UA79582C2

UA79582C2 - Gene and protein associated with schizophrenia

Info

Publication number: UA79582C2
Application number: UA2003032022A
Authority: UA
Inventors: Bernard Bihain; Barbara Bour; Lydie Bougueleret
Original assignee: Serono Genetics Inst Sa
Priority date: 2000-08-07
Filing date: 2001-07-26
Publication date: 2007-07-10
Also published as: US7449543B2; EP1307560A2; CN1468306A; EA005921B1; WO2002012279A2; AU2001294088B2; CA2418779A1; EP1307560B1; EA200300246A1; MXPA03001150A; IL154298A0; US20030148389A1; US7220581B2; AU9408801A; US20080199883A1; BR0113099A; JP2004516015A; KR20030042449A; DE60123434D1; IL154298A

Description

Опис винаходу

Даний винахід відноситься до полінуклеотидів гена РАРАР, до поліпептидів, що кодуються геном РАРАР, і до антитіл, специфічних до таких поліпептидів. Даний винахід також відноситься до способів лікування або діагностики шизофренії, біполярних порушень або споріднених захворювань ЦНС. Даний винахід також відноситься до взаємодії РАРАР з геном 934872, який є кандидатом на ген шизофренії.

Прогрес, досягнутий в технологічному оснащенні сучасних лабораторій для теоретичних і клінічних досліджень, дозволяє провести більш серйозне вивчення функцій головного мозку і нервової системи як у 70 здорових індивідуумів, так і у індивідуумів з патологією. Було висунено множину нейробіологічних |і фармакологічних гіпотез, що стосуються нейрохімічних і генетичних механізмів, що викликають порушення центральної нервової системи (ЦНС), включаючи психічні і нейродегенеративні порушення. Однак, порушення

ЦНС мають складну і ще недостатньо ясну етіологію, і їх симптоми, які перекриваються один з одним, ще недостатньо охарактеризовані і представляють певні труднощі для діагностики. У майбутньому необхідно 12 розробити такі схеми лікування і лікарські засоби, які володіли б більш тонкою і направленою дією на мультигенні етіологічні фактори, а також необхідно розробити нові аналізи для виявлення людей, які страждають вказаними захворюваннями, і для одержання більш точних діагностичних і прогностичних даних відносно пацієнтів, які страждають порушеннями ЦНС.

Порушення ЦНС можуть охоплювати захворювання широкого спектра і, відповідно, широкий спектр генетичних факторів. Прикладами порушень ЦНС є нейродегенеративні захворювання, психотичні порушення, порушення настрою, аутизм, зловживання речовинами, що викликають залежність, і алкоголізм, затримка розумового розвитку та інші психічні захворювання, включаючи порушення пізнавальної здатності, тривожні стани, порушення, пов'язане з прийомом їжі, імпульсивність, що не контролюється, і порушення особистості.

Такі порушення можуть бути визначені з використанням "Керівництва з діагностики і статистики психічних с порушень, четверте видання, класифікація (О5М-ІМ)" (Оіадповів апа 5їаїййвіїсаї Мапиаі! ої Мепіа! Оівогаетгв Ге)

Тоцгій еййіоп сіазвіїсакноп"|.

Навіть при розгляді лише невеликого ряду порушень ЦНС, очевидно, що виходячи з відсутності адекватного лікування і розуміння молекулярних механізмів психотичних порушень, шизофренії і біполярних порушень, які є новими цілями терапії даного винаходу, необхідно розробити вдосконалені способи лікування цих порушень. Що сч стосується шизофренії і біполярного порушення, то всі відомі молекули, що використовуються для лікування с шизофренії, дають побічні ефекти і діють тільки на симптоми даного захворювання. Існує крайня необхідність в одержанні нових молекул, які не давали б побічних ефектів, і які були б направлені на мішені, що беруть о участь в механізмах, які викликають шизофренію і біполярне порушення. Тому, необхідно розробити способи, що /д) полегшують виявлення і характеризацію цих мішеней. 3о Дані про поєднання шизофренії з біполярним порушенням в сім'ях, дані, одержані при дослідженні близнюків в і прийомних дітей, а також відсутність динаміки в захворюваності у всьому світі вказують на те, що шизофренія і біполярне порушення є, головним чином, генетичними станами, хоча на певному рівні присутні також і зовнішні фактори ризику, такі, як необхідні, достатні або інтерактивні етіологічні фактори. Так, наприклад, « шизофренією страждає 195 всього населення. Але якщо в сім'ї бабуся або дідусь страждали шизофренією, то З 70 ризик розвитку цього захворювання зростає приблизно до 3905, а якщо один з батьків страждав шизофренією, то с цей ризик збільшується приблизно до 1095. Якщо обидва батьки страждали шизофренією, то ризик становить з» приблизно 4076. | Й

Ідентифікація гена чутливості до шизофренії на хромосомі 13431-433

Ідентифікація генів, що беруть участь в наданні конкретної ознаки, такої як специфічне порушення центральної нервової системи, наприклад, шизофренія, може бути здійснена за допомогою двох головних 7 стратегій, які використовуються в цей час для генетичного картування, а саме, аналіз на зчеплення генів і (се) дослідження на асоціацію генів. Аналіз на зчеплення генів вимагає проведення дослідження сімейств, в яких спостерігалася множина випадків захворювання індивідуумів, і таке дослідження в цей час може бути і-й використане для виявлення моно- або олігогенних успадкованих ознак. На відміну від цього, дослідження о 20 асоціації генів дозволяють визначити частоту зустрічальності маркерних алелей у неспоріднених індивідуумів з цією ознакою (ТТ) в порівнянні з негативним контролем (Т-) за цією ознакою, і таке дослідження часто о використовується для виявлення полігенної спадковості.

Генетичний зв'язок або "зчеплення" генів засновано на аналізі, який дозволяє визначити, які з двох сусідніх послідовностей на хромосомі містять найменше число рекомбінацій, що виникають в результаті 25 кросинговеру в процесі мейозу. Для цього була визначена точна локалізація хромосомних маркерів, таких як

ГФ) мікросателітні маркери, на геномі. Аналіз на зчеплення генів дозволяє обчислити імовірності рекомбінацій на юю цільовому гені з використанням хромосомних маркерів, відповідно до генеалогічного древа, імовірність передачі хвороби і перенесення маркерів. Таким чином, якщо конкретний алель даного маркера передається з даною хворобою більш часто, ніж імовірність того, що він вже присутній в ньому (рівень рекомбінації від О до 0,5), 60 то можна зробити висновок, що цільовий ген, який розглядається, присутній у цього маркера. З використанням цього методу можна визначити локалізацію декількох генів, що свідчать про генетичну схильність до спадкової злоякісної пухлини. Для включення в дослідження на зчеплення генів сім'ї, яка страждає успадкованою формою захворювання, вона повинна задовольняти критеріям "Інформативності", тобто, ця сім'я повинна мати декілька індивідуумів, які страждають цим захворюванням, (у яких є структурна ДНК) на одне покоління, а щонайбільше, 62 вона повинна мати велике число сибсів.

Результати попередніх досліджень на зчеплення генів підтвердили припущення, що хромосома 13 ймовірно має локус чутливості до шизофренії на 13432 |Віоціп .).Г. еї аіІ., 1998, Майте Сепеїйісв, 20:70-73; іп ММ. еї аІ,, 1997, Нит. Сепеї., 99 (3): 417-420). Ці спостереження дозволяють передбачити, що локус шизофренії

Знаходиться на хромосомі 13432, що було підтверджено в дослідженнях на зчеплення генів. Аналіз на зчеплення генів був успішно застосований для картування простих генетичних ознак, які ясно вказують на характер менделевского успадкування, і які мають високий рівень пенетрантності, однак, цей метод має ряд недоліків.

По-перше, аналіз на зчеплення генів залежить від вибору генетичної моделі, відповідної для кожної ознаки, що досліджується. Крім того, використання аналізу на зчеплення генів обмежене розрізненням, яке може бути 7/0 досягнуте при його застосуванні, і для більш точного аналізу типових 20 м.п.н. - областей, які були заздалегідь ідентифіковані цим методом, потрібні додаткові дослідження. Крім того, аналіз на зчеплення генів представляє певні труднощі при його застосуванні з метою виявлення складних генетичних ознак, таких як ознаки, зумовлені комбінованою дією множини генів і/або факторів навколишнього середовища. У цих випадках для підбору адекватного числа сімей з даним захворюванням, необхідного для проведення аналізу на зчеплення 7/5 Генів для конкретних ситуацій, потрібний дуже великий об'єм роботи і коштів. І, нарешті, аналіз на зчеплення генів не може бути застосований для дослідження ознак, в яких не може брати участь велике число "Інформативних" сімей.

Пізніше, замість використання аналізів на зчеплення генів був використаний альтернативний метод досліджень на асоціацію генів, який дозволив ідентифікувати новий ген, асоційований з шизофренією і біполярним порушенням і позначений геном 934872, який локалізований в локусі хромосоми 13431-433. Цей альтернативний метод передбачає створення біалельних маркерів (головним чином, з однонуклеотидним поліморфізмом) в потрібній області, ідентифікацію маркерів, що вказують на нерівноважність із зчеплення з шизофренією, і проведення досліджень на асоціацію генів у індивідуумів з випадками неспорідненої шизофренії і біполярного порушення, а також у контрольних популяцій. с

Загалом був сконструйований ВАС-контиг, що охоплює геномну ділянку-кандидат, з використанням 27 опублікованих 55 (ЗТ5-ДНК-маркувальний сайт), локалізованих на ділянці хромосоми 13431-433 для скринінгу і) 7 геномних еквівалентних запатентованих ВАС-бібліотек. На основі цих матеріалів були генеровані нові 5Т5, ЩО дозволило побудувати щільну фізичну карту цієї області. Загалом 275 5Т5 дозволили ідентифікувати 255 ВАС, що мають всі можливі розміри і картовані шляхом хромосомної гібридизації іп зйш для їх підтвердження. Нові с зо біалельні маркери були генеровані шляхом часткового секвенування кінців вставки від субклонів деяких вставок

ВАС, локалізованих в області 13431-433 хромосоми людини. У першій фазі цього аналізу, для випадку со шизофренії і контролю, була проаналізована перша серія 34 біалельних маркерів на 9 різних ВАС вздовж ю локусу-кандидата хромосоми 13431-433, що дозволило ідентифікувати субобласть, що вказує на асоціацію з шизофренією. Після проведення цього першого аналізу генерували додаткові біалельні маркери, як описано ме)

Ззв5 Вище для побудови карти дуже високої щільності потрібної області. Була ідентифікована і повністю секвенована ї- мінімальна серія з 35 ВАС, що дозволило виявити декілька контигів, включаючи контиг, що складається з послідовностей в більше, ніж 900 т.п.н. в потрібній області.

Ці біалельні маркери були використані в комбінації з дослідженнями, які проводилися з метою уточнення конкретної потрібної субобласті, містять кандидат на ген шизофренії, 934872. У деяких дослідженнях, що « проводяться на різних понуляціях з метою підтвердження асоціації з вказаної субобластю, був визначений з с генотип цих біалельних маркерів. Дослідження на асоціацію спочатку здійснювали на двох різних скринуючих . зразках для випадків шизофренії і на контрольних зразках, взятих від індивідуумів, що проживають у и?» французькій Канаді, з яких 139 чоловік мали шизофренію, а 141 чоловік складали контрольну групу, і 215 чоловік мали шизофренію, а 241 чоловік складали контрольну групу, відповідно, а також на зразках для випадків біполярного порушення і контрольних зразках, взятих від індивідуумів, що проживають в Аргентині. Дані, -І одержані внаслідок декількох досліджень з участю вказаних індивідуумів, виявили геномну область, що має приблизно 150 т.п.н. і виявляє значущу асоціацію з шизофренією. Ця асоціація була потім підтверджена в і, незалежних дослідженнях з використанням зразків для випадків захворювання і контрольних зразків, взятих від с хворих шизофренією, що проживають в США, а також додаткових зразків, взятих від індивідуумів, що 5р проживають в Аргентині і у французькій Канаді. со Було виявлено, що геномна область приблизно в 150 т.п.н., асоційована з шизофренією, містить

Ге ген-кандидат 934872. Крім того, крім характеризації структури інтрон-екзон гена 934872, був ідентифікований ряд варіантів мМРНК-сплайсингу, включаючи тканеспецифічні варіанти мРНК-сплайсингу, і була продемонстрована присутність МРНК. Потім пептидний фрагмент, що походить від поліпептидного продукту дв 934872, амінокислотна послідовність якого показана в ЗЕО ІЮ МО:5, виявляв, при його внутрішньоочеревинному введенні мишам, зниження частоти локомоторних рухів і збільшення стереотипії. Подальше обговорення

Ф) ідентифікації гена 934872 приводиться в |заявці на патент США, що одночасно розглядається, реєстр. ка Мо09/539333, озаглавленої "Гени, білки і біалельні маркери, асоційовані з шизофренією" ("Зспігорпгепіа аззосіаФе(ай депевз, ргоїеіпз апа бБіаїІейс тагКег) і в міжнародній патентній заявці Мо РСТЛВОО/00435, що бо одночасно розглядається, які були подані ЗО березня 2000 року) і які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.

Надто необхідно ідентифікувати гени, асоційовані з шизофренією і біполярним порушенням. Також необхідно ідентифікувати гени, що беруть участь у шляху 934872, і гени, продукти яких функціонально взаємодіють з продуктами гена 934872. Ці гени можуть послужити початком нового етану в лікуванні шизофренії або 65 біполярних порушень і також дозволять проводити подальші дослідження і характеризацію гена 934872 і пов'язаного з ним біологічного шляху. Відомості про ці гени і пов'язаний з ними біологічний шлях,

відповідальних за шизофренію, можуть допомогти дослідникам зрозуміти етіологію шизофренії і біполярного порушення і сприяти розробці лікарського засобу і медичних препаратів, які будуть направлені на причину, що викликає ці захворювання. Існує також гостра необхідність в розробці нових способів виявлення чутливості до шизофренії і біполярних порушень, а також способів попередження розвитку шизофренії або контролю за ходом її розвитку. Також надто необхідно розробити засоби для діагностики цих захворювань. Дійсно, рання ідентифікація індивідуумів з ризиком розвитку шизофренії дозволила б провести раннє і/або профілактичне лікування. Крім того, точна оцінка потенційної ефективності лікарського засобу, а також потенційної толерантності до нього пацієнтів, дозволила б клініцистам збільшити відношення користь/ризик при розробці /о бхем лікування шизофренії і біполярного порушення.

Таким чином, даний винахід відноситься до нового гена і білка, який взаємодіє з пептидом 934872. Цей новий ген, позначений геном РАРАР, був клонований авторами даного винаходу, які продемонстрували, що продукт гена РАРАР взаємодіє з пептидом 934872. Відомості про партнера по скріпленню з 934872 дають можливість розробити лікарські засоби для лікування захворювань ЦНС, опосередкованих 934872 і/або РАРАР, і /5 провести дослідження 934872 шляхом одержання засобів для детекції РАРАР, 934872 і комплексів 934872-РАРАР або їх взаємодій.

Даний винахід відноситься до молекул нуклеїнової кислоти, що містять геномну послідовність нового гена людини, який кодує білок РАРАР. Геномна послідовність РАРАР включає регуляторну послідовність, розташовану вище (з 5-кінця) і нижче (з З-кінця) від транскрибованої частини вказаного гена, і ці 2о регуляторні послідовності також є частиною даного винаходу.

Даний винахід також відноситься до повної кКДНК-послідовності, що кодує білок РАРАР, а також до поліпептидів РАРАР, і до антитіл, що специфічно розпізнають поліпептид РАРАР. Даний винахід також відноситься до комплексу РАРАР-934872, що не містить білка, з яким він звичайно асоційований, а також до антитіл, що специфічно розпізнають вказаний комплекс. сч

Олігонуклеотидні зонди або праймери, що специфічно гібридизуються з геномною або з кКДНК-послідовністю

РАРАР, а також способи ДНК-ампліфікації і детекції з використанням вказаних праймерів і зондів також є і) частиною даного винаходу.

Іншим об'єктом даного винаходу є рекомбінантні вектори, що містять будь-які вищеописані послідовності нуклеїнової кислоти, а зокрема, рекомбінантні вектори, що містять регуляторну послідовність РАРАР або с зо послідовність, що кодує білок РАРАР, а також клітини-хазяї і трансгенні тварини, відмінні від людини, і що містять вказані послідовності нуклеїнової кислоти або рекомбінантні вектори. со

Даний винахід також відноситься до способів скринінгу речовин або молекул, що інгібують експресію РАРАР, ю а також до способів скринінгу речовин або молекул, які взаємодіють з поліпептидом РАРАР, і які модулюють активність поліпептиду РАРАР або порушують, попереджають, дестабілізують або посилюють скріплення і/або ме) взаємодію пептидів і/або білків РАРАР і 934872. ча

Ї нарешті, даний винахід відноситься до використання поліпептиду РАРАР, антитіл проти цього поліпептиду і агоністів і антагоністів активності РАРАР для лікування порушень ЦНС.

Короткий опис послідовностей, представлених в списку послідовностей

ЗЕО ІЮ МО:1 містить кКДНК-послідовність РАР АР. «

ЗЕО ІЮ МО:2 містить амінокислотну послідовність, що кодується КДНК ЗЕО ІЮ МО 1. з с ЗЕО ІЮ МО:З містить геномну ДНК-послідовність РАРАР. . ЗЕО ІЮ МО:4 містить ДНК-послідовність, що кодує гібридний білок "пептид 934872 - лужна фосфатаза", и? описаний в прикладі 1.

ЗЕО ІЮ МО:5 містить ДНК-послідовність, що кодує пептид 934872, що використовується для ідентифікації і

Клонування гена РАРАР, описаного в прикладі 1. -І ЗЕО ІЮО МО:6 містить амінокислотну послідовність, що кодується ДНК ЗЕО ІО МО 4.

Ідентифікація гена РАРАР. локалізованого на хромосомі 1рз5-рзб ік Для ідентифікації білка РАРАР авторами даного винаходу був використаний метод експресійного клонування, с детально описаний нижче в прикладі 1. Для цього заявниками був створений, із збереженням рамки зчитування, гібрид кДНК-послідовності, що кодує пептидний фрагмент 934872, з С-кінцем секретованої лужної фосфатази со (АР) у векторі, що містить секретовану сигнальну послідовність, розташовану вище вставки, яка направляє

Із секрецію цього гібридного білка в дане середовище, де вказане середовище, що містить цей гібридний білок, може бути зібраним, проаналізованим на АР-активність і використаним в аналізі іп зи на рецептор/ліганд.

Потім авторами даного винаходу був проведений аналіз іп зйи на рецептор/ліганд. кКДНК, виділені з

КДНК-бібліотеки головного мозку людини, клонували в експресуючий вектор і трансфікували в клітини СО5-1.

Секретований АР-гібридний білок використали як зонд для клонування РАРАР шляхом інкубування клітин з

Ф) середовищем, що містить гібридний білок "пептид 934872-АР". У випадку детекції позитивного клону аналіз ка повторювали з використанням ще більш дрібних пулів кДНК доти, поки не був ідентифікований єдиний клон.

Даний винахід також відноситься до полінуклеотидів і до поліпептидів, асоційованих з геном РАРАР. бо Частиною даного винаходу також є олігонуклеотидні зонди або праймери, які специфічно гібридизуються з геномною або з кКДНК-послідовністю РАРАР. Іншою метою даного винаходу є рекомбінантні вектори, що містять будь-які вищеописані послідовності нуклеїнової кислоти, а зокрема, рекомбінантні вектори, що включають регуляторну послідовність РАРАР або послідовність, що кодує білок РАРАР, а також клітини-хазяї, що містять вказані послідовності нуклеїнової кислоти або рекомбінантні вектори. Даний винахід також відноситься до 65 способів скринінгу молекул, які інгібують експресію гена РАРАР, і які модулюють активність білка РАРАР, або які порушують, попереджають, дестабілізують або посилюють скріплення і/або взаємодію пептидів і/або білків

РАРАР і 934872. Даний винахід також відноситься до антитіл, які специфічно направлені проти таких поліпептидів, і які можуть бути використані як діагностичні реагенти.

Ідентифікований ген і білок РАРАР може бути використаний при розробці аналізів для діагностики шизофренії або біполярних порушень і при розробці аналізів для надійної детекції генетичної схильності до шизофренії, до біполярних порушень і до споріднених захворювань. Для лікування вказаних порушень можуть бути використані нуклеїнові кислоти і поліпептиди РАРАР, а також антитіла проти вказаних поліпептидів. Ген і білок РАРАР і антитіла проти них можуть бути також використані при розробці схем скринінгу лікарських засобів для точної і ефективної оцінки терапевтичного ефекту і побічних ефектів нових або вже наявних лікарських засобів або схем 7/о лікування. Крім того, нуклеїнові кислоти і поліпептиди РАРАР можуть бути використані для дослідження 934872 і

РАРАР і їх участь в розвитку захворювань ЦНС.

Визначення

Перед більш докладним описом даного винаходу приводяться нижченаведені визначення, в яких проілюстровані і визначені значення і об'єм термінів, що використовуються в цьому винаході.

Терміни "ген РАРАР", що використовуються тут, охоплюють геномні, мРНК- і кКДНК-послідовності, що кодують білок РАРАР, включаючи регуляторні області геномної ДНК, що не транслюються.

Термін "гетерологічний білок", що використовується тут, означає будь-який білок або поліпептид, що не є білюом РАРАР. Більш конкретно, таким гетерологічним білком є сполука, яка може бути використана як маркер в подальших експериментах з регуляторною областю РАРАР.

Термін "виділений" означає, що даний матеріал повинен бути видалений з його природного середовища (наприклад, природного оточення, якщо воно є). Так, наприклад, природний полінуклеотид або поліпептид, присутній в живому організмі, не є виділеним, але ті ж самі полінуклеотид, ДНК або поліпептид, відділені від деяких або всіх матеріалів, що є в природній системі, є виділеними. Такий полінуклеотид може бути частиною вектора, і/або такий полінуклеотид або поліпептид може бути частиною композиції, і у випадку, якщо вони сч

Виділені, то даний вектор або композиція не є частиною його природного оточення.

Так, наприклад, природний полінуклеотид, присутній в живому організмі, не є виділеним, але той же самий (8) полінуклеотид, відділений від деяких або від всіх речовин, що є в природній системі, є виділеним. Більш конкретно, з поняття "виділений" повинні бути виключені: природні хромосоми (такі як хромосомні препарати), штучні хромосомні бібліотеки, геномні бібліотеки і бібліотеки кКДНК, які існують або у вигляді препарату, с зо одержаного на основі нуклеїнової кислоти іп міо, або у вигляді препарату, одержаного на основі трансфікованої/трансформованої клітини-хазяїна, де вказані клітини-хазяї являють собою або гетерогенний со препарат іп мійго або висіваються у вигляді гетерогенної популяції одиничних колоній. Конкретними ю виключеннями також є вищезгадані бібліотеки, де конкретний полінуклеотид складає менше, ніж 595 від числа вставок нуклеїнової кислоти у векторних молекулах. Іншими конкретними виключеннями є геномні ДНК цілих ме) клітин або РНК-препарати цілих клітин (включаючи вказані препарати цілих клітин, які є механічно ї- фрагментованими або ферментативно гідролізованими). Іншими конкретними виключеннями є вищезгадані препарати цілих клітин, одержані або у вигляді іп мійго-препарату, або у вигляді гетерогенної суміші, виділеної шляхом електрофорезу (включаючи перенесення блотів цього препарату), де поліпептид даного винаходу надалі не був виділений з гетерологічних полінуклеотидів в середовищі для електрофорезу « (наприклад, не був підданий подальшому вирізанню однієї смуги з популяції гетерогенних смуг в агарозному гелі пт») с або в найлоновому блоті). . Термін "очищений", що використовується тут, необов'язково означає абсолютну чистоту; а швидше, він має а відносне тлумачення. У конкретних випадках може передбачатися очищення вихідного матеріалу або природного матеріалу, принаймні, першого порядку, а переважно, другого або третього порядків, а більш переважно, четвертого або п'ятого порядків. Прикладом може служити очищення в межах від 0,195-ної -і концентрації до 1095-ної концентрації, що складає очищення другого порядку.

Для ілюстрації, окремі кКДНК-клони, виділені з бібліотеки КДНК, були очищені стандартним способом до ік електрофоретичної гомогенності. Послідовності, одержані з цих клонів, не можуть бути безпосередньо одержані с ні з бібліотеки, ні з повної ДНК людини. Самі клони кКДНК не зустрічаються в природі, і вони можуть бути 5о одержані шляхом модифікації частково очищеної природної речовини (матричної РНК). Перетворення мРНК в со бібліотеку КДНК приводить до утворення синтетичної речовини (кДНК), а чисті окремі клони кДНК можуть бути

Ге виділені з синтетичної бібліотеки шляхом клонального відбору. Так, наприклад, створення бібліотеки кКДНК з матричної РНК і подальше виділення окремих клонів з цієї бібліотеки дає приблизно 107-109-кратне очищення нативного месенджера.

Термін "очищений", що використовується тут, відноситься до поліпептиду або до полінуклеотиду даного винаходу, який був виділений з інших сполук, включаючи, але не обмежуючись ними, поліпептиди або

Ф, полінуклеотиди, вуглеводи, ліпіди і т.п. Термін "очищений" може бути використаний для ідентифікації ко відділення мономерних поліпептидів даного винаходу від олігомерних форм, таких як гомо- або гетеродимери, тримери і т.п. Термін "очищений" може бути також використаний для ідентифікації відділення ковалентно бо пов'язаних полінуклеотидів від лінійних полінуклеотидів. Полінуклеотид є, в основному, чистим в тому випадку, якщо, принаймні, 5095, а переважно, 60-7595 зразка виявляють одиночну полінуклеотидну послідовність і конформацію (лінійну в порівнянні з ковалентно пов'язаною). В основному, чистий поліпептид або полінуклеотид звичайно становить приблизно 5095, а переважно 60-9095 мас. від всього поліпептидного або полінуклеотидного зразка, відповідно, а звичайно його чистота становить приблизно 9595, а переважно, приблизно більше 99965. 65 Чистоту або гомогенність поліпептиду і полінуклеотиду визначають різними способами, добре відомими фахівцям, такими як електрофорез зразка в агарозному або в поліакриламідному гелі, з подальшою візуалізацією одиночної смуги після фарбування геля. Для певної мети може бути використане більш високе застосуванням ВЕРХ або інших способів, добре відомих фахівцям. Як альтернативний варіант здійснення винаходу, чистота поліпептидів і полінуклеотидів даного винаходу може бути визначена як "принаймні, процент чистоти" по відношенню до гетерологічних поліпептидів і полінуклеотидів (ДНК, РНК або обидві цих речовини).

Як переважний варіант здійснення винаходу, поліпептиди і полінуклеотиди даного винаходу мають чистоту, принаймні, 1095, 2095, 3095, 4095, 5095, 6090, 7095, 8095, 9095, 9595, 9695, 9895, 9995 або 10095 по відношенню до гетерологічних поліпептидів і полінуклеотидів, відповідно. В іншому переважному варіанті здійснення винаходу поліпептиди і полінуклеотиди мають чистоту, що знаходиться в межах від будь-якого числа до тисячних часток, 76 від 9095 до 10095 (наприклад, поліпептид або полінуклеотид, принаймні, з чистотою 99,99595) по відношенню до гетерологічних поліпептидів або полінуклеотидів, відповідно, або їх чистота може бути виражена як їх масове відношення до всіх сполук і молекул, крім тих, які присутні в носії. Кожне число, що представляє процент чистоти, аж до тисячних часток, може бути заявлене як окремий тип чистоти.

Термін "поліпептид" означає полімер, що складається з амінокислот, незалежно від довжини цього полімеру; /5 таким чином, в поняття "поліпептид" входять пептиди, олігопептиди і білки. Цей термін не визначає або не виключає посттрансляційні модифікації поліпептидів, так, наприклад, термін "поліпептид" охоплює поліпептиди, які включають ковалентно пов'язані глікозильні групи, ацетильні групи, фосфатні групи, ліпідні групи і т.п. В це визначення входять також поліпептиди, що містять один або декілька аналогів амінокислот (включаючи, наприклад, неприродні амінокислоти, амінокислоти, які присутні тільки в неспоріднених біологічних системах, модифіковані амінокислоти, що походять з систем ссавців і т.п.), поліпептиди із заміщеними зв'язками, а також інші модифікації, відомі фахівцям, як природні, так і неприродні.

Термін "рекомбінантний поліпептид", що використовується тут, означає поліпептиди, які були штучно сконструйовані, і які містять, принаймні, дві поліпептидних послідовності, не присутні як безперервні поліпептидні послідовності в його природному оточенні, або цей термін означає поліпептиди, які були сч об експресовані рекомбінантним полінуклеотидом.

Термін "очищений поліпептид", що використовується тут, означає поліпептид даного винаходу, який був і) виділений з інших сполук, включаючи, але не обмежуючись ними, нуклеїнові кислоти, ліпіди, вуглеводи і інші білки. Поліпептид є, в основному, чистим в тому випадку, якщо, принаймні, 5095, а переважно, 60-7595 зразка складає одиночна поліпептидна послідовність. В основному, чистий поліпептид звичайно становить приблизно су зо 5095, а переважно, 60-9Омас.95 зразка білка, а звичайно, приблизно 9595, а переважно, приблизно більше 9995 по всій масі зразка білка. Чистоту або гомогенність поліпептиду визначають способами, добре відомими фахівцям, со такими як електрофорез зразка в поліакриламідному гелі, з подальшою візуалізацією однієї поліпептидної смуги ю після фарбування геля. Для певної мети може бути використано більш високе розрізнення із застосуванням

ВЕРХ або інших добре відомих способів. (22)

Термін "тварина, відмінна від людини", що використовується тут, означає будь-яке хребетне, відмінне від ї- людини, птахи і, більш звичайно, ссавці, переважно, примати, сільськогосподарські тваринні, такі як свині, кози, вівці, осли і коні, кролики або гризуни, а більш переважно, щури або миші. Термін "тварина", що використовується тут, означає будь-яке хребетне, а переважно, ссавець. У поняття "тварина" і "ссавець", крім тварин, перерахованих вище при визначенні поняття "тварина, відмінна від людини", входить також і людина. «

Термін "антитіло", що використовується тут, означає поліпептид або групу поліпептидів, які складаються, з с принаймні, з одного зв'язуючого домену, де домен, що зв'язується з антитілом, формується внаслідок укладання

Й варіабельних доменів молекули антитіла з утворенням трьохмірних зв'язуючих областей, що мають форму и?» внутрішньої поверхні і розподіл заряду, комплементарні елементам антигенної детермінанти даного антигену, внаслідок чого забезпечується здійснення імунологічної реакції з цим антигеном. Антитілами є рекомбінантні білки, що містять зв'язувальні домени, а також їх фрагменти, включаючи Раб, Раб", Е(аб)» і Р(абв)»-фрагменти. -І Термін "антигенна детермінанта", що використовується тут, означає частину молекули антигену, а в цьому випадку, поліпептид РАРАР, який визначає специфічність реакції "антиген-антитіло". Термін "епітоп" означає ік антигенну детермінанту поліпептиду. Епітоп може містити, принаймні, З амінокислоти в просторовій конформації, с яка є унікальною для цього епітопу. В основному, епітоп містить, принаймні, б таких амінокислот, а звичайно, принаймні, 8-10 таких амінокислот. Методами визначення амінокислот, що є в епітопі, є рентгенівська со кристалографія, 2-мірний ядерний магнітний резонанс і картування епітопу, наприклад, (метод Рерзсап,

Ге описаний Сеузеп еї а). 1984; в публікації РСТ Мо МУО 84/03564; і в публікації РСТ Мо МУО 84/035061.

В описі даного винаходу термін "експресійна нуклеотидна послідовність" може означати або полінуклеотид, або нуклеїнову кислоту. Більш точно, термін "експресійна нуклеотидна послідовність" охоплює сам нуклеїновий ов матеріал, і, таким чином, не обмежується інформацією про послідовність (тобто послідовності букв, вибраної для позначення буквеного коду з чотирьох основ), яка біохімічно характеризує конкретну молекулу ДНК або о РНЮ). ка Взаємозамінні терміни "нуклеїнові кислоти", "олігонуклеотиди" і "полінуклеотиди", що використовуються тут, означають послідовності РНК, ДНК або гібридні послідовності РНК/ДНК, що складаються з більш ніж одного бо НУклеотиду, або в одноланцюговій, або в дуплексній формі. Термін "нуклеотидний", що використовується тут як прикметник, означає молекули, що містять РНК, ДНК або гібридні послідовності РНК/ДНК будь-якої довжини в одноланцюговій або в дуплексній формі. Термін "нуклеотид", що використовується тут як іменник, означає окремі нуклеотиди або ряд нуклеотидів, тобто молекулу або окрему ланку в більш великій молекулі нуклеїнової кислоти, що містить пурин або піримідин, рибозну або дезоксирибозну частину і фосфатну групу, або 65 фосфодіефірний зв'язок у випадку, коли нуклеотиди знаходяться всередині олігонуклеотиду або полінуклеотиду.

Хоча термін "нуклеотид", що використовується тут, охоплює "модифіковані нуклеотиди", які містять, принаймні,

одну з модифікацій: (а) альтернативну зв'язуючу групу, (Б) аналогічну форму пурину, (с) аналогічну форму піримідину або (4) аналогічний цукор, наприклад, аналогічні зв'язувальні групи, пурин, піримідин і цукор,

Ідив., наприклад, РСТ-публікацію Мо М/095/04064). Полінуклеотидні послідовності даного винаходу можуть бути одержані будь-якими відомими методами, включаючи методи синтезу, метод рекомбінантних ДНК, метод ех мімо-генерування або їх комбінації, а також будь-які методи очищення, відомі фахівцям.

Послідовність, яка є "функціонально пов'язаною" з регуляторною послідовністю, такою як промотор, означає, що вказаний регуляторний елемент знаходиться в правильній локалізації і орієнтації по відношенню до нуклеїнової кислоти, і тим самим забезпечує регуляцію ініціації РНК-полімерази і експресію потрібної 7/0 Нуклеїнової кислоти. Термін "функціонально приєднаний", що використовується тут, відноситься до приєднання полінуклеотидних елементів у функціональній залежності. Так, наприклад, промотор або енхансер вважаються "функціонально приєднаними" до кодуючої послідовності, якщо вони впливають на транскрипцію даної кодуючої послідовності.

Терміни "ознака" і "фетотип", що використовуються тут, є взаємозамінними і означають будь-яку видиму, /5 детектовану або як-небудь інакше визначену властивість організму, таку як, наприклад, симптоми або чутливість до захворювання. Звичайно терміни "ознаку" і "фетотип", що використовуються тут, означають симптоми або чутливість до захворювання, позитивну відповідь на лікування або побічні ефекти, асоційовані з цим лікуванням. Переважно, вказаними ознаками можуть бути, але не обмежуються ними, злоякісні пухлини, онтогенетичні захворювання і нервові хвороби.

Термін "алель", що використовується тут, означає варіанти нуклеотидної послідовності. Біалельний поліморфізм має дві форми. Дипольні організми можуть бути гомозиготними або гетерозиготними за алельною формою.

Термін "генотип", що використовується тут, означає ідентичність алелей, присутніх у індивідуума або в зразку. У контексті даного винаходу, "генотип" переважно, означає опис біалельних маркерних алелей, присутніх сч

У індивідуума або в зразку. Термін "визначення генотипу" зразка або індивідуума за біалельним маркером означає визначення специфічного алеля або специфічного нуклеотиду, присутнього в біалельному маркері у і) даного індивідуума.

Термін "мутація", що використовується тут, означає відмінність в ДНК-послідовностях між різними геномами або індивідуумами, або в межах одного генома або індивідуума, частота зустрічальності якого складає менше су зо у.

Термін "поліморфізм", що використовується тут, означає присутність двох або декількох альтернативних со геномних послідовностей або алелей в різних геномах або індивідуумах, або в одному геномі або індивідуумі. ю

Термін "поліморфний" відноситься до стану, при якому в популяції можуть бути виявлені два або декілька варіантів специфічної геномної послідовності. Термін "поліморфний сайт" означає локус, в якому є зміна. ме)

Однонуклеотидний поліморфізм означає заміну одного нуклеотиду іншим нуклеотидом в поліморфному сайті. ї-

Делеція одного нуклеотиду або інсерція одного нуклеотиду також приводить до однонуклеотидного поліморфізму. У контексті даного винаходу термін "однонуклеотидний поліморфізм", переважно, означає заміну в одному нуклеотиді. Звичайно, у різних індивідуумів, поліморфний сайт може бути зайнятий двома різними нуклеотидами. Терміни "біалельний поліморфізм" і "біалельний маркер", що використовуються тут, є « взаємозамінними і означають однонуклеотидний поліморфізм, що має два алелі з високою частотою (ств) с зустрічальності в даній понуляції. Термін "біалельний макерний алель" означає нуклеотидні варіанти, присутні в біалельному маркерному сайті. ;» Термін "розташований вище", що використовується тут, відноситься до вказівки місцеположення в напрямі до 5-кінця полінуклеотиду від конкретної вихідної точки.

Терміни "пари нуклеотидів" і "пари основ Уотсона і Крику", що використовуються тут, є взаємозамінними і -І означають нуклеотиди, які можуть бути пов'язані один з одним водневим зв'язком завдяки ідентичності їх послідовностей так, як це спостерігається в двоспіральній ДНК з тиміновими або урацильними залишками, і, пов'язаними з аденіновими залишками двома водневими зв'язками і з цитозиновими і гуаніновими залишками, с пов'язаними трьома водневими зв'язками |див. 5ігуег, І., Віоспептувзігу 4-й едйіоп, 1995).

Терміни "комплементарний" або "його комплемент", що використовуються тут, відносяться до послідовностей со полінуклеотидів, які здатні утворювати пари основ Уотсона і Крику з іншим конкретним полінуклеотидом

Ге протягом всієї комплементарної області. Відповідно до даного винаходу вважається, що перший олігонуклеотид комплементарний іншому полінуклеотиду, якщо кожна основа першого полінуклеотиду спарена з комплементарною йому основою. Звичайно комплементарними основами вважаються А і Т (абол і У), або Сі 0. ов Термін "комплемент, що використовується отут, є синонімом "комплементарного полінуклеотиду", "комплементарної нуклеїнової кислоти" і "комплементарної нуклеотидної послідовності". Ці терміни (Ф) застосовуються до пар полінукліотидів, виходячи лише тільки з їх послідовностей, але не мають ніякого ка відношення до умов, за яких ці два полінуклеотиди фактично зв'язуються.

Варіанти і фрагменти 1. во Полінуклеотиди

Даний винахід також відноситься до варіантів і фрагментів описаних тут полінуклеотидів, а зокрема, до гена РАРАР, що містить один або декілька біалельних маркерів даного винаходу.

Термін "варіанти полінуклеотидів", що використовується тут, означає полінуклеотиди, які відрізняються від відомого полінуклеотиду. Варіант полінуклеотиду може бути природним варіантом, таким як природний 65 алельний варіант, або він може являти собою варіант, який не зустрічається в природі. Такі неприродні варіанти полінуклеотиду можуть бути одержані методами мутагенезу, включаючи методи, що використовуються для мутагенезу полінуклеотидів, клітин або організмів. Звичайно, відмінності між ними є незначними, тобто нуклеотидні послідовності відомого полінуклеотиду і варіанту мають більшу схожість, а на деяких ділянках, вони взагалі ідентичні.

Відповідно до даного винаходу, варіантами полінуклеотидів є, але не обмежуються ними, нуклеотидні послідовності, які, принаймні, на 9595 ідентичні полінуклеотиду 5ЕО ІЮО МО:1 або 3, або будь-якому полінуклеотидному фрагменту, що складається з 12 суміжних нуклеотидів полінуклеотиду ЗЕО ІЮО МО 1 або 3, а переважно, принаймні, на 9995, більш переважно, принаймні, на 99,595, а найбільш переважно, принаймні, на 99,896 ідентичні полінуклеотиду ЗЕО І МО: 1 або З або будь-якому полінуклеотидному фрагменту, що 7/0 складається з 12 суміжних нуклеотидів полінуклеотиду ЗЕО ІЮ МО 1 або 3.

