier tipo de ácido nucleico, por ejemplo, ADN, ARN o APN (ácido péptido nucleico).
Para los fines de la presente invención, un ácido péptido nucleico (APN) es un análogo de ADN de tipo poliamida y las unidades monoméricas para adenina, guanina, timina y citosina están disponibles en el mercado (Perceptive Biosystems). En los APN no están presentes ciertos componentes del ADN, tales como fósforo, óxidos de fósforo o derivados de desoxirribosa. Como describen Nielsen et al., Science 254:1497 (1991); y Egholm et al., Nature 365:666 (1993), los APN se unen específicamente y fuertemente a cadenas de ADN complementarias y no se degradan por las nucleasas. De hecho, el APN se une más fuertemente al ADN que el propio ADN. Esto probablemente se debe a que no hay repulsión electrostática entre las dos cadenas y también a que el esqueleto de poliamida es más flexible. Debido a esto, los dúplex de APN/ADN se unen en una serie más amplia de condiciones de rigurosidad que los dúplex de ADN/ADN, haciendo que sea más fácil realizar hibridaciones múltiples. Pueden usarse sondas más pequeñas que con el ADN debido a la fuerte unión. Además, es más probable que puedan determinarse los desacoplamientos de una sola base con la hibridación de APN/ADN debido a que un solo desacoplamiento en un híbrido APN/ADN de 15 unidades reduce el punto de fusión (T.sub.m) en 8º-20ºC, frente a 4º-16ºC para el dúplex de ADN/ADN de 15 unidades. Además, la ausencia de grupos cargados en el APN significa que la hibridación puede realizarse a bajas concentraciones iónicas reduciéndose la posible interferencia por las sales durante el análisis.
El ADN puede ser, por ejemplo, ADNc. En una realización preferida, es un ADN genómico. El ARN puede ser, por ejemplo, ARNm. La molécula de ácido nucleico puede ser natural, sintética o semisintética o puede ser un derivado, tal como un ácido péptido nucleico (Nielsen, Science 254 (1991), 1497-1500) o fosforotioatos. Además, la molécula de ácido nucleico puede ser una molécula de ácido nucleico quimérica producida de forma recombinante que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente solas o en combinación.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aplicada en los usos de la presente invención es parte de un vector. Por lo tanto, la presente invención se refiere, en otra realización, a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de esta invención. Este vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, cósmido, virus, bacteriófago u otro vector usado, por ejemplo, convencionalmente en ingeniería genética, y puede comprender genes adicionales tales como genes marcadores que permitan la selección de dicho vector en una célula hospedadora adecuada y en condiciones adecuadas.
Las moléculas de ácido nucleico aplicadas en los usos de la presente invención pueden insertarse en varios vectores disponibles en el mercado. Los ejemplos no limitantes incluyen vectores plasmídicos compatibles con células de mamífero, tales como pUC, pBluescript (Stratagene), pET (Novagen), pREP (Invitrogen), pCRTopo (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMC1 neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pUCTag, plZD35, pLXIN y pSIR (Clontech) y pIRES-EGFP (Clontech). En el mercado también están disponibles vectores de Baculovirus tales como pBlueBac, el sistema de expresión de baculovirus BacPacz (CLONTECH) y el sistema de expresión en baculovirus MaxBacTM, células de insecto y protocolos (Invitrogen), y también pueden usarse para producir altos rendimientos de proteínas biológicamente activas. (Véase también, Miller (1993), Curr. Op. Genet. Dev., 3, 9; O'Reilly, Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, p. 127). Además, son ejemplos no limitantes de otros vectores adecuados para uso con la presente invención vectores procarióticos tales como pcDNA2; y vectores de levadura tales como pYes2. Como técnicas de modificación de vectores, véase Sambrook y Russel (2001), loc. cit. Los vectores pueden contener uno o más sistemas de replicación y herencia para la clonación o expresión, uno o más marcadores para la selección en el hospedador, por ejemplo, resistencia a antibióticos, y uno o más cassettes de expresión.
Las secuencias codificantes insertadas en el vector pueden sintetizarse por métodos convencionales, aislarse a partir de fuentes naturales o prepararse como híbridos. El ligamiento de las secuencias codificantes a elementos reguladores de la transcripción (por ejemplo, promotores, potenciadores y/o aislantes) y/o a otras secuencias de aminoácidos codificantes puede realizarse usando métodos establecidos.
Adicionalmente, los vectores pueden comprender, además de las secuencias de ácido nucleico de la invención, elementos de control de la expresión, permitiendo la expresión apropiada de las regiones codificantes en hospedadores adecuados. Estos elementos de control son conocidos para el especialista en la técnica y pueden incluir un promotor, codón de inicio de la traducción, sitio de traducción e inserción o sitios internos de entrada de ribosomas (IRES) (Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471-1476) para introducir un inserto en el vector. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico de la invención está unida operativamente a dichas secuencias de control de la expresión permitiendo la expresión en células procariotas o eucariotas. En este contexto se prefieren particularmente secuencias de control que permiten la expresión correcta en células neuronales y/o células derivadas de tejido nervioso.
Los elementos de control que aseguran la expresión en células eucariotas y procariotas son bien conocidos para los especialistas en la técnica. Como se ha mencionado anteriormente, normalmente comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción y opcionalmente señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Otros elementos reguladores pueden incluir potenciadores de la transcripción así como de la traducción, y/o regiones promotoras asociadas de forma natural o heterólogas. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión, por ejemplo, en células hospedadoras de mamífero comprenden el promotor de timidina quinasa de CMV-HSV, SV40, promotor de RSV (virus del sarcoma de Rous), el promotor 1\alpha del factor de elongación humano, el potenciador de CMV, promotor de CaM-quinasa o potenciador de SV40.
Para la expresión, por ejemplo, en tejido nervioso y/o células derivadas del mismo, en la técnica son bien conocidas varias secuencias reguladores, tales como la secuencia promotora mínima del neurofilamento L humano (Charron, J. Biol. Chem. 270 (1995), 25739-25745). Para la expresión en células procariotas, se han descrito una multitud de promotores incluyendo, por ejemplo, el promotor tac-lac, el promotor lacUV5 o el promotor trp. Aparte de los elementos que son responsables para el inicio de la transcripción, estos elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio poli-A de SV40 o el sitio poli-A de tk, cadena abajo del polinucleótido. En este contexto, en la técnica se conocen vectores de expresión adecuados tales como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene, como se usa, entre otros en los ejemplos adjuntos), pSPORT1 (GIBCO BRL) o pGEMHE (Promega), o vectores de expresión procarióticos tales como lambda gt11.
Un vector de expresión de acuerdo con esta invención es al menos capaz de dirigir la replicación, y preferiblemente la expresión, de los ácidos nucleicos y proteína de esta invención. Los orígenes de replicación adecuados incluyen, por ejemplo, los orígenes de replicación de Col E1, el origen de replicación viral de SV40 y el origen de replicación de M 13. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor de citomegalovirus (CMV), el promotor de iacZ, el promotor de gai10 y el promotor poliédrico del virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Autographa califórnica (AcMNPV). Las secuencias de terminación adecuadas incluyen, por ejemplo, la hormona de crecimiento bovina, SV40, iacZ y señales de poliadenilación poliédricas de AcMNPV. Los ejemplos de marcadores seleccionables incluyen resistencia a neomicina, ampicilina e higromicina y similares. Los vectores diseñados específicamente permiten la transposición de ADN entre diferentes células hospedadoras tales como bacterias-levaduras, bacterias-células animales, bacterias-células fúngicas o bacterias-células de invertebrados.
Aparte de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención, el vector puede comprender además secuencias de ácido nucleico que codifican señales de secreción. Estas secuencias son bien conocidas para el especialista en la técnica. Además, dependiendo del sistema de expresión usado, en la secuencia codificante de las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden añadirse secuencias líder capaces de dirigir el polipéptido expresado a un compartimento celular, y son bien conocidas en la técnica. Las secuencias líder se ensamblan en la fase apropiada con secuencias de traducción, inicio y terminación y, preferiblemente, con una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida, o una parte de la misma, entre otros sitios, dentro de la membrana extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación C- o N-terminal que confiere características deseadas, por ejemplo, estabilización o una purificación simplificada del producto recombinante expresado. Una vez incorporado el vector en el hospedador apropiado, el hospedador se mantiene en condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos y, cuando se desee, puede seguirse por la recogida y purificación de las proteínas, fragmentos antigénicos o proteínas de fusión de la invención. Por supuesto, el vector también puede comprender regiones reguladoras de organismos patógenos.
Además, dicho vector también puede ser, además de un vector de expresión, un vector de transferencia génica y/o de dirección génica. La terapia génica, que se basa en la introducción de genes terapéuticos (por ejemplo para vacunación) en células por técnicas ex-vivo o in-vivo es una de las aplicaciones más importantes de la transferencia de genes. Los vectores, sistemas de vectores y métodos adecuados para la terapia génica in-vitro o in-vivo se describen en la bibliografía y son bien conocidos para el especialista en la técnica; véase, por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; documentos WO 94/29469; WO 97/00957; Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 o Verma, Nature 389 (1997), 239-242 y las referencias citadas en estos documentos.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención y los vectores como se han descrito anteriormente en este documento pueden diseñarse para la introducción directa o para la introducción a través de liposomas o vectores virales (por ejemplo, adenovirales o retrovirales) en la célula. Además, pueden usarse sistemas de baculovirus o sistemas basados en virus vaccinia o Virus Semliki Forest como sistemas de expresión eucarióticos para las moléculas de ácido nucleico de la invención. Además de la producción recombinante, pueden producirse fragmentos de la proteína, la proteína de fusión o fragmentos antigénicos de la invención por síntesis directa de péptidos usando técnicas en fase sólida (véase Stewart et al., (1969) Solid Phase Peptide Synthesis; Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154). La síntesis de proteínas in vitro puede realizarse usando técnicas manuales o por medio de una automatización. La síntesis automática puede conseguirse, por ejemplo, usando el Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer, Foster City CA) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Varios fragmentos pueden sintetizarse químicamente por separado y combinarse usando métodos químicos para producir la molécula de longitud completa.
También se describe en este documento un hospedador transformado con un vector o un hospedador que comprende la molécula de ácido nucleico de la invención. Dicho hospedador se puede producir introduciendo dicho vector o secuencia de nucleótidos en una célula hospedadora que, en su presencia en la célula, media la expresión de una proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de la invención o que comprende una secuencia de nucleótidos o un vector de acuerdo con la invención, siendo la secuencia de nucleótidos y/o el polipéptido codificado extraño para la célula hospedadora.
Por "extraño" se entiende que la secuencia de nucleótidos y/o el polipéptido codificado es heterólogo con respecto al hospedador, que significa derivado de una célula u organismo con una base genómica diferente, o es homólogo con respecto al hospedador pero está localizado en un entorno genómico diferente que el del homólogo natural de dicha secuencia de nucleótidos. Esto significa que si la secuencia de nucleótidos es homóloga con respecto al hospedador, no se localiza en su localización natural en el genoma de dicho hospedador, en particular está rodeada por genes diferentes. En este caso, la secuencia de nucleótidos puede estar bajo el control de su propio promotor o bajo el control de un promotor heterólogo. La localización de la molécula de ácido nucleico introducida o el vector puede determinarse por el especialista en la técnica usando métodos bien conocidos por dicho especialista en la técnica, por ejemplo, Transferencia de Southern. El vector o la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención que está presente en el hospedador puede estar integrada en el genoma del hospedador o puede mantenerse en alguna forma extracromosómicamente. A este respecto, también se entenderá que la secuencia de nucleótidos de la invención puede usarse para restaurar o crear un gen mutante por recombinación homóloga.
Dicho hospedador puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Son células procariotas/bacterianas adecuadas las usadas generalmente para clonación, tales como E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens o Bacillus subtilis. Dicho hospedador eucariota puede ser una célula de mamífero, una célula de anfibio, una célula de pez, una célula de insecto, una célula fúngica, una célula vegetal o una célula bacteriana (por ejemplo, las cepas de E. coli HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 y JM101). Se prefieren células hospedadoras recombinantes eucariotas. Los ejemplos de células hospedadoras eucariotas incluyen, pero sin limitación, levaduras, por ejemplo células de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis o Pichia pastoris, líneas celulares de origen humano, bovino, porcino, de mono y de roedor, así como células de insecto, incluyendo pero sin limitación células de insecto Spodoptera frugiperda y células de insecto derivadas de Drosophila, así como células de pez cebra. Las líneas celulares derivadas de especies de mamífero adecuadas para uso y disponibles en el mercado incluyen, pero sin limitación, células L, células CV-1, células COS-1 (ATCC CRL 1650), células COS-7 (ATCC CRL 1651), células HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) y MRC-5 (ATCC CCL 171).
Preferiblemente, dicha célula de mamífero es una célula neuronal y/o una célula cultivada tal como, entre otras, una célula HEK 293 (riñón embrionario humano), una célula CHO, HeLa, NIH3T3, BHK, PC12 o una célula madre neuronal preferiblemente derivada de un mamífero y más preferiblemente de un ser humano.
Preferiblemente, dicha célula de anfibio es un oocito. Más preferiblemente, dicho oocito es un oocito de rana, particularmente preferido un oocito de Xenopus laevis.
El hospedador descrito en este documento es un organismo transgénico no humano. Dicho organismo no humano puede ser un mamífero, anfibio, un pez, un insecto, un hongo o una planta. Son animales transgénicos no humanos particularmente preferidos especies de Drosophila, Caenorhabditis elegans, especies de Xenopus, pez cebra, Spodoptera frugiperda, Autographa californica, ratones y ratas. Las plantas transgénicas comprenden, pero sin limitación, trigo, tabaco, perejil y Arabidopsis. Los hongos transgénicos también son bien conocidos en la técnica y comprenden, entre otros, levaduras tales como S. pombe o S. cerevisiae, especies de Aspergillus, Neurospora o Ustilago o especies de Pichia.
En este documento se describe un método para producir el polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de la invención que comprende cultivar/desarrollar el hospedador de la invención y aislar el polipéptido producido.
En la técnica existen un gran número de métodos adecuados para producir polipéptidos en hospedadores apropiados. Si el hospedador es un organismo unicelular o una célula de mamífero o insecto, la persona especialista en la técnica puede volver a una diversidad de condiciones de cultivo que pueden optimizarse adicionalmente sin una carga excesiva de trabajo. Convenientemente, la proteína producida se recoge del medio de cultivo o de membranas (biológicas) aisladas por técnicas establecidas. Además, el polipéptido producido puede aislarse directamente a partir de la célula hospedadora. Dicha célula hospedadora puede ser parte o puede derivar de una parte de un organismo hospedador, por ejemplo, dicha célula hospedadora puede ser parte del SNC de un animal o la parte cosechable de una planta. Además, el polipéptido producido puede aislarse de fluidos derivados de dicho hospedador, tal como sangre, leche o líquido cefalorraquídeo.
Además, la presente invención se refiere al uso de polipéptidos representados en las SEC ID Nº: 5 a 12 que se codifican por las moléculas de ácido nucleico de la invención o se producen por el método descrito en este documento para la preparación de una composición de diagnóstico para detectar un trastorno afectivo. El polipéptido de la invención, por consiguiente, puede producirse por métodos microbiológicos o por mamíferos transgénicos. También se prevé que el polipéptido de la invención se recupere a partir de plantas transgénicas. Como alternativa, el polipéptido de la invención puede producirse sintética o semisintéticamente.
Por ejemplo, puede usarse síntesis química tal como el procedimiento en fase sólida descrito por Houghton Proc. Natl. Acad. Sci. USA (82) (1985), 5131-5135. Otro método es la traducción in vitro de ARNm. Un método preferido implica la producción recombinante de proteínas en células hospedadoras como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, pueden sintetizarse secuencias de ácido nucleico que comprenden todo o una parte de una cualquiera de las secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención por PCR, insertarse en un vector de expresión y una célula hospedadora puede transformarse con el vector de expresión. Posteriormente, la célula hospedadora se cultiva para producir el polipéptido deseado, que se aísla y purifica. El aislamiento y purificación de proteínas puede conseguirse por una cualquiera de varias técnicas conocidas; por ejemplo y sin limitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión molecular y cromatografía de afinidad, cromatografía líquida de alta presión (HPLC), HPLC de fase inversa, electroforesis en gel preparativa con disco. Además, pueden usarse sistemas de traducción sin células para producir los polipéptidos de la presente invención. Los sistemas de expresión sin células adecuados para uso de acuerdo con la presente invención incluyen lisado de reticulocitos de conejo, extracto de germen de trigo, membranas microsomales pancreáticas caninas, extracto S30 de E. coli y sistemas de transcripción/traducción acoplados tales como el sistema TNT (Promega). Estos sistemas permiten la expresión de polipéptidos o péptidos recombinantes tras la adición de vectores de clonación, fragmentos de ADN o secuencias de ARN que contienen regiones codificantes y elementos promotores apropiados. Como se ha mencionado supra, las técnicas de aislamiento/purificación de proteínas pueden requerir la modificación de las proteínas de la presente invención usando métodos convencionales. Por ejemplo, puede añadirse una señal de histidina a la proteína para permitir la purificación en una columna de níquel. Otras modificaciones pueden producir una mayor o menor actividad, permitir mayores niveles de producción de proteínas o simplificar la purificación de la proteína.
En otra realización, la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo dirigido específicamente a un polipéptido de la invención, donde dicho anticuerpo reacciona específicamente con un epítopo generado y/o formado por la mutación en el canal iónico de apertura por ATP P2X7R seleccionado entre el grupo compuesto por:
(i) un epítopo presentado específicamente por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un canal iónico de apertura por ATP P2X7R, donde el resto R (Arg), G (Gly), E (Glu), L (Leu), R (Arg), I (Ile) o R (Arg) que corresponde a la posición 117, 150, 186, 191, 270, 568 ó 578 del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre como se representa en la SEC ID Nº: 3 ó 4 se reemplaza por otro resto aminoacídico; y
(ii) un epítopo presentado específicamente por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un canal iónico de apertura por ATP P2X7R, donde se delecionan los aminoácidos correspondientes a las posiciones 488 a 494 del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre como se representa en la SEC ID Nº: 3 ó 4, para la preparación de una composición de diagnóstico para detectar un trastorno afectivo.
Con respecto a las realizaciones preferidas de (i) y (ii) se aplica lo mismo que se ha descrito anteriormente en relación con las moléculas de ácido nucleico. El término "específicamente" en este contexto significa que el anticuerpo reacciona con la proteína P2X7R mutante pero no con una proteína P2X7R de tipo silvestre. Preferiblemente, este término también significa que dicho anticuerpo no se une a otras formas mutantes de la proteína P2X7R, en particular las descritas en este documento. Si el anticuerpo reacciona específicamente como se ha definido anteriormente en este documento puede ensayarse fácilmente, entre otros métodos, comparando la reacción de dicho anticuerpo con un canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre (o una subunidad o fragmento del mismo) con la reacción de dicho anticuerpo con un polipéptido P2X7R mutante de la invención.
El anticuerpo aplicado en los usos de la presente invención puede ser, por ejemplo, policlonal o monoclonal. El término "anticuerpo" también comprende derivados o fragmentos del mismo que retienen la especificidad de unión. Las técnicas para la producción de anticuerpos son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Estos anticuerpos pueden usarse, por ejemplo, para la inmunoprecipitación e inmunolocalización de los polipéptidos de la invención así como para el control de la presencia de dichos polipéptidos, por ejemplo, en organismos recombinantes o en diagnóstico. También pueden usarse para la identificación de compuestos que interaccionan con las proteínas de acuerdo con la invención (como se menciona en este documento más adelante). Por ejemplo, puede usarse la resonancia de plasmón superficial como se emplea en el sistema BIAcore para aumentar la eficacia de anticuerpos contra fagos que se unen a un epítopo del polipéptido de la invención (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).
La presente invención además incluye anticuerpos quiméricos, monocatenarios y humanizados así como fragmentos de anticuerpo tales como, entre otros, fragmentos Fab. Los fragmentos o derivados de anticuerpos comprenden además fragmentos F(ab')2, Fv o scFv; véase, por ejemplo, Harlow y Lane, loc. cit.. En la técnica se conocen diversos procedimientos y pueden usarse para la producción de estos anticuerpos y/o fragmentos. De esta manera, los derivados (anticuerpos) pueden producirse por peptidomiméticos. Además, pueden adaptarse técnicas descritas para la producción de anticuerpos monocatenarios (véase, entre otras, la Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778) para producir anticuerpos monocatenarios contra polipéptidos de esta invención. Además, pueden usarse animales transgénicos para expresar anticuerpos humanizados contra polipéptidos de esta invención. Más preferiblemente, el anticuerpo de esta invención es un anticuerpo monoclonal. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos de estas técnicas incluyen la técnica de hibridoma (Köhler y Milstein Nature 256 (1975), 495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). Las técnicas que describen la producción de anticuerpos monocatenarios (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778) pueden adaptarse para producir anticuerpos monocatenarios contra polipéptidos inmunogénicos como los descritos anteriormente. Además, pueden usarse ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados dirigidos contra dichos polipéptidos inmunogénicos. En particular se prefiere que las construcciones de anticuerpos/anticuerpo, así como los fragmentos o derivados de anticuerpo a emplear de acuerdo con esta invención puedan expresarse en una célula. Esto puede conseguirse, entre otros métodos, por inyección directa de las moléculas proteicas correspondientes o por inyección de moléculas de ácido nucleico que las codifican. Además, se prevén estrategias de terapia génica. Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, la expresión "molécula de anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina enteras así como a partes de dichas moléculas de inmunoglobulina. Además, el término, como se ha descrito anteriormente, se refiere a moléculas de anticuerpo modificadas y/o alteradas, tales como anticuerpos quiméricos y humanizados. El término también se refiere a anticuerpos monoclonales o policlonales así como a anticuerpos generados de forma recombinante o por síntesis/anticuerpos sintetizados. El término también se refiere a anticuerpos intactos así como a fragmentos de dichos anticuerpos, tales como cadenas ligeras y pesadas separadas, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2. La expresión "molécula de anticuerpo" también comprende anticuerpos bifuncionales y construcciones de anticuerpos, tales como Fv monocatenarios (scFv) o proteínas de fusión de anticuerpo. También se prevé en el contexto de esta invención que el término "anticuerpo" comprende construcciones de anticuerpo que pueden expresarse en células, por ejemplo, construcciones de anticuerpo que pueden introducirse por transfección y/o transducción a través de, entre otras moléculas, virus o vectores. Se prevé particularmente que estas construcciones de anticuerpo reconozcan específicamente a los polipéptidos de la presente invención. Además, se prevé que dicha construcción de anticuerpos se emplee en estrategias de terapia génica.
