PT1469072E - Meios e processos para o diagnóstico e tratamento de distúrbios afectivos - Google Patents

Description

wmm%m wmm i iim ò isxiwòsnco A presente invenção tem por objecto as utilizações de um agonista de P2X7R para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios afectivos.

Até 10 % das pessoas que vão a um médico sofrem de distúrbios afectivos (também conhecidos como distúrbios do comportamento, distúrbios do humor). Apesar disso, a maior parte dos casos ficam por diagnosticar ou são tratados de forma desadequada. Os distúrbios afectivos incluem, entre outros, a depressão, a ansiedade e a doença bipolar. Estas doenças estão bem descritas na literatura; ver, por exemplo, Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders- 4a Edição Texto revisto (DMS-IV-TR), American Psychiatric Press, 2000. A depressão, também conhecida como um distúrbio afectivo bipolar, é caracterizada por uma combinação de sintomas tais como falta de humor, perda de energia, perda de interesse, sentimentos de doença fisica, fraca concentração, apetite alterado, sono alterado e um retardamento das funções físicas e mentais o que tem como resultado um sentimento inexorável de desesperança, sentimento de abandono, de culpa e de ansiedade. Os sub-tipos primários desta doença são a depressão profunda, a distimia (depressão mais branda) e a depressão atípica. Outras formas importantes de depressão são o distúrbio disfórico pré-menstrual e os distúrbios afectivos sazonais. O tratamento actual da depressão consiste em psicoterapia, fârmacos anti-depressivos ou uma combinação de ambos. A maior parte dos fármacos anti-depressivos visam o transporte da serotonina e/ou da norepinefrina dos neuro-transmissores ou a actividade da enzima monoamina oxidase. Esses anti-depressivos incluem: inibidores selectivos da absorção da serotonina (por exemplo, fluoxetina, paroxetina, sertralina, fluvoxamina), anti-depressivos triciclicos (por exemplo, amitriptilina, imipramina, desipramina, nortriptili-na), inibidores de monoamina oxidase (por exemplo, fenelzina, isocarboxazida, tranilcipromina) e anti-depressivos de marca tais como mirtazapina, reboxetina, nefazodona. Contudo, todos os fármacos anti-depressivos existentes têm desvantagens tais como uma latência prolongada até a resposta, elevado grau de não resposta e de efeitos colaterais indesejáveis (Holsboer, Biol. Psychol. 57 47-65). Por isso, existe uma necessidade na comunidade médica de novos fármacos anti-depressivos com um perfil farmacológico melhorado (Baldwin, Hum. Psychopharmacol. Clin. Exp. 16 (2001), S93-S99). Os distúrbios de ansiedade são definidos pelo aparecimento de um estado de excitação excessivo ou inapropriado, caracterizado por sentimentos de apreensão, incerteza ou medo. Classificam-se de acordo com a severidade e a duração dos seus sintomas e caracteristicas afectivas especificas. As categorias incluem: (1) Distúrbio de ansiedade generalizada, (2) distúrbio de pânico, (3) fobias, (4) distúrbios obssessivos-compulsivos, (5) distúrbio de stress pós-traumático e (6) distúrbio da ansiedade da separação. O tratamento padronizado para a maior parte dos distúrbios da ansiedade é uma combinação da terapia cognitiva - comportamental com a medicação anti-depressiva. A medicação adicional inclui benzodiazepinas e buspirona.

O distúrbio bipolar, também conhecido como maníaco-depressivo, é caracterizado por alterações do humor entre períodos de mania (isto é, o humor em alta incluindo euforia exagerada, irritabilidade) e períodos ae depressão. O distúrbio bipolar classifica-se de acordo com a severidade dos sintomas. Os pacientes a quem se diagnostica um distúrbio bipolar do tipo I sofrem de episódios maniacos ou mistos com ou sem depressão profunda. No distúrbio bipolar do tipo II, os pacientes têm episódios de hipomania e episódios de depressão profunda. Com hipomania os sintomas da mania (euforia ou irritabilidade) aparecem sob formas mais suaves e são de duração mais curta. Os fármacos actuais utilizados para tratar os distúrbios bipolares são litio, valproato e lamotrigína, que estimulam a libertação do glutamato do neuro-transmissor. Tal como com os fármacos anti-depressivos, eles levam semanas para se tornarem eficazes e podem resultar em efeitos colaterais indesejáveis, por exemplo, elevados niveis de litio no sangue que podem ser fatais. A evidência convincente sugere que os distúrbios afectivos são doenças biológicas. Contudo, não há ensaios laboratoriais ou outros procedimentos que um médico de clinica geral possa utilizar para fazer um diagnóstico definitivo. Em vez disso, um médico especialista ou um psiquiatra especialmente treinado pode diagnosticar a doença com base num grupo de sintomas que ocorrem em conjunto. Este processo é muitas vezes moroso e laborioso requerendo várias visitas ao médico para construir uma história cuidadosa dos sintomas que os pacientes normalmente experimentam assim como quaisquer sintomas que ele ou ela tenham tido no passado. Por isso, um processo fácil e eficaz para um diagnóstico preciso dos distúrbios afectivos é de elevado interesse para a comunidade médica (Wittchen et al., J. Clin. Psychiatry 62, supl. 26 Í2SMf1 23-28) . A maior parte dos pacientes que sofrem de distúrbios emocionais têm antecedentes familiares e estudos sobre gémeos idênticos sugerem uma forte componente genética, Por exemplo, o mapeamento genético numa população isolada do vale central da Costa Rica sugere uma localização do distúrbio bipolar severo no cromossoma 18q22-q23 (Freimer et al., Nature Genetics 12 (1996), 436-441). Além disso, estudos genéticos da população amish de Old Order sugerem que genes nos cromossomas 6, 13 e 15 podem contribuir para a susceptibilidade para ter o distúrbio afectivo bipolar (Ginns et al., Nature Genetics 12 (1996), 431-435). Recentemente, uma investigação muito alargada sobre o genoma numa população homogénea realizado na região de Saguenay/Lac-St-Jean do Quebec sugere a presença de uma localização principal para o distúrbio bipolar nos cromossomas 12q23-q24 (Morissette et al., Am. J. Med. Genet. (Neuropsychiatr. Genet.) 88 (1999), 567-587) . A susceptibilidade das localizações nos cromossomas 5 e 21 foram também verificadas neste estudo. Outros grupos relataram evidências mínimas para a ligação na região de 12q23 (Kelsoe et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98 (2001), 585-590; Sklar, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3 (2002), 371-413) . Considerando as várias loca-lizações mencionadas nos estudos anteriores (por exemplo, ligações aos cromossomas 5, 6, 12, 13, 15, 18, 21), fica ainda por verificar uma ligação genética definitiva para as doenças emocionais.

Assim, embora tenha sido assumido que vários genes estejam ligados aos distúrbios afectivos, tal como se mencionou aqui antes, contudo, ainda não de mostrou até agora uma correlação clara. Dado que não existe disponível nenhuma medicação nem nenhum diagnóstico bem apropriado ao nível molecular para os distúrbios afectivos, há necessidade de identificar um gene cujas mutações causem o espectro completo dos distúrbios afectivos assim como providenciar medicamentos e processos para o diagnóstico e tratamento de distúrbios afectivos.

Assim, o problema técnico subjacente á presente invenção consiste em providenciar meios e processos para o diagnóstico de distúrbios afectivos. A solução para o referido problema técnico consiste em providenciar os enquadramentos caracterizados nas reivindicações . 0 presente pedido de patente de invenção tem por objectivo uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos seleccionada no grupo que consiste em : uma sequência genómica de nucleótidos que codifica um canal de iões com barreira de ATP, P2X7R e que contém uma mutação na região 5'UTR correspondendo as posições 362, 532, 1100, 1122, 1171 ou 1702 da sequência genómica do canal de iões com barreira de ATP de tipo selvagem P2X7R, conforme descrito na SEQ ID NO: 1, em que a referida posição do referido nucleótido está substituída por outro nucleótido; uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptido que tem uma sequência de aminoácidos do canal de iões com barreira de ATP Ψ2%Ί9.4 em que o exão, conforme indicado na coluna «exão» no quadro A que se segue, o resíduo de aminoácido, conforme indicado na coluna «resíduo de aminoácido» do quadro A correspondem a posição conforme indicado na coluna «posição do tipo selvagem» do quadro A da sequência de aminoácidos do canal de iões com barreira de ATP P2X7R do tipo selvagem, conforme descrito nas SEQ ID NO: 3 ou 4 está substituído por outro resíduo de aminoácido

Quadro A

Exão Resíduo dePosição de tipo!

Exão R (Arg) exão VN ;·'λ (Gli) 1150 exão 6 ΙΕ (Glu) i' 1$ exão 6 !L (Leu) 191 exão 8iR (Arg) 1270 exão '1 (Ile) 568 exão R (Arg) 578 uma sequência de nucleótido que codifica um canal de iões com barreira de ATP P2X7R e que contém uma mutação no exão 5 ou no 8 correspondendo a posição 32548 ou a posição 37633 da sequência de nucleótidos do canal de iões com barreira de ATP do tipo selvagem P2X7R, conforme descrito na SEQ ID N° 1, em que a referida posição do referido necleótido esteja substituída por outro nucleótido; uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipéptido que tenha uma sequência de aminoácidos de um canal de iões com barreira de ATP, P2X7R, em que estão eliminados os aminoácidos que correspondem as posições 488 a 494 do canal de iões com barreira de ATP, P2X7R de tipo selvagem, conforme descrito na SEQ ID N° 3 ou 4; uma sequência genómica de nucleótidos que codifica um canal de iões com barreira de ATP, P2X7R em que, no intrão, conforme indicado na coluna «intrão» do quadro B que se segue, o nucleótido, conforme indicado na coluna «nucleótido substituído» do quadro B, correspondendo a posição conforme indicado na coluna «posição de tipo selvagem» do quadro B da sequência de nucleótidos do canal de iões com barreira de ATP, de tipo selvagem, conforme descrito na SEQ ID N° 1, esta substituído por outro nucleótido

Quadro B ilntrão !SUBSTITUÍDO Posição de tipo selvagem ttirãó 1 Intrão 3 '26308 Intrão 3 G 26422 itcrlc Q Intrão 4 T........ nÀU................................................ Intrão 5 |A 52 783 ΐ G 31 €41 wU ' Ϊ ' ”! ^ imtrÃo 6 Γ \v í* ι·'Λ< ό;·Λ'· À Intrão 7 G 36378 Intrão 7 T 36387 Intrão 7 G 136398 ... }. ... »>? 47214 ' Intrão11 T 47563 Intrão 12 c 54307 Intrão 12 G 54308 uma sequência genómica de nucleótidos que codifica um canal de iões com barreira de ATP, P2X7R e que contém uma mutação na região 3'UTR que corresponde a posição 55169, 55170, 55171, 55917 ou 54925 da sequência de nucleótidos de um canal de iões com barreira de ATP de tipo selvagem, P2X7R conforme descrito na SEQ ID N° 1, em que na referida posição o referido nucleótido está substituído por outro nucleótido; uma sequência de nucleótidos que compreende pelo menos 20 ou 21 nucleótidos e compreendendo as mutações ou as eliminações conforme definido em uma qualquer das (a) a (f)í uma sequência de ácidos nucleicos que compreende uma sequência de nculeótidos conforme se mostra em uma qualquer das SEQ ID NCs: 13 a 51; uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que compreenda sequência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 5 a 12; uma sequência de nucleótidos que híbrida com uma sequência de nucleótidos definida em uma qualquer das (a) a (g) ou com a sequência de nucleótidos de (h) e com uma mutação conforme definido em uma qualquer das (a) a -S: } f Θ uma sequência de ácidos nucleicos degenerada em resultado do código genético com a sequência de ácidos nucleicos ser conforme definido em (j) ;

Verificou-se, surpreendentemente, que as mutações no gene P2X7R que codifica o canal de iões com barreira de ATP, de pode causar todo o espectro de distúrbios afectivos. Identificaram-se seis mutações diferentes na região 5'UTR do gene %ΜΊ·%ϊ sete mutações diferentes nos exões 3, 5, 6, 8 e 13 do gene P2X7R que levam a uma substituição de um aminoácido por um aminoácido correspondente na sequência de tipo selvagem de RAXrR,· descrita nas SEQ ID N°. 3 ou 4 e duas mutações nos exões 5 e 8 do referido gene, respectivamente, que levam a uma substituição de um nucleótido por outro nucleótido, a uma eliminação de nucleótidos no exão 13 do referido gene, dezoito mutações nos intrões 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 e 12 e cinco mutações na região 3'UTR do gene P2X7R que se verificou que eo-segregam com o estado de sofrimento em 41 famílias sem parentesco, afectadas com distúrbios afectivos. & expressão "distúrbio afectivo ou emocional" quando utilizada no contexto da presente invenção, significa que inclui, mas não se limita, a depressão, ansiedade, doença unipolar, doença bipolar do tipo I, doença bipolar do tipo II, mania, distúrbio de um défice da atenção hiperactivo, abuso de substâncias e quaisquer outros distúrbios que afectam o comportamento normal ou o humor de um indivíduo. Cada mutação causa alterações que podem explicar distúrbios afectivos, conforme se mostra nos exemplos que se seguem. P2X7R é um canal de iões com barreira de ATP, que pertence a família dos canais ionotrópicos P2X. Isolou-se primeiro o gene a partir de cérebro de rato (Surprenant et ai., (1996), 272, 735-738; número de acesso do Genbank N12L019256) e em seguida a partir de uma biblioteca de monócitos humanos (Rassendren et al., J. Biol. Chem. 272 (1997), 5482-5486; números de acesso do Genbank N1VL002562, Y09561) em virtude da homologia das suas sequências com outros membros da família P2X. Verificou-se mais tarde que P2X7R correspondia a um receptor de P2Z não identificado, que medeia a acção de permeabiiização de ATP em mastócitos e macrófagos (Dahlqvist and Diamant, Acta Physiol. Scand. 34 (1974), 368-384; Steinberg and Silverstein, J. Biol. Chem. 262 (1987), 3118-3122; Gordon, Biochem. J. 233 (1986), 309-319). 0 P2X7R tem dois domínios que se estendem por membranas hidrofóbicas, um anel extracelular e forma canais iónicos da transmembrana. Os receptores de P2X7 parecem funcionar apenas sob a forma homo-olígomérica e comportam um perfil farmacológico marcadamente diferente de outros homo- ou heterómeros de P2X (North and Surprenant, Annual Rev. Pharmacology Toxicology 40 (2000), 563-580). P2X7R requer níveis em excesso de ATP de 1 mM para atingir a activação, enquanto outros receptores de P2X activam a concentrações de ATP < 100 μΜ (Steinberg et al., J. Biol. Chem. 262 (1987), 8884-8888;

Greenberg et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 10337-10343) 32) . Embora todos os receptores de P2X demonstrem propriedades não selectivas semelhantes ao canal no seguimento da ligação, os canais formados pelo P2X7R podem rapidamente transformar-se em poros, que permitem a passagem de moléculas até 900 Daltons (Virginio et al., J. Physiol. 519 (1999), 335-346). P2X7R está expresso em células hematopoieticas, mastócitos e macrófagos (Surprenant et al., Science 272 (1996), 3118-3122), onde está organizado sob a forma tetramérica ou hexamérica (Kim et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 23262-23267). P2X7R está envolvido, inter alia, na regulação da função imunitária e na resposta inflamatória. A activação de P2X7R por ATP em macrófagos, está associada com a estimulação mitogénica de células T (Baricordi et al., Blood 87 (1996), 682-690), a libertação de citocinas, tais como, interleucina-ΐβ (Griffiths et al., J. Immol. 154 (1995), 2821-2828) e a formação de policariões de macrófagos (Falzoni et al., J. Clin. Invest. 95 (1995), 1207-1216). A estimulação de P2X7R com ATP pode também resultar na morte das células por provocar fluxos massivos de iões pela transmembrana (particularmente, influxos de Ca2+ e Na+ e ef luxos de K+) e a formação de poros não selectivos da membrana do plasma (Di Virgilio et al., Cell Death Differ. 5 (1998), 191-199). No cérebro, pensou-se originalmente que P2X7R estava restrito a microglia (macrófago residente do cérebro) e as células ependimais em vez dos neurónios (Collo et al., Neuropharmacology 36 (1997), 1277-1283), sugerindo um papel de P2X7R na neurodegeneração. Contudo, desde então tem-se encontrado P2X7R em neurónios da retina de ratos (Brandle et al., Brain Research Molecular Brain Res. 62 (1998), 1C6-109) , células ganglionares da parte interior do labirinto do ouvido (Brandle et al., Neuroscience Letters 2?3 (1999), 105-108) e terminais presinápticos de neurónios através do cérebro e da espinal-medula (Deuchards et al., J. Neurosci. 21 (2001), 7143-7152). Estudos subsequentes também sugeriram que P2X7R regula a libertação de neuro-transmissores, tais como, glutamato e GABA nos neurónios do hipocampo (Armstrong et al., J. Neuroscience 22 (2002), 5938-5945, Sperlágh et al., J. Neurochem. 81 (2002), 1196-1211). A organização de P2X7R nas células gliais e nos astrócitos do cérebro parece monomérica (Kim et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 23262-23267) . Vários agonistas e antagonistas de P2X7R já foram identificados. O azul brilhante (Jiang et al., Mol. Phamacol. 58 (2000), 82-88), as isoquinolinas l-[N,0-bis(5-isoquinoli-A<u-.-u4íç-rdI} l···L-1ir031 :L] '·'<1 ''·fenIi.pip-razLnã e N- [1- [N-^éí;ii~p~ S1.) j --2-- i 3--tenÍi--pÍp<vrà£i··· na)-etil]-5-isoquinolino-sulfonamida (Humphreys et al., Mol. Pharmacol., 54 (1998), 22-32), os derivados de adamantano (patentes de invenção WO 99/29660, WO 99/29661, WO 00/61569, WO 01/42194, WO 01/44170, WO 01/44213), compostos de fenilo substituídos (patente de invenção WO 00/71529), os derivados de piperidina e piperazina (patente de invenção WO 01/46200), são antagonistas de P2X7R, enquanto ATP oxidado (ATPo) actua como um inibidor irreversível do receptor (Chen et al., J. Biol. Chem., 268 (1993), 8199-8203). Alguns destes antagonistas estão presentemente a ser avaliados para o tratamento de doenças inflamatórias, imunitárias e cardiovasculares. BzATP 5'-trifosfato de (2'-3'-0-(4-benzoilbenzoil)adenosina (C2211242201523) S actua como agonista de P2X7R (North and Surprenant, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40 (2000), 563-580). A patente de invenção WO 99/55901 descreve um processo para a identificação de compostos que modulam a actividade de um receptor de purina de mamífero seleccionado no grupo que consiste em P2X2, P2X3, P2X4, P2X5, P2X6 e P2X7 e sugere um papel dos referidos receptores de purina na terapia de distúrbios comportamentais, tais como, epilepsia, depressão e envelhecimento associados a doenças degenerativas.

Ratos mutantes a que falta P2X7R são saudáveis, férteis e não demonstram ter fenótipos visíveis. Contudo, ao contrário das suas contrapartes de tipo selvagem, os macrófagos peritoniais activados por LPS a partir de P2X7R-/- de animais falham em gerar interleucina-ΐβ (IL —1β) madura quando estimulados com ATP, o que sugere uma incapacidade dos macrófagos peritoniais para libertar IL-1 em resposta a ATP (Solle et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 125-132). Um estudo detalhado do comportamento de ratos com P2X7R-/- não foi ainda realizado. Em seres humanos, um polimorfismo de Glu-496 até Ala leva a uma perda da função de P2X7 (Gu et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 11135-11142) e está associado com leucemia linfocítica crónica das células B (Thunberg, et al., The Lancet 360 (2002), 1935-1939). Também já foram relatados outros polimorfismos na putativa região promotora de P2X7R e na região de codificação (Li et al., FEBS Lett. 531 (2002), 127-131; patente de invenção europeia EP 1199372). Apesar da abundante literatura respeitante a F2X7R, ainda nunca foi aludido nem sugerido nenhum papel nas doenças afectivas na técnica anterior.

Antes da presente invenção ser descrita em detalhe, deve entender-se que a presente invenção não se limita a uma metodologia particular, protocolos, linhas de células, vecto-res e reagentes aqui descritos, mas que ela pode ter variantes. Também se deve entender que a terminologia aqui utilizada tem por fim uma descrição apenas dos enquadramentos particulares e não pretende limitar o âmbito da presente invenção, que está apenas limitada pelas reivindicações em anexo. A menos que seja definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados que são usuais entre os especialistas na matéria. Preferencialmente, os termos aqui utilizados definem-se conforme descrito em "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H. G. W., Nagel, B. e Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suiça).

Ao longo da presente memória descritiva e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto requeira que se faça de outro modo, a palavra "compreender" e as suas variações, tais como, "compreende" e "compreendendo", deverá ser entendida como implicando a inclusão de um estado, uma etapa, um número ou um grupo de etapas ou de números inteiros, mas não excluindo qualquer número inteiro ou etapa ou grupo de números ou de etapas. Vários documentos serão citados ao longo do texto da presente memória descritiva.

Deve notar-se que, tal como se utiliza aqui e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma" e "o", "aN, incluem também as referências no plural a menos que o contexto claramente indique outra coisa. Assim, por exemplo, a referência a "um reagente" inclui um ou mais desses reagentes diferentes e a referência a "o processo" inclui a referência as etapas equivalentes e aos processos conhecidos pelos especialistas na matéria, que podem ser modificados ou substituídos pelos processos aqui descritos.

Quando utilizada aqui, a expressão "sequência de ácidos nucleicos" significa a sequência de bases que incluem as bases de purina e de pirimidina que são constituídas por moléculas de ácidos nucleicos, em que as referidas bases representam a estrutura primária de uma molécula de acido nucleico. As sequências de ácidos nucleicos incluem ADM (ácido desoxiribonucleico), ADNc (ADN complementar), ADN genómico, ARN (acido ribonucleico), formas sintéticas e polímeros mistos, estruturas helicoidais tanto paralelas (sense) como anti-paralelas (antisense) ou podem conter bases nucleotídicas derivadas ou não naturais, como será facilmente compreendido por um especialista na matéria.

Quando utilizado aqui, o termo "polipéptido" significa um péptido, uma proteína ou um polipéptido que engloba cadeias de aminoácidos de um determinado comprimento, em que os resíduos de aminoácidos estão ligados por ligações peptídicas covalentes. Contudo, os peptidomiméticos dessas proteínas/polipéptidos, em que os aminoácidos e/ou as ligações peptídicas foram substituídos por análogos funcionais, também estão englobados pela presente invenção, assim como, outros dos 20 aminoácidos diferentes codificados pelo gene, tal como, a selenocisteína. Os péptidos, oligopé-ptidos e proteínas podem ser designados por polipéptidos. Os termos polipéptido e proteína são muitas vezes utilizados aqui de forma intermutável. O termo polipéptido também se refere e não exclui modificações do polipéptido, por exemplo, glícosilação, acetilação, fosforilação e similares. Algumas destas modificações estão bem descritas em textos de base e em monografias mais detalhadas, assim como, na volumosa literatura de investigação. 0 termo "posição", quando utilizado aqui, significa a posição de qualquer aminoácido dentro de uma sequência de aminoácidos aqui descrita ou a posição de um nucleótido dentro da sequência de ácidos nucleicos aqui descrita. A expressão "canal de iões com barreira de ATP, P2X7R", de acordo com a presente invenção, significa um polipéptido que pode ser classificado como um membro da família dos receptores ionotrópicos P2X. Também são conhecidos como receptores purinérgicos. Os receptores P2X são canais de iões barrados a ligandcs. 0 ligando para estes receptores pode ser ATP e/ou outros nucleótidos naturais, tais como, ACP, UTP e UDP ou um nucleótido sintético, tal como, 2-metiltio-ATP. Os critérios para a classificação são: (1) uma homologia da sequência que é superior a 39 % em relação à família ou a espécies diferentes; (2) um mecanismo de transdução do sinal que envolve a condutância de iões (Khakh et al., Pharmacol Rev. 253 (2001), 107-18). De acordo com isto, a expressão "canal de iões com barreira de ATP, P2X7R" é intermutável com as expressões "receptor ionotrópico" ou "receptor purinérgico". Preferencialmente, a expressão "canal de iões com barreira de ATP, P2X7R" indica um polipéptido que pode ser classificado como um canal de iões com barreira de ATP, F2JP1Í com base em uma ou mais das características estruturais e/ou funcionais, preferencialmente, as descritas antes. As características estruturais referem-se a certas características estruturais que permitem classificar um polipéptido como sendo uma proteína de P2X7R. Uma dessas características é a sequência de aminoácidos. No contexto da presente invenção, um polipéptido classifica-se como um canal de iões com barreira de ATP, ' '' <·."κ,· se exibir um certo grau de identidade da sequência ao longo do seu próprio comprimento com a sequência de aminoácidos da proteína humana P2X7R descrita nas SEQ ID N°. 3 ou 4. Este grau de identidade da sequência é de pelo menos 40 %, mais preferencialmente, de pelo menos 50 %, ainda mais preferencialmente, de pelo menos 60 %, de pelo menos 70 %, de pelo menos 80 %, de pelo menos 90 % ou de pelo menos 95 %. Prefere-se particularmente que o grau de identidade da sequência seja de pelo menos de 65 %.

Além disso, as características estruturais das proteínas P2X7R são dois domínios que se estendem pelas membranas hidrofóbicas, um anel extracelular que pode ser analisado utilizando o programa TMPRED (Hofmann Bicl. Chem. 347 (1993), 166) ou TMHMM (Krogh J. Mol. Bio. 305 (2001), 567-580).

Adicionalmente, P2X7R pode existir como um simples polipéptido, um dimero, um tetrâmero ou similares.

Assim, no contexto da presente invenção, uma proteína é preferencialmente classificada como uma proteína de P2X7R se tem, pelo menos, uma das características estruturais mencionadas antes. As características funcionais referem-se as propriedades relacionadas com a actividade biológica da proteína de P2X7R. Em particular, P2X7R é um canal de iões com barreira de ATP que permite que os iões de cálcio e de sódio passem da solução extracelular para a solução intracelular e permite que os iões de potássio passem da solução intracelular para a solução extracelular. Além disso, o canal de iões com barreira de ATP, Ρ2ΧΤΕ, toma naturalmente uma forma homo-oligomérica. As características das proteínas receptoras de P2X7R podem ser determinadas como se menciona aqui a seguir. A expressão "canais de iões barrados por ATP, P2X7R" compreende as formas funcionais e não funcionais dos canais de iões barrados por ATP, P2X7R. Um canal de iões com barreira de ATP funcional, P2X7R, é entendido como uma proteína de P2X7R que tem pelo menos uma das características funcionais mencionadas antes, que pode ser medida por processos conhecidos na técnica. Um canal de iões com barreira de ATP, P2X7R, não funcional é uma proteína que pode ser classificada como uma proteína de P2X7R devido as características estruturais conforme descritas antes, mas que perdeu pelo menos uma, preferencialmente, todas as características funcionais de uma proteína de P2X7R, conforme descrito antes. A não funcionalidade da proteína de P2X7R pode ser determinada, por exemplo, medindo se os iões de cálcio e de sódio podem fluir para dentro das células ou se os iões de potássio podem sair das células. Assim, é possível determinar a ocorrência de uma mutação no canal de iões com barreira de ATP, PlXlAç medindo quer o influxo de cálcio e/ou de sódio ou o seu efluxo das células. As células que comportam uma mutação no gene de P2X7R mostram um influxo sí/Od um efluxo de iões alterado em comparação com as células que comportam uma proteína de P2X7R de tipo selvagem. Além disso, há diferentes processos que podem ser utilizados para determinar se P2X7R é funcional ou não funcional, por exemplo, se está alterado. Um desses processos consiste em medir a taxa de incorporação de etídio nas células, induzida por ATP, por exemplo, nas células isoladas de um indivíduo. 0 etídio é incorporado nas células através dos poros de F2K7i.f quando a formação de poros é activada por ATP. As células são então incubadas com ou sem ATP na presença de etídio, depois são analisadas por citometria de fluxo. A fluorescência do etídio é medida e comparada na ausência ou na presença de ATP. Se P2X7R tem uma actividade menor, a fluorescência de etídio induzida por ATP será menor do que nas células de controlo. Esse método foi utilizado para verificar a actividade de P2X7R em linfócitos B e linfócitos T isolados de pacientes com leucemia (Wiley et al., Lancet 359 (2002), 1114-1119). Em resumo, incubaram-se células isoladas em 1 mL de cloreto de potássio tamponado com Hepes, a 37 °C, com agitação contínua. Adicionou-se então o etídio numa concentração de 25 mole/L seguida, 40 segundos mais tarde, da adição de 10 pL de um concentrado de ATP a 100 mmole/L. Analisaram-se as células a 1.000 eventos/s por citometria de fluxo, utilizando um citómetro de fluxo da Coulter Elite (Coulter, Hialeah, FL) com excitação a laser de árgon a 488 nm. Recolheu-se a emissão fluorescente utilizando um filtro de passe longo a 590 nm. A intensidade média linear da fluorescência de canal para cada sub-população barrada ao longo de intervalos sucessivos de 5 s, foi analisada com a utilização do software Win-MDI (Joseph Trotter, versão 2.7) e posta em gráfico em função do tempo. Um outro método para determinar a actividade de P2X7R consiste em medir a entrada de cálcio nas células isoladas incubadas com corantes fluorescentes que emitem apenas depois da ligação ao cálcio. As células são carregadas com o corante e depois a entrada do cálcio tem de ser estimulada. Exemplos desses corantes incluem Fura-2, verde de cálcio, laranja de cálcio, carmesim de cálcio (todos disponíveis na Molecular Probes). Os processos de medição do transporte de cálcio são bem conhecidos na técnica; ver, por exemplo, Takahashi et al., Physiol Rev. 79 (1999), 1089-1125. Além disso, a entrada de cálcio nas células produz alterações no potencial eléctrico da membrana. Estas alterações podem ser medidas por electrofisiologia (aplicação de uma micropipeta a membrana de uma célula para medir as correntes iónicas através dos canais iónicos (designado na literatuta inglesa por "patch clamp" -controlo com penso)) ou utilizando corantes que são sensíveis a alteração da voltagem. Esses processos são bem conhecidos na técnica ver, por exemplo, Gonzalez et al., DDT 4 (1999), 431-439; González e Tsien, Chemistry & Biology 4 (1997), 269— 277; González e Tsien, Biophysical Journal 69 (1995), 1272-1280. Ainda outro método consiste em medir a absorção de 133Ba21. Ba21 é um bom substituinte para Ca21 e, uma vez dentro da célula, não é nem bombeado nem sequestrado pelo transporte das ATPases. A absorção de Ba21 pode ser medida ao longo de 60 s utilizando 133BaC12 (concentração final, 0,2 mM). No minuto 0, uma solução concentrada pré-aquecida de 133Ba21 (0,4 mM e 1 pCi/mL) é adicionada em volumes iguais a células isoladas pré-aquecidas, no seio de KC1 150 mM com HEPES (pH 7,4), a 37 °C. Adiciona-se ATP (1 mM) quer 10 minutos antes ou ao mesmo tempo com o isótopo de 133Ba21. Retiram-se alíquotas de 0,8 mL em diversos momentos entre o segundo 0 e 60 s e misturam-se imediatamente com 0,2 mL de MgC12 50 mM arrefecido com gelo (em meio KCl-HEPES) que tinha sido prevíamente posto em camadas sobre 250 pL de uma mistura de óleos (ftalato de di-n-butilo e ftalato de di-iso-cctilo, 7:3 vol/vol) e depois centrifugou-se a 8.000 g, durante 30 s. Aspiram-se os sobrenadantes e o óleo e faz-se a contagem dos aglomerados de células num contador gama automático Wallac Wizard 3 ou em qualquer outra unidade apropriada de medição de radiações gama.

Verificou-se que mutações de diferentes tipos no gene P2X7R estão ligadas a ocorrência de distúrbios afectivos. O primeiro tipo de mutações refere-se as mutações na região 5'UTR. Exemplos dessas mutações são substituições de nucleótidos simples nas posições que correspondem as posições 362, 532, 1100, 1122, 1171 ou 1702 da sequência genómica do canal de iões barrados por ATP, de tipo selvagem, conforme descrito na SEQ ID N°. 1. A posição que diz respeito as sequências de nucleótidos mencionadas aqui refere-se a sequência mostrada na SEQ ID N°. 1. Esta sequência representa a sequência de ácidos nucleicos do gene que codifica o canal de iões barrado por ATP, P2X7R. E possível, para um especialista na matéria, identificar a posição na sequência genómica que corresponde a uma posição na SEQ ID N°. 1 por meio do alinhamento das sequências. Além disso, as localizações exactas dos exões e dos intrões estão indicadas na SEQ ID N°. la seguir. Além disso, um especialista na matéria é capaz de identificar exões e intrões do gene P2X7R comparando a SEQ ID N°. 1 com a SEQ ID N°. 2 que mostra a sequência do ADNc do gene P2X7R.

Preferencialmente, na posição 362 na região 5'UTR da sequência genómica do gene P2X7R descrita na SEQ ID N°. 1, uma timina (T), está substituída por outro nucleótido, preferencialmente por uma base de purina. Mais preferencialmente, na referida posição, a referida timidina está substituída por uma base de pirimidina. Particularmente preferida e a situação em que a referida timina está substituída por uma citosina (C) .

Na posição 532 na região 5'UTR da sequência genómica do gene P2X7R descrita na SEQ ID N°. 1, uma timina (T) , está preferencialmente substituída por outros nucleótidos, preferencialmente por uma base de pirimidina. Mais preferencialmente, na referida posição, a referida timina está substituída por uma base de purina. Particularmente preferida, é a situação em que a referida timidina está substituída por uma guanina (G).

Os resíduos de adenina (A) nas posições 1.100 e 1.122, respectivamente, na região 5'UTR da sequência genómica do gene P2X7R, estão preferencialmente substituídos por uma base de pirimidina. Mais preferencialmente, a referida adenina está substituída por uma base de purina e é particularmente preferido que a referida adenina esteja substituída por uma guanina (G).

Na posição 1.171 na região 5'UTR da sequência genómica do gene P2X7R descrita na SEQ ID N°. 1, uma citidina (C) está substituída por outros nucleótidos, preferencialmente por uma base de pirimidina. Mais preferencialmente, a referida citidina está substituída por uma base de purina e ainda mais preferencialmente, está substituída por uma guanina (G). A guanina na posição 1.702 na região 5'UTR da sequência genómica do gene P2X7R descrita na SEQ ID N°. 1 está substituída por outro nucleótido, preferencialmente, por uma base de pirimidina. Mais preferencialmente, a referida guanina está substituída por uma base de purina e, particularmente preferido é que esteja substituída por uma base de adenina (A) .

Um segundo tipo de mutação encontrada no gene P2X7R, diz respeito as mutações nos exões que levam a substituições de aminoácidos nas sequências de aminoácidos correspondentes. Trata-se das mutações listadas na alínea (b) , supra. Neste contexto, a expressão "um resíduo de aminoácido, conforme indicado na coluna 'resíduo de aminoácido' do quadro A, corresponde a posição X do canal de iões de tipo selvagem, com barreira de ATP, ¥2^:1 conforme descrito na coluna 'posição de tipo selvagem'" tem o seguinte significado: o resíduo do aminoácido em questão estará localizado na posição X na sequência da SEQ ID N°. 3 ou 4 se a sequência em que o referido resíduo de aminoácido ocorre for comparada e alinhada com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 3 ou 4. A sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID N°. 3 ou 4 é a sequência de aminoácidos do gene P2X7R humano e é utilizada aqui como a sequência de referência. Para se determinar se um resíduo de aminoácido ou um resíduo de nucleótido numa dada sequência de P2X7R corresponde a uma certa posição na sequência de aminoácidos ou na sequência de nucleótidos da SEQ ID N°. 1, 3 ou 4, um especialista na matéria pode utilizar meios e processos bem conhecidos na técnica, por exemplo, alinhamentos quer manuais ou utilizando programas de computador, tais como os que se mencionam a seguir em relação com a definição do termo "hibridação" e com os graus de homologia.

Por exemplo, BLAST 2.0, que significa Basic Local Alignment Search Tool (Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402; Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410), pode ser utilizado para pesquisar alinhamentos locais de sequências. O BLAST produz alinhamentos tanto de sequências de nucleótidos como de aminoácidos para determinar a semelhança das sequências. Por causa da natureza local dos alinhamentos, o BLAST é especialmente Útil na determinação de emparelhamentos exactos ou na identificação de sequências similares. A unidade fundamental do resultado do algoritmo de BLAST é o par de segmentos de elevada pontuação (High-scoring Segment Pair - HSP, na terminologia inglesa). Um HSP consiste em dois fragmentos de sequência de comprimentos arbitrários mas iguais, cujo alinhamento é máximo localmente e para o qual a pontuação do alinhamento corresponde ou excede um limiar de pontuação estabelecido pelo utilizador. A abordagem do BLAST consiste em procurar HSPs entre uma sequência de estudo e uma sequência de uma base de dados, para avaliar o significado estatístico de quaisquer emparelhamentos encontrados e para referir apenas esses emparelhamentos que satisfazem o limiar seleccionado pelo utilizador, com significância. 0 parâmetro E estabelece o limiar significativo sob o ponto de vista estatístico para os emparelhamentos de sequências da base de dados de reporte. E é interpretado como o limite superior da frequência esperada da probabilidade de ocorrência de uma HSP (ou de um conjunto de HSPs) dentro do contexto da pesquisa de toda a base de dados. Quaisquer sequências da base de dados que se emparelhem e que satisfazem E, são referidas como um resultado do programa. Utilizam-se técnicas de computador análogas as da utilização do BLAST (Altschul (1997), loc. cit.; Altschul (1993), loc. cit.; Altschul (1990), loc. cit.) para pesquisar moléculas idênticas ou relacionadas em bases de dados de nucleótidos, tais como, o GenBank ou o EMBL. Esta análise é muito mais rápida do que as hibridações a base de membranas múltiplas. Além disso, a sensibilidade da pesquisa em computador pode ser modificada para determinar se qualquer emparelhamento particular está categorizado como exacto ou semelhante. A base da pesquisa é a pontuação do produto que é definida como: % da identidade da sequência x % da pontuação máxima em BLAST 100 e tem em conta tanto o grau de semelhança entre as duas sequências como o comprimento das sequências que emparelham. Por exemplo, com uma pontuação do produto de 40, o emparelha-mento será exacto com um erro de 1-2 %; e de 70, o emparelha-mento será exacto. Moléculas semelhantes são normalmente identificadas seleccionando as que mostram pontuações do produto entre 15 e 40, embora pontuações mais baixas possam identificar moléculas relacionadas.

Tal como se mencionou antes, o segundo grupo de mutações identificado no gene P2X7R, são mutações nos exões do gene ΙΏίίΙΕί que levam a substituições de aminoácidos, A este respeito, a SEQ ID N°. 2 mostra a sequência de ADNc do gene P2X7R. No exão 3 na posição 117 da sequência de aminoácidos de tipo selvagem de P2X7R correspondente, descrita na SEQ ID N°. 3 ou 4, um residuo de arginina (R) está substituído por outro resíduo de aminoácido, preferencialmente, por um resíduo de aminoácido alifático, ácido ou básico. Mais preferencialmente, por um resíduo de aminoácido aromático, que é particularmente preferido, que seja um triptofano (W). O polipéptido resultante está indicado na SEQ ID N°. 5. No exão 5, na posição 150, na sequência de aminoácidos de tipo selvagem de RSTR, descrita na SEQ ID N°. 3 ou 4, um resíduo de glicina (G) está substituído por outro resíduo de aminoácido, preferencialmente, por um resíduo de aminoácido alifático, aromático ou ácido. Mais preferencialmente, por um resíduo de aminoácido básico, o que é particularmente preferido, é que seja uma arginina (R). O polipéptido resultante está indicado na SEQ ID N°. 6.

Na posição 186, no exão 6, na sequência de aminoácidos de tipo selvagem de P2X7R correspondente, descrita na SEQ ID N°. 3 ou 4, um resíduo de glutamato (E) está substituído por outro resíduo de aminoácido, preferencialmente por um resíduo de aminoácido alifático, aromático ou ácido. Mais preferencialmente, o referido glutamato está substituído por um resíduo de aminoácido básico, sendo particularmente preferido que seja uma lisina (K) . 0 polipéptido resultante está indicado na SEQ ID N°. 7.

No exão 6, na sequência de aminoácidos de tipo selvagem de P2X7R, descrita na SEQ ID N°. 3 ou 4 na posição 191, um resíduo de leucina (L) está substituído por outro resíduo de aminoácido. 0 referido resíduo de aminoácido é, preferencialmente, um resíduo de aminoácido alifático, ácido ou básico. Mais preferencialmente, o referido resíduo de aminoácido é um resíduo de aminoácido aromático, sendo particularmente preferido que seja uma prolina (P). 0 polipéptido resultante está indicado na SEQ ID N°. 8.

No exão 8, na sequência de aminoácidos de tipo selvagem de P2X7R, descrita na SEQ ID N°. 3 ou 4 na posição 270, um resíduo de arginina (R) está substituído por outro resíduo de aminoácido. 0 referido resíduo de aminoácido é preferencialmente um resíduo de aminoácido aromático ácido ou básico. Mais preferencialmente, o referido resíduo de aminoácido é um resíduo de aminoácido alifático, sendo particularmente preferido que seja uma cisteína (C) . O polipéptido resultante está indicado na SEQ ID N°. 9.

Na posição 568, no exão 13, do resíduo de aminoácido de tipo selvagem de descrito na SEQ ID N°. 3 ou 4, um resíduo de isoleucina (I) esta substituído por outro resíduo de aminvácido. Mais preferencialmente, a referida isoleucina está substituída por um resíduo de aminoácido aromático, básico ou ácido. Ainda mais preferido, é que a referida isoleucina esteja substituída por um resíduo de aminoácido alifático, sendo particularmente preferido, que seja uma asparagina (N). 0 polipéptido resultante está indicado na SEQ ID N°. 10.

No exão 13, na posição 578, na sequência de aminoácidos de tipo selvagem de P2X7R, descrita na SEQ ID N°. 3 ou 4, um resíduo de arginina (R) está substituído por outro resíduo de aminoácido. O referido resíduo de aminoácido é, preferencialmente, um resíduo de aminoácido aromático, ácido ou básico. Mais preferencialmente, e um resíduo de aminoácido alifático e é, particularmente preferido, que seja um resíduo de glutamina (Q). O polipéptido resultante está indicado na SEQ ID N°. 12. E provável que as mutações mencionadas antes nos exões do gene ocorram devido a mutações pontuais causadas, por exemplo, por meios químicos e/ou físicos ou por imprecisão do complexo de replicação seguido de uma falha no mecanismo de reparação de uma célula, o que pode resultar numa alteração de um único codão. Os tipos possíveis de mutações pontuais são transições, isto é, a alteração de uma base de purina ou de pirimidina por outra base de purina ou de pirimidina, por exemplo, adenina por guanina ou timidina por citosina ou transversões, isto é, alterações de uma base de purina ou de pirimidina por outra base de pirimidina ou de purina, por exemplo, adenina por timidina ou guanina por citosina. Adicionalmente, uma mutação pontual pode também ser causada pela inserção ou a eliminação de um ou mais nucleótidos.

As mutações levam as substituições dos aminoácidos conforme se mencionou aqui antes e se vai mencionar aqui a seguir e estão indicadas no quadro 1 que se segue. 0 terceiro grupo de mutações do gene KX7R* tem sido identificado como sendo nos exões 5 e 8 do gene i:2X7Rf descrito na SEQ ID N°. 1 e que são silenciosas, isto 6, não levam a alterações de aminoácidos. Em particular, na posição 32.548 no exão 5 da sequência genómica de tipo selvagem do gene FQXIB, descrita na SEQ ID N°. 1, um residuo de citidina está substituído por outro nucleótido. Esse nucleótido é preferencialmente uma base de pirimidina e, particularmente preferido, e que seja uma timina. A troca de residuo de citidina na posição 32.548, no exão 5, do gene P2X7R por outro nucleótido, preferencialmente, não conduz a substituição do aminoácido cisteina por outro residuo de aminoácido.

No exão 8, do gene P2X7R de tipo selvagem, descrito na SEQ ID N°. 1, na posição 37.633, um resíduo de citidina está substituído por outro resíduo de nucleótido. Esse resíduo de nucleótido é preferencialmente uma base de pirimidina e, particularmente preferido, é que seja timina. Devido a esta substituição, o aspartato de aminoácido (D) codificado pelo respectivo codão na posição 37.633, faz com que haja lugar a uma substituição que não seja substituída por outro resíduo de aminoácido. As mutações mencionadas antes nos exões 5 e 8, nas posições 32.548 e 37633, respectivamente, do gene de tipo selvagem á2X7Rf descrito na SEQ ID N°.l, são mutações na terceira posição de um codão de tripleto, isto 6, na base oscilante, que leva as designadas mutações silenciosas. As mutações silenciosas não levam normalmente a uma mudança do aminoácido devido a degenerescência do código genetico, Lsto e, 64 tripletos que codificam todos os 20 aminoácidos de ocorrência natural. Contudo, as referidas mutações silenciosas levam a uma alteração no codão que codifica os seus respectivos aminoácidos, levando assim que o codão gerado de novo possa não coincidir também com a utilização do codão de um organismo. Nomeadamente, o codão gerado de novo não é traduzido pelo ribossoma com a mesma eficiência que o codão "antigo". Isto pode levar a quantidades insuficientes dos polipéptidos correspondentes, o que causa um fenótipo distinto. 0 quarto grupo de mutações no gene P2X7R, descrito aqui antes na alinea (d) é uma eliminação de 7 aminoácidos, correspondentes as posições 488 a 494, da sequência de aminoácidos de tipo selvagem, P2X7R, conforme descrito na SEQ ID N°. 3 ou 4. Assim, o presente pedido de patente de invenção também tem por objecto sequências de ácidos nucleicos que codificam uma proteína de P2X7R, em que os aminoácidos que correspondem as posições 488 a 494 do canal de iões de tipo selvagem com barreira de atp, KIC?!* conforme descrito na SEQ ID N°. 3 ou 4, estão eliminados. Isto significa que um fragmento que engloba as posições 488 a 494 dos aminoácidos da sequência correspondente de aminoácidos de tipo selvagem, descrita na SEQ ID N°. 3 ou 4 está eliminado, o que resulta no encurtamento do polipéptido. Um exemplo desse encurtamento do polipéptido, está descrito na SEQ ID N°. 11. Este tipo de mutação, conforme aqui descrito, codifica preferencialmente um canal de iões não funcional com barreira de ATP, P2X7R. A eliminação de um fragmento que englobe os aminoácidos 488 a 494 da sequência de aminoácidos de tipo selvagem, descrito na SEQ ID N°. 3 ou 4, é o resultado de uma eliminação do exão 13. A proteína resultante, descrita na SEQ ID N°. 11, tem falta dos aminoácidos 488 a 494 da correspondente sequência de aminoácidos de tipo selvagem, descrita na SEQ ID N°. 3 ou 4, tal como a posição 494 do aminoácido do polipéptido, eliminado, descrito na SEQ ID N°. 11, corresponde a posição 502 do aminoácido da sequência de aminoácidos de tipo selvagem, descrita na SEQ ID N°. 3 ou 4. Preferencialmente, a sequência de ácidos nuclei-cos aqui descrita, codifica um polipéptido de P2X7R em que os aminoácidos que correspondem exactamente as posições 488 a 494 da SEQ ID N°. 3 ou 4, estão eliminados. Contudo, também estão compreendidos mutantes em que mais ou menos aminoácidos dentro da sequência de aminoácidos de P2X7R estabelecida nas SEQ ID N°. 3 ou 4 podem ter sido eliminados devido, por exemplo, a um seccionamento atípico ou a uma eliminação de nucleótidos da molécula de ácido nucleico que codifica P2X7R ou devido a processos pós-translacionais errados, desde que o canal de iões barrados a ATP, PSXcft, não seja funcional. Por exemplo, é também possível que outros aminoácidos que precedem a posição 488 dos aminoácidos ou outros aminoácidos que sucedem á posição 494 de aminoácidos, possam ser eliminados ou que estejam eliminados menos aminoácidos. Preferencialmente, pelo menos um, mais preferencialmente, pelo menos dois, ainda mais preferencialmente pelo menos três e, aquilo que é verdadeiramente preferencial, pelo menos cinco resíduos de aminoácidos sejam ainda eliminados a montante da posição correspondente ao resíduo de aminoácidos 488 e/ou a jusante da posição correspondente ao resíduo de aminoácido 494 da SEQ ID N°. 3 ou 4. Contudo, é preferível que não mais do que 20, preferencialmente não mais do que 15, ainda mais preferencialmente não mais do que 10 e, aquilo que é verdadeiramente preferido, não mais do que 7 resíduos de aminoácidos, sejam ainda eliminados a montante da posição correspondente ao resíduo de aminoácidos 488 da SEQ ID N°. 3 ou 4 ou a jusante da posição correspondente ao resíduo de aminoácidos 494 da SEQ ID N°. 3 ou 4.

Outro grupo de mutações (mencionadas na alínea (e), supra) reside nos intrões 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 ou 12 da sequência genómica de tipo selvagem de descrita na SEQ ID N°. 1. As referidas mutações nos referidos intrões são mutações pontuais, conforme se mostrou no quadro B anterior e se mostra no quadro 1 a seguir.

Na respectiva posição indicada na coluna "posição no tipo selvagem" no quadro B ou indicada na coluna "polimorfismo" no quadro 1, ilustra-se a posição do resíduo de nucleótido no respectivo intrão, que está substituído por outro resíduo de nucleótido. De acordo com isto, a expressão "um nucleótido conforme indicado na coluna "intrão"" do quadro B correspondente a posição conforme indicado na coluna "nucleótido substituído" do quadro B, que corresponde a posição conforme indicada na coluna "posição de tipo selvagem" do quadro B, está substituída por outro nucleótido, significa que um resíduo de nucleótido na sequência que codifica t2X?R> estará localizado na posição Y na SEQ ID N°. 1, quando a sequência de P2X7R é comparada e alinhada com a sequência da SEQ ID N°. 1. Se o nucleótido na respectiva posição é uma base de purina, tal como adenina ou guanina, é preferível, que devido a uma transição, seja substituído por outra base de purina. Por exemplo, uma adenina é substituída por uma guanina ou uma guanina e substituída por uma adenina. Se o nucleótido na posição respectiva for uma base de pirimidina, é preferível que, devido a transição, seja substituída por outra base de pirimidina. Por exemplo, a timina é substituída por uma citidina e uma citidina é substituída por uma timina. Í também preferível que, devido a uma transversão, uma base de purina seja substituída por uma base de pirimidina ou vice-versa. Por exemplo, uma adenina é substituída por uma timina e uma guanina é substituída por uma citidina. É particularmente preferível que o referido nucleótido nos intrões 1, 3, 4, 5, 6, 1, 9, 11 ou 12 do gene P2X7R, descrito na SEQ ID N°. 1, seja substituído pelo nucleótido descrito na coluna "polimorfismo" do quadro 1 que se segue.