Нуклеотидні модифікації, присутні у варіанті полінуклеотиду, можуть бути такими, що мовчать, а це означає, що вони не приводять до зміни амінокислот, що кодуються цим полінуклеотидом. Однак, нуклеотидні модифікації можуть також приводити до замін, додавань, делецій, інсерцій і зрізання амінокислот в поліпептиді, що кодується відомою послідовністю. Ці заміни, делеції або додавання можуть включати один або /5 Декілька нуклеотидів. Вказані варіанти можуть мати модифікації в кодуючій або некодуючій області, або в тій і іншій.

Зміни в кодуючій області можуть приводити до продукування консервативних або неконсервативних амінокислотних замін, делецій або додавань.

У контексті даного винаходу, в особливо переважному його варіанті, даний винахід відноситься до 2о полінуклеотидів, що кодують поліпептиди, які, в основному, зберігають ту ж саму біологічну функцію або активність, що і зрілий білок РАРАР, або до полінуклеотидів, що кодують поліпептиди, які зберігають або мають підвищену яку-небудь певну біологічну активність, але знижену яку-небудь іншу біологічну активність.

Полінуклеотидний фрагмент означає полінуклеотид, що має послідовність, яка, загалом, ідентична, але не всій даній нуклеотидній послідовності, а переважно, нуклеотидній послідовності гена РАРАР і його варіантів. сч

Цей фрагмент може бути частиною інтрону або екзону гена РАРАР. Він може бути також частиною регуляторних областей РАРАР. о

Такі фрагменти можуть бути знаходитися у "вільному стані", тобто вони не є частиною інших полінуклеотидів або не пов'язані з іншими полінуклеотидами, або вони можуть знаходитися в одному більш великому полінуклеотиді, частину або ділянку якого вони утворюють. Дійсно, декілька з цих фрагментів можуть бути с зо присутніми в одному більш великому полінуклеотиді.

Необов'язково такі фрагменти можуть складатися, або, в основному, складатися з безперервної ділянки, со принаймні, з 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів. ю 2. Поліпептиди

Даний винахід також відноситься до варіантів, фрагментів, аналогів і похідних описаних тут поліпептидів, (22)

Зв Включаючи мутовані білки РАРАР. ї-

Таким варіантом може бути 1) варіант, в якому один або декілька амінокислотних залишків замінені консервативними або неконсервативними амінокислотними залишками, і такі замінені амінокислотні залишки можуть кодуватися, а можуть і не кодуватися генетичним кодом, або 2) варіант, в якому один або декілька амінокислотних залишків включають заміщуючу групу або 3) варіант, в якому мутований РАРАР приєднаний до « іншої сполуки, такої як сполука, яка збільшує час півжиття поліпептиду (наприклад, поліетиленгліколь), або 4) з с варіант, в якому до мутованого РАРАР приєднані додаткові амінокислоти, такі як лідерна або секреторна послідовність або послідовність, яка використовується для очищення мутованого РАРАР або передпослідовності з білка. Очевидно, що такі варіанти входять в об'єм даного винаходу.

Поліпептидний фрагмент являє собою поліпептид, що має послідовність, яка повністю аналогічна частині, але не всій послідовності даного поліпептиду, а переважно, поліпептид, що кодується геном РАРАР і його -І варіантами.

У разі заміни амінокислот в амінокислотній послідовності поліпептиду даного винаходу одна або декілька ік амінокислот можуть бути замінені "еквівалентними" амінокислотами. Термін експресована "еквівалентна" с амінокислота, що використовується тут, використовується для позначення будь-якої амінокислоти, яка може бути заміщена однією з амінокислот, що має аналогічні властивості, які, наприклад, як відомо фахівцеві в со області пептидної хімії, в основному, не повинні змінювати передбачувану вторинну структуру і гідропатичну

Із природу даного поліпептиду. Звичайно, еквівалентні заміни можуть бути зроблені в межах нижченаведених груп амінокислот: (1) Аа, Рго, Су, Сім, Авр, Сіп, Авп, Зег, ТАг; (2) Сув, Зег, Туг, ТАиг; (3) Маї, Не, Геиц, Меї,

Аа, РНе; (4) Гуз, Ага, Нів; (5) Ре, Туг, Тгр, Нів.

Конкретними варіантами модифікованої пептидної молекули РАРАР, що представляє інтерес для даного винаходу, є, але не обмежуються ними, пептидна молекула, яка володіє резистентністю до протеолізу; пептид, в

Ф) якому пептидний зв'язок -СОМН- модифікований і замінений на відновлений зв'язок (СН МН), ка ретро-інверсо-зв'язок (МНСО), метиленокси-зв'язок (СН 20), тіометиленовий зв'язок (СН 25), карба-зв'язок (СНЬСН»о), цетометиленовий зв'язок (СО-СН 5), гідроксіетиленовий зв'язок (СНОН-СН 5), зв'язок (М-М), во Е-альценовий зв'язок або також зв'язок -«СН-СН-. Даний винахід також відноситься до людського поліпептиду

РАРАР або до його фрагмента або варіанту, в яких, принаймні, один пептидний зв'язок був модифікований як описано вище.

Вказані фрагменти можуть знаходитися у "вільному стані", тобто не є частиною інших поліпептидів або не бути приєднаними до інших поліпептидів, або вони можуть знаходитися в одному більш великому поліпептиді, в5 частину або область якого вони утворюють. Однак, в одному більш великому поліпептиді можуть знаходитися декілька фрагментів.

Як репрезентативні приклади поліпептидних фрагментів даного винаходу можуть бути згадані фрагменти, що мають довжину приблизно в 5, 6, 8, 9 або 10-15, 10-20, 15-40 або 30-55 амінокислот. Переважними є фрагменти, що містять, принаймні, одну амінокислотну мутацію в білці РАРАР.

Ідентичність між нуклеїновими кислотами або поліпептидами

Терміни "процент ідентичності послідовності" і "процент гомології, що використовуються тут, є взаємозамінними і означають міру ідентичності і гомології полінуклеотидів і поліпептидів, яка визначається шляхом порівняння двох первинних послідовностей, що оптимально зіставляються у "вікні порівняння", де частина полінуклеотидної або поліпептидної послідовності в даному "вікні" порівняння може містити додавання 70 або делеції (тобто пропуски) в порівнянні з еталонною послідовністю (яка не містить цих додавань або делецій), де ці додавання або делеції були внесені для оптимального вирівнювання цих двох послідовностей.

Процент обчислюють шляхом визначення числа положень, в яких знаходяться ідентичні основи нуклеїнової кислоти або амінокислотні залишки в обох послідовностях, внаслідок чого одержують число відповідних положень, ділять одержане число відповідних положень на загальне число положень у "вікні" порівняння і одержаний результат множать на 100 з одержанням процента ідентичності послідовностей. Гомологію оцінюють з використанням будь-якого ряду алгоритмів і програм для порівняння послідовностей, відомих фахівцям.

Такими алгоритмами і програмами є, але не обмежуються ними, ТВІАЗТМ, ВІ АБТР, ЕРАЗТА, ТЕРА5ТА і

СГОБТАЇУУ (Реаггоп 5 Ііртап, 1988; Айвспш еї аЇ,, 1990; Тпотрзоп еї аї., 1994; Нірддіпв еї аї., 1996;

Акнаспи! еї аї., 1990; Аеспці еї а. 1993). В особливо переважному варіанті здійснення даного винаходу гомологію послідовностей білків і нуклеїнових кислот оцінюють з використанням програми "Вазвіс І оса! АІїдптепі

Зеагсп Тоо!" ("ВІ АТ") (програми пошуку в базах даних за допомогою локального вирівнювання послідовностей), добре відомої фахівцям (див. наприклад, Кагііп 8: АЇеспші, 1990; Айеспці еї аїЇ., 1990, 1993, 1997). Зокрема, для рішення нижченаведених задач були використані п'ять конкретних програм ВІ А5Т: (1) ВІАБТР і ВІАБТЗ здійснюють порівняння амінокислотної послідовності, що запитується, з сч г послідовностями білка бази даних; (2) ВІАБТМ здійснює порівняння нуклеотидної послідовності що запитується, з нуклеотидними і) послідовностями бази даних; (3) ВІАЗТХ здійснює порівняння концептуальних продуктів трансляції в шести рамках зчитування нуклеотидної послідовності (обох ланцюгів), що запитується, з послідовностями білка бази даних; с зо (4) ТВ АЗТМ здійснює порівняння послідовності білка нуклеотидних послідовностей, що запитується, з нуклеотидними послідовностями бази даних, що транслюються у всіх шести рамках зчитування; і со (53 ТВІАБЗТХ здійснює порівняння продуктів трансляції в шести рамках зчитування нуклеотидної ю послідовності, що запитується, з продуктами трансляції нуклеотидних послідовностей бази даних в шести рамках зчитування. Ме

Програми ВГА5БТ дозволяють ідентифікувати гомологічні послідовності шляхом ідентифікації аналогічних ї- сегментів, названих тут "пари сегментів з високою оцінкою", для амінокислотної послідовності, що запитується, або послідовності нуклеїнової кислоти і тест-послідовності, яка була одержана, переважно, з бази даних послідовностей білка або нуклеїнової кислоти. Пари сегментів з високою оцінкою переважно ідентифікують (тобто зіставляють) методами, в яких використовують оціночну матрицю, і багато які з яких відомі фахівцям. «

Переважно, оціночною матрицею, що використовується, є матриця ВГОЗОМБ2 (Соппеї еї аї!., 1992; Непікої 8 з с Непікоїї, 1993). Можуть бути також використані матриці РАМ або РАМ250О, але вони є менш переважними (див. наприклад, Зспмагіг 5 Оаупйоїї, едз., 1978). Програми ВІ А5Т дозволяють оцінювати статистичну значущість всіх з ідентифікованих пар сегментів з високою оцінкою, і переважно, відбирати ті сегменти, які задовольняють визначеному користувачем порогу значущості, такому як визначений користувачем процент гомології.

Переважно, статистичну значущість пари сегментів з високою оцінкою визначають за формулою статистичної -І значущості Кагіїп (див. наприклад, Кагіїп 5 АЇвспиі, 1990).

Програми ВІАБЗТ можуть бути використані з параметрами за умовчанням або з модифікованими і, параметрами, введеними користувачем. с Жорсткі умови гібридизації

Для визначення нуклеїнової кислоти, що гібридизується, даного винаходу, були використані наступні жорсткі со умови гібридизації:

Ге стадію гібридизації здійснюють при 6592С в присутності буфера 6455, Бхрозчину Денхардта, 0,596 ДСН і 100мкг/мл ДНК сперми лосося.

Після стадії гібридизації здійснюють чотири стадії промивання: - два промивання протягом 5 хвилин, переважно, при 652С в буфері 2х5552 і 0,195 ДСН; - одне промивання протягом 30 хвилин, переважно, при 6 5 С в буфері 2х5552 і 0,195 ДСН; о - одне промивання протягом 10 хвилин, переважно, при 652С в буфері 0,1х5552 і 0,195 ДСН, їмо) ці умови гібридизації є відповідними для молекули нуклеїнової кислоти довжиною приблизно в 20 нуклеотидів. Немає необхідності пояснювати, що описані вище умови гібридизації повинні бути адаптовані 60 відповідно до довжини потрібної нуклеїнової кислоти методами, добре відомими фахівцям. Відповідні умови гібридизації можуть бути, наприклад, адаптовані відповідно до методів, описаних в книзі Натез 5 Ніддіпз (1985).

Геномні послідовності гена РАРАР

Даний винахід відноситься до геномної послідовності РАРАР. Даний винахід охоплює ген РАРАР або геномні послідовності РАРАР, що складаються або в основному складаються з послідовності ЗЕС ІЮ МО:З3, або що б5 містять вказану послідовність; комплементарну їй послідовність; а також її фрагменти і варіанти. Вказані полінуклеотиди можуть бути очищеними, виділеними або рекомбінантними.

Нуклеіїновими кислотами РАРАР є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, або в основному складаються або складаються з вказаної безперервної ділянки, що охоплює, принаймні, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮ МО:З або комплементарної послідовності. Нуклеїновими кислотами РАРАР можуть бути також виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, або в основному складаються або складаються з вказаної безперервної ділянки, що охоплює, принаймні, 12, 15, 18, 20,25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів, вибраних з групи нуклеотидів в положеннях 1-3038, 1-421, 422-557, 2158-2218 і 2620-3039 послідовності 5ЗЕО І МО:З3 або 70 комплементарної послідовності. Даний винахід також охоплює очищений, виділений або рекомбінантний полінуклеотид, що містить нуклеотидну послідовність, яка, принаймні, на 70, 75, 80, 85, 90 або 9595 ідентична нуклеотидній послідовності ЗЕО І МО:З або комплементарній послідовності або її фрагменту. Відмінності в нуклеотидах по відношенню до нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮ МО:З можуть бути, в основному, випадково розподілені по всій довжині нуклеїнової кислоти. Проте переважними нуклеїновими кислотами є нуклеїнові /5 КИСЛОТИ, В ЯКИХ відмінності в нуклеотидах по відношенню до нуклеотидної послідовності з«ЕО ІЮ МО:З переважно локалізовані за межами кодуючих послідовностей, що містяться в екзонах. Ці нуклеїнові кислоти, а також їх фрагменти і варіанти можуть бути використані як олігонуклеотидні праймери або зонди для детекції присутності копії гена РАРАР в зразку, що тестується, або альтернативно, для ампліфікації потрібної нуклеотидної послідовності в послідовностях РАРАР. Іншим об'єктом даного винаходу є очищена, виділена або рекомбінантна 2о НУуклеїнова кислота, яка гібридизується в жорстких умовах гібридизації, описаних вище, з нуклеотидною послідовністю ЗЕО ІЮ МОЗ або з її комплементарною послідовністю або з її варіантом.

Хоча цей розділ озаглавлений Теномні послідовності РАРАР", однак, потрібно зазначити, що фрагменти нуклеїнової кислоти, що мають будь-який розмір і будь-яку послідовність, можуть також охоплювати описані в цьому розділі полінуклеотиди, що фланкують геномні послідовності РАРАР на будь-якій стороні вказаних сч ор геномних послідовностей або між двома або декількома такими послідовностями.

КДНКЕ-послідовності РАРАР (8)

Було показано, що експресія гена РАРАР приводить до продукування, принаймні, однієї молекули мРНК, нуклеотидна послідовність якої представлена в ЗЕОІЮОМО:1.

Іншим об'єктом даного винаходу є, очищена, виділена або рекомбінантна нуклеїнова кислота, що містить с зо Нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ МО:1; комплементарні їй послідовності, а також її алельні варіанти і фрагменти. Крім того, переважними полінуклеотидами даного винаходу є очищені, виділені або рекомбінантні со

КДНК РАРАР, що складаються або в основному складаються з послідовності ЗЕО ІЮ МО, або містять цю ю послідовність. Особливо переважними нуклесновими кислотами даного винаходу є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, або в основному складаються або складаються з Ме) безперервної ділянки, що охоплює, принаймні, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, ї- 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО ІЮ МО:1 або комплементарної послідовності.

Нуклеїновими кислотами також є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, принаймні, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів ЗЕО І МО:1 або комплементарної послідовності, де вказана безперервна ділянка «

Включає, принаймні, 1, 2, З, З або 10 з нижченаведених нуклеотидних положень ЗЕСО ІЮ МО:1: 1-140, 141-460, "-ь) с 460-690, 87-346 і 691-1104. ІНШИМИ переважними варіантами здійснення даного винаходу є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, принаймні, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, з 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів 5ЕО І МО:1 або комплементарну послідовність, де вказана безперервна ділянка охоплює біалельний маркер.

Даний винахід також відноситься до виділеної або очищеної нуклеїнової кислоти, що містить полінуклеотид, -і що має, принаймні, 9595-ну ідентичність нуклеотидів з полінуклеотидом ЗЕО ІЮ МО:1, переважно, 9995-ну ідентичність, переважно, 99,595-ну ідентичність, а найбільш переважно, 99,895-ну ідентичність нуклеотидів з ік полінуклеотидом 5ЕО ІЮО МО: 1, або з комплементарною послідовністю або з її біологічно активним фрагментом. с Іншим об'єктом даного винаходу є очищені, виділені або рекомбінантні нуклеїнові кислоти, що містять 5ор полінуклеотид, який гібридизується у вищезгаданих жорстких умовах гібридизації з полінуклеотидом 5ЕО ІЮ со МО:1 або з комплементарною послідовністю або з його варіантом або з біологічно активним фрагментом.

Ге КДНК ЗЕО ІО МО:1 включає 5ШТК-область, що починається від нуклеотиду в положенні 1 і закінчується нуклеотидом в положенні 86 5ЕО ІЮ МО:1. кКДНК ЗЕО ІЮО МО:1 включає З'ТК-область, що починається від нуклеотиду в положенні 347 і закінчується нуклеотидом в положенні 1104 5ЕО ІЮО МО:1. Сигнал поліаденілування дв починається від нуклеотиду в положенні 1085 і закінчується нуклеотидом в положенні 1104 ЗЕО ІЮ МОЛ.

Отже, даний винахід відноситься до очищеної, виділеної або рекомбінантої нуклеїнової кислоти, що містить

Ф) нуклеотидну послідовність 5'ШТК кДНК РАРАР, комплементарну їй послідовність або її алельний варіант. Даний ка винахід також відноситься до очищеної, виділеної або нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність З'ЮТК кКДНК РАРАР, комплементарну їй послідовність або її алельний варіант. во Хоча цей розділ озаглавлений "КДНК послідовності РАРАР", однак, потрібно зазначити, що фрагменти нуклеїнової кислоти, що мають будь-який розмір і будь-яку послідовність, можуть також охоплювати описані в цьому розділі полінуклеотиди, що фланкують геномні послідовності РАРАР на будь-якій стороні вказаних геномних послідовностей або між двома або декількома такими послідовностями.

Кодуючі послідовності 65 Відкрита рамка зчитування РАРАР міститься у відповідній МРНК ЗЕО ІЮ МО:1. Більш точно, ефективна кодуюча послідовність РАРАР (СО5) включає область, розташовану між нуклеотидом в положенні 87 (перший нуклеотид кодона АТС) і нуклеотидом в положенні 346 (кінцевий нуклеотид кодона ТА) 5ЕО ІЮ МО 1. Даний винахід також відноситься до виділених, очищених і рекомбінантних полінуклеотидів, що кодують безперервну ділянку, принаймні, з 6 суміжних амінокислот, переважно, принаймні, 8 або 10 суміжних амінокислот, а більш переважно, принаймні, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 суміжних амінокислот послідовності ЗЕО ІЮ МО:2.

Вищеописаний полінуклеотид, який містить кодуючу послідовність гена РАРАР, може бути експресований в потрібній клітині-хазяїні або в потрібному організмі-хазяїні при вміщенні цього полінуклеотиду під контроль відповідних сигналів експресії. Сигналами експресії можуть бути або сигнали, що містяться в регуляторних областях в гені РАРАР даного винаходу, або, навпаки, цими сигналами можуть бути екзогенні регуляторні 70 послідовності нуклеїнової кислоти.

Такий полінуклеотид, що вміщується під контроль відповідних сигналів експресії, може бути також вбудований у вектор для його експресії і/або ампліфікації.

Регуляторні послідовності

РАРАР

Як згадувалося вище, геномна послідовність гена РАРАР містить регуляторні послідовності в некодуючій 5-рланкуючій області і в некодуючій 3'і-фланкуючій області, яка межує з кодуючою областю РАРАР, що містить три екзони цього гена.

Полінуклеотиди, що походять від 5- і З'-регуляторних областей, можуть бути використані для детекції присутності, принаймні, однієї копії нуклеотидної послідовності ЗЕСО ІЮО МО:З або її фрагмента в зразку, що го тестується.

Промоторна активність 5'-регуляторних областей, що знаходяться в РАРАР, може бути оцінена, як описано нижче.

Для ідентифікації відповідних біологічно активних полінуклеотидних фрагментів або варіантів ЗЕО ІЮ МО:З потрібно звернутися до книги ЗатрбгоокК еї аІ. (ЗатбгоокК, 1989), де описано використання рекомбінантного сч ов вектора, що несе маркерний ген (тобто ген бета-галактозидази, хлорамфеніколацетилтрансферази і т.п.), експресія якого може детектуватись при його вміщенні під контроль біологічно активних полінуклеотидних і) фрагментів або варіантів ХЕО ІЮ МО:3. Геномні послідовності, локалізовані вище першого екзону гена РАРАР, клонували в репортерний вектор з відповідним промотором, таким як розЕАР-основа, розЕАР-енхансер, рРоааІ-основа, рРодаІ-енхансер, або в репортерні вектори з відповідним промотором, рЕСЕР-1, що с зо Виготовляються Сіопіеси, або вектор "роОІ 2-основа" або ро З-основа з репортерним геном люциферази без промотору, що виготовляється Рготеда. Коротко, кожний з цих векторів з промотором включає сайти со множинного клонування, розташовані вище репортерного гена, що кодує білок, який легко оцінюється, такий як ю секретована лужна фосфатаза, люцифераза, В-галактозидаза або білок, який флуоресціює в "зеленому" діапазоні спектра. Послідовності, розташовані вище кодуючої області РАРАР, вбудовують в сайти клонування ме) з5 вище від репортерного гена в обох орієнтаціях, і вводять у відповідну клітину-хазяїна. Рівень репортерного ї- білка аналізують і порівнюють з рівнем, одержаним від вектора, у якого відсутня вставка в сайті клонування.

Підвищений рівень експресії у векторі, що містить цю вставку, в порівнянні з контрольним вектором, вказує на присутність промотору в даній вставці. Якщо необхідно, то вищерозташовані послідовності можуть бути клоновані у вектори, що містять енхансер для підвищення рівня транскрипції, здійснюваної під контролем « послідовностей слабкого промотору. Значний рівень вищезгаданої експресії, що спостерігається у векторі, У з с якого відсутня вставка, вказує на те, що промоторна послідовність присутня у вбудованій вищерозташованій послідовності. ;» Промоторна послідовність у вищерозташованій геномній ДНК може бути потім визначена шляхом конструювання гніздових 5' і/або 3' делецій у вищерозташованій ДНК з використанням стандартної техніки, такої

Як гідроліз екзонуклеазою ЇЇ або відповідною рестриктуючою ендонуклеазою. Одержані делеційні фрагменти -І можуть бути вбудовані в репортерний вектор з промотором для того, щоб визначити, чи надає ця делеція ослабляючий або повністю інгібуючий вплив на активність промотору, такий, як, наприклад, описано в роботі ік Соїез еї а). (1998), опис якої у всій своїй повноті вводиться в дану заявку за допомогою посилання. Таким с чином, можуть бути визначені межі цих промоторів. Якщо це необхідно, то потенційні окремі регуляторні сайти всередині цього промотору можуть бути ідентифіковані з використанням сайт-направленого мутагенезу або со лінкерного сканування або окремо, або в комбінації для елімінації потенційних сайтів скріплення з факторами

Ге транскрипції всередині цього промотору. Вплив цих мутацій на рівні транскрипції може бути визначений шляхом введення мутацій в сайти клонування в репортерні вектори з промотором. Аналізи такого типу добре відомі фахівцям і (описані в УМО 97/17359, в патенті СІЛА Мо5374544; в ЕР 582796; в патенті США Мо5698389; в патенті

США Мо5643746; в патенті США Мо5502176 і в патенті США Мо5266488)|; опис яких у всій своїй повноті вводяться в дану заявку за допомогою посилання.

Ф) Сила і специфічність промотору гена РАРАР може бути оцінена за рівнями експресії детектованого ка полінуклеотиду, функціонально пов'язаного з промотором РАРАР, в клітинах і тканинах різних типів.

Детектований полінуклеотид може бути або полінуклеотидом, який специфічно гібридизується із заздалегідь бо визначеним олігонуклеотидним зондом, або з полінуклеотидом, що кодує детектований білок, включаючи поліпептид РАРАР або його фрагмент або варіант. Цей тип аналізу добре відомий фахівцям і |описаний в патенті

США Мо 5502176 і в патенті США Мо 52664881), опис яких у всій своїй повноті вводяться в дану заявку за допомогою посилання. Деякі з цих методів більш детально описані нижче.

Полінуклеотиди, що несуть регуляторні елементи, локалізовані у 5-кінця і у 3-кінця кодуючої області 65 РАРАР, можуть бути використані переважно для регуляції транскрипційної і трансляційної активності потрібного гетерологічного полінуклеотиду.

Таким чином, даний винахід також відноситься до очищеної або виділеної нуклеїнової кислоти, що включає полінуклеотид, вибраний з групи, що складається з 5- і З'єрегуляторних областей, або до комплементарної послідовності або до її біологічно активного фрагмента або варіанту. У одному з своїх аспектів "Б'-регуляторна область" містить нуклеотидну послідовність, локалізовану між положеннями 1 і 421 5ЕО ІЮО МО:3.

У одному з аспектів даного винаходу "3'-регуляторна область" містить нуклеотидну послідовність, локалізовану між положеннями 3040 і 3189 ЗЕО ІЮ МО:3.

Даний винахід також відноситься до очищеної або виділеної нуклеїнової кислоти, що містить полінуклеотид, що має, принаймні, 9595-ну ідентичність нуклеотидів з полінуклеотид ом 5ЕО ІЮ МО, вибраним з групи, що /о складається з 5- і З-регуляторних областей, переважно, 9995-ну ідентичність, переважно, 99,595-ну ідентичність, а найбільш переважно, 99,895-ну ідентичність з полінуклеотидом ЗЕО ІЮ МО:1, вибраним з групи, що складається з 5- і З'-регуляторних областей, або з комплементарною послідовністю або його біологічно активним фрагментом.

Іншим об'єктом даного винаходу є очищена або виділена нуклеїнова кислота, що містить полінуклеотид, який 7/5 Пібридизується в описаних тут жорстких умовах гібридизації, описаних вище, з полінуклеотидом, вибраним з групи, що складається з нуклеотидних послідовностей 5'- і З'-регуляторних областей, або з комплементарною послідовністю або з його варіантом або біологічно активним фрагментом.

Переважні фрагменти 5'-регуляторної області мають довжину приблизно 1500 або 1000 нуклеотидів, а переважно, приблизно 500 нуклеотидів, більш переважно, приблизно 400 нуклеотидів, ще більш переважно, 300 нуклеотидів, а найбільш переважно, приблизно 200 нуклеотидів.

Переважні фрагменти 3'-регуляторної області мають довжину, принаймні, 50, 100,150, 200, 300 або 400 основ. "Біологічно активними" похідними полінуклеотидів ЗЕО ІЮ МО:З є полінуклеотиди, що містять фрагмент, або, альтернативно, які містяться у фрагменті вказаного полінуклеотиду, який є функціональною регуляторною сч областю, що контролює експресію рекомбінантного поліпептиду або рекомбінантного полінуклеотиду в рекомбінантній клітині-хазяїні. Він може діяти як енхансер або як репресор. і)

Відповідно до даного винаходу, нуклеїнова кислота або полінуклеотид є "функціональними" як регуляторна область, що контролює експресію рекомбінантного поліпептиду або рекомбінантного полінуклеотиду, в тому випадку, якщо вказаний регуляторний полінуклеотид має нуклеотидні послідовності, які містять транскрипційні і с зо трансляційні регуляторні послідовності, і такі послідовності є "функціонально приєднаними" до нуклеотидних послідовностей, які кодують потрібний поліпептид або потрібний полінуклеотид. со

Регуляторні полінуклеотиди даного винаходу можуть бути одержані з нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮ ю

МО:З шляхом розщеплення відповідними рестриктуючими ферментами, як описано, наприклад, в книзі Затргоок еї а). (1989). Регуляторні полінуклеотиди можуть бути також одержані шляхом гідролізу ЗЕО ІЮ МО:З ферментом ме) зв екзонуклеазою, такою як Ва131 (Ууаріко еї а/!., 1986). Ці регуляторні полінуклеотиди можуть бути також одержані ї- шляхом хімічного синтезу нуклеїнових кислот, як описано в даній заявці.

Регуляторні полінуклеотиди даного винаходу можуть бути частиною рекомбінантного експресуючого вектора, який може бути використаний для експресії кодуючої послідовності в потрібній клітині-хазяїні або в організмі-хазяїні. Рекомбінантні експресуючі вектори даного винаходу описані в даній заявці. «

Переважно, 5'-регуляторний полінуклеотид даного винаходу включає 5'-нсетрансльовану область (5'ЮТК) з с КДНК РАРАР або її біологічно активний фрагмент або варіант. . Переважно, З'-регуляторний полінуклеотид даного винаходу включає 3'-нетрансльовану область (З'ЮТК) и?» КДНК РАРАР або її біологічно активний фрагмент або варіант.

Іншим об'єктом даного винаходу є очищена або виділена нуклеїнова кислота, що включає: а) нуклеїнову кислоту, що містить регуляторну нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з: -І (Ї) нуклеотидної послідовності, що містить полінуклеотид 5'-регуляторної області, або комплементарної їй послідовності; се) (ї) нуклеотидної послідовності, що містить полінуклеотид, що має, принаймні, 9595-ну ідентичність з с нуклеотидною послідовністю 5'-регуляторної області, або комплементарної їй послідовності; (її) нуклеотидної послідовності, що містить полінуклеотид, який гібридизується в жорстких умовах со гібридизації з нуклеотидною послідовністю 5'-регуляторної області, або з комплементарною послідовністю; і

Ге (ім) біологічно активного фрагмента або варіанту полінуклеотидів в (і), (ії) і (іїї);

Б) полінуклеотид, що кодує потрібний поліпептид або потрібну нуклеїнову кислоту і функціонально приєднаний до нуклеїнової кислоти, визначеної вище в (а); с) необов'язково, нуклеїнову кислоту, що містить З'-регуляторний полінуклеотид, переважно,

З'-регуляторний полінуклеотид гена РАРАР.

Ф) У конкретному варіанті визначеної вище нуклеїнової кислоти вказана нуклеїнова кислота включає ка 5'-ч-етрансльовану область (5'ТК) кКДНК РАРАР або її біологічно активний фрагмент або варіант.

У другому конкретному варіанті визначеної вище нуклеїнової кислоти вказана нуклеїнова кислота включає бор З-нетрансльовану область (З'СТК) КДНК РАРАР або її біологічно активний фрагмент або варіант.

Регуляторний полінуклеотид 5'-регуляторної області або його біологічно активні фрагменти або варіанти функціонально приєднані у 5-кінця полінуклеотиду, що кодує потрібний поліпептид або полінуклеотид.

Регуляторний полінуклеотид З'-регуляторної області або його біологічно активні фрагменти або варіанти функціонально приєднані переважно у 3'-кінця полінуклеотиду, що кодує потрібний поліпептид або 65 полінуклеотид.

Потрібний поліпептид, що кодується вищеописаною нуклеїновою кислотою, може мати будь-яку природу або будь-яке походження, включаючи білки прокаріотів або еукаріотів. Поліпептидами, експресованими під контролем регуляторної області РАРАР, є бактеріальні, грибкові або вірусні антигени. Такі поліпептиди також охоплюють еукаріотичні білки, такі як внутрішньоклітинні білки, наприклад, білки "домашнього господарства", мембрано-асоційовані білки, такі, як рецептори, і секретовані білки, наприклад, ендогенні медіатори, такі як цитокіни. Потрібним поліпептидом може бути білок РАРАР, а зокрема, білок амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ

МО:2 або її фрагмент або варіант.

Потрібні нуклеїнові кислоти, що кодуються вищезгаданим полінуклеотидом, звичайно РНК-молекула, можуть бути комплементарні потрібному кодуючому полінуклеотиду, наприклад, РАРАР-кодуючій послідовності, а тому 7/0 Вони можуть бути використані як антисмисловий полінуклеотид.

Такий полінуклеотид може бути включений в рекомбінантний експресуючий вектор для експресії потрібного поліпептиду або потрібної нуклеїнової кислоти в клітині-хазяїні або організмі-хазяїні. Відповідні рекомбінантні вектори, які містять визначений тут полінуклеотид, описані в інших розділах даної заявки.

Полінуклеотидні конструкції

Терміни "полінуклеотидна конструкція" і "рекомбінантний полінуклеотид", що використовуються тут, є взаємозамінними і означають лінійний або кільцевий, очищений або виділений полінуклеотид, який був штучно сконструйований, і який містить, принаймні, дві нуклеотидних послідовності, що не є суміжними нуклеотидними послідовностями в їх природному оточенні.

ДНК-конструкція, яка регулює тимчасову і просторову експресію гена РАРАР в рекомбінантних Клітинах-хазяях і в трансгенних тваринах

Для дослідження фізіологічних і фенотипічних наслідків відсутності синтезу білка РАРАР, як на клітинному рівні, так і в багатоклітинному організмі даний винахід також охоплює ДНК-конструкції і рекомбінантні вектори, що забезпечують залежну від зовнішніх умов експресію специфічного алеля геномної послідовності або

КДНК-послідовності гена РАРАР, а також копії цієї геномної послідовності або кДНК, що має заміни, делеції або сч ов додавання однієї або декількох основ, в порівнянні з нуклеотидною послідовністю РАРАР ЗЕО ІО МО 1 і 3, або її фрагментом, де вказані заміни, делеції або додавання основ є або в екзоні, або в інтроні, або в регуляторній (8) послідовності, але переважно, в 5'-регуляторній послідовності або в екзоні геномної послідовності РАРАР або в

КДНК РАРАР 5ЕО ІЮ МО:1. У переважному варіанті здійснення винаходу послідовність РАРАР містить біалельний маркер. с зо Даний винахід відноситься до рекомбінантних векторів, що містять будь-який з полінуклеотидів, описаних в даному винаході. Більш конкретно, полінуклеотидні конструкції даного винаходу можуть включати будь-який со полінуклеотид, описаний в розділах "Геномні послідовності гена РАРАР", "КДНК-послідовності РАРАР", "Кодуючі ю області" і "Олігонуклеотидні зонди і праймери".

Перша переважна ДНК-конструкція основана на опероні резистентності до тетрацикліну (Феї, що походить від ме) зв транспозону Тп10 Е.соїї, і що використовується для регуляції експресії гена РАРАР, як описано боззеп еї а). ї- (1992, 1995) і Бий еї а. (1994). Така ДНК-конструкція містить сім операторних послідовностей (еї від Тп10 (Іеюор), які приєднані або до мінімального промотору, або до 5'-регуляторної послідовності гена РАРАР, де вказаний мінімальний промотор або вказана регуляторна послідовність гена РАРАР функціонально приєднана до потрібного полінуклеотиду, який кодує смисловий або антисмисловий олігонуклеотид, або поліпептид, «

Включаючи поліпептид РАРАР або його пептидний фрагмент. Ця ДНК-конструкція є функціональною відносно з с залежною від зовнішніх умов експресії потрібної нуклеотидної послідовності, в тому випадку, коли та ж сама . клітина також містить нуклеотидну послідовність, що кодує репресор дикого типу (ТА) або мутантний репресор и?» (ТА), приєднаний до активуючого домену вірусного білка МР16 вірусу простого герпеса, що знаходиться під контролем промотору, такого як енхансер/промотор НСММІЄЇ ММТУ-І ТК. Дійсно, переважна ДНК-конструкція даного винаходу включає полінуклеотид, що містить послідовності оператора (геї, і полінуклеотид, що містить -І послідовність, що кодує репресор ІТА або гТА.

У конкретному варіанті здійснення винаходу ДНК-конструкція із залежною від зовнішніх умов експресією ік містить послідовність, що кодує мутантний тетрацикліновий репресор гТА, де експресія потрібного с полінуклеотиду не відбувається у відсутності тетрацикліну і індукується в його присутності.

ДНК-конструкції. що сприяють гомологічній рекомбінації: со вектори заміщення

Ге Друга переважна ДНК-конструкція містить від 5-кінця до 3-кінця: (а) першу нуклеотидну послідовність, яка міститься в геномній послідовності РАРАР; (Б) нуклеотидну послідовність, що містить маркер позитивного відбору, такий як маркер резистентності до неоміціну (песо); і (с) другу нуклеотидну послідовність, яка ов ЗНаХОДИТЬСЯ В геномній послідовності РАРАР і розташована на геномі нижче першої нуклеотидної послідовності

РАРАР (а).

Ф) У переважному варіанті здійснення винаходу ця ДНК-конструкція також включає маркер негативного відбору, ка розташованого вище нуклеотидної послідовності (а) або нижче нуклеотидної послідовності (с). Маркер негативного відбору, переважно, містить ген тимідинкінази (ІК) (ТПпотаз еї аї., 1986), ген гігроміцину-бета 6о (Те Ківїе еї а. 1990), ген прі (Мап дег Гцді ей аї., 1991; Кеїй еї аї., 1990) або ген фрагмента дифтерійного токсину А (01-А) (Маада еї аї!., 1993; Маді еї аІ., 1990). Маркер позитивного відбору, переважно, локалізований в послідовності екзону РАРАР, так, що він перериває послідовність, що кодує білок РАРАР. Ці вектори заміщення описані, наприклад, Топаз еї аї. (1986; 1987), Мапзоитг еї а). (1988) і Коїег ейа!. (1992).

Перша і друга нуклеотидні послідовності (а) і (с) можуть бути незалежно локалізовані в регуляторній 65 послідовності РАРАР, в інтронній послідовності, в екзонній послідовності або в послідовності, що містить регуляторну і/або інтронну і/або екзонну послідовності. Розмір нуклеотидних послідовностей (а) і (с) складає в межах від 1 до 50 т.п.н., переважно, від 1 до 10 т.п.н., більш переважно, від 2 до 6 т.п.н., а найбільш переважно, від 2 до 4 т.п.н.

ДНК-конструкції, що сприяють гомологічній рекомбінації: система Сте-ТохР

Ці нові ДНК-конструкції дозволяють використати сайт-специфічну рекомбінантну систему фага РІ1. Цей фаг

Р1 має рекомбіназу, позначену Сте, яка специфічно взаємодіє з 34 парами основ сайта ТОХР. Сайт Т1ОхХР складається з двох паліндромних послідовностей у 13 п.н., розділених консервативною послідовністю у 8 п.н. (Ноезз еї. аїІ., 1986). Рекомбінація під дією ферменту Сге між двома сайтами 1ОХР, що мають ідентичну 7/о орієнтацію, приводить до делеції ДНК-фрагмента.

Система Сте-лохР, що використовується в комбінації з технікою гомологічної рекомбінації, була вперше описана Си еї аїЇ. (1993, 1994). Коротко, потрібна нуклеотидна послідовність, що вбудовується в потрібне положення геному, має, принаймні, два сайти 1охР в тій же самій орієнтації і розташована у відповідних кінців нуклеотидної послідовності, що вирізається з рекомбінантного геному. Для такого вирізання потрібна /5 присутність ферменту рекомбінази (Сте) в ядрі рекомбінантної клітини-хазяїна. Фермент рекомбіназа може "занускатися" в потрібний час або за допомогою (а) інкубування рекомбінантних клітин-хазяїв в культуральному середовищі, що містить цей фермент, шляхом ін'єкції ферменту Стге безпосередньо в потрібну клітину, як описано Агакі еї а! (1995), або шляхом ліпофекції цього ферменту в клітини, як описано Вацйбропів еї аї. (1993); (в) трансфекції клітини-хазяїна вектором, що містить послідовність, що кодує Сте і функціонально приєднану до промотору, що є функціональним в рекомбінантній клітині-хазяїні і необов'язково індуцибельним, де вказаний вектор вводять в рекомбінантну клітину-хазяїна, як описано Си еї аЇ. (1993) і Зацег еї а). (1988); (с) введення в геном клітини-хазяїна полінуклеотиду, що містить послідовність, що кодує Сге і функціонально приєднану до промотору, що є функціональним в рекомбінантній клітині-хазяїні і необов'язково індуцибельним, де вказаний полінуклеотид вбудовують в геном клітини-хазяїна або шляхом довільної інсерції, сч або гомологічної рекомбінації, як описано си еї аї!. (1994).

