DE602004008528T2 - Mittel und Verfahren zur Diagnose und Behandlung affektiver Störungen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendungen eines Agonisten von P2X7R für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung affektiver Krankheiten.
  • Bis zu 10 % der Personen, die einen Arzt aufsuchen, leiden an einer affektiven Störung (auch als Verhaltensstörung oder Gemütskrankheit bekannt). Trotzdem werden die meisten Fälle nicht diagnostiziert oder nicht richtig behandelt. Affektive Störungen schließen u.a. Depression, Angst und bipolare Störung ein. Diese Krankheiten sind in der Literatur umfassend beschrieben; vgl. z.B. „Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders", 4. Auflage, überarbeiteter Text (DMS-IV-TR), American Psychiatric Press, 2000.
  • Die Depression, auch als unipolare affektive Störung bekannt, ist durch eine Kombination von Symptomen gekennzeichnet, wie gedrückte Stimmung, Energieverlust, Interessenverlust, Gefühl einer körperlichen Krankheit, Konzentrationsschwäche, veränderter Appetit, verändertes Schlafverhalten und ein Verlangsamen von körperlichen und geistigen Funktionen, was zu einem anhaltenden Gefühl von Hoffnungslosigkeit, Hilflosigkeit, Schuld und Angst führt. Die wichtigsten Subtypen dieser Krankheit sind schwere Depression, Dysthymie (mildere Depression) und atypische Depression. Andere wichtige Formen der Depression sind prämenstruelle dysphorische Störung und jahreszeitabhängige affektive Störung. Die zurzeit gängige Behandlung der Depression besteht aus Psychotherapie, Antidepressiva oder einer Kombination davon. Die meisten Antidepressiva zielen auf den Transport der Neurotransmitter Serotonin und/oder Norepinephrin oder auf die Aktivität des Enzyms Monoaminoxidase. Diese schließen ein: selektive Serotonin-Wiederaufnahme-Hemmer (z.B. Fluoxetin, Paroxetin, Sertralin, Fluvoxamin), trizyklische Antidepressiva (z.B. Amitriptylin, Imipramin, Desipramin, Nortriptylin), Monoaminoxidase-Hemmer (z.B. Phenelzin, Isocarboxazid, Tranylcypromin) und Designer-Antidepressiva wie Mirtazapin, Reboxetin, Nefazodon. Jedoch weisen alle vorliegenden Antidepressiva Mängel auf, wie eine lange Latenzzeit bis zu einem Ansprechen, einen hohen Grad an Nicht-Respondern und unerwünschte Nebenwirkungen (Holsboer, Biol. Psychol. 57 (2001), 47–65). Deshalb besteht in der Medizin ein Bedarf für neue Antidepressiva mit einem verbesserten pharmakologischen Profil (Baldwin, Hum. Psychopharmacol. Clin. Exp. 16 (2001), S93–S99).
  • Angststörungen sind durch einen exzessiven oder inadäquaten Erregungszustand definiert, der durch Gefühle von Apprehension, Unsicherheit oder Furcht gekennzeichnet ist. Sie werden gemäß der Schwere und Dauer ihrer Symptome und spezifischen affektiven Charakteristika klassifiziert. Die Kategorien schließen ein: (1) Generelle Angstneurose, (2) Angstkrankheit, (3) Phobien, (4) obsessiv-kompulsive Störung, (5) posttraumatische Stresserkrankung und (6) Trennungsangst. Die Standardbehandlung für die meisten Angststörungen besteht aus einer Kombination von kognitiver Verhaltenstherapie und Behandlung mit Antidepressiva. Weitere medikamentöse Behandlungen schließen Benzodiazepine und Buspiron ein.
  • Die bipolare Störung, auch als manische Depression bekannt, ist durch Stimmungsumschwünge zwischen manischen Episoden (d.h. gehobener Stimmung einschließlich übertriebener Euphorie, Reizbarkeit) und depressiven Episoden gekennzeichnet. Die bipolare Störung wird nach der Schwere der Symptome eingeteilt. Patienten, bei denen eine bipolare Störung des Typs I diagnostiziert wird, leiden an manischen oder gemischten Episoden mit oder ohne schwere Depression. Bei der bipolaren Störung des Typs II haben die Patienten Episoden von Hypomanie und Episoden von schwerer Depression. Bei der Hypomanie treten die Symptome der Manie (Euphorie oder Reizbarkeit) in schwächeren Formen auf und sind von kürzerer Dauer. Die zurzeit gebräuchlichen Arzneistoffe, die zur Behandlung bipolarer Störungen eingesetzt werden, sind Lithium, Valproat und Lamotrigin, welches die Freisetzung des Neurotransmitters Glutamat stimuliert. Wie bei den Antidepressiva dauert es auch hier Wochen, bis sie wirksam werden, und außerdem können sie zu unerwünschten Nebenwirkungen führen, z.B. können hohe Lithiumspiegel im Blut tödlich sein.
  • Es gibt zwingende Beweise dafür, dass affektive Störungen biologische Krankheiten sind. Jedoch gibt es keine Labortests oder anderen Verfahren, die ein Allgemeinarzt einsetzen kann, um eine genaue Diagnose zu stellen. Stattdessen muss ein speziell geschulter Arzt oder Psychiater die Krankheit anhand einer Gruppe von zusammen auftretenden Symptomen diagnostizieren. Dieser Prozess ist häufig zeitaufwändig und mühsam, wobei mehrere Visiten erforderlich sind, so dass der Arzt eine sorgfältige Anamnese der Symptome, an denen der Patient oder die Patientin zurzeit leidet, und außerdem aller Symptome, die in der Vergangenheit bei ihm oder ihr aufgetreten sind, erheben kann. Deshalb ist ein einfaches und wirksames Verfahren für die genaue Diagnose von affektiven Störungen für die Medizin von großem Interesse (Wittchen et al., J. Clin. Psychiatry 62, Erg. 26 (2001), 23–28).
  • Die meisten Patienten, die an affektiven Störungen leiden, haben eine familiäre Vorgeschichte, und Studien an eineiigen Zwillingen deuten auf eine starke genetische Komponente hin. Z.B. lässt eine genetische Kartierung an einer isolierten Population des Zentraltals von Costa Rica auf einen Locus für eine schwere bipolare Störung auf Chromosom 18q22-q23 schließen (Freimer et al., Nature Genetics 12 (1996), 436–441). Außerdem legen genetische Studien, die an der Old Order Amish-Population durchgeführt wurden, nahe, dass Gene auf den Chromosomen 6, 13 und 15 möglicherweise zu der Anfälligkeit für eine bipolare affektive Störung beitragen (Ginns et al., Nature Genetics 12 (1996), 431–435). Eine kürzlich durchgeführte Genom-weite Suche in einer homogenen Population, die in der Region von Saguenay/Lac-St-Jean in Quebec gefunden wurde, legt das Vorliegen eines Hauptlocus für die bipolare Störung auf Chromosom 12q23-q24 nahe (Morissette et al., Am. J. Med. Genet. (Neutropsychiatr. Genet.) 88 (1999), 567–587). Außerdem wurden in dieser Studie Anfälligkeits-Loci auf den Chromosomen 5 und 21 gefunden. Andere Gruppen berichten über sehr kleine Hinweise auf eine Kopplung mit der Region von 12q23 (Kelsoe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 585–590; Sklar, Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 3 (2002), 371–413). Aufgrund der in den vorstehenden Studien angegebenen verschiedenen Loci (z.B. Zusammenhang mit den Chromosomen 5, 6, 12, 13, 15, 18, 21) muss erst noch endgültig geklärt werden, mit welcher genetischen Stelle affektive Krankheiten in Zusammenhang stehen.
  • So wurde zwar für mehrere Gene vermutet, dass sie mit affektiven Störungen in Zusammenhang stehen, wie vorstehend erwähnt, jedoch wurde noch keine klare Korrelation gezeigt. Da weder eine gut geeignete Medikation noch eine Diagnose auf molekularer Ebene für affektive Störungen verfügbar ist, besteht ein Bedarf dafür, ein Gen zu identifizieren, dessen Mutationen das gesamte Spektrum von affektiven Störungen auslösen, und außerdem Medikamente und Verfahren für die Diagnose und Behandlung affektiver Störungen bereitzustellen.
  • Somit besteht das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem darin, Mittel und Verfahren zum Diagnostizieren affektiver Störungen bereitzustellen.
  • Die Lösung dieses technischen Problems wird durch Bereitstellen der Ausführungsformen erreicht, die in den Patentansprüchen angegeben sind.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Nucleinsäuremolekül, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) einer genomischen Nucleotidsequenz, die einen ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R codiert und die in der 5'UTR-Region eine Mutation enthält, die der Position 362, 532, 1100, 1122, 1171 oder 1702 der genomischen Sequenz des wie in SEQ ID NO: 1 dargestellten ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R vom Wildtyp entspricht, wobei an der Position das Nucleotid durch ein anderes Nucleotid ersetzt ist;
    • (b) einer Nucleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R hat, wobei in dem Exon, wie in der Spalte „Exon" der folgenden Tabelle A angegeben, der Aminosäurerest, wie in der Spalte „Aminosäurerest" der Tabelle A angegeben, der der Position, wie in der Spalte „Position im Wildtyp" der Tabelle A angegeben, der wie in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Wildtyp-Aminosäuresequenz des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R entspricht, durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist;
    Tabella A
    Exon Aminosäurerest Position im Wildtyp
    Exon 3 R (Arg) 117
    Exon 5 G (Gly) 150
    Exon 6 E (Glu) 186
    Exon 6 L (Leu) 191
    Exon 8 R (Arg) 270
    Exon 13 I (Ile) 568
    Exon 13 R (Arg) 578
    • (c) einer Nucleotidsequenz, die einen ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R codiert und die im Exon 5 oder 8 eine Mutation enthält, die der Position 32548 oder der Position 37633 der wie in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nucleotidsequenz des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R vom Wildtyp entspricht, wobei an der Position das Nucleotid durch ein anderes Nucleotid ersetzt ist;
    • (d) einer Nucleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz eines ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R hat, wobei Aminosäuren, die den Positionen 488 bis 494 der wie in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Wildtyp-Sequenz des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R entsprechen, deletiert sind;
    • (e) einer genomischen Nucleotidsequenz, die einen ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R codiert, wobei in dem Intron, wie in der Spalte „Intron" der folgenden Tabelle B dargestellt, das Nucleotid, wie in der Spalte „Ersetztes Nucleotid" der Tabelle B dargestellt, das der Position, wie in der Spalte „Position im Wildtyp" der Tabelle B angegeben, der wie in SEQ ID NO: 1 dargestellten Wildtyp-Nucleotidsequenz des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R entspricht, durch ein anderes Nucleotid ersetzt ist;
    Tabelle B
    Intron Ersetztes Nucleotid Position im Wildtyp
    Intron 1 G 3166
    Intron 1 C 24778
    Intron 1 C 24830
    Intron 3 A 26308
    Intron 3 G 26422
    Intron 4 G 32394
    Intron 4 T 32434
    Intron 5 A 32783
    Intron 6 G 35641
    Intron 6 A 35725
    Intron 6 T 36001
    Intron 7 G 36378
    Intron 7 T 36387
    Intron 7 G 36398
    Intron 9 C 47214
    Intron 11 T 47563
    Intron 12 C 54307
    Intron 12 G 54308
    • (f) einer genomischen Nucleotidsequenz, die einen ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R codiert und die eine Mutation in der 3'UTR-Region enthält, die der Position 55169, 55170, 55171, 55917 oder 54925 der wie in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nucleotidsequenz des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R vom Wildtyp entspricht, wobei an der Position ein Nucleotid durch ein anderes Nucleotid ersetzt ist;
    • (g) einer Nucleotidsequenz, die zumindest 20 oder 21 Nucleotide umfasst und die Mutationen oder Deletionen, wie in einem beliebigen der Punkte (a) bis (f) definiert, umfasst;
    • (h) einer Nucleinsäuresequenz, die eine Nucleotidsequenz, wie in einer beliebigen der SEQ ID NO: 13 bis 51 gezeigt, umfasst;
    • (i) einer Nucleinsäuresequenz, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NOs: 5 bis 12 umfasst;
    • (j) einer Nucleotidsequenz, die mit einer Nucleotidsequenz, wie in einem beliebigen der Punkte (a) bis (g) definiert, oder mit der Nucleotidsequenz nach (h) hybridisiert und eine Mutation aufweist, wie in einem beliebigen der Punkte (a) bis (f) definiert;
    • (k) einer Nucleinsäuresequenz, die auf Grund des genetischen Codes zu der Nucleinsäuresequenz, wie in (j) definiert, degeneriert ist.
  • Erstaunlicherweise wurde gefunden, dass Mutationen in dem P2X7R-Gen, welches den ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R codiert, das ganze Spektrum von affektiven Störungen verursachen können. Sechs verschiedene Mutationen in der 5'UTR-Region des P2X7R-Gens, sieben verschiedene Mutationen in den Exons 3, 5, 6, 8 und 13 des P2X7R-Gens, die zu einem Aminosäureaustausch der entsprechenden Aminosäure in der wie in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Wildtypsequenz von P2X7R führen bzw. zwei Mutationen in den Exons 5 und 8 des Gens, die zu einem Austausch eines Nucleotids durch ein anderes Nucleotid führen, eine Deletion von Nucleotiden in Exon 13 des Gens, 18 Mutationen in den Introns 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 und 12 und fünf Mutationen in der 3'UTR-Region des P2X7R-Gens wurden identifiziert, die in 41 nicht miteinander verwandten Familien, die von affektiven Störungen betroffen sind, mit dem affektiven Zustand zusammen segregieren. Der Begriff „affektive Störung" soll im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfassen, jedoch nicht beschränkt sein auf Depression, Angst, unipolare Störung, bipolare Störung vom Typ I, bipolare Störung vom Typ II, Manie, Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätsstörung, Substanzmissbrauch und beliebige andere Störungen, welche das normale Verhalten oder die normale Stimmung eines Individuums beeinträchtigen.
  • Jede Mutation verursacht Änderungen, welche affektive Störungen erklären können, wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird.
  • P2X7R ist ein ATP-abhängiger Ionenkanal, der zur Familie der ionotropen P2X-Kanäle gehört. Das Gen wurde zuerst aus dem Rattengehirn (Surprenant et al. 272 (1996), 735–738; Genbank-Hinterlegungsnummer NM_019256) und anschließend aus einer menschlichen Monocyten-Bank (Rassendren et al., J. Biol. Chem. 272 (1997), 5482–5486; Genbank-Hinterlegungsnummern NM_002562, Y09561) anhand seiner Sequenzhomologie mit den anderen Mitgliedern der P2X-Familie isoliert. Später wurde gefunden, dass P2X7R dem nicht-identifizierten Rezeptor P2Z entspricht, der die permeabilisierende Wirkung von ATP auf Mastzellen und Makrophagen vermittelt (Dahlqvist und Diamant, Acta Physiol. Scand. 34 (1974), 368–384; Steinberg und Silverstein, J. Biol. Chem. 262 (1987), 3118–3122; Gordon, Biochem. J. 233 (1986), 309–319). P2X7R hat zwei hydrophobe Membran-überspannende Domänen, eine extrazelluläre Schleife und bildet Transmembran-Ionenkanäle. P2X7-Rezeptoren scheinen nur in der homooligomeren Form zu funktionieren und besitzen ein pharmakologisches Profil, das sich deutlich von anderen P2X-Homo- oder Heteromeren unterscheidet (North and Surprenant, Annual Rev. Pharmacology Toxicology 40 (2000), 563–580). Für P2X7R sind ATP-Spiegel von mehr als 1 mM erforderlich, damit eine Aktivierung erfolgt, während andere P2X-Rezeptoren bei ATP-Konzentrationen von ≤ 100 μM aktiviert werden (Steinberg et al., J. Biol. Chem. 262 (1987), 8884–8888; Greenberg et al., J. Biol. Chem. 263 (1988), 10337–10343) 32). Während alle P2X-Rezeptoren nach einer Ligierung nicht-selektive kanalartige Eigenschaften aufweisen, wandeln sich die durch P2X7R gebildeten Kanäle rasch zu Poren um, welche die Passage von Molekülen von bis zu 900 Dalton zulassen können (Virginio et al., J. Physiol. 519 (1999), 335–346).
  • P2X7R wird in hämatopoetischen Zellen, Mastzellen und Makrophagen exprimiert (Surprenant et al., Science 272 (1996), 3118–3122), wo es in einer tetrameren oder einer hexameren Form organisiert ist (Kim et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 23262–23267). P2X7R ist u.a. an der Regulation der Immunfunktion und Entzündungsantwort beteiligt. Die Aktivierung von P2X7R durch ATP in Makrophagen ist assoziiert mit einer mitogenen Stimulation von T-Zellen (Baricordi et al., Blood 87 (1996), 682–690), der Freisetzung von Cytokinen wie Interleukin-1β (Griffiths et al., J. Immunol. 154 (1995), 2821–2828) und der Bildung von Makrophagen-Polykarions (Falzoni et al., J. Clin. Invest. 95 (1995), 1207–1216). Die Stimulation von P2X7R mit ATP kann auch zum Zelltod führen, indem massive Transmembran-Ionenflüsse ausgelöst werden (insbesondere das Einströmen von Ca2+ und Na+ und das Ausströmen von K+) und nicht-selektive Plasmamembranporen gebildet werden (Di Virgilio et al., Cell Death Differ. 5 (1998), 191–199).
  • Ursprünglich wurde angenommen, dass P2X7R im Gehirn auf Mikroglia (im Gehirn vorliegende Makrophagen) und Ependymzellen beschränkt ist und nicht in Neuronen vorkommt (Collo et al., Neuropharmacology 36 (1997), 1277–1283), dies legte eine Rolle von P2X7R in der Neurodegeneration nahe. Seitdem wurde P2X7R jedoch in Neuronen der Retina der Ratte (Brandle et al., Brain Research Molecular Brain Res. 62 (1998), 106–109), in Zellen des Ganglion spirale cochlearis (Brandle et al., Neuroscience Letters 273 (1999), 105–108) und in präsynaptischen Enden von Neuronen im ganzen Hirnstamm und Rückenmark gefunden (Deuchards et al., J. Neurosci. 21 (2001), 7143–7152). Anschließende Untersuchungen lassen außerdem vermuten, dass P2X7R die Freisetzung von Neurotransmittern wie Glutamat und GABA in Neuronen des Hippocampus reguliert (Armstrong et al., J. Neuroscience 22 (2002), 5938–5945; Sperlágh et al., J. Neurochem. 81 (2002), 1196–1211). Die Organisation von P2X7R in Gliazellen und Astrocyten des Gehirns erscheint monomer (Kim et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 23262–23267).
  • Verschiedene Agonisten und Antagonisten von P2X7R wurden identifiziert. Brilliant-Blau (Jiang et al., Mol. Pharmacol. 58 (2000), 82–88), die Isochinoline 1-[N,O-Bis(5-isochinolinsulfonyl)-N-methyl-L-tyrosyl]-4-phenylpiperazin und N-[1-[N-Methyl-p-(5-isochinolinsulfonyl)benzyl]-2-(4-phenylpiperazin)ethyl]-5-isochinolin-sulfonamid (Humphreys et al., Mol. Pharmacol. 54 (1998), 22–32), Adamantan-Derivate ( WO 99/29660 , WO 99/29661 , WO 00/61569 , WO 01/42194 , WO 01/44170 , WO 01/44213 ), substituierte Phenylverbindungen ( WO 00/71529 ), Piperidin und Piperazin-Derivate ( WO 01/46200 ) sind Antagonisten von P2X7R, während oxidiertes ATP (oATP) als ein irreversibler Inhibitor des Rezeptors wirkt (Chen et al., J. Biol. Chem. 268 (1993), 8199–8203). Einige dieser Antagonisten werden zurzeit für die Behandlung von Entzündungs-, Immun- und Herz-Kreislauf-Erkrankungen getestet. BzATP (2'-3'-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosin-5'-triphosphat (C24H24N5O15P3)) wirkt als Agonist von P2X7R (North und Surprenant, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40 (2000), 563–580). WO 99/55901 beschreibt ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, welche die Aktivität eines Purinrezeptors von Säugern modulieren, ausgewählt aus der Gruppe, die aus P2X2, P2X3, P2X4, P2X5, P2X6 und P2X7 besteht, und schlägt vor, dass die Purinrezeptoren in der Therapie von Verhaltensstörungen wie Epilepsie, Depression und mit dem Alter zusammenhängenden degenerativen Krankheiten eine Rolle spielen können.
  • Mutierte Mäuse, denen P2X7R fehlt, sind gesund und fruchtbar und zeigen keinen ungewöhnlichen Phänotyp. Im Gegensatz zu ihren Wildtyp-Vertretern können LPS-aktivierte peritoneale Makrophagen aus P2X7R–/–-Tieren jedoch kein reifes Interleukin-1β (IL-1β) erzeugen, wenn sie mit ATP in Kontakt gebracht werden, dies lässt vermuten, dass peritoneale Makrophagen nicht in der Lage sind, IL-1 als Reaktion auf ATP freizusetzen (Solle et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 125–132). An den P2X7R–/–-Mäusen wurde keine ausführliche Verhaltensstudie durchgeführt. Bei Menschen führt ein Glu-496-zu-Ala-Polymorphismus zu einem Verlust der P2X7-Funktion (Gu et al., J. Biol. Chem. 276 (2001), 11135–11142) und ist mit chronischer B-Zell-Lymphocyten-Leukämie assoziiert (Thunberg et al., The Lancet 360 (2002), 1935–1939). Weitere Polymorphismen in der mutmaßlichen Promotor-Region und codierenden Region von P2X7R wurden beschrieben (Li et al., FEBS Lett. 531 (2002), 127–131; EP 1199372 ).
  • Trotz der umfangreichen Literatur, die P2X7R betrifft, wurde nach dem bisherigen Stand der Technik niemals eine Rolle in affektiven Störungen vorgeschlagen oder darauf hingewiesen.
  • Bevor die vorliegenden Erfindung ausführlich beschrieben wird, muss darauf hingewiesen werden, dass diese Erfindung nicht auf die hier beschriebene bestimmte Methodik, die hier beschriebenen bestimmten Protokolle, Zelllinien, Vektoren und Reagenzien beschränkt ist, da diese variieren können. Außerdem ist es so zu verstehen, dass die hier verwendete Terminologie nur dem Zweck dient, bestimmte Ausführungsformen zu beschreiben, und in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken soll, der nur durch die beigefügten Patentansprüche eingeschränkt ist. Sofern nichts anderes angegeben ist, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die Bedeutung, die dem Fachmann normalerweise geläufig ist.
  • Vorzugsweise entsprechen die hier verwendeten Begriffe der Definition in „A Multilangual Glossary of Biotechnological Terms (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H. G. W., Nagel, B., und Kölbl, H., Hrsg., (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010-Basel, Schweiz.
  • In der ganzen vorliegenden Beschreibung und den darauf folgenden Patentansprüchen sind, sofern aus dem Zusammenhang nichts anderes hervorgeht, das Wort „umfassen" und Formen wie „umfasst" und „umfassend" so zu verstehen, dass es/sie eine angegebene ganze Zahl oder einen Schritt oder eine Gruppe von ganzen Zahlen oder Schritten einschließt, wobei dies jedoch nicht andere ganze Zahlen oder Schritte oder Gruppen von ganzen Zahlen oder Schritten ausschließt.
  • Mehrere Dokumente sind im ganzen Text der vorliegenden Beschreibung zitiert.
  • Es ist anzumerken, dass in der Verwendung hier und in den beigefügten Patentansprüchen die Singularformen „ein", „eine", „eines" und „der", „die", „das" Pluralverweise einschließen, sofern aus dem Zusammenhang nichts anderes hervorgeht. Somit schließt der Bezug auf „ein Reagens" eines oder mehrere solcher verschiedener Reagenzien ein, und der Bezug auf „das Verfahren" schließt den Bezug auf äquivalente Schritte und Verfahren ein, die dem Fachmann bekannt sind und die modifiziert oder anstelle der hier beschriebenen Verfahren eingesetzt werden können.
  • Wenn hierin verwendet, meint der Begriff „Nucleinsäuresequenz" die Sequenz von Basen, umfassend Purin- und Pyrimidinbasen, die in Nucleinsäuremolekülen enthalten sind, wobei diese Basen die Primärstruktur eines Nucleinsäuremoleküls darstellen. Nucleinsäuresequenzen schließen DNA, cDNA, genomische DNA, RNA, synthetische Formen und gemischte Polymere, sowohl Sense- als auch Antisensestränge, ein und können nicht-natürliche oder derivatisierte Nucleotidbasen enthalten, wie für den Fachmann selbstverständlich sein wird.
  • In der Verwendung hier bedeutet der Begriff „Polypeptid" ein Peptid, ein Protein oder ein Polypeptid, das Aminosäureketten einer bestimmten Länge umfasst, wobei die Aminosäurereste durch kovalente Peptidbindungen verbunden sind. Jedoch sind hierin auch Peptidomimetika solcher Proteine/Polypeptide, in denen (eine) Aminosäure(n) und/oder Peptidbindung(en) durch funktionelle Analoga ersetzt wurden, und außerdem noch andere als die 20 Gen-codierten Aminosäuren wie Selencystein beschrieben. Peptide, Oligopeptide und Proteine können Polypeptide genannt werden. Die Begriffe Polypeptid und Protein werden hier häufig austauschbar verwendet. Der Begriff Polypeptid bezieht sich auch auf Modifikationen des Polypeptids, z.B. Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung und dergleichen und schließt diese nicht aus. Solche Modifikationen sind in der Grundlagen-Fachliteratur und in ausführlicheren Abhandlungen sowie in einer umfangreichen wissenschaftlichen Literatur gut beschrieben.
  • Der hierin verwendete Begriff „Position" bedeutet die Position von entweder einer Aminosäure innerhalb einer hier dargestellten Aminosäuresequenz oder die Position eines Nucleotids innerhalb einer hier dargestellten Nucleinsäuresequenz.
  • Der Begriff „ATP-abhängiger Ionenkanal P2X7R" bezeichnet gemäß der vorliegenden Erfindung ein Polypeptid, das als ein Mitglied der Familie der ionotropen P2X-Rezeptoren klassifiziert werden kann. Diese sind auch als purinerge Rezeptoren bekannt. P2X-Rezeptoren sind Ligand-abhängige Ionenkanäle. Der Ligand für diese Rezeptoren kann ATP und/oder ein anderes natürliches Nucleotid wie ADP, UTP und UDP oder ein synthetisches Nucleotid wie 2-Methylthio-ATP sein. Die Kriterien für die Klassifizierung sind: (1) eine Sequenzhomologie, die innerhalb der ganzen Familie oder verschiedener Arten höher als 39 % ist; (2) ein Signalübertragungs-Mechanismus, der eine Ionen-Leitfähigkeit einschließt (Khakh et al., Pharmacol. Rev. 253 (2001), 107–118). Demgemäß kann der Begriff „ATP-abhängiger Ionenkanal P2X7R" auch durch die Begriffe „ionotroper Rezeptor" oder „purinerger Rezeptor" ersetzt werden. Vorzugsweise bedeutet der Begriff „ATP-abhängiger Ionenkanal P2X7R" ein Polypeptid, das aufgrund eines oder mehrerer Struktur- und/oder Funktionseigenschaften, vorzugsweise wie vorstehend beschrieben, als ein ATP-abhängiger Ionenkanal P2X7R klassifiziert werden kann. Struktureigenschaften beziehen sich auf bestimmte Strukturmerkmale, aufgrund derer ein Polypeptid als ein P2X7R-Protein klassifiziert werden kann. Ein solches Merkmal ist die Aminosäuresequenz. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird ein Polypeptid als ein ATP-abhängiger Ionenkanal P2X7R klassifiziert, wenn es innerhalb seiner ganzen Länge ein bestimmtes Ausmaß an Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Aminosäuresequenz des menschlichen P2X7R-Proteins zeigt. Dieses Ausmaß an Sequenzidentität beträgt mindestens 40 %, stärker bevorzugt mindestens 50 %, noch stärker bevorzugt mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 % oder mindestens 95 %. Es ist besonders bevorzugt, dass das Ausmaß an Sequenzidentität mindestens 65 % beträgt.
  • Struktureigenschaften von P2X7R-Proteinen sind außerdem zwei hydrophobe Membran-überspannende Domänen und eine extrazelluläre Schleife, die unter Verwendung des Programms TMPRED (Hofmann, Biol. Chem. 347 (1993), 166) oder TMHMM (Krogh, J. Mol. Bio. 305 (2001), 567–580) analysiert werden konnten. Außerdem kann P2X7R als ein einzelnes Polypeptid, als Dimer, als Tetramer oder dergleichen vorliegen.
  • Somit wird ein Protein im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorzugsweise als ein P2X7R-Protein klassifiziert, wenn es mindestens eine der vorstehend erwähnten Struktureigenschaften aufweist. Funktionseigenschaften beziehen sich auf Eigenschaften, die mit der biologischen Aktivität des P2X7R-Proteins zusammenhängen. Insbesondere ist P2X7R ein ATP-abhängiger Ionenkanal, der Calcium- und Natriumionen aus der extrazellulären Lösung zur intrazellulären Lösung passieren lässt und der Kaliumionen aus der intrazellulären zur extrazellulären Lösung passieren lässt. Außerdem bildet der ATP-abhängige Ionenkanal P2X7R von Natur aus eine homooligomere Form. Die Eigenschaften von P2X7R-Rezeptorproteinen können, wie nachstehend erwähnt, bestimmt werden. Der Begriff „ATP-abhängige Ionenkanäle P2X7R" umfasst funktionelle und nicht-funktionelle Formen der ATP-abhängigen Ionenkanäle P2X7R. Ein funktioneller ATP-abhängiger Ionenkanal P2X7R ist so zu verstehen, dass es sich um ein P2X7R-Protein handelt, das mindestens eine der vorstehend erwähnten funktionellen Eigenschaften besitzt, die durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gemessen werden können. Ein nicht-funktioneller ATP-abhängiger Ionenkanal P2X7R ist ein Protein, das aufgrund von Struktureigenschaften, wie vorstehend beschrieben, als ein P2X7R-Protein klassifiziert werden kann, das jedoch mindestens eine, vorzugsweise alle Funktionseigenschaften eines P2X7R-Proteins, wie vorstehend beschrieben, verloren hat. Eine Nicht-Funktionalität des P2X7R-Proteins kann z.B. bestimmt werden, indem gemessen wird, ob Calcium- und Natriumionen in Zellen einströmen können oder ob Kaliumionen aus Zellen ausströmen können. Auf diese Wiese ist es möglich, das Auftreten einer Mutation im ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R zu bestimmen, indem entweder der Calcium- und/oder Natriumeinstrom in oder -Ausstrom aus Zellen gemessen wird. Zellen, bei denen eine Mutation im P2X7R-Gen vorliegt, zeigen im Vergleich zu Zellen, die ein Wildtyp-P2X7R-Protein enthalten, einen veränderten Ioneneinstrom und/oder -Ausstrom.
  • Außerdem gibt es verschiedene Verfahren, mit denen festgestellt werden kann, ob das P2X7R funktionell oder nicht-funktionell, z.B. verändert, ist. Ein solches Verfahren besteht darin, die Rate des ATP-induzierten Einbaus von Ethidium in Zellen, z.B. Zellen, die aus einem Individuum isoliert wurden, zu messen. Ethidium wird in die Zellen über P2X7R-Poren dann eingebaut, wenn die Bildung einer Pore durch ATP aktiviert wird. Zellen werden also mit oder ohne ATP in Gegenwart von Ethidium inkubiert, anschließend werden sie anhand von Durchflusscytometrie analysiert. Die Fluoreszenz von Ethidium wird in Gegenwart oder in Abwesenheit von ATP gemessen und verglichen. Wenn das P2X7R eine niedrigere Aktivität aufweist, wird die durch ATP induzierte Ethidium-Fluoreszenz niedriger sein als in Kontrollzellen. Ein solches Verfahren wurde verwendet, um eine Aktivität von P2X7R in isolierten B-Lymphocyten und T-Lymphocyten aus Leukämie-Patienten nachzuweisen (Wiley et al., Lancet 359 (2002), 1114–1119). Kurz gesagt werden isolierte Zellen in 1 ml Hepes-gepuffertem Kaliumchlorid bei 37°C unter fortgesetztem Rühren inkubiert. Danach wird Ethidium in einer Konzentration von 25 Mol/l zugegeben, worauf 40 Sekunden später die Zugabe von 10 μl einer 100 mMol/l ATP-Stammlösung folgt. Die Zellen werden sodann mittels Durchflusszytometrie bei 1.000 Ereignissen/Sek. unter Verwendung eines Durchflusczytometers „Coulter Elite Flow Cytometer" (Coulter, Hialeah, FL) mit einem Argonlaser, Anregung bei 488 nm, analysiert. Die Fluoreszenzemission wurde unter Verwendung eines 590-nm-Langpass-Filters aufgenommen. Die lineare mittlere Kanalfluoreszenzintensität wurde für jede eingegrenzte Subpopulation in aufeinander folgenden Intervallen von 5 Sek. unter Verwendung der Win-MDI Software (Joseph Trotter, Version 2.7) analysiert und gegen die Zeit aufgetragen.
  • Ein anderes Verfahren zum Bestimmen der Aktivität von P2X7R besteht darin, den Einstrom von Calcium in isolierte Zellen zu messen, die mit fluoreszierenden Farbstoffen inkubiert werden, welche nur bei Bindung an Calcium emittieren. Die Zellen müssen mit dem Farbstoff beladen werden, und danach muss der Einstrom von Calcium stimuliert werden. Beispiele solcher Farbstoffe schließen Fura-2, Calcium-Green, Calcium-Orange, Calcium-Crimson ein (alle von Molecular Probes zu beziehen). Verfahren zum Messen des Calciumtransports sind auf dem Fachgebiet bekannt; vgl. z.B. Takahashi et al., Physiol. Rev. 79 (1999), 1089–1125. Weiterhin erzeugt der Einstrom von Calcium in die Zellen Änderungen im elektrischen Membranpotential. Diese Änderungen können durch Elektrophysiologie (Spannungsklemme) oder unter Verwendung von Farbstoffen, die gegenüber Spannungsänderungen empfindlich sind, gemessen werden. Auch solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z.B. González et al., DDT 4 (1999), 431–439; González und Tsien, Chemistry & Biology 4 (1997), 269–277; Ganzález und Tsien, Biophysical Journal 69 (1995), 1272–1280.
  • Ein weiteres Verfahren besteht darin, die Aufnahme von 133Ba21 zu messen. Ba21 ist ein guter Austauschstoff für Ca21, und sobald es sich innerhalb der Zelle befindet, wird es durch Transport-ATPasen weder gepumpt noch maskiert. Die Ba21-Aufnahme kann über 60 Sek. unter Verwendung von 133BaCl2 (Endkonzentration 0,2 mM) gemessen werden. Zum Zeitpunkt 0 wird eine vorgewärmte Stammlösung von 133Ba21 (0,4 mM und 1 μCi/ml) in gleichen Volumina zu vorgewärmten isolierten Zellen in 150 mM KCl mit HEPES (pH 7,4) bei 37°C zugegeben. ATP (1 mM) wird entweder zehn Minuten vor oder gleichzeitig mit dem 133Ba21-Isotop zugegeben. Aliquots von 0,8 ml werden zu Zeitpunkten zwischen 0 und 60 Sek. genommen und unmittelbar mit 0,2 ml eiskaltem 50 mM MgCl2 (in KCl-HEPES-Medium) gemischt, das vorher über 250 μl eines Ölgemisches (Di-n-butylphthalat und Diisooctylphthalat, 7:3 (Vol./Vol.)) geschichtet worden war, anschließend folgt eine Zentrifugation bei 8.000 g für 30 Sek. Die Überstände und das Öl werden abgesaugt, und die Zellpellets werden in dem automatischen Gammazähler Wallac Wizard 3 oder in einem beliebigen anderen geeigneten Gammazähler gezählt.
  • Es wurde festgestellt, dass verschiedene Arten von Mutationen in dem P2X7R-Gen mit dem Auftreten von affektiven Störungen zusammenhängen. Der erste Typ von Mutationen sind Mutationen in der 5'UTR-Region. Beispiele solcher Mutationen sind einzelne Nucleotidaustausche an Positionen, die den Positionen 362, 532, 1100, 1122, 1171 oder 1702 der wie in SEQ ID NO: 1 dargestellten genomischen Sequenz des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R vom Wildtyp entsprechen.
  • Die Position der hier angegebenen Nucleotidsequenzen bezieht sich auf die in SEQ ID NO: 1 dargestellte Sequenz. Diese Sequenz stellt die Nucleinsäuresequenz des P2X7R-Gens dar, welches den ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R codiert. Dem Fachmann ist es möglich, die Position in der genomischen Sequenz zu bestimmen, die einer Position in der SEQ ID NO: 1 entspricht, indem er ein Alignment der Sequenzen durchführt. Außerdem sind die exakten Positionen der Exons und Introns in SEQ ID NO: 1 nachstehend angegeben. Ferner ist der Fachmann in der Lage, Exons und Introns des P2X7R-Gens zu identifizieren, indem er SEQ ID NO: 1 mit SEQ ID NO: 2, welche die cDNA-Sequenz des P2X7R-Gens zeigt, vergleicht.
  • Bevorzugt ist an Position 362 in der 5'UTR-Region der in SEQ ID NO: 1 dargestellten genomischen Sequenz des P2X7R-Gens ein Thymin (T) durch ein anderes Nucleotid, vorzugsweise eine Purinbase, ersetzt. Stärker bevorzugt ist das Thymidin an dieser Position durch eine Pyrimidinbase ersetzt. Besonders bevorzugt ist es, wenn das Thymin durch ein Cytosin (C) ersetzt ist.
  • An Position 532 in der 5'UTR-Region der in SEQ ID NO: 1 dargestellten genomischen Sequenz des P2X7R-Gens ist ein Thymin (T) vorzugsweise durch ein anderes Nucleotid, vorzugsweise eine Pyrimidinbase, ersetzt. Stärker bevorzugt ist das Thymin an dieser Position durch eine Purinbase ersetzt. Besonders bevorzugt ist es, wenn das Thymidin durch ein Guanin (G) ersetzt ist.
  • Die Adeninreste (A) an den Positionen 1100 bzw. 1122 in der 5'UTR-Region der genomischen Sequenz des P2X7R-Gens sind vorzugsweise durch eine Pyrimidinbase ersetzt. Stärker bevorzugt ist das Adenin durch eine Purinbase ersetzt, und besonders bevorzugt ist es, wenn das Adenin durch ein Guanin (G) ersetzt ist.
  • An der Position 1171 der 5'UTR-Region der in SEQ ID NO: 1 dargestellten genomischen Sequenz des P2X7R-Gens ist ein Cytidin (C) durch ein anderes Nucleotid, vorzugsweise durch eine Pyrimidinbase, ersetzt. Stärker bevorzugt ist das Cytidin durch eine Purinbase ersetzt, und noch stärker bevorzugt ist das Cytidin durch ein Guanin (G) ersetzt.
  • Das Guanin an Position 1702 in der 5'UTR-Region der in SEQ ID NO: 1 dargestellten genomischen Sequenz des P2X7R-Gens ist durch ein anderes Nucleotid ersetzt, vorzugsweise durch eine Pyrimidinbase. Stärker bevorzugt ist das Guanin durch eine Purinbase ersetzt, und besonders bevorzugt ist es, wenn es durch ein Adenin (A) ersetzt ist.
  • Bei einem zweiten Typ von Mutationen, die im P2X7R-Gen gefunden werden, handelt es sich um Mutationen in Exons, die zu Aminosäuresubstitutionen in der entsprechenden Aminosäuresequenz führen. Dabei handelt es sich um die Mutationen, die unter Punkt (b) vorstehend angegeben sind. In diesem Zusammenhang hat der Begriff „ein Aminosäurerest, wie in der Spalte „Aminosäurerest" von Tabelle A angegeben, welcher der Position X des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R vom Wildtyp, wie in Spalte „Position im Wildtyp" angegeben, entspricht", die folgende Bedeutung: Der fragliche Aminosäurerest würde an Position X in der Sequenz von SEQ ID NO: 3 oder 4 liegen, wenn die Sequenz, in welcher der Aminosäurerest vorkommt, mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 3 oder 4 verglichen oder anelliert wird. Die in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellte Aminosäuresequenz ist die Aminosäuresequenz des menschlichen P2X7R-Gens und wird hierin als eine Referenzsequenz verwendet.
  • Um zu bestimmen, ob ein Aminosäurerest oder Nucleotidrest in einer bestimmten P2X7R-Sequenz einer bestimmten Position in der Aminosäuresequenz oder Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 3 oder 4 entspricht, kann der Fachmann Mittel und Verfahren einsetzen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z.B. Alignments, die entweder manuell oder unter Verwendung von Computerprogrammen durchgeführt werden, die z.B. nachstehend im Zusammenhang mit der Definition des Begriffs „Hybridisierung" und Ausmaß an Homologie angegeben sind.
  • Z.B. kann BLAST 2.0, das für Basic Local Alignment Search Tool steht (Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389–3402; Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290–300; Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403–410), für die Suche nach lokalen Sequenz-Alignments eingesetzt werden. BLAST erzeugt Alignments von sowohl Nucleotid- als auch Aminosäuresequenzen, um eine Sequenzähnlichkeit zu bestimmen. Aufgrund der lokalen Natur der Alignments ist BLAST besonders gut geeignet, exakte Übereinstimmungen zu bestimmen oder ähnliche Sequenzen zu identifizieren. Die grundlegende Einheit der BLAST-Algorithmus-Ausgabe ist das High-scoring Segment Pair (HSP). Ein HSP besteht aus zwei Sequenzfragmenten mit willkürlichen, jedoch gleichen Längen, deren Alignment lokal maximal ist und bei denen der Alignment-Wert den durch den Anwender festgelegten Schwellen- oder Ausschlusswert erfüllt oder übertrifft. Die BLAST-Vorgehensweise besteht darin, nach HSPs zwischen einer Abfrage-Sequenz und einer Datenbank-Sequenz zu suchen, um die statistische Signifikanz jeglicher gefundener Übereinstimmungen zu bewerten und nur diejenigen Übereinstimmungen zu registrieren, welche der durch den Anwender ausgewählten Signifikanz-Schwelle genügen. Der Parameter E setzt die statistisch signifikante Schwelle für das Registrieren von Übereinstimmungen mit der Datenbank-Sequenz fest. E wird als die obere Grenze der erwarteten Häufigkeit eines zufälligen Auftretens eines HSP (oder eines Satzes von HSPs) innerhalb des Zusammenhangs der gesamten Datenbank-Suche interpretiert. Jede Datenbank-Sequenz, deren Übereinstimmung dem Wert E genügt, wird in der Ausgabe des Programms registriert.
  • Analoge Computerverfahren unter Verwendung von BLAST (Altschul (1997), vorstehend; Altschul (1993), vorstehend; Altschul (1990), vorstehend) werden eingesetzt, um in Nucleotid-Datenbanken wie GenBank oder EMBL nach identischen oder verwandten Molekülen zu suchen. Für diese Analyse ist viel weniger Zeit erforderlich, als das bei zahlreichen Membran-basierten Hybridisierungen der Fall wäre. Außerdem kann die Empfindlichkeit der Computer-Suche modifiziert werden, so dass bestimmt werden kann, ob eine bestimmte Übereinstimmung als exakt oder ähnlich einzustufen ist. Die Grundlage der Suche ist der Produkt-Wert, der definiert ist als: % Sequenzidentität × % maximaler BLAST-Wert,/100 wobei sowohl das Ausmaß der Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen als auch die Länge der Sequenzübereinstimmung berücksichtigt werden. Z.B. wird die Übereinstimmung bei einem Produkt-Wert von 40 mit einem Fehler von 1 bis 2 % exakt sein; und bei einem Wert von 70 wird die Übereinstimmung exakt sein. Ähnliche Moleküle werden üblicherweise identifiziert, indem diejenigen ausgewählt werden, die Produkt-Werte zwischen 15 und 40 aufweisen, wobei jedoch möglicherweise auch durch niedrigere Werte verwandte Moleküle identifiziert werden.
  • Wie vorstehend erwähnt, handelt es sich bei der zweiten Gruppe von Mutationen, die im P2X7R-Gen identifiziert wurden, um Mutationen in den Exons des P2X7R-Gens, die zu Aminosäuresubstitutionen führen. In dieser Hinsicht zeigt SEQ ID NO: 2 die cDNA-Sequenz des P2X7R-Gens. Im Exon 3 an Position 117 der in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten entsprechenden Wildtyp-Aminosäuresequenz von P2X7R ist ein Argininrest (R) durch einen anderen Aminosäurerest, vorzugsweise durch einen aliphatischen, sauren oder basischen Aminosäurerest, ersetzt. Stärker bevorzugt ist er durch einen aromatischen Aminosäurerest ersetzt, der besonders bevorzugt ein Tryptophan (W) ist. Das resultierende Polypeptid ist in SEQ ID NO: 5 dargestellt.
  • In Exon 5 an Position 150 der in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Wildtyp-Aminosäuresequenz von P2X7R ist ein Glycinrest (G) durch einen anderen Aminosäurerest, vorzugsweise einen aliphatischen, aromatischen oder sauren Aminosäurerest ersetzt. Stärker bevorzugt ist er durch einen basischen Aminosäurerest und besonders bevorzugt durch ein Arginin (R) ersetzt. Das resultierende Polypeptid ist in SEQ ID NO: 6 dargestellt.
  • An Position 186 in Exon 6 der in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Wildtyp-Aminosäuresequenz von P2X7R ist ein Glutamatrest (E) durch einen anderen Aminosäurerest, vorzugsweise einen aliphatischen, aromatischen oder sauren Aminosäurerest ersetzt. Stärker bevorzugt ist das Glutamat durch einen basischen Aminosäurerest ersetzt, der besonders bevorzugt ein Lysin (K) ist. Das resultierende Polypeptid ist in SEQ ID NO: 7 dargestellt.
  • In Exon 6 der in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Wildtyp-Aminosäuresequenz von P2X7R ist an Position 191 ein Leucinrest (L) durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt. Dieser Aminosäurerest ist vorzugsweise ein aliphatischer, saurer oder basischer Aminosäurerest. Stärker bevorzugt ist dieser Aminosäurerest ein aromatischer Aminosäurerest, der besonders bevorzugt ein Prolin (P) ist. Das resultierende Polypeptid ist in SEQ ID NO: 8 dargestellt.
  • In Exon 8 der in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Wildtyp-Aminosäuresequenz von P2X7R ist an Position 270 ein Argininrest (R) durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt. Dieser Aminosäurerest ist vorzugsweise ein aromatischer, saurer oder basischer Aminosäurerest. Stärker bevorzugt ist dieser Aminosäurerest ein aliphatischer Aminosäurerest, der besonders bevorzugt ein Cystein (C) ist. Das resultierende Polypeptid ist in SEQ ID NO: 9 dargestellt.
  • An Position 568 in Exon 13 der in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Wildtyp-Aminosäuresequenz von P2X7R ist ein Isoleucinrest (I) durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt. Stärker bevorzugt ist das Isoleucin durch einen aromatischen, basischen oder sauren Aminosäurerest ersetzt. Noch stärker bevorzugt ist das Isoleucin durch einen aliphatischen Aminosäurerest ersetzt, der besonders bevorzugt ein Asparagin (N) ist. Das resultierende Polypeptid ist in SEQ ID NO: 10 dargestellt.
  • In Exon 13 an Position 578 der in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Wildtyp-Aminosäuresequenz von P2X7R ist ein Argininrest (R) durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt. Dieser Aminosäurerest ist vorzugsweise ein aromatischer, saurer oder basischer Aminosäurerest. Stärker bevorzugt ist er ein aliphatischer Aminosäurerest und besonders bevorzugt ist er ein Glutaminrest (Q). Das resultierende Polypeptid ist in SEQ ID NO: 12 dargestellt.
  • Man kann sich vorstellen, dass die vorstehend erwähnten Mutationen in den Exons des P2X7R-Gens aufgrund von Punktmutationen zustande kommen, deren Ursache z.B. in chemischen und/oder physikalischen Mitteln oder in einer Ungenauigkeit des Replikationskomplexes liegt, gefolgt von einem Versagen der Reparaturmaschinerie einer Zelle, so dass es zu einer Änderung eines einzelnen Codons kommen kann. Mögliche Typen von Punktmutationen sind Transitionen, d.h. ein Austausch einer Purin- oder Pyrimidinbase für eine andere Purin- oder Pyrimidinbase, z.B. Adenin zu Guanin oder Thymidin zu Cytosin, oder Transversionen, d.h. ein Austausch einer Purin- oder Pyrimidinbase für eine andere Pyrimidin- oder Purinbase, z.B. Adenin zu Thymidin oder Guanin zu Cytosin. Außerdem kann eine Punktmutation auch durch eine Insertion oder Deletion eines oder mehrerer Nucleotide verursacht werden.
