CN1656114A - 新的pancortin－Pablo蛋白相互作用及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新鉴定的人pancortin多肽、所述pancortin多肽与Pablo多肽的相互作用、所述多肽的用途以及所述多肽的生产。本发明还涉及鉴定调节pancortin多肽活性和/或pancortin－Pablo多肽相互作用的相互作用的化合物，其中调节剂可以作为pancortin和/或pancortin/Pablo相互作用的激动剂、拮抗剂和/或抑制剂，因此具有潜在治疗价值。

Description

新的pancortin-Pablo蛋白相互作用及其使用方法
                     发明领域
本发明总的来讲涉及细胞信号、细胞凋亡、神经科学和分子生物学领域。更具体地讲，本发明涉及新鉴定的包含神经元特异性pancortin多肽和神经元特异性促凋亡Pablo多肽的多肽相互作用、所述多肽的应用、所述多肽的调节以及所述多肽的生产。本发明还涉及鉴定可以作为pancortin-Pablo相互作用的激动剂、拮抗剂和/或抑制剂、并因此具有潜在治疗价值的化合物。
                     发明背景
细胞凋亡是通过激活细胞内在自杀机制而发生的程序性细胞死亡形式。这种负责细胞凋亡的生化机制在大多数(如果不是全部的话)细胞中表达。细胞凋亡主要是去除不再需要或功能异常的个别细胞所必需的生理过程。细胞凋亡是依赖于濒死细胞的主动代谢和蛋白质合成的可调型事件。
细胞凋亡在发育和体内稳态期间起着重要的作用。细胞凋亡可以在各种各样的细胞类型中由于似乎阻抑主动自杀反应的生长因子缺乏而触发。细胞凋亡对于免疫系统生理特别重要。细胞凋亡是生殖中心内对抗原低亲和性的成中心细胞的死亡模式，细胞被特异性细胞毒性T淋巴细胞或天然杀伤细胞杀死，以及被带有自身抗原的高亲和性T细胞受体的胸腺细胞杀死，所述自身抗原在胸腺发育期间是克隆缺失的(负选择)。
正在凋亡的濒死细胞与正在坏死的濒死细胞的形态学特征和生化特性显著不同。在细胞凋亡期间，细胞体积缩小并聚集。核染色质经历凝聚和断裂。细胞死亡在DNA断裂之后发生。凋亡细胞的DNA被锌离子所抑制的内源性钙-镁依赖性内切核酸酶非随机性降解。该酶通过切除核小体之间的接头DNA纵长(running)而产生约200个碱基对(bp)或200bp倍数的片段。因此，似乎DNA是导致细胞自杀过程中一个最重要的靶。然后凋亡细胞碎裂成许多质膜包被的小泡，称为“凋亡小体”，所述小泡包含凝聚的染色质片段和形态完整的细胞器，例如线粒体。凋亡细胞和凋亡小体被快速吞噬，从而保护周围组织免于损伤。凋亡细胞被快速而有效的清除使得检测组织切片中的细胞凋亡变得极其困难。
相反，坏死与快速代谢崩溃有关，代谢崩溃导致细胞膨胀，质膜完整性早期丧失，最终细胞破裂。胞质溶胶内容物从坏死细胞中渗出，引起周围组织的损伤和炎症。
虽然细胞凋亡途径的具体细节仍未完全阐明，但是已确立了作为半胱氨酸蛋白酶(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)的胱冬蛋白酶(caspase)在细胞凋亡过程的各个阶段起着必不可少的作用(Grutter，2000)。除胱冬蛋白酶之外，细胞凋亡的高度可调型过程涉及一系列复杂的事件。Bcl-2蛋白家族构成细胞凋亡的细胞内关卡。已发现的该家族成员是由首先从滤泡性淋巴瘤中分离的Bcl-2原癌基因编码的凋亡抑制蛋白(Bakhshi等，1985；Tsujimoto等，1985；Cleary和Sklar，1985)。Bcl-2蛋白的分子量为25kDa，是位于包括线粒体在内的细胞内膜的膜内在蛋白。该因子通过抑制由各种各样的死亡诱导刺激诱发的细胞凋亡而延长许多不同细胞类型的存活时间(Korsmcyer，1992)。
BCL-2相关蛋白家族由抗凋亡成员和促凋亡成员组成，它们均在所有多细胞生物体所共有的远侧凋亡途径中起作用。已经提出，抗凋亡分子(Bcl-2、BCl-xL、Mcl-1和A1)与促凋亡分子(Bax、Bak、Bcl-xS，Bad、Bik和Bid)之比可以参与决定细胞是否响应近侧凋亡刺激(Oltvai等，1992；Farrow等，1996)。因为该家族成员可以形成同源二聚体和异源二聚体，所以后者通常包括抗凋亡多肽和促凋亡多肽，这些同源二聚体和异源二聚体的平衡可能在调节细胞凋亡中起作用(Oltvai和Korsmeyer，1994)。
BCL-2家族成员按照主要基于称为BCL-同源结构域的保守基序的序列同源性来定义(Yin等，1994)。BCL-同源结构域1和2，命名为BH1和BH2，已经显示在二聚化及调节细胞凋亡中是重要的(Yin等，1994)。第三个同源区是命名为BH3的两亲性α-螺旋，在有些家族成员中已经发现，并且显示在二聚化以及促凋亡中是重要的(Chittenden等，1995)。BH4，最新鉴定的同源结构域，位于某些促凋亡家族成员氨基末端附近(Farrow等，1996)。
BCL-2家族除Bad和Bid以外的所有已知成员都具有C末端膜锚定尾(TM)。具有TM的BCL-2家族成员是细胞内的膜内在蛋白，最常见位于线粒体、内质网和细胞核膜内。BCL-2家族成员的细胞内膜定位，结合对BCl-xL单体和大肠杆菌素和白喉毒素B片段的离子成孔毒素之间的结构相似性的鉴定(Muchmore等，1996)，促进了通过几组对BCL-2家族成员在人工脂膜中形成离子通道的能力进行电生理学研究。
据认为某些病症与受影响细胞中缺陷型细胞凋亡负调节的发生有关。例如，肿瘤可以至少部分是由于抗凋亡状态所引起的，抗凋亡状态中，细胞增殖信号不恰当地超过细胞死亡信号。此外，某些DNA病毒如Epstein-Barr病毒、非洲猪热病病毒和腺病毒寄生在宿主细胞机制，驱动其自我复制，同时调节抑制细胞死亡的细胞凋亡，使得靶细胞复制病毒。此外，某些病症如淋巴增生性病症、癌症(包括抗药性癌症)、关节炎、炎症、自身免疫病等都可以因细胞死亡调节的负调节而引起。在这类病症中，需要有促进细胞凋亡的机制。
相反，在其它病症中，需要抑制细胞凋亡，例如在治疗包括AIDS、衰老、神经变性性疾病、局部缺血性和再灌注细胞死亡、不育症、创伤愈合等免疫缺陷病时需要抑制细胞凋亡。在治疗这类疾病时，需要有抑制细胞凋亡的机制。
因此，显然需要对可以在预防、缓解或矫正细胞凋亡相关性功能障碍或疾病中起作用的其它蛋白、其基因和其配体进行鉴定和表征。对可以调节细胞凋亡的化合物的鉴定可用于开发用于有利调节涉及细胞死亡的不恰当抑制或不恰当增强的病症中的细胞凋亡过程的治疗方案。
                     发明概述
本发明涉及新鉴定的人pancortin多肽、这些pancortin多肽与Pablo多肽的相互作用(即pancortin-Pablo相互作用)、所述多肽的应用以及所述多肽的生产。本发明还涉及可以鉴定调节pancortin多肽活性和/或pancortin-Pablo多肽相互作用的相互作用、并因此具有潜在治疗价值的化合物，其中调节剂可以是pancortin和/或pancortin-Pablo相互作用的激动剂、拮抗剂和/或抑制剂。在具体的实施方案中，pancortin多肽、编码pancortin多肽的多核苷酸、pancortin多肽活性的调节剂或pancortin基因表达的调节剂都可用来调节细胞凋亡，更优选调节神经细胞凋亡。
因此，在特定的实施方案中，本发明涉及一种编码人pancortin多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段有至少95％同一性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段。在另一个实施方案中，提供一种编码人pancortin多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：3的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段有至少95％同一性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段。在又一个实施方案中，提供一种编码人pancortin多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：5的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段有至少95％同一性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段。在又一个优选的实施方案中，提供一种编码人pancortin多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段。在具体的实施方案中，SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的多核苷酸选自DNA、基因组DNA、cDNA、RNA和反义RNA，并且还可以包含异源核苷酸。
在本发明的另一个实施方案中，提供一种编码人pancortin多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段有至少95％同一性的核苷酸序列，并且编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列、其变异体或其片段的多肽。在另一个实施方案中，提供一种编码人pancortin多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：3的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段有至少95％同一性的核苷酸序列，并且编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列、其变异体或其片段的多肽。在本发明的再一个实施方案中，提供一种编码人pancortin多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQID NO：5的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段有至少95％同一性的核苷酸序列，并且编码包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列、其变异体或其片段的多肽。在本发明进一步的实施方案中，提供一种编码人pancortin多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段，并且编码包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段的多肽。在其它实施方案中，SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：8的多肽结合包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列、其变异体或其片段的Pablo多肽。在某些其它实施方案中，SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的pancortin多肽是融合多肽。
在其它实施方案中，本发明涉及一种与包含SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段的多核苷酸在高严格性杂交条件下杂交的分离的多核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种由包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的分离的人pancortin多肽。在又一些实施方案中，本发明涉及一种由包含与SEQ ID NO：3的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的分离的人pancortin多肽。在再一些实施方案中，本发明涉及一种由包含与SEQ ID NO：5的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码的分离的人pancortin多肽。在另一些实施方案中，本发明涉及一种由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段的多核苷酸编码的分离的人pancortin多肽。在优选的实施方案中，pancortin多肽结合包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列、其变异体或其片段的pablo多肽，其中结合调节细胞凋亡，更优选调节神经细胞凋亡。在其它具体的实施方案中，所述多肽是融合多肽。
在优选的实施方案中，本发明涉及一种包含SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段的分离的人pancortin多肽。在一个具体优选的实施方案中，所述多肽结合包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或其变异体的pablo多肽，其中结合调节细胞凋亡，甚至更优选调节神经细胞凋亡。在某些实施方案中，所述多肽是融合多肽。
在某些其它实施方案中，本发明涉及抗pancortin多肽的特异性抗体，pancortin多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段。在具体的实施方案中，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体。在一个优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在其它实施方案中，本发明涉及抗pablo-pancortin多肽二聚体的特异性抗体。在具体的实施方案中，所述多肽二聚体包含pablo多肽和pancortin多肽，其中所述pablo多肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列、其变异体或其片段，而所述pancortin多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段。在具体的实施方案中，所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体。在一个优选的实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。
在某些实施方案中，本发明涉及包括含SEQ ID NO：1的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段的多核苷酸的表达载体。在优选的实施方案中，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列、其变异体或其片段的pancortin多肽。在其它实施方案中，本发明涉及包括含SEQ ID NO：3的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段的多核苷酸的表达载体。在优选的实施方案中，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列、其变异体或其片段的pancortin多肽。在再一些实施方案中，本发明涉及包括含SEQID NO：5的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段的多核苷酸的表达载体。在优选的实施方案中，所述多核苷酸编码包含SEQID NO：6的氨基酸序列、其变异体或其片段的pancortin多肽。在又一个实施方案中，本发明涉及包括含SEQ ID NO：7的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段的多核苷酸的重组表达载体。在优选的实施方案中，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段的pancortin多肽。在具体的实施方案中，所述表达载体还包含编码含SEQ ID NO：9的氨基酸序列、其变异体或其片段的pablo多肽的多核苷酸。在再一些具体的实施方案中，所述多核苷酸包含在选自DNA、基因组DNA、cDNA、RNA和反义RNA的载体中。在优选的实施方案中，所述多核苷酸与一个或多个选自启动子、增强子、剪接信号、终止信号、核糖体结合信号和聚腺苷酸化信号的调节元件有效连接。在其它实施方案中，所述载体DNA选自质粒DNA、附加型DNA、YAC DNA和病毒DNA。在优选的实施方案中，所述载体是质粒DNA。
在其它实施方案中，本发明涉及一种基因工程宿主细胞，所述宿主细胞已用包括含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQID NO：7的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段的多核苷酸的表达载体转化、转染或感染。在具体的实施方案中，所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是细菌细胞。在另一个优选的实施方案中，所述载体包含在宿主细胞中，并且表达所述多核苷酸，从而产生编码多肽、变异体或其片段。
在另一个实施方案中，提供稳定表达pancortin多肽的神经细胞系，pancortin多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段。
在具体的实施方案中，本发明涉及其基因组在编码内源pancortin多肽的多核苷酸中包含工程功能性破坏的转基因动物。在优选的实施方案中，所述动物对于所述功能性破坏是纯合的，而在其它实施方案中，所述动物选自小鼠、大鼠、兔子和仓鼠。在再一些实施方案中，本发明涉及一种分析试验化合物对pancortin多肽活性的影响的方法，所述包括下述步骤：提供包含编码pancortin多肽的多核苷酸的转基因动物，将试验化合物给予所述动物，然后在存在和不存在所述试验化合物的情况下，测定所述试验化合物对所述pancortin活性的影响。在具体的实施方案中，所述多核苷酸具有至少一个选自核苷酸缺失、核苷酸取代和核苷酸插入的突变。在再一些实施方案中，本发明涉及一种分析试验化合物对其基因组包含编码pancortin多肽的多核苷酸的一个功能性破坏的转基因动物的影响的方法，所述方法包括提供其基因组包含编码pancortin多肽的一个破坏的内源多核苷酸的转基因动物，将试验化合物给予所述动物，然后在存在和不存在所述试验化合物的情况下，测定所述试验化合物对所述pancortin多肽活性的影响。在又一个实施方案中，本发明涉及一种产生其基因组在编码pancortin多肽的多核苷酸中包含功能性破坏的转基因动物的方法，所述方法包括提供一种具有功能性破坏的pancortin多肽编码多核苷酸，将所述破坏的多核苷酸导入胚胎干细胞中，选择那些包含所述破坏的多核苷酸的胚胎干细胞，将包含所述破坏的多核苷酸的胚胎干细胞导入胚泡中，将所述胚泡转移到假孕动物体内，让所转移的胚泡发育成带有所述破坏的嵌合动物。在一个优选的实施方案中，所述方法还包括让所述嵌合动物与野生型动物配种，得到带有所述破坏的杂合动物。在再一个优选的实施方案中，所述方法还包括繁育所述杂合动物，产生带有所述破坏的纯合动物。
在某些实施方案中，本发明涉及调节细胞凋亡的方法，所述方法包括调节pancortin多肽的活性。在具体的实施方案中，调节细胞凋亡还包括调节pablo多肽的活性。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种调节细胞凋亡的方法，所述方法包括调节编码pancortin多肽的多核苷酸的表达。在具体的实施方案中，调节细胞凋亡还包括调节编码pablo多肽的多核苷酸的表达。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种治疗神经系统疾病患者的方法，所述方法包括调节pancortin多肽的活性和/或调节编码pancortin多肽的多核苷酸的表达。
在具体的实施方案中，所述多核苷酸具有至少一个选自核苷酸缺失、核苷酸取代和核苷酸插入的突变。在再一个实施方案中，本发明涉及一种分析试验化合物对pancortin多肽活性的影响的方法，所述方法包括下述步骤：提供包含表达pancortin多肽的多核苷酸的重组细胞，使所述细胞与试验化合物接触，然后在存在和不存在所述试验化合物的情况下，测定所述试验化合物对所述pancortin活性的影响。在一个具体的实施方案中，所述多核苷酸具有至少一个选自核苷酸缺失、核苷酸取代和核苷酸插入的突变。在另一个具体的实施方案中，所述重组细胞还可以包含表达pablo多肽的多核苷酸。在其它实施方案中，提供一种分析试验化合物对pancortin多肽和pablo多肽的结合相互作用的影响的方法，所述方法包括下述步骤：提供包含pancortin多肽和pablo多肽的酵母双杂交系统的酵母细胞，使所述细胞与试验化合物接触，然后在存在和不存在所述试验化合物的情况下，测定所述试验化合物对所述pancortin多肽和pablo多肽的结合相互作用的影响。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种产生包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段的pancortin多肽的方法，所述方法包括用包括含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7的核苷酸序列或其简并变异体的多核苷酸的表达载体转染、转化或感染重组宿主细胞，在足以产生所述多肽的条件下培养所述宿主细胞，然后从所述培养物中分离出所述多肽。
在又一个实施方案中，本发明涉及一种治疗需要降低pancortin活性的患者的方法，所述方法包括给予所述患者治疗有效量的pancortin拮抗剂和/或给予所述患者编码包含与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7的核苷酸序列、其简并变异体或其片段互补的核苷酸序列的反义RNA多核苷酸的多核苷酸。
在再一些实施方案中，本发明提供一种用于诊断患者的涉及所述患者体内pancortin多肽的表达或活性的疾病或疾病敏感性的方法，所述方法包括测定编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列或其片段的pancortin多肽的多核苷酸中是否存在突变，和/或分析来源于所述患者的样品中pancortin表达的存在情况，其中己表达的pancortin是编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列或其片段的pancortin多肽的多核苷酸。
在具体的实施方案中，本发明涉及一种用于治疗过度增殖性疾病的组合物，所述组合物包含pancortin多肽和pablo多肽，其中所述pancortin多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列，而所述pablo多肽包含氨基酸序列SEQID NO：10。在一个优选的实施方案中，所述过度增殖性疾病选自癌症、牛皮癣、再狭窄、动脉粥样硬化和纤维变性。
根据下面的发明详述、其优选实施方案和所附权利要求书，本发明的其它特征和优势将会是显而易见的。
                      附图简述
图1是表示四种pancortin mRNA蛋白编码序列的示意图。可变剪接导致产生pancortin 1、pancortin 2、pancortin 3和pancortin 4同种型。
图2A显示小鼠pancortin的基因组组构，其沿28kb DNA排列成8个外显子(黑方块)。标出了对应于每个外显子的pancortin结构域。
图2B是表示产生四种pancortin cDNA的可变剪接的示意图。可读框大小贡献为A＝66bp，B＝150bp，M＝306bp，Y＝6bp，Z＝1002bp。
图3是显示产生pancortin剔除小鼠中所用的打靶载体策略的示意图。所述策略将会产生Y外显子组成型剔除并且可以含有利用CRE-LOX系统诱导型剔除的M2外显子的小鼠。
                      发明详述
细胞凋亡经一系列普遍接受的包括胱冬蛋白酶家族活化在内的事件而发生。已知各种各样的胞外信号都可触发胱冬蛋白酶活化并导致凋亡性细胞死亡。然而，人们尚未完全清楚地了解参与细胞凋亡信号的传输和整合的步骤和分子。
先前已经证明，被鉴定为促凋亡Bcl-xL结合蛋白( pro- apoptoticBcl-x L  binding pr otein，“在下文称为Pablo”)的蛋白与抗凋亡BCL-xL蛋白相互作用，从而调节细胞凋亡，并且是神经元特异性的(于1999年10月22日申请的美国专利申请顺序号09/425,501，所述专利申请通过引用全部结合到本文中)。本发明鉴定出与Pablo相互作用的蛋白。具体地说，本发明鉴定出称为pancortin、与Pablo结合、相互作用或有关并且“介导”Pablo诱导的细胞凋亡的蛋白质家族。
pancortin代表最初基于脑特异性转录物的克隆鉴定的脑特异性糖蛋白家族(Danielson等，1994)。使差别加工的pancortin转录物在大鼠脑中以发育特异性和区域特异性方式表达(Nagano等，1998)。四种pancortin蛋白由于两个5′外显子(A和B，具有独立启动子)与不同的3′外显子(编码两个不同的C末端蛋白，称为末端Y和Z)一起使用而产生的。所有组合的矩阵导致产生4种共享中间区域(M)的mRNA和蛋白(参见图1和图2B)。
pancortin 3和4是发育期间的优势形式并且可以是分泌型的，而pancortin 1和2在成年期中占优势(Nagano等，2000)。本发明证明pancortin蛋白家族位于内质网(ER)(Nagano等，1998)。因此，如果pancortin 3和4确实是分泌型蛋白，则预期其与ER的结合作为分泌途径的组成部分。本发明证明pancortin 2是非分泌型、ER居留或结合蛋白。有许多阐明内质网在所述细胞凋亡、特别是在神经元细胞凋亡中的重要性的文献报道。在本发明的酵母双杂交试验中，观察到pancortin 2和pancortin 4与Pablo结合，而pancortin 1和pancortin3不与Pablo结合(数据未显示)。pancortin 1和pancortin 3不与Pablo结合，说明Z结构域空间上阻碍这种相互作用，或者作为Y结构域的甘氨酸残基在所述结合中具有重大意义。然而，在四种pancortin同种型中，pancortin 2似乎在体内与Pablo在功能上相互作用。pancortin2的转染导致培养的神经元细胞中细胞死亡增加，据推测可能是与内源细胞因子相互作用所致。pancortin 2与Pablo的共转染降低非神经元细胞的生存力，而它们的单独转染具有最小效应，说明pancortin 2是Pablo的配偶体，并且在中枢神经系统(CNS)中介导Pablo诱导的细胞凋亡。用Pablo和pancortin 1、3或4的共转染，没有观察到非神经元细胞中的这种协同凋亡活性。在哺乳动物细胞凋亡试验中，用pancortin 4所看到的偏差，也就是说，它在酵母双杂交体中结合Pablo，而没有促凋亡结果，具有至少三种可能的解释。第一，pancortin4的细胞内定位/打靶可使其与Pablo在物理学上分离，因此阻碍了结合。第二，pancortin 4可以在体内以抗凋亡方式结合Pablo。第三，在体内结合Pablo的pancortin 4可能在细胞凋亡中起不到什么作用。
pancortin 1、pancortin 2、pancortin 3和pancortin 4的核酸序列分别是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7。pancortin 1、pancortin 2、pancortin 3和pancortin 4的氨基酸序列分别是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8。Pablo的核酸序列是SEQ ID NO：9，其编码Pablo蛋白即SEQ ID NO：10。
SEQ ID NO：11的多核苷酸序列编码具有氨基酸序列SEQ IDNO：12的Pablo多肽片段。该Pablo片段包含全长Pablo多肽(即SEQ IDNO：10)的pancortin结合结构域。同样，SEQ ID NO：13编码pancortin2多肽片段SEQ ID NO：14，其包含全长pancortin 2多肽(即SEQ IDNO：4)的Pablo结合结构域。此外，pancortin 2(SEQ ID NO：3)的核苷酸280-459与pancortin 4(SEQ ID NO：7)的核苷酸196-375同源。pancortin 2(SEQ ID NO：3)的核苷酸280-456与pancortin 1(SEQ IDNO：1)的核苷酸280-456同源，并且与pancortin 3(SEQ ID NO：5)的核苷酸196-372同源。
因此，本发明涉及新鉴定的包含神经元特异性pancortin多肽和神经元特异性促凋亡Pablo多肽的多肽相互作用、所述多肽的应用、所述多肽的调节以及所述多肽的生产。本发明也涉及鉴定可以作为pancortin-Pablo相互作用的激动剂、拮抗剂和/或抑制剂的化合物，因此可用于预防、缓解或矫正细胞凋亡相关性功能障碍或疾病。
本发明的多核苷酸、多肽、抗体、表达载体、宿主细胞和转基因动物的组合物及使用方法在下面各小节中进行讨论。
A.编码pancortin多肽和Pablo多肽的分离的多核苷酸
考虑将本发明分离纯化的pancortin多核苷酸和Pablo多核苷酸用于生产pancortin多肽和pablo多肽及其片段。在具体的实施方案中，将pancortin多肽和pablo多肽及其片段用于分析试验化合物对pancortin-Pablo相互作用活性的影响的方法中，用于分析试验化合物对包含在编码pancortin和/或pancortin-Pablo的转基因动物体内的pancortin和Pablo的活性或相互作用的影响的方法中，用于诊断和治疗pancortin和/或pancortin-Pablo活性相关性疾病的方法中，以及用于调节pancortin和/或pancortin-Pablo活性的方法中。在其它实施方案中，提供抗pancortin多肽及其片段、pancortin-Pablo多肽二聚体及其片段的特异性抗体、在编码pancortin多肽的多核苷酸中包含功能性破坏的转基因动物、编码pancortin和/或pancortin-Pablo多肽的重组表达载体以及包含这些载体的宿主细胞。如本文中定义，术语“pancortin-Pablo”包括既存在pancortin多肽又存在Pablo多肽。
因此，一方面，本发明提供编码pancortin和/或pancortin-Pablo多肽的分离纯化的多核苷酸。在具体的实施方案中，本发明的多核苷酸是DNA分子。在一个优选的实施方案中，本发明的多核苷酸编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段的分离的人pancortin多肽。在具体的实施方案中，编码pancortin多肽的分离的多核苷酸包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7的核苷酸序列、其简并变异体或其片段。在某些实施方案中，还提供分离的Pablo多肽，其中所述Pablo多肽由包含核苷酸序列SEQ ID NO：9的多核苷酸编码。
本文所用的术语“多核苷酸”是指通过磷酸二酯键连接的核苷酸序列。在本文中，多核苷酸的方向从5′到3′。本发明的多核苷酸可以包含约40个碱基对到约成百上千个碱基对。多核苷酸最好包含约10个碱基对到约3,000个碱基对。具体多核苷酸的优选长度在下文中叙述。
本发明的多核苷酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)分子、核糖核酸(RNA)分子、或者使用核苷酸类似物产生的DNA类似物或RNA类似物。核酸分子可以是单链DNA或双链DNA，但最好是双链DNA。当多核苷酸是DNA分子时，该分子可以是基因、cDNA分子或基因组DNA分子。本文中用单字母代码表示核苷酸碱基：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、肌苷(I)和尿嘧啶(U)。
“分离的”是指“经由人的劳动”而从自然状态改变。假如天然存在“分离的”组合物或物质，那么它已经被改变，或者离开其原始环境，或者二者都有。例如，根据本文所用的术语，在活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但与其天然状态共存的材料分离的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。
“分离的”多核苷酸最好不含所述核酸所来源的生物基因组DNA中天然邻接所述核酸的序列(即位于所述核酸5′端和3′端的序列)。例如，在各种实施方案中，分离的pancortin和/或pancortin-Pablo核酸分子可以包含所述核酸所来源的细胞(例如神经元细胞或胎盘细胞)基因组DNA中天然邻接所述核酸分子的少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷酸序列。然而，pancortin核酸分子可以与其它蛋白编码或调节序列融合，而仍然被认为是分离的。
可以使用标准克隆和筛选技术，从由人类细胞mRNA或基因组DNA产生的cDNA文库获得本发明的多核苷酸。也可以使用众所周知的商业化技术合成本发明的多核苷酸。
本发明还包括这样的核酸分子：由于遗传密码的简并性，所述核酸分子与编码人pancortin多肽的SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5或SEQ ID NO：7的核苷酸序列不同，而因此编码与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列所编码的相同pancortin多肽。
在另一个优选的实施方案中，本发明分离的多核苷酸包含与SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或这些核苷酸序列的片段互补的核酸分子。与SEQ ID NO：1、SEQID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列互补的核酸分子是与核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7足够互补的核酸分子，以便它能够与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列杂交，从而形成稳定的双链体。
使用本领域众所周知的方法，可以容易地鉴定人pancortin多核苷酸的直向同源物和等位基因变异体。pancortin的等位基因变异体和直向同源物将包含以下核苷酸序列：所述核苷酸序列与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或这些核苷酸序列的片段有通常至少约70-75％同源性、更通常至少约80-85％同源性、最通常至少约90-95％或更高同源性。根据与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列或这些核苷酸序列的片段(最好在严格性条件下)杂交的能力，可以容易地鉴定所述核酸分子。
当本发明的多核苷酸用于重组生产本发明pancortin和/或pancortin-Pablo多肽时，所述多核苷酸可以包括所述成熟多肽的编码序列本身，或者所述成熟多肽的编码序列与其它编码序列在同一读框中，所述其它编码序列例如那些编码前导序列或分泌序列、前多肽序列、或原多肽序列或前原多肽序列或其它融合肽部分的序列。例如，可以编码便于纯化融合多肽的标记序列(参见Gentz等，1989，通过引用全部结合到本文中)。所述多核苷酸也可以包含非编码5′和3′序列，例如转录但不翻译的序列、剪接信号和聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点和稳定mRNA的序列。
除SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：7所示的pancortin核苷酸序列外，本领域技术人员还将会认识到，在群体(例如人类群体)内可能存在导致pancortin多肽的氨基酸序列改变的DNA序列多态性。由于天然等位基因变异，pancortin基因或多核苷酸中的所述遗传多态性可能存在于同一群体不同个体中。本文所用的术语“基因”和“重组基因”是指包含编码pancortin多肽的可读框的多核苷酸，pancortin多肽最好是人pancortin多肽。所述天然等位基因变异通常可能导致pancortin多核苷酸的核苷酸序列中1-5％的变异。天然等位基因变异引起的pancortin多核苷酸内任何和所有所述核苷酸变异和由此导致的pancortin多核苷酸内氨基酸多态性包括在本发明范围内。所述等位基因变异包括有活性等位基因变异体以及无活性或活性降低的等位基因变异体，后两种类型通常会引起病理疾病。
此外，来自其它物种的编码pancortin多肽的核酸分子和因此具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的人序列不同的核苷酸序列的核酸分子包括在本发明的范围内。可以如下分离本发明的对应于人pancortin cDNA的天然等位基因变异体和非人类直向同源物的多核苷酸：根据它们与本文公开的人pancortin多核苷酸的同源性，依照标准杂交技术，在严格杂交条件下，用人cDNA或其片段作为杂交探针进行分离。
因此，可以通过如下方法从人类以外的物种获得编码本发明多肽的多核苷酸，包括同源物和直向同源物，所述方法包括下述步骤：在严格杂交条件下，用具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7序列或其片段的标记探针筛选合适的文库；然后分离包含所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。所述杂交技术是技术人员熟知的。技术人员将会认识到，在许多情况下，分离的cDNA序列将是不完全的，因为所述多肽的编码区在所述cDNA的5′末端截短。这是逆转录酶作用的结果，所述酶本质上具有低“持续合成能力(processivity)”(酶在聚合反应期间保持附着到模板上的能力的度量)，不能在第一条链cDNA合成期间完成mRNA模板的DNA拷贝。
因此，在某些实施方案中，本发明提供的多核苷酸序列信息使得可以制备能够与本文公开的所选多核苷酸的基因序列特异性杂交的相对短的DNA(或RNA)寡核苷酸序列。本文所用的术语“寡核苷酸”定义为包含两个或多个、通常超过三(3)个、一般超过十(10)个直到一百(100)个或更多个(虽然最好在二十个到三十个之间)脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。确切大小取决于许多因素，而这些因素又依赖于所述寡核苷酸的最终功能或应用。因此，在本发明的具体实施方案中，在考虑所选核苷酸序列的基础上制备合适长度的核酸探针，所述所选核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5或SEQ ID NO：7所示的序列。所述核酸探针与编码pancortin多肽的多核苷酸特异性杂交的能力使它们能够具体地用于多个实施方案中。最重要的是，所述探针可以用于多种试验，以检测给定样品中存在互补序列。
在某些实施方案中，使用寡核苷酸引物是有利的。可以通过任何方法产生这些引物，包括化学合成、DNA复制、逆转录或它们的组合。使用本发明的多核苷酸设计所述引物的序列，以采用聚合酶链式反应(PCR)技术，从哺乳动物细胞检测、扩增或突变编码pancortin多肽的基因或多核苷酸的特定区段。
在某些实施方案中，为检测杂交体形成，本发明多核苷酸和合适标记结合使用是有利的。本领域已知各种各样的合适标记，包括能够给出可检测信号的放射性配体、酶配体或其它配体，例如抗生物素/生物素。
与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7包含的核苷酸序列或其片段相同或足够相同的多核苷酸可以用作cDNA和基因组DNA的杂交探针，或用作核酸扩增(PCR)反应的引物，以分离编码本发明多肽的全长cDNA和基因组克隆，以及分离与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或其片段有高度序列相似性的其它基因(包括编码来自人以外物种的同源物和直向同源物的基因)的cDNA和基因组克隆。通常，这些核苷酸序列与参比多核苷酸序列的核苷酸序列有至少约70％相同到至少约95％相同。所述探针或引物一般包含至少15个核苷酸，优选包含至少30个核苷酸，并且可以包含至少50个核苷酸。尤其优选的探针具有30-50个核苷酸。
有几种用于获得全长cDNA或延伸短cDNA的方法是本领域技术人员可以利用的并且是众所周知的，例如那些基于cDNA末端快速扩增法(RACE)的方法(参见Frohman等，1988)。例如，以MarathonTM技术(Clontech Laboratories Inc.)为例的技术最新进展已经显著简化对更长cDNA的搜索。在MarathonTM技术中，从由所选组织提取的mRNA制备cDNA，并在每一端连接一个“接头”序列。然后使用基因特异性寡核苷酸引物和接头特异性寡核苷酸引物的组合，进行核酸扩增(PCR)，来扩增“丢失”的cDNA 5′端。然后使用“嵌套”引物重复所述PCR反应，“嵌套”引物，也就是说，设计用于在扩增产物内退火的引物(通常接头特异性引物的3′端在接头序列内退火，而基因特异性引物的5′端在已知基因序列内退火)。然后通过DNA测序和构建的全长cDNA分析该反应的产物，所述全长cDNA如下构建：或者通过将所述产物直接连接到现有的cDNA上，产生完整序列，或者使用新序列信息设计5′引物，进行单独的全长PCR。
为提供符合本发明的某些优势，用于杂交研究或试验的优选核酸序列包括与编码pancortin多肽的多核苷酸的至少10-70个或更长的核苷酸序列段互补的探针分子，pancortin多肽例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的多肽。长度大小为至少10个核苷酸有助于保证所述片段具有形成既稳定又有选择性的双链体分子的足够长度。然而，为增加杂交体的稳定性和选择性，一般优选在长度大于10个碱基的序列段内有互补序列的分子，由此改善获得的特异性杂交分子的质量和程度。当需要时，技术人员一般优先设计具有25-40个核苷酸、55-70个核苷酸或甚至更长的基因互补序列段的核酸分子。可以容易地如下制备所述片段：例如，用化学方法直接合成所述片段，通过应用核酸复制技术例如PCR技术(美国专利第4,683,202号，通过引用全部结合到本文中)合成所述片段，或者通过从包含合适插入片段和合适限制酶位点的重组质粒切下所选DNA片段。
另一方面，本发明考虑分离纯化的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的至少10个连续碱基的序列段相同或互补的碱基序列，其中所述多核苷酸与编码pancortin多肽的多核苷酸杂交。所述分离纯化的多核苷酸最好包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7的至少25-70个连续碱基的序列段相同或互补的碱基序列。例如，本发明的多核苷酸可以包含与所公开的核苷酸序列的40个或55个连续碱基相同或互补的碱基序列段。
因此，由于本发明的多核苷酸探针分子与所述基因的互补序列段选择性形成双链体分子的能力，可以使用所述多核苷酸探针分子。根据所考虑的应用，技术人员将希望使用不同杂交条件，以获得所述探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高度选择性的应用，技术人员通常希望使用相对严格的条件来形成杂交体(参见表1)。
当然，对于某些应用，例如当技术人员希望使用与潜在模板杂交的突变体引物链制备突变体时，或者当技术人员寻求从其它细胞分离pancortin多肽编码序列、功能等同物等等时，一般需要允许形成异源双链体的较不严格的杂交条件。因此，根据与对照杂交相比的阳性杂交信号，可以容易地鉴定出交叉杂交的种类。无论如何，一般认为增加甲酰胺加入量可以使条件更严格，增加甲酰胺加入量与提高温度的作用方式相同，破坏杂种双链体的稳定性。因此，可以容易地操作杂交条件，由此这也一般成为根据所希望的结果而可选的方法。
本发明也包括能够在降低的严格性条件下、更优选严格性条件下、最优选高严格性条件下与本文描述的多核苷酸杂交的多核苷酸。严格性条件的实例示于下表1中：高严格性条件是那些至少与例如条件A-F一样严格的条件；严格性条件是至少与例如条件G-L一样严格的条件；降低的严格性条件是至少与例如条件M-R一样严格的条件。
                                   表1
                               严格性条件
 严格性条件   多核苷酸杂交体 杂交体长度(bp)1 杂交温度和缓冲液H 洗涤温度和缓冲液H
  A   DNA:DNA ＞50 65℃；1xSSC或42℃；1xSSC，50％甲酰胺 65℃；0.3xSSC
  B   DNA:DNA ＜50 TB；1xSSC TB；1xSSC
  C   DNA:RNA ＞50 67℃；1xSSC或45℃；1xSSC，50％甲酰胺 67℃；0.3xSSC
  D   DNA:RNA ＜50 TD；1xSSC TD；1xSSC
  E   RNA:RNA ＞50 70℃；1xSSC或50℃；1xSSC，50％甲酰胺 70℃；0.3xSSC
  F   RNA:RNA ＜50 TF；1xSSC TF；1xSSC
  G   DNA:DNA ＞50 65℃；4xSSC或42℃；4xSSC，50％甲酰胺 65℃；1xSSC
  H   DNA:DNA ＜50 TH；4xSSC TH；4xSSC
  I   DNA:RNA ＞50 67℃；4xSSC或45℃；4xSSC，50％甲酰胺 67℃；1xSSC
  J   DNA:RNA ＜50 TJ；4xSSC TJ；4xSSC
  K   RNA:RNA ＞50 70℃；4xSSC或50℃；4xSSC，50％甲酰胺 67℃；1xSSC
 L   RNA:RNA ＜50 TL；2xSSC TL；2xSSC
 M   DNA:DNA ＞50 50℃；4xSSC或40℃；6xSSC，50％甲酰胺 50℃；2xSSC