Um último grupo de mutações que tem sido identificado, tem a ver com as mutações que residem na região 3'UTR do gene P2X7R de tipo selvagem, descrito na SEQ ID N°. 1. As mutações foram encontradas nas posições 54.925, 55.169, 55.170, 55.171 ou 55.917, respectivamente, do gene de tipo selvagem, P2X7R, descrito na SEQ ID N°. 1.

Na posição 54.925 verificou-se que um resíduo de guanina estava substituído por outro nucleótido. Preferencialmente, o referido resíduo de guanina é substituído por uma base de pirimidina, mais preferencialmente, por uma base de purina e, é particularmente preferido, que seja por uma base de adenina.

Na posição 55.169, um resíduo de citidina está substituído por outro nucleótido, preferencialmente, por uma base de pirimidina. Mais preferencialmente, está substituído por uma base de purina e, é particularmente preferido, que esteja substituído por uma base de adenina. Nas posições 55.170 e 55.171 um resíduo de adenina está substituído por outro resíduo de nucleótido, preferencialmente, por uma base de purina. Mais preferencialmente, o referido resíduo de adenina está substituído por uma base de pirimidina e é particularmente preferido que o referido resíduo de adenina esteja substituído por um resíduo de citidina. Também se verificou que na posição 55.917 um resíduo de citidina está substituído por outro nucleótido. Preferencialmente, o referido resíduo de nucleótido é uma base de purina, mais preferencialmente, uma base de pirimidina e, é particularmente preferido que seja uma timina.

Como é evidente do que ficou dito antes, nem todas as mutações identificadas estão localizadas em exões ou conduzem a uma alteração na sequência de aminoácidos. Algumas das mutações, estão localizadas nas regiões ϊ'ΟΙ'Κ., 3'UTR ou nos intrões.

Sabe-se também que os polimorfismos nas regiões do promotor e do melhorador podem afectar a função do gene, por meio da modulação da transcrição, particularmente se estão situados em sitios de reconhecimento para as proteínas de ligação do ADN (Fishman et al., J. Clin. Invest. 102 (1998), 1369-1376). O termo "polimorfismo" que é utilizado aqui, significa uma substituição de um único nucleótido, uma inserção de um nucleótido e uma eliminação de um nucleótido que, no caso da inserção e da eliminação, inclui a inserção ou a eliminação de um ou mais nucleótidos numa posição de um gene e corresponde a alterações nas proteínas expressas. Os polimorfismos na região não traduzida 5' (5'UTR) de genes podem afectar a eficiência com que as proteínas são traduzidas. Um exemplo representativo disto verifica-se no gene c-mic em que uma C-G PNS que cria um sítio de entrada de um ribossoma interno, está associada com a eficiência acrescida da tradução de c-mic e do mieloma (Chappell et al., Oncogene 19 (2000), 4437-4440). Os polimorfismos na região 3'UTR podem afectar a função dos genes por meio da alteração da estrutura secundária do ARN e da eficiência da tradução ou afectando elementos no ARN que ligam proteínas que regulam a degradação do ARN. Os polimorfismos dentro dos intrões podem afectar a função dos genes afectando o seccicnamento do ARN o que resulta em polipéptidos aberrantes. Outra fcrma pela qual os polimorfismos intrónícos podem afectar a função do gene acontece quando eles afectam os elementos reguladores dentro dos intrões. Exemplos são o polimorfismo do sitio de ligação de Spl dentro do intrão 1 do gene C0LIA1 (Mann et a J. Clin. Invest 107 (2001), 899-907) e um polimorfismo de repetição dentro do gene Ra de IL-1 (Keen et al., Bone 23 (1998), 367-371). Outros exemplos entre PNSs intrónicos e a função do gene, estão descritos em Caceres e Komblihtt, Trends Genet. 4 (2002), 186-93. O exemplo 4 na página 52, linha 30 até a página 53, linha 51 do texto, descreve potenciais eventos de seccionamento alternativo e produção de proteínas aberrantes associada com três PNSs descritos no pedido de patente de invenção.

As sequências de ácidos nucleicos descritas aqui antes podem conter pelo menos 56.580 nucleótidos, preferencialmente, pelo menos 10.000 nucleótidos, pelo menos 5.000 nucleótidos, pelo menos 1.000 nucleótidos, pelo menos 500 nucleótidos, pelo menos 100 nucleótidos. Mais preferencialmente, as referidas sequências de ácidos nucleicos compreendem pelo menos 50 nucleótidos e é particularmente preferido que compreendam pelo menos 20 ou 21 nucleótidos compreendendo as mutações ou as eliminações, conforme se descreveu aqui antes. Mais preferencialmente, essa sequência de ácidos nucleicos tem uma sequência conforme descrito em uma qualquer das SEQ ID N°s. 13 a 51.

As sequências de ácidos nucleicos aqui descritas antes, que compreendem mutações em exões que levam a uma substituição da sequência de arninoácidos correspondente dos polipéptidos de tipo selvagem, descritos na SEQ ID N°. 3 ou 4, codificam os polipéptidos mostrados nas SEQ ID N°s: 5 a 10 e 12. Adicionalmente, as sequências de ácidos nucleicos aqui descritas antes, que compreendem uma eliminação, conduzem a um polipéptido truncado em comparação com o polipéptido de comprimento completo do polipéptido de tipo selvagem, rKJR.í mostrados na SEQ ID N°. 3 ou 4, está indicado na SEQ ID N°. 11. A presente invenção tem também por objecto as moléculas de ácidos nucleicos que hibridam com uma das moléculas de ácidos nucleicos descritas antes e que exibem uma mutação conforme foi descrito aqui antes. 0 termo "híbrida", tal como se utiliza aqui, pode dizer respeito a hibridações em condições severas ou não severas.

Se não for especificado, as condições preferencialmente não são severas. As referidas condições de hibridação podem ser estabelecidas de acordo com os protocolos convencionais descritos, por exemplo, em Sambrook, Russell "Molecular

Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), ou Higgins e Hames (Eds.) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985). O conjunto de condições está bem dentro das competências dos técnicos e pode ser determinado de acordo com os protocolos descritos na técnica. Assim, a detecção de sequências apenas hibridadas especificamente, vai requerer normalmente condições de hibridação severas e condições de lavagem, tais como, 0,1 x SSC, SDS a 0,1 %, a 65 "C. As condições de hibridação não severas para a detecção de homólogos ou de sequências não exactamente complementares, podem ser fixadas em 6 x SSC, SDS a 1 %, a 65 "C. Como é bem connecido, o comprimento da sonda e a composição do ácido nucleico a ser determinada, constituem ainda outros parâmetros das condições de hibridação. Note-se que variações nas condições anteriores podem ser realizadas através da inclusão e/ou da substituição de reagentes de bloqueio alternativos utilizados para suprimir condições iniciais nas experiências de hibridação. Os reagentes de bloqueio típicos, incluem o reagente de Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN de esperma de salmão desnaturado e formulações concessionadas disponíveis comercialmente. A inclusão de reagentes de bloqueio específicos pode requerer a modificação das condições de hibridação descritas antes, devido a problemas de compatibilidade. As moléculas dos ácidos nucleicos de hibridação também compreendem fragmentos das moléculas descritas antes. Esses fragmentos podem representar sequências de ácidos nucleicos que codificam para um canal de iões não funcional com barreira de ATP, P2.X7R ou um seu fragmento não funcional e que têm um comprimento de pelo menos 12 nucleótidos, preferencialmente pelo menos 15, mais preferencialmente, pelo menos 18, mais preferencialmente pelo menos 21 nucleótidos, mais preferencialmente pelo menos 30 nucleótidos, ainda mais preferencialmente pelo menos 40 nucleótidos e, o que é preferível, pelo menos 60 nucleótidos. Além disso, as moléculas de ácidos nucleicos que hibridam com qualquer uma das moléculas de ácidos nucleicos mencionadas antes também incluem fragmentos complementares, derivados e variantes alélicas dessas moléculas. Adicionalmente, um complexo de hibridação refere-se a um complexo entre duas sequências de ácidos nucleicos em virtude da formação de ligações de hidrogénio entre as bases G e C complementares e entre as bases A e T complementares; estas ligações de hidrogénio podem ainda ser estabilizadas por meio de interacções de empilhamento de bases. A ligação de hidrogénio das duas sequências complementares de ácidos nucleicos está numa configuração anti-paralela. Um complexo de hibridação pode ser formado em solução (por exemplo, análise de Cot ou de Rot) ou entre uma sequência de ácidos nucleicos presente em solução e outra sequência de ácidos nucleicos imobilizada num suporte sólido (por exemple, membranas, filtros, fragmentos, alfinetes ou lâminas de vidro as quais as células tenham sido fixadas). Os termos complementar ou complementaridade referem-se a ligação natural de polinucleótidos em condições de temperatura e salinidade permissíveis por meio dos pares de bases. Por exemplo, a sequência "A-G-T" liga-se a sequência de complementaridade "T-C-A". A complementaridade entre duas moléculas de estrutura helicoidal simples pode ser "parcial", em que apenas alguns dos ácidos nucleicos se ligam ou pode ser completa quanto existe uma complementaridade total entre as moléculas de estrutura helicoidal simples. 0 grau de complementaridade entre as estruturas helicoidais dos ácidos nucleicos, tem efeitos significativos na eficiência e na força de hibridação entre as estruturas helicoidais dos ácidos nucleicos. Isto é de particular importância nas reacções de amplificação, que dependem da ligação entre as estruturas helicoidais dos ácidos nucleicos. A expressão "sequências de hibridação" refere-se preferencialmente a sequências que exibem uma identidade de sequência de pelo menos 40 %, preferencialmente, de pelo menos 50 %, mais preferencialmente de pelo menos 6 0 %, ainda mais preferencialmente de pelo menos 70 %, particularmente preferido de pelo menos 80 %, mais particularmente preferido de pelo menos 90 %, ainda mais particularmente preferido de pelo menos 95 % e, o mais preferido, de pelo menos 9 7 % de identidade com uma sequência de ácido nucleico conforme descrita antes, codificando uma proteína de P2X7R com uma mutação descrita. Além disso, a expressão "sequências de hibridação" refere-se preferencialmente as sequências que codificam uma proteína de F2K78 com uma identidade de sequência de pelo menos 40 %, preferencialmente de pelo menos 50 %, mais preferencialmente, de pelo menos 60 %, ainda mais preferencialmente de pelo menos ?0 %, particularmente preferido de pelo menos 80 %, mais particularmente preferido de pelo menos 90 %, ainda mais particularmente preferido de pelo menos 95 % e, o mais preferido, de pelo menos 97 % de identidade com uma sequência de aminoácidos de um mutante de P2X7R conforme se descreveu aqui antes. Tal como se utiliza aqui, o termo "idêntico" ou a expressão "percentagem de identidade" no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos, referem-se a duas ou mais sequências ou sub-sequências, que são iguais ou que têm uma percentagem especifica de resíduos de aminoácidos ou de nucleótidos que são iguais (por exemplo, 60 % ou 65 % de identidade, preferencialmente 70-95 % de identidade, mais preferencialmente pelo menos 95 % de identidade), quando comparadas e alinhadas para a correspondência máxima sobre uma janela de comparação ou em relação a uma região designada quando se faz a medição utilizando um algoritmo de comparação de sequências, tal como é conhecido na técnica ou por meio de alinhamento manual e inspecção visual. As sequências que têm, por exemplo, 60 % a 95 % ou ainda uma maior identidade de sequências, são consideradas como sendo praticamente idênticas. Essa definição também se aplica ao complemento de uma sequência de ensaio. Preferencialmente, a identidade descrita existe em relação a uma região que tem de comprimento pelo menos cerca de 15 a 25 aminoácidos ou nucleótidos, mais preferencialmente, em relação a uma região que tem um comprimento de cerca de 50 a 100 aminoácidos ou nucleótidos. Os especialistas na matéria sabem como determinar a percentagem de identidade entre sequências utilizando, por exemplo, algoritmos tais como os que se baseiam no programa de computador CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) ou FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245), tal como é conhecido na técnica. Embora o algoritmo de FASTCB normalmente não considere eliminações ou adições internas nas sequências que não correspondem, isto é, intervalos no seu cálculo, isto pode ser corrigido manualmente para evitar uma sobre-estimativa da percentagem de identidade. O CLUSTALW, contudo, tem em consideração esses intervalos na sequência ao calcular a sua identidade. Também estão disponíveis para os especialistas na matéria os algoritmos BLAST e BLAST 2.0 (Altschul Nucl. Acids Res. 25 (1977), 3389-3402). O programa BLASTN para as sequências de ácidos nucleicos utiliza como matriz uma palavra (W) com o comprimento de 11, uma estimativa (E) de 10, M=5, N=4 e uma comparação de ambas as estruturas helicoidais. Para as sequências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como matriz um comprimento de palavra (W) de 3 e uma estimativa (E) de 10. A matriz de pontuação BLOSUM62 (Henikoff Proc. Natl. Acad. Sei., EUA, 89, (1989), 10915) utiliza alinhamentos (B) de 50, estimativa (E) de 10, M=5, N=4 e uma comparação de ambas as estruturas helicoidais.

Além disso, tal como se descreveu aqui antes, a presente invenção tem por objecto moléculas de ácidos nucleicos cuja sequência está degenerada em comparação com a sequência de uma molécula de hibridação descrita antes. Quando se utiliza aqui, a expressão "estando degenerada em resultado do código genético" significa que, devido a redundância das diferentes sequências de nucleótidos do código genético, codificam para o mesmo aminoácido.

Também tem por objecto as moléculas de ácidos nucleicos que compreendem uma ou mais das mutações ou das eliminações descritas antes.

As moléculas de ácidos nucleicos aqui descritas podem ser derivadas de qualquer organismo codificando os correspondentes canais de iões com barreira de ATP, P2X7R. Por exem-

pio, os canais de iões barrados a ATP, ΡΓΧ" ' : í' foram referidos em vários organismos, por exemplo, no rato (ver, Suprenant (1996), cit. loc. V, murganhos (Genbank, N° . de Acesso AJ 489297), sapo anfíbio xenopus (Genbank, N° . de acesso AJ 345114), galinhas (Genbank, n°. de acesso BM 491404) ou touros do género Bos (Genbank, N°. de acesso AF 083073). Num enquadramento preferido a molécula de ácido nucleico aqui descrita deriva de um vertebrado, preferencialmente de um mamífero, ainda mais preferencialmente a molécula de ácido nucleico deriva de coelhos ou cobaias e, mais preferencialmente, o ácido nucleico deriva de murganhos, ratos ou seres humanos. A molécula de ácido nucleico aplicada aqui descritas podem ser qualquer tipo de ácido nucleico, por exemplo, ADN, ARN ou ANP (ácido nucleico de péptido) . Para os fins da presente invenção, um ácido nucleico de péptido (ANP) é um tipo de poliamida do análogo de ADN e as unidades monoméricas para adenina, guanina, timina e citosina estão disponíveis comercialmente (Perceptive Biosystems). Alguns componentes do ADN, tais como fósforo, Óxidos fosforosos ou derivados de desoxiribose, não estão presentes no ANPs. Tal como descrito por Nielsen et al., Science 254: 1497 (1991); e Egholm et al., Nature 365: 666 (1993), os ANPs ligam-se especificamente e fortemente as estruturas helicoidais complementares de ADN e não são degradados pelas nucleases. De facto, o ANP liga-se mais fortemente ao ADN no que o que acontece com o próprio ADN. Isto deve-se provavelmente ao facto de não haver repulsão electrostática entre as duas estruturas helicoidais e também ao facto de a estrutura da poliamida ser mais flexível. Por causa disto, os duplexes de ANP/ADN ligam-se numa gama mais vasta de condições severas do que os duplexes de ADN/ADN, tornando mais fácil realizar a hibridação de multiduplexes. Podem utilizar-se sondas mais pequenas do que com o ADN devido a forte ligação. Além disso, é mais provável que os desemparelhamentos de bases simples possam ser determinados com a hibridação de ANP/ADN, porque um simples desemparelhamento em 15 mer de ANP/ADN baixa o ponto de fusão (T. sub. m) de 8 °C-20 °C versus 4 °C-16 °C para o duplex de 15 mer de ADN/ADN. Também a ausência de grupos com carga no ANP significa que a hibridação pode ser feita para forças iónicas menores e reduz possíveis interferências por meio de sais durante a análise. 0 ADN pode ser, por exemplo, ADNc. Preferencialmente, o ADN é um ADN genómico. 0 ARN pode ser, por exemplo, ARNm (mensageiro) . A molécula de ácido nucleico pode ser natural, sintética ou semi-sintética ou pode ser um derivado, tal como, um ácido nucleico de péptido (Nielsen, Science 254 (1991), 1497-1500) ou fosforotioatos. Além disso, a molécula de ácido nucleico pode ser uma molécula de ácido nucleico quimérico produzida recombinantemente, compreendendo qualquer molécula de ácido nucleico mencionada antes, quer isolada ou em combinação. A molécula de ácido nucleico descrita antes pode fazer parte de um vector. Esse vector pode ser, por exemplo, um plasmido, cosmido, vírus, vector bacteriófago ou outro, utilizado, por exemplo, convencionalmente, em engenharia genética e pode compreender ainda outros genes, tais como, genes marcadores que permitem a selecção do referido vector numa célula hospedeira apropriada e nas condições apropriadas .

As moléculas de ácido nucleico descritas antes, podem ser inseridas em vários vectores disponíveis comercialmente. Exemplos não limitativos incluem vectores de plasmidos compatíveis com células de mamífero, tais como, pUC, pBluescript (Stratagene), pET (Novagen), pREP (Invitrogen), pCRTopo (Invitrogen), pcADN3 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMCl neo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pUCTag, p!ZD35, pLXIN e pSIR (Clontech) e pIRES-EGFP (Clontech). Os vectores de baculovírus, tais como, pBlueBac, BacPacz Baculovírus Expression System (CLONTECH), e MaxBacTM Baculovírus Expression System, células de insectos e protocolos (Invitrogen), estão disponíveis comercialmente e podem também ser utilizados para produzir proteína activa, com elevados rendimentos sob o ponto de vista biológico. (Ver também, Miller (1993), Curr. Op. Genet. Dev., 3, 9; 0'Reilly, Baculovírus Expression Vectors: A Laboratory Manual, p. 127). Além disso, vectores procarióticos, tais como, pcADN2; e vectores de fungos, tais como, pYes2, são exemplos não limitativos de outros vectores apropriados para serem utilizados na presente invenção. Para as técnicas de modificação de vectores, ver Sambrook e Russel (2001), cit. loc. Os vectores podem conter um ou mais sistemas de replicação e de hereditariedade para a clonagem ou a expressão e um ou mais marcadores para selecção no hospedeiro, por exemplo, resistência a antibióticos e uma ou mais cassetes de expressão. As sequências de codificação inseridas no vector, podem ser sintetizadas por processos padronizados, isoladas a partir de fontes naturais ou preparadas como híbridos. A ligação das sequências de codificação aos elementos reguladores transcricionais (por exemplo, promotores, melho-radores e/ou isoladores) e/ou a outras sequências que codificam aminoácidos, pode ser realizada utilizando processos já estabelecidos.

Além disso, os vectores podem, para além das sequências de ácidos nucleicos descritas antes, compreender elementos de controlo de expressão, permitindo uma expressão própria das regiões de codificação em hospedeiros apropriados. Esses elementos de controlo são conhecidos dos técnicos e podem incluir um promotor, um codão de iniciação da tradução, um sítio de tradução e de inserção ou sítios de entrada de ribossomas internos (SERI) (Owens, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 98 (2001), 1471-1476) para a introdução de uma inserção no vector. Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico da presente invenção está ligada operacionalmente as referidas sequências de controlo de expressão, permitindo a expressão em células eucarióticas ou procarióticas. Neste contexto, são particularmente preferidas as sequências de controlo que permitem a expressão correcta em células de neurónios e/ou células derivadas do tecido dos nervos. Os elementos de controlo que asseguram a expressão em células eucarióticas e procarióticas são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Tal como se mencionou antes, compreendem normalmente sequências reguladoras que asseguram a iniciação da transcrição e eventualmente sinais de poli-A que asseguram a terminação da transcrição e a estabilização do transcripto. Os elementos reguladores adicionais podem incluir melhorado-res transcricionais assim como translacionais e/ou regiões promotoras associadas naturalmente ou heterólogas. Os possíveis elementos reguladores que permitem a expressão em, por exemplo, células hospedeiras de mamíferos, compreendem o promotor CMV-VSH de timidina cinase, SV40, promotor de VSR (vírus do sarcoma de Rous), promotor la do factor de elongação humana, potenciador de VMC, promotor de CaM cinase ou melhorador de SV40. Para a expressão, por exemplo, em tecido nervoso e/ou em células dele derivadas, existem várias sequências reguladoras bem conhecidas na técnica, como a sequência mínima do promotor do neurofilamento humano L (Charron, J. Biol. Chem. 270 (1935), 25739-25745). Para a expressão em células procarióticas, já foi descrito uma multitude de promotores incluindo, por exemplo, o promotor de tac-lac, o lacUVS ou o promotor de trp. Para além dos elementos que são responsáveis pela iniciação da transcrição, esses elementos reguladores podem também compreender sinais de terminação da transcrição, tais como, sítios de SV40-poli- A ou o sítio tk-poli-A, a jusante do polinucleótido. Neste contexto, conhecem-se na técnica os vectores de expressão apropriados, tais como, o vector de expressão de ADNc de Okayama-Berg, pcDVl (Pharmacia), pRc/CMV, pcADNl, pcADN3 (Invitrogene, tal como se utiliza, inter alia, nos exemplos em anexo), pSPORTl (GIBCO BRL) ou pGEMHE (Promega) ou vectores de expressão procarióticos, tais como, lambda gtll.

Um vector de expressão é pelo menos capaz de dirigir a replicação e, preferencialmente, a expressão dos ácidos nucleicos e da proteína tal como descrito antes. As origens de replicação apropriadas incluem, por exemplo, o Col El, o SV40 virai e as origens de replicação M 13. Os promotores apropriados incluem, por exemplo, o promotor de citomegalo-vírus (CMV) , o promotor de lacZ, o promotor de gallO poli-édrico do vírus de poliedrose nuclear, múltiplos de Autographa californica (VPNMAc). As sequências de terminação apropriadas incluem, por exemplo, a hormona de crescimento de bovino, SV40, lacZ e os sinais de poliadenilação poliédrica de VPNMAc. Exemplos de marcadores seleccionáveis incluem os de resistência a neomicina, ampicilina, higromicina e similares. Os vectores especificamente desenhados permitem o transporte de ADN entre células hospedeiras diferentes, tais como, bactérias-fungos ou células de bactérias-animais ou células de bactérias-leveduras ou células de bactérias-invertebrados. Para além das moléculas de ácidos nucleicos descritas antes, o vector pode ainda compreender sequências de ácidos nucleicos, que codificam para os sinais de secreção. Essas sequências são bem conhecidas dos especialistas na matéria. Além disso, consoante o sistema de expressão utilizado, podem adicionar-se, a sequência de codificação das moléculas de ácido nucleico, sequências líder capazes de dirigir o polipéptido expresso para um compartimento celular e essas sequências líder são bem conhecidas na técnica. As sequências líder são adicionadas na fase apropriada com sequências de tradução, iniciação e terminação e, preferencialmente, uma sequência líder capaz de dirigir a secreção da proteína traduzida ou parte dela para, inter alia, a membrana extracelular. Eventualmente, a sequência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão, incluindo um peptido de identificação do terminal C ou N conferindo as característi-cas desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso. Uma vez incorporado o vector no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido nas condições apropriadas para um elevado nível de expressão das sequências de nucleótidos e, se desejado, pode seguir-se a recolha e purificação das proteínas, dos fragmentos antigénicos ou das proteínas de fusão. Obviamente, o vector pode também compreender regiões reguladoras de organismos patogénicos. Além disso, o referido vector pode ser, para além de um vector de expressão, um vector de transferência de genes e/ou um vector para atingir os genes. A terapia de genes, que se baseia na introdução de genes terapêuticos (por exemplo, por meio da vacinação) em células por técnicas ex vivo ou in vivo, é uma das aplicações mais importantes da transferência de genes. Os vectores apropriados, os sistemas de vectores e os processos apropriados para a terapia de genes in vitro ou in vivo, estão descritos na literatura e são conhecidos dos especialistas na matéria; ver, por exemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370— 374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; patente de invenção WO 94/29469; patente de invenção WO 97/00957; Schaper, Current Opinior. in Biotechnology 7 (1996), 635-640 ou Verma, Nature 389 (1997), 239-242 e referências aí citadas. As moléculas de ácidos nucleicos descritas antes e os vectores conforme se descreveu aqui antes, podem ser preparados para introdução directa ou para introdução por via dos lipossomas ou vectores virais (por exemplo, adenovirais, retrovirais) nas células. Adicionalmente, os sistemas de baculovirus ou os sistemas a base do virus vaccinia ou do vírus da floresta de Semliki, podem ser utilizados como sistemas de expressão eucarióticos para as moléculas de ácidos nucleicos aqui descritas. Para além da produção recombinante, os fragmentos das proteínas, as proteínas de fusão ou os fragmentos antigénicos da presente invenção, podem ser produzidos por síntese directa dos péptidos utilizando técnicas em fase sólida (ver, Stewart et al. (1969) Solid Phase Peptide Synthesis; Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149-2154) . As sínteses de proteínas in vitro podem ser realizadas utilizando técnicas manuais ou automáticas. As sínteses automáticas podem ser conseguidas, por exemplo, utilizando um sintetizador de péptidos 431A da Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City CA), de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Podem produzir-se vários fragmentos por síntese química feita separadamente e depois combinam-se, utilizando processos químicos para produzir a molécula de comprimento completo. 0 presente pedido de patente de invenção também tem por objecto um hospedeiro transformado com um vector descrito antes ou com um hospedeiro que compreende a molécula de ácido nucleico descrita antes, 0 referido hospedeiro pode ser produzido por meio da introdução do referido vector ou da referida sequência de nucleótidos nm® célula hospedeira que, após a sua presença na célula, medeia a expressão de uma proteína codificada pela sequência de nucleótidos ou que compreende uma sequência de nucleótidos ou um vector, em que a sequência de nucleótidos o polipéptido codificado é estranho a célula hospedeira. Por "estranho" entende-se que a sequência de nucleótidos e/ou o polipéptido codificado pode ser heterólogo em relação ao hospedeiro, isto é, deriva de uma célula ou de um organismo com antecedentes genómicos diferentes ou é homólogo em relação a célula hospedeira, mas está localizado num ambiente genómico diferente do que ocorre naturalmente com a contraparte da referida sequência de nucleótidos. Isto significa que, se a sequência de nucleótidos é homóloga em relação ao hospedeiro, não está localizada na sua localização natural no genoma do referido hospedeiro, em particular, está rodeada por genes diferentes. Neste caso, a sequência de nucleótidos pode estar quer sob o controlo do seu próprio promotor ou sob o controlo de um promotor heterólogo. A localização da molécula de ácido nucleico ou do vector introduzidos pode ser determinada por um especialista na matéria, utilizando processos bem conhecidos pelos especialistas nesta técnica, por exemplo, transferência de ADN/ADN (Southern Blotting). 0 vector ou a sequência de nucleótidos que está presente no hospedeiro, pode estar ou integrada no genoma do hospedeiro ou pode ser mantida na mesma forma extra-cromossómica. A este respeito, também se deve entender que a sequência de nucleótidos da presente invenção pode ser utilizada para restaurar ou criar um gene mutante por via de uma recombinação homóloga. 0 referido hospedeiro pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. As referidas células procarióti-cas/bacterianas são as que se utilizam normalmente para a clonagem como as de E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens ou Bacillus subtilis. 0 referido hospedeiro eucariótico pode ser uma célula de mamífero, uma célula de anfíbio, uma célula de peixe, uma célula de insecto, uma célula de fungo, uma célula de planta ou uma célula bacteriana (por exemplo, as estirpes ΗΒΊ01, DH5a, XL1 Blue, Y1090 e JM101 de E. coli). Preferem-se as células hospedeiras eucarióticas recombinantes. Exemplos de células hospedeiras eucarióticas incluem, mas não se limitam, a leveduras, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis ou células de Pichia pastoris, linhas de células humanas, de bovino, de suínos, de macacos e com origem em roedores, assim como células de insectos que incluem, mas não se limitam, a células de insectos Spodoptera frugiperda e células de insectos derivadas de Drosophila, assim como, células do peixe zebra. As linhas de células derivadas de espécies de mamíferos apropriadas para serem utilizadas e comercialmente disponíveis incluem, mas não se limitam, a células L, células CV-1, células COS-1 (ATCC CRL 1650), células COS-7 (ATCC CRL 1651), células HeLa (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) e MRC-5 (ATCC CCL 171).

Num enquadramento particularmente preferido, a referida célula de mamífero é uma célula de neurónio e/ou uma célula de cultura semelhante, inter alia, a uma célula HEK 293 (rim embriónico humano), uma célula OHC, HeLa, NIH3T3, BHK, PC12 ou células tronco de neurónios, preferencialmente, derivadas de um mamífero e, mais preferencialmente, de um ser humano. Num outro enquadramento mais preferido, a referida célula anfíbia é um oócito. Num outro enquadramento ainda mais preferido, o referido oócito é um oócito de sapo, sendo particularmente preferido, um oócito de Xenopus laevis.

Preferencialmente, a célula hospedeira descrita aqui é um organismo transgenico não humano. O referido organismo não humano pode ser um mamífero, um anfíbio, um peixe, um insecto, um fungo ou uma planta. Os animais transgénicos não humanos, particularmente preferidos, são as espécies de Drosophila, Caenorhabditis elegans, espécies de Xenopus, peixes zebra, Spodoptera frugiperda, Autographa californica, ratos e murganhos. As plantas transgénicas compreendem, mas não se limitam, a trigo, tabaco, salsa e Arabidopsis. Os fungos transgénicos são também bem conhecidos na técnica e compreendem, inter alia, leveduras, tal como, S. pombe ou S. cerevisae ou Aspergillus, Neurospora ou espécies de Ustilago ou espécies de Pichia. 0 presente pedido de patente de invenção tem por objecto um processo para a produção do polipéptido codificado por uma molécula de ácido nucleico descrita antes, que compreende a cultura/desenvolvimento do hospedeiro descrito antes da presente invenção e o isolamento do polipéptido produzido. Existe na técnica um grande número de processos apropriados para produzir polipéptidos nos hospedeiros apropriados. Se o hospedeiro é um organismo unicelular ou uma célula de mamífero ou uma célula de insecto, um especialista na técnica pode reverter para uma variedade de condições de cultura, que podem ser ainda optimizadas sem uma carga de trabalho desnecessária. Convenientemente, colhe-se a proteína produzida a partir do meio de cultura ou a partir de membranas (biológicas) isoladas por técnicas já estabelecidas. Além disso, o polipéptido produzido pode ser directa-mente isolado da célula hospedeira. A referida célula hospedeira pode fazer parte ou derivar de uma parte de um organismo hospedeiro, por exemplo, a referida célula hospedeira pode fazer parte do SNC de um animal ou da parte colhida de uma planta. Além disso, o polipéptido produzido pode ser isolado a partir de fluidos derivados do respectivo hospedeiro, tal como, sangue, leite ou fluido cérebro-espinal .

Adicionalmente, descrevem-se aqui polipéptidos descritos nas SEQ ID N°s. 5 a 12, que são codificadas pelas euuléoolu» de ácidos nucleicos aqui descritas. Estes polipéptidos, de acordo com isto, podem ser ser produzidos por processos microbiológicos ou por meio de mamíferos transgénicos ou por meio de plantas transgénicas. Alternativamente, estes polipéptidos podem ser produzidod por uma via sintética ou semi-sintética.

Por exemplo, as sínteses químicas, tais como, o processo em fase sólida descrito por Houghton Proc. Natl. Acad. Sei. EUA (82) (1985), 5131-5135, podem ser utilizadas. Outro processo consiste na tradução in vitro do ARNm. Um processo preferido envolve a produção recombinante de proteína em células hospedeiras, tal como se descreveu antes. Por exemplo, as sequências de ácidos nucleotídicos que compreendem toda ou uma porção de qualquer uma das sequências de nucleótidos aqui descritas podem ser sintetizadas por RCP (reacção em cadeia de polimerase), inseridas num vector de expressão e uma célula hospedeira transformada com o vector de expressão. Depois, a célula hospedeira é posta em cultura para produzir o polipéptido desejado, que é isolado e purificado. 0 isolamento e a purificação da proteína pode ser conseguido por qualquer uma das várias técnicas conhecidas; por exemplo, e sem limitação, cromatografia de permuta iónica, cromatografia de filtração em gel e cromatografia de afinidade, cromatografia líquida de elevada resolução (CLER), CLER de fase inversa, electroforese preparativa em gel de disco. Além disso, podem utilizar-se sistemas de tradução isentos de células, para produzir os polipéptidos aqui descritos. Os sistemas de expressão isentos de células apropriados para serem utilizados de acordo com o presente pedido de patente de invenção, incluem lisado de reticulócito de coelho, extracto de germen de trigo, membranas microsso-mais pancreáticas de caninos, extracto de S30 de E. coli e sistemas acoplados de transcrição/tradução, tal como, c sistema TNT (Promega). Estes sistemas permitem a expressão de polipéptidos ou de péptidos recombinantes após a adição de vectores de clonagem, fragmentos de ADN ou sequências de ARN contendo regiões de codificação e elementos promotores apropriados. Tal como se mencionou antes, as técnicas de isolamento/purificação podem requerer a modificação das proteínas utilizando processos convencionais. Por exemplo, pode-se adicionar um marcador de histidina a proteína, para permitir a purificação numa coluna de níquel. Outras modificações podem causar actividades maiores ou menores, permitir níveis de produção de proteína mais elevados ou simplificar a purificação da proteína.

Podem-se utilizar os polipéptidos descritos antes para desenvolver anticorpos especificamente dirigidos a um polipéptido, em que o referido anticorpo reage especifica-mente com um epítopo gerado e/ou formado pela mutação no canal de ião com barreira de ATP, £2x7;Rf seleccionado no grupo que consiste em: um epítopo especificamente apresentado por um

polipéptido, que tem uma sequência de aminoácidos de um canal de iões com barreira de ATP, P2X7R, em que os resíduos R (Arg), G (Gli), E (Glu), L (Leu), R (Arg), I (Ile) ou R (Arg) correspondem as posições 117, 150, 186, 191, 270, 568 ou 578 do canal de iões com barreira de ATP, de tipo selvagem, conforme descrito na SEQ ID N°. 3 ou 4, está substituído por outro resíduo de aminoacido; e um epítopo especificamente representado por um polipéptido, que tem uma sequência de aminoácidos de canal de iões com barreira de ATP, &K7R* em que os aminoácidos correspondendo as posições 488 a 494 do canal de iões com barreira de ASP, de tipo selvagem, R2x'VRf onforme descrito na SEQ ID N°. 3 ou 4, estão eliminados.

No que respeita aos items preferidos das alíneas (i) e (ii), o mesmo aplica-se, tal como se descreveu antes, as moléculas de ácidos nucleicos. 0 termo "especificamente" neste contexto, significa que o anticorpo reage com a proteína mutante de mas não com a proteína P2X7R de tipo selvagem. Preferencialmente, este termo também significa que esse anticorpo não se liga a outras formas mutantes da proteína RiRtíiíq em particular, as descritas aqui. Se o anticorpo reage especificamente tal como se definiu aqui antes, pode ser facilmente ensaiado, inter alia, comparando a reacção do referido anticorpo com um canal de iões com barreira de ATP, de tipo selvagem, P2X7R (ou uma sua sub-unidade ou um seu fragmento), com a reacção do referido anticorpo com um polipéptido mutante de P2X7R da presente invenção. 0 anticorpo pode ser, por exemplo, policlonal ou monoclonal. 0 termo "anticorpo" também compreende os seus derivados ou fragmentos que ainda mantêm a especificidade da ligação. As técnicas para a produção de anticorpos são bem conhecidas na técnica e estão descritas, por exemplo, em Harlow e Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Estes anticorpos podem ser utilizados, por exemplo, para a imuno-precipitação e a imuno-localização dos polipéptidos descritos antes, assim como para a monitorização da presença desses polipéptidos, por exemplo, em organismos recombinantes ou em diagnósticos. Também podem ser utilizados para a identificação de compostos que interagem com as proteínas de acordo descritas antes (tal como se menciona aqui a seguir) . Por exemplo, a ressonância plasmónica da superfície, tal como se utiliza no sistema BIAcore, pode ser utilizada para aumentar a eficiência dos anticorpos de fagos, que se ligam a um epítopo dos polipéptidos (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 ¢1995), 7-13). São possíveis anticorpos quiméricos, de cadeia simples e humanizados, tal como fragmentos de anticorpos, tal como, inter alia, fragmentos de Fab. Os fragmentos de anticorpos ou os seus derivados compreendem ainda fragmentos de F(ab')2, Fv ou scFv; ver, por exemplo, Harlow e Lane, cit. loc.. Conhecem-se vários processos na técnica que podem ser utilizados para a produção desses anticorpos e/ou fragmentos. Assim, os derivados (do anticorpo) podem ser produzidos por meio de produtos miméticos dos péptidos. Além disso, as técnicas descritas para a produção dos anticorpos de cadeia simples (ver, inter alia, a patente de invenção norte-americana U.S. 4.946.778) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples dos polipéptidos aqui descritos. Também se podem utilizar animais transgénicos para expressar anticorpos humanizados dos polipéptidos descritos antes. Mais preferencialmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Para a preparação de anticorpos monoclonais, pode utilizar-se qualquer técnica que providencie anticorpos produzidos por culturas contínuas de linhas de células. Exemplos dessas técnicas incluem a técnica do hibridoma (Kohler e Milstein Nature 256 (1975), 495-497), a técnica do trioma, a técnica do hibridoma das células B humanas (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) e a técnica de EBV-hibridoma (hibridoma por vírus de Epstein-Barr), para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). As técnicas que descrevem a produção de anticorpos de cadeia simples (por exemplo, a patente de invenção norte-americana U.S. 4.946.778), podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples 'contra polipéptidos imunogénícos, tal como se descreveu antes, Itu» disso, podem utilizar-se ratos transgénicos para expressar anticorpos humanizados dirigidos contra os referidos polipéptidos imunogénicos. É particularmente preferido que as estruturas dos anticorpos, assim como dos fragmentos ou dos derivados dos anticorpos sejam capazes de ser expressas numa célula. Isto pode, inter alia, ser conseguido pela injecção directa das moléculas das proteináceas correspondentes ou por injecção de moléculas de ácidos nucleicos que as codificam. Além disso, consideram-se abordagens da terapia de genes. De acordo com isto, a expressão "molécula de anticorpo" diz respeito a moléculas completas de imunoglobulina, assim como a partes dessas moléculas de imunoglobulina. Além disso, o termo também diz respeito, tal como se discutiu antes, a moléculas de anticorpos modificadas e/ou alteradas, tal como, anticorpos quiméricos e humanizados. A expressão também diz respeito a anticorpos monoclonais ou policlonais, assim como a anticorpos gerados de forma recombinante, gerados sintéti-camente/sintetizados. A expressão também diz respeito a anticorpos intactos, assim como, aos fragmentos de anticorpos, tal como, cadeias leves e pesadas separadas, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2. A expressão "molécula de anticorpo" também compreende anticorpos bifuncionais e estruturas de anticorpos como cadeias simples Fvs (scFv) ou proteínas de fusão de anticorpos. Também se considera que o termo "anticorpo" compreende estruturas de anticorpos que podem ser expressas em células, por exemplo, estruturas de anticorpos que podem ser transfectadas e/ou transduzidas por via, inter alia, de vírus ou de vectores. Considera-se, particularmente, que essas estruturas de anticorpos reconhecem especificamente os polipéptidos descritos antes. Considera-se, além disso, que as referidas estruturas de anticorpos sejam utilizadas nas abordagens da terapia de genes. A presente invenção tem também por objecto um aptâmero que se liga especificamente a um poiipéptido descrito antes, em que o referido aptâmero reage com um epítopo desse polipéptido. A presente invenção tem ainda por objecto a um aptâmero dirigido especificamente a uma molécula de ácido nucleico correspondente, tal como descrito antes. Quando utilizado aqui, o termo "aptâmero" significa moléculas de ácido nucleico que se podem ligar as moléculas alvo. A preparação de aptâmeros é bem conhecida na técnica e pode envolver, inter alia, a utilização de bibliotecas combinatórias de ARN para identificar sítios de ligação (Gold, Ann. Rev. Biochem. 64 (1995), 763-797).

Além disso, a presente invenção tem por objecto a utilização de um iniciador ou um par de iniciadores capazes de amplificar especificamente as moléculas de ácido nucleico aqui descritas. 0 termo "iniciador" quando utilizado aqui, significa uma molécula de ácido nucleico de estrutura helicoidal simples, capaz de se enrolar a volta da molécula de ácido nucleico descrita antes e de ser assim capaz de servir como um ponto inicial para a amplificação. 0 referido termo, também compreende oligoribo- ou desoxiribonucleótidos, que são complementares de uma região de uma das estruturas helicoidais de uma molécula de ácido nucleico tal como aqui descrito. Quando utilizada aqui, a expressão "par de iniciadores" significa um par de iniciadores que dizem respeito a uma região complementar de uma molécula de ácido nucleico dirigida na direcção oposta, uma em relação â outra de modo a permitir, por exemplo, a amplificação por reacção em cadeia de polimerase (RCP). 0 termo "amplificação" refere-se a cópia repetida de uma sequência específica de nucleótidos, que resulta num aumento da quantidade da referida sequência de nucleótidos especificada e permite a geração de uma multitude de moléculas de ácido nucleico ou partes delas idênticas ou praticamente idênticas (isto é, pelo menos 95 , mais preferencialmente, pelo menos 98 %, ainda mais preferencialmente, pelo menos 99 % e, o mais preferido, pelo menos 99,5

%, tal como, 99,9 % idênticas). Esses processos estão bem estabelecidos na técnica; ver Sambrook et al. "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2a edição 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor. Incluem a reacção em cadeia de polimerase (RCP) e as suas modificações, a reacção em cadeia de ligase (RCL), para nomear alguns dos processos de amplificação preferidos. Quando utilizado no contexto de iniciadores, o termo "especificamente" significa que apenas as moléculas de ácido nucleico, conforme foram descritas aqui antes, são amplificadas e as moléculas de ácido nucleico que codificam o receptor de tipo selvagem, com barreira de ATP, F2)C7S.t conforme descrito na SEQ ID N°. 1, não são amplificadas. Assim, um iniciador, tal como descrito aqui antes, é preferencialmente um iniciador que se liga a uma região da molécula de ácido nucleico aqui descrita, que é único para esta molécula e que não está presente na sequência de codificação de tipo selvagem de KXcR, isto é, o iniciador liga-se numa região em que ocorre uma das mutações descritas antes. Em ligação com um par de iniciadores aqui descritos, é possível que um dos iniciadores do par seja específico com o significado descrito antes ou que ambos os iniciadores do par sejam específicos. Em ambos os casos, a utilização desse par de iniciadores vai permitir amplificar especificamente um mutante da presente invenção, tal como foi descrito aqui antes, mas não a sequência de codificacão de P2X7R de tipo selvagem. A extremidade de 3'-OH de um iniciador é utilizada por uma polimerase para ser aumentada pela sucessiva incorporação de nucleótidos. 0 iniciador ou o par de iniciadores da presente invenção pode ser utilizado, por exemplo, em experiências de extensão de iniciadores no ARN da matriz, de acordo com processos conhecidos pelos especialistas nesta técnica. Preferencialmente, o iniciador ou o par de iniciadores são utilizados em reacções de amplificação no P-Mi matriz ou no ADN matriz, preferencialmente ADBc ou ADN genómico. As expressões "ADN matriz" ou "ARN matriz" referem-se a moléculas de ADN ou de ARN ou aos seus fragmentos, de qualquer fonte ou a uma composição de nucleótidos que compreende uma sequência alvo de nucleótidos, conforme descrito antes. 0 iniciador ou o par de iniciadores podem também ser utilizados para experiências de hibridação, conforme se sabe da técnica. Preferencialmente, o iniciador ou o par de iniciadores são utilizados em reacções em cadeia de polimerase, para amplificar sequências que correspondem a uma sequência da molécula de ácido nucleico descrito antes. Sabe-se que o comprimento de um iniciador resulta de diferentes parâmetros (Gillam, Gene 8 (1979), 81-97; Innis, PCR Protocols: A guide to methods and applications, Academic Press, San Diego, EUA (1990)). Preferencialmente, o iniciador deve apenas hibridar ou ligar-se a uma região especifica de uma sequência alvo de nucleótidos. O comprimento de um iniciador que, sob o ponto o ponto de vista estatístico, híbrida apenas com uma região de uma sequência alvo de nucleótidos, pode ser calculado pela seguinte fórmula: (1/4)x (em que o símbolo x representa o comprimento do iniciador). Por exemplo, um hepta- ou octanucleótido seria suficiente para se ligar, sob o ponto de vista estatístico, apenas uma vez numa sequência de 37 kb. Contudo, sabe-se que um iniciador que emparelha exactamente com uma estrutura helicoidal matriz complementar, deve ter pelo menos 9 pares de bases de comprimento, doutra forma não se pode gerar nenhuma estrutura helicoidal dupla estável (Goulian, Biochemistry 12 (1973), 2893-2901). Também se considera que se podem utilizar algoritmos com base em computaaores, para desenhar iniciadores capazes de amplificar moléculas de ácidos nucleiccs descritas antes. Preferencialmente, os iniciadores têm pelo menos 10 nucleótidos de comprimento, mais preferencialmente, pelo menos 12 nucleótidos de comprimento, ainda mais preferencialmente, pelo menos 15 nucleótidos de comprimento, particularmente preferido, pelo menos 18 nucleótidos de comprimento, ainda mais particularmente preferido, pelo menos 20 nucleótidos de comprimento e, o que é mais preferencial, pelo menos 25 nucleótidos de comprimento.

Também é possível que o iniciador ou o par de iniciadores esteja marcado. O marcador pode ser, por exemplo, um marcador radioactivo, tal como, 32P, 33P ou 35S. Preferencialmente, o marcador não e um marcador radioactivo, por exemplo, digoxigenina, biotina e corante de fluorescência ou um corante. Preferencialmente, os referidos iniciadores seleccionam-se no grupo que consiste nas SEQ ID N°s. 52 a 111.

Ainda noutro enquadramento, o presente pedido de patente de invenção tem por objecto uma composição que compreende uma molécula de ácido nucleico, um vector, um polipéptido, um anticorpo, um aptâmero e/ou um iniciador ou um par de iniciadores tal como descrito aqui. O termo "composição", tal como se utiliza aqui, está relacionado com composições que compreendem pelo menos uma molécula de ácido nucleico, um vector, um polipéptido, um anticorpo e/ou um iniciador ou um par de iniciadores tal como descrito aqui. Pode eventualmente compreender ainda outras moléculas capazes de alterar as características dos componentes aqui descritos e desse modo, por exemplo, suprimir, bloquear, modular e/ou activar a sua função, a qual tem propriedades neuroprctectoras, nootrópi-cas, antidepressivas e/ou protectoras das células, como será descrito aqui a seguir. M composições podem estar sob a forma sólida, liquida ou gasosa ou podem estar, inter alia, sob a forma de pós, comprimidos, soluções ou aerossóis.

Preferencialmente, a composição é uma composição de diagnóstico, que compreende ainda, eventualmente, meios apropriados para a detecção. Tal como se descreveu antes, verificou-se, surpreendentemente que as mutações na proteína de P2X7R estão ligadas a distúrbios afectivos. Assim, este conhecimento permite agora o diagnóstico de distúrbios afectivos de uma forma fácil. A composição de diagnóstico compreende pelo menos um dos compostos mencionados antes. A composição de diagnóstico pode ser utilizada, inter alia, para processos para a determinação da presença e/ou da expressão dos ácidos nucleicos e/ou dos polipéptidos aqui descritos. Isto pode ser efectuado por meio da detecção, por exemplo, da presença de um gene correspondente no material genético de um indivíduo ou da presença do ARNm correspondente, que compreende o isolamento do ADN ou do ARN de uma célula derivada do referido indivíduo, fazendo contactar o ADN ou o ARN assim obtido com uma sonda de ácido nucleico, conforme descrito antes, em condições de hibridação e detectando a presença de ARNms hibridados com a sonda. Alternativamente, a composição de diagnóstico pode também ser utilizada para a detecção da presença de uma molécula de ácido nucleico aqui descrita, por meio de RCP. Além disso, os polipéptidos aqui descritos podem ser detectados por meio de processos conhecidos na técnica, que compreendem, inter alia, processos imunológicos, tais como, RIA, FIA, ELISA, SCAF ou análise por transferência de anticorpo/proteina (Western blotting). Além disso, a composição de diagnóstico pode ser útil, inter alia, na detecçãc da prevalência, do início ou da progressão de uma doença relacionada com a expressão de um polipéptido descrito antes. De acordo com isto, a composição de diagnóstico pode ser utilizada, inter alia, para avaliar a prevalência, o início e/ou o estado da doença dos distúrbios afectivos, conforme se definia aqui antes. Também está no âmbito da presente invenção, que a composição de diagnóstico da presente invenção possa ser útil na discriminação de estados de uma doença. A composição de diagnóstico compreende, eventualmente, meios apropriados para a detecção. As moléculas de ácido nucleico, vectores, hospedeiros, anticorpos, aptâmeros, polipéptidos descritos antes são, por exemplo, apropriados para serem utilizados em imuno-ensaios, em que podem ser utilizados na fase liquida ou ligados a um veiculo em fase sólida. Exemplos de veículos bem conhecidos incluem vidro, poliestireno, iões de polivinilo, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextrano, nylon, amiloses, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetite. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel. Os veículos em fase sólida são conhecidos dos especialistas na técnica e podem compreender pérolas de poliestireno, pérolas de látex, pérolas magnéticas, partículas coloidais de metais, pedaços de vidro e/ou de sílica e superfícies, tiras de nitrocelulose, membranas, folhas, duracitos e as paredes das cavidades de um tabuleiro de reacção, tubos de plástico ou outros tubos de ensaio. Os processos apropriados de imobilização de moléculas de ácidos nucleicos, vectores, hospedeiros, anticorpos, aptâmeros, polipéptidos, etc. em fases sólidas, incluem, mas não se limitam, a interacções iónicas, hidrofóbicas, covalentes ou reticulações (químicas) e similares. Exemplos de imuno-ensaios que podem utilizar os referidos compostos aqui descritos, são imuno-ensaios concorrentes e não concorrentes, num formato directo ou indirecto. Os ensaios de detecção normalmente utilizados podem compreender processos radioisotópicos ou não radio-isotópicos. Exemplos desses imuno-ensaios são o radio-imuno-ensaio (RIA) , ·:: ensaio de sandwich (ensaio imunométrico) e o ensaio de transferência de ADN/ARNm (Northern) ou transferência de ADN/ADN (Southern) . JOésa disso, estes processos de detecção compreendem, inter alia, ensaios imuno-radio-imunometricos (EIRI), ensaios de imuno-enzimas (EIE), ensaios imunitários ligados a enzimas (ELISA), ensaios imuno-fluorescentes (EIF) e ensaios imuno-quimioluminiscentes (EIQL). Além disso, os compostos de diagnóstico podem ser utilizados em técnicas como ensaios de transferência de energia por ressonância de fluorescência (TERF). Os marcadores e os processos apropriados para a marcação são conhecidos dos especialistas nesta técnica. Exemplos dos tipos de marcadores que podem ser utilizados na presente invenção incluem, inter alia, fluorocrómios (tal como, fluoresceina, rodamina, vermelho do Texas, etc.), enzimas (tal como, peroxidase de rábano, β-galactosidase, fosfatase alcalina), isótopos radioactivos (tal como, 32P, 33P, 35S ou 1251), biotina, digoxigenina, metais coloidais, compostos quimio- ou bioluminescentes (tal como, dioxetanos, luminol ou acridinimos).

