KR20030042449A - 정신분열증 관련된 유전자와 단백질 - Google Patents

정신분열증 관련된 유전자와 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PAPAP 유전자의 폴리뉴클레오티드, PAPAP 유전자에 의해 인코드되는 폴리펩티드, 이런 폴리펩티드에 특이적인 항체에 관한다. 또한, 본 발명은 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 CNS 질환의 치료 또는 진단을 위한 방법에 관한다. 또한, 본 발명은 정신분열증 후보 유전자 g34872와 PAPAP의 상호작용에 관한다.

Description

정신분열증 관련된 유전자와 단백질{SCHIZOPHRENIA RELATED GENE AND PROTEIN}
임상 연자에게 가용한 기술 설비의 발전으로 건강 상태와 질환 상태에서 뇌와 신경계 기능의 정교한 연구가 가능하게 되었다. 정신 질환과 신경퇴행성 질환을 비롯한 중추신경계(CNS) 질환에 관여하는 신경화학적ㆍ유전학적 기전의 측면에서 많은 신경학적ㆍ약리학적 가설이 제시되고 있다. 하지만, CNS 질환은 복합적이고 이해하기 어려운 병인 및 중복되고 거의 특성화되지 않으며 측정하기 어려운 증상을 보인다. 결과적으로, 앞으로의 치료 섭생과 약물 개발 노력은 좀더 정교하고 다중유전적 원인에 좀더 집중되어야 하고, 질환 개체군을 구분하는 신규한 분석법을 필요로 하며, CNS 질환 환자에 대한 좀더 정확한 진단과 예후 정보를 제공해야 한다.
CNS 질환은 광범위한 질환 및 상응하는 광범위한 유전적 요인을 동반할 수있다. CNS 질환의 예에는 신경퇴행성 질환, 정신 질환, 기분 장애, 자폐증, 약물 의존과 알코올 중독, 정신 지체 및 인식 장애, 정신 장애, 불안 장애, 섭식 장애, 충동 조절 장애, 인격 장애를 비롯한 다른 정신 질환이 포함된다. 질환은 Diagnosis Statistical Manual of Mental Disorder fourth edition(DSM-Ⅳ) 분류에 따라 정의할 수 있다.
CNS 질환의 소규모 부분집합을 고려하는 경우에도 정신 질환, 특히 정신 분열증과 양극성 장애의 적절한 치료 및 분자적 기초에 대한 이해의 부족으로 인해 치료 발명의 새로운 표적 및 개선된 치료 방법이 필요하다는 것은 명백하다. 정신분열증과 양극성 장애의 치료에 사용되는 모든 공지된 분자는 부작용을 보이고 효과가 이들의 증상에만 한정된다. 관련된 부작용이 없으면서 정신분열증과 양극성 장애의 원인 기전에 관여하는 표적을 저해하는 신규한 분자가 절실히 필요하다. 따라서, 이들 표적의 발견과 특성화를 용이하게 하는 도구는 유용하다.
가족에서 정신분열증과 양극성 장애의 집중, 쌍둥이와 입양 연구의 증거, 전세계적 발병률에서 변화 결여는 환경적 위험 요인이 일정 수준으로 발병에 관여한다 하더라도 정신분열증과 양극성 장애가 일차적으로 유전적 질환이라는 것을 암시한다. 가령, 정신분열증은 전체 인구의 1%에서 발병한다. 하지만, 조부모중 1명에게 정신분열증이 있으면, 병에 걸릴 위험이 3% 정도; 부모중 1명에게 정신분열증이 있으면 10% 정도로 증가한다. 부모 모두에게 정신분열증이 있으면 위험은 40% 정도까지 상승한다.
크로모좀 13q31-q33에서 정신분열증 취약성 유전자의 동정
특정 형질, 예를 들면 정신분열증과 같은 특이적인 중추신경계 질환에 관여하는 유전자의 동정은 현재 유전자 지도작성에 활용되고 있는 2가지 주요 전략: 연쇄 분석 및 연관 연구를 통하여 실시할 수 있다. 연쇄 분석은 여러 환자의 가족 연구를 필요로 하고, 현재 단일- 또는 저인자(oligogenic) 유전된 형질의 검출에 이용된다. 반대로, 연관 연구는 형질 음성 (T-) 대조군과 비교하여 무관한 형질 (T+) 개체에서 마커 대립유전자의 빈도를 검사하고, 일반적으로 다인자(polygenic) 유전의 검출에 이용된다.
유전적 링크 또는 "연쇄"는 크로모좀에서 2개의 인접한 서열이 감수분열동안 유전자 교환에 의한 재조합을 최소한으로 보유하는 지에 대한 분석에 기초한다. 이를 위하여, 마이크로위성(microsatellite) 마커와 같은 크로모좀 마커는 게놈에 정확하게 위치시킨다. 유전자 링크 분석은 계통도(genealogical tree)에 따라 사용된 크로모좀 마커와 표적 유전자에서 재조합, 상기 질환의 전달, 마커의 전달 가능성을 측정한다. 따라서, 상기 질환에서 임의 마커의 특정 대립유전자가 통상적 수준(0 내지 0.5의 재조합 수준)보다 더 높은 빈도로 전달되면, 표적 유전자가 마커의 인근에서 발견된다고 추론하는 것이 가능하다. 이런 기술을 활용하여, 가족성 암의 유전적 소인을 보이는 몇몇 유전자의 위치를 확인하였다. 유전자 링크 연구에 포함되기 위해서는 유전 질환의 영향을 받은 가족은 "정보적 요소" 기준을 충족시켜야 한다: 세대마다 수명의 피해 개체(구성 DNA가 가용함) 및 많은 후손.
기존 연쇄 연구의 결과는 크로모좀 13이 13q32에서 정신분열증 취약성 좌위를 보유할 가능성이 높다는 가설을 뒷받침하였다(Blouin JL et al., 1998, NatureGenetics, 20:70-73; Lin MW et al., 1997, Hum. Genet., 99(3):417-420). 크로모좀 13q32 좌위에 정신분열증 좌위의 존재를 암시하는 이들 관찰 결과는 연쇄 연구를 실시하여 얻었다. 연쇄 분석법은 명확한 만델리안 유전 패턴을 보이고 높은 투과도(penetrance)를 갖는 간단한 유전 형질을 지도에 표시하는 데에는 성공적으로 적용되었지만, 이런 분석법에는 다양한 단점이 존재한다. 먼저, 연쇄 분석법은 각 연구 형질에 적합한 유전 모델의 선택에 대한 의존으로 제한된다. 게다가, 연쇄 분석법을 활용하여 얻어질 수 있는 분석은 제한적이고, 이런 방법을 통하여 초기에 동정되는 일반적으로 20Mb 영역의 분석을 정교하게 하기 위하여 상보성 연구가 요구된다. 이에 더하여, 연쇄 분석법은 복합적인 유전 형질, 예를 들면 다중 유전자 및/또는 환경 요인의 복합적 작용에 기인한 유전 형질에 적용되는 경우에 입증하기 어렵다. 또한, 연쇄 분석법을 이런 상황에 적용하기 위하여 원하는 피해 가족의 수를 확보하는 데에는 너무나 많은 노력과 시간이 필요하다. 최종적으로, 연쇄 분석은 정보를 제공할 수 있는 다수의 가족이 존재하지 않는 형질의 연구에는 적용할 수 없다.
좀더 최근에는 연쇄 연구 대신에, 연관 연구를 실시하는 대안적 방법으로 크로모좀 13q1-q33에 위치하는 g34872 유전자라고 하는 새로운 정신분열증과 양극성 장애 관련된 유전자가 동정되었다. 이런 대안적 방법은 관심있는 영역에서 이중대립유전자 마커(주로 단일 뉴클레오티드 다형성)를 발생시키고, 정신분열증과 연쇄 불평형인 마커를 동정하고, 무관한 정신분열증과 양극성 장애의 환자와 대조군에서 연관 연구를 실시하는 단계로 구성된다.
요약하면, 후보 게놈 영역을 포함하는 BAC contig(콘틱)은 7개의 게놈 등가의 독점적 BAC 라이브러리를 스크린하기 위하여 크로모좀 13q31-33q 영역에 위치하는 27개의 공개된 STS를 이용하여 작제하였다. 이들 물질로부터 신규한 STS를 만들고 상기 영역의 밀집된 물리적 지도를 작성하였다. 전체적으로, 275개 STS는 검증을 위한 in situ 크로모좀 혼성화로 지도에 표시된 모든 크기의 255개 BAC의 동정을 가능하게 하였다. 새로운 이중대립유전자 마커는 사람 크로모좀 13q31-q33 영역에 위치하는 BAC 삽입체 일부의 서브클론으로부터 유래된 삽입체 말단의 부분적 염기서열분석으로 만들었다. 이런 분석의 첫 번째 단계에서, 정신분열증과 대조군에서 크로모좀 13q31-q33 후보 좌위 전역에 존재하는 9개의 상이한 BAC에서 34개의 이중대립유전자 마커를 분석하여, 정시분열증과 연관을 보이는 소구역(subregion)을 동정하였다. 첫 번째 분석에 이어, 표적 유전자의 고도로 밀집된 지도를 제공하기 위한 추가적인 대립유전자 마커를 전술한 바와 같이 만들었다. 최소 35개의 BAC를 동정하고 완전하게 염기서열분석하였는데, 여기에서 표적 유전자의 900kb이상 서열로 구성되는 콘틱을 비롯한 몇몇 콘틱이 도출되었다.
연관 연구에서 이들 이중대립유전자 마커는 정신분열증 후보 유전자 g34872를 보유하는 관심있는 특정 소구역을 세밀하게 구별하는데 사용되었다. 이들 이중대립유전자 마커는 소구역과의 연관을 확인하기 위하여 상이한 개체군에서 실시된 몇몇 연구에서 유전형이 확인되었다. 먼저, 연관 연구는 각각 139명의 환자와 141명의 대조군 및 215의 환자와 241명의 대조군으로 구성되는 프랑스계 캐나다 개체군으로부터 정신분열증 환자와 대조군의 2가지 상이한 스크리닝 시료 및 아르헨티나 개체군으로부터 양극성 장애 환자와 대조군에서 실시하였다. 이런 개체군을 이용한 몇몇 연구의 결과는 정신분열증과 현저한 연관을 보이는 대략 150kb의 게놈 영역을 암시하였다. 이후, 이런 연관은 미국 정신분열증 개체군으로부터 환자와 대조군을 이용한 별개의 연구 및 아르헨티나 개체군과 프랑스계 캐나다 개체군으로부터 추가적인 시료에서 확인되었다.
정신분열증과 연관된 대략 150kb 게놈 영역은 후보 유전자 g34872를 보유하는 것으로 밝혀졌다. g34872 유전자의 인트론-엑손 구조의 특성화에 더하여, 조직 특이적 mRNA를 비롯한 광범위한 mRNA 접합 변이체가 동정되었고, mRNA의 존재가 입증되었다. 후속으로, g34872 폴리펩티드로부터 유래된 펩티드 단편(SEQ ID No. 5에 도시된 아미노산 서열)은 생쥐 복강에 주사되는 경우에 이동성 동작 빈도의 감소 및 반복 행동의 증가를 보였다. g34872 유전자의 동정과 관련된 추가적인 설명은 2000년 3월 30일에 출원되어 현재 계류중인 미국 특허 출원 09/539,333 "Schizophrenia associated genes proteins and biallelic markers" 및 국제 특허 출원 PCT/IB00/00435에서 제시한다.
정신분열증과 양극성 장애에 관여하는 유전자를 동정하는 하는 것이 필요하다. 또한, g34872 경로에 관여하는 유전자 및 산물이 g34872 유전자 산물과 기능적으로 상호작용하는 유전자를 동정하는 것이 필요하다. 이들 유전자는 정신분열증 또는 양극성 장애의 치료에 새로운 개입지점을 제공하고, g34872 및 관련된 생물학적 경로의 추가적인 연구와 특성화를 가능하게 한다. 정신분열증에 관여하는 이들 유전자 및 관련된 생물학적 경로에 관한 지식은 연자들이 정신분열증과 양극성 장애의 병인을 이해하도록 하고, 상기 질환의 원인에 대한 직접적인 약물과 약물 치료를 결과할 것이다. 또한, 정신분열증과 양극성 이온에 대한 취약성을 검출하고 상기 질환의 발병을 예방 또는 추적하는 신규한 방법이 필요하다. 진단 도구 역시 매우 유용하다. 실제로, 정신분열증이 발병할 위험이 높은 개체의 조기 확인은 진단 및/또는 예방적 치료를 가능하게 한다. 게다가, 약물의 효능과 이에 대한 환자의 내성에 대한 정확한 평가는 의사들이 정신분열증과 양극성 장애 치료 섭생의 이익/위험 비율을 향상시킬 수 있도록 할 것이다.
따라서, 본 발명은 g34872 펩티드와 상호작용하는 신규한 유전자와 단백질에 관한다. 본 발명자들은 PAPAP 유전자라고 하는 신규한 유전자를 클론하고, PAPAP 유전자 산물이 g34872 펩티드와 상호작용한다는 것을 예증한다. g34872 결합 패턴에 관한 지식은 g34872 및/또는 PAPAP에 의해 매개되는 CNS 질환의 치료를 위한 약물의 개발을 가능하게 하고, PAPAP, g34872, g34872-PAPAP 복합체 또는 상호작용을 검출하는 수단을 제공하여 g34872의 연구를 가능하게 한다.
본 발명의 요약
본 발명은 PAPAP 단백질을 인코드하는 신규한 사람 유전자의 게놈 서열로 구성되는 핵산 분자에 관한다. PAPAP 게놈 서열은 상기 유전자의 전사된 부분의 상류(5'-말단) 및 하류(3'-말단)에 위치하는 조절 서열로 구성되는데, 이들 조절 서열 역시 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명은 PAPAP 폴리펩티드 및 이런 폴리펩티드를 특이적으로 인식하는 항체를 비롯하여, PAPAP 단백질을 인코드하는 완전 cDNA 서열에 관한다.
또한, 본 발명은 자연적으로 관련되는 단백질이 존재하지 않는 PAPAP-g34872 복합체 및 상기 복합체를 특이적으로 인식하는 항체에 관한다.
또한, 본 발명은 PAPAP 게놈이나 cDNA 서열과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머 및 상기 프라이머와 프로브를 이용한 DNA 증폭과 검출 방법에 관한다.
또한, 본 발명은 전술한 임의의 핵산 서열로 구성되는 재조합 벡터, 특히 PAPAP의 조절 서열이나 PAPAP 단백질을 인코드하는 서열로 구성되는 재조합 벡터 및 상기 핵산 서열이나 재조합 벡터를 포함하는 세포 숙주와 유전자도입된(transgenic) 사람을 제외한 동물에 관한다.
또한, 본 발명은 PAPAP 유전자의 발현을 저해하는 물질이나 분자를 스크리닝하는 방법 및 PAPAP 폴리펩티드와 상호작용하거나, PAPAP 폴리펩티드의 활성을 조절하거나, 또는 PAPAP와 g34872 펩티드(또는 단백질)의 결합 및/또는 상호작용을 파괴, 예방, 불안정화 혹은 강화시키는 물질이나 분자를 스크리닝하는 방법에 관한다.
최종적으로, 본 발명은 CNS 질환의 치료에서 PAPAP 폴리펩티드, 이의 항체, PAPAP 활성의 작용제 또는 길항제의 용도에 관한다.
서열 목록에 제시된 서열의 간단한 설명
SEQ ID No. 1은 PAPAP의 cDNA 서열을 도시한다.
SEQ ID No. 2는 SEQ ID No 1의 cDNA에 의해 인코드되는 아미노산 서열을 도시한다.
SEQ ID No. 3은 PAPAP의 게놈 DNA 서열을 도시한다.
SEQ ID No. 4는 실시예 1에서 밝힌 g34872 펩티드-알칼리성 포스파타제 융합 단백질을 인코드하는 DNA 서열을 도시한다.
SEQ ID No. 5는 실시예 1에서 밝힌 바와 같이, PAPAP 유전자를 동정 및 클론하는데 사용되는 g34872 펩티드를 인코드하는 DNA 서열을 도시한다.
SEQ ID No. 6은 SEQ ID No. 4의 DNA에 의해 인코드되는 아미노산 서열을 도시한다.
본 발명은 PAPAP 유전자의 뉴클레오티드, PAPAP 유전자에 의해 인코드되는 폴리펩티드, 이런 폴리펩티드에 특이적인 항체에 관한다. 또한, 본 발명은 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 CNS의 치료 혹은 진단 방법에 관한다. 또한, 본 발명은 PAPAP와 정신분열증 후보 유전자 g34872의 상관관계에 관한다.
크로모좀 1p35-p36에 위치한 PAPAP 유전자의 동정
본 발명자들은 실시예 1에서 상세하게 설명한 바와 같이, PAPAP 단백질을 동정하기 위하여 발현 클로닝 방법을 활용하였다. 간단히 말하면, 본 발명자들은 삽입체의 상류에 위치하고 융합 단백질을 배지에 배출되도록 하는 분비 신호 서열을 보유하는 벡터에서, g34872 펩티드의 펩티드 단편을 인코드하는 cDNA 서열과 배출된 알칼리성 포스파타제(AP)의 C-말단의 인-프레임 융합을 실시하고, 융합 단백질을 함유하는 배지는 수거하고 AP 활성을 분석하며 in situ 수용체/리간드 분석에 사용하였다. 이후, 본 발명자는 in situ 수용체/리간드 분석을 실시하였다. 사람 뇌 cDNA 라이브러리로부터 유래된 cDNA는 발현 벡터로 클론하고 COS-1 세포로 트랜스펙션시켰다. 배출된 AP 융합 단백질은 g34872 펩티드-AP 융합 단백질을 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양시켜 PAPAP를 클론하는 프로브를 사용하였다. 양성 클론이 검출되면, 단일 클론이 동정될 때까지 좀더 소규모의 cDNA로 분석을 반복하였다.
따라서, 본 발명은 PAPAP 유전자와 관련된 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드에 관한다. PAPAP의 게놈 또는 cDNA 서열과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머 역시 본 발명에 포함된다. 본 발명의 다른 목적은 본 발명에서 밝힌 임의의 핵산 서열로 구성되는 재조합 벡터, 특히 PAPAP의 조절 서열이나 PAPAP 단백질을 인코드하는 서열로 구성되는 재조합 벡터 및 상기 핵산 서열이나 재조합 벡터를 포함하는 세포 숙주에 관한다.
또한, 본 발명은 PAPAP 유전자의 발현을 저해하거나, PAPAP 단백질의 활성을 조절하거나, 또는 PAPAP와 g34872 펩티드(또는 단백질)의 결합 및/또는 상호작용을 파괴, 예방, 불안정화 혹은 강화시키는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한다. 또한, 본 발명은 진단 시약으로 유용한 상기 폴리펩티드에 대한 특이적인 항체에 관한다.
동정된 PAPAP 유전자와 단백질은 정신분열증 또는 양극성 장애의 진단을 위한 분석 및 정신분열증, 양극성 질환, 이들과 관련된 질환에 대한 유전적 취약성의 정확한 검출을 위한 분석의 설계에 사용할 수 있다. PAPAP 핵산, 폴리펩티드, 이런 폴리펩티드에 대한 항체 역시 상기 질환의 치료에 사용할 수 있다. PAPAP 유전자, 단백질, 이에 대한 항체는 신규한 또는 기존의 약물 또는 치료 섭생의 치료요법적 잠재력과 부작용의 정확하고 효과적인 평가를 제공하는 약물 스크리닝 프로토콜의 설계에도 사용할 수 있다. 이에 더하여, PAPAP 핵산과 폴리펩티드는 g34872와 PAPAP 및 CNS 질환에서 이들의 참여에 관한 연구에 사용할 수 있다.
정의
본 발명을 좀더 자세하게 설명하기에 앞서, 본 발명을 설명하기 위하여 이용된 용어의 의미와 범위를 한정하기 위하여 다음과 같은 정의를 제시한다.
본원에서 "PAPAP 유전자"에는 PAPAP 단백질을 인코드하고 게놈 DNA의 번역되지 않은 조절 영역을 포함하는 게놈, mRNA, cDNA 서열이 포함된다.
본원에서 "이질성 단백질"은 PAPAP 단백질을 제외한 임의의 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 좀더 구체적으로, 이질성 단백질은 PAPAP 조절 영역과의 추가적인 검사에 마커로 사용할 수 있는 화합물이다.
"분리된"은 물질이 원래의 환경(예, 자연 발생하는 경우에 고유 환경)으로부터 이동되는 것을 의미한다. 가령, 살아있는 동물에 존재하는 자연-발생 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 분리된 것이 아니지만, 고유 시스템에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 격리된 상기와 동일한 폴리뉴클레오티드, DNA 또는 폴리펩티드는 분리된 것이다. 이런 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부가 되거나 또는 이런 폴리뉴클레오티드 혹은 폴리펩티드는 조성물의 일부가 될 수 있는데, 벡터나 조성물이 고유 환경의 일부가 아니라는 점에서 이 역시 분리된 것이다.
가령, 살아있는 동물에 존재하는 자연-발생 폴리펩티드는 분리된 것이 아니지만, 고유 시스템에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 격리된 상기와 동일한 폴리뉴클레오티드는 분리된 것이다. "분리된"의 정의에서 자연-발생 크로모좀(예, 크로모좀 스프레드); 인공 크로모좀 라이브러리; 게놈 라이브러리; 시험관내 핵산 제형 또는 트랜스펙션/형질전환된 숙주 세포 제형(여기서, 숙주 세포는 시험관내 이질성 제형이거나 또는 단일 콜로니의 이질성 개체군으로 도말된다)으로 존재하는 cDNA 라이브러리는 제외된다. 특정된 폴리뉴클레오티드가 벡터 분자에서 핵산 삽입체 수의 5% 미만을 구성하는 라이브러리 역시 제외된다. 전체 세포 게놈 DNA 또는 전체 세포 RNA 제형(기계적으로 전단된 또는 효소적으로 절단된 전체 세포 제형 포함) 역시 제외된다. 전기영동(블랏 전달)에 의해 분리되는 시험관내 제형 또는 이질성 혼합물로서 상기 전체 세포 제형 역시 배제되는데, 여기서 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 전기영동 매체에서 이질성 폴리뉴클레오티드로부터 더 이상 분리되지 않는다(예, 아가로즈 겔 또는 나일론 블랏에서 이질성 밴드 개체군으로부터 단일 밴드를 절단함으로써 추가적인 분리).
본원에서 "정제된"은 절대 순도를 요구하지는 않는다; 오히려, 이는 상대적 정의로서 이해한다. 출발 물질 또는 천연 물질의 정제는 최소한 1 크기 자릿수, 바람직하게는 2 또는 3 크기 자릿수, 좀더 바람직하게는 4 또는 5 크기 자릿수로 생각한다. 예로써, 0.1% 농도에서 10% 농도로의 정제는 2 크기 자릿수이다.
cDNA 라이브러리로부터 개별 cDNA 클론은 통상적으로 전기영동적 동질성까지 정제된다. 이들 클론으로부터 수득된 서열은 라이브러리로부터 또는 전체 사람 DNA로부터 구할 수 없었다. cDNA 클론은 자연 발생하지 않고, 부분적으로 정제된 자연 발생 물질(메신저 RNA)의 조작을 통하여 얻는다. mRNA의 cDNA 라이브러리로의 전환에는 합성 물질(cDNA)의 생성이 포함되고, 순수한 개별 cDNA 클론은 클론 선별로 합성 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 따라서, 메신저 RNA로부터 cDNA 라이브러리를 만들고, 후속으로 상기 라이브러리로부터 개별 클론을 분리하면 고유메시지가 104-106배 정제된다.
이에 더하여, "정제된"은 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 탄수화물, 지질 등을 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 화합물로부터 격리되는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 설명하는데 이용할 수 있다. "정제된"은 호모- 또는 헤테로- 이합체, 삼합체 등과 같은 올리고형으로부터 본 발명의 단량체형 폴리펩티드의 분리를 명기하는데 이용할 수도 있다. "정제된"은 선형 폴리뉴클레오티드로부터 공유 결합된 폴리뉴클레오티드의 분리를 명기하는데 이용할 수도 있다. 폴리펩티드는 적어도 50%, 바람직하게는 60 내지 75%의 시료가 단일 폴리뉴클레오티드 서열과 입체형태를 보이는 경우에 실질적으로 순수하다. 실질적으로 순수한 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 각각 대략 50%, 바람직하게는 60 내지 90%, 좀더 바람직하게는 대략 95%, 가장 바람직하게는 99% w/w이상의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 시료로 구성된다. 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드 순도 또는 동질성은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면 시료의 아가로즈 또는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 후속으로 겔을 염색한 직후에 단일 밴드 가시화로 표시한다. 특정 목적을 위한 더 높은 분석은 HPLC 또는 다른 공지된 방법으로 제공할 수 있다. 대안적 구체예로 본 발명에 따른 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드의 정제는 이질성 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드(DNA, RNA 또는 둘 모두)와 관련하여 "적어도" 순도%로 표시할 수도 있다. 적절한 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드는 각각 이질성 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드와 관련하여 적어도 10%, 20%, 30%,40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 96%, 98%, 99%, 또는 100% 순도이다. 다른 적절한 구체예에서, 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드는 각각 이질성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 관련하여 90% 내지 100%사이에서 1/1000 자릿수까지의 순도(예, 적어도 99.995% 순도의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드), 또는 담체에 존재하는 화합물 및 분자를 제외한 모든 화합물 및 분자와 관련하여 w/w 비율로 순도를 갖는다. 1/1000 자릿수까지 순도 %를 표시하는 각 숫자는 순도의 개별 형식으로 주장할 수 있다.
본원에서 "폴리펩티드"는 중합체의 길이와 상관없이 아미노산 중합체를 의미한다; 따라서, 펩티드, 올리고펩티드, 단백질은 폴리펩티드의 정의에 포함된다. 이 용어는 폴리펩티드의 발현-후 수식을 명기 또는 배제하지 않는다, 예를 들면 글리코실기, 아세틸기, 포스페이트기, 지질기 등을 보유하는 폴리펩티드는 폴리펩티드에 포함된다. 하나이상의 아미노산 유사체를 보유하는 폴리펩티드(예, 비-자연 발생 아미노산, 무관한 생물체에서만 자연적으로 발생하는 아미노산, 포유동물체로부터 유래된 수식된 아미노산 등), 치환된 연쇄를 보유하는 폴리펩티드, 자연 발생하고 자연-발생하지 않는 당분야에 공지된 다른 변형체 역시 폴리펩티드에 포함된다.
본원에서 "재조합 폴리펩티드"는 인위적으로 설계되고 최초 고유 환경의 연속 폴리펩티드 서열에서 발견되지 않는 적어도 2개의 폴리펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 폴리펩티드를 의미한다.
본원에서 "정제된 폴리펩티드"는 핵산, 지질, 탄수화물, 다른 단백질을 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 화합물로부터 격리된 본 발명에 따른 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드는 적어도 50%, 바람직하게는 60 내지 75%의 시료가 폴리펩티드 서열을 보이는 경우에 실질적으로 순수하다. 일반적으로, 실질적으로 순수한 폴리펩티드는 각각 대략 50%, 바람직하게는 60 내지 90%, 좀더 바람직하게는 대략 95%, 가장 바람직하게는 99% w/w이상의 단백질 시료로 구성된다. 폴리펩티드 순도 또는 동질성은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면 시료의 아가로즈 또는 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 및 후속으로 겔을 염색한 직후에 단일 밴드 가시화로 표시한다. 특정 목적을 위한 더 높은 분석은 HPLC 또는 다른 공지된 방법으로 제공할 수 있다.
본원에서 "사람을 제외한 동물"은 사람을 제외한 척추동물, 조류, 포유동물, 바람직하게는 영장류, 가금(예, 돼지, 염소, 양, 당나귀, 말, 토끼) 또는 설취류, 좀더 바람직하게는 쥐 또는 생쥐를 의미한다. 본원에서 "동물"은 임의의 척추동물, 바람직하게는 포유동물을 의미한다. "동물"과 "포유동물"에는 "사람을 제외한"을 명시하지 않는 경우 사람이 포함된다.
본원에서 "항체"는 한 개이상의 결합 도메인으로 구성되는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 군을 의미하는데, 여기서 항체 결합 도메인은 항체 분자에서 다양한 도메인의 접힙(folding)으로 생성되고 항원의 항원 결정기 외형에 상보적인 내부 표면 형태 및 전하 분포를 갖는 3차원 결합 공간을 형성하는데, 이는 항원과의 면역학적 반응을 가능하게 한다. 항체에는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2를 비롯하여 결합 도메인을 보유하는 재조합 단백질이 포함된다.
본원에서 "항원 결정기"는 항원-항체 반응의 특이성을 결정하는 항원 분자의 일부분, 본원에서는 PAPAP 폴리펩티드를 의미한다. "에피토프"는 폴리펩티드의 항원 결정기를 의미한다. 에피토프는 상기 에피토프에 독특한 공간적 입체형태를 제공하는 적게는 3개의 아미노산으로 구성된다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 6개의 이런 아미노산, 바람직하게는 적어도 8-10개의 이런 아미노산으로 구성된다. 에피토프를 구성하는 아미노산을 측정하는 방법에는 x-레이 결정법; 2-차원 핵 자기 공명법; 에피토프 지도작성, 예를 들면 Geysen et al. 1984; PCT 출원 WO 84/03564; PCT 출원 WO 84/03506에서 밝힌 Pepscan 방법이 포함된다.