La presente invención también se refiere al uso de un aptámero que se une específicamente a un polipéptido de acuerdo con la invención donde dicho aptámero reacciona con un epítopo de un polipéptido de la presente invención para la preparación de una composición de diagnóstico para detectar un trastorno afectivo. La presente invención además se refiere al uso de un aptámero dirigido específicamente a una molécula de ácido nucleico correspondiente de acuerdo con la invención para la preparación de una composición de diagnóstico para detectar un trastorno afectivo.
De acuerdo con la presente invención, el término "aptámero" significa moléculas de ácido nucleico que pueden unirse a moléculas diana. Los aptámeros comúnmente comprenden ARN, ADN monocatenario, ARN modificado o moléculas de ADN modificadas. La preparación de aptámeros es bien conocida en la técnica y puede implicar, entre otras cosas, el uso de bibliotecas de ARN combinatorias para identificar sitios de unión (Gold, Ann. Rev. Biochem. 64 (1995), 763-797).
Además, la presente invención se refiere al uso de un cebador o un par de cebadores capaces de amplificar específicamente las moléculas de ácido nucleico de la presente invención para la preparación de una composición de diagnóstico para detectar un trastorno afectivo. El término "cebador", cuando se usa en la presente invención, significa una molécula de ácido nucleico monocatenaria capaz de hibridar con la molécula de ácido nucleico de la presente solicitud y, por lo tanto, que puede servir como punto de partida para la amplificación. Dicho término también comprende oligorribo- o desoxirribonucleótidos que son complementarios a una región de una de las cadenas de una molécula de ácido nucleico de la presente invención. De acuerdo con la presente invención, la expresión "par de cebadores" significa un par de cebadores que están dirigidos en la dirección opuesta entre sí, con respecto a una región complementaria de una molécula de ácido nucleico, para permitir, por ejemplo, la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
El término "amplificación" se refiere a la copia repetida de una secuencia especificada de nucleótidos dando como resultado un aumento en la cantidad de dicha secuencia especificada de nucleótidos y permite la generación de una multitud de moléculas de ácido nucleico idénticas o esencialmente idénticas (es decir, con una identidad de al menos 95%, más preferiblemente de al menos 98%, incluso más preferiblemente de al menos 99% y aún más preferiblemente de al menos 99,5%, tal como de 99,9%) o partes de las mismas. Estos métodos están bien establecidos en la técnica; véase Sambrook et al. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2ª edición 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor. Incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y modificaciones de la misma, y reacción en cadena de la ligasa (LCR) por nombrar algunos métodos de amplificación preferidos.
Cuando se usan en el contexto de los cebadores, el término "específicamente" significa que sólo se amplifican las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento anteriormente y no se amplifican las moléculas de ácido nucleico que codifican el receptor de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representado en la SEC ID Nº: 1. De esta manera, un cebador de acuerdo con la invención es preferiblemente un cebador que se une a una región de una molécula de ácido nucleico de la invención que es única para esta molécula y que no está presente en la secuencia codificante de P2X7R de tipo silvestre, es decir, el cebador se une en una región en la que se produce una de las mutaciones descritas anteriormente. En relación con un par de cebadores de acuerdo con la invención, es posible que uno de los cebadores del par sea específico en el sentido descrito anteriormente o que los dos cebadores del par sean específicos. En ambos casos, el uso de dicho par de cebadores permitiría amplificar específicamente un mutante de la invención como se ha descrito anteriormente en este documento, pero no la secuencia codificante de P2X7R de tipo silvestre.
El extremo 3'-OH de un cebador se usa por una polimerasa para extenderse por la incorporación sucesiva de nucleótidos. El cebador o par de cebadores de la presente invención puede usarse, por ejemplo, en experimentos de extensión de cebadores sobre una plantilla de ARN de acuerdo con los métodos conocidos por el especialista en la técnica. Preferiblemente, el cebador o par de cebadores de la presente invención se usan para reacciones de amplificación sobre la plantilla de ARN o la plantilla de ADN, preferiblemente ADNc o ARN genómico. Las expresiones "plantilla de ADN" o "plantilla de ARN" se refieren a moléculas de ADN o ARN o fragmentos de las mismas de cualquier fuente o composición de nucleótidos, que comprenden una secuencia de nucleótidos diana como se ha definido anteriormente. El cebador o par de cebadores también puede usarse para experimentos de hibridación como los conocidos en la técnica. Preferiblemente, el cebador o par de cebadores se usan en reacciones en cadena de la polimerasa para amplificar secuencias que corresponden a una secuencia de la molécula de ácido nucleico de la presente invención. Se sabe que la longitud de un cebador se obtiene a partir de diferentes parámetros (Gillam, Gene 8 (1979), 81-97; Innis, PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press, San Diego, USA (1990)). Preferiblemente, el cebador sólo debe hibridar o unirse con una región específica de una secuencia de nucleótidos diana. La longitud de un cebador que hibrida estadísticamente sólo en una región de una secuencia de nucleótidos diana puede calcularse por la siguiente fórmula: (^{1}/_{4})^{x} (donde x es la longitud del cebador). Por ejemplo, un hepta- u octanucleótido sería suficiente para unirse estadísticamente sólo una vez en una secuencia de 37 kb. Sin embargo, se sabe que un cebador que corresponde exactamente a una cadena de plantilla complementaria debe tener al menos una longitud de 9 pares de bases, de lo contrario no podría generarse una doble cadena estable (Goulian, Biochemistry 12 (1973), 2893-2901). También se prevé que pueden usarse algoritmos basados en ordenador para diseñar cebadores capaces de amplificar las moléculas de ácido nucleico de la invención. Preferiblemente, los cebadores de la invención tienen una longitud de al menos 10 nucleótidos, más preferiblemente de al menos 12 nucleótidos, incluso más preferiblemente de al menos 15 nucleótidos, de una forma particularmente preferida de al menos 18 nucleótidos, de una forma incluso particularmente más preferida de al menos 20 nucleótidos y aún más preferiblemente de al menos 25 nucleótidos. Sin embargo, la invención también puede realizarse con cebadores que sean más cortos o más largos.
También se prevé que el cebador o par de cebadores esté marcado. El marcador puede ser, por ejemplo, un marcador radiactivo tal como ^{32}P, ^{33}P o ^{35}S. En una realización preferida de la invención, el marcador es un marcador no radiactivo, por ejemplo, digoxigenina, biotina y un colorante fluorescente o un tinte.
En otra realización preferida, dichos cebadores se seleccionan entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº: 52 a 111.
En otra realización, la presente invención se refiere a una composición de diagnóstico que comprende una molécula de ácido nucleico, un vector, un polipéptido, un anticuerpo, un aptámero y/o un cebador o par de cebadores de la invención para uso en el diagnóstico de un trastorno afectivo.
El término "composición", como se usa de acuerdo con la presente invención, se refiere a composiciones que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico, vector, polipéptido, un anticuerpo y/o cebador o par de cebadores de esta invención. Opcionalmente, puede comprender moléculas adicionales capaces de alterar las características del componente de la invención y de esta manera, por ejemplo, suprimir, bloquear, modular y/o activar su función, que tienen propiedades neuroprotectoras, nootrópicas, antidepresivas y/o protectoras de las células como se describirá más adelante en este documento. La composición puede estar en forma sólida, líquida o gaseosa y puede estar, entre otras, en forma de (un) polvo(s), (un) comprimido(s), (una) solución (soluciones) o (un) aerosol(es).
En una realización preferida, la composición de diagnóstico de acuerdo con la invención opcionalmente comprende además medios adecuados para su detección. Como se ha descrito anteriormente, la presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que las mutaciones en la proteína P2X7R están relacionadas con trastornos afectivos. De esta manera, este conocimiento permite diagnosticar trastornos afectivos de una forma fácil. La composición de diagnóstico comprende al menos uno de los compuestos mencionados anteriormente de la invención. La composición de diagnóstico puede usarse, entre otras cosas, para métodos para determinar la presencia y/o expresión de los ácidos nucleicos y/o polipéptidos de la invención. Esto puede realizarse por medio de la detección, por ejemplo, de la presencia de un gen correspondiente en el material genético de un individuo o la presencia del ARNm correspondiente que comprende el aislamiento del ADN o ARN a partir de una célula derivada de dicho individuo, la puesta en contacto del ADN o ARN obtenido de esta manera con una sonda de ácido nucleico como se ha descrito anteriormente en condiciones de hibridación, y la detección de la presencia de ARNm hibridados con la sonda. Como alternativa, la composición de diagnóstico también puede usarse para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico de la invención por PCR. Además, los polipéptidos de la invención pueden detectarse por métodos conocidos en la técnica que comprenden, entre otros, métodos inmunológicos tales como RIA, FIA, ELISA, FACS o transferencia de Western.
Además, la composición de diagnóstico de la invención puede ser útil, entre otras cosas, para detectar la prevalencia, el inicio o el progreso de una enfermedad relacionada con la expresión de un polipéptido de la invención. Por consiguiente, la composición de diagnóstico de la invención puede usarse, entre otras cosas, para evaluar la prevalencia, el inicio y/o el estado de enfermedad de trastornos afectivos, como se han definido anteriormente en este documento. También se contempla que la composición de diagnóstico de la invención puede ser útil para distinguir entre las fases de una enfermedad.
La composición de diagnóstico opcionalmente comprende medios adecuados para la detección. La(s) molécula(s) de ácido nucleico, vector(es), hospedador(es), anticuerpo(s), aptámero(s) y polipéptido(s) descritos anteriormente son adecuados, por ejemplo, para uso en inmunoensayos en los que pueden utilizarse en fase líquida o unirse a un soporte en fase sólida. Los ejemplos de vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, ion polivinílico, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amilosas, celulosas naturales o modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. Para los fines de la invención, el soporte puede ser de naturaleza soluble o insoluble.
Los soportes de fase sólida son conocidos por los especialistas en la técnica y pueden comprender perlas de poliestireno, perlas de látex, perlas magnéticas, partículas metálicas coloidales, chips y superficies de vidrio y/o silicio, tiras de nitrocelulosa, membrana, láminas, duracitos y las paredes de pocillos de una bandeja de reacción, tubos de plástico u otros tubos de ensayo. Los métodos adecuados para inmovilizar molécula(s), vector(es), hospedador(es), anticuerpo(s), aptámero(s), polipéptido(s), etc. sobre las fases sólidas incluyen, pero sin limitación, interacciones iónicas, hidrófobas, covalentes o reticulación (química) y similares. Son ejemplos de inmunoensayos que pueden utilizar dichos compuestos de la invención inmunoensayos competitivos y no competitivos en un formato directo o indirecto. Los ensayos de detección usados comúnmente pueden comprender métodos con radioisótopos o sin radioisótopos. Son ejemplos de dichos inmunoensayos el radioinmunoensayo (RIA), el ensayo de sándwich (ensayo inmunométrico) y el ensayo de transferencia de Northern o de Southern. Además, estos métodos de detección comprenden, entre otros, IRMA (Ensayo Radioinmunométrico Inmune), EIA (Ensayo Inmuno Enzimático), ELISA (Ensayo Inmune Asociado a Enzimas), FIA (Ensayo Inmune Fluorescente) y CLIA (Ensayo Inmune Quimioluminiscente). Además, los compuestos de diagnóstico de la presente invención pueden emplearse en técnicas tales como FRET (Transferencia de Energía de Resonancia por Fluorescencia).
Los especialistas habituales en la técnica conocen los marcadores y métodos de marcaje apropiados. Los ejemplos de los tipos de marcadores que pueden usarse en la presente invención incluyen, entre otros, fluorocromos (tales como fluoresceína, rodamina, Rojo Texas, etc.), enzimas (tales como peroxidasa de rábano picante, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina), isótopos radiactivos (tales como 32P, 33P, 35S o 125I), biotina, digoxigenina, metales coloidales y compuestos quimio- o bioluminiscentes (tales como dioxetanos, luminol o acridinio).
Se dispone de una diversidad de técnicas para marcar biomoléculas, que son bien conocidas para el especialista en la técnica y se consideran dentro del alcance de la presente invención y comprenden, entre otras, acoplamiento covalente de enzimas o grupos biotinilo, fosforilaciones, biotinilaciones, cebado aleatorio, traducciones con muesca, adición de colas (usando transferasas terminales). Estas técnicas, por ejemplo, se describen en Tijssen, "Practice and theory of enzyme inmunoassays", Burden and von Knippenburg (Eds), Volume 15 (1985); "Basic methods in molecular biology", Davis LG, Dibmer MD, Battery Elsevier (1990); Mayer, (Eds) "Immunochemical methods in cell and molecular biology" Academic Press, London (1987); o en la serie "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc.
Los métodos de detección comprenden, pero sin limitación, autorradiografía, microscopía de fluorescencia, reacciones enzimáticas directas e indirectas, etc.
Dicha composición de diagnóstico puede usarse en métodos para detectar la presencia y/o abundancia de una molécula de ácido nucleico de la invención en una muestra biológica y/o médica y/o para detectar la expresión de dicha molécula de ácido nucleico (por ejemplo, determinando el ARNm o el polipéptido expresado). Además, dicha composición de diagnóstico también puede usarse en métodos de la presente invención, entre otras cosas, para la detección de antagonistas o agonistas específicos para canales iónicos de apertura por ATP P2X7R (véase en este documento más adelante).
En una realización adicional, la presente invención proporciona un método in vitro para diagnosticar un trastorno afectivo o una susceptibilidad a un trastorno afectivo, que comprende la etapa de determinar en una muestra obtenida a partir de un individuo si la proteína P2X7R expresada en las células de dicho individuo está infraexpresada en comparación con el nivel de proteína P2X7R de un individuo no afectado. En este documento también se describe un método in vitro para diagnosticar un trastorno afectivo o una susceptibilidad al mismo determinando la sobreexpresión, falta de funcionalidad o alteración de la apertura por ATP de P2X7R. La expresión "sobre- o infraexpresada en comparación con el nivel de proteína P2X7R" en el contexto de la presente invención significa que el nivel de proteína P2X7R es mayor o menor que el nivel de P2X7R de un individuo sano, es decir, un individuo no afectado por un trastorno afectivo. La sobreexpresión puede deberse, por ejemplo, a una mayor cantidad de ARNm de P2X7R producida por velocidades de transcripción aumentadas debido a la mayor actividad de la ARN polimerasa II. Por consiguiente, la cantidad de ARNm puede conducir a un aumento de la traducción y, de esta manera, a un mayor nivel de proteína P2X7R. También es posible que una mayor cantidad de proteína P2X7R se deba a una mayor estabilidad de la proteína. Una infraexpresión de proteína P2X7R puede deberse a bajas velocidades de transcripción del gen P2X7R y, de esta manera, cantidades insuficientes de ARNm de P2X7R sólo producen una baja cantidad de proteína P2X7R. Otra razón puede ser que la proteína P2X7R sea inestable y, de esta manera, no esté presente en cantidades comparables al nivel de proteína de tipo silvestre.
La infra- o sobreexpresión de proteína P2X7R puede determinarse por métodos bien conocidos para la persona especialista en la técnica. Éstos incluyen, pero sin limitación, métodos para determinar la cantidad de ARNm o la cantidad y/o actividad de la proteína. Son ejemplos análisis de Transferencia de Northern o técnicas de base inmune, tales como Transferencia de Western.
"No funcional" significa que la proteína P2X7R ha perdido al menos una propiedad funcional que presenta la proteína P2X7R de tipo silvestre como se ha descrito en este documento anteriormente. Preferiblemente, "no funcional" significa que la proteína P2X7R ya no funciona como canal. La no funcionalidad puede deberse, por ejemplo, al hecho de que un alelo que aparece en un individuo codifique una proteína P2X7R que conduce a dímeros no funcionales (mutación dominante negativa). Si una proteína P2X7R en un individuo es funcional o no funcional puede determinarse por los métodos descritos en este documento anteriormente y en los ejemplos.
La expresión "apertura por ATP alterada" significa que la proteína P2X7R respectiva reacciona al ATP de una forma diferente que la proteína P2X7R de tipo silvestre. Esto puede determinarse como se describe en los ejemplos adjuntos o como se ha descrito anteriormente en este documento.
En el contexto del diagnóstico, no sólo podría tener valor diagnóstico la actividad de la P2X7R, sino también la cantidad de expresión. Por ejemplo, si un polimorfismo afecta a la estabilidad del ARN o a la eficacia de traducción, esto podría conducir a una menor expresión de la proteína P2X7 no sólo en el hipocampo, sino también en la sangre. Por lo tanto, se podría especular que una menor cantidad de P2X7 detectada por transferencia de western en células sanguíneas podría estar relacionada con una depresión.
Otro aspecto de la presente invención es un método para diagnosticar un trastorno afectivo o una susceptibilidad a un trastorno afectivo que comprende la etapa de determinar en una muestra obtenida a partir de un individuo si la secuencia del gen P2X7R o la proteína codificada del mismo comprende una mutación como se define en este documento en comparación con la secuencia P2X7R de tipo silvestre.
Una realización preferida de la presente invención es un método, donde una mutación es una mutación en la secuencia de P2X7R como se ha definido anteriormente en este documento y/o un reemplazo o deleción de nucleótidos seleccionados de la siguiente Tabla C que indica en la columna "Región de P2X7R" la región de la secuencia de nucleótidos genómica de P2X7R en la que se produce el reemplazo o deleción, en la columna "Nucleótido" de la Tabla C el nucleótido que se reemplaza por otro nucleótido o los nucleótidos que se delecionan y en la columna "Posición en tipo silvestre" de la Tabla C la posición correspondiente en la secuencia de nucleótidos del canal iónico de apertura por ATP de tipo silvestre P2X7R como se representa en la SEC ID Nº: 1.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA C
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Como se ha indicado anteriormente, si el nucleótido respectivo que se reemplaza por otro nucleótido es una base de purina, se prefiere que se reemplace por otra base de purina. Si es una base de pirimidina, se prefiere que se reemplace por otra base de pirimidina. También se prefiere que una base de purina se reemplace por una base de pirimidina y que una base de pirimidina se reemplace por una base de purina. Lo más preferido es que los nucleótidos indicados en la Tabla C se reemplacen por los nucleótidos indicados en la posición respectiva de la Tabla 12 presentada más adelante (véase el Ejemplo 3).
En una realización preferida, la presente invención se refiere a una composición de diagnóstico diseñada para uso en un método en el que se determina la aparición de la mutación en el gen del canal iónico de apertura por ATP P2X7R por PCR, métodos inmunológicos y/o métodos electrofisiológicos como se describe más adelante en este documento y en los ejemplos adjuntos. Además, es posible determinar la aparición de una mutación en el canal iónico de apertura por ATP P2X7R como se ha descrito anteriormente en este documento.
También se prevé que la presente invención se refiere a métodos in vitro para diagnosticar un trastorno afectivo de un individuo, que comprende:
(a) aislar ADN a partir de células obtenidas de un individuo;
(b) determinar todo o parte de la composición de nucleótidos del gen P2X7R; y
(c) analizar dicha composición de nucleótidos de P2X7R con respecto a la presencia de uno o más polimorfismos, mutaciones o variaciones alélicas como se definen en este documento.
El término "gen" significa una secuencia de nucleótidos asociada con la producción de una proteína, incluyendo secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, secuencias de intrones, secuencias de exones, regiones codificantes, región 5' no traducida (5'UTR), región 3' no traducida (3'UTR) y variantes de corte y empalme.
En una realización preferida del método descrito, el individuo es un mamífero y más preferiblemente un ser humano. Además, las células preferiblemente proceden de piel, sangre, orina o líquido cefalorraquídeo.
El método de la presente invención permite el diagnóstico de un trastorno afectivo de acuerdo con la composición de un marcador genético que corresponde al gen P2X7R. Como se demuestra por los ejemplos adjuntos, los polimorfismos en la proteína P2X7R están asociados genéticamente con pacientes que padecen un trastorno afectivo.
De acuerdo con esta realización de la presente invención, el diagnóstico de un trastorno afectivo puede realizarse, por ejemplo, aislando células de un individuo y aislando el ADN genómico de dichas células. Estas células pueden recogerse a partir de fluidos corporales, piel, cabello, biopsias y otras fuentes. La colección y el análisis de las células de fluidos corporales tales como sangre, orina y líquido cefalorraquídeo es bien conocido en la técnica; véase, por ejemplo, Rodak, "Haematology: Clinical Principles & Applications" segunda ed., WB Saunders Co, 2002; Brunzel, "Fundamentals of Urine and Body Fluids Analysis", WB Saunders Co, 1994; Hemdon y Brumback (Ed.), "Cerebrospinal Fluid", Kluwer Academic Pub., 1989. Además, en la técnica están bien descritos métodos para el aislamiento de ADN; véase, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.