  • Die Mutationen, die zu dem wie vorstehend und nachstehend erwähnten Austausch von Aminosäuren führen, sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben.
  • Die dritte Gruppe von Mutationen, die in dem P2X7R-Gen identifiziert wurden, liegen in den Exons 5 und 8 des in SEQ ID NO: 1 dargestellten P2X7R-Gens und sind stumme Mutationen, d.h. sie führen zu keinen Aminosäureänderungen. Insbesondere an Position 32548 in Exon 5 der in SEQ ID NO: 1 dargestellten genomischen Sequenz des P2X7R-Gens vom Wildtyp ist ein Cytidinrest durch ein anderes Nucleotid ersetzt. Dieses Nucleotid ist vorzugsweise eine Pyrimidinbase und besonders bevorzugt ein Thymin. Der Austausch des Cytidinrests an Position 32548 in Exon 5 des P2X7R-Gens durch ein anderes Nucleotid führt vorzugsweise nicht zu einem Austausch der Aminosäure Cystein durch einen anderen Aminosäurerest.
  • In Exon 8 des in SEQ ID NO: 1 dargestellten P2X7R-Gens vom Wildtyp ist an Position 37633 ein Cytidinrest durch einen anderen Nucleotidrest ersetzt. Dieser Nucleotidrest ist vorzugsweise eine Pyrimidinbase oder besonders bevorzugt Thymin. Aufgrund dieses Austausches wird die Aminosäure Aspartat (D), die durch das entsprechende Codon, in welchem an Position 37633 ein Austausch stattgefunden hat, codiert ist, vorzugsweise nicht durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt.
  • Die vorstehend erwähnten Mutationen in den Exons 5 und 8 an den Positionen 32548 bzw. 37633 des in SEQ ID NO: 1 dargestellten P2X7R-Gens vom Wildtyp sind Mutationen an der dritten Position eines Triplett-Codons, d.h. an der Wobble-Base, die zu sogenannten stummen Mutationen führen. Stumme Mutationen führen normalerweise aufgrund der Degeneration des genetischen Codes zu keiner Änderung der Aminosäure, d.h. 64 Tripletts codieren alle 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren. Jedoch führen stumme Mutationen insofern zu einer Änderung in dem Codon, welches seine entsprechenden Aminosäuren codiert, als das neu erzeugte Codon möglicherweise nicht so gut in die Codonpräferenz eines Organismus passt. So wird das neu erzeugte Codon durch das Ribosom nicht mit der gleichen Effizienz translatiert wie das „alte" Codon. Dies führt möglicherweise zu nicht ausreichenden Mengen des entsprechenden Polypeptids, wodurch ein anderer Phänotyp zustande kommen kann.
  • Bei der vierten Gruppe von Mutationen in dem P2X7R-Gen, die vorstehend in Punkt (d) beschrieben sind, handelt es sich um eine Deletion von sieben Aminosäuren, die den Positionen 488 bis 494 der wie in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten P2X7R-Aminosäuresequenz vom Wildtyp entsprechen. Somit offenbart die vorliegende Anmeldung auch Nucleinsäuresequenzen, die ein P2X7R-Protein codieren, in dem Aminosäuren deletiert sind, die den Positionen 488 bis 494 des wie in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R vom Wildtyp entsprechen. Das bedeutet, dass ein Fragment, welches die Aminosäurepositionen 488 bis 494 der wie in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten entsprechenden Wildtyp-Aminosäuresequenz umfasst, deletiert ist, wodurch ein verkürztes Polypeptid zustande kommt. Ein Beispiel eines solchen verkürzten Polypeptids ist in SEQ ID NO: 11 dargestellt. Dieser Mutationstyp, wie hier beschrieben, codiert vorzugsweise einen nicht-funktionellen ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R. Die Deletion eines Fragments, das die Aminosäuren 488 bis 494 der wie in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Wildtyp-Aminosäuresequenz umfasst, ist das Ergebnis einer Deletion in Exon 13. Dem resultierenden Protein, das in SEQ ID NO: 11 dargestellt ist, fehlen die Aminosäuren 488 bis 494 der entsprechenden, wie in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Wildtyp-Aminosäuresequenz, so dass die Aminosäureposition 494 des in SEQ ID NO: 11 dargestellten deletierten Polypeptids der Aminosäureposition 502 der in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Wildtyp-Aminosäuresequenz entspricht. Vorzugsweise codiert die hierin beschriebene Nucleinsäuresequenz ein P2X7R-Polypeptid, in dem exakt die Aminosäuren, die den Positionen 488 bis 494 von SEQ ID NO: 3 oder 4 entsprechen, deletiert sind. Jedoch sind auch Mutanten enthalten, in denen entweder mehr oder weniger Aminosäuren innerhalb der in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten Aminosäuresequenz von P2X7R aufgrund eines atypischen Spleißens oder einer Deletion von Nucleotiden des P2X7R-codierenden Nucleinsäuremoleküls oder aufgrund falscher posttranslationaler Prozesse deletiert sein können, so lange der ATP-abhängige Ionenkanal P2X7R nicht-funktionell ist. Z.B. ist es auch möglich, dass weitere Aminosäuren, die vor der Aminosäureposition 488 liegen, oder Aminosäuren, die auf die Aminosäureposition 494 folgen, deletiert sind oder dass weniger Aminosäuren deletiert sind.
  • Vorzugsweise sind weiterhin mindestens ein, stärker bevorzugt mindestens zwei, noch stärker bevorzugt mindestens drei und am stärksten bevorzugt mindestens fünf Aminosäurereste stromaufwärts der Position, die dem Aminosäurerest 488 entspricht, und/oder stromabwärts der Position, die dem Aminosäurerest 494 von SEQ ID NO: 3 oder 4 entspricht, deletiert.
  • Jedoch ist es bevorzugt, dass weiterhin nicht mehr als 20, vorzugsweise nicht mehr als 15, noch stärker bevorzugt nicht mehr als 10 und am stärksten bevorzugt nicht mehr als 7 Aminosäurereste stromaufwärts der Position, die dem Aminosäurerest 488 von SEQ ID NO: 3 oder 4 entspricht, oder stromabwärts der Position, die dem Aminosäurerest 494 von SEQ ID NO: 3 oder 4 entspricht, deletiert sind.
  • Eine weitere Gruppe von Mutationen (wie im vorstehenden Punkt (e) erwähnt) liegt in den Introns 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 oder 12 der in SEQ ID NO: 1 dargestellten genomischen Sequenz von P2X7R vom Wildtyp. Diese Mutationen in diesen Introns sind Punktmutationen, wie in der vorstehenden Tabelle B und der nachstehenden Tabelle 1 dargestellt.
  • An der entsprechenden Position, wie in der Spalte „Position im Wildtyp" in Tabelle B oder in der Spalte „Polymorphismus" in Tabelle 1 angegeben, ist die Position des Nucleotidrests in dem entsprechenden Intron angegeben, der durch einen anderen Nucleotidrest ersetzt ist. Demgemäß bedeutet der Begriff „ein Nucleotid, wie in Spalte „Intron" von Tabelle B angegeben, das der Position, wie in Spalte „Ersetztes Nucleotid" von Tabelle B angegeben, entspricht, entsprechend der Position, wie in Spalte „Position im Wildtyp" von Tabelle B angegeben, ist durch ein anderes Nucleotid ersetzt", dass ein Nucleotidrest in einer P2X7R-codierenden Sequenz an Position Y in SEQ ID NO: 1 stehen würde, wenn die P2X7R-Sequenz mit der Sequenz von SEQ ID NO: 1 verglichen oder daran anelliert wird.
  • Wenn das Nucleotid an der entsprechenden Position eine Purinbase wie Adenin oder Guanin ist, ist es bevorzugt, dass es aufgrund einer Transition durch eine andere Purinbase ersetzt ist. Z.B. ist ein Adenin durch ein Guanin ersetzt, oder ein Guanin ist durch ein Adenin ersetzt. Wenn das Nucleotid an der entsprechenden Position eine Pyrimidinbase ist, ist es bevorzugt, dass es aufgrund einer Transition durch eine andere Pyrimidinbase ersetzt ist. Z.B. ist ein Thymin durch ein Cytidin ersetzt, und ein Cytidin ist durch ein Thymin ersetzt.
  • Außerdem ist es bevorzugt, dass aufgrund einer Transversion eine Purinbase durch eine Pyrimidinbase und umgekehrt ersetzt ist. Z.B. ist ein Adenin durch ein Thymin und ein Guanin durch ein Cytidin ersetzt. Besonders bevorzugt ist es, wenn das Nucleotid in den Introns 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11 oder 12 des in SEQ ID NO: 1 dargestellten P2X7R-Gens durch das Nucleotid, wie in der Spalte „Polymorphismus" der nachstehenden Tabelle 1 angegeben, ersetzt ist.
  • Eine letzte Gruppe von Mutationen, die identifiziert wurden, bezieht sich auf Mutationen, die in der 3'TR-Region des in SEQ ID NO: 1 dargestellten P2X7R-Gens vom Wildtyp liegen. Die Mutationen wurden an den Positionen 54925, 55169, 55170, 55171 bzw. 55917 des in SEQ ID NO: dargestellten P2X7R-Gens vom Wildtyp gefunden.
  • An Position 54925 wurde gefunden, dass ein Guaninrest durch ein anderes Nucleotid ersetzt ist. Vorzugsweise ist der Guaninrest durch eine Pyrimidinbase, stärker bevorzugt durch eine Purinbase und besonders bevorzugt durch ein Adenin ersetzt.
  • An Position 55169 ist ein Cytidinrest durch ein anderes Nucleotid, vorzugsweise durch eine Pyrimidinbase ersetzt. Stärker bevorzugt ist er durch eine Purinbase ersetzt, und besonders bevorzugt ist er durch ein Adenin ersetzt.
  • An den Positionen 55170 und 55171 ist ein Adeninrest durch einen anderen Nucleotidrest, vorzugsweise durch eine Purinbase ersetzt. Stärker bevorzugt ist der Adeninrest durch eine Pyrimidinbase ersetzt, und besonders bevorzugt ist der Adeninrest durch einen Cytidinrest ersetzt. Außerdem wurde gefunden, dass an Position 55917 ein Cytidinrest durch ein anderes Nucleotid ersetzt ist. Vorzugsweise ist der Nucleotidrest eine Purinbase, stärker bevorzugt eine Pyrimidinbase und besonders bevorzugt ein Thymin.
  • Wie aus dem Vorstehenden ersichtlich ist, liegen nicht alle identifizierten Mutationen in Exons oder führen zu einer Änderung in der Aminosäuresequenz. Einige der Mutationen liegen in der 5'UTR-Region, in der 3'UTR-Region oder in Introns.
  • Es ist bekannt, dass Polymorphismen in Promotor- und Enhancer-Regionen die Funktion eines Gens beeinträchtigen können, indem sie die Transkription modulieren, insbesondere wenn sie an Erkennungsstellen für DNA-bindende Proteine liegen (Fishman et al., J. Clin. Invest. 102 (1998), 1369–1376). Der hierin verwendete Begriff „Polymorphismus" bedeutet eine einzelne Nucleotidsubstitution, Nucleotidinsertion und Nucleotiddeletion, die im Fall einer Insertion und Deletion eine Insertion oder Deletion von einem oder mehreren Nucleotiden an einer Position eines Gens und entsprechende Änderungen in exprimierten Proteinen umfassen. Polymorphismen in der 5'-untranslatierten Region (5'UTR) von Genen können die Effizienz beeinträchtigen, mit der Proteine translatiert werden. Ein repräsentatives Beispiel hiervon liegt im c-myc-Gen, wo ein C-G-SNP, der eine innere Ribosomen-Eintrittstelle erzeugt, mit einer gesteigerten Effizienz der c-myc-Translation und einem Myelom assoziiert ist (Chappell et al., Oncogene 19 (2000), 4437–4440). Polymorphismen in der 3'UTR können die Genfunktion beeinträchtigen, indem sie die Sekundärstruktur von RNA oder die Effizienz der Translation verändern oder indem sie Motive in der RNA beeinflussen, die an Proteine binden, welche den RNA-Abbau regulieren. Polymorphismen innerhalb von Introns können die Funktion eines Gens beeinträchtigen, indem sie das RNA-Spleißen beeinträchtigen, wodurch es zu abweichenden Polypeptiden kommt. Eine andere Art und Weise, wie Intron-Polymorphismen die Funktion eines Gens beeinträchtigen können, besteht darin, dass sie regulatorische Motive innerhalb von Introns beeinträchtigen. Beispiele sind der Polymorphismus der SP1-Bindungsstelle innerhalb von Intron 1 des Gens COLIA1 (Mann et al., J. Clin. Invest. 107 (2001), 899–907) und wiederholte Polymorphismen innerhalb des Gens IL-1Ra (Keen et al., Bone 23 (1998), 367–371). Weitere Beispiele des Zusammenhangs von Intron-SNPs und Genfunktion sind in Caceres und Kornblihtt, Trends Genet. 4 (2002), 186–193, beschrieben. Beispiel 4 auf Seite 52, Zeile 30, bis Seite 53, Zeile 51, des Texts beschreibt mögliche alternative Spleiß-Ereignisse und die Produktion eines abweichenden Proteins, die mit drei in der Anmeldung beschriebenen SNPs assoziiert sind.
  • Die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuresequenzen können mindestens 56.580 Nucleotide, vorzugsweise mindestens 10.000 Nucleotide, mindestens 5.000 Nucleotide, mindestens 1.000 Nucleotide, mindestens 500 Nucleotide, mindestens 100 Nucleotide umfassen. Stärker bevorzugt umfassen die Nucleinsäuresequenzen mindestens 50 Nucleotide, und besonders bevorzugt umfassen sie mindestens 20 oder 21 Nucleotide, welche die vorstehend beschriebenen Mutationen oder Deletionen umfassen. Am stärksten bevorzugt hat eine solche Nucleinsäuresequenz eine wie in einer der SEQ ID NO: 13 bis 51 dargestellte Sequenz.
  • Die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuresequenzen, die Mutationen in Exons umfassen, welche zu einem Ersetzten der entsprechenden Aminosäuresequenz des in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten P2X7R-Polypeptids vom Wildtyp führen, codieren Polypeptide, die in den SEQ ID NO: 5 bis 10 und 12 dargestellt sind.
  • Außerdem sind vorstehend die Nucleinsäuresequenzen die hierin beschrieben sind und die eine Deletion umfassen, die im Vergleich zu dem in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten vollständigen Polypeptid des Wildtyp-P2X7R-Polypeptids zu einem verkürzten Polypeptid führt, in SEQ ID NO: 11 dargestellt.
  • Hierin offenbart werden auch Nucleinsäuremoleküle, die mit einem der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle hybridisieren und die eine Mutation, wie vorstehend beschrieben, aufweisen.
  • Der hierin verwendete Begriff „hybridisiert" kann sich auf Hybridisierungen unter stringenten oder nicht-stringenten Bedingungen beziehen. Wenn nicht weiter spezifiziert, sind die Bedingungen vorzugsweise nicht-stringent. Die Hybridisierungsbedingungen können gemäß herkömmlichen Protokollen festgesetzt werden, die z.B. in: Sambrook, Russell, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., (2001); Ausubel, „Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., (1989), oder Higgins und Hames (Hrsg.), „Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", IRL Press Oxford, Washington DC, (1985), beschrieben sind. Die Auswahl der Bedingungen ist dem Fachmann geläufig und kann gemäß auf dem Fachgebiet beschriebenen Protokollen bestimmt werden. So sind, wenn nur spezifisch hybridisierende Sequenzen nachgewiesen werden sollen, üblicherweise stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen erforderlich, wie 0,1 × SSC, 0,1 % SDS bei 65°C. Nicht-stringente Hybridisierungsbedingungen für den Nachweis von homologen oder nicht exakt komplementären Sequenzen können auf 6 × SSC, 1 % SDS bei 65°C eingestellt werden. Wie bekannt ist, bestehen weitere Parameter der Hybridisierungsbedingungen aus der Länge der Sonde und der Zusammensetzung der Nucleinsäure, die bestimmt werden soll. Es ist anzumerken, dass es durch Zugabe und/oder Substitution von Alternativ-Blockierungsreagenzien, die verwendet werden, um in Hybridisierungsexperimenten den Hintergrund zu unterdrücken, zu Variationen in den vorstehenden Bedingungen kommen kann. Typische Blockierungsreagenzien schließen Denhardt-Reagens, BLOTTO, Heparin, denaturierte Lachssperma-DNA und kommerziell verfügbare geschützte Formulierungen ein. Durch die Zugabe spezifischer Blockierungsreagenzien kann aufgrund von Problemen mit der Kompatibilität auch noch eine Modifikation der vorstehend beschriebenen Hybridisierungsbedingungen erforderlich werden. Hybridisierende Nucleinsäuremoleküle umfassen auch Fragmente der vorstehend beschriebenen Moleküle. Solche Fragmente können Nucleinsäuresequenzen darstellen, welche einen nicht-funktionellen ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R oder ein nicht-funktionelles Fragment davon codieren und die eine Länge von mindestens 12 Nucleotiden, vorzugsweise mindestens 15, stärker bevorzugt mindestens 18, stärker bevorzugt von mindestens 21 Nucleotiden, stärker bevorzugt von mindestens 30 Nucleotiden, noch stärker bevorzugt von mindestens 40 Nucleotiden und am stärksten bevorzugt von mindestens 60 Nucleotiden haben. Weiterhin schließen Nucleinsäuremoleküle, die mit einem beliebigen der vorstehend erwähnten Nucleinsäuremoleküle hybridisieren, auch komplementäre Fragmente, Derivate und allele Varianten dieser Moleküle ein. Außerdem bezieht sich ein Hybridisierungskomplex auf einen Komplex zwischen zwei Nucleinsäuresequenzen aufgrund der Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen komplementären G- und C-Basen und zwischen komplementären A- und T-Basen; diese Wasserstoffbindungen können durch Basen-Stapelungs-Interaktionen noch weiter stabilisiert werden. Die zwei komplementären Nucleinsäuresequenzen sind über Wasserstoffbindungen in einer antiparallelen Konfiguration gebunden. Ein Hybridisierungskomplex kann in Lösung (z.B. Cot- oder Rot-Analyse) oder zwischen einer in Lösung vorliegenden Nucleinsäuresequenz und einer anderen Nucleinsäuresequenz, die an einem festen Träger immobilisiert ist (z.B. Membranen, Filter, Chips, Stifte oder Glasobjektträger, an die z.B. Zellen fixiert wurden), gebildet werden. Die Begriffe „komplementär" oder „Komplementarität" beziehen sich auf die natürliche Bindung von Polynucleotiden unter permissiven Salz- und Temperaturbedingungen durch Basenpaarung. Z.B. bindet die Sequenz „A-G-T" an die komplementäre Sequenz „T-C-A". Eine Komplementarität zwischen zwei einzelsträngigen Molekülen kann „partiell" sein, wobei nur einige der Nucleinsäuren binden, oder sie kann vollständig sein, wenn zwischen den einzelsträngigen Molekülen eine totale Komplementarität vorliegt. Das Ausmaß der Komplementarität zwischen Nucleinsäuresträngen hat signifikante Effekte auf die Wirksamkeit und Stärke der Hybridisierung zwischen den Nucleinsäuresträngen. Dies ist in Amplifikationsreaktionen besonders wichtig, die von der Bindung zwischen Nucleinsäuresträngen abhängen.
  • Der Begriff „hybridisierende Sequenzen" bezieht sich vorzugsweise auf Sequenzen, die eine Sequenzidentität von mindestens 40 %, vorzugsweise mindestens 50 %, stärker bevorzugt mindestens 60 %, noch stärker bevorzugt mindestens 70 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, mehr besonders bevorzugt mindestens 90 %, noch mehr besonders bevorzugt mindestens 95 % und am stärksten bevorzugt mindestens 97 % mit einer Nucleinsäuresequenz, wie vorstehend beschrieben, aufweisen, die ein P2X7R-Protein codiert, das eine beschriebene Mutation zeigt. Außerdem bezieht sich der Begriff „hybridisierende Sequenzen" vorzugsweise auf Sequenzen, die ein P2X7R-Protein codieren, das eine Sequenzidentität von mindestens 40 %, vorzugsweise mindestens 50 %, stärker bevorzugt mindestens 60 %, noch stärker bevorzugt mindestens 70 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, mehr besonders bevorzugt mindestens 90 %, noch mehr besonders bevorzugt mindestens 95 % und am stärksten bevorzugt mindestens 97 % mit einer Aminosäuresequenz einer P2X7R-Mutante, wie vorstehend beschrieben, aufweist.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „identisch" oder „prozentuale Identität" im Zusammenhang mit zwei oder mehreren Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenzen auf zwei oder mehrere Sequenzen oder Subsequenzen, die gleich sind oder die einen angegebenen Prozentsatz von Aminosäureresten oder Nucleotiden aufweisen, die gleich sind (z.B. eine Identität von 60 % oder 65 %, vorzugsweise eine Identität von 70 bis 95 %, stärker bevorzugt eine Identität von mindestens 95 %), wenn sie so verglichen oder anelliert werden, dass in einem Vergleichsfenster oder, über einen bestimmten Bereich, wie gemessen unter Verwendung eines auf dem Fachgebiet bekannten Sequenzvergleichs-Algorithmus, oder durch manuelles Alignment und visuelle Inspektion eine maximale Übereinstimmung entsteht. Sequenzen, die eine Sequenzidentität von z.B. 60 % bis 95 % oder mehr aufweisen, werden als im Wesentlichen identisch angesehen. Eine solche Definition bezieht sich auch auf das Komplement einer Testsequenz. Vorzugsweise liegt die beschriebene Identität über einen Bereich vor, der eine Länge von mindestens etwa 15 bis 25 Aminosäuren oder Nucleotiden aufweist, stärker bevorzugt über einen Bereich, der eine Länge von etwa 50 bis 100 Aminosäuren oder Nucleotiden aufweist. Der Fachmann ist in der Lage, die prozentuale Identität zwischen/unter Sequenzen zu bestimmen, indem er Algorithmen einsetzt, wie diejenigen, die auf dem Computerprogramm CLUSTALW (Thompson, Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673–4680) oder FASTDB (Brutlag, Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237–245) beruhen, wie auf dem Fachgebiet bekannt.
  • Zwar berücksichtigt der Algorithmus FASTDB bei seiner Berechnung typischerweise keine inneren, nicht-übereinstimmenden Deletionen oder Additionen in Sequenzen, d.h. Lücken, dies kann jedoch manuell korrigiert werden, um eine zu hohe Schätzung der prozentualen Identität zu verhindern. Dagegen berücksichtigt CLUSTALW bei seinen Berechnungen der Identität auch Sequenz-Lücken. Außerdem sind für den Fachmann die Algorithmen BLAST und BLAST 2.0 verfügbar (Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1977), 3389–3402). Das Programm BLASTN für Nucleinsäuresequenzen verwendet als Standardparameter Wortlängen (W) von 11, eine Erwartung (E) von 10, M = 5, N = 4 und einen Vergleich beider Stränge. Für Aminosäuresequenzen verwendet das Programm BLASTP als Standardparameter Wortlängen (W) von 3 und eine Erwartung (E) von 10. Die Scoring-Matrix BLOSUM62 (Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1989), 10915) verwendet Alignments (B) von 50, Erwartung (E) von 10, M = 5, N = 4 und einen Vergleich beider Stränge.
  • Außerdem werden hierin auch Nucleinsäuremoleküle offenbart, deren Sequenz im Vergleich zu der Sequenz eines vorstehend beschriebenen hybridisierenden Moleküls degeneriert ist. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „als Folge des genetischen Codes degeneriert sein", dass aufgrund der Redundanz des genetischen Codes verschiedene Nucleotidsequenzen für die gleiche Aminosäure codieren.
  • Außerdem werden hier Nucleinsäuremoleküle offenbart, die eine oder mehrere der vorstehend beschriebenen Mutationen oder Deletionen umfassen.
  • Die hierin offenbarten Nucleinsäuremoleküle können von einem beliebigen Organismus stammen, der entsprechende ATP-abhängige P2X7R-Ionenkanäle codiert. Z.B. wurden ATP-abhängige Ionenkanäle P2X7R in verschiedenen Organismen beschrieben, z.B. in Ratte (vgl. Surprenant (1996), vorstehend), Maus (Genbank-Hinterlegungsnummer AJ 489297), Xenopus (Genbank-Hinterlegungsnummer AJ 345114), Huhn (Genbank-Hinterlegungsnummer BM 491404) oder Bos taurus (Genbank-Hinterlegungsnummer AF 083073). In einer bevorzugten Ausführungsform stammt das hierin beschriebene Nucleinsäuremolekül von einem Wirbeltier, vorzugsweise von einem Säuger, stärker bevorzugt stammt das Nucleinsäuremolekül von einem Kaninchen oder Meerschweinchen, und am stärksten bevorzugt stammt die Nucleinsäure von einer Maus, einer Ratte oder einem Menschen.
  • Das hierin offenbarte Nucleinsäuremolekül kann einen beliebigen Nucleinsäure-Typ darstellen, z.B. DNA, RNA oder PNA (Peptid-Nucleinsäure).
  • Für die hierin angeführten Zwecke ist eine Peptid-Nucleinsäure (PNA) ein DNA-Analogon vom Polyamid-Typ, wobei die monomeren Einheiten für Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin im Handel verfügbar sind (Perceptive Biosystems). Bestimmte Komponenten der DNA wie Phosphor, Phosphoroxide oder Desoxyribose-Derivate liegen in PNAs nicht vor. Wie von Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497; und Egholm et al., Nature 365 (1993), 666, beschrieben, binden PNAs spezifisch und fest an komplementäre DNA-Stränge und werden nicht durch Nucleasen abgebaut. Tatsächlich bindet PNA stärker an DNA als die DNA selbst. Dies beruht wahrscheinlich darauf, dass es keine elektrostatische Abstoßung zwischen den zwei Strängen gibt und dass das Polyamid-Grundgerüst außerdem flexibler ist. Deshalb binden PNA/DNA-Doppelstränge unter einem größeren Spektrum von Stringenzbedingungen als DNA/DNA-Doppelstränge, wodurch es leichter wird, eine Multiplex-Hybridisierung durchzuführen. Aufgrund der starken Bindung können zudem kleinere Sonden verwendet werden als bei der DNA. Außerdem ist die Wahrscheinlichkeit größer, dass einzelne Basenfehlpaarungen mit einer PNA/DNA-Hybridisierung besser bestimmt werden können, da eine einzelne Fehlpaarung in einer aus 15 Nucleotiden bestehenden PNA/DNA den Schmelzpunkt (T.sub.m) um 8–20°C erniedrigt, gegenüber 4–16°C bei einem aus 15 Nucleotiden bestehenden DNA/DNA-Doppelstrang. Weiterhin bedeutet das Fehlen von geladenen Gruppen in einer PNA, dass eine Hybridisierung bei niedrigen Ionenstärken durchgeführt werden kann, wodurch eine mögliche Störung durch Salz während der Analyse abgeschwächt wird.
  • Die DNA kann z.B. eine cDNA sein. Bevorzugt ist sie eine genomische DNA. Die RNA kann z.B. eine mRNA sein. Das Nucleinsäuremolekül kann natürlich, synthetisch oder halbsynthetisch sein, oder es kann ein Derivat wie eine Peptid-Nucleinsäure (Nielsen, Science 254 (1991), 1497–1500) oder Phosphorothioate sein. Außerdem kann das Nucleinsäuremolekül ein rekombinant erzeugtes chimäres Nucleinsäuremolekül sein, das beliebige der vorstehend erwähnten Nucleinsäuremoleküle entweder alleine oder in Kombination umfasst.
  • Das vorstehend beschriebene Nucleinsäuremolekül kann Teil eines Vektors sein. Ein solcher Vektor kann z.B. ein Plasmid, Cosmid, Virus, Bakteriophage oder ein anderer Vektor sein, der z.B. üblicherweise in der Gentechnik verwendet wird, und kann weitere Gene wie Markergene umfassen, die eine Selektion des Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen möglich machen.
  • Die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle können in verschiedene, im Handel verfügbare Vektoren eingefügt werden. Nichteinschränkende Beispiele schließen Plasmidvektoren ein, die mit Säugerzellen kompatibel sind, wie pUC, pBluescript (Stratagene), pET (Novagen), pREP (Invitrogen), pCRTopo (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), pMC1 neo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2neo, pBPV-1, pdBPVMMTneo, pRSVgpt, pRSVneo, pSV2-dhfr, pUCTag, pIZD35, pLXIN und pSIR (Clontech) und pIRES-EGFP (Clontech). Baculovirus-Vektoren wie pBlueBac, BacPacz Baculovirus Expression System (Clontech) und MaxBacTM Baculovirus Expression System, Insektenzellen und Protokolle (Invitrogen) sind im Handel verfügbar und können auch eingesetzt werden, um hohe Ausbeuten eines biologisch aktiven Proteins herzustellen (vgl. auch Miller (1993), Curr. Op. Genet. Dev. 3: 9; O'Reilly, „Baculovirus Expression Vektors: A Laboratory Manual", S. 127). Außerdem stellen prokaryontische Vektoren wie pcDNA2 und Hefevektoren wie pYes2 nicht-einschränkende Beispiele anderer Vektoren dar, die für die Verwendung hierin geeignet sind. Verfahren zum Modifizieren von Vektoren finden sich in Sambrook und Russel (2001), vorstehend. Vektoren können ein oder mehrere Replikations- und Erbgutsysteme für Clonierung oder Expression, einen oder mehrere Marker für die Selektion im Wirt, z.B. Antibiotikaresistenz, und eine oder mehrere Expressionskassetten enthalten.
  • Die codierenden Sequenzen, die im Vektor eingefügt sind, können durch Standardverfahren synthetisiert, aus natürlichen Quellen isoliert oder als Hybride hergestellt werden. Eine Ligierung der codierenden Sequenzen an Transkriptions-Regulations-Elemente (z.B. Promotoren, Enhancer und/oder Isolatorsequenzen) und/oder an andere Aminosäure-codierende Sequenzen kann unter Verwendung eingeführter Verfahren erfolgen.
  • Weiterhin können die Vektoren zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Nucleinsäuresequenzen auch Expressionskontrollelemente umfassen, die eine richtige Expression der codierenden Regionen in geeigneten Wirten möglich machen. Solche Kontrollelemente sind dem Fachmann bekannt und können einen Promotor, ein Translations-Initiations-Codon, eine Translations- und Insertionsstelle oder innere Ribosomen-Eintrittstellen (IRES) (Owens, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (2001), 1471–1476) zum Einführen einer Insertion in den Vektor umfassen. Vorzugsweise ist die Nucleinsäure mit den Expressionskontrollsequenzen funktionell verbunden, wodurch eine Expression in eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen ermöglicht wird. Besonders bevorzugt sind in diesem Zusammenhang Kontrollsequenzen, die eine korrekte Expression in Nervenzellen und/oder Zellen, die von Nervengewebe stammen, möglich machen.
  • Kontrollelemente, die eine Expression in eukaryontischen und prokaryontischen Zellen sicherstellen, sind dem Fachmann bekannt. Wie vorstehend erwähnt, umfassen sie normalerweise regulatorische Sequenzen, welche die Initiation der Transkription sicherstellen, und gegebenenfalls Poly-A-Signale, welche die Termination der Transkription und Stabilisierung des Transkripts sicherstellen. Zusätzliche regulatorische Elemente können Transkriptions- und Translations-Enhancer und/oder natürlich-assoziierte oder heterologe Promotorregionen einschließen. Mögliche regulatorische Elemente, die eine Expression in z.B. Säugerwirtszellen möglich machen, umfassen den CMV-HSV-Thymidinkinase-Promotor, SV40-, RSV-Promotor (Rous-Sarkom-Virus), den Promotor des menschlichen Elongations-Faktors 1α, CMV-Enhancer, CaM-Kinase-Promotor oder SV40-Enhancer.
  • Für die Expression z.B. in Nervengewebe und/oder Zellen, die hiervon stammen, sind auf dem Fachgebiet mehrere regulatorische Sequenzen bekannt, wie die minimale Promotorsequenz des menschlichen Neurofilaments L (Charron, J. Biol. Chem. 270 (1995), 25739–25745). Für die Expression in prokaryontischen Zellen wurden zahlreiche Promotoren beschrieben, einschließlich z.B. des tac-lac-Promotors, des lacUV5- oder des trp-Promotors. Solche regulatorischen Elemente können neben Elementen, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind, auch Transkriptions-Terminationssignale wie die SV40-Poly-A-Stelle oder die tk-Poly-A-Stelle stromabwärts des Polynucleotids umfassen. In diesem Zusammenhang sind auf dem Fachgebiet geeignete Expressionsvektoren bekannt, wie der Okayama-Berg-cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen, wie u.a. in den angefügten Beispielen verwendet), pSPORTI (GIBCO BRL) oder pGEMHE (Promega) oder prokaryontische Expressionsvektoren wie Lambda gt11.
  • Ein Expressionsvektor ist mindestens in der Lage, die Replikation, und vorzugsweise die Expression, der Nucleinsäuren und des Proteins, wie vorstehend beschrieben, zu steuern. Geeignete Replikationsursprünge schließen z.B. die Col E1-, SV-40-Virus- und M13-Replikationsursprünge ein. Geeignete Promotoren schließen z.B. den Promotor des Cytomegalie-Virus (CMV), den lacZ-Promotor, den gal10-Promotor und den Polyeder-Promotor des multiplen Kernpolyedervirus von Autographs californica („Autographs californica multiple nuclear polyhedrosis vrus”, AcMNPV) ein. Geeignete Terminationssequenzen schließen z.B. die Rinder-Wachstumshormon-, SV40-, lacZ- und AcMNPV-Polyeder-Polyadenylierungssignale ein. Beispiele von selektierbaren Markern schließen Neomycin-, Ampicillin- und Hygromycin-Resistenz und dergleichen ein. Spezifisch entworfene Vektoren machen das Pendeln von DNA zwischen verschiedenen Wirtszellen möglich, wie Bakterien-Hefe oder Bakterien-tierische Zellen oder Bakterien-Pilzzellen oder Bakterien-Invertebratenzellen.
  • Der Vektor kann neben den vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekülen weiterhin Nucleinsäuresequenzen umfassen, die Sekretionssignale codieren. Solche Sequenzen sind dem Fachmann bekannt. Weiterhin können, abhängig von dem verwendeten Expressionssystem, zu der codierenden Sequenz der Nucleinsäuremoleküle noch Leadersequenzen zugefügt werden, die in der Lage sind, das exprimierte Polypeptid zu einem Kompartiment der Zelle zu steuern, wobei diese auf dem Fachgebiet bekannt sind. Die Leadersequenz(en) wird (werden) in einer geeigneten Phase mit Translations-, Initiations- und Terminationssequenzen verknüpft, wobei eine Leadersequenz vorzugsweise in der Lage ist, die Sekretion eines translatierten Proteins oder eines Teils davon u.a. in die extrazelluläre Membran zu steuern. Gegebenenfalls kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein codieren, einschließlich eines C- oder N-terminalen Identifikationspeptids, das gewünschte Eigenschaften verleiht, z.B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung eines exprimierten rekombinanten Produkts. Sobald der Vektor in den geeigneten Wirt eingebaut wurde, wird der Wirt unter Bedingungen gehalten, die für eine Expression der Nucleotidsequenzen auf hohem Niveau geeignet sind, und, sofern gewünscht, können anschließend die Proteine, antigenen Fragmente oder Fusionsproteine gewonnen und gereinigt werden. Natürlich kann der Vektor auch regulatorische Regionen aus pathogenen Organismen umfassen.
  • Weiterhin kann der Vektor, außer ein Expressionsvektor, auch ein Gen-Transfer- und/oder ein Gen-Targeting-Vektor sein. Die Gentherapie, die auf dem Einführen therapeutischer Gene (z.B. für eine Impfung) in Zellen durch ex vivo- oder in vivo-Techniken beruht, ist eine der wichtigsten Anwendungen des Gentransfers. Geeignete Vektoren, Vektorsysteme und Verfahren für eine in vitro- oder in vivo-Gentherapie sind in der Literatur beschrieben und dem Fachmann bekannt; vgl. z.B. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534–539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911–919; Anderson, Science 256 (1992), 808–813; Isner, Lancet 348 (1996), 370–374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077–1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714–716; WO 94/29469 ; WO 97/00957 ; Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635–640; oder Verma, Nature 389 (1997), 239–242; und die dort zitierten Referenzen.
  • Die Nucleinsäuremoleküle und Vektoren, wie hier vorstehend beschrieben, können für eine direkte Einführung oder für eine Einführung durch Liposomen oder virale Vektoren (z.B. Adenovirus, Retrovirus) in die Zelle entworfen werden. Außerdem können Baculovirus-Systeme oder Systeme, die auf Vacciniavirus oder Semliki-Forest-Virus beruhen, als eukaryontisches Expressionssystem für die hierin beschriebenen Nucleinsäuremoleküle eingesetzt werden. Fragmente des Proteins, das Fusionsprotein oder antigene Fragmente können, zusätzlich zu einer rekombinanten Produktion, auch durch eine direkte Peptidsynthese unter Verwendung von Festphasenverfahren hergestellt werden (vgl. Stewart et al., (1969), „Solid Phase Peptide Synthesis", Freeman Co, San Francisco; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149–2154). Eine in vitro-Proteinsynthese kann anhand manueller Verfahren oder automatisch durchgeführt werden. Eine automatische Synthese kann z.B. unter Verwendung des Applied Biosystems-Peptid-Synthesegeräts 431A (Perkin Elmer, Foster City, KA) gemäß den Anweisungen des Herstellers erfolgen. Verschiedene Fragmente können getrennt chemisch synthetisiert und dann unter Verwendung chemischer Verfahren kombiniert werden, so dass das vollständige Molekül entsteht.
  • Außerdem offenbart die vorliegende Anmeldung einen Wirt, der mit einem vorstehend beschriebenen Vektor transformiert ist, oder einen Wirt, der das vorstehend beschriebene Nucleinsäuremolekül umfasst. Der Wirt kann hergestellt werden, indem der Vektor oder die Nucleotidsequenz in eine Wirtszelle eingeführt wird, der/die bei Vorliegen in der Zelle die Expression eines durch die Nucleotidsequenz codierten Proteins vermittelt, oder umfassend eine Nucleotidsequenz oder einen Vektor, wobei die Nucleotidsequenz und/oder das codierte Polypeptid für die Wirtszelle fremd ist.
  • Mit „fremd" ist gemeint, dass die Nucleotidsequenz und/oder das codierte Polypeptid entweder bezüglich des Wirts heterolog ist/sind, was bedeutet, dass sie/es von einer Zelle oder einem Organismus mit einem anderen genomischen Hintergrund stammt oder dass sie/es bezüglich des Wirts homolog ist, jedoch in einer anderen genomischen Umgebung liegt als das natürlich vorkommende Gegenstück der Nucleotidsequenz. Das bedeutet, dass, wenn die Nucleotidsequenz bezüglich des Wirts homolog ist, sie nicht in ihrer natürlichen Position in dem Genom des Wirts liegt und dass sie insbesondere von anderen Genen umgeben ist. In diesem Fall kann die Nucleotidsequenz entweder unter der Kontrolle ihres eigenen Promotors oder unter der Kontrolle eines heterologen Promotors stehen. Die Position des eingeführten Nucleinsäuremoleküls oder des Vektors kann durch den Fachmann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, z.B. durch Southern-Blot-Verfahren, bestimmt werden. Der Vektor oder die Nucleotidsequenz, der/die in dem Wirt vorliegt, kann entweder in das Genom des Wirts eingebaut werden oder in irgendeiner Form extrachromosomal erhalten bleiben. In dieser Hinsicht ist es auch so zu verstehen, dass die Nucleotidsequenz eingesetzt werden kann, um ein mutiertes Gen durch homologe Rekombination wiederherzustellen oder zu erzeugen.
  • Der Wirt kann eine beliebige prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein. Geeignete prokaryontische/bakterielle Zellen sind diejenigen, die allgemein für die Clonierung verwendet werden, wie E. coli, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens oder Bacillus subtilis. Der eukaryontische Wirt kann eine Säugerzelle, eine Amphibienzelle, eine Fischzelle, eine Insektenzelle, eine Pilzzelle, eine Pflanzenzelle oder eine Bakterienzelle (z.B. E. coli-Stämme HB101, DH5a, XL1 Blue, Y1090 und JM101) sein. Eukaryontische rekombinante Wirtszellen sind bevorzugt. Beispiele von eukaryontischen Wirtszellen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Hefezellen, z.B. Zellen von Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis oder Pichia pastoris, Zelllinien, die vom Mensch, Rind, Schwein, Affe und Nager stammen, und außerdem Insektenzellen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Spodoptera frugiperda-Insektenzellen und von Drosophila stammende Insektenzellen, und außerdem Zebrafischzellen. Von Säugerarten hergeleitete Zelllinien, die für die Verwendung geeignet und kommerziell verfügbar sind, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf L-Zellen, CV1-Zellen, COS-1-Zellen (ATCC CRL 1650), COS-7-Zellen (ATCC CRL 1651), HeLa-Zellen (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171).
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Sängerzellen eine Nervenzelle und/oder eine gezüchtete Zelle, wie u.a. eine HEK-293-Zelle (menschliche embryonale Nierenzelle), eine CHO-, HeLa-, NIH3T3-, BHK-, PC12-Zelle oder eine neuronale Stammzelle, die vorzugsweise von einem Säuger und stärker bevorzugt von einem Menschen stammt.
  • In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Amphibienzelle eine Eizelle. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist die Eizelle eine Frosch-Eizelle, besonders bevorzugt ist sie eine Eizelle von Xenopus laevis.
  • Vorzugsweise ist der Wirt ist ein transgener Nicht-Mensch-Organismus. Der Nicht-Mensch-Organismus kann ein Säuger, eine Amphibie, ein Fisch, ein Insekt, ein Pilz oder eine Pflanze sein. Besonders bevorzugte transgene Nicht-Mensch-Tiere sind Drosophila-Arten, Caenorhabditis elegans, Xenopus-Arten, Zebrafisch, Spodoptera frugiperda, Autographs californica, Mäuse und Ratten. Transgene Pflanzen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Weizen, Tabak, Petersilie und Arabidopsis. Transgene Pilze sind auf dem Fachgebiet auch gut bekannt und umfassen u.a. Hefen wie S. pombe oder S. cerevisiae oder Aspergillus-, Neurospora- oder Ustilago-Arten oder Pichia-Arten.
  • Die vorliegende Anmeldung offenbart ein Verfahren zum Herstellen des durch ein vorstehend beschriebenes Nucleinsäuremolekül codierten Polypeptids, umfassend das Züchten/Aufziehen des vorstehend beschriebenen Wirts der Erfindung und das Isolieren des erzeugten Polypeptids.
  • Auf dem Fachgebiet gibt es eine große Zahl von geeigneten Verfahren zum Herstellen von Polypeptiden in geeigneten Wirten. Wenn der Wirt ein einzelliger Organismus oder eine Säuger- oder Insektenzelle ist, kann der Fachmann auf eine Vielzahl von Kulturbedingungen zurückgreifen, die ohne übermäßigen Arbeitseinsatz noch weiter optimiert werden können. Das produzierte Protein wird einfach aus dem Kulturmedium oder aus isolierten (biologischen) Membranen durch etablierte Verfahren geerntet. Außerdem kann das produzierte Polypeptid direkt aus der Wirtszelle isoliert werden. Der Wirt kann Teil eines Wirtsorganismus sein oder von einem Teil eines Wirtsorganismus stammen, z.B. kann die Wirtszelle Teil des ZNS eines Tiers oder des erntebaren Teils einer Pflanze sein. Außerdem kann das produzierte Polypeptid aus Flüssigkeiten isoliert werden, die von dem Wirt stammen, wie Blut, Milch oder Zerebrospinalflüssigkeit.
  • Weiterhin werden hierin die in SEQ ID NO: 5 bis 12 dargestellten Polypeptide offenbart, die durch die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle codiert sind. Diese Polypeptide können demgemäß durch mikrobiologische Verfahren oder durch transgene Tiere oder transgene Pflanzen hergestellt werden. Alternativ können diese Polypeptide synthetisch oder halbsynthetisch hergestellt werden.
  • Z.B. kann eine chemische Synthese verwendet werden, wie das Festphasen-Verfahren, das von Houghton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 5131–5135, beschrieben ist. Ein anderes Verfahren ist eine in vitro-Translation von mRNA. Ein bevorzugtes Verfahren umfasst die rekombinante Produktion von Protein in Wirtszellen, wie vorstehend beschrieben. Z.B. können Nucleinsäuresequenzen, welche alles oder einen Teil von einer beliebigen der hierin beschriebenen Nucleinsäuresequenzen umfassen, durch PCR synthetisiert werden, in einen Expressionsvektor eingefügt werden, und sodann kann eine Wirtszelle mit dem Expressionsvektor transformiert werden. Danach wird die Wirtszelle gezüchtet, so dass das gewünschte Polypeptid produziert wird, das sodann isoliert und gereinigt wird. Die Proteinisolierung und Reinigung kann durch ein beliebiges von verschiedenen bekannten Verfahren erfolgen; z.B. und ohne Einschränkung, Ionenaustausch-Chromatographie, Gelfiltrations-Chromatographie und Affinitäts-Chromatographie, Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC), Umkehrphasen-HPLC, präparative Platten-Gelelektrophorese. Außerdem können zellfreie Translationssysteme eingesetzt werden, um die hierin beschriebenen Polypeptide herzustellen. Geeignete zellfreie Expressionssysteme zur Verwendung gemäß der vorliegenden Anmeldung schließen Kaninchen-Retikulocyten-Lysat, Weizenkeim-Extrakt, Hundepankreas-Mikrosomenmembranen, E. coli-S30-Extrakt und gekoppelte Transkriptions/Translationssysteme wie das TNT-System (Promega) ein. Diese Systeme erlauben bei Zugabe von Clonierungsvektoren, DNA-Fragmenten oder RNA-Sequenzen, welche codierende Regionen und geeignete Promotorelemente enthalten, die Expression von rekombinanten Polypeptiden oder Peptiden. Wie vorstehend erwähnt, können Proteinisolierungs/reinigungs-Verfahren Modifikationen anhand herkömmlicher Verfahren benötigen. Z.B. kann ein Histidin-„Marker Tag" an das Protein angehängt werden, um die Reinigung auf einer Nickelsäule zu ermöglichen. Andere Modifikationen können eine höhere oder niedrigere Aktivität verursachen, höhere Spiegel des produzierten Proteins möglich machen oder die Reinigung des Proteins vereinfachen.
  • Die vorstehend beschriebenen Polypeptide können verwendet werden, um Antikörper heranzuziehen, die spezifisch gegen ein solches Polypeptid gerichtet sind, wobei der Antikörper spezifisch mit einem Epitop reagiert, das durch die Mutation im ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R erzeugt und/oder gebildet wird, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus:
    • (i) einem Epitop, das spezifisch durch ein Polypeptid präsentiert wird, das eine Aminosäuresequenz eines ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R aufweist, wobei der Rest R (Arg), G (Gly), E (Glu), L (Leu), R (Arg), I (Ile) oder R (Arg), entsprechend der Position 117, 150, 186, 191, 270, 568 oder 578 des wie in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R vom Wildtyp, durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt ist; und
    • (ii) einem Epitop, das spezifisch durch ein Polypeptid präsentiert wird, das eine Aminosäuresequenz eines ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R aufweist, wobei die Aminosäuren, die den Positionen 488 bis 494 des wie in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R vom Wildtyp entsprechen, deletiert sind.
  • Hinsichtlich bevorzugter Elemente von (i) und (ii) lässt sich das gleiche, wie vorstehend beschrieben, auch im Zusammenhang mit den Nucleinsäuremolekülen anwenden. Der Begriff „spezifisch" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass der Antikörper mit dem mutierten P2X7R-Protein reagiert, nicht jedoch mit einem P2X7R-Protein vom Wildtyp. Vorzugsweise bedeutet dieser Begriff auch, dass ein solcher Antikörper nicht an andere mutierte Formen des P2X7R-Proteins bindet, insbesondere solche, die hier beschrieben sind. Ob der Antikörper spezifisch reagiert, wie vorstehend definiert, kann einfach getestet werden, indem u.a. die Reaktion des Antikörpers mit einem ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R vom Wildtyp (oder einer Untereinheit oder einem Fragment davon) mit der Reaktion des Antikörpers mit einem mutierten P2X7R-Polypeptid der Erfindung verglichen wird.