본원에서, "뉴클레오티드 서열"은 폴리뉴클레오티드 또는 핵산을 의미한다. 좀더 구체적으로, "뉴클레오티드 서열"에는 핵산 물질 자체가 포함되고, 따라서 특정 DNA 또는 RNA 분자를 생화학적으로 특성화하는 서열 정보(즉, 4개의 염기 문자에서 선택되는 문자의 연속)에 제한되지 않는다.
본원에서, "핵산", "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드"는 서로 동일한 의미를 가지고, 여기에는 단일 사슬 또는 이중 나선 형태로 한 개이상의 뉴클레오티드로 구성되는 RNA, DNA, 또는 RNA/DNA 하이브리드 서열이 포함된다. 본원에서 "뉴클레오티드"에는 단일 사슬 또는 이중 나선 형태로 임의 길이의 RNA, DNA, 또는 RNA/DNA 하이브리드 서열로 구성되는 서열 역시 포함된다. 또한, 본원에서 "뉴클레오티드"는 개별 뉴클레오티드 또는 다수의 뉴클레오티드, 다시 말하면 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 경우에 퓨린 또는 피리미딘, 리보즈 또는 디옥시리보즈 당 성분, 인산염 기 또는 포스포디에스터 결합으로 구성되는 분자 또는 좀더 큰 핵산 분자에서 개별 단위를 의미한다. "뉴클레오티드"에는 적어도 한 개의 변형체 (a) 다른 결합기, (b) 퓨린의 유사체, (c) 피리미딘의 유사체 또는 (d) 당 유사체를 포함하는 "변형된 뉴클레오티드"가 포함된다(참조: WO95/04064). 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 합성, 재조합,ex vivo발생 또는 이들의 조합을 비롯한 임의의 공지된 방법 및 당분야에 공지된 정제 방법을 활용하여 만들 수 있다.
조절 서열, 예를 들면 프로모터에 "작동적으로 연결된" 서열은 조절 요소가 핵산에서 정확한 위치와 방향으로 존재하여 RNA 중합효소 개시 및 관심있는 핵산의 발현을 조절한다는 것을 의미한다. 본원에서 "작동적으로 연결된"은 기능적 상관관계에서 폴리뉴클레오티드 요소의 연쇄를 의미한다. 가령, 프로모터 또는 인헨서는 코딩 서열에 작동적으로 연결되고 코딩 서열의 전사에 영향을 준다.
"형질"과 "표현형"은 본원에서 동일한 의미를 갖고 미생물의 가시적인, 검출가능한 또는 달리 측정가능한 특성, 예를 들면 질환의 증상 또는 질환에 대한 취약성을 의미한다. 일반적으로, "형질" 또는 "표현형"은 질환의 증상 또는 이에 대한 취약성, 치료와 관련된 유익한 반응 또는 치료와 관련된 부작용을 의미한다. 바람직하게는, 이런 형질은 암, 발달 질환, 신경 질환일 수 있지만, 이들에 국한되지는 않는다.
"대립유전자"는 뉴클레오티드 서열의 변이를 의미한다. 이중대립유전자 다형성은 2가지 형태를 갖는다. 이배체 미생물은 하나의 대립유전자형에 대하여 동형접합성 또는 이형접합성일 수 있다.
본원에서 "유전형"은 개체 또는 시료에 존재하는 대립유전자의 본성을 의미한다. 일반적으로, 유전형은 개체 또는 시료에 존재하는 이중대립유전자성 마커 대립유전자의 종류를 의미한다. "이중대립유전자 마커에 대한 시료 또는 개체의 "유전자형 분석(genotyping)"에는 이중대립유전자 마커에서 개체가 보유하는 특정 대립유전자 또는 특정 뉴클레오티드를 결정하는 것이 포함된다.
본원에서 "돌연변이"는 1% 미만의 빈도로 상이한 게놈 또는 개체간 DNA 서열에서 차이를 의미한다.
본원에서 "다형성"은 상이한 게놈 또는 개체간 2개이상의 게놈 서열 또는 대립유전자의 발생을 의미한다. "다형적(polymorphic)"은 특정 게놈 서열에서 2개 이상 변이가 개체군에서 발견되는 상태를 의미한다. "다형적 부위"는 변이가 발생하는 좌위이다. 단일 뉴클레오티드 다형성은 다형적 부위에서 1개 뉴클레오티드의 다른 뉴클레오티드로의 치환이다. 단일 뉴클레오티드의 결실 또는 단일 뉴클레오티드의 부가 역시 단일 뉴클레오티드 다형성을 유발한다. 본원에서, "단일 뉴클레오티드 다형성"은 가급적 단일 뉴클레오티드 치환을 의미한다. 전형적으로, 상이한 개체간 다형적 부위가 2개의 상이한 뉴클레오티드에 의해 점유될 수도 있다. 본원에서 "이중대립유전자 다형성"과 "이중대립유전자 마커"는 동일한 의미를 갖고 개체군에서 상당히 높은 빈도로 2개의 대립유전자를 갖는 단일 뉴클레오티드 다형성을 의미한다. "이중대립유전자성 마커 대립유전자"는 이중대립유전자 마커 부위에 존재하는 뉴클레오티드 변이를 의미한다.
본원에서 "상류"는 특정 기준지점으로부터 뉴클레오티드의 5'말단 방향으로의 위치를 의미한다.
본원에서 "염기쌍"과 "Watson & Crick 염기쌍"은 동일한 의미를 갖고 이중나선 DNA에서 발견되는 것과 유사한 방식으로 서열 상동성으로 인해 서로 수소 결합된 뉴클레오티드를 의미하는데, 여기서 티민 또는 우라실 잔기는 2개의 수소 결합에 의해 아데닌 잔기에 결합하고, 사이토신 잔기는 3개의 수소 결합에 의해 구아닌 잔기에 결합한다(Stryer, L., Biochemistry, 4thedtion, 1995)
"상보성" 또는 "이의 보체"는 상보성 전체 영역에서 다른 특정된 폴리뉴클레오티드와 Watson & Crick 염기쌍을 형성할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 본 발명에서는 첫 번째 폴리뉴클레오티드에서 각 염기가 상보성 염기와 쌍을 이루는 경우에 첫 번째 폴리뉴클레오티드는 두 번째 폴리뉴클레오티드와 상보성이라고 한다. 상보성 염기는 A와 T(또는 A와 U), 또는 C와 G이다. 본원에서 "보체"는 "상보성 뉴클레오티드", "상보성 핵산", "상보성 뉴클레오티드 서열과 동의어로 사용된다. 이들 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드가 실제로 반응하는 특정 조건이 아닌 순전히 서열에 기초한 폴리뉴클레오티드의 쌍에 적용된다.
변이와 단편
본 발명은 전술한 폴리뉴클레오티드, 특히 본 발명에 따른 하나이상의 이중대립유전자 마커를 보유하는 PAPAP 유전자의 변이와 단편에 관한다.
본원에서 폴리뉴클레오티드의 변이는 기준 폴리뉴클레오티드와 상이한 폴리뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드의 변이는 자연 발생 변이, 예를 들면 자연 발생 대립유전자 변이이거나 또는 자연 발생하는 것으로 알려져 있지 않은 변이이다. 폴리뉴클레오티드의 이런 비-자연 발생 변이는 폴리뉴클레오티드, 세포 또는 미생물에 적용되는 것을 비롯하여 돌연변이유발 기술로 만들 수 있다. 일반적으로, 차이는 제한적이고, 기준 뉴클레오티드 서열과 변이는 전반적으로 유사하고 다수의 영역에서 상동하다.
본 발명에 다른 폴리뉴클레오티드의 변이에는 SEQ ID No 1이나 3 폴리뉴클레오티드와 적어도 95% 상동한 뉴클레오티드 서열 혹은 SEQ ID No 1 이나 3 폴리뉴클레오티드의 적어도 12개 연속 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 단편 및 SEQ ID No 1이나 3 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID No 1 이나 3 폴리뉴클레오티드의 적어도 12개 연속 뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드 단편과 바람직하게는 적어도 99% 상동한, 좀더 바람직하게는 99.5% 상동한, 가장 바람직하게는 적어도 99.8% 상동한 뉴클레오티드 서열이 포함되지만, 이들에 국한되지 않는다.
변이 폴리뉴클레오티드에 존재하는 뉴클레오티드 변화는 침묵할 수도 있는데, 이는 이들이 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 아미노산을 변화시키지 않는다는 것을 의미한다. 하지만, 뉴클레오티드 변화는 기준 서열에 의해 인코드되는 폴리펩티드에서 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합, 절두를 유발할 수도 있다. 치환, 결실 또는 부가에는 하나이상의 뉴클레오티드가 참여할 수 있다. 변이는 코딩영역, 비-코딩 영역 또는 둘 모두에서 발생할 수 있다. 코딩 영역에서 변화는 보존성 또는 비-보존성 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 유발할 수 있다.
본 발명의 특히 적절한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 성숙 PAPAP 단백질과 동일한 생물학적 기능이나 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩티드, 또는 특정 생물 활성을 유지 혹은 증가시키면서 이차적인 생물 활성을 감소시키는 폴리펩티드를 인코드한다.
폴리뉴클레오티드 단편은 임의의 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 PAPAP 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 이의 변이의 일부분과 완전히 상동한 서열을 보유하는 폴리뉴클레오티드이다. 단편은 PAPAP 유전자의 인트론이나 엑손의 일부일 수 있다. 이는 PAPAP의 조절 영역의 일부일 수도 있다.
이런 단편은 "프리-스탠딩(free-standing)", 다시 말하면 다른 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 다른 폴리뉴클레오티드에 융합되지 않거나, 또는 좀더 큰 단일 폴리뉴클레오티드에서 일부분 또는 영역을 형성할 수도 있다. 실제로, 이들 단편중 몇몇 단편은 좀더 큰 폴리뉴클레오티드상에 존재한다.
선택적으로, 이런 단편은 적어도 8, 10, 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 또는 1000개의 연속 뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
2-폴리펩티드
또한, 본 발명은 돌연변이된 PAPAP 단백질을 비롯하여, 전술한 폴리펩티드의 변이, 단편, 유사체, 유도체에 관한다.
변이는 하나이상의 아미노산 잔기가 보존된 또는 비-보존된 아미노산 잔기로치환되고 이런 치환된 아미노산 잔기가 유전자 코드에 의해 인코드되는 또는 인코드되지 않는 변이; 2) 하나이상의 아미노산 잔기가 치환기를 보유하는 변이; 3) 돌연변이된 PAPAP가 다른 화합물, 예를 들면 폴리펩티드의 반감기를 증가시키는 화합물(예, 폴리에틸렌 글리콜)과 융합되는 변이; 또는 4) 부가된 아미노산이 돌연변이된 PAPAP, 예를 들면 리더나 분비 서열 또는 돌연변이된 PAPAP 혹은 전단백질(preprotein) 서열의 정제에 사용되는 서열에 융합되는 변이일 수 있다.
폴리펩티드 단편은 임의의 폴리펩티드 서열, 바람직하게는 PAPAP 유전자에 의해 인코드되는 폴리펩티드 및 이의 변이의 일부분과 완전히 상동한 서열을 보유하는 폴리펩티드이다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열에서 아미노산 치환의 경우에, 하나 또는 수 개의 아미노산은 "등가의" 아미노산으로 치환될 수 있다. 본원에서 "등가의" 아미노산은 펩티드 화학분야의 당업자가 폴리펩티드의 이차 구조와 수치(hydropathic) 성질이 실질적으로 변화지 않을 것으로 예상할 수 있을 정도로, 유사한 특성을 보유하는 아미노산을 대체할 수 있는 임의의 아미노산을 의미한다. 일반적으로, 다음의 아미노산 군은 등가의 변화를 나타낸다: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Il3, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His.
본 발명에 따른 변형된 PAPAP 펩티드 분자의 특정 구체예에는 단백분해에 저항하는 펩티드 분자, 다시 말하면 -CONH-펩티드 결합이 변화되고 (CH2NH) 환원된 결합, (NHCO) 레트로 인벌소 결합, (CH2-O) 메틸렌-옥시 결합, (CH2-S) 티오메틸렌결합, (CH2CH2) 카바 결합, (CO-CH2) 케토메틸렌 결합, (CHOH-CH2) 하이드록시에틸렌 결합, (N-N) 결합, E-알센 결합 또는 -CH=CH 결합으로 치환되는 펩티드가 포함되지만, 이들에 국한되지 않는다. 또한, 본 발명에는 사람 PAPAP 폴리펩티드 또는 적어도 한 개의 펩티드 결합이 전술한 바와 같이 변형된 이의 단편이나 변이가 포함된다.
이런 단편은 "프리-스탠딩(free-standing)", 다시 말하면 다른 폴리펩티드의 일부 또는 다른 폴리펩티드에 융합되지 않거나, 또는 좀더 큰 단일 폴리펩티드에서 일부분 또는 영역을 형성할 수도 있다. 실제로, 몇몇 단편은 좀더 큰 폴리펩티드상에 존재한다.
본 발명에 다른 폴리펩티드 단편의 대표적 예는 대략 5, 6, 7, 8, 9, 10 내지 15, 10 내지 20, 15 내지 40, 또는 30 내지 55개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드이다. 바람직하게는, PAPAP 단백질에서 적어도 한 개의 아미노산 돌연변이를 갖는 폴리펩티드 단편이다.
핵산 또는 폴리펩티드간 상동성
본원에서 "서열 상동성 %"와 "동질성 %"는 동일한 의미를 갖고 폴리뉴클레오티드와 폴리펩티드간 비교를 의미하며 비교 윈도우에서 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하여 결정하는데, 여기서 비교 윈도우상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부분은 두 서열의 최적 정렬을 위하여 기준 서열(부가 또는 결실을 보유하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 보유할 수도 있다. 서열 상동성 %는 양 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 총수를 측정하여 대합된 위치의 총수를 산출하고, 대합된 위치의 총수를 비교 윈도우에서 위치의 총수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 계산한다. 동질성은 당분야에 공지된 다양한 서열 비교 알고리즘과 프로그램을 활용하여 평가한다. 이런 알고리즘과 프로그램에는 TBLASTN, BLASTIP, FASTA, TFASTA, CLUSTALW (Pearson and Lipman, 1988; Altschul et al., 1990; Thompson et al., 1994; Higgins et al., 1996; Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1993)이 포함되지만, 이들에 국한되지 않는다. 특히 적절한 구체예에서, 단백질과 핵산 서열 동질성은 당분야에 공지된 Basic Local Alignment Tool("BLAST")를 활용하여 평가한다(Karlin and Altschul, 1990; Altschul et al., 1990 1993, 1997).
특히, 5종류의 특정 BLAST 프로그램이 다음의 작업을 실행하는데 활용되고 있다:
(1) BLASTP와 BLAST3은 단백질 서열 데이터베이스와 아미노산 쿼리 서열을 비교한다;
(2) BLASTN은 뉴클레오티드 서열 데이터베이스와 뉴클레오티드 쿼리 서열을 비교한다;
(3) BLASTX는 단백질 서열 데이터베이스와 쿼리 뉴클레오티드 서열(양 가닥)의 6개-프레임 추정 변역 산물을 비교한다;
(4) TBLASTN은 6개의 해독틀(양 가닥)에서 번역된 뉴클레오티드 서열 데이터베이스와 쿼리 단백질 서열을 비교한다;
(5) TBLASTX는 뉴클레오티드 서열 데이터베이스의 6개-프레임 번역과 뉴클레오티드 쿼리 서열의 6개-프레임 번역을 비교한다.
BLAST 프로그램은 유사한 분절을 동정하여 상동성 서열을 동정하는데, 이는 이후 쿼리 아미노 서열이나 핵산 서열과 단백질이나 핵산 서열 데이터베이스로부터 얻은 시험 서열간 "하이-스코어링 분절 쌍"이라고 한다. 하이-스코어링 분절 쌍은 가급적 당분야에 공지된 스코어링 매트릭스로 동정(즉, 정렬)한다. 이용되는 스코어링 매트릭스는 바람직하게는 BLOSUM62 매트릭스(Gonnet et al., 1992; Henikoff and Henikoff, 1993)이다. 조금 덜 선호되긴 하지만, PAM 또는 PAM250 매트릭스 역시 이용할 수 있다(Schwartz and Dayhoff, eds., 1978). BLAST 프로그램은 확인된 모든 하이-스코어링 분절 쌍의 통계학적 유의성을 평가하고, 가급적 사용자-특정된 유의성 한계, 예를 들면 사용자-특정된 동질성 %를 만족시키는 분절을 선택한다. 바람직하게는, 하이-스코어링 분절 쌍의 통계학적 유의성은 Karlin의 통계 유의성 공식(Karlin and Altschul, 1990)을 활용하여 평가한다.
BLAST 프로그램은 디폴트 변수 또는 사용자가 제공한 파라미터로 이용할 수 있다.
엄격한 혼성화 조건
본 발명에 따른 혼성화 핵산을 정의하기 위한 엄격한 혼성화 조건은 다음과 같다:
혼성화 단계는 6 x SSC 완충액, 5 x 덴하르트 용액, 0.5% SDS, 100㎍/㎖ 연어 정자 DNA의 존재하에 65℃에서 달성한다.
혼성화 단계에 이어 4가지 세척 단계를 실시한다:
- 2 x SSC와 0.1% SDS 완충액의 존재하에 65℃에서 5분동안 2회 세척;
- 2 x SSC와 0.1% SDS 완충액의 존재하에 65℃에서 30분동안 1회 세척;
- 2 x SSC와 0.1% SDS 완충액의 존재하에 65℃에서 10분동안 1회 세척.
이들 혼성화 조건은 대략 20개 뉴클레오티드로 구성되는 핵산 분자에 적합하다. 전술한 혼성화 조건은 당업자에게 공지된 기술로 원하는 핵산의 길이에 따라 조정할 수 있다. 가령, 적합한 혼성화 조건은 Hames와 Higgins(1985)의 책자에서 공개한 내용에 따라 조정할 수 있다.
PAPAP 유전자의 게놈 서열
본 발명은 PAPAP의 게놈 서열에 관한다. 본 발명에는 PAPAP 유전자, SEQ ID No 3 서열로 구성되는 PAPAP 게놈 서열, 이들의 상보성 서열, 이들의 단편과 변이체가 포함된다. 이들 폴리뉴클레오티드는 정제, 분리 또는 재조합될 수 있다.
PAPAP 핵산에는 SEQ ID No 3의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체가 포함된다. PAPAP 핵산에는 SEQ ID 3의 1 내지 3038, 1 내지 421, 422 내지 557, 2158 내지 2218, 2620 내지 3039 위치 뉴클레오티드 군에서 선택되는 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체 역시 포함된다. 또한, 본 발명에는 SEQ ID No 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열로 구성되는분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드, 이의 상보성 서열 또는 이의 단편이 포함된다. 일반적으로, SEQ ID No 3 뉴클레오티드 서열과 관련된 뉴클레오티드 차이는 핵산 전체에 무작위로 분포한다. 그럼에도 불구하고, 바람직한 핵산은 SEQ ID No 3 뉴클레오티드 서열과 관련된 뉴클레오티드 차이가 엑손에 포함되는 코딩 서열 외부에 위치하는 핵산이다. 이들 핵산, 이들의 단편과 변이체는 테스트 시료에서 PAPAP 유전자 사본의 존재를 검출하는 또는 대안으로 PAPAP 서열에서 표적 뉴클레오티드 서열을 증폭하기 위한 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브로 사용될 수 있다. 본 발명의 다른 목적은 전술한 엄격한 혼성화 조건하에 SEQ ID No 3 뉴클레오티드 서열과 혼성화되는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산, 이의 상보성 서열 또는 변이체에 관한다.
본 섹션의 타이틀이 "PAPAP 유전자의 게놈 서열"이긴 하지만, 양 측면에서 PAPAP의 게놈 서열에 접하는 또는 2개이상의 이런 게놈 서열간 임의의 크기와 서열의 핵산 단편 역시 본 섹션에서 밝힌 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
PAPAP cDNA 서열
PAPAP 유전자의 발현은 적어도 한가지 종류의 mRNA를 생산하는데, 이의 핵산 서열은 SEQ ID No 1에 제시한다.
본 발명의 다른 목적은 SEQ ID No 1 뉴클레오티드 서열로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산, 이의 상보성 서열, 대립유전자 변이체와 단편이다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에는 SEQ ID No 1의 서열로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 PAPAP cDNA가 포함된다. 특히 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에는 SEQ ID No 1의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체가 포함된다. 또한, 본 발명의 핵산에는 SEQ ID No 1의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체가 포함되는데, 여기서 상기 연속 뉴클레오티드는 SEQ ID No 1: 1 내지 140, 141 내지 460, 460 내지 690, 87 내지 346, 691 내지 1104 뉴클레오티드 위치중에서 적어도 1, 2, 3, 5 또는 10개를 포함한다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에는 SEQ ID No 1의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체가 포함되는데, 여기서 상기 연속 뉴클레오티드는 이중대립유전자 마커를 포함한다.
또한, 본 발명은 SEQ ID No 1 폴리뉴클레오티드와 적어도 95% 뉴클레오티드 상동성, 바람직하게는 99% 뉴클레오티드 상동성, 좀더 바람직하게는 99.5% 뉴클레오티드 상동성, 가장 바람직하게는 99.8% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산, 이의 상보성 서열 또는 생물학적 활성 단편에 관한다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 엄격한 조건하에 SEQ ID No 1 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산, 이의 상보성 서열, 변이체 또는 생물학적 활성 단편에 관한다.
SEQ ID No 1의 cDNA는 SEQ ID No 1의 1번 위치 뉴클레오티드에서 시작하여 86번 위치 뉴클레오티드에서 종결되는 5'-UTR 영역을 포함한다. SEQ ID No 1의 cDNA는 347번 위치 뉴클레오티드에서 시작하여 1104 위치 뉴클레오티드에서 종결되는 3'-UTR 영역을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 SEQ ID No 1의 1085 위치 뉴클레오티드에서 시작하여 1104 위치 뉴클레오티드에서 종결된다.
결과적으로, 본 발명은 PAPAP cDNA 5'UTR의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산, 이의 상보성 서열 또는 대립유전자 변이체에 관한다. 또한, 본 발명은 PAPAP cDNA 3'UTR의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산, 이의 상보성 서열 또는 대립유전자 변이체에 관한다.
본 섹션의 타이틀이 "PAPAP cDNA 서열"이긴 하지만, 양 측면에서 PAPAP의 게놈 서열에 접하는 또는 2개이상의 이런 게놈 서열간 임의의 크기와 서열의 핵산 단편 역시 본 섹션에서 밝힌 폴리뉴클레오티드로 구성될 수 있다.
코딩 영역
PAPAP 개방해독틀은 SEQ ID No 1의 상응하는 mRNA에 포함된다. 좀더 구체적으로, 효과적인 PAPAP 코딩 서열(CDS)은 SEQ ID No 1의 87번 위치 뉴클레오티드(ATG 코돈의 첫 번째 뉴클레오티드)와 346번 위치 뉴클레오티드(TGA 코돈의 마지막 뉴클레오티드)간 영역을 포함한다. 본 발명은 SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 인코드하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드에 관한다.
PAPAP 유전자의 코딩 서열을 포함하는 전술한 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 신호의 조절하에 원하는 숙주 세포 또는 숙주 미생물에서 발현될 수 있다. 발현 신호는 본 발명의 PAPAP 유전자상의 조절 영역에 포함된 발현 신호이거나 또는 외인성 조절 핵산 서열이다. 이런 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 신호하에 발현 및/또는 증폭을 위한 벡터에 삽입될 수도 있다.
PAPAP의 조절 서열
전술한 바와 같이, PAPAP 유전자의 게놈 서열은 상기 유전자의 3가지 엑손을 포함하는 PAPAP 코딩 영역에 접하는 비-코딩 5-측부영역과 비-코딩 3-측부영역에 조절 서열을 보유한다.
5'와 3' 조절 영역으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드는 테스트 시료에서 SEQ ID No 3의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편의 1개이상 사본의 존재를 검출하는데 유용하다.
PAPAP에 포함된 5'조절 영역의 프로모터 활성은 후술한 바와 같이 평가할 수 있다.
SEQ ID No 3의 유관한 생물학적 활성 폴리뉴클레오티드 단편 또는 변이체를 동정하기 위하여, 당업자는 마커 유전자(즉, 베타 갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 등)를 보유하는 재조합 벡터의 용도를 설명하는 Sambrook et al.(Sambrook, 1989)을 참조하는데, 상기 마커 유전자의 발현은 SEQ ID No 3의 생물학적 활성 폴리뉴클레오티드 단편 또는 변이체의 조절하에 검출된다. PAPAP 유전자의 첫 번째 엑손의 상류에 위치한 게놈 서열은 적절한 프로모터 리포터 벡터, 예를 들면 pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer, pβgal-Basic, pβgal-Enhancer, pEGEP-1 프로모터 리포터 벡터(Clontech); 또는 pGL2-Basic, pGL3-Basic 무-프로모터 루시페라제 리포터 유전자 벡터(Promega)로 클론시킨다. 간단히 말하면, 이들 프로모터 리포터 벡터 각각은 쉽게 분석가능한 단백질, 예를 들면 배출된 알칼리성 포스파타제, 루시페라제, β-갈락토시다제 또는 녹색 형광 단백질을 인코드하는 리포터 유전자의 상류에 위치하는 다중 클로닝 부위를 보유한다. PAPA 코딩 영역의 상류 서열은 양 방향으로 리포터 유전자 상류의 클로닝 부위로 삽입되고 적합한 숙주 세포에 도입된다. 리포터 단백질의 수준은 클로닝 부위에 삽입체가 없는 벡터로부터 얻어진 수준과 비교 분석한다. 대조군 벡터와 비교하여 삽입체를 보유하는 벡터에서 상승된 발현 수준의 존재는 삽입체에서 프로모터의 존재를 암시한다. 필요한 경우, 상류 서열은 약한 프로모터 서열로부터 전사 수준을 증가시키기 위한 인헨서를 보유하는 벡터에 클론할 수 있다. 삽입체가 없는 벡터에서 관찰되는 수준보다 현저하게 높은 발현 수준은 프로모터 서열이 삽입된 상류 서열에 존재한다는 것을 암시한다.
상류 게놈 DNA에서 프로모터 서열은 통상적인 기술, 예를 들면 엑소뉴클레아제 III 또는 적합한 제한 엔도뉴클레아제 절단으로 상류 DNA에서 중첩(nested) 5' 및/또는 3' 결실을 작제함으로써 추가로 정의한다. 생성된 결실 단편은 프로모터 리포터 벡터에 삽입하여 결실이 프로모터 활성을 감소 또는 소멸시키는 지를 확인할 수 있다(Coles et al.(1998)). 이런 방식으로, 경계를 정의할 수 있다. 원하는 경우, 프로모터에서 잠재적인 개별 조절 부위는 개별적으로 또는 복합적으로 프로모터내에서 잠재적인 전사 인자를 소멸시키는 특정 부위 돌연변이유발 또는 링커 스캐닝으로 확인할 수 있다. 전사 수준에 대한 이들 돌연변이의 효과는 돌연변이를 프로모터 리포터 벡터상의 클로닝 부위로 삽입하여 확인할 수 있다. 이런 유형의 분석법은 당분야에 공지된 것이다(WO 97/17359, US Patent No. 5, 374,544; EP 582 796; US Patent No. 5,698,389; US 5,643,746; US Patent No. 5,502,176; US Patent 5,266,488;).
PAPAP 유전자의 프로모터의 강도와 특이성은 상이한 유형의 세포와 조직에서 PAPAP 프로모터에 작동적으로 연결된 검출가능한 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 통하여 평가할 수 이TEk. 검출가능한 폴리뉴클레오티드는 사전결정된 올리고뉴클레오티드 프로브와 특이적으로 혼성화되는 폴리뉴클레오티드, 또는 PAPAP 폴리펩티드, 이의 단편 혹은 변이체를 비롯한 검출가능한 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 이런 유형의 분석법은 당분야에 공지된 것이다(US Patent No. 5,502,176; US Patent No. 5,266,488). 이런 방법중 일부는 하기에 상술한다.
PAPAP 코딩 영역의 5' 말단과 3' 말단에 위치하는 조절 요소를 보유하는 폴리뉴클레오티드는 관심있는 이질성 폴리뉴클레오티드의 전사와 번역 활성을 조절하는데 효과적으로 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 5'와 3' 조절 영역에서 선택되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 분리되거나 정제된 핵산, 이의 상보성 서열, 생물학적 활성 단편 또는 변이체에 관한다. 한 측면에서, "5' 조절 영역"은 SEQ ID No 3의 1 내지 421번 위치에존재하는 뉴클레오티드로 구성된다. 한 측면에서, "3' 조절 영역은 SEQ ID No 3의 3040 내지 3189번 위치에 존재하는 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
또한, 본 발명은 5'와 3' 조절 영역에서 선택되는 폴리뉴클레오티드와 적어도 95% 뉴클레오티드 상동성, 바람직하게는 99% 뉴클레오티드 상동성, 좀더 바람직하게는 99.5% 뉴클레오티드 상동성, 가장 바람직하게는 99.8% 뉴클레오티드 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 분리되거나 정제된 핵산, 이의 상보성 서열, 변이체 또는 생물학적 활성 단편에 관한다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 엄격한 조건하에 5'와 3' 조절 영역에서 선택되는 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 핵산, 이의 상보성 서열, 변이체 또는 생물학적 활성 단편에 관한다.