Una vez aislado el ADN, pueden diseñarse diversos cebadores oligonucleotídicos que abarquen el locus de P2X7R para amplificar el material genético por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En libros de texto convencionales, pueden encontrarse métodos convencionales para diseñar, sintetizar y producir dichos cebadores oligonucleotídicos y realizar la amplificación por PCR, véase, por ejemplo, Aqrawal (Ed.), "Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties (Methods in Molecular Biology, 20)", Humana Press, 1993; Innis et al. (Ed.), "PCR Applications: Protocols for Functional Genomics", Academic Press, 1999; Chen and Janes (Ed.), "PCR Cloning Protocols: From Molecular Cloning to Genetic", 2ª edición, Humana Press, 2002. También se proporcionan cebadores para la detección de polimorfismos de P2X7R en, pero sin limitación, la SEC ID Nº: 52 a la SEC ID Nº: 111. Una vez amplificado el ADN, la estructura de nucleótidos puede analizarse por métodos de secuenciación y compararse con el ADN de P2X7R normal. La secuenciación puede realizarse manualmente por cualquier biólogo molecular de experiencia habitual o por un aparato de secuenciación automático. Estos procedimientos son comunes en la técnica, véase, por ejemplo Adams et al. (Ed.), "Automated DNA Sequencing and Analysis", Academic Press, 1994; Alphey. "DNA Sequencing: From Experimental Methods to Bioinformatics", Springer Verlag Publishing, 1997.
La detección y análisis de polimorfismos en P2X7R también puede realizarse usando un sistema de mutación refractario a la amplificación (ARMSTM), extensión lineal de un sistema de mutación refractario a la amplificación (ALEXTM), polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP), análisis de heterodúplex, PCR-SSCP, SSCP fluorescente en un secuenciador de ADN automático, electroforesis en gel en gradiente de desnaturalización, ensayos de protección de ARNasa, detección de mutaciones por hibridación de oligonucleótidos con especificidad de secuencia, métodos de escisión química, métodos de escisión enzimática de desacoplamiento, métodos de longitud de fragmentos de escisión, hibridación de oligonucleótidos con especificidad de alelo en chips de ADN y otros de estos métodos conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Nollau et al, Clin. Chem. 43 (1997), 1114-1128; Burczak y Mardis (Ed.), "Polymorphism Detection & Analysis Techniques", Eaton Pub Co, 2000; Cotton et al. (Ed.), "Mutation Detection: A Practical Approach", Irl Press, 1998; Taylor (Ed.), "Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphisms in DNA", CRC Press, 1997.
La presente invención también se refiere a un método para diagnosticas un trastorno afectivo en un individuo, que comprende:
(a) aislar ARN a partir de células obtenidas de un individuo;
(b) convertir el ARN en ADNc;
(c) determinar todo o parte de la composición de nucleótidos del ADNc obtenido de esta manera; y
(c) analizar dicha composición de nucleótidos con respecto a la presencia de uno o más polimorfismos o variación alélica como se define en este documento.
Con respecto a las realizaciones preferidas, se aplica lo mismo que se ha descrito anteriormente.
La detección y análisis de polimorfismos en el ARN de P2X7R puede realizarse de acuerdo con los métodos descritos anteriormente.
La presente invención también se refiere a un método para diagnosticar un trastorno afectivo en un individuo, que comprende:
(a) aislar ARN o proteínas de células obtenidas a partir de un individuo;
(b) determinar los niveles de ARN o proteína P2X7R;
(c) comparar los niveles de ARN o proteína P2X7R con los niveles correspondientes de un individuo normal que no padece un trastorno afectivo, donde la infraexpresión de dicho ARN o proteína P2X7R indica un trastorno afectivo.
Con respecto a las realizaciones preferidas, se aplica lo mismo que se ha descrito anteriormente.
Como se demuestra por los ejemplos adjuntos, existe una relación entre la expresión o el nivel de proteína de P2X7R y un trastorno afectivo. Estas y otras realizaciones de la presente invención se le ocurrirán fácilmente a los especialistas habituales en la técnica en vista de la descripción de este documento.
También se describe en este documento un polinucleótido que comprende al menos 20 bases del gen P2X7R humano y que comprende una mutación o polimorfismo seleccionado entre cualquiera de los siguientes:
TABLA 1 Nuevos polimorfismos en la proteína P2X7R humana
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El polimorfismo describe la posición y la variación observada. La posición y numeración del polimorfismo corresponde al gen P2X7R humano como se define en la SEC ID Nº: 1. Los cebadores usados para la amplificación y secuenciación por SNP se muestran en la Tabla 1a y se indican en la SEC ID Nº: 52 a SEC ID Nº: 111.
TABLA 1a Secuencias de cebadores para amplificación y secuenciación por SNP
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Otro aspecto de la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico para trastornos afectivos que comprende una sonda oligonucleotídica específica o un cebador que corresponde a polimorfismos de P2X7R como se describe en este documento. El kit de diagnóstico puede comprender el envase y las instrucciones apropiadas para uso en el método de la invención. Dicho kit puede comprender además un tampón apropiado y enzimas tales como la transcriptasa inversa y polimerasas termoestables.
En una realización preferida de la invención, el diagnóstico puede realizarse en un ratón, rata o ser humano. La invención se aplica generalmente in vitro, por ejemplo, usando células u otro material obtenido a partir de un individuo. Sin embargo, también puede aplicarse en un individuo vivo o post mortem.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, el diagnóstico de un trastorno afectivo puede seguirse por la prescripción o administración de un fármaco antidepresivo. La administración y dosificación de fármacos antidepresivos puede variar entre los pacientes y es bien conocida en la técnica médica, véase, por ejemplo, Benkert y Hippius, "Kompendium der Psychiatrischen Pharmakotherapie", Springer Verlag Publishing, 2000; Albers, "Handbook of Psychiatric Drugs: 2001-2002 Edition", Current Clinical Strategies Publishing, 2000. Los ejemplos preferidos incluyen entre 5 mg y 80 mg por día, preferiblemente 20 mg de fluoxetina; entre 5 mg y 50 mg por día, preferiblemente 20 mg de paroxetina; entre 5 mg y 200 mg por día, preferiblemente 50 mg de sertralina; entre 5 mg y 300 mg por día, preferiblemente 100 mg de fluvoxamina; entre 5 mg y 100 mg por día, preferiblemente 30 mg de mirtazapina; entre 4 mg y 50 mg, preferiblemente 8 mg de reboxetina; entre 5 mg y 600 mg por día, preferiblemente 200 mg de nefazodona; entre 450 mg y 1800 mg por día, preferiblemente 900 mg de carbonato de litio.
La proteína P2X7R también es útil para controlar la eficacia y/o dosificación de un fármaco o la probabilidad de que un paciente responda a un fármaco. De esta manera, la presente descripción describe un método para controlar la eficacia y/o dosificación de un fármaco, por ejemplo, un fármaco antidepresivo, y/o la probabilidad de que un paciente responda a dicho fármaco, que comprende determinar el nivel de expresión y/o actividad de la proteína P2X7R en un paciente antes y después de la administración del fármaco respectivo. Como se presenta en los ejemplos mostrados más adelante, el tratamiento con un fármaco antidepresivo produce una regulación positiva en la actividad de P2X7R. En seres humanos, la actividad de P2X7R puede controlarse por Tomografía por Emisión de Positrones (PET) o Tomografía Computerizada por Emisión de un solo Fotón (SPECT) usando un indicador de ligando radiomarcado para P2X7R. Los ejemplos de ligandos de P2X7R pueden ser, pero sin limitación, ATP, un antagonista que se une a P2X7R, un agonista que se une a P2X7R, o un polinucleótido pequeño que comprende al menos 20 bases del gen P2X7R humano. Una modulación de la actividad P2X7R, la distribución en la membrana o los niveles de expresión reflejarían la actividad y potencia del fármaco antidepresivo. Los métodos y técnicas necesarios para el análisis PET son bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Paans y Vaalburq, Curr. Pharmac. Design 6 (2000), 1583-1591; van Waarde. Curr. Pharmac. Design. 6 (2000), 1593-1610; Paans et al, Methods 27 (2002), 195-207; Passchier et al., Methods 27 (2002), 278-286; Laruelle et al., Methods 27 (2002), 287-299.
De acuerdo con la presente invención, por el término "muestra" se entiende cualquier muestra biológica obtenida a partir de un individuo, línea celular, cultivo de tejidos u otra fuente que contenga polinucleótidos o polipéptidos o porciones de los mismos. Cuando se indica, las muestras biológicas incluyen fluidos corporales (tales como sangre, suero, plasma, orina, fluido sinovial y fluido espinal) y fuentes de tejidos que se ha observado que expresan los polinucleótidos de la presente invención. Los métodos para obtener biopsias de tejidos y fluidos corporales a partir de mamíferos son bien conocidos en la técnica. Como fuente se prefiere una muestra biológica que incluye ADN genómico, ARNm o proteínas.
Como se ha descrito en este documento anteriormente, pueden producirse mutaciones del gen que codifica P2X7R que afecten al nivel de ADN o al nivel del ARNm y pueden dar como resultado una expresión alterada de P2X7R o una expresión de canales iónicos de apertura por ATP P2X7R que muestren una función alterada o ausencia de función en comparación con los canales iónicos de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre descritos en este documento. De esta manera, existen varios métodos sobre el nivel de ADN, el nivel de ARN o el nivel de proteína para determinar si el gen del canal iónico de apertura por ATP P2X7R muestra una mutación como se ha descrito anteriormente en este documento. Por consiguiente, el ARNm, ADNc, AND y AND genómico son las moléculas de ácido nucleico preferidas a usar en los métodos mencionados más adelante. Además, se prefieren polipéptidos o fragmentos de los mismos si se va a determinar una mutación en la proteína del canal iónico de apertura por ATP P2X7R como se ha descrito en este documento.
Preferiblemente, una mutación puntual que conduce al reemplazo de un resto aminoacídico en las posiciones indicadas en la Tabla 1 de la secuencia de aminoácidos P2X7R de tipo silvestre correspondiente representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4 por otro aminoácido puede determinarse por PCR. Dicha PCR se continúa por un análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) si, debido a la mutación puntual, se genera un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción que no está presente en la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre o se crea un sitio de reconocimiento para una enzima de restricción que no aparece en la proteína P2X7R de tipo silvestre. Más preferiblemente, dicha mutación puede determinarse por PCR usando cebadores y condiciones que permitan sólo una amplificación de la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre que codifica el aminoácido de tipo silvestre correspondiente en la posición respectiva, pero no de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico que codifica un resto aminoacídico diferente en la posición correspondiente. Es incluso más preferido que la PCR se realice para determinar una mutación usando cebadores y condiciones que no permiten la amplificación si está presente la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre, pero sólo si se codifica otro resto aminoacídico en la posición respectiva. Se prefiere particularmente un método que usa PCR y cebadores en condiciones que permiten la amplificación de un fragmento que comprende al menos los restos nucleotídicos que codifican el resto aminoacídico correspondiente a las posiciones de la SEC ID Nº: 1.
Dicha PCR se continúa, por ejemplo, por secuenciación y/o análisis de conformación de una sola cadena (SSCA). Dicho fragmento preferiblemente tiene una longitud de al menos 25 nucleótidos, más preferiblemente de al menos 50 nucleótidos, e incluso más preferiblemente de al menos 75 nucleótidos, de una forma particularmente preferida de al menos 100 nucleótidos, de una manera más particularmente preferida de al menos 200 nucleótidos, de una manera también más particularmente preferida de al menos 250 nucleótidos e incluso de una manera más particularmente preferida de al menos 300 nucleótidos, siendo lo más preferido particularmente una longitud de al menos 600 nucleótidos. Dichos cebadores preferiblemente tiene una longitud de al menos 12 nucleótidos, más preferiblemente de al menos 15 nucleótidos, incluso más preferiblemente de al menos 18 nucleótidos y aún más preferiblemente de al menos 21 nucleótidos como se representa en las SEC ID Nº: 52 a 111. La temperatura para hibridar dichos cebadores preferiblemente es de al menos 50ºC, más preferiblemente de al menos 55ºC y aún más preferiblemente de al menos 58ºC. La temperatura para la desnaturalización preferiblemente es de al menos 95ºC durante preferiblemente al menos 10 segundos, más preferiblemente al menos 20 segundos, incluso más preferiblemente al menos 30 segundos y aún más preferiblemente al menos 60 segundos. Sin embargo, dependiendo de la longitud y el contenido de G-C de la secuencia de ácido nucleico a amplificar, la temperatura para la desnaturalización puede ser más corta o más larga. La temperatura para la extensión de los cebadores hibridados preferiblemente es de al menos 10 segundos, más preferiblemente de al menos 20 segundos, incluso más preferiblemente de al menos 30 segundos y aún más preferiblemente de al menos 60 segundos. En los ejemplos presentados más adelante se ejemplifica una reacción de PCR que comprende las condiciones mencionadas anteriormente. La posterior secuenciación y/o SSCA se realiza como se conoce en la técnica. Preferiblemente, los fragmentos de PCR se separan en un gel de poliacrilamida al 10% a 4ºC, pero también se prefiere la temperatura ambiente. Los fragmentos de PCR que muestran un desplazamiento de banda SSCA se amplifican con los cebadores en las condiciones mencionadas anteriormente y posteriormente se secuencian. Como alternativa, también es posible secuenciar directamente el ADN genómico para determinar si se ha producido una mutación en el gen CLCN2. En Horecka, Yeast 16 (2000), 967-970 se demuestra una estrategia de secuenciación genómica directa, por ejemplo, para la levadura de panadería.
Preferiblemente, una deleción se determina usando técnicas de hibridación conocidas en la técnica. En particular, se diseña un cebador como se ha mencionado en este documento anteriormente que sea capaz de hibridar únicamente con el ADN genómico de tipo silvestre como se representa en la SEC ID Nº: 1 pero no con una secuencia de nucleótidos que comprende una deleción de un fragmento entre los nucleótidos 54562 y 54582 de la SEC ID Nº: 1. También se prefiere el método de hibridación fluorescente in situ (FISH) para determinar en cromosomas enteros, en particular en el cromosoma 12q23-q24, que dicho cromosoma tiene la deleción mencionada anteriormente. Es incluso más preferido que una deleción de restos nucleotídicos como se ha descrito en este documento pueda determinarse usando PCR, donde un cebador de un par de cebadores se localiza dentro de la región de ADN genómico que comprende dicha deleción. Preferiblemente, dicha deleción está entre las posiciones de nucleótidos 54562 y 54582 como se representa en la SEC ID Nº: 1. De esta manera, en las condiciones apropiadas no se obtendrá ningún fragmento de PCR si el ADN genómico comprende dicha deleción. Se prefiere particularmente realizar una PCR que use cebadores que están localizados cadena arriba o cadena abajo de la deleción para determinar dicha deleción. En condiciones apropiadas como se ha mencionado anteriormente en este documento, se amplificará tanto un fragmento de ADN genómico de la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre indicada en la SEC ID Nº: 1 como un fragmento de la secuencia de nucleótidos que comprende una deleción preferiblemente de los nucleótidos entre las posiciones 54562 y 54582 representadas en la SEC ID Nº: 1.
También es posible determinar las mutaciones de P2X7R descritas anteriormente sobre el nivel de proteína. Algunas de las mutaciones descritas anteriormente conducen a versiones acortadas de la proteína P2X7R. De esta manera, es concebible determinar la aparición de estas mutaciones determinando la longitud o peso molecular de la proteína P2X7R expresada en un individuo, por ejemplo, por SDS PAGE.
También es posible determinar las mutaciones del canal de apertura por ATP P2X7R como se describe en este documento usando los anticuerpos de la presente invención. Dichos anticuerpos específicos por dichas mutaciones de proteínas P2X7R se determinarán por técnicas de ensayo tales como radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, análisis de transferencia de Western y ensayo ELISA. También se prefieren métodos inmunohistológicos
clásicos.
El descubrimiento, descrito en la presente invención, de que ciertas mutaciones en el gen que codifica P2X7R y/o la proteína correspondiente están relacionados con un trastorno afectivo indica que la ausencia de función o la disfunción de la proteína P2X7R es responsable de diversas formas de trastornos afectivos. De esta manera, el descubrimiento de estas mutaciones no sólo permite el diagnóstico de trastornos afectivos determinando si las mutaciones descritas anteriormente se producen en un individuo. También permite desarrollar un tratamiento de trastornos afectivos que se han diagnosticado como el resultado de una mutación en el gen codificante de P2X7R. Dicho tratamiento puede comprender, por ejemplo, la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína P2X7R no funcional o funcional de tipo silvestre restaurando de esta manera en dicho individuo la actividad P2X7R o la activación o represión de (un) gen(es) P2X7R in vivo. La expresión "activación o represión" en este contexto significa que la expresión del gen está potenciada (activación) o reducida (represión). Un aumento de la expresión puede conseguirse, por ejemplo, aumentando la eficacia del inicio de la transcripción, por ejemplo, usando compuestos adecuados que tienen un efecto activador sobre la transcripción. Como alternativa, puede conseguirse una potenciación reemplazando el promotor natural por un promotor más eficaz.
Una represión puede conseguirse suprimiendo la expresión del gen, por ejemplo, suprimiendo específicamente la transcripción del promotor respectivo por compuestos adecuados o haciendo que el promotor sea menos eficaz o no funcional.
En una realización más preferida, los métodos o usos descritos en este documento se prevén para tratar trastornos afectivos seleccionados del grupo compuesto por depresión mayor, trastorno de ansiedad generalizada o trastorno bipolar.
En una realización particularmente preferida, dicha depresión mayor se selecciona entre el grupo compuesto por depresión mayor, distimia, depresión atípica, trastorno disfórico premenstrual y trastorno afectivo estacional.
En otra realización particularmente preferida, dicho trastorno de ansiedad generalizada se selecciona entre el grupo compuesto por trastorno de pánico, fobias, agorafobia, fobia social, fobia específica, trastorno obsesivo compulsivo, trastorno de estrés postraumático, trastorno de ansiedad de separación, manía, hipomanía y trastorno ciclotímico.
Otra realización particularmente preferida es que dicho trastorno bipolar es el trastorno bipolar de tipo I o el trastorno bipolar de tipo II.
Además, la presente invención se refiere a un kit que comprende la molécula de ácido nucleico, el vector, el hospedador, el polipéptido, el anticuerpo o el aptámero, el cebador o un par de cebadores de la invención o la molécula identificada o caracterizada en un método como se describe más adelante en la presente invención.
Ventajosamente, el kit de la presente invención comprende además, opcionalmente (un) tampón (tampones) de reacción, soluciones de almacenamiento y/o los demás reactivos o materiales necesarios para realizar ensayos científicos o de diagnóstico o similares. Además, partes del kit de la invención pueden envasarse individualmente en viales o frascos o en combinación en recipientes o unidades de múltiples recipientes.
El kit de la presente invención puede usarse ventajosamente, entre otras cosas, para realizar el método para producir un polipéptido de la invención, el método o métodos de identificación y/o caracterización de moléculas que interaccionan específicamente con canales iónicos de apertura por ATP P2X7R como se describe en este documento más adelante, y podría emplearse en una diversidad de aplicaciones mencionadas en este documento, por ejemplo, como kits de diagnóstico, como herramientas de investigación o herramientas terapéuticas. Además, el kit de la invención puede contener medios para detección adecuados para fines científicos, médicos y/o de diagnóstico. La fabricación de los kits preferiblemente sigue procedimientos convencionales que son conocidos para la persona especialista en la técnica.
Las figuras indican:
Figura 1a. Mapa genómico de la región del cromosoma 12 humano asociada con el trastorno afectivo bipolar. Se representan los genes encontrados entre los marcadores NBG11 y NBG2.
Figura 1b. Ilustración gráfica del análisis multipuntual usando ASPEX en pares de hermanos independientes.
Figura 1c. Gráfico que ilustra el análisis multipuntual usando ASPEX en todos los pares de hermanos.
Figura 1d. Gráfico que ilustra el programa ASPEX sib_phase considerando solo pares de hermanos independientes.
Figura 1e. Gráfico que ilustra el programa ASPEX sib_phase considerando todos los pares de hermanos.
Figura 1f. Efecto del polimorfismo P2XR7v13A sobre niveles basales de cortisol antes y después de la administración de dexametasona (ensayo DST). Los individuos se sometieron al ensayo en los diez días siguientes a la admisión. Los individuos con los genotipos AG y GG tienen niveles de cortisol significativamente menores antes y después de la administración de dexametasona.
Figura 1g. Efecto del polimorfismo P2XR7v13A sobre la respuesta de cortisol durante el ensayo Dex/CRH. Los individuos se sometieron al ensayo en los diez días posteriores a la admisión (es decir, en el periodo de admisión) y por último diez días después del alta (es decir, en el periodo de alta). Los individuos con el genotipo GG tienen menores niveles de cortisol en respuesta al ensayo Dex/CRH en el periodo de admisión y en el periodo de alta. Estos resultados indican un eje HPA normal.
Figura 1h. Efecto del polimorfismo de P2XR7v13A sobre la respuesta de ACTH durante el ensayo Dex/CRH. Los individuos se sometieron al ensayo en los diez días posteriores a la admisión (es decir, en el periodo de admisión) y por último diez días después del alta (es decir, en el periodo de alta). Los individuos con el genotipo GG tienen menores niveles de ACTH en respuesta al ensayo Dex/CRH, en el periodo de admisión y en el periodo de alta. Estos resultados indican un eje HPA anormal.
Figura 1i. Duración del tratamiento antidepresivo hasta la remisión. La depresión se diagnostica de acuerdo con la Escala de Evaluación de Depresión de Hamilton (HAM-D; Hamilton, Br. J. Soc. Clin. Psychol. 6 (1967) 278-296). Una puntuación HAM-D de 10 o menor se considera remisión de los síntomas depresivos.
Figura 1j. Efecto del polimorfismo de P2XR7v13C sobre los niveles basales de cortisol antes y después de la administración de dexametasona (ensayo DST). Los individuos se sometieron al ensayo en los diez días posteriores a la admisión. Los individuos con los genotipos CC tienen niveles de cortisol elevados después de la administración de dexametasona.
Figura 1k. Efecto del polimorfismo P2XR7v13C sobre la respuesta de cortisol durante el ensayo Dex/CRH. Los individuos se sometieron al ensayo en los diez días posteriores a la admisión (es decir, en el periodo de admisión) y por último diez días después del alta (es decir, en el periodo de alta). Los individuos con el genotipo AC o CC tienen niveles de cortisol elevados en respuesta el ensayo Dex/CRH en el periodo de admisión, indicando un eje HPA anormal.