У конкретному варіанті здійснення винаходу вектор, що містить послідовність, що вбудовується в ген РАРАР і) шляхом гомологічної рекомбінації, конструюють так, щоб селективні маркери були фланковані сайтами ТохР в тій же самій орієнтації, якщо це можливе, шляхом обробки ферментом Сге для елімінації селективних маркерів, ще присутніх в потрібних послідовностях РАРАР, які були інсертовані шляхом гомологічної рекомбінації. | в с зо цьому випадку необхідні два селективних маркери: маркер позитивного відбору для відбору на подію рекомбінації і маркер негативного відбору для відбору на подію гомологічної рекомбінації. Вектори і методи з со використанням системи Сте-1охР описані 201 еї аї. (1994). ю

Таким чином, третя переважна ДНК-конструкція включає від 5-кінця до 3-кінця: (а) першу нуклеотидну послідовність, яка міститься в геномній послідовності РАР АР; (Б) нуклеотидну послідовність, що містить (22) з5 полінуклеотид, що кодує маркер позитивного відбору, де вказана нуклеотидна послідовність містить дві ча додаткові послідовності, що визначають сайт, розпізнаваний рекомбіназою, такою як сайт 1ОХР, причому два цих сайти знаходяться в одній і тій же орієнтації; і (с) другу нуклеотидну послідовність, яка знаходиться в геномній послідовності РАРАР і розташована на геномі нижче першої нуклеотидної послідовності РАРАР (а).

Послідовності, що визначають сайт, розпізнаваний рекомбіназою, такою як сайт ІОХР, переважно, « локалізовані в нуклеотидній послідовності (Б) у відповідних положеннях, що фланкують нуклеотидну з с послідовність, яка повинна бути вирізана в залежності від оточуючих умов. В одному з варіантів здійснення . винаходу два сайти 1ОХР локалізовані з кожної сторони послідовності маркера позитивного відбору так, щоб її и?» вирізання відбувалося в потрібний час після події гомологічної рекомбінації.

У переважному варіанті способу, що передбачає використання третьої ДНК-конструкції, описаної вище,

Вирізання полінуклеотидного фрагмента, фланкованого двома сайтами, розпізнавані рекомбіназою, переважно, -І двома сайтами 1ОХР, здійснюється в потрібний час, завдяки присутності в геномі рекомбінантної клітини-хазяїна послідовності, що кодує фермент Стге, функціонально приєднаний до промоторної послідовності, а переважно, ік до індуцибельного промотору, більш переважно, до тканеспецифічної промоторної послідовності, а найбільш с переважно до промоторної послідовності, яка є індуцибельною і тканиноспецифічною, як описано би еї аї. 1994). со Присутність ферменту Стге в геномі рекомбінантної клітини-хазяїна може бути результатом схрещування двох

Ге трансгенних тварин, першої трансгенної тварини, що несе потрібну послідовність, яка походить від РАРАР і містить сайти ТохР, як описано вище, і другої трансгенної тварини, що несе послідовність, яка кодує Стге і функціонально приєднана до відповідної промоторної послідовності, як описано си еї аї. (1994).

Просторово-часова регуляція експресії ферменту Сте може бути також досягнута з використанням вектора на основі аденовірусу, що містить ген Сте, який дозволяє інфікувати клітини або іп мімо інфікувати органи для

Ф) доставки ферменту Сте, як описано Апіоп 85 Сгапат (1995) і Капедаєе еї а). (1995). ка ДНК-конструкції, описані вище, можуть бути використані для введення потрібної нуклеотидної послідовності даного винаходу, переважно, геномної послідовності РАРАР або кДНК-послідовності РАРАР, а найбільш бо переважно модифікованої копії геномної або кКДНК-послідовності РАРАР в заздалегідь визначене положення в цільовому геномі, що приводить до генерування модифікованої копії цільового гена ("відключення" гомологічної рекомбінації) або до заміни копії потрібного гена іншою копією достатньою мірою гомологічною для того, щоб відбувалася подія гомологічної рекомбінації ("включення" гомологічної рекомбінації). У конкретному варіанті здійснення винаходу ДНК-конструкції, описані вище, можуть бути використані для введення геномної 65 послідовності РАРАР або кДНК-послідовності РАРАР, що включає, принаймні, один біалельний маркер.

Ядерні антисмислові ДНК-конструкції

Інші композиції, що містять вектор даного винаходу, що включає олігонуклеотидний фрагмент нуклеотидної послідовності КДНК ЗЕО ІЮ МО, переважно, фрагмент, що включає старт-кодон гена РАРАР, можуть бути використані як антисмислова послідовність, яка інгібує експресію відповідного гена РАРАР. Переважними

Методами з використанням антисмислового полінуклеотиду даного винаходу є процедури, описані Зслакіе! еї аї (1995), або процедури, описані в заявці РСТ Мо УУО 95/24223, опис яких у всій своїй повноті вводиться в дану заявку за допомогою посилання.

Антисмислові послідовності переважно вибирають з полінуклеотидів (довжиною 15-200 п.н.), комплементарних 5'-кінцю МРНК РАРАР. В одному з варіантів здійснення винаходу використовується комбінація 7/0 різних антисмислових полінуклеотидів, комплементарних різним частинам потрібного гена.

Переважні антисмислові полінуклеотиди даного винаходу комплементарні послідовності МРНК РАРАР, яка містить або кодон ініціації трансляції АТО, або сайт сплайсингу. Інші переважні антисмислові полінуклеотиди даного винаходу комплементарні сайту сплайсингу МРНК РАРАР.

Антисмислові полінуклеотиди даного винаходу, переважно, мають сигнал 3' -поліаденілування, який був замінений послідовністю рибозиму, яка сама розщеплюється, так, щоб транскрипти РНК-полімерази Ії продукувались без роїу(А) на своїх 3-кінцях, причому ці антисмислові полінуклеотиди нездатні транспортуватись з ядра, як описано Гі еї аІ. (1994). У переважному варіанті здійснення винаходу ці антисмислові полінуклеотиди РАРАР також включають, в кластері рибозиму, гістонну структуру "стебло-петля" для стабілізації розщеплених транскриптів з метою їх захисту від 3-5'-екзонуклеолітичного розщеплення, наприклад, структуру, описану Ескпег еї а. (1991).

Олігонуклеотидні зонди і праймери

Полінуклеотиди, що походять від гена РАРАР, можуть бути використані для детекції присутності, принаймні, копії нуклеотидної послідовності ЗЕО ІЮ МО':1 або 3, або її фрагмента, комплементу або варіанту в зразку, що тестується. с

Особливо переважними зондами і праймерами даного винаходу є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, принаймні, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, (8) 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів послідовності ЗЕО І МО:З або комплементарні послідовності. Зондами і праймерами також є виділені, очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, принаймні, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або с зо 1000 суміжних нуклеотидів ЗЕО ІЮО МО:З або його комплементарні послідовності, де вказана безперервна ділянка включає нуклеотид, принаймні, один з нижченаведених нуклеотидів в положеннях ЗЕСО ІЮО МО:3: 1-3038, 1-421, со 422-557, 2158-2218 і 2620-3039. Іншими переважними зондами і праймерами даного винаходу є виділені, ю очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, принаймні, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів ЗЕО ІЮО МО:1 або її (22) комплементарної послідовності. Іншими переважними зондами і праймерами даного винаходу є виділені, ї- очищені або рекомбінантні полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, принаймні, з 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 суміжних нуклеотидів ЗЕО ІЮО МО:1 або її комплементарної послідовності, де вказана безперервна ділянка містить нуклеотид, принаймні, в одному з нижченаведених положень послідовності ЗЕО ІЮ МО:1: 1-140, 141-460, 460-690, 87-346 і 6691-1104. «

Таким чином, даний винахід також відноситься до нуклеїново кислотних зондів, які відрізняються тим, що з с вони специфічно гібридизуються в описаних вище жорстких умовах гібридизації з нуклеїновою кислотою, вибраною з групи, що складається з нуклеотидних послідовностей ЗЕСО ІЮ МО: 1 і З або їх варіантів або їх ;» комплементарних послідовностей.

В одному з варіантів свого здійснення даний винахід охоплює виділені, очищені і рекомбінантні полінуклеотиди, що складаються, або, в основному, складаються з безперервної ділянки, що охоплює 8-50 -І суміжних нуклеотидів будь-які з послідовностей ЗЕО ІЮ МО-1, З і їх комплементів, де вказана безперервна ділянка включає РАРАР-асоційований біалельний маркер у вказаній послідовності, або біалельний маркер се) нерівноважності із зчеплення з РАРАР, і де вказана безперервна ділянка має, але необов'язково, довжину в с 18-35 суміжних нуклеотидів, а вказаний біалельний маркер знаходиться на відстані 4 нуклеотидів від центра 5р вказаного полінуклеотиду, де вказаний полінуклеотид необов'язково складається з вказаної безперервної со ділянки, і вказана безперервна ділянка має довжину в 25 суміжних нуклеотидів, а вказаний біалельний маркер

Ге знаходиться в центрі вказаного полінуклеотиду; при цьому, необов'язково, 3-кінець вказаної безперервної ділянки розташований у 3-кінця вказаного полінуклеотиду, і, необов'язково, 3-кінець вказаної безперервної ділянки локалізований у 3-кінця вказаного полінуклеотиду, а вказаний біалельний маркер розташований у дво З-кінця вказаного полінуклеотиду.

В іншому варіанті свого здійснення даний винахід охоплює виділені, очищені і рекомбінантні (Ф, полінуклеотиди, що містять безперервну ділянку, або складаються, або, в основному, складаються з вказаної ка безперервної ділянки, що охоплює 8-50 суміжних нуклеотидів будь-яких послідовності зЗЕО ІЮ МО-:1, З або їх комплементів, де 3'-кінець вказаної безперервної ділянки розташований у 3-кінця вказаного полінуклеотиду і бо де З-кінець вказаного полінуклеотиду локалізований в області в 20 нуклеотидів, розташованих вище

РАРАР-асоційованого біалельного маркера у вказаній послідовності, або біалельного маркера нерівноважності із зчеплення з РАРАР.

В іншому варіанті свого здійснення даний винахід охоплює полінуклеотиди, що використовуються в гібридизаційних аналізах, секвенуючих аналізах і у ферментативних аналізах, що проводяться для детекції 65 невідповідності основ з метою визначення ідентичності нуклеотидів в РАРАР-асоційованому біалельном маркері в ЗЕО ІЮО МО:1, З або в комплементарних послідовностях; а також полінуклеотиди, що використовуються для ампліфікації сегментів нуклеотидів, що містять РАРАР-асоційований біалельний маркер в 5ЗЕО ІО МО, З або в комплементарних послідовностях.

Даний винахід відноситься до використання полінуклеотидів даного винаходу для визначення ідентичності нуклеотидів в РАРАР-асоційованому біалельному маркері, переважно, в гібридизаційних аналізах, секвенуючих аналізах, мікросеквенуючих аналізах або у ферментативних аналізах, що проводяться для детекції невідповідності основ і для ампліфікації сегментів нуклеотидів, що містять РАРАР-асоційований біалельний маркер.

Зонд або праймер даного винаходу має довжину від 8 до 1000 нуклеотидів, або, зокрема, довжину, 70 принаймні, в 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 або 1000 нуклеотидів.

Більш конкретно, довжина цих зондів і праймерів може складати в межах від 8, 10, 15, 20 або 30 до 100 нуклеотидів, а переважно, від 10 до 50, а більш переважно, від 15 до 30 нуклеотидів. Більш короткі зонди і праймери мають тенденцію до втрати специфічності по відношенню до послідовності-мішені нуклеїнової кислоти і звичайно вимагають більш низьких температур для утворення досить стабільних гібридних комплексів з /5 матрицею. Більш довгі зонди і праймери є такими, що дорого коштують, і іноді вони можуть зазнавати самогібридизації з утворенням "шпилькових" структур. Відповідна довжина праймерів і зондів в конкретній сукупності аналітичних умов може бути визначена емпірично самим фахівцем.

Утворення стабільних гібридів залежить від температури плавлення (Тт) ДНК. Тт залежить від довжини праймера або зонда, іонної сили розчину і вмісту з-С. Чим вище вміст з-С в праймері або зонді, тим вище 2о температура плавлення, оскільки пари 5:С мають три водневих зв'язки, а пари А: мають тільки два зв'язки.

Вміст ОС в зондах даного винаходу звичайно складає в межах від 10 до 7595, переважно, від 35 до 6095, а більш переважно, від 40 до 5590.

Вказані праймери і зонди можуть бути одержані будь-яким відповідним методом, включаючи, наприклад, клонування і рестрикцію відповідних послідовностей і прямий хімічний синтез наприклад, фосфодіефірним сч ов Методом Магапо еї аї. (1979), фосфодіефірним методом Вгомуп еї а!. (1979), діетилфосфорамідитним методом

Веаийсаде еї! аї. (1981) і методом з використанням твердого носія, описаним в ЕР 0707592. і)

Детектуючими зондами звичайно є послідовності нуклеїнової кислоти або незаряджені аналоги нуклеїнової кислоти, такі як, наприклад, пептид-вмісні нуклеїнові кислоти, (описані в Міжнародній патентній заявці УМО 92/20702, і морфолінові аналоги, описані в патентах США МоМо 5185444, 5034506 і 5142047). Цей зонд можна с зо зробити "неподовжуваним", так, щоб до цього зонда не могли додаватися інші аМТР. Самі аналоги, як всередині, так і зовні, звичайно не подовжуються, а нуклеїновокислотні зонди можуть бути зроблені неподовжуваними со шляхом модифікації 3'-кінця зонда, так, щоб гідроксильна група не могла більше брати участь в подовженні. ю

Наприклад, 3'-кінець зонда може бути функціоналізований захоплюючою або детектуючою міткою, так, щоб, він міг захоплювати або як-небудь інакше блокувати гідроксильну групу. Альтернативно, 3'-гідроксильна група може ме) бути просто відщеплена, замінена або модифікована, причому, в (заявці на патент США, реєстр. Мо 07/049061, М поданої 19 квітня 1993 року), описані модифікації, які можуть бути використані для створення "неподовжуваного" зонда.

Будь-який з полінуклеотидів даного винаходу може бути позначений, якщо це необхідно, шляхом включення будь-якої мітки, відомої фахівцям, і яка визначається спектроскопічними, фотохімічними, біохімічними, « імунохімічними або хімічними методами. Так, наприклад, відповідними мітками є радіоактивні речовини ств) с (включаючи ЗР, 3585, ЗН, 71251), флуоресцентні барвники (включаючи Б5-бромдезоксиуридин, флуоресцеїн, ц ацетиламінофлуорен, дигоксигенін) або біотин. Полінуклеотиди переважно мітять у 3- і 5-кінців. Прикладами "» методів нерадіоактивного мічення фрагментів нуклеїнової кислоти є методи, описані в патенті Франції Мо

ЕК-7810975 або Огаеа еї а! (1988) або Запспег-Резсадог еї а! (1988). Крім того, зонди даного винаходу можуть 5 мати структурні властивості, які дозволяють здійснювати ампліфікацію сигналу, причому такими структурними -І властивостями володіють, наприклад, розгалужені ДНК-зонди, описані Огаеєа еї аі!., 1991 або в Європейському патенті Мо ЕР 0225807 (Спігоп). іш Мітка може бути також використана для захоплення праймера з метою полегшення іммобілізації або ос праймера, або продукту подовження праймера, такого як ампліфікована ДНК, на твердому носії. Мітка-пастка приєднується до праймерів або зондів і може специфічно зв'язуватися з членом, який утворює пару скріплення з со членом, що специфічно зв'язується з твердофазним реагентом (наприклад, з біотином і стрептавідином). Тому, в з залежності від типу мітки, яку несе полінуклеотид або зонд, вона може бути використана для захоплення або для детекції ДНК-мішені. Крім того, потрібно зазначити, що описані тут полінуклеотиди, праймери або зонди самі можуть служити міткою-пасткою. Так, наприклад, у випадку, коли членом, що зв'язується з твердофазним реагентом, є послідовність нуклеїнової кислоти, то вона може бути вибрана так, щоб вона зв'язувалася з комплементарною частиною праймера або зонда, і, тим самим, і мобілізувала праймер або зонд на твердій фазі. о У випадках, коли сам полінуклеотидний зонд служить зв'язувальним членом, для кожного фахівця очевидно, що ко цей зонд буде містити послідовність або "хвіст", які не є комплементарними даної мішені. У випадку, коли сам полінуклеотидний праймер служить міткою-пасткою, то, принаймні, частина цього праймера буде вільно бо гібридизуватись з нуклеїновою кислотою на твердій фазі. Техніка мічення ДНК добре відома фахівцям.

Зонди даного винаходу можуть бути використані в різних цілях. А саме, вони можуть бути використані в

Саузерн-гібридизації з геномною ДНК. Ці зонди можуть бути також використані для детекції продуктів

ПЛР-ампліфікації. Вони можуть бути також використані для детекції невідповідностей в гені РАРАР або мРНК з використанням іншої техніки. 65 Будь-який з полінуклеотидів, праймерів і зондів даного винаходу може бути відповідним чином іммобілізований на твердому носії. Тверді носії відомі фахівцям, і ними є стінки ямок реакційного планшета,

тест-пробірки, полістиролові сфери, магнітні сфери, нітроцелюлозні смужки, мембрани, мікрочастинки, такі як латексні частинки, баранячі еритроцити (або еритроцити інших тварин), дурацити і т.п. Вибір твердого носія не грає вирішальної ролі і може бути здійснений на розсуд фахівця. Таким чином, найбільш відповідними прикладами є латексні частинки, мікрочастинки, магнітні або немагнітні сфери, мембрани, пластикові пробірки, стінки ямок для мікротування, скло або кремнієві чипи, баранячі еритроцити (або еритроцити інших тварин) і дурацити. Відповідними методами іммобілізації нуклеїнових кислот на твердих фазах є іонні, гідрофобні, ковалентні взаємодії і т.п. Термін "твердий носій", що використовується тут, означає будь-який матеріал, який є нерозчинним, або який може бути зроблений нерозчинним внаслідок подальшої реакції. Цей твердий носій 7/0 може бути вибраний так, щоб він володів властивою йому здатністю захоплювати та іммобілізувати захоплений реагент. Альтернативно, тверда фаза може містити додатковий рецептор, який здатний захоплювати та іммобілізувати захоплений реагент. Таким додатковим рецептором може бути заряджена речовина, яка має заряд, протилежний заряду самого реагенту, що захоплюється, або заряджена речовина, кон'югована з реагентом, що захоплюється. У ще одному альтернативному способі молекулою рецептора може бути будь-який /5 член, що специфічно зв'язується, який іммобілізований на твердому носії (приєднаний до твердого носія), і який здатний іммобілізувати захоплений реагент за допомогою реакції специфічного скріплення. Молекула рецептора здатна опосередковано зв'язувати захоплений реагент з твердим носієм перед проведенням аналізу або в процесі проведення аналізу. Так, наприклад, твердою фазою може бути пластик, дериватизований пластик, магнітний або немагнітний метал, скляна або кремнієва поверхня тест-пробірки, мікротитраційні ямки, листи, сфери, мікрочастинки, чипи, баранячі еритроцити (або еритроцити інших тварин), дурацитиФ та інші конфігурації, відомі фахівцям. Полінуклеотиди даного винаходу можуть бути приєднані до твердого носія або іммобілізовані на твердому носії окремо або групами, що складаються, принаймні, з 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 або різних полінуклеотидів даного винаходу на одному твердому носії. Крім того, полінуклеотиди, що не є полінуклеотидами даного винаходу, можуть бути приєднані до того ж самого твердого носія таким же чином, як с 25 один або декілька полінуклеотидів даного винаходу.

Отже, даний винахід також відноситься до способу детекції присутності нуклеїнової кислоти, що містить (8) полінуклеотид ЗЕО ІЮ МО:1 або 3, його фрагмент або варіант і комплементарну послідовність, в зразку, де вказаний спосіб включає наступні стадії: а) контактування нуклеїновокислотного зонда або множини нуклеїновокислотних зондів, які можуть с зо гібридизуватись з нуклеотидною послідовністю, включеною в нуклеїнову кислоту ЗЕО ІЮ МО: 1 або 3, або її фрагментом або варіантом і комплементарною послідовністю, із зразком, що аналізується; і со

Б) детекції гібридного комплексу, що утворився між зондом і нуклеїновою кислотою в даному зразку. ю

Крім того, даний винахід відноситься до набору для детекції присутності нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність ЗЕО ОО МО:1 або З, її фрагмент або варіант, і комплементарну послідовність, в ме) з Зразку, де вказаний набір включає: ча а) нуклеїновокислотний зонд або множину нуклеїновокислотних зондів, які можуть гібридизуватись з нуклеотидною послідовністю, включеною в нуклеїнову кислоту ЗЕО ІЮ МО:1 або 3, або з її фрагментом або варіантом і комплементарною послідовністю, і

Б) необов'язково, реагенти, необхідні для здійснення реакції гібридизації. «

У першому переважному варіанті винаходу, що відноситься до способу детекції і до набору, вказаний з с нуклеїновокислотний зонд або множину нуклеїновокислотних зондів мітять детектованою молекулою. У другому . переважному варіанті винаходу, що відноситься до способу детекції і до набору, вказаний нуклеїновокислотний и?» зонд або множину нуклеїновокислотних зондів іммобілізують на субстрат.

Олігонуклеотидні масиви

Субстрат, що містить множину олігонуклеотидних праймерів або зондів даного винаходу, може бути -І використаний для детекції або ампліфікації потрібних послідовностей в гені РАРАР, і він може бути також використаний для детекції мутацій в кодуючих або в некодуючих послідовностях гена РАРАР. ік Будь-який описаний тут полінуклеотид може бути приєднаний в областях, що перекриваються, або в с довільних ділянках до твердого носія. Альтернативно, полінуклеотиди даного винаходу можуть бути приєднані у впорядкованих масивах, де кожний полінуклеотид приєднаний в тому місці твердого носія, яке не со перекривається з місцем приєднання будь-якого іншого полінуклеотиду. Переважно, такий впорядкований масив

Ге полінуклеотидів називають "адресованим", де різні місцеположення реєструються і можуть бути використані як частина аналітичної процедури. Масиви адресованих полінуклеотидів звичайно містять множину різних олігонуклеотидних зондів, які зв'язуються з поверхнею субстрату в різних відомих положеннях. Знання точного дв положення кожного полінуклеотиду дає можливість використати ці "адресовані" масиви в гібридизаційних аналізах. Для полінуклеотидів даного винаходу може бути застосований будь-який відомий метод з (Ф, використанням адресованих масивів. Одним з конкретних варіантів таких полінуклеотидих масивів є масив, ка відомий як СепесПірв м, який, в основному, (описаний в патенті США Мо5143854; в публікаціях РСТ УМО 90/15070 і 92/10092)1. В основному, ці масиви можуть бути продуковані методами механічного синтезу або прямого бо світлонапрямленого синтезу, які являють собою комбінацію фотолітографічних методів і твердофазного синтезу олігонуклеотидів (Бодог еї аї., 1991). Іммобілізація масивів олігонуклеотидів на твердих носіях стала можливою завдяки розробці технології що звичайно ідентифікується як "Крупномасштабний синтез іммобілізованих полімерів" ("Мегу ІГагде ЗсаІе Ітторбіїлгей Роїутег Зупіпезіз") (МІ 5ІРЗтм), в якому зонди звичайно іммобілізовані в масиві високої щільності на твердій поверхні чипу. Приклади МІ 5ІРзЗтм представлені 65 |в патентах США МоМо5143854 і 5412087 і в нублікаціях РСТ УУО 90/15070, МО 92/10092 і УМО 95/11995І, де описані методи формування олігонуклеотидних масивів з використанням такої техніки як світлонапрямлений синтез. При розробці стратегій для одержання масивів олігонуклеотидів, іммобілізованих на твердих носіях, в спробі максимізувати рівні гібридизації і інформації про послідовності були розроблені додаткові стратегії представлення для упорядкування і відображення масивів на чипах. Приклади таких стратегій представлення (описані в публікаціях РСТ УУО 94/12305, МО 94/11530, МО 97/29212 ії МО 97/312561, описи яких у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.

В іншому варіанті олігонуклеотидних масивів даного винаходу, матриця олігонуклеотидних зондів може бути переважно використана для детекції мутацій, присутніх в гені РАРАР, а переважно в його регуляторної області.

Для цих конкретних цілей спеціально конструювали зонди, що мають послідовність, що дозволяє їм 70 гібридизуватись з генами, які несуть відомі мутації (делецію, інерцію або заміну одного або декількох нуклеотидів). Термін "відомі мутації" означає мутації в гені РАРАР, який був ідентифікований, наприклад, методом, використаним Ниапо е! а!. (1996) або Затвгоп еї а). (1996).

Іншим методом, який застосовується для детекції мутацій в гені РАРАР, є використання ДНК-масивів високої щільності. Кожний олігонуклеотидний зонд, що складає одиничний елемент ДНК-масиву високої щільності, був сконструйований так, щоб він відповідав специфічній послідовності геномної ДНК або кКДНК РАРАР. Таким чином, масив, що складається з олігонуклеотидів, комплементарних підпослідовностей послідовності гена-мішені, використовується для визначення ідентичності послідовності-мішені з послідовністю гена дикого тину з метою вимірювання його кількості і детекції відмінностей між послідовністю-мішенню і послідовністю гена РАРАР дикого тину, що порівнюється. В одну таку конструкцію, позначену 4Ї -масивом "черепичного" типу, введена серія 2о З чотирьох зондів (А, С, с, Т), а переважно, 15-нуклеотидні олігонуклеотиди. У кожній серії з чотирьох зондів абсолютний комплемент буде гібридизуватись більш сильно, ніж зонди з невідповідностями. Потім нуклеїновокислотну мішень довжиною | сканують на мутації з використанням масиву "черепичного" типу, що містить 41Ї,-зонди, де весь набір зондів має всі можливі мутації у відомій еталонній послідовності.

Гібридизаційні сигнали від серії 15-мірного зонда "черепичного" масиву спотворюються зміною лише однієї сч об основи в послідовності-мішені. Внаслідок цього відбувається характерна втрата сигналу або "футпринт" для зондів, що фланкують положення мутації. Ця техніка описана Спее еї а)!., 1996. і)

Таким чином, даний винахід відноситься до масиву молекул нуклеїнової кислоти, що містить, принаймні, один полінуклеотид, описаний вище і використовується як зонд або праймер. У переважному варіанті даний винахід відноситься до масиву молекул нуклеїнової кислоти, що містить, принаймні, два полінуклеотиди, описані вище і с зо що використовуються як зонди або праймери.

Білки і поліпептидні фрагменти РАРАР со

Термін "поліпептиди РАРАР", що використовується тут, охоплює всі білки і поліпептиди даного винаходу. ю

Частиною даного винаходу також є поліпептиди, що кодуються полінуклеотидами даного винаходу, а також гібридні поліпептиди, що містять вказані поліпептиди. Даний винахід відноситься до людських білків РАРАР, (22)

Зз5 Включаючи виділені або очищені білки РАРАР, що складаються з, або, в основному, складаються з послідовності ї-

ЗЕО ІЮО МО:2, або містять цю послідовність.

Як описано в даній заявці, авторами даного винаходу було продемонстровано, що білок РАРАР асоційований з білком або пептидом 934872, який розглядається як фактор генетичної схильності до шизофренії і біполярних порушень, а також до споріднених порушень ЦНС. «

Даний винахід відноситься до поліпептиду, що кодується нуклеотидною послідовністю ЗЕС ІЮ МО: 1 або Забо ств) с комплементарною послідовністю або її фрагментом.

Даний винахід відноситься до виділених, очищених рекомбінантних поліпептидів, що містить безперервну з ділянку, принаймні, з 6 амінокислот, переважно, принаймні, з 8-Ю, а більш переважно, принаймні, з 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 суміжних амінокислот ЗЕО ІЮ МО:2. В інших переважних варіантах здійснення винаходу

Вказана безперервна ділянка з суміжних амінокислот містить сайт мутації або функціональної мутації, включаючи -І делецію, додавання, заміну або усікання амінокислот в послідовності білка РАРАР.

Даний винахід також охоплює очищений, виділений або рекомбінантний полінуклеотид, що містить се) амінокислотну послідовність, що має, принаймні, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 або 9995-ну ідентичність с амінокислот з амінокислотною послідовністю ЗЕО ІЮ МО:2 або її фрагментом. Такі варіанти поліпептидів входять 5о В даний винахід незалежно від того, чи мають вони нормальну біологічну активність чи ні. Навіть в тому бо випадку, якщо конкретна поліпептидна молекула не володіє біологічною активністю, для кожного фахівця

Із очевидно, яким чином може бути використаний даний поліпептид, наприклад, як вакцина або для продукування антитіл. Іншими застосуваннями поліпептидів даного винаходу, які не володіють РАРАР-активністю, є, іпіег аа, їх використання як епітопних міток для епітопного картування, і як маркерів молекулярної маси на

ДСН-ПААГ-гелях або на колонках для гель-фільтрації з молекулярним ситом, здійснюваної методами, відомими фахівцям. Як описано нижче, поліпептиди даного винаходу можуть бути також використані для продукування

Ф) поліклональних і моноклональних антитіл, які можуть бути використані в аналізах на детекцію експресії білків ка РАРАР або як агоністи і антагоністи, здатні посилювати або інгібувати функції білка РАРАР. Крім того, такі поліпептиди можуть бути використані в дріжджовій двогібридній системі для "захоплення" білків, що зв'язуються во З білком РАРАР, які також є агоністами і антагоністами-кандидатами даного винаходу.

В інших варіантах свого здійснення даний винахід також відноситься до комплексів, утворених поліпептидами

РАРАР і 934872. Таким чином, даний винахід відноситься до очищених, виділених або рекомбінантно продукованих комплексів, що складаються, принаймні, з одного поліпептиду РАРАР, і принаймні, з одного поліпептиду 934872, де вказаний поліпептид РАРАР містить, принаймні, 6 амінокислот, переважно, принаймні, 65 8-10 амінокислот, а більш переважно, принаймні, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІЮО МО:2. У переважному варіанті здійснення винаходу вказаний поліпептид 934872 містить, принаймні, 6, переважно,

принаймні, 8-10 амінокислот ЗЕО ІЮ МО:5.

Крім того, як було передбачено, виходячи з додаткового аналізу структури поліпептиду РАРАР, поліпептид

РАРАР даного винаходу може містити сайт М-глікозилювання (А5БР) в положеннях амінокислот 69-72 (амінокислоти ММТО). Крім того, поліпептид РАРАР даного винаходу може містити сайт фосфорилювання протеїнкінази С в положеннях амінокислот 26-28 (5СК), 53-55 (5КК), 71-73 (ТОК) і 80-82 (ЗРК). Крім того, поліпептид РАРАР може містити сайт М-міристоїлювання в положеннях амінокислот 18-23 (35020503), 22-27 (СОІЕЗС) і 37-42 (ЗАСОМК). Іншими структурними аспектами є мотиви рацемази АБР 5 СО в положеннях амінокислот 8-16 і 9-16 (амінокислоти О-РМУО). 70 Крім своєї асоціації з шизофренією і біполярним порушенням за допомогою взаємодії з 934872, поліпептид

РАРАР також має послідовність, гомологічну кальцій/кальмодулінзалежного білка протеїнкінази І! (САМКИ) (реєстр. Мо АБ2711561), участь якого в нейротрансмісії була продемонстрована раніше. В одному з аспектів даного винаходу РАРАР може діяти як молекулярний шаперон; так, наприклад, РАРАР може посилювати або запобігати взаємодії або скріпленню 934872 з рецептором 934872. В іншому аспекті винаходу РАРАР може 7/5 функціонально взаємодіяти з білками 934872 на шляху передачі сигналу. Білки РАРАР, переважно, виділяють із зразків тканини людини або ссавця або експресують з генів людини або ссавця.

Поліпептиди РАРАР даного винаходу можуть бути одержані рутинними методами експресії, відомими фахівцям. Полінуклеотид, що кодує потрібний поліпептид, лігують в експресуючий вектор, придатний для будь-якого стандартного хазяїна. Для одержання рекомбінантних поліпептидів можуть бути використані як 2о вукаріотичні, так ї прокаріотичні системи хазяїв, і сукупність деяких найбільш поширених систем. Потім поліпептид виділяють з лізованих клітин або з культурального середовища і очищають до певної міри, необхідної для використання. Очищення проводять будь-яким відомим методом, таким як, наприклад, диференціальна екстракція, фракціонування солями, хроматографія, центрифугування і т.п. Різні методи очищення білків можна знайти, наприклад, в "Методах ензимології" (Меййпоавз іп Епгутоіоду). сч

Крім того, більш короткі фрагменти білка продукують методами хімічного синтезу. Альтернативно, білки даного винаходу екстрагують з клітин або тканин людини або інших тварин. Методи очищення білків відомі (8) фахівцям, і такими методами є використання детергентів або хаотропних агентів для дизрупції частинок з подальшою диференціальною екстракцією і розділенням поліпептидів за допомогою іонообмінної хроматографії, афінної хроматографії, седиментації в градієнті щільності і гель-електрофорезу. с зо Для експресії білків і поліпептидів РАРАР може бути використана будь-яка КДНК РАРАР, включаючи ЗЕО ІЮ

МО:1. Нуклеїнову кислоту, що кодує експресований білок або поліпептид РАРАР, функціонально приєднують до со промотору в експресуючому векторі з використанням стандартної техніки клонування. Вставка РАРАР в ю експресуючому векторі може включати повну кодуючу послідовність для білка РАРАР або його частини. Так, наприклад, РАРАР-вставка може кодувати поліпептид, що містить, принаймні, 10 суміжних амінокислот білка (22) з5 РАРАР ЗЕ ІО МО2. ча

Експресуючим вектором є будь-які експресійні системи ссавця, дріжджів, комах або бактерій, відомі фахівцям. Комерційно доступні вектори і експресійні системи постачаються рядом фірм-постачальників, включаючи Сепеїйіс Іпвійше (Сатрьгідде, МА), Зігаїадепе (Га доїІа, Саїйогпіа), Рготеда (Мадізоп, МУУізсопвіп) і Іпмігодеп (Зап Оіедо, Саїйогпіа). Якщо це необхідно, то для посилення експресії і полегшення правильного « укладання білка, оточення кодона і спаровування послідовностей кодонів оптимізують для конкретного в с експресуючого організму, в який вводять експресуючий вектор, як описано, в патенті США, Найіеїй еї аї.,

Мо5082767, опис якого у всій своїй повноті вводиться в дану заявку за допомогою посилання. ;» В одному з варіантів здійснення винаходу повну кодуючу послідовність КДНК РАРАР функціонально приєднують до промотору в експресуючому векторі за допомогою роїу(А)-сигналу КДНК. Альтернативно, якщо

Нуклеїнова кислота, що кодує частину білка РАРАР, у якого відсутній метіонін, служить як сайт ініціації, то -І ініціюючий метіонін може бути введений після першого кодона нуклеїнової кислоти з використанням стандартної техніки. Аналогічним чином, якщо у вставці з КДНК РАРАР відсутній роїу(А)-сигнал, то ця послідовність може ік бути введена в конструкцію, наприклад, за допомогою сплайсингу з роїу(А)-сигналу від рес5 (Зігаїадепе) з с використанням рестриктуючих ендонуклеаз Валі і За1!7, і вбудована в експресуючий вектор ссавця рХТІі 5о (Зігаїадепе). рХТ1 містить ГТК їі частину гена дад мишачого вірусу лейкозу Молоні. Положення ІТК в даній со конструкції дозволяє здійснювати стабільну трансфекцію. Вказаний вектор включає промотор тимідинкінази

Ге вірусу простого герпеса і селективний ген неоміцину. Нуклеїнову кислоту, що кодує білок РАРАР або його частину, одержують з бактеріального вектора, що містить КДНК РАРАР 5ЕО ІЮО МО:2, за допомогою ПЛР з використанням олігонуклеотидних праймерів, комплементарних КДНК РАРАР або його частини, де вказаний ов Вектор містить послідовності рестриктуючої ендонуклеази Рзїї, вбудованої в 5-праймер, і рестриктуючої ендонуклеази Вот у 5-кінця відповідного КДНК-3'і-праймера, для гарантії того, що послідовність, що кодує

Ф) білок РАРАР або його частину, буде правильно розташована по відношенню до роїу А-сигналу. Очищений ка фрагмент, одержаний внаслідок ПЛР-реакції, гідролізують РвзіЇї, затупляють по кінцях екзонуклеазою, гідролізують ВаїЇЇ, очищають і лігують з вектором рХТт1, що вже містить роїу А-сигнал і гідролізований ВапІЇ. во Лігований продукт трансфікують в мишачі клітини МІНЗТЗ з використанням ліпофектину (І їе Тесппоіодіев,

Іпс., сгапа Ізіапа, Мем/ Могк) в умовах, вказаних в описі продукту. Позитивні трансфектанти відбирають після культивування трансфікованих клітин в бОбОмкг/мл 5418 (Зідта, КІ оців, Мівззоигі).

Вищеописані процедури можуть бути також використані для експресії мутантного білка РАРАР, відповідального за детектований фенотип, або його частини. 65 Експресований білок очищають стандартними методами очищення, такими як осадження сульфатом амонію або хроматографічне розділення за розміром або зарядом. Білок, що кодується нуклеїновокислотною вставкою,

може бути також очищений стандартними імунохроматографічними методами. У таких процедурах розчин, що містить експресований білок РАРАР або його частину, такий як клітинний екстракт, наносять на колонку, що містить антитіла проти білка РАРАР або його частини, нанесені на хроматографічну матрицю. Експресований білок зв'язується з імунохроматографічною колонкою. Потім колонку промивають для видалення неспецифічно пов'язаних білків. Цей специфічно пов'язаний експресований білок видаляють з колонки і виділяють стандартними методами.

Для підтвердження експресії білсла РАРАР або його частини білки, експресовані з клітин-хазяїв і які містять експресуючий вектор, що включає вставку, яка кодує білок РАРАР або його частину, можуть бути піддані 7/0 порівнянню з білками, експресованими в клітинах-хазяях, що містять експресуючий вектор без вставки.

Присутність смуги в зразках клітин, що містять експресуючий вектор з вставкою, яка відсутня в зразках клітин, що містять експресуючий вектор без вставки, вказує на те, що був експресований білок РАРАР або його частина.

В основному, ця смуга буде мати рухливість, очікувану для білка РАРАР або його частини. Однак, ця смуга може також мати рухливість, відмінну від очікуваної рухливості, у разі модифікацій, таких як глікозилювання, 7/5 Убіхітинізація або ферментативний гідроліз.

Антитіла, здатні специфічно розпізнавати експресований білок РАРАР або його частину, описані нижче.

Якщо продукування антитіла неможливе, то нуклеїнові кислоти, що кодують білок РАРАР або його частину, вбудовують в експресуючі вектори, сконструйовані для одержання схем очищення із застосуванням химерних поліпептидів. У таких стратегіях нуклеїнову кислоту, що кодує білок РАРАР або його частину, вбудовують в тій же самій рамці зчитування, яку має ген, що кодує іншу половину химери. Іншою половиною цієї химери є послідовність, що кодує В-глобін або нікелезв'язувальний поліпептид. Потім для очищення химерного білка використовують хроматографічну матрицю, що має антитіло проти В-глобіну або антитіло, що зв'язується з нікелем. Між геном В-глобіну або нікелезв'язувальним поліпептидом і геном білка РАРАР або його частини конструюють сайти розщеплення протеазою. Таким чином, дві поліпептиди химери можуть бути відділені один с

Від одного за допомогою розщеплення протеазою.