Está disponível uma variedade de técnicas para biomoléculas de marcação, que são bem conhecidas dos especialistas na técnica e que compreendem, inter alia, o acoplamento covalente de enzimas ou de grupos de biotinilo, a fosforilações, as biotinilações, a iniciação aleatória, as traduções cortadas, o entalhamento (utilizando transferases terminais). Estas técnicas estão descritas, por exemplo, em Tijssen, "Practice and theory of enzyme immunoassays", Burden e von Knippenburg (Eds), Volume 15 (1985); "Basic methods in molecular biology", Davis L. G., Dibmer M. D., Battey Elsevier (1990); Mayer, (Eds) "Immunochemical methods in cell and molecular biology" Academic Press, London (1987) ; ou nas séries "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc. Os processos de detecção compreendem, mas não se limitam, a autoradiografia, microscopia de fluorescência, reacçoes enzimáticas directas e indirectas, etc. A referida composição de diagnóstico pode ser utilizada para processos, para a detecção da presença e/ou da abundância de uma molécula de ácido nucleico descrita antes, numa amostra biológica e/ou medica e/ou para a detecção da expressão dessa molécula de ácido nucleico (por exemplo, por determinação do ARNm ou do polipéptido expresso) . Além disso, a referida composição de diagnóstico pode também ser utilizada nos processos descritos aqui, inter alia, para a detecção de antagonistas ou agonistas específicos, para os canais de iões com barreira de ATP de P2X7R (ver aqui a seguir). A presente invenção tem por objecto um processo de diagnóstico de distúrbios afectivos ou de uma susceptibili-dade para um distúrbio afectivo, que compreende a etapa de determinação, numa amostra obtida num indivíduo, se a proteína de P2X7R expressa nas células do referido indivíduo está sub-expressa em comparação com o nível de proteína de P2X7R de um indivíduo não afectado. A expressão "sobre- ou sub-expresso em comparação com nível de proteína de P2X7R" no contexto da presente invenção, significa que o nível de proteína de P2X7R é mais elevado ou mais baixo do que o nível de P2X7R de um indivíduo saudável, isto é, um indivíduo não afectado por um distúrbio afectivo. A sobre-expressão pode resultar, por exemplo, de um aumento da quantidade de ARNm de P2X7R causada por taxas maiores de transcrição, devidas a uma actividade acrescida da ARN-polimerase II. A quantidade de ARNm pode, de acordo com isto, levar a uma tradução acrescida e, assim a um nível de proteína de P2X7R mais elevado. Pode também ser possível que uma quantidade mais elevada da proteína de P2X7R seja causada por uma estabilidade acrescida da proteína. Uma sub-expressão da proteína de P2X7R pode ser causada por taxas de transcrição baixas do gene de P2X7R e, assim, quantidades insuficientes de ARNm de PIXlfú que dão apenas origem a uma quantidade baixa de proteína de P2X7R.

Outra razão, pode ser que a proteína de P2X7R seja instável e, assim não esta presente em quantidades comparáveis ao nível de proteína de tipo selvagem. A sub- ou sobre-expressão de proteína de pode ser determinada por processos bem conhecidos pelos especialistas nesta técnica. Estes processos incluem, mas não se limitam, a processos para a determinação da quantidade de ARNm ou da quantidade e/ou da actividade da proteína. Exemplos são as análises de transferência de ADN/ARN para uma matriz imobilizada (Northern Blot) ou técnicas com base imunitária, tais como, as transferências de anticorpo/proteína para uma matriz imobilizada (Western Blotting). "Não funcional" significa que a proteína de P2X7R perdeu, pelo menos, uma propriedade funcional exibida pela proteína de P2X7R natural, tal como foi descrito aqui antes. Preferencialmente, "não funcional" significa que a proteína de P2X7R já não funciona como um canal. A não funcionalidade pode ser causada, por exemplo, pelo facto de que a ocorrência de um alelo num indivíduo codifica para uma proteína de que conduz a dímeros não funcionais (mutação negativa dominante). Se uma proteína de P2X7R num indivíduo é funcional ou não funcional, pode ser determinado pelos processos descritos aqui antes e nos exemplos. A expressão "alterado por barreira de ATP" significa que a respectiva proteína de P2X7R reage de uma maneira diferente com ATP comparada com a proteína de P2X7R natural. Isto pode ser determinado conforme descrito nos exemplos em anexo ou como se descreveu aqui antes. No contexto de diagnóstico, não apenas a actividade de P2X7R pode ser de valor para g diagnóstico, mas também a quantidade de expressão. Por exempio, se um polimorfismo afecta a estabilidade de ARN ou a eficiência da tradução, isto pode levar a uma expressão menor da proteína de P2X7 não apenas no hipocampo mas também no sangue. Por isso, pode-se especular que uma quantidade mais baixa de P2X7 detectada por análise de transferência de anticorpo/proteína para uma matriz imobilizada (Western) em células sanguíneas, pode estar relacionada com a depressão.

Um outro aspecto da presente invenção, diz respeito a um processo para o diagnóstico de um distúrbio afectivo ou a susceptibilidade para um distúrbio afectivo, que compreende a etapa de determinação, numa amostra obtida de um indivíduo, se a sequência de genes de P2X7R ou a sua proteína codificada compreende uma mutação tal como definido aqui, em comparação com a sequência de P2X7R natural.

Um enquadramento preferido da presente invenção, consiste num processo em que uma mutação é uma mutação numa sequência de 1?2:5Q'E> conforme foi definido aqui antes e/ou uma substituição ou eliminação de um nucleótido seleccionado no quadro C que se segue, indicando-se na coluna "região de P2X7R" a região da sequência genómica de nucleótidos de P2X7R, em que a substituição ou a eliminação ocorre, na coluna "nucleótido" do quadro C o nucleótido que é substituído por outro nucleótido ou os nucleótidos que são eliminados e na coluna "posição na natureza" do quadro C, a posição correspondente na sequência de nucleótidos de P2X7R natural, do canal de iões com barreira de ATP, conforme descrito na SEQ ID N°. 1.

Quadro C (Região de | | (Nucleótido lP2X7R 1 ( 0 B'f B í S*· i Posição 1 natureza €1 : f : na! m

:::U 0TB íRegiΙο í 72232 i Nucleótido .........r:

Posição natureza

5'TTR 5'UTR tFi $*' j:T t:

St :rrs.

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Região P2K7R de 1 jNucleótido | 1 Posição \natureza _________L„______________________________ na 1 \ : lAOrâc- 35 \T ..........s.................................................................... | 885ti. i Infcrâo· S> |â i i mu \ .............. i ..........—: Intrão 6 :eliminação de GTTT ..........£................................................................... i J 8 5 8 5 5 88 Π ! Im: rit 8 i ,-v _________i___________________________________ i ______________; Idferâit sp Ϊ '·'·.· 1 ,i.:C :8: Ã> '·':· i vi \ 3' ; A. __________i____________________________________________________________________ > .·· u : ;.· .............. j T>:Vf r- S vV.· :· i 3· .... N3 ;; \ Ov -4 >:: ,· 1 lAtrâg t ; í-A ; -:55 .:5 88 i 1 Ittrãt 3'· € 13 7 4 3 § ——j X^trto NN' í ;-v; S .........i.................................................................... ;3?313 v; ' 1 ” r- ;i Í3\í 5V A; 3 ·: v· > v *„· u i; E 5 Ϊ ,·: r! ;i 33505 58585 S j .'V 5 78 ·: '3- Ol ^ 5> R· E ik íííò· 8 í: .88 33 3 8 41 8 | Irrtrio 8ΕϊΓΓΓ

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Região de P2X7R Nucleótido Posição na natureza 3'UTR G 54925 3'UTR C 55169 3' UTR A 55170 3'UTR A 55171 3'UTR C 55917

Tal como se indicou aqui antes, se o respectivo nucleótido, que é substituído por outro nucleótido, é uma base de purina, prefere-se que seja substituído por outra base de purina. Se for uma base de pirimidina, prefere-se que seja substituído por outra base de pirimidina. Também se prefere que uma base de purina seja substituída por uma base de pirimidina e que uma base de pirimidina seja substituída por uma base de purina. Mais preferencialmente, os nucleóti-dos indicados no quadro C são substituídos pelos nucleótidos indicados na respectiva posição no quadro 12 aqui a seguir (ver exemplo 3).

Um outro objecto da presente invenção, é uma composição de diagnóstico destinada a ser utilizada num processo em que a ocorrência da mutação no gene P2X7R do canal de iões com barreira de ATP, é determinada por RCP, processos imunológi-cos e/ou processos electrofisiológicos conforme se descreve aqui a seguir e nos exemplos em anexo. Adicionalmente, é possível, determinar a ocorrência de uma mutação em P2X7R do canal de iões com barreira de ATP, conforme foi descrito aqui antes. A presente invenção tem ainda por objecto, aqui descrito, a utilização de uma molécula de ácido nucleico, de um vector, de um polipéptido, de um anticorpo, de um aptâmero e/ou de um iniciador ou de um par de iniciadores para a preparaçao de uma composição de diagnóstico para a detecção de um distúrbio afectivo. A presente invenção tem ainda por objecto processos de diagnóstico de distúrbios afectivos de um indivíduo, que compreendem: o isolamento do ADN de células obtidas de um indivíduo; a determinação de toda ou parte da composição dos nucleótidos do gene de P2X7R; e

a análise da referida composição de nucleótidos de P2X7R para avaliar a presença de um ou mais polimorfismos, mutações ou variações alélicas. 0 termo "gene" significa uma sequência de nucleótidos associada com a produção de uma proteína, incluindo sequências de promotores, sequências de potenciadoras, sequências de intrões, sequências de exões, regiões de codificação, regiões de 5' não traduzidas (5'UTR), regiões de 3' não traduzidas (3'UTR) e variantes de combinações.

Nos processos aqui descritos, o indivíduo é um mamífero e, mais preferencialmente, um ser humano. Além disso, as células derivam preferencialmente da pele, do sangue, da urina ou do fluido cérebro-espinal.

Os processos aqui descritos permitem o diagnóstico de um distúrbio afectivo de accrdo com a composição de um marcador genético, que corresponde ao gene de P2X7R. Tal ccmo foi demonstrado pelos exemplos em anexo, os polimorfismos em ilêíTPu estão ligados geneticamente a pacientes que sofrem de um distúrbio afectivo.

De acordo com isto, o diagnóstico de um distúrbio afectivo pode ser efectuado, por exemplo, isolando as células de um indivíduo e isolando o ADN genómico das referidas células. Essas células podem ser recolhidas de fluidos do corpo, da pele, do cabelo, de biópsias e de outras fontes. A recolha e análise das células de fluidos do corpo, tais como, o sangue, a urina e o fluido cérebro-espinal são bem conhecidas na técnica; ver, por exemplo, Rodak, "Haematology: Clinicai Principies & Applications" segunda ed., WB Saunders Co, 2002; Brunzel, "Fundamentais of Urine and Body Fluids Analysis", WB Saunders Co, 1994; Herndon e Brumback (Ed.), "Cerebrospinal Fluid", Kluwer Academic Pub., 1989. Além disso, os processos para o isolamento do ADN estão bem descritos na técnica; ver, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3S edição, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.

Uma vez isolado o ADN, podem preparar-se vários iniciadores de oligonucleótidos que atravessam o local de P2X7R, de modo a amplificar o material genético por uma reacção em cadeia de polimerase (RCP). Os processos convencionais para preparar, sintetizar e produzir os referidos iniciadores de oligonucleótidos e para realizar a amplificação por RCP, podem ser encontrados em textos normalizados, ver, por exemplo, Agrawal (Ed.), "Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties (Methods in Molecular Biology, 20)", Humana Press, 1993; Innis et al. (Ed.), "PCR Applications: Protocols for

Functional Genomics", Academic Press, 1999; Chen e Janes (Ed.), "PCR Cloning Protocols: From Molecular Cloning to Genetic", 2* edição, Humana Press, 2002. Os iniciadores para a detecção dos polimorfismos de P2X7R são também indicados, mas não se limitam, as SFQ ID N°. 52 até S SEQ ID N°. 111.

Uma vez amplificado o ADN, pode analisar-se a estrutura de nucleótidos por meio de processos de sequenciação e comparação com o ADN de P2X7R normal. A sequenciação pode ser realizada manualmente por qualquer biólogo molecular com competências comuns ou por meio de um aparelho de sequenciação automática. Estes processos são comuns na técnica, ver, por exemplo, Adams et al. (Ed.), "Automated DNA Sequencing and Analysis", Academic Press, 1994; Alphey, "DNA Sequencing: From Experimental Methods to Bioinformatics", Springer Verlag Publishing, 1997. A detecção e a análise de polimorfismos em também pode ser realizada utilizando um sistema de mutação refractária de amplificação (ARMSTM), a extensão linear de um sistema de mutação refractário de amplificação (ALEXTM), polimorfismo de conformação de estrutura helicoidal simples (SSCP), análises de heteroduplexes, RCP-SSCP, SSCP fluorescente num sequenciador automático de ADN, electroforese em gel com um gradiente de desnaturação, ensaios de protecção de ARNase, detecção de mutações por hibridação especifica de oligonucleótidos da sequência, processos de clivagem química, processos de clivagem de desemparelhamento de enzimas, processos de clivagem do comprimento dos fragmentos, hibridação de oligonucleótidos específicos de alelos em fragmentos de ADN e para outros processos conhecidos na técnica, ver, por exemplo, Nollau et al., Clin. Chem. 43 (1997), 1114-1128; Burczak and Mardis (Ed.), "Polymorphism Detection & Analysis Techniques", Eaton Pub Co, 2000; Cotton et al. (Ed.), "Mutation Detection: A Practical Approach", Irl Press, 1998; Taylor (Ed.), "Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphísms in DNA", CRC Press, 1997. A presente invenção também tem por objecto, um processo de diagnóstico de um distúrbio afectivo num indivíduo, que compreende: o isolamento do ARN de células obtidas de um indivíduo; a conversão do ARN em ADNc; a determinação de toda ou parte da composição dos nucleótidos do ADNc assim obtido; e a análise da referida composição de nucleótidos para a detecção da presença de um ou mais polimorfismos ou de variações alélicas, conforme definido aqui.

No que respeita aos enquadramentos preferidos, aplica-se o mesmo que já foi descrito antes. A detecção e análise de polimorfismos no ARN de P2X7R, podem ser realizadas de acordo com os processos descritos antes. A presente invenção também tem por objecto, um processo de diagnóstico de um distúrbio afectivo num indivíduo, que compreende: o isolamento do ARN ou de proteínas das células obtidas de um indivíduo; a determinação dos níveis de ARN ou de proteína em P2X7R; e a comparação dos níveis de ARN ou de proteína de P2X7R com os níveis correspondentes de um indivíduo normal que não sofra de nenhum distúrbio afectivo.

Tal como se demonstra pelos exemplos em anexo, existe uma relação ente a expressão ou o nível de proteína de P2X7R e um distúrbio afectivo. A presente invenção também tem por objecto um polinu-cleótido que compreende pelo menos 20 bases do gene humano de P2X7R e compreende uma mutação ou um polimorfismo seleccio-nado entre um qualquer dos seguintes:

Quadro 1. Novos polimorfismos no P2X7R humano

Região em P2X7 Polimorfismo Modificação da Proteína 5' UTR 362 T-C 5'UTR 532 T-G 1100 A-G S” íJTR 1122 A-G S* UTR 1171 C-G 5' UTR 1702 G-A Intrão 01 3166 G-C μητζ&ρ uí 24778 C-T •X· ,v, . .v. v X Λ. t-IÚiÚ uC~ú" taáo Úi 26188 C-T Arg 117 Trp Intrão 03 26308 A-G Intrão 03 26422 G-A Intrão 04 32394 G-A llltrli? 14 32434 T-C Exão 05 32493 G-A Gli 150 Arg Exão 05 32548 C-T Cis 168 silencioso Intrão 05 32783 A-C Exão 06 35438 G-A Glu 186 Lis Exão 06 35454 T-C Leu 191 Pro

|:RegMq em| Polimorfismo |Modificação da Proteína Intrão 06 35725 A-C Intrão 06 36001 T-G Intrão 07 36378 G-A Intrão 07 36387 T-A Intrão 07 36398 G-C Exão 08 37604 C-T Arg 270 Cis Exão 08 37633 C-T Asp 279 silencioso Intrão 09 47214 C-T 1 Intrão 11 47563 T-C Intrão 12 54307 C-T Intrão 12 54308 G-A Exão 13 ieliminação de 54562-54582 de CCCTGAGAGCCACAGGTGCCT Eliminação de 7aa 488 a 494 (PESHRCL) Exão 13 54804 A-T Ile 568 Asn Exão 13 54834 G-A Arg 578 Gin 3' UTR 55169 C-A 3' UTR 55170 A-C | 3'UTR 55171 A-C 3'UTR 55917 C-T 3'UTR 5 4925 G-A 0 polimorfismo descreve a posição e as variações observadas. A posição e a numeração do polimorfismo corresponde ao gene humano de P2X7R, tal como definido na SEQ ID N°. 1. Os iniciadores utilizados para a amplificação de PNS e a sequenciação, estão indicados no quadro la e listados nas SEQ ID N°. 52 até a SEQ ID N°. 111.

Quadro la. Sequências de iniciadores para a amplificação e de PNS

Nome do Orientação Sequência Inicio Fim Iniciador P2RX7__01. for Paralelo cgtaggacttggcgcttct 2785 2803 P2RX7....01. rev Anti- gagcacgtctcagattcgaaa 3224 3244 àv :1¾ R .XiP R-. 15 PckX.? divtcc l:acal«I,o oca tggggoáfgtot:qa ctadtc 24 € 6 d 21:527 55557 5.7 .. rao ílr. : .-.v. ctcetggixtctçisçcc.is-gt.t 251 SB 71? í 7 í pC.ra.2«7ÍO: 1»2 8X7. J 3 *.£&£'riIlSTlCl Í1T' ! ! | Ρ:Χθ5.1θ:1θ- J PÒ8 1 5· X"~ jp

í.: 5'.' -:¾ í.· CIO i F2RK7 dl„for loxta I. a 1 a | a fc1 ca t ccat eagá: gg c \ q g t o cc I:.ag f g c t -¾ g s a c cg g a

!............................................. P2 EX / (77 i, róo cot 7 “ paralelo gccatgtgaattttctaccgat •\ \ > ·. •'Ç v·'.’ :> o. o: · 0 13I29B P2RX7 05.for Paralelo ttcgttgtggttaggatggg 32314 32333 P2RX7_.05.rev Anti- caaggatgctcagggtagtagc 32805 32826 paralelo P2RX7....06 .for Paralelo cactaggtttgctgtatccatttct 35277 35301 P2RX7....06. rev Anti- gcaactgtgtgagagcttgg 35731 35750 paralelo P2RX7...07. for Paralelo tcaaccctggtccagtgtg 35950 35968 r2RX7^0?,rcc ; Ao t i ·· c«coà5gtaqctct.oaO'toata2.gç ablcl 2 51 a B ; caraleio - : : i 55M7 55,.for Parai 0.1.C co.ata2oç.oit.otq:oòcct daadt ; 7 7 2 51 5 i .......................................j............:...........................7.....1.....1.....1 · · i 22:5X7 ;5Ϊ7, OC'2 catcttgttgccttggaaacc | ; 5: -'Ò -·>; R; ,'\ ; ·· 8 v ;

PdPKI o Bodo? 57557 Od,rac :ipcccicic da rol. Ο Ιοί: |g-j X {"„loaoiai oo o; i45321 ! 4534 3 ....................\ „______________ :775? χ O .J i , í;: Λ .Íl .·,

Nome /6 Orientação Início Fim Iniciador F2MT 1,2 Anti- gox t tí a -a a gggs o 11 c t g c t a g t a 50651 paralelo P2RX7__13a.for Paralelo gcttacagaacacatgcatgg 53252: i>2Rx'i' 11*,. rev Anti- * ggitttagtg 0 S4 7 32 :53751 paralelo : P2RX7.__13b. for Paralelo atcaccacctcagagctgttc sabia 53 53 Q P2RX7 13b.rev Anti- gttaacatggctactgcagcc 32233 : 4 5>iA'/ '4' paralelo P2XR7_13d.for Paralelo gcttagaaaggaggcgactcc 55454 53554: P2XR7 Prol3.for Paralelo ttgtgacatttgcaaggctgcc 2317 P2XR7 Pro7.rev Anti- tctgaagctctgctcctgag 135:3 3.174· paralelo : P2XR7 ProS.rev Anti- ctcaccttctggcttccagt IS 11 1650 paralelo I P2XR7 Pro9.for Paralelo cttaccactcccaggactaa 1332 1515 P2XR7 ProlO.for Paralelo gtctgcctgttcactgccat 1133 1,165 | P2XR7 Prol.for Paralelo cagagaccttcagaaacttcg 133:1 '.0*0 P2XR7 Pro2.rev Anti- agatcaccagggacacagtg 2221 213 7 paralelo P2XR7„„Pro3. for Paralelo ctcaactccactttcctcgg 2153 o 5 & ·*> x; s0 λ. P2XR7_Pro4.rev Anti- cctttcacttttttggtctcatg 2S55 2671 paralelo F2KF2 Prol. 5/r Paralelo gggagaattctgaaaatgccc 2111 P2XR7_Pro6.rev Anti- ggaccagagctctactcttc 2:351 2570 paralelo ÍP2XR7_Proll.for -1— Paralelo aggtcatagatcgacctgcc .................................................................. 2255 2315 | P2XR7....Prol2. rev ;Anti- aagaagcgccaagtcctacg .·>. ,s .·· /555 j j paralelo ....._..___________.i i i Paralelo ......................................... gcaatccagactgaagttgac 2051 12071 | P2XR7__Prol5.rev Anti- ' ai- r :.v t ;kx citgcagt t ggtg •-N. 1 /·; ; -X- >$ :-i & 2537 ; ........ paralelo ......................................; ..........................................................................................i__l iHcme áo L ...... : 1Γ: ; ca amor Orientação Sequência F!mííS~ ----------- ;....... I ;' ν’ !" :.f.oy ?Paralelo L...................................... cctttaaaatcagagaccttcaga 1831 Paralelo gcccatcctctgaacaccat 2 708 12727 Ela. for i.................1___________-____________________ : Para leia <........................................ i cccc fggaècf ct i:gat a11u j 5 a7 ·' ! : jXIEil i EEEB1 EúiBIvipr : Para ia.!a o "oao* "> r" /ΚΊ a 1E 4 95β i a \ 3 ··:·.: P2XR7_.3UTR2.rev Anti- paralelo gtgggacagtttgctgtgcct 55150 | 55170 P2XR7._3UTR3.for Paralelo gagtccttaccaatagcagg 55183 55202 Anti- paralelo gtcaaagaatttgtggccacc 55643 5 5 6 6 3 ! & D £ Paralelo catgaactgtcttttaatgtgtaaag 55515 RSMo ? Y.j Anti- paralelo gagatacggtttcaccatgttg 55955 iõPlt P2XR7 3UTR7.for Paralelo aattagctgggcatggtgcg **V> *Vs 5C011 ::2ER7 10TEÒ, r$V Anti- paralelo ttgagatggagtctcgctctg ví ^ i. ώ ib oPi-sO | 1 i Anti- paralelo cactgtccacgtgactgctt 56208 PiRXi IX. FEE Paralelo tcctacttcggtctggtaagagatt 4 72 8 1 47305 | P2RX7 ll.Rev Anti- paralelo gggcctaattttcgtgcat ''i ,·; >. 4768P | P2RX7....13G. For Paralelo aagaacctagaacctgagggctt 154333 ”1353 P2RX7_,13G. Rev Anti- paralelo ttgagatgggaggcagctt 54541 545SP: | P2RX7 13H.For Paralelo ttcggctcccaggacat 54773 i; P2RX7....13H. Rev Anti- paralelo cacagagctttgcaggtgaa 55248 | >v, s\ í\ .i

Tendo ¢-^: conta o que ficou dito, a presente invenção, tem também por objecto um kit de diagnóstico para distúrbios afectivos, que compreende uma sonda especifica de oligonucleótidos ou o iniciador correspondente aos polimorfismos de P2X7R. 0 kit de diagnóstico pode incluir embalagens e instruções apropriadas para a utilização no processo descrito antes. 0 referido kit pode ainda compreender um tampão apropriado e enzimas, tais como transcriptase inversa e polimerases termo-estáveis.

Os diagnósticos podem ser realizados em murganhos, ratos ou seres humanos. 0 diagnóstico geralmente aplica-se in vitro, por exemplo, utilizando células ou outros materiais obtidos de um indivíduo. Contudo, pode ser aplicado num indivíduo vivo ou post mortem. 0 diagnóstico de um distúrbio afectivo pode ser seguido por prescrição ou administração de um fármaco antidepressivo. A administração e a dosagem dos fármacos antidepressivos podem variar de paciente para paciente e são bem conhecidas pela técnica médica, ver, por exemplo, Benkert and Hippius, "Kompendium der Psychiatrischen Pharmakotherapie", Springer Verlag Publishing, 2000; Albers, "Handbook of Psychiatric Drugs: 2001-2002 Edição", Current Clinicai Strategies Publishing, 2000. Exemplos preferidos incluem doses entre 5 mg e 80 mg por dia, preferencialmente 20 mg de fluoxetina; entre 5 mg e 50 mg por dia, preferencialmente 20 mg de paroxetina; entre 5 mg e 200 mg por dia, preferencialmente 50 mg de sertralina; entre 5 mg e 300 mg por dia, preferencialmente 100 mg de fluvoxamina; entre 5 mg e 100 mg por dia, preferencialmente 30 mg de mirtazapina; entre 4 mg e 50 mg, preferencialmente, 8 mg de reboxetina; entre 5 mg e 600 mg por dia, preferencialmente 200 mg de nefazodona; entre 450 mg e 1.800 mg por dia, preferencialmente 900 mg de carbonato de lítio. A proteína de P2X7R é também útil para monitorizar a eficácia e/ou a dosagem de um fármaco ou a predisposição de um paciente para responder a um fármaco. Ãs>sim, descreve-se aqui um processo para monitorizar a eficácia e/ou a dosagem de um fármaco, por exemplo, um fármaco antidepressivo e/ou a predisposição de um paciente para responder ao referido fármaco, que compreende a determinação do nivel de expressão e/ou de actividade da proteína P2X7R num paciente, antes e depois da administração do respectivo fármaco. Tal como se apresenta nos exemplos que se seguem, o tratamento com um fármaco antidepressivo resulta numa sobre-regulação da actividade de P2X7R. Nos seres humanos, a actividade de P2X7R pode ser monitorizada por tomografia de emissão de positrões (PET) ou tomografia computorizada de emissão de fotões simples (SPECT), utilizando um traçador de ligando rádio-marcado para P2X7R. Exemplos de ligandos de P2X7R podem ser, mas não se limitam, a ATP, um antagonista da ligação de um agonista da ligação de P2X7R ou um polinucleótido pequeno, que compreende pelo menos 20 bases do gene humano, P2X7R. Uma modulação da actividade de E2X7S, a distribuição da membrana ou os níveis de expressão, irão reflectir a actividade e a potência do fármaco antidepressivo. Os processos e as técnicas necessári-as para a análise por PET, são bem conhecidos na técnica ver, por exemplo, Paans and Vaalburg, Curr. Pharmac. Design 6 (2000), 1583-1591; van

Waarde, Curr. Pharmac. Design. 6 (2000), 1593-1610; Paans et al., Methods 27 (2002), 195-207; Passchier et al., Methods 27 (2002), 278-286; Laruelle et al., Methods 27 (2002), 287-299.

Quando utilizado aqui, o termo "amostra" entende-se qualquer amostra biológica obtida a partir de um indivíduo, linha de células, cultura de tecidos ou outra fonte que contenha polinucleótidos ou polipéptidos ou porções deles. Tal como indicado, as amostras biológicas incluem fluidos do corpo (tal como, sangue, soro, plasma, urina, fluido sinovial e fluido espinal) e fontes de tecido em que se verifica que expressam os polinucleótidos descrito antes. Os processos para a obtenção de biópsias de tecido e de fluidos do corpo de mamíferos são bem conhecidos na técnica. Uma amostra biológica que inclui ADN genómico, ARNm ou proteínas, é preferida como fonte.

Preferencialmente, uma mutação pontual que leva a substituição de um resíduo de aminoácido, por outro aminoácido, em posições como as indicadas no quadro 1 da correspondente sequência de aminoácidos de de origem natural, descrita na SEQ ID N°. 3 ou 4, pode ser determinada por RCP. A referida RCP é seguida de uma análise de polimorfismo de restrição do comprimento do fragmento (PRCF), se for devida a mutação pontual, gera-se um sítio de reconhecimento para uma endonuclease de restrição, que não está presente na sequência de nucleótidos de origem natural ou um sítio de reconhecimento para a enzima de restrição é criado, que também não ocorre no P2X7R de origem natural. Mais preferencialmente, a referida mutação pode ser determinada por RCP utilizando iniciadores e condições que permitem apenas uma amplificação da sequência de nucleótidos de origem natural, que codifica o correspondente aminoácido de origem natural na respectiva posição, mas não da sequência de nucleótidos de uma molécula de ácido nucleico que codifica um resíduo diferente de aminoácidos na correspondente posição. É ainda mais preferido, que a RCP seja realizada para determinar uma mutação utilizando iniciadores e condições que não permitam amplificação se estiver presente a sequência de nucleótidos de origem natural, mas apenas se outro resíduo de aminoácido for codificado na respectiva posição. Particularmente preferido é um processo utilizando RGP e iniciadores em condições que permitam a amplificação de um fragmento, que compreende pelo menos os resíduos de nucleótidos que codificam c resíduo de aminoácido correspondente às posições da SEQ ID N°. 1. A referida RCP é seguida, por exemplo, por sequenciação e/ou uma análise de conformidade da estrutura helicoidal simples (ACES). 0 referido fragmento tem, preferencialmente, um comprimento de pelo menos 25 nucleótidos, mais preferencialmente um comprimento de pelo menos 50 nucleótidos de comprimento, ainda mais preferencialmente, um comprimento de pelo menos 75 nucleótidos, particularmente preferido, um comprimento de pelo menos 100 nucleótidos, mais particularmente preferido, um comprimento de pelo menos 200 nucleótidos, ainda mais particularmente preferido, um comprimento de pelo menos 250 nucleótidos, e ainda mais particularmente preferido, um comprimento de pelo menos 300 nucleótidos e o que é mais particularmente preferido, um comprimento de pelo menos 600 nucleótidos. Os referidos iniciadores tem, preferencialmente, um comprimento de pelo menos 12 nucleótidos, mais preferencialmente, um comprimento de pelo menos 15 nucleótidos, ainda mais preferencialmente, um comprimento de pelo menos 18 nucleótidos e o mais preferido, um comprimento de pelo menos 21 nucleótidos, conforme descrito nas SEQ ID 52 a 111. A temperatura para enrolar os referidos iniciadores é, preferencialmente, de pelo menos 50 "C, mais preferencialmente, de pelo menos 55 "C e ainda mais preferencialmente, de pelo menos 58 "C. A temperatura para a desnaturação é, preferencialmente, de pelo menos 95 "C durante, preferencialmente, pelo menos 10 segundos, mais preferencialmente, pelo menos 20 segundos, ainda mais preferencialmente, pelo menos 30 segundos e o mais preferido, pelo menos 60 segundos. Contudo, consoante o comprimento e o teor de G-C da sequência de ácidos nueleiccs a ser amplificada, a temperatura para a desnaturação pode ser mais baixa ou mais elevada. O tempo para a extensão dos iniciadores enrolados é, preferencialmente, de pelo menos 10 segundos, mais preferencialmente, de pelo menos 20 segundes, ainda mais preferencialmente, de pelo menos 30 segundos e o

mais preferido, de pelo menos 60 segundos. Uma reacção de RCP que compreende as condições mencionadas antes, está exemplificada nos exemplos que se seguem. A sequenciação subsequente e/ou a ACES é realizada conforme é conhecido na técnica. Preferencialmente, separam-se os fragmentos de RCP num gel de poliacrilamida a 10 %, a4°Couo que também é preferível, a temperatura ambiente. Os fragmentos de RCP, que mostram uma deslocação da banda de ACES são amplificados com iniciadores nas condições mencionadas antes e são em seguida sequenciados. Alternativamente, é também possível sequenciar directamente o ADN genómico de modo a determinar se ocorreu uma mutação no gene CLCN2. Uma abordagem de sequenciação genómica directa está demonstrada, por exemplo, para levedura de padeiro em Horecka, Yeast 16 (2000), 967-970. Preferencialmente, determina-se uma eliminação utilizando técnicas de hibridação conforme e conhecido na técnica. Em particular, desenha-se um iniciador tal como se mencionou antes aqui, que seja capaz de hibridar apenas com ADN genómico de origem natural, conforme descrito na SEQ ID N°. 1, mas não com uma sequência de nucleótidos que compreenda uma eliminação de um fragmento entre os nucleótidos 54562 e 54582 da SEQ ID N°. 1. Também preferido é o processo da hibridação fluorescente in situ (FISH) para a determinação dos cromossomas completos, em particular, no cromossoma 12q23-q24, cromossoma esse que tem a eliminação mencionada antes. Ainda mais preferido, é que a eliminação dos resíduos de nucleótidos conforme se descreveu aqui, possa ser determinada utilizando RCP, em que um iniciador ou um par de iniciadores está localizado dentro da região do ADN genómico que compreende a referida eliminação. Preferencialmente, a referida eliminação está entre as posições 54562 e 54582 dos nucleótidos, conforme descrito na SEQ ID M°. 1. Assim, em condições apropriadas, não vai resultar nenhum fragmento de RCP se o ACN genómico contiver a referida eliminação. É particularmente preferido que a RCP que utiliza os iniciadores que estão localizados a montante ou a jusante da eliminação, seja realizada para determinar a referida eliminação. Nas condições apropriadas conforme mencionado aqui antes, tanto um fragmento de ADN genómico da sequência de nucleótidos de origem natural, tal como estabelecido na SEQ ID N°. 1, como um fragmento da sequência de nucleótidos que compreende uma eliminação preferencialmente dos nucleótidos entre as posições 54562 e 54582, conforme descrito na SEQ ID N°. 1, serão amplificados. É também possível determinar as mutações de P2X7R descritas antes ao nível das proteínas. Algumas das mutações descritas antes levam a versões encurtadas da proteína P2X7R. Assim, é concebível determinar a ocorrência destas mutações por meio da determinação do comprimento ou do peso molecular da proteína P2X7R expressa num indivíduo, por exemplo, por SDS-PAGE. É também possível determinar as mutações do canal com barreira de ATP de P2X7R conforme descrito aqui, utilizando os anticorpos da presente invenção. Os referidos anticorpos específicos para as referidas mutações das proteínas de P2X7R, serão determinados por técnicas de ensaio, tais como, radio-imuno-ensaios, ensaios comparativos de ligação, análise de transferência de anticorpo/proteína para uma matriz imobilizada (Western) e ensaio por ELISA. Também são preferidos os processos clássicos imuno-histológicos.

As verificações de que certas mutações no gene que codifica P2X7R e/ou na proteína correspondente, estão ligadas com distúrbios afectivos, o que é indicativo de que a não função ou a disfunção da proteína de P2X7R e responsável por várias formas de distúrbios afectivos. Assim, a verificação destas mutações não só permitem o diagnéstico de distúrbios afectivos por meio da determinação se as mutações descritas antes ocorrem no indivíduo, mas também permite desenvolver um tratamento de distúrbios afectivos que tenham sido diagnos- ticados como sendo o resultado de uma mutação no gene que codifica P2X7R. Esse tratamento pode compreender, por exemplo, a introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína de de origem natural, funcional ou não funcional, restaurando assim, no referido indivíduo, a actividade de P2X7R ou a activação ou a repressão de (a) genes de P2X7R in vivo. A expressão "activação ou repressão" neste contexto, significa que a expressão do gene ou está potenciada (activação) ou está reduzida (repressão). Um aumento de expressão pode ser conseguido, por exemplo, aumentando a eficiência da iniciação da transcrição utilizando, por exemplo, compostos apropriados que têm um efeito de activação na transcrição. Alternativamente, pode conseguir-se um aumento substituindo o promotor de ocorrência natural por um promotor mais eficiente. Pode conseguir-se uma repressão suprimindo a expressão do gene, por exemplo, suprimindo especificamente a transcrição a partir do promotor respectivo, por meio de compostos apropriados ou tornando o promotor menos eficiente ou não funcional.

Também se descreve aqui uma composição farmacêutica. A expressão "composição farmacêutica", refere-se a uma composição que compreende uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica P2X7R de um canal de iões com barreira de ATP e que se selecciona no grupo que consiste em: uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos conforme descrita na SEQ ID NO: 2, 3 ou 4; uma sequência de nucleótidos que compreende a sequência de nucleótidos conforme descrita na SEQ ID NO: 1 ou na SEQ ID NO: 2; uma sequência de nucleótidos que híbrida com a sequência de nucleótidos de (a) ou (b); e (d) uma sequência de nucleótidos que está degenerada como resultado do código genético com a sequência de nucleótidos de

Essas composições farmacêuticas compreendem uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína funcional de P2X7R e, eventualmente, um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. A composição farmacêutica pode ser administrada a um paciente com um veículo aceitável sob o ponto de vista fisiológico, conforme se descreve aqui. Num enquadramento específico, a expressão "aceitável sob o ponto de vista farmacêutico" significa aprovada por uma agência reguladora ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para ser utilizada em animais e, mais particularmente em seres humanos. 0 termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual se administra o agente terapêutico.

Esses veículos farmacêuticos podem ser líquidos esterilizados tal como água e óleos, incluindo os de petróleo, de animais, de vegetais ou de origem sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e similares. 0 veículo preferido É a água quenado se administra a composição farmacêutica intravenosamente. Podem utilizar-se solução salinas e dextrose aquosa e soluções de glicerol como veículos líquidos, particularmente para soluções injectáveís. Ox excipientes apropriados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha gesso, gel de sílica, estearato de sódio, mono-estearato de glicerol, talco, iões de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. A composição, se desejado, pode também conter quantidades menores de agentes de molhagem ou de emulsão ou agentes de tamponamento do pH. Estas composições podem ter a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação controlada e similares. A composição pode ser formulada como supositórios, com os ligantes e veículos tradicionais tais como triglicéridos. A formulação oral pode incluir veículos padrão tais como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc. de grau farmacêutico. Exemplos de veículos farmacêuticos estão descritos em "Remington1 s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Essas composições conterão uma quantidade efectiva dos compostos mencionados antes, preferencialmente sob uma forma purificada, em conjunto com uma quantidade apropriada de veículo de modo a providenciar a forma para uma administração apropriada ao paciente. A formulação deve condizer com o modo de administração. Preferencialmente, a composição é formulada de acordo com processos de rotina tal como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Normalmente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso, isotónico, esterilizado. Quando necessário, a composição pode também incluir um agente de solubilização e um anestésico local tal como lidocaína para diminuir a dor no sítio da injecção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos quer separadamente, quer misturados numa forma de dosagem unitária, por exemplo, sob a forma de pó anidro liofilizado ou concentrado isento de água numa embalagem fechada hermeticamente tal como uma ampola ou uma saqueta indicando a quantidade de agente activo. Quando a composição se destina a ser administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água esterilizada ou solução salina de grau farmacêutico. Quando se administra a composição por injecção, pode dar-se uma ampola de água esterilizada para injecção ou solução salina, de modo que os ingredientes se possam misturar antes da administração. A composição farmacêutica pode ser formulada sob formas neutras ou de sais. Os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico incluem os que são formados com aniões tais como os derivados de ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc. os formados com catiões tais como os derivados de sódio, potássio, amónio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino-etanol, histidina, procaína, etc. Pode eventualmente utilizar-se ensaios in vitro para ajudar a identificar os intervalos de dosagem óptima. A dose precisa a ser utilizada na formulação também dependerá da via de administração e da severidade da doença ou distúrbio e deve ser decidida de acordo com o diagnóstico do médico e as circunstâncias de cada paciente. As doses efectivas podem ser extrapoladas das curvas de dose-resposta derivadas dos sistemas de ensaisos em modelos de animais ou in vitro. Preferencialmente, a composição farmacêutica é administrada directamente ou em combinação com um adjuvante. Preferencialmente prepara-se a composição farmacêutica para aplicação na terapia de genes. A técnica da terapia de genes já foi descrita antes em relação com as moléculas de ácidos nculeicos e tudo o que aí se disse aplica-se em relação as composições farmacêuticas. Por exemplo, a molécula de ácido nucleicc na composição farmacêutica está preferencialmente sob uma forma que permite a sua introdução, expressão e/ou integração estável em células de m< indivíduo a ser tratado.

Para a terapia de genes, podem utilizar-se vários vectores virais, por exemplo, adenovirus, vírus do herpes, vírus vaccinia ou, preferencialmente, um vírus de ARN tal como um retrovírus. Exemplos de vectores retrovirais em que um único gene estarnho pode ser inserido, incluem, mas não se limitam a vírus de leucemia de murino Moloney (VLMuMO), vírus do sarcoma de murino Harvey (VSMuHa) , vírus do tumor mamário de murino (VTMMu) e vírus do sarcoma de Rous (VSR). Um certo número de outros vectores retrovirais podem também incorporar genes múltiplos. Todos estes vectores podem transferir ou incorporar um gene para um marcador selectivo de modo a que as células transduzidas possam ser identificadas e geradas. Inserindo uma sequência de P2X7R de interesse que codifique uma proteína funcional de P2X7R no vector virai, em conjunto com outro gene que codifica, por exemplo, o ligando para um receptor numa célula alvo específica, por exemplo, o vector é então específico do alvo. Os vectores retrovirais podem tornar-se específicos do alvo por meio da inserção, por exemplo, de um polinucleótido que codifique um açúcar, um glicolípido ou uma proteína. Um técnic da matéria saberá se se pode facilmente acertar sem recorrer a experimentação desnecessária, as sequências específicas de polinucleótidos que podem ser inseridas no genoma retroviral para permitir uma libertação no alvo específico do vector retroviral contendo a sequência de polinucleótidos inserida. Dado que os retrovírus recombinantes são preferencialmente incompletos, são necessários ajudas para produzir partículas infecciosas do vector. Esta ajuda pode ser dada, por exemplo, utilizando linhas de células auxiliares que contêm plasmidos que codificam todos os genes estruturais do retrovírus sob o controlo de sequências reguladoras dentro das RTL (repetições terminais longas). A estes plasmidos falta uma sequência de nucleótidos que permite o mecanismo de empilhamento para reconhecer um transcritor de ARN para a encapsidação. As linhas de células auxiliares têm eliminações do sinal de empilhamento que incluem, mas não se limitam a w2, PA317 e ?al2, por exemplo. Estas linhas de células produzem viriões vazios, dado que não se acumula nenhum genoma. Se se introduz um vector retroviral nessas células em que o sinal de acondicionamento está intacto, mas os genes estruturais estão substituídos por outros genes de interesse, o vector pode ser acondicionado e o virião do vector é produzido. Alternativamente, as NIH 3T3 ou outras células de cultura de tecido podem ser directamente transfectadas com plasmidos que codificam os genes estruturais retrovirais gag, pol e env, por transfecção convencional do fosfato de cálcio. Estas células são então transfectadas com o plasmido do vector contendo os genes de interesse. As células resultantes libertam o vector retroviral no meio de cultura. Um outro sistema de libertação dirigida ao alvo para os polinucleótidos de P2X7R é um sistema de dispersão coloidal. Os sistemas de dispersão coloidal incluem complexos de macromoléculas , nanocápsulas, microesferas, pérolas e sistemas à base d elípidos incluindo emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomas. 0 sistema coloidal preferido é um lipossoma. Os lipossomas são vesículas artificiais da membrana que são úteis como veículos de libertação in vitro e in vivo. Tem-se verificado que grandes vesículas unilamelares (GVU), cuja dimensão varia num intervalo de 0,2-4,0 pm podem encapsular uma percentagem substancial de um tampão aquoso contendo macromoléculas grandes. O ARN, o ADN e os viriões intactos podem ser encapsulados dentro do interior aquoso e depois serem libertados para as células numa forma activa sob o ponto de vista biológico (Fraley e tal., Trends Biochem. Sei., 6: 77, 1981). Para além das células de mamíferos, têm-se utilizado lipossemas para a libertação de polinucleótidos em células de plantas, fungos e bactérias. Para que o lipossoma seja um veículo de transferência de genes eficiente, devem estar presentes as seguintes características: (1) encapsulação dos genes de interesse com elevada eficiência embora não comprometendo a sua actividade biológica; (2) ligação substancial e preferencial a uma célula alvo em comparação com as células que não são alvo; (3) libertação dos conteúdos aquosos da vesícula para o citoplasma da célula alvo com elevada eficiência; e (4) expressão efectiva e precisa da informação genética (Mannino e tal., Biotechniques, 6: 682, 1988). A composição do lipossoma é normalmente uma combinação de fosfolípidos, particularmente de fosfolípidos de temperatura de transição em fase alta, normalmente em combinação com esteróides, especialmente colesterol. Também se podem utilizar outros fosfolípidos ou outros lípidos. As características físicas dos lipossomas dependem do pH, da força iónica e da presença de catiões bivalentes. Exemplos de lípidos úteis na produção de lipossomas incluem compostos de fosfatidilo, tais como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos e gangliósidos. Particularmente úteis são os diacilfosfoalqulgliceróis, em que a parte de lípido contém de 14-18 átomos de carbono, particularmente de 16-18 átomos de carbono e estão saturados. Os fosfolípidos ilustrativos incluem fosfatidilcolina do ovo, dipalmitoilfosfatidilcolina e disterearoilfosfatidilcolina. 0 direccionamento dos lipossomas pode ser classificado com base em factores anatómicos e mecânicos. A classificação anatómica baseia-se no nível se selectividade, por exemplo, específico do órgão, específico da célula e específico da organela (estrutura sub-celular especializada). Os objectivos mecânicos podem distinguir-se com base no facto de serem passivos ou activos. Para objectivos passivos utiliza-se a tendência natural dos lipossomas para se distribuírem nas células do sistema reticulo-endotelial (SRE) em órgãos que contêm capilares sinusoidais.

Tendo em vista o que se disse antes, descreve-se aqui a utilização da composição farmacêutica que compreende uma sequência de nucleótidos que codifica um canal de iões funcional com barreira de ATP conforme se descreveu aqui antes num processo de tratamento de um distúrbio afectivo que compreende a administração de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico da referida composição farmacêutica, a um indivíduo que sofre do referido distúrbio.

Quando utilizado aqui, o termo "indivíduo" significa um indivíduo que tem necessidado de um tratamento de um distúrbio afectivo. Preferencialmente o indivíduo é um vertebrado, ainda mais preferencialmente um mamífero, particularmente preferido um ser humano. 0 termo "administrado" significa a administração de uma dose efectiva sob o ponto de vista terapêutico da molécula de ácido nucleico mencionada antes, codificando uma proteína funcional de P2x7R num indivíduo. Por "quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico" entende-se uma dose que produz os efeitos para os quais foi administrada. A dose exacta dependerá dos fins do tratamento e será acertada por um especialista na técnica utilizando técnicas conhecidas. Tal como é conhecido da técnica e já foi descrito antes, pode ser necessários fazer ajustamentos para libertação sistémica versus localizada de acordo com condições como idade, peso do corpo, estado geral de saúde, sexo , dieta, tempo de administração, interacções do fármaco e a severidade das condições e esses ajustamentos serão feitos com experimentação de rotina pelos especialistas na técnica.