Figura 1l. Efecto del polimorfismo de P2XR7v13C sobre la respuesta de ACTH durante el ensayo Dex/CRH. Los individuos se sometieron al ensayo en los diez días posteriores a la admisión (es decir, en el periodo de admisión) y por último diez días después del alta (es decir, en el periodo de alta). Los individuos con el genotipo CC tienen menores niveles de ACTH en respuesta al ensayo Dex/CRH, en el periodo de admisión y en el periodo de alta. Estos resultados indican un eje HPA anormal.
Figura 2. Análisis RT-PCR de la secuencia codificante completa de P2X7R en diferentes tejidos.
Figura 3. Expresión de P2X7R en el bulbo olfativo, hipotálamo y células ependimales en el cerebro de un ratón sin estrés. 100 aumentos.
Figura 4. Expresión de P2X7R en el hipocampo/giro dentado y órgano subcomisural en el cerebro de un ratón sin estrés. 100 aumentos.
Figura 5. Comportamiento de flotación en el ensayo de natación forzada. El comportamiento de afrontamiento pasivo de estrés se redujo después de un tratamiento a largo plazo con el antidepresivo paroxetina (Par28: tratado con paroxetina durante 28 días, per os). Basal n = 8; vehículo n = 8; Par28 n = 8.
Figura 6. Análisis comparativo de expresión de P2X7R en el bulbo olfativo de ratones sin estrés tratados con vehículo y tratados con antidepresivo. 100 aumentos.
Figura 7. Análisis comparativo de expresión de P2X7R en el hipotálamo de ratones sin estrés, tratados con vehículo y tratados con antidepresivo. 100 aumentos.
Figura 8. Análisis comparativo de expresión de P2X7R en células ependimales de ratones sin estrés tratados con vehículo y tratados con antidepresivo. 100 aumentos.
Figura 9. Análisis comparativo de expresión de P2X7R en el hipocampo de ratones sin estrés tratados con vehículo y tratados con antidepresivo. 25 aumentos.
Figura 10. Expresión de P2X7R en el hipocampo de un ratón tratado con vehículo. 25 aumentos.
Figura 11. Expresión de P2X7R en el hipocampo de un ratón tratado con el antidepresivo paroxetina. 25 aumentos.
Figura 12. Expresión detallada de P2X7R en el giro dentado de un ratón tratado con el antidepresivo paroxetina. 400 aumentos.
Figura 13. Análisis comparativo de expresión de P2X7R y células apoptóticas en el hipocampo de un ratón tratado con el antidepresivo paroxetina. 100 aumentos.
Figura 14. Comportamiento de flotación en el ensayo de natación forzada. El comportamiento de afrontamiento pasivo de estrés aumentó después de la inyección intrahipocampal aguda (bilateral, giro dentado) de ARNsi dirigido a P2X7R. Vehículo n = 7; ARN de control n = 10; ARNsi de P2X7R n = 9.
Figura 15. Análisis comparativo de expresión de P2X7R en el hipocampo de ratones tratados con vehículo, ARN de control y de ARNsi dirigido a P2X7R. 100 aumentos fila superior, 25 aumentos fila inferior.
Figura 16a, b, c, d, e. Tres variantes de corte y empalme producidas por polimorfismos en los intrones de P2X7R.
Figura 17. Expresión de P2X7R en líneas de células de hipocampo inmortalizadas.
Figura 18. Aumento de la entrada de calcio en células de hipocampo tratadas con un compuesto agonista de P2X7R (BzATP).
Figura 19a, b. Entrada de colorante bromuro de etidio en células del hipocampo (a) tratadas con compuesto agonista de P2X7R (BzATP) o (b) pretratadas con un compuesto antagonista de P2X7R.
Figura 19c. Acción agonista de BzATP y tenidap sobre la actividad de P2X7R. Se midió la actividad del canal de calcio de P2X7R humano en condiciones basales durante 4 segundos a 10 segundos. A. Control negativo que consistía en células cargadas con Fluo-4-AM 10 \muM sin tratamiento adicional. B. Células tratadas con BzATP 20 \muM después de cuatro segundos de medición basal. C. Células tratadas con tenidap 50 \muM después de cuatro segundos de medición basal.
Figura 20. Efecto de inyección intrahipocampal de un compuesto agonista de P2X7R (BzATP) sobre el comportamiento en el ensayo de natación forzada.
Figura 21. Ensayo de campo abierto que mide la actividad locomotora de ratones tratados con un compuesto agonista de P2X7R (BzATP).
Figura 22. Análisis comparativo de células apoptóticas en el hipocampo de un ratón tratado con solución de vehículo de control o compuesto agonista de P2X7R (BzATP).
Figura 23. Efecto de inyección intrahipocampal del antagonista de P2X7R KN-62 y oATP sobre el comportamiento durante el ensayo de natación forzada.
Figura 24. Ensayo de campo abierto que mide la actividad locomotora de ratones tratados con el antagonista de P2X7R KN-62 y oATP.
Puede obtenerse una mejor comprensión de la presente invención y de sus muchas ventajas a partir de los siguientes ejemplos, ofrecidos sólo con fines ilustrativos y que no pretenden limitar el alcance de la presente invención de forma alguna.
Ejemplo 1 Análisis de asociación de Trastorno Afectivo Bipolar en una población humana homogénea
En el análisis de asociación se usaron 41 familias de diferentes tamaños que contenían un total de 485 individuos muestreados de la región de Saguenay/Lac St-Jean. Los individuos se distribuyeron de acuerdo con su diagnóstico como se indica a continuación: 105 individuos afectados con Trastorno Bipolar de tipo I (BPI) o trastorno bipolar de tipo esquizoafectivo; 42 individuos con Trastorno Bipolar de tipo II (BPII) diagnosticado; 54 individuos con depresión mayor recurrente; y 57 individuos con depresión mayor de un solo episodio. Los 227 individuos restantes no estaban afectados y eran normales. Para el cálculo, se usó la siguiente clasificación: los individuos a los que se les había diagnosticado BPI, trastorno esquizoafectivo, tipo bipolar, BPII y depresión mayor recurrente se consideraron afectados (n = 201); los individuos con un solo episodio de depresión mayor se clasificaron como fenotipo desconocido (n = 57); y todos los demás diagnósticos como no afectados (n = 227).
Se recogieron muestras de sangre de cada individuo en tubos Vacutainer K3 EDTA de 10 ml (Becton-Dickinson) y se aisló ADN genómico por el kit de aislamiento de ADN Puregene (Gentra Systems). Se vertió sangre en un tubo cónico de 50 ml y se diluyó con cuatro volúmenes de Solución de Lisis de Glóbulos Rojos. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, el tubo se centrifugó durante 10 minutos a 2.000 g y el sobrenadante se retiró dejando el sedimento celular y 200-400 \mul del líquido residual. Las células se resuspendieron sometiendo el tubo a agitación vorticial y se añadieron 9 ml de Solución de Lisis de Células moviendo la pipeta verticalmente. Se añadieron 40 \mul de Solución de RNAsa A (20 mg/ml) y la muestra se mezcló invirtiendo el tubo varias veces. La muestra se incubó a 37ºC durante 15 minutos y se enfrió a temperatura ambiente. Se añadieron 3 ml de Solución de Precipitación de Proteínas al lisado celular. El tubo se sometió a agitación vorticial vigorosamente durante 30 segundos y se centrifugó a 2.000 g durante 10 minutos. El sobrenadante se vertió en un nuevo tubo que contenía 9 ml de isopropanol al 100%. La muestra se mezcló por inversión suave varias veces. El tubo se centrifugó a 2.000 g durante 5 minutos. El sedimento blanco de ADN se lavó con 10 ml de etanol al 70% y el tubo se centrifugó a 2.000 g durante 3 minutos. Se retiró el etanol por vertido y se dejó que el sedimento se secara parcialmente al aire. El ADN se solubilizó en 500 \mul de Solución de Hidratación de ADN. La concentración final se ajustó a 300-400 \mug/ml.
Para la genotipificación de marcadores microsatélites se usó un método basado en fluorescencia. En resumen, la región que incluía cada secuencia repetida se amplificó por PCR usando un cebador no marcado y un cebador marcado con fluorescente (Applied biosystems inc, CA, USA). Los colorantes asociados con el marcador y la longitud del producto de PCR correspondiente se indican en la tabla 2. La reacción de PCR se realizó usando 10 ng de muestra de ADN, 0,2 unidades de ADN polimerasa Taq platinum (Invitrogene, CA, USA), Tris-Cl 20 mM (pH 8,4), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, una concentración 100 \muM de dNTP y una concentración 1,5 \muM de cada cebador en un volumen final de 7 \mul. Las muestras se incubaron a 95ºC durante 3 minutos para activar la Taq platinum ADN polimerasa, y después se realizaron 10 ciclos de amplificación por PCR como se indica a continuación: 95ºC durante 15 segundos; 58ºC durante 15 segundos; 72ºC durante 30 segundos; después de esto se realizaron 15 ciclos como se indica a continuación: 89ºC durante 15 segundos; 58ºC durante 15 segundos; y 72ºC durante 10 segundos. Finalmente, las muestras se incubaron a 72ºC durante 30 minutos. Después de la amplificación por PCR, las muestras se reunieron de acuerdo con su cebador marcado con colorante y su longitud de producto de PCR (conjunto de cuatro muestras). La muestra reunida se separó en un analizador de ADN ABI 3100 (Applied Biosystems inc, CA, USA). Los datos resultantes se analizaron usando Genemapper2 (Applied Biosystems inc, CA, USA), y se recopilaron en una base de datos 4D (ACIUS) diseñada en un entorno Macintosh como se ha descrito previamente (Morissette et al., Am. J. Med. Genet. (Neuropsychiatr. Genet.) 88 (1999), 567-587).
En la tabla 2 se muestran marcadores usados en el siguiente análisis de asociación. La fracción de recombinación (q) entre sucesivos marcadores se calculó de acuerdo con las familias analizadas.
TABLA 2 Marcadores genómicos usados para el análisis de asociación
14
- Se usó la función del mapa de Haldane para la distancia acumulativa en cMorgans.
Para el análisis paramétrico bipuntual, se usó el análisis de puntuación MOD donde se maximizó la puntuación LOD paramétrica sobre modelos genéticos.
Los siguientes resultados se obtuvieron bajo un análisis de puntuación MOD para modelos recesivos.
TABLA 3 Análisis de puntuación MOD para modelos recesivos
16
Se realizaron estudios de puntuación LOD sin modelo usando ANALYZE, sib_phase del paquete ASPEX V1.85 (David Hinds y Neil Risch 1999; ftp://lahmed.stanford.edu/pub/aspex, véase también http://watson.hgen.pitt.edu./docs/ usage.html) y SIMWALK2 (Sobel y Lange, Am J Hum Genet 58 (1996), 1323-1337) para analizar los alelos compartidos entre pares de hermanos afectados. El programa ANALYZE pondera las familias de acuerdo con su tamaño. El programa ASPEX sib_phase usa frecuencias de alelos para reconstruir la información que falta y se adapta para series de datos en las que faltan los padres, pero pueden usarse niños tipificados adicionales para reconstruir e indicar la fase de los padres. SimWalk2 es una aplicación informática de genética estadística para el haplotipo, asociación paramétrica, asociación no paramétrica (NPL), identidad por descendencia (IBD) y análisis de tipificación errónea en cualquier tamaño de genealogía. SimWalk2 usa la cadena de Markov Monte Carlo (MCMC) y simuló algoritmos de hibridación para realizar estos análisis multipuntuales.
ASPEX sib-phase se usó con dos estrategias computacionales: En primer lugar, usando pares de hermanos estrictamente independientes; y en segundo lugar usando todas las combinaciones de pares de hermanos afectados. Se realizó ASPEX para cálculos bipuntuales y multipuntuales.
Los resultados bi-puntuales observados con ANALYZE y ASPEX se muestran en la Tabla 4.
TABLA 4 Resultados bipuntuales observados con ANALYSE y ASPEX
17
SIMWALK2 calculó cuatro parámetros estadísticos diferentes basándose en árboles de descendencia. Estos parámetros estadísticos miden el grado de agrupamiento entre los alelos marcadores que descienden de los fundadores.
El parámetro estadístico A es el número de diferentes alelos fundadores que aportan alelos al individuo afectado y es el más potente para detectar la asociación a un rasgo recesivo. El parámetro estadístico B es el número máximo de alelos entre los descendientes afectados de cualquiera de los alelos fundadores y es el más potente para detectar la asociación con un rasgo dominante. El parámetro estadístico C es la "entropía" de los alelos marcadores entre los individuos afectados. El parámetro estadístico D es el grado de alelos compartidos entre todos los pares afectados medido por su coeficiente de parentesco IBD. Los parámetros estadísticos C y D son parámetros estadísticos más generales que indican si algunos alelos fundadores están demasiado representados entre los afectados.
La tabla 5 muestra los resultados observados por SIMWALK2. Los autores indican que los valores p deben ser generalmente conservativos. Se expresan como -Log(valores de p). Para la correspondencia, -Log(0,05) = 1,30, -Log(0,01) = 2, -Log(0,001) = 3 etc.
TABLA 5 Análisis SIMWALK2
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Resultado multipuntual observado con ASPEX cuando solo se usaron pares de hermanos independientes (Figura 1b). El valor máximo de la puntuación LOD se observó a NBG11.
Resultado multipuntual observado con ASPEX cuando se consideraron todos los pares de hermanos (Figura 1c). El valor máximo de puntuación LOD se observó a NBG11, pero apareció un segundo pico a NBG4 y NBG3.
Los valores de puntuación LOD bipuntuales y multipuntuales calculados por ASPEX fueron similares. El segundo pico, observado cuando se usan todos los pares de hermanos, pueden explicarse por la presencia de un individuo afectado recombinante, con muchos hermanos afectados, que comparten la región cromosómica telomérica a NBG12. Este tipo de individuos tiene un gran impacto sobre los valores de puntuación LOD cuando se usan todos los pares de hermanos en lugar de un par de hermanos. Esta situación se observó en dos familias.
Posteriormente se realizaron análisis de estratos. Aunque HOMOG no detectó pruebas de heterogeneidad, se construyó un ensayo de homogeneidad basándose en los alelos compartidos encontrados en regiones cromosómicas seleccionadas. Para este análisis sólo se usaron 20 de las 41 familias, ya que las otras no se genotipificaron en todas estas regiones. Para cada marcador dentro de las regiones seleccionadas, la proporción de alelos compartidos IBD por pares de hermanos afectados se estimó con ASPEX (sib_phase). Para cada región retenida, la proporción de alelos compartidos se usó como variable para un Análisis de Componentes Principales y el primer componente principal como un índice de asociación. Se realizó un análisis de correlación sobre estos índices para detectar heterogeneidad (correlación < 0) o epistasis (correlación > 0). Se usó un algoritmo de Fisher para clasificar dos grupos de familias como asociadas o no asociadas a un locus particular. Se observó una correlación negativa entre la región del cromosoma 12 y el área del cromosoma 15 (r = -0,51; p = 0,023). Un análisis de agrupamientos sugirió que 11 familias de 20 estaban asociadas al cromosoma 12. Esta submuestra se denominó estrato.
Este estrato incluía 11 familias (266 individuos muestreados) que incluyen 52 casos de BPI o trastorno esquizoafectivo tipo bipolar, 20 casos de BPII y 28 casos de depresión mayor recurrente.
En modelos recesivos se obtuvieron los siguientes valores de puntuación MOD ilustrados en la Tabla 6.
TABLA 6 Puntuaciones MOD en modelos recesivos
19
En la Tabla 7 se muestran los resultados de puntuaciones LOD sin modelo obtenidas con ANALYZE y ASPEX aplicados a los estratos.
TABLA 7 Puntuación LOD sin modelo obtenida con ANALYZE y ASPEX
21
En la Tabla 8 se ilustran resultados sin modelo observados con SIMWALK2.
TABLA 8 Puntuación LOD sin modelo obtenida con SIMWALK2
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En las Figuras 1d y 1e se muestran los resultados multipuntuales en los estratos con ASPEX sib_phase considerando sólo pares de hermanos independientes (Figura 1b) o todos los pares de hermanos (Figura 1c). Como se ha indicado previamente, apareció un segundo pico cuando se observaron todos los pares de hermanos.
Se calculó un intervalo de confianza. Se usó GENEFINDER (Liang et al., Am. J. Hum. Genet. 66 (2000), 1631-1641) para estimar la localización del gen de susceptibilidad (por ejemplo t). El método se basa en la IBD (Identidad por Descendencia) compartida de pares de hermanos afectados para múltiples marcadores. Para el objetivo de nuestro análisis, las genealogías se dividieron en familias. Se usaron 56 familias nucleares y 183 pares de hermanos. Liang KY, Huang CY, Beaty TH (2000) A unified sampling approach for multipoint analysis of qualitative and quantitative traits in sib pairs. Am J Hum Genet 66: 1631-1641.
Los resultados de GENEFINDER indican la localización de un gen de susceptibilidad para trastornos afectivos a 3,19 \pm 0,446 cM telomérico con respecto al marcador D12S1721 (D12S1721 está localizado aprox. a 136,82 cM en el mapa del cromosoma 12 de Marshfield promediado por sexo).
I.C. 95%: [2,32, 4,06];
I.C. 99%: [2,03, 4,35]
I.C. 99,9%: [1,71, 4,67]
A partir de los estratos, se obtuvieron 24 núcleos y 107 pares de hermanos, y la localización del gen de susceptibilidad se estimó a 3,07 \pm 0,57 (véase el mapa anterior). Se obtuvieron los siguientes intervalos de confianza (I.C.):
I.C. 95%: [1,95, 4,19];
I.C. 99%: [1,59, 4,55]
I.C. 99,9%: [1,18, 4,96]
Se realizó un estudio de asociación usando los marcadores microsatélites NBG con CLUMP (Sham & Curtis. Ann. Hum. Genet. 59 (1995), 97-105). Las muestras se distribuyeron como se indica a continuación: 83 hombres/caso; 124 mujeres/caso; 95 hombres/control; y 101 mujeres/control. Se usaron mil simulaciones para estimar los valores de p. Los resultados observados se resumen en la Tabla 9.
TABLA 9 Estudio de asociación usando el microsatélite NBG
24 
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El parámetro estadístico T1 es el parámetro estadístico chi-cuadrado habitual en la tabla de contingencia de partida.
El parámetro estadístico T2 es el parámetro estadístico chi-cuadrado habitual aplicado en la tabla de contingencia obtenida después de colapsar las columnas con los valores esperados pequeños conjuntamente.
El parámetro estadístico T3 es el parámetro estadístico chi-cuadrado de mayor tamaño conseguido comparando una columna de la tabla original con el total de las otras columnas.
El parámetro estadístico T4 es el parámetro estadístico chi-cuadrado de mayor tamaño conseguido comparando cualquier combinación de alelos con el resto.
Sólo el marcador NBG12 dio una asociación significativa al nivel de 1%. Para los otros marcadores, no hubo ningún alelo individual que pareciera asociado con el trastorno bipolar. Parece ser que ningún alelo fundador se representaba demasiado entre los afectados. No hay ningún resultado significativo para la asociación de genotipos con los marcadores NBG.
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Se realizaron estudios de asociación adicionales basados en marcadores microsatélites usando CLUMP sobre muestras que contenían individuos adicionales de control y de casos. Se usaron mil simulaciones para estimar los valores de p.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 9a Valores de p empíricos observados con CLUMP para los parámetros estadísticos T1 y T3 para análisis alélicos y genotípicos de marcadores microsatélites
25
La hipótesis HWE se cumplió al nivel de 5% para cada marcador microsatélite después de la aplicación de las correcciones de Bonferroni conservativas para el ensayo múltiple (Bland & Altman, Brit. J. Med. 310 (1995) 170). La Tabla 9a indica los valores de p empíricos observados con CLUMP para los análisis de asociación de alelos y genotipos. Se observaron valores de p empíricos menores de 0,005 en el marcador NBG12 para los parámetros estadísticos T1 y T3 según el análisis de asociación alélica. El parámetro estadístico T1 sugería asociación alélica entre trastornos afectivos bipolares y NBG6 (valor de p empírico = 0,008). Además, se observó un valor de p empírico muy poco significativo de 0,023 en el marcador más distal D12S2075.
En conclusión, los resultados multipuntual paramétricos y sin modelo sugieren investigar los genes localizados entre D12S1619 y D12S1666. Además, de acuerdo con los resultados de GENEFINDER, deben considerarse los genes situados centroméricos a NBG9 para los análisis de asociación y de desequilibrio de ligamiento. Además, se observó una asociación positiva con el marcador NBG6, que está localizado en el intrón 9 del gen P2X7R.
Ejemplo 2 Mapeo físico y análisis mutacional del cromosoma 12 que asocia la proteína P2X7R a trastornos afectivos bipolares
La predicción más conservativa de la región asociada con la enfermedad se incluye entre los marcadores NBG11 y NBG2 (véase la Figura 1a). Esta región se delimitó de acuerdo con el análisis de ligamiento y asociación descrito en el Ejemplo 1, usando marcadores Genethon y marcadores NBG. La longitud aproximada de esta región es 5,2 Mb. En esta región se incluyeron dos huecos importantes (entre FLJ10701 y FLJ32372, y entre FLJ1466 y MONDOA). En este área se indicaron al menos 73 genes, siendo 48 genes conocidos y 25 desconocidos pero asociados con el ARNm y/o los agrupamientos EST basados en el último ensamblaje del genoma disponible en UCSC (noviembre de 2002). No se han indicado los genes previstos. Sin embargo, la estimación de CI 99% (intervalo de confianza) usando GENEFINDER ha limitado la región más interesante entre los marcadores D12S1666 y NBG9. Esta región genómica cubre 1,6 Mb e incluye al menos 28 genes, y no tiene ningún hueco importante. De esta manera, se usó el término región de fBAD (Trastornos Afectivos Bipolares familiares) para describir el segmento genómico entre D12S1666 y NBG9. Los genes encontrados dentro de esta región incluyen CaMKK2, CABP, P2X7, P2X4, PIN, PLA2, G1B, CIT, PXN, Rab35 y APC5. Sin embargo, dada la presente técnica, no habría sido evidente para un especialista en la técnica seleccionar P2X7R como gen asociado con enfermedades afectivas. Serían obvios otros genes distintos de los indicados anteriormente.