  • Der Antikörper kann z.B. polyclonal oder monoclonal sein. Der Begriff „Antikörper" kann auch Derivate oder Fragmente davon umfassen, bei denen die Bindungsspezifität noch erhalten bleibt. Verfahren zur Produktion von Antikörpern sind auf dem Fachgebiet bekannt und z.B. in: Harlow und Lane, „Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988, beschrieben. Diese Antikörper können z.B. für die Immunfällung und Immunlokalisation der vorstehend beschriebenen Polypeptide und auch für das Überwachen des Vorliegens solcher Polypeptide, z.B. in rekombinanten Organismen oder in der Diagnose, eingesetzt werden. Sie können auch für die Identifizierung von Verbindungen eingesetzt werden, die mit den vorstehend beschriebenen Proteinen interagieren (wie nachstehend erwähnt). Z.B. kann die Oberflächen-Plasmon-Resonanz, wie im BIAcore-System eingesetzt, verwendet werden, um die Wirksamkeit von Phagen-Antikörpern zu steigern, die an ein Epitop des Polypeptids binden (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97–105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7–13).
  • Denkbar sind chimäre, einzelkettige und humanisierte Antikörper sowie Antikörperfragmente wie u.a. Fab-Fragmente ein. Antikörperfragmente oder Derivate umfassen weiterhin F(ab')2-, Fv- oder scFv-Fragmente; vgl. z.B. Harlow und Lane, vorstehend. Verschiedene Verfahren sind auf dem Fachgebiet bekannt und können für die Herstellung solcher Antikörper und/oder Fragmente verwendet werden. So können die (Antikörper-)Derivate durch Peptidomimetika hergestellt werden. Weiterhin können Verfahren, die für die Produktion einzelkettiger Antikörper beschrieben sind (vgl. u.a. US-Patent 4,946,778 ), so angepasst werden, dass einzelkettige Antikörper gegen (ein) hierin beschriebene(s) Polypeptid(e) hergestellt werden können. Außerdem können transgene Tiere eingesetzt werden, um humanisierte Antikörper gegen hierin beschriebene Polypeptide zu exprimieren. Am stärksten bevorzugt ist es, dass der Antikörper der vorliegenden Erfindung ein monoclonaler Antikörper ist. Für die Herstellung von monoclonalen Antikörpern kann ein beliebiges Verfahren verwendet werden, welches Antikörper bereitstellt, die durch kontinuierliche Zelllinien-Kulturen produziert werden. Beispiele solcher Verfahren schließen die Hybridomtechnik (Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495–497), die Triom-Technik, die Mensch-B-Zellen-Hybridom-Technik (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) und die EBV-Hybridom-Technik zur Herstellung menschlicher monoclonaler Antikörper ein (Cole et al., „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc. (1985), 77–96). Verfahren, welche die Produktion von einzelkettigen Antikörpern beschreiben (z.B. US-Patent 4,946,778 ), können so angepasst werden, dass sie einzelkettige Antikörper gegen immunogene Polypeptide produzieren, wie vorstehend beschrieben. Weiterhin können transgene Mäuse eingesetzt werden, um humanisierte Antikörper, die gegen die immunogenen Polypeptide gerichtet sind, zu exprimieren. Besonders bevorzugt ist es, wenn die Antikörper/Antikörperkonstrukte und außerdem Antikörperfragmente oder Derivate in einer Zelle exprimiert werden können. Dies kann u.a. dadurch erreicht werden, dass das entsprechende proteinartige Molekül direkt injiziert wird oder dass Nucleinsäuremoleküle, die es codieren, injiziert werden. Ferner werden Vorgehensweisen der Gentherapie für möglich gehalten. Demgemäß betrifft der Begriff „Antikörpermolekül" vollständige Immunglobulinmoleküle ebenso wie Teile solcher Immunglobulinmoleküle. Weiterhin betrifft der Begriff, wie vorstehend erläutert, modifizierte und/oder veränderte Antikörpermoleküle wie chimäre und humanisierte Antikörper. Außerdem betrifft der Begriff monoclonale oder polyclonale Antikörper sowie rekombinant oder synthetisch erzeugte/synthetisierte Antikörper. Der Begriff betrifft auch intakte Antikörper sowie Antikörperfragmente davon wie getrennte leichte und schwere Ketten, Fab, Fab/c, Fv, Feb', F(ab')2. Der Begriff „Antikörpermolekül" umfasst auch bifunktionelle Antikörper und Antikörperkonstrukte wie Einzelketten-Fvs (scFv) oder Antikörper-Fusionsproteine. Außerdem ist es im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung so gemeint, dass der Begriff „Antikörper" Antikörperkonstrukte umfasst, die in Zellen exprimiert werden können, z.B. Antikörperkonstrukte, die u.a. durch Viren oder Vektoren transfiziert und/oder transduziert werden können. Insbesondere ist es so gemeint, dass solche Antikörperkonstrukte spezifisch die vorstehend beschriebenen Polypeptide erkennen. Weiterhin wird es für möglich gehalten, dass das Antikörperkonstrukt in Verfahren der Gentherapie verwendet wird.
  • Ebenso wird hierin ein Aptamer eingeschlossen, das spezifisch an ein vorstehend beschriebenes Polypeptid bindet, wobei das Aptamer mit einem Epitop eines solchen Polypeptids reagiert. Weiterhin wird ein Aptamer offenbart, das spezifisch gegen ein entsprechendes Nucleinsäuremolekül, wie vorstehend beschrieben, gerichtet ist.
  • Wenn hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Aptamer" Nucleinsäuremoleküle, die an Zielmoleküle binden können. Aptamere umfassen üblicherweise RNA-, einzelsträngige DNA-, modifizierte RNA- oder modifizierte DNA-Moleküle. Die Herstellung von Aptameren ist auf dem Fachgebiet bekannt und kann u.a. die Verwendung von kombinatorischen RNA-Banken zum Identifizieren von Bindungsstellen umfassen (Gold, Ann. Rev. Biochem. 64 (1995), 763–797).
  • Weiterhin offenbart die vorliegende Anmeldung einen Primer oder ein Primerpaar, der/das in der Lage ist, die hierin beschriebenen Nucleinsäuremoleküle spezifisch zu amplifizieren. Wenn hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Primer" ein einzelsträngiges Nucleinsäuremolekül, das in der Lage ist, sich an das vorstehend beschriebene Nucleinsäuremolekül anzulagern, und das dadurch in der Lage ist, als Startpunkt für eine Amplifikation zu dienen. Der Begriff umfasst auch Oligoribo- oder Desoxyribonucleotide, die zu einer Region von einem der Stränge eines vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküls komplementär sind. Wenn hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Primerpaar" ein Paar von Primern, die hinsichtlich einer komplementären Region eines Nucleinsäuremoleküls zueinander in entgegengesetzter Richtung ausgerichtet sind, wodurch z.B. eine Amplifikation durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) möglich gemacht wird.
  • Der Begriff „Amplifizieren" bezieht sich auf ein wiederholtes Kopieren einer spezifizierten Sequenz von Nucleotiden, das zu einer Zunahme der Menge der spezifizierten Sequenz von Nucleotiden führt und die Erzeugung einer Vielzahl von identischen oder im Wesentlichen identischen (d.h. zu mindestens 95 %, stärker bevorzugt mindestens 98 %, noch stärker bevorzugt mindestens 99 % und am stärksten bevorzugt mindestens 99,5 %, wie 99,9 %, identischen) Nucleinsäuremolekülen oder Teilen davon möglich macht. Solche Verfahren sind auf dem Fachgebiet etabliert; vgl. Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Aufl., 1989, CSH Press, Cold Spring Harbor. Sie schließen eine Polymerasekettenreaktion (PCR) und Modifikationen davon sowie eine Ligasekettenreaktion (LCR) ein, um nur einige bevorzugte Amplifikationsverfahren zu nennen.
  • Im Zusammenhang mit Primern bedeutet der Begriff „spezifisch", dass nur die wie vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle amplifiziert werden und dass Nucleinsäuremoleküle, die den in SEQ ID NO: 1 dargestellten ATP-abhängigen Rezeptor P2X7R vom Wildtyp codieren, nicht amplifiziert werden. Somit ist ein Primer, wie hierin beschrieben, vorzugsweise ein Primer, der an eine Region eines hierin beschriebenen Nucleinsäuremoleküls bindet, welche für dieses Molekül einmalig ist und welche nicht in der Wildtyp-P2X7R-codierenden Sequenz vorliegt, d.h. der Primer bindet in einer Region, in der eine der vorstehend beschriebenen Mutationen vorliegt. Im Zusammenhang mit einem hierin beschriebenen Primerpaar ist es möglich, dass einer der Primer des Paars in der vorstehend beschriebenen Bedeutung spezifisch ist oder dass beide Primer des Paars spezifisch sind. In beiden Fällen würde es die Verwendung eines solchen Primerpaars möglich machen, eine Mutante der Erfindung, wie vorstehend beschrieben, spezifisch zu amplifizieren, nicht jedoch die Wildtyp-P2X7R-codierende Sequenz.
  • Das 3'-OH-Ende eines Primers wird durch eine Polymerase durch fortlaufenden Einbau von Nucleotiden verlängert. Der Primer oder das Primerpaar kann z.B. in Primerverlängerungs-Experimenten auf Matrizen-RNA gemäß Verfahren eingesetzt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Vorzugsweise wird der Primer oder das Primerpaar für Amplifikationsreaktionen an Matrizen-RNA oder Matrizen-DNA, vorzugsweise cDNA oder genomische DNA, verwendet. Die Begriffe „Matrizen-DNA" oder „Matrizen-RNA" beziehen sich auf DNA- oder RNA-Moleküle oder Fragmente davon einer beliebigen Quelle oder Nucleotidzusammensetzung, die eine Ziel-Nucleotidsequenz, wie vorstehend definiert, umfassen. Der Primer oder das Primerpaar kann auch für Hybridisierungsexperimente verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Vorzugsweise wird der Primer oder das Primerpaar in Polymerasekettenreaktionen eingesetzt, um Sequenzen zu amplifizieren, die einer Sequenz des vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküls entsprechen. Es ist bekannt, dass die Länge eines Primers durch verschiedene Parameter bestimmt wird (Gillam, Gene 8(1979), 81–97; Innis, „PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Academic Press, San Diego, USA (1990)). Vorzugsweise sollte der Primer nur mit einer spezifischen Region einer Ziel-Nucleotidsequenz hybridisieren oder daran binden. Die Länge eines Primers, der statistisch nur mit einer einzigen Region einer Ziel-Nucleotidsequenz hybridisiert, kann durch die folgende Formel berechnet werden: (1/4)x (wobei x die Länge des Primer ist). Z.B. wäre ein Hepta- oder Octanucleotid ausreichend, um statistisch nur einmal an eine Sequenz von 37 kb zu binden. Jedoch ist bekannt, dass ein Primer, der sich mit einem komplementären Matrizenstrang exakt paart, mindestens eine Länge von 9 Basenpaaren aufweisen muss, da anderenfalls kein stabiler doppelsträngiger Strang erzeugt werden kann (Goulian, Biochemistry 12 (1973), 2893–2901). Außerdem wird in Betracht gezogen, dass Computer-basierte Algorithmen verwendet werden können, um Primer zu entwerfen, welche in der Lage sind, die vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküle zu amplifizieren. Vorzugsweise haben die Primer der Erfindung eine Länge von mindestens zehn Nucleotiden, stärker bevorzugt eine Länge von mindestens 12 Nucleotiden, noch stärker bevorzugt eine Länge von mindestens 15 Nucleotiden, besonders bevorzugt eine Länge von mindestens 18 Nucleotiden, noch mehr besonders bevorzugt eine Länge von mindestens 20 Nucleotiden und am stärksten bevorzugt eine Länge von mindestens 25 Nucleotiden.
  • Außerdem kann es sein, dass der Primer oder das Primerpaar markiert ist. Die Markierung kann z.B. eine radioaktive Markierung wie 32P, 33P oder 35S sein.
  • Bevorzugt ist die Markierung eine nicht-radioaktive Markierung, z.B. Digoxigenin, Biotin und ein fluoreszierender Farbstoff oder ein Farbstoff. Bevorzugt sind die Primer aus der Gruppe ausgewählt, die aus SEQ ID NO: 52 bis 111 besteht.
  • In einem weiteren Aspekt offenbart die vorliegende Anmeldung eine Zusammensetzung, die ein Nucleinsäuremolekül, einen Vektor, ein Polypeptid, einen Antikörper, ein Aptamer und/oder einen Primer oder ein Primerpaar wie hierin beschrieben umfasst.
  • Der Begriff „Zusammensetzung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Zusammensetzungen, die mindestens ein Nucleinsäuremolekül, einen Vektor, ein Polypeptid, einen Antikörper und/oder einen Primer oder ein Primerpaar, wie hierin beschrieben, umfassen. Gegebenenfalls kann er weitere Moleküle umfassen, die in der Lage sind, die Eigenschaften der hierin beschriebenen Komponente zu verändern, wodurch z.B. ihre Funktion unterdrückt, blockiert, moduliert und/oder aktiviert wird, wobei diese Moleküle neuroprotektive, nootrope, antidepressive und/oder zellschützende Eigenschaften besitzen, wie hier nachstehend noch beschrieben wird. Die Zusammensetzung kann in fester, flüssiger oder gasförmiger Form vorliegen und kann u.a. in der Form von Pulver(n), Tablette(n), Lösung(en) oder Aerosol(en) vorliegen.
  • Bevorzugt ist die Zusammensetzung eine diagnostische Zusammensetzung, die gegebenenfalls darüber hinaus geeignete Mittel zum Nachweis umfasst. Wie vorstehend beschrieben, wurde überraschend festgestellt, dass Mutationen im P2X7R-Protein mit affektiven Störungen in Zusammenhang stehen. Somit macht es dieses Wissen jetzt möglich, affektive Störungen auf einfache Art und Weise zu diagnostizieren. Die diagnostische Zusammensetzung umfasst mindestens eine der vorstehend erwähnten Verbindungen. Die diagnostische Zusammensetzung kann u.a. für Verfahren verwendet werden, mit denen das Vorliegen und/oder die Expression der Nucleinsäuren und/oder der Polypeptide bestimmt werden/wird, die hierin beschrieben sind. Dies kann erreicht werden, indem z.B. das Vorliegen eines entsprechenden Gens in dem genetischen Material eines Individuums oder das Vorliegen der entsprechenden mRNA nachgewiesen wird; dies umfasst das Isolieren von DNA oder RNA aus einer Zelle, die von dem Individuum stammt, das Inkontaktbringen der auf diese Weise erhaltenen DNA oder RNA mit einer Nucleinsäuresonde, wie vorstehend beschrieben, unter Hybridisierungsbedingungen und das Nachweisen des Vorliegens von mRNAs, die mit der Sonde hybridisierten. Alternativ kann die diagnostische Zusammensetzung auch zum Nachweisen des Vorliegens eines hierin beschriebenen Nucleinsäuremoleküls durch PCR eingesetzt werden. Weiterhin können hierin beschriebene Polypeptide mit Verfahren nachgewiesen werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind und die u.a. immunologische Verfahren wie RIA, FIA, ELISA, FACS oder Western-Blot-Verfahren umfassen.
  • Außerdem kann die diagnostische Zusammensetzung u.a. zum Nachweisen der Prävalenz, des Ausbruchs oder des Fortschreitens einer Krankheit eingesetzt werden, die mit der Expression eines vorstehend beschriebenen Polypeptids in Zusammenhang steht. Demgemäß kann die diagnostische Zusammensetzung u.a. eingesetzt werden, um die Prävalenz, den Ausbruch und/oder den Krankheitsstatus von affektiven Störungen, wie vorstehend definiert, zu bestimmen. Außerdem ist es so gemeint, dass die diagnostische Zusammensetzung eingesetzt werden kann, um das Stadium (die Stadien) einer Krankheit zu unterscheiden.
  • Die diagnostische Zusammensetzung umfasst gegebenenfalls geeignete Mittel zum Nachweis. Das (die) vorstehend beschriebene(n) Nucleinsäuremolekül(e), Vektor(en), Wirt(e), Antikörper, Aptamer(e), Polypeptid(e) sind z.B. für die Verwendung in Immuntests geeignet, in denen sie in flüssiger Phase oder an einen Festphasen-Träger gebunden verwendet werden können. Beispiele bekannter Träger umfassen Glas, Polystyrol, Polyvinyl-Ion, Polypropylen, Polyethylen, Polycarbonat, Dextran, Nylon, Amylosen, neutrale und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Der Träger kann entweder löslich oder unlöslich sein.
  • Festphasen-Träger sind dem Fachmann bekannt und können Polystyrolperlen, Latexperlen, magnetische Perlen, kolloidale Metallpartikel, Glas- und/oder Silicon-Chips und -Oberflächen, Nitrocellulose-Streifen, Membranen, Platten, Duracytes und die Wände von Vertiefungen einer Reaktionsplatte, Kunststoffröhrchen oder andere Teströhrchen umfassen. Geeignete Verfahren zum Immobilisieren von Nucleinsäuremolekül(en), Vektor(en), Wirt(en), Antikörper(n), Apatmer(en), Polypeptid(en) usw. an festen Phasen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf ionische, hydrophobe, kovalente Wechselwirkungen oder (chemische) Vernetzung und dergleichen. Beispiele von Immuntests, in denen die hierin beschriebenen Verbindungen eingesetzt werden können, sind kompetitive und nicht-kompetitive Immuntests in einem direkten oder indirekten Format. Üblicherweise verwendete Nachweistests können radioisotopische oder nicht-radioisotopische Verfahren umfassen. Beispiele solcher Immuntests sind der Radioimmuntest (RIA), der Sandwich-Test (immunometrischer Test) und der Northern- oder Southern-Blot-Test. Weiterhin umfassen diese Nachweisverfahren u.a. IRMA (Immunradioimmunmetrischer Test), EIA (Enzymimmuntest), ELISA (enzymverbundener Immuntest), FIA (Fluoreszenzimmuntest) und CLIA (Chemilumineszenzimmuntest). Außerdem können die diagnostischen Verbindungen in Verfahren wie FREI – (Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer-)Tests eingesetzt werden.
  • Geeignete Markierungen und Verfahren zum Markieren sind dem Fachmann bekannt. Beispiele der Arten von Markierungen, die verwendet werden können, schließen u.a. Fluorochrome (wie Fluorescein, Rhodamin, Texas-Rot usw.), Enzyme (wie Meerrettich-Peroxidase, β-Galactosidase, alkalische Phosphatase), radioaktive Isotope (wie 32P, 33P, 35S oder 125I), Biotin, Digoxigenin, kolloidale Metalle, chemi- oder biolumineszierende Verbindungen (wie Dioxetane, Luminol oder Acridinium-Stoffe) ein.
  • Für die Markierung von Biomolekülen ist eine Vielzahl von Verfahren verfügbar, die dem Fachmann bekannt sind, wobei sie u.a. die kovalente Kopplung von Enzymen oder Biotinylgruppen, Phosphorylierungen, Biotinylierungen, Zufalls-Priming, Nick-Translationen, das Anfügen eines Schwanzes (unter Verwendung terminaler Transferasen) umfassen. Solche Verfahren sind z.B. beschrieben in Tijssen, „Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Burden und von Knippenburg, (Hrsg.), Bd. 15 (1985); „Basic Methods in Molecular Biology", Davis L. G., Dibmer M. D., Battey Elsevier (1990); Mayer, (Hrsg.), „Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology", Academic Press, London (1987); oder in der Reihe „Methods in Enzymology", Academic Press, Inc..
  • Nachweisverfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Autoradiographie, Fluoreszenzmikroskopie, direkte und indirekte enzymatische Umsetzungen usw..
  • Die diagnostische Zusammensetzung kann für Verfahren verwendet werden, mit denen das Vorliegen und/oder die Häufigkeit eines vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremoleküls in einer biologischen und/oder medizinischen Probe nachgewiesen wird, und/oder mit denen die Expression eines solchen Nucleinsäuremoleküols nachgewiesen wird (z.B. indem die mRNA oder das exprimierte Polypeptid bestimmt wird). Weiterhin kann die diagnostische Zusammensetzung auch in hierin beschriebenen Verfahren eingesetzt werden, mit denen u.a. spezifische Antagonisten oder Agonisten von ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanälen nachgewiesen werden (vgl. nachstehend).
  • Hierin wird ein Verfahren zum Diagnostizieren einer affektiven Störung oder einer Anfälligkeit für eine affektive Störung beschrieben, umfassend den Schritt des Bestimmens in einer Probe, die von einem Individuum erhalten wurde, ob das in den Zellen des Individuums exprimierte P2X7R-Protein nicht funktionell ist, im Vergleich zum P2X7R-Protein vom Wildtyp eine veränderte ATP-Abhängigkeit zeigt oder im Vergleich zum P2X7R-Proteinspiegel eines nicht betroffenen Individuums Ober- oder unterexprimiert ist.
  • Der Begriff „über- oder unterexprimiert im Vergleich zu dem P2X7R-Proteinspiegel" bedeutet im Kontext hierin, dass der P2X7R-Proteinspiegel höher oder niedriger ist als der P2X7R-Spiegel eines gesunden Individuums, d.h. eines Individuums, das nicht an einer affektiven Störung leidet. Die Überexpression kann z.B. durch eine gesteigerte Menge an P2X7R-mRNA zustande kommen, welche durch erhöhte Transkriptionsraten aufgrund einer gesteigerten Aktivität der RNA-Polymerase II verursacht wird. Die Menge an mRNA kann demgemäß zu einer gesteigerten Translation und somit zu einem höheren Spiegel des P2X7R-Proteins führen. Außerdem kann es sein, dass eine größere Menge an P2X7R-Protein durch eine erhöhte Stabilität des Proteins zustande kommt. Eine Unterexpression des P2X7R-Proteins kann durch niedrige Transkriptionsraten des P2X7R-Gens bedingt sein, so dass unzureichende Mengen von P2X7R-mRNA eine niedrige Menge des P2X7R-Proteins ergeben. Ein anderer Grund kann sein, dass das P2X7R-Protein instabil ist und somit nicht in Mengen vorliegt, die mit dem Spiegel des Wildtyp-Proteins vergleichbar sind.
  • Die Unter- oder Überexpression des P2X7R-Proteins kann durch Verfahren bestimmt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Diese schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Verfahren zum Bestimmen der Menge von mRNA oder der Menge und/oder der Aktvität des Proteins. Beispiele sind Northern-Blot-Analyse oder Immun-basierte Verfahren wie Western-Blot-Verfahren.
  • „Nicht-funktionell" bedeutet, dass das P2X7R-Protein mindestens eine Funktionseigenschaft verloren hat, die das P2X7R-Protein vom Wildtyp, wie hier vorstehend beschrieben, besitzt. Vorzugsweise bedeutet „nicht-funktionell", dass das P2X7R-Protein nicht mehr als ein Kanal funktioniert. Nicht-Funktionalität kann z.B. durch die Tatsache verursacht werden, dass das eine Allel, das in einem Individuum vorkommt, ein P2X7R-Protein codiert, welches zu nicht-funktionellen Dimeren führt (dominante negative Mutation). Ob ein P2X7R-Protein in einem Individuum funktionell oder nicht-funktionell ist, kann durch die vorstehend und in den Beispielen beschriebenen Verfahren bestimmt werden.
  • Der Begriff „veränderte ATP-Abhängigkeit" bedeutet, dass das entsprechende P2X7R-Protein in unterschiedlicher Weise auf ATP reagiert als das P2X7R-Protein vom Wildtyp. Dies kann, wie in den beigefügten Beispielen beschrieben oder wie vorstehend erläutert, bestimmt werden.
  • Im Zusammenhang einer Diagnose könnte nicht nur die Aktvität des P2X7R, sondern auch die exprimierte Menge davon von diagnostischem Wert sein. Wenn z.B. ein Polymorphismus die Stabilität der RNA oder die Effizienz der Translation stört, könnte dies zu einer niedrigeren Expression des P2X7-Proteins nicht nur im Hippocampus, sondern auch im Blut führen. Deshalb könnte man spekulieren, dass eine durch Western-Blot nachgewiesene niedrigere Menge von P2X7 in Blutzellen mit einer Depression in Zusammenhang stehen könnte.
  • Ein weiterer hierin beschriebener Aspekt ist ein Verfahren zum Diagnostizieren einer affektiven Störung oder einer Anfälligkeit für eine affektive Störung, umfassend den Schritt des Bestimmens in einer Probe, die von einem Individuum erhalten wurde, ob die P2X7R-Gensequenz oder das dadurch codierte Protein im Vergleich zu der P2X7R-Sequenz vom Wildtyp eine Mutation umfasst.
  • Ein bevorzugter Aspekt beschreibt ein Verfahren, wobei eine Mutation eine Mutation in einer P2X7R-Sequenz, wie vorstehend definiert, und/oder ein Nucleotidaustausch oder eine -Deletion ist, ausgewählt aus der folgenden Tabelle C, wobei in der Spalte „Region von P2X7R" die Region der genomischen Nucleotidsequenz von P2X7R angegeben ist, in der der Austausch oder die Deletion geschieht, in der Spalte „Nucleotid" der Tabelle C das Nucleotid, das durch ein anderes Nucleotid ersetzt ist, oder die Nucleotide, die deletiert sind, angegeben ist/sind und in der Spalte „Position im Wildtyp" der Tabelle C die entsprechende Position der wie in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nucleotidsequenz des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R vom Wildtyp angegeben ist. Tabelle C
    Region von P2X7R Nucleotid Position im Wildtyp
    5'UTR T 362
    5'UTR T 532
    5'UTR A 1100
    5'UTR A 1122
    5'UTR C 1171
    5'UTR T 1351
    5'UTR G 1702
    5'UTR T 1731
    5'UTR C 1860
    5'UTR C 2162
    5'UTR C 2238
    5'UTR A 2373
    5'UTR G 2569
    5'UTR G 2702
    Intron 1 G 3166
    Intron 1 C 24778
    Intron 1 C 24830
    Exon 2 T 24942
    Exon 3 C 26188
    Exon 3 A 26308
    Exon 3 G 26422
    Intron 4 G 32394
    Intron 4 T 32434
    Exon 5 G 32493
    Exon 5 G 32506
    Exon 5 C 32507
    Exon 5 C 32548
    Intron 5 A 32783
    Intron 5 T 35309
    Intron 5 C 35374
    Intron 5 A 35378
    Exon 6 G 35438
    Exon 6 T 35454
    Intron 6 T 35549
    Intron 6 G 35641
    Intron 6 A 35725
    Intron 6 T 36001
    Intron 6 A 36064
    Intron 6 Deletion von GTTT 36091 bis 36094
    Intron 6 C 36108
    Intron 7 C 36374
    Intron 7 G 36378
    Intron 7 T 36387
    Intron 7 G 36398
    Intron 7 C 37439
    Intron 7 T 37513
    Exon 8 C 37604
    Exon 8 G 37605
    Exon 8 G 37623
    Exon 8 C 37633
    Intron 9 C 47214
    Exon 11 G 47383
    Exon 11 C 47411
    Intron 11 T 47563
    Intron 12 C 54307
    Intron 12 G 54308
    Exon 13 C 54399
    Exon 13 A 54480
    Exon 13 C 54523
    Exon 13 Deletion von CCCTGAGAGCCACAGGTGC CT 54562 bis 54582
    Exon 13 A 54588
    Exon 13 C 54664
    Exon 13 G 54703
    Exon 13 A 54804
    Exon 13 G 54834
    Exon 13 G 54847
    3'UTR G 54925
    3'UTR C 55169
    3'UTR A 55170
    3'UTR A 55171
    3'UTR C 55917
  • Wie vorstehend angegeben ist es bevorzugt, wenn das entsprechende Nucleotid, das durch ein anderes Nucleotid ersetzt ist, eine Purinbase ist, dass es durch eine andere Purinbase ersetzt ist. Wenn es eine Pyrimidinbase ist, ist es bevorzugt, dass es durch ein andere Pyrimidinbase ersetzt ist. Außerdem ist es bevorzugt, dass eine Purinbase durch eine Pyrimidinbase ersetzt ist und dass eine Pyrimidinbase durch eine Purinbase ersetzt ist. Am stärksten bevorzugt sind die in Tabelle C angegebenen Nucleotide durch die an der entsprechenden Position in der nachstehenden Tabelle 12 angegebenen Nucleotide ersetzt (vgl. Beispiel 3).
  • Eine anderer, hierin beschriebener Aspekt ist eine diagnostische Zusammensetzung, die für die Verwendung in einem Verfahren entworfen wurde, in dem das Auftreten der Mutation in dem Gen des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R durch PCR, immunologische Methoden und/oder elektrophysiologische Verfahren, wie nachstehend und in den angefügten Beispielen beschrieben, bestimmt wird. Außerdem ist es möglich, das Auftreten einer Mutation in dem ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R, wie vorstehend beschrieben, zu bestimmen.
  • Noch ein anderer hierin beschriebener Aspekt beschreibt die Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls, eines Vektors, eines Polypeptids, eines Antikörpers, eines Aptamers und/oder eines Primers oder Primerpaares für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zum Nachweis einer affektiven Störung.
  • Außerdem werden hierin Verfahren zum Diagnostizieren einer affektiven Störung eines Individuums beschrieben, umfassend:
    • (a) Isolieren von DNA aus Zellen, die von einem Individuum erhalten wurden;
    • (b) Bestimmen der gesamten oder eines Teils der Nucleotidzusammensetzung des P2X7R-Gens; und
    • (c) Analysieren der Nucleotidzusammensetzung von P2X7R auf die Anwesenheit eines/r oder mehrerer Polymorphismen, Mutationen oder allelischer Variationen.
  • Der Begriff „Gen" bedeutet eine Nucleotidsequenz, die mit der Produktion eines Proteins assoziiert ist, einschließlich Promotorsequenzen, Enhancersequenzen, Intronsequenzen, Exonsequenzen, codierender Sequenzen, 5'-untranslatierter Region (5'UTR), 3'-untranslatierter Region (3'UTR) und Spleißvarianten.
  • In den hierin beschriebenen Verfahren ist das Individuum ein Säuger und stärker bevorzugt ein Mensch. Außerdem stammen die Zellen vorzugsweise aus Haut, Blut, Urin oder Zerebrospinalflüssigkeit.
  • Die hierin beschriebenen Verfahren ermöglichen die Diagnose einer affektiven Störung gemäß der Zusammensetzung eines genetischen Markers, der dem P2X7R-Gen entspricht. Wie durch die beigefügten Beispiele gezeigt wird, stehen Polymorphismen in dem P2X7R in einem genetischen Zusammenhang mit Patienten, die an einer affektiven Störung leiden.
  • Demgemäß kann die Diagnose einer affektiven Störung z.B. erreicht werden, indem Zellen von einem Individuum isoliert werden und sodann die genomische DNA der Zellen isoliert wird. Solche Zellen können aus Körperflüssigkeiten, Haut, Haaren, Biopsien und anderen Quellen gewonnen werden. Das Gewinnen und Analysieren von Zellen aus Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin und Zerebrospinalflüssigkeit ist auf dem Fachgebiet bekannt; vgl. z.B. Rodak, „Haematology: Clinical Principles & Applications", 2. Aufl., WB Saunders Co., 2002; Brunzel, „Fundamentals of Urine and Body Fluids Analysis", WB Saunders Co., 1994; Hemdon und Brumback (Hrsg.), „Cerebrospinal Fluid", Kluwer Academic Pub., 1989. Außerdem sind Verfahren zum Isolieren von DNA auf dem Fachgebiet gut beschrieben; vgl. z.B. Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001.
  • Sobald die DNA isoliert wurde, können verschiedene Oligonucleotid-Primer, welche den P2X7R-Locus überspannen, entworfen werden, um das genetische Material durch Polymerasekettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Herkömmliche Verfahren zum Entwerfen, Synthetisieren, Produzieren der Oligonucleotid-Primer und Durchführen der PCR-Amplifikation finden sich in Standard-Fachbücher, vgl. z.B. Agrawal (Hrsg.), „Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties (Methods in Molecular Biology, 20)", Humana Press, 1993; Innis et al., (Hrsg.), „PCR Applications: Protocols for Functional Genomics", Academic Press, 1999; Chen und Janes (Hrsg.), „PCR Cloning Protocols: From Molecular Cloning to Genetic", 2. Aufl., Humana Press, 2002. Primer zum Nachweis von P2X7R- Polymorphismen sind auch in den SEQ ID NO: 52 bis SEQ ID NO: 111 angegeben, sind jedoch nicht hierauf beschränkt. Sobald die DNA amplifiziert wurde, kann die Nucleotidstruktur durch Sequenzierverfahren analysiert und mit der normalen P2X7R-DNA verglichen werden. Die Sequenzierung kann durch einen Fachmann der Molekularbiologie manuell durchgeführt werden, oder sie kann durch eine automatische Sequenzierapparatur erfolgen. Diese Verfahren sind auf dem Fachgebiet üblich, vgl. z.B. Adams et al., (Hrsg.), „Automated DNA Sequencing and Analysis", Academic Press, 1994; Alphey, „DNA Sequencing: From Experimental Methods to Bioinformatics", Springer Verlag Publishing, 1997.
  • Der Nachweis und die Analyse von Polymorphismen in P2X7R können auch durchgeführt werden unter Verwendung von „Amplification Refractory Mutation System" (ARMSTM), „Amplification Refractory Mutation System Linear Extension" (ALEXTM), Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP), Heteroduplex-Analyse, PCR-SSCP, Flureszenz-SSCP in einem automatischen DNA-Sequenziergerät, denaturierender Gradientengel-Elektrophorese, Rnase-Schutztests, Nachweis von Mutationen durch Sequenz-spezifische Oligonucleotid-Hybridisierung, chemischen Spaltungsverfahren, enzymatischen Fehlpaarungs-Spaltungsverfahren, Fragmentlängen-Spaltungsverfahren, Allel-spezifischer Oligonucleotid-Hybridisierung auf DNA-Chips und anderen Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, vgl. z.B. Nollau et al., Clin. Chem. 43 (1997), 1114–1128; Burczak und Mardis (Hrsg.), „Polymorphism Detection & Analysis Techniques", Eaton Pub. Co., 2000; Cotton et al., (Hrsg.), „Mutation Detection: A Practical Approach", Irl Press, 1998; Taylor (Hrsg.), „Laboratory Methods for the Detection of Mutations and Polymorphisms in DNA", CRC Press, 1997.
  • Des Weiteren wird hierin ein Verfahren zum Diagnostizieren einer affektiven Störung in einem Individuum beschrieben, umfassend:
    • (a) Isolieren von RNA aus Zellen, die von einem Individuum erhalten wurden;
    • (b) Umwandeln der RNA in cDNA;
    • (c) Bestimmen der gesamten oder eines Teils der Nucleotidzusammensetzung der auf dieser Weise erhaltenen cDNA; und
    • (d) Analysieren der Nucleotidzusammensetzung auf die Anwesenheit eines oder mehrerer Polymorphismen oder allelischer Variationen.
  • Hinsichtlich der bevorzugten Ausführungsformen lässt sich hier das Gleiche, wie bereits vorstehend beschrieben, anwenden.
  • Der Nachweis und die Analyse von Polymorphismen in der P2X7R-RNA können gemäß den vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
  • Zusätzlich wird hierin auch ein Verfahren zum Diagnostizieren einer affektiven Störung in einem Individuum beschrieben, umfassend:
    • (a) Isolieren von RNA oder Proteinen aus Zellen, die von einem Individuum erhalten wurden;
    • (b) Bestimmen der Spiegel von P2X7R-RNA oder -Protein; und
    • (c) Vergleichen der Spiegel von P2X7R-RNA oder -Protein mit den entsprechenden Spiegeln eines normalen Individuums, das nicht an einer affektiven Störung leidet.
  • Wie durch die beigefügten Beispiele gezeigt wird, gibt es einen Zusammenhang zwischen der Expression oder dem Proteinspiegel von P2X7R und einer affektiven Störung.
  • Außerdem ist hierin ein Polynucleotid offenbart, das mindestens 20 Basen des menschlichen P2X7R-Gens umfasst und das eine Mutation oder einen Polymorphismus umfasst, ausgewählt aus einem der folgenden: Tabelle 1: Neue Polymorphismen im menschlichen P2X7R
    Region in P2X7 Polymorphismus Proteinmodifikation
    5'UTR 362 T-C
    5'UTR 532 T-G
    5'UTR 1100 A-G
    5'UTR 1122 A-G
    5'UTR 1171 C-G
    5'UTR 1702 G-A
    Intron01 3166 G-C
    Intron01 24778 C-T
    Intron01 24830 6C-T
    Exon03 26188 C-T Arg117Trp
    Intron03 26308 A-G
    Intron03 26422 G-A
    Intron04 32394 G-A
    Intron04 32434 T-C
    Exon05 32493 G-A Gly150Arg
    Exon05 32548 C-T Stumm Cys 168
    Intron05 32783 A-C
    Exon06 35438 G-A Glu186Lys
    Exon06 35454 T-C Leu191Pro
    Intron06 35641 G-C
    Intron06 35725 A-C
    Intron06 36001 T-G
    Intron07 36378 G-A
    Intron07 36387 T-A
    Intron07 36398 G-C
    Exon08 37604 C-T Arg270Cys
    Exon08 37633 C-T Stumm Asp279
    Intron09 47214 C-T
    Intron11 47563 T-C
    Intron12 54307 C-T
    Intron12 54308 G-A
    Exon13 54562-54582 Deletion of CCCTGAGA GCCACAGGTGCCT Deletion von 7 As 488 bis 494 (PESHRCL)
    Exon13 54804 A-T Ile568Asn
    Exon13 54834 G-A Arg578Gln
    3'UTR 55169 C-A
    3'UTR 55170 A-C
    3'UTR 55171 A-C
    3'UTR 55917 C-T
    3'UTR 54925 G-A
  • In der Spalte Polymorphismus sind die Position und die festgestellte Variation angegeben. Die Position und Nummerierung des Polymorphismus entspricht dem wie in SEQ ID NO: 1 definierten menschlichen P2X7R-Gen. Primer, die für die SNP-Amplifikation und Sequenzierung verwendet werden, sind in Tabelle 1a dargestellt und in den SEQ ID NO: 52 bis SEQ ID NO: 111 aufgelistet. Tabelle 1a: Primersequenzen für SNP-Amplifikation und Sequenzierung
    Primer-Name Orientierung Sequenz Anfang Ende
    P2RX7_01.for Sense cgtaggacttggcgcttct 2785 2803
    P2RX7_01.rev Anti sense gagcacgtctcagattcgaaa 3224 3244
    P2RX7_02.for Sense ccatgaggcaggtatgactattc 24665 24687
    P2RX7_02.rev Antisense ctcctggatctcacccagt 25168 25187
    P2RX7_03.for Sense ctcgtccagctttgatattaagc 25966 25988
    P2RX7_03.rev Antisense ggtccctagtgctagaaccaga 26426 26447
    P2RX7_04.for Sense attcatccgtcagtggcc 30794 30811
    P2RX7_04.rev Antisense gccatgtgaattttctaccgat 31277 31298
    P2RX7_05.for Sense ttcgttgtggttaggatggg 32314 32333
    P2RX7_05.rev Antisense caaggatgctcagggtagtagc 32805 32826
    P2RX7_06.for Sense cactaggtttgctgtatccatttct 35277 35301
    P2RX7_06.rev Antisense gcaactgtgtgagagcttgg 35731 35750
    P2RX7_07.for Sense tcaaccctggtccagtgtg 35950 35968
    P2RX7_07.rev Antisense caccaagtagctctcactcataagg 36424 36448
    P2RX7_08.for Sense caataacacttgtgcgagttaggt 37380 37403
    P2RX7_08.rev Antisense catcttgttgccttggaaacc 37750 37770
    P2RX7_09.for Sense tgagtggtaatcctgctactgc 45321 45343
    P2RX7_09.rev Antisense aggcccactcctgtactcg 45743 45761
    P2RX7_10_11.for Sense ccaagtcacagcatgaggc 47119 47137
    P2RX7_10_11.rev Antisense acccagcgacgtatccac 47632 47649
    P2RX7_12.for Sense agcatggggttccatttc 50252 50268
    P2RX7_12.rev Antisense gcataaaagggactcctgctagta 50691 50714
    P2RX7_13a.for Sense gcttacagaacacatgcatgg 54232 54252
    P2RX7_13a.rev Antisense gcacctgtaggcacagtgc 54739 54757
    P2RX7_13b.for Sense atcaccacctcagagctgttc 54620 54640
    P2RX7_13b.rev Antisense gttaacatggctactgcagcc 55203 55223
    P2XR7_13d.for Sense gcttagaaaggaggcgactcc 54484 54504
    P2XR7_Pro13.for Sense ttgtgacatttgcaaggctgcc 2617 2638
    P2XA7_Pro7.rev Antisense tctgaagctctgctcctgag 1955 1974
    P2XA7_Pro8.rev Antisense ctcaccttctggcttccagt 1611 1630
    P2XR7_Pro9.for Sense cttaccactcccaggactaa 1496 1515
    P2XR7_Pro10.for Sense gtctgcctgttcactgccat 1149 1168
    P2XR7_Prol.for Sense cagagaccttcagaaacttcg 1841 1861
    P2XR7_Pro2.rev Antisense agatcaccagggacacagtg 2261 2280
    P2XR7_Pro3.for Sense ctcaactccactttcctcgg 2133 2152
    P2XR7Pro4.rev Antisense cctttcacttttttggtctcatg 2655 2677
    P2XR7_Pro5.for Sense gggagaattctgaaaatgccc 2691 2711
    P2XR7_Pro6.rev Antisense ggaccagagctctactcttc 2951 2970
    P2XA7_Pro11.for Sense aggtcatagatcgacctgcc 2296 2315
    P2XR7_Pro12.rev Antisense aagaagcgccaagtcctacg 2785 2804
    P2XR7_Pro14.for Sense gcaatccagactgaagttgac 2051 2071
    P2XR7_Pro15.rev Antisense actctggtctgcagttggtg 2428 2447
    P2XR7_Pro21.for Sense cctttaaaatcagagaccttcaga 1831 1854
    P2XR7_Pro22.for Sense gcccatcctctgaacaccat 2708 2727
    P2XR7_3UTR10.for Sense cccttggaactcttgctatcg 55804 55824
    P2XR7_3UTR1.for Sense ggcagtacagtggcttcaaga 54858 54878
    P2XR7 3UTR2.rev Antisense gtgggacagtttgctgtgcct 55150 55170
    P2XR7_3UTR3.for Sense gagtccttaccaatagcagg 55183 55202
    P2XR7_3UTR4.rev Antisense gtcaaagaatttgtggccacc 55643 55663
    P2XR7_3UTR5.for Sense catgaactgtcttttaatgtgtaaag 55515 55540
    P2XR7_3UTR6.rev Antisense gagatacggtttcaccatgttg 55955 55976
    P2XR7_3UTR7.for Sense aattagctgggcatggtgcg 55992 56011
    P2XR7_ 3UTR8.rev Antisense ttgagatggagtctcgctctg 56122 56140
    P2XR7_3UTR9.rev Antisense cactgtccacgtactgctt 56208 56227
    P2RX7_11.For Sense tcctacttcggtctggtaagagatt 47281 47305
    P2RX7_ 11.Rev Antisense ggcctaattttcgtgcat 47591 47609
    P2RX7_13G.For Sense aagaacctagaacctgagggctt 54333 54355
    P2RX7 _13G.Rev Antisense ttgagatgggaggcagctt 54541 54559
    P2RX7_13H.For Sense ttcggctcccaggacat 54773 54789
    P2RX7_13H.Rev Antisense cacagagctttgcaggtgaa 55248 55267
  • Unter Berücksichtigung des Vorstehenden wird hierin ein diagnostischer Kit für affektive Störungen beschrieben, der eine spezifische Oligonucleotid-Sonde oder Primer entsprechend den P2X7R-Polymorphismen umfasst. Der diagnostische Kit kann eine geeignete Verpackung und Anweisungen zur Verwendung im vorstehend beschriebenen Verfahren umfassen. Der Kit kann weiterhin einen geeigneten Puffer und Enzyme wie reverse Transkriptase und thermostabile Polymerasen umfassen.
  • Die Diagnose kann an einer Maus, einer Ratte oder einem Menschen durchgeführt werden. Die Diagnose wird im Allgemeinen in vitro durchgeführt, z.B. unter Verwendung von Zellen oder einem anderen Material, die/das aus einem Individuum erhalten wurden/wurde. Jedoch kann sie auch an einem lebenden Individuum oder post mortem angewendet werden.
  • Nach der Diagnose einer affektiven Störung kann ein Antidepressivum verschrieben oder verabreicht werden. Die Verabreichung und die Dosierung von Antidepressiva können bei verschiedenen Patienten variieren und sind auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z.B. Benkert und Hippius, „Kompendium der Psychiatrischen Pharmakotherapie", Springer Verlag Publishing, 2000; Albers, „Handbook of Psychiatric Drugs: Auflage 2001–2002", Current Clinical Strategies Pulishing, 2000. Bevorzugte Beispiele schließen ein: zwischen 5 mg und 80 mg pro Tag, vorzugsweise 20 mg, Fluoxetin; zwischen 5 mg und 50 mg pro Tag, vorzugsweise 20 mg, Paroxetin; zwischen 5 mg und 200 mg pro Tag, vorzugsweise 50 mg, Sertralin; zwischen 5 mg und 300 mg pro Tag, vorzugsweise 100 mg, Fluvoxamin; zwischen 5 mg und 100 mg pro Tag, vorzugsweise 30 mg, Mirtazapin; zwischen 4 mg und 50 mg, vorzugsweise 8 mg, Reboxetin; zwischen 5 mg und 600 mg pro Tag, vorzugsweise 200 mg, Nefazodon; zwischen 450 mg und 1800 mg pro Tag, vorzugsweise 900 mg, Lithiumcarbonat.
  • Das P2X7R-Protein kann auch eingesetzt werden, um die Wirksamkeit und/oder Dosierung eines Arzneistoffs oder die Wahrscheinlichkeit, dass ein Patient auf einen Arzneistoff anspricht, zu überwachen. Somit wird hierin ein Verfahren zum Überwachen der Wirksamkeit und/oder Dosierung eines Arzneistoffs, z.B. eines Antidepressivums, und/oder der Wahrscheinlichkeit, dass ein Patient auf den Arzneistoff anspricht, beschrieben, umfassend das Bestimmen des Spiegels der Expression und/oder der Aktivität des P2X7R-Proteins in einem Patienten vor und nach der Verabreichung des entsprechenden Arzneistoffs. Wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird, führt die Behandlung mit einem Antidepressivum zu einer Hochregulation der P2X7R-Aktivität. Bei Menschen kann die P2X7R-Aktivität durch Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder durch Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) unter Verwendung eines radiomarkierten Ligand-Tracers für P2X7R überwacht werden. Beispiele von P2X7R-Liganden können sein, sind jedoch nicht beschränkt auf ATP, einen Antagonisten, der P2X7R bindet, einen Agonisten, der P2X7R bindet, oder ein kleines Polynucleotid, das mindestens 20 Basen des menschlichen P2X7R-Gens umfasst. Eine Modulation von P2X7R-Aktivität, Membranverteilung oder Expressionsspiegeln würde die Aktivität und Wirksamkeit des Antidepressivums zeigen. Verfahren und Techniken, die für eine PET-Analyse erforderlich sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z.B. Paans und Vaalburg, Curr. Phamac. Design 6 (2000), 1583–1591; van Waarde, Curr. Phamac. Design, 6 (2000), 1593–1610; Paans et al., Methods 27 (2002), 195–207; Passchier et al., Methods 27 (2002), 278–286; Laruelle et al., Methods 27 (2002), 287–299.
  • Wenn hierin verwendet, soll der Begriff „Probe" eine beliebige biologische Probe darstellen, die aus einem Individuum, einer Zelllinie, Gewebekultur oder anderen Quelle erhalten wird, die Polynucleotide oder Polypeptide oder Teile davon enthält. Wie angegeben schließen biologische Proben Körperflüssigkeiten (wie Blut, Serum, Plasma, Urin, Synovialflüssigkeit und Spinalflüssigkeit) und Gewebe ein, für die gefunden wurde, dass sie die vorstehend beschriebenen Polynucleotide exprimieren. Verfahren zum Erhalten von Gewebebiopsien und Körperflüssigkeiten von Säugern sind auf dem Fachgebiet bekannt. Eine biologische Probe, die genomische DNA, mRNA oder Proteine einschließt, ist als Quelle bevorzugt.