As utilizações são aplicáveis tanto a terapia humana como a aplicações veterinárias. Os compostos aqui descritos antes que têm a actividade terapêutica desejada podem ser administrados a um paciente num veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, tal como descrito aqui. Consoante a forma de introdução, os compostos podem ser formulados numa variedade de formas conforme se discute a seguir. A concentração do composto activo sob o ponto de vista terapêutico na formulação pode variar desde cerca de 0,1-100 % em peso. Os agentes podem ser administrados isoladamente ou em combinação com outros tratamentos. A administração da composição farmacêutica pode ser feita numa variedade de formas conforme se discutiu antes, incluindo, mas não se limitando a administração oral, sub-cutânea, intravenosa, intra-arterial, intranodal, intramedular, intratecal, intraventricular, intranasal, intrabrônquica, transdérmica, intra-rectal, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal ou intra-ocular. Nalguns casos, por exemplo no tratamento de feridas e de inflamação, os agentes candidatos podem ser aplicados directamente sob a forma de um aerossol anidro em solução. O médico assistente e os factores clínicos irão determinar o regime de dosagem. Como é bem sabido das técnicas médicas, as dosagens para qualquer paciente dependem de muitos factores, incluindo o tamanho do paciente, a área da superfície do corpo, a idade, o o composto em particular a ser administrado, o sexo, o tempo e a via de administração, o estado geral de saúde e outros fármacos que estejam a ser administrados ao mesmo tempo. Uma dose típica pode estar, por exemplo, no intervalo de 0,001 a 1000 pg; contudo, podem considerar-se doses abaixo ou acima deste intervalo dado como exemplo, especíalmente tendo em consideração os factores mencionados antes.

As doses são dadas preferencialmente uma vez por semana, contudo, durante a progressão do tratamento, as doses podem ser dadas a intervalos de tempo maiores e se houver necessidade podem ser dadas a intervalos de tempo mais curtos, por exemplo, diariamente. Num caso preferido, a resposta imunitária é controlada utilizando processos aqui descritos e outros processos conhecidos pelos especialistas na matéria e faz-se a optimização das doses, por exemplo, nos tempos, quantidades e/ou na composição. As doses podem variar mas prefere-se uma dose para administração intravenosa de ADN de aproximadamente 106 a 1012 cópias da molécula de ADN. Se o regime for de infusão contínua, também deve estar no intervalo de 1 pg a 10 mg de unidades por quilograma de peso de corpo por minuto, respectivamente. O progresso pode ser monitorizado por meio de avaliações periódicas. A composição farmacêutica pode ser administrada localmente ou sistemicamente. A administração será preferencialmente parentérica, por exemplo, intravenosa. A preparação para administração parentérica inclui soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas esterilizadas. Exemplos de dissolventes não aquosos são propileno-glicol, polietileno-glicol, óleos vegetais tais como azeite e ésteres orgânicos injectáveis tal como oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções, suspensões e emulsões alcoólicas/aquosas, incluindo meios salinos e tamponados. Os veículos parentéricos incluem iões de sódio em solução, dextrose de Ringer, dextrose e iões de sódio, Ringer lactado ou óleos não voláteis. Os veículos intravenosos incluem fluidos e reforços de nutrientes, reforços de electrólitos (tal como os que são a base de dextrose de Ringer) e similares. Podem também estar presentes conservantes e outros aditivos tais como, por exemplo, agentes antimicrobianos, an|í=oxídantes, agentes quelantes e gases inertes e similares. Também se considera que a as composições farmacêuticas sejam utilizadas em abordagens de co-terapia, isto é, em co-administração com outros medicamentos ou fármacos, por exemplo outros fármacos para a prevenção, tratamento ou melhoria de distúrbios afectivos.

Além disso, a presente invenção etm por objecto uma composição farmacêutica que compreende um composto, cuja administração as células leva a uma redução ou a um aumento da expressão de um ácido nucleico que codifica P2X7R de um canal de iões com barreira de ATP nas células ou que comprrende uma molécula de ácido nucleico cuja expressão nas células ou cuja administração as células leva a uma redução ou aumenta a expressão de um ácido nucleico que codifica P2X7R de um canal de iões com barreira de ATP nas células. A referida composição farmacêutica pode ser útil para o tratamento de indivíduos que têm uma quantidade acrescida ou reduzida da proteína de P2X7R ou de um nível de expressão conforme se descreveu aqui antes. Preferencialmente, a referida composição farmacêutica leva ao aumento da expressão de um ácido nucleico que codifica P2X7R de um canal de iões com barreira de ATP nas células.

Considera-se que a composição farmacêutica mencionada antes, cuja administração às células leva a uma redução da expressão de um ácido nucleico que codifica um P2X7R de um canal de iões com barreira de ATP é um ácido nucleico anti-paralelo, uma ribozima, um ácido nucleico co-supressor, ARNi ou ARNsi. Uma abordagem com ARNsi está descrita, por exemplo, em Elbashir ((2001), Nature 411, 494-498)). Considera-se, por exemplo, que se utiliza ARN curtos em forma de gancho (ARNshs) como composição farmacêutica. A abordagem com ARNsh para o silenciamento dos genes é bem conhecido na técnica e pode compreender a utilização de ARNs tp (temporais pequenos); ver, inter alia, Paddison (2002) Genes Dím 16,

948-958. Tal como mencionado antes, as abordagens para o silenciamento dos genes são conhecidas da técnica e compreendem abbordagens do "ARN" semelhantes a ARNi ou a ARNsi. A utilização com sucesso destas abordagens está ilustrada em Paddison (2002) cit. loc., Elbashir ((2002), Methods 26, 199-213; Novina (2002) Mal. Med. 3 de Junho, 2002; Donze (2002) Nucl. Acids Res. 30, e46; Paul (2002) Nat. Biotech 20, 505-508; Lee (2002) Nat. Biotech. 20, 505-508; Miyagashi (2002) Nat. Biotech. 20, 497-500; Yu (2002) PNAS 99, 6047-6052 ar Brummelkamp (2002), Science 296, 550.553.

Estas abordagens podem ser â base de vectores, por exemplo, o vector pSUPER ou os vectores pollll de ARN podem ser utilizados conforme ilustrado, inter alia, em Yu (2002) cit. loc.; Miyagishi (2002) cit. loc. ou Brummelkamp (2002) cit. loc. Um composto que leva a uma redução da expressão do gene de P2X7R pode ser, por exemplo, um composto que actua na região reguladora do gene e por isso reduz o nível de transcrição. Esses compostos podem ser identificados por processos conforme se descreve aqui a seguir.

Também se descreve aqui a utilização de um uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína funcional de conforme aqui descrito antes em relação com a composição farmacêutica para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio afectivo.

Um outro aspecto aqui descrito é uma composição farmacêutica que compreende, inter alia, os polinucleótidos tal como se descreveram antes, isto é, polinucleótidos com mutações e/ou eliminações tal como se descreveram aqui antes. Essas composições farmacêuticas podem ser Úteis, por exemplo, para c tratanento de indivíduos que têm uma quantidade aumentada ou diminuída da proteína de fôMvR ou tendo uma prcteína de P2X7R com uma actividade aumentada ou diminuída que pode ser determinada tal como se descreveu aqui antes. Preferencialmente, essa composição farmacêutica pode ser útil para o tratamento de indivíduos que têm uma quantidade diminuída da proteína de P2X7R ou tendo uma proteína de P2X7R com uma actividade diminuída que pode ser determinada tal como se descreveu aqui antes. Considera-se que, por exemplo, uma proteína de P2X7R não funcional ou preferencialmente hiperfuncional contida na referida composição farmacêutica é incorporada num complexo de P2X7R que existe naturalmente nas células tal como se descreveu aqui antes. Também se considera que as técnicas descritas antes para a terapia de genes podem ser utilizadas para o tratamento de um indivíduo com as moléculas de ácidos nucleicos tal como se descreveu aqui antes, mutatis mutandis.

No que respeita aos possíveis modos de administração, aplica-se o mesmo que se estabeleceu aqui antes.

Além disso, descreve-se aqui a utilização das moléculas de ácidos nucleicos, dos vectores, dos polipéptidos, do anticorpo e/ou do aptâmero descritos antes para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio afectivo.

Um outro aspecto aqui descrito é a utilização de um modulador da actividade ou da expressão de P2X7R para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio afectivo. Quando se utiliza aqui, o termo "modulador" significa um composto(s), um complexo de compostos, uma substância ou um complexo de substâncias que podem ser modificados, isto é, modulam a actividade de P2X7R ou a expressão de P2X7R quer directamente cu indirectamente. A modulação pode ocorrer, por exemplo, ao nível da proteína. Particularmente, a proteína de P2X7R pode interferir com o modulador quer como mais activa ou menos activa. A modulação pode também ocorrer ao nível do ácido nucleico. Nomeadamente, o gene é transcrito mais frequentemente ou menos frequentemente dando origem a mais ou menos proteína. A modulação pode também influenciar a estabilidade do ARN ou da proteína. Dado que se verificou surpreendentemente que os agonistas de P2X7R melhoram os sintomas dos ratos seleccionados por um comportamento ansioso e depressivo, o modulador da actividade de P2X7R utilizado para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio afectivo num agonista. 0 termo "agonista" significa um agente ou um composto que pode interagir com um receptor e iniciar uma resposta fisiológica ou farmacológica característica desse receptor. Exemplos de agonistas de P2X7R incluem, mas não se restringem a ATP, ATP-4, BzATP 5'-trlfosfato de {2'-3'-0-(4-benzoilbenzoil)adenosina e tenidap (5-cloro-2,3-di-hidro-2-oxo-3- (2-tienilcarbonil) -indole-l-carboxamlda, isto é, ou um seu derivado. Particularmente preferido, o referido agonista utilizado para tartar a depressão ou a ansiedade é BzATPtal como demonstrado no exemplo 9 que se dá aqui a seguir. Embora tenha sido referido que a activação de P2X7R podia induzir apoptose e a morte da célula in vivo (Di Virgílio et al., Cell Death Differ. 5 (1988). 191-199:

Vlrginio at al., J. Physiol. 519 (1999), 335-346), o presente pedido de patente de invenção demonstra, no exemplo 9 aqui a seguir, que o tratamento do cérebro de rato seleccionado por ansiedade e comportamento depressivo com BzATP, não revelou diferenças significativas nos números de células apoptóticas entre os ratos de controlo e os ratos tratados com BzATP, Este resultado indica que a activação de P2X7R não resulta na morre das células cerebrais in vivo, tornando assim o BzATP como um fármaco candidato para o tratamento de distúrbios afectivo:.

Dado que se verificou, inesperadamente, que os agonistas de P2X7R melhoram os sintomas dos ratos seleccionados por ansiedade e comportamento depressivo, a presente invenção tem por objecto, num outro enquadrmaento, a utilização de um agente de modulação da actividade de P2X7R que é um agonista de P2X7R para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de distúrbios afectivos tais como ansiedade e comportamento depressivo. 0 que é ainda mais impressionante ê a verificação do presente pedido de patente de invenção, mostrada no exemplo 10, que os antagonistas de P2X7R não têm efeitos anti-depressivos embora se tenha pensado isso na técnica anterior, por exemplo, nas patentes de invenção WO 03/042190, WO 03/042191, WO 03/049353 ou patente de invenção norte-americana US 2004/0029841. AS patentes de invenção WO 031042190, WO 031042191, WO 031059353 ou US 200410029841 descrevem composições de antagonistas de P2X7R e processos de tratamento de doenças mediados por f2X'7R, por meio da administração destes compostos. Contudo, enquanto na técnica anterior pode-se fazer uma ligação entre P2X7R e, por exemplo, o tratamento da depressão, está geralmente implícito que os antagonistas de P2X7R têm de ser utilizados no tratamento de, por exemplo, depressão. Assim, a verificação da presente invenção de que os antagonistas não têm efeitos anti-depressivos, mas embora os agonistas de P2X7R tenham um efeito anti-depressivo que não se esperava e isto é assim ainda mais surpreendente. O presente pedido de patente de invenção, por isso, dá, inter alia, a base para o desenvolvimento de medicamentos efectivos com benefícios terapêuticos contra, por exemplo, a depressão, em particular, os referidos medicamentos compreendem um aqonista de pglX/R, são efectivos no tratamento de distúrbios afectivos, em particular para o tratamento desses distúrbios mencionados aqui e, em particular, para o tratamento da depressão. Exemplos de agonistas de P2X7R incluem, mas não se limitam a ΑΤΡ, ΑΤΡ-4, BzATP 5'-trlfosfato de {2'-3'-0-(4-benzoilbenzoil) adenosina Preferencialmente, ο agonista de P2X7R a ser utilizado para o tratamento de um distúrbio afectivo é o BzATP. Mais preferencialmente, utiliza-se BzATP para tratar a depressão ou a ansiedade como se demonstra aqui a seguir no exemplo 9. 0 presente pedido de patente de invenção dá uma outra indicação inesperada de que o composto quimico chamado tenidap também funciona como um modulador (isto é, como agonista) de P2X7R que pode assim ser utilizado para o tratamento de distúrbios afectivos. Assim, descrevem-se várias aplicações médicas para tenidap ou para um seu derivado. Contudo, a utilização de tenidap ou de um seu derivado para o tratamento de distúrbios afectivos não é conhecido nem sugerido na técnica anterior. De acordo com isto, o presente pedido de patente de invenção tem por objecto a utilização de tenidap ou de 2-oxindole-l-carbamidas triplamente substituídas, para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio afectivo. Obviamente também tem por objecto a utilização de uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico de 2-oxindole-l-carbamídas triplamente substituídas, para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio afectivo. A composição de tenidap (5-cloro-2,3-di-hidro-2-oxo-3-(2-tienilcarbonii) -indole-l-carboxamida, isto é, ) com a seguinte fórmula estrutural e outras 2-oxindcle-l-carbamidas triplamente substituídas e a sua utilização como anti-inflamatórios e agentes analgésicos e como inibidores enizmas tanto ciclc-oxigenase (Cox) como de lipoxigenase (5-LPO) foi descrita, pela primeira vez, na patente de invenção norte-americana U3 4.556.672. Obviamente, vàtlM modificações , por exemplo, dos grupos laterais ou dos átomos, que são bem conhecidas na técnica, podem ser feitas a composição de tenidap.

Os derivados de tenidap de 2-oxindole, substituído em 3 posições, estão descritos, por exemplo, nas patentes de invenção norte-americanas US 4.556. 672; US 4.658.037; US 4.7 21;712 ; US 5.290.802; US 5.118. 703; US 5.270.331; US 5.298.522; US 5.086.186. US 5. 449.788 E US 5. 795.902. Vários processos para a síntese de tenidap e outros derivados de 2-oxindole-l-carboxamidas, substituído em 3 posições, são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplos, as patentes de invenção norte-americanas US 4.652.658 US 4.585.194; US 4.952.703; patente de invenção europeia EP-31 155 828, patentes de invenção WO 90/104393, WO 94/107488, WO 94/117061, WO 95/20574; WO 97/136895; van Deurzen et al., J. Mol. Catai. B-Enzym., 2 (1996), 33-42; Porcs-Makkay e Simig, Org. Process. Res. Dev., 4 (2000), 10-16; Kumar et al., Org. Process. Res. Dev., 5 (2001), 61-64. A forma cristalina anidra do sal de sódio de tenidap está descritas nas patentes de invenção US 5.036.099 e WO 88/05656. A composição injectável e a composição farmacêutica para administração rectal de tenidap estão mencionadas, respectivamentes nas patentes de invenção europeias EP-Bl 508 811 e EP-B1 508 310. Também está descrito na técnica anterior que o tenidap ou um seu derivado pode ser administrado em combinação com tetraciclina (patente de invenção norte-americana US 5.308.839) ou metotrexato (patente de invenção WO 96/5419) para o tratamento de artrite reumatóide, inibição da fotodecomposição de tenidap e outras 2-oxindcie-l-carbcxamidas, substituídas em 3 pcsições, esta descrito na patente de invenção WO 96/33701.

Foram descritas outras aplicações de tenidap ou de um seu derivado e outras 2-cxindole-l-carboxamidas, substituídas em 3 posições, para a inibição de interleucina-1 cuja bio-síntese é feita em mamíferos e para o tratamento de distúrbios mediados por ínterleucina-1 (patente de invenção US 4.861.794); para a inibição da libertação de elastase a partir de neutrófilos (patente de invenção norte-americana US 5.006.547); para a supressão da função de células T em mamíferos e para tratar distúrbios auto-imunotárics das células T do tipo sistémico ou do tipo específico de órgãos (patente de invenção norte-americana US 4.853.409; Dolhain et al., Scand. J. Immunol. 42 (1995), 686-693). Tenidap é também utilizado para o tratamento de doença de Alzheimer (patente de invenção WO 96/31209; patente de invenção norte-americana US 5.545,656). O tenidap ou um seu derivado ou os seus sais de bases aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico têm mostrado que inibem a activação de colagenase, tratam distúrbios e doenças mediadas por colagenase e inibem a actividade de mieloperoxidase em mamíferos (patente de invenção norte-americana US 5.008.283). O tenidap pode reduzir o colesterol total do soro, o colesterol de LBS (lipoproteína de baixa densidade, LDL na terminologia inglesa) e os triglicéridos (patente de invenção norte-americana US 5.122.534) e pode ser utilizado para o tratamento de lesões do miocárdio induzidas por isquémia e lesões do miocárdio mediadas por citocina (patente de invenção europeia EP-1 679 396). Contudo, nenhum dos documentos referidos antes descreve a utilização de tenidap pu dos seus derivados ou das suas 2-oxindole-l-carboxamidas, substituído em 3 posições, para o tratamento, por exemplo, de distúrbios afectivos tal como a depressão.

Sanz et al., But. J. Pharmacol. 355 (1998), 235-244 sugerem que o tenidap pode aumentar a actividade do receptor de P2X7R. Sugere-se que c tenidap pode actuar por meio do aumento dos níveis de ATP (adenosina-tri-fosfato) ou aumentando o efeito de ATP em P2X7R. ATP é op ligando natural de P2X7R. De acordo com isto, o tenidap ou um seu derivado são moduladores (isto é agonistas) de P2X7R tal como se descreve aqui, dado que se define um modulador como um agente directo ou indirecto da modulação da actividade ou da expressão de P2X7R. Utilizando os ensinamentos da presente invenção, os moduladores (isto é os agonistas) de P2X7R são úteis para o tratamento de distúrbios afectivos e considera-se que o tenidap ou os seus derivados são utilizados como moduladores (isto é agonistas) da actividade de P2X7R para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio afectivo, cujos exemplos estão descritos aqui. A preparação de composições farmacêuticas, os modos de administração, etc. estão descritos supra e infra e aplicam-se a utilização de tenidap ou dos seus derivados referidos antes, para a preparação de uma composição farmacêutica, mutatis mutandis. Além disso, aquilo que se descreve aqui no que respeita as utilizações para o tratamento de distúrbios afectivos aplica-se a utilização de tenidap ou dos seus derivados referidos antes, para o tratamento de distúrbios afectivos, mutatis mutandis.

Além disso, o presente pedido de patente de invenção tem por objecto moduladores (isto é agonistas) de P2X7R que podem ser utilizados em qualquer uma das suas combinações para o tratamento de distúrbios afectivos. Por exemplo, BzATP e tenidap ou os seus derivados de 2-oxindole-l carboxamidas substituídos em 3 posições podem ser utilizados em conjunto, por exemplo, simultaneamente ou por meio de administrações sucessivas, para o tratamento de distúrbios afectivos.

Preferencialmente, a composição farmacêutica aqui descrita compreende, eventualmente, outras moléculas que têm proprieàades protectoras das células capazes de alterar as características dos componentes da presente invenção, por exemplo, modulando, preferencialmente bloqueando possíveis efeitos colaterais adversos ou negativos possíveis, mas indesejados, destes composnentes. Um desses efeitos colaterais adversos ou negativos possíveis, mas indesejados é a formação de poros na membrana da célula das células tratadas o que, em última análise, leva a apoptose. De acordo com isto, outras moléculas que pertencem a classe dos moduladores do receptor beta-adrenérgico, incluindo os agonistas ou os antagonistas são compostos que têm propriedades de estabilização da membrana. Os moduladores do receptor beta-adrenérgico, incluindo os agonistas ou os antagonistas são compostos que diminuem ou aumentam as respostas cronotrópicas positivas, inotrópicas positivas, bronco-dilatadoras e vasodilatadoras causadas pelos agonistas ou os antagonistas do receptor beta-adrenérgico. A dimensão desta resposta diminuída ou aumentada é proporcional a forma do sistema nervo-simpático e a concentração do agente de bloqueio do receptor beta-adrenérgico que atinge os sítios do receptor. Um modulador do receptor beta-adrenérgico, no contexto da presente invenção, é assim um antagonista ou um agonista. A actividade de um antagonista ou um agonista do receptor beta-adrenérgico pode ser determinada medindo a acumulação do mono-fosfato de adenosina cíclica (MFAc, cAMP na terminologia inglesa) em células de ovários de hamster chinês (OHC). As células de OHC podem ser unicamente transfectadas com o ADNc que codifica para o receptor adrenérgico beta-1, beta-2 ou beta-3, sob o controlo do promotor de CMV ou qualquer outro elemento apropriado do promotor. A transfecção das células é realizada utilizando processos padrão de transfecção de células, ver, por exemplo, Joyner, "Genet Targeting: A Practical Approach", Oxford University Press, New Ycrk, 1993. As células que sobre-espressam um dos genes beta-adrenérgicos crescem entãc até a confluência em meio F12 de Ham (Gibco ERL) contendo soro bovino fetal a 10 %, 500 mg/mL de Geneticina, 100 U/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina e 250 ng/mL de fungizone (nome comercial de anfotericina B), de acordo com o processo descrito em American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomes, sétima edição, 1992, p. 36, ATCC CCL 61 CHO-K1. Os compostos dos moduladores beta-adrenérgicos podem ser preparados como solução concentradas a 10 mM em DMSO (DMSO a 0,1 %, concentração final), diluído em meio F12 de Ham e adicionado as células a 10':;õ até XO"’5 M em conjunto com isobutilmetilxantina ΙίΓ'5 M para inibir a actividade de fosfodiesterase. O meio e as células foram então incubados durante 5 minutos a 37 °C. No fim deste período, o meio é aspirtado e faz-se alise das células em HC1 0,01 N. O teor células de MFAc pode então ser determinado por rádio-imuno-ensaio (RIA) utilizando um kit da New England Nuclear (Burlington, Mass.)· Há uma correlação directa entre o teor celular de MFAc e a activação/inibição do receptor beta-adrenérgico. Outros processos para determinar a actividade dos receptores beta-adrenérgicos estão bem descritos na técnica, ver, por exemplo, Vansal and Feller, J. Recept. Signal. Transduct. Res. 19 (1999) 1353-863: Durocher et al., Anal. Biochem. 284 (2000) 316-326.

Exemplos de compostos que correspondem a definição de agente de modulação do receptor beta-adrenérgico incluem, mas não se limitam, a antagonistas conhecidos do receptor beta-adrenérgico tais como timolol, sotalol, esmolol, cateotol, propranolol, betaxolol, penbutalol, metoprolol, acebutolol, atenoloi, metoprolol, pindolol e bisoprolol e os seus sais, hidratos, solvatados e as suas formas de cristal em que podem ocorrer. Outros exemplos de agentes de bloqueio de receptores beta-adrenérgicos estão descritos na patente de invenção norte-americana US 5.776.930. Exemplos preferidos de antagonistas de receptores beta-adrenérgicos são o DL-propanolol, D-propanolol e labetolol. O D-propanolol e o labetolol são antagonistas de receptores beta-adrenérgicos com propriedades de estabilização da membrana, enquanto o D-propanolol é um isómero óptico com uma fraca actividade de bloqueio de beta-adrenérgicos. A adição evetual de antagonistas ou de agonistas de receptores beta-adrenérgicos as composições farmacêuticas da presente invenção para o tratamento de um distúrbio afectivo podem ser úteis no contexto da administração dos agonistas de P2X7R. Isto porque a técnica anterior sugeria que a activação de P2X7R por agonistas pode resultar na morte das células pelo desencadeamento da formação de poros dentro da membrna das células. Contudo, como se vai demonstrar no exemplo 9 do presente pedido de patente de invenção, o efeito da actividade de formação de poros descrito para os agonistas da técnica anterior, só foi observado para muito poucas células. Recentemente, Alzola et al., Cell Signal. 13 (2001), 465-473 mostraram que concentrações de 10 a 300 μΜ de DL-propanolol, D-propanolol ou labetalol podem inibir a actividade de formação de poros de P2X7R sem afectar a abertura da actividade do canal de iões de P2X7R. A partir da patente de invenção francesa FR 2768526 sabe-se também que os moduladores beta-adrenérgicos, por exemplo, os agonistas, são úteis como agentes de inibição da apoptose. De acordo com isto, num enquadramento preferido da presente invenção, os moduladores dos receptores beta-adrenérgicos, incluindo os antagonistas e os agonistas, são administrados em combinação com agonistas de P2X7R para o tratamento de distúrbios afectivos. Os referidos antagonistas ou agonistas dos receptores beta-adrenérgicos são administrados, preferencialmente, numa concentração de 10 a 300 μΜ. A dose, a preparação farmacêutica e a libertação do agente de modulação de P2X7R (isto é, o agonista) para utilização de acordo com a presente invenção podem ser formulados de uma forma convencional de acordo com os processos encontrados na técnica, utilizando um ou mais veículos ou escipientes fisiológicos. Ver, por exemplo, Ansel et al., "Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", 7& edição, Lippincolt Williams & Wilkins Publishers, 1999. Assim, o agente de modulação de P2X7R e os seus sais e solvvatados, aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico, podem ser formulados para administração por inalação, insuflação (quer através da boca ou do nariz), por via oral, bucal, parentérica ou administração rectal.

Para administração oral, a composição farmacêutica do agente de modulação de P2X7R pode ter, por exemplo, a forma de comprimidos ou cápsulas preparados por meios convencionais com excipientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, tal como agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona, hidroxipropíl-metilcelulose), cargas (por exemplo, lactose, celulose microcristalina, hidrogeno-fosfato de cálcio), lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco, sílica), desintegrantes (por exemplo, amido de batata, glicolato de amido e sódio), ou agentes de molhagem (por exemplo, sulfato de laurilo e sódio). As preparações líquidas para administração oral podem ter a forma, por exemplo, de soluções, xaropes ou suspensões ou podem apresentar-se como um produto anidro para reconstituição com água ou com outros veículos apropriados, antes de ser utilizado. Essas preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico tal como agentes de suspensão (por exemplo, sorbitol, xarope, derivados de celulose, gorduras comestíveis hidrogenadas), agentes de emulsão (por exemplo, lecitina, acácia), veiculos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool de etilo, óleos vegetais fraccionados), conservantes (por exemplo, p-hidroxicarbonatos de metilo ou de propilo, ácidos sóricos). As preparações podem também conter sais tampão, aromatizantes, corantes e agentes de adoçamento quando se considerar apropriado. As preparações para administração oral podem se formuladas de forma apropriada para originar uma libertação controlada do agente de modulação da actividade de P2X7R.

Para administração por inalação, o agente de modulação de P2X7R (isto é, o agonista) para ser utilizado de acordo com a presente invenção, é libertado de uma forma conveniente sob a forma de uma forma de apresentação de aerossol pulverizável a partir de uma embalagem pressurizada ou de um nebulizador, com a utilização de um propelente apropriado (por exemplo, diclorodifluormetano, triclorofluorometano, diclorotetrafluorometano, dióxido de carbono ou outro gás apropriado). No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada utilizando uma válvula para libertar uma quantidade medida. As cápsulas e cartuchos, por exemplo, de gelatina, para serem utilzados num inalador ou num insuflador, podem ser formulados de modo a conterem uma mistura de pós do agente de modulação da actividade de P2X7R e uma base de pó apropriada tal como lactose ou amido.

Um agente de modulação de P2X7R (isto é, o agonista), pode ser formulado para administração paerntérica por injecção, por exemplo, por injecção de bólus ou por infusão continua. A via da injecção inclui a intra-venosa, intra-peritoneal ou a sub-cutânea. As formulações para injecção podem apresentar-se em formas de dosagem unitárias (por exemplo, em frascos, em embalagens com várias doses) e com um conservante adicionado. 0 agente de modulação da actividade de P2X7R pode tomar formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos aquosos ou oleosos e pode conter agentes de formulação tal como agentes de suspensão, de estabilização ou de dispersão. Alternativamente, o agente pode estar sob a forma de pó para reconstituição com um veículo apropriado (por exemplo, água esterilizada isenta de pirogénio) antes da sua utilização.

Pode-se pretender que o agente de modulação de P2X7R (isto é, o agonista) se apresente numa embalagem, dispositivo farmacêutico distribuidor que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitárias contendo o referido agente. A embalagem pode conter, por exemplo, uma folha de metal ou de plástico, tal como uma embalagem em blister. A embalagem ou o dispositivo farmacêutico distribuidor podem estar acompanhados com as instruções para administração.

Num enquadramento mais preferido, as utilizações mencionadas antes são consideradas para tratar distúrbios afectivos seleccionados no grupo que consiste em depressão nervosa, distúrbio de ansiedade generalizada e doença bipolar.

Num enquadramento particularmente preferido, a referida depressão nervosa selecciona-se no grupo que consiste em depressão clínica, distímia, depressão atípica, distúrbio disfórico pré-mestrual e distúrbios afectivos sazonais.

Num outro enquadramento particularmente preferido, o referido distúrbio de ansiedade generalizada é seleccionado do grupo que consiste em distúrbio de pânico, fobias, agorafobia, fobia social, fobia específica, distúrbio obsessivo compulsivo, distúrbio de stress pós-traumático, distúrbio da ansiedade da separação, mania, hipomania e distúrbio ciclotimico.

Um enquadramento ainda também particularmente preferido é aquele em que o distúrbio bipolar é um distúrbio bipolar do tipo I ou um distúrbio bipolar do tipo II.

Adicionalmente, o presente pedido de patente invenção tem por objecto um kit que compreende a molécula de ácido nucleico, o vector, o hospedeiro, o polipéptido, o anticorpo ou o aptâmero, o iniciador ou o par de iniciadores aqui descrito ou a molécula, conforme identificado ou caracterizado num processo que se segue da presente invenção. Com vantagem, o kit compreende ainda, eventualmente, (a) tampões de reacção, soluções de armazenagem e/ou reagentes ou materiais de permanência requeridas para a realização dos ensaios científicos ou de diagnóstico ou similares. Além disso, as partes do kit da presente invenção podem ser embaladas individualmente em frascos ou garrafas ou, em combinação, em contentores ou unidades com embalagens múltiplas. 0 kit pode ser utilizado, com vantagem, inter alia, para realizar o processo de produção de um polipéptido descrito antes, os processos de identificação e/ou caracterização das moléculas que interagem especificamente com os canais de iões com barreira de ATP de . conforme descrito aqui a seguir e/ou pode ser utilizado numa variedade de aplicações aqui referidas, por exemplo, como kits de diagnóstico, como ferramentas de investigação ou ferramentas terapêuticas. Adicionalmente, o kit pode conter meios para a detecção apropriada para fins científicos, médicos e/ou de diagnóstico. 0 fabrico dos kits segue preferencialmente processos padronizados que são conhecidos pelos especialistas na técnica.

Além disso, o presente pedido de patente de invenção descreve um processo para a identificação de compostos ou de misturas de compostos que são capazes de interagir especificamente com um polipéptido aqui descrito, compreendendo as etapas de (a) contacto de um dos polipéptidos descritos antes com um composto candidato ou uma mistura de compostos a ser ensaiados; e (b) a determinação se o referido é capaz de interagir especificamente com o referido polipéptido. 0 polipéptido pode ser dado directamente ou por expressão de uma molécula de ácido nucleico correspondente ou um vector como se descreveu antes, por exemplo, in vitro ou numa célula hospedeira apropriada.

Adicionalmente, a presente invenção descreve um processo para a caracterização de compostos que são capazes de alterar as caracteristicas dos polipéptidos aqui descritos, compreendendo as etapas de (a) contacto de um polipéptido descrito antes com o respectivo composto; e (b) a determinação se o composto altera uma caracteristica do referido polipéptido. A expressão "alteração da caracteristica dos polipéptidos aqui decritos" significa que as caracteristicas funcionais desses polipéptidos, em comparação com as caracteristicas funcionais que tenham sido contactados antes com os compostos identificados pelo processo descrito antes, estão alteradas, isto é, mudadas. A referida identificação e/ou caracterização dos compostos que são capazes de interagir com ou de alterar as caracteristicas do polipéptido descrito antes, pode ser, inter alia, conseguida pela transfecção de um hospedeiro apropriado com uma molécula de ácido nucleico descrito antes. Os referidos hospedeiros compreendem, mas não se limitam a células de HEK 293 ou são injectados em oócitos de sapos, preferencialmente um oócito de Xenopus para a expressão funcional (Goldin, Methods Enzymol. 207 (1992), 266). Os canais expressos de P2X7R com barreira de ATP podem ser examinados utilizando técnicas padrão de medição de correntes através da membrana neuronal por meio de dois eléctrodos (Stuhmer, Methods Enzymol. 207 (1992), 319; Kahler, Science 273 (1996), 1709). Depois da expressão de um canal de iões de P2X7R com barreira de ATP, tal como descrito aqui, as correntes das membranas podem ser deduzidas na ausência e/ou na presença da molécula a ser identificada e/ou caracterizada. Os processos para a redução das correntes das membranas são bem conhecidos na técnica e compreendem, por exemplo, processos de medição de correntes através da membrana neuronal, conforme descrito em Hamill, Pfluger's Arch. 391 (1981), 85-100 ou técnicas de medição de correntes através da membrana neuronal por meio de dois eléctrodos, conforme descrito em Methfessel, Pflugers Archive 407 (1986), 577-588. De acordo com a presente invenção, a expressão "interacção com os polipéptidos aqui descritos" significa que estes polipéptidos interagem directamente e/ou indirectamente com compostos identificados pelo processo descito antes. Além disso, o presente pedido de patente de invenção descreve um processo de avaliação de moléculas que são capazes de interagir com o polipéptido descrito antes, comparando as etapas de (a) contacto do referido polipéptido com uma molécula; e (b) a medição e/ou a detecção de uma resposta; e (c) a comparação da refeida resposta com uma resposta padrão conforme medido na ausência da referida molécula candidata.

Também se descreve aqui um processo para a identificação de um composto que é capaz de aumentar oureduzir a expressão do gene de P2X7R que compreende as etapas de contacto de uma célula que expressa o gene de P2X7R do seu promotor natural ou um gene repórter conduzida por o promotor de P2X7R e a determinação se a expressão do gene está aumentada ou reduzida quando comparada com as condições em que o composto não está presente. As moléculas candidatas potenciais ou as misturas candidatas de moléculas podem ser, inter alia, substâncias, compostos ou composições que são de origem química ou biológica, que ocorrem naturalmente e/ou que são produzidas de forma sintética, recombinante e/ou química ou compostos ou composições aqui descritas antes. Assim, as moléculas candidatas podem ser proteínas, fragmentos de proteínas, péptidos, aminoácidos e/ou dos seus derivados ou outros compostos, tal como iões, que se ligam a e/ou interagem com canais de iões de P2X7R com barreira de ATP, de origem natural. Essa ligação e/ou interacção dos compostos candidatos podem ser encontrados utilizando, inter alia, sistemas de fungos com dois híbridos ou sistemas modificados de fungos com dois híbridos, conforme descrito, por exemplo, em Fields, Nature 340 (1989), 245-246; Gyuris, Cell 75 (1993), 791-801; ou Zervos, Cell 72 (1993), 223-232.

Além disso, as moléculas candidatas potenciais podem ser contactadas por uma célula, tal como um oócito ou uma célula de HEK 293, que expressão um polipéptido descrito antes ou com um fragmento da membrana compreendendo esse polipéptido e uma resposta correspondente (inter allia, uma resposta a dose, uma resposta a corrente ou uma simples resposta ao canal da corrente) pode ser medida de modo a elucidar qualquer efeito que a referida molécula candidato causa.

Descrevem-se aqui também processos para identificar, caracterizar e para avaliar moléculas que são capazes de interagir com os canais de iões ae P2X7R com barreira de ATP aqui descritos, que compreendem os chamados processos de avaliação de elevado rendimento e abordagens similares que são conhecidas na técnica [Spencer, Biotechnol. Bioeng. 61 (1998) , 61-67; Oldenburg, Anne. Rev. Med. Chem. 33 (1998), 301-311) e que se realizam utilizando placas de 96 cavidades, 384 cavidades, 1536 cavidades (e outras) disponíveis comercialmente. Outros processos que se podem utilizar compreendem, mas não se limitam a leituras homogéneas de fluorescência em sistemas de avaliação de elevado rendimento (tal como descrito, inter alia, em Pope, Drug Discovery Today 4 (1999), 350-362). O processo para a identificação, caracterização e/ou avaliação de moléculas capzes de interagir com os canais de iões de P2X7R com barreira de ATP pode, inter alia, utilizar hospedeiros tal como se definiu aqui, que expressam o polipéptido descrito antes. Os ensaios com base nas células, a instrumentação para os referidos ensaios e/ou as medições são bem conhecidos na técnica e estão descritos, inter alia, em Gonzalez, Drug Discovery Today 4 (1999), 431-439 ou Ramm, Drug Discovery Today 4 (1999) , 401-410. Também se considera que as avaliações de elevado rendimento aqui deescritas são feitas utilizando, por exemplo, ARNc, isto é, ARN sintético a partir de uma esrutura de ADNc) que pode ser introduzido nas células hospedeiras, tal como oócitos de Xenopus utilizando processos de rotina na técnica. Como exemplo, pode utilizar-se a injecção directa de ácidos nucleicos, tal como o sistema de injecção de Eppendorf (Micromnipulator 5171 e Transjector 5242). As células injectadas/transformadas podem ser analisadas para correntes de iões de cerca de 4 horas depois de se ter utilizado as técnicas de medição de correntes através da membrana neuronal que são vulgarmente utilizadas na técnica.

Adicionalmente, o presente pedido de patente de invenção descreve um processo para a produção de uma composição farmacêutica compreendendo as etapas de um processo para a identificação, caracterização e/ou avaliação de moléculas capazes de interagir com e/ou de alterar os canais de iões de P2X7R com barreira de ATP e ainda compreendendo uma etapa em que é gerado um derivado da referida molécula caracterizada e/ou avaliada. Esse derivado pode ser gerado por, inter alia, peptidomiméticos. 0 pedido de patente de invenção tem ainda por objecto um processo para a produção de uma composição farmacêutica, cujas etapas foram descritas antes, para a identificação, caracterização avaliação e/ou derivação de moléculas capazes de interagir com e/ou de alterar as caracteristicas de canais de iões de P2X7R com barreira de ATP e para a formulação das moléculas identificadas, caracterizadas e avaliadas e/ou derivadas numa forma aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Preferencialmente, o processo é um processo em que a refeida molécula compreende moléculas neuroprotectoras, nortrópicas e/ou anti-epilécticas.

Ainda um outro aspecto é a utilização de um polipéptido de em particular os descritos aqui, para identificar agentes biológicos, quimicos ou farmacológicos que podem ter um efeito anti-depressivo. 0 termo "agente" refere-se a um composto ou a uma composição química capaz de induzir um efeito terapêutico ou profiláctico desejado quando administrado apropriadamente a um indivíduo ou célula. Por exemplo, a presente descrição permite a geração de células que expressam P2X7R para a identificação e caracterização de agentes que modulam o inflexo e o efluxo iónico. Por exemplo, as células HEK293 ou outras linhas de células (por exemplo, HCN-1 A, HCN-2, HIT-Ti 5, RIN-mSF, betaIC3, PC12, HT22, SH-SY5Y, Neuro2A oo CA77), podem ser transfectadas de forma estável com ADNc que codifica a P2X7R humana e colocadas em placa em placas com 12, 96 e 384 cavidades. As referidas células são postas em cultura num meio apropriado. Os exemplos desses meios são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 4 * edição, Wiley-Liss Publishing, 2000.

As referidas células podem então ser pré-incubadas com os referidos agentes durante 15 min antes da estimulação com ATP 3 mM durante 10 minutos. Terminações as reacções por aspiração rápida do meio extracelular em cada cavidade. As células em cada cavidade são em seguida extraídas durante a noite com 1 mL de HN03 a 10 %. O teor de potássio (K+) nos extractos pode ser determinado por espectrofotometria de absorvência atómica. Mede-se então a função dos agentes pela percentagem de inibição ou de estimulação de KT libertado, desencadeada por ATP 3 mM e comparando com o K+ libertado na ausência dos agentes. A actividade de P2X7R pode também ser acompanhada de acordo com o movimento do cálcio (Ca2+; ver Denyer et al., Drug Discov. Today 9 (1998), 323-332; Gonzálea et al., Drug Discov. Today 9 (1999), 431-439; Holmchen e Waters, Eur. J. Pharmacol. 447 (2002), 119-129). Também se podem verificar os agentes na ausência de ATP. A actividade de P2X7R pode também ser monitorizada de acordo com a secreção dos neurotransmissores tais como glutamato e AGAB (ácido gama-aminobutírico, GABA na terminologia inglesa). Os níveis de neurotransmissores nas células tratadas podem ser quantificados por processos apropriados, por exemplo, ensaio imuno-absorvente ligado a enzimas (ELISA), rádio-imuno-ensaio (RIA), cromatografia líquida de elevada resolução (CLER). Utilizando estes processos, pode-se avaliar um grande número de compostos quanto ao aumento da secreção dos neurotransmissores (por exemplo, glutamato). A libertação de glutamato pode ser medida, por exemplo, por ensaios fluorométricos de libertação de glutamato (por exemplo, kit de ensaio de ácido glutâmico vermelho de amplex/oxidase de glutamato, Molecular Probes) ou ElectroFisiologia de elevado rendimento.

Ainda se vai descrever aqui que os polipéptidos de P2X7R aqui descritos são utilizados num processo para a identificação de compostos ou de agentes com actividade agonista com os referidos polipéptidos de P2X7R ou com os polipéptidos descritos antes. Os agentes e compostos são definidos e descritos aqui antes e a seguir. Em particular, as células que expressam o gene de P2X7R entram em contacto com os agentes, moléculas ou compostos candidatos, conforme foi aqui descrito antes e mede-se quer o influxo de cálcio ou a entrada de brometo de etidio, por processos conecidos na técnica, aqui descritos antes e, em particular, descritos no exemplo 8 a seguir. As células utilizadas no processo para a identificação de agonistas de P2X7R são preferencialmente as células de uma linha de células do hipocampo. As linhas de células do hipocampo são preparadas por processos conhecidos na técnica, por exemplo, descritas nas patentes de invenção europeias EP 0 773 287 ou EP 0 773 292. Exemplos não limitativos de linhas de células do hipocampo são células H19-7 do hipocampo de ratos (ATCC-2526) descritas em Eves et al. Proc. Matt. Acad. Sei. USA 89 (1992), 4373-4377, células HN9.10 do hipocampo de ratos descritas em Lee et al. J. Neurosci. 10 (1992), 1779-1787 ou células Hi5B do hipocampo de ratos descritas em Renfranz et al., Cell 66 (1991), 713-729. Preferencialmente, as células do hipocampo utilizadas de acordo com o processo mencionado antes são células das séries HT (ver Davis e Maher (1994), Brain Res. 652, 169-173),

Morimote e Koshland (1990), Neuron 5, 875-880). Prefere-se que as células do hipocampo expressem o gene endógeno de P2X7R. Contudo, também se pretende que essas células possam ser geneticamente modificadas por meio da introdução de um gene exógeno de P2X7R utilizando processos normalmente conhecidos na técnica. Mais preferncialmente, as células HT-22 são utilizadas para a identificação de agonistas dos polipéptidos de P2X7R aqui descritos ou dos polipéptidos e as células HT-39 são utilizadas como um controlo negativo, conforme descrito no exemplo 8 a seguir.

Por exemplo, as células são transfectadas com estruturas de ácidos nucleicos que codificam um gene repórter regulado pelo promotor de P2X7R (ver antes), em que um aumento ou diminuição na expressão do gene repórter em resposta aos agentes biológicos ou farmacêuticos pode ser analisado utilizando processos que detectam níveis ou estados da proteína ou do ARNm presentes na células correspondente ou pode-se detectar as actividades biológicas do gene repórter. As moléculas repórter ou os marcadores apropriados, que podem ser utilizados, incluem radionucleótidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminescentes ou cromogénicos, assim como substratos, co-factores, inibidores, partículas magnéticas e similares. 0 desenho desses ensaios de avaliação de fármacos é bem conhecido da técnica; ver Harvey ed., 'Advances in drug discovery techniques', John Wiley and Sons, 1998; Vogel and Vogel eds., 'Drug discovery and evaluation: Pharmaceutical assays', Springer-Verlag Berlin, 1997). Por exemplo, a avaliação de fármacos em modelos de animais, em ensaios in vitro, utilizando células de animais ou ensaios in vivo envolvendo ensaios de toxicologia em animais. Pode-se utilizar um modelo in vitro para avaliar bibliotecas de compostos em qualquer uma das variedades de técnicas de avaliação de farmacos.

Os agentes candidatos englobam numerosas classes químicas, embora normalmente sejam moléculas orgânicas, preferencialmente compostos orgânicos pequenos com um peso molecular de mais do que 50 e menos do que cerca de 2.500

Daltons. Os agentes candidatos compreendem grupos funcionais necessários para a interacção estrutural com proteína, particularmente com a ligação de hidrogénio e normalmente incluem pelo menos uma amina, um grupo carbonilo, hidroxilo ou carboxilo, preferencialmente pelo menos dois dos grupos químico funcionais. Os agentes candidatos muitas vezes compreendem estruturas carbocíclicas ou heterocíclicas e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas com um ou mais dos grupos funcionais anteriores.

Os agentes candidatos encontram-se também entre biomoléculas, incluindo péptidos, aminoácidos, sacáridos, ácidos gordos, esteróides, purinas, pirimidinas, ácidos nucleicos e derivados, análogos estruturais ou as suas combinações. Os agentes candidatos obtêm-se de uma vasta variedade de fontes incluindo bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Por exemplo, estão disponíveis numerosos meios para sínteses aleatórias e directas de uma grande variedade de compostos orgânicos e biomoléculas, incluindo a expressão aleatória de oligonucleótidos e oligopéptidos. Alternativamente, estão disponíveis ou podem produzir-se facilmente bibliotecas de compostos naturais sob a forma de extractos de bactérias, fungos, plantas e animais. Além disso, as bibliotecas e compostos naturais ou produzidos por síntese são facilmente modificados através de meios químicos, físicos e bioquímicos convencionais e podem ser utilizados para produzir bibliotecas combonatórias. Os agentes farmacológicos conhecidos podem ser submetidos a modificações químicas ou aleatórias, tais como acilação, alquilação, esterificação, amidificação, etc., para produzir análogos estruturais.

Uma outra técnica para para avaliação do fármaco que pode ser utilizada, providencia uma avaliação de alto rendimento de compostos que têm afinidade de ligação apropriada com a proteína de interesse tal como descrito no pedido de patente de invenção PCT publicada WO 84/03564. Neste processo, que se aplica às proteínas descritas aqui, providencia-se um grande número de compostos de ensaio pequenos e diferentes, por exemplo, aptâmeros, péptidos, compostos de baixo peso molecular, etc., são fornecidos ou sintetizados num substrato sólido, tal como alfinetes de plástico ou uma outra superfície qualquer. Os compostos de ensaio reagem com as proteínas ou os seus fragmentos e são lavados. As proteínas ligadas são detectadaspor processos bem conhecidos na técnica. As proteínas purificadas podem também ser revestidas directamente sobre placas para serem utilizadas nas técnicas de rastreamento de fármacos mencionadas antes. Alternativamente, os anticorpos não neutralizados podem ser utilizados para capturar o péptido e imobilizá-lo num suporte sólido. Num outro enquadramento, pode-se utilizar ensaios comparativos de avaliação dos fármacos em que anticorpos de neutralização capazes de se ligarem as proteínas concorrem especificamente com um composto de ensaio para a ligação da proteína. Desta maneira, os anticorpos podem ser utilizados para detectar a presença de qualquer péptido, que partilha um ou mais determinantes antigénicos com a proteína. O presente pedido de patente de invenção descreve ainda em particular um processo em que a composição farmacêutica a ser produzida ainda compreende substâncias neuroprotectoras, substâncias nootrópicas, azul brilhante, piperidina ou os seus derivados, derivados de adamantina, compostos de fenilo substituídos, ATP oxidado, 2-0-(4-benzoilbenzoil)adenosina-5-trifosfato ou 3-0-(4-benzoiibenzoiijadenosina-5-trifosfato. Também se pretende que as composições farmacêuticas a ser produzidas compreendem ainda antidepressivos tais como fluoxetina, paroxetina, serfralina, fluroxamina, reirtazapina, reoretina, nefazodona ou carbonato de lítio.

Preferencialmente os compostos dos processos mencionados antes compreendem antagonistas, antagonistas parciais, agonistas parciais a/ou agonistas para P2X7R de canais de iões com barreira de ATP.

Quando utilizado aqui, o termo "antagonista" indica moléculas/substâncias que são capazes de inibir e/ou reduzir um efeito agonistico. 0 termo "antagonista" compreende antagonistas concorrentes, não concorrentes, funcionais e químicos, descritos, inter alia, em Mutschler, "Arzneimittelwirkungen" Uwíasòj Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Alemanha. A expressão "antagonista parcial" quando utilizada aqui, significa uma molécula/substância que é capaz de bloquear de forma incompleta a acção de agonitas, através, inter alia, de um mecanismo não concorrente. Neste contexto, um antagonista é preferencialmente um fármaco que não dá uma resposta por si próprio, mas bloqueia as respostas mediadas pelos agonistas. É uma entidade química que opõe as respostas associadas ao receptor normalmente induzidas por outro agente bioactivo. Para P2X3E# os antagonistas têm uma CI50 entre 10 nanomolar e 30 micromolar.

Como "agonoistas", de acordo com a presente invenção, indicam-se as moléculas/substâncias que têm uma afinidade assim como uma actividade intrínseca. Na maior parte dos casos, a referida actividade intrínseca (a) é definida como sendo proporcional ao quociente do efeito provocado por o referido agonista (EA) e o efeito que se pode obter obter de uma forma mazimizada num dados sistema biológico (Emax); por isso, a actividade intrínseca pode ser definida como A actividade intrínseca relativa mais elevada resulta de EA/Emax=l. Os agonostas com uma actividade intrínseca de 1 são agonostas completos, enquanto as substâncias/moléculas com uma actividade intrínseca t 0 e <1 são agonistas parciais. Os agonistas parciais mostram um duplo efeito, isto é, compreendem efeitos agonísticos assim como efeitos antagonísticos. Preferencialmente, no contexto da presente invenção, um agonista (ou um agonista completo) é uma substância endógena ou um fármaco que pode interagir com um receptor e iniciar uma resposta fisiológica ou farmacológica máxima ou completa, característica desse receptor. ATP. 0 ligando natural para P2X7R, é um agonista com uma CE50 de 300 micromolar enquanto o agonista Bz-ATP de P2X7R sintético tem uma CE50 de 8 micromolar. Assim, os agonistas de P2X7R têm uma CE50 igual ou inferior a 300 micromolar. A CE50 é definida como a concentração de agonista que provoca uma resposta que está a meio entre a resposta de base e a resposta máxima numa curva de resposta a dose em que o eixo dos X representa a concentração de um agonista e o eixo do Y representa a corrente de iões. Um agonista inverso (também chamado antagonista negativo) é um fármaco que actua no mesmo receptor que o de um agonista, produzindo um efeito contrário. Um agonista parcial é uma substância ou um fármaco endógeno que também provoca respostas fisiológicas ou farmacológicas mas a resposta máxima é inferior a resposta máxima a um agonista completo, independentemente da quantidade de fármaco aplicada. No caso de P2X7R, os agonistas parciais têm CE50s maiores do que 300 micromolecular.