바람직하게는, 5' 조절 영역의 단편은 대략 1500 내지 1000개, 바람직하게는 500개, 좀더 바람직하게는 400개, 이보다 좀더 바람직하게는 300개, 가장 바람직하게는 200개의 뉴클레오티드를 보유한다.
바람직하게는, 3' 조절 영역의 단편은 적어도 50, 100, 150, 200, 300, 400개의 염기이다.
SEQ ID No 3의 "생물학적 활성" 폴리뉴클레오티드 유도체는 재조합 숙주 세포에서 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 조절 영역으로 기능하는 상기 폴리뉴클레오티드의 단편을 포함하는 또는 상기 단편으로 구성되는 폴리뉴클레오티드이다. 이는 인헨서 또는 억제체로 작용할 수 있다.
본 발명에서, 조절 폴리뉴클레오티드가 전사와 번역 조절 정보를 담고 있는뉴클레오티드 서열을 보유하고 이런 서열이 원하는 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열 또는 원하는 폴리뉴클레오티드에 "작동적으로 연결되는" 경우에 이런 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현하기 위한 조절 영역으로 "기능한다".
본 발명의 조절 뉴클레오티드는 Sambrook et al.(1989)에서 밝힌 바와 같이 적절한 제한 효소를 이용한 절단으로 SEQ ID No 3의 뉴클레오티드 서열로부터 만들 수 있다. 조절 폴리뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제 효소, 예를 들면 Bal31(Wabiko et al., 1986)로 SEQ ID No 3을 절단하여 만들 수도 있다. 또한, 이들 조절 폴리뉴클레오티드는 본원에서 밝힌 핵산 화학적 합성으로 만들 수 있다.
본 발명에 따른 조절 폴리뉴클레오티드는 원하는 숙주 세포 또는 숙주 미생물에서 코딩 서열을 발현하는데 사용할 수 있는 재조합 발현 벡터의 일부분이 될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 본원에서 제시한다.
바람직하게는, 본 발명의 5'-조절 폴리뉴클레오티드는 PAPAP cDNA의 5-비번역 영역(5'-UTR), 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 3'-조절 폴리뉴클레오티드는 PAPAP cDNA의 3-비번역 영역(3'-UTR), 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다.
본 발명의 다른 목적은 다음과 같이 구성되는 분리된 또는 정제된 핵산을 제공하는 것이다:
a) 다음에서 선택되는 조절 뉴클레오티드 서열로 구성되는 핵산:
(i) 5' 조절 영역의 폴리뉴클레오티드로 구성되는 뉴클레오티드
서열 또는 이의 상보성 서열;
(ii) 5' 조절 영역의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95%의
뉴클레오티드 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드로 구성되는
뉴클레오티드 서열 또는 이의 상보성 서열;
(iii) 엄격한 혼성화 조건하에 5' 조절 영역의 뉴클레오티드 서열과
혼성화되는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 뉴클레오티드 서열 또는
이의 상보성 서열;
(iv) (ⅰ),(ⅱ), (ⅲ) 뉴클레오티드의 생물학적 활성 단편 또는 변이체
b) 상기 (a) 정의된 핵산에 작동적으로 연결되고 원하는 폴리펩티드 또는 핵산을 인코드하는 폴리뉴클레오티드;
c) 선택적으로, 3'-조절 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 PAPAP 유전자의 3'-조절 폴리뉴클레오티드로 구성되는 핵산.
상기 정의된 핵산의 특정 구체예에서, 핵산은 PAPAP cDNA의 5'-비번역 영역(5'-UTR), 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다.
상기 정의된 핵산의 다른 특정 구체예에서, 핵산은 PAPAP cDNA의 3'-비번역 영역(3'-UTR), 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함한다.
5'-비번역 영역(5'-UTR)의 조절 폴리뉴클레오티드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체는 원하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 작동적으로 연결시킨다.
3'-비번역 영역(3'-UTR)의 조절 폴리뉴클레오티드, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체는 원하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 작동적으로 연결시킨다.
전술한 핵산에 의해 인코드되는 원하는 폴리펩티드는 다양한 특성 또는 기원을 보일 수 있는데, 여기에는 진핵과 원핵 기원의 단백질이 포함된다. PAPAP 조절 영역의 조절하에 발현되는 폴리펩티드에는 박테리아, 진균 또는 바이러스 항원이 포함된다. 또한, 진핵 단백질, 예를 들면 "하우스 키핑" 단백질과 같은 세포내 단백질; 수용체와 같은 막-결합된 단백질; 내인성 매개물질(예, 사이토킨)과 같은 배출된 단백질이 포함된다. 원하는 폴리펩티드는 PAPAP 단백질, 특히 SEQ ID No 2의 아미노산 서열로 구성되는 단백질, 이의 단편 또는 변이체일 수 있다.
전술한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 원하는 핵산, 일반적으로 RNA 분자는 원하는 코딩 폴리뉴클레오티드, 예를 들면 PAPAP 코딩 서열에 상보적이고, 따라서 안티센스 폴리뉴클레오티드로 유용하다.
이런 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 또는 숙주 미생물에서 원하는 폴리펩티드 또는 원하는 핵산을 발현하기 위한 재조합 발현 벡터에 포함될 수 있다. 이런 폴리뉴클레오티드를 포함하는데 적합한 재조합 벡터는 전술한 바 있다.
폴리뉴클레오티드 구조체
본원에서 ""폴리뉴클레오티드 구조체"와 "재조합 폴리뉴클레오티드"는 동일한 의미를 갖고 인위적으로 설계되고 최초 고유 환경에서 연속 뉴클레오티드 서열로 발견되지 않는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 선형이나 환형의 분리되거나 정제된 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
재조합 세포 숙주와 유전자도입 동물에서 시간적, 공간적 PAPAP 유전자 발현을 조절하는 DNA 구조체
세포 수준과 다세포 미생물 수준에서 PAPAP 단백질 합성의 결핍으로 인한 생리적, 표현형적 결과를 조사하기 위하여, 본 발명에는 PAPAP 게놈 서열이나 cDNA의 특정 대립유전자 및 SEQ ID No 1과 3의 PAPAP 뉴클레오티드 서열이나 이의 단편과 관련하여 하나이상 염기의 치환, 결실 혹은 부가를 보유하는 상기 게놈 서열이나 cDNA 사본의 조건 발현을 가능하게 하는 DNA 구조체와 재조합 벡터가 포함되는데, 여기서 염기 치환, 결실, 부가는 엑손, 인트론 또는 조절 서열, 바람직하게는 5'-조절 서열, PAPAP 게놈 서열의 엑손 또는 SEQ ID No 1의 PAPAP cDNA이내에 위치한다. 적절한 구체예에서, PAPAP 서열은 대립유전자 마커를 포함한다.
본 발명에는 본 발명에서 밝힌 폴리뉴클레오티드중 임의 하나로 구성되는 재조합 벡터가 포함된다. 좀더 구체적으로, 본 발명에 다른 폴리뉴클레오티드 구조체는 "PAPAP 유전자의 게놈 서열" 섹션, "PAPAP cDNA 서열" 섹션, "코딩 영역" 섹션, "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머" 섹션에서 밝힌 폴리뉴클레오티드중 임의 하나로 구성될 수 있다.
바람직한 첫 번째 DNA 구조체는 Gossen et al.(1992, 1995)과 Furth et al.(1994)에서 밝힌 바와 같이 PAPAP 유전자 발현을 조절하는 대장균(E. Coli) 트랜스포손 Tn10으로부터 유래된 테트라사이클린 저항성 오페론tet에 기초한다. 이런 DNA는 Tn10으로부터 유래된 7개의tet오퍼레이터 서열(tetop)을 보유하는데, 이들 서열은 PAPAP 유전자의 최소 프로모터 또는 5'-조절 서열에 융합되고, 상기 최소 프로모터 또는 PAPAP 조절 서열은 센스 혹은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 PAPAP 폴리펩티드 혹은 이의 펩티드 단편을 비롯한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된다. 이런 DNA 구조체는 동일 세포가 프로모터, 예를 들면 HCMVIE1 인헨서/프로모터 또는 MMTV-LTR의 조절하에 단순 포진 바이러스의 바이러스 단백질 VP16의 활성화 도메인에 융합된 야생형(tTA) 또는 돌연변이(rTA) 억제체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성되는 경우에, 관심있는 뉴클레오티드 서열에 대한 조건 발현 시스템으로 기능한다. 실제로, 본 발명의 바람직한 DNA 구조체는tet오퍼레이터 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 tTA 또는 rTA 억제체를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된다.
특정 구체예에서, 조건 발현 DNA 구조체는 돌연변이 테트라사이클린 억제체 rTA를 인코드하는 서열을 보유하는데, 관심있는 폴리뉴클레오티드의 발현은 테트라사이클린의 부재하에서는 침묵하고 이의 존재하에서는 유도된다.
상동성 재조합을 가능하게 하는 DNA 구조체: 치환 벡터
바람직한 두 번째 DNA 구조체는 5'-말단에서 3'-말단까지 다음과 같이 구성된다: (a) PAPAP 게놈 서열로 구성되는 제 1 뉴클레오티드 서열; (b) 양성 선별 마커, 예를 들면 네오마이신 저항성(neo) 마커로 구성되는 뉴클레오티드 서열; (c) PAPAP 게놈 서열로 구성되고 게놈에서 (a) PAPAP 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는 제 2 뉴클레오티드 서열.
적절한 구체예에서, 상기 DNA 구조체는 (a) 뉴클레오티드 서열 상류 또는 (c) 뉴클레오티드 서열 하류에 위치하는 음성 선별 마커로 구성된다. 바람직하게는, 음성 선별 마커는 티미딘 키나아제(tk) 유전자(Thomas et al., 1986), 히그로마이신 베타 유전자(Te Riele et al., 1990), hprt 유전자(Van der Lugt et al., 1991; Reid et al., 1990) 또는 디프테리아 독소 A 단편(Dt-A) 유전자(Nada et al., 1993; Yagi et al. 1990)로 구성된다. 바람직하게는, 양성 선별 마커는 PAPAP 단백질을 인코드하는 서열을 깨뜨리기 위하여 PAPAP 엑손 서열내에 위치시킨다. 이들 치환 벡터는 Thomas et al.(1986; 1987); Mansour et al.,(988); Koller et al.(1992)에서 기술한다.
제 1과 제 2 뉴클레오티드 서열 (a)와 (c)는 PAPAP 조절 서열, 인트론 서열, 엑손 서열, 또는 조절 및/또는 인트론 및/또는 엑손 서열을 포함하는 서열내에 독립적으로 위치시킬 수 있다. 뉴클레오티드 서열 (a)와 (c)의 크기는 1 내지 50kb, 바람직하게는 1 내지 10kb, 좀더 바람직하게는 2 내지 6kb, 가장 바람직하게는 2 내지 4kb이다.
상동성 재조합을 가능하게 하는 DNA 구조체: Cre-LoxP 시스템
이들 신규한 DNA 구조체는 P1 파지의 부위 특이적 재조합 시스템을 이용한다. P1 파지는 34 염기쌍 loxP와 특이적으로 상호작용하는 Cre라고 하는 재조합효소(recombinase)를 보유한다. loxP 부위는 8bp 보존된 서열에 의해 분리되는 13bp의 팰린드롬 서열 2개로 구성된다(Hoess et al., 1986). 동일 배향된 2개의 loxP 부위사이에서 Cre 효소에 의한 재조합은 DNA 단편의 결실을 초래한다.
상동성 재조합 기술과 짝으로 사용되는 Cre-loxP 시스템은 Gu et al.(1993, 1994)에서 처음으로 기술되었다. 간단히 말하면, 게놈의 표적 위치로 삽입되는 뉴클레오티드 서열은 동일 배향되고 재조합 게놈으로부터 절단되는 뉴클레오티드 서열의 각 말단에 위치하는 적어도 2개의 loxP 부위를 보유한다. 절단은 재조합 세포 숙주의 핵내에 재조합효소(Cre) 효소의 존재를 필요로 한다. 재조합효소 효소는 (a) Araki et al.(1995)에서 밝힌 바와 같이 Cre 효소를 원하는 세포에 직접 주사하여 또는 Baubonis et al.(1993)에서 밝힌 바와 같이 상기 효소의 세포로의 리포펙션으로 이런 효소를 함유하는 배양 배지에서 재조합 세포 숙주를 배양하고; (b) 재조합 세포 숙주에서 기능하는 프로모터에 작동적으로 연결된Cre코딩 서열을 포함하는 벡터로 숙주 세포를 트랜스펙션시키고, 상기 프로모터는 상기 세포 숙주에서 선택적으로 유도되고, 상기 벡터는 Gu et al.(1993)와 Sauer et al.(1988)에서 밝힌 바와 같이 재조합 세포 숙주에 도입되고; (c) 재조합 숙주 세포에서 기능하는 프로모터에 작동적으로 연결된Cre코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 세포 숙주의 게놈에 도입하고, 상기 프로모터는 상기 숙주 세포에서 선택적으로 유도되고, 상기 폴리뉴클레오티드는 Gu et al.(1994)에서 밝힌 바와 같이 무작위 삽입 또는 상동성 재조합으로 세포 숙주의 게놈에 삽입된다.
특정 구체예에서, 상동성 재조합으로 PAPAP 유전자에 삽입되는 서열을 포함하는 벡터는 선별 마커가 동일 배향의 loxP가 측면에 접하도록 작제하는데, Cre 효소 처리로 선별 마커는 제거하면서 상동성 재조합에 의해 삽입된 PAPAP 서열은 존속하도록 하는 것이 가능하다. 한번 더, 2개의 선택 마커가 필요하다: 재조합 현상을 선별하는 양성 선별 마커 및 상동성 재조합 현상을 선별하는 음성 선별 마커. Cre-loxP 시스템을 이용한 벡터와 방법은 Zou et al.(1994)에서 기술한다.
따라서, 바람직한 본 발명의 세 번째 DNA 구조체는 5'-말단에서 3'-말단까지 다음과 같이 구성된다: (a) PAPAP 게놈 서열로 구성되는 제 1 뉴클레오티드 서열; (b) 양성 선별 마커를 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 뉴클레오티드 서열, 상기 뉴클레오티드 서열은 재조합효소에 의해 인식되는 부위, 예를 들면 loxP 부위를 정의하는 2개의 서열을 추가로 포함하고, 상기 두 부위는 동일 배향으로 위치하고; (c) PAPAP 게놈 서열로 구성되고 게놈에서 (a) PAPAP 뉴클레오티드 서열의 하류에 위치하는 제 2 뉴클레오티드 서열.
바람직하게는, 재조합효소에 의해 인식되는 부위, 예를 들면 loxP 부위를 정의하는 서열은 (b) 뉴클레오티드 서열에서, 조건 절단이 요구되는 뉴클레오티드 서열에 인접하는 위치에서 존재한다. 특정 구체예에서, 2개의 loxP 부위는 상동성 재조합이후 원하는 시점에 절단을 가능하게 하기 위하여 각각의 양성 선별 마크 서열에 위치시킨다.
전술한 세 번째 DNA 구조체를 이용한 방법의 적절한 구체예에서, 재조합효소에 의해 인식되는 두 부위, 바람직하게는 두 개의 loxP 부위가 측면에서 접하는 폴리뉴클레오티드 단편의 절단은 Gu et al.(1994)에서 밝힌 바와 같이 재조합 숙주 세포 게놈에서 프로모터 서열, 바람직하게는 유도성 프로모터, 좀더 바람직하게는 조직-특이적 프로모터 서열, 가장 바람직하게는 유도성이고 조직-특이적인 프로모터 서열에 작동적으로 연결된 Cre 효소를 인코드하는 서열의 존재로 인하여 원하는시점에 실행된다.
재조합 숙주 세포의 게놈에서 Cre 효소의 존재는 Gu et al.(1994)에서 밝힌 바와 같이 2마리의 유전자도입 동물, 전술한 바와 같이 loxP 부위를 보유하는 PAPAP-유래된 서열을 포함하는 제 1 유전자도입 동물 및 적합한 프로모터 서열에 작동적으로 연결된Cre코딩 서열을 포함하는 제 2 유전자도입 동물의 번식으로부터 유래할 수 있다.
또한, Cre 효소 발현의 공간적-시간적 조절은 Graham(1995)과 Kanegae et al.(1995)에서 밝힌 바와 같이 Cre 유전자를 보유하여 세포의 감염 또는 장기의in vivo감염, Cre 효소의 전달을 가능하게 하는 아데노바이러스 기초한 벡터로 달성할 수 있다.
전술한 DNA 구조체는 본 발명의 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 PAPAP 게놈 서열이나 PAPAP cDNA 서열, 가장 바람직하게는 PAPAP 게놈이나 cDNA 서열의 변형된 사본을 표적 게놈의 사전결정된 위치에 도입하여 표적 유전자의 변형된 사본 발생 또는 상동성 재조합이 일어나도록 할만큼 상동한 다른 사본에 의한 표적 유전자 사본의 치환(적중 상동성 재조합)을 유도하는데 사용할 수 있다. 특정 구체예에서, 전술한 DNA 구조체는 적어도 1개의 이중대립유전자 마커를 포함하는 PAPAP 게놈 서열 또는 PAPAP cDNA 서열을 도입하는데 사용할 수 있다.
핵 안티센스 DNA 구조체
본 발명의 벡터를 함유하는 다른 조성물은 핵산 서열 SEQ ID No cDNA의 올리고뉴클레오티드 단편, 바람직하게는 PAPAP 유전자의 개시 코돈을 포함하는 단편을상응하는 PAPAP 유전자의 발현을 저해하는 안티센스 도구로써 포함한다. 본 발명에 다른 안티센스 폴리뉴클레오티드를 이용하는 바람직하는 방법은 Sczakiel et al.(1995)에서 밝힌 과정 또는 WO 95/24223에서 밝힌 과정이다.
바람직하게는, 안티센스 도구는 PAPAP mRNA의 5'말단에 상보적인 폴리뉴클레오티드(15-200bp)에서 선택된다. 한 구체예에서, 원하는 표적 유전자의 상이한 부분에 상보적인 개별 안티센스 폴리뉴클레오티드의 조합을 사용한다.
본 발명에 따른 바람직한 안티센스 폴리뉴클레오티드는 번역 개시 코돈 ATG 또는 접합 부위를 보유하는 PAPAP mRNA의 서열에 상보적이다. 본 발명에 따른 다른 바람직한 안티센스 폴리뉴클레오티드는 PAPAP mRNA의 접합 부위에 상보적이다.
바람직하게는, 본 발명의 안티센스 폴리뉴클레오티드는 Liu et al.(1994)에서 밝힌 바와 같이 자가-절단 리보자임 서열로 치환되는 3' 폴리아데닐화 신호를 갖고, 따라서 RNA 중합효소 II 전사체는 3' 말단에 poly(A)가 없고, 이들 안티센스 폴리뉴클레오티드는 핵으로 배출될 수 없다. 적절한 구체예에서, 이들 PAPAP 안티센스 폴리뉴클레오티드는 Eckner et al.(1991)에서 밝힌 구조와 같이 절단된 전사체를 3'-5' 엑소뉴클레아제 분해로부터 안정화시키는 히스톤 스템-루프 구조를 리보자임 카세트에 포함한다.
올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머
PAPAP 유전자로부터 유래된 폴리뉴클레오티드는 테스트 시료에서 SEQ ID No 1이나 3의 한 개이상 사본, 이의 단편, 보체 또는 변이체의 존재를 검출하는데 유용하다.
본 발명의 특히 바람직한 프로브와 프라이머에는 SEQ ID No 3의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체가 포함된다. 프로브와 프라이머에는 SEQ ID 3의 1 내지 3038, 1 내지 421, 422 내지 557, 2158 내지 2218, 2620 내지 3039 위치 뉴클레오티드 군에서 선택되는 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체 역시 포함된다. 본 발명의 다른 바람직한 프로브와 프라이머에는 SEQ ID No 1의 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500, 1000개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드 또는 이의 보체가 포함되는데, 여기서 상기 연속 뉴클레오티드는 SEQ ID No 1: 1 내지 140, 141 내지 460, 460 내지 690, 87 내지 346, 691 내지 1104 뉴클레오티드 위치중에서 적어도 한가지를 포함한다.
따라서, 본 발명은 엄격한 혼성화 조건하에 SEQ ID No 1과 3의 뉴클레오티드 서열, 이의 상보성 서열 또는 변이체와 특이적으로 혼성화되는 핵산 프로브에 관한다.
한 구체예에서, 본 발명에는 SEQ ID No 1, 3중 한가지의 8 내지 50개 연속 뉴클레오티드로 구성되는 또는 이를 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드가 포함되는데, 여기서 상기 연속 뉴클레오티드는 PAPAP-관련된 이중대립유전자 마커 또는 PAPAP와 연쇄 불균형의 이중대립유전자 마커를 보유한다; 선택적으로, 연속 뉴클레오티드는 18 내지 35개 뉴클레오티드이고 이중대립유전자 마커는 상기 폴리뉴클레오티드 중심의 4번 뉴클레오티드에 존재한다; 선택적으로, 연속 뉴클레오티드는 25개 뉴클레오티드이고 이중대립유전자 마커는 상기 폴리뉴클레오티드 중심에 존재한다; 선택적으로, 연속 뉴클레오티드의 3'말단은 상기 뉴클레오티드의 3'말단에 존재한다; 선택적으로, 연속 뉴클레오티드의 3'말단은 상기 뉴클레오티드의 3'말단에 존재하고 이중대립유전자 마커는 상기 폴리뉴클레오티드의 3'말단에 존재한다.
다른 구체예에서, 본 발명에는 SEQ ID No 1, 3중 한가지의 8 내지 50개 연속 뉴클레오티드로 구성되는 또는 이를 포함하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드가 포함되는데, 여기서 상기 연속 뉴클레오티드의 3'말단은 상기 폴리뉴클레오티드의 3'말단에 위치하고, 상기 폴리뉴클레오티드의 3'말단은 PAPAP-관련된 이중대립유전자 마커 또는 PAPAP와 연쇄 불균형의 이중대립유전자 마커 상류의 20개 뉴클레오티드이내에 위치한다.
다른 구체예에서, 본 발명에는 혼성화 분석, 염기서열분석, SEQ ID No 1, 3이나 이의 보체에서 PAPAP-관련된 이중대립유전자 마커에서 뉴클레오티드의 정체를 확인하기 위한 효소-기초한 미스매치 검출 방법에 사용되는 폴리뉴클레오티드 및 SEQ ID No 1,3 이나 이의 보체에서 PAPAP-관련된 이중대립유전자 마커를 포함하는 뉴클레오티드의 분절을 증폭하는데 사용되는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본 발명은 PAPAP-관련된 이중대립유전자 마커에서 뉴클레오티드의 정체를 확인에서 분석, 바람직하게는 혼성화 분석, 염기서열분석, 마이크로염기서열분석 또는 효소-기초한 미스매치 검출 분석 및 PAPAP-관련된 이중대립유전자 마커를 포함하는 뉴클레오티드 분절의 증폭에서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한다.
본 발명에 따른 프로브 또는 프라이머는 8 내지 1000개의 뉴클레오티드, 좀더 구체적으로, 적어도 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 250, 500, 1000의 뉴클레오티드를 갖는다. 좀더 구체적으로, 이들 프로브와 프라이머의 길이는 8, 10, 15, 20 또는 30 내지 100, 바람직하게는 10 내지 50, 좀더 바람직하게는 15 내지 30개의 뉴클레오티드이다. 좀더 짧은 프로브와 프라이머는 표적 핵산 서열에 대한 특이성이 결핍되는 경향이 있고, 일반적으로 주형과 안정적인 하이브리드 복합체를 형성하는데 좀더 낮은 온도를 필요로 한다. 좀더 긴 프로브와 프라이머는 만드는데 비용이 많이 들고, 때때로 자가-혼성화되어 헤이핀 구조를 형성할 수 있다. 특정한 분석 조건하에 프라이머와 프로브의 적합한 길이는 당업자가 경험적으로 판단할 수 있다.
안정한 하이브리드의 형성은 DNA의 융점(Tm)에 의존한다. Tm은 프라이머 또는 프로브의 길이, 용액의 이온력, G+C 함량에 따라 달라진다. 프라이머 또는 프로브의 G+C 함량이 높을수록 융점이 높은데, 그 이유는 G:C 쌍은 3개의 수소 결합을 갖는 반면 A:T는 2개의 수소 결합을 갖기 때문이다. 본 발명의 프로브에서 GC 함량은 10 내지 75%, 바람직하게는 35 내지 60%, 좀더 바람직하게는 40 내지 55%이다.
프라이머와 프로브는 임의의 적절한 방법, 예를 들면 적합한 서열의 클로닝과 제한 및 Narang et al.(1979)의 포스포디에스터 방법, Brown et al.(1979)의 포스포디에스터 방법, Beaucage et al.(1981)의 디에틸포스포라미디트 방법, EP 0 707 592에서 밝힌 고체 서포트 방법과 같은 방법에 의한 직접적인 화학적 합성으로 만들 수 있다.
검출 프로브는 일반적으로 핵산 서열 또는 하전되지 않은 핵산 유사체, 예를 들면 국제 특허 출원 WO 92/20702에 개시된 펩티드 핵산, 미국 특허 5, 185,44; 5,034,506, 5,142,047에서 기술된 모폴리노 유사체이다. 프로브는 dNTP가 추가로 부가될 수 없다는 점에서 "확장-불가능"하다. 본질적으로 유사체는 확장-불가능하고, 핵산 프로브는 3'말단을 변형시켜 하이드록실기가 더 이상 신장에 참여할 수 없도록 함으로써 확장-불가능하게 만들 수 있다. 가령, 프로브의 3'말단은 포획이나 검출 라벨로 기능화시켜 하이드록실기를 소모 또는 차단할 수 있다. 대안으로, 3'하이드록실기는 절단, 치환 또는 변형할 수 있다(U.S. Patent No. 07/049,061, filed April 19, 1993).
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 현미경적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단으로 탐지할 수 있는 당분야에 공지된 라벨을 통합하여 표지할 수 있다. 가령, 유용한 라벨에는 방사성 물질(예,32P,35S,3H,125I), 형광 염료(예, 5-브로모디속시우리딘, 플루레신, 아세틸아미노플루오렌, 디옥시제닌) 또는 비오틴이 포함된다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드는 3'와 5'말단에 표지한다. 핵산 단편의 비-방사성 표지는 프랑스 특허 No. FR-7810975, Urdea et al(1988);Sanchez-Pescador et al(1988)에서 기술한다. 이에 더하여, 본 발명에 따른 프로브는 신호 증폭을 가능하게 하는 구조적 특징을 가질 수 있는데, 이런 구조적 특징은 예로써 Urdea et al. in 1991 또는 EP 0 225 807 (Chiron)에서 밝힌 것과 같은 분지쇄 DNA 프로브이다.
라벨은 프라이머를 포획하여 고형 서포트에 프라이머 또는 프라이머 신장 산물, 예를 들면 증폭된 DNA의 고정을 용이하게 하는데 사용할 수 있다. 포획 라벨은 프라이머 또는 프로브에 부착되는데, 고체상 시약의 특이적 결합 구성원(예, 비오틴과 스트렙타비딘)과 결합쌍을 형성하는 특이적인 결합 구성원일 수 있다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 또는 프로브에 의해 포함되는 라벨의 종류에 따라, 표적 DNA를 포획 또는 검출하는 것이 가능하다. 게다가, 본원에 제시된 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포획 라벨로서 기능한다. 가령, 고체상 시약의 결합 구성원이 핵산 서열인 경우에, 프라이머 또는 프로브의 상보성 영역에 결합하여 상기 프라이머 또는 프로브를 고체상에 고정시키는 포획 라벨을 선택한다. 폴리뉴클레오티드 프로브 자체가 결합 구성원으로 기능하는 경우에, 이런 프로브가 표적과 상보적이지 않은 서열 또는 "꼬리"를 보유한다. 폴리뉴클레오티드 프라이머 자체가 포획 라벨로 기능하는 경우에, 프라이머의 적어도 일부는 고체상에서 핵산과 자유롭게 혼성화된다. DNA 표지 기술은 당업자에게 공지된 것이다.