Por ejemplo, el gen CaMKK2 (también conocido como proteína quinasa quinasa beta dependiente de Ca^{2+}/Calmo-
dulina o CaMKKb) es una proteína quinasa de serina/treonina implicada en rutas de señalización dependientes de Ca^{2+}. CaMKK2 puede activar in vitro las quinasas corriente abajo CaMKIV y CaMKI, que modulan la transcripción de genes a través de la fosforilación de factores de transcripción (por ejemplo, CREB, SRF, MEF2; Corcoran y Means, J. Biol. Chem. 276 (2001), 2975-2978; Soderling, Trends Biochem. Sci. 24 (1999), 232-236). Su papel en la cascada de Ca^{2+} no es crítico. Algunos estudios sugieren que las CaMK podrían activarse sin la fosforilación de las CaMKK (Matsushita y Naim, J. Biol. Chem. 274 (1998), 10086-10093). Sin embargo, la etapa de fosforilación de CaMKK contribuiría a la amplificación de la señal de Ca^{2+}, ya que CaMKK es más sensible a la activación por Ca^{2+}/Calmodulina, y por lo tanto CaMKK sería un mediador importante cuando los niveles de Ca^{2+} intracelular son bajos (Anderson et al., J. Biol. Chem. 273 (1998), 31880-31889).
CaMKK2 es una diana evidente para la depresión ya que la técnica anterior sugiere que las rutas de señalización dependientes de AMPc (mediadas por activación de PKA) están afectadas en el cerebro de pacientes con Trastornos Afectivos Bipolares (Field et al., J. Neurochem. 73 (1997), 1704-1710; Rahman et al., J. Neurochem. 68 (1997), 297-304; Takahashi et al., J. Neurosci. 19 (1999), 610-618). De acuerdo con un estudio que usa líneas celulares linfoblásticas, el trastorno bipolar podría estar relacionado con niveles de calcio intracelular elevados (Yoon et al., Mol. Psychiatry 6 (2001), 678-683). Además, algunos grupos encontraron relaciones entre fármacos antidepresivos y activación de CaMK (Budziszewska et al., Br. J. Pharmacol. 130 (2000), 1385-1393; Consogno et al., Neuropsychopharmacology 24 (2001), 21-30; Mori et al, Neuropharmacology 40 (2001), 448-456; Zanotti et al., Neuropharmacology 37 (1998), 1081-1089). Además, la inhibición de CaMKK por fosforilación mediada por PKA sugiere una fuerte relación entre las dos rutas (Matsushita et al., J. Biol. Chem. 273 (1999), 21473-21481). Estas observaciones sugerirían a una persona especialista en la técnica que CaMKK2 es el gen responsable de la enfermedad afectiva bipolar.
Otro candidato evidente para los trastornos afectivos habría sido el gen CABP1 que genera cuatro proteínas de unión a Ca^{2+} neuronales por el uso alternativo de los 9 exones codificantes, que son L-CABP, S-CABP, calbrain y caldendrina (Haeseleer et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 1247-1260). Su expresión está restringida casi totalmente a tejidos cerebrales. Un estudio cerebral sobre calbrain revela su efecto negativo sobre la actividad de CaMKII dependiente de Ca^{2+}/Calmodulina por interacciones competitivas con el dominio de unión a CaM de CaMKII (Yamagushi et al., J. Biol. Chem. 274 (1999), 3610-3616). Se podrían esperar papeles similares en la señalización de Ca^{2+} para otros productos alternativos de CABP1. La participación del gen CABP1 en rutas de señalización dependientes de Ca^{2+} haría evidente para un especialista en la técnica seleccionar este gen como candidato para el trastorno afectivo bipolar. Sin embargo, todos los exones de CABP1 se analizaron con respecto a la presencia de mutaciones y, sorprendentemente, sólo se detectaron dos mutaciones en regiones no codificantes.
El gen PIN (inhibidor proteico de NOS (óxido nítrico sintasa)) es otro candidato evidente responsable del trastorno afectivo bipolar. El óxido nítrico (NO) del cerebro puede estar implicado en la apoptosis, sinaptogénesis y desarrollo neuronal. Como el NO no puede almacenarse en vesículas como otros neurotransmisores, su liberación se regula por la actividad de la NOS (óxido nítrico sintasa). PIN es un inhibidor directo de la NOS por la unión y desestabilización del complejo homodímero activo de NOS (Jaffrey et al., Science 274 (1996), 774-777). PIN está muy conservado a lo largo de la evolución y se expresa en muchos tipos celulares. Un estudio clínico reciente que evalúa los niveles plasmáticos de nitrato en estados depresivos sugiere que la producción NO está aumentada en la depresión (Suzuki et al., J. Affect. Disord. 63 (2001), 221-224) y puede deberse a una deficiencia en la inhibición de la NOS. Además, en un modelo de ratón, se han asociado antagonistas de la NO sintasa a propiedades antidepresivas (Harkin et al., 1999; Karolewicz et al., Eur. J. Pharmacol. 372 (1999), 215-220). De esta manera, PIN sería un candidato evidente. Sin embargo, debido a la acción pleiotrópica del NO, una deficiencia en la función de PIN generaría muchos trastornos no relacionados a lo largo de todo el cuerpo. De esta manera, sin la información presentada en la descripción de este documento, un especialista habitual en la técnica habría previsto PIN y no P2X7R como gen asociado con trastornos afectivos.
La fosfolipasa humana A2 grupo IB (PLA2G1B) cataliza la liberación de ácidos grasos a partir de glicero-3-fosfocolinas. Los genes de fosfolipasa A2 (PLA2) se expresan en muchos tejidos. Algunos estudios han demostrado asociaciones entre una actividad excesiva de PLA2 en el cerebro y trastornos afectivos (Chang et al., Neurochem. Res. 23 (1998), 887-892; Hibbeln et al., Biol. Psychiatry 25 (1989), 945-961). Además, otros estudios genéticos han encontrado asociaciones entre el gen PLA2G1B y el trastorno afectivo bipolar (Dawson et al., Psychiatr. Genet. 5 (1995), 177-180). De esta manera, PLAG1B representa un probable candidato para trastornos afectivos. Sin embargo, en el presente ejemplo sólo se encontró una mutación silenciosa dentro del exón 3 del gen PLAG1B.
El gen de la quinasa citron humana, una proteína asociada a Rho (CIT), codifica una proteína de 183 kDa que se asocia con la GTPasa Rho. CIT comparte una fuerte similitud con proteínas ROCK y ROK que son otras quinasas asociadas a Rho (Madaule et al., Nature 394 (1998), 491-494). Las GTPasas Rho están implicadas en muchos procesos tales como la organización del citoesqueleto, la circulación en la membrana, el crecimiento celular y la activación de la transcripción (Van Aelst y D'Souza-Schorey, Genes Dev. 11 (1997), 2295-2322). Los estudios sobre variantes cerebrales de Citrón-K (sin el dominio quinasa) revelan la asociación con proteínas de densidad postsinápticas (PSD-95), lo que sugiere un papel en la organización o función de la sinapsis (Zhang et al., J. Neurosci. 19 (1999), 96-108; Furuyashiki et al., J. Neurosci. 19 (1999), 109-118).
El gen de la paxilina humana (PXN) codifica una proteína de 68 kDa que se encuentra en adhesiones focales. Está dentro de adhesiones focales en las que moléculas de adhesión interaccionan dinámicamente con el citoesqueleto (Salgia et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 5039-5047). Las rutas de señalización que regulan estas interacciones dinámicas empiezan a esclarecerse. Muchas observaciones sugieren que la paxilina está implicada en la transducción de señales desde receptores de factores de crecimiento a adhesiones focales. La paxilina se expresa en muchos tejidos incluyendo el cerebro.
Sin embargo, como se indica más adelante, el gen causante de enfermedades afectivas se identifica como el receptor de P2X7 (P2X7R).
Se buscaron mutaciones en secuencias codificantes y límites exón-intrón de los genes mencionados anteriormente, ya que estas mutaciones con mucha probabilidad proporcionarán Polimorfismos de un Solo Nucleótido (SNP) funcionalmente significativos. La muestra inicial estaba compuesta de 16 individuos afectados no relacionados de la región Saguenay/Lac St-Jean, que proporciona una potencia de 80% para detectar polimorfismos con una frecuencia de 0,05. Para identificar los polimorfismos, primero se amplificaron por PCR las secuencia diana. Después, los productos de PCR se purificaron en membranas Whatman GF/C (VWR, Montreal, Canadá) y se cuantificaron usando un ensayo de cuantificación de ADN bicatenario PicoGreen (Molecular probes, Oregon, USA). Se secuenciaron 4 ng de productos de PCR purificados usando el kit de secuenciación DYEnamic ET Terminator Cycle (Amersham Biosciences, Baie D'Urfé, Canadá). Los productos de secuenciación se resolvieron en un analizador de ADN ABI PRISM 3730XL y un analizador de ADN ABI PRISM 3700. Los productos de PCR se secuenciaron en las dos direcciones. Los SNP identificados en los genes estudiados se indican en la Tabla 10.
TABLA 10 Análisis mutacional entre marcadores D12S1666 y NBG9
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Cada SNP en los genes Rab35, PXN, PLA2G1B, PIN, CaBP, OASL, P2X4R, CaMKK2 y APC5 se diseñó de acuerdo con el gen en el que se encontró, y su localización en ese gen (regiones intrónicas o exónicas). Cada SNP en el gen P2X7R se diseñó de acuerdo con su posición en la SEC ID Nº: 1. El alelo describe la posición y la variación observada. En regiones codificantes, la posición es relativa al codón de inicio, mientras que los SNP intrónicos están colocados con respecto al principio del intrón correspondiente (cuando se conoce). En la tabla 1a y en las SEC ID Nº: 52 a 111 se definen los cebadores usados para identificar los SNP en P2X7R y la localización de cada SNP.
Se realizaron estudios de asociación usando SNP de sentido erróneo. Se usaron SNP de sentido erróneo o SNP que pudieran estar cercanos a los sitios de corte y empalme, porque es más probable que las enfermedades estén asociadas con una función indebida de las proteínas. El grupo de casos estaba compuesto por individuos bipolares I, personas a las que se les había diagnosticado trastorno bipolar de tipo esquizoafectivo (182 sujetos) y trastorno bipolar II (31 sujetos). Muchos controles de la región Saguenay/Lac-St-Jean se muestrearon a partir de los bancos de ADN Steinert, Glaucoma y Paget. En los individuos de control no se diagnosticaron trastornos afectivos. De acuerdo con los riesgos a lo largo de la vida de padecer trastornos bipolares (1%), no hubo necesidad de seleccionar controles para trastornos psiquiátricos.
La secuenciación directa de productos de PCR es, con mucho, el método más precio de análisis y es el método elegido en vista de la capacidad de la presente plataforma de secuenciación. Los productos de PCR se analizaron por secuenciación directa como se ha descrito anteriormente. Después del análisis de secuenciación, los individuos se tipificaron automáticamente para el SNP correspondiente usando un programa desarrollado internamente, GENO.pl. Los resultados de la genotipificación de SNP se recopilan en una base de datos 4D.
La hipótesis de asociación se ensayó con CLUMP (Sham & Curtis 1995, Ann. Hum. Genet. 59: 97-105). Se usaron mil simulaciones para estimar los valores de p. Los resultados se ilustran en la tabla 11. El parámetro estadístico T1, que es el parámetro estadístico chi-cuadrado habitual en la tabla de contingencia de partida, se usó para ensayar la asociación alélica. Además, el mayor parámetro estadístico chi-cuadrado conseguido comparando una columna de la tabla original con el total de las demás columnas, denominado parámetro estadístico T3, se añadió al previo para ensayar la posible asociación de genotipos, ya que los resultados del parámetro estadístico T1 pueden sesgarse cuando la tabla de contingencia contiene celdas con valores bajos.
TABLA 11 Hipótesis de asociación usando CLUMP
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Los estudios de asociación que usan SNP en P2X7, P2X4 y CaMKK2 revelan asociaciones significativas a un nivel de aproximadamente 5% menor. Se observaron tres asociaciones de genotipo en P2X7. Sin embargo, los SNP P2XR7v11B y P2XR7v13E están muy asociados entre sí basándose en una tabla de contingencia. También hay una asociación de alelos a nivel de 5,7% para SNP6f18v2 en CaMKK2. La información asociada con cada SNP relevante puede encontrarse en las Tablas 10 y 12.
Se realizaron estudios de asociación adicionales usando CLUMP en muestras que contienen más individuos de casos y de control. Se usaron mil simulaciones para estimar los valores de p.
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TABLA 11a Valores de p empíricos y razones de posibilidades (OR) con un intervalo de confianza de 95%, observados con CLUMP para el análisis de alelos y genotipos de SNP
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Se genotipificaron treinta y tres SNP en P2X7R, siete STP en P2X4R y cuatro SNP en CAMKK2, con una frecuencia alélica minoritaria mayor o igual a 1% (Tabla 11a). Las distribuciones de genotipos de estos SNP no se desviaron significativamente de HWE. Al nivel de 5%, se observaron aumentos estadísticamente significativos de la frecuencia alélica minoritaria en el grupo del trastorno afectivo bipolar a P2XR7v13F (valor de p = 0,030, OR = 3,24, CI 95% = 1,04-10,12), P2XR4UTR3A (valor de p = 0,015, OR = 1,50, CI 95% = 1,11-2,02) y CAMKK2E01B (valor de p = 0,048, OR = 1,33, CI 95% = 1,01-1,76). La distribución de genotipos en los SNP P2X7Rv13F y P2XR4UTR3A también difería significativamente a este nivel para los parámetros estadísticos T1 y T3, con un aumento de heterocigotos en la muestra de casos. Un SNP del exón 11 de P2X7R, P2XR7v11B, y otro del exón 13, P2XR7v13E, presentaron diferencias en distribuciones de genotipos con un valor de p mínimo de 0,028 y 0,025 observados con el parámetro estadístico T3. De nuevo, se observaron aumentos en la frecuencia de heterocigotos de 12% y 13%, respectivamente, en la muestra bipolar en estos polimorfismos.
Los ensayos de asociación haplotípicos significativos condujeron a valores de p menores de 0,5% para diferentes grupos de SNP que solapaban con el gen P2X7R (Tabla 11b). Considerando la colección de SNP que variaba de SNP32507 a SNP54847 (tabla 11c) como ejemplo para la distribución de haplotipos, se observó la mayor diferencia de frecuencias entre casos y controles con el haplotipo nº 1 (tabla 11d). El haplotipo nº 2 es otro ejemplo de haplotipo que se observa con más frecuencia en el grupo de casos. Por otra parte, la frecuencia para el haplotipo nº 3 está ligeramente aumentada en la muestra de control (diferencia de frecuencias = 0,091). La tabla 11e presenta los productos peptídicos derivados de los haplotipos nucleotídicos mostrados en la tabla 11d.
TABLA 11b Haplotipos que muestran asociación alélica significativa al nivel de 0,5% para los parámetros estadísticos T1 o T3
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TABLA 11c Posición y alelos para SNP de formación de haplotipos. Los haplotipos se describen en la tabla 11d
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TABLA 11d Haplotipos con diferencias significativas de frecuencias entre individuos afectados y de control
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TABLA 11e Aminoácidos correspondientes para cSNP descritos en la Tabla 11c. Están colocados de acuerdo con la SEC ID Nº: 3
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Ejemplo 3 Polimorfismos encontrados en P2X7R en individuos que padecen depresión
Se realizaron estudios de asociación usando SNP en el gen P2X7R en una muestra de casos/controles (535 individuos) procedente de una población alemana. El grupo de casos estaba compuesto por 36 individuos a los que se les había diagnosticado trastorno bipolar tipo I o tipo II y 279 individuos a los que se les habían diagnosticado trastornos unipolares (es decir depresión) que representaban 133 hombres afectados y 182 mujeres afectadas. Entre los controles, se contaron los 220 individuos de control restantes que eran normales (es decir, se les había diagnosticado como no depresivos) y comprendían 81 hombres, 182 mujeres y 14 de sexo desconocido. Se detectó la misma distribución sexual en los dos grupos.
En esta muestra se identificaron SNP usando un subgrupo de 24 individuos afectados. Los SNP en el gen P2X7R detectados en la población alemana fueron similares si no idénticos a los SNP vistos en la población de Saguenay/Lac-St-Jean (véase la tabla 12). También se observaron otros SNP de sentido erróneo raros en la población alemana, tales como Arg117Trp (P2XR7E03A), Glu186Lys (P2XR7E06A), Leu191Pro (P2XR7E06B) e Ile568Asn (P2XR7E13J). Estos aminoácidos están bastante conservados entre genes P2X7 ortólogos. Es posible que la mutación Ile568Asn (P2XR7E13J) pueda estar implicada en la expresión en la superficie de P2X7.
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TABLA 12 Comparación entre polimorfismos en la población de Saguenay/Lac-St-Jean y la población alemana en el gen P2X7R humano
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La posición y numeración del polimorfismo corresponde al gen P2X7R humano como se ha definido en la SEC ID Nº: 1. Para identificar la organización genómica del gen P2X7R, primero se organizaron clones BAC usando marcadores polimórficos conocidos, sitios de señalización de secuencia (STS), secuencias con extremo BAC y señales de secuencia expresadas (EST). Se reensamblaron regiones de ADN no orientadas y desordenadas en una secuencia usando Phrap y las piezas se reordenaron usando exones de P2X7R como soportes. No se ha realizado una organización completa del gen para P2X7R. Sólo hay una estructura parcial de gen desde el exón 6 a 13, NT_037809. Por lo tanto, esta secuencia genómica que incluye el gen P2X7R como se representa en la SEC ID Nº: 1 podría contener algunos errores de secuencia, específicamente en regiones intrónicas. Los cebadores usados para la amplificación y secuenciación de SNP se muestran en la Tabla 1a y se representan en las SEC ID Nº: 52 a 111.
Se realizó un análisis estadístico de acuerdo con el método CLUMP (Sham & Curtis 1995, Ann, Hum, Genet. 59:97-105). La tabla 13 resume los estudios de asociación alélica y genotípica para SNP en el gen P2X7.
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TABLA 13 Estudios de asociación alélica y genotípica usando CLUMP
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Para el análisis de SNP, se controló el equilibrio de Hardy-Weinberg (HW) en las muestras de control. El principio de Hardy-Weinberg (HWP) puede indicarse como se indica a continuación: En una población grande de emparejamientos aleatorios, en la que no hay migración o selección frente a un genotipo particular y la tasa de mutación permanece constante, las proporciones de los diversos genotipos permanecerán sin cambios de una generación a otra. Considérese un sistema de dos alelos con los alelos A y a. Si la proporción de A en la población se representa como p y la proporción de a como q, entonces p + q representa la suma total de alelos en este locus, es decir p + q = 1. El HWP es útil para evaluar algunos problemas de población como la diversidad conyugal, endogamia, estratificación de la población, mezcla y variabilidad reducida de un genotipo particular. El SNP P2XR7v13A no respetó el equilibrio de Hardy-Weinberg.
La hipótesis de asociación también se ensayó usando una tabla de positividad de alelos considerada adecuada para la detección de alelos de susceptibilidad que muestran un modo dominante de herencia (Ohashi y Tokunaga, J. Hum. Genet. 44 (1999), 246-248; Ohashi et al., Ann. Hum. Genet. 65 (2001), 197-206). Usando este método se obtuvieron resultados similares a los obtenidos usando las tablas de frecuencia de alelos, con la excepción de P2XR7v05A donde los valores de p fueron 0,253. De esta manera, P2XR7v05A presentó una asociación menos significativa en este análisis. Esta diferencia puede atribuirse al modo de herencia.
La proporción de individuos unipolares en el análisis de la población Alemana es bastante importante, ya que la Asociación Psiquiátrica Americana (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-4th Edition Text Revision (DMS-IV-TR), American Psychiatric Press, 2000) ha notificado un aumento en la susceptibilidad de trastornos unipolares en grupos femeninos. Para determinar si la variable sexual podía influir en el análisis de asociación, se realizaron estudios de asociación adicionales controlando el parámetro sexual. Se omitieron del estudio individuos normales de la población alemana sin información sobre el sexo. Después, se obtuvo un modelo de regresión logística incluyendo el sexo como factor. Para obtener un modelo tan estable como sea posible, el modelo de regresión se minimizó usando la diferencia entre logaritmos de probabilidad para modelos con o sin interacción (Hosmer y Lemeshow, "Applied logistic regression", John Wiley and Sons, 1989). La estrategia usada para manipular las celdas cero de las tablas de continencia fue eliminar la categoría asociada completamente. Los cálculos se realizaron con SAS v8.0. SAS es un paquete de software estadístico que permite al usuario manipular y analizar datos de muchas maneras diferentes. Debido a sus capacidades, este paquete de software se usa en muchas disciplinas, incluyendo ciencias médicas, ciencias biológicas y ciencias sociales.
La introducción de un parámetro sexual no alteraba la asociación ya observada en el análisis previo. Además, este modelo de análisis reveló resultados adicionales: se observó una asociación potencial de alelos con P2XR7v05B (p = 0,064), y una asociación genotípica para P2XR7v08A (p = 0,042).