  • Wie vorstehend beschrieben, können Mutationen des P2X7R-codierenden Gens auf DNA-Ebene oder auf mRNA-Ebene auftreten und zu einer veränderten Expression von P2X7R oder zur Expression von ATP-abhängigen Ionenkanälen P2X7R führen, die im Vergleich zu dem ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R vom Wildtyp, wie hier beschrieben, entweder eine veränderte Funktion oder keine Funktion zeigen. Somit gibt es verschiedene Verfahren auf DNA-Ebene, RNA-Ebene oder Protein-Ebene, mit denen bestimmt werden kann, ob das Gen des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R eine Mutation, wie vorstehend beschrieben, aufweist. Folglich sind mRNA, cDNA, DNA und genomische DNA die bevorzugten Nucleinsäuremoleküle, die in den nachstehend erwähnten Verfahren verwendet werden sollen. Außerdem sind Polypeptide oder Fragmente davon bevorzugt, wenn eine Mutation in dem ATP-abhängigen Ionenkanal-P2X7R-Protein, wie hier beschrieben, bestimmt werden soll.
  • Vorzugsweise kann eine Punktmutation, die zu einem Austausch eines Aminosäurerests an den wie in Tabelle 1 angegebenen Positionen der in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellten entsprechenden Wildtyp-P2X7R-Aminosäuresequenz durch eine andere Aminosäure führt, durch PCR bestimmt werden. Auf die PCR folgt eine Analyse des Restriktionsfragment-Längen-Polymorphismus (RFLP), wenn aufgrund der Punktmutation eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease erzeugt wird, die in der Nucleotidsequenz des Wildtyps nicht vorliegt, oder wenn eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym erzeugt wird, die im Wildtyp-P2X7R nicht vorliegt. Stärker bevorzugt kann die Mutation durch eine PCR unter Verwendung von Primern und Bedingungen bestimmt werden, die nur eine Amplifikation der Nucleotidsequenz des Wildtyps erlauben, welche die entsprechende Wildtyp-Aminosäure an der entsprechenden Position codiert, jedoch nicht der Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls, welches einen anderen Aminosäurerest an der entsprechenden Position codiert. Noch stärker bevorzugt ist es, dass eine PCR zur Bestimmung einer Mutation unter Verwendung von Primern und Bedingungen durchgeführt wird, die keine Amplifikation erlauben, wenn die Wildtyp-Nucleotidsequenz vorliegt, sondern nur dann, wenn ein anderer Aminosäurerest an der entsprechenden Position codiert ist. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren unter Verwendung von PCR und Primern unter Bedingungen, die eine Amplifikation eines Fragments erlauben, das mindestens die Nucleotidreste umfasst, die den Aminosäurerest, entsprechend den Positionen von SEQ ID NO: 1, codieren.
  • Auf die PCR folgt z.B. eine Sequenzierung und/oder eine Einzelstrang-Konformations-Analyse (SSCA). Das Fragment hat vorzugsweise eine Länge von mindestens 25 Nucleotiden, stärker bevorzugt eine Länge von mindestens 50 Nucleotiden, noch stärker bevorzugt eine Länge von mindestens 75 Nucleotiden, besonders bevorzugt eine Länge von mindestens 100 Nucleotiden, mehr besonders bevorzugt eine Länge von mindestens 200 Nucleotiden, noch mehr besonders bevorzugt eine Länge von mindestens 250 Nucleotiden, noch mehr besonders bevorzugt eine Länge von mindestens 300 Nucleotiden und am stärksten bevorzugt eine Länge von mindestens 600 Nucleotiden. Die Primer haben vorzugsweise eine Länge von mindestens 12 Nucleotiden, stärker bevorzugt eine Länge von mindestens 15 Nucleotiden, noch stärker bevorzugt eine Länge von mindestens 18 Nucleotiden und am stärksten bevorzugt eine Länge von mindestens 21 Nucleotiden, wie in den SEQ ID NO: 52 bis 111 dargestellt. Die Temperatur für die Anellierung der Primer beträgt vorzugsweise mindestens 50°C, stärker bevorzugt mindestens 55°C und am stärksten bevorzugt mindestens 58°C. Die Temperatur für die Denaturierung beträgt vorzugsweise mindestens 95°C für vorzugsweise mindestens 10 Sek., stärker bevorzugt mindestens 20 Sek., noch stärker bevorzugt mindestens 30 Sek. und am stärksten bevorzugt mindestens 60 sek. Jedoch kann die Temperatur für die Denaturierung, abhängig von der Länge und dem G-C-Gehalt der zu amplifizierenden Nucleinsäuresequenz, kürzer oder länger angewendet werden. Die Temperatur für die Verlängerung der anellierten Primer wird vorzugsweise mindestens 10 Sek., stärker bevorzugt mindestens 20 Sek., noch stärker bevorzugt mindestens 30 Sek. und am stärksten bevorzugt mindestens 60 Sek. angewendet. Eine die vorstehenden Bedingungen umfassende PCR-Reaktion ist in den nachstehenden Beispielen beispielhaft dargestellt. Die anschließende Sequenzierung und/oder SSCA wird, wie auf dem Fachgebiet bekannt, durchgeführt. Vorzugsweise werden die PCR-Fragmente auf einem 10%-Polyacrylamid-Gel bei 4°C oder auch bevorzugt bei Raumtemperatur aufgetrennt. Die PCR-Fragmente, die in der SSCA eine Bandenverschiebung zeigen, werden mit den Primern unter den vorstehend angegebenen Bedingungen amplifiziert und anschließend sequenziert. Alternativ ist es auch möglich, genomische DNA direkt zu sequenzieren, um zu bestimmen, ob eine Mutation im CLCN2-Gen aufgetreten ist. Das Verfahren einer direkten genomischen Sequenzierung wird z.B. für Bäckerhefe in Horecka, Yeast 16 (2000), 967–970, gezeigt.
  • Vorzugsweise wird eine Deletion unter Verwendung von Hybridisierungsverfahren bestimmt, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Insbesondere wird ein Primer, wie vorstehend beschrieben, entworfen, der in der Lage ist, nur mit der wie in SEQ ID NO: 1 dargestellten genomischen DNA vom Wildtyp zu hybridisieren, nicht jedoch mit einer Nucleotidsequenz, die eine Deletion eines Fragments zwischen den Nucleotiden 54562 und 54582 von SEQ ID NO: 1 umfasst. Außerdem ist ein Verfahren der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) bevorzugt, mit dem an ganzen Chromosomen, insbesondere an Chromosom 12q23-q24, bestimmt wird, dass dieses Chromosom die vorstehend erwähnte Deletion aufweist. Noch stärker bevorzugt ist es, dass eine Deletion von Nucleotidresten, wie hier beschrieben, unter Verwendung einer PCR bestimmt werden kann, wobei der eine Primer eines Primerpaars innerhalb der Region der genomischen DNA liegt, welche die Deletion umfasst. Vorzugsweise liegt diese Deletion zwischen den wie in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nucleotidpositionen 54562 und 54582. Somit wird unter den geeigneten Bedingungen kein PCR-Fragment zustande kommen, wenn die genomische DNA diese Deletion umfasst. Besonders bevorzugt ist es, dass zur Bestimmung der Deletion eine PCR unter Verwendung von Primern durchgeführt wird, die stromaufwärts oder stromabwärts der Deletion liegen. Unter geeigneten Bedingungen, wie vorstehend erwähnt, werden dann sowohl ein Fragment der genomischen DNA der wie in SEQ ID NO: 1 dargestellten Wildtyp-Nucleotidsequenz als auch ein Fragment der Nucleotidsequenz, umfassend eine Deletion vorzugsweise der Nucleotide zwischen den wie in SEQ ID NO: 1 dargestellten Positionen 54562 und 54582, amplifiziert.
  • Außerdem ist es möglich, die vorstehend beschriebenen P2X7R-Mutationen auf Protein-Ebene zu bestimmen. Einige der vorstehend beschriebenen Mutationen führen zu verkürzten Versionen des P2X7R-Proteins. Somit ist es denkbar, dass man das Auftreten dieser Mutationen bestimmen kann, indem man die Länge oder das Molekulargewicht des durch ein Individuum exprimierten P2X7R-Proteins z.B. durch SOS-PAGE ermittelt.
  • Außerdem ist es möglich, die Mutationen des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R, wie hier beschrieben, unter Verwendung von Antikörpern zu bestimmen. Die Antikörper, die für die Mutationen von P2X7R-Proteinen spezifisch sind, werden durch Testverfahren wie Radioimmuntests, kompetitive Bindungstests, Western-Blot-Analyse und ELISA-Test bestimmt. Außerdem sind klassische immunhistologische Verfahren bevorzugt.
  • Die Entdeckung, dass bestimmte Mutationen in dem P2X7R-codierenden Gen und/oder in dem entsprechenden Protein mit einer affektiven Störung in Zusammenhang stehen, zeigt, dass die Nicht- oder Dysfunktion des P2X7R-Proteins für verschiedene Formen von affektiven Störungen verantwortlich ist. Somit ermöglicht die Entdeckung dieser Mutationen nicht nur die Diagnose affektiver Störungen durch die Bestimmung, ob die vorstehend beschriebenen Mutationen in einem Individuum vorkommen. Sie macht auch die Entwicklung einer Behandlung affektiver Störungen möglich, bei denen diagnostiziert worden ist, dass sie durch eine Mutation in dem P2X7R-codierenden Gen zustande kommen. Eine solche Behandlung kann z.B. die Einführung eines Nucleinsäuremoleküls, welches ein nicht-funktionelles oder funktionelles Wildtyp-P2X7R-Protein codiert, wodurch in diesem Individuum die P2X7R-Aktivität wiederhergestellt wird, oder die Aktivierung oder Repression eines P2X7R-Gens (von P2X7R-Genen) in vivo umfassen. Der Begriff „Aktivierung oder Repression" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Expression des Gens entweder gesteigert wird (Aktivierung) oder reduziert wird (Repression). Eine Steigerung der Expression kann z.B. erreicht werden, indem die Wirksamkeit der Transkriptions-Initiation z.B. durch Verwendung geeigneter Verbindungen erhöht wird, die eine aktivierende Wirkung auf die Transkription ausüben. Alternativ kann eine Steigerung erreicht werden, indem der natürlich vorkommende Promotor durch einen effizienteren Promotor ersetzt wird.
  • Eine Repression kann erreicht werden, indem die Expression des Gens unterdrückt wird, z.B. indem spezifisch die Transkription aus dem entsprechenden Promotor durch geeignete Verbindungen unterdrückt wird oder indem der Promotor weniger effizient oder nicht-funktionell gemacht wird.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform sollen die hier beschriebenen Verfahren oder Verwendungen affektive Störungen behandeln, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus schwerer Depression, generalisierter Angststörung und bipolarer Störung besteht.
  • Ebenfalls offenbart ist hierin ein Arzneimittel. Der Begriff „Arzneimittel" betrifft eine Zusammensetzung, umfassend ein Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die einen ATP-abhängigen Ionenkanal P2X7R codiert und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
    • (a) einer Nucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz, wie in SEQ ID NO: 3 oder 4 dargestellt, umfasst;
    • (b) einer Nucleotidsequenz, die die Nucleotidsequenz, wie in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellt, umfasst;
    • (c) einer Nucleotidsequenz, die an die Nucleotidsequenz von (a) oder (b) hybridisiert; und
    • (d) einer Nucleotidsequenz, die auf Grund des genetischen Codes für die Nucleotidsequenz von (c) degeneriert ist.
  • Solche Arzneimittel umfassen eine pharmazeutisch wirksame Menge eines ein funktionelles P2X7R-Protein codierenden Nucleinsäuremoleküls und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Das Arzneimittel kann einem Patienten mit einem physiologisch verträglichen Träger verabreicht werden, wie hierin beschrieben. In einer spezifischen Ausführungsform bedeutet der Begriff „pharmazeutisch verträglich" von einer Regulierungsbehörde oder einer anderen allgemein anerkannten Pharmacopoe für den Gebrauch bei Tieren und insbesondere bei Menschen zugelassen. Der Begriff „Träger" bezieht sich auf ein Verdünnungsmittel, ein Adjuvans, einen Exzipienten oder ein Vehikel, mit dem das Therapeutikum verabreicht wird.
  • Solche pharmazeutische Träger können sterile Flüssigkeiten sein, wie Wasser und Öle einschließlich solcher, die aus Petroleum, Tieren, Pflanzen stammen oder synthetischen Ursprungs sind, wie Erdnussöl, Sojaöl, Mineralöl, Sesamöl und ähnliche. Wasser ist ein bevorzugter Träger, wenn das Arzneimittel intravenös verabreicht wird. Salzlösungen und wässrige Dextrose- und Glycerinlösungen können ebenfalls als flüssige Träger verwendet werden, insbesondere für injizierbare Lösungen. Geeignete pharmazeutische Exzipienten schließen Stärke, Glucose, Lactose, Saccharose, Gelatine, Malz, Reis, Mehl, Kreide, Silicagel, Natriumstearat, Glycerinmonostearat, Talk, Natriumion, getrocknete Magermilch, Glycerin, Propylenglykol, Wasser, Ethanol und ähnliche. Die Zusammensetzung kann, falls gewünscht, auch geringe Mengen an Benetzungsmitteln oder Emulgatoren oder pH-Puffermittel enthalten. Diese Zusammensetzungen können in der Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Pulver, Formulierungen mit verzögerter Freigabe und ähnlichen vorliegen. Die Zusammensetzung kann als Suppositorium mit herkömmlichen Bindemitteln und Trägern wie Triglyceriden formuliert sein. Orale Formulierungen können Standardträger wie Mannit, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat pharmazeutischer Qualität usw. enthalten. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind in „Remington's Pharmaceutical Sciences" von E. W. Martin beschrieben. Solche Zusammensetzungen enthalten eine pharmazeutisch wirksame Menge der vorstehend erwähnten Verbindungen, vorzugsweise in gereinigter Form, zusammen mit einer geeigneten Trägermenge, um so die Form für eine geeignete Verabreichung an den Patienten bereitzustellen. Die Formulierung sollte der Verabreichungsart entsprechen.
  • Bevorzugt ist die Zusammensetzung gemäß Standardverfahren als Arzneimittel für die intravenöse Verabreichung an Menschen formuliert. Normalerweise sind Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung Lösungen in sterilem, wässrigem, isotonischem Puffer. Wo erforderlich, kann die Zusammensetzung ein Solubilisierungsmittel und ein lokales Anästhetikum wie Lignocain zur Schmerzlinderung an der Injektionsstelle einschließen. Im Allgemeinen werden die Bestandteile entweder einzeln oder in Form von Einheitsdosierungen gemischt, zum Beispiel in Form eines trockenen lyophilisierten Pulvers oder eines wasserfreien Konzentrats in einem hermetisch dichten Behältnis wie einer Ampulle oder einem kleinen Beutel, auf der die Wirkstoffmenge angegeben ist, geliefert. Wenn die Zusammensetzung durch Infusion verabreicht werden soll, kann sie mithilfe einer Infusionsflasche, die steriles Wasser oder sterile Salzlösung pharmazeutischer Qualität enthält, verabreicht werden. Wenn die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser zur Injektion oder Salzlösung bereitgestellt werden, so dass die Bestandteile vor der Verabreichung gemischt werden können.
  • Das Arzneimittel kann in neutraler Form oder Salzform formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze schließen jene Salze ein, die mit Anionen gebildet sind, wie diejenigen, die von Salzsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure usw. abgeleitet sind, und jene, die mit Kationen gebildet sind, wie diejenigen, die von Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium, Eisenhydroxiden, Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain usw. abgeleitet sind.
  • Gegebenenfalls können in vitro-Tests verwendet werden, um die optimale Dosierungsbereiche zu bestimmen. Die genaue Dosis, die in der Formulierung verwendet werden soll, hängt auch von der Verabreichungsart und dem Grad der Erkrankung oder Störung ab und sollte nach Ermessen des Arztes und entsprechend den individuellen Gegebenheiten des einzelnen Patienten festgelegt werden. Wirksame Dosen können von Dosis-Wirkungs-Kurven aus in vitro-Testsystemen oder Tiermodellversuchssystemen hergeleitet werden. Vorzugsweise wird das Arzneimittel direkt oder in Kombination mit einem Adjuvans verabreicht.
  • Das Arzneimittel ist vorzugsweise für die Anwendung in der Gentherapie entwickelt. Das Verfahren der Gentherapie ist bereits vorstehend in Zusammenhang mit den Nucleinsäuremolekülen beschrieben worden und die vorstehenden Ausführungen sind auch auf das Arzneimittel anzuwenden. So weist das Nucleinsäuremolekül im Arzneimittel bevorzugt eine Form auf, die seine Einführung, Expression und/oder stabile Integration in die Zellen eines zu behandelnden Individuums erlaubt.
  • Für die Gentherapie können verschiedene virale Vektoren verwendet werden, zum Beispiel Adenovirus, Herpesvirus, Vacciniavirus oder bevorzugt ein RNA-Virus wie ein Retrovirus. Beispiele für retrovirale Vektoren, in die ein einzelnes fremdes Gen eingeführt werden kann, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: murines Moloney-Leukämievirus (MoMuLV), murinen Harvey-Sarkom-Virus (HaMuSV), murines Mammatumorvirus (MuMTV) und Rous-Sarkomvirus (RSV). Eine Reihe zusätzlicher retroviraler Vektoren kann ebenfalls multiple Gene einschließen. Alle dieser Vektoren können ein Gen für einen selektierbaren Marker transferieren oder inkorporieren, so dass transduzierte Zellen identifiziert und erzeugt werden können. Durch die Einführung einer P2X7R-Sequenz von Interesse, die ein funktionelles P2X7R-Protein codiert, in einen viralen Vektor zusammen mit einem anderen Gen, das beispielsweise den Liganden für einen Rezeptor auf einer spezifischen Zielzelle codiert, wird der Vektor zielspezifisch.
  • Retrovirale Vektoren können dadurch zielspezifisch gemacht werden, indem zum Beispiel ein Polynucleotid eingeführt wird, das einen Zucker, ein Glycolipid oder ein Protein codiert. Dem Fachmann sind spezifische Polynucleotidsequenzen bekannt, die in das retrovirale Genom eingeführt werden können, um Ziel-spezifische Abgabe des retroviralen Vektors, der die eingeführte Polynucleotidsequenz enthält, zu ermöglichen, oder er kann diese ohne unzumutbaren Aufwand ermitteln.
  • Da rekombinante Retroviren vorzugsweise defekt sind, erfordern sie eine Unterstützung, um infektiöse Vektorpartikel zu produzieren. Diese Unterstützung kann zum Beispiel darin bestehen, dass man Helferzelllinien verwendet, die Plasmide enthalten, die alle strukturellen Gene des Retrovirus unter der Kontrolle regulatorischer Sequenzen innerhalb der LTR codieren. Diesen Plasmiden fehlt eine Nucleotidsequenz, die den Verpackungsmechanismus in die Lage versetzt, ein RNA-Transkript für die Einkapselung zu erkennen. Helferzelllinien, die Deletionen des Verpackungssignals aufweisen, schließen zum Beispiel w2, PA317 und PA12 ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Diese Zelllinien produzieren leere Virionen, da kein Genom gepackt ist. Wenn ein retroviraler Vektor in Zellen eingeführt wird, in denen das Verpackungssignal intakt ist, die strukturellen Gene jedoch durch andere Gene von Interesse ersetzt sind, kann der Vektor verpackt werden und Vektorvirion produziert werden. Alternativ können NIH 3T3- oder andere Gewebekulturzellen mittels der herkömmlichen Calcium-Phosphat-Transfektion direkt mit Plasmiden, die die retroviralen strukturellen Gene gag, pol und env codieren, transfiziert werden. Diese Zellen sind dann mit dem Vektorplasmid transfiziert, das die Gene von Interesse enthält. Die daraus resultierenden Zellen geben den retroviralen Vektor in das Kulturmedium ab. Ein anderes System für die zielspezifische Abgabe für P2X7R-Polynucleotide ist ein kolloidales Dispersionssystem. Kolloidale Dispersionssysteme schließen makromolekulare Komplexe, Nanokapseln, Mikrosphären, Kügelchen und lipidbasierte Systeme einschließlich Wasser-in-Öl-Emulsionen, Mizellen, Mischmizellen und Liposomen ein. Das bevorzugte kolloidale System ist ein Liposom. Liposomen sind künstliche Membranvesikel, die in vitro und in vivo als Abgabevehikel nützlich sind. Es wurde gezeigt, dass große unilamellare Vesikel (LUV), deren Größe im Bereich von 0,2–4,0 pm liegt, einen wesentlichen Prozentsatz eines wässrigen, große Makromoleküle enthaltenden Puffers einkapseln können. RNA, DNA und intakte Virionen können innerhalb des wässrigen Inneren eingekapselt werden and in einer biologisch aktiven Form an Zellen abgegeben werden (Fraley et al., Trends Biochem. Sci. 6 (1981) 77). Außer Säugerzellen wurden Liposomen für die Abgabe von Polynucleotiden in Pflanzen-, Hefe- und Bakterienzellen verwendet. Damit ein Liposom ein wirksames Vehikel für den Gentransfer ist, sollten die folgenden Eigenschaften gegeben sein: (1) hochwirksame Einkapselung der Gene von Interesse ohne Beeinträchtigung ihrer biologischen Aktivität; (2) bevorzugte und wesentliche Bindung an eine Zielzelle im Vergleich zu Nicht-Zielzellen; (3) hochwirksame Abgabe des wässrigen Vesikelinhalts an das Zielzellcytoplasma; und (4) genaue und und wirksame Expression genetischer Information (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988) 682). Die Zusammensetzung der Liposomen ist normalerweise eine Kombination von Phospholipiden, insbesondere Phospholipide mit hoher Phasenübergangstemperatur, gewöhnlich in Kombination mit Steroiden, insbesondere Cholestrin. Andere Phospholipide oder andere Lipide können ebenfalls verwendet werden. Die physikalischen Eigenschaften von Liposomen hängen von pH-Wert, Ionenstärke und dem Vorhandensein divalenter Kationen ab. Beispiele von Lipiden, die für die Liposomenproduktion nützlich sind, schließen Phosphatidylverbindungen wie Phosphatidylglycerin, Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin, Sphingolipide, Cerebroside und Ganglioside ein. Besonders nützlich sind Diacylphosphatidylglycerine, bei denen der Lipidrest von 14 bis 18 Kohlenstoffatome, insbesondere von 16 bis 18 Kohlenstoffatome enthält und gesättigt ist. Beispielhafte Phospholipide schließen Ei-Phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin und Distearoylphosphatidylcholin ein. Das Targeting von Liposomen kann auf der Grundlage anatomischer und mechanischer Faktoren klassifiziert werden. Die anatomische Klassifikation beruht auf dem Grad der Selektivität, z.B. organspezifisch, zellspezifisch und organellenspezifisch. Beim mechanisches Targeting lässt sich unterscheiden, ob es aktiv oder passiv erfolgt. Passives Targeting verwendet die natürliche Tendenz von Liposomen, sich auf Zellen des reticuloendothelialen Systems (RES) in Organen, die sinusoidale Kapillaren enthalten, zu verteilen.
  • Unter Berücksichtigung des Vorstehenden wird hierin die Verwendung des Arzneimittels, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die einen funktionellen ATP-abhängigen Ionenkanal, wie hierin beschrieben, codiert, in einem Verfahren zur Behandlung einer affektiven Störung beschrieben, wobei die Verwendung die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge des Arzneimittels an ein an dieser Störung leidendes Individuum umfasst.
  • Wenn hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Individuum" ein Einzelwesen, die einer Behandlung einer affektiven Störung bedarf. Bevorzugt ist das Individuum ein Wirbeltier, noch stärker bevorzugt ein Säuger, besonders bevorzugt ein Mensch.
  • Der Begriff „verabreicht" bedeutet Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosis des oben erwähnten Nucleinsäuremoleküls, das ein funktionelles P2X7R-Protein codiert, an ein Einzelwesen. Unter „therapeutisch wirksamer Menge" ist eine Dosis zu verstehen, die die Wirkungen, auf die ihre Verabreichung abzielt, hervorruft. Die genaue Dosis hängt vom Behandlungszweck ab und kann von einem Fachmann unter Verwendung bekannter Verfahren überprüft werden. Wie auf dem Fachgebiet bekannt und vorstehend beschrieben, kann es erforderlich sein, Anpassungen hinsichtlich systemischer versus lokalisierter Abgabe, Alter, Körpergewicht, allgemeinem Gesundheitszustand, Geschlecht, Ernährung, Verabreichungszeit, Wechselwirkung mit anderen Arzneistoffen und Schwere des Krankheitszustandes vorzunehmen, die anhand von Standardversuchen durch den Fachmann festzulegen sind.
  • Die Verwendungen sind sowohl für die Humantherapie als auch für veterinärmedizinische Anwendungen geeignet. Die hierin beschriebenen Verbindungen, die die gewünschte therapeutische Aktivität aufweisen, können, wie hierin beschrieben, einem Patienten in einem physiologisch verträglichen Träger verabreicht werden. Abhängig von der Art der Einbringung können die Verbindungen auf verschiedene Weise formuliert werden. Die Konzentration der therapeutisch wirksamen Verbindung kann von etwa 0.1–100 Gew.-% variieren. Die Wirkstoffe können allein oder in Kombination mit anderen Behandlungen verabreicht werden.
  • Die Verabreichung des Arzneimittels kann, wie vorstehend erläutert, auf unterschiedliche Weise erfolgen, einschließlich der folgenden Verabreichungsarten, aber nicht auf diese beschränkt: oral, subkutan, intravenös, intraarteriell, intranodal, intramedullär, intrathekal, intraventrikulär, intranasal, intrabronchial, transdermal, intranodal, intrarektal, intraperitoneal, intramuskulär, interpulmonal, vaginal, rektal oder intraokular. In einigen Fällen, zum Beispiel bei der Behandlung von Wunden und Entzündungen, können die in Frage kommenden Wirkstoffe direkt als Lösung in Form eines Trockensprays angewendet werden.
  • Der Dosierungsplan wird durch den behandelnden Arzt und aufgrund klinischer Faktoren festgelegt. Wie auf dem Gebiet der Medizin bekannt, hängt die Dosierung für den einzelnen Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Körpergröße des Patienten, der Körperoberfläche, des Alters, der zu verabreichenden spezifischen Verbindung, des Geschlechts, der Verabreichungszeit und -art, des allgemeinen Gesundheitszustandes und anderer Arzneistoffe, die gleichzeitig verabreicht werden. Eine typische Dosis kann beispielsweise im Bereich von 0,001 bis 1.000 μg liegen; jedoch sind auch Dosen unterhalb oder oberhalb dieses Bereichs denkbar, insbesondere unter Berücksichtigung der oben erwähnten Faktoren.
  • Die Dosen werden bevorzugt einmal pro Woche verabreicht, können jedoch bei fortschreitender Behandlung in viel längeren Zeitintervallen gegeben werden und notfalls auch in viel kürzeren Zeitintervallen, z.B. täglich, gegeben werden. In einem bevorzugten Fall wird die Immunantwort gemäß hierin beschriebener Verfahren sowie weiteren dem Fachmann bekannter Verfahren kontrolliert und die Dosen z.B. in Bezug auf Zeit, Menge und/oder Zusammensetzung optimiert. Die Dosierungen werden variieren, jedoch beträgt eine bevorzugte Dosis zur intravenösen Verabreichung von DNA zwischen etwa 106 bis 1012 Kopien des DNA-Moleküls. Wenn eine Dauerinfusion verordnet wurde, sollten sie auch im Bereich von 1 μg bis 10 mg Einheiten pro Kilogramm Körpergewicht pro Minute sein. Der Verlauf kann mittels periodischer Messungen kontrolliert werden. Das Arzneimittel kann lokal oder systemisch verabreicht werden. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise parenteral, z.B. intravenös. Formulierungen für die parenterale Verabreichung schließen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Wässrige Träger schließen Wasser, Alkohol-Wasser-Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösung und gepufferter Medien, ein. Parenterale Träger schließen Natriumionenlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumion, Ringer-Lactat-Lösung oder fette Öle ein. Intravenöse Vehikel schließen Flüssigkeits- und Nährstoff-Ergänzungslösungen, Elektrolytergänzungs-lösungen (wie auf Ringer-Dextrose basierende Lösungen) und ähnliche ein. Konservierungsstoffe und andere Zusatzstoffe wie beispielsweise antimikrobielle Wirkstoffe, Antioxidanzien, Chelatbildner, inerte Gase und ähnliche können ebenfalls verwendet werden.
  • Es ist auch vorgesehen, dass die Arzneimittel in Ko-Therapieansätzen verwendet werden, d.h. zusammen mit anderen Medikamenten oder Arzneistoffen verabreicht werden, z.B. Arzneistoffen zur Verhinderung, Behandlung oder Besserung affektiver Störungen.
  • Des Weiteren wird hierin ein Arzneimittel beschrieben, umfassend eine Verbindung, deren Verabreichung an Zellen zu einer Reduktion oder einer Steigerung der Expression einer einen ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanal codierenden Nucleinsäure in den Zellen führt, oder ein Nucleinsäuremolekül, dessen Expression in Zellen oder Verabreichung an Zellen zu einer Reduktion oder einer Steigerung der Expression einer einen ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanal codierenden Nucleinsäure in den Zellen führt. Das Arzneimittel kann für die Behandlung von Individuen verwendet werden, die eine erhöhte oder reduzierte Menge des P2X7R-Proteins oder einen erhöhten oder reduzierten Expressionsspiegel aufweisen, wie hierin vorstehend beschrieben. Vorzugsweise führt das Arzneimittel zu einer Steigerung der Expression einer einen ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanal codierenden Nucleinsäure in den Zellen.
  • Es ist vorgesehen, dass das vorstehend erwähnte Arzneimittel, dessen Verabreichung an Zellen zu einer Reduktion der Expression einer einen ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanal codierenden Nucleinsäure führt, eine Antisense-Nucleinsäure, ein Rybozym, eine co-suppressive Nucleinsäure, iRNA oder siRNA ist.
  • Ein siRNA-Ansatz ist beispielsweise in Elbashir (Nature 411(2001), 494–498) beschrieben. Es ist auch vorgesehen, dass zum Beispiel kurze Haarnadel-RNAs (shRNAs) als Arzneimittel verwendet werden. Der shRNA-Ansatz zur Genverstummung ist auf dem Fachgebiet bekannt und kann die Verwendung von st (small temporal) RNAs einschließen; s. u.a. Paddison, Genes Dev. 16 (2002), 948–958.
  • Wie vorstehend erwähnt, sind Genverstummungs-Ansätze auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen „RNA"-Ansätze mit RNAi oder siRNA. Die erfolgreiche Anwendung solcher Ansätze wurde gezeigt in: Paddison (2002) a.a.O., Elbashir, Methods 26, (2002) 199–213; Novina Mat. Med. June 3 (2002); Donze Nucl. Acids Res. 30 (2002), e46; Paul, Nat. Biotech. 20 (2002), 505–508; Lee, Nat. Biotech. 20 (2002), 500–505; Miyagashi, Nat. Biotech. 20 (2002) 497–500; Yu, PNAS 99 (2002), 6047–6052 oder Brummelkamp, Science 296 (2002), 530–553. Diese Ansätze können auf einem Vektor basieren, z.B. dem pSUPER-Vektor, oder es können RNA-PolIII-Vektoren verwendet werden, wie u.a. gezeigt in Yu (2002) a.a.O., Miyagishi (2002) a.a.O. oder Brummelkamp (2002) a.a.O.
  • Eine Verbindung, die zu einer Reduktion der Expression des P2X7R-Gens führt, kann z.B. eine Verbindung sein, die auf die regulatorische Region des Gens einwirkt und dadurch die Transkriptionsrate herabsetzt. Solche Verbindungen können durch Verfahren, wie hierin nachstehend beschrieben, identifiziert werden.
  • Hierin beschrieben wird die Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls, das ein funktionelles P2X7R-Protein, wie hierin beschrieben, codiert, in Verbindung mit dem Arzneimittel für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer affektiven Störung.
  • Ein anderer hierin beschriebener Aspekt ist ein Arzneimittel, das u.a. die Polynucleotide, wie vorstehend beschrieben, umfasst, d.h. Polynucleotide, die Mutationen und/oder Deletionen, wie hierin vorstehend beschrieben, umfassen. Solche Arzneimittel können z.B. für die Behandlung von Individuen verwendet werden, die eine erhöhte oder verminderte Menge an P2X7R-Protein aufweisen oder ein P2X7R-Protein aufweisen, das gesteigerte oder verminderte Aktivität zeigt, die, wie hierein vorstehend beschrieben, bestimmt werden kann. Bevorzugt kann ein solches Arzneimittel für die Behandlung von Individuen verwendet werden, die eine verminderte Menge des P2X7R-Proteins aufweisen oder ein P2X7R-Protein aufweisen, das verminderte Aktivität zeigt, die, wie hierin vorstehend beschrieben, bestimmt werden kann. Es ist vorgesehen, dass z.B. ein nicht-funktionelles oder bevorzugt hyperfunktionelles P2X7R-Protein, das von dem Arzneimittel umfasst ist, in einen P2X7R-Komplex eingebaut ist, der natürlicherweise in den Zellen vorliegt, wie hierin oben beschrieben. Es ist auch vorgesehen, dass die vorstehend beschriebenen Verfahren für die Gentherapie zur Behandlung eines Individuums mit den wie vorstehend beschriebenen Nucleinsäuremolekülen mutatis mutandis verwendet werden können.
  • Hinsichtlich der möglichen Verabreichungsarten gilt das Gleiche, wie vorstehend dargelegt.
  • Darüber hinaus wird hierin die Verwendung der Nucleinsäuremoleküle, der Vektoren, der Polypeptide, des Antikörpers und/oder des Aptamers, wie vorstehend beschrieben, für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer affektiven Störung beschrieben.
  • Ein weiterer hierin beschriebener Aspekt ist die Verwendung eines Modulators der P2X7R-Aktivität oder der Expression für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer affektiven Störung. Wenn hierin verwendet, bedeutet der Begriff „Modulator" (eine) Verbindung(en), einen Komplex von Verbindungen, (einen) Stoff(e) oder einen Komplex von Stoffen, die die Aktivität von P2X7R oder die Expression von P2X7R entweder direkt oder indirekt modifizieren, d.h. modulieren, können. Die Modulation kann zum Beispiel auf Proteinebene erfolgen. Insbesondere kann das P2X7R-Protein mit dem Modulator so interagieren, dass seine Aktivität entweder verstärkt oder vermindert wird. Die Modulation kann auch auf der Ebene der Nucleinsäure erfolgen. Und zwar wird das Gen häufiger oder weniger häufig transkribiert, was zu einer Zunahme oder Abnahme der Proteinmenge führt. Die Modulation kann auch die RNA- oder Proteinstabilität beeinflussen. Da überraschend festgestellt wurde, dass Agonisten von P2X7R zu einer Besserung der Symptome bei Mäusen führen, die aufgrund von Angstzuständen und depressivem Verhalten ausgewählt wurden, ist der Modulator der P2X7R-Aktivität, der für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer affektiven Störung verwendet wird, ein Agonist. Der Begriff „Agonist" bedeutet ein Agens oder eine Verbindung, die mit einem Rezeptor interagieren und eine physiologische oder pharmakologische Antwort, die für diesen Rezeptor charakteristisch ist, auslösen kann. Beispiele für P2X7R-Agonisten schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf ATP, ATP-4, BzATP (2'-3'-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosin-5'-triphosphat (C24H24N5O15P3)) und Tenidap (5-Chlor-2,3-dihydro-2oxo-3-(2-thienylcarbonyl)indol-1-carboxamid, d.h. C15H11ClN2O2S) oder ein Derivat davon. Besonders bevorzugt ist der Agonist zur Behandlung von Depression oder Angstzuständen BzATP, wie hierin nachstehend in Beispiel 9 gezeigt.
  • Obwohl beschrieben wurde, das die Aktivierung von P2X7R in vitro Apoptose und Zelltod induzieren kann (Di Virgilio et al., Cell Death Differ. 5 (1988), 191–199; Virginio et al., J. Physiol. 519 (1999) 335–346), zeigt die vorliegende Anmeldung hierin nachstehend in Beispiel 9, dass die Behandlung des Gehirns von Mäusen mit BzATP, die aufgrund von Angstzuständen und depressivem Verhalten ausgewählt wurden, keine wesentlichen Unterschiede hinsichtlich der Anzahl apoptotischer Zellen bei Kontrollmäusen im Vergleich zu mit BzATP behandelten Mäusen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die P2X7R-Aktivierung nicht zum Tod zerebraler Zellen in vivo führte, was BzATP somit zum Kandidaten für einen Arzneistoff zur Behandlung affektiver Störungen macht.
  • Da überraschend festgestellt wurde, dass P2X7R-Agonisten die Symptome bei Mäusen bessert, die aufgrund von Angstzuständen und depressivem Verhalten ausgewählt wurden, betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform die Verwendung eines Agens, das die P2X7R-Aktivität moduliert, wobei das Agens ein Agonist von P2X7R ist, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung affektiver Störungen wie Angstzustände oder depressivem Verhalten. Noch überraschender ist die in Beispiel 10 dargelegte Erkenntnis der vorliegenden Anmeldung, dass P2X7R-Antagonisten keine antidepressiven Wirkungen haben, obgleich dies der Lehre des Stands der Technik entspricht, z.B. beschreiben WO 03/042190 , WO 03/042191 , WO 03/049353 oder US 2004/0029841 . WO 03/042190 , WO 03/042191 , WO 03/059353 oder US 2004/0029841 Zusammensetzungen von P2X7R-Antagonisten und Verfahren zur Behandlung P2X7-vermittelter Erkrankungen mittels Verabreichung dieser Verbindungen. Während der Stand der Technik einen Zusammenhang zwischen P2X7R und z.B. der Behandlung von Depressionen herstellen kann, wird jedoch im Allgemeinen angenommen, dass P2X7R-Antagonisten in der Behandlung z.B. einer Depression verwendet werden müssen. Somit war die Erkenntnis der vorliegenden Erfindung, dass Antagonisten keine antidepressiven Wirkungen haben, sondern vielmehr P2X7R-Agonisten antidepressive Wirkung haben, nicht zu erwarten und war daher umso überraschender. Die vorliegende Anmeldung stellt daher unter anderem die Grundlage für die Entwicklung wirksamer Medikamente mit therapeutischem Nutzen hinsichtlich beispielsweise Depressionen bereit. Insbesondere Medikamente, die einen P2X7R-Agonisten umfassen, sind wirksam bei der Behandlung affektiver Störungen, insbesondere der Behandlung der hierin erwähnten Störungen und insbesondere bei der Behandlung von Depressionen. Beispiele für P2X7R-Agonisten schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf ATP, ATP-4, BzATP (2'-3'-O(4-Benzoylbenzoyl)adenosin-5'-triphosphat (C24H24N5O15P3)). Bevorzugt ist der P2X7R-Agonist, der für die Behandlung von affektiven Störungen verwendet wird, BzATP. Stärker bevorzugt wird BzATP verwendet, um, wie hierin nachstehend in Beispiel 9 gezeigt, Depressionen oder Angstzustände zu behandeln.
  • Die vorliegende Anmeldung enthält ein weiteres unerwartetes Ergebnis, nämlich dass die chemische Verbindung mit dem Namen Tenidap auch die Funktion eines Modulators (d.h. eines Agonisten) von P2X7R hat und daher für die Behandlung von affektiven Störungen verwendet werden kann. Bisher wurden verschiedene medizinische Anwendungen für Tenidap oder ein Derivat davon beschrieben. Die Verwendung von Tenidap oder eines Derivats davon für die Behandlung affektiver Störungen ist jedoch weder bekannt, noch wird sie im Stand der Technik vorgeschlagen. Demgemäß betrifft die vorliegende Anmeldung die Verwendung von Tenidap oder 3-substituierten 2-Oxindol-1-carboxamiden für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer affektiven Störung. Natürlich ist auch die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge von Tenidap oder 3-substituierten 2-Oxindol-1-carboxamiden für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer affektiven Störung vorgesehen.
  • Die Zusammensetzung von Tenidap (5-Chloro-2,3-dihydro-2-oxo-3-(2-thienylcarbonyl)-indol-1-carboxamid, d.h. C15H11ClN2O2S)) mit der folgenden Strukturformel
    Figure 00650001
    und anderer 3-substituierter 2-Oxindol-1-carboxamide und ihre Verwendung als antientzündliche oder analgetische Wirkstoffe und als Inhibitoren sowohl von Cyclooxygenase (Cox)- als auch von Lipoxygenase (5-LPO)-Enzymen wurde erstmals in US 4,556,672 offenbart. Natürlich kann die Zusammensetzung Tenidap vielfach modifiziert werden, beispielsweise durch die Modifikation von Seitengruppen oder Atomen, was auf dem Fachgebiet bekannt sind.
  • Derivate von Tenidap oder von 3-substituierten 2-Oxindol-Derivaten sind beispielsweise beschrieben in: US 4,556,672 ; US 4,658,037 ; US 4,721,712 ; US 5,290,802 ; US 5,118,703 ; US 5,270,331 ; US 5,298,522 , US 5,086,186 ; US 5,449,788 und US 5,795,902 . Verschiedene Verfahren für die Synthese von Tenidap und anderer 3-substituierter 2-Oxindol-1-carboxamiden sind auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z.B. US 4,652,658 ; US 4,665,194 ; US 4,952,703 ; EP-B1 155 828 ; WO 90/04393 ; WO 94/07488 ; WO 94/17061 ; WO 95/20574 ; WO 97/36895 ; van Deurzen et al., J. Mol. Catal. B-Enzym., 2 (1996), 33–42; Porcs-Makkay und Simig, Org. Process. Res. Dev., 4 (2000), 10–16; Kumar et al., Org. Process. Res. Dev., 5 (2001), 61–64. Die wasserfreie, kristalline Form des Natriumsalzes von Tenidap ist beschrieben in: US 5,036,099 und WO 88/05656 . Eine injizierbare Zusammensetzung und ein Arzneimittel für die rektale Verabreichung von Tenidap sind in EP-B1 508 311 bzw. EP-B1 508 310 erwähnt. Im Stand der Technik wir ebenfalls beschrieben, dass Tenidap oder ein Derivat davon in Kombination mit Tetracyclin ( US 5,308,839 ) oder Methotrexat ( WO 96/35419 ) zur Behandlung von rheumatoider Arthritis verabreicht werden kann. Die Hemmung der Photozersetzung von Tenidap und anderer 3-substituierter 2-Oxindol-1 carboxamide ist in WO 96/33701 beschrieben.
  • Weitere Anwendungen von Tenidap oder eines Derivats davon sowie anderer 3-substituierter 2-Oxindol-1-carboxamide wurden beschrieben für die Hemmung der Interleukin-1-Biosynthese in Säugern und für die Behandlung von Interleukin-1 vermittelten Störungen ( US 4,861,794 ), für die Hemmung der Elastasefreisetzung aus Neutrophilen ( US 5,006,547 ), für die Suppression der T-Zell-Funktion in Säugern und für die Behandlung von T-Zell vermittelten Autoimmunstörungen systemischer oder organspezifischer Art ( US 4,853,409 ; Dolhain et al., Scand. J. Immunol. 42 (1995), 686–693). Tenidap wird auch zur Behandlung der Alzheimerschen Krankheit verwendet ( WO 96/31209 ; US 5,545,656 ).
  • Es wurde auch festgestellt, dass Tenidap oder ein Derivat davon oder seine pharmazeutisch verträglichen Basensalze die Kollagenaseaktivierung in Säugern hemmen, Kollagenase-vermittelte Störungen und Erkrankungen in Säugern behandeln und die Myeloperoxidaseaktivität in Säugern hemmen ( US 5,008,283 ). Tenidap kann das Gesamtserumcholesterin, LDL-Cholesterin und Triglyceride reduzieren ( US 5,122,534 ) und es kann zur Behandlung von Ischämie-bedingter Herzmuskelverletzung und Cytokin-vermittelter Herzmuskelverletzung verwendet werden ( EP-B1 679 396 ). Jedoch offenbart keines der vorstehend erwähnten Dokumente eine Verwendung von Tenidap oder Derivaten davon oder 3-substituierter 2-Oxindol-1-carboxamide zur Behandlung von beispielsweise affektiven Störungen wie Depression.
  • In Sanz et al., Eur. J. Pharmacol. 355 (1998), 235–244 wird nahegelegt, dass Tenidap die Aktivität des P2X7R-Rezeptors steigern kann. Es wird nahegelegt, dass die Wirkung von Tenidap auf einer Erhöhung der ATP-Spiegel oder einer Verbesserung der ATP-Wirkung auf P2X7 beruhen kann. ATP ist der natürliche Ligand von P2X7R. Demgemäß ist Tenidap oder ein Derivat davon ein Modulator (d.h. ein Agonist) von P2X7R, wie hierin beschrieben, da gemäß der Definition ein Modulator die Aktivität oder die Expression von P2X7R entweder direkt oder indirekt moduliert. Unter Anwendung der Lehre der vorliegenden Erfindung, dass Modulatoren (d.h. Agonisten) von P2X7R für die Behandlung von affektiven Störungen nützlich sind, ist es vorgesehen, dass Tenidap oder ein Derivat davon als Modulator (d.h. als Agonist) der P2X7R-Aktivität für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer affektiven Störung verwendet wird; Beispiele hierfür sind hier beschrieben. Die Herstellung von Arzneimitteln, die Verabreichungsarten usw. sind vorstehend und nachstehend beschrieben und sind mutatis mutandis auf die Verwendung von Tenidap oder des vorstehend erwähnten Derivats für die Herstellung eines Arzneimittels anzuwenden. Darüber hinaus gilt das, was hierin bezüglich der Verwendungen zur Behandlung von affektiven Störungen beschrieben ist, mutatis mutandis für die Verwendung von Tenidap oder des vorstehend erwähnten Derivats zur Behandlung affektiver Störungen.
  • Die vorliegende Anmeldung sieht des Weiteren vor, dass Modulatoren (d.h. Agonisten) von P2X7R in jeder beliebigen Kombination zur Behandlung einer affektiven Störung verwendet werden können. Beispielsweise können BzATP und Tenidap oder 3-substituierte 2-Oxindol-1carboxamide zur Behandlung einer affektiven Störung zusammen verwendet werden, z.B. gleichzeitig oder aufeinander folgend verabreicht werden.
  • Bevorzugt umfasst das hierin beschriebene Arzneimittel gegebenenfalls weitere Moleküle, die zellschützende Eigenschaften besitzen und die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Komponenten verändern können, indem sie beispielsweise unerwünschte, nachteilige oder negative Nebenwirkungen dieser Komponenten modulieren, bevorzugt blockieren. Eine solche mögliche unerwünschte, nachteilige oder negative Nebenwirkung ist die Bildung von Poren in der Zellmembran behandelter Zellen, die letztlich zur Apoptose führt. Demgemäß gehören weitere Moleküle zur Klasse der beta-adrenergen Rezeptormodulatoren, einschließlich Agonisten oder Antagonisten, mit membranstabilisierenden Eigenschaften. Betaadrenerge Rezeptormodulatoren einschließlich Agonisten und Antagonisten sind Verbindungen, die die positiv chronotropen, positiv inotropen, bronchodilatorischen und vasodilatorischen Antworten, die durch beta-adrenerge Rezeptoragonisten oder -antagonisten verursacht werden, abschwächen oder steigern. Die Stärke der abgeschwächten oder gesteigerten Antwort ist proportional zum vorliegenden sympathischen Tonus und der Konzentration des beta-adrenergen Rezeptorblockers, der die Rezeptorstellen erreicht. Somit ist im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ein beta-adrenerger Rezeptormodulator ein Antagonist oder ein Agonist. Die Aktivität eines beta-adrenergen Rezeptorantagonisten oder -agonisten kann, wie auf dem Fachgebiet bekannt, bestimmt werden. Die Aktivität von beta-adrenergen Rezeptoren kann durch Messung der Akkumulation von zyklischem Adenosinmonophosphat (CAMP) in Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO-Zellen) bestimmt werden. CHO-Zellen können einmalig mit cDNA transfiziert werden, die den humanen beta1-, beta2 oder beta3-adrenergen Rezeptor unter der Kontrolle des CMV-Promotors oder eines beliebigen anderen geeigneten Promotorelements codiert. Die Transfektion der Zellen wird nach Standardverfahren der Zelltransfektion durchgeführt, vgl. z.B. Joyner, „Gene Targeting: A Pratical Approach", Oxford University Press, New York, 1993. Zellen, die eines der beta-adrenergen Gene überexprimieren, werden dann bis zur Konfluenz gemäß dem Verfahren in American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas, siebte Auflage, 1992, S. 36, ATCC CCL 61 CHO-K1 in Ham-F12-Medium (Gibco BRL), das 10% fötales Rinderserum, 500 mg/ml Genlicin, 100 E/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 250 ng/ml Fungizon enthält, gezüchtet. Betaadrenerge Modulatorverbindungen können als 10 mM-Stammlösungen in DMSO (0.1% DMSO, Endkonzentration) hergestellt werden, in Ham-F12-Medium verdünnt werden und zusammen mit 10–3 M Isobutylmethylxanthin zu den Zellen zu 10–10 bis 10–15 M hinzugefügt werden, um die Phosphodiesteraseaktivität zu hemmen. Medien und Zellen werden dann 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Am Ende dieses Zeitraums, werden die Medien abgesaugt und die Zellen in 0.01 N HCl lysiert. Der Zellgehalt von cAMP kann dann durch Radioimmunassay (RIA) bestimmt werden, wobei man einen Kit von New England Nuclear (Burlington, Mass.) verwendet. Es gibt einen direkten Zusammenhang zwischen dem cAMP-Zellgehalt und der Aktivierung/Inhibierung des beta-adrenergen Rezeptors. Andere Verfahren zur Bestimmung der Aktiviät eines beta-adrenergen Rezeptors sind für das Fachgebiet beschrieben, vgl. z.B. Vansal und Feller, J. Recept. Signal. Transduct. Res. 19 (1999) 853–863; Durocher et al., Anal. Biochem. 284 (2000) 316–326.