 N   DNA:DNA ＜50 TN；6xSSC TN；6xSSC
 O   DNA:RNA ＞50 55℃；4xSSC或42℃；6xSSC，50％甲酰胺 55℃；2xSSC
 P   DNA:RNA ＜50 TP；6xSSC TP；6xSSC
 Q   RNA:RNA ＞50 60℃；4xSSC或45℃；6xSSC，50％甲酰胺 60℃；2xSSC
 R   RNA:RNA ＜50  TR；4xSSC TR；4xSSC
(bp)1：杂交体长度预期是杂交多核苷酸的杂交区。当多核苷酸与未知序列的靶多核苷酸杂交时，杂交体长度假定是所述杂交多核苷酸的长度。当已知序列的多核苷酸被杂交时，则可以通过将所述多核苷酸的所述序列进行序列比对并且鉴定出一个或多个最适序列互补性的区域，来确定杂交体长度。
缓冲液H：在杂交缓冲液和洗涤缓冲液中，SSPE(1xSSPE为0.15M NaCl、10mMNaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)可以替代为SSC(1xSSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成之后，将洗涤进行15分钟。
TB-TR：预期长度少于50个碱基对的杂交体的杂交温度应该是低于杂交体解链温度(Tm)5-10℃，其中Tm按照下列等式来确定。对于长度少于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基数)+4(G+C碱基数)。对于长度在18-49个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N为杂交体中的碱基数，而[Na+]为杂交缓冲液中钠离子的浓度(对于1xSSC，[Na+]＝0.165M)。
对于多核苷酸杂交，严格性条件的其它实例在以下文献中提供：Sambrook等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第9章和第11章，和Ausubel等编著，1995，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，第2.10节和第6.3-6.4节，所述文献通过引用结合到本文中。
除上文所述编码pancortin多肽的核酸分子外，本发明的另一方面涉及与其反义的分离的核酸分子。“反义”核酸包含与编码蛋白的“有义”核酸互补的核苷酸序列，如与双链cDNA分子的编码链互补的核苷酸序列或者与mRNA序列互补的核苷酸序列。因此，反义核酸可以与有义核酸通过氢键结合。反义核酸可以与完整的pancortin编码链互补，或者仅与其片段互补。在一个实施方案中，反义核酸分子与编码pancortin多肽的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。
术语“编码区”是指包含翻译成为氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区，如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7的完整编码区。在另一个实施方案中，所述反义核酸分子与编码pancortin多肽的核苷酸序列的编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”是指在编码区侧翼、不翻译成为氨基酸的5′和3′序列(即也称为5′和3′非翻译区)。
对于编码本文公开的pancortin多肽的编码链序列(例如SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7)，可以根据沃森-克里克碱基配对法则，设计本发明的反义核酸。所述反义核酸分子可以与pancortin mRNA的完整编码区互补，但更优选是仅与pancortin mRNA的编码区片段或非编码区片段反义的寡核苷酸。例如，所述反义寡核苷酸可以与pancortin mRNA翻译起始位点周围的区互补。
反义寡核苷酸可以长约例如5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个核苷酸。可以使用本领域已知的方法，采用化学合成和酶促连接反应，构建本发明的反义核酸。例如，使用设计用以增加分子的生物稳定性或增加在反义核酸和有义核酸之间形成的双链体的物理稳定性的天然存在的核苷酸或各种经修饰的核苷酸，可以化学合成反义核酸(例如反义寡核苷酸)，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用来产生所述反义核酸的修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(beta-galactosylqueosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5′-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲酯、尿嘧啶-5-乙醇酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。另外，也考虑将主链修饰例如肽核酸(PNA)用于本发明(参见美国专利第6,201,103号)。
另一方面，可以用以反义方向(即从插入核酸转录的RNA对于目标靶核酸而言必定为反义方向，在下面的小节中有进一步的描述)，将核酸亚克隆到表达载体中，用所述表达载体通过生物学方法产生反义核酸。
通常将本发明的反义核酸分子给予受治疗者，或者使其在受治疗者体内原位产生，以便它们与编码pancortin多肽的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，因此例如通过抑制转录和/或翻译而抑制所述多肽的表达。所述杂交可以通过常规核苷酸互补性形成稳定的双链体，或者例如在结合DNA双链体的反义核酸分子的情况下，通过双螺旋大沟内的特异性相互作用。本发明反义核酸分子给予途径的实例包括在组织部位进行直接注射。或者，可以修饰反义核酸分子使其靶向所选细胞，然后系统给予。例如，对于系统给药，可以修饰反义分子，使其特异性结合在所选细胞表面表达的受体或抗原上，例如通过将所述反义核酸分子连接到结合细胞表面受体或抗原的肽或抗体。然后可以使用本文所述载体，将所述反义核酸分子传递到细胞。
在又一个实施方案中，本发明的反义核酸分子是α-端基异构核酸分子。α-端基异构核酸分子与互补RNA形成特殊的双链杂交体，其中与通常的γ-单位相反，所述链相互平行(Gaultier等(1987))。所述反义核酸分子也可以包含一个2′-邻甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987(a))或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，1987(b))。
在再一个实施方案中，本发明的反义核酸是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与它们有互补区的单链核酸例如mRNA。因此，可以使用核酶(例如锤头型核酶(在Haselhoff和Gerlach，1988中描述))催化性切割pancortin mRNA转录物，由此抑制pancortin mRNA的翻译。可以根据本文公开的pancortin cDNA的核苷酸序列(即SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQID NO：7)，设计对pancortin编码核酸有特异性的核酶。例如，可以构建四膜虫属(Tetrahymena)L-19 IVS RNA的衍生物，其中活性位点的核苷酸序列与pancortin编码mRNA中要切割的核苷酸序列互补。参见例如Cech等的美国专利第4,987,071号和Cech等的美国专利第5,116,742号，这两个专利文献均通过引用全部结合到本文中。或者，可以使用pancortin mRNA，从RNA分子库选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA。参见例如Bartel和Szostak，1993。
另一方面，可以通过对与pancortin基因调节区(例如pancortin基因启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列打靶而形成三螺旋结构，阻止pancortin基因在靶细胞中的转录，从而抑制pancortin基因表达。一般参见Helene，1991；Helene等，1992；和Maher，1992。
也可以采用RNA干涉(RNAi)来抑制pancortin基因表达。这是一项针对转录后基因沉默(PTGS)的技术，其中靶基因活性被关连双链RNA(dsRNA)特异性消除。RNAi在许多方面类似于植物中的PTGS并且已在许多无脊椎动物中检测到，所述无脊椎动物包括锥虫、水螅、涡虫、线虫和果蝇(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))。它可以参与调节转座元件固定化和抗病毒状态形成。哺乳动物系统中的RNAi公开于国际申请号WO 00/63364，所述申请通过引用全部结合到本文中。基本上，将与靶(pancortin)同源的至少600个核苷酸大小的dsRNA导入细胞中，然后观察基因活性的序列特异性降低。
B.pancortin多肽和Pablo多肽
在具体实施方案中，本发明提供分离纯化的pancortin和/或pancortin-Pablo多肽及其片段。本发明的pancortin和/或pancortin-Pablo多肽最好是重组多肽。在某些实施方案中，pancortin和/或pancortin-Pablo在非人类细胞中通过重组表达产生。在某些实施方案中，本发明的pancortin多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段。在其它实施方案中，本发明还提供包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列、其变异体或其片段的Pablo多肽。
依照本发明的pancortin多肽包括含以下氨基酸序列的多肽：1)SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列；2)人pancortin多肽的功能性和非功能性天然存在的等位基因变异体；3)重组产生的人pancortin多肽的变异体；和4)从除人类以外的生物分离的pancortin多肽(人pancortin多肽的直向同源物)。
依照本发明的人pancortin多肽的等位基因变异体包括1)从人类细胞或组织分离的多肽；2)与编码人pancortin多肽的遗传位点相同的遗传位点编码的多肽；和3)包含与人pancortin基本同源的多肽。
人pancortin的等位基因变异体包括功能性和非功能性pancortin多肽。功能性等位基因变异体是保持在细胞内结合pancortin配体(例如Pablo)以及转导信号(例如调节细胞凋亡)能力的人pancortin多肽的天然存在的氨基酸序列变异体。功能性等位基因变异体通常仅包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的一个或多个氨基酸的保守取代，或者所述多肽非关键区内非关键残基的取代、缺失或插入。
非功能性等位基因变异体是没有在细胞内结合配体和/或转导信号能力的人pancortin多肽的天然存在的氨基酸序列变异体。非功能性等位基因变异体通常包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列非保守取代、缺失或插入，或者所述序列的成熟前截短，或者在关键残基或关键区的取代、缺失或插入。
本发明还提供人pancortin多肽的非人类直向同源物。人pancortin多肽的直向同源物是从非人类生物中分离并具有与人pancortin多肽相同的配体结合和信号传递能力的多肽。可以容易地鉴定如下多肽为人pancortin多肽的直向同源物：所述多肽包含与SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8基本同源的氨基酸序列。
可以在本发明多肽的结构中进行修饰和改变，而仍获得具有pancortin样特征的分子。例如，可以用其它氨基酸取代序列中的某些氨基酸，而不明显损失蛋白活性。因为多肽的相互作用能力和本质决定了该多肽的生物学功能活性，所以可以在多肽序列中(当然，或者在其可能的DNA编码序列中)进行某些氨基酸序列取代，而仍然获得有相似性质的多肽。
当进行所述改变时，可以考虑氨基酸的亲水指数。氨基酸亲水指数对于赋予多肽交互生物学功能的重要性是本领域众所周知的(Kyte & Doolittle，1982)。已知某些氨基酸可以被其它具有相似亲水指数或分值的氨基酸取代，而仍然产生有相似生物活性的多肽。在疏水性和电荷特征的基础上，为每种氨基酸都指定亲水指数。这些指数是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
相信氨基酸残基的相对亲水特征决定所得多肽的二级结构和三级结构，而多肽的二级结构和三级结构又决定所述多肽与其它分子(例如酶、底物、受体、抗体、抗原等)的相互作用。本领域已知一种氨基酸可以被另一种具有相似亲水指数的氨基酸取代，而仍获得在功能上等同的多肽。在这样的改变中，优选亲水指数在+/-2以内的氨基酸的取代，尤其优选亲水指数在+/-1以内的氨基酸的取代，甚至更优选亲水指数在+/-0.5以内的氨基酸的取代。
也可以在亲水性的基础上进行相似氨基酸的取代，尤其是在由此产生的生物学功能等同多肽或肽用于免疫学实施方案的情况下进行相似氨基酸的取代。美国专利第4,554,101号陈述：由相邻氨基酸的亲水性决定的多肽的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与所述多肽的生物学性质相关，该专利文献通过引用全部结合到本文中。
如在美国专利第4,554,101号中详细叙述的，为氨基酸残基指定以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；脯氨酸(-0.5±1)；苏氨酸(-0.4)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。已知一种氨基酸可以被另一种具有相似亲水性值的氨基酸取代而仍然获得在生物学上等同、尤其是在免疫学上等同的多肽。在这样的改变中，优选亲水性值在±2以内的氨基酸的取代，尤其优选亲水性值在±1以内的氨基酸的取代，甚至更优选亲水性值在±0.5以内的氨基酸的取代。
因此，如上文所概述的，氨基酸取代一般基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑上述各种特征的示例性取代是本领域技术人员熟知的，包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸(参见表2)。因此，本发明考虑如上所述的人pancortin多肽的功能等同物或生物学等同物。
     表2原始残基   示例性取代的残基
Ala       Gly；Ser
Arg       Lys
Asn       Gln；His
Asp       Glu
Cys       Ser
Gln       Asn
Glu       Asp
Gly       Ala
His       Asn；Gln
Ile       Leu；Val
Leu       Ile；Val
Lys       Arg
Met       Leu；Tyr
Ser       Thr
Thr       Ser
Trp       Tyr
Tyr       Trp；Phe
Val       Ile；Leu
也可以使用定点诱变制备多肽的生物学等同物或功能等同物。定点诱变是通过对可能DNA的特异性诱变，从该多肽序列制备第二代多肽或生物学功能等同的多肽或肽的技术。如上所述，当需要进行氨基酸取代时，可能希望有所述改变。该技术进一步提供容易地制备和测试序列变异体的能力，例如通过在DNA中引入一个或多个核苷酸序列改变而加入一种或多种上文考虑的改变。定点诱变允许通过使用编码所需突变DNA序列的特异性寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸而产生突变体，提供具有足够大小和序列复杂性以在所跨越的缺失连接两端形成稳定双链体的引物序列。通常，优选长度约17-25个核苷酸的引物，在需要改变的序列的连接两侧各有约5-10个残基。
一般而言，定点诱变技术是本领域众所周知的。正如技术人员将会认识到的，该技术一般使用以单链形式和双链形式都可以存在的噬菌体载体。通常，如下进行依照本文的定点诱变：首先获得单链载体，所述单链载体在其序列内包括编码所有或部分所选的pancortin多肽序列的DNA序列。制备(例如合成)带有所需突变序列的寡核苷酸引物。然后使该引物退火到所述单链载体，使用酶如大肠杆菌(E.coli)聚合酶I克列诺(Klenow)片段延伸，以完成携带突变的链的合成。因此，形成异源双链体，其中一条链编码原始的无突变序列，而第二条链带有所需突变。然后用该异源双链体载体转化合适的细胞，例如大肠杆菌细胞，然后选择包括携带所述突变的重组载体的克隆。市售的试剂盒提供除寡核苷酸引物以外的所有所需试剂。
pancortin多肽是参与细胞内凋亡信号途径的pancortin。本文所用的凋亡信号途径是指当配体与pancortin或Pablo(pancortin多肽或Pablo多肽)结合时，调节(例如刺激或抑制)细胞功能/活性。所述功能的实例包括动员参与信号转导途径的细胞内分子，如磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)、肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)或腺苷酸环化酶；极化质膜；产生或分泌分子；改变细胞组分的结构；细胞增殖，如合成DNA；细胞迁移；细胞分化；和细胞存活。由于所鉴定的pancortin多肽基本上在脑中表达，因此，本发明也考虑了参与pancortin信号途径的细胞的实例，所述细胞的实例包括神经细胞，例如周围神经系统细胞和中枢神经系统细胞，例如脑细胞，例如边缘系统细胞、下丘脑细胞、海马细胞、黑质细胞、皮质细胞、脑干细胞、新皮质细胞、基底神经节细胞、尾状核细胞、嗅结节细胞和上丘细胞。
细胞凋亡是整个生命活动中用于去除过多、受损伤或受感染细胞的主要程序性细胞死亡形式。其在正常细胞发育中是重要的，细胞凋亡程序控制的丧失将会引起许多疾病，包括由于细胞凋亡不足而蓄积不需要的细胞(例如癌症)以及由于过度细胞凋亡而引起的细胞损失(例如神经变性)。处于凋亡中的细胞表现出特征性的形态学特征。这些包括膜泡化、细胞核和细胞质凝聚，接着细胞碎裂成膜结合凋亡小体，该凋亡小体被巨噬细胞快速吞噬，而不渗漏出细胞内容物。在细胞凋亡中观察到由于核酸酶激活所引起的基因组DNA断裂成寡核小体片段，这是被广泛接受的细胞凋亡性死亡的生化标志。无论是否开始损害且结果是产生的上游死亡信号，细胞凋亡的处决期正常涉及胱冬蛋白酶的活化。胱冬蛋白酶是秀丽新小杆线虫(C.elegans)基因产物Ced-3的哺乳动物同源物。已经鉴定出哺乳动物胱冬蛋白酶家族的14个成员，它们在各种各样的组织和细胞类型中广泛表达。已经表明，胱冬蛋白酶活化影响慢性神经变性性疾病(例如早老性痴呆(Alzheimer′s disease)和亨廷顿舞蹈病(Huntington′s disease))中局部缺血脑、局部缺血心脏的细胞死亡和神经元损失。
内质网(ER)在折叠、修饰和分选新合成的蛋白质、维持细胞内Ca2+内稳态以及合成脂质和甾醇中起关键性的作用。当这些过程被扰乱时，至少三种主要的ER应激诱导的信号途径可以被激活：1)解折叠蛋白效应(UPR)途径，2)ER过载效反(EOR)途径，该途径导致NF-κB活化，因此产生细胞因子，和3)真核翻译起始因子(elF-2a)的磷酸化，导致翻译起始被抑制，因而阻断蛋白质合成。
ER介导的Ca2+内稳态的改变足以诱导细胞凋亡。例如，毒胡萝卜素(ER Ca-ATP酶的抑制剂)可以诱导神经元细胞凋亡，而抑制从ER释放Ca2+的药物(例如丹曲林)可以保护神经元抵抗凋亡。尽管扰乱ERCa2+内稳态进而诱导神经元细胞凋亡的药物的功效证明该细胞器的正常起作用是神经元存活所必需的，但是其它发现表明，在ER水平上发生的调节事件可能控制细胞死亡过程。Bcl-xL是抗凋亡蛋白，可以防止实验性发育细胞死亡和神经变性性疾病模型中的神经元细胞凋亡。该蛋白与ER和线粒体膜结合，从而稳定Ca2+内稳态并抑制氧化性应激。另外，破坏ER功能的药物(例如衣霉素或布雷菲德菌素A)引起线粒体功能障碍和胱冬蛋白酶活化。
ER应激或其它凋亡刺激也可以激活ER表面的胱冬蛋白酶，从而诱导细胞凋亡。鼠胱冬蛋白酶12在小鼠组织中广泛表达，并且主要居留在ER外膜上。胱冬蛋白酶12被诱导ER应激的化学物质(例如毒胡萝卜素、A23187、布雷菲德菌素A或衣霉素)所激活，但不被靶向线粒体的损害所激活。定位于ER外表面的Bcl-xL-BAP31-原胱冬蛋白酶8复合物是细胞凋亡信号的另一个推定的靶，对这些传感蛋白的调节可能是Pablo-pancortin相互作用的结果。
本发明的pancortin多肽应理解为包含与pancortin多肽有基本序列相似性、结构相似性和/或功能相似性的任何pancortin多肽，所述pancortin多肽选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQID NO：8的氨基酸序列。另外，本发明的pancortin多肽并不限制具体的来源。因此，本发明提供对来自各种各样来源的pancortin多肽种属的一般性检测和分离。如果存在种间差异，则对这些差异的鉴定是在技术人员专业知识范围内。因此，本发明考虑了来自任何哺乳动物的pancortin多肽，其中优选的哺乳动物是人。
本发明考虑了pancortin可以被有利地切割成可供用于进一步结构或功能分析或用于产生诸如pancortin相关多肽和pancortin特异性抗体等试剂的片段。通过用内多肽酶glu-C(Boehringer，Indianapolis，IN)等肽酶处理纯化或未纯化的pancortin，可以完成这一步。用CNBr处理是另一种方法，通过该方法可以从天然pancortin产生pancortin片段。重组技术也可以用来产生特异性pancortin片段。
另外，也考虑了可以确定与pancortin立体相似的化合物，以模拟所述肽结构的关键部分，所述化合物被称为肽模似物(peptidomimetics)。模拟物是模拟多肽二级结构元件的含肽分子。参见例如Johnson等(1993)。肽模拟物应用的基本原理是多肽的肽骨架主要以使得有利于分子相互作用(例如受体和配体的相互作用)的方式定位氨基酸侧链。
因此，肽模拟物概念的成功应用主要集中在多肽内的β-转角的模似物。同样，可以通过如上所述的基于计算机的算法，预测pancortin内的β-转角结构。正如Johnson等(1993)所讨论的，一旦测定出该转角的氨基酸组分，则可以构建模拟物，以达到对氨基酸侧链的必需元件的相似空间定向。
“融合多肽”是指由两个通常无关的融合基因或其片段编码的多肽。例如，包含免疫球蛋白分子的恒定区各部分和其它人多肽或其部分的融合多肽已有描述。在许多情况下，用免疫球蛋白Fc区作为融合多肽组成部分有利地用于治疗和诊断中，产生例如改进的药代动力学特性。另一方面，对于某些应用，最好能够在表达、检测和纯化融合多肽后使Fc部分缺失。
C.pancortin抗体和pancortin-Pablo抗体
在另一个实施方案中，本发明提供与pancortin多肽发生免疫反应的抗体。在其它实施方案中，本发明提供与pancortin-Pablo二聚体发生免疫反应的抗体。本发明的抗体最好是单克隆抗体。另外，pancortin多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQID NO：8的氨基酸残基序列，而Pablo多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸残基序列。抗体的制备和表征方法是本领域众所周知的(参见例如Antibodies“A Laboratory Manual，E.Howell和D.Lane，Cold SpringHarbor Laboratory，1988)。在又一些实施方案中，本发明提供与pancortin多核苷酸发生免疫反应的抗体。
简而言之，通过用包含本发明多肽或多核苷酸的免疫原免疫动物，然后获取该免疫动物的抗血清，来制备多克隆抗体。各种动物都可以用来生产抗血清。通常，用于生产抗-抗血清的动物是兔子、小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。因为兔子的血量相对较大，因此，对于生产多克隆抗体，优先选择兔子。
正如本领域众所周知的，给定多肽或多核苷酸可能在其免疫原性方面有所不同。因此，通常需要在本发明的免疫原(例如多肽或多核苷酸)上偶联载体。示例性的优选载体有匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。也可以用其它白蛋白例如卵清蛋白、鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白作为载体。
将多肽或多核苷酸与载体多肽缀合的方法是本领域众所周知的，包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺和bis-biazotized benzidine。
正如本领域众所周知的，可以通过应用称为佐剂的免疫应答的非特异性刺激物，增强针对特定免疫原的免疫原性。示例性的优选佐剂包括完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于生产多克隆抗体的免疫原用量尤其随所述免疫原的性质和用于免疫的动物而变化。可以使用多种途径(皮下途径、肌内途径、皮内途径、静脉内途径和腹膜内途径)给予免疫原。免疫后在不同点采集免疫动物的血样，监测多克隆抗体的产生。当获得所需水平的免疫原性时，可以给免疫动物放血，然后分离血清并贮存。
另一方面，本发明考虑生产与pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽二聚体发生免疫反应的抗体的方法，所述方法包括下述步骤：(a)用编码pancortin或pancortin-Pablo多肽的多核苷酸转染重组宿主细胞；(b)所述宿主细胞在足以表达所述多肽的条件下进行培养；(c)回收所述多肽；(d)制备抗所述多肽的抗体。最好用SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的多核苷酸转染所述宿主细胞。甚至更优选本发明提供按照上述方法制备的抗体。
通过使用众所周知的技术，可以容易地制备本发明的单克隆抗体，所述技术例如在美国专利第4,196,265中举例说明的技术，该专利文献通过引用全部结合到本文中。通常，技术涉及首先用所选抗原(例如本发明的多肽或多核苷酸)以足以引起免疫应答的方式免疫合适的动物。啮齿动物例如小鼠和大鼠是优选的动物。然后使来自免疫动物的脾细胞与无限增殖骨髓瘤细胞融合。当所述免疫动物是小鼠时，优选的骨髓瘤细胞是鼠NS-1骨髓瘤细胞。
在选择性培养基中培养所述融合脾/骨髓瘤细胞，从亲代细胞中选择融合的脾/骨髓瘤细胞。从融合细胞与未融合亲代细胞的混合物中分离出融合细胞，例如通过在组织培养液中加入阻断从头合成核苷酸的试剂。示例性的优选试剂是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤既阻断嘌呤又阻断嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸仅阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤时，在培养基中补充次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸源。当使用重氮丝氨酸时，在培养基中补充次黄嘌呤。
所述培养产生杂交瘤群体，然后从中选择出特异性杂交瘤。通常，如下选择杂交瘤：在微量滴定板中通过单克隆稀释培养细胞，然后检测各个克隆上清液与抗原多肽的反应性。然后无限繁殖所选克隆，提供单克隆抗体。
下面提供产生本发明抗体的具体实例：给小鼠腹膜内注射约1-200μg包含本发明多肽的抗原。通过注射所述抗原以及佐剂例如完全弗氏佐剂(免疫应答的一种非特异性刺激剂，包含灭活结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis))，刺激B淋巴细胞生长。第一次注射后过一段时间(例如至少两周)，给小鼠注射第二剂与不完全弗氏佐剂混合的抗原，进行加强免疫。
第二次注射后过几周，从小鼠尾取血，通过针对放射性标记抗原的免疫沉淀滴定血清。最好重复所述加强免疫和滴定过程，直到获得合适效价。取出具有最高效价的小鼠脾，用注射器匀浆所述脾，获得脾淋巴细胞。来自免疫小鼠的脾一般含有约5×107至2×108个淋巴细胞。
通过各种众所周知的方法诱导实验动物体内称为骨髓瘤细胞的突变淋巴细胞生长，然后从所述动物获得所述细胞。骨髓瘤细胞缺乏核苷酸生物合成的补救途径。因为骨髓瘤细胞是肿瘤细胞，所以它们能够在组织培养中无限繁殖，并因此被称为是无限增殖的。已经建立来自小鼠和大鼠的各种骨髓瘤培养细胞系，例如鼠NS-1骨髓瘤细胞。
在适于促进融合的条件下，将骨髓瘤细胞与来自用本发明抗原/多肽注射的小鼠或大鼠的脾的正常抗体生产细胞混合。融合条件包括例如存在聚乙二醇。所得融合细胞是杂交瘤细胞。象骨髓瘤细胞一样，杂交瘤细胞在培养中无限生长。
通过在选择性培养基例如HAT培养基(次黄嘌呤，氨基蝶呤，胸苷)中进行培养，将杂交瘤细胞与未融合骨髓瘤细胞分离开来。未融合骨髓瘤细胞缺乏从补救途径合成核苷酸所需的酶，因为具有这些酶的细胞在氨基蝶呤、氨甲蝶呤或重氮丝氨酸存在下被杀死。未融合的淋巴细胞在组织培养物中也不能生长。因此，只有成功融合的细胞(杂交瘤细胞)才能够在选择性培养基中生长。
每种存活的杂交瘤细胞产生一种抗体。然后根据与本发明抗原/多肽发生免疫反应的特异性抗体的产生，对这些细胞进行筛选。通过有限稀释所述杂交瘤细胞，分离单细胞杂交瘤。多次连续稀释所述杂交瘤，在让所述稀释物生长后，测试上清液中单克隆抗体的存在。然后大量培养产生所述抗体的克隆，以生产合适量的本发明抗体。
通过使用本发明的单克隆抗体，可以将本发明的特定多肽和多核苷酸作为抗原进行识别，并因此鉴定它们。一旦鉴定出这些多肽和多核苷酸后，可以通过例如抗体亲和层析等技术分离和纯化它们。在抗体亲和层析中，单克隆抗体结合固体底物，暴露于包含所需抗原的溶液。通过与结合抗体的特异性免疫反应，从所述溶液分离所述抗原。然后容易地从底物中分离出所述多肽或多核苷酸并进行纯化。
此外，在下面参考文献中可以找到尤其适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例：例如，美国专利第5,223,409号；国际申请号WO 92/18619；国际申请号WO 91/17271；国际申请号WO92/20791；国际申请号WO 92/15679；国际申请号WO 93/01288；国际申请号WO 92/01047；国际申请号WO 92/09690和国际申请号WO90/02809。
另外，可以使用标准重组DNA技术制备的包含人类和非人类片段的重组抗pancortin抗体和/或抗pancortin-Pablo抗体，例如嵌合抗体和人源化单克隆抗体也在本发明的范围内。可以通过本领域已知的重组DNA技术，制备所述嵌合抗体和人源化单克隆抗体，例如使用以下文献中介绍的方法：美国专利第6,054,297号；美国专利第4,816,567号；欧洲申请号EP 184,187；欧洲申请号EP 125,023；欧洲申请号EP 171,496；欧洲申请号EP 173,494；以及国际申请号WO86/01533。
可以通过标准技术，用抗pancortin抗体或抗pancortin-Pablo抗体(例如单克隆抗体)分别分离pancortin或pancortin-Pablo多肽二聚体，所述标准技术例如亲和层析或免疫沉淀。抗pancortin抗体或抗pancortin-Pablo抗体可便于纯化来自细胞的天然pancortin或pancortin-Pablo多肽，以及纯化宿主细胞内表达的重组产生的pancortin或pancortin-Pablo多肽。此外，可以使用抗pancortin抗体或抗pancortin-Pablo抗体检测pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽二聚体(例如在细胞裂解物或细胞上清液中)，以评价pancortin或pancortin-Pablo多肽表达的丰度和模式。对pancortin或pancortin-Pablo多肽循环片段的检测可以用于鉴定研究对象体内的pancortin或pancortin-Pablo多肽更新。抗pancortin抗体或抗pancortin-Pablo抗体可以在诊断学上用于监测组织内的蛋白水平，作为临床试验程序的一部分，例如用于确定给定治疗方案的功效。通过将所述抗体偶联(即物理连接)到可检测物质上，可以便利地检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、P-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、dichlorotriazinylarnine fluorescein、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和acquorin，而合适放射性材料的实例包括125I、131I、15S或3H。
D.载体、宿主细胞和重组pancortin和Pablo多肽
在一个替代实施方案中，本发明提供包含编码pancortin多肽或pancortin-Pablo二聚体或其片段的多核苷酸的表达载体。优选本发明的表达载体包含以下多核苷酸：所述多核苷酸编码包含SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的氨基酸残基序列的多肽。更优选本发明的表达载体包含以下多核苷酸：所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1、SEQ ID：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID：7或SEQ ID NO：9的核苷酸碱基序列。甚至更优选本发明的表达载体包含有效连接增强子-启动子的多核苷酸。在某些实施方案中，本发明的表达载体包含有效连接原核启动子的多核苷酸。或者，本发明的表达载体包含有效连接增强子-启动子的多核苷酸，其中所述增强子-启动子是真核启动子，所述表达载体还包含位于羧基末端氨基酸3′以及在编码多肽的转录单位内的聚腺苷酸化信号。
原核生物中的蛋白表达最通常在大肠杆菌内进行，使用包含指导融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或诱导型启动子的载体。融合载体在其所编码的蛋白内加入多个氨基酸，常常加在重组蛋白的氨基端。所述融合载体通常有三个目的：1)增加重组蛋白的表达；2)增加所述重组蛋白的溶解度；和3)通过作为亲和纯化中的配体，有助于纯化所述重组蛋白。在融合表达载体中，通常在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白酶切割位点，使得能够在纯化所述融合蛋白后将所述重组蛋白与所述融合部分分离开来。所述酶及其关连识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。
典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson，1988)、pMAL(New England Biolabs，Beverly；MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，所述表达载体分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或A蛋白与靶重组蛋白融合。
在一个实施方案中，将pancortin或Pablo基因的编码序列克隆到pGEX表达载体中，产生编码融合蛋白的载体，所述融合蛋白从N末端到C末端包含GST-凝血酶切割位点-pancortin或-Pablo多肽。可以使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂，通过亲和层析纯化所述融合蛋白。通过用凝血酶切割所述融合蛋白，可以回收未与GST融合的重组pancortin或Pablo多肽。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等，1988)和pET IId(Studier等，1990)。从pTrc载体的靶基因表达依赖于宿主RNA聚合酶从杂种trp-lac融合启动子开始的转录。从pETIId载体的靶基因表达依赖于共表达的病毒RNA聚合酶J7 gnl介导的从T7 gnl 0-lac融合启动子开始的转录。该病毒聚合酶由宿主株BL21(DE3)或HMS I 74(DE3)从居留原噬菌体提供，所述居留原噬菌体携带在lacUV 5启动子转录控制下的T7 gnl基因。
使大肠杆菌中重组蛋白表达最大化的一个策略是在蛋白酶解所述重组蛋白的能力受损的宿主细菌中表达所述蛋白。另一个策略是改变要插入到表达载体中的核酸的核酸序列，以便每个氨基酸的各个密码子是在大肠杆菌中偏倚利用的那些密码子。可以通过标准DNA诱变技术或合成技术，进行本发明对核酸序列的所述改变。
在另一个实施方案中，pancortin或Pablo多核苷酸表达载体是酵母表达载体。在酿酒酵母(S.cerivisae)中的表达载体的实例包括pYepSec I(Baldari等，1987)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，1982)、pJRY88(Schultz等，1987)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。
或者，可以使用例如杆状病毒表达载体，在昆虫细胞内表达pancortin多核苷酸或pancortin-Pablo多核苷酸。在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白可利用的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，1983)和pVL系列(Lucklow和Summers，1989)。
在又一个实施方案中，使用哺乳动物表达载体，在哺乳动物细胞内表达本发明的多核苷酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed，1987)、pCDNA3-1(Invitrogen)和pMT2PC(Kaufman等，1987)。当在哺乳动物细胞内使用时，所述表达载体的控制功能通常由病毒调节元件提供。
例如，常用的启动子来源于多形瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于既在原核细胞又在真核细胞中使用的其它合适的表达系统，参见Sambrook等，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989的第16章和第17章，该文献通过引用全部结合到本文中。
在另一个实施方案中，所述重组哺乳动物表达载体能够指导所述核酸优先在特定细胞类型内表达(例如用组织特异性调节元件表达所述核酸)。组织特异性调节元件是本领域已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert等，1987)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton，1988)，尤其是T细胞受体启动子(Winoto和Baltimore，1989)和免疫球蛋白启动子(Banerji等，1983，Queen和Baltimore，1983)、神经元特异性启动子(例如神经丝启动子；Byrne和Ruddle，1989)、胰腺特异性启动子(Edlund等，1985)和乳腺特异性启动子(例如乳清蛋白启动子；美国专利第4,873,316号和欧洲申请第EP 264,166号)。也包括发育调节的启动子，例如鼠hox启动子(Kessel和Gruss，1990)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman，1989)。
本发明还提供包含以反义方向克隆到表达载体中的、编码pancortin或多肽的DNA分子的重组表达载体。也就是说，所述DNA分子与调节序列有效连接，其连接方式使得可以表达对于pancortin或Pablo mRNA而言是反义的RNA分子(DNA分子的转录)。可以选择与以反义方向克隆的核酸有效连接并指导所述反义RNA分子在各种各样的细胞类型中连续表达的调节序列，例如病毒启动子和/或增强子；或者可以选择指导组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达反义RNA的调节序列。所述反义表达载体可以为重组质粒、噬菌粒或减毒病毒形式，其中反义核酸在高效调节区控制之下产生，其活性可以通过将载体导入细胞类型中进行测定。
本发明的另一方面涉及其中导入了本发明重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应清楚该术语不仅指具体的研究对象-细胞，而且指这种细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在后代中发生，这样的后代实际上可能与亲代细胞并不完全相同，但仍然包括本文所用术语的范围之内。宿主细胞可以是任何原核细胞或真核细胞。例如，pancortin或Pablo多肽可以在细菌细胞例如大肠杆菌(Ecoli)、昆虫细胞、酵母细胞或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
可以通过常规转化、感染或转染技术，将载体DNA导入原核细胞或真核细胞中。本文所用的术语“转化”和“转染”是指各种各样的用于将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞中的公知技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等(″Molecular Cloning：A Laboratory Manual″，第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其它实验室手册中找到。
对于哺乳动物细胞的稳定转染，人们知道，根据所用的表达载体和转染技术，只有一小部分细胞可以将外源DNA整合到其基因组中。为了鉴定并选择这些整合子，一般将编码选择标记的基因(例如抗生素抗性基因)与目标基因一起导入宿主细胞中。优选的选择标记包括那些赋予抗药性例如抗G418、潮霉素和氨甲蝶呤的选择标记。可以将编码选择标记的核酸在与编码pancortin或Pablo多肽的载体相同的载体上导入宿主细胞中，或者可以在不同的载体上将其导入。用所导入核酸稳定转染的细胞可以通过药物选择进行鉴定(例如掺入了选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞死亡)。
本发明的宿主细胞例如培养的原核或真核宿主细胞可以用来产生(即表达)pancortin或Pablo多肽。因此，本发明还提供使用本发明宿主细胞生产pancortin或Pablo多肽的方法。在一个实施方案中，所述方法包括将本发明宿主细胞(该宿主细胞中导入了编码pancortin或Pablo多肽的重组表达载体)在合适的培养基中进行培养，直到产生pancortin或Pablo多肽。在另一个实施方案中，所述方法还包括从所述培养基或宿主细胞中分离出pancortin或Pablo多肽。
启动子是DNA分子的一个区，通常位于转录起始点(即转录起始位点)前面(上游)约100个核苷酸对以内。该区通常包含位于不同基因相对位置的几种类型DNA序列元件。本文所用的术语“启动子”包括在本领域所指的上游启动子区、启动子区或者通用真核RNA聚合酶II转录单位的启动子。
另一种类型独立存在的转录调节序列元件是增强子。增强子为特定编码区(例如基因)提供时间、位置和表达水平的特异性。增强子的主要功能是在包含结合所述增强子的一个或多个转录因子的细胞内，增加编码序列的转录水平。与启动子不同，只要启动子存在，增强子就能在与转录起始位点不同距离的地方起作用。
本文所用的短语“增强子-启动子”是指既包含增强子元件又包含启动子元件的复合单位。增强子-启动子与编码至少一种基因产物的编码序列有效连接。本文所用的词组“有效连接”是指增强子-启动子与所述编码序列的连接方式使得编码序列的转录受到所述增强子-启动子控制和调节。将增强子-启动子有效连接到编码序列的方法是本领域众所周知的。另外，正如本领域众所周知的，增强子-启动子相对于转录受到它们控制的编码序列的精确取向和位置，尤其取决于所述增强子-启动子的具体性质。因此，TATA框最小化启动子一般位于转录起始位点上游约25个到约30个碱基对，上游启动子元件一般位于转录起始位点上游约100个到约200个碱基对。与此不同，增强子可以位于起始位点下游，并且可以在离所述位点相当远的位置上。
本发明载体构建体中所用的增强子-启动子可以是任何在待转染细胞中驱动表达的增强子-启动子。通过应用具有熟知特性的增强子-启动子，可以使基因产物表达的水平和模式最优化。
表达载体的编码序列与转录终止区有效连接。RNA聚合酶通过在发生聚腺苷酸化的位点转录编码DNA序列。通常，位于聚腺苷酸化位点下游几百个碱基对的DNA序列用来终止转录。这些DNA序列在本文被称为转录终止区。这些区需要已转录信使RNA(mRNA)的有效聚腺苷酸化。转录终止区是本领域众所周知的。本发明腺病毒载体构建体中所用的优选转录终止区包含SV40的聚腺苷酸化信号或鱼精蛋白基因。
表达载体包含编码pancortin或Pablo多肽的多核苷酸。这样的多核苷酸意指包括编码足够长的pancortin或Pablo多肽的核苷酸碱基序列，以使所述区段与编码非pancortin多肽或非Pablo多肽的多核苷酸区段相区别。本发明的多核苷酸也可以编码具有变异氨基酸序列的生物功能性多肽或肽，例如具有基于例如待置换氨基酸的相对亲水性分值各项考虑所选择的变化。这些变异序列是从天然来源分离的或在本文公开的序列中用诱变方法例如定点诱变诱导的那些序列。