Se realizaron estudios de asociación usando muestras reunidas uniendo los individuos de las muestras de la población de Saguenay/Lac-St-Jean con los de la población Alemana. Los resultados se ilustran en la tabla 14. El objetivo de este análisis es destacar las características comunes entre las dos poblaciones. Sin embargo, de acuerdo con las diferencias entre las dos muestras (principalmente el fenotipo de individuos afectados, es decir, trastorno bipolar en las muestras de Saguenay/Lac-St-Jean, frente al trastorno principalmente unipolar en la población Alemana) se controlaron algunos parámetros, incluyendo el sexo y la etnicidad. La estrategia de modelos para las regresiones logísticas se ha descrito anteriormente.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 14 Estudios de asociación usando muestras reunidas de las dos poblaciones
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Se observó una asociación alélica y genotípica para el locus P2XR7v13A (p = 0,0047) que fue más fuerte que en el análisis separado. También se observó una asociación alélica significativa para el locus P2XR7v08A (p = 0,0452). Además, el presente análisis también demuestra la relación potencial entre SNP P2XR7v05A y el origen con un valor de p = 0,0515 (no mostrado en la tabla) que está de acuerdo con el análisis de asociación previo realizado en las dos muestras por separado (véase la Tabla 13).
El análisis de haplotipo se realizó usando la población Alemana. El programa PHASE (Stephens et al., Am. J. Hum. Genet. 68 (2001), 978-989) se usó para estimar haplotipos de SNP con exones del gen de P2X7R. Se crearon haplotipos para cada exón que tenía más de un SNP asociado (véase la Tabla 15 para los SNP asociados a exones). Los grupos de casos variaron de 218 a 220 individuos, mientras que los grupos de control variaron entre 312 y 316 individuos. La hipótesis de asociación se ensayó con el método CLUMP, ya que se crearon muchos haplotipos para cada exón. Los ensayos estadísticos T1 y T3 se realizaron como se ha descrito anteriormente. También se calcularon los parámetros estadísticos T2 y T4 también debido a la presencia de pequeñas celdas eficaces en las tablas de contingencia. El parámetro estadístico T2 es el parámetro estadístico chi-cuadrado habitual aplicado en la tabla de contingencia obtenida después de colapsar las columnas con pequeños valores esperados. El parámetro estadístico T4 es el mayor parámetro estadístico chi-cuadrado obtenido comparando una columna de la tabla original con el total de las demás columnas. Se usaron mil simulaciones para estimar los valores de p. Los datos resultantes se analizaron con el modelo de regresión logística (descrito anteriormente) usando SAS V8.0 para considerar el parámetro sexual (para estos ensayos la muestra se redujo por 14 individuos normales). Sin embargo, este método de análisis se limita por la fiabilidad de haplotipos reconstruidos.
TABLA 15 SNP asociados con exones
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TABLA 16 Asociación genotípica con haplotipos en el exón 13 de P2X7R
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* \hskip0.1cm El ensayo de T1 no debe considerarse debido a las tablas de contingencia con celdas cero.
** \begin{minipage}[t]{140mm} Entre estos 15 haplotipos, se observaron 8 haplotipos en los que las celdas de casos tienen menos de 3 individuos.\end{minipage}
La Tabla 16 ilustra una asociación genotípica con haplotipos en el exón 13 de los genes P2X7R. De manera interesante, se observaron muchos haplotipos para el exón 13. Las diferencias entre los parámetros estadísticos en el exón 13 (T3 menos significativo) pueden explicarse por la implicación de más de un genotipo de haplotipos en la enfermedad. También se detectó una asociación alélica potencial con haplotipos en el exón 5 del gen P2X7R.
A continuación se proporcionan resultados clínicos que ilustran las consecuencias funcionales de polimorfismos en P2X7R.
El desarrollo y transcurso de depresión está asociado causalmente con alteraciones en la regulación central del eje hipotalámico-pituitaria-adrenocortical (HPA). Las anomalías en el eje HPA pueden medirse usando el ensayo de supresión de dexametasona (DST) o el ensayo combinado de hormona de liberación de dexametasona/corticotropina (Dex/CRH). Los cambios en las mediciones de cortisol y/u hormona adrenocorticotrópica (ACTH) durante el ensayo DST o Dex/CHR indican una disfunción del HPA en pacientes deprimidos (Heuser et al, J. Psychiat. Res. 28 (1994) 341-356; Rybakowski y Twardowska, J. Psychiat. Res. 33 (1999) 363-370; Zobel et al, J. Psychiat. Res. 35 (2001) 83-94; Künzel et al, Neuropsychopharmacology 28 (2003) 2169-2178). Para demostrar que los SNP de P2X7R asociados con trastornos afectivos también están correlacionados con cambios en el eje de HPA, se midieron los niveles de cortisol y ATCH en respuesta al ensayo DST y Dex/CRH para los SNP P2XR7v13A y P2XR7v13C. P2XR7v13A consiste en un cambio de un nucleótido A por G que da como resultado una modificación Gln460Arg en la proteína P2X7R. El SNP P2XR7v13C corresponde a un cambio de un nucleótido A por C que da como resultado una modificación Glu496Ala que según se ha demostrado reduce espectacularmente la actividad de la proteína (Wiley et al, Drug Dev. Res. 53 (2001) 72-76).
Los métodos y condiciones para realizar el ensayo DST y Dex/CRH son bien conocidos en la técnica, véase por ejemplo Heuser et al, J. Psychiat. Res. 28 (1994) 341-356; Künzel et al, Neuropsychopharmacology 28 (2003) 2169-2178. En resumen, los individuos se pretrataron a las 23:00 con una administración oral de 1,5 mg de dexametasona. Para el ensayo DST, se extrajo una muestra de sangre a las 8:00 antes de la administración de dexametasona (es decir, pre-dexametasona) y a las 8:00 la mañana siguiente a la administración de dexametasona (es decir, post-dexametasona). Para el ensayo Dex/CRH, se insertó un catéter venoso a las 14:30 al día siguiente de la administración de dexametasona y se extrajo sangre a las 15:00, 15:30, 15:45, 16:00 y 16:15 en tubos que contenían EDTA y trasilol (Bayer Inc., Alemania). A las 15:02, se administraron por vía intravenosa 100 mg de CRH humana (Ferring Inc., Alemania). La medición de las concentraciones plasmáticas de cortisol se realizó usando un kit de radioinmunoensayo comercial (ICN Biomedicals, USA) mientras que las concentraciones plasmáticas de ACTH se midieron usando un ensayo inmunométrico comercial (Nichols Institute, USA). Los dos ensayos se realizaron de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
Para el SNP P2XR7v13A, se observó una reducción en los niveles basales de cortisol en el momento de la admisión en individuos con un alelo AG o GG en comparación con los individuos con el alelo AA (Figura 1f). Durante el ensayo Sex/CRH, se midió una reducción en la respuesta de cortisol y ATCH en individuos con el alelo GG en comparación con individuos con un alelo AA o AG (Figuras 1g y 1h).
Además, la respuesta al tratamiento antidepresivo estaba retardada en los individuos GG (Figura 1i).
Para el SNP P2XR7v13C, se midió un aumento en los niveles basales de cortisol después de la administración de dexametasona (Figura 1j). Durante el ensayo Dex/CRH, los individuos con el alelo CC presentaron una respuesta elevada al cortisol (Figura 1k), pero una respuesta reducida a la ATCH (Figura 1l) en comparación con los individuos AA y AC. Estos resultados indican una regulación defectuosa del eje HPA.
De esta manera, los SNP en P2X7R se correlacionan con una disfunción en el eje HPA y demuestran las consecuencias funcionales y clínicas de polimorfismos en P2X7R.
Ejemplo 4 Estructura del gen P2X7R y expresión del ARNm y secuencia del transcrito
Se analizó una secuencia de nucleótidos de 1700 pb correspondiente al promotor de P2X7R humano usando los algoritmos Matinspector V2.2 y Transfac 4.0. Este análisis demostró que el gen de P2X7R no contiene una caja TATA patrón, pero tiene sitios SP1 que pueden formar el inicio de la transcripción. Aparte de las secuencias de SP1, hay sitios de unión para los factores de transcripción GARA, Oct e Ikarus. Se cree que estos sitios proporcionan especificidad de tejido. De manera interesante, el promotor de P2X7R tiene sitios de unión que sugieren capacidad de respuesta a diferentes citoquinas tales como AP-1, NFAT y CEBPB.
P2X7R posee 13 exones y 12 intrones (Buell et al., Receptors Channels 5 (1998), 347) que proporcionan una base para un corte y empalme alternativo que produciría en teoría diferentes transcritos y produciría diferentes isoformas con posibles funciones diferentes. No se identificó claramente ninguna variante de corte y empalme alternativa. Sin embargo, los experimentos de agrupamiento EST permitieron la descripción de tres variantes de corte y empalme. Una se define por la falta del exón 5. Esta variante P2X7v02 corresponde al clon IMAGE: 3628076 aislado a partir de líneas celulares procedentes de cerebro. El P2X7v02 que carece del exón 5 produce un desplazamiento de fase, generando de esta manera un polipéptido más corto. La segunda variante de corte y empalme P2X7v03, se caracteriza por la presencia del intrón corto 10 en el ARNm. Esta variante se confirma por dos secuencias de alta calidad, el clon de ADNc BRAMY2008977 (número AC: AK090866) procedente de amígdala humana y el clon EST dbEST: 7339877 procedente de un tumor humano desconocido. La última variante, P2X7v04, se define por la falta del primer exón que sugiere un uso alternativo del promotor próximo al exón 2. Un clon EST de alta calidad dbEST:4782844 procedente de un tumor de cabeza y cuello confirma esta variante. Estas variantes se muestran en las Figuras 16a a 16e.
Variantes de P2X7
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Por lo tanto, las secuencias de inicio de la transcripción y la traducción de P2X7R humano se analizaron usando el software informático Blast, Genescan y HMMgene. Este análisis indicó que P2X7R posee con alta probabilidad sólo un sitio de inicio de la traducción. La mayoría de las señales de secuencia de expresión de P2X7R (EST; Único agrupamiento Hs. 193470) que tenían un extremo 5' fiable mostraron un sitio de inicio de la transcripción idéntico. Ninguna de las EST mostró ninguna indicación de un corte y empalme alternativo. Por lo tanto, los análisis virtuales sugieren que hay poca probabilidad de encontrar diferentes transcritos producidos por corte y empalme alternativo o el uso de promotores alternativos.
Los datos virtuales mencionados anteriormente se confirmaron por análisis RT-PCR que incluía la secuencia codificante de P2X7R humano prevista entera usando oligonucleótidos de 14 y 19 bases (5'-ATGCCGGCTTGCTG-3'; 5'-GTAGGGATACTTGAAGCCA-3') correspondientes al principio y final de la secuencia codificante, respectivamente. Se aisló ARN total de cerebro entero, de diferentes áreas del cerebro diseccionadas, timo, bazo y riñón, y se analizó con respecto a la expresión de P2X7R. Se realizaron reacciones de RT-PCR usando el sistema polimerasa C. Therm One Step (Roche Applied Science) y un protocolo para PCR touchdown (con reducción de la temperatura de hibridación) con un inicio caliente. En resumen, se realizó una transcripción inversa a 52ºC de acuerdo con las condiciones del fabricante. Las reacciones de PCR se realizaron con temperaturas de hibridación de 64ºC para los primeros cinco ciclos y de 54ºC para los siguientes 30 ciclos.
Se detectó una sola banda específica de tamaño de 1785 pb correspondiente a la secuencia codificante completa de P2X7R. Se detectó ARNm de P2X7R en cerebro entero, hipocampo, cerebelo, leucocitos y timo, pero no en corteza cerebral, hipotálamo, bazo y riñón (Figura 2). Todos los productos de PCR se clonaron usando el plásmido pGEM-T-Easy (Promega) seleccionado en bacterias Top-10 (Invitrogen) por selección azul-blanca y se ensayaron por digestión con EcoRI. Se amplificaron clones que tenían fragmentos del tamaño esperado y se purificaron para secuenciación. La secuencia confirmó la identidad de los clones de 1785 pb como la secuencia codificante completa de P2X7R de tipo silvestre. Por lo tanto, en todos los tejidos ensayados, P2X7R de tipo silvestre se expresa como un solo transcrito que incluye la secuencia codificante completa. La presencia de isoformas con especificidad de tejido es poco probable. Estos estudios proporcionan información útil sobre la expresión del ARNm de P2X7R y el procesamiento del transcrito. Esta información puede usarse para sintetizar ribosondas para hibridación in situ, transferencia de Northern y Southern así como para la obtención de células por ingeniería genética para la sobreexpresión de P2X7R.
Ejemplo 5 Expresión de P2X7R en cerebro de ratón
La expresión de P2X7R se estudió adicionalmente por inmunohistoquímica de secciones en serie de cerebros de ratón completos usando un anticuerpo policlonal dirigido contra un péptido interno de P2X7R (Santa Cruz Biotechnology). Los cerebros de ratones sin estrés se congelaron inmediatamente, se cortaron en cortes de 16 \mum y se fijaron con paraformaldehído durante 5 minutos. Las secciones se bloquearon durante 30 minutos a temperatura ambiente con suero de caballo 1:10. Todos los anticuerpos se diluyeron en tampón TBST (solución salina tamponada con Tris con 0,05% de Tween 20). El primer anticuerpo se usó en una dilución 1:200 y se incubó durante una noche. Todos los lavados se realizaron con tampón TBST. Como anticuerpo secundario se usó una IgG biotinilada anti-cabra (Vector Laboratories) y la detección se realizó usando el sistema complejo de estreptavidina-biotina-peroxidasa se rábano picante (Vector Laboratories) en combinación con diaminobencidina. Los cortes se tiñeron con azul de toluidina como tinte de contraste usando procedimientos convencionales. Como control negativo se usó el mismo procedimiento en ausencia del anticuerpo primario. Como control positivo para ensayar la conservación del tejido, ésta se verificó con un anticuerpo específico para la proteína Patched 1 (Santa Cruz Biotechnology). Patched 1 se usó como control positivo porque tiñe todas las estructuras cerebrales relevantes y no se ve afectada por el estrés ni por antidepresivos. Se detectó un modelo de tinción muy específico, coherente con la localización subcelular específica de P2X7R en células cerebrales. Los controles negativos carecían completamente de señal. El control positivo con Patched 1 mostró una intensidad de señal y distribución idénticas en todas las muestras, indicando que todos los tejidos se habían conservado y procesado igualmente bien.
Desde la parte frontal a la caudal, la proteína P2X7R se observó en la capa glomerular del bulbo olfativo a bajos niveles (Figura 3). P2X7R también estaba presente a niveles muy bajos en un área restringida del núcleo hipotalámico periventricular (Figura 3). Las células ependimales que rodeaban a los ventrículos laterales también mostraron una ligera tinción (Figura 3). Se detectó una señal más fuerte en áreas restringidas del hipocampo, donde la señal estaba presente en células individuales de la capa polimorfa, el lacunosum molecular y la capa oriens (Figura 4). En áreas más posteriores del hipocampo, la señal estaba presente en la capa molecular, estrato radiado y cerca del CA3. En una posición más caudal, P2X7R se expresaba en el órgano subcomisural (Figura 4). Por lo tanto, la expresión basal de P2X7R en el cerebro de ratones sin estrés está restringida a áreas que previamente se habían asociado con depresión, estrés, aprendizaje y memoria.
Ejemplo 6 P2X7R está modulado en ratones tratados con un antidepresivo
Se realizó una validación adicional del papel de P2X7R en trastornos afectivos examinando su patrón de expresión en respuesta al estrés y al tratamiento con fármacos antidepresivos. Se administró un programa de tratamiento que se había demostrado que producía efectos antidepresivos sobre el nivel conductual a ratones que se habían caracterizado como respondedores a antidepresivos, usando una diversidad de paradigmas de comportamiento adecuados para detectar los efectos ansiolíticos y antidepresivos de antidepresivos clásicos tales como el inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina paroxetina. La paroxetina se administró por medio de una sonda a ratones macho sin experimentación previa durante un período de tiempo de 28 días a una dosificación de 10 mg/kg de peso corporal dos veces al día. En paralelo, un grupo de ratones de control recibió solución de vehículo (es decir, sin paroxetina) usando el mismo régimen de tratamiento mientras que a un segundo grupo de control de ratones se les dejó tranquilos y sin estrés (es decir, se dejaron sin tratar) durante el mismo período de los experimentos. Al final del tratamiento a largo plazo, parte de los ratones de cada grupo experimental se ensayaron en la caja de oscuridad/luz (ensayo de comportamiento de ansiedad) y en el ensayo de natación forzada de Porsolt (ensayo de comportamiento de tipo depresivo) para confirmar la eficacia del tratamiento (Figura 5). El comportamiento de afrontamiento pasivo del estrés se redujo después del tratamiento a largo plazo con el antidepresivo paroxetina. La otra parte de los grupos experimentales (es decir, ratones sin experiencia de ensayo) se decapitaron, se extrajeron rápidamente los cerebros y se congelaron a -80ºC hasta el uso.
La expresión de P2X7R en los cerebros de ratones en condiciones sin estrés y en ratones en condiciones de estrés ligero producido por la aplicación del vehículo, y en los ratones sometidos al tratamiento con paroxetina se evaluó usando tres cerebros diferentes de cada grupo. Se analizaron cortes seriados de cada grupo de animales en paralelo por inmunohistoquímica usando los mismos materiales para producir resultados completamente comparables. No se observó ningún cambio significativo en la expresión de P2X7R en el bulbo olfativo en respuesta al estrés o al tratamiento con paroxetina (Figura 6). Sin embargo, en el núcleo periventricular del hipotálamo, la paroxetina produjo una ligera inhibición de la expresión de P2X7R (Figura 7). No se observó ningún cambio significativo en las células ependimales de diferentes áreas del cerebro (Figura 8). Los cambios más espectaculares se observaron en el hipocampo, donde P2X7R se inhibía fuertemente por una manipulación estresante mientras que el tratamiento con paroxetina producía una estimulación notable por encima de los niveles basales (Figuras 9, 10 y 11). Este efecto se observó a lo largo de todo el hipocampo, pero fue más evidente en la capa polimorfa cerca del giro dentado. En el órgano subcomisural, la expresión de P2X7R se mantuvo sin cambios por los diferentes tratamientos. Por lo tanto, la expresión de P2X7R está regulada fuertemente en dos áreas cerebrales específicas implicadas en la depresión y el estrés. Otras áreas cerebrales, que mostraron bajos niveles de P2X7R y no están implicadas directamente en la depresión, no mostraron cambios.
En las muestras procedentes de ratones tratados con paroxetina y que mostraban una fuerte expresión de P2X7R, fue posible analizar la distribución de P2X7R con más detalle (Figuras 10 y 11). La proteína P2X7R no sólo estaba presente en los cuerpos celulares, sino que también se detectaba claramente en proyecciones que inervaban la capa granular del giro dentado (Figura 12). Esta localización subcelular de P2X7R es coherente con un papel en la liberación de neurotransmisores y la potenciación a largo plazo.
Como algunos informes (Muria et al., Biochem. J. 288 (1992), 897-901; Ferrari et al., FEBS Lett. 447 (1999), 71-75) sugieren que la estimulación crónica y de alta dosis de P2X7R puede producir apoptosis en algunos tipos celulares, los hipocampos de los animales descritos anteriormente se analizaron con respecto a la co-localización de células apoptóticas y células que expresaban P2X7R, en secciones consecutivas, usando tinción TUNNEL e inmunohistoquímica. En secciones correlativas, sólo se detectaron algunas células apoptóticas y estaban presentes a lo largo de las capas granulares del hipocampo donde no se observó expresión de P2X7R (Figura 13). No se observaron diferencias significativas en los números de células apoptóticas entre las diferentes condiciones de tratamiento. Por lo tanto, la localización y número de células apoptóticas no se correlacionaba con la localización y número de células que expresaban P2X7R y descarta una implicación de P2X7R en la inducción de apoptosis en el hipocampo.
De esta manera, la expresión de P2X7R está considerablemente restringida a áreas específicas del cerebro implicadas en la depresión. Además, la expresión de P2X7R se inhibe por el estrés y se estimula fuertemente por el tratamiento con antidepresivos en estas áreas específicas. Por lo tanto, P2X7R cumple todos los criterios necesarios para las acciones de los antidepresivos de acuerdo con las normas más importante en el campo de la investigación de la depresión. Además, estos resultados sugieren que la modulación de la función de P2X7R está asociada con el estrés crónico, que sirve como modelo para varios aspectos de trastornos afectivos.
Ejemplo 7 El efecto conductual de la inhibición de P2X7R en ratones
Para demostrar que la inhibición de P2X7R actúa como agente causante de trastornos afectivos, la función de P2X7R se inhibió específicamente en distintas regiones del cerebro sin afectar a ninguna otra función cerebral. Esto se consiguió administrando moléculas de ARN de interferencia pequeñas (ARNsi) bicatenarias en áreas restringidas del cerebro.
De acuerdo con el patrón de expresión observado de P2X7R en el hipocampo (Figuras 9, 10 y 11) y la implicación conocida del hipocampo en la depresión, se seleccionó el giro dentado (hipocampo) como región diana para la aplicación de ARNsi. A ratones macho sin experimentación previa se les implantó bilateralmente una cánula de guía (calibre 23, longitud 8 mm) por medio de un instrumento estereotáctico. Las coordenadas, en relación al bregma, fueron -2,00 posterior, \pm 1,0 mm lateral y -1,0 mm ventral. Después de un período de recuperación de 5 días, los ratones se dividieron en tres grupos experimentales: vehículo (veh), ARN bicatenario de control (control) y ARNsi bicatenario específico de P2X7R (ARNsi). Las secuencias usadas para si ARN de P2X7R son 5'-GUGGGUCUUGCA
CAUGAUCTT-3' y 5'-GAUCAUGUGCAAGACCCACTT-3'. Las dos secuencias se hibridaron e inyectaron juntas como un ARN bicatenario. En el día 6 después de la cirugía, los ratones se anestesiaron ligeramente con isoflurano y se realizaron inyecciones de ARNsi. La concentración del control y ARNsi fue 0,1 nmol/\mul y se infundió un volumen de 1 \mul por lado usando sistemas de inyección adaptados específicamente (calibre 30, longitud 9 mm). La anestesia para la infusión fue de corta duración y los ratones se despertaron inmediatamente o unos pocos segundos después de la manipulación.