Um especialista na matéria pode, por isso, utilizar facilmente os compostos e os processos aqui descritos de modo a esclarecer os efeitos agonisticos e/ou antagonisticos e/oa as caracteristicas de um compostc/molécula/substância a ser identificado e/ou caracterizado de acordo com um qualquer dos processos descritos antes. Por exemplo, um antagonista identificado de P2X7R do canal de iões com barreira de ATP que compreenda as mutações e/ou as eliminações aqui descritas antes, pode ser útil para restabelecer as propriedades normalmente exibidas pelos canais de iões com barreira de ATP de P2X7R de origem natural. Um agonista identificado de P2X7R do canal de iões com barreira de ATP que compreenda as mutações e/ou as eliminações aqui descritas antes, pode ser útil para restabelecer a perda de funcionalidade dos canais de iões com barreira de ATP de P2X7R.

As figuras mostram:

Figura la. Mapa genómico da região no cromossoma humano 12 associado ao distúrbio afectivo bipolar. Os genes encontram-se entre os marcadores NBG11 e NBG2 conforme descrito.

Figura lb. Gráfico que ilustra a análise em vários momentos, utilizando ASPEX em pares independentes de sib.

Figura lc. Gráfico que ilustra a análise em vários momentos, utilizando ASPEX em todos os pares sib.

Figura ld. Gráfico que ilustra a fase sib de ASPEX considerando apenas pares de sib independentes.

Figura le. Gráfico que ilustra a fase sib de ASPEX considerando todos os pares de sib.

Figura lf. Efeito do polimorfismo P2XR7vl3A nos níveis básicos de cortisol antes e depois da administração de dexametasona (ensaio DST). Os indivíduos foram submetidos ao ensaio nos primeiros dez dias de admissão. Os indivíduos com genótipos AG e GG têm níveis de cortisol significativamente mais baixos antes e após da administração de dexametasona.

Figura lg. Efeito do polimorfismo P2XR7vl3A na resposta ao cortisol durante o ensaio de Dex/CRH. Os indivíduos foram submetidos ao ensaio nos primeiros dez dias de admissão (isto é, na admissão) e nos últimos dez dias antes da saída (isto é, a saída) . Os indivíduos com o genótipo GG têm níveis de cortisol mais baixos na resposta ao ensaio com Dex/CRH na admissão e na saída. Estes resultados são indicativos de um eixo de HPA anormal.

Figura lh. Efeito do polimorfismo P2XR7vl3A na resposta de HACT durante o ensaio de Dex/CRH. Os indivíduos foram submetidos ao ensaio nos primeiros dez dias após a admissão (isto é, na admissão) e nos últimos dez dias antes da saída (isto é, a saída) . Os indivíduos com o genótipo GG têm níveis de HACT mais baixos em resposta ao ensaio com Dex/CRH, na admissão e na saída. Estes resultados são indicativos de um eixo anormal de HPA.

Figure li. Duração do tratamento antidepressivo até a remissão. A depressão foi diagnosticada de acordo com a escala de classificação de depressão de Hamilton (HAM-D; Hamilton, Br. J. Soc. Clin. Psychol. 6 (1967) 278-296). Uma pontuação HAM-D de 10 ou abaixo, é considerada como uma remissão dos sintomas depressivos.

Figura 1 j. Efeito do polimorfismo P2XR7vl3C nos níveis básicos de cortisol antes e depois da administração de dexametasona (ensaio de DST). Os indivíduos foram submetidos ao ensaio nos primeiros dez dias após a admissão. Os indivíduos com o genótipo CC tinham níveis de cortisol elevados após a administração de dexametasona .

Figura Ik. Efeito do polimorfismo P2XR7vl3C na resposta ao cortisol durante o ensaio de Oòx/ÇRíL Os indivíduos foram submetidos ao ensaio nos primeiros dez dias depois da admissão (isto é, na admissão) e nos últimos dez dias antes da saída (isto é, a saída) . Os indivíduos com o genótipo AC ou CC tinham níveis elevados de cortisol em resposta ao ensaio de Dex/CRH na admissão, indicando um eixo de HPA anormal.

Figure 11. Efeito do polimorfismo P2XR7vl3C na resposta a HACT durante o ensaio de Dex/CRH. Os indivíduos foram submetidos ao ensaio nos primeiros dez dias após a admissão (isto é, na admissão) e nos últimos dez dias antes da saída (isto é, a saída) . Os indivíduos com o genótipo CC tinham níveis de HACT mais baixos em resposta ao ensaio de Dex/CRH na admissão e na saída. Estes resultados são indicativos de um eixo de HPA anormal.

Figura 2. Análise de RCP-TI (transcriptase inversa) da sequência de codificação completa de P2X7R nos diferentes tecidos.

Figura 3. Expressão de P2X7R no bolbo olfactivo, hipotálamo e nas células ependimais no cérebro de um rato sem stress. Ampliação de lOOx.

Figura 4. Expressão de P2X7R no hipocampo/giro dentado e orgão sub-comisural no cérebro de um rato isento de stress. Ampliação de iOOx.

Figura 5. Comportamento de flutuação no ensaio de natação forçada. 0 comportamento que lida com o stress passivo diminuiu depois do tratamento de longo prazo com o antidepressivo paroxetina (Par 28: tratado com paroxetina durante 28 dias, per os). Básico n = 8; veiculo n = 8; Par 28 n = 8.

Figura 6. Análise comparativa da expressão de P2X7R no bolbo olfactivo de ratos isentos de stress, tratados com veiculo e tratados com antidepressivo. Ampliação de IOOx.

Figura 7. Análise comparativa da expressão de P2X7R no hipotálamo de ratos isentos de stress, tratados com veiculo e tratados com anti-depressivo. Ampliação de IOOx.

Figura 8. Análise comparativa da expressão de P2X7R em células ependimais de ratos isentos de stress, tratados com veiculo e tratados com anti-depressivo. Ampliação de IOOx.

Figura 9. Análise comparativa da expressão de P2X7R no hipocampo de ratos isentos de stress, tratados com veiculo e tratados com anti-depressivo. Ampliação de 25x.

Figura 10. Expressão de P2X7R no hipocampo de ratos tratados com veiculo. Ampliação de 25x.

Figura 11. Expressão de P2X7R no hipocampo de ratos tratados com o anti-depressivo paroxetina. Ampliação de 25x.

Figura 12. Expressão detalhada de P2X7R no giro dentado (circunvolução cerebral) de ratos tratados com o anti-depressivo paroxetina. Ampliação de 4 00x.

Figura 13. Análise comparativa da expressão de P2X7R e das células apoptóticas no hipocampo de ratos tratados com o anti-depressivo paroxetina. Ampliação de lOOx.

Figura 14. Comportamento de flutuação num ensaio de natação forçada. 0 comportamento que lida com o stress passivo aumentou após uma intra-hipocampal aguda (bilateral, giro dentado) de ARNsi, atingindo P2X7R. Veiculo n = 7; ARN de controlo n = 10; ARNsi de P2X7R n = 9.

Figura 15. Análise comparativa da expressão de P2X7R no hipocampo de ratos tratados com veiculo, ARN de controlo e ARNsi atingindo P2X7R. Ampliação de lOOx na fila superior, ampliação de 25x na fila inferior.

Figuras 16a, b, c, d, e. Três variantes combinadas causadas pelos polimorfismos nos intrões P2X7R.

Figura 17. Expressão de P2X7R em linhas de células do hipocampo imortalizadas.

Figura 18. Aumento do influxo de cálcio nas células do hipocampo, tratadas com um composto agonista de P2X7R (BzATP).

Figuras 19a, b. Entrada do corante do brometo de etidio nas células do hipocampo (a) tratadas com o composto agonista de P2X7R (BzATP) ou (b) pré-tratadas com um composto antagonista de P2X7R.

Figura 19c. Acção agonista de BzATP e tenidap na actividade de P2X7R. A actividade do canal de cálcio de P2X7R humano foi medida em condições básicas durante 4 segundos até 10 segundos. A. Controlo negativo consistindo em células carregadas com Fluo-4-ΑΜ 10 μΜ sem mais tratamento. B. Células tratadas com BzATP 20 μΜ após 4 segundos de medição básica. C. Células tratadas com tenidap 50 μΜ após 4 segundos de medições básicas.

Figura 20. Efeito da injecção intra-hipocampal de um composto agonista de P2X7R (BzATP), no comportamento no ensaio de natação forçada.

Figura 21. Ensaio em campo aberto que mede a actividade locomotora de ratos tratados com um composto agonista de P2X7R (BzATP).

Figura 22. Análise comparativa de células apoptóticas no hipocampo de ratos tratados com uma solução de veiculo de controlo ou com um composto agonista de P2X7R (BzATP).

Figura 23. Efeito da injecção intra-hipocampal do antagonista de P2X7R KN-62 e de ATPo no comportamento durante o ensaio de natação forçada.

Figura 24. Ensaio em campo aberto que mede a actividade locomotora de ratos tratados com os antagonistas de P2X7R KN-62 e ATPo.

Poder-se-á ter uma melhor compreensão da presente invenção e das suas muitas vantagens a partir dos exemplos que se seguem, dados com fins apenas ilustrativos e não pretendendo limitar o âmbito da presente invenção, de nenhuma forma. EXEMPLO 1

Analise da ligação do Distúrbio A£ectivo Bipolar mima População Humana Homogénea

Utilizaram-se 41 famílias, de dimensões diferentes, num total de 485 indivíduos incluídos na amostra, da região de Saguenay/Lac St. Jean, nas análises de ligação. Distribuíram-se os indivíduos de acordo com os seus diagnósticos como se segue: 105 indivíduos sofriam de distúrbio bipolar do tipo I (BPI) ou distúrbio esquizo-afectivo bipolar; 42 indivíduos foram diagnosticados com distúrbio bipolar do tipo II (BPII); 54 indivíduos com depressão profunda recorrente; e 57 indivíduos com um único episódio de depressão profunda. Os restantes 227 indivíduos não estavam afectados e eram normais. Para os fins do cálculo, utilizou-se a classificação seguinte: indivíduos diagnosticados quer com BPI, distúrbio esquizo-afectivo, do tipo bipolar, BPII e depressão profunda recorrente, foram considerados como afectados (n=201); indivíduos com um episódio único de depressão profunda, foram classificados como fenótipo desconhecido (n=57); e todos os outros foram diagnosticados como não afectados (n=227).

Recolheram-se amostras de sangue de cada um dos indivíduos em tubos de 10 mL de K3 Vacutainer com EDTA (Becton-Dickinson) e isolou-se o ADN genómico utilizando o kit de isolamento de ADN Puregene (Gentra Systems). Verteu-se o sangue em tubos cónicos de 50 mL e diluiu-se com quatro volumes de solução de lise de células de glóbulos vermelhos do sangue. Após uma incubação de 10 minutos, a temperatura ambiente, o tubo foi centrifugado durante 10 minutos, a 2.000 g e retirou-se o sobrenadante deixando o aglomerado de células para trás e 200-400 pL do líquido residual. Fez-se uma nova suspensão com as células por centrifugação do tubo e adicionou-se 9 mL de solução de lise de células com movimentos da pipeta para baixo e para cima. Adicionou-se 40 pL de uma solução de ARNase A (20 mg/mL) e misturou-se a amostra invertendo o tubo várias vezes. Fez-se a incubação da amostra a 37 °C, durante 15 minutos e arrefeceu-se para a temperatura ambiente. Adicionou-se ao lisado de células 3 mL de uma solução de precipitação de proteínas. O tubo foi vigorosamente centrifugado durante 30 segundos e centrifugou-se a 2.000 g, durante 10 minutos. Verteu-se o sobrenadante num novo tubo contendo 9 mL de isopropanol a 100 %.Misturou-se a amostra invertendo-a cuidadosamente várias vezes. Fez-se a centrifugação do tubo a 2.000 g, durante 5 minutos. Lavou-se o aglomerado branco de ADN com 10 mL de etanol a 70 % e centrifugou-se o tubo a 2.000 g, durante 3 minutos. Retirou-se o etanol e deixou-se o aglomerado secar parcialmente ao ar. Solubilizou-se o ADN em 500 pL de uma solução de hidratação de ADN. Ajustou-se a concentração final para 300-400 pg/mL.

Utilizou-se um processo a base da fluorescência para determinar os genótipos dos marcadores de micro-satélites. Em resumo, amplificou-se a região que engloba cada sequência repetida por RCP, utilizando um iniciador não marcado e um iniciador marcado por fluorescência (Applied Biosystems Inc, CA, EUA). Os corantes associados ao marcador e o comprimento do produto de RCP correspondentes, estão listados no quadro 2. A reacção de RCP foi realizada utilizando 10 ng de amostra de ADN, 0,2 unidades de polimerase de ADN de Taq platina (Invitrogene, CA, EUA), Tris-Cl 20 mM (pH a 8,4), KC1 50 mM, MgC12 1,5 mM, 100 pM de dNTP e 1,5 pM de cada iniciador num volume final de 7 pL. Incubaram-se as amostras a 95 "C, durante 3 minutos para activar a polimerase de ADN de Taq platina, depois fez-se a amplificação por RCP de 10 ciclos como se segue: a 95 "C, durante 15 segundos; a 58 °C, durante 15 segundos; a 72 "C, durante 30 segundos; depois disso realizaram-se 15 ciclos como se segue: a 89 "C, durante 15 segundos; a 58 "C, durante 15 segundos; a 72 "C, durante 30 segundos. Finalmente, incubaram-se as amostras a 72 "C durante 30 minutos. No seguimento da amplificação por RCP juntaram-se as amostras ao seu iniciador marcado com corante e ao seu produto de RCP (conjunto de quatro amostras). Separou-se o conjunto de amostras num analisador de ADN ABI 3100 (Applied Biosystems Inc, CA, EUA). Analisaram-se os dados resultantes utilizando o Genemapper2 (Applied Biosystems Inc, CA, EUA) e compilaram-se numa base de dados a 4D (ACIUS), desenhada num ambiente Macintosh como se descreveu previamente (Morissette et al., Am. J. Med. Genet. (Neuropsychiatr. Genet.) 88 (1999), 567-587).

Os marcadores utilizados nas análises de ligação que se seguem, estão indicados no quadro 2. A fracção de recombinação (q) entre os marcadores sucessivos foi tratada em computador de acordo com as famílias analisadas.

Quadro 2. Marcadores genómicos utilizados para as análises de ligação

Localização Corante Associado Comp. do Alelo (pb; Distância (q) Distância Cumulativa Heterozigo-sidade (%) D12S1619 VIC 170-210 0,0135 0,00 74,5 NBGIl VIC 204-218 0,006 1,37 65.5 ;/.l .-..01 Vvt i V.vA j ; ·· At· 0f091 | 1,3? 0EG1 j VIC .......................................1................................. \ ú,mi t ν,νπ ; 39,2............r .............................................. : ................. ; •·>>.·ί -·\;.ν··:. -·Ν V. : ·}·;>·?-.o> x-. r-si-ct : y 1 "\ · OAV-AOO |; 0,195 j JglC ; 7:2,1 j 'UP viu .....................i................................. IOãaM | 0,01:1 : 7,27 j 13,7 ....... i \ ,:B2---11¾ s .07 0 ;?,·. :· i...................... V..Í -· ·'· -·. A ;:.v:í V;..í : ;:\.0í .0 ................ ; 1 :j 737:9 j VIC: [ ISA-AÃO ( t J-vVOvf 5 ..· V0 ; ; VEÇCO i /Au 1 12 V ---7¾¾ | 1, 27 j 317 j! EM22 ! mts | íos-cíc- 1 íg 0#l.........= 1770 | 10 j /0-66: ! 1,11 ..........!................................. 0¾ i _ J ; ; v':· \ í u ) .:122--566 .v :·Η> :ί, \ ua \ í \ ·λ· : -c. a /1 .6· 1 1,11 1 14,1 Utilizou-se a função de mapa de Haldane para a distância cumulativa em cMorgans Para uma análise paramétrica em dois pontos, utilizou-se a análise de pontuação de MOD em que a pontuação LOD paramétrica foi maximizada em relação aos modelos genéticos.

Os resultados que se seguem foram obtidos sob a análise da pontuação MOD para modelos recessivos.

Quadro 3. Análise de pontuação de MOD para modelos recessivos |Localização Distância Distância Cumulativa (c2) Pontuação LOD (qmax) D12S1619 0, 0135 0,00 3,46 (0,10) >' 66X1 1.,01/6 1,« 4,02 {6,04) 61M1S66. \ 0,001 5 1,2? \ 1:,22 /6,14) ; ..................................................................v..........$.............................. BB! 5 \ 0, 001. 2,0? 1 0,06 10/163 ! ...............................................................................í........42.:,- . :. i p/asmt j cooos | >,n \ 2,0:1 (of::io) | 0256 0,6:11 | 2,67 1 1,51 o), 00) j 0200 6,0X15 ] J,75 | f,77 iD,05) j 020? 6,0035 | 5,?5 6> 75 i 0,22) | OBllO 6,001 ] 5,30 \ 0,74 10,001 j ........ 0,002 í 5,40 ..........................................1........................................................... ..... 2,41 (0,16) i í BB64 1 0,00:1 ! 6,31 .........................................i..........................................!..............................................................................i 3,46 10,50: i 050' '·, " · 6,41 j 5,06 10,051 000: 1 i 7,01 1 .........................................1.........................................-1............................................................i y 54 .</>. ».v> X, V ^ .-.V-x·' í

Realizaram-se estudos de pontuação de LOD isentos ae modelo utilizando ANALYZE, sib....phase do package 1.85 da ASPEX ÍDavid Hinds e Neil Risch 1999; ftp://lahmed.stanford.edu/pub/aspex, ver também http://watson.hqen.pitt.edu/docs/usage.html) e SIMWALK2 (Sobel e Lange, Am J Hum Genet 58 (1996), 1323-1337), para analisar a partilha de alelos entre os pares sib afectados. 0 programa ANALYZE pondera laços familiares de acordo com a sua dimensão. 0 programa de fases de sib de parentesco ASPEX utiliza frequências de alelo para reconstruir a informação que falta e está talhado para conjuntos de dados em que faltam os pais, mas em que se podem utilizar mais filhos tipificados para reconstruir a fase dos pais. 0 SimWalk2 é uma aplicação em computador de estatística genética para o haplotipo (combinação de alelos que não se encontram em equilíbrio de ligamento), a ligação paramétrica, a ligação não paramétrica (LNP), a identidade por descendente (IPD) e as análises de erro de classificação em qualquer classificação de genealogia. SimWalk2 utiliza a cadeia de Markov de Monte Cario (CMMC) e simula os algoritmos de enrolamento para realizar estas análises em vários momentos. A sib....fase do ASPEX foi utilizada com duas estratégias computacionais: primeiro, utilizando pares de parentesco sib estritamente independentes; em segundo, utilizando todas as combinações de pares de parentesco sib afectados. Utilizou-se ASPEX para cálculo quer em dois momentos, quer em vários momentos.

Os resultados dos cálculos para dois momentos observados com ANALYZE e ASPEX estão indicados no quadro 4.

Quadro 4. Resultados em dois momentos observados com o

ANALYZE e o ASPEX

í L rv·. l í w

: YY /,YYY fcsmqisçfe Y·; j j ysã um ίίίΛ feiJí; Y* ImMãm Írí: l ' Λ : /: 2:. ... (C.i; í·;:.: ·"·: : ·:·· j s Y : «ís YY;Y C \< :'l .............. V.V..AWAV.V.V·.·.·,.·». 129 parentesco fase sib D12S1619 0,0135 0, 00 2,31 2,55 3,14 NBG11 0,006 1,37 2,83 2, 71 3,27 D12S1666 0, 301 1,97 1,C 1 2,52 3,14 NBG5 0, 001 Ο Λ 7 eL, f \J ! 0,50 2,52 3,13 D12S1721 0, 005 1 c*7 - / / 2,51 3,12 N3G8 C, 011 2, 67 0, 5 1 2,24 2,75 NBG6 0, 0115 3,79 2,55 2,11 2, 64 NBG9 C,0035 4,95 Ò, 49 1,65 1, 97 NBG10 0, 001 5,30 0, 77 1, 45 2,10 NBG12 0, 009 5,40 0, 47 1,44 2,17 NBG4 0, 001 6,31 1,21 1,29 3,07 NBG3 0, 006 6, 41 1, 84 1,29 3,07 NBG2 7,01 1,24 1,22 3,00 0 SIMWALK2 tratou em computador quatro estatísticas diferentes com base nas árvores de descendentes. Estas estatísticas medem o grau de agrupamento entre os alelos marcadores que descendem dos fundadores. A estatística A é o número dos diferentes alelos que contribuem com os alelos fundadores para o indivíduo afectado e que é a ferramenta mais poderosa para detectar a ligação a um traço recessivo. A estatística B é o número máximo de alelos entre os descendentes afectados de qualquer alelo fundador e é a mais poderosa na detecção da ligação a um traço dominante. A estatística C á a "entropia" dos alelos marcadores entre os afectados. A estatística D é a extensão da partilha de alelos entre todos os pares afectados, conforme se pode medir pelo coeficiente de parentesco da IPD. As estatísticas C e D são estatísticas mais gerais que indicam se alguns alelos fundadores estão excessivamente representados entre os afectados. 0 quadro 5 mostra os resultados observados com SIMWALK2. Os autores assinalam que os valores de p devem ser geralmente conservadores. Estão expressos como -Log (valores de p). Para fins de correspondência, -Log (0,05)=1,30, -Log (0,01)=2, -Log (0,001)=3, etc.

Quadro 5. Análise com o SIMWALK2

Localiz. D i s t. (q) Distância Cumul.(cM) EST(A!-Log (valor p) EST -Log (valor p) EST(C)-Log (valor p) EST(D)-Log (valor f: ULSiRU 1 u 61:¾¾. ·: «0 ΙΙΛΐΜ < ’ Mie U:, UÍU ! ·, uu sisSii rluu )1.,0; polir?· | Í.URS j R fUS IRO URL i 6,4U I R U 1ÍR já )Ul ' 1 - ;1 V j i.. vl.U Wír· ?;u ; u at μ,ν }r ~........ URRO (RRíU RR júR; RRi hçiH auRC'........... dbhOi ].R13:U SlíH j 6, R ; 1 i .RU | . ·· ; çus <- :··' :* RR | UOUR ; jU.UÚ URU .................... U V; >< RR6 j juR juRU LM®» 1,6:161 RÍ|64 R<; ; :,· | URU i a -u; ;· uRU ; ;i. Ru ;hi> URU líRS-S RuUU | fc, 1 i UR SCO u,u a :-:61:11 ÍRíU ; 6.6 ¢).,05 iuv-·: i-L i.u* Ra li RSRÚ K ) [ríR ··»·...:..... *..... · · a RUI ·, Ra

Resultados observados em vários pontos com o ASPEX, quando se utilizaram apenas pares de parentesco independentes (figura lb). O valor máximo de pontuação de LOD foi observado em NBG11.

Resultados observados em vários pontos, com o ASPEX, quando se consideraram todos os pares de parentesco (figura lc) . O valor da pontuação máxima de LOD observou-se em NBG11 mas apareceu um segundo pico em NBG4 e NBG3.

Os valores da pontuação quer em vários pontos, quer em dois pontos de LOD tratados em computador por ASPEX, foram semelhantes. O segundo pico, observado quando se utilizaram todos os pares de parentesco, pode ser explicado pela presença de um indivíduo recombinante afectado, com muitos parentes afectados, partilhando a região cromossómica telomérica com NBG12. Este tipo de indivíduo tem um largo impacto nos valores da pontuação de LOD quanto todos os pares de parentesco são utilizados em vez de um par de parentesco. Esta situação foi observada em dois parentescos.

Realizou-se em seguida a análise por estratos. Embora HOMOG não tenha detectado evidencias de heterogeneidade, o ensaio de homogeneidade foi construído com base na partilha de alelos verificada nas regiões cromossómicas seleccionadas. Utilizaram-se apenas 20 das 41 famílias para esta análise, dado que as outras não estavam genotipadas em todas estas regiões. Por cada marcador dentro das regiões seleccionadas, estimou-se a proporção de IPD de alelos partilhados por pares de parentes afectados com ASPEX (fase de parentesco). Para cada região retida, a proporção de alelos partilhados foi utilizada como uma variável para uma análise do componente principal e o primeiro componente principal como um índice de ligação. A análise de correlação foi feita nestes índices para detectar a heterogeneidade (correlação < 0) ou epistase (correlação > 0) . Utilizou-se o algoritmo de Fisher para classificar em dois grupos de famílias conforme estivessem ligadas ou não ligadas a uma localização particular. Observou-se uma correlação negativa entre a região 12 do cromossoma e a área 15 do cromossoma (r = -0,51; p = 0,023). A análise de agrupamentos sugeriu que 11 das 20 famílias estavam ligadas ao cromossoma 12. Esta sub-amostra foi chama de estratos.

Estes estratos incluíam 11 famílias (266 indivíduos na amostra), que incluem 52 IPD ou distúrbios esquizo-afectivos, do tipo bipolar, 20 BPII e 20 depressões nervosas recorrentes.

Os valores da pontuação MOD que se seguem, ilustrados no quadro 6, foram obtidos em modelos recessivos.

Quadro 6. Pontuações de MOD em modelos recessivos

Localização Distância (q) Distância Cumulativa (cM) Pontuaçao LOD D12S1619 0, 0135 O O o 4,03 OO O o ÍN3G11 3,006 1,37 4,98 : D12S1666 0, 001 1,97 1,45 (0,12) NBG5 0,301 ....................................... 2, 07 0,79 (0,14) (fim • ···; .·: ’s · · < ' 4 si:}· < V jv v,· ;,: IMM 8U·. ‘' NBG6 0,C115 3,79 5,06 (0,06) N3G9 0,0035 4,95 1,57 1-i o M3G10 0,001 5,30 1,73 (0,00) NBG12 0,009 5,40 1,65 (0,12) NBG4 C,001 LiSÍ 4.,¾¾ : :.· y y \ w, «Ufe Mi - . . Ih ** MM? _ ί,δΐ ·; (t <!

Os resultados da pontuação de LOD isenta de modelo obtidos com ANALYZE e ASPEX, aplicados aos estratos, estão indicados no quadro 7.

Quadro 7. Pontuação de LOD isenta de modelo obtida com

ANALYZE e ASPEX

Localiz. Dist. (q) ...... Dist. Cumulat. .. Pontuação ; de LOD em ANALIZE Pontuação de L00 em fase de parentesco independentement e dos pares de parentesco Pontuação ; de todos os pares de parentesco em LCD da fase de pârentesco .·· «λ·: .%· ··;<.<· .<· 0,0135 lAbs'' 7,65 0, 006 h-m ' ' ' ......................... 'v ; 1·:' :·. vi ν' iLsl .......................______* 0, 001 ‘ n\; ·:·; <·; ...... 7,7 i 0,001 V,. o.·:·. X

Os resultados isentos de modelo observados com SIMWALK2 estão ilustrados no quadro 8.

Quadro 8. Pontuação de LOD isenta de modelo obtida com SIMWALK2

Os resultados em vários pontos nos estratos com a fase de parentesco de ASPEX, considerando apenas pares de parentesco independentes (figura lb) ou todos os pares de parentesco (figura 1c), estão indicados nas figuras ld e le. Como já foi referido antes, apareceu um segundo pico quando se observaram todos os pares de parentesco. Calculou-se um intervalo de confiança. Utilizou-se GENEFINDER (Liang et al.,

Am. J. Hum. Genet. 66 (2000), 1631-1641) para estimar a localização do gene de susceptibilidade (digamos t). O processo baseia-se na identidade por descendente (IPD), partilhada pelos pares de parentesco afectados para múltiplos marcadores. Para o fim da nossa análise, dividiram-se as gerações em parentescos, Utilizaram-se 56 famílias nucleares e 183 pares de parentesco. Liang K. Y., Huang C. Y., Beaty T. H. (2000) . Uma abordagem de amostragem unificada para análises em vários pontos de traços qualitativos e quantitativos de pares de parentesco. Am J Hum Genet 66: 1631-1641.

Os pontos que resultam do GENEFINDER para a localização de um gene de susceptibilidade para distúrbios afectivos a 3,19 + 0,446 cM telomérico em relação ao marcador D12S1721 (D12S1721 está localizado aproximadamente a 136,82 cM no mapa do cromossoma 12 de Marshfield ponderado com o sexo). 95 % I.C. : [2,32, 4,061; 99 % I.C. : [2,03, 4,351; 99, 9 % I.C. : [1,71, 4,67]. DOS estratos, obtiveram-se 24 núcleos e 107 pares de parentesco e a localização do gene de susceptibilidade foi estimada em 3,07 i 0,57 (ver mapa anterior). Obteve-se o intervalo de confiança (I.C.) que se segue: 95 % I.C. : [1,95, 4,191; 99 % I.C. : 11/59, 4,551; 99, 9 0,. "o I.C. : [1,18, 4,96].

Um estudo de associação utilizando marcadores de micro-satélite NBG foi feito com GLUMP (Sham & Curtis, Ann. Hum. Genet. 59 (1995), 97-105). As amostras foram distribuídas como se segue: 83 indivíduos do sexo masculino/caso; 124 indivíduos do sexo feminino/caso; 95 indivíduos do sexo masculino/controlo; e 101 indivíduos do sexo femini-no/controlo. Utilizou-se 100 simulações para estimar o valor de p. Os resultados observados estão resumidos no quadro 9.

Quadro 9. Estudo de associação utilizando um micro-satélite

de NBG

Localização Amostra Estatíst. tl Estatíst. T2 Estatíst. T3 Esiatist. T4 Caso Controlo (valor de p) (valor de p) (valor de p) (valor ae pí NBGil 204 129 0,226 0,562 0,410 0,421 NBGS 206 194 0,972 C, 980 0,948 0,971 NBG8 206 194 0,983 1,000 0,994 0,978 NBG6 206 194 0,147 0,074 0,759 0, 485 NEG9 206 190 0,512 0,940 0,786 0,583 NBG 10 206 190 0,594 0, 480 0,403 0, 709 NBG 12 206 190 0,002 0,019 0,003 0,117

Estatística TI e a estatística usual do qui quadrado no quadro de contingência Estatística T2 é a estatística usual do qui quadrado aplicada no quadro de contingência obtido depois das colunas de colapso com os pequenos valores espectáveis em conjunto Estatística T3 e a maior estatística do qui quadrado obtida comparando uma coluna do quadro original com o total das outras colunas

Estatística T4 é a maior estatística do qui quadrado obtida comparando qualquer combinação de alelos com o resto

Apenas o marcador NBG12 deu uma associação significativa ao nível de 1 %. Para os outros marcadores, não apareceram alelos isolados que parecessem estar associados ao distúrbio bipolar. Não parece que nenhuns alelos fundadores estivessem representados entre os indivíduos afectados. Não houve nenhum resultado significativo para a associação dos genótipos com os marcadores NBG.

Mais estudos de associação com base em marcadores de micro-satélite utilizando CLUMP, foram realizados nas amostras contendo mais indivíduos de controlo e indivíduos com casos. Utilizou-se 1.000 simulações para estimar os valores de p.

Quadro 9a. Valores de p empíricos observados com CLUMP nas estatísticas TI e T3 para as análises alélicas e genotípicas de marcadores de micro-satélites

Alelos 'Genótipos Nome Efectivo Tl T3 Tl Ti Caso Controles í (valor p) (valor p) :(valor p) <· 204 98 0250 0, 421 0,680 208 175 0,366 0, 543 0,393 ; (i* si Λ >iy 213 179 0,969 0,934 0,997 210 176 0,693 0,463 0,805 Si-Sí# NBG8 213 179 0,754 0,921 0,973 : í.:;‘ Λ P · NBG6 213 179 0, 008 0,356 0,172 NBG9 213 175 0,759 0,768 0,690 : S NBG10 213 175 0,521 0,178 0,122 : I.S· trmsíi* 212 180 0,887 0,864 O, 782 sbs:;:;í: 213 175 m,002 0,018 QySiti 207 178 0,418 0,506 0,813 ÇçÇííi 209 175 :0,171 0,829 0,601 211 180 0,171 0, 405 0,540 210 170 0,896 0, 749 0,210 ό,ϋί; itiisllíhd 210 179 0,803 0,692 0, 710 f v· d* i 211 180 0,394 0, 740 0, 445 .v-íi á 2 y : 209 179 0,890 0,869 0,895 S-Ã* r: '; v á > ; 209 180 0,087 i 0, 170 0,652 «ΙύΐύϊίΜ 211 181 0,361 0,248 0, 505 8,.vá:': 203 181 0,023 0,157 0,085 ^ lá? A hipótese de HWE foi satisfeita ao nivel de 5 % para cada marcador de micro-satélite após a aplicação das correcções conservadoras de Bonferroni para ensaio múltiplos (Bland & Altman, Brit. J. Med. 310 (1995) 170). O quadro 9a lista os valores empíricos de p observados com CLUMP para análises de associação de alelos e genótipos. Os valores empíricos de p inferiores a 0,005 foram observados no marcador NBG12 para as estatísticas TI e T3 sob análise de associação alélica. A estatística TI sugeriu a associação alélica entre doenças afectivas bipolares e o NBGG (valor empírico de p=0,008). Além disso, observou-se um valor empírico muito pouco significativo de p de 0,023 no marcador mais distai D12S2075. Π?

Em conclusão, os resultados paramétricos e em vários momentos, isentos de modelo, sugerem que se investigue os genes localizados entre D12S1619 e D12S1666. Além disso, de acordo com os resultados do GENEFINDER, os genes situados numa posição central em relação a NBG9 devem ser considerados para a análise de associação e de desequilíbrio da ligação. Além disso, verificaram-se associações positivas com um marcador NBG6, que está localizado no intrão 9 do gene P2X7R. EXEMPLO 2

Mapeamento Físico e Análise de Mutações do Cromossoma 12 que Associa o P2X7R a distúrbios Afectivos Bipolares A previsão mais conservadora para a região associada a doença está incluída entre os marcadores NBG11 e NBG2 (ver, figura la) . Esta região foi delimitada de acordo com a análise de ligação e de associação descrita no exemplo 1, utilizando marcadores de genoton e marcadores de NBG. 0 comprimento aproximado desta região é de 5,2 Mb. Os dois maiores intervalos (entre FLJ10701 e FLJ32372 e entre FLJ1466 e MONDOA) estão incluídos nesta região. Listaram-se pelo menos 73 genes nesta área, em que 48 são genes conhecidos e 25 são genes desconhecidos mas associados a ARNm e/ou conjuntos de EST com base na junção do último genoma disponível na UCSC (Novembro de 2002) . Os genes que se previram não estão listados. Contudo, a estimativa de IC de 99 % (intervalo de confiança) utilizando o GENEFINDER limitou a região mais interessante entre os marcadores D12S1666 e NBG9. Esta região genómica cobre 1,6 Mb e inclui pelo menos 28 genes e não tem intervalos grandes. Assim, a expressão região de distúrbios afectivos bipolares familiares (DABf), foi utilizada para descrever o segmento genómico entre D12S1666 e NBG9. Os genes encontrados dentro desta região incluem CaMKK2, CABP, P2X7, P2X4, PIN, PLA2, G1B, CIT, PXN, Rab35, e APC5. Contudo, considerando a técnica actual, não tem sido óbvio para um especialista nesta técnica a forma de seleccionar P2X7R como o gene associado as doenças afectivas. Outros genes dos que estão na lista anterior seriam óbvios.

Por exemplo, o gene CaMKK2 (também conhecido como a cinase da proteína cinase beta dependente de Ca2+/calmodulina ou CaMKKb) é uma proteína cinase de serina/treonina envolvida nas vias de sinalização dependentes de Ca2+. CaMKK2 pode activar in vitro a jusante das cinases CaMKIV e CaMKI, que modulam a transcrição de genes através da fosforilação dos factores de transcriptase (por exemplo, CREB, SRF, MEF2; Corcoran and Means, J. Biol. Chem. 276 (2001), 2975-2978; Soderling, Trends Biochem. Sei. 24 (1999), 232-236). O seu papel na cascata de Ca2+ não e crítico. Alguns estudos sugerem que CaMKs podia ser activado sem a fosforilação de CaMKKs (Matsushita and Nairn, J. Biol. Chem. 274 (1998), 10086-10093). Contudo, a etapa de fosforilação de CaMKK irá contribuir para a amplificação do sinal de Ca2+ dado que CaMKK é mais sensível a activação por Ca2+/calmodulina, por isso, CaMKK seria um mediador importante quando os níveis intracelulares de Ca2+ são baixos (Anderson et al., J. Biol. Chem. 273 (1998), 31880-31889).

CaMKK2 é um alvo óbvio para a depressão, dado que a técnica anterior sugeriu que as vias de sinalização dependentes de cAMP (mediadas pela activação de PKA), está afectada no cérebro de pacientes com distúrbios afectivos bipolares (Field et al., J. Neurochem. 73 (1997), 1704-1710; Rahman et al., J. Neurochem. 68 (1997), 297-304; Takahashi et al., J. Neurosci. 19 (1999), 610-618). De acordo com um estudo utilizando linhas de células linfoblásticas, pode-se relacionar o distúrbio bípolar com níveis elevados de cálcio 678- intracelular (Yoon et al., Mol. Psychiatry 6 (2001), 683) . Além disso, nalguns grupos verificaram-se relações entre fármacos antidepressivos e a activação de CaMK (Budziszewska et al., Br. J. Pharmacol. 130 (2000), 1385-1393; Consogno et al., Neuropsychopharmacology 24 (2001), 21-30; Mori et al., Neuropharmacology 40 (2001), 448-456; Zanotti et al., Neuropharmacology 37 (1998), 1081-1089). Além disso, a inibição de CaMKK por fosforilação mediada por PKA, sugere uma relação próxima entre ambas as vias (Matsushita et al., J. Biol. Chem. 273 (1999), 21473-21481). Estas observações sugeririam a um especialista nesta técnica que CaMKK2 é o gene responsável pela doença afectiva bipolar.

Outro candidato óbvio para distúrbios emocionais seria o gene CABP1, que gera quatro proteínas de ligação a Ca2+ dos neurónios, por meio da utilização alternativa dos 9 exões de codificação, que são L-CABP, S-CABP, calbraína e caldendrina (Haeseleer et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 1247-1260). A sua expressão está quase totalmente restrita aos tecidos do cérebro. Um estudo funcional sobre a calbraína revela o seu efeito negativo na actividade de CaMKII dependente de Ca2+/calmodulina por uma interacção concorrente com o domínio de ligação de CaM de CaMKII (Yamagushi et al., J. Biol. Chem. 274 (1999), 3610-3616). Seria espectável, papéis semelhantes na sinalização de Caí+ para outros produtos alternativos de CABP1. A participação do gene CABP1 nas vias de sinalização dependentes de Cê**, tornaria óbvio para um especialista na matéria como seleccionar este gene como um candidato para doença afectiva bipolar. Contudo, analisaram-se todos os exões de CABP1 quanto a presença de mutações e, surpreendentemente, detectaram-se apenas duas mutações em regiões não codificantes. 0 gene ΡΙΝ (proteína inibidora de NOS (sintase de óxido nítrico)) é outro candidato óbvio responsável pela doença afectiva bipolar. 0 óxido nítrico (NO) no cérebro, pode estar envolvido na apóptose, sinaptogénese e no desenvolvimento de neurónios. Dado que o NO não pode ser armazenado em vesículas como outros neuro-transmissores, a sua libertação é regulada pela actividade de NOS (sintase de óxido nítrico) . PIN é um iníbídor directo de NOS pela ligação e desestabilização do complexo homodimerico activo de NOS (Jaffrey et al., Science 274 (1996), 774-777). 0 PIN está altamente conservado durante a evolução e está expresso em muitos tipos de células. Um recente estudo clínico de avaliação dos níveis de nitrato no plasma em estado depressivos sugere que a produção de NO está aumentada nos casos de depressão (Suzuki et al., J. Affect. Disord. 63 (2001), 221-224) e pode resultar de uma deficiência na inibição de NOS. Além disso, no modelo de ratos, os antagonistas da sintase de NO têm estado ligados a propriedades antidepressivas (Harkin et al., 1999; Karolewicz et al., Eur. J. Pharmacol. 372 (1999), 215-220). Assim, o PIN seria óbvio. Contudo, devido a acção pleiotrófica de NO, uma deficiência na função de PIN iria gerar muitos distúrbios não relacionados ao longo do corpo. Assim, sem a informação apresentada na presente memória descritiva, um especialista nesta técnica poderia prever o PIN e não P2X7R como o gene associado a distúrbios afectivos ou emocionais. A fosfolipase A2 humana do grupo IB (PLA2G1B) catalisa a libertação de ácidos gordos a partir de glicero-3-fosfo-colinas. Os genes A2 de fosfolipase (PLA2) estão expressos em muito tecidos. Alguns estudos demonstraram associações entre uma actividade excessiva de PLA2 no cérebro e distúrbios afectivos (Chang et al., Neurochem. Res. 23 (1998), 887-892; Hibbeln et al., Bíol. Psychiatry 25 (1989) , 945-961). Aièís disso, outros estudos genéticos verificaram associações entre o gene PLA2G1B e o distúrbio afectivo bipolar (Dawson et al.,

Psychiatr. Genet. 5 (1995), 177-180). Assim, PLAGIB representa um provável candidato para os distúrbios afecti-vos. Contudo, no presente exemplo, encontrou-se apenas uma única mutação silenciosa dentro do exão 3 do gene PLAG1 B. O gene humano de cidra cinase, proteina associada com Rho (CIT) é uma proteina de 183 kDa, que está associada ao Rho de GTPase. CIT partilha uma forte semelhança com as proteínas ROCK e ROK, que são outras cinases associadas a Rho (Madaule et al., Nature 394 (1998), 491-494). As GTPases de Rho estão envolvidas em muitos processos tal como a organização cito-esquelética, o tráfico das membranas, o crescimento das células e a activação transcricional (Van Aelst and DrSouza-Schorey, Genes Dev. 11 (1997), 2295-2322). Estudos no cérebro sobre variantes de cidra-K (sem o domínio da cinase) revelam a associação com proteínas de densidade pós-sinápticas (PSD-95), sugerindo um papel quer na organização, quer na função de cada sinapse (Zhang et al., J. Neurosci. 19 (1999), 96-108; Furuyashiki et al., J. Neurosci. 19 (1999), 109-118) . O gene humano de paxilina (PXN) codifica uma proteína de 68 kDa encontrada nas adesões focais. E também dentro das adesões focais que as moléculas de adesão interagem dinamicamente com o cito-esqueleto (Salgia et al., J. Biol. Chem. 270 ¢1995), 5039-5047). As vias de sinalização que regulam estas interacções dinâmicas começam a ser explicadas. Muitas observações sugerem que a paxilina está envolvida em sinais de tradução desde receptores de factores do crescimento até adesões focais. A paxilina está expressa em muitos tecidos incluindo no cérebro.

Contudo, como se estabelece a seguir, o gene causador das doenças afectivas ou emocionais está identificado como sendo o receptor de P2X7 (P2X7R).

Pesguisaram-se mutações nas sequências de codificação e nas fronteiras entre exão/intrão dos genes mencionados antes, dado que é muito provável que essas mutações que tenham um significado funcional nos polimorfismos de nucleótidos simples (PNS). A amostra inicial era composta por 16 indivíduos afectados que não eram parentes da região de Saguenay/Lac St. Jean, o que deu um poder de 80 % para detectar polimorfismos com uma frequência de 0,05. Para identificar polimorfismos, as sequências-alvo foram primeiro simplificadas por RCP. Depois, purificaram-se os produtos da RCP em membranas Whatman GF/C (VWR, Montreal, Canadá) e quantificaram-se utilizando os ensaios de quantificação de ADNds da PicoGreen (Molecular probes, Oregon, EUA). Fez-se a sequenciação de 4 ng de produtos de RCP purificados, utilizando um kit de sequenciação de ciclos de terminação DYEnamic ET (Amersham Biosciences, Baie D'Urfé, Canadá). Os produtos de sequenciação foram resolvidos num analisador de ADN ABI PRISM 3730XL e num analisador de ADN ABI PRISM 3700. Os produtos de RCP são sequenciados em ambas as direcções. Os PNSs identificados nos genes estudados estão listados no quadro 10.