本发明的表达载体最好包含编码包含SEQ ID NO：、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10的氨基酸残基序列的多肽的多核苷酸。表达载体可以包括任何上述pancortin或Pablo多肽的pancortin或Pablo多肽编码区本身，或者它可以含有在所述pancortin或Pablo多肽的基本编码区中带所选改变或修饰的编码区。或者，所述载体或片段可以编码较大的多肽或者包括所述基本编码区的多肽。在任何事件中，人们都应该认识到，由于密码子丰度以及生物功能等同，本发明的该方面并不限于对应于上述多肽序列的特定DNA分子。
示例性的载体包括pCMV家族(包括pCMV6b和pCMV6c(ChironCorp.，Emeryville CA.))的哺乳动物表达载体。在某些情况下，特别是在这些不同哺乳动物表达载体的情况下，所得构建体可能需要与含有选择标记例如pSV2neo的载体共转染。通过共转染到二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系例如DG44中，表达pancortin或Pablo多肽的克隆由于DNA掺入到这样的表达载体中而可以被检出。
可以通过本领域众所周知的多种技术，将本发明的DNA分子、基因或多核苷酸掺入载体中。例如，已经证明，载体pUC18尤其有价值。同样，相关载体M13mp18和M13mp19可以用于本发明的某些实施方案中，特别是用于进行双脱氧测序。
本发明的表达载体既可用作制备大量pancortin或Pablo多肽编码DNA本身的工具，又可用作制备编码多肽和肽的工具。考虑了在通过重组方法制备本发明pancortin或Pablo多肽的情况下，人们可以应用原核或真核表达载体作为穿梭系统。然而，在原核系统中通常不能正确加工前体多肽时，特别是所述系统不能正确加工膜结合的真核多肽时，并且由于真核pancortin或Pablo多肽是用本发明公开的内容进行预测，因此人们同样可以在真核宿主中表达所述序列。然而，甚至在所述DNA区段编码真核pancortin或Pablo多肽的情况下，考虑了原核表达可能具有某些额外的应用性。因此，本发明可以与可在真核细胞和原核细胞之间穿梭的载体结合使用。这样的系统在本文中有描述，使得可以使用细菌宿主细胞以及真核宿主细胞。
在需要表达重组pancortin或Pablo多肽并且考虑了真核宿主的情况下，最好使用掺入了真核复制起点的载体，例如质粒。另外，为了在真核系统中表达，人们希望使pancortin或Pablo编码序列位于有效真核启动子例如结合中国仓鼠卵巢细胞使用的启动子附近并且处于该启动子的控制之下。为了使编码序列处于启动子的控制之下，无论该启动子是真核启动子还是原核启动子，一般都需要使所述多肽的正确翻译读框的翻译起始一侧5′端位于相对于所选启动子3′或下游约1个核苷酸至约50个核苷酸之间。此外，在预期真核表达的情况下，人们通常希望将合适的聚腺苷酸化位点掺入到包括pancortin或Pablo多肽的转录单位中。
pCMV质粒是在本发明中尤其有用的一系列哺乳动物表达载体。设计所述载体主要用于基本所有的培养细胞，在SV40转化的猿猴COS细胞系中作用尤其出色。pCMV1、pCMV2、pCMV3和pCMV5载体彼此在每种质粒多接头区内的某些独特限制性位点上有所不同。pCMV4载体与这四种质粒的不同之处是在所述多接头前的序列内包含翻译增强子。虽然功能上相似的pCMV6b和pCMV6c载体并不直接来源于pCMV1-5载体系列，但可以从Chiron Corp.(Emeryville，CA)获得pCMV6b和pCMV6c载体，所述载体相互之间相同，只是所述多接头区的取向相反。
所述pCMV质粒的通用组成如下。载体骨架是pTZ18R(Pharmacia)，包含一个用于产生单链DNA的噬菌体f1复制起点以及一个氨苄青霉素抗性基因。所述CMV区由人巨细胞病毒(Towne株)主要立即早期基因强启动子调节区的核苷酸-760到+3组成(Thomsen等，1984；Boshart等，1985)。人生长激素片段(hGH)包含代表该基因序列1533-2157的转录终止信号和聚腺苷酸化信号。该片段中有一个Alu中等重复DNA序列。最后，SV40复制起点和早期区启动子-增强子(来源于pcD-X质粒)(HindII到PstI片段)已有描述(Okayama等，1983)。该片段中启动子的取向使得转录在远离CMV/hGH表达盒的位置开始进行。
所述pCMV质粒相互之间的区别在于所述多接头区内的差异以及是否存在所述翻译增强子。开始的pCMV1质粒已经受到累积的修饰，在所述多接头区内赋予数量增加的单一限制性位点。为创建pCMV2，从而破坏pCMV1两个EcoRI位点中的一个。为创建pCMV3，通过缺失从所述SV40区开始的短区段(StuI到EcoRI)，修饰pCMV1，如此进行使得所述多接头内的PstI、SalI和BamHI位点成为单一位点。为创建pCMV4，加入对应于从CMV启动子转录的mRNA5′非翻译区的DNA合成片段。通过降低多肽合成中对起始因子的要求，所述序列作为翻译增强子起作用(Jobling等，1987；Browning等，1988)。为创建pCMV5，从pCMV1的SV40起点区缺失DNA区段(HpaI到EcoRI)，使得所述起始多接头内的所有位点成为单一位点。
已经在猿猴COS细胞、小鼠L细胞、CHO细胞和HeLa细胞中成功地表达了pCMV载体。在几个并排比较中，它们在CHO细胞中的表达水平比基于SV40的载体高5-10倍。已经使用所述pCMV载体表达LDL受体、核因子1、GSα多肽、多肽磷酸酶、小突触小泡蛋白、突触蛋白、胰岛素受体、流感血凝素、雄激素受体、固醇26-羟化酶、类固醇17-羟化酶和类固醇21-羟化酶、细胞色素P-450氧化还原酶、β-肾上腺素能受体、叶酸受体、胆固醇侧链切割酶和其它cDNA的宿主。应当注意到，可以使用这些质粒中的SV40启动子表达其它基因，例如显性选择标记。最后，在pCMU的HindIII位点和PstI位点之间的多接头内有ATG序列，可能引起假的翻译起始。如果可能，在表达质粒中应当避免该密码子。介绍胃肠外pCMV1载体和pCMV4载体的构建与使用的论文已发表(Anderson等，1989b)。
在又一个实施方案中，本发明提供用编码pancortin或Pablo多肽的多核苷酸转化、感染或转染的重组宿主细胞，以及来自这些转化或转染细胞的转基因细胞。最好用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的多核苷酸转染本发明的重组宿主细胞。用外源多核苷酸如DNA分子转化或转染细胞的方法是本领域众所周知的，包括例如以下技术：磷酸钙介导的转染或DEAE-葡聚糖介导的转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导的转染、直接显微注射和腺病毒感染(Sambrook，Fritsch和Maniatis等，1989)。
最广泛使用的方法是由磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染。虽然机制仍然不清楚，但相信转染DNA通过胞吞作用进入细胞质，然后被转运到细胞核内。根据细胞类型，在任何一个时间可以转染高达90％的培养细胞群体。因为由磷酸钙或DEAE-葡聚糖介导的转染的高效率，所以所述方法是需要外源DNA在大量细胞内瞬时表达实验的可选方法。磷酸钙介导的转染也用于建立整合多个拷贝外源DNA的细胞系，所述外源DNA通常以头尾相连的串联排列排列在宿主细胞基因组上。
在原生质体融合方法中，将来自携带大量目标质粒拷贝的细菌的原生质体直接与培养的哺乳动物细胞混合。细胞膜融合后(通常借助聚乙二醇)，将所述细菌的内容物传递到所述哺乳动物细胞质，然后将所述质粒DNA转运到细胞核内。对于通常用于瞬时表达测定的许多细胞系，原生质体融合并不如转染那样有效，但该方法可用于其中DNA胞吞作用效率低的细胞系。原生质体融合通常产生串联整合到宿主染色体中的多拷贝质粒DNA。
将短暂的高电压电脉冲施加于多种哺乳动物细胞和植物细胞导致质膜上形成纳米大小的孔。DNA或者通过这些孔，或者作为伴随所述孔关闭的膜成分重新分配的结果，被直接摄入细胞质内。电穿孔非常有效，可以用于克隆基因的瞬时表达，以及用于建立携带整合的多个拷贝目标基因的细胞系。电穿孔与磷酸钙介导的转染和原生质体融合不同，经常产生携带一个或最多几个整合的外源DNA拷贝的细胞系。
脂质体转染涉及将DNA和RNA包入脂质体内，然后使所述脂质体与细胞膜融合。DNA如何被传递到细胞的机制还不清楚，但转染效率可以高达90％。
将DNA分子直接显微注射到细胞核的好处是：DNA不暴露于细胞区室如低pH内体。因此，显微注射主要用作建立携带整合的多个拷贝目标基因的细胞系的方法。
应用腺病毒作为载体进行细胞转染是本领域众所周知的。已经报道针对各种细胞的腺病毒载体介导的细胞转染(Stratford-Perricaudet等，1992)。
转染细胞可以是原核细胞或真核细胞。本发明的宿主细胞最好是真核宿主细胞。本发明的重组宿主细胞可以是COS-1细胞。如果需要生产人多肽，培养的哺乳动物细胞或人类细胞尤其有用。
另一方面，本发明的重组宿主细胞是原核宿主细胞。本发明的重组宿主细胞最好是大肠杆菌DH5α株的细菌细胞。一般而言，原核细胞优选用于起始克隆本发明中使用的DNA序列，以及构建本发明中使用的载体。例如，大肠杆菌K12株可能尤其有用。其它可以应用的微生物菌株包括大肠杆菌B和大肠杆菌x1976(ATCC第31537号)。当然，这些实例是说明性的，而不是限制性的。
原核生物可以用于表达。可以使用上文提到的菌株，以及大肠杆菌W3110(ATCC第273325号)、芽孢杆菌(bacilli)如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)以及各种假单胞菌(Pseudomonas sp.)。
一般而言，包含来自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主一起使用。所述载体一般携带一个复制位点以及能够提供对转化细胞进行表型选择的标记序列。例如，可以使用来自大肠杆菌的质粒pBR322转化大肠杆菌(Bolivar等，1977)。pBR322包含氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，因此提供鉴定转化细胞的容易方法。所述pBR质粒或者其它微生物质粒或噬菌体也必须含有或者经修饰后含有用于表达其本身多肽的微生物能够使用的启动子。
在重组DNA构建中最常用的那些启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，1978；Itakura等，1977，Goeddel等，1979；Goeddel等，1980)以及色氨酸(TRP)启动子系统(Siebwenlist等，1980)。虽然这些是最常用的启动子，但已经发现和利用其它微生物启动子，并且已经公开关于它们核苷酸序列的细节，这使得技术人员能够将功能性启动子导入质粒载体中(Siebwenlist等，1980)。
除原核生物外，也可以使用真核微生物如酵母。真核微生物中最通常使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiase)或普通的面包酵母，虽然可以容易得到多种其它菌株。为在酵母属(Saccharomyces)中表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等，1979；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。该质粒已经包含trpI基因，该基因为不能在色氨酸存在下生长的酵母突变株提供选择标记，所述酵母突变株例如ATCC第44076号或PEP4-1(Jones，1977)。然后，通过在不存在色氨酸的情况下生长，作为酵母宿主细胞基因组特征存在的trpI损害提供检测转化的有效环境。
酵母载体中合适的启动子序列包括3-磷酸甘油酸激酶启动子(Hitzeman等，1980)或其它糖酵解酶启动子(Hess等，1968；Holland等，1978)，所述其它糖酵解酶例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。在构建合适表达质粒时，也将与这些基因结合的终止序列导入所述表达载体内需要表达的序列的下游，提供mRNA的聚腺苷酸化和终止。提供由生长条件控制转录的额外好处的其它启动子是下列酶的启动子区：醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、上文提到的甘油醛-3-磷酸脱氢酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。包含与酵母匹配的启动子、起点或复制和终止序列的任何质粒载体都是合适的。
除微生物外，也可以用来自多细胞生物的细胞的培养物作为宿主。原则上，任何所述细胞培养物都是可使用的，不论所述细胞培养物是来自脊椎动物细胞培养物还是来自无脊椎动物细胞培养物。然而，最感兴趣的是脊椎动物细胞，近年来，繁殖培养物(组织培养物)中的脊椎动物细胞已经成为常规操作。所述有用宿主细胞系的实例是AtT-20、VERO细胞和HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系以及W138细胞系、BHK细胞系、COSM6细胞系、COS-7细胞系、293细胞系和MDCK细胞系。用于所述细胞的表达载体一般(必要时)包括复制起点、位于需要表达的基因上游的启动子、以及任何需要的核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止序列。
为在哺乳动物细胞中应用，所述表达载体上的控制功能常常来自病毒材料。例如，通常使用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、劳斯肉瘤病毒(RSV)以及最频繁使用的猿猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期启动子尤其有用，因为可以容易地从所述病毒获得还包含SV40病毒复制起点的片段的这两种启动子(Fiers等，1978)。也可以使用更小或更大的SV40片段，只要其中包括从HindIII位点向病毒复制起点内BglI位点延伸的约250bp序列。此外，技术人员常常希望并且有可能利用通常与所需基因序列连接的启动子或控制序列，只要所述控制序列与所述宿主细胞系统匹配即可。
通过构建所述载体使其包括外源起点，可以提供复制起点，所述外源起点例如可以来自SV40或其它病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV、CMV)来源，或者可以由宿主细胞染色体复制机制提供。假如所述载体整合到宿主细胞染色体上，那么后一种方式常常就足够了。
在又一个实施方案中，本发明考虑制备pancortin或Pablo多肽的工艺或方法，所述工艺或方法包括用编码pancortin或Pablo多肽的多核苷酸转染细胞，产生转化的宿主细胞；然后在足以表达所述多肽的生物学条件下维持所述转化细胞。所述转化宿主细胞最好是真核细胞。或者，所述宿主细胞是原核细胞。更优选所述原核细胞是大肠杆菌DH5-α株细菌细胞。甚至更优选转染到所述转化细胞的多核苷酸包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：9的核酸序列。此外，使用上文公开的表达载体完成转染。
在所述工艺中使用的宿主细胞能够表达功能性重组pancortin或Pablo多肽。优选的宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。然而，各种细胞适用于本发明的工艺，例如酵母细胞、人类细胞系和其它本领域技术人员熟知的真核细胞系。
转染后，所述细胞在足以表达pancortin或Pablo多肽的培养条件下维持一段时间。培养条件是本领域众所周知的，包括离子组成和浓度、温度、pH等。通常，在培养基内的培养条件下维持转染细胞。各种细胞类型合适的培养基是本领域众所周知的。在一个优选的实施方案中，温度为约20℃到约50℃，更优选约30℃到约40℃，甚至更优选约37℃。
pH值优选为约6.0到约8.0，更优选约6.8到约7.8，最优选约7.4。重量摩尔渗透压浓度优选为每升约200毫摩尔(mosm/L)到约400mosm/L，更优选从约290mosm/L到约310mosm/L。转染和表达编码多肽所需的其它生物学条件是本领域众所周知的。
维持转染细胞达到足以表达pancortin或Pablo多肽的一段时间。合适的时间尤其依赖于所使用的细胞类型，并且可以容易地由技术人员确定。通常，维持时间为约2天到约14天。
从转染细胞或培养所述细胞的培养基中回收或收集重组pancortin或Pablo多肽。回收包括分离和纯化pancortin或Pablo多肽。多肽的分离和纯化技术是本领域众所周知的，包括例如沉淀、过滤、层析、电泳等程序。
E.转基因动物
在某些优选的实施方案中，本发明涉及其体细胞和生殖细胞具有本发明内源pancortin或Pablo基因的至少一个、更优选两个等位基因被功能性破坏的非人类动物。因此，本发明提供具有突变型pancortin或Pablo基因并因此缺乏pancortin或Pablo活性的活体动物。对于在野生型对照动物中产生正常量pancortin或Pablo的刺激，这些动物会产生数量显著降低的pancortin或Pablo。本发明的动物可用于例如作为评价pancortin或Pablo抑制剂的标准对照，或者作为正常人pancortin或Pablo基因的受体，由此创建用于体内筛选人pancortin或Pablo抑制剂的模型系统，以及用于鉴定用pancortin或Pablo抑制剂治疗的疾病状态。所述动物也用作研究配体对pancortin或Pablo的影响的对照。
在本发明的转基因非人类动物中，最好通过内源等位基因以及导入所述动物胚胎干细胞前体内的突变pancortin或Pablo多核苷酸或其部分之间的同源重组，来破坏pancortin或Pablo基因。然后允许所述胚胎干细胞前体发育，产生带有功能性破坏的pancortin或Pablo基因的动物。本文所用的“转基因动物”是非人类动物，优选哺乳动物，更优选啮齿动物如大鼠或小鼠，其中所述动物的一个或多个细胞包括转基因。转基因动物的其它实例包括非人类灵长类动物、绵羊、狗、母牛、山羊、鸡、两栖动物等。所述动物在pancortin或Pablo基因中可以带有一个功能性破坏的等位基因(即所述动物对于所述突变可以是杂合的)，或者更优选所述动物在pancortin或Pablo基因中带有两个功能性破坏的等位基因(即所述动物对于所述突变可以是纯合的)。
在本发明的一个实施方案中，pancortin或Pablo基因的两个等位基因的功能性破坏产生这样的动物：与非突变动物相比，所述动物的细胞中基本上不存在pancortin或Pablo基因表达产物。在另一个实施方案中，可以破坏pancortin或Pablo等位基因，以便在所述动物的细胞中产生改变的(即突变的)pancortin或Pablo基因产物。本发明优选的带有功能性破坏的pancortin或Pablo基因的非人类动物是小鼠。假设本发明纯合动物中pancortin或Pablo功能基本上完全失活，本发明杂合动物中pancortin或Pablo功能受到约50％抑制，那么用这些动物作为阳性对照，评价pancortin或Pablo抑制剂的有效性。例如，在需要测试的pancortin或Pablo抑制剂的存在下，可以给予野生型动物(即具有未突变pancortin或Pablo基因的动物)正常诱导pancortin或Pablo产生或活性的刺激，然后可以测量所述动物体内pancortin或Pablo的产生或活性。然后可以将所述野生型动物中的pancortin或Pablo反应与同样给予pancortin或Pablo刺激的本发明杂合动物和纯合动物中的pancortin或Pablo反应进行比较，确定所述试验抑制剂最大pancortin或Pablo抑制的百分率。
另外，本发明的动物用于确定具体病症是否涉及pancortin或Pablo的作用，以及是否因此能够用pancortin或Pablo抑制剂进行治疗。例如，可以尝试在具有功能性破坏的pancortin或Pablo基因的本发明动物中诱导疾病状态。然后可以确定所述动物对于所述疾病状况的易感性或抗性。根据本发明动物对疾病状况的抗性，可以鉴定能够用pancortin或Pablo抑制剂治疗的疾病状况。本发明的另一方面涉及转基因非人类动物，所述转基因非人类动物具有功能性破坏的内源pancortin或Pablo基因，但在其基因组中也携带和表达编码异源pancortin或Pablo的转基因(即来自另一物种的pancortin或Pablo)。所述动物最好是小鼠，所述异源pancortin或Pablo是人pancortin或Pablo。已经用人pancortin或Pablo重新构建的本发明的动物可以用于鉴定体内抑制人pancortin或Pablo的试剂。例如，在需要测试的试剂存在和不存在的情况下，可以给予所述动物诱导pancortin或Pablo产生和/或活性的刺激，然后测量所述动物体内的pancortin或Pablo反应。根据以下标准鉴定体内抑制人pancortin或Pablo的试剂：与所述试剂不存在时的pancortin或Pablo反应相比，在所述试剂存在时pancortin或Pablo反应降低。本文所用的“转基因”是整合到细胞(由所述细胞发育成转基因动物)基因组的外源DNA，并且所述外源DNA保留在成熟动物的基因组中，由此指导所述转基因动物体内一种或多种细胞类型或组织中所编码的基因产物表达。
本发明的又一方面涉及用于破坏宿主细胞内pancortin或Pablo基因功能的多核苷酸构建体。所述核酸构建体包含：a)非同源取代部分；b)位于所述非同源取代部分上游的第一个同源区，所述第一个同源区具有与第一个pancortin或Pablo基因序列有基本同一性的核苷酸序列；和c)位于所述非同源取代部分下游的第二个同源区，所述第二个同源区具有与第二个pancortin或Pablo基因序列有基本同一性的核苷酸序列，所述第二个pancortin或Pablo基因序列占据在天然存在的内源pancortin或Pablo基因内所述第一个pancortin或Pablo基因序列下游的位置。此外，所述第一个和第二个同源区足够长，使得当将核酸构建体导入宿主细胞时，在所述核酸分子和宿主细胞中内源pancortin或Pablo基因之间能够发生同源重组。本文所用的“同源重组动物”是非人类动物，优选哺乳动物，更优选小鼠，其中内源pancortin或Pablo基因已经通过所述内源基因与外源DNA分子之间的同源重组而被改变，所述外源DNA分子在所述动物发育之前导入动物细胞，例如动物胚胎细胞。
在一个优选的实施方案中，所述非同源取代部分包含一个阳性选择表达盒，最好包括与调节元件有效连接的新霉素磷酸转移酶基因。在另一个优选实施方案中，所述核酸构建体也包括在同源区上游或下游末端的负选择表达盒。优选的负选择表达盒包括有效连接调节元件的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。本发明的另一方面涉及其中掺入了本发明核酸构建体的重组载体。
本发明的又一方面涉及宿主细胞，其中已经在所述宿主细胞中导入了本发明核酸构建体，由此允许在所述核酸构建体与宿主细胞内源pancortin或Pablo基因之间发生同源重组，导致内源pancortin或Pablo基因的功能性破坏。所述宿主细胞可以是正常表达pancortin或Pablo的哺乳动物细胞例如人神经元，或者是多能细胞例如小鼠胚胎干细胞。所述核酸构建体已经导入其中并且与内源pancortin或Pablo基因同源重组的胚胎干细胞进一步发育，产生转基因非人类动物，所述动物的细胞源自所述胚胎干细胞，因此在其基因组中携带所述pancortin或Pablo基因破坏。可以选择在其种系中携带pancortin或Pablo基因破坏的动物，然后繁育所述动物，产生在所有体细胞和生殖细胞中都具有pancortin或Pablo基因破坏的动物。然后繁育所述小鼠，以获得pancortin或Pablo基因破坏的纯合性。
考虑在一些情况下，可以通过稳定导入本文所述的一种或多种天然、合成修饰或突变的pancortin或Pablo多核苷酸组合物，改变本发明转基因动物的基因组。本文所用的“转基因动物”指任何动物，优选非人类哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、松鼠、仓鼠、兔、豚鼠、猪、微型猪(micro-pig)、prairie、狒狒、松鼠猴和黑猩猩等)、鸟类或两栖动物，其体内的一种或多种细胞包含由于人类的干预而导入的异源核酸，所述人类干预例如本领域众所周知的转基因技术。借助精细遗传操作，例如显微注射或重组病毒感染，通过将所述核酸导入所述细胞的前体，直接或间接地将所述核酸导入所述细胞中。术语遗传操作不包括经典杂交育种或体外受精，而是指引入重组DNA分子。可以将该分子整合到染色体内，或者该分子可以是在染色体外复制的DNA。
本发明的宿主细胞也可以用来产生非人类转基因动物。所述非人类转基因动物可以用于设计用来鉴定试剂或化合物例如药物等的筛选试验中，所述药物能够缓解所选障碍的有害症状，所选障碍例如神经系统障碍，例如精神障碍或影响生物节律和睡眠-觉醒循环的障碍。例如，在一个实施方案中，本发明的宿主细胞是其中导入了pancortin或Pablo多肽-编码序列的受精卵母细胞或胚胎干细胞。这样的宿主细胞则可以用来产生其基因组中导入了外源pancortin或Pablo基因序列的非人类转基因动物，或者用来产生已改变其内源pancortin或Pablo基因序列的同源重组动物。这样的动物可用于研究pancortin或Pablo多肽的功能和/或活性，并且可用于鉴定和/或评价pancortin或Pablo多肽活性调节剂。
可以如下产生本发明的转基因动物：例如通过显微注射、逆转录病毒感染，将pancortin或Pablo多肽编码核酸导入受精卵母细胞的雄原核内，然后允许所述卵母细胞在假孕雌性代孕动物体内发育。可以将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的人pancortin或Pablo cDNA作为转基因导入非人类动物的基因组中。
此外，根据与人pancortin或Pablo cDNA(上文所述)的杂交，可以分离人pancortin或Pablo基因的非人类同源物，例如小鼠pancortin或Pablo基因，并用所述同源物作为转基因。在所述转基因中也可以包括内含子序列和聚腺苷酸化信号，以增加所述转基因表达的效率。可以将组织特异性调节序列有效连接到pancortin或Pablo转基因，指导pancortin或Pablo多肽在特定细胞内的表达。通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物(尤其是例如小鼠等动物)的方法已经成为本领域的常规方法，在例如美国专利第4,736,866号、美国专利第4,870,009号和美国专利第4,873,191号以及Hogan，1986中有描述。使用相似的方法产生其它转基因动物。根据基因组中pancortin或Pablo转基因的存在和/或pancortin或Pablo mRNA在动物组织或细胞中的表达，可以鉴定出转基因建立者动物。然后使用转基因建立者动物繁育携带所述转基因的其它动物。此外，携带编码pancortin或Pablo多肽的转基因的转基因动物可以进一步繁育成为携带其它转基因的其它转基因动物。
为了产生同源重组动物，制备包含pancortin或Pablo基因至少一个片段的载体，所述片段中已经引入缺失、添加或取代，由此改变(例如功能性破坏)pancortin或Pablo基因。pancortin或Pablo基因可以是人类基因(例如来自从用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的cDNA筛选的人类基因组文库中分离的人类基因组克隆)，但更优选是人pancortin或Pablo基因的非人类同源物。例如，可以分别用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的pancortin或PablocDNA作为探针，从小鼠基因组DNA文库中分离出小鼠pancortin或Pablo基因。然后，所述小鼠pancortin或Pablo基因可以用于构建适于改变小鼠基因组中内源pancortin或Pablo基因的同源重组载体。在一个优选的实施方案中，设计所述载体，以便当发生同源重组时，所述内源pancortin或Pablo基因被功能性破坏(即不再编码功能性蛋白；也称为“剔除(knock out)”载体)。
或者，所述载体可以设计成当发生同源重组时，所述内源pancortin或Pablo基因发生突变，或者以其它方式被改变，但仍然编码功能性蛋白(例如可以改变上游调节区，由此改变内源pancortin或Pablo多肽的表达)。在同源重组载体中，pancortin或Pablo基因被改变的片段在其5′和3′末端两侧是pancortin或Pablo基因的其它核酸，以允许所述载体携带的外源pancortin或Pablo基因与胚胎干细胞的内源pancortin或Pablo基因之间发生同源重组。其它侧翼的pancortin或Pablo核酸具有足够长度，使得能够与内源基因之间成功地进行同源重组。
所述载体内一般包括数千碱基的侧翼DNA(在5′末端和3′末端)(参见例如Thomas和Capecchi，1987，有关同源重组载体的介绍)。将所述载体导入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)中，然后选择其中导入的pancortin或Pablo基因与内源pancortin或Pablo基因之间发生同源重组的细胞(参见例如Li等，1992)。然后将所选细胞注射到动物(例如小鼠)胚泡，形成聚集嵌合体(参见例如Bradley，1987，第113-152页)。然后可以将嵌合胚胎植入合适的假孕雌性代孕动物体内，繁育所述胚胎至产期。可以使用在其生殖细胞中携带同源重组DNA的后代，通过所述转基因的种系传递，繁育其中所有细胞都包含所述同源重组DNA的动物。构建同源重组载体和同源重组动物的方法在Bradley，1991以及国际公布号WO 90/11354、WO 91/01140和WO93/04169中有进一步描述。
在另一个实施方案中，可以产生非人类转基因动物，所述转基因动物包含允许所述转基因表达受到调节的所选系统。所述系统的一个实例是噬菌体PL的cre/loxP重组酶系统。有关所述cre/loxP重组酶系统的介绍，参见例如Lakso等，1992。重组酶系统的另一个实例是酿酒酵母的FLP重组酶系统(O’Gonnan等，1991)。假如使用cre/loxP重组酶系统调节所述转基因的表达，那么需要包含编码Cre重组酶以及所选蛋白的转基因的动物。可以通过构建“双”转基因动物提供所述动物，例如通过使两种转基因动物交配，其中一种动物携带编码所选蛋白的转基因，而另一种动物携带编码重组酶的转基因。
也可以根据Wilmut等，1997和国际公布号WO 97/07668和WO97/07669中描述的方法，产生本文描述的非人类转基因动物的克隆。概括地讲，可以分离来自转基因动物的细胞如体细胞，诱导其离开生长循环，进入G0期。然后例如通过使用电脉冲，使所述休眠细胞与去核卵母细胞融合，所述去核卵母细胞来自分离所述休眠细胞的同一物种的动物。然后培养所述重新构建的卵母细胞，以便其发育成桑椹胚或胚泡，然后转移到假孕雌性代孕动物体内。该雌性代孕动物所生的后代将是从中分离所述细胞(例如体细胞)的动物的克隆。
F.本发明的应用和方法
本文描述的核酸分子、多肽、多肽同源物、调节剂、抗体、载体和宿主细胞可以用于一种或多种以下方法：a)药物筛选试验；b)诊断分析，尤其是疾病鉴定、等位基因筛选和药物遗传学试验中的诊断分析；c)治疗方法；d)药物基因组学(pharmacogenomics)；和e)监测临床试验期间的效应。本发明的多肽可以作为药物靶，开发调节pancortin-Pablo多肽二聚体活性的药物。本发明的分离的核酸分子可以用于表达pancortin或Pablo多肽(例如通过宿主细胞内或基因治疗应用中的重组表达载体)、检测pancortin或Pablo mRNA(例如在生物样品中)或pancortin或Pablo基因中的天然存在的或重组产生的遗传突变、以及调节pancortin或Pablo多肽活性，如下文进一步描述。此外，pancortin或Pablo多肽可以用于筛选调节多肽活性的药物或化合物。此外，本发明的抗pancortin抗体和抗Pablo抗体可以用于检测和分离pancortin或Pablo多肽，尤其是生物样品中存在的pancortin或Pablo多肽片段，以及用于调节pancortin或Pablo多肽活性。
药物筛选试验
本发明提供鉴定化合物或试剂的方法，所述化合物或试剂能够用于治疗特征在于(或涉及)pancortin或Pablo核酸不正常或异常表达和/或pancortin-Pablo多肽不正常或异常活性的疾病。这些方法在本文中也称为药物筛选试验，通常包括下述步骤：筛选候选/试验化合物或试剂，鉴定作为pancortin或Pablo多肽激动剂或拮抗剂的化合物，尤其是筛选与pancortin或Pablo多肽相互作用(例如结合)的能力、调节pancortin或Pablo多肽与靶分子相互作用的能力，和/或调节pancortin或Pablo核酸表达和/或pancortin或Pablo多肽活性的能力。可以使用具有一种或多种这些能力的候选/试验化合物或试剂作为药物，治疗特征是pancortin或Pablo核酸不正常或异常表达和/或pancortin或Pablo多肽不正常或异常活性的疾病。候选/试验化合物包括例如1)肽，例如可溶性肽，包括Ig尾融合肽，随机肽文库成员，以及由D-构型和/或L-构型氨基酸组成的组合化学产生的分子文库成员；2)磷酸肽(例如随机和部分简并的定向磷酸肽文库成员，参见例如Songyang等，1993)；3)抗体(例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗独特型抗体、嵌合抗体和单链抗体以及Fab、F(ab’)2、Fab表达文库片段，以及抗体的表位结合片段)；和4)有机小分子和无机小分子(例如从组合文库和天然产物文库获得的分子)。在一个实施方案中，本发明提供筛选与pancortin或Pablo多肽相互作用(例如结合)的候选/试验化合物的试验。通常，所述试验是基于重组细胞的试验或无细胞试验，包括下述步骤：例如，在允许候选/试验化合物与pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽或其片段相互作用(例如结合)而形成复合物的条件下，使表达pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽或其生物活性片段的细胞或者分离的pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽与所述候选/试验化合物混合，形成复合物，然后检测复合物的形成，其中在所述复合物中存在所述候选化合物，说明所述候选化合物与pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽或其片段相互作用(例如结合)的能力。使用竞争性结合试验，可以检测pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽和所述候选化合物之间复合物的形成，并且可以使用例如标准免疫测定定量复合物的形成。
在另一个实施方案中，本发明提供筛选试验，以鉴定调节(例如刺激或抑制)pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽和通常与pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽相互作用的分子(靶分子)之间相互作用(很有可能还调节多肽活性)的候选/试验化合物。所述靶分子的实例包括与pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽在相同信号途径中的蛋白，例如，可以在例如凋亡信号途径或在涉及pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽活性(例如Bcl-xL-Pablo-pancortin相互作用)的途径中pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽的上游(包括活性的刺激剂和抑制剂)或下游起作用的蛋白。通常，所述试验是基于重组细胞的试验，包括下述步骤：将表达pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽或其生物活性片段的细胞、pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽靶分子(例如pancortin多肽或pancortin-Pablo配体)以及候选/试验化合物例如在不同条件下混合在一起，其中仅当存在所述候选化合物时，pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽或其生物活性片段与所述靶分子相互作用(例如结合)；然后检测包括pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽和所述靶分子的复合物形成，或者检测pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽与所述靶分子之间的相互作用/反应。
对复合物形成的检测可以包括通过例如测量pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽的诱导效应来直接定量所述复合物。在候选化合物存在下(相对于在不存在候选化合物进行检测时)，pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽与靶分子之间相互作用(例如pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽与所述靶分子之间形成复合物)在统计学上的显著改变如降低，说明pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽与所述靶分子之间相互作用的调节(例如刺激或抑制)。可以使用例如免疫测定，定量pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽与所述靶分子之间复合物形成的调节。
为了进行无细胞药物筛选试验，最好将pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽或其靶分子固定化，以利于将复合物与所述一种或两种蛋白未形成复合物的形式分离，以及方便所述测定的自动化。在存在和不存在候选化合物的情况下，pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽与靶分子的相互作用(例如结合)可以在任何适于盛装所述反应物的容器内完成。所述容器的实例包括微量滴定板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供融合蛋白，所述融合蛋白中添加了允许所述蛋白结合到基质上的结构域。例如，可以将谷胱甘肽-S-转移酶/pancortin多肽或pancortin-Pablo融合蛋白吸收到谷胱甘肽琼脂糖珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)上或谷胱甘肽衍生的微量滴定板上，然后与细胞裂解物(例如用35S标记的裂解物)和所述候选化合物混合，所述混合物在有利于形成复合物的条件(例如盐和pH等生理条件)下温育。温育后，洗涤所述珠，除去任何未结合的标记，然后将基质固定化，直接测定放射性标记，或者解离所述复合物后测定上清液中的放射性标记。或者，可以从基质上解离所述复合物，通过SDS-PAGE分离，使用标准电泳技术，测定凝胶定量珠组份内的pancortin多肽或pancortin-Pablo结合蛋白水平。
在本发明的药物筛选试验中也可以使用将蛋白固定在基质上的其它技术。例如，利用生物素和链霉抗生物素的缀合，可以将pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽二聚体或其靶分子固定化。使用本领域众所周知的技术(例如生物素化试剂盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)，可以从生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽分子，然后固定在链霉抗生物素包被的96孔板(Pierce Chemical)的孔内。或者，可以将与pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽反应但并不干扰所述蛋白与其靶分子结合的抗体衍生化到所述板的孔内，然后通过抗体缀合，将pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽捕获到所述孔内。如上所述，pancortin多肽或pancortin-Pablo结合蛋白和候选化合物的制备物在所述板上pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽呈递孔内进行温育，然后可以定量在所述孔内捕获的复合物的量。除上文针对GST固定化复合物描述的那些方法外，检测所述复合物的方法包括使用抗体免疫检测复合物，所述抗体与pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽靶分子反应，或者与pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽反应而与所述靶分子竞争；所述方法还包括酶联测定，所述测定依赖于检测与靶分子结合的酶活性。
在又一个实施方案中，本发明提供鉴定能够用于治疗疾病的化合物的方法(例如筛选试验)，所述疾病的特征在于不正常或异常的pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽活性(或与所述活性有关)。该方法一般包括下述步骤：测定所述化合物或试剂调节pancortin或pancortin-Pablo核酸表达或pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽活性的能力，由此鉴定用于治疗特征在于不正常或异常的pancortin或pancortin-Pablo核酸表达或pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽活性的疾病的化合物。测定所述化合物或试剂调节pancortin或pancortin-Pablo核酸表达或pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽活性的能力的方法通常是基于细胞的试验。例如，对于通过涉及pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽的途径转导信号的配体，可以在存在和不存在候选化合物的情况下，诱导对所述配体敏感的细胞过量表达pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽。
可以鉴定产生依赖于pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽的反应(刺激或抑制)在统计学上显著改变的候选化合物。在一个实施方案中，pancortin或pancortin-Pablo核酸的表达或者pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽活性在细胞内受到调节，然后测量候选化合物对于目标读出(例如细胞凋亡)的影响。例如可以试验响应依赖于pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽的信号级联反应而受到正调节或负调节的基因表达。在优选的实施方案中，所述基因的调节区(例如5′侧翼启动子和增强子区)有效连接编码可容易检测的基因产物的检测标记(例如萤光素酶)。也可以通过例如免疫印迹法，测定pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽或pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽靶分子的磷酸化。
或者，可以利用下述方法鉴定pancortin或pancortin-Pablo表达调节剂(例如可以用于治疗特征在于不正常或异常pancortin或pancortin-Pablo核酸表达或pancortin或pancortin-Pablo多肽活性的疾病的化合物)：在所述方法中，使细胞与候选化合物接触，然后测定所述细胞中pancortin或pancortin-Pablo mRNA或蛋白的表达。将所述候选化合物存在下pancortin或pancortin-Pablo mRNA或蛋白的表达水平与不存在所述候选化合物的情况下pancortin或pancortin-PablomRNA或蛋白表达水平进行比较。然后根据该比较，可以鉴定作为pancortin或pancortin-Pablo核酸表达调节剂的候选化合物，所述候选化合物可以用于治疗特征在于不正常pancortin或pancortin-Pablo核酸表达的疾病。例如，当pancortin或pancortin-Pablo mRNA或蛋白的表达在所述候选化合物存在的情况下比所述候选化合物不存在的情况下更高(统计学上显著更高)，那么将所述候选化合物鉴定为pancortin或pancortin-Pablo核酸表达的刺激物。或者，当pancortin或pancortin-Pablo核酸表达在所述候选化合物存在的情况下比所述候选化合物不存在的情况下更低(在统计学上显著更低)，那么将所述候选化合物鉴定为pancortin或pancortin-Pablo核酸表达的抑制剂。通过本文所述用于检测pancortin或pancortin-Pablo mRNA或蛋白的方法，可以测定细胞内的pancortin或pancortin-Pablo核酸表达水平。
在本发明的某些方面，pancortin或pancortin-Pablo多肽或其部分可以在双杂交试验或三杂交试验中用作“诱饵蛋白”(参见例如美国专利第5,283,317号；美国依法登记的发明第H1，892号；Zervos等，1993；Madura等，1993；Bartel等，1993(b)；Iwabuchi等，1993；国际申请号WO 94/10300)，鉴定其它蛋白，这些蛋白与pancortin或pancortin-Pablo结合或相互作用并且涉及pancortin或pancortin-Pablo活性。所述pancortin或pancortin-Pablo结合蛋白也可能涉及pancortin或pancortin-Pablo多肽或pancortin或pancortin-Pablo靶的信号传递，例如作为凋亡介导的信号途径的下游元件。或者，所述pancortin或pancortin-Pablo结合蛋白可以是pancortin或pancortin-Pablo抑制剂。