  • Beispiele für Verbindungen, auf die die Definition eines beta-adrenergen Rezeptormodulators zutrifft, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf bekannte beta-adrenerge Rezeptoragonisten wie Timolol, Solatol, Esmolol, Cateolol, Popanolol, Betaxolol, Penbutolol, Metoprolol, Acebutolol, Atenolol, Metoprolol, Pindolol und Bisoprolol sowie ihre Salze, Hydrate, Solvate und alle kristallinen Formen, in denen sie vorkommen können. Weitere Beispiele für beta-adrenerge Rezeptorblocker sind in US 5,776,930 beschrieben. Bevorzugte Beispiele für beta-adrenerge Rezeptorantagonisten sind DL-Propanolol, D-Propanolol und Labetolol. DL-Propanolol und Labetolol sind beta-adrenerge Rezeptorantagonisten mit Membran stabilisierenden Eigenschaften, während D-Propanolol ein optisches Isomer mit geringer beta-adrenerger Blockeraktivität ist. Im Zusammenhang mit der Verabreichung von P2X7R-Agonisten kann es nützlich sein, gegebenenfalls einen beta-adrenergen Rezeptorantagonisten oder -agonisten zum erfindungsgemäßen Arzneimittel zur Behandlung affektiver Störungen hinzuzufügen. Dies liegt daran, dass der Stand der Technik nahelegt, die P2X7R-Aktivierung durch Agonisten könne zum Zelltod führen, da innerhalb der Zellmembran Porenbildung ausgelöst wird. Wie jedoch in Beispiel 9 der vorliegenden Anmeldung gezeigt wird, wurde die für P2X7R-Agonisten im Stand der Technik beschriebene Wirkung auf die Porenbildungsaktivität nur bei sehr wenigen Zellen beobachtet. In jüngster Zeit wurde von Alzola et al., Cell Signal. 13 (2001), 465–473 gezeigt, dass Konzentrationen von 10 bis 300 μM DL-Propanolol, D-Propanolol oder Labetolol die porenbildende Aktivität von P2X7R hemmen können, ohne die Öffnungsaktivität des Kationenkanals von P2X7R zu beeinflussen. Aus FR 2768626 ist auch bekannt, dass beta-adrenerge Modulatoren, z.B. Agonisten, als Apoptosehemmer nützlich sind. Demgemäß werden in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beta-adrenerge Rezeptormodulatoren einschließlich Antagonisten oder Agonisten in Kombination mit P2X7R-Agonisten verabreicht, um affektive Störungen zu behandeln. Die beta-adrenergen Rezeptorantagonisten oder -agonisten werden bevorzugt in einer Konzentration von 10 bis 300 μM verabreicht.
  • Dosierung, pharmazeutisches Präparat und Freisetzung des die P2X7R-Aktivität modulierenden Wirkstoffs (d.h. Agonisten) für die erfindungsgemäße Verwendung können nach Standardverfahren des Standes der Technik formuliert werden, wobei ein oder mehrere physiologische Träger oder Exzipienten verwendet werden, vgl. z.B. Ansel et al., „Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems", 7. Auflage, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999. So können der die P2X7R-Aktivität modulierende Wirkstoff und seine physiologisch verträglichen Salze und Solvate für die Verabreichung durch Inhalation, Insufflation (durch Mund oder Nase), für die orale, bukkale, parenterale oder rektale Verabreichung formuliert werden.
  • Für die orale Verabreichung kann das Arzneimittel aus dem P2X7R-Aktivität modulierenden Wirkstoff beispielsweise die Form von Tabletten oder Kapseln haben, die nach den üblichen Verfahren mit pharmazeutisch verträglichen Exzipienten wie Bindemitteln (z.B. vorgelatinierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxypropylmethylcellulose), Füllmitteln (z.B. Lactose, mikrokristalline Cellulose, Calciumhydrogenphosphat), Gleitmitteln (z.B. Magnesiumstearat, Talk, Silica), Sprengmitteln (z.B. Kartoffelstärke, Natriumstärkeglykolat) oder Netzmitteln (z.B. Natriumlaurylsulfat) hergestellt werden. Flüssige Formulierungen für die orale Verabreichung können beispielsweise die Form von Lösungen, Sirups oder Suspensionen haben oder können als Trockenprodukt zur Aufbereitung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor der Verwendung vorliegen. Eine solche flüssige Formulierung kann auf herkömmliche Weise mit pharmazeutisch verträglichen Zusatzstoffen wie Suspensionsmitteln (z.B. Sorbit, Sirup, Cellulosederivate, gehärtete Speisefette), Emulsionsbildnern (z.B. Lecithin, Gummi arabicum), nicht-wässrigen Vehikeln (z.B. Mandelöl, Ölester, Ethylalkohol, fraktionierte Pflanzenöle), Konservierungsmitteln (z.B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxycarbonate, Sorbinsäuren) hergestellt werden. Die Formulierungen können nach Ermessen auch Puffersalze, Geschmacksstoffe, Farbstoffe und Süßungsmittel enthalten. Präparate für die orale Verabreichung können geeignet formuliert sein, um eine kontrollierte Freisetzung des die P2X7R-Aktivität modulierenden Wirkstoffs zu ermöglichen.
  • Für die Verabreichung mittels Inhalation wird der die P2X7R-Aktivität modulierende Wirkstoff (d.h. der Agonist) zur erfindungsgemäßen Verwendung zweckmäßigerweise in der Darreichungsform eines Aerosolsprays aus einer Druckpackung oder einem Verneblungsgerät unter Verwendung eines geeigneten Treibgases (z.B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas) verabreicht. Im Fall eines Aerosols unter Druck kann die Dosiseinheit durch ein Ventil, das eine bemessene Menge freigibt, bestimmt werden. Kapseln und Patronen beispielsweise aus Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können so formuliert werden, dass sie ein Pulvergemisch aus dem die P2X7R-Aktivität modulierenden Wirkstoff und einem geeignetem Pulvergrundstoff wie Lactose oder Stärke enthalten.
  • Ein die P2X7R-Aktivität modulierender Wirkstoff (d.h. Agonist) kann für die parenterale Verabreichung mittels Injektion, z.B. durch Bolusinjektion, oder mittels Dauerinfusion formuliert werden. Die Injektionsstellen schließen intravenöse, intraperitoneale oder subkutane Injektion ein. Formulierungen für die Injektion können in Form von Dosiseinheiten (z.B. Fläschchen, in einem Multi-Dosis-Behältnis) und mit einem hinzugefügten Konservierungsmittel angeboten werden. Der P2X7R-Aktivität modulierende Wirkstoff kann in Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Vehikeln vorliegen und kann Formulierungsagenzien wie Suspensionsagenzien, Stabilisierungsagenzien oder Dispersionsagenzien enthalten. Alternativ hierzu kann der Wirkstoff in Pulverform zur Aufbereitung mit einem geeigneten Vehikel (z.B. steriles pyrogenfreies Wasser) vor der Verwendung vorliegen.
  • Ein die P2X7R-Aktivität modulierender Wirkstoff (d.h. ein Agonist) kann, falls gewünscht, in einer Packung oder einer Spendervorrichtung vorliegen, die eine oder mehrere Einheitsdosierungsformen mit dem Wirkstoff enthält. Die Packung kann zum Beispiel Metall- oder Kunststofffolie umfassen, wie beipielsweise eine Blisterpackung. Der Packung oder der Spendervorrichtung können von Anweisungen für die Verabreichung beigefügt sein.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform sollen die vorstehend beschriebenen Verwendungen affektive Störungen behandeln, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus schwerer Depression, generalisierter Angststörung und bipolarer Störung besteht.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die schwere Depression aus der Gruppe ausgewählt, die aus schwerer Depression, Dysthymie, atypischer Depression, prämenstrueller dysphorischer Störung und jahreszeitabhängiger affektiver Störung besteht.
  • In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform ist die generalisierte Angststörung aus der Gruppe ausgewählt, die aus Angst-Krankheit, Phobien, Agoraphobie, sozialer Phobie, spezifischer Phobie, obsessiv-kompulsiver Störung, posttraumatischer Stresserkrankung, Trennungsangst, Manie, Hypomanie und cyklothymer Störung besteht.
  • Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform besteht darin, dass die bipolare Störung eine bipolare Störung vom Typ I oder eine bipolare Störung vom Typ II ist.
  • Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit, welcher das Nucleinsäuremolekül, den Vektor, den Wirt, das Polypeptid, den Antikörper oder das Aptamer, den Primer oder das Primerpaar wie oben beschrieben, oder das Molekül, das in einem nachstehenden Verfahren identifiziert oder charakterisiert wird, umfasst.
  • Es ist von Vorteil, dass der Kit weiterhin gegebenenfalls (einen) Reaktionspuffer, Lösungen, die für die Lagerung geeignet sind, und/oder zusätzliche Reagenzien oder Stoffe, die für die Durchführung von wissenschaftlichen oder diagnostischen Test erforderlich sind, oder dergleichen umfasst. Außerdem können Teile des Kits der Erfindung einzeln in Gläser oder Flaschen oder in Kombination in Behälter oder Einheiten aus mehreren Behältern verpackt werden.
  • Der Kit kann vorteilhaft eingesetzt werden: u.a. zum Durchführen des Verfahrens zum Herstellen eines oben beschriebenen Polypeptids, des Verfahrens (der Verfahren) zum identifizieren und/oder Charakterisieren von Molekülen, die spezifisch mit ATP-abhängigen Ionenkanälen P2X7R interagieren, wie hier nachstehend beschrieben, und/oder er könnte in einer Vielzahl von hier angesprochenen Anwendungen eingesetzt werden, z.B. als diagnostische Kits, als Werkzeuge für die Forschung oder als Werkzeuge für die Therapie. Außerdem kann der Kit Mittel für den Nachweis enthalten, die für wissenschaftliche, medizinische und/oder diagnostische Zwecke geeignet sind. Die Herstellung der Kits erfolgt vorzugsweise gemäß Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Darüber hinaus offenbart die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen oder Gemischen von Verbindungen, die fähig sind, mit einem hierin beschriebenen Polypeptid spezifisch zu interagieren, umfassend die Schritte (a) Inkontaktbringen eines vorstehend beschriebenen Polypeptids mit einer Kandidatenverbindung oder einem Gemisch zu testender Verbindungen; und (b) Bestimmen, ob die Verbindung oder das Gemisch von Verbindungen fähig ist, mit dem Polypeptid spezifisch zu interagieren. Das Polypeptid kann direkt oder durch Expression eines entsprechenden Nucleinsäuremoleküls oder Vektors, wie oben beschrieben, d.h. in vitro oder in einer geeigneten Wirtszelle, bereitgestellt werden.
  • Zusätzlich offenbart die vorliegende Anmeldung ein Verfahren für die Charakterisierung von Verbindungen, die fähig sind die Eigenschaften der hierin beschriebenen Polypeptide zu verändern, umfassend die Schritte (a) Inkontaktbringen eines oben beschriebenen Polypeptids mit der Verbindung; und (b) Bestimmen, ob die Verbindung eine Eigenschaft des Polypeptids verändert.
  • Der Ausdruck „Eigenschaften des hierin beschriebenen Polypeptids verändern" bedeutet, dass die funktionellen Eigenschaften solcher Polypeptide im Vergleich zu funktionellen Eigenschaften, die sie vor dem Inkontaktbringen mit den durch das oben beschriebene Verfahren identifizierten Verbindungen aufwiesen, verändert, d.h. modifiziert sind.
  • Die Identifikation und/oder Charakterisierung von Verbindungen, die fähig sind, mit den oben beschriebenen Polypeptiden zu interagieren oder deren Eigenschaft zu ändern, kann unter anderem erreicht werden, indem man einen geeigneten Wirt mit einem oben beschriebenen Nucleinsäuremolekül transfiziert. Die Wirte umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf HEK-293-Zellen oder werden zur funktionellen Expression in Frosch-Oocyten, bevorzugt eine Xenopus-Oocyte, injiziert (Goldin, Methods Enzymol. 207 (1992), 266. Exprimierte ATP-abhängige P2X7R-Kanäle können unter Verwendung von üblichen 2-Elektroden-Spannungsklemm-Verfahren untersucht werden (Stuhmer, Methods Enzymol. 207 (1992) 319; Köhler, Science 273 (1996), 1709). Nach der Expression eines wie hierin definierten ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanals können Membranströme in Anwesenheit und/oder Abwesenheit des zu identifizierenden und/oder zu charakterisierenden Moleküls abgeleitet werden. Verfahren zur Ableitung von Membranströmen sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen z.B. Patch-Clamp-Verfahren, wie in Hamill, Pfluger's Arch. 391 (1981), 85–100 beschrieben, oder Zwei-Elektroden-Spannungsklemmen in Oocyten, wie in Methfessel, Pflügers Archive 407 (1986), 577–588, beschrieben. Gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „Interaktion mit den hierin beschriebenen Polypeptiden", dass diese Polypeptide direkt und/oder indirekt mit durch vorstehend beschriebene Verfahren identifizierte Verbindungen interagieren.
  • Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Anmeldung ein Screening-Verfahren für Moleküle, die fähig sind, mit den vorstehend beschriebenen Polypeptiden zu interagieren, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen des Polypeptids mit einem Molekül; und (b) Messen und/oder Nachweisen einer Antwort; und (c) Vergleichen dieser Antwort mit einer Standardantwort, wie in Abwesenheit des Kandidatenmoleküls gemessen.
  • Hierin wird auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung beschrieben, die fähig ist, die Expression des P2X7R-Gens zu erhöhen oder zu vermindern, umfassend die folgenden Schritte: Inkontaktbringen einer Zelle, die das P2X7R-Gen von seinem natürlichen Promotor oder ein Reportergen, das vom P2X7R-Promotors gesteuert wird, exprimiert, und Bestimmen, ob die Expression des Gens erhöht oder vermindert ist im Vergleich zu Bedingungen, unter denen die Verbindung nicht anwesend ist.
  • Potenzielle Kandidatenmoleküle oder Kandidatengemische von Molekülen können unter anderem Stoffe, Verbindungen oder Zusammensetzungen sein, die chemischen oder biologischen Ursprungs sind, die natürlicherweise vorkommen und/oder synthetisch, rekombinant und/oder chemisch hergestellt sind, oder Verbindungen oder Zusammensetzungen, die hierin vorstehend beschrieben sind. Somit können Kandidatenmoleküle Proteine, Proteinfragmente, Peptide, Aminosäuren und/oder Derivate davon sein oder andere Verbindungen wie Ionen, die an ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanäle vom Wildtyp binden oder mit diesen interagieren. Solche Kandidatenverbindungen für die Bindung oder Interaktion können unter anderem mithilfe von Hefe-Zweihybridsystemen oder modifizierten Hefe-Zweihybridsystemen gefunden werden, wie z.B. in Fields, Nature 340 (1989), 245–246; Gyuris, Cell 75 (1993), 791–801 oder Zervos, Cell 72 (1993), 223–232 beschrieben.
  • Des Weiteren können potenzielle Kandidatenmoleküle mit einer Zelle wie einer Oocyte oder einer HEK-293-Zelle, die ein oben beschriebenes Polypeptid exprimiert, oder mit einem Membranfleck in Kontakt gebracht werden, der ein solches Polypeptid umfasst, und eine entsprechende Antwort (u.a. eine Dosisanwort, eine Stromantwort oder eine Einzelstromkanalantwort) kann gemessen werden, um jegliche Wirkung, die das Molekül verursacht, zu klären.
  • Hierin beschrieben werden auch Verfahren zur Identifizierung, Charakterisierung und zum Screening von Molekülen, die fähig sind, mit den hierin offenbarten ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanälen zu interagieren, die die sogenannten Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz und ähnliche auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren einschließen (Spencer, Biotechnol. Bioeng. 61 (1998), 61–67; Oldenburg, Annu. Rev. Med. Chem. 33 (1998), 301–311), die unter Verwendung von im Handel erhältlichen Platten mit 96-, 384, 1536 Vertiefungen (sowie anderen) durchgeführt werden. Weitere zu verwendende Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf homogene Fluoreszenzdarstellungsverfahren in Screenings mit hohem Durchsatz (wie u. a. beschrieben in Pope, Drug Discovery Today 4 (1999), 350–362). Im Verfahren zur Identifikation, Charakterisierung und/oder zum Screening von Molekülen, die fähig sind, mit ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanälen zu interagieren, können u.a. Wirte, wie hierin definiert, verwendet werden, die das oben beschriebene Polypeptid exprimieren. Auf Zellen basierende Assays, Geräte für diese Assays und/oder Messtechniken sind auf dem Fachgebiet bekannt und sind u.a. in Gonzalez, Drug Discovery Today 4 (1999), 431–439 oder Ramm, Drug Discovery Today 4 (1999), 401–410 beschrieben. Es ist außerdem vorgesehen, dass die hierein beschriebenen Screening-Verfahren mit hohem Durchsatz unter Verwendung von beispielsweise cRNA (d.h. synthetischer RNA aus einem cDNA-Konstrukt) durchgeführt werden, die nach Standardverfahren des Fachgebiets in Wirtszellen wie Xenopus-Oocyten eingeführt werden kann. So kann beispielsweise die direkte Injektion von Nucleinsäure verwendet werden, wie das Mikroinjektionssystem von Eppendorf (Micromanipulator 5171 und Transjector 5242). Die injizierten/transformierten Zellen können nach etwa 4 Stunden auf Ionenströme hin analysiert werden, wobei im Fachgebiet übliche Patch-Clamp-Techniken verwendet werden.
  • Zusätzlich beschreibt die vorliegende Anmeldung ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das die Schritte eines Verfahrens zur Identifikation, Charakterisierung und/oder zum Screening von Molekülen umfasst, die fähig sind, mit einem ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanal zu interagieren und/oder dessen Eigenschaften zu verändern, und des Weiteren einen Schritt umfasst, in dem ein Derivat des identifizierten, charakterisierten und/oder gescreenten Moleküls hergestellt wird. Ein solches Derivat kann unter anderem mithilfe von Peptidomimetika hergestellt werden.
  • Die Anmeldung offenbart darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, umfassend die Schritte eines vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Identifizierung, Charakterisierung, zum Screening und/oder zur Derivatisierung von Molekülen, die fähig sind, mit einem ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanal zu interagieren und/oder dessen Eigenschaften zu verändern, sowie Formulierung der identifizierten, charakterisierten, gescreenten und/oder derivatisierten Moleküle in pharmazeutisch verträglicher Form.
  • Bevorzugt ist das Verfahren ein Verfahren, in dem das/die Molekül(e) (ein) neuroprotektive(s), (ein) nootrope(s) und/oder (ein) antiepileptische(s) Molekül(e) umfasst/umfassen.
  • Ein weiterer Aspekt ist die Verwendung eines P2X7R-Polypeptids, insbesondere der hierin beschriebenen Polypeptide, zur Identifizierung von biologischen, chemischen oder pharmakologischen Wirkstoffen, die eine antidepressive Wirkung haben können. Der Begriff „Wirkstoff" bezieht sich auf eine chemische Verbindung oder Zusammensetzung, die fähig ist, eine gewünschte therapeutische oder prophylaktische Wirkung hervorzurufen, wenn sie bei einem Individuum oder einer Zelle richtig angewendet wird. Zum Beispiel ermöglicht die vorliegende Offenbarung die Erzeugung von Zellen, die P2X7R exprimieren, zur Identifizierung und Charakterisierung von Wirkstoffen, die das Einströmen und Ausströmen von Ionen modulieren. So können zum Beispiel HEK293-Zellen oder andere Zelllinien (z.B. HCN-1A, HCN-2, HIT-T15, RIN-m5F, betaTC3, PC12, HT22, SH-SY5Y, Neuro2A oder CA77) stabil mit P2X7R des Menschen codierender cDNA transfiziert und in Platten mit 12, 96 und 384 Vertiefungen plattiert werden. Die Zellen werden in einem geeigneten Medium kultiviert. Beispiele für solche Medien sind auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z.B. Freshney, „Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique", 4. Auflage, Wiley-Liss Publishing, 2000.
  • Die Zellen können dann mit den Wirkstoffen 15 Minuten vorinkubiert werden, bevor sie 10 Minuten mit 3 mM ATP stimuliert werden. Die Reaktionen werden dann durch rasches Absaugen des extrazellulären Mediums in jeder Vertiefung beendet. Anschließend werden die Zellen über Nacht mit 1 ml 10%-HNO3 extrahiert. Der Kalium (K+)-Gehalt in den Auszügen kann mittels Atomabsorptionsspektrophotometrie ermittelt werden. Die Wirkung des Wirkstoffs wird dann mittels prozentualer Inhibition oder Stimulation der K+-Freisetzung gemessen, die durch 3 mM ATP ausgelöst wird, und mit der Freisetzung von K+ in Abwesenheit der Wirkstoffe verglichen. Die P2X7R-Aktivität kann ebenfalls anhand der Ca2+-Bewegung überwacht werden (Ca2 +; siehe Denver et al., Drug Discov. Today 7 (1998), 323–332; González et al., Drug Discov. Today 9 (1999), 431–439; Helmchen und Walters, Eur. J. Pharmacol. 447 (2002), 119–129). Die Wirkstoffe können auch in Abwesenheit von ATP geprüft werden.
  • Die P2X7R-Aktivität kann auch anhand der Sekretion von Neurotransmittern wie Glutamat und GABA kontrolliert werden. Neurotransmitterspiegel in behandelten Zellen können mit geeigneten Verfahren quantifiziert werden, z.B. mittels Enzymgekoppeltem Immunabsorptionstest (ELISA), Radioimmunassay (RIA), Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Mithilfe dieser Verfahren ist es möglich, eine große Anzahl von Verbindungen im Hinblick auf ein Ansteigen der Sekretion von Neurotransmittern (z.B. Glutamat) zu screenen. Die Freisetzung von Glutamat kann beispielsweise mittels fluorometrischer Tests der Glutamatfreisetzung (z.B. Amplex Red Glutamic Acid/Glutamate Oxidase Assay Kit, Molecular Probes) oder Hochdurchsatz-Elektrophysiologie gemessen werden.
  • Darüber hinaus wird hierin beschrieben, dass die hierin offenbarten P2X7R-Polypeptide in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen oder Wirkstoffen verwendet werden, die gegenüber den P2X7R-Polypeptiden oder den oben beschriebenen Polypeptiden die Aktivität eines Agonisten aufweisen. Wirkstoffe und Verbindungen sind hierin vorstehend sowie im Folgenden definiert und beschrieben. Insbesondere werden Zellen, die das P2X7-Gen exprimieren, mit Kandidatenwirkstoffen, -molekülen oder -verbindungen, wie hierin beschrieben, in Kontakt gebracht und entweder wird das Einströmen von Calcium oder von Ethidiumbromid mit auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren gemessen, wie hierin vorstehend und insbesondere hierin nachstehend in Beispiel 8 beschrieben ist. Die Zellen, die im Verfahren zur Identifizierung von P2X7R-Agonisten verwendet werden, sind bevorzugt Zellen einer Hippocampuszelllinie. Hippocampuszelllinien werden nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt, wie z.B. beschrieben in EP 0 773 287 oder EP 0 773 292 . Nicht beschränkende Beispiele für Hippocampuszelllinien sind H19-7-Hippocampuszellen der Ratte (ATCC-2526), beschrieben in Eves et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 4373–4377, HN9.10-Hippocampuszellen der Maus, beschrieben in Lee et al., J. Neurosci. 10 (1992), 1779–1787, oder Hi5B-Hippocampuszellen der Ratte, beschrieben in Renfranz et al., Cell 66 (1991), 713–729. Bevorzugt sind die Hippocampuszellen, die gemäß des oben erwähnten Verfahrens verwendet werden, Zellen der HT-Serie (siehe Davis und Maher, Brain Res. 652 (1994), 169–173, Morimoto und Koshland, Neuron 5 (1990) 875–880. Ebenfalls bevorzugt ist, dass die Hippocampuszellen das endogene P2X7R-Gen exprimieren. Jedoch ist auch vorgesehen, dass solche Zellen durch die Einführung eines exogenen P2X7R-Gens nach auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren genetisch verändert sein können. Stärker bevorzugt werden HT-22-Zellen zur Identifizierung von Agonisten der hierin beschriebenen P2X7R-Polypeptide oder der hierin beschriebenen Polypeptide verwendet und HT-39-Zellen werden, wie hierin nachstehend in Beispiel 8 beschrieben, als negative Kontrolle verwendet.
  • Zum Beispiel werden Zellen mit Nucleinsäurekonstrukten, die ein vom P2X7R-Promotor reguliertes Reportergen codieren (siehe oben), transfiziert; dann kann eine Zunahme oder Abnahme der Expression des Reportergens als Antwort auf biologische oder pharmazeutische Wirkstoffe untersucht werden, wobei Verfahren angewendet werden, mit denen sich die Spiegel oder der Status von Protein oder mRNA, das/die in der entsprechenden Zelle vorliegt, oder biologische Aktiviäten des Reportergens nachweisen lassen. Geeignete Reportermoleküle oder Marker, die verwendet werden können, schließen Radionucleotide, Enzyme, fluoreszierende, chemiluminescierende oder chromogene Wirkstoffe ebenso wie Substrate, Cofaktoren, Inhibitoren, magnetische Partikel und ähnliche ein. Die Konzeption solcher Wirkstoffscreeningtests ist auf dem Fachgebiet bekannt; siehe Harvey (Hrsg.), „Advances in drug discovery techniques", John Wiley and Sons, 1998; Vogel und Vogel (Hrsg.), „Drug discovery and evaluation: Pharmaceutical assays", Springer-Verlag Berlin, 1997): zum Beispiel Wirkstoffscreeening in Tiermodellen, in-vitro-Tests mit Tierzellen oder in-vivo-Tests, die Toxikologietests an Tieren einschließen. Ein in-vitro-Model kann zum Screening von Verbindungsbibliotheken in jedem beliebigen Wirkstoffscreeningverfahren verwendet werden.
  • Kandidatenwirkstoffe umfassen zahlreiche chemische Klassen, obwohl es sich typischerweise um organische Moleküle handelt, bevorzugt kleine organische Verbindungen mit einem Molekulargewicht von mehr als 50 und weniger als etwa 2.500 Dalton. Kandidatenwirkstoffe umfassen funktionelle Gruppen, die für die strukturelle Interaktion mit Proteinen, insbesondere Wasserstoffbindung, erforderlich sind und schließen typischerweise mindestens eine Amin-, Carbonyl-, Hydroxyl- oder Carboxylgruppe, bevorzugt mindestens zwei der funktionellen chemischen Gruppen, ein. Die Kandidatenwirkstoffe umfassen häufig carbozyklische oder heterozyklische Strukturen und/oder aromatische oder polyaromatische Strukturen, die durch eine oder mehrere der vorstehenden funktionellen Gruppen ersetzt sind.
  • Kandidatenwirkstoffe sind auch unter Biomolekülen einschließlich Peptiden, Aminsosäuren, Sacchariden, Fettsäuren, Steroiden, Purinen, Pyrimidinen, Nucleinsäuren und Derivaten, strukturellen Analoga oder Kombinationen davon zu finden. Kandidatenwirkstoffe werden aus einer Vielzahl verschiedener Quellen erhalten, einschließlich Bibliotheken synthetischer oder natürlicher Verbindungen. So stehen zum Beispiel zahlreiche Mittel für die Zufallssynthese oder die gezielte Synthese einer großen Zahl verschiedener organischer Verbindungen und Biomoleküle zur Verfügung, einschließlich der Expression randomisierter Oligonucleotide und Oligopeptide. Alternativ hierzu sind Bibliotheken natürlicher Verbindungen in Form von bakteriellen, pilzlichen, pflanzlichen und tierischen Extrakten verfügbar oder leicht herzustellen. Darüber hinaus lassen sich natürliche oder synthetisch hergestellte Bibliotheken und Verbindungen anhand üblicher chemischer, physikalischer und biochemischer Mittel leicht modifizieren und können zur Herstellung kombinatorischer Bibliotheken verwendet werden. Bekannte pharmakologische Wirkstoffe können gezielten und randomisierten chemischen Modifikationen wie Acylierung, Alkylierung, Veresterung, Amidierung usw. unterzogen werden, um strukturelle Analoga herzustellen.
  • Ein anderes Verfahren, um Wirkstoffe zu screenen, das verwendet werden kann, sieht Screening mit hohem Durchsatz von Verbindungen vor, die eine geeignete Bindungsaffinität zu dem Protein von Interesse aufweisen, wie in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 84/03564 beschrieben wird. In diesem Verfahren werden, wenn es auf die hierin beschriebenen Proteine angewendet wird, große Mengen kleiner Testverbindungen verschiedener Art, z.B. Aptamere, Peptide, Verbindungen mit geringem Molekulargewicht usw., auf einem festen Träger wie Kunststoffstifte oder eine andere Oberfläche bereitgestellt oder synthetisiert. Die Testverbindungen werden zur Reaktion mit den Proteinen oder Fragmenten davon gebracht und gewaschen. Gebundene Proteine werden dann anhand von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren ermittelt. Gereinigte Proteine können auch direkt auf Platten aufgebracht werden, um sie in den oben erwähnten Arzneistoffscreeningverfahren zu verwenden. Alternativ hierzu können nicht neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und auf einem festen Träger zu fixieren. In einer anderen Ausführungsform können kompetitive Arzneistoffscreeningsassays verwendet werden, in denen neutralisierende Antikörper, die die Fähigkeit haben, das Protein spezifisch zu binden, mit einer Testverbindung in Bezug auf die Bindung des Proteins konkurrieren. Auf diese Weise können die Antikörper verwendet werden, um das Vorliegen eines beliebigen Peptids nachzuweisen, das mit dem Protein eine oder mehrere Antigendeterminanten gemeinsam hat.
  • Die vorliegende Anmeldung beschreibt darüber hinaus insbesondere ein Verfahren, in dem das Arzneimittel, das hergestellt werden soll, des Weiteren neuroprotektive Stoffe, nootrophe Stoffe, Brilliantblau, Piperidin oder Derivate davon, Adamantinderivate, substitutierte Phenylverbindungen, oxidiertes ATP, 2-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosin-5-triphosphat oder 3-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosin-5-triphosphat) umfasst. Es ist auch vorgesehen, dass die Arzneimittel, die hergestellt werden sollen, des Weiteren Andidepressiva wie Fluoxetin, Paroxetin, Sertralin, Fluroxamin, Mirtazapin, Reoretin, Nefazodon oder Lithiumcarbonat umfassen.
  • Bevorzugt umfassen die Verbindungen der vorstehend erwähnten Verfahren einen oder mehrere Antagonisten, einen oder mehrere Teilantagonisten und/oder einen oder mehrere Agonisten für einen veränderten ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanal.
  • Wenn hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Antagonist" Moleküle/Stoffe, die fähig sind, eine agonistische Wirkung zu inhibieren und/oder zu reduzieren. Der Begriff „Antagonist" umfasst kompetitive, nicht kompetitive, funktionelle und chemische Antagonisten, wie u.a. in Mutschler, „Arzneimittelwirkungen" (1986), Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Deutschland beschrieben. Der Begriff „Teilantagonist" bezeichnet, wenn er hierin verwendet wird, ein/einen Molekül/Stoff, das/der fähig ist, die Aktivität von Agonisten unvollständig zu blockieren, wobei die Blockierung unter anderem durch nicht kompetitive Mechanismen bewirkt wird.
  • Im vorliegenden Zusammenhang ist ein Antagonist bevorzugt ein Arzneistoff, das nicht selbst eine Antwort hervorruft, sondern von Agonisten vermittelte Antworten blockiert. Es handelt sich um eine chemische Einheit, die den Rezeptor assoziierten Antworten, die normalerweise durch ein anderes bioaktives Agens induziert werden, entgegenwirkt. Für P2X7R haben die Antagonisten einen IC50 zwischen 10 nanomolar und 300 mikromolar.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden als „Agonisten" Moleküle/Stoffe bezeichnet, die eine Affinität und eine intrinsische Aktivität aufweisen. Meist wird die intrinsische Aktivität (α) als proportional zum Quotienten aus der Wirkung, die durch den Agonisten (EA) ausgelöst wird, und der Wirkung, die maximal in einem gegebenen biologischen System erhalten werden kann (Emax), definiert: daher kann die intrinsische Wirkung definiert werden als
    Figure 00790001
  • Die höchste relative intrinsische Aktivität resultiert aus EA/Emax = 1. Agonisten mit einer intrinsischen Aktivität von 1 sind volle Agonisten, während Stoffe/Moleküle mit einer intrinsischen Aktivität von > 0 und < 1 Teilagonisten sind. Teilagonisten zeigen dualistische Wirkungen, d.h. sie umfassen ebenso agonistische wie auch antagonistische Wirkungen.
  • Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung ist ein Agonist (oder voller Agonist) bevorzugt ein endogener Stoff oder ein Arzneistoff, der mit einem Rezeptor interagieren kann und eine maximale oder vollständige physiologische oder pharmakologische Antwort auslösen kann, die für diesen Rezeptor charakteristisch ist. ATP, der natürliche Ligand für P2X7R, ist ein Agonist mit einem EC50 von 300 mikromolar, während der synthetische P2X7R-Agonist BzATP einen EC50 von 8 mikromolar hat. Somit haben P2X7R-Agonisten einen EC50 gleich oder kleiner als 300 mikromolar. EC50 ist definiert als die Agonistenkonzentration, die eine Antwort in der Mitte zwischen der Basislinienantwort und der maximalen Antwort auf einer Dosis-Antwort-Kurve auslöst, wobei die X-Achse die Konzentration eines Agonisten angibt und die Y-Achse den Ionenstrom angibt. Ein inverser Agonist (auch als negativer Antagonist bezeichnet) ist ein Arzneistoff, der auf den gleichen Rezeptor wirkt wie der des Agonisten, jedoch eine gegenteilige Wirkung hat. Ein Teilagonist ist ein endogener Stoff oder ein Arzneistoff, der ebenfalls eine physiologische oder pharmakologische Antwort hervorruft, wobei, unabhängig von der angewendeten Arzneistoffmenge, die maximale Antwort jedoch niedriger als die maximale Antwort auf einen vollen Agonisten ist. Im Fall von P2X7R haben Teilagonisten EC50-Werte von über 300 mikromolar.
  • Der Fachmann kann daher die hierin beschriebenen Verbindungen und Verfahren leicht zur Klärung der agonistischen und/oder antagonistischen Wirkungen und/oder Eigenschaften einer Verbindung/eines Moleküls/eines Stoffs anwenden, die mithilfe eines der oben beschriebenen Verfahren zu identifizieren und/oder zu charakterisieren sind. Zum Beispiel kann ein identifizierter Antagonist eines ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanals, der die hierin oben beschriebene(n) Mutation(en) und/oder Deletion(en) umfasst, nützlich sein, um die Merkmale, die ATP-abhängige P2X7R-Ionenkanäle vom Wildtyp normalerweise zeigen, wiederherzustellen. Ein identifizierter Agonist des ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanals, der die hierin oben beschriebenen Mutation(en) und/oder Deletion(en) umfasst, kann nützlich sein, um die verlorene Funktionalität des ATP-abhängigen P2X7R-Ionenkanals wiederherzustellen.
  • Die Figuren zeigen:
  • 1a: Genomische Karte der Region auf dem menschlichen Chromosom 12, die mit einer bipolaren affektiven Störung assoziiert ist. Gene, die zwischen den Markern NBG11 und NBG2 gefunden wurden, sind angegeben.
  • 1b: Grafische Darstellung, welche die Mehrpunkt-Analyse („multipoint analysis") unter Verwendung von ASPEX an unabhängigen Geschwisterpaaren („Sib Pairs") erläutert.
  • 1c: Grafische Darstellung, welche die Mehrpunkt-Analyse unter Verwendung von ASPEX an allen Geschwisterpaaren erläutert.
  • 1d: Grafische Darstellung, welche die ASPEX sib_phase unter Betrachtung von nur unabhängigen Geschwisterpaaren erläutert.
  • 1e: Grafische Darstellung, welche die ASPEX sib_phase unter Betrachtung aller Geschwisterpaare erläutert.
  • 1f: Wirkung des P2XR7v13A-Polymorphismus auf die basalen Cortisolspiegel vor und nach der Verabreichung von Dexamethason (DST-Test). Der Test wurde bei den Individuen innerhalb der ersten zehn Tage nach der Aufnahme durchgeführt. Individuen mit den AG- und GG-Genotypen haben vor und nach der Dexamethason-Verabreichung signifikant niedrigere Cortisolspiegel.
  • 1g: Wirkung des P2XR7v13A-Polymorphismus auf die Cortisol-Antwort während des Dex/CRH-Tests. Der Test wurde bei den Individuen innerhalb der ersten zehn Tage nach der Aufnahme (d.h. bei Aufnahme) und an den letzten zehn Tagen vor der Entlassung (d.h. bei Entlassung) durchgeführt. Individuen mit dem GG-Genotyp haben bei der Aufnahme und bei der Entlassung als Antwort auf den Dex/CRH-Test niedrigere Cortisolspiegel. Diese Ergebnisse zeigen eine abnorme HPA-Achse an.
  • 1h: Wirkung des P2XR7v13A-Polymorphismus auf die ACTH-Antwort während des Dex/CRH-Tests. Der Test wurde bei den Individuen innerhalb der ersten zehn Tage nach der Aufnahme (d.h. bei Aufnahme) und an den letzten zehn Tagen vor der Entlassung (d.h. bei Entlassung) durchgeführt. Individuen mit dem GG-Genotyp haben bei der Aufnahme und bei der Entlassung als Antwort auf den Dex/CRH-Test niedrigere ACTH-Spiegel. Diese Ergebnisse zeigen eine abnorme HPA-Achse an.
  • 1i: Dauer einer antidepressiven Behandlung bis zur Remission. Eine Depression wird nach der Hamilton-Depressions-Beurteilungsskala („Hamilton Depression Rating Scale") (HAM-D; Hamilton, Br. J. Soc. Clin. Psychol. 6 (1967), 278–296) diagnostiziert. Ein HAM-D-Wert von 10 oder darunter wird als Remission der depressiven Symptome angesehen.
  • 1j: Wirkung des P2XR7v13C-Polymorphismus auf die basalen Cortisolspiegel vor und nach der Verabreichung von Dexamethason (DST-Test). Der Test wurde bei den Individuen innerhalb der ersten zehn Tage nach der Aufnahme durchgeführt. Individuen mit dem CC-Genotyp haben nach der Dexamethason-Verabreichung erhöhte Cortisolspiegel.
  • 1k: Wirkung des P2XR7v13C-Polymorphismus auf die Cortisol-Antwort während des Dex/CRH-Tests. Der Test wurde bei den Individuen innerhalb der ersten zehn Tage nach der Aufnahme (d.h. bei Aufnahme) und an den letzten zehn Tagen vor der Entlassung (d.h. bei Entlassung) durchgeführt. Individuen mit dem AC- oder CC-Genotyp haben bei der Aufnahme als Antwort auf den Dex/CRH-Test erhöhte Cortisolspiegel, dies zeigt eine abnorme HPA-Achse an.
  • 1l: Wirkung des P2XR7v13C-Polymorphismus auf die ACTH-Antwort während des Dex/CRH-Tests. Der Test wurde bei den Individuen innerhalb der ersten zehn Tage nach der Aufnahme (d.h. bei Aufnahme) und an den letzten zehn Tagen vor der Entlassung (d.h. bei Entlassung) durchgeführt. Individuen mit dem CC-Genotyp haben bei der Aufnahme und bei der Entlassung als Antwort auf den Dex/CRH-Test niedrigere ACTH-Spiegel. Diese Ergebnisse zeigen eine abnorme HPA-Achse an.
  • 2: RT-PCR-Analyse der vollständigen codierenden Sequenz von P2X7R in verschiedenen Geweben.
  • 3: Expression von P2X7R im Bulbus olfactorius, Hypothalamus und in Ependymzellen im Gehirn einer stressfreien Maus. Vergrößerung 100×.
  • 4: Expression von P2X7R im Hippocampus/Gyrus dentatus und Subcommissuralorgan im Gehirn einer stressfreien Maus. Vergrößerung 100×.
  • 5: Schwimmverhalten im erzwungenen Schwimmtest. Das passive Stressbewältigungsverhalten nahm nach einer langfristigen Behandlung mit dem Antidepressivum Paroxetin ab (Par28: behandelt mit Paroxetin für 28 Tage, per os). Basaler Spiegel: n = 8; Träger: n = 8; Par28: n = B.
  • 6: Vergleichsanalyse der P2X7R-Expression im Bulbus olfactorius von stressfreien, mit Träger behandelten und mit Antidepressivum behandelten Mäusen. Vergrößerung 100×.
  • 7: Vergleichsanalyse der P2X7R-Expression im Hypothalamus von stressfreien, mit Träger behandelten und mit Antidepressivum behandelten Mäusen. Vergrößerung 100×.
  • 8: Vergleichsanalyse der P2X7R-Expression in Ependymzellen von stressfreien, mit Träger behandelten und mit Antidepressivum behandelten Mäusen. Vergrößerung 100×.
  • 9: Vergleichsanalyse der P2X7R-Expression im Hippocampus von stressfreien, mit Träger behandelten und mit Antidepressivum behandelten Mäusen. Vergrößerung 25×.
  • 10: Expression von P2X7R im Hippocampus einer mit Träger behandelten Maus. Vergrößerung 25×.
  • 11: Expression von P2X7R im Hippocampus einer Maus, die mit dem Antidepressivum Paroxetin behandelt wurde. Vergrößerung 25×.
  • 12: Genaue Expression von P2X7R im Gyrus dentatus einer Maus, die mit dem Antidepressivum Paroxetin behandelt wurde. Vergrößerung 400×.
  • 13: Vergleichsanalyse der Expression von P2X7R und apoptotischen Zellen im Hippocampus einer Maus, die mit dem Antidepressivum Paroxetin behandelt wurde. Vergrößerung 100×.
  • 14: Schwimmverhalten im erzwungenen Schwimmtest. Das passive Stressbewältigungsverhalten nahm nach einer akuten Verabreichung einer auf P2X7R zielenden siRNA in den Hippocampus (bilateral, Gyrus dentatus) zu. Träger: n = 7; Kontroll-RNA: n = 10; P2X7R-siRNA: n = 9.
  • 15: Vergleichsanalyse der P2X7R-Expression im Hippocampus von Mäusen, die mit Träger, Kontroll-RNA und auf P2X7R zielender siRNA behandelt wurden. Vergrößerung 100×, obere Reihe; 25×, untere Reihe.
  • 16a, b, c, d, e: Drei Spleißvarianten, verursacht durch Polymorphismen in den Introns von P2X7R.
  • 17: Expression von P2X7R in immortalisierten Hippocampus-Zelllinien.
  • 18: Zunahme des Calciumeinstroms in Hippocampus-Zellen, die mit einer P2X7R-Agonist-Verbindung (BzATP) behandelt wurden.
  • 19a, b: Eindringen von Ethidiumbromid-Farbstoff in Hippocampus-Zellen, die (a) mit einer P2X7R-Agonist-Verbindung (BzATP) behandelt wurden oder die (b) mit einer P2X7R-Antagonist-Verbindung vorbehandelt wurden.
  • 19c: Agonist-Wirkung von BzATP und Tenidap auf die P2X7R-Aktivität. Die Calciumkanal-Aktivität von menschlichem P2X7R wurde unter Basisbedingungen vier bis zehn Sekunden gemessen. A: Negative Kontrolle, die aus Zellen bestand, die mit 10 μM Fluo-4-AM beladen wurden, ohne weitere Behandlung; B: Zellen, die nach vier Sekunden Messung des Grundniveaus mit 20 μM BzATP behandelt wurden; C: Zellen, die nach vier Sekunden Messung des Grundniveaus mit 50 μM Tenidap behandelt wurden.
  • 20: Wirkung einer Injektion einer P2X7R-Agonist-Verbindung (BzATP) in den Hippocampus auf das Verhalten im erzwungenen Schwimmtest.
  • 21: Offener Feld-Test, bei dem die lokomotorische Aktivität von Mäusen, die mit einer P2X7R-Agonist-Verbindung (BzATP) behandelt wurden, gemessen wurde.
  • 22: Vergleichsanalyse von apoptotischen Zellen im Hippocampus einer Maus, die mit einer Kontroll-Trägerlösung oder einer P2X7R-Agonist-Verbindung (BzATP) behandelt wurde.
  • 23: Wirkung einer Injektion des P2X7R-Antagonisten KN-62 und oATP in den Hippocampus auf das Verhalten während des erzwungenen Schwimmtests.
  • 24: Offener Feld-Test zum Messen der lokomotorischen Aktivität von Mäusen, die mit dem P2X7R-Antagonisten KN-62 und oATP behandelt wurden.
  • Die vorliegende Erfindung und ihre zahlreichen Vorteile werden anhand der folgenden Beispiel noch besser verständlich, die lediglich der Erläuterung dienen sollen und in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränken sollen.
  • Beispiel 1
  • Kopplungsanalyse der bipolaren affektiven Störung in einer homogenen menschlichen Population
  • 41 Familien unterschiedlicher Größe, die insgesamt 485 in die Studie aufgenommene Individuen aus der Region von Saguenay/Lac St-Jean enthielten, wurden in der Kopplungsanalyse verwendet. Die Individuen waren gemäß ihrer Diagnose wie folgt verteilt: 105 Individuen, die an einer Bipolaren Störung des Typs I (BPI) oder an einer schizoaffektiven Störung des bipolaren Typs litten; 42 Individuen, bei denen eine Bipolare Störung des Typs II (BPII) diagnostiziert wurde; 54 Individuen mit einer rezidivierenden schweren Depression; und 57 Individuen mit einer einzelnen Episode einer schweren Depression. Die restlichen 227 Individuen waren nicht betroffen und normal. Für die Berechnung wurde die folgende Klassifizierung verwendet: Individuen, bei denen BPI, schizoaffektive Störung, bipolarer Typ, BPII, oder rezidivierende schwere Depression diagnostiziert worden waren, wurden als Betroffene eingestuft (n = 201); Individuen mit einer einzelnen Episode einer schweren Depression wurden als unbekannter Phänotyp bewertet (n = 57); und alle anderen Diagnosen wurden als Nicht-Betroffene bewertet (n = 227).