Одним з експресуючих векторів, що використовуються для генерування В-глобінових химерних білків, є рес5 і) (Зігабадепе), який кодує кролячий В-глобін. Інтрон І гена кролячого В-глобіну полегшує сплайсинг експресованого транскрипту, а сигнал поліаденілювання, введений в дану конструкцію, підвищує рівень експресії. Ці способи добре відомі фахівцям з молекулярної біології. Стандартні методи опубліковані в с зо Методичному керівництві, такому як Оамід еї ай, (1086), і багато які з них розроблені Зігаїадепе, І Ме

Тесппоодіез, Іпс., або Рготеда. Крім того, поліпептид може бути продукований з даної конструкції з со використанням систем трансляції іп міго, таких як набір для експрес-трансляції тм іп міго (5ігаїадепе). ю

Антитіла, які зв'язуються з поліпептидами РАРАР даного винаходу

Для генерування антитіл, здатних зв'язуватися з експресованим білком РАРАР або його фрагментами, може іа бути використаний будь-який описаний поліпептид або цілий білок РАРАР. че

Одна з композицій антитіла даного винаходу здатна до специфічного скріплення або специфічно зв'язується з білюом РАРАР ЗЕО ІО МО:2. Композиція антитіла, що специфічно зв'язується з білююм РАРАР, повинна мати афінність скріплення для першого повнорозмірного варіанту білка РАРАР, яка, принаймні, на 595, 10905, 1590, 2090, 5090 або 10095 перевищує афінність скріплення для другого повнорозмірного варіанту білка РАРАР в ЕГІЗА « або іншому аналізі, основаному на скріпленні з антитілом. шщ с У переважному варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до композицій антитіла, поліклонального й або моноклонального, яке здатне до селективного скріплення або селективно зв'язується з епітопвмісним и? поліпептидом, що включає безперервну ділянку, принаймні, з 6 амінокислот, переважно, принаймні, з 8-Ю амінокислот, а більш переважно, принаймні, з 12, 15, 20, 25, 30,40, 50 або 100 суміжних амінокислот ЗЕО ІЮ -і У переважному варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до композицій антитіла, поліклонального або моноклонального, яке здатне до селективного скріплення або селективно зв'язуватися з комплексом іс, поліпептидів РАРАР і 934872, де вказаний поліпептид РАРАР містить, принаймні, 6 амінокислот, переважно, «сл принаймні, 8-10 амінокислот, а більш переважно, принаймні, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО 10 МО:2. У переважному варіанті здійснення винаходу, вказаний поліпептид 934872 містить, принаймні, б со амінокислот, а переважно, принаймні, 8-10 амінокислот ЗЕО ІЮ МО:5. з Епітоп може містити, щонайменше, З амінокислоти в просторовій конформації, яка є унікальною для даного епітопу. Звичайно, епітоп складається, принаймні, з 6 таких амінокислот, а частіше, принаймні, з 8-10 таких амінокислот. У переважному варіанті здійснення винаходу антигенні епітопи містять декілька амінокислот, число яких складає від З до 50. Фрагменти, які діють як епітопи, можуть бути одержані стандартними методами.

Епітопи можуть бути визначені за допомогою аналізу Джеймсона-Вольфа, який здійснюють, наприклад, за іФ) допомогою комп'ютерної програми РКОТЕАМ з використанням параметрів за умовчанням (Мегвіоп 4.0 М/іпдомув, ко ОМАЗТАК, Іпс., 1228 Боцій Рагк 5ігееї Мадівоп, УМ).

Передбачені антигенні епітопи представлені нижче. Потрібно зазначити, що в списку імуногенних епітопів бо представлені тільки амінокислотні залишки, що містяться в епітопах, які, як було передбачено відповідно до конкретного алгоритму, мають найвищу міру імуногенності. Поліпептиди даного винаходу, які конкретно не описані як імуногенні, вважаються неантигенними. При цьому, вони все ж можуть бути антигенними іп мімо, але вони просто не розпізнаються алгоритмом, що конкретно використовується. Альтернативно, ці поліпептиди, можливо, є антигенними іп мійго, як було визначено методами фагового представлення. Таким чином, 65 перераховані нижче амінокислотні залишки являють собою амінокислотні залишки, що містять лише переважні епітопи, але цей список є неповним. Дійсно, всі фрагменти поліпептидів даного винаходу, що мають, принаймні,

б амінокислот, входять в об'єм даного винаходу, і використовуються як антигенний епітоп. Крім того, перераховані нижче амінокислотні залишки є лише критичними залишками епітопів, визначених за допомогою аналізу Джеймсона-Вольфа. Так, наприклад, в перераховані послідовності можуть бути додані додаткові фланкуючі залишки або на М-кінці, або на С-кінці, або на обох М- і С-кінцях для генерування епітопвмісної частини, що має довжину, принаймні, в 6 залишків. Амінокислотні залишки, що містять інші імуногенні епітопи, можуть бути визначені за допомогою алгоритмів, аналогічних аналізу Джеймсона-Вольфа, або за допомогою іп мімо-тестування на антигенну відповідь описаними тут методами або методами, відомими фахівцям.

Епітопвмісні фрагменти даного винаходу, переважно, включають 6-50 амінокислот (тобто, ціле число від 6 до 70 50, включно) поліпептиду даного винаходу. Крім того, даний винахід включає антигенні фрагменти, що мають довжину, починаючи від 6 амінокислот і закінчуючи повнорозмірною послідовністю РАРАР.

Переважні імуногенні епітопи РАРАР:

СІу-8 - І ув-11

Авр-31 - Азп-33

СІп-40 - І ец-47

СІу-51 - І ув-54

СіІц-59 - Агдо-62 і

Зег-80 - Тиг-83.

Даний винахід також відноситься до виділеного або очищеного антитіла, здатного специфічно зв'язуватися з 2о Мутованим білком РАРАР або з його фрагментом або варіантом, що містить епітоп мутованого білка РАРАР. В іншому своєму переважному варіанті даний винахід відноситься до антитіла, здатного зв'язуватися з поліпептидом, що містить, принаймні, 10 суміжних амінокислот білка РАРАР, і включає, принаймні, одну амінокислоту, яка може кодуватися мутаціями, що приводять до появи конкретної ознаки.

Для одержання антитіл бажано використати тварин або ссавців, дикого тину або трансгенних, що не с відносяться до людини, які експресують тип РАРАР, відмінний від типу РАРАР, з яким зв'язується антитіло, а особливо переважними є тварини, які не експресують РАРАР (тобто описані тут тварини, у яких відсутній і)

РАРАР). Тварини, у яких відсутній РАРАР, будуть розпізнавати всі області або більшість доступних областей білка РАРАР як чужорідних антигенів, а тому вони будуть продукувати антитіла для більш широкого спектра епітопів РАРАР. Крім того, більш короткі поліпептиди, що мають тільки 10-30 амінокислот, можуть бути с зр Використані для забезпечення специфічного скріплення з будь-яким білюом РАРАР. Крім того, імунна система гуморальної відповіді тварин, які продукують молекули РАРАР, які є схожими з антигенною послідовністю, будуть со переважно розпізнавати відмінності між нативними РАРАР-молекулами тварини і антигенною послідовністю і МУ продукувати антитіла проти цих унікальних сайтів в послідовності антигену. Така техніка може бути, зокрема, використана для одержання антитіл, що специфічно зв'язуються з будь-яким одним з білків РАРАР. ме)

Препарати антитіл, одержані відповідно до будь-якого протоколу, можуть бути використані в кількісних ї- імуноаналізах, в яких визначають концентрації ангигенвмісних речовин в біологічних зразках; і крім того, вони можуть бути використані в напівкількісному або якісному аналізі для ідентифікації присутності антигену в біологічному зразку. Ці антитіла можуть бути також використані в терапевтичних композиціях для цитолізу клітин, які експресують даний білок або для зниження рівня цього білка в організмі. «

Антитіла даного винаходу можуть бути помічені будь-якими радіоактивними, флуоресцентними або з с ферментними мітками, відомими фахівцям.

Тому даний винахід також відноситься до способу специфічної детекції присутності поліпептиду РАРАР з даного винаходу в біологічному зразку, де вказаний спосіб включає наступні стадії: а) контактування біологічного зразка з поліклональним або моноклональним антитілом, яке специфічно зв'язується з поліпептидом РАРАР, що містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮО МО:2, або з його пептидним -І фрагментом або варіантом, і

Б) детекції комплексу "антиген-антитіло", що утворився. се) Даний винахід також відноситься до діагностичного набору для детекції іп міго присутності поліпептиду с РАРАР даного винаходу в біологічному зразку, де вказаний набір включає: а) поліклональне або моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується з поліпептидом РАРАР, що містить бо амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:2, або з його пептидним фрагментом або варіантом, необов'язково

Ге мічені, і

Б) реагент, що забезпечує детекцію утворених комплексів антиген-антитіло, де вказаний реагент, необов'язково, несе мітку, або сам може розпізнаватися міченим реагентом, а більш конкретно, це відбувається

У випадку, коли вищезазначене моноклональне або поліклональне антитіло саме не є міченим.

Таким чином, даний винахід відноситься до антитіл і Т-клітинних антигенних рецепторів (ТОК), які (Ф) специфічно зв'язуються з поліпептидами, а більш конкретно, з епітопами вказаних поліпептидів даного винаходу, ка включаючи, але не обмежуючись ними, до (включаючи Ідс1, Ід(с2, доз і 954), ІЗА (включаючи ІдА1 і ІдДАг),

І9О, ІЗЕ або ІоМ і Іду. У переважному варіанті антитілами даного винаходу є фрагменти антитіл, що зв'язуються бо З людським антигеном, включаючи, але не обмежуючись ними Раб, Раб", К(ар)», Каб)», га, одноланцюговий Ем (одЕУ), одноланцюгові антитіла, дисульфідпов'язаний Ем (оцЕм) і фрагменти, що містять або домен М, або домен Мн. Вказані антитіла можуть бути одержані від будь-якої тварини, включаючи птахів і ссавців.

Переважно, вказаними антитілами є антитіла людини, миші, кролика, кози, морської свинки, верблюда, коня або курок. 65 Антигензв'язувальні фрагменти антитіл, включаючи одноланцюгові антитіла, можуть містити варіабельну область (області), окремо або в комбінації з наступними повними або неповними областями: шарнірною областю, доменами СНІ, СН2 ії СНЗ. В об'єм даного винаходу також входять будь-які комбінації з варіабельних областей і шарнірних областей і доменів СНІ, СНО? і СНЗ. В об'єм даного винаходу також входять химерні, гуманізовані і людські моноклональні і поліклональні антитіла, що специфічно зв'язуються з поліпептидами даного винаходу. В об'єм даного винаходу також входять антитіла, які є антиідіотипічними по відношенню до антитіл даного винаходу.

Антитіла даного винаходу можуть бути моноспецифічними, біспецифічними, триспецифічними, або вони можуть мати мультиспецифічність більш високого порядку. Мультиспецифічні антитіла можуть бути специфічними для інших епітопів поліпептиду даного винаходу, або вони можуть бути специфічними як для 7/0 поліпептиду даного винаходу, так і для гетерологічних композицій, таких як гетерологічний поліпептид або матеріал твердого носія. |Див., наприклад, УМО 93/17715; УМО 92/08802; УМО 91/00360; УМО 92/05793; Тий А. еї аї. (1991) 9. Іттипої. 147:60-69; патенти США МоМо 5573920, 4474893, 5601819, 4714681, 4925648; КовівІпу 5.А. еї аІ. (1992) 3. Іттипої. 148:1547-1553).

Антитіла даного винаходу можуть бути описані або охарактеризовані за їх взаємодією з епітопом(ами) або 7/5 епітопнесучою частиною(ами) поліпептиду даного винаходу, які розпізнаються або специфічно зв'язуються цими антитілами. У разі білків даного винаходу і секретованих білків, вказані антитіла можуть специфічно зв'язуватися з повнорозмірним білком, що кодується нуклеїновою кислотою даного винаходу, зі зрілим білком (тобто білком, що генерується шляхом розщеплення сигнального пептиду), що кодується нуклеїновою кислотою даного винаходу, з сигнальним пептидом, що кодується нуклеїновою кислотою даного винаходу, або з будь-яким іншим поліпептидом даного винаходу. Тому, епітоп(и) або епітопвмісна поліпептидна частина(и) можуть бути визначені як описано в даній заявці, наприклад, за М-кінцевими і С-кіндцевими положеннями, за розміром в суміжних амінокислотних залишках або яким-небудь іншим описаним тут послідовностям (вхідних в список послідовностей). Антитіла, які специфічно зв'язуються з будь-яким епітопом або поліпептидом даного винаходу, можуть бути також виключені як окремий вид. Тому, даний винахід відноситься до антитіл, які специфічно сч ов Зв'язуються з певними поліпептидами даного винаходу, що дозволяє виключити вищезазначені антитіла.

Антитіла даного винаходу можуть бути також описані і охарактеризовані з точки зору їх перехресної і) реактивності. Антитіла, які специфічно не зв'язуються з будь-яким іншим аналогом, ортологом або гомологом поліпептидів даного винаходу, входять в об'єм даного винаходу. У об'єм даного винаходу також входять антитіла, які не зв'язуються з поліпептидами, що мають менше ніж 9595, менше ніж 9095, менше ніж 8595, менше с зо ніж 8095, менше ніж 7595, менше ніж 7095, менше ніж 6595, менше ніж 60956, менше ніж 5595 і менше ніж 5095-ну ідентичність (обчислену відомими і описаними тут методами) з поліпептидом даного винаходу. Крім того, даний со винахід відноситься до антитіл, що зв'язуються лише з поліпептидами, які кодуються полінуклеотидами, що ю гібридизуються з полінуклеотидом даного винаходу в жорстких умовах гібридизації (як описано в даній заявці).

Антитіла даного винаходу можуть бути також описані або охарактеризовані з точки зору їх афінності скріплення. ме)

Переважними афінностями скріплення є афінності скріплення з константою дисоціації або Ка, що складає менше ї-

Б5х10 М, 10М, 5х1077М, 1077М, 5х109М, 109М, 5х109М, 109М, 5х1079М, 107оМ, 5х1071М, 10771М, 5х107?М, 1072М, 5х107З3М, 1073М, 5Х107М, 1072М, 5Х10х10-75М ї 1075М,

Антитіла даного винаходу використовуються в методах, якими є, але не обмежуються ними, відомі методи « очищення, детекції і націлювання на поліпептиди даного винаходу, включаючи діагностичні іп мімо і іп мйго методи і терапевтичні методи. Так, наприклад, ці антитіла використовуються в імуноаналізах для якісного і - с кількісного вимірювання рівнів поліпептидів даного винаходу в біологічних зразках. Див. наприклад, роботу "» Напому еї аі., АМТІВООСІЕ5: А ГАВОКАТОКУ МАМИОАГ (Соїа Зргіпд Нагбог І арогаюгу Ргезв, 2па ей. 1988) (яка у " всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання).

Антитіла даного винаходу можуть бути використані окремо або в комбінації з іншими композиціями. Ці антитіла можуть бути потім рекомбінантно приєднані до гетерологічногоу поліпептиду у М- або С-кінця, або вони - можуть бути хімічно кон'юговані (включаючи ковалентне або нековалентне кон'югування) з поліпептидами або со іншими композиціями. Так, наприклад, антитіла даного винаходу можуть бути рекомбінантно пов'язані або кон'юговані з молекулами, що використовуються як мітки в детектуючих аналізах, і з еректорними молекулами, о такими як гетерологічні поліпептиди, лікарські засоби або токсини. Див. наприклад, УМО 92/08495; УУО 91/14438; о 50 МО 89/12624; патент США Мо5314995; і ЕР 0396387.

Антитіла даного винаходу можуть бути одержані будь-яким відповідним методом, відомим фахівцям. Так, о) наприклад, поліпептид даного винаходу або його антигенний фрагмент може бути введений тварині для стимуляції продукування сироватки, що містить поліклональні антитіла. Термін "моноклональне антитіло" не обмежується антитілами, продукованими за допомогою гібридомної техніки. Термін "антитіло" означає поліпептид або групу поліпептидів, що складаються, принаймні, з одного зв'язуючого домену, де цей

Ге! зв'язувальний домен утворюється внаслідок укладання варіабельних доменів молекули антитіла з утворенням трьохмірних зв'язуючих областей, що мають внутрішню форму поверхонь і розподіл заряду, які комплементарні де відповідним ознакам антигенної детермінанти, і, тим самим, забезпечують можливість імунологічної реакції з антигеном. Термін "моноклональне антитіло" означає антитіло, яке походить від одного клону, включаючи 60 еукаріотичний, прокаріотичний або фаговий клон, але не відноситься до методу його одержання. Моноклональні антитіла можуть бути одержані з використанням багатьох методів, відомих фахівцям, включаючи використання гібридомної техніки, техніки рекомбінантних ДНК і техніки фагового представлення.

Гібридомна техніка добре відома фахівцям (див., наприклад, роботи Нагіом/ еї аї. (1998); Наттегійна еї аї. (1981) (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання). Раб і К(абБ)2-фрагменти бо можуть бути одержані, наприклад, з продукованих гібридомою антитіл шляхом протеолітичного розщеплення ферментами, такими як папаїн (для продукування Еар-фрагментів) або пепсин (для продукування

Каьв)»-фрагментів).

Альтернативно, антитіла даного винаходу можуть бути продуковані за допомогою техніки рекомбінантних

ДНК або шляхом хімічного синтезу методом, відомим фахівцям. Так, наприклад, антитіла даного винаходу

Можуть бути одержані методами фагового представлення, відомими фахівцям. У методах фагового представлення домени функціональних антитіл представлені на поверхні фагової частинки, яка несе полінуклеотидні послідовності, які кодують ці частинки. Фаг з потрібними зв'язувальними властивостями вибирають з набору антитіл або з комбінаторної бібліотеки антитіл (наприклад, людських або мишачих) шляхом прямого відбору з використанням безпосередньо антигену, звичайно антигену, пов'язаного або іммобілізованого уо чна твердій поверхні або сфері. Фагом, що використовується в цих методах, звичайно є нитчастий фаг, включаючи ї4 і М13, з Рар-доменом, Ру-доменом або стабілізованим дисульфідом Еу-доменом антитіла, рекомбінантно приєднаними до фагового білка, що кодується або геном ПІ, або геном МІ. Прикладами методів фагового представлення, які можуть бути використані для продукування антитіла даного винаходу, можуть служити методи, (описані в роботах Вгіпктап Ш. еї аІЇ. (1995); Атевз, К.5. еї аіІ. (1995); КеШерогоцодп С.А. еї 7/5 81. (1994); Регвіс І. еї а). (1997); Випоп О.К. еї аї. (1994); РСТ/5891/01134; МУ/О 90/02809; УМО 91/10737; МО 92/01047; МО 92/18619; МО 93/11236; УМО 95/15982; МО 95/20401; і в патентах США МоМо 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727 і 5733743 (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання)).

Як описано у вищезгаданих роботах, після фагового відбору, антитіло-кодуючі області даного фага можуть бути виділені і використані для генерування цілих антитіл, включаючи людські антитіла або будь-який інший потрібний антигензв'язувальний фрагмент, і експресовані в будь-якому відповідному хазяїні, включаючи клітини ссавців, клітини комах, клітини рослин, дріжджі і бактерії. Так, наприклад, рекомбінантне продукування Раб,

Еаб', Р(аб)» і Е (ар)»-фрагментів може бути також здійснено відомими методами, такими як методи, (описані в

МО 92/22324; Миїйпах К.Ї. еї аЇ. (1992), Замжаі Н. еї аї., (1995) і ВецЦег М. еї аїЇ. (1988) (які у всій своїй сч об повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання)).

Прикладами методів, які можуть бути використані для продукування одноланцюгових Еу-фрагментів і антитіл, і) є методи, (описані в патентах США МоМо4946778 і 5258498; Низіоп еї аЇ. (1991); пи Її. еї аї. (1993); і ЗКеїта

А. еї аї. (1988)). Для деяких цілей, включаючи іп мімо-використання антитіл у людини і використання в детектуючих іп міїго аналізах, переважно, можуть бути використані химерні, гуманізовані або людські антитіла. с

Зо Методи продукування химерних антитіл відомі фахівцям. |Див. наприклад, Могтівоп (1985); ОЇ еї аї. (1986);

Сійез 5.0. еї аІ., (1989) і патент США Мо 5807715. Антитіла можуть бути гуманізовані з використанням ряду со методів, включаючи СОК-"щеплення" (ЕР 0239400; УМО 91/09967; патенти США МоМо5530101 і 5585089), ю маскування або модифікацію поверхні (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Радіап Е.А. (1991); Зіцапіска О.М. еї а). (1994); КодивзКа М.А. еї аї. (1994) і "перестановку" ланцюгів (патент США Мо5565332). Людські антитіла можуть Ме бути одержані рядом методів, відомих фахівцям, включаючи методи фагового представлення, описані вище. ї-

Див. також патенти США МоМо4444887, 4716111, 5545806 і 5814318; МО 98/46645; УМО 98/50433; УМО 98/24983;

МО 96/34096; МО 96/33735; і МО 91/10741 (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання)).

Крім того, даний винахід відноситься до антитіл, рекомбінантно приєднаних або хімічно кон'югованих « (включаючи ковалентне або нековалентне кон'югування) з поліпептидом даного винаходу. Ці антитіла можуть пл) с бути специфічними до антигенів, що не є поліпептидами даного винаходу. Так, наприклад, антитіла можуть бути використані для доставки поліпептидів даного винаходу в клітини конкретних типів, або іп міго, або іп мімо, ;» шляхом скріплення або кон'югування поліпептидів даного винаходу з антитілами, специфічними до конкретних рецепторів клітинної поверхні. Антитіла, пов'язані або кон'юговані з поліпептидами даного винаходу можуть бути також використані в іп міго імуноаналізах і в методах очищення, відомих фахівцям. Див. наприклад, -І Нагбог еї аі., див. вище і МО 93/21232; ЕР 0439095; Магатига М. еї аїІ. (1994); патент США Мо 5474981; С Шіев 5.0. еїг а. (1992); Реї! Н.Р. еї а. (1991) (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання)). се) Даний винахід також відноситься до композицій, що містять поліпептиди даного винаходу, пов'язані або с кон'юговані з доменами антитіл, що не є варіабельними областями. Так, наприклад, поліпептиди даного 5о Винаходу можуть бути пов'язані або кон'юговані з Ес-областю антитіла або з його частиною. Ця частина бо антитіла, сполучена з поліпептидом даного винаходу, може містити шарнірну область, домен СНІ, домен СН? і

Ге домен СНЗ або будь-яку комбінацію цілих доменів або їх частин. Поліпептиди даного винаходу можуть бути пов'язані або кон'юговані з вищезгаданими частинами антитіл для збільшення часу півжиття поліпептидів іп мімо або для використання в імуноаналізах відповідно до методів, відомих фахівцям. Ці поліпептиди можуть бути ов також злиті або кон'юговані з вищезгаданими частинами антитіл з утворенням мультимерів. Так, наприклад,

Ес-частини, сполучені з поліпептидами даного винаходу, можуть утворювати димери за допомогою

Ф) дисульфідного зв'язку між цими Ес-частинами. Більш великі мультимерні форми можуть бути одержані шляхом ка сполучення поліпептидів з частинами ІдА і (ЯМ. Методи злиття або кон'югування поліпептидів даного винаходу з частинами антитіл відомі фахівцям. |Див. наприклад, патенти США МоМо 5336603, 5622929, 5359046, 5349053, бо 5447851, 5112946; ЕР 0307434; ЕР 0367166; УМО 96/04388, УУО 91/06570; АзпКепа?і А. еї а. (1991); непо ХХ. еї аІ. (1995) і МІЇ Н. еї а. (1992) (які у всій своїй повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання)).

Крім того, даний винахід відноситься до антитіл, які діють як агоністи або антагоністи для поліпептидів даного винаходу. Так, наприклад, даний винахід відноситься до антитіл, які порушують взаємодію рецептор/ліганд з поліпептидами даного винаходу, або частково, або повністю. В об'єм даного винаходу входять 65 рецепторспецифічні антитіла і лігандспецифічні антитіла. В об'єм даного винаходу входять рецепторспецифічні антитіла, які не запобігають скріпленню з лігандом, але запобігають активації рецептора. Активація рецептора

(тобто передача сигналу) може бути визначена методами, описаними в даній заявці, або якими-небудь іншими відомими методами. Даний винахід також включає рецепторспецифічні антитіла, які запобігають скріпленню з лігандом і активації рецептора. Аналогічним чином, в об'єм даного винаходу входять нейтралізуючі антитіла, які зв'язуються з лігандом і запобігають скріпленню ліганду з рецептором, а також антитіла, які зв'язуються з лігандом і тим самим запобігають активації рецептора, але не запобігають скріпленню ліганду з рецептором.

Даний винахід також відноситься до антитіл, які активують цей рецептор. Вказані антитіла можуть діяти як агоністи по відношенню до всіх, або не до всіх біологічних активностей, що підпадають під вплив лігандопосередкованої активації рецептора. Вказані антитіла можуть бути визначені як агоністи або антагоністи 70 біологічних активностей, що включають описані тут питомі активності. Вищезгадані антитіла-агоністи можуть бути одержані методами, відомими фахівцям. |Див. наприклад, МО 96/40281; патент США Мо 5811097; Оепа В. еї а. (1988); Спеп 7. еї аїЇ. (1998); Натор .А. еї а). (1998); 2пи 7. еї а). (1998), Мооп О.М. еї аї. (1998);

Ргагї М. еї аї., (1998); Рйага М. ей аїЇ. (1997); Ііашага 3. ей а). (1997); Сагівоп М.О. еї аї. (1997);

Тагутап К.Е. еї аїЇ. (1995); МиїМег М.А. еї аЇ. (1998); Вапйцпек Р. еї аЇ. (1996) (які у всій своїй повноті /5 ВВОДЯТЬСЯ В даний опис за допомогою посилання)).

Як обговорювалося вище, антитіла для поліпептидів даного винаходу можуть бути, в свою чергу, використані для генерування антиідіотипічних антитіл, які "імітують" поліпептиди даного винаходу, методами, добре відомими фахівцям. |Див. наприклад, Сгеепзрап 5 Вопа (1989); Мізвіпої (1991)). Так, наприклад, антитіла, які зв'язуються з поліпептидом і конкурентно інгібують мультимеризацію поліпептиду або скріплення поліпептиду 2о даного винаходу з лігандом, можуть бути використані для генерування антиідіотипічних антитіл, які "імітують" мультимеризацію або скріплення домену, а, отже, скріплення і нейтралізацію поліпептиду або його ліганду. Такі нейтралізуючі антиідіотипічні антитіла можуть бути використані для скріплення поліпептиду даного винаходу або для скріплення з його лігандом/рецептором, і тим самим блокування його біологічної активності.

Рекомбінантні вектори сч

Термін "вектор", що використовується тут, означає кільцеву або лінійну молекулу ДНК або РНК, яка є або дволанцюговою, або одноланцюговою, і яка містить, принаймні, один потрібний полінуклеотид, призначений для і) його перенесення в клітину-хазяїна, або в одноклітинний або в багатоклітинний організм хазяїна.

Даний винахід охоплює сімейство рекомбінантних векторів, що включають регуляторний полінуклеотид, що походить від геномної послідовності РАРАР, і/або кодуючий полінуклеотид, що походить або від геномної с зо послідовності, або від КкДНК-послідовності РАРАР.

У загальних рисах, рекомбінантний вектор даного винаходу може містити будь-який з описаних тут со полінуклеотидів, включаючи регуляторні послідовності, що кодують послідовності і полінуклеотидні конструкції, ю а також будь-який праймер або зонд РАРАР, визначений вище. Більш конкретно рекомбінантні вектори даного винаходу можуть містити будь-який з полінуклеотидів, описаних в розділах "Геномні послідовності гена РАРАР", (22) "КДНК-послідовності РАРАР", "Кодуючі області", "Полінуклеотидні конструкції" і "Олігонуклеотидні зонди і ї- праймери".

У першому переважному варіанті здійснення винаходу рекомбінантний вектор даного винаходу використовується для ампліфікації вбудованого полінуклеотиду, що походить від геномної послідовності РАРАР

ЗЕО ІО МО:З або кКДНК РАРАР, наприклад, КДНК ЗЕО ІЮО МО:1 у відповідній клітині-хазяїні, причому, цей « Пполінуклеотид ампліфікується кожний раз, коли реплікується рекомбінантний вектор. з с У другому переважному варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до рекомбінантних векторів, що . містять або регуляторний полінуклеотид, або кодуючу нуклеїнову кислоту даного винаходу, або і те і інше. У и?» деяких варіантах здійснення винаходу експресуючі вектори використовуються для експресії поліпептиду РАРАР, який може бути потім очищений або, наприклад, використаний в лігандскринуючих аналізах або як імуноген для вироблення специфічних антитіл проти білка РАРАР. В інших варіантах здійснення винаходу експресуючі -І вектори використовуються для конструювання трансгенних тварин, а також для генної терапії. Для експресії необхідно, щоб в даних векторах вироблялися відповідні сигнали, де вказаними сигналами є різні регуляторні ік елементи, такі як енхансери/промотори, що походять від вірусів або ссавців і регулюють експресію потрібних с генів в клітинах-хазяях. Звичайно, в експресуючі вектори даного винаходу вводять маркери домінантного відбору 5о за лікарським засобом для одержання перманентних, стабільних клітинних клонів, що експресують дані со продукти, оскільки вони являють собою елементи, які здійснюють зчеплення експресії маркера відбору за

Із лікарським засобом з експресією даного поліпептиду.

Більш конкретно, даний винахід відноситься до експресуючих векторів, що включають нуклеїнові кислоти, які кодують білок РАРАР, а переважно, білок РАРАР амінокислотної послідовності ЗЕО ІЮ МО:2 або його варіанти або фрагменти.

Даний винахід також відноситься до рекомбінантного експресуючого вектора, що використовується для

Ф) експресії кодуючої послідовності РАРАР, де вказаний вектор містить нуклеїнову кислоту ЗЕО ІЮ МО:1. ка Деякі з елементів, які можуть бути присутніми у векторах даного винаходу, більш детально описані у наступних розділах. во 1. Загальні ознаки експресуючих векторів даного винаходу

Рекомбінантним вектором даного винаходу є, але не обмежуються ними, МАС (штучна дріжджова хромосома), ВАС (штучна бактеріальна хромосома), фаг, фагміда, косміда, плазміда або навіть лінійна

ДНК-молекула, яка може являти собою хромосомну, нехромосомну, напівсинтетичну і синтетичну ДНК. Такий рекомбінантний вектор може містити одиницю транскрипції, до складу якої входять: 65 (1) генетичний елемент або елементи, що регулюють експресію, наприклад, промотори або енхансери.

Енхансери являють собою цис-діючі елементи ДНК, звичайно довжиною приблизно 100-300 п.н., які впливають на промотор, і тим самим посилюють транскрипцію; (2) структурна або кодуюча послідовність, яка транскрибується в мРНК і, зрештою, транслюється в поліпептид, причому вказана структурна або кодуюча послідовність функціонально приєднана до регуляторних елементів, описаних в (1);і (3) відповідна послідовність ініціації і термінації транскрипції. Структурні одиниці, призначені для використання в дріжджових або еукаріотичних експресуючих системах, переважно, включають лідерну послідовність, що забезпечує позаклітинну секрецію трансльованого білка клітиною-хазяїном. Альтернативно, якщо рекомбінантний білок експресується за відсутності лідерної або транспортної послідовності, то він може 7/0 Включати М-кінцевий залишок. Потім цей залишок може, або не може, віддеплюватись від експресованого рекомбінантного білка з утворенням кінцевого продукту.

В основному, рекомбінантні експресуючі вектори включають сайти ініціації реплікації, селективні маркери, що здійснюють трансформацію клітини-хазяїна, і промотор, що походить від високоекспресованого гена, для регуляції транскрипції розташованої нижче структурної послідовності. Гетерологічна структурна послідовність /5 зазнає укладання у відповідній фазі з послідовностями ініціації і термінації трансляції, а переважно, з лідерною послідовністю, здатною регулювати секрецію білка, що транслюється в периплазматичний простір або у позаклітинне середовище. У конкретному варіанті здійснення винаходу, де вектор адаптований для трансфекції і експресії потрібних послідовностей в клітинах-хазяях ссавця, переважні вектори містять сайти ініціації реплікації в потрібному хазяїні, відповідні промотор і енхансер, а також будь-які необхідні сайти скріплення з рибосомою, сигнал поліаденілювання, донорні і акцепторні сайти сплайсингу, послідовності термінації транскрипції і 5'рланкуючі нетранскрибовані послідовності. ДНК-послідовності, що походять від вірусного геному 5М40, наприклад, ранній промотор, енхансер, сигнали сплайсингу і поліаденілювання, можуть бути використані для одержання необхідних не транскрибованих генетичних елементів.

Іп мімо-експресія поліпептиду РАРАР ЗЕО ІЮО МО:2 або його фрагментів або варіантів може бути використана с ов для корекції генетичного дефекту, асоційованого з експресією нативного гена в організмі хазяїна або для продукування біологічно неактивного білка РАРАР. і)

Отже, даний винахід також відноситься до рекомбінантних експресуючих векторів, сконструйованих, головним чином, для продукування іп мімо поліпептиду РАРАР ЗЕО ІО МО:2 або його фрагментів або варіантів шляхом введення відповідного генетичного матеріалу в організм пацієнта, що піддається лікуванню. Цей с зо генетичний матеріал може бути введений іп міго в клітину, яка була заздалегідь екстрагована з цього організму, після чого вказану модифіковану клітину-хазяїна знов вводять у вказаний організм, безпосередньо іп со мімо у відповідну тканину. ю 2. Регуляторні елементи

Промотори ме)

Відповідні промоторні області, що використовуються в експресуючих векторах даного винаходу, вибирають з МУ урахуванням клітини-хазяїна, в якій повинен експресуватись гетерологічний ген. Який саме промотор використовується для регуляції експресії потрібної послідовності нуклеїнової кислоти не має вирішального значення, якщо тільки він здатний регулювати експресію нуклеїнової кислоти в клітинах-мішенях. Таким чином, якщо клітиною-мішенню є людська клітина, то переважно, щоб положення даної кодуючої області нуклеїнової «

Кислоти було суміжним з даним промотором і знаходилося під контролем вказаного промотору, здатного в с регулювати її експресію в людській клітині, наприклад, людського або вірусного промотору. . Відповідний промотор може бути гетерологічним по відношенню до нуклеїнової кислоти, експресію якої він а регулює, або альтернативно, він може бути ендогенним по відношенню до нативного полінуклеотиду, що містить експресовану кодуючу послідовність. Крім того, вказаний промотор є, в основному, гетерологічним по

Відношенню до рекомбінантних векторних послідовностей, в які була вбудована конструкція "промотор-кодуюча -І послідовність".

Промоторні області можуть бути вибрані з будь-якого потрібного гена з використанням, наприклад, векторів ік САТ (хлорамфенікол-трансферази), а більш переважно, векторів рКК232-8 і рем. с Переважними бактеріальними промоторуми є промотори І! ад, І ас7, промотори РНК-полімерази бактеріофага

ТЗ або Т7, промотори орі, лямбда РК, РІ. і р (ЕР 0036776), промотор поліедрину або промотор білка Р. 10 со бакуловірусу (Кії Момадеп) (Зтік еї аї, 1983; О'КейуУу еї а!., 1992), промотор лямбда РК або також промотор ігс.

Ге Еукаріотичними промоторуми є передранній промотор СММ, промотор тимідинкінази НОМ, ранній і пізній промотор 5М40, ІТК від ретровірусу і промотор мишачого металотіонеїну-Ї. Вибір відповідного вектора і промотору може бути зроблений будь-яким фахівцем. 5Б Вибір промотору може бути зроблений будь-яким фахівцем в області генної інженерії. Для цього фахівець може, наприклад, звернутися до книги ЗатрбгооК еї аї. (1989), або також до опису відповідних процедур,

Ф) приведеного в роботі Ешег еї а!. (1996). ка Інші регуляторні елементи

Якщо використовується кКДНК-вставка, то для ефективного здійснення поліаденілювання генного транскрипту во необхідно ввести сигнал поліаденілювання. Природа сигналу поліаденілювання не має вирішального значення для успішного здійснення даного винаходу, і для цих цілей може бути використана будь-яка послідовність, така як сигнали гормону зростання людини і сигнали поліаденілювання 5М40. Елементом експресійного кластера може бути також термінатор. Ці елементи можуть служити для збільшення рівнів транскрипту і для мінімізації зчитування інформації з кластера в інші послідовності. 65 З. Селектовані маркери

Вказані маркери повинні вводити в дану клітину зміни, що ідентифікуються, які дозволяють легко ідентифікувати клітини, що містять експресійну конструкцію. Такими селективними маркерними генами для відбору трансформованих клітин-хазяїв є, переважно, ген дигодрофолат-редуктази або ген резистентності до неоміцину для еукаріотичної клітинної культури, ТКР1 для 5.сегемівіае або ген резистентності до тетрацикліну, рифампіцину або ампіциліну для Е.соїі, або ген левансахарази для мікобактерій, причому цей останній маркер є маркером негативного відбору. 4. Переважні вектори

Бактеріальні вектори

Як репрезентативний, але необмежувальний приклад, можуть служити вектори, що використовуються в 7/0 бактеріях, які містять селективний маркер і бактеріальний сайт ініціації реплікації, і які можуть бути одержані з комерційно доступних плазмід, що містять генетичні елементи рВК322 (АТСС 37017). Такими комерційно доступними векторами є, наприклад, рКК223-3 (Рпагтасіа, Оррзаїа, Зм'едеп) і СЕМІ1 (Рготеда Віоіес,

Мадізоп, УМІ, ОА).

Фахівцям відоме велике число інших відповідних і комерційно доступних векторів, таких як наступні /5 бактеріальні вектори: РОЕ7О, рОЕСО, рОЕ-9 (Сіадеп), роз, ррІО, рНадезогірі, рвіх174, ррісезогірі ЗК, ррекв, рРМНЗА, рМНІбА, рМНІ8А, рМНабА (5ігагадепе); рігс99а, ркКК223-3, рКкК233-3, рОК5Б40, ркІТ5 (РНагтасіа), рРУЛМЕО, рЗМ2САТ, рос44, рхХтТ1, ро (Зігаїадепе); рЗМКЗ, рВРМ, рМ5О, рамі (РНаптасіа); роєЕ-з3о0 (СіАехргеззв).

Бактеріофагові вектори

Вектор на основі бактеріофага Р1 може містити великі вставки, що складають приблизно від 80 до 100 т.п.н.