Quadro 10. Análise de mutações entre marcadores D12S1666 e

Genes Posições Variações Alelos Modificações Rab35 Exão 06 RABE06A 486G-A Asn 162 silencioso |Rab35 Intrão 04 RABI04A 5 1 C-T desconhecido 1Rab35 Intrão 03 RABI03A 33 G-A desconhecido Rab35 Intrão 02 BABI02B 85 G-A desconhecido Rab35 Intrão C2 RABI02A 76 C-G desconhecido PXN Exão li PXNE11A 1527 C-T Tre 509 silencioso PXN Exão 06 PXNE06A 750 C-T Ser 250 silencioso PXN Exão 02 PXNE02A 217 G-A Gli 73 Ser PLA2G13 Exão 03 PLA2G1BE03A 294 C-T Ser 98 silencioso PIN 5' UTR01 PINUTR01A -49 T-G desconhecido PIN 5' UTROl PINUTR01B -80 T-C desconhecido PIN Intrão 02 PINI02A 26 C-T desconhecido PIN Intrão 02 FIíÍIÁPm 50 C-T desconhecido CaBP Intrão 04 CaB?I04A 35 C-T desconhecido CaBP Exão 01 CaBPEOlA -23 A-G desconhecido OASL Exão 02 CASLE02A 213 G-T Gli 72 silensioso | OASL Exão 02 CASLE02B 408 C-T Leu 136 silencioso | OASL Exão 05 OASLE05A 1042 G-A Vai 348 Met OASL Exão 06 0ASLE06A 1509 G-A Ser 503 silencioso P2X7R 5' UTR P2XR7UTR5L 362 T-C desconhecido IP2X7R 5'UTR 532 T-G desconhecido P2X7R 5' UTR P2XR7UTR5K 1100 A-G desconhecido P2X7R 5'UTR 1122 A-G desconhecido SP2X7R ? 5'UTR 1171 C-G (desconhecido | 5' UTR :72Χ:κ7ϋΤ'ί,ϊί· 1351 T-C desconhecido l i > 5' UTR P2XR7UTRSN 1702 G-A desconhecido j: RXiAR P2XR7UTR5G 1731. T-G desconhecido i RRrik :;P ΪΜ 1860 C-T desconhecido ; 7AR7R · γ ; : :·: mRrUUTASA 2162 C-A desconhecido ; o·1...' 5 =' RTR 2238 C-T desconhecido UTR P2XR70TR5D 2173 A-G desconhecido ; P2X7R 5' UTR P2XR7UTR5E 2569 G-A desconhecido : P2X7R 5' UTR P2XR7UTR5C 2702 G-A | desconhecido i :·".·· ':· 7 ·: ;·A 2 ; · j i P2X7R ............ Intrão 01 P2XR7IC1A 24778 C-T desconhecido ; P2X7R Intrão 01 ΐΑΧΑΑΓΟΙ» 24830 C-T desconhecido j

M

Genes Posições Variaçõêâ Alelos Modificações P2X7R Exão 02 P2XR7 ΐ32Α :: 24942 T-C Vai 176 Ala P2X7R Exão 03 P2XR7E03A 1 26188 C-T Arçll7Trp ; P2X7R Intrão 03 P2XR7I0 i: 26308 A-G desconheciao P2X7R Intrão 03 P2XR7I03B 26422 G-A desconhecido P2X7R Intrão 04 P2XR7IC4A :32394 G-A aesconhecido 2¾¾¾¾ Intrão 04 22277x0(2 >32434 T-C desconhecido P2X7R Exão 05 P2XR7E05D i 32493 G-A 21.:;. 150 Arg ;P2X7R Exão 05 P2XR7v05A |32507 C-T Tir 155 His P2X7R Exão 05 P2XR7E05C i 32783 C-T Cis 168 silencioso :P2X7R Intrão 05 P2XR7I05C : 32783 A-C desconhecido P2X7R Inrrão C5 P2XR7I05D 35309 T-C desconhecido : P2X7R Intrão 05 P2XR7I05B 1 35374 C-T desconhecido \ P2X7R Intrão 05 P2XR7I05A 35378 A-C desconhecido P2X7R Exão 06 P2XR7E06A 35438 G-A Glu 186 Lis .P2X7R Exão 06 :32XR7ã6s3 j 35454 T-C Leu 191 Pro ;P2X7R Intrão 06 P2XR7106C i35549 T-C desconhecido \ ;P2X7R Intrão 06 P2XR7106G 35641 G-C desconhecido \ P2X7R Intrão 06 P2XR7106D i35725 A-C desconhecido 1P2X7R Intrão 06 P2XR7I06F 36001 T-G desconhecido P2X7R Intrão 06 P2XR7106E 36064 A-T desconhecido P2X7R Intrão 06 P2XR7I06A jeliminação de desconhecido 36091 de GTTT (ΧΙχΧΧ ImXX; CX 27227(022 i36108 C-G desconhecido VíX'ϊ'Χο .27 2722(707¾ i 36374 C-T desconhecido V;7 $ Intrão 07 23:3X713 7 s 36378 G-A desconhecido ;i::: ;> ;:.r Ύ & Intrão 07 32:2371373 i 36387 T-A desconhecido r:Í.X.7H Irírxís >37 22:237137 p 136398 G-C desconhecido 2::(272 iKtãç 3? 22.22:73372 :37439 C-T desconhecido 22X72: Tsçpiin 3? 2222X337?' : 37513 T-C desconhecido RK:Sv> 73 333:3373(223 37604 C-T Arg 270 Cis 23227t222 37605 G-A Arg 270 His 22XTR 222:;- 36 222277333 37623 G-A : Arg 276 His ílcíiXX 6:s.S-t 33 222:372323 37633 C-T ; Asp 279 silencioso PXX '/.2; : Intrão 09 : rvxyx?-';,·, 47214 C-T desconhecido 22(22. : RssS ;! : (2X2:722.12 47383 G-A Ala 348 Tre :22-7¾ i 337227"· IIC 47411 C-G Tre 357 Ser 227X2- j Intrão il j 73(3373:3:22 47563 T-C desconhecido fct.rfc Ιχΐ ; 32:227233'3> 54307 C-T j desconhecido ; Intrão i2 i 34308 G-h :j desconhecido ; RXi?:;:. ;i 3 : 33-2277 232 54399 C-T j; Mis 433 Vai j

Genes Posições Variações Alelos Modi f i cações P2X7R Exão 13 154480 A-G 7Gin 460 Arg 222::12 Exão 13 2221273:33:1 154523 C-T :Pro 474 silencioso P2X7R Exão 13 7eliminação de 754562 de CCCTGA. 1GAGCCACAGGTGCCT 7494 PESHRCL P2X7R ;Exão 13 2322773:33 754188 A-C :Gin 496 Ala P2X7R iExão 13 a-a'·;: W ' x |34664 C-G íHis 521 silencioso P2X7R Exão 13 |54703 G-T Leu 534 silencioso P2X7R ; Exão 13 | 54804 A-? 7Ile 568 Asn P2X7R Exão 13 754834 G-A |Arg 578 Gin P2X7R Exão 13 2:737331 a 754847 G-A Pro 582 silencioso P2X7R 3’ UTR 72227772222 |5 5 1 6 9 C-A 7 desconhecido P2X7R 7 3' UTR 2-^2,1372232 | 55 170 A-C desconhecido P2X7R : 3' UTR :? 2:22.7 372:7 c:; 755171 A-C desconhecido P2X7R 3' UTR 722R277TR22 155917 C-T desconhecido P2X7R : 3’ UTR 2n222n:fR22 754925 G-A desconhecido P2X4R 5' UTR i- 1956 G-A desconhecido P2X4R 5' UTR 7272223322¾ j- 1649 G-A desconhecido P2X4R 5’ UTR 2-222 3222.23 - 800 G-A ;desconhecido P2X4R 5’ UTR 2:222:2722,3¾ - 648 C-A 7 desconhecido P2X4R 5’ UTR - 537 A-G desconhecido P2X4R 5' UTR 3:2772233222 - 437 A-G desconhecido P2X4R 5' UTR 222242:7233 - 20 6VNRG desconhecido P2X4R 5' UTR 223327)2233 - 2 11 C-G desconhecido P2X4R 5' UTR 13722:2222 X2 -15 0VNRGGGCCCC desconhecido P2X4R 5' UTR £72277232222: - 98 G-T desconhecido P2X4R Intrão 01 · ΧΛη-ϊ .uí.sx 31 G-T desconhecido P2X4R Exão 0 2 -ί:'.7.ηη«κ..!.::ηη .2 6 2 G-A Ala 87 silencioso P2X4R Intrão 0 2 22:724:2 0 772. 4600 C-T desconhecido P2X4R Intrão 03 222.2.-7:227773. 15 G-A desconhecido P2X.4R Intrão 03 7 223*2 7272 7 2 G-A desconhecido F2X4R Exão 04 :-:-.22,74 2243 355 G-A Ile 119 Vai P2X4R Exão 04 772223 23-272 3 7 5 G-A I 32.2 1 25 sileccioso P2X4R Intrãc C4 2-2 2:22:1:322 7.3 T-C 7 desconhecido P2X4R Intião 04 27733:31333 32 G-A 7 desconhecido 7 P2X4R Exão 0 5 | Eú^'h 465 T-C | .Ser 155 silencioso 7 1A3M Exão 37 | .2.3\k4.4..:::: 724 A-G 7 Ser 242 Gli ; P2X4R Intrão 08 | 277)324.7723722 7 4ÍnH:7,n-S333 ae T j desconhecido 7 Exão 09 ! 7344 A-G 7 Tir 315 Cis 7 P2X4R Intrão 10 7 £773723 277-32 7LL G-T 1 -desconhecido )

Genes Posições Variações Alelos (Modificações P2X4R Intrão 10 P2XR4I1QB G-C (desconhecido P2X4R Intrão 1 0 P2XR4I10C A-G (desconhecido P2X4R Intrão 11 P2XR4I11B C-G !desconhecido í?;g;:4S Intrão 11 P2XR4I11C T-A desconhecido P2X4R Intrão 11 P2XR4I11A 374 C-T (desconhecido 1 3’ UTR ' 0·:ίΜ&^ΐ! .fcíV 733 C-T desconhecido C .'ΧΡ'ΒΒΒ 3' UTR 390 G-A desconhecido 3' UTR 239 G-A desconhecido Intrão 15 325 T-C desconhecido Intrão 15 ..... 169 G-A desconhecido Intrão 14 224 A-G desconhecido Intrão 10 Eliminação de desconhecido 156 de GTGATCCGCCTG Intrão 09 528 A-G desconhecido Ç;M((KX2 Intrão 09 521 A-G desconhecido Exão 09 1095 C-A Ile 365 silencioso Exão 09 £·: is .s iiA-i ^ 1087 C-T Arg 363 Cis Exão 05 - ϊ 687 C-T Pro 229 silencioso jglll Intrão 03 X.v-iVí^ivíivi .:/:-2 .'i· :i\ 10 C-T :desconhecido Intrão 02 tC-B. 39 C-T desconhecido CAMRK/ Intrão 01 2911 G-C desconhecido Intrão 01 ^ s . % ' Λ 8 9 C-A desconhecido ; Exão 01 PPPtniAA 253 A-T Tre 85 Ser :CsBKK2 Exão 01 ·->. 29 G-A Ser 10 Asn CííMKIí: 5' UTR01 ÍBBíaK BOBBBi B 253 T-C desconhecido Ó.íBKti 5' UTR01 SPBP12Xíf8í;ig 63 C-A desconhecido Intrão 01 >>. ç· ··'·'< T 2 10 G-T desconhecido Intrão 01 ; afaií.oíj 50 A-T desconhecido Intrão 05 ! 7 3 T-C desconhecido Intrão 06 i 7 3 T-G desconhecido \ 'õxão 11 MAS tlS A 1416 C-T His 472 silencioso i

Cada PNS nos genes Rab35, PXN, Η,ΜΘΙΒ, PIN, CaBP, OASL, P2X4R, CaMKK2 e APC5 foi designado de acordo com o gene onde foi encontrado e a sua localização nesse gene (regiões intrónicas ou exónicas). Cada PNS no gene P2X7R foi designado de acordo com a sua posição na SEQ ID N°. 1. 0 alelc descreve a posição e a variação observada. Nas regiões de codificação, a posição é relativa ao codão inicial, enquanto os PNSs intrónicos estão posicionados relativamente ao inicio do intrão correspondente (quando conhecido). Os iniciadores utilizados para a identificação dos PNSs em P2X7R e a localização de cada um dos PNSs incluídos nos quadros 2 e 12, estão definidos-no quadro la e nas SEQ ID N°s. 52 a 111.

Realizaram-se estudos de associação utilizando PNSs sem sentido. Os PNSs sem sentido ou os PNSs que podiam estar próximos dos sítios de seccionamento, foram utilizados porque é mais provável que as doenças estejam associadas a uma função imprópria nas proteínas. 0 grupo dos casos era composto por indivíduos bipolares do tipo I, pessoas diagnosticadas com tipos bipolares esquizo-afectivo (182 indivíduos) e pessoas diagnosticadas com bipolar do tipo II (31 indivíduos). Fez-se a amostragem de muitos controlos da região de Saguenay/Lac St. Jean, a partir de bancos de Steinert, glaucoma e de ADN com doença de Paget. Os indivíduos de controlo não tiveram nenhum diagnóstico de distúrbios afectivos. De acordo com os riscos para toda a vida dos distúrbios bipolares (1 %) não há necessidade de rastrear os controlos quanto a distúrbios psiquiátricos. A sequenciação directa dos produtos de RCP é de longe um processo mais preciso de análise e é o processo de escolha tendo em vista a capacidade da plataforma de sequenciação dos requerentes. Analisaram-se os produtos de RCP por sequenciação directa como se descreveu antes. Após a análise de sequenciação, tipificaram-se automaticamente os indivíduos quanto ao PNS correspondente utilizando um programa desenvolvido internamente, GENO.pl. Os resultados da genotipificação de PNS estão compilados numa base de dados em 4D. A hipótese de associação foi ensaiada com CLUMP (Sham & Curtis 1995, Ann. Hum. Genet. 59:97-105). Utilizou-se 1.000 simulações para estimar os valores de p. Os resultados estão ilustrados no quadro 11. A estatística 171* que é a estatística usual de qui quadrado no quadro de contingência sem experiência, foi utilizado para ensaiar a associação alélica. Além disso, a maior estatística de qui quadrado obtida comparando uma coluna do quadro original em função do total das outras colunas, chamada estatística T3, foi adicionado ao ensaio anterior para as associações potenciais de genótipo, dado que os resultados da estatística TI podem estar corrompidos quando a tabela de contingência contém células com valores baixos.

Quadro 11. Hipótese de associação utilizando CLUMP

Análise de \ Análise de Efectivo Alelos Genótipos ! | valor i valor valor | Gene 1 PNSs Casos Controlos ; : \ :·. ·- -*·· v j...... P(T3) i l F2:mlvx:íi 2XÇ 211 0,735 5 0,,'XO ; 7f3:X ; XIX 214 0, 344 1 0,2X0 > 0f L36 i : : : j P2XR3vX3S .L................................... 312 211 0,780 j 0,027 ! 0, 017 CAHKK? IM 135 i uiv 1,00 ; j PMiS.X 12 ?4 2:0 S 135 D,. 818 1 0,982 0,441 202 135 2, 05? | sui o j 0,0.§5 \ ;883€Π0?1 2 02 .......—_____ ÍA 212 ! 0,532 1________L_J 0,285 i

Os estudos de associação utilizando PNSs em P2X7, P2X4, e CaMKK2 revelaram associações significativas ao nível de cerca de 5 % ou menos. Observaram-se 3 associações de genótipos em P2X7. Contudo, PNSs, P2XR7vllB e estão fortemente ligados em conjunto com base na tabela de contingência. Mâ também uma associação de alelos ao nível de 5,7 % para os PNS6fl8v2 em CaMKK2. A informação associada a cada PNS relevante pode ser encontrada nos quadros ]_q e ^2

Outros estudos de associação utilizando CLUMP, foram realizados em amostras que continham mais casos e indivíduos de controlo. Utilizou-se 1.000 simulações para estimar os valores de p.

Quadro 11a. Valores de p empíricos e taxa de probabilidades (TP) com um intervalo de confiança de 95 % observado com CLUMP para as análises de alelos e genótipos de PNSs r— [ -5: 8 7-::-:·7 i i- .:7:,8 -....... S : :::-:.7 Gene : ‘; do marcador) Frequências de Alelos Efectivo valor p í¥ TP com IC de 95 7Ί T3 Caso Controlo valor de p valor de p yzxu': F2ZK7TJTK5T C ( C, 18 ) · T (0,82) 212 208 0,230 1,21 0,86-1/71 0,067 0, 069 (2 ] G : 0, 09) ; T (0,91) 211 204 0, 481 1,19 í·., ISvllSG 0,261 0,231 R2XR/UTR5H C3> C 10,95! T (0,05) 210 202 0, 549 1,19 0,67-2,13 0,768 0,582 Χΐ;:\ύ Í4] A (0,05); C (0,95) 210 207 0, 526 1,26 0,63-2,34 0, 754 0,517 s:-:-:1 15) c (0,78); 211 207 0, 629 i .,-0:7¾ 0,79-1,50 0,104 0,128 F7W7UTEB (6) A (C, 96) ; Cr )7.-78) 211 205 0,268 1,43 0,77-2,55 3,548 0, 240 Oí fc (C,À>); G (0,96) 211 210 0,658 1,23 0,65-2,33 0,139 0,234 (8í A {0,22j; C- (0,78} 208 210 0,889 1, 04 scu-ru 0,168 O ro uo P2XR7IC1B C (0,98); T (0,02) 210 2C7 0,352 1,71 8, -71:-:5(. 77 0,348 0,348 P2XR7v02A ::oj C (0,05); 211 208 2,189 1,49 0,64-2,64 0,397 0,167 i..........V«««vvvs4 P2XR7Tf)«- G (0,99) 211 ..........i 211 0,344 ........... i C, 25 :: .·: : .> s :· 0,356 i 0,336 ! j i : : 15 : m Çl^v v. 1; I 3 // | "—-777-,,,,........·; :8,85-5,51 í ; .............i 5.5:38 | l................. . ... » :! ::: íil ίΐ,.ϊί-ΐ :: s. > X.; ///1/83 : 1 ....... G.VAú .............: ! S ' ......... : s::o | ......5 :f, 775 j Ou. l ..............r 5.:55:: 1 7 7 7 í | :::v75 .........-......>. ·. ::.55-1.55 ; • :-::5¾ >* i % 4,;:··ό ;i 1 1 ! 5,:7:5 o,·::*··!.,::;* ^ | ! : ______._____i______..._____._________ ..2:1,,,,1, .....r 11: 5.75-8,:65 j 2·: ·. v v ·:· -·· ·: ·· ·>·-.·· ·.; ....... d.GGÚ :: !5§

Fez-se a genotipificação de trinta e três PNSs em rlXIR* sete PNSs em P2X4R e quatro PNSs em CAMKK2, com frequência dos alelos menores, maiores ou iguais a 1 % (quadro 11a). As distribuições dos genótipos destes PNSs não se desviaram significativamente de HWE. Ao nível dos 5 %, os aumentos significativos sob o ponto de vista estatístico da frequência de alelos menores, foram observados no grupo de distúrbios afectivos bipolares em P2XR7vl3F (valor de p =0,030, TP=3,24, IC de 95 84--10,3¾), P2XR4UTR3A (valor de p=0,015, TP=1,50, IC de 95 1*1,11-2,02) e CAMKK2E01B (valor de p=0,048, 1P=1,33, IC de 95 1-1,01-1,76). A distribuição dos genótipos nos PNSs P2XR7vl3F e P2XR4UTR3A também diferiram significativamente a este nível para as estatísticas TI e T3, com um aumento de heterozigotos na amostra dos casos. Um PNS do exão 11 de P2X7R, P2XR7vllB e outro do exão 13, P2XR7vl3E, exibiram diferenças nas distribuições dos genótipos com um valor mínimo de p de 0, 028 e 0,025 observados ambos na estatística T3. Novamente, um aumento na frequência de heterozigotos de 12 % e 13 % foram observados, respectiva-mente, na amostra bipolar nestes polimorfismos.

Os ensaios significativos de associação haplotípica levaram a valores de p inferiores a 0,5 % para diferentes grupos de PNS sobrepondo o gene P2X7R (quadro 11b). Considerando a colecção de PNSs que vai desde PNS32507 a PNS54847 (quadro 11c) como um exemplo para a distribuição baplotípica, os requerentes observaram a maior diferença de frequências entre casos e controlos com o haplotipo n°. 1 (quadro lld). 0 haplotipo n°. 2, é outro exemplo de haplotipo que é observado ma is frequentemente no grupo dos casos. Por outro lado, a frequência para o haplotipo n°. 3, está ligeíramente aumentada na amostra de controlo (diferença das frequências = 0,091). 0 quadro lie apresenta os produtos peptídicos derivados dos haplotipos nucleotídicos mostrados no quadro lld.

Quadro 11b. Haplotipos mostrando a associação alélica significante ao nivel de 0,5 % para as estatísticas TI ou T3

Quadro 11c. Posição e alelos para os PNSs que formam haplotipos. Os haplotipos estão descritos no quadro lld.

Quadro lld. Haplotipos com diferenças de frequências significativas entre os indivíduos afectados e de controlo j ;! '.uF:V· ;! .333-:3 :3333.3 33M3 1.3333.3 ;·ί'ίΪΜ j 3 3383 5 .·:· -v > ·'' v " t -λ *·χ·;··::: ;'!; ·. 1 5 ΰ ;i C; *'· :: S = 1 :·' 1 ···: ! r e | ;i | ...................................<·..................i..................I...................Ι Ε; i il4é0s |M8 ,'N —Ί ............... ........3........ .............. Ί ........!........ ! Wi.í | LL12_ ;! c c | .............. ! '-v ·-· > ·>'··.··· I .....07¾..........] j 3 :. 3 :: >-> E j 8 3 ·: | ::·;·:'λ· ..........:·; Ví *:.vi í

LL S :? í ~ ! c í í . . i 1 . i : í i.......1.......|......' ! Q 1 ~ <· -v V ·:· ··> ·:·:· .......í.......i.......::.......1........!.......I.......iJ

Quadro lie. Aminoácidos correspondentes aos PNScs descritos no quadro 11c. Estão posicionados de acordo com a SEQ ID N°.3 lr#èí^Í<> 13«. |SEQ ID N°, 3 piu 1 I.............. m u ί ...............1... :· ··>· .·:·/ ' .···.- ···:· :· ::.-U U-: j | ;sie ΓίΒΕ 14 3-3 1 i r i J i i j.fkp 1::3:1¾¾ i í .. Ϊ 3' S ; ,.....::.....1 H. ! i< ...........1.......... : -:<· : M. \ í E 1 R I L .. L i L.......................................... r i ..............L E | E i 1......A i t .;...... | í J E ; 1 ílÂKvlrtt:1:--3 3 Ú ! E | E \ ;r "t.....p:.....|...........t > : í ;

Posição na SEQ ID N°. 3 460 474 496 521 534 568 582 Haplotipo 1 Q P E H L I P Haplotipo 2 Q P .........1............... Haplotipo 3 Q P E Η j 11 i i X EXEMPLO 3

Polimorfismos Encontrados no P2X7R em Indivíduos que Sofrem de Depressão

Realizaram-se estudos de associação utilizando PNSs em genes P2X7R em amostras de casos/controlo (535 indivíduos) de uma população alemã. 0 grupo dos casos era composto por 36 indivíduos com diagnóstico de doença bipolar do tipo I ou do tipo II e 279 indivíduos com diagnóstico de distúrbios unipolares (isto é, depressão) representando 133 indivíduos do sexo masculino afectados e 182 indivíduos do sexo feminino afectados. Entre os controlos, contavam-se os 220 indivíduos de controlo remanescente, que eram normais (isto é, sem diagnósticos depressivos) e compreendendo 81 indivíduos do sexo masculino, 182 indivíduos do sexo feminino e 14 de sexo desconhecido. Anotou-se a mesma distribuição de sexo em ambos os grupos.

Identificaram-se os PNSs nesta amostra utilizando um subgrupo de 24 indivíduos afectados. Os PNSs no gene P2X7R detectados na população alemã eram semelhantes ou mesmo idênticos aos PNSs vistos na de Saguenay/Lac St.

Jean (ver, quadro 12) . Também se notaram outros PNSs raros e sem sentido na população alemã, tal corno, Arg 117 Trp G12XkJEu3A) j, Glu 186 Lis (P2XR7E06A) , Leu 191 Pro * Ile 568 Asn « Estes aminoácidos estão bem conservados entre os genes ortólogos de P2X7. É possível que a Siuteçto Ile 568 Asn (P2XR7E13J) p&i-s estar envolvida na expressão em >. ·'... 1...... de P2X7 .

Quadro 12. Comparação entre os polimorfismos na população de Saguenay/Lac St. Jean e a população alemã no gene humano P2X7R í \êà ..............................................; j ....................................................ϊ í .........................................:................. íAidSSisáíi i -> í ϊ, ν ^ \mm& Til | m .........i .........!............................................! ! ........................................;................. :4ívÍ. i j ':iv; *ϊ >; ' immm fOí ..........Ϊ........................................; \ W: i mwBmM l ϊϋί: i ψ \βββββ ..v im | BmBmiB 5 ν·ν’· j. ,inrw™^ \wmmm |V ·:·0ν u» | mBxBB | O.·: ó : ,,,,, V V ΛΤ~~1 ~ --------------—^------------------} v Λ ' :·. : i................. i ! B:m \BBBm •..........................................! , J BtmtixBB | ..................rf...............|................ .....-r:-::;.....................i ΐ:,:,| v A W: \mmm í ! : :; ;..............................................i O·:::::,·.'!:;!·::;!·.!·.: j ....................................................! j ; í BB : ....................................................} vi V ’? ) '·’';·:··ν ; .........................................j................. i;' iii i ,v y .V : piii, í BB BwB^B i l, , iyí 'V -; ;i\ ;λ'· . l BBBBík .ν.-.ν.-.ΐν,v.V.V.V.V.V,·. ! m \ mBBB:B i íi^'!’i: ν',ν·5' 1 m SíiSéi^ i s .......\ νΛνι;Γΐ;'Γ''νιν,"^"νιΊ": jrfji..................... ,:5:-44 1 ψ* OÍÒÍÃOÒ^ÍÍVAÒ::·; | ................p...............|................. λ: 'ϊ ; Rpip : BBMBB 1 .p..................i j i Í:,li i 'g; ;í:r- I :: ;V Bmmm. 1H 1 .....v ^ v:' '.· :< | mmtBmim j ildi [ j ΐχίφ' >ií m mm·: 0Ϊί | ; '.V” 0-:> iíov:·:';:;.'·.,: { m...........!.......Λ....... j i ftspfc- li BWBB | 1 | Ml \ i; : WmMB ! 55:520 ! .....:4-:: V Rò-: ! Ο ν; 1 BBBBB | mi \.................. , 1 Slli 1 , [— Ai- ; v<vv·:*' » lli \mmk i-a 1.................1»................. i 5o;:í W Iro 1 - .......|:....... " »...........j í 1::0:¾¾ .'0 BmnBk 0 | u.m | ihlii Λ.,,.,,.,.,,,,_____________________ 1........................................ I ...........Ϊ :Intrlc OJ Bt j 26422 | Desconhecido ; ; ofi8 í 0,12 ; 00 04 | Ιΐΐίΐ’' :,:04¾ ....."“‘"í....."* BB í.................32194.................. >..................................;................; í Desconhecido : i 0,03 : 0,01 |'Sa M •,.w.Lv,..............4............. C'v í 32434 i Desconhecido i ! ; | 0,33 ; 0,29 ; iExáo 05 -- -S : : τ''' j í i •Γ& |.................32491.................: 1. | Gii 150 Arg j raro ;................. ......o',02 ; : 05 \®mm i G-A 4 32506 1 Vai 154 silencioso ------........... RARO i

' g-a lilíl j i '1,. AI ; - ; 11 Υ&ΑΫΑΑ ............ j C-T lAlll Í *;.s Ai; vç; | láll' } i li-Al i-1 '[' A-G HW j :;;»!* Bí j sai j iW j ' >. "·:: -K j C-T lASAl 1 Ulmim \ kl ' \ U'· \ í 1 Eliminação de ! 1 Plc o | ccctgaga 1 I GCCACAGG TGCCT \ "m- m m i i i i ; viAi : . : ϊ t ; ; s mg i3 \mmw \ a-c 11-ÍA i ií:,;· ill Alá : :1,11- : íçVá 1 Eõc 13 ! ντίϊΐΐΐίΐΐτΐ: i C-G WAS'! !ál:á áll álá ; lá A A : - J Eioojj \nmm \ g-t A¥'Ç3 i ; m \....................-m....................? 1 EKãc 13 ; a-t ÍlAiíl ; ; lá AÁi ta : ; |νΐ1 1 4 / | G-à AlilAí i lás Aái Sb 1 ·. j IMá ; Ivilv 13 í ;?«m i G-A :lVÍ:á>: i ím llá: áliááíni.·:;:·:?·:;: kA : 11,-1:1 i 3'::';I7 MVíre-ÇAç i (A ilili i hwwèmkik í lá 11: i 11,11' i 3 ' UTR i: .3·:::":."·'}·..» \ A-C ίίίν'ίί i ÍilááVáálláíliáí:- 1 ::-,1::1 : 1.1 : 3'UTR |,ϊ?Μΐ!Λ | A-C lláll | fàz£$&&k i lá-111: j :Í.:ÍT : 3? UTR \y^'mm ! C-T 1:111^ j í.áá:V:.áÇi:SlV:á:·; : ; - : 33'TT \m^m \ G-A iliili : lVáVá:VV:á-::1-:: j -- ί -¾¾ j A posição e a numeração dos polimorfismos correspondem ao gene humano F2X7R conforme definido na SEQ ID N°. 1. Para identificar a organização genómíca do gene P2X7R organizaram-se primeiro clones de BAG utilizando marcadores polimórficos conhecidos, sitios da marcação da sequência (SMSs), sequências com terminação de BAC e marcadores de sequências expressas (MSEs). As regiões de ADN não orientadas e desordenadas, foram novamente juntas numa sequência utilizando Phrap e reordenaram-se as peças utilizando os exões de P2X7R suportes. Não se fez nenhuma organização completa dos genes para P2X7R. Trata-se apenas de uma estrutura parcial de genes desde o exão 6 a 13, NT....037809. Por isso, esta sequência genómíca que engloba o gene de P2X7R conforme descrito na SEQ ID N°. 1, podia conter alguns erros da sequência, especificamente, nas regiões intrónicas. Os iniciadores utilizados para a amplificação de PNS e a sequenciação, estão indicados no quadro la e descritos nas SEQ ID N°s. 52 a 111.

Realizou-se a análise estatística de acordo com o processo CLUMP (Sham & Curtis 1995, Ann. Hum. Genet. 59:97-105) . O quadro 13 resume os estudos de associação alélica e genotípica para PNSs no gene P2X7.

Quadro 13

. Estudos de associação alélica e genotípica utilizando CLUMP

Localiz

Freaaèncias alélieas

Casos Controlos

| ' A coluna alélieas apresenta o alelo para cada PNS O··:. c-2, 3=3, irã! * o tua irespectiva frequência. ** Para este PNS observou-se um6 célula zero era ambos (alelo e genótipo) os quadros de contingência Z*v2, valor de ρ ΟΙ. iaà foi observado no ensaio exacto de Fisher. (HW)

Para a análise de PNS, o equilíbrio de Hardy-Weinberg foi controlado nas amostras de controlo. 0 principio de

Hardy-Weinberg (PHW) pode ser estabelecido como se segue: numa grande população, emparceirada aleatoriamente, em que não há migração ou selecção em função de um genótipo particular e a taxa de mutação permanece constante, as proporções dos vários genóripos permanecem inalteradas de uma geração para outra. Toma-se um sistema de dois alelos com os alelos A e a. Se a proporção de A na população for representada como p e a proporção de a como q, então p + q representa a soma total de alelos neste local, isto é, p + q = 1. 0 PHW é Útil para avaliar alguns problemas de populações, tal como, a classificação marital, a procriação consanguínea, a estratificação da população, a mistura, a diminuição da viabilidade de um genótipo em particular. 0 PNSP2XR7vl3A não respeitou o equilíbrio de Hardy-Weinberg. A hipótese de associação foi também ensaiada utilizando um quadro de positividade de alelo conhecido por ser apropriado para a detecção de susceptibilidade de alelos, mostrando um modo dominante de hereditariedade (Ohashi and Tokunaga, J. Hum. Genet. 44 (1999), 246-248; Ohashi et al., Ann. Hum. Genet. 65 (2001), 197-206). Obtiveram-se resultados semelhantes utilizando este método aos obtidos utilizando os quadros de frequência de alelos, com excepção de P2XR7v05A em que os valores de p eram de 0,253. Assim, P2XR7v05A apresentou uma associação menos significativa nesta análise. Esta diferença pode ser atribuída ao modo de hereditariedade. A proporção de indivíduos unipolares na análise da população alemã é bastante importante dado que a American do sexo podia

Psychiatric Association (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Dísorders-4th Edição Text Revision (DMS-IV-TR), Amariõáh Psychiatric Press, 2000) relatou um aumento na susceptibilidade para distúrbios unipolares em grupos do sexo feminino, Para determinar se a influenciar a análise da associaqão, realizaram-se mais estudos de associação controlando o parâmetro do sexo. Indivíduos normais na população alemã, sem informação sobre o género, foram abolidos do estuda. Depois, derivou-se um modelo de regressão logística incluindo o sexc como factor. Para se obter um modelo que fosse tão estável quanto possivei, minimizou-se o modelo de regressão utilizando a diferença entre a probabilidade logarítmica para modelos com ou sem interacção (Hosmer, and Lemeshow, "Applied logistic regression", John Wiley and Sons, 1989) . A estratégia utilizada para manusear as células zero das tabelas de contingência foi eliminar completamente a categoria associada. Os cálculos foram feitos com SAS vB.O. SAS é um pacote de software estatístico, que permite ao utilizador manipular e analisar dados de muitas maneiras diferentes. Dadas as suas capacidades, este pacote de software é utilizado em muitas disciplinas, incluindo as ciências médicas, as ciências biológicas e as ciências sociais. A introdução de um parâmetro referente ao sexo do indivíduo não perturba a associação já observada em análises anteriores. Além disso, este modelo de análise revelou resultados adicionais: uma potencial associação de alelos com P2XR7v05B (p=0,064) e uma associação genotípica para P2XR7v08A (p=0,042), que foram observadas.

Os estudos de associação utilizando os conjuntos de amostras foram realizados misturando indivíduos das amostras de Saguenay/Lac St. Jean com os da população alemã, Os resultados ilustrados no quadro 14. A finalidade desta o distúrbio bipolar nas amostras de análise é sublinhar as características comuns entre ambas as populações, Contudo, de acordo com as diferenças entre ambas as amostras (principalmente o fenótipo dos afectados, isto é,

Saguenay/Lac St. Jean versus os distúrbios na sua maioria unipolares da população alemã) controlaram-se alguns parâmetros, inciuindo o sexo e a etnia. A estratégia de modulação para as regressões logísticas, foram descritas antes.

Quadro 14. Estudos de associação utilizando amostras conjugadas de as populações

Observou-se uma associação alélica e genotípica para a localização P2XR7vl3A (p=0,0047) que era mais forte do que em análises separadas. Assinalou-se uma associação alélica significativa para a localização úiXliúDBl (p=0,0452). Além disso, a presente análise também demonstra a relação potencial entre e a origem com um valor de p = 0,0515 (não mostrado no quadro), que está em concordância com a análise de associação prévia feito em ambas as amostras separadamente (ver, quadro 13). A análise do haplotipo foi realizada utilizando a população alemã. 0 programa PHASE (Stephens et al., Am. J. Hum. Genet. 68 (2001), 978-989) foi utilizado para estimar os haplotipos dos PNSs dentro dos exões do gene P2X7R. Criaram-se haplotipos para cada exão com mais do que um PNS associado (ver, quadro 15 para os PNSs associaaos aos exões). Os grupos dos casos variaram entre 218-220 indivíduos, em que os grupos de controlo variavam entre 312-316 indivíduos. Ensaiou-se a hipótese de associação com o processo de CLUMP dado que muitos haplotipos foram criados para cada exão. Os ensaios estatísticos TI e T3 foram realizados como se descreveu antes. As estatísticas T2 e T4 foram também calculadas devido a presença de células pequenas efectivas nos quadros de contingência. A estatística T2 é a estatística usual de qui quadrado aplicada a uma tabela de contingência, obtida depois da junção das colunas com valores espectáveis pequenos. A estatística T4 é a maior estatística de qui quadrado obtida, comparando uma coluna do quadro original com o total das outras colunas. Utilizou-se 1.000 simulações para estimar os valores de p. Os dados resultantes foram analisados com o modelo de regressão logística (descrito antes), utilizando SAS v8.0, de modo a considerar o parâmetro do sexo (para estes ensaios a amostra foi reduzida de 14 indivíduos normais). Contudo, este processo de análise está limitado pela fiabilidade dos haplotipos reconstruídos.

Quadro 15. PNSs associados ao exão

Exões PNSs associados

kãk 77:7 «ií P2 >í 5¾. 42K.R7l;G5C 74444- IC PRÍgIGvY1E Μ47 «1EB- U„. 4™ i P2'XR7 21 ··' 24447 EI. 4.7 45 4:47«·'! 77 ÉaEI yI 77

Quadro 16. Associação genotipica com haplotipos no exão 13 de F2X7R

Análise de alelo I Análise de genotipo

[Análisede alelo \Análise de genotipo

|contingência com células zero. -í;·· Sntre estes 15 haplotipos, observaram-se 8 haplotípos em que as cslulâ.ii dos casos tinham menos 3 indivíduos. 0 quadro 16 ilustra uma associação genotipica com haplotipos no exão 13 dos genes P2X7R. É interessante notar, que muitos haplotipos para o exão 13 foram observados. As diferenças entre as estatísticas no exão 13 (T3 menos significativo) podem ser explicadas pelo envolvimento de mais do que um genótipo de haplotipos na doença. Também se notou uma associação alelica potencial com haplotipos no exão 5 do gene P2X7R. A seguir indicam-se resultados clínicos que ilustram as consequências funcionais dos polimorfismos em P2X7R. 0 desenvolvimento e o decurso da depressão estão ligados casualmente a falhas na regulação central do eixo hipctalâmi-co-pituitário-adrenocortical (HPA). Podem medir-se as anomalias no eixo EUA utilizando o ensaio de supressão de dexarnetasona (ESD) ou o ensaio combinado de hormona que Liberta dexametasona/corticotropina (Dex/CRH). As medições das alterações no cortisol e/ou na hormona adrenocorti-cotrópica (HACT) durante o ensaio de ESD ou o ensaio de Dex/CHR são indicativos da disfunção de HPA em pacientes deprimidos (Heuser et ai., J. Psychiat. Res. 28 (1994) 341-356; XvbatOvmi and Twardowska, J. Psychiat. Res. 33 (1999) 363-370; Zobel et sL; J. Psychiat. Res. 35 (2001) 83-94;

Knzel et al., Neuropsychopharmacology 28 (2003) 2169-2178). Para demonstrar que os PNSs de P2X7R associados com distúrbios afectivos estão correlacionados com alterações no eixo de HPA, mediram-se os níveis de cortisol e de HACT em resposta ao ensaio de ESD e de Dex/CRH, o texto foi medido para os PNSs de Í%K.P7via. e de P2XR7vl3C. vliA consiste numa alteração do nucleótido A para G que resulta numa modificação de Gin 460 Arg para a modificação na proteína de P2X7R. O PNS de P2XR7vl3C corresponde a uma alteração do nucleótido A para C, que resulta numa modificação de Glu 496 Ala que tem demonstrado reduzir drasticamente a actividade da proteína (Wiley et al., Drug Dev. Res. 53 (2001) 72-76).

Os processos e as condições para realizar o ensaio de ESD e de Dex/CRH são bem conhecidos na técnica ver, por exemplo, Heuser et al., J. Psychiat. Res. 28 (1994) 341-356; Knzel et al., Neuropsychopharmacology 28 (2003) 2169-2178. Em resumo, os indivíduos pré-tratados às 23:00 com uma administração oral de 1,5 mg de dexametasona. Para o ensaio de ESD, recolheu-se uma amostra de sangue as 8:00 antes da administração da dexametasona (isto é, pré-dexametasona) e as 8:00 da manhã no seguimento da administração da dexametasona (isto é, pós-dexametasona). Para o ensaio de Dex/CRH, inseriu-se um cateter venoso às 14:30 no dia a seguir da administração da dexametasona e recolheu-se sangue as 15:00, 15:30, 15:45, 16:00 e 16:15 para tubos contendo EDTA e trasilol (Bayer Inc., Alemanha), fe 15:02, administrou-se intravenosamente 100 mg de CRH humano (Ferring Inc., Alemanha). As medições das concentrações de cortisol no plasma foram feitas utilizando um kit de radio-irnuno-ensaio comerciai (ICN Elmwdica|s:f EUA), enquanto se mediam as concentrações de HACT nu plasma utilizando um ensaio comercial imunométrico (Nichols Institute, EUA). Ambos os ensaios foram realizados de acordo com as especificações do fabricante.

Para o PNS de verificou-se um decréscimo nos niveis básicos de cortisol na admissão dcs indivíduos com um aleio AG ou GG, quando comparados com os indivíduos com o alelo Aà (figura lf) . Durante o ensaio de Dex/CRH, mediu-se uma redução no cortisol e na resposta de HACT em indivíduos com o alelo GG quando comparados com indivíduos com um alelo Aà ou AG (figuras lg e lh).

Além disso, a resposta ao tratamento com antidepressivos ficou retardada nos indivíduos com o alelo GG (figura li).

Para o PNS de PlXId/vídCd mediu-se um aumento nos níveis básicos de cortisol após a administração de dexametasona (figura lj). Durante o ensaio de Dex/CRH, compararam-se indivíduos com o alelo CC exibindo elevada resposta ao cortisol (figura lk), mas uma resposta reduzida a HACT (figura 11), quando comparado com indivíduos com um alelo AA e AC. Estes resultados são indicativos da desregulação do eixo de HPA.

Assim, os PNSs em P2X7R estão correlacionados com a disfunção no eixo HPA e demonstra as consequências funcionais e clínicas dos polimorfismos em P2X7R. EXEMPLO 4

Estrutura do Gene P2X7R e Expressão de Mim e Sequência do Transcripto Mâ!£s»ii-sé uma sequência de nucleótidos com 1.700 pb correspondendo ao promotor de AÍX7R humano, utilizando os algoritmos Matinspector V2.2 e Transfac 4.0. Esta análise mostrou que o gene P2X7R não contém uma caixa padrão TATA mas tem sítios SP1 que podem realizar uma iniciação cranscricional. Para além das sequências de SPl, há sítios de ligação para os factores de transcrição GATA, Oct e Lkarus. Pensa-se que estes sítios conferem especificidade ao tecido. Ê interessante notar que o promoror de P2X7R tem sítios de ligação que sugerem a responsabilidade pelas diferentes citocinas, tais como, AP-1, NFAT e CEBPB. P2X7R possui 13 exões e 12 intrões (Buell et al., Receptors Channels 5 (1998), 347), dando uma base de seccionamento alternativo que poderia dar, em teoria, transcriptos diferentes e produzir isoformas diferentes com possíveis funções diferentes. Não se identificou claramente nenhuma variante seccionada. Contudo, experiências de agrupamento de EST permitiram a descrição de três variantes de seccionamento. Uma define-se pela falta do exão 5. Esta variante de P2X7v02 corresponde ao clone IMAGE: 3628076, isolado de uma linha de células derivada do cérebro. O P2X7v02 a que falta o exão 5 produz uma secção deslocada gerando assim um polipéptido mais pequeno. A segunda variante de seccionamento, P2X7v03, é caracterizada pela presença do intrão curto 10 no ARNm. Esta variante é suportada por duas sequências de elevada qualidade, o clone de ADNc BRAMY2Q08977 (número AC: AK090866) da amígdala humana e o clone EST, dbEST:7339877, derivado de um tumor humano desconhecido. A última variante, P2X7v04, define-se pela falta do primeiro exão o que sugere uma utilização de um promotor alternativo fechado com. c exão 2. Um clone de EST de elevada qualidade, dbEST:4782844, derivada de um tumor da cabeça e do pescoço suporta esta variante. Estas variantes toiídlo indicadas nas figures 16a a 16e.

Variantes de P2X7 «SsrêMã mmvm vmvm mm-ttòi ψ&0ιΜ mmwm ¥M7vm m.m*m mtmmnm»m nmví& í^50«2 *S3m*83 fãjeívM F3S3líg« wws* *23ΤΝβ* *3*7*64 fâ^víES#aàeM* $$«?¥% «i«é »«?#&%6*P*«1 --------------*~-Aím,mí» ’~r»vmÉsà^iemmm l .· , , ------1«.. , .. , , -SÉ. , . , . . λ .3*. . . . - . , .46 .- . , ,;,. , , , M tU, ,,,,M*>, .„,1*# ^vv » .. .v -^-i. 6mm^ss^^wí»íB^sK<siç^&n6i^w^^sm^ír^m6»H#* Hl, , .,.M·,,^.».. ,,... 15-6.,.. Λ. .,166.........SM ll^iaS«S^mS^lOT6ffl6fS^X^66í^^?3®C3®^|»ÍÍ^Oima^ -·ι-|-ν»Λι Λ ι'ι'ι -^-- '- ·.·- .*->.·-> i-rf^-,>>-.Vf-h-vY.v Ί>-γιΤ^·ν lyinvi^VfyThTViVi^ai^-Í^-ftW-i^TmΆ^ iÍ.V-y.....···.·..·- vahmm^mhah úWmimm·»* *IW\MÍP!(>W.YiW.V('W¥ *VIWWWWW-w.6w»W!»llB'í»:6'ft\Vr,W'.VW’!*1VWIV\ViV.,ílW»V''.V»'aÍi»»i\/'»W.VI\\'.W\V.V'ià«» Ml,.,,,. ,3.58, „,... ,.168,,,,., ,3*®,. ,,,,466 V.VM- *VV ΛΛίΛν.ν.νΛ'.ν*·,ν.Α·Μ·Λ·Α·Λ'·#ί V'.VffWW»W.V.»^'λΛ·».*Τ ν-Ά·.ν.Λ·Λ.ν»νΛΛ.·.ν.Λ·.ν.'Α:Λ.·.!Λ'Αί^4.·* AA*Vdi«» i-VV'*^ ^Af isMwmím,íí&?íOTmLWímjs}^^^ íK^^lYS^OCCgí^VSSETÍ^HlSCEíl^SS^S^^SSVIlSPKSíPíWQ^lítS^ 5^C^lT^^3Í^V?^^íS^K^^PKm^5¥W¥OS^5^?ÍÕSiÍ^ +··νΛ· “.-T —“^f6 »^ T‘r4T“*^.^Ti‘S'.TW.VT·^ WTl-W VA ft^^. lVTiWTlTI V.WW.W.VT :341,:.,.„ .SM,....,., ,Μδ,,-,,.,., ,M6,.,., „l»,. ,.,.,«1® -λ «·* *y» *- «*-* rtrtV»-fcsy. 131.,, . . .116, ,,,,,,,446...... . ,M0.,,,:s.. M0,,,,,.,, 116 “^-ftW^^+W.VWWtt.V.ViW^WAfV-W^V^T.flWWff.VV.WltwW^W.V-B.W V.^VW-SVK.SN V, ,V S\&'.V> ΛΙΛί-vV.V.^^kf •tt!,+ ,h;T^-rt,+;w;*+.'ft,,*.\T,v»iV,'S*i«,?r.Yv;v*p.n,v,,ft ff-t-.vww^.v.ffnfl-ww.wn.vwfrwwÍíiWiV.ftwwv.iVVi ,ν.ν.Λ.ν.*..^*, *· Ml,,,,, ,#6,/§«,,,....:516..,..,..iS#...,,,. .53*' ι**ϊνβ* BimvM fiftimmm SSFISÍT x,,,x,®'IÀ'^**·-«·· w-ww*»w.ií'»*'*'í»*^wx'Wí'*í>'X-«'.'í-***:W'if'X»;*·»<«;«·««·:-x-r-x-j*#.* x- a

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Por isso, analisaram-se as sequências de iniciação transcricíonal e de tradução do P2X7R humano, utilizando os softwares de computador Blast, Genescan e HMMgene. Esta análise indicou que P2X7R possui uma elevada probabilidade apenas no sitio de inicio da translação. A maior parte dos marcadores da sequência que uxpmssu: P2X7R (ESTs; conjunto Umque Ks. 1/3-: 7i= têm nira extremidade ;7y hiiml que mostrou um sítio de iniciação transcricional idêntico. Nenhum dos ESTs mostrou qualquer indicação de seccionamento alternativo. Por isso, a análise em silício sugere que nâ uma baixa probabilidade de encontrar diferentes transcriptos produzidos pfôis seccionamento alternativo ou utilizando um promotor alternativo.

Os dados anteriores mencionados de silício foram confirmados por uma extensão da análise por RCP-TI de toda a sequência de codificação humana de P2X7R prevista, utilizando 14 e 19 bases (5'-ATGCCGGCTTGCTG-3'; 5*-GTAGGGATACTTGAAGCCA-3') oligonucleotídicas correspondendo ao início e ao fim da sequência de codificação, respectivamente. Isolou-se ARN total de todo o cérebro, diferentes áreas de cérebro dissecadas, timo, baço e rim e analisaram-se quanto a expressão de P2X7R. As reacções de RCP-TI foram realizadas utilizando o sistema C de polimerase em uma etapa térmica (Roche Applied Science) e um protocolo para realizar RCP com um início a quente. Em resumo, a transcrição inversa realizou-se a 52 °C de acordo com as condições do fabricante. As reacções de RCP foram executadas com temperaturas de enrolamento de 64 °C para os primeiros 5 ciclos e de 54 °C para os 30 ciclos seguintes.

Detectou-se uma banda específica única, com a dimensão de 1.785 pb, correspondendo à sequência de codificação completa de P2X7R. 0 ARNm de P2X7R foi detectado em todo cérebro, no hipocampo, no cerebelo, nos leucócitos e no timo, mas não no córtex cerebral, no hípotálamo, no baço e nos rins (figura 2) . Todos os prcdutos de RCP foram donados utilizando o plasmido pGEM-T-Easy (Promega), seleccionados em bactérias Iop-10 (Invitrogen) por meio de uma selecção azul e bronca e fez-se o seu ensaio por digestão αοοΐ EcoRI. Os clones que tinham fragmentos da dimensão esperada foram amplificados e purificados para sequenciação. A sequência confirmou a identidade dos clones com 1.785 pb como a sequência de codificação completa de P2X7R de origem natural. Por isso, em todos os tecidos ensaiados, o P2X7R de origem natural está expresso com um único transcripto que Inclui a sequência de codificação completa. A presença de isoformas especificas do tecido e improvável. Estes estudos deram informação útil acerca da expressão de ARNm de P2X7R e do tratamento dos transcriptos. Esta informação pode ser utilizada para sintetizar ribo-sondas para hibridação in situ, análise de transferência de ADN/ADN ou ADN/ARNm para uma matriz imobilizada (Northern e Southern), assim como, engenharia genética de células para a sobrexpressão de P2X7R.

Expressão de P2X7R no Cérebro de Rato

Estudou-se melhor a expressão de P2X7R por imuno-histoquimica de secções em série de cérebros de rato completos, utilizando um anticorpo policlonal dirigido contra um péptido interno de P2X7R (Santa Cruz Biotechnology). Os cérebros de ratos isentos de stress foram congelados por choque térmico, cortados em secções de 16 pm e fixados com paraformaldeido, durante 5 minutos. Bloquearam-se as secções durante 30 minutos a temperatura ambiente com soro de cavalo a 1:10. Todos os anticorpos foram diluídos em tampão TEST (solução salina tamponada com Tris com Tween 20 a 0,05 %). Utilizou-se o primeiro anticorpo numa diluição de 1:200 e incubou-se durante a noite. Realizaram-se as lavagens em tampão TBST. Como anticorpo utilizou-se IgG anti- sistema cabra biotinilada (Vector Laboratories) e realizou-se a detecção utilizando combinação com diaminobencidina. As lâminas foram contra-coradas com azul de toluidina utilizando processos padronizados. Realizou-se o mesmo processo na ausência de anticorpo primário como um controlo negativo. Como um controlo positivo para ensaiar a conservação do tecido, verificou-se com um anticorpo específico para a proteína Patched 1 (Santa Cruz Biotechnology). Utilizou-se Patched 1 como controlo positivo, dado que cora todas as estruturas relevantes do cérebro e não é afectada pelo stress ou por antidepressivos. Detectou-se um modelo de coloração muito específico, consistente com a localização sub-celular específica de P2X7R nas células do cérebro. Os controlos negativos estavam completamente desprovidos de sinal. 0 controlo positivo com Patched 1 mostrou uma intensidade de sinal idêntica e distribuição em todas as amostras, indicando que todos os tecidos estavam igualmente bem preservados e tratados.

Procedendo desde a parte frontal até a cauda, observou-se a proteína P2X7R na camada glomerular do bolbo olfactivo em níveis baixos (figura 3) . P2X7R estava também presente a níveis muito baixos numa área restrita no núcleo hipotalâmico periventricular (figura 3). As células ependimais que rodeia os ventrículos laterais, também mostraram uma coloração ténue (figura 3). Detectou-se um sinal mais forte nas áreas restritas do hipocampo, em que o sinal estava presente em células simples da camada polimórfica, na camada molecular porosa e na camada inicial (figura 4). Em áreas mais posteriores do hipocampo, o sinal estava presente na camada molecular, no stratum radiatum e próximo de CA3. Numa outra pooiçâo da cauda, P2X7R estava expresso no órgão sub-comisural (figura 4). Por isso, a expressão básica de P2X7R no cérebro de ratos isentos de stress, hstâ restrito o áreas que tenham sido previamente associadas com depressão, stress, aprendizagem e memória. EXEMPLO 6 P2X7R é Modulado em Ratos Tratados com um Antidepressivo

Realizou-se mais uma validação do papel de P2X7R em distúrbios afectivos, examinando o seu modelo de expressão em resposta ao stress e ao tratamento com farmacos antidepressivos. Um esquema de tratamento que tinha provado produzir efeitos antidepressivos ao nível do comportamento, foi administrado a ratos que eram caracterizados como dando respostas a antidepressivos, por meio da utilização de uma variedade de paradigmas de comportamento apropriados para detectar efeitos anxiolíticos e antidepressivos de antidepressivos clássicos, tal como, a paroxetina, inibidor selectivo da reabsorção de serotonina. A paroxetina foi libertada por alimentação forçada a ratos machos recém nascidos, durante um período de tempo de 28 dias, numa dose de 10 mg/kg de peso do corpo, duas vezes por dia. Em paralelo, deu-se a um grupo de ratos uma solução veicular (isto é, sem paroxetina), utilizando o mesmo regime de tratamento com um segundo grupo de controlo de ratos sendo deixado não perturbado e isento de stress (isto é, não tratado), durante o mesmo período das experiências, No fim do tratamento de longo prazo, parte dos ratos do grupo experimental foram testados numa caixa de noíte/dia (ensaio de comportamento da ansiedade) e em ensaio de natação forçada de Porsolt (ensaio de comportamento semelhante ao depressivo), para confirmar a eficácia do tratamento (figoTO SK O comportamento que li.da com. o stress poMipe diminuiu após c tratamento de longo prazo com o jthtidvptÈthiioo paroxetina. A outra parte dos grupos da dopoxilrdAs (isto é,

I ratos sem experiências de ensaios) foram decapitados, os cérebros foram rapidamente retirados e foram congelados a -80 °C até a sua utilização, A expressão de P2X7R nos cérebros de ratos em condições isentas de stress e em ratos em condições de stress ligeiro produzidas pela aplicação do veiculo e os ratos sob tratamento com paroxetina f:6r.m. avaliados utilizando três cérebros diferentes de cada grupo. Analisaram-se séries de lâminas de cada grupo de animais em paralelo por imuno-histoquimica utilizando os mesmos materiais, de modo a produzir resultados completamente comparáveis. Não se verificou nenhuma alteração significativa na expressão de P2X7R no bolbo olfactivo em resposta ao stress ou ao tratamento com paroxetina (figura 8). Contudo, no núcleo periventricular do hipotálamo, a paroxetina exibiu uma inibição ligeira da expressão de P2X7R (figura 7) . Não se observou nenhuma alteração significativa nas células ependimais das diferentes áreas do cérebro (figura 8) . As alterações mais dramáticas foram observadas no hipocampo, onde P2X7R estava fortemente inibido pela manipulação cheia de stress, enquanto que o tratamento com paroxetina produziu uma estimulação marcada acima dos níveis iniciais (figuras 9, 10 e 11) . Este efeito foi observado ao longo do hipocampo, mas com mais evidência na camada polimórfica próxima do giro dentado. No órgão sub-comisural, a expressão de P2X7R permaneceu inalterada pelos diferentes tratamentos. Por isso, a expressão de P2X7R é fortemente regulada em duas áreas especificas do cérebro envolvidas na depressão e no stress. Outras áreas do cérebro, que mostraram níveis baixos de P2X7R e não estão directamente envolvidas na depressão, não mostraram

Nas amostras de ratos tratadas com paroxetina e que exibiam uma forte expressão de «1^, era possível analisar a distribuição de P2X7R com mais detalhe (figuras 10 e 11). A proteína de P2X7R não estava apenas presente nos corpos das células, mas também detectou-se claramente em projecções de enervação da camada granular do giro dentado (figura 12) . Esta localização sub-celular de P2X7R é consistente com um papel na libertação de um neurotransmissor e na potenciação de longo prazo.