본 발명의 프로브는 다수의 목적에 유용하다. 이들은 특히, 게놈 DNA에 대한 서던 혼성화에 사용할 수 있다. 프로브는 PCR 증폭 산물을 검출하는데도 사용할 수 있다. 또한, 이들은 다른 기술을 활용하여 PAPAP 유전자 또는 mRNA에서 미스매치를 검출하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머, 프로브는 고체상에 쉽게 고정시킬 수 있다. 고체 서포트는 당업자에게 공지된 것으로, 여기에는 반응 트레이의 웰 벽, 테스트 튜브, 폴리스티렌 비드, 자성 비드, 니트로셀룰로오스 스트립, 막, 마이크로입자(예, 라텍스 입자), 양(또는 다른 동물) 적혈구, 두라사이트(duracyte) 등이 포함된다. 고형 서포트는 중요하지 않고 당업자가 선택할 수 있다. 따라서, 라텍스 입자, 마이크로입자, 자성이나 비-자성 비드, 막, 플라스틱 튜브, 마이크로역가 웰의 벽, 유리나 실리콘 칩, 양(또는 다른 동물) 적혈구, 두라사이트 모두 적합하다. 핵산을 고체상에 고정시키는데 적합한 방법에는 이온 결합, 소수성 결합, 공유 결합 등이 포함된다. 본원에서 고체 서포트는 불용성이거나 또는 후속 반응으로 불용화시킬 수 있는 물질을 의미한다. 고체 서포트는 포획 시약을 유인하고 고정시키는 내적 능력으로 선택할 수 있다. 대안으로, 고체상은 포획 시약을 유인하고 고정시키는 능력을 갖는 추가적인 수용체를 보유할 수 있다. 추가적인 수용체에는 포획 시약 자체 또는 포획 시약에 공액되는 하전된 물질과 관련하여 반대로 하전된 물질이 포함될 수 있다. 또 다른 대안으로, 수용체 분자는 고체 서포트에 고정되고(부착되고) 특이적인 결합 반응을 통하여 포획 시약을 고정시킬 수 있는 능력을 갖는 임의의 특이적인 결합 구성원일 수 있다. 수용체 분자는 분석의 실시에 앞서 또는 실시동안 고체 서포트 물질에 대한 포획 시약의 간접적인 결합을 가능하게 한다. 따라서, 고체상은 당업자에게 공지된 플라스틱, 파생된 플라스틱, 자성이나 비-자성 물질, 테스트 튜브의 유리나 실리콘 표면, 마이크로역가 웰, 시트, 비드, 마이크로입자, 칩, 양(또는 다른 동물) 적혈구, 두라사이트 및 다른 형태일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 고체 서포트에 개별적으로 또는 본 발명에 따른 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 또는 25개의 개별 폴리뉴클레오티드의 집합으로 단일 고체 서포트에 고정 또는 부착시킬 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 제외한 다른 폴리뉴클레오티드를 본 발명에 따른 하나 또는 복수의 폴리뉴클레오티드와 동일한 고체 서포트에 부착시킬 수 있다.
결과적으로, 본 발명은 시료에서 SEQ ID No 1이나 3의 뉴클레오티드, 이의 상보성 서열, 단편 또는 변이체로 구성되는 핵산의 존재를 검출하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다.
a) SEQ ID No 1이나 3의 핵산, 이의 상보성 서열, 단편 또는 변이체에 포함되는 뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 핵산 프로브 또는 복수의 핵산 프로브를 분석 시료와 접촉시키고;
b) 시료에서 프로브와 핵산간에 형성된 하이브리드 복합체를 검출한다.
또한, 본 발명은 시료에서 SEQ ID No 1이나 3의 뉴클레오티드, 이의 상보성 서열, 단편 또는 변이체로 구성되는 핵산의 존재를 검출하는 키트에 관하는데, 상기 키트는 다음과 같이 구성된다:
a) SEQ ID No 1이나 3의 핵산, 이의 상보성 서열, 단편 또는 변이체에 포함되는 뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 핵산 프로브 또는 복수의 핵산 프로브;
b) 선택적으로, 혼성화 반응을 실행하는데 필요한 시약.
이런 검출 방법과 키트의 적절한 첫 번째 구체예에서, 핵산 프로브 또는 복수의 핵산 프로브는 검출가능한 분자로 표지한다. 상기 방법과 키트의 적절한 두 번째 구체예에서, 핵산 프로브 또는 복수의 핵산 프로브는 기질에 고정된다.
올리고뉴클레오티드 분석
본 발명에 따른 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브를 포함하는 기질은 PAPAP 유전자에서 표적 서열을 검출 또는 증폭하는데 사용할 수 있고, PAPAP 유전자의 코딩이나 비-코딩 서열에서 돌연변이를 검출하는데 사용할 수 있다.
본원에 제시된 임의의 폴리뉴클레오티드는 고체 서포트에서 중복 지역이나 또는 무작위 위치에 부착시킬 수 있다. 대안으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 정렬된 어레이에 부착시킬 수 있는데, 여기서 각 폴리뉴클레오티드는 다른 폴리뉴클레오티드의 부착 위치와 중복되지 않는 고체상의 개별 위치에 부착된다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드의 이런 정렬된 어레이는 "어드레서블(addressable)"한데, 여기서 개별 위치는 기록되고 분석 과정의 일부로서 액세스할 수 있다. 전형적으로, 어드레서블 폴리뉴클레오티드 어레이는 상이한 공지된 위치에서 기질의 표면에 결합하는 복수의 올리고뉴클레오티드프로브로 구성된다. 각 폴리뉴클레오티드의 정확한 위치에 관한 지식은 이들 "어드레서블" 어레이가 혼성화 분석에 특히 유용하도록 한다. 당분야에 공지된 어드레서블 어레이 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 활용할 수 있다. 이런 폴리뉴클레오티드 어레이의 특정 구체예는 GenechipsTM으로, 이는 US Patent 5,143,854; PCT 국제 출원 WO 90/15070과92/10092에 전반적으로 기술되어 있다. 이들 어레이는 기계적 합성 방법 또는 광석판술과 고체상 올리고뉴클레오티드 합성의 조합을 통합하는 광 유도된 합성 방법으로 만들 수 있다(Fodor et al., 1991). 고체 서포트에 올리고뉴클레오티드 어레이의 고정은 "Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis"(VLSIPSTM) 기술의 개발로 가능하게 되었는데, 여기서 프로브는 칩의 고체 표면에 고밀도 어레이로 고정된다. VLSIPSTM기술의 예는 US Patent 5,143,854; 5,412,087; PCT 출원 WO 90/15070; WO 92/10092; WO 95/11995에서 제공하는데, 이들 문헌은 광 유도된 합성 기술과 같은 기술을 통하여 올리고뉴클레오티드 어레이를 형성하는 방법을 기술한다. 고체 서포트에 고정된 뉴클레오티드 어레이를 제공하기 위한 전략의 마련하는데 있어, 혼성화 패턴과 서열 정보를 극대화시키기 위하여 칩에 올리고뉴클레오티드 어레이를 정렬하고 전시하기 위한 추가적인 프레젠테이션 전략이 개발되었다. 이런 프리젠테이션 전력의 예는 PCT 출원 WO 94/12305; WO 94/11530; WO 97/29212; WO 97/31256에서 개시한다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 어레이의 다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브 매트릭스는 PAPAP 유전자, 바람직하게는 이의 조절 영역에서 발생하는 돌연변이를 검출하는데 유용하게 사용할 수 있다. 이를 위해, 프로브는 공지된 돌연변이(예, 하나 또는 복수 뉴클레오티드의 결실, 삽입 또는 부가)를 보유하는 유전자에 혼성화되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 특이적인 프로브를 설계한다. 공지된 돌연변이는 예로써 Huang et al.(1996) 또는 Samson et al.(1996)이 활용한기술에 따라 동정된 PAPAP 유전자에서 돌연변이를 의미한다.
PAPAP 유전자에서 돌연변이를 검출하는데 사용되는 다른 기술은 고밀도 DNA 어레이이다. 고밀도 DNA 어레이의 단위 요소를 구성하는 각 올리고뉴클레오티드 프로브는 PAPAP 게놈 DNA 또는 cDNA의 특정 서열에 대합하도록 설계한다. 따라서, 표적 유전자서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 구성되는 어레이는 야생 유전자 서열과 표적 서열의 상동성을 확인하고, 이의 함량을 측정하며 표적 서열과 PAPAP 유전자의 기준 야생형 유전자 서열간 차이를 검출하는데 사용한다. 이런 설계에서 4L 타일드(tiled) 어레이는 한 세트의 4개 프로브(A, C, G, T), 바람직하게는 15개-뉴클레오티드 올리고머로 실행한다. 각 세트의 4개 프로브에서, 완전 보체는 미스매치된 프로브보다 좀더 강하게 혼성화된다. 결과적으로, 길이 L의 핵산 표적은 4L 프로브를 보유하는 타일드 어레이로 돌연변이를 스캔하고, 전체 프로브 세트는 공지된 야생형 참고 서열에서 모든 가능한 돌연변이를 포함한다. 15-mer 프로브 세트 타일드 어레이의 혼성화 신호는 표적 서열에서 단일 염기 변화로 섭동한다. 결과로써, 돌연변이 위치에 인접하는 프로브에서 신호의 특징적인 소멸 또는 "푸트프린트(footprint)"가 존재한다. 이런 기술은 Chee et al. in 1996에 기술되었다.
따라서, 본 발명은 적어도 하나의 전술한 폴리뉴클레오티드를 프로브와 프라이머로 포함하는 핵산 분자의 어레이에 관한다. 바람직하게는, 본 발명은 2개이상의 전술한 폴리뉴클레오티드를 프로브와 프라이머로 포함하는 핵산 분자의 어레이에 관한다.
PAPAP 단백질과 폴리펩티드 단편
본원에서 "PAPAP 폴리펩티드"에는 본 발명의 모든 단백질과 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드로 인코드되는 폴리펩티드 및 이런 폴리펩티드로 구성되는 융합 펩티드 역시 본 발명에 포함된다. 본 발명에는 SEQ ID No 2 서열로 구성되는 또는 이를 포함하는 분리되거나 정제된 PAPAP 단백질을 비롯하여 사람으로부터 유래된 PAPAP 단백질이 포함된다.
전술한 바와 같이, 본 발명자들은 PAPAP 단백질이 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 CNS 질환에 대한 유전적 취약성 인자로 사려되는 g34872 단백질이나 펩티드와 연관한다는 증거를 제시하였다.
본 발명은 SEQ ID No 1이나 3의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드되는 폴리펩티드, 이의 상보성 서열 또는 단편에 관한다.
본 발명에는 SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 인코드하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 다른 적절한 구체예에서, 아미노산의 연속 스트레치는 PAPAP 단백질 서열에서 아미노산의 결실, 부가, 치환 또는 절두를 비롯한 돌연변이 또는 기능적 돌연변이의 부위를 포함한다.
또한, 본 발명에는 SEQ ID No 2의 아미노산 서열과 적어도 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%의 아미노산 상동성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리펩티드 또는 이의 단편이 포함된다. 변이 폴리펩티드 역시정상적인 생물활성을 갖는 지와 상관없이 본 발명에 포함된다. 이는 특정 폴리펩티드 분자가 생물 활성을 갖지 않는 경우에도 이들 폴리펩티드가 예로써 백신으로 또는 항체를 만드는데 사용될 수 있기 때문이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 다른 용도에는 에피토프 태그, 에피토프 지도작성 및 당분야에 공지된 방법을 이용한 SDS-PAGE 겔이나 분자체 겔 여과 칼럼에서 분자량 마커가 포함된다. 후술한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드는 다클론 항체와 단클론 항체를 만드는 데에도 사용할 수 있는데, 이들은 PAPAP 단백질 발현을 검출하는 분석에서 또는 PAPAP 단백질 기능을 강화 혹은 저해할 수 있는 작용제와 길항제로 사용될 수 있다. 게다가, 이런 폴리펩티드는 본 발명에 따른 작용제와 길항제의 후보인 PAPAP 단백질 결합 단백질을 "포획"하는 이스트 이중-하이브리드 시스템에 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 PAPAP와 g34872 폴리펩티드에 의해 형성되는 복합체에 관한다. 따라서, 본 발명은 적어도 한 개의 PAPAP 폴리펩트드와 적어도 한 개의 g34872 폴리펩티드의 분리된, 정제된, 재조합된 복합체에 관하는데, 상기 PAPAP 폴리펩티드는 SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성된다. 적절한 구체예에서, g34872 폴리펩티드는 SEQ ID No 5의 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 8 내지 10개의 아미노산으로 구성된다.
이에 더하여, PAPAP 폴리펩티드 구조의 추가적인 분석으로 제안한 바와 같이 본 발명의 PAPAP 폴리펩티드는 아미노산 위치 69-72(아미노산 NNTD)에서 N-글리코실레이션 부위(ASP)를 보유할 수 있다. 게다가, 본 발명의 PAPAP 폴리펩티드는 아미노산 위치 26-28(SCR), 53-55(SKR), 71-73(TDK), 80-82(SPK)에서 단백질 키나아제 C 인산화 부위를 보유할 수 있다. 또한, PAPAP 폴리펩티드는 아미노산 위치 18-23(GGDZGQ), 22-27(GQIFSC), 37-42(GAGQNK)에서 N-미리스토일레이션 부위를 보유할 수 있다. 다른 구조적 외관에는 아미노산 위치 8 내지 16, 9 내지 16(아미노산 D----PYG)에서 ASP & GLU 라세미화 효소 모티프가 포함된다.
PAPAP는 g34872와의 상호작용을 통한 정신분열증과 양극성 장애와 연관될 뿐만 아니라, 칼슘/칼모둘린 의존 단백질 키나아제 Ⅱ(CAMKⅡ) 단백질(AS2711561)과도 서열 상동성을 공유하는데, 상기 단백질은 신경전달에 관여하는 것으로 이미 확인되었다. 한 측면에서, PAPAP는 분자 샤프론으로 작용할 수 있다; 가령, PAPAP는 g34872와 g34872 수용체의 상호작용이나 결합을 강화 또는 예방할 수 있다. 다른 측면에서, PAPAP는 g34872가 관여하는 신호 전달 경로에 기능적으로 상호작용할 수 있다. PAPAP 단백질은 가급적 사람이나 포유동물 조직 시료로부터 분리되거나 또는 사람이나 포유동물 유전자로부터 발현된다.
본 발명의 PAPAP 폴리펩티드는 당분야에 공지된 통상적인 방법으로 만들 수 있다. 원하는 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 임의의 사용하기 편한 숙주에 적합한 발현 벡터에 결찰시킨다. 진핵과 원핵 숙주계가 재조합 폴리펩티드를 생성하는데 사용된다. 이후, 폴리펩티드는 용해된 세포 또는 배양 배지로부터 분리하고 원하는 목적에 필요한 수준으로 정제한다. 정제는 당분야에 공지된 임의의 기술, 예를 들면 분별 추출, 염 분획, 크로마토그래피, 원심분리 등으로 실시한다.
이에 더하여, 좀더 짧은 단백질 단편은 화학적 합성으로 만든다. 대안으로, 본 발명의 단백질은 사람 또는 사람을 제외한 동물의 세포나 조직으로부터 추출한다. 단백질을 정제하는 방법을 당분야에 공지된 것으로, 여기에는 세정제나 카오트로픽(chaotropic) 약물을 이용한 입자 파괴, 분별 추출 및 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 밀도에 따른 침강, 겔 전기영동에 의한 폴리펩티드의 분리가 포함된다.
SEQ ID No 1을 비롯한 PAPAP cDNA는 PAPAP 단백질과 폴리펩티드를 발현하는데 사용할 수 있다. 발현되는 PAPAP 단백질이나 폴리펩티드를 인코드하는 핵산은 통상적인 클로닝 기술을 활용하여 발현 벡터상의 프로모터에 작동적으로 연결시킨다. 발현 벡터에서 PAPAP 삽입체는 PAPAP 단백질에 대한 전체 코딩 서열 또는 이의 일부분으로 구성될 수 있다. 가령, PAPAP 유래된 삽입체는 SEQ ID No 2의 PAPAP 단백질의 10개이상 연속 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 인코드할 수 있다.
발현 벡터는 당분야에 공지된 포유동물, 이스트, 곤충 또는 박테리아 발현 시스템이다. 상업적으로 가용한 벡터와 발현 시스템은 Genetics Institute(Cambridge, MA), Stratagenen(La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin), Invitrogen (San Diego, California)을 비롯한 다양한 공급업체로부터 구할 수 있다. 원하는 경우, 발현을 강화하고 적절한 단백질 접힘을 촉진하기 위하여 서열의 코돈 환경과 코돈 쌍은 발현 벡터가 도입되는 특정 발현 미생물에 최적화시킨다(U.S.Patent No. 5,082,767).
한 구체예에서, cDNA의 폴리 A 신호를 통하여 PAPAP cDNA의 전체 코딩 서열은 발현 벡터상의 프로모터와 작동적으로 연결시킨다. 대안으로, PAPAP 단백질의 일부분을 인코드하는 핵산에서 개시 부위로 작용하는 메티오닌이 부재하는 경우에 통상적인 기술을 활용하여 핵산의 제 1 코돈에 측부에 개시 메티오닌을 도입할 수 있다. 유사하게, PAPAP cDNA로부터 유래된 삽입체에 폴리 A 신호가 부재하는 경우에, 상기 서열은 BglI과 SalI 제한 엔도뉴클레아제 효소로 pSG5(Stratagene)로부터 폴리 A 신호를 절단하고 이를 포유동물 벡터 pXT1(Stratagene)에 통합시켜 구조체에 부가할 수 있다. pXT1은 LRT 및 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 개그 유전자 일부를 포함한다. 구조체에서 LTR의 존재는 효과적이고 안정적인 트랜스펙션을 가능하게 한다. 상기 벡터는 단순 포진 티미딘 키나아제 프로모터와 선별가능 네오마이신 유전자를 보유한다. PAPAP 단백질 또는 이의 일부분을 인코드하는 핵산은 SEQ ID No 2의 PAPAP cDNA를 보유하고 5'프라이머에 통합된 Pst I 및 상응하는 cDNA 3' 프라이머의 5'말단에서 BglⅡ에 대한 제한 엔도뉴클레아제 서열을 보유하는 박테리아 벡터로부터, PAPAP cDNA 또는 이의 일부분에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 PCR로 수득하는데, 여기서 PAPAP 단백질 또는 이의 일부분을 인코드하는 서열은 폴리 A 신호와 관련하여 정확하게 위치하도록 담보한다. PCR 반응으로 수득된 정제된 단편은 Pst I로 절단하고 엑소뉴클레아제로 평활 말단이 되게 하며 BglⅡ로 절단하고 정제하며 폴리 A 신호를 보유하는 pXT1에 결찰시키고 BglⅡ로 절단한다.
결찰된 산물은 제품 명세서에 명시된 조건하에 리포펙틴(Life Technologies,Inc., Grand Island, New York)을 이용하여 NIH 3T3 세포로 트랜스펙션시킨다. 양성 형질감염체(transfectanct)는 트랜스펙션 세포를 600ug/㎖ G418(Sigma, St. Louis, Missouri)에서 배양하여 선별한다.
상기 과정은 검출가능한 표현형을 담당하는 돌연변이 PAPAP 단백질 또는 이의 일부분을 발현하는데 활용할 수도 있다.
발현된 단백질은 통상적인 정제 기술, 예를 들면 황산암모늄 침전 또는 크기나 전하에 기초한 크로마토그래피 분리로 정제한다. 핵산 삽입체에 의해 인코드되는 단백질은 표준 면역크로마토그래피 기술을 활용하여 정제할 수도 있다. 이런 과정에서, 발현된 PAPAP 단백질 또는 이의 일부분을 함유하는 용액, 예를 들면 세포 추출액은 PAPAP 단백질 또는 이의 일부분에 대한 항체를 갖는 칼럼에 가한다. 발현된 단백질은 면역크로마토그래피 칼럼에 결합하게 된다. 이후, 칼럼은 세척하여 비-특이적으로 결합된 단백질을 제거한다. 그 다음, 특이적으로 결합된 발현된 단백질은 칼럼으로부터 방출시키고 표준 기술로 회수한다.
PAPAP 단백질 또는 이의 일부분을 발현을 확인하기 위하여, PAPAP 단백질 또는 이의 일부분을 인코드하는 삽입체를 포함하는 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포로부터 발현된 단백질은 삽입체가 없는 발현 벡터를 보유하는 숙주 세포에서 발현된 단백질과 비교할 수 있다. 삽입체가 없는 발현 벡터를 보유하는 세포의 시료에서는 나타나지 않는 삽입체를 보유하는 발현 벡터를 보유하는 세포의 시료에서 밴드의 존재는 PAPAP 단백질 또는 이의 일부분이 발현된다는 것을 암시한다. 일반적으로, 이런 밴드는 PAPAP 단백질 또는 이의 일부분에서 예상되는 이동성을 갖는다.하지만, 밴드는 글리코실레이션, 유비퀴티네이션 또는 효소적 절단과 같은 수식의 결과로 예상한 것과는 다른 이동성을 가질 수도 있다.
발현된 PAPAP 단백질 또는 이의 일부분을 특이적으로 인식할 수 있는 항체는 후술한다.
항체 생산이 불가능하면, PAPAP 단백질 또는 이의 일부분을 인코드하는 핵산은 키메라 폴리펩티드를 활용한 정제 계획에 사용하기 위하여 설계된 발현 벡터에 통합시킨다. 이런 전략에서 PAPAP 단백질 또는 이의 일부분을 인코드하는 핵산은 키메라의 다른 절반을 인코드하는 유전자와 맞추어 삽입한다. 키메라의 다른 절반은 β-글로빈 또는 니켈 결합 폴리펩티드 인코딩 서열이다. 이후, β-글로빈 또는 여기에 부착된 니켈에 대한 항체를 갖는 크로마토그래피 매트릭스는 키메라 단백질을 정제하는데 사용한다. β-글로빈 유전자 또는 니켈 결합 폴리펩티드와 PAPAP 단백질 또는 이의 일부분사이에 프로테아제 절단 부위를 조작한다. 따라서, 키메라의 두 폴리펩티드는 프로테아제 절단에 의해 서로 분리된다.
β-글로빈 키메라 단백질을 만드는데 유용한 발현 벡터는 pSG5(Stratagene)로, 이는 토끼 β-글로빈을 인코드한다. 토끼 β-글로빈 유전자의 인트론 II는 발현된 전사체의 절단접합을 촉진하고, 구조체에 통합된 폴리아데닐화 신호는 발현의 수준을 증가시킨다. 이들 기술은 분자 생물학 분야의 당업자에게 공지된 것이다. 표준 방법은 Davis et al.,(1986)과 같은 방법 텍스트에 공개되어 있고, 많은 방법은 Stratagene, Life Technologies, Inc., 또는 Promega로부터 가용하다. 또한,폴리펩티드는 In vitro ExpressTMTranslation Kit(Stratagene)과 같은 시험관내 번역 시스템을 활용하여 구조체로부터 만들 수 있다.
본 발명의 PAPAP 폴리펩티드에 결합하는 항체
PAPAP 폴리펩티드 또는 전체 단백질은 발현된 PAPAP 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 만드는데 사용할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물은 SEQ ID No 2의 PAPAP 단백질에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 특이적으로 결합한다. PAPAP에 특이적으로 결합하는 항체 조성물은 ELISA, RIA 또는 다른 항체-기초된 결합 분석에서 PAPAP 단백질의 전장 2차 변이체보다 PAPAP 단백질의 전장 1차 변이체에 대하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50% 또는 100% 더 높은 결합 친화성을 보여야 한다.
적절한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성되는 에피토프-포함 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 다클론이나 단클론 항체 조성물에 관한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 PAPAP와 g34872 폴리펩티드의 복합체에 특이적으로 결합하는 다클론이나 단클론 항체 조성물에 관하는데, 여기서 상기 PAPAP 폴리펩티드는 SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성된다. 적절한 구체예에서, g34872 폴리펩티드는 SEQ ID No 5의 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 8 내지 10개의 아미노산으로 구성된다.
에피토프는 상기 에피토프에 독특한 공간적 입체형태를 제공하는 적게는 3개의 아미노산으로 구성된다. 일반적으로, 에피토프는 적어도 6개의 이런 아미노산, 바람직하게는 적어도 8-10개의 이런 아미노산으로 구성된다. 적절한 구체예에서, 항원성 에피토프는 3 내지 50개의 아미노산으로 구성된다. 에피토프로 기능하는 단편은 임의의 통상적 수단으로 만들 수 있다. 에피토프는 디폴트 변수를 이용한 PROTEAN 컴퓨터 프로그램 (Version 4.0 Windows, DNASTAR, Inc., 1228 South Park Street Madison, WI)을 활용하여 Jameson-Wolf 항원 분석으로 확인할 수 있다.
예상 항원성 에피토프는 하기에 도시한다. 면역원성 에피토프 리스트는 특정 알고리즘에서 가장 높은 항원성을 갖는 것으로 예상되는 에피토프로 구성되는 아미노산만을 기술한다. 면역원성으로 구체적으로 기술되지 않는 본 발명의 폴리펩티드 역시 항원성을 갖는 것으로 간주한다. 그 이유는 이들이 생체내에서 항원성을 보유하지만 이런 항원성이 특정 알고리즘에서 인식되지 않기 때문이다. 대안으로, 폴리펩티드는 파지 디스플레이와 같은 방법으로 시험관내에서 항원성을 보인다. 따라서, 하기 리스트는 단지 적합한 에피토프로 구성되는 아미노산 잔기로서, 완전한 리스트가 아니다. 사실, 6개이상의 아미노산 잔기로 구성되는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 모든 단편은 항원 에피토프로 본 발명에 포함된다. 게다가, 하기 리스트는 Jameson-Wolf 분석으로 확인된 에피토프의 중요 잔기일 뿐이다. 따라서, N-말단, C-말단 또는 N-과 C-말단 모두에서 추가적으로 인접하는 잔기를 하기 리스트에 추가하여 적어도 6개의 잔기로 구성되는 에피토프-보유 영역을 만들 수있다. 다른 면역원성 에피토프를 구성되는 아미노산 잔기는 Jameson-Wolf 분석과 유사한 알고리즘으로 또는 당분야에 공지된 방법을 이용한 항원 반응에 대한 생체내 검사로 측정할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 에피토프-보유 단편은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 6 내지 50개 아미노산으로 구성된다. 본 발명에는 6개 내지 전장 PAPAP 서열의 항원 단편 역시 포함된다.
적절한 PAPAP 면역원성 에피토프:
Gly 8 내지 Lys-11
Asp-31 내지 Asn-33
Gln-40 내지 Leu-47
Gly-51 내지 Lys-54
Glu-59 내지 Arg-62; and
Ser-80 내지 Thr-83
또한, 본 발명은 돌연변이된 PAPAP 단백질의 에피토프로 구성되고 돌연변이된 PAPAP 단백질에 특이적으로 결합하는 정제되거나 분리된 항체, 이의 단편이나 변이체에 관한다. 다른 적절한 구체예에서, 본 발명은 PAPAP 단백질의 10개이상 연속 아미노산으로 구성되고 형질 유발 돌연변이에 의해 인코드될 수 있는 적어도 1개의 아미노산을 보유하는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체에 관한다.
항체 결합이 요구되는 것과 상이한 종류의 PAPAP를 발현하는 사람을 제외한 동물 또는 포유동물 및 PAPAP를 발현하지 않는 동물(즉, PAPAP 적중 동물)은 항체를 만드는데 특히 유용하다. PAPAP 적중 동물은 PAPAP의 노출된 영역 대부분을 외래 항원으로 인식하고, 따라서 좀더 광범위한 PAPAP 에피토프를 갖는 항체를 만들 수 있다. 게다가, 10 내지 30 아미노산을 갖는 좀더 작은 폴리펩티드는 PAPAP 단백질중 임의 한가지에 대한 특이적인 결합을 달성하는데 유용할 수 있다. 이에 더하여, 이런 항원 서열과 유사한 종류의 PAPAP를 생산하는 동물의 체액 면역계는 고유 PAPAP와 항원 서열간의 차이를 인식하고, 항원 서열에서 독특한 부위에 대한 항체를 생산하게 된다. 이런 기술은 PAPAP 단백질중 임의 한가지에 특이적으로 결합하는 항체를 수득하는데 특히 유용하다.
이런 프로토콜에 의해 만들어진 항체 제형은 생물 시료에서 항원-보유 물질의 농도를 측정하는 정량적 면역분석에 유용하다; 이들은 또한, 생물 시료에서 항원의 존재를 반-정량적으로 또는 정성적으로 확인하는 사용된다. 항체는 체내에서 단백질을 발현하는 세포를 죽이거나 또는 단백질의 수준을 감소시키는 치료요법적 조성물에 사용될 수도 있다.
본 발명의 항체는 당분야에 공지된 방사성, 형광 또는 효소적 라벨로 표지할 수 있다.
따라서, 본 발명은 생물 시료에서 본 발명에 따른 PAPAP 폴리펩티드의 존재를 특이적으로 검출하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
a) SEQ ID No 2의 아미노산 서열로 구성되고 PAPAP 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 다클론이나 단클론 항체, 펩티드 단편 또는 이의 변이체를 생물 시료와 접촉시키고;
b) 형성된 항원-항체 복합체를 검출한다.
또한, 본 발명은 시료에서 본 발명에 따른 PAPAP 폴리펩티드의 시험관내 존재를 검출하는 진단 키트에 관하는데, 상기 키트는 다음과 같이 구성된다:
a) SEQ ID No 2의 아미노산 서열로 구성되고 PAPAP 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 다클론이나 단클론 항체, 펩티드 단편 또는 이의 변이체;
b) 형성된 항원-항체 복합체의 검출을 가능하게 하는 시약, 상기 시약은 선택적으로 라벨을 보유하거나, 또는 특히 전술한 단클론이나 다클론 항체가 자체적으로 표지되지 않은 경우에 임의의 표지된 시약으로 자신을 인식할 수 있다.