因此，在某些实施方案中，本发明考虑测量蛋白质：蛋白质相互作用。酵母双杂交系统对于研究蛋白质：蛋白质相互作用特别有用。可以获得所述系统的不同形式，用于筛选酵母噬菌粒(Harper等，1993；Elledge等，1991)或者质粒(Bartel等，1993(b)，Bartel等，(a)；Finley和Brent，1994)cDNA文库，以克隆相互作用的蛋白并研究已知的蛋白对。最近，用于高通量筛选蛋白质：蛋白质相互作用的特异性抑制剂的双杂交方法以及一次鉴定蛋白对之间许多不同相互作用的双杂交筛选已有描述(参见美国依法登记的发明第H1，892号)。
双杂交系统的成功依赖于以下事实：可以分离许多转录因子(例如GAL4)的DNA结合结构域以及聚合酶激活结构域，然后再连接以恢复功能性(Morin等，1993)。概括地讲，该试验利用两种不同的DNA构建体。在一种构建体中，编码pancortin多肽、Pablo多肽或它们两者的基因与编码已知转录因子(例如GAL-4)DNA结合结构域的基因融合。在另一种构建体中，使来自DNA序列文库的编码未鉴定蛋白(“猎物”或“样品”)的DNA序列与编码所述已知转录因子的激活结构域的基因融合。假如所述“诱饵”蛋白和所述“猎物”蛋白能够在体内相互作用，形成依赖于pancortin、或依赖于Pablo、或依赖于pancortin-Pablo的复合物，那么所述转录因子的DNA结合结构域和激活结构域就能够相互接近。这种相互接近允许有效连接响应所述转录因子的转录调节位点的报道基因(例如LacZ)的转录。可以检测所述报道基因的表达，然后分离包含所述功能性转录因子的细胞集落，用于获得编码与pancortin或pancortin-Pablo多肽相互作用的蛋白的克隆基因。
根据这些药物筛选试验鉴定的pancortin或pancortin-Pablo多肽活性和/或pancortin或pancortin-Pablo核酸表达的调节剂可以用于治疗例如神经系统疾病。这些治疗方法包括下述步骤：例如通过如本文所述的药用组合物，给予需要所述治疗的受治疗者(例如患有本文所述疾病的受治疗者)pancortin或pancortin-Pablo多肽活性和/或核酸表达的调节剂。
诊断分析
本发明还提供检测生物样品中存在pancortin或pancortin-Pablo多肽或pancortin或pancortin-Pablo核酸分子或其片段的方法。所述方法包括使所述生物样品与能够检测pancortin或pancortin-Pablo多肽或mRNA的化合物或试剂接触，以便能够检测所述生物样品中存在pancortin或pancortin-Pablo多肽/编码核酸分子。用于检测pancortin或pancortin-Pablo mRNA的优选试剂是能够与pancortin或pancortin-Pablo mRNA杂交的已标记或可标记核酸探针。所述核酸探针可以是例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQID NO：9的全长pancortin或pancortin-Pablo cDNA或其片段，例如长至少15个、30个、50个、100个、250个或500个核苷酸并且与pancortin或pancortin-Pablo mRNA足以在严格性条件下特异性杂交的寡核苷酸。用于检测pancortin或pancortin-Pablo多肽的优选试剂是能够结合pancortin或pancortin-Pablo二聚体的已标记或可标记抗体。抗体可以是多克隆抗体，或者更优选是单克隆抗体。可以使用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。术语“已标记或可标记”当指探针或抗体时，意指包括用可检测物质偶联(即物理连接)所述探针或抗体以直接标记所述探针或抗体，以及利用与另一种直接标记的试剂的反应性，间接标记所述探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，以及用生物素末端标记DNA探针，以便能够用荧光标记的链霉抗生物素进行检测。术语“生物样品”包括从受治疗者分离的组织、细胞和生物学流体，以及受治疗者体内存在的组织、细胞和流体。也就是说，本发明的检测方法可以用于检测体外以及体内生物样品内的pancortin或pancortin-Pablo mRNA或蛋白。例如，用于检测pancortin或pancortin-Pablo mRNA的体外技术包括RNA印迹杂交和原位杂交。用于检测pancortin或pancortin-Pablo多肽的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。或者，可以通过将标记抗pancortin抗体或抗pancortin-Pablo抗体引入受治疗者体内，检测所述受治疗者体内的pancortin或pancortin-Pablo多肽。例如，可以用放射性标记物标记抗体，然后可以通过标准成像技术检测受治疗者体内所述抗体的存在和位置。尤其有用的是检测在受治疗者体内表达的pancortin或pancortin-Pablo多肽等位基因变异体的方法，以及检测样品中pancortin或pancortin-Pablo多肽片段的方法。
本发明还包括用于检测生物样品中存在pancortin或pancortin-Pablo多肽的试剂盒。例如，所述试剂盒可以包含试剂，例如能够检测生物样品中pancortin或pancortin-Pablo多肽或mRNA的已标记或可标记化合物或试剂；测定所述样品中pancortin或pancortin-Pablo多肽含量的方法；以及将所述样品中pancortin或pancortin-Pablo多肽含量与标准品进行比较的方法。所述化合物或试剂可以包装在合适的容器内。所述试剂盒还可以包括使用所述试剂盒检测pancortin或pancortin-Pablo mRNA或蛋白的说明书。
本发明的方法也可以用于检测pancortin或pancortin-Pablo基因内的天然存在的遗传突变，由此确定携带所述突变基因的受治疗者是否有患如上文所述特征在于不正常或异常pancortin或pancortin-Pablo核酸表达或pancortin或pancortin-Pablo多肽活性的疾病的风险。在优选的实施方案中，所述方法包括检测从所述受治疗者体内获得的细胞样品中是否存在以下情况：遗传突变或者pancortin或pancortin-Pablo基因的错误表达，所述遗传突变的特征在于影响编码pancortin或pancortin-Pablo多肽的基因的完整性的至少一种改变。例如，可以通过确定下面情况中至少一种的存在而检测所述遗传突变：1)缺失pancortin或pancortin-Pablo基因的一个或多个核苷酸；2)在pancortin或pancortin-Pablo基因中添加一个或多个核苷酸；3)取代pancortin或pancortin-Pablo基因的一个或多个核苷酸；4)pancortin或pancortin-Pablo基因的染色体重排；5)在pancortin或pancortin-Pablo基因的信使RNA转录物水平上的改变，6)pancortin或pancortin-Pablo基因的异常修饰，例如基因组DNA的甲基化模式，7)存在pancortin或pancortin-Pablo基因信使RNA转录物的非野生型剪接模式，8)pancortin或pancortin-Pablo蛋白的非野生型水平，9)丢失pancortin或pancortin-Pablo等位基因，和10)pancortin或pancortin-Pablo蛋白的不适当翻译后修饰。如本文所述，可以使用本领域已知的许多测定技术，检测pancortin或pancortin-Pablo基因内的突变。
在某些实施方案中，对所述突变的检测包括在聚合酶链式反应(PCR)例如锚定PCR或RACE PCR中应用探针/引物(参见例如美国专利第4,683,195号和美国专利第4,683,202号)，或者在连接链式反应(LCR)中应用探针/引物，后者尤其可以用于检测pancortin或pancortin-Pablo基因内的点突变。该方法可以包括下述步骤：从患者中收集细胞样品，从所述样品细胞中分离核酸(例如基因组核酸、mRNA或者它们两者)，然后在允许pancortin或pancortin-Pablo基因(如果存在的话)杂交和扩增的条件下，使所述核酸样品与一种或多种与pancortin或pancortin-Pablo基因特异性杂交的引物接触，随后检测扩增产物的存在与否，或者检测所述扩增产物的大小，并将其与对照样品的长度进行比较。
在一个可替代的实施方案中，可以通过限制酶切割模式的改变，鉴定来自样品细胞的pancortin或pancortin-Pablo基因中的突变。例如，分离样品和对照DNA，扩增(任选)，用一种或多种限制性内切核酸酶消化，然后通过凝胶电泳测定并比较片段长度大小。样品和对照DNA之间片段长度大小的差异说明样品DNA内的突变。此外，可以应用序列特异性核酶(参见美国专利第5,498,531号，该专利文献通过引用全部结合到本文中)，通过核酶切割位点的发生或损失，计数特异性突变的存在。
在又一个实施方案中，可以使用本领域多种已知测序反应中的任何一种直接对pancortin或pancortin-Pablo基因进行测序，并通过将样品pancortin或pancortin-Pablo基因的序列与相应野生型(对照)序列进行比较，检测突变。测序反应的实例包括那些基于由Maxim和Gilbert(1977)或Sanger(1977)开发的技术的测序反应。当进行所述诊断分析时，可以利用各种自动化测序程序，其中包括通过质谱法进行测序(参见例如国际申请号WO 94/16101；Cohen等，1996；和Griffin等，1993)。
用于检测pancortin或pancortin-Pablo基因中突变的其它方法包括以下方法：应用对抗切割试剂的保护，检测RNA/RNA或RNA/DNA双链体中的错配碱基(Myers等，1985(b)；Cotton等，1988；Saleeba等，1992)，比较突变型核酸和野生型核酸的电泳迁移率(Orita等，1989；Cotton，1993；和Hayashi，1992)，以及使用变性梯度凝胶电泳测定突变型片段或野生型片段在包含变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶中的移动(Myers等，1985(a))。用于检测点突变的其它技术的实例包括选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增和选择性引物延伸。
治疗方法
本发明的另一方面涉及用于治疗患有特征在于不正常或异常pancortin或pancortin-Pablo核酸表达和/或pancortin或pancortin-Pablo多肽活性(或与其有关)的疾病或障碍的受治疗者(例如人)的方法。这些方法包括给予所述受治疗者pancortin或pancortin-Pablo多肽/基因调节剂(激动剂或拮抗剂)以便进行治疗的步骤。术语“不正常或异常pancortin或pancortin-Pablo多肽表达”是指非野生型pancortin或pancortin-Pablo多肽的表达或pancortin或pancortin-Pablo多肽表达的非野生型水平。不正常或异常pancortin或pancortin-Pablo多肽活性是指非野生型pancortin或pancortin-Pablo多肽活性或pancortin或pancortin-Pablo多肽活性的非野生型水平。由于pancortin或pancortin-Pablo多肽涉及细胞内参与信号传递的途径，因此不正常或异常pancortin或pancortin-Pablo多肽活性或表达干扰由pancortin或pancortin-Pablo多肽信号传递介导的正常功能调节，特别是在脑细胞中。本文所用的术语“治疗”是指减轻或缓解障碍或疾病的至少一种不良影响或症状，所述障碍或疾病指例如特征在于不正常或异常pancortin或pancortin-Pablo多肽活性或pancortin或pancortin-Pablo核酸表达或与其有关的障碍或疾病。
本文所用的pancortin或pancortin-Pablo多肽/基因调节剂是能够调节pancortin或pancortin-Pablo核酸表达和/或pancortin或pancortin-Pablo多肽活性的分子。例如，pancortin或pancortin-Pablo基因或蛋白调节剂可以调节pancortin或pancortin-Pablo核酸表达，例如正调节(激活/激动)或负调节(抑制/拮抗)所述表达。在另一个实例中，pancortin或pancortin-Pablo多肽/基因调节剂可以调节(例如刺激/激动或者抑制/拮抗)pancortin或pancortin-Pablo多肽活性。如果需要通过抑制pancortin或pancortin-Pablo核酸表达以治疗特征在于不正常或异常(非野生型)pancortin或pancortin-Pablo核酸表达和/或pancortin或pancortin-Pablo多肽活性(或与其有关)的障碍或疾病，那么pancortin或pancortin-Pablo调节剂可以是如本文所述的反义分子，如核酶。可以用于抑制pancortin或pancortin-Pablo核酸表达的反义分子的实例包括与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9的5′非翻译区片段(也包括起始密码子)互补的反义分子以及与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQID NO：7、SEQ ID NO：9的3′非翻译区片段互补的反义分子。
抑制pancortin或pancortin-Pablo核酸表达的pancortin或pancortin-Pablo调节剂也可以是抑制pancortin或pancortin-Pablo核酸表达的小分子或其它药物，例如使用本文所述筛选试验鉴定的小分子或药物。假如需要通过刺激pancortin或pancortin-Pablo核酸表达而治疗特征在于不正常或异常(非野生型)pancortin或pancortin-Pablo核酸表达和/或pancortin或pancortin-Pablo多肽活性(或与其有关)的疾病或障碍，那么pancortin或pancortin-Pablo调节剂可以是例如编码pancortin或pancortin-Pablo多肽的核酸分子(例如包含与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9的核苷酸序列同源的核苷酸序列的核酸分子)，或者使用本文所述筛选试验鉴定的刺激pancortin或pancortin-Pablo核酸表达的小分子(肽)或药物。
或者，假如需要通过抑制pancortin或pancortin-Pablo多肽活性而治疗特征在于不正常或异常(非野生型)pancortin或pancortin-Pablo核酸表达和/或pancortin或pancortin-Pablo多肽活性(或与其有关)的疾病或障碍，那么pancortin或pancortin-Pablo调节剂可以是抗pancortin抗体或抗pancortin-Pablo抗体，或者抑制pancortin或pancortin-Pablo多肽活性的小分子或其它药物，例如使用本文所述筛选试验鉴定的小分子或药物。假如需要通过刺激pancortin或pancortin-Pablo多肽活性而治疗特征在于不正常或异常(非野生型)pancortin或pancortin-Pablo核酸表达和/或pancortin或pancortin-Pablo多肽活性(或与其有关)的疾病或障碍，那么pancortin或pancortin-Pablo调节剂可以是活性pancortin或pancortin-Pablo多肽或其片段(例如具有与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQID NO：10的氨基酸序列或其片段同源的氨基酸序列的pancortin或pancortin-Pablo多肽或其片段)，或者是小分子或其它药物，例如使用本文所述筛选试验鉴定的刺激pancortin或pancortin-Pablo多肽活性的小分子或药物。
本发明的其它方面涉及调节pancortin或pancortin-Pablo多肽介导的细胞活性的方法。这些方法包括下述步骤：使所述细胞与调节pancortin或pancortin-Pablo多肽活性或pancortin或pancortin-Pablo核酸表达的试剂(或包括有效量试剂的组合物)接触，以便pancortin或pancortin-Pablo多肽介导的细胞活性相对于正常水平被改变(例如cAMP或磷脂酰肌醇代谢)。本文所用的“pancortin或pancortin-Pablo多肽介导的细胞活性”是指正常或异常的细胞活性或功能。pancortin或pancortin-Pablo多肽介导的细胞活性的实例包括但不限于蛋白等分子的产生或分泌、收缩、神经元生长锥导向、轴突或树突再生或变性、增殖、迁移、分化、细胞死亡、细胞存活、各种活性氧、Ca2+、谷氨酸、酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的磷酸化，以及胱冬蛋白酶活化。在一个优选的实施方案中，所述细胞是脑神经细胞，例如海马细胞。本文所用的术语“改变的”指细胞相关活性、特别是细胞凋亡的改变，如增加或减少。
在一个实施方案中，所述试剂刺激pancortin或pancortin-Pablo多肽活性或pancortin或pancortin-Pablo核酸表达。在另一个实施方案中，所述试剂抑制pancortin或pancortin-Pablo多肽活性或pancortin或pancortin-Pablo核酸表达。这些调节方法可以在体外进行(例如将所述细胞与所述试剂一起进行培养)，或者在体内进行(例如将所述试剂给予受治疗者)。在一个优选的实施方案中，所述调节方法在体内进行，即所述细胞存在于受治疗者如哺乳动物(例如人)体内，并且所述受治疗者患有特征在于异常或不正常pancortin或pancortin-Pablo多肽活性或pancortin或pancortin-Pablo核酸表达或与其有关的障碍或疾病。
在治疗方法中使用的核酸分子、蛋白、pancortin或pancortin-Pablo调节剂、化合物等可以加入下文描述的合适药用组合物中，然后通过允许所述分子、蛋白、调节剂或化合物等发挥其预定作用的途径将其给予所述受治疗者。
pancortin多核苷酸表达调节剂和/或pancortin多肽或pancortin-Pablo多肽二聚体活性调节剂可以用于治疗各种疾病或障碍，所述疾病或障碍包括但不限于心肺系统疾病，如急性心力衰竭、低血压、高血压、心绞痛、心肌梗塞等；胃肠系统疾病；中枢神经系统疾病；肾病；肝病；过度增殖性疾病，例如癌症和牛皮癣；细胞凋亡性疾病；疼痛；子宫内膜异位；厌食；易饿病；哮喘；骨质疏松；神经精神病如精神分裂症、谵妄、双相性精神病、抑郁症、焦虑症、惊恐症；尿潴留；溃疡；变态反应；良性前列腺肥大；和运动障碍，如亨廷顿舞蹈病(Huntington′s disease)或图雷特综合征(Tourett′ssyndrome)。
药物基因组学(Pharmacogenomics)
可以将试验/候选化合物或者通过如本文描述的筛选试验鉴定的对pancortin或pancortin-Pablo多肽活性(例如pancortin或pancortin-Pablo基因表达)有刺激或抑制作用的调节剂给予个体，以治疗(预防性治疗或治疗性治疗)与不正常pancortin或pancortin-Pablo多肽活性有关的疾病(例如神经障碍)。结合这样的治疗，可以考虑所述个体的药物基因组学(即对个体基因型与该个体对外源化合物或药物的反应之间关系的研究)。治疗药物代谢的差异通过改变药理上有活性的药物的剂量和血液浓度之间的关系，可能导致严重毒性或治疗失败。因此，个体的药物基因组学允许根据所述个体的基因型，选择用于预防性或治疗性治疗的有效化合物(例如药物)。所述药物基因组学可以进一步用于确定合适的剂量和治疗方案。因此，可以确定个体内的pancortin或pancortin-Pablo多肽活性、pancortin或pancortin-Pablo核酸表达或pancortin或pancortin-Pablo基因突变程度，由此选择用于治疗性或预防性治疗所述个体的合适化合物。
药物基因组学涉及对药物反应时由于受影响病人中的药物处置和异常作用改变所致的临床显著性遗传变异。参见例如Eichelbaum，1996和Linder，1997。一般而言，可以区分两种类型的药物遗传学病症。遗传病症作为单因素遗传，改变了药物对机体的作用方式(药物作用改变)；或者遗传病症作为单因素遗传，改变了机体对药物的作用方式(药物代谢改变)。这些药物遗传学病症可以或者作为罕见缺陷发生或者作为多态性发生。例如，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(GOD)是常见的遗传性酶病，其中主要临床并发症是在摄入氧化剂药物(抗疟疾药、磺胺类药、镇痛药、硝基呋喃类药)和消耗蚕豆后的溶血作用。
作为示例性的实施方案，药物代谢酶的活性是药物作用强度和持续时间的主要决定因素。药物代谢酶(例如N-乙酰转移酶2(NAT2)和细胞色素P450酶CYP2136和CYP2C19)遗传多态性的发现，解释了为什么一些病人摄取药物的标准安全剂量后没有获得预期的药物效应，或者显示过分的药物反应和严重毒性。
这些多态性在群体中表现为两种表型，即强代谢者(extensivemetabolizer，EM)和弱代谢者(poor metabolizer，PM)。PM的流行在不同群体中是不同的。例如，编码CYP2136的基因具有高度多态性，已经在PM中鉴定出几种突变，都导致缺失功能性CYP2D6。CYP2136和CYP2C19的弱代谢者当接受标准剂量时，非常普遍地有过分药物反应和副作用的经历。
假如代谢物是活性治疗部分，那么PM显示没有治疗反应，例如可待因通过其CYP2136形成的代谢物吗啡而介导的镇痛效应证明了这一点。另一个极端是所谓极度快速代谢者，他们对标准剂量没有反应。最近，已经鉴定极度快速代谢的分子基础是由于CYP2D6基因扩增。
因此，可以确定个体内的pancortin或pancortin-Pablo多肽活性、pancortin或pancortin-Pablo核酸表达或pancortin或pancortin-Pablo基因的突变程度，由此选择用于治疗性或预防性治疗受治疗者的合适药物。此外，可以进行药物遗传学研究，通过鉴定编码药物代谢酶的多态性等位基因的基因型，从而鉴定受治疗者的药物反应性表型。当用pancortin或pancortin-Pablo调节剂治疗受治疗者时，将这方面的知识应用于剂量或药物选择，能够避免不良反应或治疗失败，并因此增强治疗或预防功效，pancortin或pancortin-Pablo调节剂例如通过本文所述其中一种示例性筛选试验鉴定的调节剂。
在临床试验期间监测疗效
监测化合物(例如药物)对pancortin或pancortin-Pablo多肽/基因表达或活性的影响不仅可以应用于基本药物筛选，而且可以应用于临床试验。例如，在对表现pancortin或pancortin-Pablo基因表达、蛋白水平降低或pancortin或pancortin-Pablo多肽活性受到负调节的受治疗者的临床试验中，可以监测通过本文所述筛选试验确定的试剂对于增加pancortin或pancortin-Pablo基因表达、蛋白水平或正调节pancortin或pancortin-Pablo活性的有效性。或者，在对表现pancortin或pancortin-Pablo基因表达、蛋白水平升高或pancortin或pancortin-Pablo多肽活性受到正调节的受治疗者的临床试验中，可以监测通过筛选试验确定的试剂对于降低pancortin或pancortin-Pablo基因表达、蛋白水平或负调节pancortin或pancortin-Pablo活性的有效性。在所述临床试验中，pancortin或pancortin-Pablo多肽以及优选其它涉及例如神经系统相关疾病的基因的表达或活性可以用作特定细胞对配体反应性的“读出”或标记。
作为非限制性的实例，可以鉴定用调节pancortin或pancortin-Pablo多肽/基因活性的化合物(例如药物或小分子，在如本文所述的筛选试验中鉴定)治疗时细胞内受到调节的基因，其中包括pancortin或pancortin-Pablo基因。因此，为了在例如临床试验中研究化合物对CNS疾病的作用，可以分离细胞，制备RNA，分析pancortin或pancortin-Pablo基因以及其它涉及所述疾病的基因的表达水平。可以如下定量基因表达的水平(即基因表达模式)：通过如本文所述的RNA印迹分析或RT-PCR，或者通过本文描述的其中一种方法测量产生的蛋白量，或者通过测量pancortin或pancortin-Pablo多肽或其它基因的活性水平。用这种方法，所述基因表达模式可以作为标记，说明所述细胞对所述化合物的生理反应。因此，可以确定治疗前和用所述化合物治疗所述个体过程中不同时间点的该反应状态。
在一个优选的实施方案中，本发明提供监测用化合物(例如用本文所述筛选试验鉴定的激动剂、拮抗剂、肽模拟物(peptidomimetic)、蛋白、肽、核酸、小分子或其它药物候选物)治疗受治疗者的有效性的方法，所述方法包括下述步骤：(i)给予所述化合物前从受治疗者获取给药前样品；(ii)检测所述给药前样品中pancortin或pancortin-Pablo多肽、mRNA或基因组DNA的表达水平；(iii)从所述受治疗者获取一个或多个给药后样品；(iv)检测所述给药后样品中的pancortin或pancortin-Pablo多肽、mRNA或基因组DNA表达水平或活性；(v)将给药前样品中pancortin或pancortin-Pablo多肽、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性与一种或多种给药后样品中pancortin或pancortin-Pablo多肽、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性进行比较；然后(vi)由此改变将所述化合物给予所述受治疗者的给药量。例如，可能希望增加所述化合物的给药量，以增加pancortin或pancortin-Pablo多肽/基因表达或活性达到比检测值更高的水平，即增加所述药物的有效性。
或者，可能希望减少所述试剂的给药量，以降低pancortin或pancortin-Pablo表达或活性到比检测值更低的水平，即降低所述化合物的有效性。
药用组合物
本发明的pancortin或pancortin-Pablo核酸分子、pancortin或pancortin-Pablo多肽(尤其是pancortin或pancortin-Pablo的片段)、pancortin或pancortin-Pablo多肽调节剂以及抗pancortin抗体或抗pancortin-Pablo抗体(在本文也称为“活性化合物”)可以加入到适于给予受治疗者(例如人)的药用组合物中。所述组合物通常包括所述核酸分子、蛋白、调节剂或抗体以及药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的载体”意指包括与给药相适应的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述介质和试剂用作药用活性物质的应用是本领域众所周知的。除了与所述活性化合物不相适应的任何常规介质或试剂外，所述介质可以用于本发明的组合物。在所述组合物中也可以加入辅助的活性化合物。
将本发明的药用组合物配制成适合它的计划给药途径。给药途径的实例包括胃肠外给药(例如静脉内给药、皮内给药、皮下给药)、经口给药(例如吸入给药)、透皮给药(局部给药)、经粘膜给药和直肠给药。对于胃肠外、皮内或皮下应用所用的溶液剂或混悬剂可以包括以下组分：无菌稀释剂例如注射用水、盐溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张力的试剂例如氯化钠或葡萄糖。pH可以用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠进行调节。可以将胃肠外制剂封装入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量管形瓶中。
适于注射用的药用组合物包括无菌水性溶液剂(就水溶性而论)或者用于临时制备无菌注射液或分散体的分散剂和无菌粉针剂。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐溶液(PBS)，在所有情况下，所述组合物应该是无菌的并且应该是易于注射的液体。所述组合物在生产和储藏条件下必须是稳定的并且必须防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及它们的合适混合物。可以例如通过利用包衣剂例如卵磷脂，就分散剂而论，通过保持所需粒度以及通过利用表面活性剂，来维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等，可以实现防止微生物的作用。在许多情况下，在所述组合物中最好是包括等渗剂例如糖类、多羟基醇例如甘露醇、山梨醇、氯化钠。通过在所述组合物中包括延迟吸收的试剂例如一硬脂酸铝和明胶，可以使所述注射用组合物的吸收延长。
通过将所述活性化合物(例如pancortin或pancortin-Pablo多肽或抗pancortin或pancortin-Pablo抗体)以所需量掺入到具有一种以上列举的组分或以上列举的组分的组合的合适溶剂中，必要时接着进行过滤除菌，可以制备无菌注射液。一般而言，通过将所述活性化合物掺入到含有基本分散介质和所需其它来自以上列举的组分的无菌溶媒中，制备分散剂。就用于制备无菌注射液的无菌粉针剂而论，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，得到所述有效成分加上它们的任何额外所需来自先前过滤除菌溶液的组分的粉针剂。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载体。可以将其装入明胶胶囊剂中或者压成片剂。为了经口治疗性给药，所述活性化合物可以与赋形剂一起掺入并且以片剂、锭剂或胶囊剂形式使用。口服组合物也可采用可用作漱口剂的液体载体来制备，其中所述液体载体中的所述化合物经口给予，漱口后吐出或者吞下。可以包括药学上相容的粘合剂和/或辅料作为所述组合物的一部分。所述片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以含有任一下述组分或相似性质的化合物：粘合剂例如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂例如淀粉或乳糖、崩解剂例如藻酸、羧甲基淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或氢化植物油；助流剂例如胶态二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或糖精；或矫味剂例如欧薄荷、水杨酸甲酯或橙皮矫味剂。
对于吸入给药，用装有合适抛射剂如二氧化碳等气体的加压容器或分配器或者喷雾器以气雾剂喷雾形式给予所述化合物。系统给药也可以是通过经粘膜或透皮方式。对于经粘膜给药或透皮给药，在所述制剂中使用适合穿过屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域公知的，并且对于经粘膜给药，包括例如去垢剂、胆盐和夫西地酸衍生物。可以通过应用鼻喷雾剂或栓剂完成经粘膜给药。对于透皮给药，将所述活性化合物配制成本领域公知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。
所述化合物也可以制备成栓剂形式(例如用常规栓剂基质例如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠给药的直肠灌肠剂。
在一个实施方案中，所述活性化合物同保护所述化合物抵抗从机体快速清除的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入片和微囊化递药系统。
可以使用生物可降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。这类制剂的制备方法对于本领域技术人员将会是显而易见的。所述材料也可以在市场上从例如Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals，Inc.获得。脂质体混悬剂(包括用针对病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。可以按照本领域技术人员已知的方法，例如在美国专利第4,522,811号中描述的方法，制备这些制剂，所述专利文献通过引用结合到本文中。
尤其有利的是配制成易于给药和剂量一致的剂量单位形式的口服或胃肠外组合物。本文所用的剂量单位形式包括适合作为待治疗患者的单元剂量的物理上分离的单位；计算每个单位含有预定量的活性化合物并结合所需的药用载体产生所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式的技术标准取决于和直接取决于所述活性化合物的独特特征以及需要达到的特定疗效和用于治疗个体的这种活性化合物的所属领域的固有限制。
可以将本发明的核酸分子插入到载体中并且将其用作基因治疗载体。可以通过例如静脉内注射、局部给药(参见美国专利5,328,470)或立体定位(stereotatic)注射(参见例如Chen等，1994)，将基因治疗载体给予患者。所述基因治疗载体的药物制剂可包括基因治疗载体的可接受的稀释剂，或者可以包括其中包埋基因传递载体的缓释基质。另一方面，在可以从重组细胞完整地产生完全基因传递载体例如逆转录病毒载体的情况下，所述药物制剂可以包括一种或多种产生所述基因传递系统的细胞。所述药用组合物可以包括在容器、包装或分配器中并且附有给药说明书。
                      实施例
使用标准技术进行下面的实施例，所述标准技术除了另有详细描述的以外，都是本领域技术人员众所周知和常规的技术。下面的实施例是为举例说明的目的提出，不应当以任何方式理解为限制本
发明的范围。
                   实施例1
              pancortin互作蛋白的鉴定
酵母双杂交试验
观察到pancortin 2和pancortin 4在酵母双杂交试验中结合Pablo。因此，在酵母双杂交试验或酵母三杂交试验中，可以用pancortin蛋白、pancortin-Pablo二聚体或其部分作为“诱饵蛋白”(参见例如美国专利第5,283,317号；和国际申请号WO 94/10300)，以鉴定其它蛋白，这些蛋白与pancortin和/或pancortin-Pablo结合或相互作用，并且涉及pancortin和/或pancortin-Pablo活性。pancortin结合蛋白也可能涉及pancortin蛋白或pancortin靶的信号传递，例如作为Pablo介导的信号途径的下游元件。或者，pancortin结合蛋白可以是pancortin抑制剂。
所述双杂交系统基于大多数由独立DNA结合结构域和激活结构域构成的转录因子的调节性质。概括地讲，该项试验利用两种不同的DNA构建体。在一种构建体中，编码pancortin蛋白的基因与编码已知转录因子(例如GAL-4)DNA结合结构域的基因融合。在另一种构建体中，使来自DNA序列文库的、编码未鉴定蛋白(“猎物”或“样品”)的DNA序列与编码已知转录因子的激活结构域的基因融合。假如所述“诱饵”蛋白和所述“猎物”蛋白能够在体内相互作用，形成依赖于pancortin的复合物，那么所述转录因子的DNA结合结构域和激活结构域就能够彼此接近。这种彼此接近允许有效连接响应所述转录因子的转录调节位点的报道基因(例如LacZ)的转录。可以检测所述报道基因的表达，然后可分离包含所述功能性转录因子的细胞集落，用于获得其编码的蛋白与pancortin蛋白相互作用的克隆基因。
                   实施例2
              pancortin基因结构
pancortin 1的cDNA序列(SEQ ID NO：1)、pancortin 2的cDNA序列(SEQ ID NO：3)、pancortin 3的cDNA序列(SEQ ID NO：5)和pancortin 4的cDNA序列(SEQ ID NO：7)分别在Golden Path(Kent等，(即将出版)2002；Lander等，2001)9号染色体上进行序列比对(表3)。在Golden Path数据库的当前草案版本中，完整的9号染色体用单个131,451,592碱基对(bp)毗连群(SEQ ID NO：15)表示。pancortin存在于该毗连群的正链上。序列长度在表3第一行的圆括号内给出。大多数外显子坐标在该基因组上完全配对。因此，pancortin 1(SEQ ID NO：1)的核苷酸1-150以及pancortin 2(SEQ ID NO：3)在9号染色体上与核苷酸128764534-128764683配对。在不完全配对的情况下，不完全末端的基因组坐标在圆括号内给出。例如，将pancortin 4(SEQ ID NO：7)的核苷酸1-57与9号染色体的128752282-128752338进行序列比对。因此，pancortin基因的基因组序列在Golden Path version的9号染色体中跨越9号染色体的碱基128752282-128796723。该44,442bp序列示于SEQ ID NO：15。
                                        表3
根据与Golden Path数据库中9号染色体序列比对确定的Pancortin 1-4的基因组结构
Chr9(Golden-Path)(131,451,592bp) Pancortin 1(1458bp) Pancortin 2(462bp) Pancortin 3(1374bp) Pancortin 4(378bp)
128752282-128752347 不存在 不存在 1-66 1-57(-128752338)
128764534-128764683 1-150 1-150 不存在 不存在
128766739-128766888 151-300 151-300 67-216 58-216(128766731-)
128772409-128772564 301-456 301-462(-128772567) 217-372 217-378(-128772567)
128774831-128775050 457-676 不存在 373-592 不存在
128783294-128783400 677-783 不存在 593-699 不存在
128796049-128796723 784-1458 不存在 700-1374 不存在
pancortin 1的cDNA序列(SEQ ID NO：1)、pancortin 2的cDNA序列(SEQ ID NO：3)、pancortin 3的cDNA序列(SEQ ID NO：5)和pancortin 4的cDNA序列(SEQ ID NO：7)分别在Celera Genomeic AxisGA_x54KREBEJAA(Venter等，2001)上进行序列比对(表4)。Celera将GA_x54KREBEJAA作图至9号染色体正链上的碱基109649680-113510886。序列长度在表4第一行的圆括号内给出。在不完全配对的情况下，不完全末端的基因组坐标在圆括号内给出。
                                     表4
根据与Celera数据库比对确定的Pancortin 1-4的基因组结构
GA_x54KREBEJAA(3,861,206bp) Pancortin 1(1458bp) Pancortin 2(462bp) Pancortin 3(1374bp) Pancortin4(378bp)
1811739-1811804 不存在 不存在 1-66 1-57(-1811795)
1824243-1824392 1-150 1-150 不存在 不存在
1826448-1826597 151-300 151-300 67-216 58-216(1826440-)
1832155-1832310 301-456 301-462(-1832313) 217-372 217-378(-1832313)
1834760-1834979 457-676 不存在 373-592 不存在
1843219-1843325 677-783 不存在 593-699 不存在
1855918-1856592 784-1458 不存在 700-1374 不存在
                     实施例3
pancortin同源序列、已表达序列标志及单核苷酸多态性
pancortin 1(SEQ ID NO：1)与以下序列有高度同一性：小鼠pancortin 1(登录号D78262；98％)；大鼠“位于ER的嗅介蛋白相关的蛋白”(登录号U03417；98％)、Gallus gallus(登录号AF182815；96％)、非洲蟾蜍属(Xenopus)(登录号AF416483；93％)和一对人“未知”蛋白(登录号BC011741；99％以及登录号BC008763；99％)。最后两个人克隆(登录号BC011741和BC008763)参见哺乳动物基因库(MGC)，the National Center for Biotechnology Information(NCBI)。
除上述高百分比同一性外，pancortin也显示与以下序列有中等序列相似性：小鼠optimedin B型(登录号AF442824；66％)和大鼠optimedin B型(登录号AF442822；66％)；小鼠optimedin A型(登录号AF442825；66％ID)和大鼠optimedin A型(登录号AF442823；64％)；以及人相关蛋白(登录号AF397392和AF397394；均为66％)。pancortin 1也与以下序列相似：人嗅介蛋白3(登录号BC022531；65％)；未知人MGC克隆(登录号BC011361；60％)；和认为是神经元的人嗅介蛋白相关蛋白(登录号AF131839；60％ID)。pancortin 2(SEQ ID NO：3)、pancortin 3(SEQ ID NO：5)和pancortin 4(SEQ ID NO：7)显示相似的命中(hits)。
pancortin 1-4也具有大量的已表达序列标志(EST)命中。例如，pancortin 1(SEQ ID NO：1)命中人EST(登录号BM467174、BI253790、BI253790、BM478361、AU118447、AW957157、BG104648等)和小鼠EST(登录号BM949199、BM950765、BM948100、BG342436、BM948052等)。pancortin 2(SEQ ID NO：3)命中人EST(登录号BI490019、AL533562、BI552459、AV750017、AL533522等)和小鼠EST(登录号BG801991、BG807643、BI107666等)。pancortin 3(SEQID NO：5)和pancortin 4(SEQ ID NO：7)显示相似的命中。
根据Celera在人类基因组中给出的注释，对pancortin基因的单核苷酸多态性(SNP)进行进一步分析。表6列出了pancortin基因内或其附近出现的SNP。SNP ID是指Celera SNP数据库。对于该基因之外的SNP，下表的脚注说明其位置。
                      表5
                pancortin基因内及其附近的SNP
 pancortin 1坐标 SNP ID   核苷酸序列  SNP
 1157 hCV8788652   C  T
 936 hCV8788651   C  T
 237 hCV1856773   C  T
 最后一个内含子1 hCV1856714   C  A
 3p基因2 hCV1856715   A  G
 第一个内含子3 hCV11569860   A  -(空位)
 最后一个内含子4 hCV1856673   T  A
倒数第二个内含子5 hCV15877105  T  C
1.这是在最后一个内含子中、最后一个外显子开始的上游58个碱基。
2.这是该基因结束的46个碱基3p。
3.第一个外显子的28个碱基3p(pancortin 1的1-150个核苷酸)
4.最后一个内含子中的8个碱基(pancortin 1的677-783外显子的8个碱基3p)。
5.pancortin 1的677-783外显子的255个碱基5p。
                        实施例4
      重组pancortin多肽和Pablo多肽在细菌细胞中的表达
在本实施例中，pancortin或pancortin和Pablo在大肠杆菌(E.coli)中作为重组谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合多肽表达，分离所述融合多肽并进行表征。具体地说，使pancortin或pancortin和Pablo与GST融合，让该融合多肽在大肠杆菌例如菌株PEB 199中表达。预测人多肽SEQ ID NO：4(即pancortin-2)和SEQ ID NO：10(即Pablo)的分子量分别是约17.1kDa和61.6kDa；预测GST的分子量是26kDa，预测融合蛋白的分子量分别是约43.1kDa和87.6kDa。用IPTG诱导GST-pancortin和/或GST-Pablo融合多肽在PEB 199中的表达。通过亲和层析，在谷胱甘肽珠上，从经诱导的PEB 199菌株的粗制细菌裂解液中纯化出重组融合多肽。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析从所述细菌裂解液中纯化的多肽，然后测定所得融合蛋白的分子量。或者，采用如上所述的同样方案，使pancortin作为重组His-Tag融合多肽表达。
                    实施例5
   重组pancortin多肽和pablo多肽在COS细胞中的表达