Конструювання векторів на основі бактеріофагу РТ, таких як р1!58 або р158/пео8, конкретно описані у

Зіеіпрегуд (1992, 1994). Рекомбінантні клони РІ, що містять нуклеотидні послідовності РАРАР, можуть бути сконструйовані шляхом вбудовування великих нуклеотидів, що складають більш ніж 40 т.п.н. (іпіоп еї а). 1993). Для генерування ДНК РІ з метою проведення трансгенних експериментів, переважним протоколом такого сч об Генерування є протокол, описаний МеСогтісК еї аїЇ. (1994). Коротко, Е.соїї (переважно, штам М53529), що містить плазміду Р1, культивують протягом ночі у відповідному поживному середовищі, що містить 25мМкг/мл і) канаміцину. ДНК РІ виділяють з Е.соїї шляхом лужного лізису з використанням набору Оіадеп Ріазтіа Махі кії (Сіадеп, Спаїзугогій, СА, ОБА) відповідно до інструкцій виробників. Потім ДНК РІ очищають від бактеріального лізату на двох колонках Оіадеп-їр 500 з використанням промивальних і елююючих буферів, що містяться в с зо даному наборі. Після екстракції фенолом/етанолом здійснюють преципітацію ДНК 7095-ним етанолом. Після солюбілізації ДНК в ТЕ (10мМ Трис-НСЇ, рН 7,4, 1ММ ЕОТА), концентрацію ДНК оцінюють на спектрофотометрі. со

Якщо метою є експресія клону Р1, що містить нуклеотидні послідовності РАРАР, в трансгенній тварині, ю звичайно в трансгенній миші, то бажано видалити векторні послідовності з ДНК-фрагменту РІ, наприклад, шляхом відщеплення ДНК Рі в сайтах, що рідко розрізаються, в полілінкері РІ (5Ї, Мої або Заї|). Потім ме) зв Вставку РІ! виділяють з векторних послідовностей на агарозному гелі в імпульсному полі методами, ї- аналогічними методам, які були нещодавно описані для виділення ДНК з ХУАС (зЗсепеаді еї а/ї., 1993За; Рейегзоп еї аІ.,, 1993). На цій стадії одержану очищену ДНК-вставку концентрують, якщо це необхідно, на міліпористому фільтрі Мійїроге ОНКгаїтее-МС Рійег Опії (Мійіроге, Ведіога, МА, ОБА - гранична молекулярна маса З0000), а потім діалізують проти буфера для мікроінжекції (10мМ Трис-НСЇ, рН 7,4; 250мкМ ЕОТА), що містить 100мМ масі, « ЗОМКкМ сперміну, 7/ОмМкМ спермідину, на мембрані для мікродіалізу (тип М5, 0,025мМкМ від Мійїроге). Цілісність з с очищеної ДНК-вставки Р1 оцінюють за допомогою електрофорезу в імпульсному полі на 190 агарозному гелі (Зеа

Й Кегп СТО; ЕМО Віо-ргодисів) і з фарбуванням етидійбромідом. и?» Бакуловірусні вектори

Відповідним вектором для експресії поліпептиду РАРАР 5ЕО ІО МО:2 або його фрагментів або варіантів є

Вектор на основі бакуловірусу, який розмножується в клітинах комахи або в клітинних лініях комах. Особливо -І придатною векторною системою хазяїна є бакуловірусний вектор перенесення рмі 1392/1393 (РНагтіпдеп), який використовують для трансфекції клітинної лінії БЕЗ (АТСС МОСТІ. 1711), що походить від Зродоріега Ігидірегаа. се) Відповідно до даного винаходу, інших відповідних векторів для експресії поліпептиду РАРАР 5ЕО ІЮО МО:2 с або його фрагментів або варіантів в бакуловірусній системі експресії є вектори, описані СНаї еї аї. (1993), Мазак еї аї. (1983) еппагає(а!(1996). со Вірусні вектори

Ге В одному конкретному варіанті здійснення винаходу вектор одержують з аденовірусу. Переважними аденовірусними векторами даного винаходу є вектори, описані Реідтап 5: Зієед (1996) або Ого еї аї. (1994).

Відповідно до даного винаходу іншим переважним рекомбінантним аденовірусом є аденовірус людини тину 2 або 5 (Ай 2 або Аа 5) або аденовірус, що походить від тварини |заявка на патент Франції МоєК-93.05954).

Як системи доставки рекомбінантного гена для перенесення екзогенних полінуклеотидів іп мімо, зокрема, (Ф, ссавцям, включаючи людину, звичайно використовуються вектори, одержані на основі ретровірусів і ка аденоасоційованих вірусів. Ці вектори забезпечують ефективну доставку генів в клітини, і перенесені нуклеїнові кислоти стабільно інтегруються в хромосомну ДНК хазяїна. во Особливо переважними ретровірусами для одержання або конструювання ретровірусних носіїв для іп мімо або іп мйго для доставки гена даного винаходу є ретровіруси, вибрані з групи, що складається з фокус-індукуючого вірусу клітин норки, вірусу саркоми миші, вірусу ретикулоендотеліозу і вірусу саркоми

Рауса. Особливо переважними вірусами мишачого лейкозу є штами 4070А і 1504А, віруси Абельсона (АТСС Мо

Утк-999), Фрейнда (АТОС Мо МК-245), Гросса (АТСС Мо МК-590), Раушера (АТСС Мо Мі-998) і вірус мишачого 65 лейкозу Молоні (АТОС Мо МК-190; заявка РСТ Мо УУО 94/24298). Особливо переважними вірусами саркоми Рауса є вірус Бріана з високим титром (АТСС Мо МК-334, МК-657, УкК-726, УкК-659 і МК-728). Іншими переважними ретровірусними векторами є вектори, описані Коїй еї аї. (1996), в заявці РСТ Мо УУО 93/25234, в заявці РСТ Мо

МО 94/06920, Коих еї а!., 1989, ДшШап еї аї, 1992, і Меда еї аї, 1991.

Інша система вірусних векторів, яка може бути використана в даному винаході, містить аденоасоційований вірус (ААМ). Цей аденоасоційований вірус є природним дефектним вірусом, якому, для його ефективної реплікації і для продуктивного клітинного циклу, потрібний інший вірус-помічник, такий як аденовірус або герпесвірус (МигусгКа еї аї, 1992). Він також є одним з декількох вірусів, які можуть інтегрувати свою ДНК в неподільні клітини і виявляють високу частоту стабільної інтеграції (Ріобйе еї аЇ, 1992; ЗатиївКі еї аї, 1989; Мсі ашднііп ек аї, 1989). Однією з переважних ознак ААМ є те, що його ефективність трансдукції в /о первинні клітини менше, ніж в трансформовані клітини.

ВАС-вектори

Система клонування штучної бактеріальної хромосоми (ВАС) (ЗПігцуа еї аї., 1992) була розроблена для стабільного підтримання великих фрагментів геномної ДНК (100-300 т.п.н.) в Е.соїї. Переважним ВАС-вектором є вектор рВеіоВАСІЇ, описаний Кігп еї аї. (1996). ВАС-бібліотеки, що містять цей вектор, одержують з /5 використанням відібраної за розміром геномної ДНК, частково гідролізованої ферментами, які дозволяють Її лігувати або в ВатНі-сайт, або в НіпаП-сайт в даному векторі. Ці сайти клонування фланкуються сайтами ініціації транскрипції РНК-полімерази 17 і 5Рб, які можуть бути використані для генерування кінцевих зондів або шляхом транскрипції РНК, або ПЛР-методами. Після конструювання ВАС-бібліотеки в Е.сої, ВАС-ДНК виділяють з клітини-хазяїна у вигляді суперспіралізованого кільця. Після перетворення цих кільцевих молекул в їх лінійну форму визначають їх розмір і ці ВАС вводять в клітини реципієнта. Клонуючий сайт фланкований двома Моїй-сайтами, що дозволяє вирізати ці клоновані сегменти з вектора за допомогою МоїІ-гідролізу.

Альтернативно, ДНК-вставка, що міститься у векторі рВевВАСІЇ, може бути лінеаризована шляхом обробки

ВАС-вектора комерційно доступним ферментом лямбда-терміназою, що приводить до його розрізання в унікальному созМ-сайті, але цей метод гідролізу дає повнорозмірний ВАС-клон, що містить як ДНК-вставку, так і сч

ВАС-послідовності. 5. Доставка рекомбінантних векторів і)

Для здійснення експресії полінуклеотидів і полінуклеотидних конструкцій даного винаходу ці конструкції повинні бути доставлені в клітину. Така доставка може бути здійснена іп міго лабораторними процедурами, що проводяться для трансформації клітинних ліній, іп мімо або ех мімо, а також для лікування деяких патологічних с зо станів.

Одним з таких механізмів є інфікування вірусом, де експресійна конструкція інкапсульована в інфекційну со вірусну частинку. ю

У даному винаході також розглядається декілька невірусних способів перенесення полінуклеотидів в клітини ссавців, що культивуються, і такими способами є, але не обмежуються ними, преципітація фосфатом кальцію ме) (ОСтапат еї аї., 1973; Спеп еї аї., 1987); ОЕАЕ-декстранова трансфекція (Сораї еї аї., 1985), електропорація ї- (Ти--Казра еї аї.,, 1986; Роцег еї аіЇ., 1984), пряма мікро інжекція (Нагапа еї аї., 1985), використання

ДНЕК-навантажених ліпосом (Місоїаи еї аї., 1982; Егаїеу еї аі., 1979) і опосередкована рецептором трансфекція (уи 8. Ми, 1987; 1988). Деякі з цих методів можуть бути успішно адаптовані для використання іп мімо або ех мімо.

Після доставки експресованого полінуклеотиду в клітину, він може стабільно інтегруватися в геном « Клітини-реципієнта. Ця інтеграція може відбуватися в когнатній локалізації і орієнтації за допомогою з с гомологічної рекомбінації (заміни гена), або вона може відбуватися у випадковому неспецифічному положенні (додавання гена). У інших варіантах здійснення винаходу нуклеїнова кислота може стабільно підтримуватися в ;» клітині як окремий, епісомний сегмент ДНК. Такі сегменти нуклеїнової кислоти або "епісоми" кодують послідовності, придатні для їх збереження і реплікації незалежно або синхронізовано з циклом клітини-хазяїна.

Один з конкретних варіантів здійснення методу доставки білка або пептиду всередину клітини хребетного іп -І мімо включає стадію введення препарату, що містить фізіологічно прийнятний носій і "голий" полінуклеотид, що функціонально кодує потрібний поліпептид в інтерстиціальному просторі тканини, що містить дану клітину, ік внаслідок чого цей "голий" полінуклеотид проникає всередину клітини і володіє фізіологічною дією. Цей спосіб, с зокрема, застосовується для перенесення іп міо, але він може бути також застосований і для перенесення іп

УМО. со Композиції для використання іп міїго і іп мімо, що включають "голий" полінуклеотид, описані в заявці РСТ з Мо УУО 90/11092 (Міса! Іпс.), а також в заявці РСТ Мо МУО 95/11307 (Іпвійцшї Равіеиг, ІМ5ЕКМ, Опімегайе а ОКауа) і в статтях Тасзоп еї аї. (1996) і Ниоудеп еї а. (1996).

В іншому варіанті здійснення винаходу перенесення "голого" полінуклеотиду даного винаходу, включаючи ов Полінуклеотидну конструкцію даного винаходу, в клітини може бути здійснений шляхом бомбардування частинками (біобалістики), де вказані частинки являють собою "мікроснаряди", покриті ДНК і що прискорюються з (Ф) високою швидкістю, яка дозволяє їм "пробивати" клітинні мембрани і проникати в клітини, не викликаючи їх ка загибель, так, як описано Кіеїп ега|!. (1987).

В іншому варіанті здійснення винаходу полінуклеотид даного винаходу може бути інкапсульований в во ліпосому (Опов 45 Васспамаї 1991; Ууопо еї аї., 1980; Місоїаи еї а!., 1987).

У конкретному варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до композиції для іп мімо продукування описаного тут білка або поліпептиду РАРАР. Ця композиція містить "голий" полінуклеотид, що функціонально кодує вказаний поліпептид, в розчині, у фізіологічно прийнятному носії, ії придатний для введення в тканину, так, щоб клітини цієї тканини експресували вказаний білок або поліпептид. 65 Кількість вектора, який ін'єкується в потрібний організм хазяїна, варіюється в залежності від ділянки ін'єкції. Як приклад, вказаний вектор може бути ін'єкований в дозі, що складає від 0,1 до 1ООмкг, в організм тварини, переважно, ссавця, наприклад, миші.

В іншому варіанті вектора даного винаходу цей вектор може бути введений в клітину-хазяїна іп міо, а переважно, в клітину-хазяїна, заздалегідь виділену з організму обробленої тварини, а більш переважно, в соматичну клітину, таку як м'язова клітина. У подальшій стадії клітину, яка була трансформована вектором, що кодує потрібний поліпептид РАРАР або його потрібний фрагмент, знов вводять в організм тварини для місцевої або системної доставки рекомбінантного білка в даний організм.

Клітини-хазяї

Іншим об'єктом даного винаходу є клітина-хазяїн, яка була трансформована або трансфіковані одним з 7/0 описаних тут полінуклеотидів, а зокрема, полінуклеотидом, що містить або регуляторний полінуклеотид РАРАР, або кодуючу область поліпептиду РАРАР 5ЕО ІО МО:1 або 3, або його фрагментом або варіантом. Даний винахід також відноситься до клітин-хазяїв, які були трансформовані (прокаріотичні клітини) або трансфіковані (еукаріотичні клітини) рекомбінантним вектором, таким як один з векторів, описаних вище. Більш конкретно, клітини-хазяїв даного винаходу можуть включати будь-який з полінуклеотидів, описаних в розділах "Геномні послідовності гена РАРАР", "КДНК-послідовності РАРАР", "Кодуючі області", "Полінуклеотидні конструкції" і "Олігонуклеотидні зонди і праймери".

Інша рекомбінантна клітина-хазяїн даного винаходу містить будь-який з описаних тут векторів, а більш конкретно, будь-який з векторів, описаних в розділі "Рекомбінантні вектори".

Переважними клітинами-хазяїнами, що використовуються як реципієнти для експресуючих векторів даного 2о винаходу, є: а) прокаріотичні клітини-хазяї: штами ЕЕвзсПегіспіа соїї (штам ІЕ. ОНба), Васійиз зибБійв5, ЗаїІтопейа

Іурпітигіт, і штами таких видів як Рзейдотопавз, Зігеріотусез і бтарпуіососсив.

Б) еукаріотичні клітини-хазяї: клітини Неї а (АТСС Мосс 2; Мосс 2.1; Мосс 2.2), клітини Смі (АТОС Мосс 70), клітини СО5 (АТСС МоСтКІ 1650; МОСК 1651), клітини 5-9 (АТОС МосСКІ 1711), клітини С127 (АТОС МоСкКіІ -1804), сч ов Клітини ЗТЗ (АТСС МоСтІ-6361), клітини СНО (АТСС МеССІ-61), клітини нирок людини 293 (АТС Ме45504;

МОСТІ -1573) і клітини ВНК (ЕСАСС Мо84100501; Мо84111301). і) с) інші клітини-хазяї ссавців.

Експресія гена РАРАР в клітинах ссавців, а звичайно людини, може бути зроблена дефектною, або альтернативно, вона може бути здійснена шляхом інсерції геномної або кКДНК-послідовності РАРАР із заміною с зо відповідного гена-аналога РАРАР в геномі клітини ссавця полінуклеотидом РАРАР даного винаходу. Ці генетичні альтерації можуть бути генеровані за допомогою подій гомологічної рекомбінації з використанням специфічних со

ДНК-конструкцій, які були заздалегідь описані раніше. ю

Одним з видів клітин-хазяїв, що використовуються, є зиготи ссавців, такі як мишачі зиготи. Так, наприклад, в мишачі зиготи може бути введена, шляхом мікроінжекції, очищена молекула ДНК, що представляє ме) інтерес, наприклад, очищена молекула ДНК, яка заздалегідь була доведена до концентрації в межах від нг/мл, ї- для ВАС-вставок, і до Знг/мкл, для вставок бактеріофага РІ, в 10мМ Трис-НСЇ, рН 7,4, 250мкМ ЕОТА, що містить 100мМ Масі, ЗОмкМ сперміну, і 7ОмкМ спермідину. Якщо вказана мікроін'єкована ДНК має великий розмір, то, щоб уникнути механічного пошкодження цієї ДНК, можуть бути використані поліаміни і високі концентрації солей, як описано 5спеагі еї а! (19936). «

Будь-який з полінуклеотидів даного винаходу, включаючи описані тут ДНК-конструкції, можуть бути введені в о00/ пт») с лінію ембріональних стовбурових клітин (ЕСК), а переважно, мишачу лінію ЕСК. Лінії ЕСК походять від плюрипотентних некомітованих клітин внутрішньої клітинної маси бластоцистів перед імплантацією. з Переважними лініями ЕСК є: Е5-Е14ТО2а (АТСС МоСтКІ -1821), Е5-ЮОЗ (АТС МОСТІ. 1934 і Моск -11632), 5001 (АТС МоСКІ -11776), 36,5 (АТОС МоСкКІ -11116). Для підтримки ЕСК в некомітованому стані, їх культивують в присутності живильних клітин з інгібованим зростанням, які передають відповідні сигнали для збереження цього -І ембріонального фенотипу і служать як матриця для адгезії ЕСК. Переважними живильними клітинами є первинні ембріональні фібробласти, які одержують з тканини 13-денних 14 ембріонів фактично будь-якого мишачого ік штаму, що підтримуються в культурі, як описано Арропаап?о еї аї. (1993), і зростання яких інгібується шляхом с їх опромінення, як описано Кобегізоп (1987), або завдяки присутності інгібуючої концентрації ГІР, як описано Реаве 8. УМіПатвз (1990). со Ці конструкції в клітинах-хазяїнах можуть бути використані відповідним чином для продукування генного

Із продукту, що кодується рекомбінантною послідовністю.

Після трансформації відповідного хазяїна і культивування хазяїна до відповідної клітинної щільності, вибраний промотор індукується відповідними способами, такими як зміна температури або хімічна індукція, і 5Б Клітини культивують ще протягом деякого часу.

Клітини звичайно збирають шляхом центрифугування, руйнують фізичними або хімічними методами і (Ф, одержаний неочищений екстракт зберігають для подальшого очищення. ка Мікробні клітини, що використовуються для експресії білків, можуть бути зруйновані стандартними способами, включаючи проведення циклів заморожування-відтавання, обробку ультразвуком, механічну бо дизрупцію або використання агентів для лізису клітин. Ці методи добре відомі фахівцям.

Активація гена РАРАР

Даний винахід також відноситься до первинних, вторинних і іммобілізованих рекомбінантних клітин, одержаних за допомогою гомологічної рекомбінації з клітин хребетних, переважно, клітин ссавців, а особливо переважно, з клітин людини, які були сконструйовані для: а) вбудовування екзогенних (гетерологічних) 65 полінуклеотидів в ендогенну хромосомну ДНК потрібного гена, (Б) делетування ендогенних хромосомних ДНК, мМабо (с) заміни ендогенної хромосомної ДНК екзогенними полінуклеотидами. Інсерції, делеції і/або заміни полінуклеотидних послідовностей можуть бути здійснені в кодуючих послідовностях цільового гена і/або в регуляторних областях, таких як промоторні і енхансерні послідовності, функціонально асоційовані з цільовим геном.

Даний винахід також відноситься до способу одержання рекомбінантних клітин-хазяїв, продукованих за допомогою гомологічної рекомбінації іп мійго або іп омімо, де експресія цільового гена, аномально експресованого в даній клітині, є зміненою. Така зміна, переважно, приводить до експресії цільового гена в нормальних умовах зростання або в умовах, відповідних для продукування поліпептиду, що кодується цільовим геном. Цей спосіб включає стадії: (а) трансфекції клітини іп мйго або іп мімо полінуклеотидною конструкцією, /о яка містить (і) послідовність для доставки; (ії) регуляторну послідовність мМабо кодуючу послідовність; і (її) донорний сайт непарного сплайсингу, якщо необхідно, з продукуванням трансфікованої клітини; (Б) підтримки трансфікованої клітини іп міїго або іп мімо в умовах, відповідних для гомологічної рекомбінації.

Даний винахід також відноситься до способу зміни експресії цільового гена в клітині іп мійго або іп мімо, де вказаний ген аномально експресується, причому вказаний спосіб включає стадії: (а) трансфекції клітини іп /5 Уго або іп мімо полінуклеотидною конструкцією, яка містить (1) послідовність для доставки; (ії) регуляторну послідовність і/або кодуючу послідовність; і (ії) донорний сайт непарного сплайсингу, якщо це необхідно, з продукуванням трансфікованої клітини; (5) підтримку трансфікованої клітини іп мйго або іп мімо в умовах, відповідних для гомологічної рекомбінації, з продукуванням рекомбінантної клітини за допомогою гомологічної рекомбінації; і (с) підтримання вказаної рекомбінантної клітини іп мійго або іп мімо в умовах, відповідних для експресії даного гена.

Даний винахід також відноситься до способу одержання поліпептиду даного винаходу шляхом зміни експресії цільового ендогенного гена в клітинах-хазяїнах іп міго або іп мімо, де вказаний ген аномально експресується в даній клітині; причому вказаний спосіб включає стадії: (а) трансфекції клітини іп мйго або іп мімо полінуклеотидною конструкцією, яка містить (і) послідовність для доставки; (ії) регуляторну послідовність сч

Мабо кодуючу послідовність; і (ії) донорний сайт непарного сплайсингу, якщо необхідно, з продукуванням трансфікованої клітини; (5) підтримку трансфікованої клітини іп мійго або іп мімо в умовах, відповідних для і) гомологічної рекомбінації з продукуванням гомологічно рекомбінантної клітини; і (с) підтримання рекомбінантної клітини, продукованої за допомогою гомологічної рекомбінації іп мійго або іп мімо, в умовах, відповідних для експресії даного гена, з одержанням вказаного поліпептиду. с зо Даний винахід також відноситься до полінуклеотидої конструкції, яка змінює експресію цільового гена в клітині певного типу, в якій він аномально експресується. Це відбувається у випадку, коли дану со полінуклеотидну конструкцію вбудовують в хромосомну ДНК клітини-мішені, де вказана полінуклеотидна ю конструкція містить (а) послідовність для доставки; (Б) регуляторну послідовність і/або кодуючу послідовність; і (с) донорний сайт непарного сплайсингу, якщо це необхідно. Крім того, даний винахід включає (22) з5 полінуклеотидну конструкцію, описану вище, де вказана конструкція, крім того, містить полінуклеотид, який ча кодує поліпептид і знаходиться в тій же самій рамці зчитування з цільовим ендогенним геном після здійснення гомологічної рекомбінації в хромосомної ДНК.

Ці композиції можуть бути продуковані, а вказані методи можуть бути здійснені, як (описано в патентах США

МоМо 6054288; 6048729; 6048724; 6048524; 5994127; 5968502; 5965125; 5869239; 5817789; 5783385; 5733761; « 5641670; 5580734; в Міжнародних публікаціях МоМо УМО 96/29411, УУО 94/12650; і в наукових статтях, включаючи шщ с 1994; КоПег еї аїЇ., Ргос. Май. Асад. Зсі. БА 86:8932-8935 (1989) (описи яких у всій своїй повноті вводяться в дану заявку за допомогою посилання))|. ;» Трансгенні тварини

Терміни "трансгенні тварини" або "тварини-хазяї", що використовуються тут, означають тварин, що мають

Геном, який був генетично або штучно модифікований, так, щоб він включав одну з нуклеїнових кислот даного -І винаходу. Переважними тваринами є ссавці, але не людина, що належать до роду, вибраного з Миз (наприклад, миші), Кайиз (наприклад, щури), і Огусіодаіїз (наприклад, кролики), що мають геном, який був штучно або ік генетично модифікований шляхом вбудовування в нього нуклеїнової кислоти даного винаходу. В одному зі своїх с переважних варіантів даний винахід відноситься до ссавців-хазяїв, що не є людиною і до інших тварин, що 5ор Містять рекомбінантний вектор даного винаходу або ген РАРАР, зруйнований за допомогою гомологічної со рекомбінації з "нокаут"-вектором.

Із У багатьох клітинах всіх вказаних трансгенних тварин є клонована рекомбінантна або синтетична

ДНК-послідовність, а більш конкретно, одна з очищених або виділених нуклеїнових кислот, що містять

РАРАР-кодуючу послідовність, регуляторну послідовність РАРАР, полінуклеотидну конструкцію або

ДНК-послідовність, що кодує антисмисловий поліпептид, такий як поліпептид, описаний в даній заявці.

В основному, трансгенна тварина даного винаходу містить будь-який один з полінуклеотидів, рекомбінантних (Ф) векторів і клітин-хазяїв, описаних в даному винаході. Більш конкретно, трансгенні тварини даного винаходу ка можуть містити будь-який з полінуклеотидів, описаних в розділах "Геномні послідовності гена РАРАР", "КДНК-послідовності РАРАР", "Кодуючі області", "Полінуклеотидні конструкції" і "Олігонуклеотидні зонди і во праймери", "Рекомбінантні вектори" і "Клітини-хазяї".

У першому переважному варіанті здійснення винаходу вказані трансгенні тварини можуть служити хорошими експериментальними моделями для дослідження різних патологій, асоційованих з диференціюванням клітини, а зокрема, даний винахід відноситься до трансгенних тварин, в геном яких були вбудовані одна або декілька копій полінуклеотиду, що кодує нативний білок РАРАР, або альтернативно, білок мутант РАРАР. 65 У другому переважному варіанті здійснення винаходу вказані трансгенні тварини можуть експресувати потрібний полінуклеотид під контролем регуляторних полінуклеотидів гена РАРАР, що приводить до хорошого виходу при синтезі потрібного білка, а фактично до тканеспецифічної експресії білка, що представляє інтерес.

Конструювання трансгенних тварин даного винаходу може бути здійснене стандартними методами, добре відомими фахівцям. Більш докладний опис продукування трансгенних тварин, а зокрема, трансгенних мишей, можна знайти в патентах США: Мо4873191, виданому 10 жовтня 1989; Мо5464764, виданому 7 листопада 1995; і

Мо5789215, виданому 4 серпня 1998 року; де вказані документи для опису методів продукування трансгенних мишей вводяться в дану заявку за допомогою посилання.

Трансгенні тварини даного винаходу були продуковані відповідно до процедур, внаслідок яких була одержана тварина з геномом, що має включений в нього екзогенний генетичний матеріал. Вказана процедура 70 передбачає одержання генетичного матеріалу або його частини, яка містить або кодуючу послідовність РАРАР, або регуляторний полінуклеотид РАРАР, або ДНК-послідовність, що кодує антисмисловий полінуклеотид

РАРАР, наприклад, полінуклеотид, описаний в даній заявці.

Рекомбінантний полінуклеотид даного винаходу вбудовують в ембріональну клітинну лінію або в лінію ембріональних стовбурових (ЕС) клітин. Вбудовування, переважно, здійснюють шляхом електропорації, /5 наприклад, як описано Тпотаз еї аї. (1987). Клітини, що піддаються електропорації, скринують (наприклад, шляхом відбору за допомогою селективних маркерів, або за допомогою ПЛР або Саузерн-блот-аналізу) на позитивні клітини, які мають в своєму геномі інтегрований екзогенний рекомбінантний полінуклеотид, продукований, переважно, внаслідок подій гомологічної рекомбінації. Ілюстративним прикладом процедури позитивного-негативного відбору, яка може бути використана відповідно до даного винаходу, є процедура, описана Мапзгоиг еї а). (1988).

Потім позитивні клітини виділяють, клонують і ін'єкують в 3,5-денні бластоцисти мишей, як описано Вгадієу (1987). Після цього бластоцисти вводять самицям тварин-хазяїв і залишають на деякий час для зростання.

Альтернативно, позитивні ЕС-клітини піддають контакту з 2,5-денними ембріонами на 8-16-клітинній стадії (морули), як описано Ууоой еї аЇ. (1993) або Маду еї аІ. (1993), причому ці ЕС-клітини інтерналізують для сч ов утворення обширних колоній бластоцистів, включаючи клітини, які продукують зародкову клітинну лінію.

Потомство самиці тварини-хазяїна тестують для того, щоб визначити, які тварини є трансгенними, тобто, і) мають вбудовану екзогенну ДНК-послідовність, а які тварини є тваринними дикого типу.

Таким чином, даний винахід відноситься до трансгенної тварини, що містить нуклеїнову кислоту, рекомбінантний експресуючий вектор або рекомбінантну клітину-хазяїна даного винаходу. с зо Рекомбінантні клітинні лінії, що походять від трансгенних тварин даного винаходу

Іншим об'єктом даного винаходу є рекомбінантні клітини-хазяї, одержані від описаних тут трансгенних со тварин. В одному з варіантів свого здійснення даний винахід охоплює клітини, одержані від ссавців-хазяїв, що ю не відносяться до людини, і тварин, що містять рекомбінантний вектор даного винаходу або ген РАРАР, підданий дизрупції внаслідок гомологічної рекомбінації з "нокаут"-вектором. ме)

Рекомбінантні клітинні лінії можуть бути продуковані іп міго з клітин, одержаних з будь-якої тканини ї- трансгенної тварини відповідно до даного винаходу, наприклад, шляхом трансфекції первинних клітинних культур векторами, експресуючими онкогени, такі як великий Т-антиген 5М40, як описано Спои (1989) і Зпау еї аІ. (1991).

Аналізи на ідентифікацію сполук для лікування шизофренії і біполярного порушення «

Даний винахід відноситься до аналізів, які можуть бути використані для тестування сполук на їх здатність з с до лікування порушень ЦНС, а зокрема, до ослаблення симптомів порушень ЦНС, опосередкованих РАРАР. У переважних варіантах свого здійснення, даний винахід відноситься до сполук, що тестуються на їх здатність ;» ослабляти симптоми шизофренії або біполярного порушення, опосередкованих РАРАР.

Такі сполуки можуть бути також протестовані на їх здатність до лікування споріднених порушень, включаючи, психотичні порушення, порушення настрою, аутизм, зловживання речовинами, що викликають залежність, і -І алкоголізм, затримку розумового розвитку і інші психічні захворювання, включаючи порушення пізнавальної здатності, тривожні стани, порушення, пов'язане з прийомом їжі, імпульсивність, що не контролюється, і се) порушення особистості, визначені відповідно до "Керівництва з діагностики і статистики психічних порушень, с четверте видання, класифікація (О5М-ІМ)".

Даний винахід також відноситься до клітин і тварин, включаючи приматів і гризунів, до моделей шизофренії со і біполярного порушення і споріднених порушень.

Ге В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до неклітинних аналізів, або до аналізів, що проводяться з використанням клітин і тварин, для ідентифікації таких сполук, які впливають на активність

РАРАР. Активність РАРАР може бути піддана зміні під дією будь-якого механізму; а в деяких варіантах здійснення винаходу активність РАРАР може бути змінена шляхом модуляції рівня експресії гена РАРАР або активності генного продукту РАРАР. (Ф) В одному з своїх аспектів даний винахід відноситься до неклітинних аналізів, або до аналізів, що ка проводяться з використанням клітин і тварин, для ідентифікації сполук, які впливають на активність 934872.

Активність 934872 може бути змінена шляхом модуляції рівня експресії гена РАРАР або активності генного бо продукту РАРАР. Переважно, аналізи для ідентифікації сполук, що впливають на активність 934872, дозволяють детектувати взаємодію поліпептидів РАРАР і 934872, або детектувати комплекси РАРАР-934872.

Способи даного винаходу дозволяють ідентифікувати сполуки, які безпосередньо або опосередковано впливають на активність РАРАР або 934872. Аналізи даного винаходу, що проводяться без використання клітин або з використанням клітин і тварин, можуть застосовуватися для ідентифікації сполук, які впливають на 65 елемент шляху РАРАР, а не на сам РАРАР. Потім ці сполуки можуть бути використані як терапевтичний засіб для модуляції РАРАР і інших генних продуктів, асоційованих з шизофренією, з біполярним порушенням і з спорідненими порушеннями.

Клітинні і неклітинні аналізи

В одному аспекті клітинні аналізи, що проводяться з використанням рекомбінантних або нерекомбінантних клітин, можуть застосовуватися для ідентифікації сполук, що модулюють активність РАРАР.

В одному аспекті винаходу клітинний аналіз даного винаходу відноситься до способу ідентифікації сполуки, що тестується, для лікування шизофренії, біполярного порушення або спорідненого порушення ЦНС, що передбачає (а) обробку клітин сполукою, що тестується, при концентрації і протягом часу, достатніх для ослаблення наявного стану на даний момент, асоційованого з шизофренією, біполярним порушенням або 7/0 бпорідненим порушенням ЦНС, і (Б) визначення рівня активності РАРАР або взаємодії РАРАР-934872 або їх комплексів в клітині. Активність РАРАР може бути виміряна, наприклад, шляхом аналізу клітини на рівень

МРНК-транскриптів, рівень експресії пептиду РАРАР, локалізацію або активність білка. Переважною сполукою, що тестується, є сполука, здатна або приблизно здатна ослабляти симптом шизофренії, біполярного порушення або спорідненого порушення. Сполуки, що тестуються, здатні модулювати активність РАРАР, можуть бути відібрані для використання при розробці лікарських засобів. Такі клітинні аналізи детально описані в розділі, озаглавленому "Спосіб скринінгу лігандів, що модулює експресію гена РАРАР".

В іншому аспекті здійснення клітинного аналізу даний винахід включає спосіб ідентифікації сполуки для лікування шизофренії або біполярного порушення, що передбачає (а) обробку клітин, що мають РАРАР з рівнем активності, достатнім для стимуляції відповідного стану, асоційованого з шизофренією або біполярним порушенням, і (Б) обробку вказаної клітини сполукою, що тестується. Потім сполука, що тестується, може бути відібрана на її здатність ослабляти вказаний наявний стан на даний момент, асоційований з шизофренією або біполярним порушенням. Активність РАРАР може бути індукована будь-яким відповідним методом, включаючи, але не обмежуючись ними, одержання вектора, що містить нуклеотидну послідовність РАРАР, обробку вказаної клітини сполукою, здатною підвищувати рівень експресії РАРАР, і обробку вказаної клітини пептидом РАРАР. сч Переважною сполукою, що тестується, є сполука, здатна або приблизно здатна ослабляти симптом шизофренії, біполярного порушення або спорідненого порушення; і, альтернативно, сполука, яка, як передбачається, і) посилює наявний стан, асоційований з шизофренією, біполярним порушенням або спорідненим порушенням.

Сполука, що тестується, здатна ослабляти будь-який детектований симптом або наявний стан, асоційований з шизофренією, біполярним порушенням або спорідненим порушенням, може бути відібрана для розробки с зо лікарських засобів. Відповідні клітинні лінії можуть бути визначені будь-яким фахівцем; при цьому, переважно, використати клітинні лінії, що походять з нервової системи. со

В іншому варіанті даний винахід відноситься до клітинних і до неклітинних аналізів РАРАР, що проводяться ю для детекції скріплення пептидів РАРАР з клітинною поверхнею, і для ідентифікації сполук, які можуть бути використані для лікування шизофренії, біполярного порушення або споріднених порушень, і які взаємодіють з ме) зв рецептором РАРАР. В одному з таких варіантів полінуклеотид РАРАР або його фрагменти клонують в ї- експресуючі вектори, наприклад, у вектори, описані в даній заявці. Білки фракціонують за розміром, зарядом і очищають за допомогою імунохроматографії або іншими методами, відомими фахівцям. Після очищення білки мітять методами, відомими фахівцям. Мічені білки інкубують з клітинами або з клітинними лініями, що походять від різних органів або тканин, внаслідок чого ці білки зв'язуються з будь-яким рецептором, присутнім на « клітинній поверхні. Після інкубування клітини промивають для видалення неспецифічно пов'язаного білка. Мічені з с білки детектують за допомогою авторадіографії. Альтернативно, немічені білки можуть бути інкубовані з

Й клітинами і детектовані з використанням антитіл, що мають детектовану мітку, таку як приєднана до них и?» флуоресцентна молекула. Специфічність скріплення з клітинною поверхнею може бути проаналізована шляхом проведення конкурентного аналізу, в якому різні кількості неміченого білка інкубують з міченим білком.

Кількість міченого білка, пов'язаного з клітинною поверхнею, знижується у міру збільшення кількості -І конкурентного неміченого білка. Як контроль, в деякі реакції скріплення включають різні кількості неміченого білка, не спорідненого міченому білку. Кількість міченого білка, пов'язаного з клітинною поверхнею, не ік знижується в реакціях скріплення, що містять підвищені кількості неспорідненого неміченого білка, що вказує с на те, що білок, що кодується нуклеїновою кислотою, специфічно зв'язується з клітинною поверхнею. Один з 5р прикладів такого аналізу описаний нижче в прикладі 1. В одному аспекті даного винаходу скріплення з РАРАР со може бути використане для детекції і визначення локалізації поліпептиду 934872.

Ге В іншому варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до неклітинних аналізів на скріплення, де поліпептид РАРАР одержують і очищають так само, як і у вищеописаних клітинних аналізах на скріплення. Після очищення білки мітять і інкубують з екстрактом клітинних мембран або з ізолятом, що походить від будь-яких потрібних клітин, взятих з будь-яких органів, що представляють інтерес, тканин або їх комбінацій, внаслідок чого поліпептид РАРАР зв'язується з будь-яким рецептором, присутнім на мембрані. Після інкубування ці

Ф) мембрани промивають для видалення неспецифічно пов'язаного білка. Мічені білки детектують за допомогою ка авторадіографії. Специфічність скріплення РАРАР з мембраною може бути проаналізована шляхом проведення конкурентного аналізу, в якому різні кількості сполуки, що тестується, інкубують з міченим білком. Будь-які бо потрібні сполуки, що тестується, включаючи поліпептиди, що тестуються, можуть бути інкубовані з клітинами.

Сполуки, що тестуються, можуть бути детектовані з використанням антитіл, що мають детектовану мітку, таку, як приєднана до них флуоресцентна молекула. Кількість міченого поліпептиду РАРАР, пов'язаного з клітинною поверхнею, знижується у міру збільшення кількості конкурентної сполуки, що тестується. Як контроль, в деякі реакції скріплення включають різні кількості неміченого білка або сполуки, не спорідненої із сполукою, що б5 тестується. Сполуки, що тестуються, здатні знижувати кількість РАРАР, пов'язаного з клітинними мембранами, можуть бути відібрані як терапевтична сполука-кандидат. В одному аспекті винаходу скріплення з РАРАР може бути використане для детекції поліпептиду 4934872.

У переважних варіантах клітинних і неклітинних аналізів вказаний пептид РАРАР включає безперервну ділянку, що охоплює, принаймні, 4, 6 або 8 суміжних амінокислот послідовності ЗЕО ІЮ МО:2.

Клітинні аналізи можуть передбачати використання клітин з будь-якого відповідного джерела, при цьому особливо переважними клітинами є клітини людини, клітини приматів, клітини приматів, що не відноситься до людини, і мишачі клітини.

Аналіз з використанням тварин як моделі

Аналізи, основані на тваринах, що не є людиною, можуть бути також використані для ідентифікації сполук, 70 які модулюють активність РАРАР, для дослідження РАРАР, а також для дослідження 934872 і біологічного шляху 934872. Даний винахід відноситься до тварин, що використовуються як моделі, і до відповідних аналізів, основаних на використанні цих тварин, таких як нетрансгеннні або трансгенні тварини, включаючи тварин, що не мають ген РАРАР, або експресуючих генів РАРАР в залежності від зовнішніх умов, або що мають людський або модифікований ген РАРАР.

Таким чином, даний винахід відноситься до обробки тварин, що мають шизофренію і біполярне порушення або їх симптоми, сполукою, що тестується, здатною прямо або опосередковано модулювати активність РАРАР.

В одному аспекті винаходу аналіз, що проводиться з використанням тварин, включає здійснення способу ідентифікації сполуки, що тестується, для лікування шизофренії або біполярного порушення, що передбачає (а) обробку тварини сполукою, що тестується, при концентрації і протягом часу, достатніх для ослаблення наявного 2о стану на даний момент, асоційованого з шизофренією або з біполярним порушенням, і (5) визначення рівня активності РАРАР або взаємодії РАРАР-934872 або їх комплексів в певній ділянці організму тварини. Активність

РАРАР може бути виміряна, наприклад, за допомогою аналізу будь-якої відповідної клітини, тканини або ділянки організму. Переважною сполукою, що тестується, є сполука, здатна або приблизно здатна ослабляти симптом шизофренії, біполярного порушення або спорідненого порушення. Необов'язково, вказана сполука, що сч об тестується, здатна або приблизно здатна модулювати активність РАРАР. Сполуки, що тестуються, здатні модулювати активність РАРАР, можуть бути відібрані для використання при розробці лікарських засобів. Деякі і) приклади сполук, що тестуються, приводяться в даному описі (наприклад, бензодіазепіни, селективні інгібітори поглинання серотоніну і т.п.).