따라서, 본 발명은 항체 및 T-세포 항원 수용체(TCR)에 관하는데, 이는 폴리펩티드, 좀더 구체적으로 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 포함), IgA(IgA1, IgA2 포함), IgD, IgE, IgM, IgY를 포함하는 이들에 국한되지 않는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 적절한 구체예에서, 항체는 본 발명의 사람 항원 결합 항체 단편으로, 여기에는 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fd, 단일-사슬 Fvs(scFv), 단일-사슬 항체, 다이설파이드-결합된 Fvs(sdFv), VL이나 VH로 구성되는 단편이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 항체는 조류와 포유동물을 비롯한 임의의 동물로부터 유래될 수 있다. 바람직하게는, 항체는 사람, 뮤린, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭으로부터 유래된다.
단일-사슬 항체를 비롯한 항원-결합 항체 단편은 가변 영역 단독으로 또는 다음 영역: 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 도메인의 전체 혹은 일부와 함께 구성될 수있다. 본 발명에는 가변 영역 및 힌지 영역, CH1, CH2, CH3 도메인의 임의 조합 역시 포함된다. 또한, 본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 키메라, 인화, 사람 단클론과 다클론 항체가 포함된다. 본 발명에는 본 발명의 항체에 대한 항-이디오타입 항체도 포함된다.
본 발명의 항체는 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적일 수 있다. 다중특이적 항체는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 특이적이거나 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드와 이질성 조성물, 예를 들면 이질성 폴리펩티드 또는 고체 서포트 물질 모두에 특이적일 수 있다(WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, A. et al.(1991) J. Immunol. 147:60-69; US Patent 5,573,920, 4,474,893, 5,601,819, 4,714,681, 4,925,648; Kostelny, S.A. et al.(1992) J. Immunol. 148:1547-1553).
본 발명의 항체는 항체에 인식되거나 또는 여기에 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 에피토프 또는 에피토프-보유 영역의 측면에서 설명한다. 본 발명에 따른 단백질의 경우에, 항체는 본 발명의 핵산에 의해 인코드되는 전장 단백질, 본 발명의 핵산에 의해 인코드되는 성숙 단백질(즉, 신호 펩티드의 절단으로 생성된 단백질), 본 발명의 핵산에 의해 인코드되는 신호 펩티드 또는 본 발명의 임의 다른 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서, 이런 에피토프 또는 폴리펩티드 일부분을 보유하는 에피토프는 예로써 N-말단과 C-말단 위치, 연속 아미노산 잔기의 크기 등으로 기술할 수 있다. 본 발명의 에피토프 또는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 역시 개별적으로 구별할 수 있다. 따라서,본 발명은 본 발명에 따른 특정 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고 이의 구별을 가능하게 하는 항체에 관한다.
본 발명의 항체는 교차-반응성의 측면에서 기술할 수도 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 임의 다른 유사체, 오트로그(ortholog) 또는 상동체와 특이적으로 결합하지 않는 항체는 본 발명에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드와 95% 미만, 90% 미만, 85% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 70% 미만, 65% 미만, 60% 미만, 55% 미만, 50% 미만의 상동성(당분야에 공지된 방법으로 측정)을 갖는 폴리펩티드와 결합하지 않는 항체 역시 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명에는 엄격한 혼성화 조건하에 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코드되는 폴리펩티드에만 결합 항체가 포함된다. 본 발명의 항체는 결합 친화성의 측면에서 기술할 수도 있다. 바람직한 결합 친화성 항체는 분리 상수(Kd)가 5X10-6M, 10-6M, 5X10-7M, 10-7M, 5X10-8M, 10-8M, 5X10-9M, 10-9M, 5X10-10, 10-10M, 5X10-11M, 10-11M, 5X10-12M, 10-12M, 5X10-13M, 10-13M, 5X10-14M, 10-14M, 5X10-15M, 10-15M 미만인 항체이다.
본 발명의 항체는 시험관내와 생체내 진단 방법과 치료 방법을 비롯하여 본 발명에 따른 폴리펩티드를 정제, 검출, 표적하는 당분야에 공지된 방법에 사용된다. 가령, 항체는 생물 시료에서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 수준을 정량적으로, 정성적으로 측정하는 면역분석에 사용된다(Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988).
본 발명의 항체는 단독으로 또는 다른 조성물과 함께 사용할 수 있다. 항체는 N- 또는 C-말단에서 이질성 폴리펩티드에 재조합으로 융합되거나 또는 폴리펩티드 혹은 다른 조성물에 화학적으로 공액(공유와 비-공유 공액 포함)될 수 있다. 가령, 본 발명의 항체는 검출 분석에서 라벨로 유용한 분자 및 효과기 분자, 예를 들면 이질성 폴리펩티드, 약물 또는 독소에 재조합으로 융합되거나 또는 공액될 수 있다(WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; US Patent 5,314,995; EP 0 396 387).
본 발명의 항체는 당분야에 공지된 임의의 적절한 방법으로 만들 수 있다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 항원성 단편은 동물에 투여하여 다클론 항체를 함유하는 혈청의 생산을 유도하는데 사용할 수 있다. "단클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통하여 만들어진 항체에 국한되지 않는다. "항체"는 한 개이상의 결합 도메인으로 구성되는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 군을 의미하는데, 여기서 항체 결합 도메인은 항체 분자에서 다양한 도메인의 접힙(folding)으로 생성되고 항원의 항원 결정기 외형에 상보적인 내부 표면 형태 및 전하 분포를 갖는 3차원 결합 공간을 형성하는데, 이는 항원과의 면역학적 반응을 가능하게 한다. "단클론 항체"는 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 비롯한 단일 클론으로부터 유래된 항체를 의미하고, 이를 생산하는 방법을 의미하지 않는다. 단클론 항체는 하이브리도마 사용, 재조합, 파지 디스플레이 기술을 비롯한 당분야에 공지된 다양한 기술을 활용하여 만들 수 있다
하이브리도마 기술은 당분야에 공지된 것이다(Harlow et al.(1988);Hammerling, et. al.(1981)). Fab와 F(ab')2 단편은 예로써 파파인(Fab 단편 생성) 또는 펩신(F(ab')2 단편 생성)과 같은 효소를 이용한 단백질분해 절단으로 하이브리도마-생성된 항체로부터 만들 수 있다.
대안으로, 본 발명의 항체는 재조합 DNA 기술 또는 당분야에 공지된 합성 화학을 적용하여 만들 수 있다. 가령, 본 발명의 항체는 당분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법으로 만들 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서, 기능적 항체 도메인은 파지 입자의 표면에 전시되고, 상기 파지 입자는 이들을 인코드하는 폴리뉴클레오티드 서열을 보유한다. 원하는 결합 특성을 갖는 파지는 항원, 특히 고체 표면이나 비드에 결합되거나 또는 포획된 항원으로 직접 선별함으로써 레파토리 또는 조합 항체 라이브러리(예, 사람 또는 뮤린)로부터 선택된다. 전형적으로, 이들 방법에 사용되는 파지는 파지 유전자 III 또는 유전자 VII 단백질에 재조합으로 융합된 Fab, Fv 또는 다이설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 fd와 M13을 비롯한 섬유성 파지이다. 본 발명의 항체를 만드는데 이용할 수 있는 파지 디스플레이 방법은 Brinkman U. et al.(1995); Ames, R.S. et al.(1995); Kettleborough, C.A.. et al. (1994); Persic, L. et al.(1997); Burton, D.R. et al.(1994); PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; US Patents 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743에서 개시한다.
상기 참고문헌에서 밝힌 바와 같이, 파지 선별후 파지로부터 항체 코딩 영역을 분리하는데, 이는 사람 항체 또는 임의의 다른 항원 결합 단편을 비롯하여 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 이스트, 박테리아에서 발현되는 전체 항체를 만드는데 사용할 수 있다. 가령, Fab, Fab'F(ab)2, F(ab')2 단편을 재조합으로 생산하는 기술은 당분야에 공지된 방법으로 활용할 수 있다(WO 92/22324; Mullinax, R.L. et al.(1992); Sawai, H. et al.(1995); Better, M. et al.(1988)).
단일-사슬 Fvs와 항체를 생산하는데 사용할 수 있는 기술은 U.S. Patents 4,946,778과 5,258,498; Huston et al.(1991); Shu, L. et al.(1993); Skerra, A. et al.(1988)에서 제시한다. 사람에서 항체의 생체내 용도 및 시험관내 검출 분석을 비롯한 일부 용도에서는 키메라, 인화 또는 사람 항체를 사용하는 것이 바람직할 수도 있다(Morrison(1985); Oi et al.,(1986); Gillies, S.D. et al.(1989); US Patent 5,807,715). 항체는 다양한 기술, 예를 들면 CDR-조직 이식(EP 0 239 400; WO 91/09967; US Patent 5,530,101; 5,585,089), 베니어링(veneering)이나 박피(resurfacing)(EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E.A.,(1991); Studnicka G.M. et al.(1994); Roguska M.A. et al.(1994)), 사슬 셔플링(shuffling)(US Patent 5,565,332)으로 인화시킬 수 있다. 사람 항체는 전술한 파지 디스플레이 방법을 비롯하여 당분야에 공지된 다양한 방법으로 만들 수 있다(US Patents 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806, 5,814,318; WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; WO 91/10741).
또한, 본 발명에는 본 발명의 폴리펩티드에 재조합으로 융합된 또는 화학적으로 공액된(공유와 비-공유 공액 포함) 항체가 포함된다. 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 제외한 다른 항원에 특이적일 수도 있다. 가령, 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 특정 세포 표면 수용체에 특이적인 항체에 융합 또는 공액시킴으로써 시험관내 또는 생체내에서 본 발명의 폴리펩티드가 특정 세포형으로 향하도록 하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 또는 공액된 항체 역시 당분야에 공지된 방법으로 시험관내 면역분석 및 정제에 사용할 수 있다(Harbor et al. supra and WO 93/21232; EP 0 430 095; Naramura M. et al.(1994); US Patent 5,474,981; Gillies, S.O. et al.(1992); Fell, H.P. et al.(1991)).
또한, 본 발명은 변이 영역을 제외한 다른 도메인에 융합된 또는 공액된 본 발명의 폴리펩티드로 구성되는 조성물에 관한다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드는 항체 Fc 영역 또는 이의 일부분에 융합 또는 공액될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 항체 일부분은 힌지 영역, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 전체 도메인의 임의 조합 또는 이들의 일부분으로 구성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드의 반감기를 증가시키기 위하여 또는 공지된 방법을 이용한 면역 분석에 사용하기 위하여 항체 일부분과 융합 또는 공액될 수 있다. 폴리펩티드는 또한, 다합체를 형성하기 위하여 항체 일부분과 융합 또는 공액될 수 있다. 가령, 본 발명의 폴리펩티드에 융합된 Fc 영역은 Fc 영역간 다이설파이드 결합을 통하여 이합체를 형성할 수 있다. 좀더 상등의 다합체 형태는 본 발명의 폴리펩티드를 IgA와 IgM의 일부분에 융합시켜 만들 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 항체 일부분에 융합 또는 공액하는 방법은 당분야에 공지된 것이다(US Patents 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 5,112,946; EP 0 307434, EP 0 367 166; WO 96/04388, WO 91/06570; Ashkenazi A. et al.(1991); Zheng, X.X. et al.(1995); Vil, H. et al.(1992)).
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 작용제 또는 길항제로 작용하는 항체에 관한다. 가령, 본 발명에는 본 발명에 따른 폴리펩티드와 수용체/리간드 상호작용을 완전히 또는 부분적으로 파괴하는 항체가 포함된다. 수용체-특이적 항체와 리간드-특이적 항체 역시 본 발명에 포함된다. 또한, 본 발명에는 리간드 결합을 방해하지 않으면서 수용체 활성화를 예방하는 수용체-특이적 항체가 포함된다. 수용체 활성화(즉, 신호 전달)는 당분야에 공지된 기술로 확인할 수 있다. 본 발명에는 리간드 결합과 수용체 활성화를 모두 차단하는 수용체-특이적 항체도 포함된다. 유사하게, 본 발명에는 리간드와 결합하여 수용체와 리간드의 결합을 차단하는 중화 항체 및 리간드와 결합하여 수용체 활성화를 차단하지만 리간드가 수용체와 결합하는 것을 차단하지는 않는 항체가 포함된다. 또한, 본 발명에는 수용체를 활성화시키는 항체가 포함된다. 이들 항체는 리간드-매개된 수용체 활성화의 영향을 받는 생물 활성에 대한 작용제 역할을 할 수도 있다. 이런 항체는 본원에 개시된 특이적 활성을 포함하는 생물학적 활성에 대한 작용제 또는 길항제로 기술할 수 있다. 상기 항체 작용제는 당분야에 공지된 방법으로 만들 수 있다(WO 96/40281; US Patent 5,811,097; Deng B. et al.(1998); Chen, Z. et al.(1998); Harrop J.A. et al.(1998); Zhu, Z. et al.(1998); Yoon, D.Y. et al.(1998); Prat, M. et al.(1998); Pitard, V. et al.(1997); Liautard, J. et al.(1997); Carlson, N.G. et al.(1997); Taryman, R.E. et al.(1995); Muller, Y.A. etal(1998); Bartunek, P. Et al.(1996)).
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 폴리펩티드의 항체는 당분야에 공지된 기술로 본 발명의 폴리펩티드를 "모방"하는 항-이디오타입 항체를 만드는데 사용할 수 있다(Greenspan and Bona, (1989); Nissinoff, (1991)). 가령, 결합을 통하여 폴리펩티드 다합체화(multimerization) 또는 본 발명에 따른 폴리펩티드와 리간드의 결합을 경쟁적으로 저해하는 항체는 폴리펩티드 다합체화 또는 결합 도메인을 "모방"하고 결론적으로 폴리펩티드 또는 이의 리간드와 결합하여 이들을 중화시키는 항-이디오타입 항체를 만드는데 사용할 수 있다. 이런 중화 항-이디오타입 항체는 본 발명의 폴리펩티드에 결합시키거나 또는 이의 리간드/수용체 결합시켜 이의 생물 활성을 차단하는데 사용할 수 있다.
재조합 벡터
"벡터"는 환형 또는 선형 DNA 또는 RNA 분자를 의미하는데, 이는 이중-가닥 또는 단일 가닥이고 세포 숙주 또는 단세포나 다세포 숙주 미생물로 전달되는 적어도 한 개의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명에는 PAPAP 게놈 서열로부터 유래된 조절 폴리뉴클레오티드 및/또는 PAPAP 게놈 서열이나 cDNA 서열로부터 유래된 코딩 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 군이 포함된다.
일반적으로, 본 발명의 재조합 벡터는 조절 서열, 코딩 서열, 폴리뉴클레오티드 구조체, 전술한 PAPAP 프라이머나 프로브를 비롯한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 좀더 구체적으로, 본 발명의 재조합 벡터는 "PAPAP 유전자의 게놈서열" 섹션, "PAPAP cDNA 서열" 섹션, "코딩 영역" 섹션, "폴리뉴클레오티드 구조체" 섹션, "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머" 섹션에서 밝힌 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
적절한 첫 번째 구체예에서, 본 발명의 재조합 벡터는 적합한 숙주 세포에서 SEQ ID No 3의 PAPAP 게놈 서열 또는 PAPAP cDNA, 예를 들면 SEQ ID No 1의 cDNA로부터 유래된 삽입된 폴리뉴클레오티드를 증폭하는데 사용되고, 상기 폴리뉴클레오티드는 재조합 벡터가 복제할 때마다 증폭된다.
적절한 두 번째 구체예에서, 본 발명에 따른 재조합 벡터는 본 발명의 조절 폴리뉴클레오티드나 코딩 핵산, 또는 둘 모두를 포함하는 발현 벡터로 구성된다. 특정 구체예에서, 발현 벡터는 PAPAP 폴리펩티드를 발현하는데 사용되는데, 이후 상기 폴리펩티드는 정제하고 리간드 스크리닝 분석에 또는 PAPAP 단백질에 대한 항체를 조성하기 위한 면역원으로 사용할 수 있다. 다른 구체예에서, 발현 벡터는 유전자도입 동물의 생성 및 유전자 요법에 사용된다. 발현은 적절한 신호가 벡터에 제공되어야 가능한데, 상기 신호에는 다양한 조절 요소, 예를 들면 숙주 세포의 유전자의 발현을 유도하는 바이러스와 포유동물로부터 유래된 인헨서/프로모터가 포함된다. 산물을 발현하는 영구적이고 안정적인 세포 클론을 확립하기 위한 가장 우세한 약물 선별 마커는 본 발명의 발현 벡터에 포함되는데, 그 이유는 이들이 약물 선별 마커의 발현을 폴리펩티드의 발현과 연계시키는 요소이기 때문이다.
좀더 구체적으로, 본 발명은 PAPAP 단백질, 바람직하게는 SEQ ID No 2 아미노산 서열의 PAPAP 단백질, 이의 변이체 또는 단편을 인코드하는 핵산을 포함하는발현 벡터에 관한다.
또한, 본 발명은 PAPAP 코딩 서열의 발현에 유용한 재조합 발현 벡터에 관하는데, 여기서 상기 벡터는 SEQ ID No 1 핵산을 포함한다.
본 발명의 벡터에서 발견할 수 있는 요소중 일부는 하기 섹션에 좀더 상세하게 설명한다
1. 본 발명에 다른 발현 벡터의 전반적인 특징
본 발명에 따른 재조합 벡터는 YAC(이스트 인공 크로모좀), BAC(박테리아 인공 크로모좀), 파지, 파게미드, 코스미드, 플라스미드, 또는 크로모좀, 비-크로모좀, 반-합성, 합성 DNA를 포함할 수 있는 선형 DNA 분자 등으로 구성된다.
이런 재조합 벡터는 다음과 같은 어셈블리로 구성되는 전사 단위를 포함할 수 있다:
(1) 유전자 발현에서 조절 역할을 하는 유전 요소, 예를 들면 프로모터 또는 인헨서. 인헨서는 프로모터에 작용하여 전사를 증가시키는 10 내지 300bp 정도의 DNA로 구성되는 cis-작용 요소이다.
(2) mRNA로 전사되고 최종적으로 폴리펩티드로 번역되는 구조 또는 코딩 서열, 상기 구조 또는 코딩 서열은 (1)에서 밝힌 조절 요소에 작동적으로 연결된다.
(3) 적절한 전사 개시와 종결 서열. 이스트 또는 진핵 발현 시스템에 사용되는 구조 단위에는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질의 세포외 배출을 가능하게 하는 리더 서열이 포함된다. 대안으로, 재조합 단백질이 리더 또는 전달 서열없이 발현되는 경우에는 N-말단 잔기가 포함될 수 있다. 이런 잔기는 최종 산물을 제공하기 위하여 발현된 재조합 단백질로부터 후속으로 절단될 수도 또는 절단되지 않을 수도 있다.
일반적으로, 재조합 발현 벡터에는 복제 기점, 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 선별 마커, 하류 구조 서열의 전사를 유도하기 위한 고도로 발현된 유전자로부터 유래된 프로모터가 포함된다. 이질성 구조 서열은 적절한 단계에서 번역 개시와 종결 서열 및 번역된 단백질의 표층공간(periplasmic space)이나 세포외 매체로의 배출을 유도할 수 있는 리더 서열로 조합된다. 벡터가 포유동물 숙주 세포에서 원하는 서열을 트랜스펙션시키고 발현하는 특정 구체예에서, 바람직한 벡터는 원하는 숙주에서 복제 기점, 적합한 프로모터, 인헨서, 임의의 필요한 리보좀 결합 부위, 폴리아데닐화 신호, 스플라이스 공여자와 수용자 부위, 전사 종결 서열, 5'-측부 비-전사 서열을 포함한다. SV40 바이러스 게놈으로부터 유래된 DNA 서열, 예를 들면 SV40 기점, 초기 프로모터, 인헨서, 스플라이스, 폴리아데닐화 신호는 비-전사된 유전 요소를 제공하는데 사용될 수 있다.
SEQ ID No 2의 PAPAP 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체의 생체내 발현은 숙주 미생물에서 고유 유전자의 발현 또는 생물학적 비활성 PAPAP 단백질의 생산과 관련된 유전적 결함을 수정하는데 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 치료할 환자에 적절한 유전 물질을 도입하여 SEQ ID No 2의 PAPAP 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체의 생체내 생산을 위해 설계된 재조합 발현 벡터에 관한다. 상기 유전 물질은 환자로부터 사전에 추출된 세포에 시험관내에서 도입할 수 있는데, 이후 변형된 세포는 환자의 적합한 조직에 직접 생체내재도입할 수 있다.
2. 조절 요소
프로모터
본 발명에 따른 발현 벡터에 사용하는데 적합한 프로모터 영역은 이질성 유전자가 발현되는 세포 숙주를 고려하여 선택한다. 관심있는 핵산 서열의 발현을 조절하는데 사용되는 프로모터는 표적 세포에서 핵산의 발현을 유도할 수만 있다면, 큰 의미를 갖지 않는다. 따라서, 사람 세포를 표적하는 경우에는 사람 세포에서 발현될 수 있는 프로모터, 예를 들면 사람이나 바이러스 프로모터에 인접하여 또는 상기 프로모터하에 핵산 코딩 영역을 위치시키는 것이 바람직하다.
적합한 프로모터는 발현을 조절할 핵산에 대하여 이질성이거나 또는 대안으로 발현되는 코딩 서열을 포함하는 고유 폴리뉴클레오티드에 대하여 내인성일 수 있다. 이에 더하여, 프로모터는 구조 프로모터/코딩 서열이 삽입되는 재조합 벡터 서열에 대하여 이질성이다.
프로모터 영역은 예로써 CAT(클로람페니콜 전이효소) 벡터, 바람직하게는 pKK232-8과 pCM7 벡터를 이용하여 임의의 원하는 유전자로부터 선택할 수 있다.
바람직한 박테리아 프로모터는 LacI, LacZ, T3이나 T7 박테리아파지 RNA 중합효소 프로모터, gpt, 람다 PR, PL, trp 프로모터(EP 0036776), 폴리헤드린 프로모터, 바쿨로바이러스로부터 유래된 p10 단백질 프로모터(Kit Novagen)(Smith et al., 1983; O'Reilly et al., 1992), 람다 PR 프로모터 또는 trc 프로모터이다.
진핵 프로모터에는 극초기 CMV, HSV 티미딘 키나아제, 초기와 후기 SV40, 레트로바이러스로부터 유래된 LTR, 생쥐 메탈로티오네인-L이 포함된다. 간편한 벡터와 프로모터의 선택은 당업자에게 자명하다.
프로모터의 선택은 유전공학 분야의 당업자에게 자명하다. 가령, Sambrook et al.(1989) 또는 Fuller et al.(1996)에서 밝힌 과정을 참조한다.
다른 조절 요소
cDNA 삽입체를 이용하는 경우에는, 유전자 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 달성하기 위하여 폴라아데닐화 신호를 포함시키는 것이 바람직하다. 폴리아데닐화 신호의 특성은 본 발명의 성공적인 실행에 중요한 의미를 갖지 않고, 임의의 서열, 예를 들면 사람 성장 호르몬과 SV40 폴리아데닐화 신호를 사용할 수 있다. 종결자 역시 발현 카세트의 요소로 고려된다. 이들 요소는 메시지 수준을 강화시키고 카세트로부터 다른 서열로의 통독을 최소화시키는 역할을 한다.
3. 선별성 마커
이런 마커는 세포에 확인가능한 변화를 전달하여 발현 구조체를 포함하는 세포의 조기 동정을 가능하게 한다. 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 선별가능한 마커 유전자는 바람직하게는, 진핵 세포 배양액에서 다이하이드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 저항성; 발아효모(S. cerevisiae)에서 TRP1; 대장균(E. coli)에서 테트라사이클린, 리팜프신 또는 앰피실린 저항성 또는 마이코박테리아(mycobacteria)에서 대한 레반 사카라제인데, 상기 후자 마커는 음성 선별 마커이다.
4. 선호되는 벡터
박테리아 벡터
박테리아에 사용되는데 유용한 발현 벡터는 선별가능한 마커 및 pBR322(ATCC 37017) 유전 요소를 보유하는 상업적으로 가용한 플라스미드로부터 유래된 박테리아 복제 기점을 포함할 수 있다. 이런 상업적 벡터에는 예로써 pKK223-2(Pharmacia, Uppsala, Sweden)과 GEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)이 포함된다.
다수의 다른 적합한 벡터가 당분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 다음과 같은 박테리아 벡터가 상업적으로 가용하다: pQE70, pQE60, pQE-9(Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174 pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A(Stratagene); ptrc99a pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5(Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene); pSVK3 pBPV, pMSG, pSVL(Pharmacia); pQE-30(QIAexpress).
박테리아파지 벡터
P1 박테리아파지 벡터는 80 내지 100kb의 많은 삽입체를 포함할 수 있다.
P1 박테리아파지 벡터, 예를 들면 p158 또는 p158/neo8의 작제는 Stemberg(1992, 1994)에서 기술한다. PAPAP 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 P1 클론은 40kb이상의 폴리뉴클레오티드를 삽입하는데 고려할 수 있다(Linton et al., 1993). 유전자도입 실험을 위한 P1 DNA를 만드는데 적합한 프로토콜은 McCormick et al.(1994)에서 기술한다. 간단히 말하면, P1 플라스미드를 보유하는 대장균(E. coli)(바람직하게는, NS3529)은 25㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 액체 배지에서 하룻밤동안 배양한다. P1 DNA는 Qiagen Plasmid Maxi kit(Qiagen, Chatsworth, CA USA)를 이용한 알칼리성 세포용해로 대장균(E. coli)으로부터 준비한다. P1 DNA는 2개의 Qiagen-tip 500 칼럼에서 키트에 포함된 세척과 용출 완충액을 이용하여 박테리아 용해질로부터 정제한다. 이후, 페놀/클로로포름 추출을 실시하고, 후속으로 70% 에탄올로 DNA를 침전시킨다. TE(10 mM Tris-HCL, pH 7.4, 1mM EDTA)에 DNA를 용해시킨 이후, DNA의 농도는 분광광도법으로 평가한다.
유전자도입 동물, 전형적으로 유전자도입 생쥐에서 PAPAP 뉴클레오티드 서열을 보유하는 P1 클론을 발현시키는 경우에는 예로써 P1 폴리링커(SfiI, NotI 또는 SalI)내 빈도가 낮은 절단 부위에서 P1 DNA를 절단하여 P1 DNA 단편으로부터 벡터 서열을 제거하는 것이 바람직하다. 이후, P1 삽입체는 YAC로부터 DNA의 분리에서 적용된 방법(Schedl et al. 1993a; Peterson et al., 1993)으로 펄스-필드 아가로즈 겔에서 벡터 서열로부터 정제한다. 필요한 경우에, 정제된 삽입체 DNA는 Millipore Ultrafree-MC Filter Unit(Millipore Bedford, MA USA-30,000 분자량 한계)에서 농축하고, 후속으로 마이크로투석 막(type VS, 0.025 ㎛, Millipore)에서 100mM NaCl, 30μM 스페르민, 70μM 스프레미딘을 함유하는 마이크로주사 완충액(10mM Tris-HCl, pH 7.4, 250㎛ EDTA)에 투석한다. 정제된 P1 DNA 삽입체의 보존도(intactness)는 1% 아가로즈(Sea Kem GTG: FMC Bio-products) 펄스-필드 겔에서 전기영동 및 브롬화에티듐 염색으로 평가한다.
바쿨로바이러스 벡터
SEQ ID No 2의 PAPAP 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체에 적합한 벡터는곤충 세포와 곤충 세포주에서 증식할 수 있는 바쿨로바이러스 벡터이다. 특히 적합한 숙주 벡터 시스템은 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터 유래된 SF9 세포주(ATCC N°CRL 1711)를 트랜스펙션시키는데 사용되는 pVL1392/1393 바쿨로바이러스 전달 벡터(Pharmingen)이다.
바쿨로바이러스 발현 시스템에서 SEQ ID No 2의 PAPAP 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체에 적합한 다른 벡터에는 Chai et al.(1993), Vlasak et al.(1983), Lenhard et al.(1996)에서 밝힌 벡터가 포함된다.
바이러스 벡터
특정 구체예에서, 벡터는 아데노바이러스부터 유래된다. 본 발명에 따른 적절한 아데노바이러스 벡터는 Feldman와 Steg(1996) 또는 Ohno et al.(1994)에서 밝힌 벡터이다. 본 발명의 특정 구체예에 따른 다른 적절한 재조합 아데노바이러스는 2형이나 5형 사람 아데노바이러스(Ad2, Ad 5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스(French N°FR-93.05954)이다.
일반적으로, 레트로바이러스와 아데노-관련된 바이러스 벡터는 생체내에서 외인성 폴리뉴클레오티드를 사람을 비롯한 포유동물에 전달하는데 선택되는 재조합 유전자 전달 시스템이다. 이들 벡터는 유전자의 세포로의 효과적인 전달을 제공하고, 전달된 핵산은 숙주의 크로모좀 DNA에 안정적으로 통합된다.
본 발명에 따른 레트로바이러스 시험관내 또는 생체내 유전자 전달체의 제조나 작제에 특히 적절한 레트로바이러스는 Mink-Cell 집중 유도 바이러스, 뮤린 육종 바이러스, 레티쿨로엔도텔리오시스 바이러스, 라우스 육종 바이러스에서 선택되는 레트로바이러스이다. 특히 바람직한 뮤린 백혈병 바이러스에는 4070A와 1504A 바이러스, Abelson(ATCC No VR-999), Friend(ATCC No VR-245), Gross(ATCC No VR-590), Rauscher(ATCC No VR-998), Moloney 뮤린 백혈병 바이러스(ATCC No VR-190; PCT 출원 WO 94/24298)가 포함된다. 특히 바람직한 라우스 육종 바이러스에는 Bryan high titer(ATCC Nos VR-334, VR-657, VR-726, VR-659, VR-728)가 포함된다. 다른 적절한 레트로바이러스 벡터는 Roth et al.(1996), PCT 출원 WO 93/25234, PCT 출원 WO 94/06920 Roux et al., 1989, Julan et al., 1992, Neda et al., 1991에서 기술한다.