为了在COS细胞中表达pancortin或pancortin和Pablo，使用Invitrogen Corporation(San Diego，CA)的pcDNA/Amp载体。该载体包含一个SV40复制起点、一个氨苄青霉素抗性基因、一个大肠杆菌复制起点、后接一个多接头区的CMV启动子以及一个SV40内含子和聚腺苷酸化位点。将编码完整的pancortin和Pablo蛋白的DNA片段以及与该片段3′端符合读框融合的HA标志(Wilson等，1984)克隆到所述载体的多接头区，从而使所述重组蛋白的表达处于CMV启动子控制之下。
为了构建质粒，使用两种引物，通过PCR扩增pancortin或pancortin和Pablo DNA序列。5′引物自起始密码子起包含目标限制位点，后接约20个核苷酸的pancortin或pancortin和Pablo编码序列；3′端序列包含与另一目标限制位点互补的序列、翻译终止密码子、HA标志和最后20个核苷酸的pancortin或pancortin和Pablo编码序列。PCR扩增片段和pcDNA/Amp载体用合适的限制性酶消化，用CIAP酶(New England Biolabs，Beverly，MA)使载体去磷酸化。所选的这两个限制位点最好是不同的，以便使pancortin或pancortin和Pablo基因以正确方向插入。将该连接混合物转化到大肠杆菌细胞(菌株HB101，DH5a，SURE，可得自Stratagene Cloning Systems，La Jolla、CA，都可使用)中，将转化培养物接种到氨苄青霉素培养基平板上，然后选出抗性菌落。从转化子中分离出质粒DNA，通过限制性分析检查存在正确片段。
然后，采用磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔，用pancortin和/或pancortin-Pablo-pcDNA/Amp质粒DNA转染COS细胞。其它用于转染宿主细胞的合适方法可在以下文献中找到：Sambrook等，″Molecular Cloning：A LaboratoryManual，″第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989。pancortin或pancortin和Pablo多肽的表达使用HA特异性单克隆抗体通过下述方法进行检测：放射性标记(35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸，可得自NEN，Boston，MA，都可以使用)和免疫沉淀(Harlow和Lane，″Antibodies：ALaboratory Manual，″Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1988)。概括地讲，所述细胞用35S-甲硫氨酸(或35S-半胱氨酸)标记8小时。然后收集培养基，用去垢剂(RIPA缓冲液，150mMNaCl，1％NP-40，0.1％SDS，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)使细胞裂解。用HA特异性单克隆抗体使细胞裂解液和培养液沉淀。然后通过SDS-PAGE分析所沉淀的蛋白。
或者，将含有pancortin或pancortin和Pablo编码序列的DNA直接克隆到使用合适的限制位点的pcDNA/Amp载体的多接头中。按照上述方法，将所得质粒转染到COS细胞中，按照放射性标记和免疫沉淀法，使用pancortin或pancortin-Pablo特异性单克隆抗体，检测pancortin或pancortin和Pablo多肽的表达。
                      实施例6
                    细胞系的产生
本实施例描述如何产生包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的可读框多核苷酸序列的细胞系。将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的pancortin或pancortin和Pablo多核苷酸序列连接到哺乳动物表达载体pcDNA3.1+zeo(Invitrogen，1600 Faraday Avenue，Carlsbad，CA 92008)中。用所得质粒转染CHO细胞并用500μg/ml零霉素(zeocin)进行选择。通过RT-PCR和蛋白质印迹法检测零霉素抗性克隆表达pancortin或pancortin和Pablo的情况。随后，对pancortin或pancortin和Pablo表达对细胞凋亡信号传递的影响进行研究，其中表达可以通过RU 486系统进行诱导。
                       实施例7
               pancortin基因打靶载体的构建
pancortin的鉴定最初基于脑特异性转录物的克隆。随后，pancortin被鉴定为Pablo的结合配偶体，即一种神经元特异性促凋亡调节因子。让差别加工的转录物在大鼠脑中以发育特异性和区域特异性方式表达。四种pancortin蛋白得自两个5′外显子(A和B，均含有独立启动子)与不同的3′外显子的选择利用，所述3′外显子编码该蛋白的两个不同的C末端(末端Y和Z)(参见图1、图2A和图2B)。所有组合的矩阵产生4种共享中间区(M)的mRNA和蛋白。pancortin 3和4是发育期间的优势形式并且可以是分泌型的，而pancortin 1和2在成年期中占优势。所有这四种形式中，只有pancortin 2似乎功能性结合Pablo。
尽管已鉴定出pancortin的几种mRNA变异体，但是只有pancortin 2始终如一地结合Pablo并且在体外诱导细胞凋亡。C末端外显子(外显子Y)在翻译终止前编码一个氨基酸。该外显子的缺失将会导致pancortin 2和4的损失并且阻断与Pablo的结合。
pancortin剔除动物的产生将有助于弄清楚pancortin参与介导Pablo诱导的细胞凋亡。pancortin剔除动物将有助于了解pancortin/Pablo的破坏作用，从而防止凋亡细胞死亡。
观察到Pablo的过量表达在动物(例如大鼠、小鼠)和人神经元细胞系中是有毒性的。例如，过量表达Pablo的转基因小鼠具有包括震颤、后肢抱拢和死亡(取决于Pablo过量表达的水平)在内的表型。具有纯合Pablo剔除的转基因小鼠表现出明显的运动功能障碍和出生后死亡。
剔除形式：常规剔除包括外显子Y的缺失，导致产生pancortin 2和pancortin 4同种型的剔除。预期Y外显子的剔除不会导致死亡，因为pancortin 1和3同种型仍保持完整。
另外，当与组织特异性Cre缺失小鼠交配时，LoxP位点邻接外显子M2的插入将会提供所有pancortin种剔除的条件策略。预期Lox-P位点邻接外显子M2的插入并随后切除将会消除或截短蛋白表达成pancortin 1(BMZ)和pancortin 3(AMZ)。体外证据指出M1和M2对于促凋亡功能的重要性。因此，带有M2缺失的动物可用于比较外显子Y缺失(pancortin 2和pancortin 4特异性的)对所有pancortin亚型功能性缺失的影响。图3显示制备pancortin剔除打靶载体的示意图。
结合进行包括急性局部缺血或促凋亡损害的体内实验的原代神经元培养物，对pancortin剔除动物进行表型表征。
                     实施例8
                胚胎干细胞的转染与分析
将胚胎干细胞(例如D3株，Doestschman等，1985)在新霉素抗性胚胎成纤维细胞饲养层上进行培养，所述饲养层生长在补充15％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、青霉素(50u/ml)/链霉素(50u/ml)、非必需氨基酸、100μM 2-巯基乙醇和500u/ml白血病抑制因子的Dulbecco氏改良的Eagles培养液中。每天更换培养液，细胞每2-3天传代一次，然后通过电穿孔(25μF电容和400伏电压)用线性化质粒转染。转染后，将转染细胞在非选择性培养基中培养1-2天。随后，将其在含有更昔洛韦和新霉素的培养基中培养5天，其中最后3天在单独的新霉素中培养。扩充克隆后，将一份细胞在液氮中冷冻。用剩余细胞制备DNA并进行基因组DNA分析，以鉴定在内源pancortin和/或Pablo基因和打靶构建体之间发生同源重组的克隆。为了制备基因组DNA，使ES细胞克隆在100mM Tris HCl pH8.5、5mM EDTA、0.2％SDS、200mM NaCl和100μg/ml蛋白酶K中裂解。通过异丙醇沉淀回收DNA，将其在10mM Tris HCl、pH8.0/0.1mM EDTA中溶解。为了鉴定同源重组克隆，从所述克隆中分离的基因组DNA用限制性酶消化。限制性消化后，将DNA在0.8％琼脂糖凝胶上分离，转印到Hybond N膜上，于65℃与结合靠近打靶载体5′端的pancortin或pancortin和Pablo基因区的探针以及结合远离打靶载体3′端的pancortin或pancortin和Pablo基因区的探针杂交。标准杂交后，印迹用40mM NaPO4(pH7.2)、1mM EDTA和1％SDS于65℃洗涤，然后对X光片曝光。5′探针与野生型pancortin或pancortin和Pablo等位基因的杂交产生一个容易通过放射自显影术与具有neo插入的突变型pancortin或pancortin和Pablo等位基因相区别的片段。
                    实施例9
           pancortin和Pablo缺陷型小鼠的产生
让雌性小鼠和雄性小鼠交配，在妊娠3.5天，分离胚泡。给每个胚泡注射来自实施例2所述克隆的10-12个细胞，将7个或8个胚泡转移到假孕雌性子宫内。在妊娠第18天，通过剖腹产接生幼崽，与代孕BALB/c母鼠放在一起饲养。所得雄性和雌性嵌合体分别与雌性和雄性BALB/C小鼠(无色素被毛)交配，根据129 ES细胞基因组经由种系传代获得的色素被毛颜色，确定种系遗传。所述色素杂合子有可能携带破坏的pancortin和/或Pablo等位基因，由此使这些动物交配，孟德尔遗传学预测：约25％的后代对于所述pancortin和/或Pablo无效突变将是纯合的。通过获得尾基因组DNA，完成对所述动物的基因分型。
为证实pancortin和/或Pablo-/-小鼠不表达全长pancortin和/或Pablo mRNA转录物，从各种组织分离RNA，用pancortin和/或PablocDNA探针通过标准RNA杂交技术进行分析，或者通过逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行分析。使用4M硫氰酸胍，如Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory press(1989))所述方法，从小鼠的各种器官提取RNA，然后在5.7M CsCl中离心。对从表达pancortin和/或Pablo的组织中分离的mRNA的RNA印迹分析证明：在pancortin和/或Pablo-/-小鼠中检测不到全长pancortin和/或Pablo mRNA。特异性针对新霉素基因的引物将在pancortin和/或Pablo+/-和-/-动物体内检测到转录物，但在+/+动物体内检测不到转录物。使用RNA印迹分析和RT-PCR分析证实：pancortin和/或Pablo基因的纯合破坏导致在pancortin和/或Pablo-/-小鼠中不存在可检测全长pancortin和/或Pablo mRNA转录物。为了检查pancortin和/或Pablo缺陷型小鼠体内的pancortin和/或Pablo蛋白表达，使用标准技术，对来自分离组织的裂解物进行蛋白质印迹分析。这些结果将证明：pancortin和/或Pablo基因的纯合破坏导致在-/-小鼠中不存在可检测pancortin和/或Pablo蛋白。
                    实施例10
           对pancortin和/或Pablo产生的抑制
设计作为本发明组合物的RNA分子
在本实验中，所有RNA分子长约600nt，并且所有RNA分子设计为不能产生功能性pancortin和/或Pablo蛋白。所述分子没有帽子序列和poly-A序列；不存在天然起始密码子，所述RNA不编码全长产物。设计下列RNA分子：
(1)与部分pancortin和/或Pablo鼠信使RNA(mRNA)同源的单链(ss)有义RNA多核苷酸序列；
(2)与部分pancortin和/或Pablo鼠mRNA互补的ss反义RNA多核苷酸序列，
(3)包含有义和反义部分pancortin和/或Pablo鼠mRNA多核苷酸序列的双链(ds)RNA分子，
(4)与部分pancortin和/或Pablo鼠异源RNA(hnRNA)同源的ss有义RNA多核苷酸序列，
(5)与部分pancortin和/或Pablo鼠hnRNA互补的ss反义RNA多核苷酸序列，
(6)包含有义和反义pancortin和/或Pablo鼠hnRNA多核苷酸序列的ds RNA分子，
(7)与部分pancortin和/或Pablo启动子的上链同源的ss鼠RNA多核苷酸序列，
(8)与部分pancortin和/或Pablo启动子的下链同源的ss鼠RNA多核苷酸序列，以及
(9)包含与pancortin和/或Pablo启动子的上下两条链同源的鼠RNA多核苷酸序列的ds RNA分子。
通过对在一个末端携带T7启动子的PCR产物进行的T7 RNA聚合酶转录，可以产生以上(1)-(9)的不同RNA分子。在需要有义RNA的情况下，将T7启动子置于PCR正向引物的5′端。在需要反义RNA的情况下，将T7启动子置于PCR反向引物的5′端。当需要dsRNA时，在T7转录反应中可以包括这两种类型的PCR产物。或者，可以将有义RNA和反义RNA在转录后混合在一起。
编码折回型RNA的表达质粒的构建
可以使用本申请中公开的信息，构建编码部分pancortin和/或Pablo基因反向重复的表达质粒。可以通过PCR扩增制备长约至少600个核苷酸的两种彼此序列几乎相同的pancortin和/或Pablo基因片段，然后将其导入载体的合适限制位点，所述载体包括以相反方向转录pancortin和/或Pablo所需要的元件。用所述构建体转染的CHO细胞将仅产生折回RNA，其中互补靶基因序列形成双螺旋。所述基因组和PCR引物坐标基于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的序列。
试验
给Balb/c小鼠(5只小鼠/组)按范围10μg-500μg的剂量肌内或腹膜内注射上述鼠pancortin和/或Pablo链特异性RNA或对照。在三周时间内，每四天采集所述小鼠的血清，使用本文公开的抗体测定pancortin和/或Pablo水平。
                          实施例11
                     本发明预防疾病的方法
体内试验
用没有产生pancortin或Pablo蛋白的能力的上述pancortin和/或Pablo特异性RNA分子和作为对照的pancortin和/或Pablo特异性RNA分子，可以评价小鼠通过利用本发明注射的pancortin和/或Pablo特异性RNA分子对pancortin或Pablo相关疾病的保护。通过给Balb/c小鼠(5只小鼠/组)按10-500μg RNA剂量范围颅间注射所述RNA分子，对所述小鼠进行免疫。在注射RNA后第1、2、4和7天，观察所述小鼠pancortin和/或Pablo相关表型改变的体征。
根据本发明，因为接受本发明包含pancortin和/或Pablo序列的dsRNA分子的小鼠可能显示保护所述小鼠免患pancortin和/或Pablo相关疾病。接受对照RNA分子的小鼠可能不受保护。预期接受包含pancortin和/或Pablo序列的ss RNA分子的小鼠可能受到最小保护(如果有的话)，除非这些分子具有在体内至少部分变成双链的能力。
根据本发明，因为本发明的dsRNA分子没有产生pancortin和/或Pablo蛋白的能力，所以通过将所述RNA分子给予动物而提供的保护是由于基因特异性的非免疫介导机制所致。
                     实施例12
         果蝇和中国仓鼠培养细胞内的RNA干涉
为观察RNA干涉的效应，可以鉴定并使用天然表达pancortin和/或Pablo的细胞系，或者通过众所周知的方法(和如本文概述的方法)构建表达pancortin和/或Pablo转基因的细胞系。例如，描述果蝇细胞和CHO细胞的应用。将果蝇S2细胞和中国仓鼠CHO-K1细胞分别在Schneider培养基(Gibco BRL)中于25℃进行培养，或者在Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(Gibco BRL)中于37℃进行培养。这两种培养基中都可以补充10％热灭活胎牛血清(Mitsubishi Kasei)和抗生素(10单位/ml青霉素(Meiji)和50μg/ml链霉素(Meiji))。
转染和RNAi活性试验
将S2细胞和CHO-K1细胞分别以1×106和3×105细胞/ml接种到24孔板各孔内。1天后，使用磷酸钙沉淀法，用pancortin和/或Pablods RNA(80pg到3μg)转染细胞。转染后20小时可收获细胞，测量pancortin和/或Pablo基因表达。
                        实施例13
               脊椎动物细胞系内的反义抑制
可以使用标准技术进行反义，其中包括应用试剂盒如Sequitur Inc.(Natick，MA)的试剂盒。以下程序利用硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸和阳离子脂质。选择与所述mRNA 5′端互补的寡聚体，以便包括翻译起始位点。
1)在接种所述细胞前，通过将0.2％过滤除菌的明胶温育30分钟，用所述明胶包被所述板壁，以促进贴壁，然后用PBS洗涤一次。让细胞生长至40-80％汇合。用Hela细胞作为阳性对照。
2)用无血清培养基(例如Opti-MEMA，得自Gibco-BRL)洗涤所述细胞。
3)将合适的阳离子脂质(例如Oligofectibn A，得自Sequitur，Inc.)混合，然后加入到聚苯乙烯管内不含抗生素的无血清培养基中。根据所述脂质的来源，其浓度可以变化。将100μM贮液(2μl/ml)的寡聚体加入到盛有无血清培养基/阳离子脂质的管内，至终浓度约为200nM(范围50-400nM)，然后颠倒混合。
4)将所述寡聚体/培养基/阳离子脂质溶液加入到所述细胞中(在24孔板上，每孔约0.5mL)，然后于37℃温育4小时。
5)用培养基温和洗涤所述细胞，然后加入完全生长培养基。让所述细胞生长24小时。一定百分比的所述细胞可能会脱离该板，或者裂解。收获细胞，然后测量pancortin和/或Pablo基因表达。
                    实施例14
    pancortin和/或Pablo结合蛋白和激动剂/拮抗剂的鉴定
酵母菌株、细菌菌株以及供酵母和细菌选择和生长用的培养基是本领域众所周知的(参见例如Klein等，1989(a)，1989b；Bartel等，1993(b))，例如平板培养法(Rose等，1990)。本发明的pancortin和/或Pablo多肽在pAS2-1载体中的Gal4蛋白的结合结构域部分中作为融合蛋白(“诱饵”)表达。然后，使人脑文库以融合物(“猎物”)形式表达，以激活pACT II载体中GaL4蛋白的活化结构域部分。pancortin和/或Pablo与文库蛋白的功能性相互作用将驱动报道基因活性的表达。待用的报道表型是组氨酸原养型和β-半乳糖苷酶活性。用作诱饵的pancortin和/或Pablo将是来自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9的起始密码子至终止密码子的人cDNA。如上所述鉴定的蛋白质相互作用可以用配体进行进一步筛选，其中所述配体可以弱化蛋白质-蛋白质相互作用，或者所述配体可以诱导蛋白质-蛋白质相互作用，这在不存在所述配体时是不可检测的。
                    实施例15
                      试验
表达pancortin和/或Pablo的细胞可以用来筛选增强(激动剂)或降低(拮抗剂)pancortin-Pablo多肽二聚体作用的化合物。可以在功能试验中筛选试验化合物的作用，其中所述pancortin-Pablo二聚体调节可以用以下试验检测的细胞凋亡信号：结合试验、配体结合试验、哺乳动物双杂交试验或用凋亡终点作为读出的试验(例如碘化丙锭摄取、隧道染色、膜联蛋白染色、线粒体膜电位染料)。
另外，酵母双杂交系统如本文所述的酵母双杂交系统可以用来筛选增加或减少pancortin-Pablo结合的化合物。生长或报道基因(例如萤虫素酶)表达的变化可以用来测定pancortin-Pablo结合激动剂或拮抗剂的作用。
重组表达的pancortin和Pablo蛋白或其片段可以用于无细胞筛选类型的ELISA型形式中。例如，His标记的Pablo结合筛选板(例如96孔板或384孔板)的镍包被孔。向各孔中加入GST或硫氧还蛋白标记的pancortin，然后洗去未结合的pancortin。通过结合的GST或硫氧还蛋白标记的免疫检测，可以对pancortin与Pablo的结合进行定量。可以对所述激动剂或拮抗剂增加或减少该结合的能力进行定量。
                    实施例16
            Pablo-pancortin共免疫沉淀
共免疫沉淀研究证明，内源Pablo蛋白和内源pancortin蛋白在成年大鼠脑皮质中彼此结合在一起。共免疫沉淀研究按照标准公开的方法进行。
内源共免疫沉淀方案
1ml Wheaton玻璃匀浆器内装有1ml弱裂解缓冲液(CytoSignal：IMMUNOcatcher缓冲液试剂盒，目录号C04-050)或强裂解缓冲液(0.5％SDS；50mM Tris-HCl，pH7.5；10％甘油；1％TritonX-100；150mM NaCl；5mM EDTA)，其中每10ml缓冲液含有1 Roche Completetablet(目录号1 836 170)和4mM Roche Pefabloc SC(AEBSF，目录号104290876)。所有装置和缓冲液都保持在4℃。从成年大鼠脑中取出皮质，将其马上置于所述缓冲液中并使用8冲程的玻璃棒在冰上匀浆，或者直到见不到组织碎片。对于蛋白质测定，使用Pierce BCA蛋白质测定试剂(目录号23223、23224)。
为了预纯化(preclear)裂解液，将Roche A蛋白-琼脂糖(目录号101340515)和G蛋白-琼脂糖(目录号102430233)各50μl加入到2mg蛋白中。用含有蛋白酶抑制剂的相应裂解缓冲液将体积调至750μl。然后将所得混合物在旋转式摇瓶机中于4℃培养3-5小时；在冷冻微量离心机中以10,000xg离心1分钟，以去除非特异性吸附的不溶性物质，然后收集预纯化上清液。每个免疫沉淀使用500μg总蛋白，向各反应物中加入5μg PABLO单克隆抗体33.1、PABLO多克隆抗体15053或Pancortin单克隆抗体7.1，然后在旋转式摇瓶机中于4℃培养过夜。然后向预先加入了小鼠IgG1单克隆抗体的各管中加入60μlG蛋白-琼脂糖，然后向各管中加入A蛋白和多克隆抗体。在旋转式摇瓶机中于4℃培养1-2小时后，通过以10,000xg于4℃离心1分钟使珠沉淀。去除上清液，将所得珠重悬于1ml不含蛋白酶的裂解缓冲液中，重复洗涤2次以上。
接下来，将2x凝胶加样缓冲液加入到终沉淀中，然后向沉淀中加入Invitrogen NuPage LDS样品缓冲液(目录号NP0007)和20％NuPage还原剂(目录号NP0004)。通过涡旋混合并于95℃加热5分钟使蛋白质变性。通过以10,000xg在室温下离心3分钟而去除A蛋白-琼脂糖珠或G蛋白-琼脂糖珠。然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用NuPage预制凝胶、NuPage缓冲液系统和抗氧化剂(目录号NP0005)，对上清液进行分析。
将膜在甲醇中预先湿润5秒，置于转移缓冲液(1x NuPage转移缓冲液，目录号NP0006；20％甲醇)中，按照标准蛋白质印迹法，将凝胶转移到Millipore Immobilon-P膜(目录号IPVH07850)上。蛋白质印迹用Pablo或pancortin抗体探测。如果用单克隆抗体进行Pablo的免疫沉淀，则使用多克隆抗体，反之亦然。单克隆抗体只用来探测pancortin。然后将印迹在室温下、在摇动平台上保温2小时，然后用含有0.1％Tween-20的Gibco PBS洗涤三次，每次5分钟，然后洗涤15分钟一次。
将经洗涤的印迹与多克隆第一抗体的第二抗体即HRP缀合的驴抗兔抗体(Jackson ImmunoResearch 715-035-152)和单克隆第一抗体的HRP缀合的驴抗小鼠抗体(Jackson ImmunoResearch 715-035-150)一起保温并在摇动平台上在室温下摇动1小时。在第一抗体温育后，所述印迹再如上所述洗涤。
将Amersham Biosciences ECL-plus，目录号RPN 2132加入到印迹表面，在室温下保温5分钟。采用磷光图像仪(Molecular DynamicsStorm 860)、蓝色荧光/化学发光扫描仪，电压设定在750PMT，检测所述信号。
                           表6
免疫沉淀 蛋白质印迹   强裂解缓冲液   弱裂解缓冲液
Pablo Pancortin       -        +
Pancortin Pablo       -        +
上表6显示在弱裂解条件下，Pablo的免疫沉淀也使pancortin蛋白沉淀，反之亦然。Pablo和pancortin在强裂解条件存在下不能共沉淀可以反映出较弱的蛋白质-蛋白质相互作用，或者可能反映出Pablo和pancortin抗体的特性。
                       实施例17
                大鼠大脑中动脉闭塞中风模型
用含70％氧化亚氮和30％氧的3％异氟烷通过鼻腔吸入麻醉体重290-310g的成年雄性Wistar大鼠(Charles River，Wilmington，MA)。在手术全过程中，使用加热灯保持温度在37℃。使用管腔内缝合法(Longa等，1989)，诱导一过性大脑中动脉闭塞(MCAO)达90分钟。
简而言之，将用多聚L-赖氨酸包衣的长18mm的4-0单丝尼龙缝线(Belayev等，1996)和flame-rounded尖插入到颈外动脉内，向前通过颈内动脉，以闭合大脑中动脉(MCA)起点。90分钟后，将大鼠再麻醉，然后取出缝线。假手术对照施行相同的手术，但不将缝线插入到MCA中。
                        表7
         MCAO后Pablo-Pancortin共免疫时程
                                  局部缺血后时间(天)
假 0 0.125 0.25 1 3 5 7 11
同侧皮质 + + ++ +++ ++++ - - + +
对侧皮质 + + ++ +++ ++++ ++ + + +
在再灌注损伤期间，Pablo和pancortin复合物形成增加。上表17显示用抗Pablo抗体免疫沉淀的pancortin量在局部缺血后24小时达到其峰值。局部缺血后3天，同侧水平显著降至假水平以下，直到局部缺血后约7天，仍然下降。对侧显示与同侧相似的Pablo-pancortin复合物增加。然而，该复合物没有掺入Bcl-xL，同侧也是如此，在对侧皮质中没有显著性神经元损失。另外，与同侧不相同，损伤后第一个24小时内，对侧上Pablo-pancortin相互作用水平在升高后慢慢恢复到假水平。
该数据提供Pablo-pancortin复合物在大鼠MCAO中风模型的再灌注期间形成的证据。所述复合物形成的时间早于显著性神经元损失的时间，因此可能对其有贡献。同侧皮质上复合物形成快速下降可能是神经元激活Pablo的肌动蛋白相互作用特性的结果，因而可说明破坏Pablo-pancortin复合物在恢复期也将会是有益的。
等同实施方案：使用不超过常规实验部分，本领域技术人员将会认识到或者能够确定，本说明书中描述的本发明具体实施方案的许多等同实施方案。所附权利要求书包括这样的等同实施方案。
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                             序列表
<110>WYETH
     Mark，Robert
     Wood，Andrew
     Gulukota，Kamalakar
<120>新的pancortin-Pablo蛋白相互作用及其使用方法
<130>AM100375PCT
<150>US 60/369,244
<151>2002-04-01
<150>US 60/386,645
<151>2002-06-06
<160>15
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1458
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>1
atgtcggtgc cgctgctgaa gatcggggtc gtgctgagca ccatggccat gatcactaac     60
tggatgtccc agacgctgcc ctcgctggtg ggcctcaaca ccaccaagct ctcggcggcc    120
ggcggcggga cgctggaccg cagcaccggc gtgctgccca ccaaccctga ggagagctgg    180
caggtgtaca gctctgccca ggacagcgag ggcaggtgta tctgcacagt ggtcgcccca    240
cagcagacca tgtgttcacg ggatgcccgc acaaaacagc tgaggcagct actggagaag    300
gtgcagaaca tgtctcaatc catagaggtc ttggacaggc ggacccagag agacttgcag    360
tacgtggaga agatggagaa ccaaatgaaa ggactggagt ccaagttcaa acaggtggag    420
gagagtcata agcaacacct ggccaggcag tttaaggcga taaaagcgaa aatggatgaa    480
cttaggcctt tgatacctgt gttggaagag tacaaggccg atgccaaatt ggtattgcag    540
tttaaagagg aggtccagaa tctgacgtca gtgcttaacg agctgcaaga ggaaattggc    600
gcctatgact acgatgaact tcagagcaga gtgtccaatc ttgaagaaag gctccgtgca    660
tgcatgcaaa aactagcttg cgggaagttg acgggcatca gtgaccccgt gactgtcaag    720
acctccggct cgaggttcgg atcctggatg acagaccctc tcgcccctga aggcgataac    780
cgggtgtggt acatggacgg ctatcacaac aaccgcttcg tacgtgagta caagtccatg    840
gttgacttca tgaacacgga caatttcacc tcccaccgtc tcccccaccc ctggtcgggc    900
acggggcagg tggtctacaa cggttctatc tacttcaaca agttccagag ccacatcatc    960
atcaggtttg acctgaagac agagaccatc ctcaagaccc gcagcctgga ctatgccggt   1020
tacaacaaca tgtaccacta cgcctggggt ggccactcgg acatcgacct catggtggac   1080
gagagcgggc tgtgggccgt gtacgccacc aaccagaacg ctggcaacat cgtggtcagt   1140
aggctggacc ccgtgtccct gcagaccctg cagacctgga acacgagcta ccccaagcgc   1200
agcgccgggg aggccttcat catctgcggc acgctgtacg tcaccaacgg ctactcaggg   1260
ggtaccaagg tccactatgc ataccagacc aatgcctcca cctatgaata catcgacatc   1320
ccattccaga acaaatactc ccacatctcc atgctggact acaaccccaa ggaccgggcc   1380
ctgtatgcct ggaacaacgg ccaccagatc ctctacaacg tgaccctctt ccacgtcatc  1440
cgctccgatg agttgtag                                                1458
<210>2
<211>485
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Ser Val Pro Leu Leu Lys Ile Gly Val Val Leu Ser Thr Met Ala
1               5                   10                  15
Met Ile Thr Asn Trp Met Ser Gln Thr Leu Pro Ser Leu Val Gly Leu
            20                  25                  30
Asn Thr Thr Lys Leu Ser Ala Ala Gly Gly Gly Thr Leu Asp Arg Ser
        35                  40                  45
Thr Gly Val Leu Pro Thr Asn Pro Glu Glu Ser Trp Gln Val Tyr Ser
    50                  55                  60
Ser Ala Gln Asp Ser Glu Gly Arg Cys Ile Cys Thr Val Val Ala Pro
65                  70                  75                  80
Gln Gln Thr Met Cys Ser Arg Asp Ala Arg Thr Lys Gln Leu Arg Gln
                85                  90                  95
Leu Leu Glu Lys Val Gln Asn Met Ser Gln Ser Ile Glu Val Leu Asp
            100                 105                 110
Arg Arg Thr Gln Arg Asp Leu Gln Tyr Val Glu Lys Met Glu Asn Gln
        115                 120                 125
Met Lys Gly Leu Glu Ser Lys Phe Lys Gln Val Glu Glu Ser His Lys
    130                 135                 140
Gln His Leu Ala Arg Gln Phe Lys Ala Ile Lys Ala Lys Met Asp Glu
145                 150                 155                 160
Leu Arg Pro Leu Ile Pro Val Leu Glu Glu Tyr Lys Ala Asp Ala Lys
                165                 170                 l75
Leu Val Leu Gln Phe Lys Glu Glu Val Gln Asn Leu Thr Ser Val Leu
            180                 185                 190
Asn Glu Leu Gln Glu Glu Ile Gly Ala Tyr Asp Tyr Asp Glu Leu Gln
        195                 200                 205
Ser Arg Val Ser Asn Leu Glu Glu Arg Leu Arg Ala Cys Met Gln Lys
    210                 215                 220
Leu Ala Cys Gly Lys Leu Thr Gly Ile Ser Asp Pro Val Thr Val Lys
225                 230                 235                 240
Thr Ser Gly Ser Arg Phe Gly Ser Trp Met Thr Asp Pro Leu Ala Pro
                245                 250                 255
Glu Gly Asp Asn Arg Val Trp Tyr Met Asp Gly Tyr His Asn Asn Arg
            260                 265                 270
Phe Val Arg Glu Tyr Lys Ser Met Val Asp Phe Met Asn Thr Asp Asn
        275                 280                 285
Phe Thr Ser His Arg Leu Pro His Pro Trp Ser Gly Thr Gly Gln Val
    290                 295                 300
Val Tyr Asn Gly Ser Ile Tyr Phe Asn Lys Phe Gln Ser His Ile Ile
305                 3l0                 315                 320
Ile Arg Phe Asp Leu Lys Thr Glu Thr Ile Leu Lys Thr Arg Ser Leu
                325                 330                 335
Asp Tyr Ala Gly Tyr Asn Asn Met Tyr His Tyr Ala Trp Gly Gly His
            340                 345                 350
Ser Asp Ile Asp Leu Met Val Asp Glu Ser Gly Leu Trp Ala Val Tyr
        355                 360                 365
Ala Thr Asn Gln Asn Ala Gly Asn Ile Val Val Ser Arg Leu Asp Pro
    370                 375                 380
Val Ser Leu Gln Thr Leu Gln Thr Trp Asn Thr Ser Tyr Pro Lys Arg
385                 390                 395                 400
Ser Ala Gly Glu Ala Phe Ile Ile Cys Gly Thr Leu Tyr Val Thr Asn
                405                 410                 415
Gly Tyr Ser Gly Gly Thr Lys Val His Tyr Ala Tyr Gln Thr Asn Ala
            420                 425                 430
Ser Thr Tyr Glu Tyr Ile Asp Ile Pro Phe Gln Asn Lys Tyr Ser His
        435                 440                 445
Ile Ser Met Leu Asp Tyr Asn Pro Lys Asp Arg Ala Leu Tyr Ala Trp
    450                 455                 460
Asn Asn Gly His Gln Ile Leu Tyr Asn Val Thr Leu Phe His Val Ile
465                 470                 475                 480
Arg Ser Asp Glu Leu
                485
<210>3
<211>462
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>3
atgtcggtgc cgctgctgaa gatcggggtc gtgctgagca ccatggccat gatcactaac     60
tggatgtccc agacgctgcc ctcgctggtg ggcctcaaca ccaccaagct ctcggcggcc    120
ggcggcggga cgctggaccg cagcaccggc gtgctgccca ccaaccctga ggagagctgg    180
caggtgtaca gctctgccca ggacagcgag ggcaggtgta tctgcacagt ggtcgcccca    240
cagcagacca tgtgttcacg ggatgcccgc acaaaacagc tgaggcagct actggagaag    300
gtgcagaaca tgtctcaatc catagaggtc ttggacaggc ggacccagag agacttgcag    360
tacgtggaga agatggagaa ccaaatgaaa ggactggagt ccaagttcaa acaggtggag    420
gagagtcata agcaacacct ggccaggcag tttaagggct aa                       462
<210>4
<211>153
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>4
Met Ser Val Pro Leu Leu Lys Ile Gly Val Val Leu Ser Thr Met Ala
1               5                   10                  15
Met Ile Thr Asn Trp Met Ser Gln Thr Leu Pro Ser Leu Val Gly Leu
            20                  25                  30
Asn Thr Thr Lys Leu Ser Ala Ala Gly Gly Gly Thr Leu Asp Arg Ser
        35                  40                  45
Thr Gly Val Leu Pro Thr Asn Pro Glu Glu Ser Trp Gln Val Tyr Ser
    50                  55                  60
Ser Ala Gln Asp Ser Glu Gly Arg Cys Ile Cys Thr Val Val Ala Pro
65                  70                  75                  80
Gln Gln Thr Met Cys Ser Arg Asp Ala Arg Thr Lys Gln Leu Arg Gln
                85                  90                  95
Leu Leu Glu Lys Val Gln Asn Met Ser Gln Ser Ile Glu Val Leu Asp
            100                 105                 110
Arg Arg Thr Gln Arg Asp Leu Gln Tyr Val Glu Lys Met Glu Asn Gln
        115                 120                 125
Met Lys Gly Leu Glu Ser Lys Phe Lys Gln Val Glu Glu Ser His Lys
    130                 135                 140
Gln His Leu Ala Arg Gln Phe Lys Gly
145                 150
<210>5
<211>1374
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>5
atgcacccgg cccggaagct cctcagcctc ctcttcctca tcctgatggg cactgaactc     60
actcaagtgc tgcccaccaa ccctgaggag agctggcagg tgtacagctc tgcccaggac    120
agcgagggca ggtgtatctg cacagtggtc gccccacagc agaccatgtg ttcacgggat    180