  • Von jedem Individuum wurden Blutproben in 10-ml-Röhrchen K3 EDTA Vacutainer (Becton-Dickinson) gewonnen und die genomische DNA wurde durch den Isolierungs-Kit Puregene DNA Isolation Kit (Gentra Systems) isoliert. Das Blut wurde in ein konisches 50-ml-Röhrchen gegossen und mit vier Volumina Erythrocyten-Lyselösung („Red Blood Cell Lysis Solution") verdünnt. Nach einer Inkubation von zehn Minuten bei Raumtemperatur wurde das Röhrchen zehn Minuten bei 2000 g zentrifugiert und der Überstand so entnommen, dass das Zellpellet und 200 bis 400 μl der restlichen Flüssigkeit zurückblieben. Die Zellen wurden durch Verwirbelung des Röhrchens resuspendiert, sodann wurden 9 ml Zelllyselösung („Cell Lysis Solution") unter Auf- und Abpipettieren zugegeben. 40 μl RNase A-Lösung („RNAse A Solution") (20 mg/ml) wurden zugefügt und die Probe gemischt, indem das Röhrchen mehrmals umgedreht wurde. Die Probe wurde 15 Minuten bei 37°C inkubiert und auf Raumtemperatur abgekühlt. 3 ml Protein-Fällungslösung („Protein Precipitation Solution") wurden zum Zelllysat zugegeben. Das Röhrchen wurde 30 Sekunden kräftig verwirbelt und sodann zehn Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen gegossen, das 9 ml 100 % Isopropanol enthielt. Die Probe wurde gemischt, indem sie mehrmals vorsichtig umgedreht wurde. Das Röhrchen wurde fünf Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Das weiße DNA-Pellet wurde mit 10 ml 70 % Ethanol gewaschen und das Röhrchen drei Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Ethanol wurde abgegossen, und das Pellet ließ man an der Luft teilweise trocknen. Die DNA wurde in 500 μl DNA-Hydratisierungslösung („DNA Hydration Solution") solubilisiert. Die Endkonzentration wurde auf 300 bis 400 μg/ml eingestellt.
  • Für die Genotypisierung von Mikrosatellitenmarkern wurde ein auf Fluoreszenz beruhendes Verfahren verwendet. Kurz gesagt wurde die Region, die jede Wiederholungssequenz umfasste, durch PCR amplifiziert, indem ein nicht-markierter Primer und ein fluoreszierend markierter Primer verwendet wurden (Applied Biosystems Inc., CA, USA). Die Marker-assoziierten Farbstoffe und die Länge des entsprechenden PCR-Produkts sind in Tabelle 2 angegeben. Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung von 10 ng DNA-Probe, 0,2 Einheiten Platinum-Taq-DNA-Polymerase (Invitrogen, CA, USA), 20 mM Tris-Cl (pH 8,4), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 100 μM dNTP und 1,5 μM von jedem Primer in einem Endvolumen von 7 μl durchgeführt. Die Proben wurden drei Minuten bei 95°C inkubiert, um die Platinum Taq-DNA-Polymerase zu aktivieren, danach wurden zehn Zyklen einer PCR-Amplifikation wie folgt durchgeführt: 95°C für 15 Sekunden; 58°C für 15 Sekunden; 72°C für 30 Sekunden; danach wurden 15 Zyklen wie folgt durchgeführt: 89°C für 15 Sekunden; 58°C für 15 Sekunden; 72°C für 30 Sekunden. Schließlich wurden die Proben 30 Minuten bei 72°C inkubiert. Nach der PCR-Amplifikation wurden die Proben gemäß ihrem Farbstoff-markierten Primer und ihrer PCR-Produkt-Länge vereinigt (Pool von vier Proben). Die vereinigten Proben wurden auf einem ABI 3100 DNA-Analysator (Applied Biosystems Inc., CA, USA) aufgetrennt. Die resultierenden Daten wurden unter Verwendung von Genemapper2 (Applied Biosystems Inc., CA, USA) analysiert und in eine in einer Macintosh-Umgebung entworfene 4D-Datenbank (ACIUS), wie früher beschrieben, kompiliert (Morissette et al., Am. J. Med. Genet. (Neuropsychiatr. Genet. 88 (1999), 567–587).
  • Die Marker, die in der folgenden Kopplungsanalyse verwendet wurden, sind in Tabelle 2 angegeben. Die Rekombinationsfraktion (q) zwischen aufeinander folgenden Markern wurde gemäß den analysierten Familien berechnet. Tabelle 2 Genomische Marker, die für die Kopplungsanalyse verwendet wurden
    Locus Assoziierter Farbstoff Allel-Länge (bp) Entfernung (g) Kumulative Entferng. (cM) Heterozygotie (%)
    D12S1619 VIC 170–210 0.0135 0.00 74.5
    NBG11 VIC 204–218 0.006 1.37 65.5
    D12S1666 FAM 241–281 0.001 1.97 66.9
    NBG5 VIC 253–261 0.001 2.07 38.3
    D12S1721 VIC 263–299 0.005 2.17 72.1
    NBG8 VIC 166–188 0.011 2.67 73.3
    NBG6 NED 182–218 0.0115 3.79 73.9
    NBG9 VIC 156–180 0.0035 4.95 68.9
    NBG10 FAM 174–186 0.001 5.30 49.7
    NBG12 NED 165–207 0.009 5.40 64.2
    NBG4 NED 171–199 0.001 6.31 66.4
    NBG3 VIC 182–206 0.006 6.41 64.8
    NBG2 VIC 171–199 7.01 54.2
    • – Für die kumulative Entfernung in cMorgan wurde die Kartenfunktion nach Haldane verwendet.
  • Für eine parametrische Zweipunkt-Analyse wurde die MOD-Score-Analyse verwendet, wobei der parametrische LCD-Score anhand genetischer Modelle maximiert wurde.
  • Die folgenden Ergebnisse wurden durch eine MOD-Score-Analyse für rezessive Modelle erhalten. Tabelle 3 MOD-Score-Analyse für rezessive Modelle
    Locus Entfernung (q) Kumulative Entfernung (cM) LOD-Score (qmax)
    D12S1619 0.0135 0.00 3.46 (0.10)
    NBG11 0.006 1.37 4.06 (0.04)
    D12S1666 0.001 1.97 1.22 (0.14)
    NBG5 0.001 2.07 0.66 (0.16)
    D12S1721 0.005 2.17 2.82 (0.10)
    NBG8 0.011 2.67 1.51 (0.00)
    NBG6 0.0115 3.79 4.77 (0.06)
    NBG9 0.0035 4.95 0.75 (0.22)
    NBG10 0.001 5.30 0.74 (0.00)
    NBG12 0.009 5.40 1.41 (0.16)
    NBG4 0.001 6.31 3.56 (0.08)
    NBG3 0.006 6.41 3.96 (0.08)
    NBG2 7.01 2.59 (0.10)
  • Modellfreie LOD-Score-Studien wurden unter Verwendung von ANALYZE, sib_phase des ASPEX V1.85 Pakets (David Hinds und Neil Risch, 1999; ftp://lahmed.stanford.edu/pub/aspex, vgl. auch http://watson.hgen.pitt.edu/docs/usage.html) und SIMWALK2 (Sobel und Lange, Am. J. Hum. Genet. 58 (1996), 1323–1337) durchgeführt, um das gemeinsame Auftreten von Allelen („allele sharing") bei betroffenen Geschwisterpaaren zu analysieren. Das Programm ANALYZE gewichtet Sippschaften gemäß ihrer Größe. Das Programm ASPEX sib_phase nutzt Allel-Häufigkeiten, um fehlende Informationen zu rekonstruieren, und ist für Datensätze maßgeschneidert, bei denen die Eltern fehlen, jedoch weitere typisierte Kinder verwendet werden können, um die Eltern zu rekonstruieren und einzuteilen. SimWalk2 ist ein Computerprogramm der statistischen Genetik für Analysen des Haplotyps, der parametrischen Kopplung, der nicht-parametrischen Kopplung (NPL), der Identität nach Herkunft (IBD) und von Fehltypisierung bei einem beliebig großen Stammbaum. SimWalk2 nutzt Markov Chain Monte Carlo (MCMC) und simuliert Annealing-Algorithmen, um diese Mehrpunkt-Analysen durchführen zu können.
  • ASPEX sib_phase wurde zusammen mit zwei Berechnungsstrategien eingesetzt: erstens, indem völlig unabhängige Geschwisterpaare verwendet wurden; zweitens, indem alle betroffenen Geschwisterpaar-Kombinationen verwendet wurden. ASPEX wurde für Zweipunkt- und Mehrpunkt-Berechnungen durchgeführt.
  • Die Zweipunkt-Ergebnisse, die mit ANALYZE und ASPEX erhalten wurden, sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4 Zweipunkt-Ergebnisse, die mit ANALYZE und ASPEX erhalten wurden
    Locus Entfernung (q) Kumulative Entfernung (cM) Geschwister-Paar aus ANALYZE LOD-Score sib_phase LOD-Score unabh. Geschw.-P. sib_phase LOD-Score alle Geschw.-Paare
    D12S1619 0.0135 0.00 2.31 2.55 3.14
    NBG11 0.006 1.37 2.83 2.72 3.27
    D12S1666 0.001 1.97 1.01 2.52 3.14
    NBG5 0.001 2.07 0.50 2.52 3.13
    D12S1721 0.005 2.17 1.57 2.51 3.12
    NBG8 0.011 2.67 0.51 2.24 2.75
    NBG6 0.0115 3.79 2.55 2.11 2.64
    NBG9 0.0035 4.95 0.49 1.65 1.97
    NBG10 0.001 5.30 0.77 1.45 2.10
    NBG12 0.009 5.40 0.47 1.44 2.17
    NBG4 0.001 6.31 1.21 1.29 3.07
    NBG3 0.006 6.41 1.84 1.29 3.07
    NBG2 7.01 1.24 1.22 3.00
  • SIMWALK2 berechnete aufgrund von Stammbäumen vier unterschiedliche Statistiken. Diese Statistiken bestimmen den Grad der Clusterbildung bei den Marker-Allelen, die von den Gründern stammen.
  • Die Statistik A ist die Anzahl unterschiedlicher Gründer-Allele, die in den Allelen des Betroffenen enthalten sind, wobei sich diese Statistik am besten dafür eignet, eine Kopplung mit einem rezessiven Merkmal nachzuweisen. Die Statistik B ist die maximale Anzahl von Allelen bei den Betroffenen, die von einem beliebigen Gründer-Allel stammen, und eignet sich am besten dafür, die Kopplung mit einem dominanten Merkmal nachzuweisen. Die Statistik C ist die „Entropie" der Markerallele bei den Betroffenen. Die Statistik D ist das Ausmaß von gemeinsamen Allelen bei allen betroffenen Paaren, gemessen durch ihren IBD-Verwandtschafts-Koeffizienten. Die Statistiken C und D sind allgemeinere Statistiken, die angeben, ob einige wenige Gründer-Allele bei den betroffenen Personen überrepräsentiert sind.
  • Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse, die mit SIMWALK2 erhalten wurden. Die Autoren weisen darauf hin, dass p-Werte im Allgemeinen konservativ sein sollten.
  • Sie werden als –Log(p-Werte) ausgedrückt. Entsprechend ist: –Log(0,05) = 1,30, –Log(0,01) = 2, –Log(0,001) = 3 usw.. Tabelle 5 SIMWALK2-Analyse
    Locus Entfernung (q) Kumulative Entfernung (cM) STAT(A) –Log(p-Wert) STAT(B) –Log(p-Wert) STAT(C) –Log(p-Wert) STAT(D) –Log(p-Wert)
    D12S1619 0.0135 0.00 1.4550 14103 1.1306 1.1310
    NBG11 0.006 1.37 2.0157 1.4375 1.5955 1.9845
    D12S1666 0.001 1.97 2.0236 0.9765 1.4727 1.4614
    NBG5 0.001 2.07 1.7596 0.8558 1.3866 1.3602
    D12S1721 0.005 2.17 1.6628 1.1692 1.4235 1.6384
    NBG8 0.011 2.67 1.5374 0.6940 1.0623 1.1552
    NBG6 0.0115 3.79 1.5896 0.4452 1.0935 1.1766
    NBG9 0.0035 4.95 1.2677 0.3815 0.8412 0.9133
    NBG10 0.001 5.30 1.1117 0.3642 0.6987 0.7554
    NBG12 0.009 5.40 1.0809 0.3485 0.6368 0.7179
    NBG4 0.001 6.31 1.1024 0.4148 0.6368 0.8544
    NBG3 0.006 6.41 1.1040 0.4146 0.6373 0.8559
    NBG2 7.01 1.0963 0.5380 0.6587 0.9356
  • Mehrpunkt-Ergebnis, das mit ASPEX erhalten wurde, wenn nur unabhängige Geschwisterpaare verwendet wurden (1b). Der maximale LOD-Score-Wert wurde bei NBG11 festgestellt.
  • Mehrpunkt-Ergebnis, das mit ASPEX erhalten wurde, wenn alle Geschwisterpaare berücksichtigt wurden (1c). Der maximale LOD-Score-Wert wurde bei NBG11 festgestellt, jedoch erschien ein zweiter Peak bei NBG4 und NBG3.
  • Die durch ASPEX berechneten Mehrpunkt- und Zweipunkt-LOD-Score-Werte waren ähnlich. Der zweite Peak, der festgestellt wird, wenn alle Geschwisterpaare verwendet werden, lässt sich durch das Vorliegen eines rekombinanten betroffenen Individuums mit zahlreichen betroffenen Geschwistern erklären, welche die chromosomale Region gemeinsam haben, die, bezogen auf NBG12, in Richtung Telomer liegt. Diese Art von Individuen hat einen großen Einfluss auf LCD-Score-Werte, wenn anstelle eines einzigen Geschwisterpaars alle Geschwisterpaare verwendet werden. Diese Situation wurde bei zwei Sippschaften festgestellt.
  • Anschließend wurde eine Strata-Analyse durchgeführt. Obwohl HOMOG keinen Hinweis auf eine Heterogenität nachwies, wurde ein Homogenitätstest konstruiert, der auf gemeinsamen Allelen beruhte, die in ausgewählten chromosomalen Regionen gefunden wurden. Für diese Analyse wurden nur 20 der 41 Familien verwendet, da die anderen nicht in allen diesen Regionen genotypisiert waren. Für jeden Marker innerhalb der gewählten Regionen wurde der Anteil von Allelen, die den betroffenen Geschwisterpaaren aufgrund von IBD gemeinsam waren, mit ASPEX (sib_phase) bestimmt. Für jede beibehaltene Region wurde der Anteil von gemeinsamen Allelen als Variable für eine Hauptkomponentenanalyse („Principal Component Analysis") eingesetzt und die erste Hauptkomponente als Index der Kopplung genommen. An diesen Indizes wurde eine Korrelationsanalyse durchgeführt, um eine Heterogenität (Korrelation < 0) oder eine Epistasie (Korrelation > 0) nachzuweisen. Der Fisher-Algorithmus wurde eingesetzt, um eine Einteilung in zwei Gruppen von Familien als mit einem bestimmten Locus gekoppelt oder nicht-gekoppelt durchzuführen. Eine negative Korrelation wurde zwischen dem Chromosom-12-Bereich und dem Chromosom-15-Bereich festgestellt (r = –0,51; p = 0,023). Eine Cluster-Analyse legte nahe, dass 11 Familien von 20 mit Chromosom 12 gekoppelt waren. Diese Unter-Stichprobe wurde die Strata genannt.
  • Diese Strata schloss elf Familien ein (266 aufgenommene Individuen), die 52 BPI oder schizoaffektive Störungen, bipolarer Typ, 20 BPII und 28 rezidivierende schwere Depressionen umfassten.
  • Die folgenden MOD-Score-Werte, die in Tabelle 6 angegeben sind, wurden durch rezessive Modelle erhalten. Tabelle 6 MOD-Scores bei rezessiven Modellen
    Locus Entfernung (q) Kumulative Entfernung (cM) LOD-Score (qmax)
    D12S1619 0.0135 0.00 4.03 (0.08)
    NBG11 0.006 1.37 4.98 (0.00)
    D12S1666 0.001 1.97 1.49 (0.12)
    NBG5 0.001 2.07 0.79 (0.14)
    D12S1721 0.005 2.17 4.23 (0.06)
    NBG8 0.011 2.67 2.79 (0.00)
    NBG6 0.0115 3.79 5.06 (0.06)
    NBG9 0.0035 4.95 1.57 (0.14)
    NBG10 0.001 5.30 1.73 (0.00)
    NBG12 0.009 5.40 1.65 (0.12)
    NBG4 0.001 6.31 4.60 (0.08)
    NBG3 0.006 6.41 4.84 (0.06)
    NBG2 7.01 2.80 (0.06)
  • Modellfreie LOD-Score-Ergebnisse, die mit ANALYZE und ASPEX bei Anwendung auf die Strata erhalten wurden, sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7 Modellfreier LOD-Score, erhalten mit ANALYZE und ASPEX
    Locus Entfernung (q) Kumulative Entfernung (cM) ANALYZE LOD-Score sib_phase LOD-Score Unabhängige Geschwisterpaare sib_phase LOD-Score Alle Geschwisterpaare
    D12S1619 0.0135 0.00 4.54 5.29 7.65
    NBG11 0.006 1.37 4.29 5.34 7.70
    D12S1666 0.001 1.97 2.77 5.36 7.74
    NBG5 0.001 2.07 0.67 5.36 7.74
    D12S1721 0.005 2.17 4.48 5.35 7.74
    NBG8 0.011 2.67 2.97 4.87 7.00
    NBG6 0.0115 3.79 4.05 4.59 6.76
    NBG9 0.0035 4.95 2.03 3.72 5.41
    NBG10 0.001 5.30 2.00 3.42 5.89
    NBG12 0.009 5.40 0.89 3.44 6.11
    NBG4 0.001 6.31 2.84 3.71 9.00
    NBG3 0.006 6.41 3.89 3.71 9.01
    NBG2 7.01 1.91 3.52 8.73
  • Modellfreie Ergebnisse, die mit SIMWALK2 erhalten wurden, sind in Tabelle 8 dargestellt. Tabelle 8 Modellfreier LCD-Score, erhalten mit SIMWALK2
    Locus Entfernung (q) Kumulative Entfernung (cM) STAT(A) –Log(p-Wert) STAT(B) –Log(p-Wert) STAT(C) –Log(p-Wert) STAT(D) –Log(p-Wert)
    D12S1619 0.0135 0,00 2,5963 0,9565 3.2156 2,3584
    NBG11 0.006 1,37 3,0698 1,7400 3,7747 3,0103
    D12S1666 0.001 1,97 2,9340 1,6546 3,5812 2,7223
    NBG5 0.001 2,07 2,9781 1,2722 3,6505 2,7846
    D12S1721 0.005 2,17 2,9680 1,2630 3,6844 2,7752
    NBG8 0.011 2,67 3,0954 1,0804 3,4399 2,5554
    NBG6 0.0115 3,79 3,1632 1,0672 3,2670 2,5956
    NBG9 0.0035 4,95 2,2106 1,0137 2,7765 2,4456
    NBG10 0.001 5,30 2,5513 1,0251 2,7625 2,1914
    NBG12 0.009 5,40 2,4893 0,9868 2,6841 2,0920
    NBG4 0.001 6,31 2,9028 1,1312 3,4063 2,8156
    NBG3 0.006 6,41 2,9070 1,1326 3,4637 2,8300
    NBG2 7,01 2,8430 1,1108 3,3135 2,7978
  • Mehrpunkt-Ergebnisse bei der Strata mit ASPEX sib_phase unter Berücksichtigung von nur unabhängigen Geschwisterpaaren (1b) oder von allen Geschwisterpaaren (1c) sind in den 1d und 1e dargestellt. Wie schon vorstehend angeführt, erschien ein zweiter Peak, wenn alle Geschwisterpaare berücksichtigt wurden.
  • Ein Konfidenzintervall wurde berechnet. GENEFINDER (Liang et al., Am. J. Hum. Genet. 66 (2000), 1631–1641) wurde eingesetzt, um die Position des Anfälligkeits-Gens zu bestimmen (genannt t). Das Verfahren beruhte auf dem gemeinsamen Auftreten mehrerer Marker durch IBD (Identität nach Herkunft) bei betroffenen Geschwisterpaaren. Für den Zweck unserer Analyse wurden die Nachkommen in Sippschaften eingeteilt. 56 Kernfamilien und 183 Geschwisterpaare wurden verwendet. Lang, K. Y., Huang, C. Y., Beaty, T. H., (2000), „A unified sampling approach for multipoint analysis of qualitative and quantitative traits in sib pairs", Am. J. Hum. Genet. 66: 1631–1641.
  • Die GENEFINDER-Ergebnisse zeigen die Position eines Anfälligkeits-Gens für affektive Störungen 3,19 ± 0,446 cM in Richtung Telomer zu dem Marker D12S1721 (D12S1721 liegt etwa bei 136,82 cM auf der Geschlechts-gemittelten Marshfield-Karte von Chromosom 12).
    95 % Cl: [2,32, 4,06];
    99 % Cl: [2,03, 4,35];
    99,9 % Cl: [1,71, 4,67].
  • Aus der Strata wurden 24 Kern- und 107 Geschwisterpaare erhalten und die Position des Anfälligkeits-Gens bei 3,07 ± 0,57 (vgl. die vorstehende Karte) bestimmt. Das folgende Konfidenzintervall (Cl) wurde erhalten.
    95 % Cl: [1,95, 4,19];
    99 % Cl: [1,59, 4,55];
    99,9 % Cl: [1,18, 4,96].
  • Eine Assoziationsstudie wurde unter Verwendung der NBG-Mikrosatellitenmarker mit CLUMP durchgeführt (Sham und Curtis, Ann. Hum. Genet. 59 (1995), 97–105). Die Stichproben waren wie folgt verteilt: 83 männlich/Fall; 124 weiblich/Fall; 95 männlich/Kontrolle; und 101 weiblich/Kontrolle. Die p-Werte wurden unter Verwendung von 1000 Simulationen bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 9 zusammengestellt. Tabelle 9 Assoziationsstudie unter Verwendung von NBG-Mikrosatelliten
    Locus Stichprobe T1-Statistik (p-Wert) T2-Statistik (p-Wert) T3-Statistik (p-Wert) T4-Statistik (p-Wert)
    Fall Kontrolle
    NBG11 204 129 0.226 0.562 0.410 0.421
    NBG5 206 194 0.972 0.980 0.948 0.971
    NBG8 206 194 0.983 1.000 0.994 0.978
    NBG6 206 194 0.147 0.074 0.759 0.485
    NBG9 206 190 0.512 0.940 0.786 0.583
    NBG10 206 190 0.594 0.480 0.403 0.709
    NBG12 206 190 0.002 0.019 0.003 0.117
  • Die T1-Statistik ist die übliche Chi-Quadrat-Statistik an der rohen Kontingenztabelle. Die T2-Statistik ist die übliche Chi-Quadrat-Statistik an der Kontingenztabelle, die nach einem Collapsing von Spalten mit kleinen erwarteten Werten erhalten wurde. Die T3-Statistik ist die größte Chi-Quadrat-Statistik, die durch Vergleichen der einen Spalte der ursprünglichen Tabelle mit dem Gesamtwert der anderen Spalten erhalten wurde.
  • Die T4-Statistik ist die größte Chi-Quadrat-Statistik, die durch Vergleichen einer beliebigen Kombination von Allelen mit dem Rest erhalten wurde.
  • Nur der NBG12-Marker ergab eine signifikante Assoziation auf dem Niveau von 1 %. Für die anderen Marker gab es keine einzelnen Allele, die mit einer bipolaren Störung assoziiert zu sein scheinen. Es macht den Eindruck, dass bei den Betroffenen keine Gründer-Allele überrepräsentiert waren. Für eine Assoziation von Genotypen mit den NBG-Markern wurde kein signifikantes Ergebnis erhalten.
  • Weitere, auf Mikrosatellitenmarkern basierende Assoziationsstudien wurden unter Verwendung von CLUMP an Stichproben durchgeführt, die noch zusätzliche Kontroll- und Fall-Individuen enthielten. Die p-Werte wurden unter Verwendung von 1000 Simulationen bestimmt. Tabelle 9a Empirische p-Werte, festgestellt mit CLUMP für die Statistiken T1 und T3 für Allel- und Genotyp-Analysen von Mikrosatellitenmarkern
    Name Effektive Allele Genotypen
    Fälle Kontrollen T1 (p-Wert) T3 (p-Wert) T1 (p-Wert) T3 (p-Wert)
    NBG11 204 98 0.250 0.421 0.680 0.553
    D12S1666 208 175 0.366 0.543 0.393 0.476
    NBG5 213 179 0.969 0.934 0.997 1.000
    D12S1721 210 176 0.693 0.463 0.805 0.838
    NBG8 213 179 0.754 0.921 0.973 0.929
    NBG6 213 179 0.008 0.356 0.172 0.449
    NBG9 213 175 0.759 0.768 0.690 0.606
    NBG10 213 175 0.521 0.178 0.122 0.173
    D12S1349 212 180 0.887 0.864 0.782 0.816
    NBG12 213 175 0.002 <10–3 0.018 0.552
    NBG4 207 178 0.418 0.506 0.813 0.545
    NBG3 209 175 0.171 0.829 0.601 0.897
    D12S378 211 180 0.171 0.405 0.540 0.560
    NBG2 210 170 0.896 0.749 0.210 0.613
    D12S1614 210 179 0.803 0.692 0.710 0.831
    D12S342 211 180 0.394 0.740 0.445 0.622
    D12S340 209 179 0.890 0.869 0.895 0.838
    D12S1639 209 180 0.087 0.170 0.652 0.295
    D12S1634 211 181 0.361 0.248 0.505 0.590
    D12S2075 203 181 0.023 0.157 0.085 0.451
  • Die HWE-Hypothese wurde für jeden Mikrosatellitenmarker auf dem Niveau von 5 % nach Anwendung der konservativen Bonferroni-Korrekturen für mehrfaches Testen bestätigt (Bland und Altman, Brit. J. Med. 310 (1995), 170). In Tabelle 9a sind empirische p-Werte angegeben, die mit CLUMP für Allel- und Genotyp-Assoziationsanalysen ermittelt wurden. Empirische p-Werte von unter 0,005 wurden beim Marker NBG12 für T1- und T3-Statistiken bei der Allel-Assoziationsanalyse festgestellt. Die T1-Statistik legte eine Allel-Assoziation zwischen bipolaren affektiven Störungen und NBG6 nahe (empirischer p-Wert = 0,008). Außerdem wurde ein gerade noch signifikanter empirischer p-Wert von 0,023 bei dem am weitesten distal liegenden Marker D12S2075 festgestellt.
  • Zusammenfassend wird durch die parametrischen und modellfreien Mehrpunkt-Ergebnisse nahegelegt, dass man Gene untersuchen sollte, die zwischen D12S1619 und D12S1666 liegen. Außerdem sollten gemäß den GENEFINDER-Ergebnissen Gene, die, bezogen auf NBG9, in Richtung Centromer liegen, für eine Assoziations- und Kopplungs-Ungleichgewichts-Analyse in Betracht gezogen werden. Darüber hinaus war eine positive Assoziation mit dem Marker NBG6 zu sehen, der im Intron 9 des P2X7R-Gens liegt.
  • Beispiel 2
  • Physikalische Kartierung und Mutationsanalyse von Chromosom 12, wodurch P2X7R mit bipolaren affektiven Störungen assoziiert wird
  • Die konservativste Voraussage für die Krankheits-assoziierte Region ist zwischen den Markern NBG11 und NBG2 enthalten (vgl. 1a). Diese Region wurde gemäß Kopplungs- und Assoziationsanalysen, wie in Beispiel 1 beschrieben, eingegrenzt, wobei Genethon-Marker und NBG-Marker verwendet wurden. Die ungefähre Länge dieser Region beträgt 5,2 Mb. Zwei größere Lücken (zwischen FLJ10701 und FLJ32372 und zwischen FLJ1466 und MONDOA) waren in dieser Region enthalten. Mindestens 73 Gene wurden in diesem Bereich aufgelistet, von denen 48 bekannte Gene sind und 25 unbekannt sind, jedoch mit mRNA und/oder EST-Clustern assoziiert sind, wobei dies auf dem letzten, von UCSC verfügbaren Genome Assembly (November 2002) basiert. Vorausgesagte Gene wurden nicht aufgeführt. Jedoch hat die Bestimmung von Cl 99 % (Konfidenzintervall) unter Verwendung von GENEFINDER die interessanteste Region auf den Bereich zwischen den Markern D12S1666 und NBG9 eingeschränkt. Diese genomische Region deckt 1,6 Mb ab und schließt mindestens 28 Gene ein, und sie weist keine größere Lücke auf. Somit wurde der Begriff fBAD-Region (familiäre Bipolare Affektive Störungen) verwendet, um das genomische Segment zwischen D12S1666 und NBG9 zu beschreiben. Gene, die innerhalb dieser Region gefunden wurden, schließen CaMKK2, CABP, P2X7, P2X4, PIN, PLA2, GIB, CIT, PXN, Rab35 und APC5 ein. Jedoch wäre es nach dem Stand der Technik für einen gewöhnlichen Fachmann nicht offensichtlich gewesen, P2X7R als das Gen auszuwählen, das mit affektiven Krankheiten assoziiert ist. Dagegen wären andere Gene aus den vorstehend angegebenen offensichtlich gewesen.
  • Z.B. ist das Gen CaMKK2 (auch als Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase-beta oder CaMKKb bekannt) eine Serin/Threonin-Proteinkinase, die an Ca2 +-abhängigen Signalgebungswegen beteiligt ist. CaMKK2 kann in vitro die stromabwärts liegenden Kinasen CaMKIV und CaMKI, welche die Gentranskription modulieren, durch Phosphorylierung von Transkriptionsfaktoren aktivieren (z.B.: CREB, SRF, MEF2; Corcoran und Means, J. Biol. Chem. 276 (2001), 2975–2978; Soderling, Trends Biochem. Sci. 24 (1999), 232–236). Ihre Rolle in der Ca2+-Kaskade ist nicht kritisch. Einige Studien schlagen vor, dass CaMKs ohne die CaMKKs-Phosphorylierung aktiviert werden könnten (Matsushita und Nairn, J. Biol. Chem. 274 (1998), 10086–10093). Jedoch würde der CaMKK-Phosphorylierungsschritt zur Amplifikation des Ca2+-Signals beitragen, da CaMKK für eine Aktivierung durch Ca2+/Calmodulin empfindlicher ist, weshalb CaMKK ein wichtiger Mediator wäre, wenn die Spiegel von intrazellulärem Ca2+ niedrig sind (Anderson et al., J. Biol. Chem. 273 (1998), 31880–31889).
  • CaMKK2 ist ein offensichtliches Ziel für Depression, da der Stand der Technik nahelegt, dass cAMP-abhängige Signalgebungswege (vermittelt durch PKA-Aktivierung) im Gehirn von Patienten mit Bipolaren Affektiven Störungen gestört sind (Field et al., J. Neurochem. 73 (1997), 1704–1710; Rahman et al., J. Neurochem. 68 (1997), 297–304; Takahashi et al., J. Neurosci. 19 (1999), 610–618). Gemäß einer Studie unter Verwendung von Lymphoblasten-Zelllinien könnten Bipolare Störungen mit erhöhten intrazellulären Calciumspiegeln in Zusammenhang stehen (Yoon et al., Mol. Psychiatry 6 (2001), 678–683). Außerdem fanden einige Gruppen Zusammenhänge zwischen Antidepressiva und einer CaMK-Aktivierung (Budziszewska et al., Br. J. Pharmacol. 130 (2000), 1385–1393; Consogno et al., Neuropsychopharmacology 24 (2001), 21–30; Mori et al., Neuropharmacology 40 (2001), 448–456; Zanotti et al., Neuropharmacology 37 (1998), 1081–1089). Weiterhin legt die Hemmung von CaMKK durch eine PKA-vermittelte Phosphorylierung einen engen Zusammenhang zwischen den beiden Wegen nahe (Matsushita et al., J. Biol. Chem. 273 (1999), 21473–21481). Diese Beobachtungen würden einen Fachmann vermuten lassen, dass CaMKK2 das Gen ist, welches für eine bipolare affektive Erkrankung verantwortlich ist.
  • Ein anderer offensichtlicher Kandidat für affektive Störungen wäre das CABP1-Gen gewesen, welches durch eine alternative Verwendung der neun codierenden Exons vier neuronale Ca2+-bindende Proteine erzeugt, die L-CABP, S-CABP, Calbrain und Caldendrin sind (Haeseleer et al., J. Biol. Chem. 275 (2000), 1247–1260). Ihre Expression ist fast vollständig auf Gehirngewebe beschränkt. Eine Funktionsstudie von Calbrain zeigt seine negative Wirkung auf die Ca2+/Calmodulinabhängige CaMKII-Aktivität, indem es mit der CaM-bindenden Domäne von CaMKII kompetitiv interagiert (Yamagushi et al., J. Biol. Chem. 274 (1999), 3610–3616). Für andere alternative CABP1-Produkte würde man ähnliche Rollen in der Ca2+-Signalgebung erwarten. Für den Fachmann wäre die Beteiligung des CABP1-Gens an Ca2 +-abhängigen Signalgebungswegen ein offensichtlicher Hinweis darauf, dass er dieses Gen als einen Kandidaten für eine bipolare affektive Störung auswählen sollte. Zwar wurden alle CABP1-Exons auf das Vorliegen von Mutationen analysiert, jedoch wurden erstaunlicherweise nur zwei Mutationen in nicht-codierenden Regionen nachgewiesen.
  • Das PIN-Gen (Protein-Inhibitor von NOS (Stickstoffmonooxid-Synthase)) ist ein weiterer offensichtlicher Kandidat für ein Gen, das für eine bipolare affektive Störung verantwortlich sein könnte. Stickstoffmonooxid (NO) im Gehirn könnte an Apoptose, Synaptogenese und Nervenentwicklung beteiligt sein. Da NO nicht wie andere Neurotransmitter in Vesikeln gelagert werden kann, wird seine Freisetzung durch die Aktivität von NOS (Stickstoffmonooxid-Synthase) reguliert. PIN ist ein direkter Inhibitor von NOS, indem er an den aktiven Homodimer-Komplex von NOS bindet und ihn destabilisiert (Jaffrey et al., Science 274 (1996), 774–777). PIN ist während der Evolution hoch-konserviert und wird in zahlreichen Zelltypen exprimiert. Eine kürzliche klinische Studie, bei der Plasma-Nitratspiegel in depressiven Stadien untersucht wurden, legt nahe, dass die NO-Produktion bei einer Depression erhöht ist (Suzuki et al., J. Affect. Disord. 63 (2001), 221–224) und dass dies möglicherweise durch einen Mangel in der NOS-Hemmung zustande kommt. Außerdem wurden in einem Mausmodell NO-Synthase-Antagonisten mit antidepressiven Eigenschaften in Verbindung gebracht (Harkin et al., 1999; Karolewicz et al., Eur. J. Pharmacol. 372 (1999), 215–220). Somit wäre PIN ein offensichtlicher Kandidat, jedoch würde aufgrund der pleiotrophen Wirkung von NO ein Mangel in der PIN-Funktion zahlreiche nicht-zusammenhängende Störungen im ganzen Körper bewirken. Somit hätte ein Fachmann ohne die in der vorliegenden Beschreibung dargelegten Informationen PIN, und nicht P2X7R, als das Gen vorausgesagt, das mit affektiven Störungen assoziiert ist.
  • Die menschliche Phospholipase A2-Gruppe IB (PLA2G1B) katalysiert die Freisetzung von Fettsäuren aus Glycerin-3-phosphocholinen. Gene der Phospholipase A2 (PLA2) werden in zahlreichen Geweben exprimiert. Einige Studien haben Zusammenhänge zwischen einer exzessiven PLA2-Aktivität im Gehirn und affektiven Störungen gezeigt (Chang et al., Neurochem. Res. 23 (1998), 887–892; Nibbeln et al., Biol. Psychiatry 25 (1989), 945–961). Außerdem wurden in anderen genetischen Studien Assoziationen zwischen dem PLA2G1B-Gen und der bipolaren affektiven Störung gefunden (Dawson et al., Psychiatr. Genet. 5 (1995), 177–180). Somit stellt PLAG1B einen wahrscheinlichen Kandidaten für affektive Störungen dar. Jedoch wurde in dem vorliegenden Beispiel nur eine einzige stumme Mutation innerhalb von Exon 3 des PLAG1B-Gens gefunden.
  • Das menschliche Rho-assoziierte Citron-Kinase-Gen-Protein (CIT) ist ein 183-kDa-Protein, das sich an die GTPase Rho assoziiert. CIT hat eine große Ähnlichkeit mit ROCK- und ROK-Proteinen, die andere Rho-assoziierte Kinasen darstellen (Madaule et al., Nature 394 (1998), 491–494). Rho-GTPasen sind an zahlreichen Prozessen beteiligt, wie Cytoskelett-Organisation, Membran-Trafficking, Zellwachstum und Transkriptions-Aktivierung (Van Aelst und D'Souza-Schorey, Genes Dev. 11 (1997), 2295–2322). Untersuchungen an Gehirn-Varianten von Citron-K (ohne die Kinase-Domäne) zeigen die Assoziation mit Proteinen der postsynaptischen Dichte (PSD-95), dies legt eine Rolle entweder in der Organisation oder in der Funktion der Synapse nahe (Zhang et al., J. Neurosci 19 (1999), 96–108; Furuyashiki et al., J. Neurosci. 19 (1999), 109–118).
  • Das menschliche Paxillin-(PXN-)Gen codiert ein 68-kDa-Protein, das in fokalen Adhäsionen gefunden wird. Es liegt innerhalb fokaler Adhäsionen vor, wo Adhäsionsmoleküle dynamisch mit dem Cytoskelett interagieren (Salgia et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 5039–5047). Die Signalgebungswege, welche diese dynamischen Interaktionen regulieren, werden seit kurzem näher untersucht. Zahlreiche Beobachtungen legen nahe, dass Paxillin an der Übertragung von Signalen von Wachstumsfaktor-Rezeptoren zu fokalen Adhäsionen beteiligt ist. Das Paxillin wird in zahlreichen Geweben, einschließlich des Gehirns, exprimiert.
  • Wie jedoch nachstehend erklärt wird, handelt es sich bei dem Gen, welches als die Ursache von affektiven Krankheiten identifiziert wurde, um den P2X7-Rezeptor (P2X7R).
  • In codierenden Sequenzen und an Exon-Intron-Grenzen der vorstehend erwähnten Gene wurde nach Mutationen gesucht, denn es ist eher wahrscheinlich, dass solche Mutationen funktionell signifikante Einzel-Nucleotid-Polymorphismen („Single Nucleotide Polymorphisms", SNPs) ergeben. Die Ausgangs-Stichprobe bestand aus 16 nicht-verwandten betroffenen Individuen aus der Region Saguenay/Lac St-Jean, wodurch man eine Teststärke („power") von 80 % zum Nachweisen von Polymorphismen mit einer Häufigkeit von 0,05 erhält. Um Polymorphismen zu identifizieren, werden die Sequenzen von Interesse zuerst durch PCR amplifiziert. Danach werden die PCR-Produkte auf Whatman GF/C-Membranen (VWR, Montreal, Kanada) gereinigt und unter Verwendung des ds-DNA-Quantifizierungstests PicoGreen dsDNA Quantitation Assay (Molecular Probes, Oregon, USA) quantitativ bestimmt. 4 ng von gereinigten PCR-Produkten werden sequenziert, wobei der Sequenzierkit DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences, Baie D'Urfé, Kanada) verwendet wird. Die Sequenzierprodukte werden auf den DNA-Analysatoren, einem ABI PRISM 3730XL DNA Analyzer und „ABI PRISM 3700 DNA Analyzer analysiert. Die PCR-Produkte werden in beiden Richtungen sequenziert. Die in den untersuchten Genen identifizierten SNPs sind in Tabelle 10 angegeben. Tabelle 10 Mutationsanalyse zwischen den Markern D12S1666 und NBG9
    Gene Positonen Variationen Allele Modifikationen
    Rab35 Exon06 RABE06A 486G-A Stumm Asn162
    Rab35 Intron04 RABI04A 51C-T Unbekannt
    Rab35 Intron03 RABI03A 33G-A Unbekannt
    Rab35 Intron02 RABI02B 85G-A Unbekannt
    Rab35 Intron02 RABI02A 76C-G Unbekannt
    PXN Exon11 PXNE11A 1527C-T Stumm Thr509
    PXN Exon06 PXNE06A 750C-T Stumm Ser250
    PXN Exon02 PXNE02A 217G-A Gly73Ser
    PLA2G1B Exon03 PLA2G1BE03A 294C-T Stumm Ser98
    PIN 5'UTR01 PINUTR01A -49T-G Unbekannt
    PIN 5'UTR01 PINUTR01B -80T-C Unbekannt
    PIN Intron02 PINI02A 26C-T Unbekannt
    PIN Intron02 PINI02B 50C-T Unbekannt
    CaBP Intron04 CaBPI04A 35C-T Unbekannt
    CaBP Exon01 CaBPE01A -23A-G Unbekannt
    OASL Exon02 OASLE02A 213G-T Stumm Gly72
    OASL Exon02 OASLE02B 408C-T Stumm Leu136
    OASL Exon05 OASLE05A 1042G-A Val348Met
    OASL Exon06 OASLE06A 1509G-A Stumm Ser503
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5L 362T-C Unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5M 532T-G Unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5K 1100A-G Unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5J 1122A-G Unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5I 1171C-G Unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5F 1351T-C Unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5N 1702G-A Unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5G 1731T-G Unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5H 1860C-T Unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5A 2162C-A Unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5B 2238C-T Unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5D 2373A-G Unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5E 2569G-A unbekannt
    P2X7R 5'UTR P2XR7UTR5C 2702G-A Unbekannt
    P2X7R Intron01 P2XR7I01C 3166G-C Unbekannt
    P2X7R Intron01 P2XR7I01A 24778C-T Unbekannt
    P2X7R Intron01 P2XR7I01B 24830C-T Unbekannt
    P2X7R Exon02 P2XR7v02A 24942T-C Val76Ala
    P2X7R Exon03 P2XR7E03A 26188C-T Arg117Trp
    P2X7R Intron03 P2XR7I03A 26308A-G Unbekannt
    P2X7R Intron03 P2XR7I03B 26422G-A unbekannt
    P2X7R Intron04 P2XR7I04A 323940-A Unbekannt
    P2X7R Intron04 P2XR7v05B 32434T-C Unbekannt
    P2X7R Exon05 P2XR7E05D 32493G-A Gly150Arg
    P2X7R Exon05 P2XR7v05A 32507C-T Tyr155His
    P2X7R Exon05 P2XR7E05C 32783C-T Stumm Cys168
    P2X7R Intron05 P2XR7I05C 32783A-C Unbekannt
    P2X7R Intron05 P2XR7I05D 35309T-C Unbekannt
    P2X7R Intron05 P2XR7I05B 35374C-T Unbekannt
    P2X7R Intron05 P2XR7I05A 35378A-C Unbekannt
    F2X7R Exon06 P2XR7E06A 35438G-A Glu186Lys
    P2X7R Exon06 P2XR7E06B 35454T-C Leu191Pro
    P2X7R Intron06 P2XR7I06C 35549T-C Unbekannt
    P2X7R Intron06 P2XR7I06G 35641G-C Unbekannt
    P2X7R Intron06 P2XR7I06D 35725A-C Unbekannt
    P2X7R Intron06 P2XR7I06F 36001T-G Unbekannt
    P2X7R Intron06 P2XR7I06E 36064A-T Unbekannt
    P2X7R Intron06 P2XR7I06A 36091DelGTTT Unbekannt
    P2X7R Intron06 P2XA7I06B 36108C-G Unbekannt
    P2X7R Intron07 P2XR7107A 36374C-T Unbekannt
    P2X7R Intron07 P2XR7I07B 36378G-A Unbekannt
    P2X7R Intron07 P2XR7I07C 36387T-A Unbekannt
    P2X7R Intron07 P2XR7I07D 36398G-C Unbekannt
    P2X7R Intron07 P2XR7I07E 37439C-T Unbekannt
    P2X7R Intron07 P2XR7I07F 37513T-C Unbekannt
    P2X7R Exon08 P2XR7E08C 37604C-T Arg270Cys
    P2X7R Exon08 P2XR7v08A 37605G-A Arg270His
    P2X7R Exon08 P2XR7v08B 37623G-A Arg276His
    P2X7R Exon08 P2XR7E08D 37633C-T Stumm Asp279
    P2X7R Intron09 P2XR7v11A 47214C-T Unbekannt
    P2X7R Exon11 P2XR7v11B 47383G-A Ala348Thr
    P2X7R Exon11 P2XR7v11C 47411C-G Thr357Ser
    P2XC7R Intron11 P2XR7I11D 47563T-C Unbekannt
    P2X7R Intron12 P2XR7I12A 54307C-T Unbekannt
    P2X7R Intron12 P2XR7I12B 54308G-A Unbekannt
    P2X7R Exon13 P2XR7v13F 54399C-T Ala433Val
    P2X7R Exon13 P2XR7v13A 54480A-G Gln460Arg
    P2X7R Exon13 P2XR7v13B 54523C-T Stumm Pro474
    P2X7R Exon 13 P2XR7v13G 54562DelCCCTGAGAG CCACAGGTGCCT Del. v. 7 As. 488–494 PESHRCL
    P2X7R Exon13 P2XR7v13C 54588A-C Glu496Ala
    P2X7R Exon13 P2XR7v13H 54664C-G Stumm His521
    P2X7R Exon13 P2XR7813D 54703G-T Stumm Leu534
    P2X7R Exon13 P2XR7E13J 54804A-T Ile568Asn
    P2X7R Exon13 P2XR7v13I 54834G-A Arg578Gln
    P2X7R Exon13 P2XR7v13E 54847G-A Stumm Pro582
    P2X7R 3'UTR P2XR7UTR3A 55169C-A Unbekannt
    P2X7R 3'UTR P2XR7UTR3B 55170A-C Unbekannt
    P2X7R 3'UTR P2XR7UTR3C 55171A-C Unbekannt
    P2X7R 3'UTR P2XR7UTR3D 55917C-T Unbekannt
    P2X7R 3'UTR P2XR7UTR3E 54925G-A Unbekannt
    P2X4R 5'UTR P2XR4UTR5I -1956G-A Unbekannt
    P2X4R 5'UTR P2XR4UTR5H -1649G-A Unbekannt
    P2X4R 5'UTR P2XR4UTR5G -800G-A Unbekannt
    P2X4R 5'UTR P2XR4UTR5A -648C-A Unbekannt
    P2X4R 5'UTR P2XR4UTR5B -537A-G Unbekannt
    P2X4R 5'UTR P2XR4UTR5C -437A-G Unbekannt
    P2X4R 5'UTR P2XR4UTR5J -206VNRG unbekannt
    P2X4R 5'UTR P2XR4UTR5D -211C-G Unbekannt
    P2X4R 5'UTR P2XR4UTR5F -150VNRGGGCCCC Unbekannt
    P2X4R 5'UTR P2XR4UTR5E -98G-T Unbekannt
    P2X4R Intron01 P2XR4I01A 31G-T Unbekannt
    P2X4R Exon02 P2XR4E02A 262G-A Stumme Mutation Ala87
    P2X4R Intron02 P2XR4I02A 4600C-T Unbekannt
    P2X4R Intron03 P2XR4I03A 15G-A Unbekannt
    P2X4R Intron03 P2XR4I03B 72G-A Unbekannt
    P2X4R Exon04 P2XR4E04A 355G-A Ile119Val
    P2X4R Exon04 P2XR4E04A 375G-A Stumm Val125
    P2X4R Intron04 P2XR4I04B 17T-C Unbekannt
    P2X4R Intron04 P2XR4I04A 32G-A Unbekannt
    P2X4R Exon05 P2XR4E05A 465T-C Stumm Ser155
    P2X4R Exon07 P2XR4E07A 724A-G Ser242Gly
    P2X4R Intron08 P2XR4I08A DelT Unbekannt
    P2X4R Exon09 P2XR4E09A 944A-G Tyr315Cys
    P2X4R Intron10 P2XR4I10A 11G-T Unbekannt
    P2X4R Intron10 P2XR4I10B G-C Unbekannt
    P2X4R Intron10 P2XR4I10C A-G Unbekannt
    P2X4R Intron11 P2XR4I11B C-G Unbekannt
    P2X4R Intron11 P2XR4I11C T-A Unbekannt
    P2X4R Intron11 P2XR4I11A 374C-T Unbekannt
    CaMKK2 3'UTR CaMKK2UTR3bA 733C-T Unbekannt
    CaMKK2 3'UTR CaMKK2UTR3aB 390G-A Unbekannt
    CaMKK2 3'UTR CaMKK2UTR3aA 239G-A Unbekannt
    CaMKK2 Intron15 CaMKK2I15B 325T-C Unbekannt
    CaMKK2 Intron15 CaMKK2I15A 169G-A Unbekannt
    CaMKK2 Intron14 CaMKK2I14A 224A-G Unbekannt
    CaMKK2 Intron10 CaMKK2I10A 156DelGTGATCCGCCT G Unbekannt
    CaMKK2 intron09 CaMKK2I09B 528A-G Unbekannt
    CaMKK2 intron09 CaMKK2I09A 521A-G Unbekannt
    CaMKK2 Exon09 SNP6f18v5 1095C-A Stumm Ile365
    CaMKK2 Exon09 SNP6f18v4 1087C-T Arg363Cys
    CaMKK2 Exon05 CaMKKE05A 687C-T Stumm Pro229
    CaMKK2 Intron03 CaMKK2I03A 10C-T Unbekannt
    CaMKK2 Intron02 CaMKK2I02A 39C-T Unbekannt
    CaMKK2 Intron01 CaMKK2I01B 2911G-C unbekannt
    CaMKK2 Intron01 CaMKK2I01A 89C-A Unbekannt
    CaMKK2 Exon01 SNP6f18v2 253A-T Thr85Ser
    CaMKK2 Exon01 SNP6f18v1 29G-A Ser10Asn
    CaMKK2 5'UTR01 CaMK2UTR01B 253T-C Unbekannt
    CaMKK2 5'UTR01 CaMKK2UTR01A 63C-A Unbekannt
    APC5 Intron01 APC5I01A 10G-T Unbekannt
    APC5 intron01 APC5I01B 50A-T Unbekannt
    APC5 Intron05 APC5I05A 73T-C Unbekannt
    APC5 Intron06 APC5I06A 73T-G Unbekannt
    APC5 Exon11 APC5EI1A 1416C-T Stumm His472
  • Jeder SNP in den Genen Rab35, PXN, PLA2G1B, PIN, CaBP, OASL, P2X4R, CaMKK2 und APC5 wurde nach dem Gen, in dem er gefunden wurde, und nach seiner Position in diesem Gen (Intron- oder Exon-Regionen) bezeichnet. Jeder SNP in dem P2X7R-Gen wurde entsprechend seiner Position auf SEQ ID NO: 1 bezeichnet. In der Spalte Allele ist die Position und die festgestellte Variation angegeben. In codierenden Regionen wird die Position auf das Start-Codon bezogen, wohingegen die Position der Intron-SNPs auf den Beginn des entsprechenden Introns bezogen wird (sofern bekannt). Primer, die zum Identifizieren der SNPs in dem P2X7R verwendet werden, und die Position der jeweiligen SNPs, die in den Tabellen 2 und 12 enthalten sind, sind in Tabelle 1a und in den SEQ ID NO: 52 bis 111 definiert.