본 발명에서 고려되는 또 다른 바이러스 벡터 시스템은 아데노-관련된 바이러스(AAV)로 구성된다. 아데노-관련된 바이러스는 효과적인 복제 및 생명 사이클을 위한 보조 바이러스로 다른 바이러스, 예를 들면 아데노바이러스 또는 포진 바이러스를 필요로 하는 자연 발생 결함 바이러스이다(Muzyczka et al., 1992). 이는 DNA를 비-분열 세포에 통합시키고 높은 빈도의 안정적 통합을 보이는 극소수 바이러스중 하나이다(Flotte et al., 1992; Samulski et al., 1989; McLaughlin et al., 1989). AAV의 다른 장점은 형질전환된 세포와 관련된 일차 세포(primary cell)를 형질도입하는 능력의 감소에 기인한다.
BAC 벡터
박테리아 인공 크로모좀(BAC) 클로닝 시스템(Shizuya t al., 1992)은 큰 게놈 DNA 단편(100-300kb)을 대장균(E. coli)에 안정적으로 유지시키기 위하여 개발되었다. 적절한 BAC 벡터는 Kim et al.(1996)에서 밝힌 pBeloBAC11 벡터를 포함한다. BAC 라이브러리는 벡터에서 Bam HI 또는 HindⅢ 부위로의 결찰을 허용하는 효소로 부분적으로 절단된 크기-선별된 게놈 DNA를 이용하여 상기 벡터로 준비한다. 이들 클로닝 부위의 측부는 RNA 전사 또는 PCR 방법으로 최종 프로브를 만드는데 사용할 수 있는 T7과 SP6 RNA 중합표소 전사 개시 부위이다. 대장균(E. coli)에서 BAC 라이브러리의 작제이후, BAC DNA는 숙주 세포로부터 초나선 환형으로 정제된다. 이들 환형 분자를 선형으로 전환시키기에 앞서, 크기 결정 및 BAC의 수용체 세포로의 도입이 진행된다. 클로닝 부위는 2개의 NotⅠ부위가 측면에 접하는데, 이들 부위는 NotⅠ절단에 의해 클론된 분절이 벡터로부터 절단되도록 한다. 대안으로, pBeloBAC11 벡터에 포함된 DNA 삽입체는 단일 cosN 부위에서 절단을 유발하는 상업적으로 가용한 효소 람다 털미나제(terminase)로 BAC 벡터를 처리하여 선형화시킬 수 있지만, 이런 절단 방법은 삽입체 DNA와 BAC 서열을 모두 포함하는 전장 BAC 클론을 결과한다.
5. 재조합 벡터의 전달
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드 구조체의 발현을 달성하기 위하여, 이들 구조체는 세포로 전달되어야 한다. 이런 전달은 세포주를 형질전환시키는 실험실 과정에서와 같이 시험관내에서, 또는 특정 질환의 치료에서와 같이 생체내외에서 달성할 수 있다.
한가지 기전은 바이러스 감염인데, 여기서 발현 구조체는 감염성 바이러스 입자에 통합된다.
본 발명에서는 폴리뉴클레오티드를 배양된 포유동물 세포에 전달하기 위한몇몇 비-바이러스 방법을 고려하는데, 여기에는 칼슘 포스페이트 침전(Graham et al., 1973; Chen et al., 1987), DEAE-덱스트란(Gopal, 1985), 에렉트로포레이션(Tur-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), 직접 미세주사(Harland et al., 1985), DNA-적하된 리포좀(Nicolau et al., 1982; Fraley et al., 1979), 수용체-매개된 트랜스펙션(Wu and Wu, 1987; 1988) 등이 포함된다. 이들 기술중 일부는 생체내외 용도에 성공적으로 적용될 수 있다.
발현 폴리뉴클레오티드가 세포에 전달되면, 이는 수용자 세포의 게놈에 안정적으로 통합될 수 있다. 이런 통합은 상동성 재조합을 통하여 동원(cognate)위치와 배향으로 진행되거나(유전자 치환) 또는 무작위의 비-특이적인 위치로 통합될 수 있다(유전자 보충). 다른 구체예에서, 핵산은 별도의 에피좀 DNA 분절로 세포에서 안정적으로 유지될 수도 있다. 이런 핵산 분절 또는 "에피좀"은 숙주 세포 사이클과 독립적으로 또는 이런 사이클과 동조하여 복제와 유지를 가능하게 하는 서열을 인코드한다.
특정 구체예에서, 생체내에서 단백질 또는 펩티드를 척추동물의 세포내로 전달하는 방법은 생리적으로 수용가능한 담체 및 관심있는 폴리펩티드를 작동적으로 코딩하는 나신 폴리뉴클레오티드를 함유하는 제형을 세포로 구성되는 조직의 간질성 공간에 도입하는 단계로 구성되고, 여기서 나신 폴리뉴클레오티드는 세포의 내부로 흡수되고 생리 효과를 보인다. 이는 특히 시험관내 전달에 적용할 수 있지만, 시험관내 전달에도 적용할 수 있다.
"나신" 폴리뉴클레오티드로 구성되는 시험관내와 생체내에서 사용되는 조성물은 PCT 출원 WO 90/11092(Vical Inc.), PCT 출원 WO 95/11307(Institut Pasteur, INSERM, Universite d'Ottawa), Tacson et al.(1996), Huygen et al.(1996)에서 기술한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 구조체를 비롯하여 본 발명에 따른 나신 폴리뉴클레오티드의 세포로의 전달은 입자 폭탄(바이오리스틱)으로 실시하는데, 상기 입자는 고속으로 가속되는 DNA-피복된 마이크로발사체로서, 이들 DNA가 세포막을 통과하여 세포에 진입하도록 한다(Klein et al.(1987)).
적절한 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 리포좀에 포집된다(Ghosh and Bacchawat, 1991; Wong et al., 1980; Nicolau et al., 1987).
특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 PAPAP 단백질 또는 폴리펩티드의 생체내 생산을 위한 조성물을 제시한다. 상기 조성물은 생리학적으로 수용가능한 담체에 용해되고 조직에 도입되면 조직의 세포가 상기 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하도록 하는 이런 폴리펩티드를 작동적으로 코딩하는 나신 폴리뉴클레오티드로 구성된다.
원하는 숙주 미생물에 주사되는 벡터의 함량은 주사 부위에 따라 달라진다. 일반적으로, 동물 신체, 바람직하게는 포유동물 신체, 예를 들면 생쥐 신체에 0.1 내지 100㎍이 주사된다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 벡터는 숙주 세포, 바람직하게는 처리된 동물로부터 수거된 숙주 세포, 좀더 바람직하게는 체세포(예, 근세포)에 도입할 수 있다. 후속 단계에서, 세포는 원하는 PAPAP 폴리펩티드 또는 이의 단편을 코딩하는 벡터로 형질전환되고, 상기 세포는 동물 신체에 재도입하여 상기 재조합 단백질을 국소적으로 또는 전신적으로 체내에 전달한다.
세포 숙주
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 특히 SEQ ID No 1이나 3의 PAPAP 폴리펩티드의 PAPAP 조절 폴리뉴클레오티드 또는 코딩 서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드, 이의 단편이나 변이체로 형질전환 또는 트랜스펙션되는 숙주 세포에 관한다. 본 발명에는 전술한 재조합 벡터로 형질전환(원핵 세포) 또는 트랜스펙션(진핵 세포)된 숙주 세포 역시 포함된다. 좀더 구체적으로, 본 발명의 세포 숙주는 "PAPAP 유전자의 게놈 서열" 섹션, "PAPAP cDNA 서열" 섹션, "코딩 영역" 섹션, "폴리뉴클레오티드 구조체" 섹션, "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머" 섹션에서 밝힌 폴리뉴클레오티드를 보유할 수 있다.
본 발명에 따른 다른 재조합 세포 숙주는 본원에서 밝힌 임의의 벡터, 좀더 구체적으로 "재조합 벡터" 섹션에서 밝힌 임의의 벡터를 보유할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터에 대한 수용자로 사용하는데 적합한 숙주 세포는 다음과 같다:
a) 원핵 숙주 세포: 대장균(Escherichia coli)(I.E.DH5-α균주), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무림(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스(Pseudomonas), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 스태필로코커스(Staphylococus)와 같은 종으로부터 유래된 균주;
b) 진핵 숙주 세포: HeLa 세포(ATCC N°CCL2; N°CCL2.1; N°CCL2.2), Cv 1세포(ATCC N°CCL70), COS 세포(ATCC N°CRL1650; N°CRL1651), Sf-9 세포(ATCC °CRL1711), C127 세포(ATCC N°CRL-1804); 3T3(ATCC N°CRL-6361), CHO(ATCC N°CCL-61), 사람 신장 293(ATCC N°45504; N°CRL-1573), BHK(ECACC N°84100501; N°84111301);
c) 다른 포유동물 숙주 세포.
포유동물, 전형적으로 사람 세포에서 PAPAP 유전자 발현은 불완전하거나, 또는 대안으로 본 발명에 따른 PAPAP 폴리뉴클레오티드로 동물 세포의 게놈에서 PAPAP 유전자 상대를 대체하는 게놈 서열이나 cDNA 서열의 삽입으로 진행된다. 이런 유전적 변형은 전술한 특이적인 DNA 구조체를 이용한 상동성 재조합으로 달성할 수 있다.
사용할 수 있는 세포 숙주중 한가지는 포유동물 접합자, 예를 들면 뮤린 접합자이다. 가령, 뮤린 접합자는 관심있는 정제된 DNA 분자, 예를 들면 100mM NaCl 30μM 스페르민, 70μM 스페르미딘을 함유하는 10mM Tris-HCl, pH 7.4, 250㎛ EDTA에서 1 ng/㎖(BAC 삽입체) 내지 3ng/㎕(P1 박테리오파지 삽입체) 농도 범위로 조정된 정제된 DNA 분자를 미세주사할 수 있다. 미세주사되는 DNA가 대형인 경우에는 폴리아민과 높은 염 농도를 이용하여 DNA의 물리적 파괴를 피할 수 있다(Schedl et al.(1993b)).
본원에서 밝힌 DNA 구조체를 비롯한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 배아 줄기(ES) 세포주, 바람직하게는 생쥐 ES 세포주에 도입할 수 있다. ES 세포주는
착상전 배반포의 내세포괴(inner cell mass)의 전능한 비수임된 세포로부터 유래한다. 적절한 ES 세포주는 다음과 같다: ES-E14TG2a(ATCC n°CRL-1821), ES-D3(ATCC n°CRL1934, n°CRL-11632), YS001(ATCC n°CRL-11776), 36.5(ATCC n°CRL-11116). ES 세포는 비수임된 상태로 유지하기 위하여, 배아 표현형을 보존하는데 적합한 신호를 제공하고 ES 세포 유착을 위한 매트릭스로 기능하는 성정 저해된 영양세포의 존재하에 배양한다. 적절한 영양 세포는 Abbondanzo et al.(1993)에서 밝힌 바와 같이 지속 배양되고 Robertson(1987)에서 밝힌 바와 같이 자외선 또는 Pease와 Williams(1990)가 밝힌 바와 같이 저해 농도의 LIF 존재에 의해 성장이 저해되는 거의 모든 생쥐 계통의 13일 내지 14일된 배아의 조직으로부터 확립된 원시 배아 섬유아세포이다.
숙주 세포에서 구조체는 재조합 서열에 의해 인코드되는 유전자 산물을 생산하는 통상적인 방법에 사용할 수 있다.
적합한 숙주의 형질전환 및 적절한 세포밀도까지 숙주의 배양이후, 적당한 수단, 예를 들면 온도 변화 또는 화학적 유도로 선별 프로모터를 유도하고, 세포는 추가로 일정 기간동안 배양한다.
전형적으로, 세포는 원심분리로 수거하고 물리적 또는 화학적 수단으로 파괴하며, 생성된 정제되지 않은 추출물은 추가 정제를 위해 보관한다.
단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴 또는 세포용해제의 이용을 비롯한 임의의 간편한 방법으로 파괴할 수 있다. 이런 방법은 당분야에 공지된 것이다.
PAPAP 유전자 활성화
또한, 본 발명은 a) 표적 유전자의 내인성 크로모좀 DNA로 외인성(이질성) 폴리뉴클레오티드 삽입, b) 내인성 크로모좀 DNA 결실, 및/또는 c) 내인성 크로모좀 DNA의 외인성 폴리뉴클레오티드로의 치환된 척추동물 기원, 바람직하게는 포유동물 기원, 특히 사람 기원의 일차, 이차, 불사화된 상동성 재조합된 숙주 세포에 관한다. 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입, 결실 또는 치환은 표적 유전자의 코딩 서열 및/또는 조절 영역, 예를 들면 표적 유전자와 작동적으로 연결된 프로모터와 인헨서 서열에서 발생할 수 있다.
또한, 본 발명은 시험관내 또는 생체내에서 상동성 재조합된 숙주 세포를 만드는 방법에 관하는데, 여기서 세포에서 정상적으로 발현되지 않는 표적 유전자의 발현이 변화된다. 바람직하게는, 이런 변형은 정상 성장 조건 또는 표적 유전자에 의해 인코드되는 폴리펩티드를 생산하는데 적합한 조건하에 표적 유전자의 발현을 유도한다. 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다: (a) 시험관내 또는 생체내에서 세포를 폴리뉴클레오티드 구조체로 트랜스펙션시키고, 상기 폴리뉴클레오티드 구조체는 (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열 및/또는 코딩 서열; (iii) 필요한 경우 트랜스펙션된 세포를 생산하기 위한 비대합된 스플라이스 공여자 부위로 구성되고; (b) 시험관내 또는 생체내에서 트랜스펙션된 세포를 상동성 재조합에 적합한 조건하에 유지시킨다.
또한, 본 발명은 시험관내 또는 생체내 세포에서 표적 유전자의 발현을 변화시키는 방법에 관하는데, 여기서 상기 유전자는 세포에서 정상적으로 발현되지 않고, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: (a) 시험관내 또는 생체내에서 세포를 폴리뉴클레오티드 구조체로 트랜스펙션시키고, 상기 폴리뉴클레오티드 구조체는 (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열 및/또는 코딩 서열; (iii) 필요한 경우 트랜스펙션된 세포를 생산하기 위한 비대합된 스플라이스 공여자 부위로 구성되고; (b) 시험관내 또는 생체내에서 트랜스펙션된 세포를 유전자 발현에 적합한 조건하에 유지시킨다.
또한, 본 발명은 시험관내 또는 생체내 세포에서 표적화된 내인성 유전자의 발현을 변화시켜 본 발명에 따른 폴리펩티드를 만드는 방법에 관하는데, 여기서 상기 유전자는 세포에서 정상적으로 발현되지 않고, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다: (a) 시험관내에서 세포를 폴리뉴클레오티드 구조체로 트랜스펙션시키고, 상기 폴리뉴클레오티드 구조체는 (i) 표적화 서열; (ii) 조절 서열 및/또는 코딩 서열; (iii) 필요한 경우 트랜스펙션된 세포를 생산하기 위한 비대합된 스플라이스 공여자 부위로 구성되고; (b) 시험관내 또는 생체내에서 트랜스펙션된 세포를 상동성 재조합에 적합한 조건하에 유지시켜 상동성 재조합된 세포를 만들고; c) 시험관내 또는 생체내에서 트랜스펙션된 세포를 유전자 발현에 적합한 조건하에 유지시켜 폴리펩티드를 생산한다.
또한, 본 발명은 세포에서 표적화된 유전자의 발현을 변화시키는 폴리뉴클레오티드 구조체에 관하는데, 여기서 상기 유전자는 정상적으로 발현되지 않는다. 이는 폴리뉴클레오티드 구조체가 표적 세포의 크로모좀 DNA에 삽입되는 경우에 발생하는데, 여기서 폴리뉴클레오티드 구조체는 다음과 같이 구성된다: (i) 표적화서열; (ii) 조절 서열 및/또는 코딩 서열; (iii) 필요한 경우, 비대합된 스플라이스-공여자 부위. 본 발명에는 전술한 폴리뉴클레오티드 구조체도 포함되는데, 여기서 상기 구조체는 폴리펩티드를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고 크로모좀 DNA와 상동성 재조합이후 표적화된 내인성 유전자와 쌍을 이룬다.
조성물은 당분야에 공지된 방법과 기술로 생산할 수 있다(미국 특허 출원 6,054,288; 6,048,729; 6,048,724; 6,048,524; 5,994,127; 5,968,502; 5,965,125; 5,869,239; 5,817,789; 5,783,385; 5,733,761; 5,641,670; 5,580,734; PCT 출원 WO 96/29411, WO 94/12650; 과학 논문 Koller et al. Proc, 1994, Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935(1989)).
유전자도입 동물
본원에서 "유전자도입 동물" 또는 "숙주 동물"은 게놈이 유전적으로, 인위적으로 조작되어 본 발명에 따른 핵산중 한가지를 포함하는 동물을 의미한다. 바람직한 동물은 사람을 제외한 동물인데, 여기에는 본 발명에 따른 핵산의 삽입에 의해 게놈이 인위적으로, 유전적으로 변형되고Mus(예, 생쥐),Rattus(예, 쥐),Oryctogalus(예, 토끼)에서 선택되는 속(genus)에 속하는 동물이 포함된다. 한 구체예에서, 본 발명에는 본 발명에 따른 재조합 벡터 또는 본 발명의 적중 벡터와의 상동성 재조합으로 파괴된 PAPAP 유전자를 보유하는 사람아닌 숙주 포유동물 및 동물이 포함된다.
본 발명의 유전자도입 동물은 복수의 세포에 클론된 재조합 또는 합성 DNA 서열, 좀더 구체적으로 PAPAP 코딩 서열, PAPAP 조절 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 구조체 또는 본원에서 밝힌 안티센스 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 DNA 서열로 구성되는 분리되거나 정제된 핵산을 보유한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 유전자도입 동물은 본원에서 밝힌 폴리뉴클레오티드, 재조합 벡터, 세포 숙주를 보유한다. 특히, 본 발명의 유전자도입 동물은 "PAPAP 유전자의 게놈 서열" 섹션, "PAPAP cDNA 서열" 섹션, "코딩 영역" 섹션, "폴리뉴클레오티드 구조체" 섹션, "올리고뉴클레오티드 프로브와 프라이머" 섹션, "재조합 벡터" 섹션, "세포 숙주" 섹션에서 밝힌 폴리뉴클레오티드를 보유할 수 있다.
적절한 첫 번째 구체예에서, 이들 유전자도입 동물 특히, 고유 PAPAP 단백질 또는 대안으로 돌연변이 PAPAP 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 한 개 또는 수 개의 사본이 삽입된 게놈을 갖는 유전자도입 동물은 세포 분화와 관련된 다양한 병리를 연구하기 위한 훌륭한 실험 모델일 될 수 있다.
적절한 두 번째 구체예에서, 이들 유전자도입 동물은 PAPAP 유전자의 조절 폴리뉴클레오티드의 조절하에 원하는 폴리펩티드를 발현하여, 궁극적으로 높은 수율로 상기 단백질 합성 및 이런 단백질의 조직 특이적 발현을 달성한다.
본 발명에 따른 유전자도입 동물의 설계는 당분야에 공지된 통상적 기술로 만들 수 있다. 유전자도입 동물, 특히 유전자도입 생쥐의 생산과 관련하여 미국 특허 4,873,191(Oct. 10, 1989); 5,464,764(Nov 7, 1995); 5,789,215(Aug 4, 1998)를 참조할 수 있다.
본 발명의 유전자도입 동물은 외인성 유전자 물질을 통합하는 게놈을 갖는동물을 결과하는 과정으로 만들 수 있다. 이런 과정에는 PAPAP 코딩 서열, PAPAP 조절 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 구조체 또는 본원에서 밝힌 안티센스 폴리뉴클레오티드를 인코드하는 DNA 서열을 인코드하는 유전 물질 또는 이의 일부분을 얻는 단계가 포함된다.
본 발명의 재조합 폴리뉴클레오티드는 배아 또는 ES 줄기 세포주에 삽입한다. 이런 삽입은 에렉트로포레이션으로 실시한다(Thomas et al.(1987)). 에렉트로포레이션되는 세포는 스크리닝하여(선별가능 마커를 통한 선별, PCR 또는 서던 블랏 분석), 가급적 상동성 재조합으로 자신의 게놈에 외인성 재조합 폴리뉴클레오티드를 통합하는 양성 세포를 찾는다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 양성-음성 선별 과정은 Mansour et al.(1988)에서 기술한다.
이후, 양성 세포는 분리하고 클론하며 생쥐로부터 얻은 3.5일된 배반포에 주사한다(Bradley(1987)). 이후, 배반포는 암컷 숙주 동물에 삽입하고 일정 기간 성장시킨다.
대안으로, 양성 ES 세포는 2.5 일된 8-16 세포 단계 배아(상실배)와 접촉시키고(Wood et al.(1993), Nagy et al.(1993)), ES 세포는 흡수하여 생식세포주로 발달하는 세포를 비롯한 배반포의 광범위한 콜로니를 형성한다.
암컷 숙주의 후손은 검사하여 야생형 동물과 유전자도입된, 다시 말하면 삽입된 외인성 DNA를 보유하는 동물을 확인한다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 다른 핵산, 재조합 발현 벡터 또는 재조합 숙주 세포를 보유하는 유전자도입 동물에 관한다.
본 발명의 유전자도입 동물로부터 유래된 재조합 세포주
본 발명의 또 다른 목적은 본원에서 밝힌 유전자도입 동물로부터 수득된 재조합 숙주 세포에 관한다. 한 구체예에서, 본 발명에는 본 발명에 따른 재조합 벡터 또는 적중 벡터와의 상동성 재조합으로 파괴된 PAPAP 유전자를 보유하는 사람아닌 숙주 포유동물 및 동물로부터 유래된 세포가 포함된다.
재조합 세포주는 본 발명에 다른 유전자도입 동물의 임의 조직으로부터 수득되는 세포로부터 시험관내에서 예로써 SV40 거대 T 항원과 같은onc-유전자를 발현하는 벡터로 원시 세포 배양액의 트랜스펙션으로 확립할 수 있다(Chou(1989), Shay et al.(1991))
정신분열증과 양극성 장애의 치료를 위한 화합물의 확인 분석
본 발명은 CNS 질환을 치료하는, 특히 PAPAP에 의해 매개되는 CNS 질환의 증상을 완화시키는 화합물의 능력을 검사하는데 활용할 수 있다. 적절한 구체예에서, 화합물은 PAPAP에 의해 매개되는 정신분열증 또는 양극성 장애의 증상을 완화시키는 능력을 검사한다. 또한, 화합물은 관련된 질환, 예를 들면 정신 질환, 기분 장애, 자폐증, 약물 의존과 알코올 중독, 정신 지체 및 인식 장애, 정신 장애, 불안 장애, 섭식 장애, 충동 조절 장애, 인격 장애를 비롯한 다른 정신 질환을 치료하는 능력을 검사할 수 있다[Diagnosis Statistical Manual of Mental Disorder fourth edition(DSM-Ⅳ) 분류].
또한, 본 발명은 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환의 모델로 영장류와 설취류를 비롯한 세포와 동물을 제시한다.
한 측면에서, PAPAP 활성에 영향을 주는 화합물의 확인을 위한 비-세포 기초한, 세포-기초한, 동물 기초한 분석법을 제시한다. PAPAP 활성은 임의의 기전에 의해 영향을 받을 수 있다; 특정 구체예에서, PAPAP 활성은 PAPAP 유전자 발현의 수준 또는 PAPAP 유전자 산물의 활성을 조절하여 영향을 준다.
한 측면에서, g34872 활성에 영향을 주는 화합물의 확인을 위한 비-세포 기초한, 세포-기초한, 동물 기초한 분석법을 제시한다. G34872 활성은 PAPAP 유전자 발현의 수준 또는 PAPAP 유전자 산물의 활성을 조절하여 영향을 줄 수 있다. 바람직하게는, g34872 활성에 영향을 주는 이런 화합물을 확인하기 위한 분석은 PAPAP와 g34872의 상호작용을 검출하거나 또는 PAPAP-g34872 복합체를 검출할 수 있다.
이런 방법은 PAPAP 또는 g34872 활성에 직접적인 또는 간접적인 영향을 주는 화합물을 확인할 수 있다. 본 발명의 비-세포 기초한, 세포-기초한, 동물 기초한 분석법은 PAPAP 자체를 제외한 PAPAP 경로의 요소에 작용하는 화합물을 확인하는데 활용할수 있다. 이후, 이들 화합물은 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환에 관여하는 PAPAP와 다른 유전자 산물을 조절하는 치료 약물로 사용할 수 있다.
세포와 비-세포 기초한 분석법
한 측면에서, 재조합 또는 비-재조합 세포를 이용한 세포 기초한 분석법은 PAPAP 활성을 조절하는 화합물을 확인하는데 활용할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 세포 기초한 분석법에는 정신 분열증, 양극성 장애 또는 관련된 CNS 질환을 치료하기 위한 검사 화합물을 확인하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 다음과 같이 구성된다: (a) 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된CNS 질환의 종점을 완화하는 농도와 시간으로 세포를 검사 화합물에 노출시키고; (b) 세포에서 PAPAP 활성의 수준 또는 PAPAP-g34872 상호작용이나 복합체를 확인한다. PAPAP 활성은 예로써 세포에서 mRNA 전사체 수준, PAPAP 펩티드 발현, 국소화 또는 단백질 활성을 분석하여 측정할 수 있다. 바람직하게는, 검사 화합물은 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환의 증상을 완화시킬 수 있는 화합물이다. PAPAP 활성을 조절할 수 있는 검사 화합물은 약물 개발에 선별적으로 사용할 수 있다. 이런 세포 기초한 분석법은 "PAPAP 유전자의 발현을 조절하는 리간드를 스크리닝하는 방법" 섹션에서 좀더 상세하게 설명한다.