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gaggtcttgg acaggcggac ccagagagac ttgcagtacg tggagaagat ggagaaccaa    300
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aggcagttta aggcgataaa agcgaaaatg gatgaactta ggcctttgat acctgtgttg    420
gaagagtaca aggccgatgc caaattggta ttgcagttta aagaggaggt ccagaatctg    480
acgtcagtgc ttaacgagct gcaagaggaa attggcgcct atgactacga tgaacttcag    540
agcagagtgt ccaatcttga agaaaggctc cgtgcatgca tgcaaaaact agcttgcggg    600
aagttgacgg gcatcagtga ccccgtgact gtcaagacct ccggctcgag gttcggatcc    660
tggatgacag accctctcgc ccctgaaggc gataaccggg tgtggtacat ggacggctat    720
cacaacaacc gcttcgtacg tgagtacaag tccatggttg acttcatgaa cacggacaat    780
ttcacctccc accgtctccc ccacccctgg tcgggcacgg ggcaggtggt ctacaacggt    840
tctatctact tcaacaagtt ccagagccac atcatcatca ggtttgacct gaagacagag    900
accatcctca agacccgcag cctggactat gccggttaca acaacatgta ccactacgcc    960
tggggtggcc actcggacat cgacctcatg gtggacgaga gcgggctgtg ggccgtgtac   1020
gccaccaacc agaacgctgg caacatcgtg gtcagtaggc tggaccccgt gtccctgcag   1080
accctgcaga cctggaacac gagctacccc aagcgcagcg ccggggaggc cttcatcatc   1140
tgcggcacgc tgtacgtcac caacggctac tcagggggta ccaaggtcca ctatgcatac   1200
cagaccaatg cctccaccta tgaatacatc gacatcccat tccagaacaa atactcccac   1260
atctccatgc tggactacaa ccccaaggac cgggccctgt atgcctggaa caacggccac   1320
cagatcctct acaacgtgac cctcttccac gtcatccgct ccgatgagtt gtag         1374
<210>6
<211>457
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>6
Met His Pro Ala Arg Lys Leu Leu Ser Leu Leu Phe Leu Ile Leu Met
1               5                   10                  15
Gly Thr Glu Leu Thr Gln Val Leu Pro Thr Asn Pro Glu Glu Ser Trp
            20                  25                  30
Gln Val Tyr Ser Ser Ala Gln Asp Ser Glu Gly Arg Cys Ile Cys Thr
        35                  40                  45
Val Val Ala Pro Gln Gln Thr Met Cys Ser Arg Asp Ala Arg Thr Lys
    50                  55                  60
Gln Leu Arg Gln Leu Leu Glu Lys Val Gln Asn Met Ser Gln Ser Ile
65                  70                  75                  80
Glu Val Leu Asp Arg Arg Thr Gln Arg Asp Leu Gln Tyr Val Glu Lys
                85                  90                  95
Met Glu Asn Gln Met Lys Gly Leu Glu Ser Lys Phe Lys Gln Val Glu
            100                 105                 110
Glu Ser His Lys Gln His Leu Ala Arg Gln Phe Lys Ala Ile Lys Ala
        115                 120                 125
Lys Met Asp Glu Leu Arg Pro Leu Ile Pro Val Leu Glu Glu Tyr Lys
    130                 135                 140
Ala Asp Ala Lys Leu Val Leu Gln Phe Lys Glu Glu Val Gln Asn Leu
145                 150                 155                 160
Thr Ser Val Leu Asn Glu Leu Gln Glu Glu Ile Gly Ala Tyr Asp Tyr
                165                 170                 175
Asp Glu Leu Gln Ser Arg Val Ser Asn Leu Glu Glu Arg Leu Arg Ala
            180                 185                 190
Cys Met Gln Lys Leu Ala Cys Gly Lys Leu Thr Gly Ile Ser Asp Pro
        195                 200                 205
Val Thr Val Lys Thr Ser Gly Ser Arg Phe Gly Ser Trp Met Thr Asp
    210                 215                 220
Pro Leu Ala Pro Glu Gly Asp Asn Arg Val Trp Tyr Met Asp Gly Tyr
225                 230                 235                 240
His Asn Asn Arg Phe Val Arg Glu Tyr Lys Ser Met Val Asp Phe Met
                245                 250                 255
Asn Thr Asp Asn Phe Thr Ser His Arg Leu Pro His Pro Trp Ser Gly
            260                 265                 270
Thr Gly Gln Val Val Tyr Asn Gly Ser Ile Tyr Phe Asn Lys Phe Gln
        275                 280                 285
Ser His Ile Ile Ile Arg Phe Asp Leu Lys Thr Glu Thr Ile Leu Lys
    290                 295                 300
Thr Arg Ser Leu Asp Tyr Ala Gly Tyr Asn Asn Met Tyr His Tyr Ala
305                 310                 315                 320
Trp Gly Gly His Ser Asp Ile Asp Leu Met Val Asp Glu Ser Gly Leu
                325                 330                 335
Trp Ala Val Tyr Ala Thr Asn Gln Asn Ala Gly Asn Ile Val Val Ser
            340                 345                 350
Arg Leu Asp Pro Val Ser Leu Gln Thr Leu Gln Thr Trp Asn Thr Ser
        355                 360                 365
Tyr Pro Lys Arg Ser Ala Gly Glu Ala Phe Ile Ile Cys Gly Thr Leu
    370                 375                 380
Tyr Val Thr Asn Gly Tyr Ser Gly Gly Thr Lys Val His Tyr Ala Tyr
385                 390                 395                 400
Gln Thr Asn Ala Ser Thr Tyr Glu Tyr Ile Asp Ile Pro Phe Gln Asn
                405                 410                 415
Lys Tyr Ser His Ile Ser Met Leu Asp Tyr Asn Pro Lys Asp Arg Ala
            420                 425                 430
Leu Tyr Ala Trp Asn Asn Gly His Gln Ile Leu Tyr Asn Val Thr Leu
        435                 440                 445
Phe His Val Ile Arg Ser Asp Glu Leu
    450                 455
<210>7
<211>378
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>7
atgcacccgg cccggaagct cctcagcctc ctcttcctca tcctgatggg cactgaactc     60
actcaagtgc tgcccaccaa ccctgaggag agctggcagg tgtacagctc tgcccaggac    120
agcgagggca ggtgtatctg cacagtggtc gccccacagc agaccatgtg ttcacgggat    180
gcccgcacaa aacagctgag gcagctactg gagaaggtgc agaacatgtc tcaatccata    240
gaggtcttgg acaggcggac ccagagagac ttgcagtacg tggagaagat ggagaaccaa    300
atgaaaggac tggagtccaa gttcaaacag gtggaggaga gtcataagca acacctggcc    360
aggcagttta agggctaa                                                  378
<210>8
<211>125
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>8
Met His Pro Ala Arg Lys Leu Leu Ser Leu Leu Phe Leu Ile Leu Met
1               5                   10                  15
Gly Thr Glu Leu Thr Gln Val Leu Pro Thr Asn Pro Glu Glu Ser Trp
            20                  25                  30
Gln Val Tyr Ser Ser Ala Gln Asp Ser Glu Gly Arg Cys Ile Cys Thr
        35                  40                  45
Val Val Ala Pro Gln Gln Thr Met Cys Ser Arg Asp Ala Arg Thr Lys
    50                  55                  60
Gln Leu Arg Gln Leu Leu Glu Lys Val Gln Asn Met Ser Gln Ser Ile
65                  70                  75                  80
Glu Val Leu Asp Arg Arg Thr Gln Arg Asp Leu Gln Tyr Val Glu Lys
                85                  90                  95
Met Glu Asn Gln Met Lys Gly Leu Glu Ser Lys Phe Lys Gln Val Glu
            100                 105                 110
Glu Ser His Lys Gln His Leu Ala Arg Gln Phe Lys Gly
        115                 120                 125
<210>9
<211>1680
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>9
atgccgctag tgaaaagaaa catcgatcct aggcacttgt gccacacagc actgcctaga     60
ggcattaaga atgaactgga atgtgtaacc aatatttcct tggcaaatat aattagacaa     120
ctaagtagcc taagtaaata tgctgaagat atatttggag aattattcaa tgaagcacat     180
agtttttcct tcagagtcaa ctcattgcaa gaacgtgtgg accgtttatc tgttagtgtt     240
acacagcttg atccaaagga agaagaattg tctttgcaag atataacaat gaggaaagct     300
ttccgaagtt ctacaattca agaccagcag cttttcgatc gcaagacttt gcctattcca     360
ttacaggaga cgtacgatgt ttgtgaacag cctccacctc tcaatatact cactccttat     420
agagatgatg gtaaagaagg tctgaagttt tataccaatc cttcgtattt ctttgatcta     480
tggaaagaaa aaatgttgca agatacagag gataagagga aggaaaagag gaagcagaag     540
cagaaaaatc tagatcgtcc tcatgaacca gaaaaagtgc caagagcacc tcatgacagg     600
cggcgagaat ggcagaagct ggcccaaggt ccagagctgg ctgaagatga tgctaatctc     660
ttacataagc atattgaagt tgctaatggc ccagcctctc attttgaaac aagacctcag     720
acatacgtgg atcatatgga tggatcttac tcactttctg ccttgccatt tagtcagatg     780
agtgagcttc tgactagagc tgaggaaagg gtattagtca gaccacatga accacctcca     840
cctccaccaa tgcatggagc aggagatgca aaaccgatac ccacctgtat cagttctgct     900
acaggtttga tagaaaatcg ccctcagtca ccagctacag gcagaacacc tgtgtttgtg     960
agccccactc ccccacctcc tccaccacct cttccatctg ccttgtcaac ttcctcatta    1020
agagcttcaa tgacttcaac tcctccccct ccagtacctc ccccacctcc acctccagcc    1080
actgctttgc aagctccagc agtaccacca cctccagctc ctcttcagat tgcccctgga    1140
gttcttcacc cagctcctcc tccaattgca cctcctctag tacagccctc tccaccagta    1200
gctagagctg ccccagtatg tgagactgta ccagttcatc cactcccaca aggtgaagtt   1260
caggggctgc ctccaccccc accaccgcct cctctgcctc cacctggcat tcgaccatca   1320
tcacctgtca cagttacagc tcttgctcat cctccctctg ggctacatcc aactccatct   1380
actgccccag gtccccatgt tccattaatg cctccatctc ctccatcaca agttatacct   1440
gcttctgagc caaagcgcca tccatcaacc ctacctgtaa tcagtgatgc caggagtgtg   1500
ctactggaag caatacgaaa aggtattcag ctacgcaaag tagaagagca gcgtgaacag   1560
gaagctaagc atgaacgcat tgaaaacgat gttgccacca tcctgtctcg ccgtattgct   1620
gttgaatata gtgattcgga agatgattca gaatttgatg aagtagattg gttggagtaa   1680
<210>10
<211>559
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>10
Met Pro Leu Val Lys Arg Asn Ile Asp Pro Arg His Leu Cys His Thr
1               5                   10                  15
Ala Leu Pro Arg Gly Ile Lys Asn Glu Leu Glu Cys Val Thr Asn Ile
            20                  25                  30
Ser Leu Ala Asn Ile Ile Arg Gln Leu Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Ala
        35                  40                  45
Glu Asp Ile Phe Gly Glu Leu Phe Asn Glu Ala His Ser Phe Ser Phe
    50                  55                  60
Arg Val Asn Ser Leu Gln Glu Arg Val Asp Arg Leu Ser Val Ser Val
65                  70                  75                  80
Thr Gln Leu Asp Pro Lys Glu Glu Glu Leu Ser Leu Gln Asp Ile Thr
                85                  90                  95
Met Arg Lys Ala Phe Arg Ser Ser Thr Ile Gln Asp Gln Gln Leu Phe
            100                 105                 110
Asp Arg Lys Thr Leu Pro Ile Pro Leu Gln Glu Thr Tyr Asp Val Cys
        115                 120                 125
Glu Gln Pro Pro Pro Leu Asn Ile Leu Thr Pro Tyr Arg Asp Asp Gly
    130                 135                 140
Lys Glu Gly Leu Lys Phe Tyr Thr Asn Pro Ser Tyr Phe Phe Asp Leu
145                 150                 155                 160
Trp Lys Glu Lys Met Leu Gln Asp Thr Glu Asp Lys Arg Lys Glu Lys
                165                 170                 175
Arg Lys Gln Lys Gln Lys Asn Leu Asp Arg Pro His Glu Pro Glu Lys
            180                 185                 190
Val Pro Arg Ala Pro His Asp Arg Arg Arg Glu Trp Gln Lys Leu Ala
        195                 200                 205
Gln Gly Pro Glu Leu Ala Glu Asp Asp Ala Asn Leu Leu His Lys His
    210                 215                 220
Ile Glu Val Ala Asn Gly Pro Ala Ser His Phe Glu Thr Arg Pro Gln
225                 230                 235                 240
Thr Tyr Val Asp His Met Asp Gly Ser Tyr Ser Leu Ser Ala Leu Pro
                245                 250                 255
Phe Ser Gln Met Ser Glu Leu Leu Thr Arg Ala Glu Glu Arg Val Leu
            260                 265                 270
Val Arg Pro His Glu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Met His Gly Ala Gly
        275                 280                 285
Asp Ala Lys Pro Ile Pro Thr Cys Ile Ser Ser Ala Thr Gly Leu Ile
    290                 295                 300
Glu Asn Arg Pro Gln Ser Pro Ala Thr Gly Arg Thr Pro Val Phe Val
305                 310                 315                 320
Ser Pro Thr Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Ser Ala Leu Ser
                325                 330                 335
Thr Ser Ser Leu Arg Ala Ser Met Thr Ser Thr Pro Pro Pro Pro Val
            340                 345                 350
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Ala Leu Gln Ala Pro Ala Val
        355                 360                 365
Pro Pro Pro Pro Ala Pro Leu Gln Ile Ala Pro Gly Val Leu His Pro
    370                 375                 380
Ala Pro Pro Pro Ile Ala Pro Pro Leu Val Gln Pro Ser Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Ala Arg Ala Ala Pro Val Cys Glu Thr Val Pro Val His Pro Leu Pro
                405                 410                 415
Gln Gly Glu Val Gln Gly Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu
            420                 425                 430
Pro Pro Pro Gly Ile Arg Pro Ser Ser Pro Val Thr Val Thr Ala Leu
        435                 440                 445
Ala His Pro Pro Ser Gly Leu His Pro Thr Pro Ser Thr Ala Pro Gly
    450                 455                 460
Pro His Val Pro Leu Met Pro Pro Ser Pro Pro Ser Gln Val Ile Pro
465                 470                 475                 480
Ala Ser Glu Pro Lys Arg His Pro Ser Thr Leu Pro Val Ile Ser Asp
                485                 490                 495
Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg Lys Gly Ile Gln Leu Arg
            500                 505                 510
Lys Val Glu Glu Gln Arg Glu Gln Glu Ala Lys His Glu Arg Ile Glu
        515                 520                 525
Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr Ser
    530                 535                 540
Asp Ser Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asp Glu Val Asp Trp Leu Glu
545                 550                 555
<210>11
<211>507
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>11
atgccgctag tgaaaagaaa catcgatcct aggcacttgt gccacacagc actgcctaga     60
ggcattaaga atgaactgga atgtgtaacc aatatttcct tggcaaatat aattagacaa    120
ctaagtagcc taagtaaata tgctgaagat atatttggag aattattcaa tgaagcacat    180
agtttttcct tcagagtcaa ctcattgcaa gaacgtgtgg accgtttatc tgttagtgtt    240
acacagcttg atccaaagga agaagaattg tctttgcaag atataacaat gaggaaagct    300
ttccgaagtt ctacaattca agaccagcag cttttcgatc gcaagacttt gcctattcca    360
ttacaggaga cgtacgatgt ttgtgaacag cctccacctc tcaatatact cactccttat    420
agagatgatg gtaaagaagg tctgaagttt tataccaatc cttcgtattt ctttgatcta    480
tggaaagaaa aaatgttgca agataca                                        507
<210>12
<211>169
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>12
Met Pro Leu Val Lys Arg Asn Ile Asp Pro Arg His Leu Cys His Thr
1               5                   10                  15
Ala Leu Pro Arg Gly Ile Lys Asn Glu Leu Glu Cys Val Thr Asn Ile
            20                  25                  30
Ser Leu Ala Asn Ile Ile Arg Gln Leu Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Ala
        35                  40                  45
Glu Asp Ile Phe Gly Glu Leu Phe Asn Glu Ala His Ser Phe Ser Phe
    50                  55                  60
Arg Val Asn Ser Leu Gln Glu Arg Val Asp Arg Leu Ser Val Ser Val
65                  70                  75                  80
Thr Gln Leu Asp Pro Lys Glu Glu Glu Leu Ser Leu Gln Asp Ile Thr
                85                  90                  95
Met Arg Lys Ala Phe Arg Ser Ser Thr Ile Gln Asp Gln Gln Leu Phe
            100                 105                 110
Asp Arg Lys Thr Leu Pro Ile Pro Leu Gln Glu Thr Tyr Asp Val Cys
        115                 120                 125
Glu Gln Pro Pro Pro Leu Asn Ile Leu Thr Pro Tyr Arg Asp Asp Gly
    130                 135                 140
Lys Glu Gly Leu Lys Phe Tyr Thr Asn Pro Ser Tyr Phe Phe Asp Leu
145                 150                 155                 160
Trp Lys Glu Lys Met Leu Gln Asp Thr
                165
<210>13
<211>180
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>13
ctgaggcagc tactggagaa ggtgcagaac atgtctcaat ccatagaggt cttggacagg     60
cggacccaga gagacttgca gtacgtggag aagatggaga accaaatgaa aggactggag    120
tccaagttca aacaggtgga ggagagttat aagcaacacc tggccaggca gtttaagggc    180
<210>14
<211>60
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>14
Leu Arg Gln Leu Leu Glu Lys Val Gln Asn Met Ser Gln Ser Ile Glu
1               5                   10                  15
Val Leu Asp Arg Arg Thr Gln Arg Asp Leu Gln Tyr Val Glu Lys Met
            20                  25                  30
Glu Asn Gln Met Lys Gly Leu Glu Ser Lys Phe Lys Gln Val Glu Glu
        35                  40                  45
Ser His Lys Gln His Leu Ala Arg Gln Phe Lys Gly
    50                  55                  60
<210>15
<211>44442
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<400>15
atgcacccgg cccggaagct cctcagcctc ctcttcctca tcctgatggg cactgaactc     60
actcaagtac gtgcatccaa cgccattttc ctccctgcca ggcgcccggc ccggcccctc    120
gggagcccca caaagtccgg gaacggctct ggctccgcgc cgccccgcgc ccccggcctg    180
ggcgcccgaa gtgccggggt tggggagggg gccagggcgc taggctggac ctgggtggga    240
gggaggggtg caggctgacc ggagacggcg ctcctccagc cccggctcag cagagctgac    300
agctgccccc tttttcctag gactccgctg cccccgactc cctgctgaga agttcaaagg    360
gcagcacgag ggggtctttg gctgctattg tcatctggag ggggaagagt gagagccgga    420
tagccaagac cccaggcatt ttcagaggtg gcgggacctt agtcctaccc ccaacacaca    480
cccctgagtg gctcatcctc cctttgggca taacgctgcc cttgggggct ccagaaacag    540
gcggtgggga ttgtgccgct gagacctgga agggcagcca gcgtgccggc cagctgtgtg    600
cattgctggc ttaatatgca gggcttgggg ggctgtggcc acatgcccgg caggaggtga    660
gtgaggagcc ctgtggcgtg ctggtgtggg gatcgtgggc atttcaaacg ggcttgtcgt    720
accctgaaca atgtatcaat agagaaaggt ctctgcttgg tattctccat tttaaagatg     780
catattggag ctggcaggtc ttgggggagg agaagggctg tctgtgagcg ccgaactggg     840
agggttgctt tggcactatg gtgctcggaa gagcctgcca gccgagggag ccgggctgct     900
tgggagtgac attaaaatgc cctttcaatg atgccactgt gccacgctct gaactgggag     960
actctggccc tttggagttg caagtccagg aagtgatggg cagccagtac cttggcccca    1020
agccccagct gcccctgacc cttctttcct tcctcccttc ctccatctcc ctcagaataa    1080
aagagaaaac aaagcagaga agatgggagg gccagagagc gagaggaaga ccacaggaga    1140
gaagacactg aacgagcttc ccttgttttg cctggaagcc cacgctggct ccctggctct    1200
gcccaggatg tgcagtccaa atcccaatcc agcagtgggg ttatgtcgtc ccgcttaccc    1260
tcagagccct tctcctggtg ctgcccagac gatcagccag tccctcctgg agaggttctg    1320
catggcctct aggagaggtt ttcttggccc caggaaggcc tggtggaggg tggtggttgt    1380
gcactgttgc tggacagatg cattcattca tgtgcacaca cacacacaca catgcacaca    1440
caggggagca gatacctgca gagaagagcc aaccaggtcc tgattagtgg caagctgccc    1500
cacaaagggc tatgcctgtg tcttattgag acaccttggc aaagagatgg ctgattctgg    1560
gtggtcctgg acatggccgc acccaagggc cctccaagcc ttaatggcac cctgaagcct    1620
ccatgcccag gccaaaagat gcttttcctc cctaagttct cctctttgtg tctttttaaa    1680
gattccctgt tctggggaga aacttttggt tcaacttcaa ttagaagcct tgtctcagtg    1740
gtgaaagtat ttgtccatcc acacgaaggg tgctggacat ccgaacccca gccagcccct    1800
ggtcacaccc ctgcatcctc acaccttaga gtcagggccc agccagccac cttcaggacc    1860
ctggtcagct ccgccagccc acagcctccg cgggtcagga agggaaatgc tgctgttttc    1920
tttgctggcc tggcatgttc ctctctctga agctgaacca caggctgtct caggggaatg    1980
tgtcccttga ctcagccagg aggcacctcc caccctcatg gtacagctcc accttcccca    2040
ggctggcttc tgataattgt gctttcggaa tcttgcattg gaggccagtt atcctaatgt    2100
gttgggattt tggaaaaaag cctcagcagg tgaaatcacg tcaacgtttc tgagtctctg    2160
aagggggcag agagtggctg gctcagcacc agcacccgag agcctggcta ccctagtccc    2220
cacctgggtg ggccccactg gggttatgcc aggtgacttt catctttgac ctctaagatg    2280
gcatctgggg tcgggaatgg gtgtgggggc aggaccagcc tgctctgatt ccaagagcta    2340
ctgggggaca tccatcccca agcatcttac tttcttgatt ccaaagttat gcgttgcggg    2400
ttccctgagc aatgctgctc atatttgtga gtgagtgaag aagcatgtct gggcttcagg    2460
atagggtgct ggagctgcct ggtgtctgcc tcccgcttcc actgtaggta aattgctcca    2520
acagccacat ccttgctttt agctccttcc aagggatgga catgcgattc tagggccact    2580
gtgtttctaa atgagcatac gtcgacataa gaagatgtca gaaacgcctg gatcctacct    2640
gcacttaaga aatgctgcct ggaggattca ggcggacagg cagggggagt ggagcacatg    2700
gcggggccat ctgttctccc gacagcttac ttacgatgag acactcaatc aaacaccaac    2760
cgttgatgga tggcctacga cacgcaaggc tgtggggcca ggtgaacttt gtcctcagac    2820
agaaagacat ttcacatggt cttgctctgt gattttcaac aaaagactgg tatttcatgc    2880
tcttagagaa gcagggtaaa gtggcatggt actgagcttc cggggcaggg tccagaggca    2940
ttgatctctg ggccttgggg aaggtggggc agggcaggga ctccctgggc tccaggccca    3000
ccgccacacc ccccaggctt cccttcagag tgaagaatgt tttttgtacg tgatagggta    3060
aaaggggctg ggaagctttg tagcaacaac cttgaaccca gatggcctca ttctcacccc    3120
gatcccacca gacactggct gtgtgacctt gagaaaggcc ctttaacccc tctgagcctg    3180
accttccttg tttcacaagg aggattaaac aagatgattc ttgagtaaaa tcccttcctg    3240
ctacagaccc ccaaccccat tctttccttg gctcactcat cctctcctta gacaagcatt    3300
tcctgggtac cagctggtta gatttaactc ggtcaattct gggcttacaa tgttaagtga    3360
gtccaaaccc ttgccgcttg gcacctgggg ccggcttgct ttgagggaag accccaggct    3420
ctgccataat catgtgtttc agtggcaaaa gaagtgtctg caccgagtgc tctgggtagg    3480
agttggggag tgagttctgt tttggaagct ggaggcagct ctggagaagg aggatatttg    3540
atctgggtcc aggcttgcac ctgggtccac tagtgagccc gggggaaaga agaagaggac    3600