Dado que alguns relatórios (Muria et al., Biochem. J. 288 (1992), 897-901; Ferrari et al., FEBS Lett. 447 ¢1999), 71-75) sugerem que uma estimulação crónica e de dose elevada de P2X7R pode causar apóptose nalguns tipos de células, o hipocampo dos animais descritos antes foi analisado para a co-localização de células apoptóticas e células de expressão de em secções consecutivas, utilizando a coloração por TUNNEL e a imuno-histoquímica. Em secções correlativas, apenas se detectaram algumas células apoptóticas e elas estavam presentes ao longo das camadas granulares do hipocampo onde não se observou nenhuma expressão de P2X7R (figura 13). Não se observou nenhuma diferença significativa nos números de células apoptóticas entre as diferentes condições de tratamento. Por isso, a localização e o número de células apoptóticas não está correlacionada com a localização e o número de células que expressam P2X7R e regulam um envolvimento de P2X7R na indução da apóptose no hipocampo.

Assim, a expressão de P2X7R íSâté consideravelmente restringida a áreas ; . ' do cérebro envolvidas na depressão. Mèm disso, a expressão de P2X7R é inibida pelo stress e é fortemente estimulada pelo tratamento com antidepressivos nestas áreas específicas. For isso, P/X7R preenche todos os critérios requeridos para as acções de antidepressivos de acordo com os padrões mais elevados no domínio da investigação sobre depressão. Além disso, estes resultados sugerem que a modulação da função de νΧ. -ί esta associada som stress crónico, o que stírvs como um modelo para várias aspectos de distúrbios afectivos. EXEMPLO 7 O Efeito Comportamental da Inibição de P2X7R em Ratos

Para demonstrar que a inibição de P2X7R actua como um agente causador de distúrbios afectivos, inibiu-se especificamente a função de P2X7R em regiões distintas do cérebro sem afectar qualquer outra função do cérebro. Isto foi conseguido libertando moléculas de ARN, de interferência pequena, de estrutura helicoidal dupla (ARNip) em áreas restritas do cérebro.

De acordo com o modelo de expressão de P2X7R observado no hipocampo (figures 9, 10 e 11) e o envolvimento conhecido do hipocampo na depressão, seleccionou-se o giro dentado (hipocampo) como região alvo para a aplicação de ARNip. Implantou-se uma cânula guia em ratos machos, recém nascidos, bilateralmente (calibre 23, comprimento 8 mm) por meio de um instrumento estereotáctico. As coordenadas, em relação ao local na superfície do crânio onde se juntam as suturas sagital e coronal, foram -2,0 mm posterior, +1,0 mm lateral e -1,0 mm ventral. No seguimento de um período de recuperação de 5 dias, dividiram-se os ratos em três grupos experimentais: veículo (vei), ARN de estrutura helicoidal dupla, de controlo (controlo) e ARNip de estrutura helicoidal dupla, ©.sp^cifico de P2X7R (Mílip;· * As sequências utilizadas para o ARNip de > :"X'·+ foram t" Aidd:tx AòAAAcAt ΑλΙ+οΓΑ'3V e 5'- GAUCAUGUGCAAGACCCACTT-3' . ΑΜμ'β; as sequências foram enroladas e injectadas em conjunto com um ARN de estrutura helicoidal dupla. No sexto dia após a cirurgia, os ratos foram ligeiramente anestesiados com Isofluran e foram dadas as injecções de ARNip. A concentração do controlo e de ARNip foi e 0,1 nmole/pL e infundir?-se um volume de 1 pL por lado, utilizando um sistema de injecção especificamente adaptado (calibre 30, comprimento 9 mm) . A anestesia para a infusão foi de curta duração e os ratos acordaram imediatamente ou alguns segundos após a manipulação.

Uma vez libertadas no cérebro as moléculas de ARNip específicas para elas foram absorvidas pelas células do cérebro e induziram especificamente a degradação do ARNm complementar de P2X7R com uma elevada eficiência. Como resultado, a função de P2X7R foi especificamente inibida durante um curto período de tempo sem afectar qualquer outra função do cérebro. A este respeito, a injecção de veículo ou de ARNip de controlo não resultou em alterações óbvias no comportamento normal, isto é, ingestão de alimentos e de água ou no comportamento motor na gaiola de alojamento.

Os efeitos da inibição de P2X7R num comportamento semelhante ao depressivo foi avaliado 24 horas e 48 horas após a infusão de ARNip, controlo ou veículo, de acordo com o paradigma do ensaio padrão, o ensaio de natação forçada de Porsolt (Porsolt et al., Arch. Int. Pharmacodym. 229 (1977), 327-336; Porsolt, Rev. Neurosci. 11 (2000), 53-59). O parâmetro utilizado para avaliar um comportamento semelhante ao depressivo, é o tempo em que o animal flutua na água, um comportamento que esta associado com o comportamento de desespero à medida que o animal não faz qualquer esforço para activamente lidar com a situação de stress. Comparado com a aDilchçio do veículo não se detectou nenhuma influência do ARN de controlo de estrutura helicoidal dupla (5'-CAACUUCAUCUUCUACGCGTT-3') no comportamento de flutuação (lidar com stress passivo) . Ao contrário, comparado com os controlos, os ratos que receberam ARNip específico de P2X7R mostraram um aumento significativo do comportamento passivo, que é construído como um comportamento semelhante ao depressivo (figura 14) . Esta interpretação torna-se muito mais evidente quando o efeito dos antidepressivos no comportamento que lida com o stress passivo no ensaio forçado de natação for visualizado (figura 5). 0 comportamento que lida com o stress passivo aumentou depois da injecção intra-hipocampo aguda (bilateral, giro dentado) do ARNip dirigido a P2X7R. 0 ensaio de natação forçada de Porsolt é um ensaio padrão utilizado para avaliar a eficácia dos antidepressivos e tem provado, por meio de muitos estudos, que o ensaio é sensível de uma forma selectiva para estes efeitos, dado que se utiliza o modelo correcto de animais. 0 paradigma tem sido largamente utilizado para testar compostos farmacêuticos e para validar modelos de depressão em animais, que mostram um aumento no comportamento passivo, tal como, os ratos, em que o P2X7R foi inibido (ARNip).

No fim da experiência os ratos foram sacrificados e examinaram-se os cérebros para confirmar a localização e a eficiência das injecções de ARNip. Para este fim, cortaram-se os cérebros em secções e as lâminas foram coradas por imuno-histoquímica, utilizando os protocolos mencionados antes. Os cérebros dos ratos injectados com o ARNip de estrutura helicoidal dupla, especifico, com ARN de estrutura helicoidal dupla de controlo e com veículo, foram examinados em paralelo. Nestas condições, o ARNip específico contra P2X7R injectado próximo do gito dentado, induziu uma luGirdâo media de 30 I na expressão da proteína de Ψ2Ά7® quando comparada com as amostras de ratos injectados com veículo ou com ARN de estrutura helicoidal dupla de controlo. Tanto o número de células que expressam P2X7R como a intensidade da expressão, foram fortemente reduzidas (figura 15) . As injecções com ARNip não produziram nenhum sinal de inflamação ou de infiltração local no hipocampc. Assim, a expressão de P2X7R é inibida especificamente e localmente pela aplicação de ARNip in vivo. Esta inibição produz alterações comportamentais que indicam um papel causador para P2X7R nos distúrbios afectivos. Estes resultados, em combinação com os mencionados antes, suportam e confirmam a observação de mutações de P2X7R como estando associadas com doenças afectivas em seres humanos e que a modulação da actividade de P2X7R tem efeitos antidepressivos. EXEMPLO 8

Ensaio de Avaliação do Fármaco

Estabeleceram-se processos para identificar agonistas de PiXlR,. utilizando uma linha de células de hipocampo de rato imortalizadas expressando o gene P2X7 endógeno. Em resumo, a expressão de P2X7 foi confirmada por uma cultura de células a 37 °C/C02 a 5 %, no seio de DMEM com soro bovino fetal a 10 % (Gibco). Quando se atingiu 80 % de confluência, colheram-se as células em SBF e homogeneizaram-se por meio da passagem repetida através de uma seringa (agulha de 18G). A quantidade de proteína total foi medida pelo ensaio de Bradford (Sigma; diluído a 1:5, D.Q. medida a 595 nm), de acordo com as recomendações do fabricante. Misturaram-se então os homogeneizados de proteína com um volume igual de tampão de carga (Tris-Cl 50 mM, a pH 6,8; glicerol a 25 %; azul de bromofenol 7,2 mM; SDS a 2 %; immilC/çço Λ·:;Ρ:rooi 200 nM) e em seguida desnaturou-se água a ferver durante 10 minutos. Carregou-se 20 mg de cada amostra num gel de poliacrilamida a 10 %, contendo SDS a 0,4 %. A electroforese e a transferência de anticorpo/proteína para uma matriz imobilizada (análise de Western) foram realizadas de acordo com protocolos convencionais descritos, por exemplo, em Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001). As membranas foram então bloqueadas com leite em pó a 5 % e foram incubadas com um anticorpo contra P2X7R (diluição a 1:1.000; Santa Cruz Biotech) seguido da incubação com um anticorpo secundário acoplado com uma peroxidase de cavalo anti-cabra (diluição a 1:10.000; Santa Cruz Biotech). Incubaram-se então as membranas durante 1 hora, a 37 °C em substrato de Western Lumi-Light (Roche Applied Science) seguido de uma exposição durante 10 minutos num filme MR BioMax (Kodak).

Detectou-se uma banda de 70 kD correspondendo a dimensão espectável da proteína P2X7R nas células HT-22, demonstrando a expressão do gene P2X7 endógeno de ratos (figura 17) . Uma segunda linha de células de hipocampo de rato (HT-39) não expressou P2X7.

Dado que P2X7R é um canal de iões com barreira de ATP que permite a entrada de iões de cálcio e de sódio nas células, o método para a identificação de agonistas de P2X7R foi estabelecido por meio da monitorização do influxo de cálcio nas células HT-22. As células foram primeiro carregadas com um corante fluorescente, éster AM verde de Oregon (Molecular Frobes), durante 30 minutos, a temperatura ambiente, iavaram-se 2 vezes com DMEM/soro bovino fetal a 10 % para eliminar o excesso de corante e foram postas em cultura durante 15 minutos, na presença de 100 til de S*-trifosfato ae 2- e 2'-3'-O-(4-benzoilbenzoil)adenosina (BzATP: Ç2 4H:,\:l>·;:·:; j. (:f, A BzATP é um agonista conhecido de P2X.m (North and Surprenant, Annu. Por. Pharmacol. Toxicol. 40 (2000), 563-580). O movimento do cálcio para dentro das células foi visualizado com um microscópio fluorescente com um filtro de fluoresceína (comprimento de onda 492/517 nm) . O éster AM de verde de Oregon é um corante fluorescente que se liga ao cálcio intracelular. De acordo com isto, um aumento da fluorescência verde foi observado nas células tratadas com BzATP (figura 18) sinalizando uma activação de P2X7R que resulta num influxo de cálcio para dentro das células e um aumento da ligação do corante verde de Oregon ao cálcio intracelular.

Alternativamente, o éster AM de verde de Oregon pode ser substituído por fluo-3, fluo-4, fluo-5F, fluo-5N, fluo-4FF, dextrano Fluo-4, Fluo-3 AM, Fluo-4 AM, Fluo-5F AM, Fluo-5N AM e Fluo-4FF AM (Molecular Probes) . O influxo de cálcio nas células HT-22 pode ser medido em microplacas de 96 microtubos e de 384 microtubos, utilizando um kit de ensaio de Calcium Plus (Molecular Device) ou um kit de ensaio de Calcium FLIPRB para sistemas de leitura de placas com imagem fluorométrica (Molecular Device). As células HT-22 podem ser substituídas por quaisquer células que expressam ΡΙΧΤΕ, incluindo as células que tenham sido geneticamente modificadas pela introdução de um gene exógeno de P2X7. A especificidade do agonista de P2X7R no influxo de cálcio, foi confirmada pelo pré-tratamento das células HT-22 com ATP oxidado 100 mM (ATPo; Sigma), durante 1 hora antes da adição de BzATP. O ATPo é um inibidor irreversível do receptor (Chen et al., J. Biol. Chem., 268 (1993), 8199 — 8203). A activação de CTOR peio agonista, foi inibida pelo ATPo (figura 18) conforme ilustraaa pela ausência de fluo rescêncía verde nas aêiiSi&s,

Ainda um outro processo de medição da actividade de P2X7R envolve a entrada de brometo de etidio em células de expressão de P2X7R. A activação de l::2X7R. por um agonista permite a entrada de brometo de etidio que se liga ao ADN nuclear e emite um sinal de fluorescência. Alternativamente, o corante de propídio Y0PR0-1 pode ser substituído por brometo de etidio. Um aumento na fluorescência pode ser utilizado como uma medida da activação do receptor de P2X7. Por isso, o ensaio pode ser utilizado para ensaiar e quantificar o efeito de um agente ou de um composto com propriedades agonistas de P2X7R. No presente exemplo, semearam-se 103 células HT-22 por microtubo, numas placas microtituladoras de fundo plano de 96 microtubos e incubaram-se a 37 *0200:2 a 5 % em meio DMEM contendo SBF a 10 % até as células se ligarem a superfície da cultura. Uma vez ligadas, as células foram incubadas durante 60 minutos em meio DMEM contendo SBF a 10 %, brometo de etidio 10-4M e concentrações crescentes de BzATP (1 μΜ, 10 μΜ, 100 μΜ, 500 μΜ, 1 mM) . 0 número de células fluorescentes que integraram o brometo de etidio com o ADN, pode então ser contadas utilizando um microscópio de fluorescência (Zeiss, Alemanha). As concentrações acima de 100 μΜ de BzATP aumentaram o número de núcleos fluorescentes que assinalam a activação de P2X7R (figura 19a). Alternativamente, a fluorescência do brometo de etidio pode ser medida utilizando um leitor de placas de fluorescência da Perkin-Elmer (excitação 520 nm, emissão 595 nm, larguras do slit: Ex 15 nm, Em 20 nm) . Das leituras obtidas, pode-se calcular uma figura de pCI50 para cada agente candidato ou composto. De acordo com isto, o agonista de 2/X7P define-se como um agcnista ou um compostc cos; uma CF,50 igual ou superior a 300 micromolar, enquanto que o termo CE50 define-se como a concentração que provoca 50 I da resposta máxima a um agonista (North and Surprenant, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40 (2000), 563-580). A especificída- de de um agonista para P2.X7R pode ser avaliada por pré-incubação das células durante 60 minutos com ATPo 100 μΜ antes da adição do agonista e do corante do brometo de etídio. Nestas condições, a activação de P2X7R pelo agonista é Inibida pelo ATPo resultando numa redução do número de células fluorescentes (figura 19b).

Ainda noutro processo para identificação de agonistas de P2X7R pretendeu-se gerar uma linha de células de rato imortalizada, que sobrexpressa o gene humano de P2X7R sob o controlo do promotor precoce de citomegalovirus (CNV) humano/região potenciadora. O ADNc de P2X7R humano foi inserido no vector de ADNpc.3.1 (Invitrogen) e transfectado na linha de células do hipocampo de rato HT-22, utilizando lipofectamina (Invitrogen), de acordo com as especificações do fabricante. Um dia após a transfecção, adicionou-se o meio de cultura contendo 500 pg/mL de G418 às células. Os clones resistentes foram isolados separadamente e postos em cultura 14 dias após a aplicação do meio de selecção.

Avaliou-se a actividade agonistica de um composto medindo a entrada de cálcio nas células que sobrexpressam o P2X7R humano. Fez-se a cultura de células em placas de 96 microtubos e incubaram-se a 37 °C com DMEM em atmosfera de C02 a 5 % com soro bovino fetal a 10 I (Gibco) até atingirem a confluência. As células foram então carregadas durante uma hora com 10 μΜ de Fluo-4 Míi (Molecular Probes) . Fluo-4 AM é um corante fluorescente que se liga ao cálcio intracelular. Após c carregamento, lavam-se as células uma vez com um tampão contendo CaC12 0,5 mM e Hepes 20 mM e tratam-se com BzATP 20 μΜ ou tenidap 50 μΜ. Detectou-se a actividade da agonista medindo um aumento do influxo de cálcio qxa resulta numa ligação acrescida com Fluo-4 AM e um aumento da fluorescência. As alterações no sinal á» fluorescência são medidas utilizando um leitor de placas Fluostar Óptima (BMG biotech) . Tanto BzATP como tenidap produziram um rápido aumento na intensidade da fluorescência que declinou lentamente ao longo do tempo (figura 19c). Assim, ambos os compostos estimularam a actividade de P2X7R o que resulta num influxo de iões para dentro das células. EXEMPLO 9

Activação de P2X7R com Agonistas tem Efeitos Antidepressivos

Para demonstrar que a activação de P2X7R tem efeitos terapêuticos nos distúrbios afectivos, administrou-se o agonista de P2X7R BzATP (5'-trifisfato de 2'-3'-0-(4-benzoilbenzoil) adenosina a uma estirpe seleccionada de ratos DBA/201a, que exibe características de ser altamente ansioso, respondendo a antidepressivos e mostrando ansiólise depois do tratamento subcrónico com antidepressivos (Lucki et al., Psychopharmacology 155 (2001), 315-322). BzATP é um composto com uma especificidade forte para P2X7R (North and Surprenant, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40 (2000), 563-580). No exemplo presente, o agonista de P2X7R foi directamente injectado no hipocampo do rato. Contudo, um agente ou um composto agonista de P2X7R pode também ser libertado oralmente, subcutaneamente, intravenosamente, intra-arterialmente, intranodalmente, intramedular-mente, por via intratecal, intraventricular, intranasalmente, intrabronquialmente, transdermicamente, intrarectalmente, intraperitonealmente, intrarnuscularmente, intrapulmonarmente, vaginalmente, rectaimente ou intraocularmente.

Implantaram-se cânulas com guia (calibre 23, comprimento 8 mm) ratos machos com Idade de 4 meses, por meie de um instrumento estereotáctico (David Kopf Instruments). As a bregma, foram -2,0 coordenadas em a bregma, foram -2,0 posterior, + 1,C mm lateral e -1,0 mm ventral. Depois da cirurgia, deixaram-se os ratos recuperar durante 10 a 12 dias. No seguimento deste período de recuperação, injectaram-se os ratos com 1 μ! de uma solução de veículo (DMSO a 0,5 %,

Sigma) ou 50 μΜ de BzATP (Sigma, preparada no seio de DMSC a 0,15 %) em cada lado do cérebro, durante um período de 6 0 segundos. Deram-se as injecções utilizando uma agulha de calibra 30 com 9 mm inserida na cânula de guia e ligada por via de um tubo a uma seringa de 10 μΐ de Hamilton. O comportamento individual do rato foi avaliado utilizando o ensaio de natação forçada de Porsolt 24 horas após a injecção da solução de veículo ou de BzATP. Fez-se uma pré-exposição de 5 minutos ao ensaio, 10-15 minutos depois da injecção de veículo ou de BzATP. O ensaio de natação forçada é um ensaio padrão que mede as reduções primárias induzidas pelo stress em fuga ou em escape, chamado o comportamento do desespero. Utilizou-se o ensaio para determinar a eficácia de antidepressivos, para ensaiar novos compostos farmacêuticos e para validar modelos de depressão em animais (Porsolt et al., Arch. Int. Pharmacodym. 229 (1977), 327-336; Porsolt, Rev. Neurosci. 11 (2000), 53-58; Rénéric et al., Behav. Brain Res. 136 (2002), 521-532; Page et al., Psychopharmacology 165 (2003), 194-201; Kellíher et al., Psychoneuroendocrinology 28 (2003), 332-347). C ensaio consiste em colocar um rato durante um período de 5 minutos num cilindro de vidro contendo água. Nestas circunstâncias, o rato não pode tocar no fundo do cilindro e isso força-o a nadar. 0 tempo, a latência e a frequência da luta versus a flutuação, são pontuadas coms parâmetros comportamentaís. & flutuação (isto é, os movimentos feitos apenas para manter o equilíbrio e a ιή$ψί·ζ:ά.ψά<ϊ) é um comportamento passivo associado ao desespero e representa um sintoma semelhante a de depressão dado que o animal não faz qualquer esforço para lidar activamente com a situação stressante. 0 crescimento da luta (isto é, tentativas para escapar) indica um comportamento que lida de forma activa com a situação, que pode ser interpretado como uma melhoria dos sintomas semelhantes à depressão. Por exemplo, o t ràlarnsitt-o com antidepressivos serotonérgicos reduz o tempo total de flutuação (Borgibi* Neurosci. Bicbehav. Rev. 19 (1995), 377-395; Redrobe and Bourin, Psychopharmacology 138 (1998), 198-206) e, em paralelo, aumenta o tempo de comportamento activo (isto é, natação ou luta; Lucki et al., Psychopharmacology 155 (2001), 315-322). O BzÃTP agonista de P2X7R mostrou aumentar as tentativas activas de escape (isto é, aumenta o tempo e a frequência da luta, diminui em latência a luta) enquanto ao mesmo tempo que diminui o comportamento passivo (isto é, diminui o tempo e a frequência da flutuação, aumenta em latência a flutuação), que foi medido e comparado ao rato de controlo injectado com uma solução de veículo (figura 20). Os resultados observados foram observados sob o ponto de vista estatístico utilizando os ensaios U de Mann-Whitney e o ensaio de MANOVA de uma via. As diferenças no tempo de luta, latência de flutuação e frequência de flutuação, mostraram ser significativos sob o ponto de vista estatístico. Embora a latência, a frequência da luta e o tempo de flutuação resultantes não fossem suportados sob o ponto de vista estatístico, eles ainda representam uma tendência para a melhoria no comportamento de lidar com stress. Estes resultados demonstram que um agonista de P2X7R pode levar a melhorias em sintomas semelhantes aos depressivos.

Dado que as conclusões trazidas pelo ensaio da ftitiÇdiP forçada podem ser Influenciadas por efeitos não específicos ds: um agente ou de « composto na actividade do animal (isto é, aumento no comportamento de luta pode ser o resultado de hiperactividade em vez de um aumento do comportamento activo de lidar com a situação), o efeito potencial de BzATP na actividade locomotora foi avaliado pelo ensaio em campo aberto (Crawley "What's wrong with my mouse: Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice", Wiley-Liss (2000)). A actividade locomotora em ratos tratados com uma solução de veiculo de controlo ou com BzATP 50 μΜ foi avaliada 24 horas após a injecção colocando individualmente um animal numa caixa de madeira cinzenta escura (30 x 30 x 40 cm) . Controlou-se a actividade locomotora durante um período de 30 minutos utilizando uma câmara de vídeo. A distância global percorrida pelos animais durante o período de ensaio, foi então analisada por meio de um software de computador VideoMot2 (TSE GmbH, Bad Homburg). Não se mediu nenhuma diferença na actividade locomotora entre os ratos tratados com uma solução de veículo de controlo e com BzATP (figura 21). Por isso, a aplicação de BzATP não induz hiperactividade. Estes resultados confirmam que a activação de P2X7R por um agente ou um composto agonista leva a melhorias nos sintomas do tipo depressivo e não e o resultado de um efeito não específico da actividade do animal per se. Vários relatórios sugerem que a activação de P2X7R pode induzir a apóptose e a morte das células in vitro (Di Virgílio et al., Cell Death Differ. 5 (1998), 191-199, Virginio et al., J. Physiol. 519 (1999), 335-346). Para testar se a activação de P2X7R no hipocampo resultou na norte das células, quantificaram-se os níveis de apóptose no cérebro de ratos tratadss com BzATP. Sacrificaram-se os ratos Ά® fim das experiências comportamentais, retiraram-se os cérebros, congelaram-se e seccionaram-se em lâminas ·!« 16 pm. Estudaram-se então as seccões do cérebro quanto à apóptose utilizando o sistema de TUNEL fiuorométríco DeadEnd, de acordo com a recomendação do fabricante (Promega Corporation}. 0 sistema TUNEL mede o ADN fragmentado das células apoptóticas. C controlo positivo para o ensaio foi feito por pré-tratamento das secções do cérebro durante 10 minutos, com uma unidade/mL de ADNase I.

Observaram-se muito poucas células apoptóticas (isto é, menos do que uma célula por secção do cérebro) nos cérebros dos ratos tratados com veiculo de controlo ou com o agonista de P2X7R (figura 22) quando comparado com as secções de controlo positivo pré-tratadas com ADNase. Além disso, não se observaram diferenças significativas nos números de células apoptóticas entre os animais de controlo e os ratos tratados com BzATP, indicando que a activação de P2X7R não resultou na morte das células cerebrais in vivo. EXEMPLO 10

Os Antagonistas de P2X7R não Efeitos Antidepressivos

Os antagonistas de P2X7R KN-62 (1-(N,O-bis[5-isoquinoli-t.c:·^gu 1 foro, 1 ] · H-mutí 1-1-1itgssi.1 .:·-4· im 11 plperariria 1 e ATP oxidado (ATPo), foram administrados a ratos DBA/201 (Harlan Winkelmann, Alemanha), que exibem as características comportamentais de serem altamente ansiosos. KN-62 tem demonstrado ser um antagonista concorrente de P2X7R (Chessel et al., Brit. J. Pharmacol., 124 (1998), 1314-1320), enquanto que ATPo actua como um inibidor irreversível de P2X7R (Chen et al., J. Biol. Chem., 268 (1993), 8199-8203).

No exemplo presente, os antagonistas de P2X7R foram directamente injectados na região do giro dentado do hipocampo. Em resumo, implantou-se bilateralmente em ratos machos com idades de Crês meses, cânulas com guias (calibre 23, comprimento 8 mm) por meio de um instrumento estéreo-táctico (David Kopf Instruments). As coordenadas, em relação a bregma, foram de -1,5 mm posterior, mm lateral e -0,8 mm ventral. Deixaram-se os ratos a recuperar durante 10 a 13 dias após a cirurgia. No seguimento deste período de recuperação, injectaram-se os ratos com 1 μΐ de uma solução de veiculo (DMSO a 0,01 %, Sigma) ou KN-62 100 nM (Sigma, preparada no seio de DMSO a 0,01 %) ou ATPo 10 μΜ (Sigma, preparada no seio de SBF) em cada lado do cérebro, durante um período de 60 segundos. Todas as injecções foram dadas utilizando uma agulha de calibre 31 com 9 mm inserida na cânula cors guia e foram ligadas por via de um tubo a uma seringa Hamilton de 10 μΐ. 0 comportamento individual dos ratos foi avaliado utilizando o ensaio de natação forçada de Porsolt 24 horas após a injecção da solução de veículo, de KN-62 ou de ATPo. Realizou-se uma pré-exposição de 5 minutos ao ensaio, 15-17 minutos depois da injecção de veículo, de KN-62 ou de ATPo. No exemplo 9 dá-se uma descrição do ensaio de natação forçada de Porsolt. No exemplo presente, não se mediram alterações nas tentativas activas de escape (isto é, tempo, frequência, iatência da luta) ou no comportamento passivo (isto é, tempo, frequência, iatência de fiutuação) entre ratos tratados com veículo, KN-62 ou ATPo (figura 23). Os resultados observados foram verificados sob o ponto de vista estatístico utilizando o ensaio de MANOVA de uma via. As diferenças encontradas nos diferentes parâmetros entre os ratos tratados com veículo, KN-62 ou ATPo não foram sustentadas sob o ponto de vista estatístico. Estes resultados demonstraram que 3s antagonistas de P2X7R não melhoram os sintomas semelhantes aos da depressão e não acção anti-depressiva.

Dado que as conclusões trazidas pelo ensaio da natação forçada podem ser influenciadas por efeitos não específicos de um agente ou de um composto na actividade do animal (isto é, o aumento no comportamento de luta pode ser resultado de hiperactividade em vez de um aumento do comportamento activo de lidar com a situação), o efeito potencial do antagonista de 1211¾ ATPo, na actividade locomotora foi avaliado pelo ensaio em campo aberto. A actividade locomotora em ratos tratados com uma solução de veículo de controlo, ATPo 10 μΜ ou ATPo 50 μΜ foi avaliada 15 minutos após a injecção colocando individualmente os animais numa caixa de madeira cinzenta escura (30 x 30 x 40 cm) . Controlou-se a actividade locomotora durante um período de 30 minutos utilizando uma câmara de vídeo. A distância global percorrida pelos animais durante o período de ensaio foi então analisada por meio de um software de computador VideoMot2 (TSE GmbH, Bad Homburg). Não se mediu nenhuma diferença na actividade locomotora entre os ratos tratados com uma solução de veículo de controlo e com ATPo (figura 24). Por isso, a aplicação de um antagonista de P2X7R não induziu nestes animais nem hipo- nem hiperactividade .

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> NeuroNova AG <120> Processo para o Diagnóstico e o Tratamento de Distúrbios Afvct tvo:;:

XXX <210 > 1 <211> 56580

<212> ADN <213> Homo sapiens <220> <2 21> exão 1 <222> (3000) .. (3124) <223> < 2 2 0 > <221> exão 2 <222> (24841) .. (25009) <223> <220> <221> exão 3 <222> (26134).. (26202) <223> <2 2 0> <221> exão 4 <222> (30958)..(31030) <223> < 2 2 0 > <221> exão 5 <222> (32481).. (32577) <223> <2 2 0 > <221> exão 6 <222> (35416)..(35496) exao 7 <222> (36113)..(36242) <223> <220> <221> exão 8 <222> (37541)..(37677)

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<22i> CDS <222> (79)..(1863) <2:23> 24Sí;> 2 ggcacgaggg cttgctgtgg ccctgtcagg aagagtagag ctctggtcca gctccgegca gggagggagg ctgtcacc atg ccg gcc tgc tgc age tgc agt gat gtt ttc Met Pro Ala Cis Cis Ser Cis Ser Asp Vai Fen 1 5 10 cag t a t gag acg aac aaa j·· V- ac t cgg ate cag age atg e at t a t ggc Gin Tir Glu Tre Asn Lis Val Tre Arg 11 e Gin Ser Met Asn Tir G 1 i 15 20 25 acc a 11 aag tgg ttc ttc cac gtg ate ate ttt tcc tac çtt tgc ttt Tre 11 e Lis Trp Fen Fen His Val 11 e 11 e Fen Ser Tir Val Ciç Fen 50 35 40 geet ctg gtg agt gac aag nvg tac cag cgg aaa gag cct gtc ate sgt Ala Leu Val Ser Asp Lis Leu Tír Gin Arg Lis Glu Pro Val 11 e Ser 45 50 55 t c t gtg cac acc aag gtg aag gqg ata gea '••:-T gtg aaa gag gag ate Ser Val His Tre Lis Val L i s Gli 11 e Ala Glu Val Lis Glu Glu 11 e 60 65 70 75 gtg gag aat gga gtg aag aag ttg gtg cac agt gtc ttt gac acc gea Val Glu Asn Gli Val Lis Lis Leu Val H i s Ser Val Fen Tre A la 80 85 90 gac acc ttc c c t ttg cag aac t c t ttc ttc atg aca aac AíS: rir Tre Fen Prc Leu Gin Gli Asn Ser Fen Fen Val Met Tre Asn 95 100 105 ttt c tc âclâ aca gaa ggc caa g.>.g cag cgg ttg tgt CCC t a t CCC Fen Leu S Tre Glu dl Gin Glu Gin Arg Leu Cis Pro Glu Tir Pro 110 •li 120 acc ege agÇ acg c tc tgt tcc zcz gac çgv ggt tgt aaa aag vgu ΤΓ6 Arg Arg Tre Leu Cis Ser Ser Asp hrg Gli Cis ·· ····? Lis Trp 125 130 135 acg gac ccg cag age a 11 caç acc gga agg tw·: gta gtg c at

Met Asp Pro Gin Ser L i s Gli Ile Gin Tre Gii Arg Cis Vai Vai E i s 140 145 150 155 gaa ggg aac cag aag acc tgt gaa gtc t c t gee VSS tgc CCC ctC Slii Gli Asn Gin Lis Tre Cis Glu Vai Ser Trp Cis Pro Ile Glu 160 165 17C gca gtg gaa gag gee CCC cgg cct gat ctc ttg aac agt gee gaa aac •:··'· "· Vai Glu Glu Ala Pro Arg Pro A ia Leu Leu Asn Ser Ala Glu Asn i 7 5 180 185 11 c act ·:;·> ctc ate aag aac aat ate gac 11 c CCC ggc cac aac tac Fen Tre Vai Leu Ile L i s Asn Asn Ile Asp Fen Pro Gli His Asn Tir 190 195 200 acc acg aga aac ate ctg cca ggt 11 a aac ate ac t tgt acc ttc cac Tre Tre A; .· Asn Ile Lei; Pro Gli Leu Asn Ile Tre Cis Tre Fen His 205 210 215 aag act cag a at cca cag tgt CCC a 11 ttc cga cta gga gac ate ttc L i s Tre Gin Asn Pro Gin C i s Pro Ile Fen Arç Leu Gli Ile Fen 220 225 230 235 cga gaa aca ggc gat aat ttt tc a gat gtg gca a 11 cag ggc gga ata Arg Glu Tre Gli. Asp Asn Fen Ser Asp Val Ala ile Gin Gli Gli 11 e 240 245 250 atq ggc a 11 gag ate tac tgg gac tgc aac cta gac cgt tgg ttc cat M e t Gli Ile Glu Ile Tir Trp iíi Cis Asn Leu Asp Arg Trp Fen His 255 260 265 cac tgc c at ccc aaa tac agt ttc cgt cgc a 11 gac gac aag acc acc His Ci s His Pro L i s Tir Ser Fen À.íi.Xv Arg Leu Asp Lis Tre Tre 270 275 280 aac gtg tcc ttg tac cct ggc tac aac ttc aga tac gee aag tac tac Asn Vai Ser Leu Tir Pro Gli Tir Asn Fen Tir Ala J.áS Tir Tir 285 290 295 aag gaa aac aat gtt gag aaa cgg act ctg ata aaa gtC; ttc :-.y.í:sv ate Lis Glu Asn Asn Vai Glu L i s v'\V:>5 Tre Leu Ile Lis Val Fen Gli Ile 300 305 310 315 cgt ttt gac ate ctg gtt ttt ggc acc gga gga aaa ttt gac att ate Arg Fen Ac;.· Ile Leu Vai Fen Gli Tre Gli Gli L is Fen Ile Ile 320 325 330 cag ctg gtt ,v-,v tac ate ggc tea acc ctc tcc tac ttc ggt ctg gee Gin Leu Vai Vai Tir Ile Gli Ser Tre Leu Ser Tir Fen Gli Leu Ala 335 340 345 qct gtcj 11 c ate gac ttc ctc ate gac act tac tcc agt aac tgc tgt Ala Vai Fen ile Asp íiíti Leu Ile Asp ΤΓΘ T 7 r Ser Ser Asn Cis Cis 350 355 360 cgc tcc c at atf tat ccc tgc aag tgc too Cif CCC tgt Τ'·:' gtc Arg Ser jri 1 s Ile Tir Pro Trp Cis Lis Cis Cis Gin Pro Cis \r.\ 365 i Tvl 375 aac gaa tac tac tac aag aâg tgc ÕOV ta att ÇitíJ gag cca aag

Asn Glu T i r T i r T i r Arg Lis L i s Cis Glu Ser I i e Vai Glu Pro Lis 38C 385 3 90 395 ccg aca 11 a aag t a t gtg ccc ttt St Si gat gaa tcc cac a 11 ãtg Pro Tre Leu Lis Tir Vai Ser Fen Vai Asp Glu Ser ais Ile Arg Met 400 405 410 gtg aac cag cag c t a c t a gçg aga agt ctg caa gat gt;:· 3*3 age caa Vai Asn Gin Gin Leu Leu Gli Arg Ser Leu Gin Asp Vai Lis Gli Gin 415 420 425 gaa gtc cca aga c c t gcg srgv gac ttc aca gat ttg tcc agg erg CCC Glu Vai Pro Arg Pro Ala Met ATÍÍ Fen Tre Asp Leu Ser Arg Leu Pro 430 435 440 ctg gcc c tc c at gac aca ccc ccg a 11 cct gga caa cca gag gag ata Leu Ala Leu His Asp Tre Pro Pro Ile Pro G 1 i Gin Pro Glu Glu Ile 445 450 C55 cag ctg c t t aga aag gag gcg ac t cct aga tcc agg gat age CCC gtc Gin Leu Leu Arg Lis Glu Ala Tre Pro Arg Ser Atg Asp Ser Pro Vai 460 4 65 470 475 tgg tgc cag tgt gga age tgc ctc cca t c t caa ctc cct gag agt: cac Trp Cis Gin Cis G 1 i Ser Cis Leu Pro Ser Gin Leu Pro Glu Ser His 480 485 490 agg tgc ctg gag gag ctg tgc tgc cgg aaa aag ccg ggg gcc tgc ate Arg Cís Leu Glu Glu Leu Cis Cis Arg Lis Lis Pro Gli A la Cis Ile 4 95 500 505 acc acc tc a gag ctg ttc agg aag ctg gtc ctg tcc aga cac gtc cta Tre Tre Ser Glu Leu Fen Ãxg Lis Leu Vai Leu Ser Arg His Vai Leu 510 515 520 cag 11 c ctc ctg ctc tac cag gag CCC ttg ctg gcg ctg $at gtg gat Gin Fen Leu Leu Leu Tir Gin Glu Pro Leu Leu A la Leu Asp Vai ·&«·« 525 530 535 tcc acc aac age cgg ctg cgg cac tgt gcc tac agg tgc tac gcc acc Ser Tre Asn Ser Arg Leu Arg His Cis Ala Tir Arg C i s Tir Ala Tre 540 545 550 555 tgg cgc 11 c ggc tcc cag gac atg gct gac ttt gcc acc ctg CCC age Trp Arg Fen Gii Ser Gin Asp Met Ala Asp Fen Ala Ile Leu Pro Ser 560 565 570 tgc tgc cgc tgg agg ate cgg aaa :.-í ttt ccg aag agt gaa ggg cag Cis C i s Arg Trp ·&:·£ vv Ile Arg Lis Glu Fen Prc L i s Ser Gj-U Gii Gin 575 58C 585 tac agt ggc ttc aag ãgt cct v .> ~ tç aagcc agg caccçt 3 gct cacgtctgta 1893 Tir Ser Gli Fen Ias 3er Pro Ti £· 193 595 atcccagcgc gcctggctaa tttgggaggc cgaggcaggc caaggcgaaa tcctqtctgt agatcacctg aggtcgggag ttggagaccc actaaaaata caaãaatcag ccagacatgg 2013 tggcatgcac ctgcaatccc agctactcgg gaggctgagg cacaagaatc acttgaaccc 2073 gggaggcaga ggttgtagtg agcccagatt gtgccactgc gggaggcaca 2133 gcaaactgtc ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 2164 3

<211> 595 < 212 > PRT <213> Homo sapiens

Met Pro Ala Cis Cis Ser Cis Ser Asp Val Fen Gin Tir Glu Tre Asn 1 5 10 15 Lis Vai Tre Arg Ile Gin Ser Met Asn Tir Gli Tre Ile Lis Trp Fen 20 25 30 Fen His Vai Ile Ile Fen Ser Tir Val Cis Fen Ala Leu Val Ser Asp 35 40 45 Lis Leu Tir Gin Arg Lis Glu Pro Val Ile Ser Ser Val His Tre Lis 30 55 60 Vai Lis Gli Ile Ala Glu Val Lis Glu Glu Ile Val Glu Asn Gli Val 65 70 75 80 Lis Lis Leu Vai His Ser Vai Fen ϊ·'φ Tre Ala Mp Tir Tre Fen Pro 85 90 95 Leu Gin Gli Asn Ser Fen Fen Val Met Tre Asn Fen Leu Lis Tre Glu 100 105 110 Gli Gin Glu Gin Arg Leu Cis Pro Glu :rir Pro Tre Arg Arg Tre Leu 115 120 125 Cis Ser Ser Asp Arg Gli Cis Lis Lis Gli Trp Met Asp Pro Gin Ser 130 135 140 Lis Gli Ile Gin Tre Gli Arg Cis Val Vai His Glu Gli Asn Gin Lis 145 150 155 160 Tre Cis Glu Vai Ser Ala Trp Cis Pro Ile Glu Ala Val Glu Glu Ala 165 1 0 175 Pro Arg Pro Ala Leu Leu Asn Ser Ala Glu Asn Fen re V â -L Leu Ile 180 185 190 Lis Asn Asn Ile Fen Pro Gli His Asn Tir Tre Tre Asn Ile 195 200 205 Leu Pro Gli Leu Asn Ile Tre Ciç Tre Fen His Jjis Tre Gin Asn Pro 210 215 220 Gin Cis Pro Ile Fen Arg Lee A?:# Ile Fen Arg G” u Tre Gil Asp 245 230 235 240 Asn Fen Ser Asp Vai Ala Ile Gin Gli Gli Ile Met* Gli Ile Glu Ile 255 245

25C rp. i ... Trp Asp CÍS Asn Leu Asp Arg Irp Fen His His Cis His Lro L is 260 265 270 Tir Ser Fen Arg Arg Leu Asp Asp Lis Tre Tre Asn Val Ser Leu Tir 275 280 285 Pr o Gli T i r Asn Fen Arg T ír Ala Lis T i r Tir L i s Glu Asn Asn Val 290 295 300 Glu Lis Ar Q Tre Leu 11 e Lis Val Fen Gli Ile Arg Fen Rsp Ile Leu 305 310 31 5 320 V ai Fen Gli Tre 01.1 Gli L i s Fen Asp Ile Ile Gin Leu val Val Tir 325 330 335 11 e Gli Ser Tre Len Ser Tir Fen Gli Leu Ala Ala Val Fen Ile Asp 340 345 350 Fen Leu 11 e Asp 1Γ6 Ti s: Ser Ser Asn C i s Cis Arg Ser te.3 Ile Tir 355 3 60 365 Pr o Trp Cis Lis Cis Cis Gin Pro Cis Val Val Asn Glu Tir Tir Tir 370 375 380 Arg L i s L i s Cis Glu Ser Ile Val Glu Pro Lis Pro Tre Leu L i s Tir 385 390 395 400 Vai S e r Fen Vai Asp Glu S e r His Ile Arg Met Val Asn Gin Gin Leu 405 410 415 Leu Gli Arg Ser Leu Gin Asp Val Lis Gli Gin Glu Val Pro Arg Pro 420 425 430 A1 a Met Asp Fen Tre Asp Leu Ser Arg Leu Pro Leu Ala Leu His 435 440 445 Tre Lro Pro 11 e Pro Gli Gin Pro Giu Glu Ile Gin Leu Leu A:;;:· L i s 450 455 460 Glu Ala Tre Pro Arg Ser Arg Asp Ser Pro Val Trp Cis Gin Cis Gli 465 470 475 48 0 Ser Cis Leu Pro Ser Gin Leu Pro Glu Ser His Arg Cis Leu Glu Glu 485 490 495 Leu Cis Cis Arg Lis Lis Pro Gli Ala Cis Ile Tre Tre Ser Glu Leu 500 505 5 10 Fen Arg Lis Leu Val Leu Ser Arg His Val Leu Gin Fen Leu Leu Leu 515 520 525 Tir Gin Glu Pro Leu Leu A 1 a Leu te® Val Aí;® Ser Tre Asn Ser Arg 530 535 540 Leu Arg E i s C i s A1 a Tir Arg Cis Tir Ala Tre Trp Arg Fen Gli Ser 545 550 560 Gin Asp Met A 1 a Asp Fen A 1 a Ile iaCU Pro Ser Cis Cis Arg Arg 565 57G 575 lie Arg Lis Glu Fen Pro L i s Ser Glu Gli Gin Tir Ser Gli Fen L is 580 5E5 590 Ser Pro Tir 219 595 <210> 4

<1117’ 595 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMÍNIO <222> (1) . . (20) <223> Domínio intracelular <220> <221> TRANSMEM <222> (21)..(46) <22 3> <220> <221> DOMÍNIO <222> (47) . . (320) <223> Domínio extracelular <220> <221> TRANSMEM <222> (321) .. (356) <223> <220> <221> DOMÍNIO <222> (357)..(595) <223> Domínio intracellular <400> 4

Met Pro Ala Cis Cis Ser Cis Ser Asp Vai Fen Gin Tir Glu Tre Asn 1 5 10 75 Lis Vai Tre Arg Ile Gin Ser víê: i Α'όΠ Tir Gll Tre Ile Lis Trp Fen 20 25 30

Fen His Vai Ser Tir Val Cis Fen Ala Leu Val Ser Asp 35 40 45 xj 2- S Leu Tir Gin Arg Lis Glu Pro Val Ile Ser Ser Val His Tre Lis 50 55 60 V a 1 Lis Gli Ile Ala Glu Val LlS Glu Glu ile Val Glu Asn Gli Val 65 70 75 80 L is Lis Leu Val Ser Vai Fen Asp Tre Ala Asp Tir Tre Fen Prs 85 90 95 Leu Glu Gli Asn S e r Fen Fen Val Met T r e Asn Fen Leu L is Tre Glu i 0 0 105 1 10 Gli Gin Glu Gin Arg Leu Cis Pro Glu Tir Pro Tre Arg Arg Tre Leu 115 120 125 C i s Ser Ser Asp Arg ol x Cis L i s L i s G1 i Trp Met Asp Pro Gin Ser 130 135 140 Lis Gli Ile Gin Tre G1 i Arg Cis Val Val His Glu Gli Asn Gin Lis 145 150 155 160 T r e Cis Glu Val Ser Ala Crp Cis Pro Ile Glu Ala Val Glu Glu A 1 a i 6 5 170 175 Pro V -V Pro Ala Leu Leu Asn Ser Ala Glu Asn Fen Tre Val Leu Ile 180 1 85 190 L i s Asn Asn Ile Asp Fen Pro Gli His Asn Tir Tre Tre Arg Asn Ile 195 200 205 Leu Pro Gli Leu Asn Ile Tre C i s Tre Fen His Lis Tre Gin Asn Pro 210 215 220 Gin C i s Pro Ile Fen Arg Leu Gli Ile Fen Arg Glu Tre Gli ÂUÍ.: 225 230 235 240 Asn Fen Ser Asp Val Ala lie Gin Gli Gli Ile Met Gli Ile Glu ile 245 250 255 Tir Trp Asp C i s Asn Leu Asp Arg Trp Fen His His Cis Pro Lis 260 265 270 Tir Ser Fen Arg Arg Leu Asp Asp L is Tre Tre Asn Val Ser Leu Tir 275 280 285 Pro Gli Tir Asn Fen Arg Tir Ala L i s T i r Tir L i s Glu Asn Asn Val 290 295 300 Glu L i s Arg Tre Leu Ile L i s s&a Gli ile Arg Fen Ile Leu 305 3 10 315 320 Vai Fen Gli T r e Gli AU. L is Fen Asp lie lie Gin Leu Val ?íí.i. Vi r 325 330 335 lie Gli Ser Tre Leu Ser Tir Fen Gli Leu Ala A ia V ai Fen Ile Asp 340 345 350 Fen Leu lie Asp Tre T i r Ser Ser Asn Cis C s Ser His Ile Tir 355 360 3 65 Pro Trp Cis L i s Cis Cis Gin Pro Cis Vai Cal Asn Glu Tir Tir Tir 37C 375 380 Arg Lis Lis Cis Glu Ser Ile Val Glu Fro Lis Pro Tre Leu Lis Tir 221 385

39C 395

Vai Ser Fen Vai Asp Glu Ser SÍ.A Ile Arg Met Vai Gin G i n Leu 435 410 415 Glí Arg Ser Leu Gin Asp Vai Lis Gli Gin Glu Val Pro Arg Pro 420 425 430 Ala Met Asp Fen Tre Asp L0U Ser Arg Leu Pro Leu A 1 a Leu His Asp 435 440 445 Tre P r o Pro Ile Pro Gli Gin Pro Glu Glu Ile Gin Leu Leu Arg L i s 450 455 46C Glu A 1 a Tre Pro Arg Ser Arg Ser Pro Vai Trp C i s Gin Cis Gli 465 470 475 480 Ser Ci s Leu Pro Ser Gin Leu Pro Glu Ser His Arg Cis Leu Glu Giu 485 490 495 Leu Cis Cis Arg 'v; s Lis V;;;.. Gli Ala Cis Ile Tre Tre Ser Giu Leu 500 505 510 Fen Arg Lis Leu Vai Leu Ser Arg His Vai Leu Gin Fen Leu Leu Leu 515 520 525 Tir Gin Glu Pro Leu Leu A 1 a Leu Asp Vai Asp Ser Tre Asn Ser Arg 530 535 540 Leu Arg His Cis Ala Tir Arg T i r A 1 a Tre T rp Arg Fen Gli Ser 545 550 555 560 Gin Asp Met Ala Asp Fen Ala Ile Leu Pro Ser C i s Cis Arg Trp Arg 565 570 575 Ile Arg Lis Glu Fen Pro Lis Ser Glu Glí Gin Tir Ser Gli Fen L i s 580 585 590 Ser Pro Tir 595