В іншому аспекті винаходу аналіз, що проводиться з використанням тварин, включає здійснення способу с зо ідентифікації сполуки для лікування шизофренії або біполярного порушення, що передбачає (а) обробку тварини пептидом РАРАР з рівнем активності, достатнім для стимуляції симптомів або відповідного стану, асоційованого со з шизофренією або біполярним порушенням, і (5) обробку вказаної клітини сполукою, що тестується. Потім ю сполука, що тестується, може бути відібрана на її здатність ослабляти вказані стани, асоційовані з шизофренією або біполярним порушенням. Активність РАРАР може бути індукована будь-яким відповідним ме)

Зз5 Методом, включаючи, але не обмежуючись ними, одержання вектора, що містить нуклеотидну послідовність ча

РАРАР, обробку вказаної клітини сполукою, здатною підвищувати рівень експресії РАРАР, і обробку вказаної клітини пептидом РАРАР. Переважно, вказану тварину обробляють пептидом РАРАР, що містить безперервну ділянку, що охоплює, принаймні, 4, б або 8 суміжних амінокислот ЗЕО ІЮ МО:2. Переважною сполукою, що тестується, є сполука, здатна або приблизно здатна ослабляти симптом шизофренії, біполярного порушення або « спорідненого порушення; і, альтернативно, сполука, яка, як передбачається, посилює симптом шизофренії, в с біполярного порушення або спорідненого порушення. Сполукай, що тестується, здатна ослабляти будь-який детектований симптом або наявний стан, асоційований з шизофренією, біполярним порушенням або ;» спорідненим порушенням, може бути відібрана для її використання в розробці лікарських засобів.

В одному варіанті здійснення винаходу мишу обробляють пептидом РАРАР, піддають контакту із сполукою, що тестується, після чого оцінюють на симптоми, характерні для шизофренії, біполярного порушення або -І спорідненого порушення, шляхом спостереження за стереотипією. В інших варіантах здійснення винаходу вказані симптоми оцінюють шляхом проведення, принаймні, одного тесту, вибраного з групи, що включає ік спостереження за твариною, що знаходиться в клітці її мешкання, неврологічну оцінку; тести на індуковану с стресом гіпотермію, примусове плавання, РТ2-припадок, і на рухому активність; тест шляхом підвішування за 5ор Хвіст; спостереження в лабіринті Плюс; тести на розпізнавання нових об'єктів, на препульсивне гальмування, і со на больове відчуття, що викликається тепловим подразником; тест з використанням У-лабіринту і тест з

Ге використанням метаболічної камери (тести Рзуспозсгееп тм від Рвзусподепісв Іпс.). Опис інших тестів можна знайти, наприклад, у Стам/Іеу еї аї., Ногт. Вепам. 31(3): 197-211 (1997); Стамеу, Вгаїп Кез. 835(1). -18-26 (1999).

У способах скринінгу даного винаходу може бути використана будь-яка відповідна сполука, що тестується.

Прикладами сполук, які можуть бути скриновані в способах даного винаходу, є невеликі органічні або неорганічні молекули, нуклеїнові кислоти, включаючи полінуклеотиди з рандомізованих і направлених іФ) полінуклеотидних бібліотек, пептиди, включаючи пептиди, що кодуються рандомізованими і направленими ко пептидними бібліотеками, розчинні пептиди, гібридні пептиди і фосфопептиди, антитіла, включаючи поліклональні, моноклональні, химерні, гуманізовані і антиідіотипічні антитіла, одноланцюгові антитіла, бо фрагменти Раб, К(аб)» і експресійну бібліотеку РГар-фрагментів, і їх епітопзв'язувальні фрагменти. У деяких аспектах даного винаходу сполукою, здатною поліпшувати або посилювати симптом або наявні стани шизофренії, біполярного порушення або спорідненого порушення, може бути, наприклад, антипсихотичні лікарські засоби загальної дії, нейролептики, атипічні нейролептики, антидепресанти, седативні лікарські засоби, норадренергічні агоністи і антагоністи загальної дії, допамінергічні агоністи і антагоністи, б5 інгібітори поглинання серотоніну, бензодіазепіни.

У цих аналізах, сполука, що тестується, може бути введена (наприклад, і.м., і.р., ї.т., перорально або яким-небудь іншим способом) тварині, наприклад, в різних дозах. Дію даної сполуки на експресію РАРАР визначають шляхом порівняння рівнів РАРАР, наприклад, в кровотоці або у вибраній тканині, за допомогою

Нозерн-блот-аналізу, імуноаналізу, ПЛР і т.п., як описано вище. При цьому може бути використана будь-яка

Відповідна тварина. Переважною твариною є примат, примат, що не є людиною, ссавець або миша. Як тварина, що тестується, можуть бути також використані гуманізовані миші, тобто миші, у яких ендогенний мишачий білок був видалений ("нокаут"), а замість цього був доданий гомологічний людський білок із застосуванням стандартної техніки одержання трансгенних тварин. У такої миші буде експресуватись тільки людська форма білка. Гуманізована миша, що експресує тільки людський РАРАР, може бути використана для дослідження іп 70 мімо-реакцій, симптоматичних для порушень ЦНС, які будуть продукуватися у відповідь на потенційні агенти, регулюючі рівні білка РАРАР або мРНК, або рівні взаємодії РАРАР-934872 або їх комплексів. Як приклад можуть служити трансгенні миші, що несуть ген людського ароє4. Потім цих мишей схрещують з мишачою лінією, у якої відсутній ендогенний ароєЄ, внаслідок чого одержують тварину-модель, що несе людські білки, які, очевидно, можуть служити моделлю для розвитку хвороби Альцгеймера. Такі трансгенні тварини можуть бути використані /5 для окремого аналізу біохімічних і фізіологічних стадій захворювання, і для розробки способу терапії захворювання (робота Іогіпд еї аїЇ., Меийгобіої. Адіпуд 17:173 (1996), яка у всій своїй повноті вводиться в даний опис за допомогою посилання).

Методи скринінгу речовин, взаємодіючих з поліпептидом РАРАР

Відповідно до даного винаходу, "ліганд" означає молекулу, таку як білок, пептид, антитіло або будь-яку

Хімічно синтезовану сполуку, здатну зв'язуватися з білком РАРАР або з одним з його фрагментів або варіантів, або модулювати експресію полінуклеотиду, що кодує РАРАР, його фрагмент або варіант.

У способі скринінгу лігандів даного винаходу біологічний зразок або певну молекулу, що тестується, яка, приблизно, є лігандом білка РАРАР, піддають контакту з відповідним очищеним білком РАРАР, наприклад, з відповідним очищеним рекомбінантним білюм РАРАР, продукованим рекомбінантними клітинами-хазяїнами, сч ов описаними вище, з метою утворення комплексу між цим білком і передбачуваною молекулою-лігандом, що о тестується.

Як ілюстративний приклад, для дослідження взаємодії білка РАРАР або його фрагмента, що містить безперервну ділянку, що складається, принаймні, з 6 амінокислот, переважно, принаймні, з 8-10 амінокислот, а більш переважно, принаймні, з 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІЮО МО:2, з лікарськими с зо засобами або невеликими молекулами, такими як молекули, генеровані методом комбінаторного хімічного синтезу, проводять мікродіаліз в поєднанні з ВЕРХ, як описано УУапа еї а/І.(1997) або афінний капілярний со електрофорез, описаний Вигнп еї а/.(1997), і ці описи вводяться в дану заявку за допомогою посилання. ю

В інших способах пептиди, лікарські засоби, жирні кислоти, ліпопротеїни або невеликі молекули, які взаємодіють з білюм РАРАР або з його фрагментом, що містить безперервну ділянку, що складається, ме) принаймні, з 6 амінокислот, переважно, принаймні, з 8-10 амінокислот, а більш переважно, принаймні, 12, 15, ї- 20,25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІЮ МО:2, можуть бути ідентифіковані з використанням аналізу, описаного нижче. Молекулу, що тестується на скріплення, мітять детектованою міткою, такою як флуоресцентна, радіоактивна або ферментативна мітка, і піддають контакту з іммобілізованим білюм РАРАР, або з його фрагментом в умовах, які сприяють специфічному скріпленню. Після видалення неспецифічно пов'язаних « молекул, пов'язані молекули детектують з використанням відповідних засобів. з с Іншою метою даного винаходу є розробка способів скринінгу речовин-кандидатів, які взаємодіють з поліпептидом РАРАР. з Даний винахід відноситься до способів скринінгу речовин-кандидатів, які взаємодіють з поліпептидом РАРАР або його фрагментом або варіантом. Відповідно до своєї здатності ковалентно або нековалентно зв'язуватися з білком РАРАР або його фрагментом або варіантом, ці речовини або молекули можуть бути переважно -І використані як іп мігго, так і іп мімо.

Іп міїго, вказані взаємодіючі молекули можуть бути використані як детектуючі засоби для ідентифікації ік присутності білка РАРАР в зразку, переважно, в біологічному зразку. с Спосіб скринінгу речовин-кандидатів включає наступні стадії: а) одержання поліпептиду, що містить, або в основному складається або складається з білка РАРАР або його со фрагмента, що містить безперервну ділянку, принаймні, з б амінокислот, переважно, принаймні, з 8-10

Ге амінокислот, а більш переважно, принаймні, з 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІЮ МО:2;

Б) одержання речовини-кандидата; с) контактування вказаного поліпептиду з вказаною речовиною-кандидатом; а) детекції комплексів, утворених між вказаним поліпептидом і вказаною речовиною-кандидатом.

В одному з своїх варіантів даний винахід відноситься до використання РАРАР для дослідження шляху

Ф) 934872 при порушеннях ЦНС. Способи скринінгу на взаємодію речовин можуть бути використані для детекції ка взаємодії РАРАР і д34872. Таким чином, цей спосіб даного винаходу також передбачає: а) одержання поліпептиду, що містить, або в основному складається або складається з білка або його бо фрагмента, що містить безперервну ділянку, принаймні, з б амінокислот, переважно, принаймні, з 8-10 амінокислот, а більш переважно, принаймні, з 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІЮ МО:2;

В) одержання поліпептиду 934872; с) контактування вказаного поліпептиду РАРАР з вказаним поліпептидом 934872; а) детекцію комплексів, утворених між вказаним поліпептидом РАРАР і вказаним поліпептидом 934872. 65 Переважно, вказаний поліпептид 934872 містить, принаймні, 4, 6 або, переважно, 8 суміжних амінокислот в амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:5.

Даний винахід відноситься до набору для скринінгу речовини-кандидата, що взаємодіє з поліпептидом

РАРАР, де вказаний набір містить: а) білок РАРАР, що має амінокислотну послідовність, вибрану з групи, що складається з амінокислотних послідовностей ЗЕ ІЮО МО:2 або пептидного фрагмента, що містить безперервну ділянку, принаймні, з 6 амінокислот, переважно, принаймні, з 8-10 амінокислот, а більш переважно, принаймні, з 12, 15, 20,25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІЮ МО:2;

Б) необов'язково, засіб, що використовується для детекції комплексу, утвореного вказаним білком РАРАР, його пептидним фрагментом або варіантом з вказаною речовиною-кандидатом. 70 У переважному варіанті набору, описаного вище, засіб для детекції включає моноклональні або поліклональні антитіла, направлені проти білка РАРАР або його пептидного фрагмента або варіанту.

Різні речовини або молекули-кандидати можуть бути проаналізовані на взаємодію з поліпептидом РАРАР.

Такими речовинами або молекулами є, але не обмежуються ними, природні або синтетичні органічні сполуки або молекули біологічного походження, такі як поліпептиди. Якщо речовина або молекула-кандидат містить /5 Поліпептид, то цей поліпептид може бути продуктом експресії фагового клону, що належить до рандомізованої пептидної фагової бібліотекию, або альтернативно, цей поліпептид може бути продуктом експресії

КДНК-бібліотеки, клонованої у вектор, придатний для здійснення скринінг-аналізу на двокомпонентний гібрид.

Даний винахід також відноситься до набору, що використовується для здійснення способу скринінгу, описаного вище. Такі набори містять, переважно, поліпептид РАРАР або його фрагмент або варіант, і необов'язково, засіб, що використовується для детекції комплексу, утвореного між вказаним поліпептидом

РАРАР і вказаною речовиною-кандидатом. У переважному варіанті вказаний засіб для детекції включає моноклональні або поліклональні антитіла, направлені проти поліпептиду білка РАРАР або його фрагмента або варіанту.

А. Ліганди-кандидати, одержані з рандомізованої бібліотеки пептидів сч

У конкретному варіанті здійснення способу скринінгу передбачуваним лігандом є продукт експресії

КДНК-вставки у фаговому векторі (Рагптіеу 5 тій, 1988). Більш конкретно, використовуються фагові і) рандомізовані бібліотеки пептидів. Рандомізовані ДНК-вставки кодують пептиди довжиною від 8 до 20 амінокислот (ОІдепригд К.К. еї аїЇ.,, 1992; Маіїадоп Р. еї аї.,, 1996; Ісав А.Н. 1994; МУУевіегіпк М.А.3., 1995;

Ееїїсі Р. еї аІ.,, 1991). Відповідно до цього конкретного варіанту одержують рекомбінантні фаги, експресуючі с білок, який зв'язується з іммобілізованим білком РАРАР і утримує його; а потім комплекс, утворений між білком

РАРАР і рекомбінантним фагом, може бути підданий імунопреципітації з використанням поліклонального або со моноклонального антитіла, направленого проти білка РАРАР. ю

Після конструювання бібліотеки лігандів в рекомбінантних фагах, фагову популяцію піддають контактуванню з іммобілізованим білком РАРАР. Потім препарат комплексів промивають для видалення неспецифічно ме) пов'язаних рекомбінантних фагів. Фаги, які специфічно зв'язуються з білком РАРАР, потім елююють буфером (з ї- кислотним рН) або піддають імунопреципітації з використанням моноклонального антитіла, продукованого гібридомою проти РАРАР, і цю фагову популяцію потім ампліфікують за допомогою понадінфікування бактеріями (наприклад, Е.соїї). Стадію відбору можна повторювати декілька разів, переважно, 2-4 рази, з метою відбору більш специфічних рекомбінантних фагових клонів. Останньою стадією є характеризація пептиду, продукованого « відібраними рекомбінантними фаговими клонами або шляхом експресії в інфікованій бактерії, і виділення і з с експресії фагової вставки в іншій системі "вектор-хазяїн", або шляхом секвенування вставки, що міститься у відібраних рекомбінантних фагах. ;» В. Ліганди-кандидати, одержані в експериментах на конкурентне скріплення Альтернативно, пептиди, лікарські засоби або невеликі молекули, які зв'язуються з білююм РАРАР або з його фрагментом, що містить безперервну ділянку, принаймні, з 6 амінокислот, переважно, принаймні, з 8-10 амінокислот, а більш переважно, -І принаймні, з 12, 15, 20, 25, 30 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІЮ МО:2, можуть бути ідентифіковані в експериментах на конкурентне скріплення. ік У таких аналізах білок РАРАР або його фрагмент іммобілізують на поверхні, такій як пластиковий планшет. с Потім вказаний іммобілізований білок РАРАР або його фрагмент піддають контактуванню із зростаючими 5ор Кількостями пептидів, лікарських засобів або невеликих молекул в присутності відомого детектованого міченого бо ліганду для білка РАРАР. Так, наприклад, РАРАР-ліганд може бути детектовано помічений флуоресцентною,

Ге радіоактивною або ферментативною міткою. Здатність молекули, що тестується, зв'язуватися з білюм РАРАР або з його фрагментом визначають шляхом вимірювання кількості відомого детектовано міченого пов'язаного ліганду в присутності молекули, що тестується. Зниження кількості відомого ліганду, пов'язаного з білком бв РАРАР або його фрагментом, у разі присутності молекули, що тестується, вказує на те, що ця молекула, що тестується, здатна зв'язуватися з білком РАРАР або з його фрагментом. (Ф) С. Ліганди-кандидати, одержані за допомогою афінної хроматографії ка Білки або інші молекули, що взаємодіють з білюм РАРАР або його фрагментом, що містить безперервну ділянку, принаймні, з 6 амінокислот, переважно, принаймні, з 8-10 амінокислот, а більш переважно, принаймні, во З 12, 15, 20,25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІЮ МО:2, можуть бути також детектовані з використанням афінних колонок, що містять білок РАРАР або його фрагмент. Білок РАРАР або його фрагмент може бути пов'язаний з колонкою з використанням стандартної техніки, включаючи хімічне скріплення з відповідним носієм на колонці, таким як агароза, Айі СеїФ, або інші носії, які звичайно використовуються фахівцями. У деяких варіантах здійснення цього методу афінна колонка містить химерні білки, в яких білок РАРАР або його фрагмент б5 утворює гібрид з глутатіон-з-трансферазою (051). На вказану афінну колонку наносять суміш клітинних білків або пул експресованих білків, описаних вище. Потім, білки або інші молекули, що взаємодіють з білюм РАРАР або його фрагментом і пов'язані з колонкою, можуть бути виділені і проаналізовані шляхом електрофорезу на двомірному гелі, як описано в роботі Катипзеп еї аіЇ. (1997), яка вводиться в даний опис за допомогою посилання. Альтернативно, білки, що втримуються на афінній колонці, можуть бути очищені за допомогою електрофорезу і секвеновані. Той же самий метод може бути використаний з метою виділення антитіл для здійснення скринінгу продуктів фагового представлення або для скринінгу людських антитіл фагового представлення. р. Ліганди-кандидати, одержані з використанням оптичних біосенсорів

Білки, що взаємодіють з білком РАРАР або з його фрагментом, що містить безперервну ділянку, принаймні, з 70 6 амінокислот, переважно, принаймні, з 8-10 амінокислот, а більш переважно, принаймні, з 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот ЗЕО ІО МО:2, можуть бути також скриновані з використанням оптичного біосенсора, як описано в роботі Едмжагаз 45 І еаіїпеграгтом/ (1997), а також в роботі Зпао еї а). (1995), опис яких вводиться в дану заявку за допомогою посилання. Ці методи дозволяють здійснювати детекцію взаємодій між молекулами в режимі реального часу і не вимагають використання мічених молекул. Цей метод заснований на 7/5 явищі поверхневого плазмонного резонансу (ППР). Коротко, лігандну молекулу-кандидата, що тестується, зв'язують з поверхнею (такою як карбоксиметилдекстранова матриця). Промінь світла прямує на ту сторону поверхні, яка не містить зразка, що тестується, і відбивається вказаною поверхнею. Явище ППР спричиняє зміну інтенсивності відображеного світла в залежності від кута і довжини хвилі падаючого світла. Скріплення лігандних молекул-кандидатів приводить до зміни показника заломлення на поверхні, і ця зміна детектується як зміна сигналу ППР. Для скринінгу лігандних молекул- або речовин-кандидатів, які здатні взаємодіяти з білком

РАРАР або з його фрагментом, білок РАРАР або його фрагмент іммобілізують на поверхні. Ця поверхня на одній своїй стороні має комірку, Через яку проходить молекула-кандидат, що досліджується. Скріплення молекули-кандидата з білюм РАРАР або з його фрагментом детектують як зміну ППР-сигналу.

Молекулами-кандидатами, що тестуються, можуть бути білки, пептиди, вуглеводи, ліпіди або невеликі молекули, с об Генеровані методами комбінаторної хімії. Ці методи можуть бути також здійснені шляхом іммобілізації еукаріотичних або прокаріотичних клітин або ліпідних везикул, що містять на своїй поверхні ендогенний або і) рекомбінантно експресований білок РАРАР.

Головна перевага цього методу полягає в тому, що він дозволяє визначати швидкість асоціації між білком

РАРАР і молекулами, що взаємодіють з цим білююм РАРАР. Тому він дає можливість специфічно відбирати с зо лігандні молекули, що взаємодіють з білюм РАРАР або з його фрагментом, за константами сильної або, навпаки, слабкої асоціації. со

Е. Ліганди-кандидати, одержані за допомогою скринінг-аналізу на двокомпонентні гібриди ю

Для дослідження взаємодії білок-білок іп мімо конструюють дріжджову двокомпонентну гібридну систему (Ріеїдз 8 опо, 1989) шляхом злиття білка--приманки" з ДНК-зв'язу вальним доменом дріжджового білка Са14. ме)

Цей метод також описаний в патенті США Мо5667973 і в патенті США Мо5283173 (Рієїдз еї аї.), які у всій своїй ї- повноті вводяться в даний опис за допомогою посилання.

Загальна процедура скринінгу бібліотеки за допомогою аналізу на двокомпонентний гібрид може бути здійснена як описано Нагрег еї а/!. (1993), або як описано Сто еї а)/. (1998), або також Еготопі-Касіпе еї а/!. (1997).

Білок або поліпептид--приманка" містить, або в основному складається або складається з поліпептиду « РАРАР або його фрагмента, що містить безперервну ділянку, принаймні, з 6 амінокислот, переважно, принаймні, лю) с з 8-10 амінокислот, а більш переважно, принаймні, з 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 або 100 амінокислот 5ЕО ІЮ МО:2.

Більш конкретно, нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид РАРАР або його фрагмент або варіант, ;» з'єднують з полінуклеотидом, що кодує ДНК-зв'язувальний домен білка саї1 4, де вказану гібридну нуклеотидну послідовність вбудовують у відповідний експресуючий вектор, наприклад, рА5З2 або рмМ3.

Потім, бібліотеку кКДНК людини створюють в спеціально сконструйованому векторі, так, щоб людська -І КДНК-вставка була приєднана до нуклеотидної послідовності у векторі, що кодує транскрипційний домен саї 4.

Переважним вектором є вектор рАСТ. Поліпептиди, кодовані нуклеотидними вставками бібліотеки людських се) КДНК, називають поліпептидами- "жертвами". с Третій вектор містить детектований маркерний ген, такий як ген бета-галактозидази або ген САТ, який 5ор знаходиться під контролем регуляторної послідовності, відповідальної за скріплення з повнорозмірним білком со Са/4 і яка містить домен активації транскрипції і ДНК-зв'язувальний домен. Так, наприклад, може бути

Ге використаний вектор рРОБЕС.

Можуть бути також використані два різних дріжджових штами. Як приклад, що ілюструє, але не обмежує, двох дріжджових штамів можуть служити наступні штами: 7190, фенотип якого являє собою: (МАТа, І еи2-3, 112 игаЗ3-12, ігрІ-901, піз3-0200, аде2-101, да14брда!1800

ОКАЗ ОАЇ -І ас, І У5 ОАЇ-НІ 53, суп");

Ф, 187, фенотип якого являє собою: (МАТа да14 да180 піз3 ігрі-901 аде2-101 ига3-52 Іеи 2-3, -1412 ОКАЗ ко САЇ -Іас/теї"), і який має тип схрещування, протилежний типу схрещування У190.

Коротко, 20мкг рАЗ2/РАРАР і 20мкг бібліотеки КДНК рАСТ котрансформують дріжджовим штамом У190. бо Трансформанти відбирають для культивування на мінімальних середовищах, що не містять гістидину, лейцину і триптофану, але містять інгібітор синтезу гістидину 3-АТ (50мМ). Позитивні колонії скринують на бета-галактозидазу за допомогою аналізу на фільтрах. Потім, подвійні позитивні колонії (Нів", Бейа-да!") культивують на планшетах, що не містять гістидину і лейцину, але містять триптофан і циклогексимід (1Омг/мл) для відбору на втрату плазміди рАЗ2/РАРАР, але збереження плазмідних бібліотек рРАСТ-КДНК. Одержані штами 65 Х190 схрещують зі штамами У187, експресуючими РАРАР або неспоріднені контрольні білки, такі як циклофілін

В, ламін або 5МЕ1, що використовуються як Саї 4-гібриди, як описано Нагрег еї аї. (1993) і Вгат еї аї. (Вгат

К.). еї аЇ. 1993), і скринують на бета-галактозидазу за допомогою аналізу на фільтрах. Дріжджові клони, які являють собою бБеїа-даІ-гібриди після схрещування з контрольними Оаьа4-гібридами, розглядаються як хибнопозитивні.

В іншому варіанті методу з використанням двокомпонентного гібриду даного винаходу взаємодія РАРАР або його фрагмента або варіанту з клітинними білками може бути оцінена з використанням керівництва "МаїсптакКег

Тмжмо Нургій Бузіет 2" (Сайаіод Кеї. Мо К1604-1, Сіопіеспу". Як описано в керівництві МаїсптакКег Тжмо НукБбгіа

Зувіет 2 (Сайаіод Кеї. К1І604-1, Сіопіес!), опис якого вводиться в дану заявку за допомогою посилання, нуклеїнові кислоти, що кодують білок РАРАР або його фрагмент, вбудовують в експресуючий вектор так, щоб він 70 був в одній рамці зчитування з ДНК, що кодує ДНК-зв'язувальний домен дріжджового активатора транскрипції

Са! 4. Потрібну кКДНК, переважно, людську кКДНК, вбудовують у другий експресуючий вектор, так, щоб вони були в одній рамці зчитування з ДНК, що кодує домен активації Саї 4. Ці дві експресуючі плазміди трансформують в дріжджі, і ці дріжджі висівають на селективне середовище, яке дозволяє провести відбір на експресію селективних маркерів на кожному з експресуючих векторів, а також на Са! 4-залежну експресію гена НІБЗ. 7/5 Трансформанти, здатні рости на середовищі, що не містить гістидину, скринують на СЗаї 4-залежну експресію

Іас7. Клітини, які є позитивними в аналізі на гістидин і Іас/7, виявляють взаємодію між РАРАР і білком або пептидом, що кодуються заздалегідь відібраною кКДНК-вставкою.

Спосіб скринінгу речовин, що взаємодіють з регуляторними послідовностями гена РАРАР

Даний винахід також відноситься до способу скринінгу речовин або молекул, здатних взаємодіяти з регуляторними послідовностями гена РАРАР, такими як, наприклад, промоторні або енхансерні послідовності.

Нуклеїнові кислоти, що кодують білки, здатні взаємодіяти з регуляторними послідовностями гена РАРАР, а більш переважно, з нуклеотидною послідовністю, вибраною з групи, що складається з полінуклеотидів 5'- і

З'-регуляторної області або їх фрагментів або варіантів, а переважно, з варіантом, що містить один з біалельних маркерів даного винаходу, можуть бути ідентифіковані з використанням одногібридної системи, такої сч об як система, описана в буклеті, що входить в набір "Маїсптакег Опе-Нубгій Зузіет Кі" від Сіопіесі (СаїаІсд

Кеї. Мо К1604-1), технічний опис якого вводиться в дану заявку за допомогою посилання. Коротко, потрібну і) нуклеотидну послідовність клонують вище від селективної репортерної послідовності, і одержану

ДНК-конструкцію інтегрують в дріжджовий геном (Засспаготусез сегемізіае). Потім дріжджові клітини, що містять репортерну послідовність в своєму геномі, трансформують бібліотекою, що містить гібридні молекули між кДНК, с зо що кодують білки-кандидати на скріплення з регуляторними послідовностями гена РАРАР, і послідовностями, що кодують домен-активатор дріжджового фактора транскрипції, такий як Са! 4. Рекомбінантні дріжджові клітини со висівають в культуральне середовище для відбору клітин, що експресують цю репортерну послідовність. Таким У чином, відібрані рекомбінантні дріжджові клітини містять гібридний білок, здатний зв'язуватися з потрібною регуляторною послідовністю гена РАРАР. Потім кДНК, що кодують гібридні білки, секвенують і ці послідовності ме) зв Можуть бути клоновані в експресуючі або трансрикпційні вектори іп міо. Скріплення поліпептидів, що ї- кодуються з цільовими регуляторними послідовностями гена РАРАР, може бути підтверджене методами, відомими фахівцям, такими як аналізи на сповільнення рухливості в гелі або аналізи на захист від ДНКази.

Аналізи на сповільнення рухливості в гелі можуть бути також здійснені незалежно в цілях скринінгу на молекули-кандидати, здатні взаємодіяти з регуляторними послідовностями гена РАРАР, як описано Егіей. « «

СтоїШтегв (1981), Сагпег 8 Кеугіп (1981) ї Оепі 85 Іаїсптап (1993), Ї описи цих публікацій вводиться в дану з с заявку за допомогою посилання. Вказані методи засновані на тому принципі, згідно з яким ДНК-фрагмент, що зв'язується з білком, мігрує повільніше, ніж той же самий непов'язаний ДНК-фрагмент. Коротко, потрібну ;» нуклеотидну послідовність мітять. Потім цю потрібну мічену нуклеотидну послідовність піддають контакту або з повним ядерним клітинним екстрактом, що містить фактори транскрипції, або з різними Молекулами-кандидатами, що тестуються. Взаємодію між потрібною регуляторною послідовністю гена РАРАР і -І молекулою-кандидатом або фактором транскрипції детектують за допомогою гель-електрофорезу або капілярного електрофорезу по сповільненню рухливості. се) Метод скринінгу лігандів, які модулюють експресію гена РАРАР с Іншою метою даного винаходу є розробка способу скринінгу молекул, які модулюють експресію білка РАРАР.

Вказаний спосіб скринінгу включає стадії: со а) культивування прокаріотичної або еукаріотичної клітини, яка була трансфікована нуклеотидною

Ге послідовністю, що кодує білок РАРАР або його варіант або фрагмент, і що знаходиться під контролем свого власного промотору; р) контактування вказаної культивованої клітини з молекулою, що тестується; 5Б с) кількісної оцінки експресії білка РАРАР або його варіанту або фрагмента.

В одному з варіантів здійснення винаходу нуклеотидна послідовність, що кодує білок РАРАР або його варіант

Ф) або фрагмент, містить алель, принаймні одного з РАРАР-асоційованих біалельних маркерів, і його ка комплементи.

З використанням техніки рекомбінантних ДНК, добре відомої фахівцям, ДНК-послідовність, що кодує білок бо РАРАР, вбудовують в експресуючий вектор нижче від його промоторної послідовності. Як ілюструючий приклад може служити промоторна послідовність гена РАРАР, яка міститься в нуклеїновій кислоті 5'-регуляторної області.

Кількісна оцінка експресії білюа РАРАР може бути здійснена або на рівні мРНК, або на рівні білка. В останньому випадку, поліклональні або моноклональні антитіла можуть бути використані для оцінки кількостей 65 білка, продукованого РАРАР, наприклад, в аналізах ЕП ІЗА або РІА.

У переважному варіанті здійснення винаходу кількісну оцінку МРНК РАРАР здійснюють шляхом кількісної

ПЛР-ампліфікації кКДНК, одержаної за допомогою зворотної транскрипції повнорозмірної мРНК культивованої

РАРАР-трансфікованої клітини-хазяїна з використанням пари праймерів, що є специфічними для РАРАР.

Даний винахід також відноситься до способу скринінгу речовин або молекул, які також здатні збільшувати або, навпаки, зменшувати рівень експресії гена РАРАР. Такий спосіб дає можливість фахівцеві відбирати речовини, які володіють дією, регулюючою рівень експресії гена РАРАР, і які можуть бути використані як активні інгредієнти, що входять до складу фармацевтичних композицій, для лікування пацієнтів, які страждають від шизофренії, біполярного порушення або спорідненого порушення центральної нервової системи.

Таким чином, частиною даного винаходу також є спосіб скринінгу речовини або молекули-кандидата, яка 7/0 Модулює експресію гена РАРАР, де вказаний спосіб включає наступні стадії: - одержання рекомбінантної клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, де вказана нуклеїнова кислота містить нуклеотидну послідовність 5'-регуляторної області або її біологічно активних фрагментів або варіантів, розташованих вище від полінуклеотиду, що кодує детектований білок; - одержання речовини-кандидата; і - визначення здатності вказаної речовини-кандидата модулювати рівні експресії полінуклеотиду, що кодує детектований білок.

В іншому варіанті здійснення винаходу нуклеїнова кислота, що містить нуклеотидну послідовність 5'-регуляторної області або її біологічно активного фрагмента або варіанту, також включає 5'ИТК-область кКДНК

РАРАР 5ЕО ІО МО/1, або один з її біологічно активних фрагментів або варіантів.

Серед переважних полінуклеотидів, що кодують детектований білок, можуть бути згадані полінуклеотиди, що кодують бета-галактозидазу, білок, флуоресціюючий в зеленому діапазоні (СЕР), і хлорамфеніколацетил-трансферазу (САТ).

Даний винахід також відноситься до наборів, що використовуються для здійснення описаного тут способу скринінгу. Такі набори, переважно, містять рекомбінантний вектор, що забезпечує експресію нуклеотидної сч ов послідовності 5'-регуляторної області або її біологічно активного фрагмента або варіанту, розташованих вище і функціонально приєднаних до полінуклеотиду, що кодує детектований білок або білок РАРАР або його фрагмент і) або варіант.

У іншому своєму варіанті даний винахід відноситься до способу скринінгу речовини або молекули-кандидата, які модулюють експресію гена РАРАР, де вказаний спосіб включає наступні стадії: с зо а) одержання рекомбінантної клітини-хазяїна, що містить нуклеїнову кислоту, яка містить нуклеотидну послідовність 5'0ТК-послідовності КДНК РАРАР ЗЕО ІЮО МО:1 або один з її біологічно активних фрагментів або со варіантів, де вказана 5'ШТК-послідовність або її біологічно активний фрагмент або варіант функціонально ю приєднані до полінуклеотиду, що кодує детектований білок;

В) одержання речовини-кандидата; і (22) с) визначення здатності вказаної речовини-кандидата модулювати рівні експресії полінуклеотиду, що кодує ї- детектований білок.

У конкретному варіанті здійснення вищезгаданого способу скринінгу нуклеїнова кислота, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5ТК-послідовності КДНК РАРАР 5ЕО ІЮО МО 1 або одного з її біологічно активних фрагментів або варіантів, включає промоторну послідовність, яка є « ендогенною по відношенню до 5'ЮТК-послідовності РАРАР. з с В іншому конкретному варіанті здійснення вищезгаданого способу скринінгу нуклеїнова кислота, що містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з 5ТК-послідовності КДНК РАРАР 5ЕО ІЮО МО 1 ;» або одного з її біологічно активних фрагментів або варіантів, включає промоторну послідовність, яка є екзогенною по відношенню до визначеної тут 5'ТК-послідовності РАРАР.

В іншому переважному варіанті 5 ТК -послідовність КДНК РАРАР 5ЕО ІЮО МО:1 або її біологічно активні -І фрагменти включає РАРАР-асоційований біалельний маркер або його комплементи.

Даний винахід також відноситься до наборів, що використовуються для здійснення способу скринінгу се) речовини-кандидата, що модулює експресію гена РАРАР, де вказаний набір включає рекомбінантний вектор, с який містить нуклеїнову кислоту, що включає 5'Цта-послідовність КДНК РАРАР 5ЕО ІЮО МО:1 або один з її біологічно активних фрагментів або варіантів, причому вказана 5 ШТК -послідовність або її біологічно со активний фрагмент або варіант функціонально приєднані до полінуклеотиду, що кодує детектований білок.

Із Для конструювання відповідного рекомбінантного вектора, що використовується для проведення описаних вище способів скринінгу, потрібно звернутися до розділу даної заявки, де детально описані переважні рекомбінантні вектори даного винаходу.

Рівні і характер експресії РАРАР можуть бути проаналізовані шляхом гібридизації в розчині з довгими зондами, як описано в Міжнародній патентній заявці Мо УУО 97/05277, зміст якої цілком вводиться в даний опис за (Ф) допомогою посилання. Коротко, КДНК РАРАР або геномну ДНК РАРАР, описані вище, або їх фрагменти, ка вбудовують в сайт клонування безпосередньо нижче від промотору РНК-полімерази бактеріофага (Т3, Т7 або

ЗРб) для продукування антисмислової РНК. РАРАР-вставка, переважно, включає, принаймні, 100 або більше во нуклеотидів, що безперервно йдуть один за одним, геномної ДНК-послідовності або кДНК-послідовності. Цю плазміду лінеаризують і транскрибують в присутності рибонуклеотидів, що містять модифіковані рибонуклеотиди (тобто біотин-ОТР і ОІС-ОТР). Надлишок цієї ДНК з подвійною міткою гібридизують в розчині з мРНК, виділеною з потрібних клітин або тканин. Гібридизацію здійснюють в стандартних жорстких умовах (40-50 протягом 16 годин в 80956-ному формаміді, 0,4М буфері масі, рН 7-8). Негібридизований зонд видаляють шляхом гідролізу б5 рибонуклеазами, специфічними для одноланцюгової РНК (тобто РНКазами СІЗ, ТІ, Ру М, 02 або А).

Присутність модифікації біотин-ОТР дозволяє захоплювати цей гібрид на мікротитраційному планшеті, покритому стрептавідином. Наявність Оіс-модифікації дозволяє детектувати і кількісно оцінювати цей гібрид за допомогою

ЕСІЗА з використанням анти-0ІС антитіла, кон'югованого з лужною фосфатазою.

Кількісний аналіз експресії гена РАРАР може бути також здійснений з використанням масивів. Термін "масив", що використовується тут, означає одномірну, двомірну або мультимірну матрицю з множини нуклеїнових кислот, що мають довжину, достатню для забезпечення специфічної детекції експресії мРНК, здатних гібридизуватись з ними. Так, наприклад, вказані масиви можуть містити множину нуклеїнових кислот, що походять від генів, рівні експресії яких необхідно оцінити. Ці масиви можуть включати геномну ДНК РАРАР,

КДНК-послідовності РАРАР або комплементарні послідовності або їх фрагменти, а зокрема, послідовності, що /0 Включають, принаймні, один РАРАР-асоційований біалельний маркер. Переважними є фрагменти, що мають довжину, принаймні, в 15 нуклеотидів. В інших варіантах здійснення винаходу вказані фрагменти мають довжину, принаймні, в 25 нуклеотидів. У деяких варіантах здійснення винаходу вказані фрагменти мають довжину, принаймні, в 50 нуклеотидів. Більш переважно, вказані фрагменти мають довжину, принаймні, в 100 нуклеотидів.

В іншому переважному варіанті здійснення винаходу вказані фрагменти мають довжину більш ніж в 100 /5 Нуклеотидів. У деяких варіантах здійснення винаходу вказані фрагменти можуть мати довжину більш ніж в 500 нуклеотидів.

Так, наприклад, кількісний аналіз експресії гена РАРАР може бути здійснений з використанням мікромасиву комплементарних ДНК, як описано Зспепа еї аї. (1995 і 1996). Повнорозмірні КДНК РАРАР або їх фрагменти ампліфікують за допомогою ПЛР і розташовують у вигляді масивів в 9б-ямковому мікротитраційному планшеті на силілованому предметному склі мікроскопа з використанням високошвидкісної робототехніки. Друковані масиви інкубують у вологій камері для регідратації елементів масиву і промивають, один раз в 0,295 ДСН протягом 1 хвилини, два рази у воді протягом 1 хвилини і один раз в розчині борогідриду натрію протягом 5 хвилин. Ці масиви занурюють у воду на 2 хвилини при 952С, переносять в 0,295 ДСН на 1 хвилину, двічі промивають водою, сушать повітрям і залишають в темряві при 2526. с

МРНК виділяють з клітин і тканин або одержують комерційно доступну мРНК і приготовляють зонди за о допомогою одного раунду оберненої транскрипції. Зонди гібридизують протягом 6-12 годин при 602С з 1см? мікромасивами на 14Х14мм склі, покритому покривним склом. Матриці промивають промивальним буфером низької жорсткості (1хХ55С/0,295 ДСН) протягом 5 хвилин при 252С, а потім промивальним буфером високої жорсткості (0,1х55С/0,296 ДСН) протягом 10 хвилин при кімнатній температурі. Масиви скануютьв 01х55С з С використанням флуоресцентного лазерного скануючого пристрою, забезпеченого серією стандартних фільтрів. со

Точні дані диференціальної експресії одержують шляхом обчислення середнього значення відношень для двох незалежних гібридизацій. Щео,

Кількісний аналіз експресії гена РАРАР може бути також здійснений з використанням повнорозмірних кКДНК Ф

РАРАР або їх фрагментів в комплементарних ДНК-масивах, як описано Ріеш еї аї. (1996). Повнорозмірну КДНК

Зо РАРАР або її фрагменти піддають ПЛР-ампліфікації і наносять на мембрани у вигляді плям. Потім мРНК, що в. походять від різних тканин або клітин, мітять радіоактивними нуклеотидами. Після гібридизації і промивання в регульованих умовах, гібридизовані мРНК детектують шляхом люмінесцентної візуалізації або авторадіографії.