agaggctggg tacggtggct cataccttta aggccagcac tttgatcact tgaggtcagg    3660
agttcaaaac cagcccggcc aacatgaaga aaccccattt ctactaaaaa tacaaaaaat    3720
gagcagggcg tggtggcaga cgcctataat cccagctact caggagactg agggaggaga    3780
atcacttgaa cccaggaggc agaggttgca gtgagccgag actgcaccac tgcactccag    3840
cctgggcgac agagcgagat tctgtctcaa aaaaaagaag aagaagagga cagaaatggc    3900
tgcagacaga ggctgcagca ggaagaaggg cctggaaacc ctgactctca catccaatgc    3960
tcaatccacg tgggttgagg gtatttgaag tgtttgaaga tggaagcgga gctctcctca    4020
ttagccacgc atccccaggc cgggcctggc ctttcctaaa acatgacacc cctggatgcc    4080
cctggtgggg ttcaagctgt cagtgaacac agaacaggct tgagtggcaa ccgtcactgt    4140
gactgtttgc cttcaggttt tattgagtga ctactgtttg ctgggtctcg gagttgggcc    4200
agctgtttgc cagtctaggt gcctgcattg agaagtgggc agacccggga ctgcacttgg    4260
ggagttgtgg gttggtgtga acagggcaga cgagaagacc agggaggtga tgctgactta    4320
ggctttcaga gaaccccagt gaggcccatc cctctgaatc tgttcctcat ccccccattt    4380
agctcattct agagctgaag acctcacttc actgccctga gcaaatccaa caagtagaaa    4440
cggctaaaca cttttacctg ctgcaaccta agcttgggcc aggtggtctg gatgagctgt    4500
cttgtccccc tgccaggccc tcttcccctc cagcttctct gccccctctg ttttggactt    4560
gctgggagga tacagtgttt gtagaagggg atggagtgca cgggtagggg gaagagttca    4620
ggtgaaattg gggtcttttc ctaaacccat tatttcagaa tacgtggaat tcattcagtc    4680
tttgcaccaa agttggctgt ggcctctcag gctggcaatg cctctggaca cacggaggga    4740
gaggggcacc ctcccctttc ccattctccc gggctgcctc ccctggtgga gaggctcctg    4800
acaccagggg cgctgagctg tcaatcctgc ccatgagaca gctgctccgt ctcctaaagc    4860
aatttgcttc tcattccact gacttcaacc ttccccaatc agaagaaagg taatttcctg    4920
ccttgggttg tatttattac taaagttatc aggccctgta atcagtatta acatcaccgt    4980
gtaaagtaat acaaaactaa ttactagcta aactgaatta gatacatggc aaccacgagc    5040
taggctgaca gggcgagcag ccaatttcca gctctgaaag attcgtcctg gacaccctgc    5100
acgctcggaa acctcagcgc tgtcccgact ggcaccgcag ggcgaccgaa gggaggggaa    5160
gagagaacag gaagtaaaaa tgcacacctc tgagtttttt tagattatta aaataataat    5220
ctaaatatta taaataataa tgatagtaaa taatatacta tataagataa ataatgtaag    5280
aaactggagc ccgcccggag ttaaagcccc aggaatcccg ccagtggcga ggactgatac    5340
cgcatgtcac gagtgtaaac tttatcatgt tgcggcggtc ccagcaatcc tgggcagttg    5400
tccccattct tgacctgagg acacacaggc gtggggaggt taagcagcct gcccatccac    5460
ccagcacata tgtgatgacc ccagatggtg ctctaggtct gtctgacatc tgagaaacct    5520
aagttctggt gcttgttaag acagaaagaa aatgcaaagt cgaaaaacag cgcagtgtca    5580
ccgaacacca gtgcaaagga ggtgctggtg ctgctgccgg gtcgccgacc tctgtggaat    5640
gcaccacaga gcccatcagc tgtgcctttc cgactgtgtg gacacgtgca cggccggctg    5700
ctgaccttga aaacgggctt ttgaaggaga aagcagggca agaaggaggg ggtccgcttg    5760
tggtttcctt gcaacccctg aggatcaaag accccagcag gcccgtccac cccttggaaa    5820
cggggatgca tctaggagtg cctgccccgc tgcctcagtt ctctggagtg taaggttagg    5880
ggttacgtag gcagccctgt gcccgttaaa tgtctcagca tgtgcatgac aacttgagat    5940
ccaagaagtc agaattaggg gccaggcgca ctggctcatg cctgtgatcc cagcactttg    6000
agaggccgag gcaggtggat cacttgaggt caggagttcg aggccaagaa gtaagaaata    6060
ggatctacag gtcctgagct aaggtggcct ctcagtgagg ctctaaactg cccgacacgt    6120
gcacccgaca cgcctgcggg tccggtgacc ccctttgttg cacctggcat gctttgcaca    6180
aggtggctgg aggggctgcc atggagagaa tccgctgcgt tcgaactgac ccgtcctcgt    6240
gtgtggctgc tcacctggag aaggtttcct gtccctgctt cttctgtgct cgtgtcaaag    6300
ctcacgcccc tgcctgggct ccagctggtg atggcagctg cagtgttagc agacctgctc    6360
gccccaaaag gacatcccag cagcagggat cttgcccgta tattccttat gcatggttca    6420
atgacagtta aaatctgatt ggagagtgtg tagccatgaa aagttgagat gaaagagtgt    6480
aagggggaga tgggaatgag gtcggctccc cagcccttgt ccacattcag atcagcagtt    6540
cacagcatcg ctttgggccg tccctaaagt ggttccattc cagctagtgg ttttaggtat    6600
acaagttgtc ttcggggagt ttaaaccctg ccgcggggat ttccctacca tacaaaatgg    6660
ctctcctgag tggtgctgaa aagaaagtct cccccacttg cttctggtga tgcttcgggg    6720
gcctaagagt caaagaaaga acatcagtgt attgtaaata actttactcc atgcactgaa    6780
ggatgtggtt tttgacagtg cagtgggact cagaaatggg gagccagcca tttaccaaca    6840
atttggctgt caacttgagt ccttgaaccc ctgcccagcc tccttcccag ccccaaatat    6900
gcacacacag gtttccgttc ccaggccact cagcctcagc atcttgtccc acagatgcac    6960
agactgagtc agctctgagt ggcagcaggt gaggggtgtt gacggaccca ggggtgcttt    7020
gttccatcag caatacaaag gatgatgaaa caggagattc tcccaggggc tgcagcagtc    7080
ttggtgagag gtggctaaga acgtttccga ggccaagtcc aggctccaca gggcaggccc    7140
catcagtaat gcccgggagc ctcctgtgca gaggccgggt gtcgtctgga tgcaaagaac    7200
tttgtttgga atctggcagc accaaatcct tggctgtaag caaatggtgc cacctggggc    7260
attttccaca ttcccagctg gaccctggga ttgactcttt gatgtttctc atcatgatgt    7320
cacctttgaa ttcatgtcag gatcaatgac tgattccaca gaaaccgggc tgcctttccc    7380
aattagttac ggtgagtttc ctcacctggg aagtaggaaa tgattatgtt tgtggggtcc    7440
ctgaaaaacg tgcattcagc ccagagggtg acgtgtctgc tgaattgtct tgtccctgtt    7500
cttcaaagta ccactcccag aattggcctc tttttccatt cggcaactaa gggaatacag    7560
agctgtggct tcccttggcc tggctgtggc caggctgaga cgatatccat gaaagaggcg    7620
tggaacctgc cagggagagt gcggagggtg catgaagggt ctggggggat gggggccgtg    7680
gacaagtcag ctctctggat ggacaaggaa ctaggactga agagctggac acgaggccaa    7740
ctgctgaatg gaggaaacgt cccccagcaa cagccatggg tctgtgggat gctctcccca    7800
gggcaagtag ctccccatca ctgtcactgg gggacttgaa gagctgacac tgagggaaag    7860
ggggaaggac gatacctcgg aggaagttga atctcctggg tcggcagctc aggccagccg    7920
tgctcacaaa ccccaagcac agtggctcat gatggcaacg gtgtgcatag ggcacaggct    7980
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ccctctctgg atctgttttc ctcatgacag aggcagagag acagggtgtg actgagacat    8100
ttggctctga aagctgctca gtcgtggccc ttagccgttc tccctcccgg ggccaaaatc    8160
gcaggtcaca cagccacgcc tgatgcaggt ggtgtttggg agactgtcag cttatgggag    8220
gtgctgccag gcacagggag ccgggccagg atggaaatcc tctccaggga agggggtgag    8280
gagcagttac gcctccaccc atgtgtgaac ccagaggcct cagaggaggg gagtacaggg    8340
aacacttggc tcagaagacc catgctggtc ttctgtggct gccgagaggg agtgcccagg    8400
ggacctgtgg ctcctcccat tctgcctggc ttgaggccag gtcctttcct tgctcctgga    8460
atgttccagc acagaaaggg aatgaaaaag ctacatacaa cgttagaaaa aggagaggtg    8520
gctccatgtg ggacctctct ctgtgtctct tctctctctg tgtcactcta tctttcttct    8580
ctctctctct tctctctctg tctctcatct ctctctctgt ctctcctctc tccgtctctt    8640
ctctctctcc tctctgtctc tattatctct cctctctgtc tctcttctgt ctctcctctc    8700
tgtctctatt atctctcctc tctctgtctc tcttctctct gtctctcctc tctctgtttc    8760
tcctctcttc tcctctctct ctgtctctct ctccatttct ttgtcttcct ctctgtctcc    8820
tctctgtttc tttgtctttc tgtctctctg cctttgtctc tctctctctc tcttcttctc    8880
cccttctccc tccctttctt cctcccctcc ccttgtttcc cttcaagata tttgccaata    8940
gcctgaggag agtatgcgta tttttaaaca gcaaccgggc atccaaactt tgtcccttga    9000
gggcatcctt tgccaaggag catcgggaag tggcccagag acctgcttcc ctccaagcag    9060
ccactcctgg ctctgggacc tgagtaggtt tgcatcctgc ggacctcact gttctgactg    9120
tgggtgtcag tggtcgtctg actgtgggtg ttggtgtcgt ctgtgcccta tcagctcacc    9180
atgtggctgt cctagggctt ctcgaggtga ttccccaata gcccacgtgt gtccgcctct    9240
tgtaaggtct atagcaagct gggcaggagc accctctcac acttgcgtct tctgagctct    9300
gaagccggga gatgcagagg gggtgtgctt gtttttatgt gtgttgatga atttgtacag    9360
agtccaccaa ggtcaaggcc tgtagggggc tggcatgagg atagagacgt ggctgttcta    9420
acctgtcatg acagggaggg tggtgcaggc tcgtgccagg actcagaaag gggtgggcaa    9480
cctcctgtcc ttcccacgag cgtggaaggc aagggcccat gaaatgtctt ctggcggcct    9540
ctgtggctcg tggaactgtg cggacagcca gggctgctgt ggccatgcaa ctcatgccac    9600
ttctggggct cgtgagattt aactatggcc atgacattta taagacgagg atgctaccat    9660
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tctttctagg cctgagattc ctcatctata cagtggagtc aatgccacca caccatgcac    9780
ttcagtaagg attgggtgcc aggcatggca aagccccagt gccaccaggg gcgcagcacc    9840
tgccccatca gcatccgtat gattgttcag agctgcaggt gtgatgagcc ctggctttaa    9900
gagaagtcgt gaagaaattg ggattgaaag tcctctttag gaacacttgg tattgcctgg    9960
cgccatggat cccctaatcc aaatgccttc attcttcaac gatccatact ttccttctgg   10020
aatgctccat ggccttctaa atccaattac acttactcaa gccttatctg acgacccttt   10080
caaaaccatt atgcccactg aatcacagat tttagaaact ggacaggaca gtttggagca   10140
ggtgcaggtt ggagccgctc aggtgcaggt tggagccgct caggtgcagg ttagagcagt   10200
ccaagtgcag gttaatcttt tacttcgtta aataaataaa tgtctatggc ttctgagatg   10260
gcctgacagt tttgtggatt ggattgggtt gcatttgaat ttgttcccgc agaacaagtg   10320
gtccttgtcc ttccgcagcg ggaagcggcg tgagtgatct ggacagacac ggcttgtggc   10380
cttgaatcgg tgttaaacat gcatggccag aggagggggg cgaagccagc ccaaccggac   10440
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gattacagca ttaatcagaa aagcagatct gaggggctca tttaactagc gggtctcaca   10620
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gcgctccttc cggcccggcg tccgtctttc aaatcccatc caggaaggga gattaatttt   10800
cgcccaggca gagaagagtg tagtgagtga tctggaggat tctttccttc ccaaatggct   10860
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tgacacgcgt gagtcctgct gcggtcgccg cagagggccg ggaagagggg cagcgtgcgc   11040
cacttgccct gcctctgtgc ctgggcgcca tgactcgagc gccacccctg agtcagtaag   11100
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cagaccttat gcagctcctg ccgggtgtgc gccctcccag ggccctcact gcgcaccgcg   11280
ggccacggca gaccacccca gccccagcct tgctgtgcag gtgtcaggag tgccggttgg   11340
ctcccttcct cccaagcaag gccttagggc accgcggctg ccctgggatc gcaggggcgc   11400
ctttagctct ccaccgatgc cccgacgccc ccctggcgct ggaggccctc gcgagtctgg   11460
ctgcttttcg gagcctgccc tgcctgctgg gtttcaggcg acggcccagg ctggctggga   11520
ccctcgaatc accgcggaaa agggctccag taggcaggac ggcgccgtct ctctgccggc   11580
aacctttgcc ccaaagcgga ccctctgcgg ggatcggaga gggatgcccc ggcgtgagga   11640
tgggagaagc cccgggacgg gagggccgcg ggccgtgccc ccagctggag tccccgcgcc   11700
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tcccaactcc tgggcggact ggagtttgca gacctcgctg ccagcagcca gggggcggcg   11820
gggagccgag cgagaggaaa aatccaccca tttcctgggc ggattgcgtc ggtcccgccc   11880
ggccgagccc cgcctcccgg ccgcggcccc cgcgcgcagc ccgcgcagcg ctcagagccg   11940
gacggcgctt cccggtggcg gcggaggagc ccggagggac gcagccgggc aaggcagggc   12000
gcagggcggg cggcgcgagg cgcagggcgc ggcgggcaga ggccacctgg ccaccttccc   12060
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ggcggcggcg ggcgaggggg cgcggggaca cagccaggcg cccctgcccg cccggtgccc   12180
gccgctgaag gccgcctggg cgcgggagcc ggtgccagct cggagcgggc gctggaggca   12240
gctcgaggcg cgatgtcggt gccgctgctc aagatcgggg tcgtgctgag caccatggcc   12300
atgatcacta actggatgtc ccagacgctg ccctcgctgg tgggcctcaa caccaccaag   12360
ctctcggcgg ccggcggcgg gacgctggac cgcagcaccg gcgtaagtgc gcccgccggc   12420
cgccttggcg cggctcctcc tcctcctcct cctccccctc ctcggtccgg agccccgggc   12480
tgggcgggcg ccgcgcggga cccgagtcgc ccagggaggc ggcggggagc agggcgggca   12540
agggcaggcg tcgcgggccg gcgcagcggt ggcgaccctg ctccccgctc ccccagcctg   12600
ggccactcca tctccgcccg cgcgcccctg gggcggcgtt tccttcgtct gggcccctcg   12660
ccgcggggcc gggggagctt ggtgggttct cggaggcttg gagtcctggg tcagtaatca   12720
tgagcccccc attgaaaagg ttaggaaact aaggctgggg acttggggac ttgtccaagg   12780
tcacactcag cgagtgaggg gtggagccgc cgctagaccc tagtctgggc tcggtccagc   12840
ggggactgag cccgccctag tttgtaaaag ccagactggc cggaccgggc tgggagtggg   12900
gccccagccg gtgggctccg gagctcctgc ccgcgcctgc attcccaaag tcccaaggcg   12960
ccctttcctc cccagtccat aggagggttt gttccttctc ctccgaggac ggtgccgagg   13020
ggcttgggtg gggcccctgg gagcctgccc ttgggcgctc accccctcgc ctttgccttc   13080
gtcttctgcg cgcacccctc cctcctggcc tctgaaattg aaatcgcgtc tccctctcga   13140
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gagcgaggct gagctgaaac cgccacccgg agggccgcgc ggggaagggg ccgctgccgg   13260
gaaggcgcgc cccagaccac tggcccttta ggctgaaagg agaggtgaag gacgtgagtc   13320
tccctccctc tctctttttg ctgccagggg tttagtgccc tgcgaagagg gctccgtggt   13380
gtggctccct cctaagaccc ctcttgaggc cgccctccct gctccttcag gaatcggagg   13440
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tgaatgagat taaagatatg actactatag attctacccg cccaacttct cctccccatc   13560
ttcatgctaa aaatagcaga gagatgacct gatgccaccg gaggggagcg tgctcagaga   13620
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gcagggctgg gctgcaaggt tagaccagac atgggcagct ccggtttctt tggtgatctt   13740
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ggcgacctcc accaaatggc tcgtgggggg agcccacaag gagctggaaa cctagtgttt   13860
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ccttgctcct agtccagcct gtggcctcca gttgcccctc ccatccaccc agcagatcaa   14160
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agggtcttgc ctctttgaca tccttccagc cctgagcccc ctaacaggag acctgtgcct   14280
ctttgttccc agggaccctt tcttcccttt gggtcaaaca tgtcttggga ccatttcctc   14340
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aggtgtatct gcacagtggt cgctccacag cagaccatgt gttcacggga tgcccgcaca   14580
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atttgtgaat gagtgaaagg gtggatggac ggatgggtgg atgggtgggt ggatggatgg   14820
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atggtgagac gggacacaag gctcgtctct gagtgatgtc ataatctgtg tgcacagggc   15000
tggggctgtc acccagcagc taccttggag agcgcccgtg ggcccaggaa tgcatggcca   15060
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gcaggacagg aaccccatct gcctgcttca gggcactcag ccctcctggt ctgtctcctt   27120
tgttgcccag agacccctct gtctctggcc tgaggtcctc agtgggcatc tccccgggcc   27180
tgttctatga gatcgtccat gctgctgcgt agaagtggcc tcctcttgtg aatagcaaga   27240
ggcagattgt ctcatccgca ggggcatcag cttgtccagg ctcccggcct tgcacagcgc   27300
tctgccctct gagcccgtct ggggccgtcg gggggcctct gcccctccag ctgagcatgc   27360
tggccctcca agcccaggcc ttcctaggag agagagcccg tttgggccat ttcctgagcc   27420
tccaacagtg caggaagccc ggccagccct ctcctgcctc tcccctcctc ttccctcctt   27480
gtgtgtgcat cctgagtgct cgtgactgga gagggacgct ttcctgaact gcatgtgcca   27540
agattccact gaggctctgc catgggcttt tttggatcct gtcagttcct gaggtcttgg   27600
cagaagcagt ctggatggag aaccaaaaat aactccctga ctcaaggagg gcaggtggcc   27660
tccagcccca agggccctgg gagctgtgcc tacagccagc agttggaaga tcagggtgca   27720
gagccagcct cacccttccc tgcccttgct aagccaggat tttaaggctc atttcaaggg   27780
gtcacttttg catttaaaag agggagctgg agagggtgat gctcagctct gagccagtgg   27840
ggcccatgca ggagggaaga gggagccctt ggcccacggc agggtgggcc tggggcagag   27900
ccgccctctg gagagcagaa ctgcaaggtc cagggtgggc gggatgaagt gggaggggtg   27960
aagaccacgt ccacttgggc tcgccttttc tgcacatcct caggctgaat ccccagtgat   28020
gcctcctgac ctctgtggag ctctgactct gtggcaggtg ctgtcccaaa agctctctgg   28080
tggtccctgc cctaattctc acagcagcct tccgaggggg cactgttgtt attagcccat   28140
ctatagagaa ggagagggag tacacagcag cccccaggga agagggtcac cctccctcct   28200
tcactgagac agagagtgaa gccttcgact tgggaggctt ttctgagcaa tgagtcattc   28260
gttcattcat taattcattc catacaaatc cccaggctga gttttggagg aaacagggtg   28320
agtgcaggaa gcttcttccc tggggcagta agacccagac attccttggc agccccatga   28380
gatgtacggt gggaagctgg ctccggctgc agtgaggaca ggcagaccag gcaaagtgaa   28440
ggaagggcac gtctttaggg cagaggtgtc agtttggggc aagccagtga aggtgggtgg   28500
gaaggtgggg ctggggccgg cacaccaggt ggagggacag ctggagcaaa gctgcgtgaa   28560
ccagcagggc ggggctctgg ccaggcggcg gagaggagcc cagcactgac ttgctgcctc   28620
tggcctctgc cggctgcctg caaggtggag ggcagacacc tggtctcctt ccggtaggtc   28680
atgcgaccgg gatgagtctg ctgcgggtgt ggttccgggc gttagtgtgg gccagcgtca   28740
cggaaggccc ggcgtgttga ctgaggaggc tgaagtggcc agagcccgtg tgcgctgctg   28800
gatggaaacc cagcatgggg ccgccactcc tctaggcttc tccttccgga caactaacag   28860
aaccacggcg tggaaagtcc tcacgggatg ttcacagggc caaggcactg tcttagggga   28920
caccagcctc tggatggcag ggagggctgg agaggggctg tgaagggctt ctcccagcgc   28980
ccacccagtg cagagggagc tgctgtctcc cccgaagccc agggcccccc agcagccgga   29040
gggtgagccc agccatggct cctccctccc acctcctgcc tcctgctcct ccagggcctt   29100
agtgaagccg ccctgagctc cacctctccg ccagcgagtt gcactggggt gaaaatctgg   29160
gccgggctct cctggaagag gagtctcttg tgagacttct cagacccccc acatcttctt   29220
acttctcgtc cccatagacg ccggtcagct gtggccatct cctctccatc cctttcttct   29280
gctgcttctc ctcccacaga tggggagcat ggcctggccc agagcccgtg tggaccacgg   29340
ccgagaagac cctggcagcc tctcacccgg ccccactgcc aggaagcctc cagccatgag   29400
gggacaatat ttacttggga aagcacataa ttcctcctga aagtaggaat ggggaactac   29460
gcacggagga ggaagggagg gaagggctgt gacatttctt cttccaatcg gggcagaggc   29520
ggcagcccgg gagccaggtt gccggggcct tggagcaatg cagcccgact cgatgggaat   29580
ttgggggcaa acccagtctt tttctgtggg cagtgggctc ctcgtccctc tgaaagccct   29640
ggtgcccgga tgcacgctct cccaccaacc cacagaatcg gagacgcctc catgccggca   29700
gggccgggag cgttcctctt tctggtcttg tgtgatgcca gtaacaggcc acttccagtt   29760
gggagagagt gggaggcacc ctgagacccg cgctgagcat gggagtggcc aggccgcgtc   29820
ctcccggggg ccagcctgga gcctgcccca ccctgcttgc cgacaggatt atcctggctg   29880
agccgaggtc cgggcgcact cacccgcagt cttcccccac acgtggatgg cctctgaact   29940
cgtgtgctcg tgcaagccca ccgagggtgc cacgcagacc taggaggtca caggcgggct   30000
tggccgggag ggacagggca gggtgcgggg acttgtggtg gaggggccct tcctctaccc   30060
tccccaggaa agccacccac ttcccatcca gggtccctgt tagaatcagg agcgtttggc   30120
ccttcagagg gcggccgagg ctcgtgcatt ctggaagagc tgcgtggctg cgcagacaca   30180
ccggcctccg ggcaggagga gttctgttcc tgtgcagtgg gtgtggaagc cgccctgagc   30240
cctcgggggt gtggggggct ccagcctcag tccaaatcac cgggtggccc gggtgtgtcc   30300
ctcctcacct ccatggtcct ctgtgagacg ggagggctgc tgagatcaca tccaggatcc   30360
catccgccct ggtgcgctcc agcttgggct cctcccactg gcagaagcaa ccggctcacg   30420
cctgtgggag aagcgcgcag gctcttcctg cgggaaggca gctgtggcct ttgtcccggg   30480
tcagttccgg ggcggctggt ggtgctgctg ctccatcgtg ggacagggcc tgcctggatg   30540
cagtgtctca cactgggcct gactgtgccc cacgcgggct gggctgtcag ggcatgacct   30600
ctaatgccct tgggggtgga gccgctgcgt tcccatctcc aagagaagaa aattgagtct   30660
tggcaaagct gaccccctct cctagaggtg ctgctccagc acccccatcc ccaggccatg   30720
ggtccagcag gctgaggagg cgtgaagcct gggagggcgg ccgtctgccc acggctcttc   30780
cctgctatcc tggccacagc tgctctgttt tggggaggag gtggcttttc cgagagtggg   30840
ggagttgtct gtgaaaacaa gggcgtgagc agctttccac agtaccccag accccgaggg   30900
caagaggaga agccgccaca tggcacgtgt gctctgggca gtcgaggtca gggtcatcac   30960
cgcgggccgg ggcccccgcc ctccctctcc tgacctgcgt gctcttttcc agcttgcggg   31020
aagttgacgg gcatcagtga ccccgtgact gtcaagacct ccggctcgag gttcggatcc   31080
tggatgacag accctctcgc ccctgaaggc gataaccggg tgagtgtccc cttatgtcat   31140
agggggtcat ttgggcaagg gcgctctcgg acacctggtg ggccccagac atgggtacaa   31200
gccacgccca ccctccaggg cctatggact gggcagcttg gtgcctgggg gcgtttgttc   31260
ctggaagact ttcgggaggg acccaggcct ctatgctaat ccagagctgt agatcatggg   31320
ccagggagtg acatgaggtt gatggtatcc catgacatgg ctgtagaccc cttcaaggcc   31380
tcctccccgg cccggtgggc tgggctgggc tgggctgggc tgggctgggc tgggctggtg   31440
ccccaagtcc atttctctgg agccgaaacc cagccctgac ttttccggtc cttgcatctg   31500
cttcaggaag agaattcatt aggcctttct tgttttaatg acatctcatt tgtatttcat   31560
ttgccattcc tttcatggct gatggagact catgttcctt ttgatttagg aaagaggcca   31620
tgttcttttt tcccaggctt ttccccgctg ggtgaaacct cagaagagga gagagaaaca   31680
ggcatcatat ttgcctttat ctggggggct gggttttatg ttcgagcccc tttgaaaaat   31740
ggggaggtga gggtggctgc ccgactgatg gtgaggcccg gcctcgctcg gcccctgggc   31800
cccagacccc tgtatacagg cagcatgggc ttgtagactc cctccaaagt gagcaccctc   31860
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tgacctctgg ctgccagagt gggcatttct cacccagcaa ccccttcctt caggggtttg   31980
caggacactt agaaaataaa cacttaaaaa caaacaaccc agctctgccc tgggccgact   32040
gagaaaggcc ctttgaaatg tgagatcctc taagctttat ctggagcggg tttgaaggaa   32100
gggatggacc cagctctctc ccctctgatt tctgatctct ttgcctccct ccttcaccat   32160
tgccaccatt tccacgaaat ctcttatatt taaaacatgg gcggtacggc ctctggcaca   32220
ctccttcctt ccaggaagat ggctggggag gggaggggga ctggcagact tgctagagcc   32280
tgttgcatgt gtcttgatcc cccagcctcg catgggagtg gcccccgccc ccatctggaa   32340
gggctggcca gactgcagag ccgggataca attggtgttg ggtgtttgtc agggaggttt   32400
ttctgtcctg ttttctaaat tgtgacagct gaggcttgga agttttctaa caatttaatt   32460
agctgtgaag actctgacca ctcttttatt ccacatccca cctggaaaac cccacttatg   32520
ttcagagtta ggaacttgct cctgccacag atgtttttgt aatgatcata atacagaaga   32580
aaacaaggtg atgctggcag gcacttagaa agcaggcccg ggcacagtgg ctcacacctg   32640
taatcccagc actttgggag gctgaggcgg gcggatcacc tgaagtcagg agtttgagac   32700
catcctggcc aacaaggtga aaccccatct ctctaaaaat gcaaaaatta gccaggcgtg   32760
gtggcgtgca cctgtaatcc cagcgactcc ggaggctgag gcataagaat cgcttgaacc   32820
tgggaggcag aggttgcagt gagccgagat catgctactg cactccagcc tgggtgatag   32880
agcgaggctc tgtctcaaaa aaaaaaaaac aaaaaaaaca gcgagtgtgt cctgtgtgca   32940
ggtgctgtcc aaagcacttt cttttcatgc attaactccc ttaatagcgg gggaaggacg   33000
gggccttcat gcagccatct gcgtgccctt cctgctttgt cctccctggg acctgcctgc   33060
gtcggggtca ttggcatctc agtgtggatg acaagactgt tctcacgccc agaggcagaa   33120