다른 측면에서, 본 발명의 세포 기초한 분석법에는 정신 분열증 또는 양극성 장애를 치료하기 위한 검사 화합물을 확인하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 다음과 같이 구성된다: (a) 정신분열증-관련된 또는 양극성 장애-관련된 종점을 유발하는 수준의 PAPAP 활성에 세포를 노출시키고; (b) 상기 세포를 검사 화합물에 노출시킨다. 이후, 검사 화합물은 정신분열증-관련된 또는 양극성 장애-관련된 종점을 완화시키는 능력에 따라 선별할 수 있다. PAPAP 활성은 임의의 적합한 방법, 예를 들면 PAPAP 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공하고, PAPAP 발현을 증가시킬 수 있는 화합물로 상기 세포를 처리하고, PAPAP 펩티드로 상기 세포를 처리하여 제공할 수 있다. 바람직하게는, 검사 화합물은 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환의 증상을 완화시킬 수 있는 화합물이다; 하지만, 검사 화합물은 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환의 종점을 악화시킬 수도 있다. 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환의 검출가능한 증상 또는 종점을 완화시킬 수 있는 검사 화합물은 약물 개발에 선별적으로 사용할 수 있다. 적합한 세포주는 당업자가 결정할 수 있다; 바람직하게는, 신경 기원 세포주를 이용한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 PAPAP 펩티드가 세포 표면에 결합하는 지를 확인하고 PAPAP 수용체와 상호작용하여 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환을 치료하는 화합물을 확인하는 세포와 비-세포 기초한 분석법을 제시한다. 이런 구체예에서, PAPAP 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편은 본원에서 밝힌 바와 같이 발현 벡터에 클론시킨다. 단백질은 크기, 전하, 면역 크로마토그래피 또는 당업자에게 공지된 다른 기술로 정제한다. 정제이후, 단백질은 당업자에게 공지된 기술로 표지한다. 표지된 단백질은 상기 단백질이 세포 표면에 존재하는 임의의 수용체와 결합하도록 하는 다양한 장기 또는 조직으로부터 유래된 세포나 세포주와 함께 배양한다. 배양이후, 세포는 세척하여 비-특이적으로 결합된 단백질을 제거한다. 표지된 단백질은 자가방사법으로 검출한다. 대안으로, 표지안된 단백질은 세포와 함께 배양하고 검출가능한 라벨, 예를 들면 형광 분자가 부착된 항체로 검출할 수 있다. 세포 표면 결합의 특이성은 경합 분석을 실시하여 분석할 수 있는데, 여기서 다양한 함량의 표지안된 단백질은 표지된 단백질과 함께 배양한다. 세포 표면에 결합된 표지된 단백질의 함량은 표지안된 경합 단백질의 함량이 증가할수록 감소한다. 일부 결합 반응에서는 표지된 단백질과 무관한 다양한 함량의 표지안된 단백질을 대조군으로 포함시킨다. 세포 표면에 결합하는 표지된 단백질의 함량은 무관한 표지안된 단백질의 함량이 증가된 결합 반응에서 감소하지 않는데, 이는 핵산에 의해 인코드되는 단백질이 세포 표면에 특이적으로 결합한다는 것을 암시한다. 이런 분석의 한가지 예는 하기 실시예 1에 제시한다. 한 측면에서, PAPAP 결합은 g34872 폴리펩티드를 검출하고 위치 확인에 활용할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 비-세포 기초한 결합 분석에 관하는데, 여기서 PAPAP 폴리펩티드는 전술한 세포 기초한 결합 분석에서처럼 준비하고 정제한다. 정제이후, 단백질은 표지하고 PAPAP 폴리펩티드가 막에 존재하는 임의의 수용체에 결합하도록 하는 임의의 장기, 조직 또는 이들 조합에서 얻은 원하는 세포로부터 유래된 세포막 추출물 또는 분리물과 함께 배양한다. 배양이후, 막은 세척하여 비-특이적으로 결합된 단백질을 제거한다. 표지된 단백질은 자가방사법으로 검출한다. 대안으로, 표지안된 단백질은 세포와 함께 배양하고 검출가능한 라벨, 예를 들면 형광 분자가 부착된 항체로 검출할 수 있다. 세포 표면 결합의 특이성은 경합 분석을 실시하여 분석할 수 있는데, 여기서 다양한 함량의 표지안된 단백질은 표지된 단백질과 함께 배양한다. 세포 표면에 결합된 표지된 단백질의 함량은 표지안된 경합성 단백질의 함량이 증가할수록 감소한다. 일부 결합 반응에서는 표지된 단백질과 무관한 다양한 함량의 표지안된 단백질을 대조군으로 포함시킨다. 세포 표면에 결합된 표지된 단백질의 함량은 무관한 표지안된 단백질의 함량이 증가된 결합 반응물에서 감소하지 않는데, 이는 핵산에 의해 인코드되는 단백질이 세포 표면에 특이적으로 결합한다는 것을 암시한다. 이런 분석의 한가지 예는 하기 실시예 1에 제시한다. 한 측면에서, PAPAP 결합은 g34872 폴리펩티드를 검출하는데 활용할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 비-세포 기초한 결합 분석에 관하는데, 여기서PAPAP 폴리펩티드는 전술한 세포 기초한 결합 분석에서처럼 준비하고 정제한다. 정제이후, 단백질은 표지하고, PAPAP 폴리펩티드가 막에 존재하는 임의의 수용체와 결합하도록 하는 임의의 장기, 조직 또는 이들의 조합에서 얻은 세포로부터 유래된 세포막 추출물 또는 분리물과 함께 배양한다. 배양이후, 막은 세척하여 비-특이적으로 결합된 단백질을 제거한다. 표지된 단백질은 자가방사법으로 검출한다. PAPAP의 막 결합의 특이성은 경합 분석을 실시하여 분석할 수 있는데, 여기서 다양한 함량의 검사 화합물은 표지된 단백질과 함께 배양한다. 검사 폴리펩티드를 비롯한 원하는 검사 화합물은 상기 세포와 함께 배양할 수 있다. 검사 화합물은 검출가능한 라벨, 예를 들면 형광 분자가 부착된 항체로 검출할 수 있다. 세포 표면에 결합된 표지된 PAPAP 폴리펩티드의 함량은 경합성 검사 화합물의 함량이 증가할수록 감소한다. 일부 결합 반응에서는 검사 화합물과 무관한 다양한 함량의 표지안된 단백질이나 화합물을 대조군으로 포함시킨다. 세포 표면에 결합하는 PAPAP의 함량을 감소시킬 수 있는 검사 화합물은 치료 후보 화합물로 선별할 수 있다. 한 측면에서, PAPAP 결합은 g34872 폴리펩티드를 검출하는데 활용할 수 있다.
세포와 비-세포 기초한 분석법의 적절한 구체예에서, PAPAP 펩티드는 SEQ ID Nos 2의 적어도 4, 6 또는 8개의 연속 아미노산으로 구성된다.
상기 세포 기초한 분석법에는 적절한 기원의 임의 세포가 포함될 수 있다; 특히 적절한 세포는 사람 세포, 영장류 세포, 비-사람 영장류 세포, 생쥐 세포이다.
동물 모델 기초한 분석법
비-사람 동물 기초한 분석법은 PAPAP 활성을 조절하는 화합물을 확인하고, PAPAP를 연구하고, g34872 및 g34872 생물 경로를 연구하는데 사용할 수 있다. 본 발명에는 PAPAP 유전자가 결핍되거나, PAPAP 유전자를 조건적으로 발현하거나 또는 PAPAP 유전자의 사람이나 변형된 형태를 보유하는 동물을 비롯하여 비-유전자도입 혹은 유전자도입 동물에게 적합한 동물 모델 및 동물 기초한 분석법이 포함된다.
따라서, 본 발명은 PAPAP 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 조절할 수 있는 검사 화합물로 정신분열증, 양극성 장애 또는 이들의 증상을 보이는 동물을 치료하는데 활용할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 동물 기초한 분석법에는 정신 분열증 또는 양극성 장애를 치료하기 위한 화합물을 확인하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 다음과 같이 구성된다: (a) 정신분열증-관련된 또는 양극성 장애-관련된 종점을 유발하는 수준의 PAPAP 활성에 동물을 노출시키고; (b) 상기 동물을 검사 화합물에 노출시킨다. 이후, 검사 화합물은 정신분열증-관련된 또는 양극성 장애-관련된 종점을 완화시키는 능력에 따라 선별할 수 있다. PAPAP 활성은 임의의 적합한 방법, 예를 들면 PAPAP 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 제공하고, PAPAP 발현을 증가시킬 수 있는 화합물로 상기 동물을 처리하고, PAPAP 펩티드로 상기 동물을 처리하여 제공할 수 있다. 바람직하게는, 검사 화합물은 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환의 증상을 완화시킬 수 있는 화합물이다; 하지만, 검사 화합물은 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환의 종점을 악화시킬 수도 있다. 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환의 검출가능한 증상 또는 종점을 완화시킬 수 있는검사 화합물은 약물 개발에 선별적으로 사용할 수 있다.
한 구체예에서, 생쥐는 PAPAP 펩티드로 처리하고 검사 화합물에 노출시키며, 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환을 암시하는 증상은 반복행동을 관찰하여 평가한다. 다른 구체예에서, 상기 증상은 홈 케이지 관찰, 신경학적 평가, 스트레스-유도된 저체온증, 강요된 수영, PTZ 경련, 운동성 활동, 꼬리 현수(tail suspension), 상승된 플러스 메이즈(maze), 새로운 물체 인식, 프리펄스(prepulse) 저해, 냉열통, Y-메이즈, 대사 체임버 테스트((PsychoscreenTM, Psychogenics Inc.)중에서 적어도 한가지를 실시하여 평가한다. 다른 테스트는 Crawley et al, Horm. Behav. 31(3):197-21(1997); Crawley, Brain Res 835(1):18-26(1999)에서 기술한다.
임의의 적합한 검사 화합물은 본 발명의 스크리닝 방법에 사용할 수 있다. 본 발명의 방법으로 스크리닝할 수 있는 화합물에는 작은 유기나 무기 분자; 무작위와 통제된 폴리뉴클레오티드 라이브러리로부터 유래된 폴리뉴클레오티드를 비롯한 핵산; 무작위와 통제된 펩티드 라이브러리로부터 유래된 펩티드, 수용성 펩티드, 융합 펩티드, 포스포펩티드를 비롯한 펩티드; 다클론, 단클론, 키메라, 인화, 항-이디오타입 항체를 비롯한 항체; 단일 사슬 항체, FAb, F(ab')2, FAb 발현 라이브러리 단편, 이들의 에피토프-결합 단편이 포함된다. 특정 측면에서, 정신분열증, 양극성 장애, 관련된 질환의 증상이나 종점을 완화 또는 악화시킬 수 있는 화합물에는 전체적인 항정신성 약물, 신경이완제, 비특이성 신경이완제, 항우울제,항-불안제, 노르아데르날린성 작용제와 길항제, 도파민성 작용제와 길항제, 세로토닌 재흡수 저해물질, 벤조디아제핀이 포함된다.
이들 분석에서, 검사 화합물은 다양한 용량 수준으로 동물에 투여할 수 있다(예, Ⅳ, IP, IM, 경구 등). PAPAP 발현에 대한 화합물의 효과는 전술한 바와 같이 노던 블랏, 면역분석, PCR 등을 활용하여 예로써 혈액 또는 선택된 조직에서 PAPAP 수준을 비교하여 확인한다. 임의의 적합한 동물을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 동물은 영장류, 사람아닌 영장류, 포유동물 또는 생쥐이다. 인화된 생쥐, 다시 말하면 내인성 생쥐 단백질이 적중되고 표준 유전자도입 방식으로 상동상 사람 단백질이 부가된 생쥐 역시 실험 동물로 이용할 수 있다. 이런 생쥐는 인화된 형태의 단백질만을 발현한다. 사람 PAPAP만을 발현하는 인화된 생쥐는 PAPAP 단백질이나 mRNA 수준, 또는 PAPAP-g34872 상호작용이나 복합체를 조절하는 잠재적 약물에 대한 CNS 질환의 생체내 증상 반응을 연구하는데 이용할 수 있다. 예로써, 사람 apoE4 유전자를 보유하는 유전자도입 생쥐가 만들어졌다. 이들은 내인성 apoE가 결핍되고 알츠하이머병 발병의 원인으로 추정되는 사람 단백질을 보유하는 동물 모델을 생산하는 생쥐 라인의 후손들이다. 이런 유전자도입 동물은 질환의 생화학적, 생리적 단계를 상세히 분석하고 질환 개입을 위한 치료방법을 개발하는데 유용하다(Loring, et al, Neurobiol. Aging 17:173(1996).
PAPAP 폴리펩티드와 상호작용하는 물질의 스크리닝 방법
본 발명에서, 리간드는 PAPAP 단백질, 이의 단편 또는 변이체와 결합하거나 또는 PAPAP, 이의 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을조절할 수 있는 단백질, 펩티드, 항체 또는 임의의 화학적 합성화합물과 같은 분자를 의미한다.
본 발명에 따른 리간드 스크리닝 방법에서, PAPAP 단백질의 추정 리간드로 검사할 생물 시료 또는 정의된 분자는 상응하는 정제된 PAPAP 단백질, 예를 들면 재조합 세포 숙주에 의해 생산되는 상응하는 정제된 재조합 PAPAP 단백질과 접촉시켜 상기 단백질과 검사할 추정 리간드 분자간 복합체를 형성시킨다.
가령, SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성되는 PAPAP 단백질이나 이의 단편과 약물이나 소형 분자, 예를 들면 조합 화학, HPLC와 결부된 마이크로투석(Wang et al.(1997)) 또는 친화성 모세관 전기영동 방법(Bush et al.(1997))을 통하여 만들어진 분자의 복합체를 형성시킨다.
다른 방법에서, SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성되는 PAPAP 단백질이나 이의 단편과 상호작용하는 펩티드, 약물, 지방산, 리포프로테인 또는 작은 분자는 다음과 같은 분석법으로 확인할 수 있다. 결합을 검사할 분자는 검출가능한 라벨, 예를 들면 형광, 방사성 또는 효소 태그로 표지하고, 특이적인 결합이 가능한 조건하에 고정된 PAPAP 단백질이나 이의 단편과 접촉시킨다. 비-특이적으로 결합된 분자를 제거한 이후, 결합된 분자는 적절한 수단으로 검출한다.
본 발명의 다른 목적은 PAPAP 폴리펩티드와 상호작용하는 후보 물질을 스크리닝하는 방법과 키트에 관한다.
본 발명은 PAPAP 단백질, 이의 단편 또는 변이체와 상호작용하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제시한다. PAPAP 단백질, 이의 단편 또는 변이체와 공유 또는 비-공유 결합하는 능력으로 인해, 이들 물질은 시험관내와 생체내에서 효과적으로 사용할 수 있다.
시험관내에서, 이런 상호작용 분자는 시료, 바람직하게는 생물 시료에서 PAPAP 단백질의 존재를 확인하는 검출 수단으로 사용할 수 있다.
후보 물질을 스크리닝하는 방법은 다음의 단계로 구성된다.
a) SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성되는 PAPAP 단백질이나 이의 단편으로 구성되는 또는 이들을 포함하는 폴리펩티드를 제공하고;
b) 후보 물질을 수득하고;
c) 상기 폴리펩티드와 후보 물질을 접촉시키고;
d) 상기 폴리펩티드와 후보 물질간에 형성된 복합체를 검출한다.
한 구체예에서, 본 발명은 CNS 질환에서 g34872 경로의 연구를 위한 PAPAP의 용도에 관한다. 상호작용 물질을 스크리닝하는 방법은 PAPAP와 g34872의 상호작용을 검출하는데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 다음의 단계로 구성되는 스크리닝 방법에 관한다.
a) SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성되는 PAPAP 단백질이나 이의 단편으로 구성되는 또는 이들을 포함하는 폴리펩티드를 제공하고;
b) g34872을 수득하고;
c) 상기 PAPAP 폴리펩티드와 g34872 폴리펩티드를 접촉시키고;
d) 상기 PAPAP 폴리펩티드와 g34872 폴리펩티드간에 형성된 복합체를 검출한다.
바람직하게는, g34872 폴리펩티드는 SEQ ID No 5의 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 8 내지 10개의 아미노산으로 구성된다.
또한, 본 발명은 PAPAP 폴리펩티드와 상호작용하는 후보 물질을 스크리닝하는 키트에 관하는데, 상기 키트는 다음과 같이 구성된다.
a) SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성되는 PAPAP 단백질이나 이의 단편
b) 선택적으로, PAPAP 단백질, 이의 단편 또는 변이체와 후보 물질간에 형성된 복합체를 검출하는데 유용한 수단.
전술한 키트의 적절한 구체예에서, 검출 수단은 PAPAP 단백질, 이의 단편 또는 변이체에 대한 단클론이나 다클론 항체로 구성된다.
다양한 후보 물질이나 분자는 PAPAP 폴리펩티드와의 상호작용을 분석할 수있다. 이들 물질이나 분자에는 고유 혹은 합성 유기 화합물 또는 생물 기원의 분자, 예를 들면 폴리펩티드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 후보 물질이나 분자가 폴리펩티드를 포함하는 경우에, 상기 폴리펩티드는 파지-기초된 무작위 펩티드 라이브러리에 속하는 파지 클론의 발현 산물 또는 대안으로 이중-하이브리드 스크리닝 분석을 실시하는데 적합한 벡터에 클론된 cDNA 라이브러리의 발현 산물일 수 있다.
또한, 본 발명은 전술한 스크리닝 방법을 실행하는데 유용한 키트에 관한다. 바람직하게는, 이런 키트는 PAPAP 폴리펩티드, 이의 단편 또는 변이체 및 선택적으로 PAPAP 단백질, 이의 단편 또는 변이체와 후보 물질간에 형성된 복합체를 검출하는데 유용한 수단으로 구성되다. 적절한 구체예에서, 검출 수단은 PAPAP 단백질, 이의 단편 또는 변이체에 대한 단클론이나 다클론 항체로 구성된다.
A. 무작위 펩티드 라이브러리로부터 수득된 후보 리간드
스크리닝 방법의 특정 구체예에서, 추정 리간드는 파지 벡터에 포함된 DNA 삽입체의 발현 산물이다(Parmley and Smith, 1988). 특히, 무작위 펩티드 파지 라이브러리가 사용된다. 무작위 DNA 삽입체는 8 내지 20개 아미노산 길이의 펩티드를 인코드한다(Oldenburg K.R. et al., 1992; Valadon P., et al., 1996; Lucas A.H., 1994; Westerink M.A.J., 1995; Felici F. et al., 1991). 이런 특정 구체예에 따라, 고정된 PAPAP 단백질에 결합하는 단백질을 발현하는 재조합 파지는 유지시키고, PAPAP 단백질과 재조합 파지간에 형성된 복합체는 PAPAP 단백질에 대한 다클론이나 단클론 항체로 면역침전시킬 수 있다.
일단 재조합 파지에서 리간드 라이브러리가 작제되면, 파지 개체군은 고정된 PAPAP 단백질과 접촉시킨다. 이후, 복합체는 세척하여 비-특이적으로 결합된 재조합 파지를 제거한다. 그 다음, PAPAP 단백질에 특이적으로 결합하는 파지는 완충액(산성 pH)으로 용출하거나 또는 하이브리도마 항-PAPAP에 의해 만들어진 단클론 항체로 면역침전시키고, 이런 파지 개체군은 박테리아(가령, 대장균(E. coli))의 과잉-감염(over-infection)으로 증폭시킨다. 선별 단계는 수회, 바람직하게는 2-4회 반복하여 좀더 특이적인 재조합 파지 클론을 선별한다. 최종 단계는 선별된 재조합 파지 클론에 의해 생성된 펩티드를 감염된 박테리아에서 발현과 분리로 특성화시키는 단계, 다른 숙주-벡터 시스템에서 파지 삽입체를 발현시키는 단계 또는 선별된 재조합 파지에 포함된 삽입체를 서열분석하는 단계로 구성된다.
B. 경합 실험으로 수득된 후보 리간드
대안으로, SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성되는 PAPAP 단백질이나 이의 단편과 결합하는 펩티드, 약물 또는 소형 분자들은 경합 실험으로 확인할 수 있다. 이런 분석에서, PAPAP 단백질 또는 이의 단편은 표면, 예를 들면 플라스틱 평판에 고정시킨다. 펩티드, 약물 또는 소형 분자들은 PAPAP 단백질 리간드로 알려진 검출가능한 라벨의 존재하에 함량을 점진적으로 증가시키면서 고정된 PAPAP 단백질 또는 이의 단편과 접촉시킨다. 가령, PAPAP 리간드는 형광, 방사성 또는 효소 태그로 검출가능하게 표지할 수 있다. PAPAP 단백질이나 이의 단편에 결합하는 검사 분자의 능력은 검사 분자의 존재하에 결합된 검출가능하게 표지된 리간드의 함량을 측정하여 확인한다. 검사 분자가 존재하는 경우에 PAPAP 단백질이나 이의 단편에 결합하는 공지된 리간드의 함량이 줄어드는데, 이는 검사 분자가 PAPAP 단백질이나 이의 단편과 결합할 수 있다는 것을 암시한다.
C. 친화성 크로마토그래피에 의해 수득된 후보 리간드
SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성되는 PAPAP 단백질이나 이의 단편과 상호작용하는 단백질 또는 다른 분자는 PAPAP 단백질이나 이의 단편을 보유하는 친화성 칼럼을 이용하여 발견할 수 있다. PAPAP 단백질이나 이의 단편은 통상적 기술, 예를 들면 아가로즈 Affi Gel®또는 당업자에게 공지된 다른 매트릭스와 같은 적합한 칼럼 매트릭스에 대한 화학적 결합으로 칼럼에 부착시킬 수 있다. 상기 방법의 일부 구체예에서, 친화성 칼럼은 PAPAP 단백질이나 이의 단편이 글루타티온 S 트랜스퍼라제(GST)와 융합된 키메라 단백질을 함유한다. 세포 단백질의 혼합물 또는 전술한 발현된 단백질의 풀을 친화성 칼럼에 가한다. 이후, 칼럼에 부착된 PAPAP 단백질이나 이의 단편과 상호작용하는 단백질 또는 다른 분자는 분리하고 Ramunsen et al.(1997)에서 밝힌 바와 같이 2-D 전기영동 겔에서 분석할 수 있다. 대안으로, 친화성 칼럼에 잔존하는 펩티드는 전기영동 기초한 방법으로 정제하고 서열분석할 수 있다. 상기 방법은 항체를 분리하거나, 파지 디스플레이 산물을 스크리닝하거나 또는 파지 디스플레이 사람 항체를 스크리닝하는데 활용할 수 있다.
D. 광학적 바이오센서 방법으로 수득된 후보 리간드
SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성되는 PAPAP 단백질이나 이의 단편과 상호작용하는 단백질은 광학적 바이오센서로 스크리닝할 수도 있다(Edwards and Leatherbarrow(1997), Szabo et al.(1995)). 이 기술은 실시간으로 분자간 상호작용의 검출이 가능하고, 표지된 라벨을 필요로 하지 않는다. 이 기술은 표면 플라스몬 공명(SPR) 현상에 기초한다. 간단히 말하면, 검사할 후보 리간드 분자는 표면(예, 카복시메틸 덱스트란 매트릭스)에 부착시킨다. 광빔은 검사 시료를 함유하지 않은 표면의 측면으로 향하고 상기 표면에 의해 반사된다. SPR 현상은 각도 및 파장과 특이적으로 연관하여 반사된 광의 밀도를 감소시킨다. 후보 리간드 물질의 결합은 표면에서 굴절율에 변화를 초래하고, 이런 변화는 SPR 신호에서 변화로 감지된다. PAPAP 단백질이나 이의 단편과 상호작용할 수 있는 후보 리간드 분자 또는 물질의 스크리닝에서, PAPAP 단백질이나 이의 단편은 표면에 고정시킨다. 상기 표면은 분석할 후보 물질이 통과하게 되는 세포로 구성된다. PAPAP 단백질이나 이의 단편에 후보 물질의 결합은 SPR 신호의 변화로 감지된다. 검사된 후보 물질은 조합 화학으로 만들어진 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 소형 분자일 수 있다. 이 기술은 내인성 또는 재조합으로 발현된 PAPAP 단백질을 보이는 진핵이나 원핵 세포 또는 지질 소포를 표면에 고정시켜 실시할 수도 있다.
상기 방법의 최대 이점은 PAPAP 단백질 및 PAPAP 단백질과 상호작용하는 분자간 결합 속도를 측정할 수 있다는 점이다. 따라서, 강한 또는 상대적으로 약한 결합 상수를 통하여 PAPAP 단백질이나 이의 단편과 상호작용하는 리간드 분자를 특이적으로 선별하는 것이 가능하다.
E. 이중-하이브리드 스크리닝 분석을 통하여 수득된 후보 리간드
이중-하이브리드 시스템은 생체내에서 단백질-단백질 상호작용을 연구하기 위한 것으로(Fields and Song 1989), 이스트 Gal4 단백질의 DNA 결합 도메인에 미끼 단백질의 융합에 의존한다. 이 기술은 미국 특허 US 5,667,973과 5,283,173(Fields et al.)에서도 기술한다.
이중-하이브리드 분석에 의한 라이브러리 스크리닝의 전반적 과정은 Harper et al.(1993), Cho et al.(1998) 또는 Fromont-Racine et al.(1997)에서 밝힌 과정으로 실시할 수 있다.
미끼 단백질이나 폴리펩티드는 SEQ ID No 2의 적어도 6개 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개 내지 10개의 아미노산, 좀더 바람직하게는 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100개의 연속 아미노산으로 구성되는 PAPAP 단백질이나 이의 단편으로 구성되거나 또는 이를 포함한다.
좀더 구체적으로, PAPAP 단백질, 이의 단편 또는 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 GAL4 단백질의 DNA 결합 도메인을 인코드하는 폴리뉴클레오티드에 융합되는데, 상기 융합된 뉴클레오티드 서열은 적합한 발현 벡터, 예를 들면 pAS2 또는 pM3에 삽입한다.
이후, 특별하게 설계된 벡터에 사람 cDNA 라이브러리를 작제하여, 사람 cDNA삽입체가 GAL4 단백질의 전사 도메인을 인코드하는 벡터상의 뉴클레오티드 서열과 융합되도록 한다. 바람직하게는, 사용된 벡터는 pACT 벡터이다. 사람 cDNA 라이브러리의 뉴클레오티드 삽입체에 의해 인코드되는 폴리펩티드는 "먹이" 폴리펩티드라 한다.
세 번째 벡터는 검출가능한 마커 유전자, 예를 들면 전사 활성 도메인과 DNA 결합 도메인 모두를 포함하는 완전 Gal4 단백질의 결합에 반응하는 조절 서열의 조절하에 위치하는 베타 갈락토시다제 유전자 또는 CAT 유전자를 보유한다. 가령, 벡터 pG5EC를 사용할 수 있다.
또한, 2가지 상이한 이스트 균주가 사용된다. 예로써, 2가지 상이한 이스트 균주는 다음과 같다:
- Y190, 이의 표현형은 (MATa, Leu2-3, 112 ura3-12, trpl-901 his3-D200 ade2-101, gal4Dgall80D URA3 GAL-LacZ, LYS GAL-HIS3, cyh)이다;
- Y187, 이의 표현형은 (MATa gal4 gal80 his3 trpl-901 ade2-101 ura3-52 leu2-3, -112 URA3 GAL-lacZmet)으로, Y190의 반대 교배형(mating type)이다.
간단히 말하면, 20㎍의 pAS2/PAPAP와 20㎍의 pACT-cDNA 라이브러리는 이스트 균주 Y190에 공동-형질전환시킨다. 형질전환체는 히스티딘, 루이신, 트립토판이 결핍되지만 히스티딘 합성 저해물질 3-AT(50mM)을 함유하는 최소 배지에서 성장에 대하여 선별한다. 양성 콜로니는 필터 리프트(lift) 분석으로 베타 갈락토시다제에 대하여 선별한다. 이후, 이중 양성 콜로니(His +,beta-gal +)는 히스티딘과 루이신이 결핍되지만 트립토판과 사이클로헥사미드(10mg/㎖)를 함유하는 평판에 배양하여 pAS2/PAPAP 플라스미드는 없지만 pACT-cDNA 라이브러리 플라스미드는 계속 유지하는 콜로니를 선별한다. 결과의 Y190 균주는 Gal4 융합체로 PAPAP 또는 무관한 대조군 단백질; 예를 들면 사이클로필린 B, 라민 또는 SNF1을 발현하는 Y187 균주와 교배시키고[Harper et al.(1993), Bram et al.(Bram RJ et al., 1993)], 필터 리프트(lift) 분석으로 베타 갈락토시다제에 대하여 선별한다. 대조군 Gal4 융합체와의 교배후beta-gal -인 이스트 클론은 가양성(false positive)이다.
본 발명에 따른 이중-하이브리드 방법의 다른 구체예에서, PAPAP, 이의 단편이나 변이체와 세포 단백질간 상호작용은 매치메이커 Hybrid System 2(Catalog No. K1604-1, Clontech)를 이용하여 평가할 수 있다. 매치메이커 Two Hybrid System 2(Catalog No. K1604-1, Clotech)에 동반된 매뉴얼에 밝힌 바와 같이, PAPAP 단백질이나 이의 일부분을 인코드하는 핵산은 발현 벡터에 삽입시켜 이들이 이스트 전사 활성자 GAL4의 DNA 코딩 영역을 인코드하는 DNA와 쌍을 이루게 한다. 원하는 cDNA, 바람직하게는 사람 cDNA는 두 번째 발현 벡터에 삽입시켜 이들이 GAL4의 활성화 도메인을 인코드하는 DNA와 쌍을 이루게 한다. 이중 발현 플라스미드는 이스트로 형질전환시키고, 이스트는 HIS3 유전자의 GAL4 의존성 발현뿐만 아니라 각 발현 벡터에서 선별 마커의 발현을 선별하는 선별 배지에 도말한다. 히스티딘이 결핍된 배지에서 성장할 수 있는 형질전환체는 GAL4 의존성 lacZ 발현에 대하여 스크리닝한다. 히스티딘 선별과 lacZ 분석 모두에서 양성인 세포는 PAPAP와 초기에 선별된 cDNA 삽입체에 의해 인코드되는 단백질이나 펩티드간 상호작용을 보유한다.
PAPAP의 조절 서열과 상호작용하는 물질을 스크리닝 하는 방법
또한, 본 발명은 PAPAP 유전자의 조절 서열, 예를 들면 프로모터 또는 인헨서 서열과 상호작용 할 수 있는 물질이나 분자를 스크리닝하는 방법에 관한다.
PAPAP 유전자의 조절 서열, 좀더 구체적으로 5'와 3' 조절 영역의 폴리뉴클레오티드, 이의 단편 또는 변이체에서 선택되는 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 본 발명의 이중대립유전자 마커중 한가지를 포함하는 변이체와 상호작용할 수 있는 단백질을 인코드하는 핵산은 Matchmaker One-Hybrid System kit(Catalog Ref. n°K1603-1, Clontech)에 동봉된 책자에 기술되어 있는 바와 같이 단일-하이브리드 시스템으로 동정할 수 있다. 간단히 말하면, 표적 뉴클레오티드 서열은 선별가능 리포터 서열의 상류에 클론시키고, 생성된 DNA 구조체는 이스트(Saccharomyces cerevisiae) 게놈에 통합시킨다. 이후, 게놈에 리포터 서열을 포함하는 이스트 세포는 PAPAP 유전자의 조절 서열에 결합하는 후보 단백질을 인코드하는 cDNA와 GAL4와 같은 이스트 전사 인자의 활성자 도메인을 인코드하는 서열간 융합 분자로 구성되는 라이브러리로 형질전환시킨다. 재조합 이스트 세포는 리포터서열을 발현하는 세포를 선별하는 액체 배지에 도말한다. 이렇게 선별된 재조합 이스트 세포는 PAPAP 유전자의 조절 서열에 결합할 수 있는 융합 단백질을 보유한다. 이후, 상기 융합 단백질을 인코드하는 cDNA는 서열분석하고 시험관내에서 발현이나 전사 벡터에 클론시킬 수 있다. PAPAP 유전자의 표적 조절 서열에 상기 인코드된 폴리펩티드의 결합은 당업자에게 공지된 기술, 예를 들면 겔 지체 분석 또는 DNAse 보호 분석으로 확인할 수 있다.