Una vez suministradas al cerebro, las moléculas de ARNsi específicas para P2X7R se absorbieron por las células cerebrales e indujeron específicamente la degradación del ARNm de P2X7R complementario con alta eficacia. Como resultado, la función de P2X7R se inhibió específicamente durante un corto período sin afectar a ninguna otra función cerebral. A este respecto, la inyección de vehículo o ARNsi de control no tuvo como resultado ningún cambio evidente en el comportamiento normal, es decir, la alimentación y la ingesta de agua, o el comportamiento motor en la jaula.
Los efectos de la inhibición de P2X7R sobre el comportamiento de tipo depresivo se evaluaron 24 horas y 48 horas después de la infusión de ARNsi, control o vehículo de acuerdo con el paradigma de ensayo convencional, el ensayo de natación forzada de Porsolt (Porsolt et al., Arch. Int. Pharmacodym. 229 (1977), 327-336; Porsolt, Rev. Neurosci. 11 (2000), 53-58). El parámetro usado para evaluar el comportamiento de tipo depresivo es el tiempo durante el cual el animal está flotando en el agua, un comportamiento que está asociado con el comportamiento de desesperación, ya que el animal no hace ningún esfuerzo por afrontar activamente la situación que le produce estrés. En comparación con la aplicación de vehículo, no se detectó ninguna influencia del ARN bicatenario de control (5'-CAACUUCAUCUUCUACGCGTT-3') sobre el comportamiento de flotación (afrontamiento pasivo del estrés). Por el contrario, en comparación con los controles, los ratones a los que se les había infundido ARNsi específico para P2X7R mostraron un aumento significativo en el comportamiento pasivo, que se considera un comportamiento de tipo depresivo (Figura 14). Esta interpretación se vuelve más evidente cuando se visualizan los efectos de los antidepresivos sobre el comportamiento de afrontamiento pasivo de estrés en el ensayo de natación forzada (Figura 5). El comportamiento de afrontamiento pasivo de estrés aumentó después de una inyección aguda dentro del hipocampo (bilateral, giro dentado) de ARNsi que se dirigía a P2X7R. El ensayo de natación forzada de Porsolt es un ensayo convencional usado para evaluar la eficacia de antidepresivos y en muchos estudios se ha demostrado que el ensayo es sensible selectivamente para estos efectos, dado que se usa el modelo de animal correcto. El paradigma se ha usado ampliamente para ensayar compuestos farmacéuticos y para validar modelos animales de depresión, que muestran un aumento en el comportamiento pasivo como lo hacen los ratones cuando se ha inhibido la proteína P2X7R (ARNsi).
Al final del experimento, los ratones se sacrificaron y los cerebros se examinaron para confirmar la localización y eficacia de las inyecciones de ARNsi. Para este fin, los cerebros se cortaron en secciones y los cortes se tiñeron por inmunohistoquímica usando los protocolos mencionados anteriormente. Se examinaron en paralelo cerebros de ratones a los que se les había inyectado el ARNsi bicatenario específico, con ARN bicatenario de control y con vehículo. En estas condiciones, el ARNsi específico dirigido contra P2X7R inyectado cerca del giro dentado indujo una inhibición media de 80% de la expresión de la proteína P2X7R en comparación con las muestras de ratones a los que se les había inyectado vehículo o ARN bicatenario de control. Tanto el número de células que expresaban P2X7R como la intensidad de la expresión se redujeron fuertemente (Figura 15). Las inyecciones con ARNsi no produjeron ningún signo de inflamación local o infiltración en el hipocampo. De esta manera, la expresión de P2X7R se inhibe específica y localmente por la aplicación de ARNsi in vivo. Esta inhibición produjo cambios de comportamiento que indicaban un papel causante para P2X7R en trastornos afectivos. Estos resultados en combinación con los mencionados anteriormente apoyan y confirman la observación de mutaciones en P2X7R que están asociadas con enfermedades afectivas en seres humanos y que la modulación de la actividad P2X7R tiene efectos antidepresivos.
Ejemplo 8 Ensayo de selección de fármacos
Se establecieron métodos para identificar agonistas de P2X7R usando una línea celular de hipocampo de ratón inmortalizada que expresaba el gen P2X7 endógeno. En resumen, la expresión de P2X7 se confirmó cultivando las células a 37ºC/5% de CO_{2} en DMEM con 10% de suero bovino fetal (Gibco). Después de alcanzar una confluencia de 80%, las células se recogieron en PBS y se homogeneizaron por un pase repetido a través de una jeringa (aguja 18G). La cantidad de proteína total se inhibió por el ensayo de Bradford (Sigma; diluido 1:5, D.O. medida a 595 nm) de acuerdo con la recomendación del fabricante. Después, los homogeneizados de proteína se mezclaron con un volumen igual de tampón de carga (Tris-Cl 50 mM pH 6,8; glicerol al 25%; azul de bromofenol 7,2 mM, SDS al 2%; \beta-mercaptoetanol 200 nM) y posteriormente se desnaturalizaron en agua hirviendo durante 10 minutos. Se cargaron 20 mg de cada muestra en un gel de poliacrilamida al 10% que contenía SDS al 0,4%. Se realizaron electroforesis y transferencia de Western de acuerdo con los protocolos convencionales descritos, por ejemplo, en Sambrook, Rusell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001). Después, las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5% y se incubaron con un anticuerpo contra P2X7R (dilución 1:1000; Santa Cruz Biotech) seguido de incubación con un anticuerpo secundario de caballo anti-cabra acoplado con peroxidasa (dilución 1:10.000; Santa Cruz Biotech). Después, las membranas se incubaron durante 1 hora a 37ºC en Sustrato de Transferencia de Western Lumi-Light (Roche Applied Science) seguido de una exposición de 10 minutos en una Película BioMax MR (Kodak).
Se detectó una banda de 70 kD correspondiente al tamaño esperado de la proteína P2X7R en células HT-22 que demostraba la expresión del gen P2X7 endógeno de ratón (Figura 17). Una segunda línea de células de hipocampo de ratón (HT-39) no expresaba P2X7.
Como P2X7R es un canal iónico de apertura por ATP que permite la entrada de iones de calcio y sodio en las células, se estableció un método para identificar agonistas de P2X7R controlando la entrada de calcio en células HT-22. Las células primero se cargaron con el colorante fluorescente éster AM de verde Oregon (Molecular Probes) durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron dos veces con DMEM/suero bovino fetal al 10% para retirar el exceso de colorante y se cultivaron durante 15 minutos en presencia de una concentración 100 \muM de 2- y 2'-3'-O-(4-benzoilbenzoil)adenosina 5'-trifosfato (BzATP: C_{24}H_{24}N_{5}O_{15}P_{3})). BzATP es un agonista conocido de P2X7R (North y Surprenant, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40 (2000), 563-580). El movimiento de calcio al interior de las células se visualizó con un microscopio de fluorescencia con un filtro de fluoresceína (longitud de onda 492/517 nm). El éster AM de verde Oregon es un colorante fluorescente que se une al calcio intracelular. Por consiguiente, se observó un aumento en la fluorescencia verde en células tratadas con BzATP (Figura 18) que señalizaba una activación de P2X7R que tiene como resultado una entrada de calcio en las células y un aumento de la unión del colorante verde Oregon al calcio intracelular.
Como alternativa, el éster AM de verde Oregon puede reemplazarse por Fluo-3, fluo-4, fluo-5F, fluo-5N, fluo-4FF, Fluo-4 dextrano, Fluo-3 AM, Fluo-4 AM, Fluo-5F AM, Fluo-5N AM y Fluo-4FF AM (Molecular Probes). La entrada de calcio en las células HT-22 también puede medirse en microplacas de 96 pocillos y 384 pocillos usando el Kit de Ensayo Calcium Plus (Molecular Device) o el Kit de Ensayo de Calcio FLIPR ® para Sistemas de Lectura Fluorométrica en Placas de Imágenes (Molecular Device). Las células HT-22 pueden reemplazarse por cualquier célula que exprese P2X7R, incluyendo células que se han modificado genéticamente por la introducción de un gen P2X7 exógeno.
La especificidad del agonista de P2X7R sobre la entrada de calcio se confirmó por pretratamiento de las células HT-22 con ATP Oxidado (oATP; Sigma) 100 mM durante 1 hora antes de la adición de BzATP. oATP es un inhibidor irreversible del receptor (Chen et al., J. Biol. Chem., 268 (1993), 8199-8203). La activación de P2X7R por el agonista se inhibió por oATP (Figura 18) como se ilustra por la ausencia de fluorescencia verde en las células.
Otro método para medir la actividad de P2X7R implica la entrada de bromuro de etidio en células que expresan P2X7R. La activación de P2X7R por un agonista permite la entrada de bromuro de etidio, que se une al ADN nuclear y emite una señal de fluorescencia. Como alternativa, el colorante de propidio YOPRO-1 puede sustituir al bromuro de etidio. Un aumento de fluorescencia puede usarse como medida de activación del receptor de P2X7. Por lo tanto, el ensayo puede usarse para ensayar y cuantificar el efecto de un agente o compuesto con propiedades agonistas sobre P2X7R. En el presente ejemplo, se sembraron 10^{3} células HT-22 por pocillo en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC/5% de CO_{2} en medio DMEM que contenía 10% de FCS hasta que las células se unieron a la superficie de cultivo. Una vez unidas, las células se incubaron durante 60 minutos en medio DMEM que contenía 10% de FCS, bromuro de etidio 10^{-4} M y concentraciones crecientes de BzATP (1 \muM, 10 \muM, 100 \muM, 500 \muM, 1 mM). Después puede contarse el número de células fluorescentes que han integrado el bromuro de etidio al ADN usando un microscopio fluorescente (Zeiss, Alemania). Las concentraciones por encima de BzATP 100 \muM aumentaron el número de activación de señalización de núcleos fluorescentes de P2X7R (Figura 19a). Como alternativa, la fluorescencia de bromuro de etidio puede medirse usando un lector de placas fluorescentes Perkin-Elmer (excitación 520 nm, emisión 595 nm, amplitud de ranura: Ex 15 nm, Em 20 nm). A partir de las lecturas obtenidas, puede calcularse una cifra de pCI50 para cada agente o compuesto candidato. Por consiguiente, un agonista de P2X7R se define como un agente o un compuesto con una CE50 igual o inferior a 300 micromolar, mientras que la expresión CE50 se define como la concentración que induce 50% de la respuesta máxima a un agonista (North y Surprenant, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40 (2000), 563-580). La especificidad de un agonista para P2X7R puede evaluarse por preincubación de las células durante 60 minutos con o-ATP 100 \muM antes de añadir el agonista y el colorante de bromuro de etidio. En estas condiciones, la activación de P2X7R por el agonista se inhibe por oATP, dando como resultado una reducción en el número de células fluorescentes (Figura 19b).
Otro método para identificar agonistas de P2X7R se ideó generando una línea de células de ratón inmortalizada que sobreexpresa el gen P2X7R humano bajo el control de la región promotora/potenciadora temprana del citomegalovirus humano (CMV). El ADNc de P2X7R humano se insertó en el vector pcDNA3.1 (Invitrogen) y se utilizó para transfectar la línea celular de hipocampo de ratón HT-22 usando Lipofectamine (Invitrogen) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Un día después de la transfección, se añadió medio de cultivo que contenía 500 \mug/ml de G418 a las células. Los clones resistentes se aislaron por separado y se cultivaron 14 días después de aplicar el medio de selección.
La actividad agonista de un compuesto se evaluó midiendo la entrada de calcio en las células que sobreexpresan el P2X7R humano. Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC con 5% de CO_{2} en DMEM con 10% de suero bovino fetal (Gibco) hasta que alcanzaron la confluencia. Después, las células se cargaron durante una hora con una concentración 10 \muM de Fluo-4 AM (Molecular Probes). Fluo-4 AM es un colorante fluorescente que se une al calcio intracelular. Después de la carga, las células se lavaron una vez con tampón que contenía CaCl_{2} 0,5 mM y Hepes 20 mM y se trataron con BzATP \muM o tenidap 50 \muM. La actividad agonista se detectó midiendo un aumento en la entrada de calcio que produce un aumento en la unión a Fluo-4 AM y un aumento de fluorescencia. Los cambios en la señal de fluorescencia se miden usando un lector de placas Fluostar Optima (BMG biotech). Tanto BzATP como tenidap produjeron un aumento rápido en la intensidad de fluorescencia que se redujo lentamente a lo largo del tiempo (Figura 19c). De esta manera, los dos compuestos estimularon la actividad de P2X7R, lo cual tiene como resultado una entrada de iones en las células.
Ejemplo 9 La activación de P2X7R con agonistas tiene efectos antidepresivos
Para demostrar que la activación de P2X7R tiene efectos terapéuticos sobre trastornos afectivos, se administró el agonista de P2X7R BzATP (2'-3'-O-(4-benzoilbenzoil)adenosina 5'-trifosfato (C_{24}H_{24}N_{5}O_{15}P_{3})) a una cepa de ratón DBA/2OIa seleccionada que presenta características de una elevada ansiedad, de responder a antidepresivos y de mostrar ansiolisis después de un tratamiento subcrónico con antidepresivos (Lucki et al., Psychopharmacology 155 (2001), 315-322). BzATP es un compuesto con una fuerte especificidad por P2X7R (North y Surprenant. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40 (2000), 563-580). En el presente ejemplo, el agonista de P2X7R se inyectó directamente en el hipocampo de ratones. Sin embargo, también pudo suministrarse un agente o compuesto agonista de P2X7R por vía oral, subcutánea, intravenosa, intraarterial, intranodal, intramedular, intratecal, intraventricular, intranasal, intrabronquial, transdérmica, intrarrectal, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal o intraocular.
En ratones macho de cuatro meses de edad se implantaron bilateralmente cánulas guía (calibre 23, longitud 8 mm) por medio de un instrumento estereotáctico (David Kopf Instruments). Las coordenadas, en relación al bregma, fueron -2,0 mm posterior, \pm1,0 mm lateral y -1,0 mm ventral. Después de la cirugía, se dejó que los ratones se recuperaran durante 10 a 12 días. Después de este período de recuperación, en los ratones se inyectó 1 \mul de solución de vehículo (DMSO al 0,5%, Sigma) o BzATP 50 \muM (Sigma, preparado en DMSO al 0,5%) en cada lado del cerebro durante un período de 60 segundos. Las inyecciones se realizaron usando una aguja de calibre 30 de 9 mm insertada en la cánula guía y conectada a través de un tubo a una jeringa Hamilton de 10 \mul.
El comportamiento de los ratones individuales se evaluó usando el ensayo de natación forzada de Porsolt 24 horas después de la inyección de solución de vehículo o BzATP. Se realizó una pre-exposición de 5 minutos al ensayo 10-15 minutos después de la inyección de vehículo o BzATP. El ensayo de natación forzada es un ensayo convencional que mide reducciones primarias inducidas por estrés en acciones de evasión o escape, denominado desesperanza conductual. El ensayo se usa para determinar la eficacia de antidepresivos, ensayar nuevos compuestos farmacéuticos y validar modelos animales de depresión (Porsolt et al., Arch. Int. Pharmacodym. 229 (1977), 327-336; Porsolt. Rev. Neurosci. 11 (2000), 53-58; Rénéric et al., Behav. Brain Res. 136 (2002), 521-532; Page et al., Psychopharmacology 165 (2003), 194-201; Kelliher et al., Psychoneuroendocrinology 28 (2003), 332-347). El ensayo consiste en poner un ratón durante un período de 5 minutos en un cilindro de vidrio que contiene agua. En estas circunstancias, el ratón no puede tocar el fondo del cilindro y de esta forma se ve forzado a nadar. El tiempo, la latencia y la frecuencia de forcejeos frente a la flotación se evalúan como parámetros del comportamiento. La flotación (es decir, los movimientos realizados únicamente para mantener el equilibrio y la respiración) es un comportamiento pasivo asociado con la desesperanza y representa un síntoma de tipo depresivo ya que el animal no hace ningún esfuerzo por afrontar activamente la situación que le produce estrés. Un aumento del forcejeo (es decir, intentos activos de escapar) indica un comportamiento de afrontamiento activo que podría interpretarse como una mejora de los síntomas de tipo depresivo. Por ejemplo, el tratamiento con antidepresivos serotonérgicos reduce el tiempo total empleado en la flotación (Borsini, Neurosci. Biobehav. Rev. 19 (1995), 377-395; Redrobe y Bourin, Psychopharmacology 138 (1998), 198-206, y, en paralelo, aumenta el tiempo de comportamiento activo (es decir, la natación o el forcejeo; Lucki et al., Psychopharmacology 155 (2001), 315-322).
Se descubrió que el agonista de P2X7R BzATP aumentaba los intentos activos de escape (es decir, un aumento del tiempo y frecuencia de forcejeo, y una reducción en la latencia de forcejeo) mientras que se midió una reducción en el comportamiento pasivo (es decir, reducción en el tiempo y frecuencia de flotación, y aumento en la latencia de flotación) en comparación con los ratones de control a los que se les inyectó solución de vehículo (Figura 20). Los resultados observados se verificaron estadísticamente usando ensayos U de Mann-Whitney y MANOVA de una vía. Las diferencias en el tiempo de forcejeo, latencia de flotación y frecuencia de flotación se consideraron estadísticamente significativas. Aunque la latencia y la frecuencia de forcejeo y los resultados del tiempo de flotación no se soportaron estadísticamente, representaban una tendencia a una mejora en el comportamiento de afrontamiento del estrés. Estos resultados demuestran que un agonista de P2X7R puede producir mejoras en síntomas de tipo depresivo.
Como las conclusiones extraídas del ensayo de natación forzada pueden verse influenciadas por efectos no específicos de un agente o compuesto sobre la actividad animal (es decir, un aumento en el comportamiento de forcejeo puede ser el resultado de hiperactividad en lugar de un aumento del comportamiento de afrontamiento activo), el efecto potencial de BzATP sobre la actividad locomotora se evaluó por el ensayo de campo abierto (Crawley "What's wrong with my mouse: Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice", Wiley-Liss (2000)). Se evaluó la actividad locomotora en ratones tratados con solución de vehículo de control o BzATP 50 \muM 24 horas después de la inyección, poniendo el animal individual en una caja de madera de color gris oscuro (30x30x40 cm). Se controló la actividad locomotora durante un período de 30 minutos usando una videocámara. La distancia total que recorrieron los animales durante el período de ensayo después se analizó por medio de un software informático VideoMot2 (TSE GmbH, Bad Homburg). No se midió ninguna diferencia en la actividad locomotora entre los ratones tratados con solución de vehículo de control y BzATP (Figura 21). Por lo tanto, la aplicación de BzATP no inducía hiperactividad. Estos resultados confirma que la activación de P2X7R por un agente o compuesto agonista produce mejoras en síntomas de tipo depresivo y no es el resultado de un efecto inespecífico sobre la actividad animal per se.
Varios informes sugieren que la activación de P2X7R puede inducir apoptosis y muerte celular in vitro (Di Virgilio et al., Cell Death Differ. 5 (1998), 191-199, Virginio et al., J. Psysiol. 519 (1999), 335-346). Para ensayar si la activación de P2X7R en el hipocampo producía muerte celular, se cuantificaron los niveles de apoptosis en el cerebro de los ratones tratados con BzATP. Los ratones se sacrificaron al final de los experimentos de comportamiento, los cerebros se retiraron, se congelaron inmediatamente y se seccionaron en cortes de 16 \mum. Las secciones cerebrales después se estudiaron con respecto a la apoptosis usando un sistema TUNEL fluorométrico DeadEnd de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Promega Corporation). El sistema TUNEL mide el ADN fragmentado de células apoptóticas. El control positivo del ensayo se realiza por pre-tratamiento de secciones cerebrales durante 10 minutos con 1 unidad/ml de DNAsa I.
Se observaron muy pocas células apoptóticas (es decir, menos de una células por sección cerebral) en cerebros de ratones tratados con vehículo de control o con el agonista de P2X7R (Figura 22) en comparación con las secciones de control positivo pretratadas con DNAsa. Además, no se observó ninguna diferencia significativa en el número de células apoptóticas entre los animales de control y los ratones tratados con BzATP, lo que indica que la activación de P2X7R no daba como resultado muerte celular cerebral in vivo.
Ejemplo 10 Los antagonistas de P2X7R no tienen efectos antidepresivos
Se administraron antagonistas de P2X7R KN-62 (1-(N,O-bis[5-isoquinolinasulfonil]-N-metil-L-tirosil)-4-fenilpiperazina) y ATP oxidado (oATP) a ratones DBA/2O1a (Harlan Winkelmann, Alemania) que presentan las características de comportamiento de una alta ansiedad. Se ha demostrado que KN-62 es un antagonista no competitivo de P2X7R (Chessel et al., Brit. J. Pharmacol., 124 (1998), 1314-1320) mientras que oATP actúa como un inhibidor irreversible de P2X7R (Chen et al., J. Biol. Chem., 268 (1993), 8199-8203).
En el presente ejemplo, los antagonistas de P2X7R se inyectaron directamente en la región del giro dentado del hipocampo. En resumen, a ratones macho de tres meses de edad se les implantó bilateralmente una cánula guía (calibre 23, longitud 8 mm) por medio de un instrumento estereotáctico (David Kopf instruments). Las coordenadas, en relación al bregma, fueron 1,5 mm posterior, \pm1,0 mm lateral y -0,8 mm ventral. Se dejó que los ratones se recuperaran durante 10 a 13 días después de la cirugía. Después de este período de recuperación, a los ratones se les inyectó 1 \mul de solución de vehículo (0,01% de DMSO, Sigma) o KN-62 100 nM (Sigma, preparado en DMSO al 0,01%) u oATP 10 \muM (Sigma, preparado en PBS) en cada lado del cerebro durante un período de 60 segundos. Todas las inyecciones se realizaron usando una aguja de calibre 31 de 9 mm insertada en la cánula guía y conectada a través de un tubo a una jeringa Hamilton de 10 \mul.