gggtctcagg atcatggagt gcctgtctgc agcatgcact gacactccaa gccgagtccc   33180
ttataccacc ctccccctac aagtgccctt cccacacctc cccgcaatct ggcccacccc   33240
actatgcaga gcaggaaaac caccccacaa acccacgctg accacattga gatctgtgag   33300
caggaagcag tcacctccct gctgcagagg gcaaccccag ggctggactg ctctgtctgt   33360
atctaacacc ccccaggact ggactgcttt gtctgtacct tacacccccc agggctggac   33420
tgctctgtct gtatctaacg ccacacgtgt gtgcctcttg acttctgttt ttgtatcacc   33480
ttcctttgtc gtagggagca ctagtcaagt tatcgttttt ctaggtacca aggatctggg   33540
gctcctggaa gccccggctg tttgctttgc acagcgcagc gagggtgtgg gtttgcaaag   33600
ctgtcgcggt gctgatggat gcttttgatc attaggcatc tattttctgc ttgatgactg   33660
gatcgccctc caggaaaaga ggctctgatg gtgggtagag tgtggggaga agaagccgca   33720
ggagaaggga tccctggcaa gggggtgggg gagatgggtg ctggggctgg cagaggagcc   33780
acccggagcc tgctcagagc accctcggct acggccattc caagccatac gctcagcaca   33840
gcctccaact cccagtgtgc taagtgacat gtccccaggt cctgtcattg atctaggcca   33900
gccgtggttt gtttgttttg atcttttcca atctcccatt cagttttgat cacacacaca   33960
ggagcccaat aactcgctcc aaaaaaaaaa gaaaaagaaa tcaatgtcgg cttcagtgca   34020
ggctgccacg gagggcattg taaggcaggt gtggccaagg gcagagggga gaggttcaat   34080
ggggctgcct agtagagagc ccggctcagg gggacctgca gaatctctgt gttcgtgtga   34140
ccacaggagg gacggtcctg agccagcttc agggccttgc taagctgtca gaacaaggtt   34200
agcttgggac gcctttgcag caggtctttc tggattcatt tattaagcac tgactgtatg   34260
tccggcctgt gctgagcact gagagccccc aagttcttct cagcaggaag ccacccctgc   34320
gcttcccagg gcaccgggcc ccacagcccc tcctttcctt cccgcccgtc ccattgcctc   34380
agtgttggag gagggaaggg ctgtgtggag gttggccagc tctcaacctg atgcgtgaat   34440
gccctgccag gctgtgttcc cacccactgg gagaccacat gagttctggg accccttccc   34500
cagctcggag gcttctggcc tgctctgacc atggcctgcc ttccagagcc caacatctgc   34560
ctcctccttt ctgacccgct tcctataaaa gtctcaggtc agctcacatc agacaccaga   34620
caccaaaaag ggggccagcg ctactcccac caccccagga agttcatgtt tgaaggggtg   34680
atataattag gaaaacactg tcatttacaa acagcagcaa gcttagctta gcgtttcaaa   34740
gtcctttccc atcatctaaa cagcgtcaag gccatctaga tattttataa ggatcccacg   34800
gaatcttttt ttccagaagg tggaaatatc caaaatgcat aaaaccgtgt gggtgcaggc   34860
agtgatccgc ccgccgccag tggtgcaata aacatcaacg ccccttccag tcacttctca   34920
gtgtgaggag ggaccttccc aggaccgaga accgttgtct gttccccttc agccttcact   34980
ccccaagtgg agcctccggc agaaactgcc agcatccccc ccacctcttt cccaccaccc   35040
attcagctac gggccgcttt agagtgtctt ttccagcggc ccaggctcct tgatgttagg   35100
aattctgtca ggacgacatg tgacagatgc ttgccaaacc aaagggaagt gccagcgcgg   35160
gcccaagtcc ctacgccaag accccttaaa tagcatccgc ttcccacttc ccgggggctg   35220
catcagaggc atttgggacg gcagtgccag atctgtgccc atcgtccagc tctaccctga   35280
accgagaggc cctcttcact gggaagctga tgaaagtaat cgggacagtt aggaaaatcc   35340
cacgttctca gtaaactgca ccacatgtgg ctgaaatgcg gtgcagaggt tcagacagcc   35400
agtttttctt atatgggaag ctgtgttggg cctcggtttc ggagaagcct ggtcccctga   35460
aagcatggta tttacaaatg cattttgtgt ttgcgtgaga aggaagaacc cacccgttgc   35520
tttatctttt ccggcaaaga aaccctcatg ggttggggag gggatttggg caggaacttg   35580
gggccttcca gcctgtgtcg tcgaattaga gtgaggctgt gctcggggca gggtggcctc   35640
gctcgccgtc tggccgcagg ctctcaggga ctgtagcgca tggcccattg aactggagaa   35700
ggatgatcag tgtgcgagac ctccacgacc cccaggaggc ctgagtccag ccctgacccc   35760
ctgcttttcc tagatctcgg ggctgggaat ctgaactttc ctgcctgtgc tgagggtggg   35820
tgtgttgcgg agcttgggga catcagatgt caccagtgag ctcctgtgtg gggtccctgt   35880
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gggcagcacc agtggctcta atacaccagg tttcagctca tggcacacag cagcccgtcc   36420
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aggcacctgc agaagagtct ctggtctctg ctgtctaagg tccctgttcc ctccaggctg   36600
cactggcctt ctgttcccag aatgttctct ctggtctccc cttcctatgc ctggggaacc   36660
ccaagattct tccagcacga ggatttttgc gtggagccat ggcccctcat gaggtcagaa   36720
gctttgggag gacagggcct gtgtccccag cacctggaaa ataggagatg aatggtggcc   36780
cttgatggag cttggggccc agccttgggg ctctgtgtag ccaagacctg gggcaggatg   36840
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ccccaggtct cgctggagac tggcggtggc tggcggtgga ggcgcttctt ggtgccgcat   37860
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cacagtgagg cggcaaggcc tcccctccgg gctcacggtc aggtgggaga cacatgcccg   38040
atgccccagc acacgggtgt ggaagcccaa gaggtgccct gtggctgctg caggagctcc   38100
cacagcctgg ggggcaccac aggggctcac tgtcacccag tgctggaggc tggaagcccc   38160
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cacatggctc ctccctgtgt ctgtgtcccc tcttctgtct cttataagga cacttgtcac   38340
tggatttagg gcccaccttc atccaggacc agctcatctt gagattcttt tttttttttt   38400
tttttttttt ttttgagaca gggtctcact ctgttgccca tgctggagtg ctggagtgca   38460
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attacaggca cgtgccacca tgtccagcta atttttatat ttttagtaga gacgaggttt   38580
cactgtgttg gccaggtctc gaactcctga cctcgtgatc cgcccacctt agcctcccaa   38640
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gggcagcctg gggagggagg gaggggctgg ctgggcagca gagtttggag tttgggatca   39000
gaaagggtgt gtacagggga ctgggtaagg gacaggctgg accggcattc tagaaggttc   39060
acacaggcca caccagagct gcagaggcca ggagggagct gccagcacca ctgaggaatg   39120
aggcagcggg aaccaggccc cagacacgga ttattcccat gtgcatgggg aatagccctc   39180
ttcgcacgcg gcacagtgtg gaccccggag ctgatgtcat ccaagccccc cacccacccc   39240
tgctctatgg caggaaggat gaggccaggc aggaacagca agcttctccc tgcaaatgcg   39300
tctgccctat ttgggacaat ttccccgctg gagcttgaca cacacagatc ctttcctcaa   39360
gaccgctagg gccacaaaag gtcaagggtg aatgtacttc tttgtaattc agccctgcta   39420
ggaaagaaat atcctctatt gtgggagcca ccgaaatctt cagccagggg tgccatcttc   39480
accttcctac acattcacca ctcaggtctg cagcttcagg ccgagccttc aaacccacgt   39540
ccacatccag gttgcatcct tcggaagagg gaggaggccg gcgaagcctt acctggccag   39600
gccccacttc cccagcacag ggacgagatt gcttgcccaa ggtcagccct gatgggtgac   39660
gcagggacag agggtttgcc ctccaggttc ccctgggggc agaaaggata agtggacgga   39720
gggaaatggg ccgtttacct ggcaggttca tggcatggac agcagcgcat cagggctggg   39780
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tggtgtgtgg ggatgggtag cagcacccct ggcctctgcc cctagatgcc agcagcactt   39900
tccccacttc ccagtcaaga caatcgaact gtttctgggc atgtgcagtg cccccagggc   39960
agatcaccac tggccagatt ggtggtttca agctcagggt ttggagtccc ctcttgactc   40020
tgaccactgg aaagtcacca aacctccctg gcctccattt tctagtctaa aaatggggcg   40080
atcacggctc cctgggtgca cgggctcatg tgataattga aggcaagaga tgatgccagc   40140
gtccggcaca gtgaatgccc tgagtaacgg cacacaagtg acctggcatc caggcagcct   40200
ggttccgctc ttggcctttt gctgggtgcc cttgggtctt tttggaaaga acgataggtc   40260
ctgcccggag gcgcaagtgc tcaatctccc taaaagccgg tactgtattt ggggccgcct   40320
ccccagagag gaagctagca ggcattgatg gaatttgatc tgagccttgg gacttggaga   40380
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cctactgtga agcacggggc tccttatccc aaggcctgtg gggttctgag tgcctctctt   40500
tgcatgggtg ccttcccatt ggcaactgga tctcagcctc gaaggagttt ttaccccaca   40560
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gccgattctc cctcccaccc ccaattacat cttcagagtg cggtatcctg tgtcattttg   40680
ctggtgtact ggaagagaag gtgatttaaa aatccttagc aagttgatgc tggtgtatcc   40740
cccttctgcc catgggaagg aggctctgga cccagggtac aggggtgagt caccctgggt   40800
ccccgcgatc aagggcttgt ttgtgggggt gatgtgtgaa cacagtcaaa ggtgttctgt   40860
gtgctgcgat ggcaggggtg gttcccctcc aggcaggtca ggagagggct tggggaggaa   40920
tggtattaga tgtgagtttc agaagcagtg agctccctgt ctgatgagat agccaagcaa   40980
agagggggca agagggcagc tttgtggcag tgtcattaag ggggtttcag cacatggccc   41040
cgttccctcc aatacccctc ccggttctaa tctgtgaccc acatcattga ggtttggtct   41100
gtgggaggct aaggataata gcctcaaatg aggcccagct gaaaaaaaaa aaaagatctc   41160
attaaaaaca aaaagcacat ctgcttgtaa gtatcgaatg gatgtcttga gaagaaggtt   41220
ataatttttt tttaattttt agcgcgtgtg taatgccaag tctgaaagct ccctcatcct   41280
tagtctcctg cagctccaga gccctcgacg gataaagcag ctgtctcatt gccagacaga   41340
tgcatgcaga gcggcaccag cctgccagac tccctctgcc taactgcgtt gctttctaat   41400
ttgctcccac attggttgaa aatgactaaa gcattttgcg caaagtccag acagttctca   41460
agtcaactgg catttcatcg gaaatctctt cttctgtaac cccaaacttg ggccattact   41520
gggtttgcta tcttggttgc tttcgacaac cagaggcttc ttcaaagccc atattcttct   41580
cggagaggca cttttgctgg attaggggtg acaatgagtg attacactca cagcatccca   41640
aatgccaaat taatgacatt ccgccctgca gacaggatga ctcagtccgt gccgcagcga   41700
tggcttggtg ggaggagagg ccttgagcgt ggtgtcttgt tgggatatgg gagctggccc   41760
gccccggtga ctttgagagt cgatcctcac tgcagacaac agctgcctgg ggctgtgagc   41820
atttgccctc ggctaggcca ggtggctgtg ccccttcgaa ggcccccttc agccctgggt   41880
tctgtactga aggagctcct ttcttgcaca cgtgtgtatg acccccacta tgggccaggc   41940
ccctggctag gggtatggca gtgaacagat aggtgcagct gctgccccac aacctggtgt   42000
catcccaagc aagcagaggg caggattagg ggcgaatggc tgcacgtata cgcctgtgtg   42060
ctcccatccc accttcctgc tagattcttt cttcaaactg ggcctgtgtg tcccatccca   42120
aattcccact agatcctttc ttcaaactgt gtgttcccat ctcaccttcc cactagaccc   42180
tttcttcaaa ctgggccatc ctttctctga tagcacaata gctgtgtctc cttttgagga   42240
gtgtgctggg tttggaggta ggacgtggca ccctttggtt gtgactactc tttcctggct   42300
ctctgggttt ggagggagga catggcaccc tttggtcgtg actactgttt cctggctctt   42360
tcagctcctt ctcctgaggt ccaggaaatt ccaagtcggg gaacagcttc ccgcccaagg   42420
aacagctttc cacacaagcc tgttccaccc cactttggaa gtgctcgccg ggtctttgga   42480
agtgctcact gggtctttgg aagtcctcac tgggtctttg gagtactcac tgggtctttg   42540
gagtgctcac cgggtctttg gagtgctcac caggtctttg gaagtgctca ctgggtcttt   42600
ggagtgctcg ctgggtcttt ggaaatgctc actgggtctt tggagtgctc gctgggtctt   42660
tggagtgctc gctgtgtctt tggagtgctc gctgtgtctt tggagtgctc accaggtctt   42720
tagagtgctt actgggtctt tggagtgctc actgggtctt tggagtgctc gctgggtctt   42780
tggaatgctc gctgggtctt tggaatgctc gctggatctt tggaagtgct cactgggtct   42840
ttggagtgct tgctgggtct ttggaaatgc tcactgggtc tttggagtac tcactgggtc   42900
tttggaatgc tcactgggtc tttggagtac tcactggctc tttggagtgc tcactgggtc   42960
tttggaaatg ctcactgggt ctctggagta ctcactgggt ctctggagtg ctcactgggt   43020
ctttggagtg ctcgccgtgt ctttggagtg ctcgccgtgt ctttggagtg ctcgccgggt   43080
ctttggagtg ctcgccgggt ctttggagtg ctcaccgggt ctttggagtg ctcactgtgt   43140
ctttggagtg cttactgggt ctttggagtg ctcgccgggt ctttggagtg ctctctgtgt   43200
ctttggaagt gctcactggg tctttggaaa tgctcgccgg gtctttggca tgctcgccgg   43260
gtctttggag tactcactgg atctttggat tactcactgg atctttggaa gtgctcactg   43320
gatctttgga agtgctcact gggtctttgg agtgctcacc gggcctttgg aagtgctcac   43380
cgggtctttg gagtactcgt tgtgtctttg gagtgctcac cgagtctttg gagtacttac   43440
cgggtctttg gagtactcac tgggtctttg gagtgctcgc tgtgtctttg gagtactcac   43500
tgggtctttg gagtgctcac tgggtctttg gaagtgctca cttggtcttt ggagtactca   43560
ctgggtcttt ggagtactca ctggatcttt ggaagtgctc acggggtctt tggagtgctt   43620
tctgggtctt tggagtgctc actgggtctt tggagtgctc agtgggtctt tggagtactc   43680
actggatctt tggaagtgct cactgggtct ttggagtact cactgggtct ttggaagtgc   43740
tcaccaccgg gtctgctctc tccacaggtg tggtacatgg acggctatca caacaaccgc   43800
ttcgtacgtg agtacaagtc catggttgac ttcatgaaca cggacaattt cacctcccac   43860
cgtctccccc acccctggtc gggcacgggg caggtggtct acaacggttc tatctacttc   43920
aacaagttcc agagccacat catcatcagg tttgacctga agacagagac catcctcaag   43980
acccgcagcc tggactatgc cggttacaac aacatgtacc actacgcctg gggtggccac   44040
tcggacatcg acctcatggt ggacgagagc gggctgtggg ccgtgtacgc caccaaccag   44100
aacgctggca acatcgtggt cagtaggctg gaccccgtgt ccctgcagac cctgcagacc   44160
tggaacacga gctaccccaa gcgcagcgcc ggggaggcct tcatcatctg cggcacgctg   44220
tacgtcacca acggctactc agggggtacc aaggtccact atgcatacca gaccaatgcc   44280
tccacctatg aatacatcga catcccattc cagaacaaat actcccacat ctccatgctg   44340
gactacaacc ccaaggaccg ggccctgtat gcctggaaca acggccacca gatcctctac   44400
aacgtgaccc tcttccacgt catccgctcc gacgagttgt ag                      44442

Claims (97)

1.一种编码人pancortin多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列、其简并变异体或其互补序列有至少95％同一性的核苷酸序列。
2.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列、其简并变异体或其互补序列。
3.一种编码人pancortin多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：3的核苷酸序列、其简并变异体或其互补序列有至少95％同一性的核苷酸序列。
4.权利要求3的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列、其简并变异体或其互补序列。
5.一种编码人pancortin多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：5的核苷酸序列、其简并变异体或其互补序列有至少95％同一性的核苷酸序列。
6.权利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列、其简并变异体或其互补序列。
7.一种编码人pancortin多肽的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列、其简并变异体或其互补序列。
8.权利要求1、3、5或7中任一项的多核苷酸，其中所述多核苷酸选自DNA、cDNA、RNA和反义RNA。
9.权利要求8的多核苷酸，所述多核苷酸还包含异源核苷酸。
10.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的多肽包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列、其变异体或其片段。
11.权利要求3的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的多肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列、其变异体或其片段。
12.权利要求5的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的多肽包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列、其变异体或其片段。
13.权利要求7的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码的多肽包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段。
14.权利要求10、11、12或13中任一项的多核苷酸，其中所述多肽结合包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列、其变异体或其片段的pablo多肽。
15.权利要求10、11、12或13中任一项的多核苷酸，其中所述多肽是融合多肽。
16.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸与包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7的核苷酸序列或其互补序列的多核苷酸在高严格性杂交条件下杂交。
17.一种分离的人pancortin多肽，所述人pancortin多肽由包含与SEQ ID NO：1的核苷酸序列、其简并变异体或其互补序列有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
18.一种分离的人pancortin多肽，所述人pancortin多肽由包含与SEQ ID NO：3的核苷酸序列、其简并变异体或其互补序列有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
19.一种分离的人pancortin多肽，所述人pancortin多肽由包含与SEQ ID NO：5的核苷酸序列、其简并变异体或其互补序列有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸编码。
20.一种分离的人pancortin多肽，所述人pancortin多肽由包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列、其简并变异体或其互补序列的多核苷酸编码。
21.权利要求17、18、19或20中任一项的多肽，其中所述pancortin多肽结合包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列、其变异体或其片段的pablo多肽，其中结合调节神经细胞凋亡。
22.权利要求17、18、19或20中任一项的多肽，其中所述多肽是融合多肽。
23.一种分离的人pancortin多肽，所述人pancortin多肽包含SEQID NO：2的氨基酸序列、其变异体或其片段。
24.一种分离的人pancortin多肽，所述人pancortin多肽包含SEQID NO：4的氨基酸序列、其变异体或其片段。
25.一种分离的人pancortin多肽，所述人pancortin多肽包含SEQID NO：6的氨基酸序列、其变异体或其片段。
26.一种分离的人pancortin多肽，所述人pancortin多肽包含SEQID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段。
27.权利要求23、24、25或26中任一项的多肽，其中所述多肽结合包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列或其变异体的pablo多肽，其中结合调节神经细胞凋亡。
28.权利要求23、24、25或26中任一项的多肽，其中所述多肽是融合多肽。
29.一种针对pancortin多肽的特异性抗体，所述pancortin多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段。
30.权利要求29的抗体，其中所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体。
31.权利要求30的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
32.一种针对pablo-pancortin多肽二聚体的特异性抗体。
33.权利要求32的抗体，其中所述多肽二聚体包含pablo多肽和pancortin多肽，所述pablo多肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列、其变异体或其片段，而所述pancortin多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段。
34.权利要求33的抗体，其中所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和单链抗体。
35.权利要求34的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
36.一种表达载体，所述表达载体包括含SEQ ID NO：1的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段的多核苷酸。
37.权利要求36的载体，其中所述多核苷酸编码包含SEQ IDNO：2的氨基酸序列、其变异体或其片段的pancortin多肽。
38.一种表达载体，所述表达载体包括含SEQ ID NO：3的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段的多核苷酸。
39.权利要求38的载体，其中所述多核苷酸编码包含SEQ IDNO：4的氨基酸序列、其变异体或其片段的pancortin多肽。
40.一种表达载体，所述表达载体包括含SEQ ID NO：5的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段的多核苷酸。
41.权利要求40的载体，其中所述多核苷酸编码包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列、其变异体或其片段的pancortin多肽。
42.一种重组表达载体，所述重组表达载体包括含SEQ ID NO：7的核苷酸序列、其简并变异体、其互补序列或其片段的多核苷酸。
43.权利要求42的载体，其中所述多核苷酸编码包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段的pancortin多肽。
44.权利要求36、38、40或42中任一项的载体，所述载体还包含编码pablo多肽的多核苷酸，所述pablo多肽包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列、其变异体或其片段。
45.权利要求36、38、40或42中任一项的载体，其中所述多核苷酸选自DNA、基因组DNA、cDNA、RNA和反义RNA。
46.权利要求45的载体，其中所述多核苷酸与一个或多个调节元件有效连接，所述调节元件选自启动子、增强子、剪接信号、终止信号、核糖体结合信号和聚腺苷酸化信号。
47.权利要求36、38、40或42中任一项的载体，其中所述载体DNA选自质粒DNA、附加型DNA、YAC DNA和病毒DNA。
48.权利要求47的载体，其中所述载体是质粒DNA。
49.一种基因工程宿主细胞，所述宿主细胞用权利要求36的载体转化、转染或感染。
50.一种基因工程宿主细胞，所述宿主细胞用权利要求38的载体转化、转染或感染。
51.一种基因工程宿主细胞，所述宿主细胞用权利要求40的载体转化、转染或感染。
52.一种基因工程宿主细胞，所述宿主细胞用权利要求42的载体转化、转染或感染。
53.权利要求49、50、51或52中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞。
54.权利要求53的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
55.权利要求49、50、51或52中任一项的宿主细胞，其中所述载体表达所述多核苷酸，产生编码多肽、变异体或其片段。
56.一种稳定表达pancortin多肽的神经细胞系，所述pancortin多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段。
57.一种用于调节细胞凋亡的方法，所述方法包括调节pancortin多肽的活性。
58.权利要求57的方法，所述方法还包括调节pablo多肽的活性。
59.一种用于调节细胞凋亡的方法，所述方法包括调节编码pancortin多肽的多核苷酸的表达。
60.权利要求59的方法，所述方法还包括调节编码pablo多肽的多核苷酸的表达。
61.一种用于治疗神经系统疾病患者的方法，所述方法包括调节pancortin多肽的活性和/或调节编码pancortin多肽的多核苷酸的表达。
62.一种用于分析试验化合物对pancortin多肽活性的影响的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供包含编码pancortin多肽的多核苷酸的转基因动物；
(b)将试验化合物给予所述动物；和
(c)在存在和不存在所述试验化合物的情况下，测定所述试验化合物对所述pancortin活性的影响。
63.权利要求62的方法，其中所述多核苷酸具有至少一个选自核苷酸缺失、核苷酸取代和核苷酸插入的突变。
64.一种用于分析试验化合物对其基因组包含编码pancortin多肽的多核苷酸的一个功能性破坏的动物的影响的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供其基因组包含编码pancortin多肽的内源多核苷酸的一个破坏的转基因动物；
(b)将试验化合物给予所述动物；和
(c)在存在和不存在所述试验化合物的情况下，测定所述试验化合物对所述pancortin多肽活性的影响。
65.一种用于分析试验化合物对pancortin多肽活性的影响的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供包含表达pancortin多肽的多核苷酸的重组细胞；
(b)使所述细胞与试验化合物接触；和
(c)在存在和不存在所述试验化合物的情况下，测定所述试验化合物对所述pancortin活性的影响。
66.权利要求65的方法，其中所述多核苷酸具有至少一个选自核苷酸缺失、核苷酸取代和核苷酸插入的突变。
67.权利要求66的方法，其中所述细胞还包含表达pablo多肽的多核苷酸。
68.一种用于分析试验化合物对pancortin多肽和pablo多肽结合相互作用的影响的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)提供供酵母双杂交系统用的酵母细胞，所述酵母细胞包含pancortin多肽和pablo多肽；
(b)使所述细胞与试验化合物接触；和
(c)在存在和不存在所述试验化合物的情况下，测定所述试验化合物对所述pancortin多肽和pablo多肽结合相互作用的影响。
69.一种生产pancortin多肽的方法，所述pancortin多肽包含SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列、其变异体或其片段，所述方法包括：
(a)用表达载体转染、转化或感染重组宿主细胞，所述表达载体包括含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7的核苷酸序列或其简并变异体的多核苷酸；
(b)将所述宿主细胞在足以产生所述多肽的条件下进行培养；和
(c)从所述培养物中分离出所述多肽。
70.一种用于治疗需要pancortin活性降低的患者的方法，所述方法包括：
(a)给予所述患者治疗有效量的pancortin拮抗剂；和/或
(b)给予所述患者编码反义RNA多核苷酸的多核苷酸，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7的核苷酸序列、其简并变异体或其片段互补的核苷酸序列。
71.一种用于诊断患者中与pancortin多肽表达或活性相关的疾病或对所述疾病易感性的方法，所述方法包括：
(a)测定编码pancortin多肽的多核苷酸中是否存在突变，所述pancortin多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：8的氨基酸序列或其片段；和/或
(b)分析来源于所述患者的样品中存在pancortin表达，其中所述已表达pancortin是编码包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8的氨基酸序列或其片段的pancortin多肽的多核苷酸。
72.一种用于治疗过度增殖性疾病的组合物，所述组合物包含pancortin多肽和pablo多肽，所述pancortin多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列，而所述pablo多肽包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
73.权利要求72的过度增殖性疾病，其中所述疾病选自癌症、牛皮癣、再狭窄、动脉粥样硬化和纤维变性。
74.一种核酸分子，所述核酸分子对pancortin mRNA分子是反义的。
75.一种抑制pancortin基因在细胞中表达的方法，所述方法包括为所述细胞提供反义核酸。
76.一种非人类转基因哺乳动物，所述非人类转基因哺乳动物的基因组包含编码pancortin多肽或其片段的外源多核苷酸，其中所述多核苷酸表达处于调节型启动子的控制之下。
77.权利要求76的哺乳动物，其中所述多核苷酸包含SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的核酸序列。
78.权利要求77的哺乳动物，其中所述多肽包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
79.权利要求76的哺乳动物，其中所述哺乳动物是褐鼠(Rattusnorvegicus)或小家鼠(Mus musculus)。
80.权利要求76的哺乳动物，其中所述调节型启动子是诱导型启动子。
81.权利要求80的哺乳动物，其中所述诱导型启动子是Gal4-E1A或四环素效应元件(TRE)。
82.权利要求76的哺乳动物，其中所述调节型启动子是组织特异性启动子。
83.权利要求82的哺乳动物，其中所述组织特异性启动子是神经元特异性启动子。
84.权利要求83的哺乳动物，其中所述启动子是小鼠Thy 1.2。
85.权利要求76的哺乳动物，其中所述哺乳动物的特征在于选自以下的表型：后肢震颤、体型变小、后肢握力下降、前肢抱拢、后肢抱拢和死亡。
86.一种非人类转基因哺乳动物，所述非人类转基因哺乳动物的基因组在其内源pancortin基因中包含纯合破坏，其中所述破坏阻止功能性pancortin多肽的表达。
87.权利要求86的哺乳动物，其中所述哺乳动物是小家鼠。
88.权利要求86的哺乳动物，其中所述哺乳动物的特征在于选自以下的表型：后肢震颤、体型变小、后肢握力下降、前肢抱拢、后肢抱拢和死亡。
89.一种用于产生非人类转基因哺乳动物的方法，所述非人类转基因哺乳动物的基因组包含编码pancortin多肽或其片段的外源多核苷酸，所述方法包括下述步骤：
(a)将包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5或SEQ IDNO：7的核酸序列的多核苷酸导入受精卵母细胞的原核中，其中所述多核苷酸与启动子有效连接；
(b)将所述卵母细胞植入假孕非人类哺乳动物体内，其中所述卵母细胞发育成胚胎；和
(c)让所述胚胎发育成活的转基因哺乳动物。
90.权利要求89的方法，其中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5或SEQ ID NO：7的多核苷酸编码其氨基酸序列为SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8的全长pancortin多肽。
91.权利要求90的方法，其中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：5或SEQ ID NO：7的多核苷酸编码突变型Pablo多肽。
92.权利要求90的方法，其中所述多核苷酸表达处于组成型启动子的控制之下。
93.权利要求89的方法，其中所述哺乳动物的特征在于选自以下的表型：后肢震颤、体型变小、后肢握力下降、前肢抱拢、后肢抱拢和死亡。
94.一种用于产生非人类转基因哺乳动物的方法，所述非人类转基因哺乳动物的基因组在其内源pancortin基因中包含破坏，所述方法包括：
(a)提供具有功能性破坏的pancortin多肽编码多核苷酸；
(b)将所述破坏的多核苷酸导入胚胎干细胞中；
(c)选择那些包含所述破坏的多核苷酸的胚胎干细胞；
(d)将步骤(c)的胚胎干细胞导入胚泡中；
(e)将步骤(d)的胚泡转移到假孕动物体内；和
(f)让所转移的胚泡发育成带有所述破坏的嵌合哺乳动物；其中所述破坏阻止功能性pancortin多肽的表达。
95.权利要求94的方法，所述方法还包括使所述嵌合哺乳动物与野生型动物配种，以获得带有所述破坏的杂合哺乳动物。
96.权利要求94的方法，所述方法还包括繁殖所述杂合哺乳动物，以产生带有所述破坏的纯合哺乳动物。
97.权利要求94的方法，其中所述哺乳动物的特征在于选自以下的表型：后肢震颤、体型变小、后肢握力下降、前肢抱拢、后肢抱拢和死亡。
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