  • Assoziationsstudien wurden durchgeführt, bei denen Fehlsinn-SNPs verwendet wurden. Fehlsinn-SNPs oder SNPs, die in der Nähe der Spleißstellen liegen könnten, wurden eingesetzt, da die Wahrscheinlichkeit größer ist, dass Krankheiten mit einer inkorrekten Funktion von Proteinen assoziiert sind. Die Fall-Gruppe bestand aus Bipolar-I-Individuen, schizoaffektiver bipolarer Typ (182 Personen), und bipolar-II-diagnostizierten Personen (31 Individuen). Zahlreiche Kontrollen aus der Region Saguenay/Lac St-Jean stammten von Steinert-, Glaucoma- und Paget-DNA-Banken. Bei den Kontrollindividuen waren keine affektiven Störungen diagnostiziert worden. Gemäß dem Risiko, während eines Lebens an bipolaren Störungen zu erkranken (1 %), ist es nicht erforderlich, die Kontrollen auf psychiatrische Störungen durchzumustern.
  • Die direkte Sequenzierung von PCR-Produkten ist bei weitem das genaueste Analyseverfahren, und es stellt für uns angesichts der Kapazität unserer Sequenzierungsplattform das Verfahren der Wahl dar. PCR-Produkte wurden durch direkte Sequenzierung, wie vorstehend beschrieben, analysiert. Nach der Sequenzanalyse werden die Individuen unter Verwendung eines selbst entwickelten Programms, GENO.pl, automatisch für den entsprechenden SNP typisiert. Die Ergebnisse der SNP-Genotypisierung werden in eine 4D-Datenbank kompiliert.
  • Die Assoziationshypothese wurde mit CLUMP getestet (Sham und Curtis, 1995, Ann. Hum. Genet. 59: 97–105). Die p-Werte wurden anhand von 1000 Simulationen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 angegeben. Die T1-Statistik, welche die übliche Chi-Quadrat-Statistik an der rohen Kontingenztabelle ist, wurde eingesetzt, um auf Allel-Assoziation zu testen. Außerdem wurde die größte Chi-Quadrat-Statistik, die durch Vergleichen von einer Spalte der ursprünglichen Tabelle mit dem Gesamtwert der anderen Spalten erhalten wurde, genannt T3-Statistik, zu der vorherigen hinzugefügt, um auf eine mögliche Genotyp-Assoziation zu testen, da die Ergebnisse der T1-Statistik möglicherweise verzerrt sind, wenn die Kontingenztabelle Zellen mit niedrigen Werten enthält. Tabelle 11 Assoziationshypothese unter Verwendung von CLUMP
    Effektive Allel-Analyse p-Wert (T1) Genotyp-Analyse
    Gen SNPs Fälle Kontrollen p-Wert (T2) p-Wert (T3)
    P2X7R P2XR7v11B 208 211 0.795 0.036 0.028
    P2XR7v13A 212 214 0.344 0.250 0.186
    P2XR7v13E 212 211 0.780 0.017 0.017
    CAMKK2 SNP6f18v5 206 135 1.00 1.00 1.00
    SNP6f18v4 206 135 0.816 0.962 0.841
    SNP6f18v2 205 135 0.057 0.110 0.095
    SNP6f18v1 206 135 0.512 0.532 0.385
  • Die Assoziationsstudien unter Verwendung von SNPs in P2X7, P2X4 und CaMKK2 zeigen Assoziationen, die auf einem Niveau von etwa 5 % oder weniger signifikant sind. Drei Genotyp-Assoziationen in P2X7 wurden festgestellt. Jedoch sind die SNPs P2XR7v11B und P2XR7v13E, basierend auf einer Kontingenztabelle, eng miteinander gekoppelt. Außerdem liegt eine Allel-Assoziation auf dem Niveau von 5,7 % für SNP6f18v2 in CaMKK2 vor. Die mit jedem relevanten SNP zusammenhängenden Informationen finden sich in den Tabellen 10 und 12.
  • Weitere Assoziationsstudien unter Verwendung von CLUMP wurden an Stichproben durchgeführt, die noch mehr Fall- und Kontrollindividuen enthalten. Die p-Werte wurden anhand von 1000 Simulationen bestimmt. Tabelle 11a Empirische p-Werte und Odds Ratio (OR) (Verhältnis von Odds) mit einem Konfidenzintervall von 95 %, festgestellt mit CLUMP, für Allel- und Genotyp-Analyse von SNPs
    Gen Marker (Marker-Rangfolge) Allel-Häufigkeiten Effektive Allele Genotypen
    Fälle Kontrollen T1 p-Wert OR OR 95% Cl T1 p-Wert T3 p-Wert
    P2XR7 P2XR7UTR5F (1) C (0.18); T (0.82) 212 208 0.280 1.21 0.86-1.71 0.067 0.069
    P2XR7UTR5G (2) G (0.09); T (0.91) 211 204 0.481 1.19 0.76-1.87 0.261 0.231
    P2XR7UTR5H (3) C (0.95); T (0.05) 210 202 0.549 1.19 0.67-2.13 0.768 0.582
    P2XR7UTR5A (4) A (0.05); C (0.95) 210 207 0.526 1.26 0.68-2.34 0.754 0.517
    P2XR7UTR5B (5) C (0.78); T (0.22) 211 207 0.629 1.09 0.79-1.50 0.104 0.128
    P2XR7UTR5D (6) A (0.96); G (0.04) 211 205 0.268 1.43 0.77-2.65 0.598 0.240
    P2XR7UTR5E (7) A (0.04); G (0.96) 211 210 0.658 123 0.65-2.33 0.139 0.234
    P2XR7UTR5C (8) A (0.22); G (0.78) 208 210 0.889 1.04 0.75-1.44 0.168 0.293
    P2XR7I01B (9) C (0.98); T (0.02) 210 207 0.352 1.71 0.67-4.39 0.348 0.348
    P2XR7v02A (10) C (0.05); F (0.95) 211 208 0.189 1.49 0.84-2.64 0.397 0.167
    P2XR7I04A (11) A (0.01); G (0.99) 211 211 0.344 0.25 0.03-2.23 0.356 0.356
    P2XR7v05B (12) C (0.75); T (0.25) 212 211 0.854 1.03 0.76-1.41 0.234 0.335
    P2XR7E05D (13) A (0.01); G (0.99) 211 211 0.726 1.51 0.42-5.38 0.735 0.735
    P2XR7v05A (14) C (0.48); T (0.52) 211 209 0.638 1.07 0.82-1.40 0.895 0.895
    P2XR7E05C (15) C (0.97); T (0.03) 210 211 0.195 0.45 0.16-1.31 0.349 0.276
    P2XR7I07E (16) C (0.64); T (0.36) 208 214 0.394 0.87 0.66-1.16 0.057 0.064
    P2XR7v08A (17) A (0.24); G (0.76) 210 212 0.221 1.22 0.90-1.67 0.433 0.496
    P2XR7v08B (18) A (0.05); G (0.95) 210 213 0.386 0.71 0.36-1.41 0.520 0.662
    P2XR7V11A (19) C (0.88); T (0.12) 213 149 0.394 0.60 0.50-1.29 0.387 0.463
    P2XR7v11B (20) A (0.36); G (0.64) 208 211 0.795 1.04 0.79-1.38 0.036 0.028
    P2XR7v11C (21) C (0.89); G (0.11) 211 212 0.409 0.82 0.52-1.28 0.303 0.661
    P2XR7v13F (22) C (0.99); T (0.01) 196 207 0.030 3.24 1.04-10.12 0.039 0.039
    P2XR7v13A (23) A (0.84); G (0.16) 212 214 0.344 1.21 0.85-1.72 0.250 0.186
    P2XR7v13B (24) C (0.89); T (0.11) 207 212 0.494 0.83 0.53-1.31 0.315 0.699
    P2XR7v13C (25) A (0.77); C(0.23) 211 213 0.731 0.95 0.68-1.31 0.557 0.616
    P2XR7V13H (26) C (0.98); G (0.02) 211 213 0.238 1.75 0.68-4.49 0.236 0.236
    P2XR7E13D (27) G (0.89); T (0.11) 211 213 0.435 0.82 0.53-1.28 0.268 0.680
    P2XR7E13J (28) A (0.03); T (0.97) 204 199 0.179 0.48 0.16-1.42 0.329 0.329
    P2XR7v13E (29) A (0.36); G (0.64) 212 213 0.841 104 0.79-1.37 0.026 0.025
    P2XR7UTR3E (30) A (0.04); G (0.96) 205 197 1.000 0.96 0.45-2.04 1.000 1.000
    P2XR7UTR3A (31) A (0.47); C (0.53) 208 209 0.932 0.99 0.75-1.30 0.264 0.239
    P2XR7UTR3B (32) A (0.92); C (0.08) 208 210 0.174 0.65 0.38-1.14 0.151 0.303
    P2XR7UTR3C (33) A (0.95); C (0.05) 208 210 0.395 0.71 0.36-1.40 0.508 0.667
    P2XR4 UTR5A A (0.18); C (0.82) 212 210 0.285 0.82 0.57-1.18 0.514 0.484
    UTR5B A (0.69); G (0.31) 212 210 0.670 0.93 0.70-1.25 0.833 0.833
    I06A C (0.84); T (0.16) 207 192 0.212 0.78 0.53-1.16 0.398 0.217
    E07A A (0.84); G (0.16) 212 208 0.294 0.81 0.55-1.19 0.536 0.479
    UTR3A C (0.74); G (0.26) 211 203 0.015 1.50 1.11-2.02 0.021 0.014
    UTR3B A (0.97); T (0.03) 211 209 0.653 0.81 0.33-1.97 0.649 0.649
    UTR3C C (0.03); G (0.97) 211 209 0.653 0.81 0.33-1.97 0.672 0.672
    CAMK K2 E09B A (0.03); C (0.97) 208 214 0.830 0.85 0.36-2.00 0.829 0.829
    E09A C (0.83); T (0.17) 208 214 0.202 0.78 0.54-1.14 0.446 0.473
    E01B A (0.35); T (0.65) 207 214 0.048 1.33 1.01-1.76 0.126 0.218
    E01A C (0.93); T (0.07) 208 214 0.189 1.44 0.86-2.39 0.439 0.237
  • 33 SNPs in P2X7R, sieben SNPs in P2X4R und vier SNPs in CaMKK2 mit einer geringen Allelhäufigkeit von mehr als oder gleich 1 % wurden genotypisiert (Tabelle 11 a). Die Genotyp-Verteilungen dieser SNPs wichen nicht signifikant von HWE ab. Statistisch signifikante Anstiege der geringen Allelhäufigkeit auf dem 5-%-Niveau wurden in der Gruppe der bipolaren affektiven Störungen bei p2XR7v13F (p-Wert = 0,030, OR = 3,24, 95 % Cl = 1,04–10,12), P2XR4UTR3A (p-Wert = 0,015, OR = 1,50, 95 % Cl = 1,11–2,02) und CAMKK2E01B (p-Wert = 0,048, OR = 1,33, 95 % Cl = 1,01–1,76) festgestellt. Auch unterschied sich die Verteilung der Genotypen an den SNPs P2XR7v13F und P2XR4UTR3A auf diesem Niveau signifikant für T1- und T3-Statistiken, mit einem Anstieg von Heterozygoten in der Fall-Stichprobe. Ein SNP aus Exon 11 von P2X7R, P2XR7v11B, und ein anderer aus Exon 13, P2XR7v13E, zeigten einen Unterschied in Genotyp-Verteilungen mit einem minimalen p-Wert von 0,028 und 0,025, die beide mit der T3-Statistik festgestellt wurden. Wieder wurde in der bipolaren Stichprobe bei diesen Polymorphismen ein Anstieg in der Heterozygoten-Häufigkeit von 12 % bzw. 13 % festgestellt.
  • Signifikante Haplotyp-Assoziationstests führten für unterschiedliche SNP-Gruppen, welche das P2X7R-Gen überlappten, zu p-Werten von unter 0,5 % (Tabelle 11b). Als wir die Sammlung von SNPs im Bereich von SNP32507 bis SNP54847 (Tabelle 11c) als ein Beispiel für die Haplotyp-Verteilung nahmen, konnten wir beim Haplotyp Nr. 1 den größten Unterschied von Häufigkeiten zwischen Fällen und Kontrollen feststellen (Tabelle 11 d). Der Haplotyp Nr. 2 ist ein weiteres Beispiel eines Haplotyps, der in der Fallgruppe häufiger festgestellt wird.
  • Andererseits ist die Häufigkeit für Haplotyp Nr. 3 in der Kontrollprobe leicht erhöht (Unterschied der Häufigkeiten = 0,091). In Tabelle 11e sind die Peptidprodukte angegeben, die von den in Tabelle 11d dargestellten Nucleotid-Haplotypen hergeleitet sind. Tabelle 11b Haplotypen, die Allel-Assoziationen zeigen, die für Ti- oder T3-Statistiken auf dem 0,5-%-Niveau signifikant sind
    Haplotyp (Marker-Rangfolgen 1) Anz. SNPs Entferng.2 (bp) Haplotyp effektive T1-Statistik T3-Statistik Anzahl von Haplotypen 3
    Fälle Kontrollen (p-Wert) (p-Wert)
    P2XR7I01B-P2XR7v13A (9-23) 15 29618 361 257 0.0003 0.0252 20
    P2XR7v02A-P2XR7v13B (10-24) 15 29550 361 260 0.00008 0.0294 20
    P2XR7I04A-P2XR7v13C (11-25) 15 22164 360 264 0.0003 0.0323 19
    P2XR7v05B-P2XR7v13H (12-26) 15 22200 361 265 0.0004 0.0065 18
    P2XR7E05D-P2XR7E13D (13-27) 15 22180 365 268 0.0035 0.0287 16
    P2XR7v05A-R2XR7E13J (14-28) 15 22267 352 246 0.0007 0.0163 15
    P2XR7E05C-P2XR7v13E (15-29) 15 22269 353 250 0.0012 0.0200 10
    P2XR7I07E-P2XR7UTR3E (16-30) 15 17452 355 247 0.0020 0.0192 11
    • 1 Die Marker-Rangfolgen von SNPs im Haplotyp, wie in Tabelle 11b angegeben, beziehen sich auf diejenigen, die in Tabelle 11a genotypisiert wurden;
    • 2 Abstand zwischen den zwei am weitesten entfernten SNPs des Haplotyps;
    • 3 Zahl von Haplotypen mit Häufigkeiten > 1 % in Fall- oder Kontrollgruppen.
    Tabelle 11c Position und Allel für Haplotyp-bildende SNPs. Haplotypen sind in Tabelle 11d angegeben
    SEQ ID NO Polymorphismus Position
    1 C-T 32507
    1 C-T 32548
    1 C-T 37439
    1 G-A 37605
    1 G-A 37623
    1 C-T 47214
    1 G-A 47383
    1 C-G 47411
    1 C-T 54399
    1 A-G 54480
    1 C-T 54523
    1 A-C 54588
    1 C-T 54664
    1 G-T 54703
    1 T-A 54804
    1 G-A 54847
    Tabelle 11d Haplotypen mit signifikantem Unterschied von Häufigkeiten zwischen Betroffenen und Kontrollindividuen
    Haplotyp 32507 32548 37439 37605 37623 47214 47383 47411 54399 54480
    No 1 C C C A G C G C C A
    No 2 C C C G G C G C C A
    No 3 C C T G G C A C C A
    Haplotyp 54523 54588 54664 54703 54804 54847 FBetroff. FKontroll.
    No 1 C A C G T G 0.20 0.13
    No 2 C C C G T G 0.05 0.01
    No 3 C A C G T A 0.11 0.20
    Tabelle 11e Entsprechende Aminosäuren für cSNPs, wie in Tabelle 11c beschrieben. Ihre Position ist entspricht der in SEQ ID NO: 3 angegeben
    Position in SEQ ID NO3 155 168 270 276 348 357 433
    Haplotyp 1 Y C H R A T A
    Haplatyp 2 Y C R R A T A
    Haplotyp 3 Y C R R T T A
    Position in SEQ ID NO3 460 474 496 521 534 568 582
    Haplotyp 1 Q P E H L I P
    Haplotyp 2 Q P A H L I P
    Haplotyp 3 Q P E H L I P
  • Beispiel 3
  • Polymorphismen, die in P2X7R in Individuen gefunden wurden, die an einer Depression leiden
  • Assoziationsstudien unter Verwendung von SNPs in dem P2X7R-Gen wurden in einer Fall-/Kontroll-Stichprobe (535 Individuen) aus einer deutschen Population durchgeführt. Die Fall-Gruppe bestand aus 36 Individuen, bei denen bipolare Störungen vom Typ I oder Typ II diagnostiziert worden waren, und aus 279 Individuen, bei denen unipolare Störungen (d.h. Depression) diagnostiziert worden waren, wobei es sich um 133 betroffene Männer und 182 betroffene Frauen handelte. Die restlichen 220 Individuen, die wir zu den Kontrollen zählen, waren normal (d.h. sie wurden als nicht-depressiv diagnostiziert) und umfassten 81 Männer und 182 Frauen sowie 14 Personen unbekannten Geschlechts. Es wurde darauf geachtet, dass in beiden Gruppen die gleiche Geschlechterverteilung vorlag.
  • SNPs wurden in dieser Stichprobe unter Verwendung einer Untergruppe von 24 betroffenen Individuen identifiziert. Die in der deutschen Population nachgewiesenen SNPs in dem P2X7R-Gen waren ähnlich, wenn nicht identisch, zu den SNPs, die in der Population von Saguenay/Lac St-Jean gefunden wurden (vgl. Tabelle 12). Außerdem wurden in der deutschen Population andere seltene Fehlsinn-SNPs festgestellt, wie Arg117Trp (P2XR7E03A), Glu186Lys (P2XR7E06A), Leu191Pro (P2XR7E06B), Ile568Asn (P2XR7E13J). Diese Aminosäuren sind zwischen orthologen P2X7-Genen ziemlich stark konserviert. Es ist möglich, dass die Mutation Ile568Asn (P2XR7E13J) an der Oberflächenexpression von P2X7 beteiligt ist. Tabelle 12 Vergleich zwischen Polymorphismen in dem menschlichen P2X7R-Gen in der Population von Saguenay/Lac St-Jean und in der deutschen Population
    Assoziierte Exons oder Introns Variation (SNP oder andere) Allel Position* Modifikation Häufigkeit (Kanada) Häufigkeit (Deutschld.)
    5'UTR P2XR7UTR5L T-C 362 Unbekannt 0,13 0,08
    5'UTR P2XR7UTR5M T-G 532 Unbekannt 0,16 0,1
    5'UTR P2XR7UTR5K AG 1100 Unbekannt 0,13 0,13
    5'UTR P2XR7UTR5J A-G 1122 Unbekannt 0,13 0,13
    5'UTR P2XR7UTR5I C-G 1171 Unbekannt 0,06 0,02
    5'UTR P2XR7UTR5F T-C 1351 Unbekannt 0,3 0,12
    5'UTR P2XR7UTR5N G-A 1702 Unbekannt – 0,02
    5'UTR P2XR7UTR5G T-G 1731 Unbekannt 0,17 0,15
    5'UTR P2XR7UTR5H C-T 1860 Unbekannt 0,07 0,15
    5'UTR P2XR7UTR5A C-A 2162 Unbekannt 0,07 0,12
    5'UTR P2XR7UTR5B C-T 2238 Unbekannt 0,3 0,27
    5'UTR P2XR7UTR5D A-G 2373 Unbekannt 0,07 0,12
    5'UTR P2XR7UTR5E G-A 2569 Unbekannt 0,1 0,02
    5'UTR P2XR7UTR5C G-A 2702 Unbekannt 0,31 0,27
    Intron01 P2XR7I01C G-C 3166 Unbekannt 0,03 –
    Intron01 P2XR7I01A C-T 24778 Unbekannt 0,03 –
    Intron01 P2XR7I01B C-T 24830 Unbekannt 0,03 selten
    Exon02 P2XR7v02A T-C 24942 Val76Ala 0,06 0,08
    Exon03 P2XR7E03A C-T 26188 Arg117Trp – selten
    Intron03 P2XR7I03A A-G 26308 Unbekannt 0,7 0,44
    Intron03 P2XR7I03B G-A 26422 Unbekannt 0,18 0,12
    Intron04 P2XR7I04A G-A 32394 unbekannt 0,03 0,01
    Intron04 P2XR7v05B T-C 32434 Unbekannt 0,33 0,29
    Exon05 P2XR7E05D G-A 32493 Gly150Arg Selten 0,02
    Exon05 P2XR7E05E G-A 32506 Stumm Val154 – RARE
    Exon05 P2XR7v05A C-T 32507 Tyr155His 0,33 0,44
    Exon05 P2XR7E05C C-T 32548 Stumm Cys168 Selten 0,02
    Intron05 P2XR7I05C A-C 32783 Unbekannt 0,25 –
    Intron05 P2KR7I05D T-C 35309 unbekannt ND 0,35
    Intron05 P2XR7I05B C-T 35374 Unbekannt 0,7 0,67
    Intron05 P2XR7I05A A-C 35378 Unbekannt 0,7 0,65
    Exon06 P2XR7E06A G-A 35438 Glu186Lys – 0,02
    Exon06 P2XR7E06B T-C 35454 Leu191Pro – 0,02
    Intron06 P2XR7I06C T-C 35549 Unbekannt 0,04 0,08
    Intron06 P2XR7I06G G-C 35641 Unbekannt – 0,02
    Intron06 P2XR7I06D A-C 35725 Unbekannt 0,21 0,27
    Intron06 P2XR7I06F T-G 36001 Unbekannt 0,17 0,3
    Intron06 P2XR7I06E A-T 36064 Unbekannt 0,11 0,1
    Intron06 P2XR7I06A DelGTTT 36091-36094 Unbekannt 0,14 0,3
    Intron06 P2XR7I06B C-G 36108 Unbekannt 0,14 0,29
    Intron07 P2XR7I07A C-T 36374 Unbekannt 0,07 –
    Intron07 P2XR7I07B G-A 36378 Unbekannt 0,21 0,28
    Intron07 P2XR7I07C T-A 36387 Unbekannt 0,21 0,28
    Intron07 P2XR7I07D G-C 36398 Unbekannt 0,42 0,4
    Intron07 P2XR7I07E C-T 37439 Unbekannt 0,41 –
    Intron07 P2XR7I07F T-C 37513 Unbekannt – Selten
    Exon08 P2XR7E08C C-T 37604 Arg270Cys Selten –
    Exon08 P2XR7v08A G-A 37605 Arg270His 0,46 0,24
    Exon08 P2XR7v08B G-A 37623 Arg276His 0,03 0,02
    Exon08 P2XR7E08D C-T 37633 Stumm Asp279 Selten –
    Intron09 P2XR7v11A C-T 47214 Unbekannt 0,08 0,03
    Exon11 P2XR7v11B G-A 47383 Ala348Thr 0,5 0,44
    Exon11 P2XR7v11C C-G 47411 Thr357Ser 0,08 0,07
    Intron11 P2XR7I11D T-C 47563 Unbekannt 0,43 0,44
    Intron12 P2XR7I12A C-T 54307 Unbekannt 0,32 –
    Intron12 P2XR7I12B G-A 54308 Unbekannt 0,03 –
    Exon13 P2XR7v13F C-T 54399 Ala433Val 0,13 –
    Exon13 P2XR7v13A A-G 54480 Gln460Arg 0,13 0,17
    Exon13 P2XR7v13B C-T 54523 Stumm Pro474 0,1 0,07
    Exon13 P2XR7v13G DelCCCTGAGA GCCACAGG TGCCT 54562-54582 Del. v. 7 As. 488 bls 494 PESHRCL) Selten
    Exon13 P2XR7v13C A-C 54588 Glu496Ata 0,13 0,06
    Exon13 P2XR7v13H C-G 54664 His521Gln 0,03 –
    Exon13 P2XR7E13D G-T 54703 Stumm Leu534 0,1 0,02
    Exon13 P2XR7E13J A-T 54804 Ile568Asn – 0,01
    Exon13 P2XR7v13I G-A 54834 Arg578Gln – Selten
    Exon13 P2XR7v13E G-A 54847 Stumm Pro582 0,4 0,45
    3'UTR P2XR7UTR3A C-A 55169 unbekannt 0,48 0,37
    3'UTR P2XR7UTR3B A-C 55170 Unbekannt 0,09 0,1
    3'UTR P2XR7UTR3C A-C 55171 unbekannt 0,05 0,06
    3'UTR P2XR7UTR3D C-T 55917 Unbekannt 0,001 –
    3'UTR P2XR7UTR3E G-A 54925 Unbekannt – 0,01
  • Die Position und Nummerierung der Polymorphismen entspricht dem wie in SEQ ID NO: 1 definierten menschlichen P2X7R-Gen. Um die genomische Organisation des P2X7R-Gens zu identifizieren, wurden zuerst BAC-Clone unter Verwendung von bekannten polymorphen Markern, sequenzmarkierte Stellen (STSs), BAC-Endsequenzen und exprimierten sequenzmarkierten Stellen (ESTs) organisiert. Nicht-orientierte und ungeordnete DNA-Regionen wurden unter Verwendung von Phrap wieder zu Sequenzen zusammengebaut und die Stücke neu angeordnet, indem P2X7R-Exons als Gerüste verwendet wurden. Keine vollständige Genorganisation für P2X7R wurde durchgeführt. Es liegt nur eine partielle Genstruktur vom Exon 6 bis 13, NT_037809, vor. Deshalb könnte diese genomische Sequenz, die das wie in SEQ ID NO: 1 dargestellte P2X7R-Gen umfasst, einige Sequenzfehler enthalten, insbesondere in Intron-Regionen. Die Primer, die für die SNP-Amplifikation und -Sequenzierung verwendet wurden, sind in Tabelle 1a angegeben und in den SEQ ID NOs: 52 bis 111 dargestellt.
  • Die statistische Analyse wurde gemäß dem CLUMP-Verfahren (Sham und Curtis, 1995, Ann. Hum. Genet. 59: 97–105) durchgeführt. In Tabelle 13 sind die Allel- und Genotyp-Assoziationsstudien für SNPs in dem P2X7-Gen zusammengefasst. Tabelle 13 Allel- und Genotyp-Assoziationsstudien unter Verwendung von CLUMP
    Effektive Allel-Analyse Genotyp-Analyse
    Locus Allel-Häufigkeiten* Fälle Kontrollen p-Wert (T1) p-Wert (T1) p-Wert (T3)
    P2XR7UTR5F 2(0.23); 4(0.77) 311 217 0.109 0.319 0.339
    P2XR7UTR5N 1(0.001); 3(0.999)** 314 218 0.038 0.448 0.448
    P2XR7UTR5G 2(0.001); 3(0.105); 4(0.894) 314 218 0.993 0.714 0.761
    P2XR7UTR5H 2(0.92); 4(0.08) 312 215 0.743 0.884 0.754
    P2XR7UTR5A 1(0.08); 2(0.92) 312 219 0.557 0.786 0.678
    P2XR7UTR5B 2(0.73); 4(0.27) 310 218 0.485 0.761 0.814
    P2XR7UTR5D 1(0.92); 3(0.08) 311 217 0.555 0.787 0.691
    P2XR7v02A 2(0.09); 4(0.91) 313 218 0.501 0.729 0.591
    P2XR7I04A 1(0.04); 3(0.96) 314 220 0.604 0.433 0.348
    P2XR7v05B 2(0.69); 4(0.31) 314 220 0.133 0.270 0.325
    P2XR7F05D 1(0.03); 3(0.97) 314 220 0.842 0.827 0.827
    P2XR7E05E 1(0.006); 3(0.994)** 314 220 0.048 0.045 0.045
    P2XR7v05A 2(0.60); 4(0.40) 314 220 0.038 0.144 0.219
    P2XR7E05C 2(0.98); 4(0.02) 314 220 1.000 1.000 1.000
    P2XR7I07F 2(0.002); 4(0.98) 315 219 1.000 1.000 1.000
    P2XA7v08A 1(0.23); 3(0.77) 315 219 0.454 0.673 0.634
    P2XR7v08B 1(0.02); 3(0.98) 315 219 0.636 0.638 0.638
    P2XR7v11A 2(0.95); 4(0.05) 311 218 0.348 0.391 0.436
    P2XR7v11H 1(0.45); 3(0.55) 312 218 0.605 0.803 0.790
    P2XR7v11C 2(0.93); 3(0.07) 312 218 0.793 0.256 0.924
    P2XR7I11D 2(0.45); 4(0.55) 312 219 0.665 0.735 0.740
    P2XR7v13A 1(0.87); 3(0.13) 305 215 0.017 <0.001 <0.001
    P2XR7v13B 2(0.93); 4(0.07) 305 216 1.000 0.228 0.677
    P2XR7V13C 1(0.91); 2(0.09) 305 216 0.151 0.006 0.008
    P2XR7E13D 3(0.94); 4(0.06) 315 219 0.402 0.429 0.474
    P2XR7E13J 1(0.01); 4(0.99) 315 219 0.618 0.603 0.603
    P2XR7E13I 1(0.004); 3(0.996) 315 219 0.999 1.000 1.000
    P2XR7v13E 1(0.46); 3(0.54) 314 219 0.699 0.866 0.845
    P2XR7UTR3A 1(0.518); 2(0.482) 314 219 0.617 0.850 0.875
    P2XR7UTR3B 1(0.966); 2(0.034) 313 219 0.522 0.850 0.643
    P2XR7UTR3C 1(0.979); 2(0.021) 313 219 0.636 0.505 0.382
    P2XR7UTR3E 1(0.02); 3(0.98) 315 219 0.147 0.161 0.161
    • * Die Spalte Allel-Häufigkeiten stellt das jeweilige Allel für jeden SNP (A = 1, C = 2, G = 3, T = 4) und die entsprechende Häufigkeit dar.
    • ** Für diesen SNP haben wir in beiden (Allel- und Genotyp-)2X2-Kontingenztabellen eine Nullzelle („zero cell") festgestellt. Ein p-Wert < 0,045 wurde anhand des exakten Fisher-Tests ermittelt.
  • Für die SNP-Analyse wurde das Hardy-Weinberg-(HW-)Gleichgewicht in den Kontrollproben kontrolliert. Das Hardy-Weinberg-Prinzip (HWP) kann wie folgt angegeben werden: In einer großen Population mit Zufallspaarung, in der es keine Migration oder Selektion eines bestimmten Genotyps gibt und die Mutationsrate konstant bleibt, werden die Anteile der verschiedenen Genotypen von einer Generation zu einer anderen unverändert bleiben. Man betrachtet hier ein Zwei-Allel- System mit den Allelen A und a. Wenn der Anteil von A in der Population als p und der Anteil von a als q dargestellt wird, stellt p plus q die Gesamtsumme der Allele an diesem Locus dar, d.h. p + q = 1. Das HWP kann eingesetzt werden, um gewisse Probleme in einer Population zu bestimmen, wie Auswahl des Ehepartners, Inzucht, Schichtung („stratification") der Population, Beimischung, verminderte Lebensfähigkeit eines bestimmten Genotyps. Der SNP P2XR7v13A entsprach nicht dem Hardy-Weinberg-Gleichgewicht.
  • Außerdem wurde die Assoziationshypothese unter Verwendung einer Allel-Positivitäts-Tabelle getestet, von der bekannt ist, dass sie für den Nachweis von Anfälligkeits-Allelen geeignet ist, deren Vererbung in dominanter Art erfolgt (Ohashi und Tokunaga, J. Hum. Genet. 44 (1999), 246–248; Ohashi et al., Ann. Hum. Genet. 65 (2001), 197–206). Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden ähnliche Ergebnisse erhalten wie diejenigen, die unter Verwendung der Allel-Häufigkeitstabellen erhalten wurden, mit der Ausnahme von P2XR7v05A, bei dem die p-Werte 0,253 betrugen. Somit zeigt P2XR7v05A in dieser Analyse eine weniger signifikante Assoziation. Dieser Unterschied kann der Vererbungsart zugeschrieben werden.
  • Der Anteil von unipolaren Individuen in der Analyse der deutschen Population ist ziemlich wichtig, da in einem Bericht der American Psychiatric Assoziation (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4. Auflage, überarbeiteter Text (DMS-IV-TR), American Psychiatric Press, 2000) ein Anstieg der Anfälligkeit für unipolare Störungen in Gruppen von Frauen festgestellt wird. Um zu bestimmen, ob die Variable des Geschlechts einen Einfluss auf die Assoziationsanalyse haben könnte, wurden weitere Assoziationsstudien durchgeführt, indem die Geschlechtsparameter kontrolliert wurden. Aus dieser Studie wurden die normalen Individuen in der deutschen Population ohne Angabe des Geschlechts ausgeschlossen. Danach wurde ein logistisches Regressionsmodell hergeleitet, indem das Geschlecht als Faktor aufgenommen wurde. Um ein Modell zu erhalten, das so stabil wie möglich ist, wurde das Regressionsmodell unter Verwendung des Unterschieds zwischen log-Wahrscheinlichkeiten für Modelle mit oder ohne Wechselwirkung minimiert (Hosmer und Lemeshow, „Applied logistic regression", John Wiley and Sons, 1989). Die Strategie, die für die Handhabung der Nullzellen aus den Kontingenztabellen verwendet wurde, bestand darin, die assoziierte Kategorie vollständig zu eliminieren. Berechnungen erfolgten mit SAS v 8.0. SAS ist ein Statistik-Softwarepaket, das den Benutzer in die Lage versetzt, Daten auf die unterschiedlichste Art und Weise zu manipulieren und zu analysieren. Dieses Softwarepaket wird aufgrund seiner Fähigkeiten in zahlreichen Fachgebieten eingesetzt, einschließlich medizinischer Wissenschaften, biologischer Wissenschaften und Sozialwissenschaften.
  • Die Einführung eines Geschlechtsparameters brachte die bereits in früheren Analysen festgestellte Assoziation nicht durcheinander. Außerdem ergab dieses Analysemodell weitere Ergebnisse: eine mögliche Allel-Assoziation mit P2XR7v05B (p = 0,064) und eine genotypische Assoziation für P2XR7v08A (p = 0,042) wurden festgestellt.
  • Assoziationsstudien unter Verwendung vereinigter Proben wurden durchgeführt, indem Individuen aus den Stichproben der Population von Saguenay/Lac St-Jean mit denen der deutschen Population vereinigt wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 14 dargestellt. Das Ziel dieser Analyse besteht darin, gemeinsame Merkmale zwischen den beiden Population hervorzuheben. Jedoch wurden, gemäß den Unterschieden zwischen den beiden Stichproben (hauptsächlich der Phänotyp von betroffenen Individuen, d.h. bipolare Störung, in den Stichproben von Saguenay/Lac St-Jean gegenüber der meist unipolaren Störung in der deutschen Population), einige Parameter kontrolliert, einschließlich Geschlecht und Ethnizität. Die Modellstrategie für logistische Regressionen war, wie vorstehend beschrieben. Tabelle 14 Assoziationsstudien unter Verwendung vereinigter Stichproben aus beiden Populationen
    Locus Allel-Analyse Genotyp-Analyse
    p-Wert für SNP p-Wert für Geschlecht p-Wert für SNP p-Wert für Geschlecht
    P2XR7v02A 0.8254 0.0085 0.8650 0.4531
    P2XR7v05B 0.1751 0.3714 0.2034 0.5110
    P2XR7v05A 0.3808 0.0266 0.0885 0.1392
    P2XR7v08A 0.0452 0.0041 0.1021 0.3452
    P2XR7v08B 0.3471 0.0040 0.3413 0.3617
    P2XR7v11A 0.3559 0.0136 0.5888 0.4404
    P2XR7v11B 0.5902 0.0093 0.3897 0.4302
    P2XR7v11C 0.3731 0.0094 0.7648 0.4615
    P2XR7v13A 0.0047 0.0209 < 0.0001 0.4814
    P2XR7v13B 0.5129 0.2352 0.9584 0.4092
    P2XR7v13C 0.2466 0.0284 0.2225 0.4228
    P2XR7v13E 0.8168 0.0159 0.3713 0.4990
  • Eine Allel- und Genotyp-Assozitation wurde für den Locus P2XR7v13A festgestellt (p = 0,0047), die stärker war als in den getrennten Analysen. Außerdem wurde eine signifikante Allel-Assozitation für den Locus P2XR7v08A festgestellt (p = 0,0452). Weiterhin zeigt die vorliegende Analyse auch den möglichen Zusammenhang zwischen dem SNP P2XR7v05A und der ursprünglichen Version mit einem p-Wert = 0,0515 (nicht in der Tabelle dargestellt); dies stimmt mit früheren Assoziationsanalysen überein, die in beiden Stichproben getrennt durchgeführt wurden (vgl. Tabelle 13).
  • Die Haplotyp-Analyse wurde unter Verwendung der deutschen Population durchgeführt. Das Programm PHASE (Stephens et al., Am. J. Hum. Genet. 68 (2001), 978–989) wurde eingesetzt, um SNPs-Haplotypen innerhalb von Exons des P2X7R-Gens zu bestimmen. Haplotypen wurden für jedes Exon erzeugt, das mehr als einen assoziierten SNP aufwies (vgl. Tabelle 15 für Exon-assoziierte SNPs). Die Fall-Gruppen variierten von 218 bis 220 Individuen, während die Kontrollgruppen zwischen 312 und 316 Individuen variierten. Die Assoziationshypothese wurde mit dem CLUMP-Verfahren getestet, da für jedes Exon zahlreiche Haplotypen erzeugt wurden. T1- und T3-Statistik-Tests wurden, wie vorstehend beschrieben, durchgeführt. Außerdem wurden T2- und T4-Statistiken wegen des Vorliegens kleiner effektiver Zellen in den Kontingenztabellen berechnet. Die T2-Statistik ist die übliche Chi-Quadrat-Statistik, die an der Kontingenztabelle angewendet wurde, die nach Collapsing von Spalten mit kleinen erwarteten Werten erhalten wurde. Die T4-Statistik ist die größte Chi-Quadrat-Statistik, die durch Vergleichen einer Spalte der ursprünglichen Tabelle mit dem Gesamtwert der anderen Spalten erhalten wurde. Die p-Werte wurden unter Verwendung von 1000 Simulationen bestimmt. Die resultierenden Daten wurden mit dem logistischen Regressionsmodell (vorstehend beschrieben) unter Verwendung von SAS V8.0 analysiert, um den Geschlechtsparameter zu berücksichtigen (für diese Tests wurde die Stichprobe um 14 normale Individuen reduziert). Jedoch wird dieses Analysenverfahren durch die Zuverlässigkeit von rekonstruierten Haplotypen eingeschränkt. Tabelle 15 Exon-assoziierte SNPs
    Exons Assoziiert SNPs
    5 P2XR7E05D P2XR7E05E P2XR7v05A P2XR7E05C
    8 P2XR7v08A P2XR7v08B
    11 P2XRv11B P2XRv11C
    13 P2XR7v13A P2XR7v13B P2XR7v13C P2XR7E13D P2XR7E13J P2XR7v13I P2XR7v13E
    Tabelle 16 Genotyp-Assoziation mit Haplotypen in Exon 13 von P2X7R
    Exon (Haplotyp) Allel-Analyse Genotyp-Analyse
    Clump* p-Wert (Geschl.) p-Wert (Haplo) Clump p-Wert (Geschl.) p-Wert (Haplo)
    5(5) T1:0.032 T2:0.068 T3:0.054 T4:0.059 0.3133 0.1947 T1:0.193 T2:0.159 T3:0.099 T4:0.304 0.460 0.5355
    8(3) T1:0.551 T2:0.585 T3:0.646 T4:0.646 0.3813 0.3064 T1:0.812 T2:0.689 T3:0.644 T4:0.756 0.5428 0.6652
    11(3) T1:0.750 T2:0.786 T3:0.726 T4:0.726 0.0886 0.7396 T1:0.625 T2:0.919 T3:0.929 T4:0.921 0.2305 0.9494
    13(15**) T1:0.088 T2:0.079 T3:0.147 T4:0.072 0.1871 0.1264 T1:0.001 T2:0.002 T3:0.057 T4:<0.001 0.4610 0.019
    • * Der T1-Test sollte aufgrund von Kontingenztabellen mit Nullzellen nicht berücksichtigt werden.
    • ** Unter diesen 15 Haplotypen stellten wir acht Haplotypen fest, in denen Fall-Zellen weniger als drei Individuen aufweisen.
  • Tabelle 16 erläutert eine Genotyp-Assoziation mit Haplotypen im Exon 13 der P2X7R-Gene. Interessanterweise wurden zahlreiche Haplotypen für das Exon 13 festgestellt. Die Unterschiede zwischen den Statistiken in Exon 13 (T3 ist weniger signifikant) können durch die Beteiligung von mehr als einem Genotyp von Haplotypen an der Krankheit erklärt werden. Eine mögliche Allel-Assoziation wurde auch mit Haplotypen im Exon 5 des P2X7R-Gens festgestellt.
  • Im Folgenden sind klinische Ergebnisse dargestellt, welche die funktionellen Folgen von Polymorphismen in P2X7R erläutern.
  • Die Entwicklung und der Verlauf einer Depression ist mit Beeinträchtigungen in der zentralen Regulation der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse (HPA-Achse) ursächlich verbunden. Anomalien in der HPA-Achse können unter Verwendung des Dexamethason-Suppressions-Tests (DST) oder des kombinierten Dexamethason/Corticotropin-Freisetzungshormon-Tests (Dex/CRH-Tests) gemessen werden. Veränderungen in den gemessenen Werten von Cortisol und/oder adrenocorticotropem Hormon (ACTH) während des DST- oder Dex/CHR-Tests zeigen eine HPA-Dysfunktion bei depressiven Patienten an (Heuser et al., J. Psychiat. Res. 28 (1994), 341–356; Rybakowski und Twardowska, J. Psychiat. Res. 33 (1999), 363–370; Zobel et al., J. Psychiat. Res. 35 (2001), 83–94; Künzel et al., Neuropsychopharmacology 28 (2003), 2169–2178). Um zu zeigen, dass P2X7R-SNPs, die mit affektiven Störungen assoziiert sind, auch mit Änderungen in der HPA-Achse korreliert sind, wurden die Cortisol- und ACTH-Spiegel als Antwort auf den DST- und Dex/CRH-Test für die SNPs P2XR7v13A und P2XR7v13C gemessen. P2XR7v13A besteht aus einer Nucleotidänderung von A zu G, die in dem P2X7R-Protein zu einer Gln460Arg-Modifikation führt. Der SNP P2XR7v13C entspricht einer Nucleotidänderung von A zu C, die zu einer Glu496Ala-Modifikation führt, für die gezeigt wurde, dass sie die Aktivität des Protein drastisch reduziert (Wiley et al., Drug Dev. Res. 53 (2001), 72–76).
  • Verfahren und Bedingungen zum Durchführen des DST- und Dex/CRH-Tests sind auf dem Fachgebiet bekannt, vgl. z.B. Heuser et al., J. Psychiat. Res. 28 (1994) 341–356; Künzel et al., Neuropsychopharmacology 28 (2003), 2169–2178. Kurz gesagt wurden Individuen um 23:00 vorbehandelt, indem sie 1,5 mg Dexamethason oral verabreicht bekamen. Für den DST-Test wurde um 8:00 vor der Dexamethason-Verabreichung (d.h. Prä-Dexamethason) und um 8:00 am Morgen nach der Dexamethason-Verabreichung (d.h. Post-Dexamethason) eine Blutprobe genommen. Für den Dex/CRH-Test wurde um 14:30 am Tag nach der Dexamethason-Verabreichung ein Venenkatheter gelegt und um 15:00, 15:30, 15:45, 16:00 und 16:15 Blut in Röhrchen abgenommen, die EDTA und Trasylol (Bayer Inc., Deutschland) enthielten. Um 15:02 wurden 100 mg menschliches CRH (Ferring Inc., Deutschland) intravenös verabreicht. Die Messung von Plasma-Cortisol-Konzentrationen erfolgte unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Radioimmuntest-Kits (ION Biomedicals, USA), während Plasma-ACTH-Konzentrationen unter Verwendung eines kommerziellen immunometrischen Tests (Nichols Institute, USA) gemessen wurden. Beide Tests wurden gemäß den Anweisungen des jeweiligen Herstellers durchgeführt.
  • Für den SNP P2XR7v13A wurde bei Individuen mit einem AG- oder GG-Allel im Vergleich zu Individuen mit dem AA-Allel bei der Aufnahme eine Verminderung der basalen Cortisolspiegel festgestellt (1f). Während des Dex/CRH-Tests wurde bei Individuen mit dem GG-Allel im Vergleich zu Individuen mit einem AA- oder AG-Allel eine Reduktion in der Cortisol- und ACTH-Antwort gemessen (1g und 1h). Weiterhin war eine Antwort auf eine Behandlung mit Antidepressiva in GG-Individuen verzögert (1i).
  • Für den SNP P2XR7v13C wurde nach der Dexamethason-Verabreichung ein Anstieg der basalen Cortisolspiegel gemessen (1i). Während des Dex/CRH-Tests zeigten Individuen mit dem CC-Allel im Vergleich zu AA- und AC-Individuen eine erhöhte Cortisol-Antwort (1k), jedoch eine reduzierte ACTH-Antwort (1l). Diese Ergebnisse weisen auf eine Fehlregulation der HPA-Achse hin.
  • Somit korrelieren SNPs in P2X7R mit einer Fehlfunktion in der HPA-Achse und machen die funktionellen und klinischen Folgen von Polymorphismen in P2X7R deutlich.
  • Beispiel 4
  • P2X7R-Gen-Struktur und mRNA-Expression und Transkript-Sequenz
  • Eine 1700-bp-Nucleotidsequenz, die dem menschlichen P2X7R-Promotor entsprach, wurde unter Verwendung der Algorithmen Matinspector V2.2 und Transfac 4.0 analysiert. Diese Analyse zeigte, dass das P2X7R-Gen keine Standard-TATA-Box enthält, jedoch SP1-Stellen aufweist, die zur Initiation der Transkription dienen können. Neben den SP1-Sequenzen liegen Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren GATA, Oct und Ikarus vor. Es wird vermutet, dass diese Stellen eine Gewebespezifität bereitstellen. Interessanterweise hat der P2X7R-Promotor Bindungsstellen, welche eine Ansprechbarkeit auf verschiedene Cytokine wie AP-1, NFAT und CEBPB nahelegen.