El comportamiento de los ratones individuales se evaluó usando un ensayo de natación forzada de Porsolt 24 después de la inyección de solución de vehículo, KN-62 u oATP. Se realizó una pre-exposición de 5 minutos al ensayo 15-17 minutos después de la administración de vehículo, KN-62 u oATP. En el ejemplo 9 se proporciona una descripción del ensayo de natación forzada de Porsolt. En el presente ejemplo, no se midió ningún cambio en los intentos activos de escape (es decir, tiempo, frecuencia o latencia de forcejeo) ni en el comportamiento pasivo (es decir, tiempo, frecuencia o latencia de flotación) entre los ratones tratados con vehículo, KN-62 u oATP (Figura 23). Los resultados observados se verificaron estadísticamente usando un ensayo MANOVA de una vía. Las diferencias observadas en los diferentes parámetros entre los ratones tratados con vehículo, KN-62 u oATP no se confirmaron estadísticamente. Estos resultados demuestran que los antagonistas de P2X7R no mejoran los síntomas de tipo depresivo y no tienen acción antidepresiva.
Como las conclusiones extraídas del ensayo de natación forzada pueden verse influenciadas por efectos no específicos de un agente o compuesto sobre la actividad animal (es decir, el aumento en el comportamiento de forcejeo puede ser el resultado de una hiperactividad en lugar de un mayor comportamiento de afrontamiento activo), se evaluó el efecto potencial del antagonista de P2X7R oATP sobre la actividad locomotora realizando el ensayo de campo abierto. Se evaluó la actividad locomotora en ratones tratados con solución de vehículo de control, oATP 10 \muM u oATP 50 \muM 15 minutos después de la inyección poniendo el animal individual en una caja de madera de color gris oscuro (30x30x40 cm). La actividad locomotora se controló durante un período de 30 minutos usando una videocámara. La distancia total que recorrieron los animales durante el período de ensayo después se analizó por medio de un software informático VideoMot2 (TSE GmbH, Bad Homburg). No se midió ninguna diferencia en la actividad locomotora entre los ratones tratados con solución de vehículo de control y oATP (Figura 24). Por lo tanto, la aplicación de un antagonista de P2X7R no inducía hipo- o hiperactividad en los animales.
<110> NeuroNova AG
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<120> Un método para el diagnóstico y tratamiento de trastornos afectivos
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<130> XXX
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<220>
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<221> exón 1
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<222> (34000)..(3124)
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<223>
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<220>
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<221> exón 2
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<222> (24841)..(25009)
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<223>
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<220>
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<221> exón 3
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<222> (26134)..(26202)
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<223>
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<220>
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<221> exón 4
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<222> (13958)..(31030)
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<223>
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<220>
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<222> (32481)..(32577)
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<223>
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<220>
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<220>
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<223>
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<220>
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<223>
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71 
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72
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gtaacctcac tgagaacaga 
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20 
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tttggtaggc gaaggcgggc 
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20 
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ccttgtatgg gctttcgtgc t 
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actgccatat gtactattcc 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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aaatctaccc agccacttag 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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tgcagtggcc cacagcacag 
\hfill
20 
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<213> Homo sapiens 
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tttcccatgt ttgccattta 
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\hfill
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\hfill
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\hfill
20 
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tctctcgccc aggttgagtt 
\hfill
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\hfill
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\hfill
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tgcctggtgt cccatcgagg 
\hfill
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\hfill
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\hfill
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\hfill
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\hfill
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hfill
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caggaggcag ggatcatttg 
\hfill
20 
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<212> ADN
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tccacccgct acgctaaggt 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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tgcgctaagg actttaccta 
\hfill
20 
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<213> Homo sapiens 
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tttacctacc ctacctcgtc 
\hfill
20 
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ccatcactgc tgtcccaaat 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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tcgccttgat gacaagacca 
\hfill
20 
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
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gtaaactctt ccactctgtt 
\hfill
20 
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\vskip0.400000\baselineskip
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accaagacac ggagagattc 
\hfill
20 
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 42
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
taatattaaa tgtaacttta 
\hfill
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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aatattaaac ataactttat 
\hfill
20 
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<213> Homo sapiens 
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ccatctcaac tggaggagct 
\hfill
20 
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\hskip-.1em\dddseqskip
gactttgcca tcctgcccag 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggaggatcc agaaagagtt 
\hfill
20 
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aatcccagca ctttgggagg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aaactgtcc aaaaaaaaaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
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\hskip-.1em\dddseqskip
aactgtcccc caaaaaaaaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgtccccac aaaaaaaaaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
caaggcgggt ggatcactta 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgtaggactt ggcgcttct 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
gagcacgtct cagattcgaa a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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ccatgaggca ggtatgacta ttc 
\hfill
23 
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<210> 55
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcctggatc tcacccatt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgtccagc tttgatatta agc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtccctagt gctagaacca ga 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
attcatccgt cagtggcc 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccatgtgaa ttttctaccg at 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcgttgtgg ttaggatggg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caaggatgct cagggtagta gc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cactaggttt gctgtatcca tttct 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcaactgtgt gagagcttgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcaaccctgg tccagtgtg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caccaagtag ctctcactca taagg 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caataacact tgtgcgagtt aggt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catcttgttg ccttggaaac c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgagtggta atcctgctac tgc 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggcccactc ctgtactcg 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaagtcaca gcatgaggc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acccagcgac gtatccac 
\hfill
18 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagcatgggg ttccatttc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcataaaagg gactcctgct agta 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttacagaa cacatgcatg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcacctgtag gcacagtgc 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atcaccacct cagagctgtt c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttaacatgg ctactgcagc c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcttagaaag gaggcgactc c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgtgacatt tgcaaggctg cc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tctgaagctc tgctcctgag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcaccttct ggcttccagt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttaccactc ccaggactaa 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtctgcctgt tcactgccat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagagacctt cagaaacttc g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agatcaccag ggacacagtg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcaactcca ctttcctcgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctttcactt ttttggtctc atg 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggagaattc tgaaaatgcc c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaccagagc tctactcttc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
aggtcataga tcgacctgcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
aagaagcgcc aagtcctacg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcaatccaga ctgaagttga c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
actctggtct gcagttggtg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cctttaaaat cagagacctt caga 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gcccatcctc tgaacaccat 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccttggac tcttgctatc g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggcagtacag tggcttcaag a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgggacagt ttgctgtgcc t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagtccttac caatagcagg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtcaaagaat ttgtggccac c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgaactgt cttttaatgt gtaaag 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagatacggt ttcaccatgt tg 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aattagctgg gcatggtgcg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgagatgga gtctgctct g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cactgtccac gtgactgctt 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tcctacttcg gtctggtaag agatt 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggcctaatt ttcgtgcat 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagaacctag aacctgaggg ctt 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgagatggg aggcagctt 
\hfill
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttcggctccc aggacat 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacagagctt tgcaggtgaa 
\hfill
20

Claims (18)

1. Uso de
(i)
una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo consistente en:
(a)
una secuencia de nucleótidos genómica que codifica un canal iónico de apertura por ATP P2X7R y que contiene una mutación en la región 5'UTR que corresponde a las posiciones 532, 1100, 1122, 1171 o 1702 de la secuencia genómica del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 1, donde en dicha posición dicho nucleótido se reemplaza por otro nucleótido;
(b)
una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de canal iónico de apertura por ATP P2X7R, donde en el exón indicado en la columna "Exón" de la siguiente Tabla A, el resto aminoacídico indicado en la columna "Resto aminoacídico" de la Tabla A que corresponde a la posición indicada en la columna "Posición en tipo silvestre" de la Tabla A de la secuencia de aminoácidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4 se reemplaza por otro resto aminoacídico.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA A
103 
\vskip1.000000\baselineskip
(c)
una secuencia de nucleótidos que codifica un canal iónico de apertura por ATP P2X7R y que contiene una mutación en el exón 5 u 8 que corresponde a la posición 32548 o la posición 37633 de la secuencia de nucleótidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 1, donde en dicha posición dicho nucleótido se reemplaza por otro nucleótido;
(d)
una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un canal iónico de apertura por ATP P2X7R, donde se delecionan los aminoácidos correspondientes a las posiciones 488 a 494 del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representado en la SEC ID Nº: 3 ó 4;
(e)
una secuencia de nucleótidos genómica que codifica un canal iónico de apertura por ATP P2X7R, donde en el intrón indicado en la columna "Intrón" de la siguiente Tabla B, el nucleótido indicado en la columna "Nucleótido reemplazado" de la Tabla B que corresponde a la posición indicada en la columna "Posición en tipo silvestre" de la Tabla B de la secuencia de nucleótidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 1 se reemplaza por otro nucleótido.
TABLA B
104 
\vskip1.000000\baselineskip
(f)
una secuencia de nucleótidos genómica que codifica un canal iónico de apertura por ATP P2X7R y que contiene una mutación en la región 3'UTR que corresponde a la posición 54925, 55169, 55170, 55171 ó 55917 de la secuencia de nucleótidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 1, donde en dicha posición, dicho nucleótido se reemplaza por otro nucleótido;
(g)
una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 20 ó 21 nucleótidos y que comprende las mutaciones o deleciones definidas en una cualquiera de (a) a (f);
(h)
una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos como la mostrada en una cualquiera de las SEC ID Nº: 13 a 51;
(j)
una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEC ID Nº: 5 a 12;
(k)
una secuencia de nucleótidos que hibrida con una secuencia de nucleótidos definida en una cualquiera de (a) a (g) o con la secuencia de nucleótidos de (h) que tiene una mutación como la definida en una cualquiera de (a) a (f);
(l)
una secuencia de ácido nucleico que está degenerada como resultado del código genético con respecto a la secuencia de ácido nucleico definida en (k);
(m)
una secuencia de nucleótidos genómica que tiene un reemplazo o deleción de nucleótidos seleccionados entre la siguiente Tabla C que indica en la columna "Región de P2X7R" la región de la secuencia de nucleótidos genómica de P2X7R en la que se produce el reemplazo o deleción, en la columna "Nucleótido" de la Tabla C el nucleótido que se reemplaza por otro nucleótido o los nucleótidos que se delecionan y en la columna "Posición en tipo silvestre" de la Tabla C la posición correspondiente en la secuencia de nucleótidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representado en la SEC ID Nº: 1.
TABLA C
106
107
108
(ii)
un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de (i);
(iii)
un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de (i)(b) o (i)(d);
(iv)
un anticuerpo dirigido específicamente al polipéptido de (iii);
(v)
un aptámero que se une específicamente a la molécula de ácido nucleico de (i); y/o
(vi)
un cebador o par de cebadores capaces de amplificar específicamente la molécula de ácido nucleico de (i)
para la preparación de una composición de diagnóstico para la detección de un trastorno afectivo.
2. El uso de la reivindicación 1, donde dicha molécula de ácido nucleico procede de ratón, rata o ser humano.
3. El uso de la reivindicación 1 ó 2, donde dicha molécula de ácido nucleico es ADN, ARN, APN o fosforotioatos.
4. El uso de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo reacciona específicamente con un epítopo generado y/o formado por mutación en el canal iónico de apertura por ATP P2X7R, seleccionado entre el grupo consistente en:
(i)
un epítopo presentado específicamente por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un canal iónico de apertura por ATP P2X7R, donde el resto R (Arg), G (Gly), E (Glu), L (Leu), R (Arg), I (Ile) o R (Arg) que corresponde a la posición 117, 150, 186, 191, 270, 568 ó 578 del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representado en la SEC ID Nº: 3 ó 4 se reemplaza por otro resto aminoacídico; y
(ii)
un epítopo presentado específicamente por un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de un canal iónico de apertura por ATP P2X7R, donde se delecionan los aminoácidos correspondientes a las posiciones 488 a 494 del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representado en la SEC ID Nº: 3 ó 4.
5. El uso de la reivindicación 1 ó 4, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
6. El uso de la reivindicación 1, donde dicho cebador o par de cebadores se selecciona entre el grupo consistente en las SEC ID Nº: 52 a 111.
7. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la composición de diagnóstico opcionalmente comprende además medios adecuados para la deleción.
8. Un método in vitro para diagnosticar un trastorno afectivo o la susceptibilidad de padecer un trastorno afectivo, que comprende la etapa de determinar en una muestra obtenida a partir de un individuo si la proteína P2XR7 expresada en las células de dicho individuo está infraexpresada en comparación con el nivel de proteína P2XR7 de un individuo no afectado.
9. Un método in vitro para diagnosticar un trastorno afectivo o la susceptibilidad de padecer a un trastorno afectivo, que comprende la etapa de determinar en una muestra obtenida a partir de un individuo si la secuencia del gen P2X7R o la proteína codificada del mismo comprende una mutación en comparación con la secuencia de P2X7R de tipo silvestre, donde dicha mutación es una mutación como se ha definido en la reivindicación 1.
10. El método de la reivindicación 9, donde la aparición de la mutación en el gen del canal iónico de apertura por ATP P2X7R se determina por PCR o métodos inmunológicos.
11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde dicho trastorno afectivo se selecciona entre el grupo compuesto por depresión mayor, trastorno de ansiedad generalizada y trastorno bipolar.
12. El uso o el método de la reivindicación 11, donde dicha depresión mayor se selecciona entre el grupo compuesto por depresión mayor, distimia, depresión atípica, trastorno disfórico premenstrual y trastorno estacional afectivo.
13. El uso o el método de la reivindicación 11, donde dicho trastorno de ansiedad generalizada se selecciona entre el grupo compuesto por trastorno de pánico, fobias, agorafobia, fobia social, fobia específica, trastorno obsesivo compulsivo, trastorno de estrés postraumático, trastorno de ansiedad de separación, manía, hipomanía y trastorno ciclotímico.
14. El uso o el método de la reivindicación 11, donde dicho trastorno bipolar es trastorno bipolar de tipo I o trastorno bipolar de tipo II.
15. Un método in vitro para diagnosticar un trastorno afectivo en un individuo, que comprende:
(a)
aislar ADN a partir de células obtenidas a partir de un individuo;
(b)
determinar toda o parte de la composición de nucleótidos del gen P2X7R; y
(c)
analizar dicha composición de nucleótidos de P2X7R con respecto a la presencia de uno o más polimorfismos, mutaciones o variaciones alélicas como se han definido en la reivindicación 1.
16. Un método in vitro para diagnosticar un trastorno afectivo de un individuo, que comprende:
(a)
aislar ARN a partir de células obtenidas de un individuo;
(b)
convertir dicho ARN en ADNc;
(c)
determinar toda o parte de la composición de nucleótidos del gen P2X7R; y
(d)
analizar dicha composición de nucleótidos de P2X7R con respecto a la presencia de uno o más polimorfismos, mutaciones o variaciones alélicas como se han definido en la reivindicación 1.
17. Un método in vitro para diagnosticar un trastorno afectivo de un individuo que comprende:
(a)
aislar ARN o proteínas a partir de células obtenidas de un individuo;
(b)
determinar los niveles de ARN o proteína P2X7R; y
(c)
comparar los niveles de ARN o proteína P2X7R con los niveles correspondientes de un individuo normal que no padece un trastorno afectivo, donde una infraexpresión de dicho ARN o proteína P2X7R indica un trastorno afectivo.
18. Una composición de diagnóstico para uso en el diagnóstico de un trastorno afectivo que comprende
(i)
la molécula de ácido definida en la reivindicación 1(i)(a) o 1(i)(c) a 1(i)(m), que preferiblemente procede de ratón, rata o ser humano;
(ii)
una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R, donde en el exón indicado en la columna "Exón" de la siguiente Tabla A, el resto aminoacídico indicado en la columna "Resto aminoacídico" de la Tabla A que corresponde a la posición indicada en la columna "Posición en tipo silvestre" de la Tabla A de la secuencia de aminoácidos del canal iónico de apertura por ATP P2X7R de tipo silvestre representada en la SEC ID Nº: 3 ó 4 se reemplaza por otro resto aminoacídico
TABLA A
109
(iii)
una molécula de ácido nucleico que hibrida con la molécula de ácido nucleico definida en (i) o (ii);
(iii)
un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii);
(iv)
un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico definida en (ii) o en la reivindicación 1(i)(d),
(v)
un anticuerpo dirigido específicamente al polipéptido de (iv) o el anticuerpo definido en la reivindicación 4 ó 5,
(vi)
un aptámero que se une específicamente a la molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii); y/o
(vi)
un cebador o par de cebadores capaces de amplificar específicamente la molécula de ácido nucleico de (i), (ii) o (iii) o el cebador o par de cebadores definidos en la reivindicación 6.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1360203E (pt) 2001-01-17 2009-04-03 Intreat Pty Ltd Anticorpos de receptor p2x7 não funcional para diagnóstico e tratamento de cancros e outros estados
WO2004090097A2 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel human p2x7 splice variant, hbmyp2x7v
US8124730B1 (en) 2004-04-02 2012-02-28 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel human P2X7 splice variant, HBMYP2X7v
RU2410430C2 (ru) * 2004-08-31 2011-01-27 Силентис С.А.У. Способы и композиции для ингибирования экспрессии рецептора p2х7
US20100074884A1 (en) * 2005-05-31 2010-03-25 Duska Scientific Co. Inhibition of neuronal damage
WO2007115095A2 (en) * 2006-03-29 2007-10-11 The Trustees Of Columbia University In The City Ofnew York Systems and methods for using molecular networks in genetic linkage analysis of complex traits
US20070249666A1 (en) * 2006-03-31 2007-10-25 Bratcher Natalie A P2X7 Antagonists to Treat Affective Disorders
WO2008043146A1 (en) * 2006-10-10 2008-04-17 Biosceptre International Limited Antibodies against non functional p2x7 receptor
AU2007306924A1 (en) * 2006-10-10 2008-04-17 Biosceptre International Limited Hybridomas producing antibodies against non functional P2X7 receptor
EP1938801A1 (en) * 2006-12-22 2008-07-02 Biofrontera Bioscience GmbH Nanoemulsion
WO2009019503A2 (en) * 2007-08-03 2009-02-12 Astrazeneca Ab P2x7 antagonists for use in the treatment of mood disorders
US8293491B2 (en) 2007-09-14 2012-10-23 Biosceptre International Limited Purinergic (P2X) receptors in extra-cellular body fluid
CA2737126C (en) * 2007-09-14 2018-05-01 Biosceptre International Limited Novel p2x7 epitopes
CA2700972A1 (en) * 2007-10-04 2009-04-09 Merck Sharp & Dohme Corp. N-substituted oxindoline derivatives as calcium channel blockers
AU2009266430B2 (en) 2008-07-04 2014-08-14 Biosceptre International Limited Anti- P2X7 peptides and epitopes
EP2966090B1 (en) 2009-08-20 2018-10-10 Biosceptre (Aust) Pty Ltd Anti p2x7 receptor antibodies and fragments thereof
WO2011075789A1 (en) 2009-12-24 2011-06-30 Biosceptre International Limited Antibodies to non-functional oligomeric p2x7 receptors
CN106310245A (zh) 2010-09-10 2017-01-11 生物权威(澳大利亚)有限责任公司 陪伴动物治疗
AU2012278921B2 (en) 2011-07-01 2016-11-10 Biosceptre International Limited Combination therapy
WO2014182601A1 (en) 2013-05-08 2014-11-13 Children's Medical Center Corporation A method of preventing and treating type 1 diabetes, allograft rejection and lung fibrosis (by targeting the atp/p2x7r axis)
JP6728657B2 (ja) * 2015-12-04 2020-07-22 東洋紡株式会社 核酸増幅法
WO2017165423A1 (en) * 2016-03-21 2017-09-28 Indiana University Research & Technology Corporation Drugs, pharmacogenomics and biomarkers for active longevity
CN115381950B (zh) * 2022-09-06 2023-08-18 天津医科大学总医院 Rab 35或其下游调控分子在治疗骨折后慢性疼痛中的应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6214581B1 (en) * 1998-01-16 2001-04-10 Abbott Laboratories Nucleic acids encoding a functional human purinoreceptor P2X3 and P2X6, and methods of production and use thereof
WO1999055901A2 (en) * 1998-04-30 1999-11-04 Abbott Laboratories Screening assay for identifying human purinoreceptor ligands
JP2000095695A (ja) * 1998-07-23 2000-04-04 Nippon Koutai Kenkyusho:Kk 精神分裂病治療薬
ATE294577T1 (de) * 1999-02-24 2005-05-15 Univ Cincinnati Verwendung von sulfamat derivaten zur behandlung von impulsiven störungen
US7303867B2 (en) 1999-12-16 2007-12-04 Katayanagi Institute Method for detecting target nucleotide sequences
SE9904652D0 (sv) * 1999-12-17 1999-12-17 Astra Pharma Prod Novel Compounds
AU2001233955A1 (en) * 2000-02-24 2001-09-03 Oxford Glycosciences (Uk) Limited Diagnosis and treatment of bipolar affective disorder
JP2002330787A (ja) * 2000-10-21 2002-11-19 Astrazeneca Ab 化学物質
JP2003135075A (ja) * 2001-11-05 2003-05-13 Research Association For Biotechnology 新規な全長ｃＤＮＡ
WO2003042190A1 (en) * 2001-11-12 2003-05-22 Pfizer Products Inc. N-alkyl-adamantyl derivatives as p2x7-receptor antagonists
PA8557501A1 (es) * 2001-11-12 2003-06-30 Pfizer Prod Inc Benzamida, heteroarilamida y amidas inversas
CA2471562A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-24 King Pharmaceuticals Research And Development, Inc. Tyrosyl derivatives and their use as p2x7 receptor modulators
US20040029841A1 (en) * 2002-04-18 2004-02-12 Renshaw Perry F. Purinergic antagonists for treating depression
US20050037983A1 (en) * 2003-03-11 2005-02-17 Timothy Dinan Compositions and methods for the treatment of depression and other affective disorders
WO2004090097A2 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotide encoding a novel human p2x7 splice variant, hbmyp2x7v
US6759435B1 (en) * 2003-07-03 2004-07-06 A.P. Group Inc. Antidepressant drugs and methods
FR2867784B1 (fr) 2004-03-17 2006-06-09 Commissariat Energie Atomique Aptameres selectionnes a partir de cellules vivantes tumorales et leurs applications

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Publication number Publication date
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US20060110385A1 (en) 2006-05-25

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