Здійснювали повторні експерименти, а потім проводили кількісний аналіз диференціально експресованих мРНК. «

Альтернативно, експресійний аналіз з використанням геномної ДНК РАРАР, кКДНК РАРАР або її фрагментів може бути здійснений на нуклеотидних масивах високої щільності, як описано І оскнаг! еї аї. (1996) і ЗозпомзКку о) с еї аі. (1997). Олігонуклеотиди довжиною в 15-50 нуклеотидів, що походять від послідовностей геномної ДНК "» РАРАР, кДНК-послідовностей РАРАР або комплементарних послідовностей, синтезують безпосередньо на чипі " (ГосКкнагі еї аІ., див. вище) або спочатку синтезують, а потім переносять на чип (ЗозпомузКу еї аї., див. вище). Олігонуклеотиди, переважно, мають довжину приблизно в 20 нуклеотидів.

КДНК-зонди для РАРАР, мічені відповідною сполукою, такою як біотин, дигоксигенін або флуоресцентний - барвник, синтезують з відповідної мРНК-понуляції, а потім піддають рандомізованій фрагментації до середнього о розміру в 50-100 нуклеотидів. Потім вказані зонди гібридизують з чипом. Після промивання, як описано І оскнагї еї аЇ. (див. вище), і накладення різних електричних полів (бозпомузКу еї а!., 1997), барвники або сполуки для 1 мічення детектують і кількісно оцінюють. Потім здійснюють повторні гібридизації. Порівняльний аналіз со 20 інтенсивності сигналу, що йде від КДНК-зондів на один і той же олігонуклеотид-мішень в різних кДНК-зразках, вказує на диференціальну експресію МРНК РАРАР. г» Способи інгібування експресії гена РАРАР

Інші терапевтичні композиції даного винаходу переважно включають олігонуклеотидний фрагмент нуклеотидної послідовності РАРАР як антисмислову послідовність або послідовність потрійної спіралі, яка 229 інгібує експресію відповідного гена РАРАР.

Ге) Метод з використанням антисмислових послідовностей

Переважні методи з використанням антисмислового полінуклеотиду даного винаходу передбачають о проведення процедур, описаних 5слакієї! еї аї. (1995).

Антисмислові послідовності, переважно, вибирають з полінуклеотидів (довжиною 115-200 п.н.), які є 60 комплементарними 5-кінцю мРНК РАРАР. В іншому варіанті винаходу використовується комбінація різних антисмислових полінуклеотидів, комплементарних різним частинам потрібного гена-мішені.

Переважні антисмислові полінуклеотиди даного винаходу комплементарні послідовності МРНК РАРАР, яка містить або кодон ініціації трансляції АТО, або донорний або акцепторний сайт сплайсингу.

Антисмислові нуклеїнові кислоти повинні мати довжину і температуру плавлення, достатні для утворення бо внутрішньоклітинного дуплекса, що має стабільність, достатню для інгібування експресії МРНК РАРАР в цьому дуплексі. Стратегії конструювання антисмислових нуклеїнових кислот, відповідних для використання в генній терапії, описані в роботі сгееп еї аї. (1986) і Ігапі 5 М/еіпігаць (1984), які вводяться в даний опис за допомогою посилання.

У деяких стратегіях антисмислові молекули одержують шляхом зміни орієнтації кодуючої області РАРАР на обернену по відношенню до промотору, так, щоб транскрибувався ланцюг, обернений тому ланцюгу, який звичайно транскрибується в клітині. Антисмислові молекули можуть бути транскрибовані із застосуванням іп міго-систем транскрипції, таких як системи, в яких використовується полімераза 77 або ЗРб для генерування транскрипту. Інший метод передбачає транскрипцію антисмислових нуклеїнових кислот РАРАР іп мімо шляхом функціонального приєднання ДНК, що містить антисмислову послідовність, до промотору у відповідному 7/0 експресуючому векторі.

Альтернативно, відповідними стратегіями з використанням антисмислових послідовностей є стратегії, описанні Ковзвзі еї аЇ. (1991) в Міжнародних заявках МоМо МУО 94/23026, МО 95/04141, МО 92/18522 і в

Європейській патентній заявці Мо ЕР 0572287 А2.

Як альтернатива технології антисмислових послідовностей, що використовується в даному винаході, можуть /5 бути використані рибозими, які зв'язуються з послідовністю-мішенню за допомогою свого комплементарного полінуклеотидного хвоста, і які розщеплюють відповідну РНК шляхом гідролізу в її потрібному сайті (а саме "молотоподібні" рибозими). Коротко, спрощений цикл "молотоподібного" рибозиму включає: (1) специфічне скріплення його послідовності з МРНК-мішенню за допомогою комплементарних антисмислових послідовностей; (2) сайтспецифічний гідроліз мотиву ланцюга-мішені, що розщеплюється; і (3) вивільнення гідролізованих 2о продуктів, які стимулюють інший каталітичний цикл. Дійсно, використання довголанцюгового антисмислового полінуклеотиду (принаймні, з ЗО основ) або рибозимів з довгими антисмисловими плечами є переважним.

Переважна система доставки антисмислового рибозиму може бути одержана шляхом ковалентного скріплення цих антисмислових рибозимів з ліпофільними групами або шляхом використання ліпосом як стандартного носія.

Переважні антисмислові рибозими даного винаходу одержують, як описано 5слакіє! еї а). (1995), і конкретний сч ов опис процедур їх одержання, що приводиться у вказаній статті, вводиться в дану заявку за допомогою о посилання.

Метод з використанням потрійної спіралі

Геномна ДНК РАРАР може бути також використана для інгібування експресії гена РАР АР, основаного на утворенні внутрішньоклітинної потрійної спіралі. с зо Олігонуклеотиди потрійної спіралі використовують для інгібування транскрипції з геному. Вони можуть бути, зокрема, використані для дослідження зміни клітинної активності, якщо вона асоційована з конкретним геном. со

Аналогічним чином, частина геномної ДНК РАР АР може бути використана для дослідження дії, направленої ю на інгібування транскрипції РАР АР в клітині. Традиційно, гомопуринові послідовності розглядаються як найбільш придатні послідовності для використання в стратегіях потрійних спіралей. Однак, гомопіримідинові (22) послідовності також можуть інгібувати експресію гена. Такі гомопіримідинові олігонуклеотиди зв'язуються з ї- головною борозенкою в гомопуриновихтомопіримідинових послідовностях. Таким чином, в об'єм даного винаходу входять обидва типи послідовностей геномної ДНК РАРАР.

Для здійснення стратегій генної терапії методом потрійних спіралей, послідовності геномної ДНК РАРАР спочатку сканують для ідентифікації 10-20-мірних гомопіримідинових або гомопуринових фрагментів, які можуть « бути використані в стратегіях потрійних спіралей для інгібування експресії РАРАР. Після ідентифікації з с гомопіримідинових або гомопуринових фрагментів-кандидатів, їх ефективність в інгібуванні експресії РАРАР . оцінюють шляхом введення різних кількостей олігонуклеотидів, що містять дані послідовності-кандидати, в и?» клітини тканинних культур, які експресують цей ген РАРАР.

Вказані олігонуклеотиди можуть бути введені в клітини різними методами, відомими фахівцям, включаючи, але не обмежуючись ними, преципітацію фосфатом кальцію; ОЕАЕ-декстранову трансфекцію, електропорацію, -І трансфекцію, опосередковану ліпосомами, або нативне поглинання.

Потім проводять моніторинг оброблених клітин на зміну клітинної функції або на зниження рівнів експресії се) РАРАР такими методами як Нозерн-блот-аналіз, аналізи на захист від РНКази або ПЛР-стратегії, для оцінки с рівнів транскрипції гена РАРАР в клітинах, оброблених вказаним олігонуклеотидом.

Олігонуклеотиди, які є ефективними в інгібуванні експресії гена в клітинах тканинних культур, можуть бути бо потім введені іп мімо методами, описаними вище в розділі "Метод антисмислових послідовностей", в дозах,

Ге встановлених виходячи з іп міго-результатів, як описано у вказаному розділі.

У деяких варіантах даного винаходу природні (бета)аномери олігонуклеотидних ланок можуть бути замінені альфа-аномерами для надання цьому олігонуклеотиду більшої резистентності до нуклеаз. Крім того, дв інтеркалюючий агент, такий як етидійбромід або т.п., може бути приєднаний до 3-кінця альфа-олігонуклеотиду для стабілізації потрійної спіралі. Відомості з генерування олігонуклеотидів, придатних для утворення (Ф) потрійної спіралі, можна знайти в роботі Сгійіп еї а. (1989), яка вводиться в даний опис за допомогою посилання. ка Фармацевтичні композиції і препарати

РАРАР-модулюючі сполуки во З використанням описаних тут методів можуть бути ідентифіковані сполуки, які селективно модулюють

РАРАР-активність або модулюють взаємодію РАРАР-934872 іп мійго і іп мімо. Сполуками, ідентифікованими способом даного винаходу, є, наприклад, антитіла, що володіють специфічністю скріплення з пептидом РАРАР.

Також передбачається, що гомологи РАРАР можуть бути використані для модуляції РАРАР-опосередкованої активності і спорідненого фізіологічного стану, асоційованого з шизофренією або біполярним порушенням. У 65 Загальних рисах, передбачається, що аналітичні методи даного винаходу, засновані на ролі РАРАР в порушеннях центральної нервової системи, можуть бути використані для ідентифікації сполук, здатних впливати на шлях розвитку захворювання.

Показання

Хоча було продемонстровано, що РАРАР асоціюється з шизофренією і біполярним порушенням, однак, було показано, що РАРАР може брати участь в різних порушеннях центральної нервової системи. Передбачається, що порушення нервової системи повинні мати складну генетичну основу і часто мають визначені загальні симптоми. Зокрема, як описано в даній заявці, показанням можуть служити шизофренія і інші психотичні порушення, нейродегенеративні порушення, порушення настрою, аутизм, зловживання речовинами, що викликають залежність, і алкоголізм, затримка розумового розвитку і інші психічні захворювання, включаючи 7/0 порушення пізнавальної здатності, тривожні стани, порушення, пов'язане з прийомом їжі, імпульсивність, що не контролюється, і порушення особистості, які можуть бути визначені з використанням "Керівництва з діагностики і статистики психічних порушень, четверте видання, класифікація (О5М-1ІМ)".

Фармацевтичні композиції і способи введення

Сполуки, ідентифіковані способами даного винаходу, можуть бути введені ссавцеві, включаючи людину, /5 окремо або у фармацевтичних композиціях, в яких вони змішані з відповідними носіями або наповнювачами в терапевтично ефективних дозах, для лікування або ослаблення симптомів шизофренії і біполярних споріднених порушень. Термін "терапевтично ефективна доза" означає кількість сполуки, достатню для ослаблення симптомів, визначених описаними тут методами. Переважно, терапевтично ефективна доза є відповідною для безперервного або періодичного використання або введення. Методи одержання і введення сполук даного 2о винаходу можна знайти в керівництві Кетіпдіоп'є Рпагтасеціїса! Зсіепсез, Маск Рибіїзпіпуо. Со., Еавіоп, РА, останнє видання.

Способи введення

Відповідними способами введення є пероральне, ректальне, трансмукозальне або внутрішньокишечникове введення, парентеральна доставка, включаючи внутрішньом'язові, підшкірні, інтрамедулярні ін'єкції, а також сч об інтратекальні, прямі інтравентрикулярні, внутрішньовенні, внутрішньоочеревинні, інтраназальні або внутрішньоочні ін'єкції. Особливо цінним методом введення сполук для лікування захворювань центральної і) нервової системи є хірургічна імплантація пристрою для доставки сполуки протягом тривалого проміжку часу, такої як інтратекальна доставка, включаючи вливання в цереброспінальну рідину через імплантований насос (Меадігопіс, що поставляється, Іпс., Міппеароїїз, ММ). Зокрема, розглядаються препарати даного винаходу для с зо пролонгованого вивільнення лікарського засобу.

Композиція/препарат со

Фармацевтичні композиції і препарати для використання з метою даного винаходу можуть бути одержані ю стандартним способом з використанням одного або декількох фізіологічно прийнятних носіїв, включаючи наповнювачі і добавки. Конкретний склад композиції залежить від вибраного способу введення. (22)

Для ін'єкцій, агенти даного винаходу можуть бути введені у водні розчини, а переважно, у фізіологічно ї- сумісні буфери, такі як розчин Хенкса, розчин Рінгера або фізіологічний розчин, такий як фосфатний або бікарбонатний буфер. Для введення Через слизову, в даній композиції використовуються дифундуючі реагенти, відповідні для проходження через мембрану. Такі дифундуючі реагенти в основному, відомі фахівцям.

Фармацевтичними препаратами, які можуть бути використані для перорального введення, є « "пуш-фіт"-капсули ("ризп-ЯЄ - капсули з щільною підгонкою двох половинок), виготовлені з желатину, а також Ше) с м'які герметично запаяні капсули, виготовлені з желатину або пластифікатора, такого як гліцерин або сорбіт.

Ці "пуш-фіт"-капсули можуть містити активні інгредієнти в суміші з наповнювачами, такими як лактоза, ;» зв'язувальними агентами, такими як крохмаль, і/або замаслювачами, такими як тальк або стеарат магнію, і необов'язково зі стабілізаторами. У м'яких капсулах активні сполуки можуть бути розчинені або суспендовані у відповідних рідинах, таких як жирні масла, вазелінове масло або рідкі поліетиленгліколі. Крім того, можуть -І бути додані стабілізатори. Всі композиції для перорального введення повинні вводитися в дозах, відповідних для такого введення. ік Для трансбукального введення композиції можуть бути одержані у формі таблеток або пастилок, с виготовлених стандартним способом.

Для введення шляхом інгаляції, сполуки, що використовуються відповідно до даного винаходу, звичайно со доставляють у формі аерозольного спрею з аерозольної упаковки або розпилювача з використанням

Із відповідного газоподібного пропеленту, наприклад, двоокису вуглецю. У разі використання аерозольного інгалятора разова доза може бути встановлена за допомогою клапана для доставки кількості, що дозується.

Капсули і картриджі, наприклад, з желатину, для використання в інгаляторі або інсуфляторі, можуть бути виготовлені так, щоб вони містили порошкоподібну суміш сполуки і відповідної порошкоподібної основи, такої як лактоза або крохмаль.

Ф) Ці сполуки можуть бути приготовані для парентерального введення шляхом ін'єкції, наприклад, шляхом ка ін'єкції або безперервного вливання болюсу. Препарати для ін'єкції можуть бути виготовлені у вигляді разової лікарської форми, наприклад, в ампулах або в контейнерах для багаторазового прийому з додаванням бо Консерванту. Ці композиції можуть мати форму суспензій, розчинів або емульсій у водних носіях, і можуть містити технологічні добавки, такі як суспендуючі, стабілізуючі і/або диспергуючі агенти.

Фармацевтичні композиції для парентерального введення включають водні розчини активних сполук у водорозчинній формі. Водні суспензії можуть містити речовини, що підвищують в'язкість цієї суспензії, такі як натрійвмісна карбоксиметилцелюлоза, сорбіт або декстран. Ця суспензія може також, але необов'язково, містити 65 відповідні стабілізатори або агенти, що підвищують розчинність сполук, що дозволяє одержувати високою мірою концентровані розчини.

Альтернативно, активний інгредієнт може мати форму порошку або ліофілізовану форму для розведення відповідним носієм, таким як стерильна апірогенна вода, безпосередньо перед використанням.

Крім описаних вище композицій, ці сполуки можуть бути також приготовані у вигляді депо-препарату. Такі композиції тривалої дії можуть бути введені шляхом імплантації (наприклад, підшкірно або внутрішньом'язово) або шляхом внутрішньом'язової ін'єкції. Так, наприклад, вказані сполуки можуть бути приготовані з використанням відповідних полімерних або гідрофобних матеріалів (наприклад, у вигляді емульсій у відповідному маслі) або іонообмінних смол, або вони можуть бути виготовлені у вигляді слабкорозчинних похідних, на слабкорозчинній солі. 70 Крім того, вказані сполуки можуть бути доставлені з використанням системи пролонгованого вивільнення, такої як напівпроникна матриця з твердих гідрофобних полімерів, що містять терапевтичний агент. Є різні вже розроблені матеріали пролонгованого вивільнення, які добре відомі фахівцям. Капсули пролонгованого вивільнення, в залежності від їх хімічної природи, вивільняють сполуки протягом періоду часу від декількох тижнів і до більше ніж 100 днів.

В залежності від хімічної природи і біологічної стабільності терапевтичного реагенту можуть бути використані додаткові стратегії стабілізації білка.

Фармацевтичні композиції можуть також включати відповідні твердофазні або гелеві носії або наповнювачі.

Прикладами таких носіїв або наповнювачів є, але не обмежуються ними, карбонат кальцію, фосфат кальцію, різний цукор, крохмаль, похідна целюлоза, желатин і полімери, такий як поліетиленгліколі.

Ефективні дози

Фармацевтичними композиціями, відповідними для використання в даному винаході, є композиції, в яких активні інгредієнти містяться в кількості, ефективній для досягнення потрібної мети. Більш конкретно, термін "терапевтично ефективна кількість" означає кількість, ефективну для попередження розвитку або для ослаблення наявних симптомів у індивідуума, що піддається лікуванню. Визначення ефективних кількостей може сч бути здійснене будь-яким фахівцем, а особливо виходячи з приведеного тут докладного опису.

Для будь-якої сполуки, що використовується в способі даного винаходу, терапевтично ефективна доза може і) бути встановлена виходячи з аналізів клітинних культур, і така доза може бути введена тваринам з моделлю захворювання.

Одержана інформація може бути використана для більш точного визначення відповідних доз для введення с зо людині.

Термін "терапевтично ефективна доза" означає кількість сполуки, яка приводить до ослаблення симптомів у со пацієнта. Токсичність і терапевтична ефективність таких сполук може бути визначена згідно зі стандартними ю фармацевтичними процедурами з використанням клітинних культур або експериментальних тварин, наприклад, для визначення І 0 59 (доза, летальна для 5095 популяції, що тестується) і ЕО 50 (доза, терапевтично ефективна Ме

Зв для 50905 понуляції). Відношення доз з токсичним і терапевтичним ефектом являє собою терапевтичний індекс, ї- який може бути виражений як відношення між ГО вої ЕЮОво. Переважними є сполуки, які мають високий терапевтичний індекс.

Дані, одержані на основі аналізів клітинних культур і досліджень тварин, можуть бути використані для одержання доз в інтервалах, відповідних для введення людині. Доза таких сполук, переважно, складає в межах « концентрацій в кровотоці порядку ЕО 5у і має низьку токсичність або взагалі не має токсичності. Доза може п) с варіюватися в цих межах в залежності від лікарської форми, що використовується, і способу введення. Точний . склад, спосіб введення і доза можуть бути індивідуально вибрані лікуючим лікарем, виходячи з стану пацієнта и? (див., наприклад, Ріпа еї аі., ""Пе Рпагтасоіодіса! Вавзіз ої Тпегареціїсв", СП.Ї).

Попередження, діагноз і лікування психічних захворювань

Як описано вище, в одному з своїх аспектів даний винахід відноситься до одержання лікарського засобу для -І лікування психічних захворювань, а зокрема, шизофренії і біполярного порушення. Даний винахід також відноситься до лікарських засобів, діючих на РАРАР. се) У переважних варіантах здійснення даного винаходу лікарські засоби даного винаходу впливають на РАРАР с або шляхом безпосереднього впливу на РАРАР, на субодиницю, асоційовану з РАРАР-комплексом, на комплекс 5р РАРАР-934872, або опосередковано шляхом впливу на шлях РАРАР. Так, наприклад, лікарські засоби можуть со модулювати, а більш переважно, знижувати рівень РАРАР-активності, присутньої в клітині або в конкретній

Ге тканині, або підвищувати або знижувати активність білка РАРАР. У деяких варіантах свого здійснення даний винахід також відноситься до використання сполуки, здатної підвищувати або знижувати рівень експресії РАР АР або активність біль»а РАРАР, для одержання або промислового виготовлення лікарського засобу. Вказана ов сполука, переважно, використовується для лікування психічних захворювань, а переважно, для лікування шизофренії або біполярного порушення. Переважно, вказана сполука діє безпосередньо шляхом скріплення з

Ф) РАРАР, 934872 або рецептором РАРАР. Вказаним 934872 може бути будь-який поліпептид 934872, включаючи ка поліпептид 5ЕО ІЮ МО:5 або поліпептид, описаний в патентній заявці 09/539333, що спільно розглядається, озаглавленій "Гени, білки і біалельні маркери, асоційовані з шизофренією", і поданій 30 березня 2000 року. во Такі лікарські засоби можуть також підвищувати або знижувати активність сполуки, аналогічної РАРАР, тобто сполуки, що включає амінокислотну послідовність, що має, принаймні, 2595-ну ідентичність з послідовністю ЗЕС

ІЮ МО:2; сполуки, що включає амінокислотну послідовність, що має, принаймні, 5095-ну ідентичність з послідовністю ЗЕО ІЮО МО:2; і сполуки, що включає амінокислотну послідовність, що має, принаймні, 8095-ну ідентичність з послідовністю ЗЕО ІЮО МО:2. 65 Лікарські засоби, які підвищують або зменшують активність вказаних сполук у індивідуума, можуть бути використані для ослаблення або попередження симптомів у індивідуума, страждаючого від психічного захворювання або, що має схильність до психічного захворювання, яке обговорюється в даній заявці.

Альтернативно, РАРАР-активність може бути підвищена або знижена за допомогою експресії генів, що кодують ідентифіковані РАРАР-модулюючі сполуки, з використанням генної терапії. Приклади векторів і промоторів, придатних для використання в генній терапії, описані вище. РАРАР-активність може бути також підвищена або знижена шляхом продукування антитіла, яке зв'язується з пептидом РАРАР, з рецептором РАРАР або зі спорідненим білком, а також з фрагментами цих білків. Такі антитіла можуть модулювати взаємодії між

РАРАР і рецептором РАРАР або спорідненим білком. Антитіла і способи їх одержання детально описані в даній заявці. 70 Як описано вище, даний винахід відноситься до клітинних аналізів для ідентифікації сполук з метою їх використання для лікування психічного захворювання. Ці аналізи основані на детекції експресії РАРАР, вимірюванні активності білка РАРАР, або вони засновані на визначенні інших патологічних ознак шизофренії, що є на даний момент, біполярного порушення або спорідненого психічного порушення. Сполуками для лікування психічного захворювання є похідні білків або пептидів, які володіють здатністю інгібувати активність білка 7/5 РАРАР дикого типу, і які можуть бути ідентифіковані за визначенням їх здатності зв'язуватися з білюм РАРАР дикого типу. Такими сполуками також є антитіла, невеликі молекули і лікарські засоби, які можуть бути одержані з використанням ряду методів синтезу, відомих фахівцям, включаючи методи, засновані на комбінаторній хімії. Способи ідентифікації сполук і способи одержання композицій і введення лікарських засобів детально описані в даній заявці.

Використання РАРАР в методах діагностики або виявлення схильності до порушень ЦНС

У індивідуумів, які страждають шизофренією, біполярним порушенням або спорідненим порушенням, або що мають схильність до цих захворювань, можуть експресуватись аномальні рівні РАРАР. Індивідууми, у яких спостерігається знижена або підвищена РАРАР-активність в їх плазмі, фізіологічних рідинах або в тканинах, відносяться до групи підвищеного ризику розвитку шизофренії, біполярного порушення або різних порушень сч дв ЦНС або психічних станів, асоційованих із загальним механізмом розвитку захворювання. В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до способу виявлення у індивідуума ризику розвитку вказаного порушення і) або діагностування такого порушення (наприклад, шизофренії і біполярного порушення або інших психотичних порушень, порушень настрою, аутизму, зловживання речовинами, що викликають залежність, або алкоголізму, затримки розумового розвитку, і інших психічних захворювань, включаючи порушення пізнавальної здатності, с зо тривожні стани, порушення, пов'язане з прийомом їжі, імпульсивність, що не контролюється, і порушення особистості, які можуть бути визначені з використанням "Керівництва з діагностики і статистики психічних со порушень, четверте видання, класифікація (ОЗМ-ІМ))", де вказаний спосіб передбачає визначення наявності у ю індивідуума аномального рівня РАРАР-активності, включаючи активність білка РАРАР, і/або експресію мРНК

РАРАР, або аномального рівня білка РАРАР в плазмі, у фізіологічних рідинах або в тканинах. Рівень РАРАР або ме) аналогічних сполук в плазмі, у фізіологічних рідинах або в тканинах може бути визначений з використанням ряду ї- методів. Зокрема, рівень білка РАРАР може бути визначений з використанням, наприклад, Вестерн-блот-аналізів або електрофорезу білка. Детекція РАРАР може бути також здійснена з використанням антитіла, направленого проти поліпептиду РАРАР даного винаходу.

Детекція специфічного скріплення з антитілом вказує на присутність поліпептиду РАРАР в даному зразку « (наприклад, ЕГІЗА). Це може вказувати на патологічний стан, асоційований з РАРАР. з с В іншому аспекті один або декілька біалельних маркерів РАРАР, їх поліморфізм або варіанти можуть бути . також використані для розробки діагностичних тестів з метою ідентифікації індивідуумів, у яких експресуються а детектована ознака, як показник специфічного генотипу, або індивідуумів, генотип яких вказує на ризик розвитку у них в майбутньому детектованої ознаки. Така ознака, що аналізується з використанням способів Діагностики даного винаходу, може бути використана для діагностики будь-якої детектованої ознаки, включаючи -І схильність до шизофренії, біполярного порушення або до спорідненого порушення, такого як порушення, описані вище; вік, в якому почнуть з'являтися детектовані симптоми; сприятлива відповідь на лікування одного з ік вказаних порушень або на побічні ефекти, асоційовані з цим лікуванням. Така діагностика може бути с використана для моніторингу, прогнозування і/або профілактичного або терапевтичного лікування даного 5ор порушення. Вказані діагностичні способи основані на знанні нуклеїновокислотної послідовності РАРАР і со дозволяють використати різні методики для того, щоб визначити, чи має індивід, що обстежується, генотип,

Із асоційований з підвищеним ризиком розвитку детектованої ознаки, або даний індивід має детектовану ознаку внаслідок конкретної мутації, а зокрема, ці способи дозволяють здійснювати аналізи хромосом індивідуумів для визначення їх гаплотипу, такі як, наприклад, дослідження сімей, лише один аналіз ДНК сперми або обстеження в боматичних гібридів. Такі діагностичні способи можуть дозволяти детектувати специфічні алелі, присутні в послідовності РАРАР, включаючи регуляторні послідовності РАРАР, або, звичайно, присутні на хромосомі (Ф) людини в області 13433. Більш конкретно, даний винахід відноситься до способу детекції нуклеїнової кислоти, ка що містить, принаймні, одну нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ МО:1 або З або її фрагмент або комплементарну послідовність. во Вказані способи передбачають одержання зразка нуклеїнової кислоти від даного індивідуума, і визначення того факту, чи містить цей зразок нуклеїнової кислоти, принаймні, однин алель або, принаймні, однин гаплотип біалельного маркера, що вказує на ризик розвитку даної ознаки або вказує на експресію у даного індивідуума даної ознаки, зумовлену наявністю конкретного РАРАР-асоційованого поліморфізму або РАРАР-асоційованої мутації (алеля, що надає дану ознаку). 65 Така діагностика може бути основана лише на одному біалельному маркері або на групі біалельних маркерів.

У кожному з цих методів, у індивідуума, що досліджується беруть зразок нуклеїнової кислоти і визначають тип одного або декількох біалельних маркерів даного винаходу. В одному з варіантів здійснення винаходу проводять

ПЛР-ампліфікацію на зразку нуклеїнової кислоти для ампліфікації областей, в яких був ідентифікований поліморфізм, асоційований з детектованим фенотипом. Продукти ампліфікації секвенують для того, щоб визначити, чи має даний індивідуум один або декілька пов'язаних з РАРАР поліморфізмів, асоційованих з детектованим фенотипом. Альтернативно, зразок нуклеїнової кислоти піддають реакціям мікросеквенування для того, щоб визначити, чи має даний індивідуум один або декілька РАРАР-споріднених поліморфізмів, асоційованих з детектованим фенотипом і викликаних мутацією або поліморфізмом в гені РАРАР людини. В іншому варіанті здійснення винаходу зразок нуклеїнової кислоти піддають контактуванню з одним або декількома 7/0 бпецифічними олігонуклеотидними зондами, які специфічно гібридизуються з одним або декількома

РАРАР-алелями, асоційованими з детектованим фенотипом. В іншому варіанті здійснення винаходу зразок нуклеїнової кислоти піддають контактуванню з другим олігонуклеотидом, здатним продукувати продукт ампліфікації при його використанні разом з алельспецифічним олігонуклеотидом в реакції ампліфікації.

Присутність продукту ампліфікації в реакції ампліфікації вказує на те, що даний індивідуум має один або /5 декілька РАРАР-алелей, асоційованих з детектованим фенотипом. У переважному варіанті вказаною детектованою ознакою є шизофренія або біполярне порушення. Діагностичні набори містять будь-які полінуклеотиди даного винаходу. Вказані діагностичні способи є виключно ефективними, а в деяких випадках, їх можна вже почати використовувати для профілактичного лікування індивідуума або для прогнозу у цього індивідуума ознаки-передвісника симптомів, таких як малі симптоми.

Діагностика, яка передбачає аналіз і прогноз відповіді на лікарський засіб або побічних ефектів цього лікарського засобу, може бути використана для того, щоб визначити, чи можна лікувати даного індивідуума конкретним лікарським засобом. Так, наприклад, якщо така діагностика вказує на імовірність того, що даний індивідуум буде мати позитивну реакцію на лікування конкретним лікарським засобом, то цей лікарський засіб може бути введений даному індивідууму. | навпаки, якщо така діагностика вказує на імовірність продукування у сч ов даного індивідуума негативної реакції на лікування конкретним лікарським засобом, то цьому індивідууму може бути призначений альтернативний курс лікування. Негативна реакція може бути визначена або за відсутністю і) ефективної відповіді або за наявністю токсичних побічних ефектів.

Клінічні випробування лікарських засобів являють собою інше застосування діагностичних способів даного винаходу. Один або декілька маркерів, що є показниками відповіді на агент, діючий проти шизофренії, або на с зо продукування побічних ефектів, що викликаються агентом, діючим проти шизофренії, можуть бути ідентифіковані описаними вище способами. Потім може бути проведене обстеження потенційних учасників в клінічних со випробуваннях даного агента з метою ідентифікації тих індивідуумів, які, ймовірно, будуть мати сприятливу ю відповідь на лікування даним лікарським засобом, і виключити тих індивідуумів, у яких, ймовірно, будуть продукуватися побічні ефекти. Таким чином, ефективність лікування лікарським засобом може бути визначена у ме) індивідуумів, у яких спостерігається позитивна відповідь на даний лікарський засіб, причому, якість такого ї- визначення не буде знижуватися внаслідок включення індивідуумів, які в даному дослідженні мають низьку імовірність позитивної відповіді, а також буде виключений ризик розвитку у них небажаних побічних ефектів.

Попередження і лікування захворювань

Так, наприклад, через ризик суїциду, виявлення чутливості до шизофренії, біполярного порушення, а також « дО іншого психічного захворювання у даного індивідуума має дуже важливе значення. Отже, даний винахід в с відноситься до способу лікування порушення ЦНС, включаючи, зокрема, шизофренію, біполярне порушення або споріднене порушення, де вказаний спосіб включає наступні стадії: ;» - відбір індивідуума, ДНК якого містить алелі РАРАР-асоційованого поліморфізму, біалельний маркер або групу біалельних маркерів, або індивідуума, у якого спостерігається аномальна експресія МРНК РАРАР або активність білка РАРАР, асоційована з порушенням ЦНС; -І - обстеження вказаного індивідуума на появу у нього (і необов'язково, розвитку) симптомів, асоційованих з вказаним порушенням ЦНС; і і, - призначення вказаному індивідууму лікування, направленого проти вказаного порушення ЦНС або проти с його симптомів, на відповідній стадії даного захворювання.

В іншому варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до способу лікування порушення ЦНС, що бо включає наступні стадії:

Із - відбір індивідуума, ДНК якого містить алелі РАРАР-асоційованого поліморфізму, біалельний маркер або групу біалельних маркерів, або індивідуума, у якого спостерігається аномальна експресія МРНК РАРАР або активність білка РАРАР, асоційована з порушенням ЦНС; 5Б - призначення вказаному індивідууму профілактичного лікування, направленого проти вказаного порушення

ЦНе.

Ф) У ще одному варіанті свого здійснення даний винахід відноситься до способу лікування порушення ЦНС, що ка включає наступні стадії: - відбір індивідуума, ДНК якого містить алелі РАРАР-асоційованого поліморфізму, біалельний маркер або бо Групу біалельних маркерів, або індивідуума, у якого спостерігається аномальна експресія МРНК РАРАР або активність білка РАРАР, асоційована з порушенням ЦНС; - призначення вказаному індивідууму профілактичного лікування, направленого проти вказаного порушення

ЦНе. - обстеження вказаного індивідуума на появу і розвиток у нього симптомів вказаного порушення ЦНС; і 65 необов'язково, - призначення вказаному індивідууму лікування, направленого проти вказаного порушення ЦНС або проти його симптомів, на відповідній стадії даного захворювання.

З метою визначення курсу лікування індивідуума, який страждає даним захворюванням, даний винахід також відноситься до способу лікування порушення ЦНС, що включає наступні стадії: - відбору індивідуума, який страждає шизофренією або біполярним порушенням, ДНК якого містить алелі

РАРАР-асоційованого поліморфізму, бідалельний маркер або групу біалельних маркерів, або індивідуума, у якого спостерігається аномальна експресія мРНК РАРАР або активність білка РАРАР, асоційована з важким порушенням ЦНС або його симптомами; і - призначення вказаному індивідууму лікування, направленого проти вказаного порушення ЦНС або його 7/0 бимптомів.

Даний винахід також відноситься до способу лікування порушення ЦНС у відібраної групи індивідуумів.

Вказаний спосіб передбачає: - відбір індивідуума, який страждає порушенням ЦНС і має ДНК, що містить алелі РАРАР-асоційованого поліморфізму, біалельний маркер або групу біалельних маркерів, або індивідуума, у якого спостерігається /5 аномальна експресія МРНК РАРАР або активність білка РАРАР, асоційована з позитивною відповіддю на лікування ефективною кількістю лікарського засобу, направленого проти вказаного порушення ЦНС або його симптомів; - Мабо відбір індивідуума, ДНК якого не містить алелей РАРАР-асоційованого поліморфізму, біалельного маркера або групи біалельних маркерів, або індивідуума, у якого спостерігається аномальна експресія МРНК

РАРАР або активність білка РАРАР, асоційована з негативною відповіддю на лікування вказаним лікарським засобом; і - призначення вказаному відібраному індивідууму лікування ефективною кількістю вказаного лікарського засобу у відповідних інтервалах.

У контексті даного винаходу термін "позитивна відповідь" на лікарський засіб може бути визначений як сч ослаблення симптомів захворювання. У контексті даного винаходу термін "негативна відповідь" на лікарський засіб може бути визначений або як відсутність позитивної відповіді на лікарський засіб, при якому не і) відбувається ослаблення симптомів захворювання або спостерігаються побічні ефекти після введення лікарського засобу.

Переважними порушеннями ЦНС в способах даного винаходу є шизофренія і біполярне порушення. Однак, с зо даний винахід також відноситься до попередження, діагностики, прогнозування і лікування, описаного тут в способах попередження, діагностики, терапії і лікування споріднених порушень, а зокрема, споріднених со порушень ЦНС. Прикладами родинних порушень можуть служити психотичні порушення, порушення настрою, ю аутизм, зловживання речовинами, що викликають залежність, або алкоголізм, затримка розумового розвитку і інші психічні захворювання, включаючи порушення пізнавальної здатності, тривожні стани, порушення, пов'язане ме) зв З прийомом їжі, імпульсивність, що не контролюється, і порушення особистості, визначені з використанням ї- "Керівництва з діагностики і статистики психічних порушень, четверте видання, класифікація (ОЗ5М-ІМ)".

Даний винахід також відноситься до способу визначення імовірності позитивної відповіді індивідуума на лікування лікарським засобом. Цей спосіб передбачає ідентифікацію першої групи індивідуумів, у яких спостерігається позитивна відповідь на вказаний лікарський засіб, і другої групи індивідуумів, у яких « спостерігається негативна відповідь на вказаний лікарський засіб. Один або декілька біалельних маркерів з с ідентифікують в першій групі, у якої спостерігалася позитивна відповідь на вказаний лікарський засіб, або . один або декілька біалельних маркерів ідентифікують у другій групі, у якої спостерігалася негативна відповідь и?» на вказаний лікарський засіб. Вказані біалельні маркери можуть бути ідентифіковані описаними тут методами.

Потім у тестованого індивідуума беруть зразок ДНК. Цей зразок ДНК аналізують на вміст в ньому алелей

ОДНОГО або декількох біалельних маркерів, асоційованих з позитивною відповіддю на лікування вказаним -І лікарським засобом і/або на вміст в ньому алелей одного або декількох біалельних маркерів, асоційованих з негативною відповіддю на лікування вказаним лікарським засобом. ік У деяких варіантах здійснення винаходу вказаний лікарський засіб може бути введений індивідууму при с клінічному випробуванні, якщо вказаний зразок ДНК містить алелі одного або декількох біалельних маркерів, асоційованих з позитивною відповіддю на лікування вказаним лікарським засобом, і/або якщо вказаний зразок бо ДНК не містить алелей одного або декількох біалельних маркерів, асоційованих з негативною відповіддю на

Із лікування вказаним лікарським засобом. У переважних варіантах здійснення винаходу вказаним лікарським засобом є лікарський засіб, діючий проти шизофренії або біполярного порушення.

З використанням способу даного винаходу оцінка ефективності лікарського засобу може бути проведена у ов Групі індивідуумів, у яких, ймовірно, буде спостерігатися сприятлива відповідь на даний лікарський засіб.

Іншим аспектом даного винаходу є спосіб використання лікарського засобу, що передбачає одержання зразка

Ф) ДНК від індивідуума, оцінка на вміст в цьому зразку ДНК алелей одного або декількох біалельних маркерів, ка асоційованих з позитивною відповіддю на вказаний лікарський засіб і/або на вміст у вказаному ДНК-зразку алелей одного або декількох біалельних маркерів, асоційованих з негативною відповіддю на лікарський засіб, і бо введення вказаного лікарського засобу вказаному індивідууму, якщо цей ДНК-зразок містить алелі одного або декількох біалельних маркерів, асоційованих з позитивною відповіддю на вказаний лікарський засіб, і/або якщо цей ДНК-зразок не містить алелі одного або декількох біалельних маркерів, асоційованих з негативною відповіддю на вказаний лікарський засіб.

Даний винахід відноситься до способу клінічного випробування лікарського засобу, а переважно, лікарського 65 засобу, діючого проти шизофренії, біполярного порушення або його симптомів. Вказаний спосіб включає наступні стадії:

- введення гетерогенної понуляції індивідуумів лікарського засобу, а переважно, лікарського засобу, діючого проти шизофренії, або біполярного порушення, або їх симптомів; - ідентифікації першої популяції індивідуумів, у якої спостерігається позитивна відповідь на вказаний лікарський засіб, і другої популяції індивідуумів, у якої спостерігається негативна відповідь на вказаний лікарський засіб; - ідентифікації біалельних маркерів у вказаної першої популяції, у якої спостерігається позитивна відповідь на вказаний лікарський засіб; - відбору індивідуумів, ДНК яких містить біалельні маркери, асоційовані з позитивною відповіддю на 70 вказаний лікарський засіб; і - введення вказаного лікарського засобу вказаним індивідуумам. Очевидно, що такі способи надто необхідні для збільшення відношення користь/ризик завдяки введенню лікарських засобів, які можуть викликати небажані побічні ефекти і/або які є неефективними для тієї групи пацієнтів, яким їх звичайно призначають.