  • P2X7R prozessiert 13 Exons und 12 Introns (Buell et al., Receptors Channels 5 (1998), 347), wodurch eine Basis für ein alternatives Spleißen bereitgestellt wird, wodurch theoretisch unterschiedliche Transkripte erhalten und unterschiedliche Isoformen mit möglichen unterschiedlichen Funktionen produziert werden könnten. Keine alternativ gespleißte Variante wurde eindeutig identifiziert. Jedoch machten Experimente mit EST-Clustering die Beschreibung von drei Spleiβvarianten möglich. Die eine ist durch das Fehlen des Exons 5 definiert. Diese P2X7v02-Variante entspricht dem Clon IMAGE: 3628076, der aus vom Gehirn stammenden Zelllinien isoliert wurde. Die Variante P2x7v02, der das Exon 5 fehlt, produziert eine Rasterverschiebung, wodurch ein kürzeres Polypeptid erzeugt wird. Die zweite Spleiβvariante, P2X7v03, ist durch das Vorliegen des kurzen Intron 10 in der mRNA charakterisiert. Diese Variante wird durch zwei qualitativ hochwertige Sequenzen bereitgestellt, durch den cDNA-Clon BRAMY2008977 (AC-Nummer: AK090866) aus menschlichen Tonsillen und durch den EST-Clon dbEST:7339877, der aus einem unbekannten menschlichen Tumor stammt. Die letzte Variante, P2X7v04, ist durch das Fehlen des ersten Exons definiert, dies legt eine alternative Promotor-Verwendung in der Nähe von Exon 2 nahe. Ein qualitativ hochwertiger EST-Clon, dbEST:4782844, der aus einem Kopf- und Halstumor stammt, stellt diese Variante bereit. Diese Varianten sind in den 16a bis 16e dargestellt.
  • Figure 01200001
  • Deshalb wurden die Transkriptions- und Translations-Startsequenzen des menschlichen P2X7R unter Verwendung der Computersoftware Blast, Genescan und HMMgene analysiert. Diese Analysen zeigten, dass P2X7R mit großer Wahrscheinlichkeit nur eine einzige Translations-Startstelle besitzt. Die meisten exprimierten sequenzmarkierten Stellen (ESTs, Unique Cluster Hs. 193470 von P2X7R), die ein verlässliches 5'-Ende aufwiesen, zeigten eine identische Transkriptions-Startstelle. Keines der ESTs zeigte irgendeinen Hinweis auf ein alternatives Spleißen. Deshalb legt die in silico-Analyse nahe, dass eine geringe Wahrscheinlichkeit vorliegt, unterschiedliche Transkripte zu finden, die durch ein alternatives Spleißen oder eine alternative Promotor-Verwendung erzeugt werden.
  • Die vorstehend erwähnten in silico-Daten wurden durch eine RT-PCR-Analyse, welche die gesamte vorausgesagte codierende Sequenz des menschlichen P2X7R überspannte, unter Verwendung von aus 14 und 19 Basen bestehenden Oligonucleotiden (5'-ATGCCGGCTTGCTG-3', 5'-GTAGGGATACTTGAAGCCA-3'), welche dem Anfang bzw. dem Ende der codierenden Sequenz entsprachen, bestätigt. Die Gesamt-RNA aus dem ganzen Gehirn, aus verschiedenen sezierten Gehirnregionen, aus Thymus, Milz und Niere wurde jeweils isoliert und auf P2X7R-Expression analysiert. RT-PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung des C. Therm One Step-Polymerase-Systems (Roche Applied Science) und eines Protokolls für eine Touchdown-PCR mit Hot-Start durchgeführt. Kurz gesagt wurde eine reverse Transkription bei 52°C gemäß den Bedingungen des Herstellers durchgeführt. Die PCR-Reaktionen erfolgten bei Anellierungs-Temperaturen von 64°C für die ersten fünf Zyklen und von 54°C für die nächsten 30 Zyklen.
  • Eine einzelne spezifische Bande der Größe von 1785 bp wurde nachgewiesen, die der vollständigen codierenden Sequenz von P2X7R entsprach. P2X7R-mRNA wurde im ganzen Gehirn, im Hippocampus, Cerebellum, in Leukocyten und Thymus nachgewiesen, nicht jedoch in Hirnrinde, Hypothalamus, Milz und Niere (2). Alle PCR-Produkte wurden unter Verwendung von pGEM-T-Easy-Plasmid (Promega) cloniert, in Top-10-Bakterien (Invitrogen) durch Blau-Weiß-Selektion selektiert und durch EcoRI-Spaltung getestet. Clone, die Fragmente der erwarteten Größe aufwiesen, wurden für die Sequenzierung amplifiziert und gereinigt. Die Sequenz bestätigte, dass die 1785-bp-Clone mit der vollständigen codierenden Sequenz von Wildtyp-P2X7R identisch waren. Somit wird Wildtyp-P2X7R in allen getesteten Geweben als ein einzelnes Transkript exprimiert, welches die vollständige codierende Sequenz einschließt. Das Vorliegen von gewebespezifischen Isoformen ist unwahrscheinlich. Diese Studien stellen nützliche Informationen über die P2X7R-mRNA-Expression und Transkript-Prozessierung bereit. Diese Informationen können zum Synthetisieren von Ribosonden für die in situ-Hybridisierung, für Northern- und Southern-Blot und außerdem zum Verändern von Zellen, so dass es zu einer Überexpression von P2X7R kommt, eingesetzt werden.
  • Beispiel 5
  • P2X7R-Expression im Gehirn der Maus
  • Die Expression von P2X7R wurde durch Immunhistochemie von Serienschnitten von vollständigen Mausgehirnen unter Verwendung eines polyclonalen Antikörpers, der gegen ein inneres Peptid von P2X7R gerichtet war (Santa Cruz Biotechnology), noch weiter untersucht. Die Gehirne von stressfreien Mäusen wurden schockgefroren, in 16-μm-Scheibchen geschnitten und fünf Minuten mit Paraformaldehyd fixiert. Die Schnitte wurden 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 1:10-Pferdeserum blockiert. Alle Antikörper wurden in TEST-Puffer (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween-20) verdünnt. Der erste Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:200 verwendet und über Nacht inkubiert. Alle Waschgänge wurden mit TEST-Puffer durchgeführt. Als sekundärer Antikörper wurde ein biotinyliertes Anti-Ziege-IgG (Vector Laboratories) verwendet, und der Nachweis erfolgte unter Verwendung des Streptavidin-Biotin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex-Systems (Vector Laboratories) in Kombination mit Diaminobenzidin. Die Objektträger wurden mit Toluidin-Blau anhand von Standardverfahren gegengefärbt. Als negative Kontrolle wurde das gleiche Verfahren in Abwesenheit des primären Antikörpers durchgeführt. Als positive Kontrolle, um die Konservierung des Gewebes zu testen, diente ein Antikörper, der für das Protein Patched1 (Santa Cruz Biotechnology) spezifisch ist. Patched1 wurde als positive Kontrolle eingesetzt, da es alle relevanten Gehirnstrukturen anfärbt und nicht durch Stress oder Antidepressiva beeinträchtigt wird. Ein sehr spezifisches Färbemuster wurde nachgewiesen, das mit der spezifischen subzellulären Lokalisierung von P2X7R in Gehirnzellen übereinstimmte. Negative Kontrollen waren vollständig ohne Signal. Die positive Kontrolle mit Patched1 zeigte in allen Proben eine identische Signalintensität und -Verteilung, dies macht deutlich, dass alle Gewebe gleich gut konserviert und verarbeitet waren.
  • Bei einem Vorgehen von frontal nach kaudal wurde das P2X7R-Protein in der glomerulären Schicht des Bulbus olfactorius in geringen Spiegeln festgestellt (3). Außerdem lag P2X7R in sehr niedrigen Spiegeln in einem begrenzten Bereich des periventrikulären Hypothalamus-Kerns vor (3). Auch zeigten Ependymalzellen, welche die Seitenventrikel umgaben, eine schwache Färbung (3). Ein stärkeres Signal wurde in begrenzten Bereichen des Hippocampus nachgewiesen, wo das Signal in einzelnen Zellen der polymorphen Schicht, des Lacunosum moleculare und des Stratum oriens vorlag (4). In weiter hinten liegenden Bereichen des Hippocampus lag das Signal in der Molekularschicht, dem Stratum radiatum und in der Nähe des CA3 vor. In einer noch weiter kaudalen Position wurde P2X7R im Subkommissuralorgan exprimiert (4). Somit ist die basale P2X7R-Expression im Gehirn von stressfreien Mäusen auf Bereiche beschränkt, die vorher schon mit Depression, Stress, Lernen und Gedächtnis assoziiert worden waren.
  • Beispiel 6
  • P2X7R ist in Mäusen, die mit einem Antidepressivum behandelt werden, moduliert
  • Eine weitere Bestätigung der Rolle von P2X7R in affektiven Störungen erfolgte, indem sein Expressionsmuster als Antwort auf Stress und eine Behandlung mit Antidepressiva untersucht wurde. Ein Behandlungszeitplan, für den bewiesen worden war, dass er auf Verhaltensebene antidepressive Effekte erzeugt, wurde bei Mäuse angewendet, für die gezeigt worden war, dass sie auf Antidepressiva ansprechen, wobei eine Reihe von Verhaltensmustern verwendet wurden, die geeignet waren, anxiolytische und antidepressive Effekte klassischer Antidepressiva wie des selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmers Paroxetin nachzuweisen. Paroxetin wurde durch eine Schlundsonde an naive männliche Mäuse in einem Zeitraum von 28 Tagen mit einer Dosierung von 10 mg/kg Körpergewicht zweimal am Tag verabreicht. Parallel dazu erhielt eine Kontrollgruppe von Mäusen eine Trägerlösung (d.h. ohne Paroxetin), wobei das gleiche Behandlungsschema verwendet wurde, während eine zweite Kontrollgruppe von Mäusen während des gleichen Zeitraums des Experiments ungestört und stressfrei (d.h. unbehandelt) gelassen wurde. Am Ende der langfristigen Behandlung wurde ein Teil der Mäuse von jeder Versuchsgruppe in der Dunkel/Licht-Box (Test des Angstverhaltens) und im erzwungenen Schwimmtest nach Porsolt (Test des depressionsähnlichen Verhaltens) getestet, um die Wirksamkeit der Behandlung zu bestätigen (5). Das passive Stressbewältigungsverhalten nahm nach einer langfristigen Behandlung mit dem Antidepressivum Paroxetin ab. Der andere Teil der Versuchsgruppen (d.h. Mäuse ohne Testerfahrung) wurde geköpft, die Gehirne wurden rasch entnommen und bei –80°C eingefroren, bis sie verwendet wurden.
  • Die Expression von P2X7R in den Gehirnen von Mäusen unter stressfreien Bedingungen und von Mäusen unter leichtem Stress, erzeugt durch die Applikation von Vehikel, und von Mäusen unter Paroxetin-Behandlung wurde unter Verwendung von drei verschiedenen Gehirnen aus jeder Gruppe bestimmt. Serielle Objektträger wurden aus jeder Gruppe von Tieren parallel durch Immunhistochemie analysiert, wobei die gleichen Stoffe verwendet wurden, um vollständig vergleichbare Ergebnisse zu bekommen. Keine signifikante Änderung in der P2X7R-Expression im Bulbus olfactorius wurde als Antwort auf Stress oder auf die Paroxetin-Behandlung festgestellt (6). Jedoch erzeugte Paroxetin im periventikulären Nucleus des Hypothalamus eine leichte Hemmung der P2X7R-Expression (7). Keine signifikante Änderung wurde in den Ependymzellen aus unterschiedlichen Gehirnregionen festgestellt (8). Die dramatischsten Änderungen wurden im Hippocampus festgestellt, wo P2X7R durch eine stressreiche Behandlung stark gehemmt wurde, wohingegen eine Paroxetin-Behandlung eine deutliche Stimulation auf Werte über den Basalwerten erzeugte (9, 10 und 11). Diese Wirkung wurde im ganzen Hippocampus festgestellt, war jedoch in der polymorphen Schicht in der Nähe des Gyrus dentatus stärker ausgeprägt. Im Subkommissuralorgan blieb die Expression von P2X7R bei den verschiedenen Behandlungen unverändert. Somit wird die Expression von P2X7R in zwei spezifischen Gehirnbereichen, die an Depression und Stress beteiligt sind, stark reguliert. Andere Gehirnbereiche, die niedrige Spiegel von P2X7R zeigten und nicht direkt an der Depression beteiligt sind, zeigten keine Änderungen.
  • In den Proben aus mit Paroxetin behandelten Mäusen, die eine starke P2X7R-Expression zeigten, konnte die Verteilung von P2X7R noch genauer analysiert werden (10 und 11). Das P2X7R-Protein lag nicht nur in Zellkörpern vor, sondern wurde auch in Fortsätzen, welche die granuläre Schicht des Gyrus dentatus innervieren, deutlich nachgewiesen (12). Diese subzelluläre Lokalisierung von P2X7R ist mit einer Rolle in der Neurotransmitter-Freisetzung und einer langfristigen Verstärkung vereinbar.
  • Da einige Berichte (Muria et al., Biochem. J. 288 (1992), 897–901; Ferrari et al., FEBS Lett. 447 (1999), 71–75) nahelegen, dass eine chronische und hochdosierte Stimulation von P2X7R in einigen Zelltypen eine Apoptose verursachen könnte, wurden die Hippocampi der vorstehend beschriebenen Tiere in aufeinander folgenden Schnitten auf eine Ko-Lokalisierung von apoptotischen Zellen und P2X7R-exprimierenden Zellen analysiert, indem eine TUNNEL-Färbung und Immunhistochemie verwendet wurden. In korrelativen Schnitten wurden nur einige wenige apoptotische Zellen nachgewiesen, und sie lagen entlang den granulären Schichten des Hippocampus vor, wo keine P2X7R-Expression festgestellt wurde (13). Keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl von apoptotischen Zellen wurden zwischen den verschiedenen Behandlungsbedingungen festgestellt. Somit korrelierte die Lage und Zahl apoptotischer Zellen nicht mit der Lage und Zahl von P2X7R-exprimierenden Zellen, und dies schließt eine Beteiligung von P2X7R an der Induktion von Apoptose im Hippocampus aus.
  • Somit ist die Expression von P2X7R maßgeblich auf spezifische Gehirnbereiche beschränkt, die an der Depression beteiligt sind. Außerdem wird die Expression von P2X7R durch Stress gehemmt und durch eine Behandlung mit Antidepressiva in diesen spezifischen Bereichen stark stimuliert. Deshalb erfüllt P2X7R alle Kriterien, die für die Wirkungen von Antidepressiva gemäß den höchsten Standards auf dem Fachgebiet der Depressionsforschung erforderlich sind. Außerdem legen diese Ergebnisse nahe, dass eine Modulation der Funktion von P2X7R mit chronischem Stress assoziiert ist, der als ein Modell für verschiedene Aspekte von affektiven Störungen dient.
  • Beispiel 7
  • Wirkung von P2X7R-Inhibitoren auf das Verhalten bei Mäusen
  • Um zu zeigen, dass eine P2X7R-Hemmung als auslösendes Agens für affektive Störungen wirkt, wurde die P2X7R-Funktion in bestimmten Regionen des Gehirns spezifisch gehemmt, ohne eine andere Gehirnfunktion zu beeinträchtigen. Dies wurde erreicht, indem doppelsträngige kleine Interferenz-RNA-Moleküle (siRNA) in begrenzte Bereiche des Gehirns eingeführt wurden.
  • Gemäß dem festgestellten Expressionsmuster von P2X7R im Hippocampus (9, 10 und 11) und der bekannten Beteiligung des Hippocampus an der Depression wurde der Gyrus dentatus (Hippocampus) als Zielregion für die siRNA-Applikation ausgewählt. Bei männlichen naiven Mäusen wurden mit Hilfe eines stereotaktischen Instruments beidseitig Führungskanülen (Nr. 23 („23 gauge"), Länge: 8 mm) eingeführt. Die Koordinaten, bezogen auf das Bregma, waren –2,0 mm posterior, ±1,0 mm lateral und –1,0 mm ventral. Nach einer Erholungsphase von fünf Tagen wurden die Mäuse in drei Versuchsgruppen aufgeteilt: Vehikel (Veh), doppelsträngige Kontroll-RNA (Kontrolle) und P2X7R-spezifische doppelsträngige siRNA (siRNA). Die Sequenzen, die für P2X7R-siRNA verwendet wurden, sind 5'-GUGGGUCUUGCACAUGAUCTT-3' und 5'-GAUCAUGUGCAAGACCCACTT-3'. Beide Sequenzen wurden anelliert und zusammen als doppelsträngige RNA injiziert. Am Tag 6 nach der Operation wurden die Mäuse mit Isofluran leicht anästhesiert und erhielten Injektionen von siRNA. Die Konzentration der Kontroll- und siRNA betrug 0,1 nMol/μl, wobei ein Volumen von 1 μl pro Seite unter Verwendung speziell angepasster Injektionssysteme (Nr. 30 („30 gauge"), Länge: 9 mm) infundiert wurde. Die Anästhesie für die Infusion war von kurzer Dauer, und die Mäuse waren sofort oder innerhalb weniger Sekunden nach der Manipulation wieder wach.
  • Sobald die für P2X7R spezifischen siRNA-Moleküle ins Gehirn eingebracht waren, wurden sie durch Gehirnzellen aufgenommen und induzierten mit einer hohen Effizienz spezifisch den Abbau der komplementären P2X7R-mRNA. Als Ergebnis wurde die P2X7R-Funktion eine kurze Zeitspanne spezifisch gehemmt, ohne dass irgendeine andere Gehirnfunktion beeinflusst wurde. In dieser Hinsicht führte die Injektion von Vehikels, Kontroll- oder siRNA zu keinen offensichtlichen Änderungen im normalen Verhalten, d.h. bei der Aufnahme von Futter und Wasser, oder im motorischen Verhalten im Heimkäfig.
  • Die Effekte einer P2X7R-Hemmung auf ein depressionsähnliches Verhalten wurde 24 Stunden und 48 Stunden nach der Infusion von siRNA, Kontrolle oder Vehikel gemäß dem herkömmlichen Testverfahren, dem erzwungenen Schwimmtest nach Porsolt (Porsolt et al., Arch. Int. Pharmacodym. 229 (1977), 327–336; Porsolt, Rev. Neurosci. 11 (2000), 53–58), festgestellt. Der Parameter, der zum Bewerten des depressionsähnlichen Verhaltens verwendet wird, ist die Zeit, die das Tier sich im Wasser treiben lässt („floating"), wobei es ein Verhalten zeigt, das mit einem Verhalten von Hoffnungslosigkeit assoziiert ist, da das Tier keine Anstrengung unternimmt, die stressreiche Situation aktiv zu bewältigen. Im Vergleich zur Verabreichung des Trägers wurde kein Einfluss der doppelsträngigen Kontroll-RNA (5'-CAACUUCAUCUUCUACGCGTT-3') auf das Verhalten des Treibenlassens („floating") (passive Stressbewältigung) festgestellt. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse, denen die P2X7R-spezifische siRNA infundiert worden war, im Vergleich zu den Kontrollen eine signifikante Zunahme des passiven Verhaltens, das man als ein depressionsähnliches Verhalten ansieht (14). Diese Interpretation wird noch offensichtlicher, wenn man sich die Effekte von Antidepressiva auf das passive Stressbewältigungsverhalten im erzwungenen Schwimmtest ansieht (5). Das passive Stressbewältigungsverhalten nahm nach einer akuten Injektion in den Hippocampus (bilateral, Gyrus dentatus) der auf P2X7R zielenden siRNA zu. Der erzwungene Schwimmtest nach Porsolt ist ein Standardtest, der eingesetzt wird, um die Wirksamkeit von Antidepressiva zu bestimmen, wobei durch zahlreiche Studien gezeigt wurde, dass der Test für diese Effekte selektiv empfindlich ist, unter der Voraussetzung, dass das richtige Tiermodell verwendet wird. Die Versuchsmuster wurde verbreitet eingesetzt, um pharmazeutische Verbindungen zu testen und Tiermodelle der Depression zu validieren, die eine Zunahme im passiven Verhalten zeigen, wie dies bei den Mäusen der Fall ist, bei denen P2X7R gehemmt wurde (siRNA).
  • Am Ende des Experiments wurden die Mäuse getötet und die Gehirne untersucht, um die Lokalisierung und Wirksamkeit der siRNA-Injektionen zu bestätigen. Für diesen Zweck wurden von den Gehirnen Schnitte angefertigt und die Objektträger durch Immunhistochemie unter Verwendung der vorstehend erwähnten Protokolle angefärbt. Gehirne aus Mäusen, denen die spezifische doppelsträngige siRNA, die doppelsträngige Kontroll-RNA bzw. das Vehikel injiziert worden war, wurden parallel untersucht. Unter diesen Bedingungen induzierte die gegen P2X7R gerichtete spezifische siRNA, die in der Nähe des Gyrus dentatus injiziert worden war, im Vergleich zu den Proben aus Mäusen, denen das Vehikel oder die doppelsträngige Kontroll-RNA injiziert worden war, im Durchschnitt eine Hemmung der Expression des P2X7R-Proteins von 80 %. Sowohl die Anzahl der Zellen, die P2X7R exprimierten, als auch die Intensität der Expression waren stark reduziert (15). Die Injektionen mit siRNA erzeugten am Hippocampus keinerlei Zeichen einer lokalen Entzündung oder Infiltration. Somit wird die Expression von P2X7R durch die Applikation von siRNA in vivo spezifisch und lokal gehemmt. Diese Hemmung erzeugte Verhaltensänderungen, die anzeigen, dass P2X7R bei affektiven Störungen eine ursächliche Rolle spielt. Diese Ergebnisse unterstützen und bestätigen in Kombination mit den vorstehend erwähnten Ergebnissen die Feststellung, dass Mutationen in P2X7R mit affektiven Erkrankungen bei Menschen assoziiert sind und dass eine Modulation der P2X7R-Aktivität eine antidepressive Wirkung aufweist.
  • Beispiel 8
  • Arzneistoff-Screeningtest
  • Verfahren zum Identifizieren von P2X7R-Agonisten wurden eingeführt, wobei immortalisierte Hippocampus-Zelllinien der Maus verwendet wurden, welche das endogene P2X7-Gen exprimierten. Kurz gesagt wurde die Expression von P2X7 bestätigt, indem die Zellen bei 37°C, 5 % CO2, in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum (Gibco) gezüchtet wurden. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht hatten, wurden sie in PBS gewonnen und homogenisiert, indem sie wiederholt durch eine Spritze gezogen wurden (Nadel Nr. 18). Die Menge an Gesamtprotein wurde durch den Bradford-Test (Sigma; verdünnt 1:5, OD gemessen bei 595 nm) gemäß den Empfehlungen des Herstellers gemessen. Danach wurden die Proteinhomogenisate mit einem gleichen Volumen von Auftragepuffer (50 mM Tris-Cl, pH 6,8; 25 % Glycerin; 7,2 mM Bromphenolblau; 2 % SDS; 200 nM β-Mercaptoethanol) gemischt und anschließend in kochendem Wasser zehn Minuten denaturiert. 20 mg von jeder Probe wurden auf ein 10 % Polyacrylamid-Gel, enthaltend 0,4 % SDS, aufgetragen. Die Elektrophorese und der Western-Blot-Transfer wurden gemäß herkömmlichen Protokollen durchgeführt, die z.B. in Sambrook, Russell, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., (2001), beschrieben sind. Danach wurden die Membranen mit 5 % Milchpulver blockiert und mit einem Antikörper gegen P2X7R (Verdünnung von 1:1000; Santa Cruz Biotech) inkubiert, worauf eine Inkubation mit einem Peroxidasegekoppelten sekundären Anti-Ziege-Antikörper des Pferdes (Verdünnung von 1:10000; Santa Cruz Biotech) folgte. Danach wurden die Membranen eine Stunde bei 37°C in Lumi-Light Western Blotting Substrate (Roche Applied Science) inkubiert, worauf eine zehnminütige Exposition auf einem BioMax MR Film (Kodak) folgte.
  • Eine 70-kDa-Bande, die der erwarteten Größe des P2X7R-Proteins entsprach, wurde in HT-22-Zellen nachgewiesen, dies zeigt die Expression des endogenen P2X7-Gens der Maus (17). Eine zweite Hippocampus-Zelllinie der Maus (HT-39) exprimierte P2X7 nicht.
  • Da der P2X7R ein ATP-abhängiger Ionenkanal ist, der den Eintritt von Calcium- und Natriumionen in Zellen erlaubt, wurde ein Verfahren zum Identifizieren von P2X7R-Agonisten eingeführt, indem der Calcium-Einstrom in HT-22-Zellen überwacht wurde. Zuerst wurden die Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur mit dem Fluoreszenzfarbstoff Oregon Green AM Ester (Molecular Probes) beladen, sodann zweimal mit DMEM/10 % fötalem Kälberserum gewaschen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen, und 15 Minuten in Gegenwart von 100 μM 2- und 2'-3'-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosin-5'-triphosphat (BzATP: C24H24N5O15P3) gezüchtet. BzATP ist ein bekannter Agonist von P2X7R (North und Surprenant, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40 (2000), 563–580). Die Bewegung von Calcium in die Zellen hinein wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Fluorescein-Filter (Wellenlänge 492/517 nm) sichtbar gemacht. Oregon Green AM Ester ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der an intrazelluläres Calcium bindet. Demgemäß wurde in den mit BzATP behandelten Zellen ein Anstieg in der grünen Fluoreszenz festgestellt (18); dadurch wird eine Aktivierung von P2X7R angezeigt, die zu einem Einstrom von Calcium in die Zellen und zu einem Anstieg der Bindung von Oregon Green-Farbstoff an intrazelluläres Calcium führt.
  • Alternativ kann Oregon Green AM-Ester durch Fluo-3, fluo-4, fluo-5F, fluo-5N, Fluo-4FF, Fluo-4 Dextran, Fluo-3 AM, Fluo-4 AM, Fluo-5F AM, Fluo-5N AM und Fluo-4FF AM (Molecular Probes) ersetzt werden. Außerdem kann der Calcium-Einstrom in HT-22-Zellen in Mikroplatten mit 96 und 384 Vertiefungen unter Verwendung von Calcium Plus Assay Kit (Molecular Device) oder FLIPR® Calcium Assay Kit for Fluorometric Imaging Plate Reader Systems (Molecular Device) gemessen werden. HT-22-Zellen können durch beliebige Zellen, die P2X7R exprimieren, ersetzt werden, einschließlich Zellen, die durch Einführen eines exogenen P2X7-Gens genetisch verändert wurden.
  • Die Spezifität des P2X7R-Agonisten für den Calcium-Einstrom wurde bestätigt, indem die HT-22-Zellen vor der Zugabe von BzATP eine Stunde mit 100 mM oxidiertem ATP (oATP; Sigma) vorbehandelt wurden. oATP ist ein irreversibler Inhibitor des Rezeptors (Chen et al., J. Biol. Chem. 268 (1993), 8199–8203). Die Aktivierung von P2X7R durch den Agonisten wurde durch oATP gehemmt (18), wie durch die Abwesenheit der grünen Fluoreszenz in den Zellen gezeigt wird.
  • Ein weiteres Verfahren zum Messen der P2X7R-Aktivität umfasst den Eintritt von Ethidiumbromid in P2X7R-exprimierende Zellen. Durch die Aktivierung von P2X7R durch einen Agonisten wird der Eintritt von Ethidiumbromid zugelassen, welches an Kern-DNA bindet und ein fluoreszierendes Signal aussendet. Alternativ kann der Porpidium-Farbstoff YOPRO-1 anstelle von Ethidiumbromid eingesetzt werden. Eine Zunahme der Fluoreszenz kann als ein Maß der Aktivierung des P2X7-Rezeptors verwendet werden. Somit kann der Test eingesetzt werden, um die Wirkung eines Mittels oder einer Verbindung mit Agonist-Eigenschaften auf P2X7R zu testen und quantitativ zu bestimmen. In dem vorliegenden Beispiel wurden 103 HT-22-Zellen pro Vertiefung in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden ausgesät und bei 37°C und 5 % CO2 in DMEM-Medium, enthaltend 10 % FKS, so lange inkubiert, bis die Zellen sich an die Kulturoberfläche anhefteten. Sobald die Zellen angeheftet waren, wurden sie 60 Minuten in DMEM-Medium, enthaltend 10 % FKS, 10–4 M Ethidiumbromid und steigende Konzentrationen von BzATP (1 μM, 10 μM, 100 μM, 500 μM, 1 mM), inkubiert. Danach kann die Anzahl von fluoreszierenden Zellen, die das Ethidiumbromid in ihre DNA eingebaut haben, unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Zeiss, Deutschland) gezählt werden. Konzentrationen von mehr als 100 μM BzATP steigerten die Zahl von fluoreszierenden Kernen, wodurch eine Aktivierung von P2X7R angezeigt wird (19a). Alternativ kann die Ethidiumbromid-Fluoreszenz unter Verwendung eines Fluoreszenz-Plattenlesegeräts von Perkin-Elmer (Anregung: 520 nm, Emission: 595 nm, Spaltbreiten: Ex 15 nm, Ein 20 nm) gemessen werden. Aus den abgelesenen Ergebnissen kann für jedes Kandidat-Mittel oder für jede Kandidat-Verbindung eine plC50-Darstellung berechnet werden. Demgemäß ist ein P2X7R-Agonist als ein Mittel oder eine Verbindung mit einem EC50 gleich oder kleiner als 300 μMol definiert, wobei der Begriff EC50 als die Konzentration definiert ist, die 50 % einer maximalen Antwort auf einen Agonisten hervorbringt (North und Surprenant, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40 (2000), 563–580). Die Spezifität eines Agonisten für P2X7R kann bestimmt werden, indem die Zellen vor der Zugabe des Agonisten und des Ethidiumbromid-Farbstoffs 60 Minuten mit 100 μM oATP vorinkubiert werden. Unter diesen Bedingungen wird die Aktivierung von P2X7R durch den Agonisten durch oATP gehemmt, dies führt zu einer Reduktion der Anzahl von fluoreszierenden Zellen (19b).
  • Noch ein weiteres Verfahren zum Identifizieren von P2X7R-Agonisten wurde entwickelt, indem eine immortalisierte Maus-Zelllinie erzeugt wurde, die das menschliche P2X7R-Gen unter der Kontrolle der frühen Promotor/Enhancer-Region des menschlichen Cytomegalie-Virus (CMV) überexprimiert. Die menschliche P2X7R-cDNA wurde in den Vektor pcDNA3.1 (Invitrogen) eingefügt und unter Verwendung von Lipofectamin (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers in die Hippocampus-Zelllinie der Maus HT-22 transfiziert. Einen Tag nach der Transfektion wurde Kulturmedium, das 500 μg/ml G418 enthielt, zu den Zellen zugegeben. Resistente Clone wurden getrennt isoliert und nach Anwendung des Selektionsmediums 14 Tage gezüchtet.
  • Die Agonist-Aktivität einer Verbindung wurde bestimmt, indem der Calcium-Einstrom in die Zellen, welche den menschlichen P2X7R überexprimieren, gemessen wurde. Die Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen gezüchtet und bei 37°C mit 5 % CO2 in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum (Gibco) so lange inkubiert, bis sie die Konfluenz erreicht hatten. Danach wurden die Zellen eine Stunde mit 10 μM Fluo-4 AM (Molecular Probes) beladen. Fluo-4 AM ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der an intrazelluläres Calcium bindet. Nach dem Beladen wurden die Zellen einmal mit einem Puffer, enthaltend 0,5 mM CaCl2 und 20 mM Hepes, gewaschen und dann mit 20 μM BzATP oder 50 μM Tenidap behandelt. Die Agonist-Aktivität wurde nachgewiesen, indem eine Zunahme des Calcium-Einstroms gemessen wurde, die zu einer gesteigerten Bindung an Fluo-4 AM und einer erhöhten Fluoreszenz führt. Änderungen im Fluoreszenzsignal werden unter Verwendung eines Plattenlesegeräts Fluostar Optima Plate Reader (BMG biotech) gemessen. Sowohl BzATP als auch Tenidap bewirkten einen raschen Anstieg der Fluoreszenzintensität, die mit der Zeit langsam abnahm (19c). Somit stimulierten beide Verbindungen die Aktivität von P2X7R, die zu einem Einstrom von Ionen in die Zelle führt.
  • Beispiel 9
  • Die Aktivierung von P2X7R mit Agonisten hat eine antidepressive Wirkung
  • Um zu zeigen, dass die Aktivierung von P2X7R therapeutische Effekte auf affektive Störungen ausübt, wurde der P2X7R-Agonist BzATP (2'-3'-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosin-5'-triphosphat (C24H24N5O15P3)) an einen ausgewählten DBA/2OIa-Mausstamm verabreicht, der die Eigenschaften zeigt, extrem ängstlich zu sein, auf Antidepressiva anzusprechen und nach einer subchronischen antidepressiven Behandlung eine Anxiolyse zu zeigen (Lucki et al., Psychopharmacology 155 (2001), 315–322). BzATP ist eine Verbindung mit einer starken Spezifität für P2X7R (North und Surprenant, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40 (2000), 563–580). Im vorliegenden Beispiel wurde der P2X7R-Agonist direkt in den Hippocampus von Mäusen injiziert. Jedoch könnte ein P2X7R-Agonist-Mittel oder eine P2X7R-Agonist-Verbindung auch oral, subkutan, intravenös, intraarteriell, intranodal, intramedullär, intrathekal, intraventrikulär, intranasal, intrabronchial, transdermal, intrarektal, intraperitoneal, intramuskulär, intrapulmonal, vaginal, rektal oder intraokular verabreicht werden.
  • Bei vier Monate alten männlichen Mäusen wurden mit Hilfe eines stereotaktischen Instruments (David Kopf Instruments) beidseitig Führungskanülen (Nr. 23 („23 gauge"), Länge: 8 mm) implantiert. Die Koordinaten, bezogen auf das Bregma, waren –2,0 mm posterior, ±1,0 mm lateral und –1,0 mm ventral. Nach der Operation ließ man den Mäusen eine Erholungsphase von zehn bis zwölf Tagen. Nach dieser Erholungsphase erhielten die Mäuse innerhalb eines Zeitraums von 60 Sekunden in jede Seite des Gehirns Injektionen mit 1 μl Vehikellösung (0,5 % DMSO, Sigma) oder 50 μM BzATP (Sigma, hergestellt in 0,5 % DMSO). Die Injektionen erfolgten unter Verwendung einer 9-mm-Nadel Nr. 30 („30 Gauge"), die in die Führungskanülen eingeführt wurde und über einen Schlauch mit einer 10-μl-Hamilton-Spritze verbunden war.
  • Das Verhalten von einzelnen Mäusen wurde 24 Stunden nach der Injektion von Vehikellösung oder von BzATP unter Verwendung des erzwungenen Schwimmtests nach Porsolt bestimmt. Zehn bis 15 Minuten nach der Vehikel- oder BzATP-Injektion wurden die Tiere fünf Minuten dem Test vorausgesetzt. Der erzwungene Schwimmtest ist ein Standardtest, der eine primäre stressinduzierte Herabsetzung von Vermeidung oder Flucht misst, dies wird als ein Verhalten von Hoffnungslosigkeit bezeichnet. Der Test wird eingesetzt, um die Wirksamkeit von Antidepressiva zu bestimmen, neue pharmazeutische Verbindungen zu testen und Tiermodelle der Depression zu validieren (Porsolt et al., Arch. Int. Pharmacodym. 229 (1977), 327–336; Porsolt, Rev. Neurosci. 11 (2000), 53–58, Rénéric et al., Behav. Brain Res. 136 (2002), 521–532; Page et al., Psychopharmacology 165 (2003), 194–201; Kelliher et al., Psychoneuroendocrinology 28 (2003), 332–347). Der Test besteht daraus, eine Maus für einen Zeitraum von fünf Minuten in einen Glaszylinder zu geben, der Wasser enthält. Unter solchen Umständen kann die Maus den Boden des Zylinders nicht berühren und ist somit gezwungen zu schwimmen. Die Zeit, Latenz und Häufigkeit des aktiven Strampelns („struggling") gegenüber dem Treibenlassen („floating") werden als Verhaltensparameter bewertet. Das Treibenlassen (d.h. Bewegungen, die nur zum Halten des Gleichgewichts und Atmen gemacht werden) ist ein passives Verhalten, das mit Hoffnungslosigkeit assoziiert ist und ein depressionsähnliches Symptom darstellt, da das Tier keinerlei Anstrengung unternimmt, die stressreiche Situation aktiv zu bewältigen. Ein gesteigertes aktives Strampeln (d.h. aktive Versuche zu fliehen) zeigt ein aktives Bewältigungsverhalten an, das als eine Verbesserung von depressionsähnlichen Symptomen interpretiert werden kann. Z.B. reduziert eine Behandlung mit serotonergen Antidepressiva die Gesamtzeit, die mit Treibenlassen verbracht wird (Borsini, Neurosci. Biobehav. Rev. 19 (1995), 377–395; Redrobe und Bourin, Psychopharmacology 138 (1998), 198–206), und sie steigert gleichzeitig die Zeit des aktiven Verhaltens (d.h. Schwimmen oder aktives Strampeln; Lucki et al., Psychopharmacology 155 (2001), 315–322).
  • In einem Vergleichstest mit Kontrollmäusen, denen die Vehikellösung injiziert worden war, wurde festgestellt, dass der P2X7R-Agonist BzATP aktive Fluchtversuche steigert (d.h. eine Zunahme der Zeit und Häufigkeit des aktiven Strampelns, eine Abnahme in der Latenz des aktiven Strampelns), während eine Abnahme des passiven Verhaltens (d.h. eine Abnahme der Zeit und Häufigkeit des Treibenlassens, eine Zunahme der Latenz des Treibenlassens) gemessen wurde (20). Die festgestellten Ergebnisse wurden unter Verwendung von Mann-Whitney-U- und einseitigen MANOVA-Tests statistisch verifiziert. Es wurde gefunden, dass die Unterschiede in der Zeit des aktiven Strampelns, der Latenz des Treibenlassens und der Häufigkeit des Treibenlassens statistisch signifikant waren. Zwar wurden die Ergebnisse von Latenz und Häufigkeit des aktiven Strampelns und Zeit des Treibenlassens statistisch nicht bestätigt, sie stellen jedoch immer noch eine Tendenz zu einer Verbesserung im Stressbewältigungsverhalten dar. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein P2X7R-Agonist zu Verbesserungen von depressionsähnlichen Symptomen führen kann.
  • Da die aus dem erzwungenen Schwimmtest gezogenen Folgerungen auch durch unspezifische Effekte eines Mittels oder einer Verbindung auf die Aktivität des Tiers beeinflusst werden können (d.h. ein Anstieg des aktiven Strampelverhaltens kann das Ergebnis einer Hyperaktivität und nicht eines gesteigerten aktiven Bewältigungsverhaltens sein), wurde die mögliche Wirkung von BzATP auf die lokomotorische Aktivität durch den Test im offenen Feld bestimmt (Crawley, „What's wrong with my mouse: Behavorial phenotyping of transgenic and knockout mice", Wiley-Liss (2000)). Die lokomotorische Aktivität in Mäusen, die mit Kontroll-Vehikellösung oder mit 50 μM BzATP behandelt worden waren, wurde 24 Stunden nach der Injektion ermittelt, indem ein einzelnes Tier in eine dunkelgraue Holzkiste (30 × 30 × 40 cm) gegeben wurde. Die lokomotorische Aktivität wurde unter Verwendung einer Videokamera 30 Minuten lang überwacht. Danach wurde die von den Tieren während des Testzeitraums insgesamt zurückgelegte Entfernung anhand der Computersoftware VideoMot2 (TSE GmbH, Bad Homburg) ausgewertet. Zwischen den Mäusen, die mit Kontroll-Vehikellösung behandelt worden waren, und denjenigen, die mit BzATP behandelt worden waren, wurde kein Unterschied in der lokomotorischen Aktivität gemessen (21). Somit induzierte die Anwendung von BzATP keine Hyperaktivität. Diese Ergebnisse bestätigen, dass eine Aktivierung von P2X7R durch ein Agonist-Mittel oder eine Agonist-Verbindung zu Verbesserungen von depressionsähnlichen Symptomen führt und nicht das Ergebnis einer unspezifischen Wirkung auf die Aktivität des Tiers per se ist.
  • Mehrere Berichte legen nahe, dass eine Aktivierung von P2X7R in vitro Apoptose und Zelltod induzieren kann (Di Virgilio et al., Cell Death Differ. 5 (1998), 191–199, Virginio et al., J. Physiol. 519 (1999), 335–346). Um zu testen, ob eine Aktivierung von P2X7R im Hippocampus zu Zelltod führt, wurden die Apoptose-Spiegel im Gehirn der mit BzATP behandelten Mäuse quantitativ bestimmt. Die Mäuse wurden am Ende der Verhaltensexperimente getötet, die Gehirne entnommen, schockgefroren und in 16-μm-Scheibchen geschnitten. Danach wurden die Gehirnschnitte auf Apoptose untersucht, wobei das DeadEnd fluorometrische TUNEL-System gemäß den Anweisungen des Herstellers (Promega Corporation) eingesetzt wurde. Das TUNEL-System misst die fragmentierte DNA von apoptotischen Zellen. Positive Kontrollen für den Test werden hergestellt, indem die Gehirnschnitte zehn Minuten mit 1 Einheit/ml DNAse I vorbehandelt werden.
  • Sehr wenige apoptotische Zellen (d.h. weniger als eine Zelle pro Gehirnschnitt) wurden in den Gehirnen von Mäusen, die mit Kontrollvehikel oder mit dem P2X7R-Agonisten behandelt worden waren, im Vergleich zu den mit DNAse vorbehandelten positiven Kontrollschnitten festgestellt (22). Außerdem wurden keine signifikanten Unterschiede in der Anzahl von apoptotischen Zellen zwischen den Kontrolltieren und den mit BzATP behandelten Mäusen festgestellt, dies zeigt, dass die Aktivierung von P2X7R in vivo nicht zum Absterben von Gehirnzellen führt.
  • Beispiel 10
  • P2X7R-Antagonisten haben keine antidepressiven Effekte
  • Die P2X7R-Antagonisten KN-62 (1-(N,O-Bis[5-isochinolinsulfonyl]-N-methyl-L-tyrosyl)-4-phenylpiperazin) und oxidiertes ATP (oATP) wurden an DBA/201a-Mäuse (Harlan Winkelmann, Deutschland) verabreicht, die das Verhaltensmerkmal zeigen, dass sie extrem ängstlich sind. Für KN-62 wurde gezeigt, dass es sich um einen nicht-kompetitiven Antagonisten von P2X7R handelt (Chessel et al., Brit. J. Pharmacol. 124 (1998), 1314–1320), während oATP als ein irreversibler Inhibitor von P2X7R wirkt (Chen et al., J. Biol. Chem. 268 (1993), 8199–8203).
  • Im vorliegenden Beispiel wurden die P2X7R-Antagonisten direkt in die Region des Gyrus dentatus des Hippocampus injiziert. Kurz gesagt wurden bei den drei Monate alten männlichen Mäusen mit Hilfe eines stereotaktischen Instruments (David Kopf Instruments) beidseitig Führungskanülen (Nr. 23 („23 Gauge"), Länge: 8 mm) implantiert. Die Koordinaten, bezogen auf das Bregma, waren –1,5 mm posterior, ±1,0 mm lateral und –0,8 mm ventral. Nach der Operation ließ man den Mäusen eine Erholungsphase von zehn bis 13 Tagen. Nach dieser Erholungsphase erhielten die Mäuse innerhalb eines Zeitraums von 60 Sekunden in jede Seite des Gehirns Injektionen mit 1 μl Vehikellösung (0,01 % DMSO, Sigma) oder 100 nM KN-62 (Sigma, hergestellt in 0,01 % DMSO) oder 10 μM oATP (Sigma, hergestellt in PBS). Alle Injektionen erfolgten unter Verwendung einer 9-mm-Nadel Nr. 31 („31 Gauge"), die in die Führungskanülen eingeführt wurde und über einen Schlauch mit einer 10-μl-Hamilton-Spritze verbunden war.
  • Das Verhalten der einzelnen Mäuse wurde 24 Stunden nach der Injektion von Vehikellösung, von KN-62 oder von oATP unter Verwendung des erzwungenen Schwimmtests nach Porsolt bestimmt. 15 bis 17 Minuten nach der Verabreichung von Vehikel, KN-62 oder oATP wurden die Tiere fünf Minuten dem Test vorausgesetzt. Eine Beschreibung des erzwungenen Schwimmtests nach Porsolt findet sich in Beispiel 9. Im vorliegenden Beispiel wurden keine Änderungen in aktiven Fluchtversuchen (d.h. Zeit, Häufigkeit, Latenz des aktiven Strampelns) oder im passiven Verhalten (d.h. Zeit, Häufigkeit und Latenz des Treibenlassens) zwischen den mit Vehikel, KN-62 oder oATP behandelten Mäusen gemessen (23). Die festgestellten Ergebnisse wurden unter Verwendung eines einseitigen MANOVA-Tests statistisch verifiziert. Die Unterschiede, die in den verschiedenen Parametern zwischen den mit Vehikel, KN-62 oder oATP behandelten Mäusen festgestellt wurden, wurden statistisch nicht bestätigt. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass P2X7R-Antagonisten depressionsähnliche Symptome nicht verbessern und keine antidepressive Wirkung besitzen.
  • Da die aus dem erzwungenen Schwimmtest gezogenen Folgerungen auch durch unspezifische Effekte eines Mittels oder einer Verbindung auf die Aktivität des Tiers beeinflusst werden können (d.h. ein Anstieg des aktiven Strampelverhaltens kann das Ergebnis einer Hyperaktivität und nicht eines gesteigerten aktiven Bewältigungsverhaltens sein), wurde die mögliche Wirkung des P2X7R-Antagonisten oATP auf die lokomotorische Aktivität durch den Test im offenen Feld bestimmt. Die lokomotorische Aktivität bei Mäusen, die mit der Kontroll-Vehikellösung, mit 10 μM oATP oder mit 50 μM oATP behandelt worden waren, wurde 15 Minuten nach der Injektion festgestellt, indem ein einzelnes Tier in eine dunkelgraue Holzkiste (30 × 30 × 40 cm) gegeben wurde. Die lokomotorische Aktivität wurde unter Verwendung einer Videokamera 30 Minuten lang überwacht. Danach wurde die von den Tieren während des Testzeitraums insgesamt zurückgelegte Entfernung anhand der Computersoftware VideoMot2 (TSE GmbH, Bad Homburg) ausgewertet. Zwischen den Mäusen, die mit Kontroll-Vehikellösung behandelt worden waren, und denjenigen, die mit oATP behandelt worden waren, wurde kein Unterschied in der lokomotorischen Aktivität gemessen (24). Somit induzierte die Applikation eines P2X7R-Antagonisten in den Tieren keine Hypo- oder Hyperaktivität.
  • Sequenzprotokoll
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Claims (9)

  1. Verwendung eines Agonisten des ATP-abhängigen Ionenkanals P2X7R für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer affektiven Störung.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Agonist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ATP, ATP-4 und BzATP (2'-3'-O-(4-Benzoylbenzoyl)adenosin-5'-triphosphat (C24H24N5O15P3)).
  3. Verwendung von Tenidap (C15H11ClN2O2S) oder 3-substituierten-2-Oxindol-1-Carboxamiden für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer affektiven Störung.
  4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Arzneimittel gegebenenfalls zusätzlich einen β-adrenergen Rezeptormodulator umfasst.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der β-adrenerge Rezeptormodulator ein β-adrenerger Rezeptorantagonist ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DL-Propanolol, D-Propanolol and Labetolol.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die affektive Störung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus schwerer Depression, genereller Angstneurose und manisch-depressiver Erkrankung.
  7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die schwere Depression ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus schwerer Depression, Dysthymie, atypischer Depression, prämenstrueller dysphorischer Störung und jahreszeitlich abhängiger affektiver Störung.
  8. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die generelle Angstneurose ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Panik-Störung, Phobien, Agoraphobie, sozialer Phobie, spezifischer Phobie, obzessiv-kompulsiver Störung, posttraumatischer Stresserkrankung, Trennungsangst, Manie, Hypomanie und cyclothymer Störung.
  9. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die manisch-depressive Erkrankung vom Typ 1 oder Typ 2 ist.
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