<210> 5 <211> 595 <212> PRT <213> Homo sapiens

Met Pro A 1 a Cis Cis Ser Cis Ser Asp Vâl Fen Gin T i r Glu Tre Asn 1 5 10 15 Lis Val Tre Arg Ile Gin Ser Met A,sn Tir Gli Tre Ile Lis Trp Fen 20 25 30 Fen His Vai Ile Ile Fen Ser Tir Val Cis Fen Ala Leu Val Ser Asp 35 40 *5 Lis Leu Tir Gin Arg Lis Glu Pro Val Ile Ser Ser V a i Kis Tre tr* H- ta l.c; 53 60

Vai Lis Gli Ile Ala Glu «fel Lis Glu Glu Ile Vai Glu Asn Gli Val 65 70 75 80 Lis Lis Leu Vai His Ser Vai Fen As*; Tre Ai a Asp Tir Tre Fen Prc 85 90 95 Leu Gin Gli Asn Ser Fen Fen Vai Met Tre Asn Fen Leu Lis Lre Glu 100 105 110 Gli Gin Glu Gin Trp Leu Cis Pro Glu Tir Pro Tre Arg Tre Leu 115 120 125 Cis Ser Ser ί\:ψ Arg Gli Cis Lis Lis Gli Trp Met Asp J' Gin Ser 130 135 140 Lis Gli lie Gin Tre Gli Arg Cis Vai Vai His Glu Gli Asn Gin Lis i45 150 155 160 Tre Cis Glu Vai Ser Ala Trp f ··*·· Pro Ile Glu Ala Vai Glu Ala 165 170 175 Pro Arg Pro Ala Leu Leu Asn Ser Ãlcl Glu Asn Fen Tre Vai Leu Ile 180 185 190 Lis Asn Asn Ile Asp Fen Pro Gli His Asn Tir Tre Tre Arg Asn Ile i95 200 205 Leu Pro Gli Leu Asn j. lê Tre Cis Tre Fen His Lis Tre Gin Asn Pro 210 215 220 Gin Cis Pro Ile Fen Arg Leu Gli A;ífe Ile Fen Arg Glu Tre Gri 225 230 235 240 Asn Fen Ser Vai Ala Ile Gin Gii Gli Ile Met Gli Ile Glu Ile 245 250 255 Tir Trp iiíSp Cis Asn Leu Asp Arg Trp Fen His His Cis Arg Pro Lis 260 265 270 Tir Ser Fen Arg Arg Leu Asp Α.ΐρ Lis Tre Tre Asn Vai Ser Leu Tir 275 280 285 Pro Gli Tir ASz:. Fen Arg Tir Ala Lis Tir Tir Lis Glu Asn Asn Val 290 295 300 Glu Lis Arg Tre Leu Ile Lis Vai Fen Gli Ile Arg Fen Ile Leu 305 310 315 320 Vai Fen Gli Tre Gli Gli Lis Fen Afefe Ile Ile Gin Leu Val Val Tir 325 330 335 Ile Gli Ser Tre Leu Ser fir ;·;·*.« Gli Leu Ala Ala Vai Fen lie Asp 340 345 350 Fen Leu Ile Ã3P Tre Tir Ser Ser Asn Yis Cis Arg Ser His Ile Tir 355 360 3 65 Prc Trp Cis Lis Ífèíí Cis Gin Pro Cis Vai vai Asn Glu ’i. ir Tir Tir 370 375 38C Lis Lis Gi:-: Glu Ser Ile i al : Pro Lis Pro Tre Leu Lis Trr 385 390 345 43C Vai Ser Fen Vai Asp Glu Ser His Ile Arg Met V:iÍ Asn Gin Gin Leu 405 410 415 Gli Ser Leu Gin Asp Vai Gli Gin Glu Cai Pro Arg Vrx* 420 430 425

Ala Met Asp Fen Tre Asp Leu Ser Arg Leu Pro Leu íii.s Leu His Asp 435 440 445 Tre Pr o Pro Ile Pro Gli Gin Pro Sii: Glu Ile Gin Leu Leu Arg Lís 050 455 460 Glu Ala Tre Pro Arg Ser Arg Asp Ser Pro Vai Trp Cis Gin Cis Gli 465 470 4'?5 480 Ser Cis e Pio Ser Gin Leu Pro Glu Ser His Arg Cis Leu Glu Glu 485 490 495 Leu Cis Cis Arg Lis Lis Pro Gli Ala Cis Ile Tre Tre Ser Glu Leu 500 505 510 Fen Arg Lis Leu Vai Leu Ser Arg His Vai Leu Gin Fen Leu Leu Leu 515 520 525 Tir Gin Glu Pro Leu Leu Ala Leu Asp Vai Asp Ser Tre Asn Ser Arg 530 535 540 Leu Arg His Cis Ala Tir Arg Cis Tir Ala Tre Trp Arg Fen Gli Ser 545 550 555 560 Gin Asp Met Ala Asp Fen Ala Ile Leu Pro Ser Cis Cis Arg Trp Arg 565 570 575 Ile Arg Lis Glu Fen Pro Lis Ser Glu Gli Gin Tir Ser Gli Fen Lis 580 585 590 Ser Pro Tir 595 <210 > β <211> 595

<212> PRT <213> Homo sapiens

Met Pro Ala Cis Cis Ser Cis Ser Asp Vai Fen Gln Tir Glu Tre Asn ± 5 10 15 Lis Val Tre Arg ile Gin Ser Met Asn Tir Gli Tre Ile Lis Trp Fen 2C 25 30 Fen His Va.1 Ile lie Fc-n Ser Tir Vai Cis Fen Ai a Leu Val Ser Asp 35 00 45 Lis Leu Tir Gin Arg Gin V:: , TI e Ser Ser Val li :: Tre Lis 5C 55 6C vil. lis AI* Glu Vai Lis Glu Glu iie Val u L* Asn Gli Val 65 7C 75 80 Lis Lis LííV: •Li; Ser Vai Fen Asp Tre Ala Asp Tir Tre Fen Pro 90 9 2 2¾

Leu Gin Gli Asn Ser Fen Fen Vai Met Tre Asn Fen Leu Lis Tre Glu 100 105 110 C-li Gin Glu Gin Leu Cis Glu i -i r Pro Ire Arg Arg Tre Leu 115 120 125 Cis Ser Ser Bsp Arg Gli Cis Lis Lis Gli Trp Met Asp Pro Gin Ser 130 135 140 Lis Gli lie Gin Tre Arg Arg Cis Vai Vai lAs Glu Gli Asn Gin Lis 145 150 lai i60 Tre Cis Glu Vai Ser Ala Trp Cis Pro Ile Giu Ala Vai Glu Glu Ala 165 170 175 Prc Arg Pro Ala -ϋθΐΐ Leu Asn Ser Ala Glu Asn Fen Tre Vai Leu Ile ieo 185 190 Lis Asn Asn Ile Asp Fen Pro Gii His Asn Tir Tre Tre Arg Asn Ile 195 200 205 Leu Pro Gli Leu Asn Ile Tre Cis Tre Fen His Lis Tre Gin Asn Pro 210 215 220 Gin Cis Pro Ile Fen Arg Leu Gli Ile Fen Arg Glu Tre Gli Asp 225 230 235 240 Asn Fen Ser Asp Vai Ala Ile Gin Gli Gli lie Met Gli Ile Glu Ile 245 250 255 Tir Trp Asp Cis Asn Leu Asp Arg Trp Fen His His Cis Arg Pro Lis 260 265 270 Tir Ser Fen Arg Leu Asp Lis Tre Tre Asn Vai Ser Leu Tir 275 280 285 Pro Gli Tir Asn Fen Arg Tir Ala Lis Tir Tir Lis Glu Asn Asn Val 290 295 300 Glu Lis Arg Tre Leu Ile Lis Vai Fen Gli Ile Arg Fen •A··» Ile Leu 305 310 315 320 Vai Fen Gli Tre Gli Gli Lis Fen Asp lie Ile Gin Leu Vai Vai Tir 325 330 335 Ile Gli Ser Tre Leu Ser Tir Fen Gli Leu Ala Ala Vai Fen Ile #>!>£ 340 345 350 Fen Leu Ile Asp Tre Tir Ser Ser Asn Cis Cis Ser His ile Tir 355 360 365 Pro Trp Cis Lis Cis Cis Gls Pro Cis Vâl Asn Glu Tir Tir Tir 370 375 380 Arg Lis Lis Cis Glu Ser Ile Vai Giu Pro Lis Fro Tre Leu Lis Tir 385 390 395 400 Vai Ser Fen Vai Asp Giu Ser Eis lie Arg Met •isl Asn Gin Gin Leu 405 410 415 SI:;. Arg Ser Gin Asp Vai Lis Gin Gl-í Pro Arg 420 425 430 Ala Met Asp Fer. Tre Leu Ser Arg Leu Pro Leu Ala .:.·£·'& Asp 435 440 445 Tre Pro Pro Ile Pro Gli Gin Pro Giu Glu Ile Gin Leu Leu P.rc Lis 450 455 460 Gla A 1 a ire Pro Ser Arg Asp Ser P rc Val Trp Cis Gin Cis Gli 465 470 475 480 Ser Cis Leu P r c Ser Gin Leu Pro Glu Ser His Arg Cís Glu Glu 485 490 495 Leu Cis Cis Arg Lis Lis Pro Gli Ala Cis Ile Tre Tre Ser Glu Leu 530 505 510 Fen Arg Lis Leu Vai LvU Ser Arg His Val Leu Gin Fen Leu Leu Leu 515 520 525 T i r Gin Pro Leu Leu A1 a Leu Asp Val Asp Ser Tre Asn Ser Arg 530 535 540 Leu Arg B i s Cis T i r Arg Cis Ti r A la Tre Trp Arg Fen Gli Ser 545 550 555 560 Gin Asp Met A 1 â Asp Fen A 1 a Ile L e a P rc Ser Cis C i s Arg Trp Arg 565 57 0 575 11 e Arg Uís Glu Fen Pro Lis Ser Glu Gli Gin Tir Ser Gli Fen L i s 580 585 590 Ser Pro T i r 595 <210> 7 <211> 595 <212> PRT <213> Homo sapiens Met Pro A la Cis Cis Ser C i s Ser Val Fen Gin Tir Glu Tre Asn 1 5 10 15 Lis Vai Tre Arg Ile Gin Ser Met Asn Tir Gli Tre Ile Lis Trp Fen 20 25 30 Fen E i s Vai Ile Ile Fen Ser iir Val Cis Fen iCls Leu Val Ser Asp 35 40 45 Lis Leu Tir Yln Arg Lis Glu Pro Vai Tir Ser Ser V .1 Eis Tre Lis 50 55 60 Val Lis Gli Ile A1 a Glu Vai Lis Glu Glu Ile Val Glu Asn Gli Val 65 70 75 80 LiS Lis e Vai Eis Ser Vai Fen AS» re A 1 a Tir Tre ~ 8Π Pro 85 90 95 Gin C-li Asn Fen Fen Val Síít r .·.*$ Asn Fen Lis Tre Glu o 0 1 f 105 110 Gli Gin Glu Gin Arg Leu Cis Pro Glu Tir Prc "re Arg Arg Tre Leu 115 123 125 226 C i s Ser Ser Asp Arg Gli C i s Trp Met Asp Pro Gin Ser 130 135 140 Lis Glu Ile Gin Tre Gli Cis Vai Vai His Giu Gli Asn Gin Lis 145 150 155 160 Tre Cis Glu Vai Ser Ala Trp Cis Pro Ile GxU Ala Vai Glu Glu Ala 165 170 175 Arg Pro A 1 a Leu Leu Asn Ser Ala Lis Asn Fen Tre Vai Leu Ile i8 0 185 190 Lis Asn Asn Tle Asp Fen Pro Gli His Asn T-i -V Tre Tre Arg Asn Ile 195 200 205 Leu Pro Gli Leu Asn Ile Tre Cis Tre Fen His Lis Tre Gin Asn Pro 210 215 220 Gin C i s Pro Ile Fen Arg Leu Gli Asp Ile Fen Arg Glu Tre Gir Mg 225 230 235 240 Asn Fen Ser Asp Vai Ala Ile Gin Gli Gli Ile Met Gli Ile Glu Ile 245 250 255 Tir Trp Asp Cis Asn Leu Arg Trp Fen His His Cis Arg Pro Lis 260 265 270 Tir Ser Fen Arg Arg Leu Asp Lis Tre Tre Asn Vai Ser Leu Tir 275 280 285 Pr o Gli Tir Asn Fen Arg Tir Ala Lis Tir Tir L is Glu Asn Asn Vai 290 295 300 Glu L i s Arg Tre Leu Ile L i s Vai Fen Gli Ile Arg Fen ÃíiP Ile Leu 305 310 315 320 Vai Fen Gli Tre Gli Gli L i s Fen Asp Ile Ile Gin Leu Vai Vai Tir 325 330 335 Ile Gli Ser Tre Leu Ser T.ir Fen Gli Leu AI a Ma Vai Fen Ile Asp 340 345 350 Fen Leu Ile Asp Tre Tir Ser Ser Asn Cis Cis Ai 7 Ser His Ile Tir 355 360 365 Pr o Trp Cis L i s C i s C i s Gin Pro Cis Vai Vai Asn Glu Tir Tir Tir 370 375 380 Arg L i s L i s C i s Glu Ser Ile Vai Glu Pro L i s Ero Tre Lew Lis Tir 385 390 395 400 Vai Ser Fen Vai Asp Glu Ser His Ile Arg Met Vai Asn Gin Gin Leu 405 410 415 Leu Ivl 1 Arg Ser Leu Gin Asp Vai L i s Gli Gin Glu Vai Pro Arg Pro 420 425 430 /il 3, Met Asp Fen Tre Asp Leu Ser Arg Leu Pro Leu Leu His Asp 435 440 445 Tr o Ero Ile Pro 1 Gin O Glu Glu lie Gin Leu Leu L i s 450 455 i 60 Glu Ala Tre Pro OvSl Ser Ar:'.;: Asp Ser Pro V;i:i Trp Cis Gin Cis „·, , 365 470 475 480 Ser Cis Leu Pro ser Gin Leu Pro Glu Ser His Arg Cis Leu Giu Glu •vv? vi'.»·»·· 485

Leu Cls Cis Arg L i s Us Pro Gli 530 Fen Arg Lis Leu \/Sl Leu Ser Arg 5 15 520 Tir Gin GlU Pro Leu Leu Ala Leu 53c 535 Leu Arg His Cis Ala Tir Arg Cis 545 550 Gin Asp Met Ala Asp Fen Ala Ile 565 Ile Arg L i s Gin Fen v. Lis Ser 580 Ser Pro Tir 595 490 495

Aia Cis Ile Tre Tre Ser Glu Leu 505 510 His Vai Leu Gin Fen Leu Leu Leu 525 Asp V21 Asp S e z Tre Asn Ser Arg 54C Tir Ala Tre Trp Arg Fen Gli Ser 555 560 Leu Pro Ser Ci s Cis Arg Trp Arg 570 575 Glr Gli Gin Tir Ser Gii Fen Lis 585 590

<210> 8 <211> 595 <212> PRT <213> Homo sapiens

Met Fro Ala C i s C i s Ser Cis Ser Asp Vai Fen Gin Tir Glu Tre Asn J. 5 10 15 L i s Vai Tre Arg Ile Gin Ser Met Asn Tir Gli Tre Ile Lis t;;· Fen 20 25 30 Fen His Vai Ile Ile Fen Ser Tir V a 1 Cis Fen Ala Leu Vai Ser ,ΛνΡνΙ 35 40 45 L i s Leu Tir Gin Arg L i s Glu Pro Vai Ile Ser Ser Vai His Tre L is 50 OO 60 '\/al L i s Gli Ile Ala Glu Vai L i s Glu Glu Ile Vai G1 u Asn Gli Vai 65 70 75 80 L i s L i s Leu Vai 51 i:s Ser Vai Fen Asp Tre Ala Sv:|: Tir Tre Fen Pro 85 90 95 Leu Glr, C-ii Asn Ser Fen Fôií v&l Met Tre Asn Fen Leu Lis Tre Glu 100 105 116 Gli Gin Glu Gin Leu Pro Glu Tir Pro Tre Arg Atg T.ie Leu 115 120 125 Cis Ser Ser Asp Gli Cis Lis Uii Gli L rp Met Asp Ero Gin S er 130 135 Lis Gli Ile Gin Tre Gli Arg LiS Vai Vai 3·: Glu Gli Gin Lis 160 145 150 155 y&l Ser Ala Trp Cis Pro Ile Glu Ala Val Glu Glu Ala 165 170 1 75 Pro Arg Pro Ala Leu Leu Asr Ser Ala Glu Asn Fen Tre Val Pro Ile 1 80 185 190 Lis Asn Asn Ile Asp Fen Fro G 11 His Asn Tir Trs Tre Arg Asn Ile 19 5 200 205 L'iU Pro Gli Leu Asn Ile Tre Cis Tre Fen 5U.Í: Lis Tre Gin A sn Pro 210 215 220 Gin C i s Pro τ i e Fen Arg Leu Gli Asp Ile Fen Arg Glu Tre S-ii Asp 225 233 235 240 Asn Fen Ser Asp Vai à à a Ile Gin Gli Gli Ile Met Gli Ile Glu Ile 245 25C 255 T i r Trp A sp Cis Asn Leu Asp Arg Trp Fen His His Cis Arg Pro Lis 260 265 270 Tir Ser Fen Arg Arg Leu Asp Asp Lis Tre Tre Asn Vai Ser Leu Tir 275 280 285 Pro Gli Tir Asn Fen Arg Tir Ala Lis Tir Tir Lis Glu Asn Asn Val 290 295 300 Glu L i s Arg Tre Leu Ile L i s Vai Fen Gli Ile • > .· Fen Asp Ile Leu 305 310 315 320 Val Fen Gli Tre Gli G 1 i Lis Fen lie Ile Gin Leu Val Val Tir 325 330 335 X 3, θ Gli Ser Tre Leu Ser Tir Fen Gli Leu Ala Ala Val Fen Ile Asp 340 345 350 Fen Leu 11 e Asp Tre Tir Ser Ser Asn Cis C i s Arg Ser His Ile Tir 355 360 365 Pro Trp Cis L is C i s C i s Gin Pro Cis Vai Vai Asn Glu Tir T i r Tir 370 375 380 Arg L i s Lis C i s Glu Ser Ile Vai Glu Pro LlS Pro Tre Leu L i s Tir 385 390 395 400 Vai Ser Fen Vai :s.:^ Glu Ser His Ile Arg Met Val Asn Gin Gin Leu 405 410 415 Leu Gli Arg Ser 1 e u Gin Aí v. Vai L i s Gli Gin Glu Val Pro Arg Ero 420 425 430 Ala Met A sp Fen Tre Asp Leu Ser :&íg Leu Pro Leu R ia Leu His Asp 435 440 445 Tre Pro Pro Ile Pro Gli Gin Pro SlU: Glu lie Gin Leu Leu Aíf L ií.: 450 455 4 60 Glu Ala Tre Pro Arg Ser Arg Asp Ser ’δ Val Trp C i s Gin Cis Gli 465 470 4v5 480 Ser Cis ΐ'Χίί Ser Vi.:;·; Leu Pro Glu Ser E i s Arg C i s Leu L; ; 1 CLu 485 190 495 Leu Cis Cis Arg Lis LÍS Prc Gli Ala Tie Tre Tre Ser C-lu Leu 500 505 510 Fen Ara Li s Leu Vai Leu Ser Arg ::. e Vai Leu Gin Fen Leu Leu Le u 515 520

Tir Gin Glu Pro Leu Ala Leu 530 535 Leu Arg ais Cis Ã.ÍS: Tir Arg Cis 545 550 Gin Asp Met Ai a Asp Fen Ala lie 565 Ile Arg Lis Glu Fen Pro Lis Ser 580 Ser Pro Tir 595 <210> 9 <211> 595 <212> PRT <213> Homo sapiens 525

Asp Vai Asp Ser Tre Asn Ser Arg 540 Tir Ala Tre Trp Arg Fen Gli Ser fc 4¾ 560 Len Pro Ser Cis Cis Arg Trp Arg 57C 575 Glu Gii Gin Tir Ser Gli Fen Lis 585 590

Met Pro Ala Cis Cis Ser Cis Ser .ísSjfj Val Fen Gin Tir Glu Tre Asn 1 5 10 15 Lis Val Tre Arg Ile Gin Ser Met Asn Tir Gli Tre Ile Lis Trp Fen 20 25 30 Fen His Val Ile Ile Fen Ser Tir Val Cis Fen Ala Leu Val Ser 35 40 45 Lis Leu Tir Gin Arg Lis Glu Pro Val Ile Ser Ser Val His Tre Lis 50 55 60 Val Lis Gli Ile Ala Glu Val Lis Giu Glu Ile Val Glu Asn Gli Val 65 70 75 80 LÍ.S Lis Leu Val Eis Ser Val Fen Asp Tre Ala Asp Tir Tre Fen Pro 85 90 95 Leu Gin Gli Asn Ser Fen Fen Val Met Tre A&n Fen Leu Lis Tre Glu 100 105 110 Gii Gin Glu Gin Arg Leu Cis Pro Glu Tir Pro Tre Arg Svg Tre Leu 115 120 125 Cis Ser Ser Arg Via > S Lis Gli Trp Met Asp Pro Gin Ser 13C 135 140 L^s Gli Ile Gin Tre Gli Arv Cis Val Val íil-SS Glu Gli Asn Gin Lis L45 153 155 160 Tre Cis Glu Val Ser ida Trp i.::·; Ile Glu rí .· a V a 1 Glu Giu iCi a 165 175 Pro Arg Pro Ala Leu Asn Ser Ala Glu Asn Feri Tre Vai Leu 11V 183 135 190

As^ Asn Ile Asp Fen Pro Gli His Asn Tir Tre Tre Arg Asn Ile i95 2C0 205 Leu Pro Gli Leu Asn Ile Tre C i s Tre Fen His Lis Tre Gin Asn Pro 210 215 220 Gin Cis Fro Ile Fen Arg Leu Gli Asp Ile Ten Arg Glu Tre Gli Asp 225 23 C 235 240 Asn Fen Ser Asp Vai A la lie Gin Gli Gli Ile Gli Ile Glu Ile 245 250 255 Tir Trp Asp C i s Asn Leu Asp Arg Trp Fen His Eis Cis Cis Pro L i s 260 265 2-0 Ser Fen Arg Arg Leu m Asp L i s Tre Tre Asn Val Ser Leu Tir 27 5 280 285 Prc Gli Tir Asn Fen Tir Ala L i s i i r Tir L i s Glu Asn Asn Val 290 295 300 Glu L i s Arg Tre Leu Ile L i s Val Fen Gli Ile Fen Ile Leu 305 310 315 320 Vai Fen Gli Tre Gli Gli L is Fen Asp Ile Ile Gin Leu Val Vis! Tir 325 330 335 Gli Ser Leu Ser i i r Fen Gli Leu Ala Ala Val Fen Ile Asp 340 345 350 Fen Leu Ile Asa Tre Tir Ser Ser Asn Cis C i s Ser His Ile Tir 355 360 365 Pro '”rp Cis L i s Cis C i s Gin Pro Cis Val Val Asn Glu Tir Tir Tir 370 375 380 Arg LÍS L i s C i s Glu Ser Ile Val Glu Pro Lis Pro Tre Leu L i s Tir 385 390 395 400 Vai Ser Fen Vai Asp Glu Ser His Ile Arg Met Val Asn Gin Gin Leu 405 410 415 Leu Gli Ser Leu Gin Asp Val L i s Gli Gin Glu Val Pro Arg Pro 420 425 43« Met Fen Tre Asp Leu Ser Ar··:· Leu Prc Leu Ala Leu Bis Asp 435 440 445 Tre Pro Pro Ile Pro Gli Gin Pro Glu Glu Ile Gin Leu Leu Arg Lis 450 455 460 Glu A-u 3. Tre Pro Arg Ser Arg Asp Ser Pro Val Trp C i s Gin Cis Gii 465 47C 475 480 Ser Cis Leu Pro Ser Gin Leu Pro Glu Ser His N y. Cis Leu Glu Glu 485 490 495 Leu Cis Cis Arg Lis Lis Lro Aia Cis Ile L r e Tre Ser Glu Leu 500 535 510 Sí:g L i s Leu Val Leu Ser Arg His Leu Gin Fen Leu Leu Leu 51 £ 52C 525 Gin Glu Pico Le u Leu A2 ã Asp Val Asp Ser Tre Asn Ser Arg 530 535 540 Arg Rir Cis Ala Tir Arg Cis Tir Ala Tre T r c· Arg Fei: Gli Ser 545 550 555 560

Gin Asp Met Ala Asp Fen Ala Ile Leu Pro Ser Cis Cis Arg T rp Arg 565 570 575 11 e Arg Lis Glu Fec Prc Lis Ser Glu Gli Gin Tir Ser Gli Fen Lis 580 585 590

Ser Pro T i r 595 <210> 10 <211> 595

<212> PRT <213> Homo sapiens

Met Pro Ai a Cis C i s Ser Cis Ser Asp Val Fen Gin Tir Glu Tre Asn J. 5 iO 15 L i s Vai T r e .'viVsí Ile Gin Ser Met Asn T i r Gli Tre Ile L i s Trp Fen 20 25 30 Fen HÍS Vai Ile Ile Fen Ser Tir Vai Cis Fen Ala Leu Val Ser AaíK 35 40 45 T 4 o AJ J. kj Leu Tir Gin hm L o Glu Pro Vai Ile S e r Ser Val His Tre L i s 50 55 60 Vai L i s Gli Ile Ala Glu Vai Lis Glu Glu Ile Val Glu Asn Gli Val 65 70 75 80 L i s Lis Leu Vai His Ser Vai Fen Asp Tre Ala Tir Tre Fen Pro 85 90 95 Leu Gin Gli Asn Ser Fen Fen Vai Met Tre Asn Fen Leu Lis Tre Glu 100 105 110 Gli Gin Glu Gin Arg Leu Cis Pro Glu Tir Pro Tre Arg Arg Tre Leu 115 120 1 25 Cis Ser Ser Asp Arg Gli Cis Lis ;;i S Gli Trp Met Asp Pro Gin Ser 130 135 14 0 Lis Gli Ile Gin Tre Gli Arg Cis Val Vai HiS Glu Gli Asn Gin Lis 145 150 i 5 5 160 Τϊίβ C i s Glu Vai Ser Ala Trp CLí: Pro Ile Glu Ala Val Glu Glu -Ca i65 170 175 Pro Arg Prc s Leu Asc Ser Ala G iu Ara Fen Tre Val Leu Ile i 81 1E5 190 Lis Asn Ile Asp Fen Pro Gli His Tir Tre Tre Arg Asn Ile 195 200 205 Leu Fro n·. ··. Leu Asn Ile Trc Cis Trc cq n His τ r _ Tre Gin Asn Pro 215 220

Gin Cis Pro Ile Fen Arg L e3 Gli Λιφ Ile Fen Arg Tre Gli Asp 225 230 235 240 Αξπ Fen Ser Asp Ala Ile Gin Gli Gli Ile Net Gli lie Glu Ile 245 250 255 Ητ: Trp Así: Cis Asn Leu Asp Arg Trp Fen His His Cis Arg Pro Lis 260 265 270 Τι r Ser Fen Arg Arg Teu Gap A,Sp Lis Tre Tre Asn Vai Ser Leu Tir. 275 280 285 Pro Gli Tir Asn Fen Arg Tir A_la Lis Φΐ v ixr ^ ; v Lis Glu Asn Asn Vai 290 293 300 Glu Lis Arg Ire Leu n* Lis Vai Fen Gli Ile Arg Fen Asp Ile Leu 3C5 310 315 320 Vai Fen Gli Tre Gli Gli Lis Fen Asp Ile Ile Gin Leu Vgí Vai Tir 325 330 335 Ile Gli Ser Tre Leu Ser Tir Fen Gli Leu Ala Ala Vai Fen Ile ATP 340 345 350 Fen Leu Ile Asp Tre Tir Ser Ser Asn Cis Cis Arg Ser His Ile Tir 355 350 365 Pro Txp Cis Lis Cis Cis Gin Pro Cis Vai Vai Asn Glu Tir Tir Tir 370 375 380 Arg Lis Lis Cis Glu Ser Ile Vai Glu Pro Lis Pro Tre Leu Lis Tir 385 390 395 400 Vai Ser Fen Vai Glu Ser His Ile Arg Met Vai Asn Gin Gin Leu 405 410 415 Leu Gli Arg Ser Leu Gin Asp Vai Lis Gli Gin Glu Vai Pro Arg Pro 420 425 430 Ala Met Asp Fen Tre Aij·': Leu Ser Arg Leu Pro Leu Ala Leu His Asp 435 440 445 Tre Pro Pro Ile Pro Gli Gin Prc Glu Glu Ile Gin Leu Leu Arg Lis 450 455 460 Glu Ala Tre Pro Arg Ser Arg Asp Ser Pro Vai 77¾ Cis Gin Cis Gli 455 4 ? 0 475 480 Ser Cis Leu Pro Ser Gin Leu Pro Glu Ser His Arg Leu Glu Glu 485 490 495 Leu Cis Cis ígrs Lis Lis Pro Gli Ala Cis Ile Tre Tre Ser Glu Leu 500 505 510 Fen Arg Lis Leu Vai Leu Ser Arg Vaí Vai Leu Gin Fen Leu Leu Leu 515 520 525 Tir Gin Glu Pro Leu Leu Ala Leu Asp Vai Asp Ser Tre Asn Ser Arg 530 ...... 540 Leu Arg Hl s Cis Ala Tir Arg Cis Tir Ala Tre Trp Arg Fen Gli Ser 545 553 555 560 Gin Asp Met L ia svp TííK AI A Arc Leu Prc. Ser Cis Cis Arg Trp Arg 565 570 575 Ile Arg Lis Glu Fen Ser Glu Gli Gin Tir Ser Gli Lis 580

Ser Pro Tír 595

<21Q> 11 <211> 588 <212> PRT <213> Homo sapiens

Met Pro A la C i s Cis Ser C i s Ser Val Fen Gin Tir Glu Tre Asn v 5 iO i5 L i s Vai Tre Arg Ile Gin Ser Met Asn Tir Gli Tre Ile L i s Trp Fen 20 25 30 Fen A i s Vai Ile Ile Fen Ser Tir Val Cis Fen Ala Leu Val Ser Asp 35 40 45 L is Leu T ir Gin Ais L i s Glu Pro Val lie Ser Ser Val His Tre LiS 50 55 60 Vai L i s Gli lie Ala Glu Val L i s Glu Glu Ile Val Glu Asn Gli Val 65 70 73 80 L i s L i s Leu Val His Ser Val Fen Tre Ala AviÇ: Tir Tre Fen Pro 85 90 95 Leu Gin Gli Asn Ser Fen Fen Val Met Tre Asn Fen Leu Lis Tre Glu 1.00 105 110 Gli Gin Glu Gin Arg Leu Cis Pro Giu Tir Pro Tre Arg Λϊ:ϊ Tre Leu 115 120 125 Cis Ser Ser Asp Arg Gli Cis Lis L is Gli Trp Met viP Pro Gin Ser 130 i35 140 L is Gli Ile Gin Tre Gli Cis Val Vai His Glu Gli Asn Gin Lis ±45 i 5 0 155 160 Tre Cis Glu 7al Ser Ala Trp C i s Pro Ile Glu Ala Val Glu Glu Ala 165 170 175 Pro Arg Pro Ala Leu Leu Asn Ser A ia Glu Asn Fen Tre Val Leu lie ISO 165 190 L i s Asn Asn Ile Asp Fen Pro Gli E i s Asn Tir Tre Tre Arg Asn Ile 195 200 205 liíX; Pro Gli Le;> Vrn Ile Tre Cis i Fen His Lis Tre Gin Asn Pro 1::-0 215 220 Gin Cis Pro Ile Fen Aí is Leu Gli Asp 11,-s Fen Arg Glu Ire Gli ATS 22 è 230 235 240 Asn Fen Ser ,x: ψ Yal Ala Ile Gin Gli Gli Ile Met Gli Ile 2- Xli. Ile 2-5 L50 55

Cis Asn Arg Trp Fen Ki s Eis Cis Arg Pro Lis 260 265 273 Tir Ser Fen. A:"j Arg Leu Asp Lis ríre Tre Asn Vai Ser Leu Tir 275 28C 285 Gli Tir Asn Arg Tir Ala Lis Tir 'Tir Lis ÍM Asn Asn v'al 290 235 30C Glu L i s Arg Tre Leu Ile L i s vai Fen Ejl Í Ile Arg Fen Ά-W Ile Leu 305 310 315 320 Vai Fen Gli Tre ai i Gli Lis Fen Asp Ile Ile Glr Leu Vai Val Tir 325 330 335 Ile G1 i Ser Tre Leu Ser Tir Fen Gli Leu Ala Ala V al Fen Ile 340 345 350 Fen Leu Ile Tre Tir Ser Ser Asn C i s C i s Arg Ser His Ile Tir 355 36C 365 Pro Trp Cis Lis Cis Cis Gin Prc Cis Vai Val Asn Giu Tir T i r Tir 370 375 380 Arg L i s Lis Cis Glu Ser Ile Val Glu Pro Lis Pro Tre Leu L i s T i r 385 390 395 400 Vai Ser Fen Val Asp Glu Ser His Ile Arg Met Val Asn Gin Gin Leu 405 410 415 Leu Gli Arg Ser Leu Gin Asp Val Lis Gli Gin Glu Val Pro Arg Pro 420 425 430 A1 a Met Asp Fen Tre Asp Leu Ser Arg Leu Pro Leu Ala Leu E i s 7:4 íí 435 440 445 Tr e Pro Pro Ile Pro Gii Gin Pro Glu Glu Ile Gin Leu Leu Arg Lis 450 455 460 Glu Ai a Tre Pro Arg Ser Arg Asp Ser Pro Val Tgjs C i s Gin C i s Gli 465 470 475 480 Ser C i s Leu Pro Ser Gin Leu Giu Glu Leu Cis C i s Arg L i s L i s Pro 485 490 495 Gli A1 a Cís Ile Tre Tre Ser Glu Leu Fen Arg L i s Leu Val Leu Ser 500 505 510 Arg B i s 'Vai Leu Gin Fen Lei; Leu Leu Tir Glr. Glu Pro Leu Leu Ala 515 520 525 Leu Asp Vai Asp Ser Tre Asft Ser Arg Leu Arg B is Cis Ala Tir Arg 530 535 540 Cis T i r .Us Tre Lrp Arg Fen Gli S er οΊ n te:;·· «pi; Ala Asp Fen A ia 545 550 555 560 lie Leu Pro S e i Cis Cis Arg Trp Arg Ile Arg L is Glu Fen Lro L i s 565 570 575 Ser Giu Gli Gin Tir Ser Gli fen Lrs Ser Tir 585 80

<212> FRT <213> Homo sapiens

Me-c Pro kla. Cis Cis Ser Cis Ser yí.Jíj,: Vai Fen Gin T i r Glu Tre Asn 1 5 1C 15 Lis 'Jcí — Tre Arg Ile G.lr Ser Met. Asn Tir Gli Tre Ile Lis TAS Fen 20 25 30 Fen E i s Vai lie Ile Fen Ser T Vai Cis Fen A ia Leu Vai Ser 35 40 45 L i s Leu Tir Gin AS-;? L i s Glu Pro Vai Ile Ser Ser Vai His Tre Lis 50 55 60 '<Ssl Uá Gli Ile Ala Glu Vai Lis Glu Glu Ile Vai Glu Asn Gli Vai 65 70 75 80 L i s L i s Leu Vai His Ser Vai Fen Tre Ala Asp Tir Tre Fen Pro 85 90 95 Leu Gin Gli Asn Ser Fen Fen Vai M e t Tre Asn Fen Leu Lis Tre Glu 100 105 110 Gli Gin Glu Gin Arg Cis Pro Giu Tir Pro Tre Arg Arg Tre Leu 115 120 125 Cis Ser Ser Asp Arg Gli Cis Lis L i s Gli ãru Met Asp Pro Gin Ser 130 135 140 L i s Gli 11 e Gin Tre Gli Arg Cis Vai Vai His Glu Gli Asn Gin L is 145 150 155 160 Tre Cis Glu Vai Ser Ala Trp Cis Pro Ile Glu Ala Vai Glu Glu Ala 165 170 175 Pro Arg Pro Ala Leu Leu Asn Ser Ala Glu Asn Fen Tre Vai Leu Ile 1 80 185 190 Li S Asn Asn 11 e Asp Fen F r o Gii His Asn Tir Tre Tre Arg Asn ile 195 200 205 Leu Pro Cw i ii· Leu Asn Ile Tre Cis Tre Fen His L i s Tre Gin R sn Pro 210 215 220 Gin Cis Prc ile Fen Arg Leu Gli lie Fen Glu Tre Gli Jisp 225 230 235 240 Asn F e s Ser Asp Vai Ala Ile Gin Gli & 1 .i Ile Met G1L '.A: Glu Ile 245 ΟζΛ e-/ \j 255 Tir Trp Asp Cis Asn Leu Asp -Aí: Trp Fen Li s E i s C i s Aí'£ Pro Lis 265 265 270 Tir Ser Fen Arg ·':· l':Í _i6ll Arp Lis T r r Tre Asn ·· α 1 Ser Leu Tir 275 280 285 Pro ’λ í' Asn Fen Arg Tir Ala Lis Tir Tir Lis Giu Asn Asn V&L 290 295 300 Glu Lis Arg Tre Lee ile .LIà·: Vcil ren Gli Ile Fen Asp lie Leu 305 310 Vai Fen G J. i Tre Gli Gli Lis 325 Ile Gli Ser Tre Leu Ser Tir 34G Fen Leu lie Asp Tre Tir Ser 355 Pro Trp Cis Lis Cis Cis Gin 37C 375 Arg Lis Lis Cis Glu Ser Ile 385 390 Vai Ser Fen Vai Glu Ser 405 Leu Gii Arg Ser Leu Gin Asp 420 Ala Met Asp Fen Tre Asp Leu 435 Tre Pro Pro Ile Pro Gli Gin 450 455 Glu Ala Tre Pro Arg Ser Arg 465 470 Ser Cis Leu Pro Ser Gin Leu 485 Leu Cis Cis Arg Lis lis Pro 500 Fen Arg Lis Leu Vai Leu Ser 515 Tir Gin Glu Pro Leu Leu Ala 530 535 Leu Arg Bis Cis Ala Tir Arg 545 550 Gin Asp Met Ala ASÍ; Fen Ala 565 Ile Gin Lis Glu Fen Pro Lis 580 315 Fen Asp lie Ile Gin Leu Vai Vai 330 335 Fen Gli Leu Ala Lia vai Fen Ile 345 350 Ser Asn Cis Cis Ser His ile 360 365 Pro Cis Vai Vai Asn Glu Tir Tir 38C Vai Glu Pro Lis Pro Tre Leu Lis 395 His Ile Arg Met Vai Asn Gin Gin 41C 415 Vai Lis Gli Gin Glu Vai Pro 425 430 Ser Arg Leu Pro Leu Ala Leu Ris 440 445 Pro Glu Glu Ile Gin Leu Leu Arg 460 Asp Ser Pro Vai Trp Cis Gin Cis 475 Pro Glu Ser His Arg Cis Leu Glu 490 495 Gli Ala Cis lie Tre Tre Ser Glu 505 510 Arg His Vai Leu Gin Fen Leu Leu 520 525 Leu Vai Asp Ser Tre Asn Ser 540 Cis Tir Aia Tre Trp Arg Fen Gli 555 Ile Leu Pro Ser Cis Cis Arg Trp 570 575 Ser Glu Gli Gin Tir Ser Gli Feri 585 590 320

Tir

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Tir 400

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Ser ?.·:::· Tir 595 < 4 Ο Ο > 13 gtaacctcac tgagaacaga 20 <210 > 14 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens '^'3 li \·: 3 .1 3 <210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 15 ccttgtatgg gctttcgtgc t 21 <210> 16 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 16 ttgtgtatcc gtccatcagc t 21 <210 > 17 <211> 20 <212> ADN J. .5> Homo sapiens <210 > 18 <211> 20 <212> ADN <213> Homo < 4 0 0 > 18 aaatctaccc <21G> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Homo <4 00> 19 tgcagtggcc <210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> Homo <400> 20 catcctccaa <210> 21 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens agccacttag sapiens cacagcacag sapiens tgcctgcatc sapiens <210> 22 <211> 20 <212> ADN <213> Homo <400> 22 caagagcagt <2i0> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Homo <400> 23 gagcccacag <210> 24 <211> 20 <212 > ADN <213> Homo <400> 24 tgcctgcctc <210> 25 <211> 20 <212> ADN <213> Homo <400 25 tctctcgccc sapiens ggttgtgtcc sapiens atatctactg sapiens agtctctggt sapiens aggttgagtt

ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 26 acgtcctctc cgcagttctt <210> 27 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 27 attcag accg aaaggtgtgt <210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens Λ O O V 28 tgcctggtgt cccatcgagg <210> 29 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 29 gttgta ac ac tcctgtacca A ro I_s o V ?C <211> 20 < 212 > ADN < 213 > Homo sapiens < 4 Ο Ο > 30 aacagtgcca <210> 31 <211> 20 <212 > ADN <213> Homo < 4 0 0 > 31 tcactgtgcc <210> 32 <211> 20 <212 > ADN <213> Homo aaaacttcac sapiens catcaagaac sapiens tgctgcgtgc ttctggctca 20

<210> 33 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 33 ctggagaacc cttttccaag 20

<210> 34 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens

<210> 35 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 35 tccacccgct acgctaaggt

<210> 36 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 36 tgcgctaagg actttaccta

<210> 37 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 37 tttacctacc ctacctcgtc

<210> 38 <211> 20 < 212 > ADN <213> Homo sapiens <400> 38 20 ccatcactgc tgtcccaaat

<212> ADN <213> Homo <400> 39 tcgccttgat <210> 40 <211> 20 <212> ADN <213> Homo <400> 40 gtaaactctt <210> 41 <211> 20 <212> ADN <213> Homo <400> 41 accaagacac <210> 42 <211> 20 <212> ADN <213 > Homo <400> 42 taatattaaa <210> 43 <211> 20 sapiens gacaagacca sapiens ccactctgtt sapiens ggagagattc sapiens tgtaacttta <213> Homo sapiens < 4 Ο Ο > 43 aatattaaac ataactttat 20 <210> 44 <211> 20

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 44 ccatctcaac tggaggagct 20 <210> 45 <211> 20 <212> ADN <213> Homo <400> 45 sapiens gactttgcca tcctgcccag 20

<210> 46 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 46 tggaggatcc <210> 47 <211> 20 agaaagagtt 20 <213> Homo sapiens <400> 47 aatcccagca ctttgggagg 20

<210> 48 <211> 20 <212> ADN <213> Yomo sapiens <400> 48 aaactgtccc aaaaaaaaaa 20

<210> 49 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 49 aactgtcccc caaaaaaaaa 20

<210> 50 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 50 ctgtccccac aaaaaaaaaa 20 <210> 51 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <mo> 51 20 caaggcgggt ggatcactta

< 212 > ADN <213> Homo sapiens <400> 52 cgtaggactt ggcgcttct <210> 53 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 53 gagcacgtct cagattcgaa <210> 54 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 54 ccatgaggca ggtatgacta <210> 55 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 55 ctcctggatc tcacccagtt <210 > 56 <211> 23 <212> <2 ±3> Homo sapiens <4 Ο Ο > 56 ctcgtccagc tttgatatta age 23

<210> 57 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 57 ggtccctagt gctagaacca ga 22 <210> 58 <211> 18 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 58

attcatccgt cagtggcc IS

<210> 59 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 59 22 gccatgtgaa ttttctaccg at

<210 60 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 60 ttcgttgtgg ttaggatggg <21Q> 61

<211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 61 caaggatgct cagggtagta gc 22 <210> 62

<211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 62 cactaggttt gctgtatcca tttct 25

<210> 63 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 63 gcaactgtgt gagagcttgg 20

<210> 64 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens 64 tcaaccctgg tccagtgtg

<212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 65 caccaagtag ctctcactca taagg 25 <21 66 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 Oo> 66 caataacact tgtgcgagtt aggt 24 <2X0> 67 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 67 catcttgttg ccttggaaac c 21 68 >> τ -:i, 23 <212> ADN <213> Homo sapiens A O O V 68 gtgagtggta atcctçctac tgc 23 <210> 69 <.211> 19 < 212 > ADN <213> Homo sapiens <4 Ο Ο > 69 aggcccactc <210> 70 <211> 19 <212> ADN <213> Homo <400> 70 ccaagtcaca <210> 71 <211> 18 <212> ADN <213> Homo < 4 0 0 > 71 acccagcgac <210> 72 <211> 19 <212> ADN <213> Homo <400> 72 aagcatgggg < 210 > 73 <211> 24 <212> ADN <213> Homo <400> 73 ctgtactcg sapiens gcatgaggc sapiens gtatccac sapiens ttccatttc sapiens gcataaaagg gactcctgct agta <210> 74 <211> 21 <212> AON <213 > Homo <400 74 gcttacagaa <210> 75 <211> 19 <212> MJ» <213> Homo <400> 75 gcacctgtag <210> 76 <211> 21 <212> ADN <213> Homo <400> 76 atcaccacct <21Q> 77 <211> 21 <212> ADN <213> Homo gttaacatgg sapiens cacatgcatg g sapiens gcacagtgc sapiens cagagctgtt c sapiens ctactgcagc c

ADN <213> Homo sapiens <40Q> 78 gcttagaaag gaggcgoctc c 21 <210> 79 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 79 ttgtgacatt tgcaaggctg cc 22 <210> 80 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 80 tctgaagctc tgctcctgag 20 <210> 81 <211> 20 <212> ADN <213> Homo <400> 81 sapiens ctcaccttct ggcttccagt 20

<210> 82 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 00> 82 cttacc actc ccaggactaa <210> 83 <211 > Ο ^ υ <212> ADN <213 > Hemo sapiens < 4 0 0 > 83 gtctgc :ctgt tcactgccat <210 > 84 <211> 21 <212> ADN Λ Ν> UJ V Hemo sapiens < 4 0 0 > 84 cagag acctt cagaaacttc <210 85 <211 > 20 <212 > ADN <213> Hemo sapiens Λ Ο ο V 85 agatc accag ggacacagtg

<210> 86 <211> 20 <212> ADN <213> Η omo sapiens <210> 87 <211> 23

<212> ADN <213> Homo sapiens 87 cctttcactt ttttggtctc atg 23 88 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 88 gggagaattc tgaaaatgcc c 21

<210> 89 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 89 ggaccagagc tctactcttc 20 <210> 90 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens

Ai; 3 ;·. *?;·· .¾. y·· y.-y. p;,,y· V : ;

<212> ADN <213> Homo <400> 91 aagaagcgcc <21Q> 92 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens aagtcctacg sapiens <400> 92 gcaatccaga ctgaagttga c 23 <210> 93 <211> 20

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 93 actctggtct gcagttggtg <210> 94 <211> 24

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 94 24 cetttaaaat cagagacctt caga

Homo sapiens < 4 0 0 > 95 gcccatcctc tgaacaccat < 210 > 96 <211> 21 <212> ADN < V'' Ί 3; > Homo sapiens <400> 96 cccttggaac tcttgctatc g < 210 > 97 <211> 21 <212> ADN ''\4 V. Homo sapiens <400> 97 ggcagtacag tggcttcaag a <2I0> 98 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 98 gtgggacagt ttgctgtgcc t 21

<210> 99 11> 20 <212> ADN <213 > H omo sapiens < 4 Ο Ο > 99 gagtccttac caatagcagg 20 <210 > 100 <211> 21

<212> ADN <213> Homo sapiens < 4 0 0 > 100 gtcaaagaat ttgtggccac c 21

<210> 101 <211> 26 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 101 catgaactgt cttttaatgt gtaaag 26

<210> 102 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 102 gagatacggt ttcaccatgt tg 22 <210> i03

<211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens sapiens <210> 104 <211> 21 <212> ADN <213> Homo <400> 104 ttgagatgga gtctcgctct g 21

<210> 105 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 105 cactgtccac gtgactgctt 20

<210> 106 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 106 tcctacttcg gtctggtaag agatt 25

<210> 107 <211> 19 <212> ADN sapiens <213> Homo <211> 23 <212> km <213> Homo sapiens <4 C0> 108 aagaacctag aacctgaggg ctt 23 <21G> 109 <211> 19

<212> ADN <213> Homo sapiens ttgagatggg aggcagctt <210> 110 <211> 17

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 110 ttcggctccc aggacat <210> 111 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> m cacagagctt tgcaggtgaa

Claims (9)

1. Utilização de um agonista de P2X7R de um canal de iões com barreira de ATP para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio afectivo.

2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de o referido agonista se seleccionar no grupo que consiste em ATP, ATP-4 e BzATP 5'-trifosfato de (2'-3' -0- (4-benzoilbenzoil) adenosina )

3. Utilização de tenidap ou de 2-oxindole-l- carboxmidas substituídas em 3 posições para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio afectivo.

4. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo facto de a referida composição farmacêutica ainda compreender eventualmente um mediador de um receptor β-adrenérgico.

5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo facto de modulador do receptor b-adrenérgico ser um antagonista de um receptor β-adrenérgico seleccionado no grupo que consiste em DL-propanolol, D-propanolol e labetolol.

6. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo facto de o referido distúrbio afectivo se seleccionar no grupo que consiste em depressão clínica, distúrbio de ansiedade generalizada e distúrbio bipolar.

7. Utilização, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de a referida depressão clinica se seleccionar no grupo que consiste em depressão clinica, distimia, depressão âtipica, distúrbio disfórico pré-menstrual e distúrbio afectivo sazonal.

8. Utilização, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de o referido distúrbio de ansiedade generalizada se seleccionar no grupo que consiste em distúrbio de pânico, fobias, agorafobia, fobia social, fobia especifica, distúrbio obssessivo compulsivo, distúrbio de stress post-traumático, distúrbio da ensiedade da separação, mania, hipomania e distúrbio ciclotimico.

9. Utilização, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de o referido distúrbio bipolar ser um distúrbio bipolar do tipo I ou um distúrbio bipolar do tipo II. Lisboa, 17 de Outubro de 2007