Після встановлення діагнозу індивідууму, який страждає шизофренією або біполярним порушенням, /5 проводять скринінг-тести для того, щоб визначити, чи містить ДНК даного індивідуума алелі біалельного маркера або групу біалельних маркерів, асоційованих з позитивною відповіддю на лікування або з негативною відповіддю на лікування, яке може викликати побічні ефекти, або яке є неефективним.

Відбір пацієнтів, що піддаються лікуванню способом даного винаходу, може бути здійснений методами детекції, описаними вище. Індивідуумами, які повинні бути відібрані, є переважно, такі індивідууми, ДНК яких 2о не містять алелей біалельного маркера або групу біалельних маркерів, асоційованих з негативною відповіддю на лікування. Знання про генетичну схильність індивідуума до несприйнятливості або до розвитку побічних ефектів у відповідь на введення даного лікарського засобу дозволяє клініцисту призначати лікування відповідними лікарськими засобами проти шизофренії або біполярного порушення або їх симптомів.

Після визначення генетичної схильності даного пацієнта, лікар-клініцист може призначити відповідне сч лікування, про яке відомо, що воно не дає, або майже не дає, негативної відповіді, а зокрема, побічних ефектів у пацієнта. і)

У даній заявці процитовані різні нублікації, патенти і опубліковані патентні заявки. Опис цих публікацій, патентів і опублікованих описів патентів, на які є посилання в даній заявці, вводяться в даний опис за допомогою посилання для більш повного опису матеріалу, до якого відноситься даний винахід. с зо Приклади

Приклад 1 со

Аналіз на скріплення з рецептором іп зйш (фарбування клітин) ю

АР-гібридна конструкція

Лігування із збереженням рамки зчитування кДНК-послідовності, що кодує амінокислотну послідовність ме) зв пептиду РАР (ЗЕО ІЮО МО:5), з С-кінцем секретованої лужної фосфатази (АР) здійснювали в експресуючому ї- векторі рАРІіаад.

Нуклеотидна і амінокислотна послідовності (гібридного) білка, вбудовані у вказаний вектор, представлені в

ЗЕО ІЮ МО 4 і 6, відповідно.

Цей вектор містить секретовану сигнальну послідовність, розташовану вище вставки, яка направляє « секретований гібридний білок в середовище. Середовища, що містять цей гібридний білок, можуть бути зібрані, /7-З с проаналізовані на АР-активність і використані в аналізі іп віш на рецептор/ліганд.

Потім, АР-гібридний білок трансфікували в клітини 2937 і стабільні трансфектанти відбирали за ;» резистентністю до зеоцину. Середовища від клітин, що містять стабільні трансфектанти, збирали через кожні З дні і аналізували на АР-активність. Потім це середовище, що містить АР-гібрид, використали для аналізу іп

Вії на скріплення з рецептором, що проводиться як описано нижче. -І Бібліотеку кКДНК головного мозку людини конструювали з використанням набору для синтезу кКДНК

Зігаїадепе. Цю кДНК клонували в експресуючий вектор рМТ21-пео ссавця (СепНипіег). Плазмідну. ДНК ік одержували з пулів «1000 колоній з використанням набору ОіаРгер Зріп Міпіргер (Оіадеп). Ці нули ДНК потім с піддавали короткочасній трансфекції в клітини СО5-1 як описано нижче. Два мікрограми ДНК від кожного пулу 5ор /КДНК головного мозку людини розводили в 200мкл безсироваткового середовища (середовища ОМЕМ від сірсо со ВК. без домішок). Потім утворювали комплекс ДНК з реагентом РІ 05 шляхом додавання 12мкл (змішаного

Ге перед використанням) реагенту РОЗ до ДНК в безсироватковому середовищі. 20Омкл комплексу "ДНК-РІ ОЗ-ліпофектамін" додавали в ямки, що містять клітини СОЗ-1, засіяні при концентрації 0,25 х109 клітин на ямку в б-ямкових планшетах (З5мм) за один день до трансфекції (в повному середовищі, що не містить антибіотиків). Перед додаванням комплексу ДНК/ліпофектамін/Р 05, повне середовище видаляли з клітин і замінювали 800мкл безсироваткового середовища. Клітини інкубували при 372 в 5956 СО» протягом З годин, а

ІФ) потім середовище в кожній ямці замінювали 2мл повного середовища. ко Клонування рецептора/ліганду

Секретований АР-гібридний білок використали як зонд для клонування РАРАР шляхом експресії відповідно бо до стратегій клонування.

Через два дні після трансфекції починалося фарбування клітин. Культуральне середовище видаляли з б-ямкових планшетів з клітинами. Прикріплені клітини один раз промивали 2мл промивального буфера НВНА (5Омл 10Х НВБ5 (ІХ), 0,25 грамів ВБА (0,5мг/мл), ТОмл 1М НЕРЕБ, рН 7,5 (20мММ), доведеного до 500мл з використанням ЯН-О)) і інкубували протягом 90 хвилин при кімнатній температурі з 2мл середовища, що містить 65 гібридний РАРАР-білок, або середовища, що містить АР (як негативний контроль). Потім середовище видаляли і зразок промивали, принаймні, 5 разів 2гмл буфера НВНА протягом 10 хвилин. Після цього, буфер НВНА повністю видаляли, і клітини фіксували протягом 30 секунд з використанням 2мл фіксуючого реагенту (6095-ний ацетон,

Зоо-ний формальдегід, 20ММ НЕРЕЗ, рН 7,5). Цей фіксуючий реагент відразу видаляли, і зразок двічі промивали 2мл буфера Н5 на ямку (15мл 5М Масі (150мМ), 1Омл ЇМ НЕРЕВ, рН 7,5 (20 мМ), доведеного до 500 мл з використанням ан 2о0)). Зразок інкубували в буфері Н5 при 659С протягом 100 хвилин для термоінактивації ендогенною АР. Буфер Н5 видаляли і АР-активність, пов'язану з клітинною поверхнею, забарвлювали 1 мл реагенту для аналізу АР (50ММ 1М Трис-НСЇ, рН 9,5 (100мММ), ТОмл 5М Масі (100ММ), 2,5мл 1М МосСІ (5мМ), доведеного до Б50Омл, до яких були додані МВТ до кінцевої концентрації О,ЗЗмг/мл і ВСІР до кінцевої концентрації 0,17 мг/мл.). 70 Після детекції позитивного клону, аналіз повторювали з використанням більш дрібних пулів кДНК доти, поки не був ідентифікований єдиний клон (нуклеїнова кислота РАРАР).

Приклад 2

Одержання композицій антитіла з білююом РАРАР

В основному, чистий білок або поліпептид виділяли з трансфікованих або трансформованих клітин, що 7/5 Містять експресуючий вектор, що кодує білок РАРАР або його частину. Концентрацію білка в кінцевому препараті доводили, наприклад, шляхом його концентрування на фільтрі Атісоп до рівня в декілька мікрограмів/мл. Потім, моноклональне або поліклональне антитіло проти даного білка може бути одержано таким чином.

А. Продукування моноклонального антитіла методом гібридомного злиття

Моноклональне антитіло проти епітопів в білці РАРАР або в його частині може бути одержане з мишачих гібридом класичними методами, описаними Копйіег б. 5 Міївїеіп С. (1975) або модифікованими методами. Див. також Напом Е. 5 О.І апе, 1988.

Коротко, мишу повторно інокулювали декількома мікрограмами білка РАРАР або його частини протягом декількох тижнів. Потім мишу умертвляли і з її селезінки виділяли антитіло-продукуючі клітини. Клітини селезінки піддавали злиттю за допомогою поліетиленгліколю з мишачими мієломними клітинами, а надлишок су

Ннезлитих клітин руйнували шляхом культивування цієї системи на селективних середовищах, що містять аміноптерин (середовища НАТ). Успішно гібридизовані клітини розводили, і аліквоти цього розведення о вміщували в ямки мікротитраційного планшета, в якому продовжували вирощування цієї культури.

Антитіло-продукуючі клони ідентифікували шляхом детекції антитіла в супернатанті в ямках за допомогою процедур імуноаналізу, такого як ЕГІЗА, вперше описаного Еподмаї! (1980), і модифікованими методами. Відібрані с

Зо позитивні клони можуть бути розмножені, і їх продукт з моноклональним антитілом може бути зібраний для подальшого використання. Докладний опис продукування моноклонального антитіла описаний у Оаміз І. еї аї., со

Вазіс Меїйосд3з іп МоіІесшцаг Віоіоду ЕІземіег, Мем/ ХогКк Зесійоп 21-2. ю

В. Продукування поліклонального антитіла шляхом імунізації

Поліклональна антисироватка, що містить антитіла до гетерогенних епітопів білка РАРАР або його частини, б»

Зз5 Може бути одержана шляхом імунізації відповідних тварин, що не є людиною, білюм РАРАР або його ї- фрагментом, який може бути немодифікований або модифікований для посилення імуногенності. Відповідною твариною, але не людиною, є, переважно, ссавець, але не людина, а звичайно, миша, щур, кролик, коза або кінь.

Альтернативно, неочищений препарат, який має підвищену концентрацію РАРАР, може бути використаний для генерування антитіл. Такі білки, їх фрагменти або препарати вводять ссавцеві, що не є людиною, в присутності « 20 Відповідного ад'юванту (наприклад, гідроксиду алюмінію, КІВІ і т.п.), відомого фахівцям. Крім того, цей шщ с білок, його фрагмент або препарат можуть бути заздалегідь оброблені агентом, що підвищує антигенність, й причому, такі агенти відомі фахівцям, і ними є, наприклад, метильований альбумін бичачої сироватки (тВ5А), «» альбумін бичачої сироватки (В5А), поверхневий антиген гепатиту В і гемоціанін лімфи равлика (КІН). Сироватку імунізованої тварини збирали, обробляли і тестували відповідно до відомих процедур. Якщо сироватка містить поліклональні антитіла проти небажаних епітопів, то ці поліклональні антитіла можуть бути очищені за -і допомогою імуноафінної хроматографії.

Ефективне продукування поліклональних антитіл залежить від багатьох факторів, пов'язаних як з типом іс, антигену, так і з видом хазяїна. Крім того, тварини-хазяї відрізняються за своєю відповіддю на ділянку «сл інокуляції і дозу, при цьому, неадекватна або надмірна доза антигену приводить до продукування антисироватки 5р З низьким титром антитіла. Малі дози (на рівні нг) антигену, що вводиться внутрішньошкірно, у багато які со ділянки, очевидно, є найбільш надійними. Методи продукування і обробки поліклональної антисироватки відомі з фахівцям, див., наприклад, Мауег 4 УУаІКег (1987). Протокол ефективної імунізації кроликів можна знайти у

МУайикаїйів 4). еї аї. (1971).

Бустер-ін'єкції можуть бути введені регулярно через відповідні інтервали часу, і антисироватку збирають в тому випадку, якщо титр антитіла, визначений напівкількісним методом, наприклад, методом подвійної імунодифузії в агарі проти відомих концентрацій антигену, починає знижуватися. Див., наприклад, Оиспіегіопу іФ) О. еї аІ. (1973). Плато на кривій концентрації антитіла складає звичайно в межах від 0,1 до 0,2мг/мл ко сироватки (приблизно 12мкМ). Афінність антисироватки, що містить антитіла проти даного антигену, визначають шляхом побудови кривих конкурентного скріплення, як описано, наприклад, Різпег 0. (1980). во Препарати антитіл, одержані відповідно до протоколу продукування моноклональних або поліклональних антитіл, можуть бути використані в кількісних імуноаналізах, які визначають концентрації антигенвмісних речовин в біологічних зразках; вони можуть бути також використані у напівкількісних або в якісних аналізах для ідентифікації присутності антигену в біологічному зразку. Ці антитіла можуть бути також використані в терапевтичних композиціях, призначених для цитолізу клітин, експресуючих даний білок, або для зниження рівнів б5 даного білка в організмі.

Хоча даний винахід був проілюстрований і описаний на переважних варіантах його здійснення, однак, в нього можуть бути внесеш різні зміни, що не виходять за рамки сутності і об'єму даного винаходу.

БІБЛІОГРАФІЯ:

Арропаапго 5. еї аї., 1993, Меййодвз іп Епгутоіоду, Асадетіс Ргезв, Мем ХогК, рр 803-823.

Айокак.5. еї аіІ., Ат. У. Нит. Сепеї, 60:1439-1447, 1997.

АїЇївспциі еї аї, 1990, у). Мої. Віої. 215 (3): 403-410.

АїЇївспи! еї аї., 1993, Майшге Сепеїйісв 3:266-272.

АЇївспи! еї аї., 1997, Мис. Асіаз Кез. 25:3389-3402.

Атевз, К.5. еї аї. 9. Іттипої!. Меййодз 184:177-186 (1995). 70 Апоп М. еї а)ї., 1995, .). Міго!., 69:4600-4606.

Агакі К еї а. (1995) Ргос. Май). Асад. 5сі. ОБА. 92(1): 160-4.

АзПпКепа?і, А. ег аі. РМАБ 88:10535-10539 (1991).

Азгоді еї аї!., Ргоїеіпез:з(гисішге, Рипсійоп, апа Сепеїйісв, З урріетепі 1:38-42 (1997)

А!йвзиреі! еї а). (1989) Ситепі Ргоїосоіїв іп Моїесціаг Віоіоду, ОСгееп Рибіїзвпіпд Авзосіаїез апа Уміеу

Іпіегесіепсе, М.У.

Вапипек, Р. еї аІ. СуюкКіпе 8(1): 14-20 (1996).

Ваибопів МУ. (1993) Мисівїс Асіадз Кезв. 21(9):2025-9.

Веайсаде еї а!., Теігапедгоп ГІ ек 1981, 22:1859-1862.

Вецег, М. еї а). 5сіепсе 240:1041-1043 (1988).

Вгадіеу А., 1987, Ргодисіоп апа апаїувів ої сПпітаегіс тісе. Іп: Е.). Кобрегізоп (Ед.), Тегаосагсіпотав апа етьгуопіс віет сеїІв: А ргасіїса! арргоасі. ІК! Ргезв, Охіога, рр.113.

Вгат К.. ег аї., 1993, Мої. Сеї| Віої!., 13:4760-4769.

ВгіпКтап М. еї а). 9. Іттипої. Ме(йподз 182:41-50 (1995).

Вгом/п ЕТ, ВеїЇгоаі|е К, Куап МУ), Кпогапа НО, Меїйодз Епгутої 1979; 68:109-151 сч

ВгшНад еїг а. Сотр. Арр. Віовсі. 6:237-245, 1990.

Випіоп, О.К. еї а). Адмапсез іп Іттипоіоду 57:191-280 (1994). і)

Вигн еї аї., 1997, У. Спготаїйоаг., 777:311-328..

Сагізоп, М.О. еї аї. 9. Віої. Спет. 272 (17): 11295-11301 (1997).

Снаї Н. еї а!. (1993) Віоїесппої!. Аррі. Віоспет. 18:259-273. Спее еї а. (1996). Зсіепсе. 274:610-614. с зо Спеп апа Кусок Мисівїс Асідз Кезеагсп 25:347-353 1997.

Спеп еї а). (1987) Мої. Сеї). Віо!. 7:2745-2752. со

Спеп еї а. Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА 94/20 10756-10761, 1997. ю

Спеп, 7. еї а). Сапсег Кез. 58 (16): 3668-3678 (1998).

Спо КУ еї а!., 1998, Ргос. Маїй). Асад. Зсі. ОБА, 95(7):3752-3757. Ме

Спои 9У.М., 1989, Мої. Епаостіпої, 3:1511-1514, ї-

Сіагк А.О. (1990) Мої. Віої. Емої. 7:111-122.

Соіез К, Сазмеї! К, Кибіпз2івіп ОС, Нит Мої Сепеї 1998; 7:791-800

Сотрюгп .). (1991) Майшиге. 350 (6313): 91-92.

Ррамів І.0., М.О. Оібпег, апа у.г. Вацеу, Вазіс Меїпоаз іп МоїІесціаг Віоіоду, ед., ЕІземіег Ргезз, МУ, 1986 « его, В.ейа!. Віоса 92(6): 1981-1988 (1998). в с Оепі ОБ й Іаісптап О5 (1993) Те ОМА тобріїйу зпй авзау. Іп: Тгапзсгіріоп Расіоге: А Ргасіїса . Арргоасні (І аїсптап О5, ей.) рр. 1-26. Охгога: ІК. Ргезв. и? Ескпегк. ейа). (1991)ЕМВО.). 10:3513-3522.

Едмагаз еї І еаіпеграгтому, Апаїпуїїса! Віоспетівігу, 246, 1-6 (1997).

Епомаї, Е., Мей. Епгутої. 70:419 (1980). -І ЕРеідтап апа 5іед, 1996, Медесіпе/Зсіепсевз, зупіпезе, 12:47-55.

Ееїїсі Р., 1991, 9. Мої. Віої., Мої. 222:301-310. і, Ееї, Н.Р. еї а). 9. Іттипої. 146:2446-2452 (1991). с Рівіїдз апа опо, 1989, Майшге, 340:245-246.

ЕРівпег, О., Спар. 42 іп: Мапиаї! ої Сіїпісаї Іттипоіоду, 24 Ей. (Козе апа Егіедтап, Ед».) Атег. Бос. Гог бо Місгобіо!., Уазпіпдюп,

Ге Ріоне еї а!. (1992) Ат. 9. Кегзріг. СеїЇ Мої. Віої. 7:349-356.

Еодог еї а). (1991) Зсіепсе 251:767-777.

Егаїеу еї аї. (1979) Ргос. Маї!. Асад. Зсі. ОБА. 76:3348-3352.

Епеа М, Стоїпеге ОМ, Мисіеїс Асіаз Кез 1981; 9:6505-6525.

Еготопі-Касіпе М. еї а!., 1997, Маїиге Сепеїйїісв, 16(3):277-282.

Ф) Ешіег 5. А. еї аї. (1996) Іттипоіоду іп Ситепі Ргоїосоїв іп МоіІесціаг Віоіоду, А!,зибеї еї аІ. Едв, допп УМіеу Кк ка Бопв, Іпс., ОА.

Еипй Р.А. еї аї. (1994) Ргос. Маї). Асад. Зсі ОБА 91:9302-9306. во Сагпег ММ, Кем?іп А, Мисієвїс Асіаз Кез 1981; 9:3047-3060.

Сеузеп Н. Магіо еї а). 1984. Ргос. Маї!. Асад. Зсі. О.5.А. 81:3998-4002.

Спо апа Васспауа!і 1991, Тагдейпу ої ІПрозотевз (о Пераїосуїез, ІМ: І імег Оівеазев5, Тагдейей аіадповів апа (пегару изіпд зресіїіс гесеріог: апа Ідапав. УУи еї а). Едв., Магсе! ОеКеКег, Мем ХогК, рр. 87-104.

СіШіевз, 5.0. еї аї. 9. Іттипої. Меїпоаз 125:191-202 (1989). 65 СіШев, 5.0. ег ам. РМАЗ 89:1428-1432 (1992).

Соппеї еї аї., 1992, Зсіепсе 256:1443-1445,

Сораї (1985) Мої. СеїІ. Віої., 5:1188-1190. боззеп М. еї а. (1992) Ргос. Май). Асад. сі. ОБА 89:5547-5551. бозвзеп М. еї аї. (1995) 5сіепсе. 268:1766-1769.

Сганат еї аї. (1973) Мігоїоду 52:456-457.

Огееп еї а!., Агт. Кеу. Віоспет. 55:569-597 (1986).

Сгеепзрап апа Вопа, ЕАБЕВ 3). 7(5):437-444 (1989).

Стгійіп еї а). Зсіепсе 245:967-971 (1989).

Сготре, М. (1993) Маїиге Сепеїїісв. 5:111-117. 70 Сготре, М. еї а). (1989) Ргос. Май). Асад. 5сі. ЮО.5.А. 86:5855-5892. би Н. еї а. (1993) Сеї! 73:1155-1164. би Н. еї аї. (1994) Зсіепсе 265:103-106. спагеїї У С еї а. Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА. 35:273-286.

Насіа 90, Вгоду І С, Спее М5, Родог 5Р, СоїІйпз Е5, Маї Сепеї 1996; 14 (4): 441-447.

Наї! у. А. апа 5тігпом І. Р. (1997) бепоте Кезеагсі, 7:378-388.

Натез В.О. апа Ніддіпе 5.). (1985) Мисівіїс Асій Нубгіділайоп: А Ргасіїсаї Арргоасіи. Натез апа Ніддіпе

ЕЯ., ІКГ. Ргезз, Охіога.

Наг)с Г,, У/ерег Т, Аіехапагома І, І иКіп М, Капкі М, даЇапко А, Сіїп Спет 1993; З9«11РИ)-2282-2287.

Напапгпга еї а). (1985) 9. СеїІ. ВіоЇ. 101:1094-1095.

Нагіому, Е., апа 0. І апе. 1988. Апііродієз А І арогаїюгу Мапиаї. Сода Зргіпд Нагброг І арогайогу, рр. 53-242.

Нагрег /Лмеї а!., 1993, Сеїї, 75:805-816.

Наттегінпо, еї аї!., іп: МОМОСІ ОМАГЇ. АМТІВООСІЕЗ АМО Т-СЕГІ.

НУВКІСОМАФЗ 563-681 (ЕІземієг, М.У, 1981).

Нагтор, -.А. еї а. 9. Іттипої. 161 (4):1786-1794 (1998). сч

Наулеу М.Е. еї а). (1994) Ат. У). Рпувз. Апіпгорої!. 18:104.

Непікоїї апа Непікоїї, 1993, Ргоїеіпз 17:49-61. (8)

Нідвіпз еї аї., 1996, Меїййодз Епгутої. 266:383-402.

Нійег І. апа Сгееп Р. Меййодз Аррі, 1991, 1:124-8.

Ноезз еї аї. (1986) Мисіеїс Асіаз Кев. 14:2287-2300. с зо Ниапа І. ега!. (1996) Сапсег Кез 56 (5): 1137-1141.

Низюгп еї аї. Меїйодз іп Епгутоіоду 203:46-88 (1991). со

Ниудеп еї а!. (1996) Майте Меаісіпе. 2(8):893-898. ю

Ігапі У, МУеіпігаць Н, СеїІ 1984 Арг; 36(4): 1007-15.

Ушап еї аї. (1992) 9. Сеп. Міго!ї. 73:3251-3255. ме)

Капедаєе У.еї аї|., Мисі. Асідз Кев. 23:3816-3821 (1995). ї-

Каїпіп апа АїЇївспиї, 1990, Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА 87:2267-2268.

КешШебогоцой, С.А. еї аї. Еиг. У. Іттипої. 24:952-958 (1994)

Кпошигу . еї аіІ., Еипдатепіа!в ої Сепеїйїс Ерідетіоіоду, Охтога Опімегейу Ргезв, МУ, 1993

Кігп О-У. ейа!). (1996) Сепотісв 34:213-218. «

КіІєїп еї аї. (1987) Майте. 327:70-73. з с Копіег, 0. апа Міївіеїп, 3., Майте 256:495 (1975). . Коїег еї аії. (1992) Аппи. Кеу. Іттипої. 10:705-730. и? Коза! МУ, 5пап М, Зпеп М, Мапод К, Рисіпі К, Мегідап ТС, Кісптап СО, Могтів ОЮ, Ниббеї! Е, Спее М, Сіпдегаз

ТК, Маї Мей 1996; 2(7):753-759.

Ї апдедгеп М. еї а). (1998) Сепоте Кезеагсі, 8:769-776. -І Ї апде К. (1997) Маїпетаїйсаї апа 5іайівіїса! Мейоз Тог Сепеїйїіс Апаїувів. Зргіпдег, Мем/ Могк.

Ї епнага Т. еї а. (1996) Сепе. 169:187-190. і, ШПОашіага, 9. еї ам. СуюкКіпае 9(4): 233-241 (1997). с Млюоп М.Р.еї аї. (1993) 9. Сііп. Іпмеві. 92:3029-3037.

Ши 2. еї а. (1994) Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА. 91:4528-4262. бо мак єї аї., Мате Сепеїйісв, 9:341-342,1995.

Ге Чмак КУ, Наіпег УМУ, Нит Мшиаї 1994; 3(4):379-385.

Ї оскнаг! еї аЇ. Маїшге ВіоФесппоіїоду 14:1675-1680, 1996.

Г исаз А.Н., 1994, Іп: Оемеіортепі апа Сіїпіса! Овзез ої Наетрорпйиз Б Сопічцчдасе;

Мапзоиг 5.Ї.. еї а). (1988) Майшге. 336:348-352.

Маггнпаї! К.Г. еї аІ. (1994) РОК Меїййовдвз апа Арріїсайопв. 4:80-84.

Ф) МссСогтіск еї а!. (1994) Сепеї. Апа!. Тесі. Аррі. 11:158-164. ка Меїі ацопіїп В.А. еї аї. (1996) Ат. 9. Нит. Сепеї. 59:561-569.

Могіоп М.Е., Ат. 9. Нит. Сепеї, 7:277-318, 1955ю во Могтізоп, Зсіепсе 229:1202 (1985)ю

Мипег, У.А. еї аїІ. Зігисішге 6(9): 1153-1167 (1998)ю

Миїйіпах, К.Г. еї аіІ. Віо Тесппіднез 12(6):864-869 (1992)ю

Мигусгка еї аї. (1992) Сигт. Торісв іп Місто, апа Іттипої. 158:97-129.

Мада 5. еї аї. (1993) СеїІ 73:1125-1135. 65 Маду А. еї а!., 1993, Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА, 90:8424-8428.

Магатига, М. еї а. Іттипої. Гек. 39:91-99(1994)ю -БО0-

Магапо 5А, Нвішпд НМ, Вгоиззеаи К, Меїйодз Епгутої 1979; 68:90-98

Меагаега)!. (1991) У.Віої.Спет. 266:14143-14146.

Меулоп еї аї. (1989) Мисівїс Асідз Кев. 17:2503-2516.

Міскеггоп О.А. еї аї. (1990) Ргос. Маїй!. Асад. Зсі. О.5.А. 87:8923-8927.

Місоїаи С еї аї., 1987, Ме(йодз Епгутої., 149:157-76.

Місоїач еї а!. (1982) Віоспіт. Віорпувз. Асіа. 721:185-190.

Міввіпої, у. Іттипої. 147(8): 2429-2438 (1991).

Мугеп Р, Ребегезоп В, Опіеп М, Апаї! Віоспет 1993; 208 (1): 171-175 70 ОЇ ега!., Віо Тесппідцез 4:214 (1986)ю

О'КейуУ еї аї. (1992) Васцомігиз Ехргезвіоп Месіогег: А І арогаїогу Мапиа)!. МУ. Н. Егеетап апа Со., Мем Хогк.

Опгпо еї аї. (1994) Зсіепсе. 265:781-784.

ОіІдеприго К.М. еї аї., 1992, Ргос. Маї!. Асад. Зсі., 89:5393-5397.

Огіа еї а. (1989) Ргос. Май). Асай. сі. О.5.А. 86:2776-2770.

Ои!спіегіопу, 0. еї аі., Спар. 19 іп: Напарсок ої Ехрегітепіа! ІттипоїЇоду О. УМіег (ед) ВіасКмеї! (1973)

Радіап ЕА, Моїіесшціаг Іттипоіоду 28 (4/5): 489-98 (1991).

Рагтіеу апа 5тійй, Сепе, 1988, 73:305-318.

Развіїіпеп єї аІ., зепоте Кезеагсі 1997; 7:606-614.

Реаггоп апа І іртап, 1988, Ргос. Маї)!. Асад. Зсі. ОБА 85(8):2444-2448.

Реазе 5. апв МУПШіат К.5., 1990, Ехр. Сеїї. Кев., 190:209-211.

Регзіс, І. еї аі. Сепе 187 9-18 (1997).

Репіп еї аї. (1994) Ат. 3. Нит. Сепеї 55:777-787.

Регйегзоп еї аї., 1993, Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА. 90:7593-7597.

Ріем еї а). Сепоте Кезеагсп 6:492-503, 1996. сч

Ріїага, М. ейа). 9. Іттипої. Ме(подз 205(2): 177-190 (1997).

Роцег еї аї. (1984) Ргос. Маї). Асад. 5сі. О.5.А. 81(22): 7161-7165. і)

Ргаї, М. еї а). 9. Сеїї. сі. Щ(РІ2):237-247 (1998).

Катипвгеп еї а/!., 1997, ЕІесігорпогевзів, 18:588-598.

Кеїа Г.Н. еї а. (1990) Ргос. Май. Асаа. Зсі. 0О.5.А. 87:4299-4303. с зо Кобрегізоп Е., 1987, Етрбгуо-дегімей вієет сеї Ппев. Іп: Е.). Кобрегізоп Ей. Тегафосагсіпотаз апа етрбгіопіс зіет сеїІв: а ргасіїса!| арргоаспі. ІК! Ргезз, Охіога, рр. 71. со

Кодизка М.А. еї ам. РМАБЗ 91:969-973, (1994). ю

Коззві еї аІ., Рпагтасої. ТНег. 50:245-254, (1991).

Коїй .).А. еї аї. (1996) Майте Меадісіпе. 2(9):985-991. ме)

Коих еї а!. (1989) Ргос. Май. Асай. 5сі. О.5.А. 86:9079-9083. ї-

Киапо еї аї. (1990) Ргос. Маї!. Асад. Зсі. Ш.5.А. 87:6296-6300.

ЗатргооК, ., Епівси, Е.Р., апа Т. Мапіайів. (1989) МоїІесшаг Сіопіпд: А Іарогаїюгу МапиаЇ. 2ей. Соїай

Зргіпд Нагброг І арогайгу, Соїд Зргіпд Нагрог, Мем" Могк.

Затвоп М, еї аї. (1996) Маїшиге, 382 (6593): 722-725. «

Затиївкі еї аї. (1989) 9. Мігої. 63:3822-3828. в с Запспе:-Резсадог К. (1988) 9. Сііп. Місгобіо!. 26(10):1934-1938. . загкаг, б. апа Зоттег 5.5. (1991) Віобїесппідцев. и?» зацег В. еї аії. (1988) Ргос. Май. Асай. 5сі. О.5.А. 85:5166-5170. зЗамаї, Н. ег аІ. АКІ 34:26-34 (1995). зЗспаїдО.. едгаІ,, Сепеї. Ерідетіо!., 13:423-450, 1996 -І зепейді А. еї аї., 1993а, Майшге, 362:258-261. зепеаді еї аї., 19936, Мисієїс Асіаз Кез., 21:4783-4787. се) Зепепа еї а). Зсіепсе 270:467-470, 1995. с зЗеспепа еї аї., 1996, Ргос Маї! Асад Зсі ОБА, 93 (20): 10614-10619.

Зесппеїдег еї аі. (1997) Апедціп: А Зоїмаге Рог Роршайоп Сепеїйісз Оайа Апаїувів. Опімегейу ої Сепема. бо Зспулагіг апа Оаупоїй, есдв., 1978, Маїйгісез їог ОЮеїйесіпо Оівіапсе КеїайопеПпірв: Айаз ої Ргоїевіп

Ге Зедцепсе апа Зігисіиге, УУазпіпдіоп: Майопа! Віотеадіса! Кезеагспї Рошпаацоп.

Зсгаківї 0. еї а). (1995) Тгепаз Місгобіої!. 3(6):213-217. зЗпау УМ. еї аї., 1991, Віоспет. Віорпуз. Асіа, 1072:1-7. 5Б Зпетіеїа, М.С. еї а. (1991) Ргос. Маї). Асад. Зсі. 0О.5.А. 49:699-706.

Зпігицуа еї а). (1992) Ргос. Маї)!. Асад. Зсі. Ш.5.А. 89:8794-8797. (Ф) ЗпоетакКег БО, еї аї., Маї Сепеї 1996; 14 (4): 450-456. ка ЗПпиМ, Ї. ег ам. РМАБ 90:7995-7999(1993).

ЗКе!їта, А. еї а). 5сіепсе 240:1038-1040. (1988). во Зтійй (1957) Апп. Нит. Сепеї 21:254-276. тій еї а. (1983) Мої. СеїІ. Віо!. 3:2156-2165.

Бозпомузкі КО, еї аї., Ргос Маї! Асад сі ОБА 1997/94:1119-1123. зЗомжанатіпі еї аї., Ргоївіп Епдіпеегіпуд 10:207,215 (1997).

Зріеітапп 5. апа Єжепз МУ.)., Ат. У). Нит. Сепеї, 62:450-458, 1998. 65 Зріеітапп 5. еї аіІ.,, Ат. У). Нит. Сепеї., 52:506-516, 1993. еЗіегтпбега М.І. (1992) Ттепаз Сепеї 8:1-16.

Зіетбего М.І. (1994) Матт. Сепоте. 5:397-404. зігуег, І.., Віоспетівігу, 4 еайіоп, 1995. зіцапіска О.М. еї а). Ргоївіп Епдіпеегіпод 7(6):805-814 (1994).

Зумапеп АС, Сіїп Спіт Асіа 1994; 226(2):225-236. зЗгаро А. еї а. Сигг Оріп 5ігисі Віо! 5, 699-705 (1995).

Тасзвоп еї а). (1996) Майшиге Меадісіпе. 2(8):888-892.

Тагутап, К.Е. еї а). Мейгоп 14(4):755-762 (1995)

Те Кіевїйе еї аї. (1990) Майте. 348:649-651. 70 ТепмійПдег У.О. апа ОК ., Напарсок ої Нитап Сепеїс І іпкаде, допп НоркКіпз Опімегейу Ргезв, І опаоп, 1994

Тпотаз К.К. еї а. (1986) СеїІ. 44:419-428.

Тпотаз К.К. еї а. (1987) СеїІ. 51:503-512.

Тпотргоп еї аї., 1994, Мисівїс Асіаз Кев. 22(2):4673-4680

Тиг-Кагвра еї а!. (1986) Мої. СеїІ. Віої!. 6:716-718.

Туаді еї аї. (1998) Майте Віосїесппоіоду. 16:49-53.

Огаєа М.5. (1988) Мисівїс Асіаз Кезеагсп. 11:4937-4957.

Огаеєа М.5. еї а!. (1991) Мисівїс Асіаз 5утр. Зег. 24:197-200.

Маїйчкаїйїв, у. еї а. 9. Сіїп. Епдосгіпої. Мейар. 33:988-991 (1971)

Маїадоп Р., еї аї., 1996, 9. Мої. Віої, 261:11-22.

Мап дег І цаї еї аї. (1991) Сепе. 105:263-267.

МІЇ, Н. егаІ. РМАЗ 89:11337-11341 (1992)

Міазак КМ. еї аї. (1983) Єиг. 9. Віоспет. 135:123-126.

Умаріко еї а. (1986) ОМА. 5(4):305-314.

УуаїКкег еї а). (1996) Сііп. Спет. 42:9-13. сч

Уапо еї аї., 1997, Спготайоадгарпніа, 44: 205-208.

МезіегіпкК М.А.)., 1995, Ргос. Маї!. Асад. Зсі., 92:4021-4025 (8)

МУУпе, М.В. еї а. (1992) Сепотісв. 12:301-306.

МУУпе, М.В. еї а. (1997) Сепотісв. 12:301-306. опа еї аї. (1980) Сепе. 10:87-94. с зо Умоса 5.А. еї а!., 1993, Ргос. Май). Асад. Зсі. ОБА, 90:4582-4585. уми апа ууи (1987) 9. ВіоЇ. Спет. 262:4429-4432. со

Ми апа Уи (1988) Віоспетівігу. 27:887-892. ю

Ми еї а). (1989) Ргос. Май. Асайд. Зсі. Ш.5.А. 86:2757. маді Т.еї а. (1990) Ргос. Маїй). Асад. Зсі. О.5.А. 87:9918-9922. Ме

Мооп, О.У. еї а. 9. Іттипої. 160 (7): 3170-3179 (1998) ча 7пао еї а. Ат. 9). Нит. Сепеї, 63:225-240, 1998 7пепо, Х.Х. еї аї. 9. Іттипої. 154:5590-5600 (1995) 7пи, 2. ег а). Сапсег Кев. 58 (15): 3209-3214(1998) 70 У. К. еї а. (1994) Ситт. Віо!. 4:1099-1103. « - с

Claims

Формула винаходу ;»

1. Виділений полінуклеотид, вибраний з групи, що складається з: а) полінуклеотиду, що кодує поліпептид РАРАР, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО:2; -І Б) полінуклеотиду, що містить нуклеотидну послідовність ЗЕО І МО:1, З або його комплементарну послідовність; і со с) полінуклеотиду, який щонайменше на 95 95 ідентичний полінуклеотиду, вказаному в (Б). сл

2. Рекомбінантний вектор, що містить полінуклеотид за п. 1.

3. Клітина-хазяїн тварини, що відмінна від людини, яка містить рекомбінантний вектор за п. 2. (о)

4. Полінуклеотид за п. 1, який додатково включає мітку і/або приєднаний до твердого носія. ГЕ

5. Очищений поліпептид РАРАР, амінокислотна послідовність якого: (а) кодується будь-яким з полінуклеотидів за п. 1; або (Б) щонайменше на 95 95 ідентична амінокислотній послідовності ЗЕО ІЮ МО:2.

6. Антисмисловий полінуклеотид, який інгібує експресію гена, що кодує поліпептид за п. 5.

7. Спосіб продукування поліпептиду за п. 5, що включає: (Ф) а) одержання клітини-хазяїна, що містить рекомбінантний вектор за п. 2; ГІ р) культивування вказаної клітини-хазяїна в умовах, що сприяють експресії вказаного поліпептиду; с) виділення поліпептиду, який продукується вказаною клітиною-хазяїном. во

8. Антитіло або антигензв'язуючий фрагмент антитіла, яке селективно зв'язується з поліпептидом за п. 5.

9. Антитіло за п. 8, яке є химерним, гуманізованим або людським антитілом.

10. Антитіло за п. 8 або 9, яке є моноспецифічним, біспецифічним або мультиспецифічним одноланцюговим антитілом.

11. Спосіб специфічної детекції присутності поліпептиду, визначеного в п. 5, в біологічному зразку, що б Включає: а) контактування вказаного біологічного зразка з антитілом за п. 8, 9 або 10; і

Б) детекцію комплексу антиген-антитіло, утвореного вказаним антитілом і вказаним поліпептидом.

12. Спосіб /7 ус діагностики індивідуума до схильності і/або до наявності психічних порушень, зокрема шизофренії та біполярного порушення, який відрізняється тим, що активність поліпептиду за п. 5 і/або експресію мРНК, що його кодує, детектують в плазмі, рідинах тіла, тканинах тіла.

13. Тварина, вибрана з групи: трансгенна миша, щур або кролик, що містить полінуклеотид за п. 1, вектор за п. 2 або клітину-хазяїна за п.3.

14. Спосіб скринінгу речовин, які взаємодіють з поліпептидом за п. 5, що включає: а) одержання поліпептиду за п. 5; 70 Б) контактування вказаного поліпептиду з вказаною речовиною-кандидатом; с) визначення утворення комплексу між вказаним поліпептидом і вказаною речовиною-кандидатом.

15. Спосіб скринінгу речовин, які модулюють експресію полінуклеотиду за п. 1, що включає: а) культивування прокаріотичних або еукаріотичних клітин, трансфікованих полінуклеотидом за п. 1; р) контактування культивованої клітини з речовиною-кандидатом; с) детекцію експресії продукції вказаного полінуклетиду в присутності вказаної молекули-кандидата. с щі 6) с (ее) ІФ) (о) і -

- . и? -і се) 1 (ее) Ко) іме) 60 б5