겔 지체 분석은 PAPAP 유전자의 조절 서열과 상호작용할 수 있는 후보 분자를 스크리닝하기 위하여 독립적으로 실시할 수 있다(Fried and Crothers(1981); Garner and Revzin(1981); Dent and Latchman(1993)). 이들 기술은 단백질에 결합하는 DNA 단편이 결합하지 않은 동일한 DNA 단편보다 느리게 이동한다는 원칙에 기초한다. 간단히 말하면, 표적 뉴클레오티드 서열을 표지한다. 이후, 표지된 뉴클레오티드 서열은 전사 인자를 포함하는 세포의 전체 핵 추출물 또는 검사할 상이한 후보 물질과 접촉시킨다. PAPAP 유전자의 표적 조절 서열과 후보 물질이나 전사 인자간 상호작용은 겔이나 모세관 전기영동이후 이동 지체로 감지된다.
PAPAP 유전자의 발현을 조절하는 리간드를 스크리닝하는 방법
본 발명의 또 다른 목적은 PAPAP 단백질의 발현을 조절하는 분자를 스크리닝하는 방법이다. 이런 스크리닝 방법은 다음의 단계로 구성된다:
a) 자체 프로모터의 조절하에 PAPAP 단백질, 이의 단편 또는 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 트랜스펙션된 원핵이나 진핵 세포를 배양하고;
b) 배양된 세포를 검사할 분자와 접촉시키고;
c) PAPAP 단백질, 이의 단편 또는 변이체의 발현을 정량한다.
한 구체예에서, PAPAP 단백질, 이의 단편 또는 변이체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열은 적어도 한 개의 PAPAP-관련된 이중대립유전자 마커와 이의 보체의 대립유전자를 포함한다.
당업자에게 공지된 DNA 재조합 기술을 활용하여, DNA 서열을 인코드하는PAPAP 단백질은 발현 벡터에서 프로모터 서열로부터 하류에 삽입한다. 가령, PAPAP 유전자의 프로모터 서열은 5'조절 영역의 핵산에 포함시킨다.
PAPAP 단백질의 발현 정량은 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 달성할 수 있다. 후자의 경우에, 예로써 ELISA 또는 RIA 분석에서 생산된 PAPAP 단백질의 함량을 정량하는데 다클론이나 단클론 항체를 사용할 수 있다.
적절한 구체예에서, PAPAP mRNA의 정량은 PAPAP에 특이적인 프라이머를 이용한 배양된 PAPAP-트랜스펙션된 숙주 세포의 전체 mRNA의 역전사로 수득되는 cDNA의 정량적 PCR 증폭으로 달성한다.
또한, 본 발명은 PAPAP 유전자의 발현 수준을 증가 또는 감소시킬 수 있는 물질이나 분자를 스크리닝하는 방법에 관한다. 이런 방법으로, 당업자는 PAPAP 유전자의 발현 수준에 조절 효과를 보이고 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 중추신경계 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 제약학적 조성물에 함유되는 활성 성분으로 유용한 물질을 선별할 수 있다.
따라서, 본 발명에는 PAPAP 유전자의 발현을 조절하는 후보 물질이나 분자를 스크리닝하는 방법이 포함되는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
- 핵산을 보유하는 재조합 세포 숙주를 제공하고, 여기서 상기 핵산은 검출가능한 단백질을 인코드하는 폴리펩티드의 상류에 위치하는 5'조절 영역의 뉴클레오티드 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함하고;
- 후보 물질을 수득하고;
- 검출가능한 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 조절하는 후보 물질의 능력을 확인한다.
다른 구체예에서, 5'조절 영역의 뉴클레오티드 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함하는 핵산에는 SEQ ID No 1의 PAPAP cDNA의 5'UTR 영역, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체가 포함된다.
검출가능한 단백질을 인코드하는 적절한 폴리뉴클레오티드에는 베타 갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT)를 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
또한, 본 발명은 전술한 스크리닝 방법을 실행하는데 유용한 키트에 관한다. 바람직하게는, 이런 키트는 검출가능한 단백질 또는 PAPAP 단백질, 이의 단편이나 변이체를 인코드하는 폴리펩티드의 상류에 위치하고 여기에 작동적으로 연결된 5'조절 영역의 뉴클레오티드 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체의 발현을 가능하게 하는 재조합 벡터로 구성된다.
PAPAP 유전자의 발현을 조절하는 후보 물질이나 분자를 스크리닝하는 방법의 다른 구체예에서, 상기 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다:
a) 핵산을 보유하는 재조합 세포 숙주를 제공하고, 여기서 상기 핵산은 SEQ ID No 1의 PAPAP cDNA의 5'UTR 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 포함하고, 상기 5'UTR 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체는 검출가능한 단백질을 인코드하는 폴리펩티드에 작동적으로 연결되고;
b) 후보 물질을 수득하고;
c) 검출가능한 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 조절하는 후보 물질의 능력을 확인한다.
상기 스크리닝 방법의 특정 구체예에서, SEQ ID No 1의 PAPAP cDNA의 5'UTR 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 전술한 PAPAP 5'UTR 서열과 내인성의 프로모터 서열을 보유한다.
상기 스크리닝 방법의 다른 특정 구체예에서, SEQ ID No 1의 PAPAP cDNA의 5'UTR 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산은 전술한 PAPAP 5'UTR 서열과 외인성의 프로모터 서열을 보유한다.
다른 적절한 구체예에서, SEQ ID No 1의 PAPAP cDNA의 5'UTR 서열 또는 이의 생물학적 활성 단편을 포함하는 핵산은 PAPAP-관련된 이중대립유전자 마커 또는 이의 보체를 보유한다.
또한, 본 발명은 PAPAP 유전자의 발현을 조절하는 후보 물질을 스크리닝하는 키트에 관하는데, 상기 키트는 상기 핵산은 SEQ ID No 1의 PAPAP cDNA의 5'UTR 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체를 보유하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터로 구성되고, 상기 5'UTR 서열, 이의 생물학적 활성 단편 또는 변이체는 검출가능한 단백질을 인코드하는 폴리펩티드에 작동적으로 연결된다.
전술한 스크리닝 방법을 실시하는데 적합한 재조합 벡터의 설계를 위해서, 본 발명의 적절한 재조합 벡터를 상세하게 설명한 본원 명세서의 해당 섹션을 참조한다.
PAPAP의 발현 수준과 패턴은 국제 특허 출원 WO 97/05277에서 밝힌 긴 프로브와의 용액 혼성화로 분석할 수 있다. 간단히 말하면, 전술한 PAPAP cDNA이나 PAPAP 게놈 DNA 또는 이들의 단편은 박테리오파지(T3, T7 or SP6) RNA 중합효소 프로모터에서 매우 가까운 하류의 클로닝 부위에 삽입시켜 안티센스 RNA를 만든다. 바람직하게는, PAPAP 삽입체는 게놈 DNA 서열 또는 cDNA 서열의 100개이상 연속 뉴클레오티드로 구성된다. 상기 플라스미드는 선형화시키고, 변형된 리보뉴클레오티드(즉, 비오틴-UTP와 DIG-UTP)로 구성되는 리보뉴클레오티드의 존재하에 전사시킨다. 과량의 이중 표지된 RNA는 관심있는 세포 또는 조직으로부터 분리된 mRNA와 용액에서 혼성화된다. 혼성화는 평균적인 엄격한 조건(40-50℃, 16시간, 80% 폼아마이드, 0.4M NaCl 완충액 pH 7.8)하에 실시한다. 혼성화되지 않은 프로브는 단일-사슬 RNA에 특이적인 리보뉴클레아제(즉, RNases CL3, T1, Phy M, U2 또는 A)로 절단하여 제거한다. 비오틴-UTP 수식의 존재는 스트렙타비딘으로 피복된 마이크로적정 평판에 하이브리드의 포획을 가능하게 한다. DIG 수식의 존재는 알칼리성 포스파타제에 결합된 항-DIG 항체를 이용한 ELISA로 하이브리드를 검출하고 정량하는 것을 가능하게 한다.
PAPAP 유전자 발현의 정량적 분석은 어레이를 이용하여 실시할 수도 있다. 본원에서 어레이는 mRNA 발현을 특이적으로 검출할 수 있는 충분한 길이의 핵산으로 구성되는 일차원, 이차원 또는 다차원 정렬을 의미한다. 가령, 어레이는 발현 수준을 평가해야 하는 유전자로부터 유래된 복수의 핵산을 포함할 수 있다. 어레이는 PAPAP 게놈 DNA, PAPAP cDNA 서열, 이의 상보성 서열 또는 단편, 특히 적어도 한 개의 PAPAP 관련된 이중대립유전자 마커를 보유하는 서열을 포함할 수 있다.바람직하게는 단편은 적어도 15개의 뉴클레오티드이다. 다른 구체예에서, 단편은 적어도 25개의 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 단편은 적어도 50개의 뉴클레오티드이다. 좀더 바람직하게는, 단편은 적어도 100개의 뉴클레오티드이다. 다른 적절한 구체예에서, 단편은 100개이상의 뉴클레오티드이다. 일부 구체예에서, 단편은 500개이상의 뉴클레오티드이다.
가령, PAPAP 유전자 발현의 정량적 분석은 상보성 DNA 마이크로어레이로 실시할 수 있다(Schena et al.(1995 and 1996)). 전장 PAPAP cDNA 또는 이의 단편은 PCR로 증폭하고, 고속 로봇공학을 이용하여 96-웰 마이크로역가 평판으로부터 실릴레이트 현미경 슬라이드로 정렬시킨다. 프린트된 어레이는 습한 체임버에서 배양하여 어레이 요소를 수화시키고 1분동안 0.2% SDS에서 1회, 1분동안 물에서 2회, 5분동안 소디움 보로하이드라이드 용액에서 1회 세척한다. 어레이는 95℃에서 2분동안 물에 담그고 1분동안 0.2% SDS로 이전하며 물로 2회 세척하고 대기 건조시키며 25℃에서 암실에 보관한다.
세포 또는 조직 mRNA는 분리하거나 또는 상업적으로 구입하고, 프로브는 1회의 역전사로 준비한다. 프로브는 60℃에서 14 x 14㎜ 유리 커브슬립하의 1㎠ 마이크로어레이에 6-12시간동안 혼성화시킨다. 어레이는 25℃에서 낮은 엄밀도 세척 완충액(1 x SSC/0.2% SDS)에 5분동안, 이후 실온에서 높은 엄밀도 세척 완충액(0.1 x SSC/0.2% SDS)에 10분동안 세척한다. 어레이는 맞춤 필터 세트를 갖춘 형광 레이저 스캐닝으로 0.1 x SSC에서 스캔한다. 정확한 특이적 발현 측정은 독립된 2회 혼성화의 비율을 평균하여 얻는다.
PAPAP 유전자 발현의 정량 분석은 상보성 DNA 어레이에서 전장 PAPAP cDNA 또는 이의 단편으로 실시할 수도 있다(Pietu et al.(1996)). 전장 PAPAP cDNA 또는 이의 단편은 PCR 증폭하고 막에 스팟한다. 이후, 다양한 조직이나 세포로부터 기원한 mRNA는 방사성 뉴클레오티드로 표지한다. 통제된 조건하에 혼성화 및 세척이후, 혼성화된 mRNA는 포스포이미징(phosphoimaging) 또는 자가방사법으로 검출한다. 중복 실험을 실시하고, 이후 상이하게 발현된 mRNA의 정량 분석을 실시한다.
대안으로, PAPAP 게놈 DNA, PAPAP cDNA 또는 이의 단편을 이용한 발현 분석은 고밀도 뉴클레오티드 분석으로 실시할 수 있다(Lockhrt et al.(1996); Sosnowsky et al.(1997)). PAPAP 게놈 DNA, PAPAP cDNA 서열 또는 이의 상보성 서열로부터 유래된 15-50개의 뉴클레오티드로 구성되는 올리고뉴클레오티드는 칩에서 직접 합성하거나(Lockhart et al. supra), 또는 합성하고 이후 칩에 어드레스한다(Sosnowski et al., supra). 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 대략 20개의 뉴클레오티드이다.
적합한 화합물, 예를 들면 비오틴, 디곡시제닌 또는 형광 염료로 표지된 PAPAP cDNA 프로브는 적합한 mRNA 개체군으로부터 합성하고, 이후 평균 50 내지 100개의 뉴클레오티드 크기로 무작위로 단편화시킨다. 그 다음, 상기 프로브는 칩에 혼성화시킨다. 세척(Lockhart et al., supra) 및 상이한 전기장의 적용(Sosnowsky et al., 1997)이후, 염료 또는 표지화 화합물은 검출하고 정량한다. 중복 혼성화를 실시하다. 상이한 cDNA 시료상의 동일한 표적 올리고뉴클레오티드에서 cDNA 프로브로부터 기원하는 신호의 비교 강도 분석은 PAPAP mRNA의 상이한 발현을 암시한다.
PAPAP 유전자의 발현을 저해하는 방법
본 발명에 따른 다른 치료 조성물은 상응하는 PAPAP 유전자의 발현을 저해하는 PAPAP 뉴클레오티드 서열의 올리고뉴클레오티드 단편, 안티센스 또는 삼중 나선을 함유한다.
안티센스
본 발명에 따른 안티센스 폴리뉴클레오티드를 이용한 적절한 방법은 Sczakiel et al.(1995)에서 밝힌 과정이다.
바람직하게는, 안티센스는 PAPAP mRNA의 5'말단에 상보적인 폴리뉴클레오티드(15-200bp)에서 선택된다. 다른 구체예에서, 원하는 표적 유전자의 상이한 부분에 상보적인 별개의 안티센스 폴리뉴클레오티드의 조합을 사용한다.
본 발명에 따른 적절한 안티센스 폴리뉴클레오티드는 번역 개시 코돈 ATG 또는 절단접합 공여자나 수용자 부위를 보유하는 PAPAP의 mRNA 서열에 상보적이다.
안티센스 핵산은 이중으로 PAPAP mRNA의 발현을 저해하는데 충분한 안정성을 갖는 세포내 이중나선의 형성을 가능하게 하는 길이와 융점을 보유해야 한다. 유전자 요법에 사용하기 적합한 안티센스 핵산을 설계하는 전략은 Green et al., (1986); Izant and Weintraub, (1984)에서 개시한다.
일부 전략에서, 안티센스 분자는 프로모터와 관련하여 PAPAP 코딩 영역의 배향을 역전시킴으로써 세포에서 정상적으로 전사되는 것과 반대의 가닥을 전사시켜 얻는다. 안티센스 분자는 시험관내 전사 시스템, 예를 들면 전사체를 얻기 위하여T7 또는 SP6 중합효소를 이용하는 전사 시스템으로 전사시킬 수 있다. 다른 방식은 적합한 발현 벡터에서 안티센스 서열을 보유하는 DNA를 안티센스 서열에 작동적으로 연결시켜 생체내에서 PAPAP 안티센스 핵산을 전사시키는 것이다.
다른 적합한 안티센스 전략은 Rossi et al.(1991); 국제 특허 출원 WO 94/23026, WO 95/04141, WO 92/18522; 유럽 특허 출원 EP 0 572 287 A2에서 기술한다.
본 발명에 활용되는 안티센스 기술에 대한 대안은 상보성 폴리뉴클레오티드를 통하여 표적 서열에 결합하고 표적 부위를 가수분해함으로써 상응하는 RNA를 절단하는 리보자임(즉, "해머헤드 리보자임")을 사용하는 것이다. 간단히 말하면, 해머헤드 리보자임의 사이클은 다음과 같이 구성된다: (1) 상보성 안티센스 서열을 통하여 표적 RNA에 서열 특이적 결합; (2) 표적 가닥의 절단 모티프의 부위-특이적 가수분해; (3) 절단 산물의 방출, 이는 다른 촉매 사이클을 유발한다. 실제로, 장쇄 안티센스 폴리뉴클레오티드(적어도 30개 염기) 또는 긴 안티센스 팔을 갖는 리보자임이 효과적이다. 안티센스 리보자임에 적합한 전달 시스템은 이들 안티센스 리보자임을 지질친화성기에 공유 결합시키거나 또는 리포좀을 벡터로 이용하여 달성한다. 본 발명에 따른 적절한 안티센스 리보자임 Sczakiel et al.(1995)에서 밝힌 바와 같이 준비한다.
삼중 나선
PAPAP 게놈 DNA는 세포내 삼중 나선 형성에 기초하여 PAPAP 유전자의 발현을 저해하는 데에도 사용할 수 있다.
삼중 나선 올리고뉴클레오티드는 게놈으로부터 전사를 저해하는데 사용된다. 이들은 특정 유전자와 관련하여 세포 활성에서 변화를 연구하는데 특히 유용하다.
유사하게, PAPAP 게놈 DNA의 일부분은 세포내에서 PAPAP 전사를 저해하는 효과를 연구하는데 사용할 수 있다. 전통적으로, 호모퓨린 서열이 삼중 나전 전략에 가장 적합한 것으로 생각되었다. 하지만, 호모피리미딘 서열 역시 유전자 발현을 저해할 수 있다. 이런 호모피리미딘 올리고뉴클레오티드는 호모퓨린 : 호모피리미딘 서열에서 대홈(major groove)에 결합한다. 따라서, PAPAP 게놈 DNA로부터 유래된 양 유형의 서열은 본 발명의 범주에 포함된다.
삼중 나선을 이용한 유전자 요법 전략을 실행하기 위하여, PAPAP 게놈 DNA 서열은 먼저 스캔하여 PAPAP 발현을 저해하는 삼중-나선 기초한 전략에 사용할 수 있는 10-mer 내지 20-mer 호모피리미딘 또는 호모퓨린 스트레치를 동정한다. 후보 호모피리미딘 또는 호모퓨린 스트레치의 동정이후, PAPAP 발현을 저해하는 이들의 효능은 후보 서열을 보유하는 다양한 함량의 올리고뉴클레오티드를 PAPAP 유전자를 발현하는 조직 배양 세포에 도입하여 평가한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 당업자에게 공지된 다양한 방법, 예를 들면 칼슘 포스페이트 침전, DEAE-덱스트란, 에렉트로포레이션, 리포좀-매개된 트랜스펙션 또는 자연적인 흡수로 세포에 도입할 수 있다.
처리된 세포는 노던 블랏팅, RNase 보호 분석, 또는 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 PAPAP 유전자의 전사 수준을 모니터하는 PCR 기초한 전략과 같은 기술을 활용하여 변화된 세포 기능 또는 감소된 PAPAP 발현을 모니터한다.
이후, 조직 배양 세포에서 유전자 발현을 저해하는데 효과적인 올리고뉴클레오티드는 안티센스에서 밝힌 바와 같이 시험관내 결과에 기초하여 계산된 용량에서 전술한 기술을 활용하여 생체내 도입할 수 있다.
일부 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 단위의 천연(베타) 아노머(anomer)는 알파 아노머로 치환하여 올리고뉴클레오티드가 뉴클레아제에 좀더 저항하도록 할 수 있다. 이에 더하여, 브롬화에티듐 등과 같은 삽입성 물질을 알파 올리고뉴클레오티드의 3'말단에 부착하여 삼중 나선을 안정화시킬 수 있다. 삼중 나선 형성에 적합한 올리고뉴클레오티드의 발생에 관한 정보는 Griffin et al.(1989)을 참조한다.
제약학적 조성물과 제형
PAPAP-조절 화합물
전술한 방법을 활용하여, 시험관내와 생체내에서 PAPAP 활성 또는 PAPAP-g34872 상호작용을 선별적으로 조절하는 화합물을 확인할 수 있다. 본 발명의 방법으로 확인된 화합물에는 PAPAP 펩티드에 결합 특이성을 갖는 항체가 포함된다. 또한, PAPAP의 유사체가 정신분열증 또는 양극성 장애와 연관된 PAPAP-매개된 활성 및 관련된 생리 이상을 조절하는데 효과적일 것으로 기대된다. 일반적으로, 중추신경계에서 PAPAP의 역할에 기초한 본 발명의 분석 방법은 질병 경로에 개입할 수 있는 화합물을 확인하는데 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
징후
PAPAP가 정신분열증 및 양극성 장애와 연관성을 보였다는 점에서, PAPAP가관련된 징후에는 중추신경계 질환이 포함될 수 있다. 신경계 질환은 복합적인 유전적 기초를 갖고 특정 증상을 공유할 것으로 예상된다. 특히, 본원에서 밝힌 바와 같이 징후에는 정신분열증과 다른 정신 질환, 신경퇴행성 질환, 기분 장애, 자폐증, 약물 의존과 알코올 중독, 정신 지체 및 인식 장애, 정신 장애, 불안 장애, 섭식 장애, 충동 조절 장애, 인격 장애를 비롯한 다른 정신 질환이 포함될 수 있다[Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders(DSM-Ⅳ)].
제약학적 제형 및 투여 경로
본 발명의 방법을 이용하여 확인된 화합물은 정신분열증 또는 양극성 장애 관련된 질환을 치료 또는 완화하는 치료요법적 효과량으로 단독으로 또는 적합한 담체나 부형제와 혼합된 제약학적 조성물 형태로 사람 환자를 비롯한 포유동물에 투여할 수 있다. 치료요법적 효과량은 본원에서 밝힌 방법으로 증상의 완화를 결과하는데 충분한 화합물 함량을 의미한다. 바람직하게는, 치료요법적 효과량은 지속적인 주기적 복용이나 투여에 적합하다. 본 발명에 따른 화합물의 제형과 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences,"(Mack Publishing Co. Easton, PA) 최신판에서 알 수 있다.
투여 경로
적합한 투여 경로에는 지주막하, 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비강내 또는 안구내 주사를 비롯하여 경구, 직장, 경점막 또는 장 투여; 근육내, 피하, 골수내 주사를 비롯한 장관외 전달이 포함된다. 중추신경계 질환을 치료하기 위한 약물을 투여하는데 특히 적합한 방법에는 이식된 펌프(Medtronic, Inc., Minneapolis, MN)를통한 척수액으로 주입을 비롯한 지주막하 전달에서처럼 연장된 기간동안 화합물을 전달하는 장치의 외과적 이식이 포함된다.
조성물/제형
본 발명에 사용되는 제약학적 조성물과 약물은 부형제와 보조제로 구성되는 하나 또는 복수의 생리학적으로 수용가능한 담체를 이용하여 통상적 방식으로 만들 수 있다.
주사용으로, 본 발명의 약물은 수용액, 바람직하게는 생리학적 적합성 완충액( 예, 한크 용액, 링거 용액) 또는 생리 식염수 완충액(인산염 또는 중탄산염 완충액) 형태로 만들 수 있다. 경점막 투여를 위하여, 침투할 장벽에 적합한 침투탐상제(penetrant)가 제형으로 사용된다. 이런 침투탐상제는 당분야에 공지된 것이다.
경구로 복용할 수 있는 제약학적 제형에는 젤라틴으로 만들어진 푸시-핏 캡슐, 젤라틴으로 만들어진 연한 밀봉된 캡슐 및 가소제, 예를 들면 글리세롤이나 소비톨이 포함된다. 푸시-핏 캡슐은 락토오스와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제 및/또는 활석이나 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 선택적으로 안정제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연한 캡슐에서, 활성 성분은 적합한 액체, 예를 들면 지방산, 액체 파라 혹은 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 부유시킬 수 있다. 이에 더하여, 안정제를 첨가할 수도 있다. 경구 투여를 위한 모든 제형은 이런 투여에 적합한 용량으로 제공한다.
협측 투여를 위하여, 조성물은 통상적 방식으로 만들어진 정제 또는 마름모꼴 정제 형태를 취할 수 있다.
흡입 투여를 위하여, 본 발명에 따른 조성물은 적절한 가스 추진제, 예를 들면 이산화탄소를 이용하여 가압된 팩 또는 흡입치료기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다. 흡입기 또는 취입기에 사용되는 예로써 젤라틴의 캡슐과 카트리지는 상기화합물 및 적합한 분말 염기, 예를 들면 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 만들 수 있다.
화합물은 주사, 예를 들면 거환 주사 또는 연속 주입에 의한 장관외 투여용으로 만들 수 있다. 주사용 제형은 단위 약형, 예를 들면 방부제가 첨가된 앰플 또는 다중-용도 용기로 제공할 수 있다. 이런 조성물은 현탁액, 용액 또는 수성 소포에 용해된 에멸젼과 같은 형태를 취하고, 부유제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제형화 약품을 함유할 수 있다.
장관외 투여용 제약학적 제형에는 가수성 형태의 활성 화합물의 수용액이 포함된다. 수성 현탁액은 현탁액을 점도를 증가시키는 물질, 예를 들면 소디움 카복시메틸 셀룰로오스, 소비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 화합물의 용해도를 증가시키는 적합한 안정제 또는 약품을 함유할 수 있다.
대안으로, 활성 성분은 사용에 앞서 적합한 소포, 예를 들면 무-발열원 멸균수로 재구성되는 분말이나 동결건조된 형태일 수도 있다.
전술한 제형에 더하여, 화합물은 저장소 제형으로 만들 수도 있다. 이런 장기 제형은 이식(예, 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주사로 투여할 수 있다. 따라서, 이런 화합물은 중합성이나 소수성 물질(예, 오일에 용해된 에멀젼으로) 혹은 이온 교환 수지와 혼합하여, 또는 거의 불용성의 유도체, 예를 들면 거의 불용성 염으로 만들 수 있다.
또한, 화합물은 지속-방출 시스템, 예를 들면 치료 약물을 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 이용하여 전달할 수 있다. 다양한 지속 방출 물질은 당분야에 공지된 것이다. 지속-방출 캡슐은 화학적 특성에 따라, 수주 내지 최대 100일동안 화합물을 방출할 수 있다.
치료 약물의 화학적 특성과 생물학적 안정도에 따라, 단백질 안정화의 추가적인 전략을 강구할 수도 있다.
제약학적 조성물은 적합한 고체나 겔 상 담체 또는 부형제를 함유할 수도 있다. 이런 담체 또는 부형제의 예에는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
효과량
본 발명에 사용하기 적합한 제약학적 조성물에는 소요의 목적을 달성하기 위하여 효과량의 활성 성분을 함유하는 조성물이 포함된다. 좀더 구체적으로, 치료요법적 효과량은 치료된 개체의 기존 증상의 발생을 예방하거나 또는 이를 완화시키는데 효과적인 함량을 의미한다. 효과량의 결정은 당업자의 능력에 속한다.
본 발명의 방법에 사용된 화합물에서, 치료요법적 효과량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 추정하고, 동물 모델에 1회 분량을 투여할 수 있다. 이런 정보는사람에서 정확한 용량을 결정하는데 활용할 수 있다.
치료요법적 효과량은 환자에서 증상의 완화를 결과하는 화합물의 함량을 의미한다. 이런 화합물의 독성과 치료 효능은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 표준적인 제약학적 과정, 예를 들면 LD50(실험 개체군의 50%를 치사시키는 분량)과 ED50(개체군의 50%에 효과적인 분량)으로 결정할 수 있다. 독성과 치료 효능간 분량 비율은 치료지수로서, LD50과 ED50간 비율로 표시할 수 있다. 높은 치료 지수를 보이는 화합물이 바람직하다.
이들 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 사람에서 사용되는 일정 범위의 용량을 확정하는데 활용할 수 있다. 바람직하게는, 이런 화합물의 용량은 부작용이 거의 없으면서 ED50을 비롯한 순환 농도의 범위 이내가 된다. 이런 화합물의 용량은 이용된 약형 밑 투여 루트에 따라 상기 범위에서 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로, 용량은 환자의 조건에 비추어 개별 의사가 선택할 수 있다(Fingl et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1)
정신 질환의 예방, 진단 및 치료
전술한 바와 같이, 본 발명의 한 측면은 정신 질환, 특히 정신분열증과 양극성 장애의 치료 약물의 제조에 관한다.
적절한 구체예에서, 본 발명의 약물은 PAPAP, PAPAP 복합체와 연관된 아단위, PAPAP-g34872 복합체에 직접적으로 작용하거나 또는 PAPAP 경로에 작용하여 간접적으로 PAPAP에 작용한다. 가령, 약물은 세포 또는 특정 조직에서 발생하는 PAPAP 활성의 수준을 조절하고 좀더 바람직하게는 이를 감소시키거나, 또는 PAPAP단백질의 활성을 증가 혹은 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 약물의 제조에서 PAPAP 발현 또는 PAPAP 단백질 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있는 화합물의 용도에 관한다. 바람직하게는, 상기 화합물은 정신 질환, 바람직하게는 정신분열증 또는 양극성 장애의 치료에 사용된다. 바람직하게는, 상기 화합물은 PAPAP, PAPAP, g34872 또는 PAPAP 수용체에 결합하여 직접 작용한다. 상기 g34872는 SEQ ID No 5의 폴리펩티드 또는 특허 출원 09/539,333 "Schizophrenia associated genes, proteins ad biallelic markers"(30 March 2000)에서 밝힌 폴리펩티드를 비롯한 임의의 g34872 단백질일 수 있다.
이런 약물은 PAPAP와 유사한 화합물, SEQ ID No 2와 적어도 25%의 아미노산 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 화합물, SEQ ID No 2와 적어도 50%의 아미노산 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 화합물, SEQ ID No 2와 적어도 80%의 아미노산 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 화합물의 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
개체에서 이들 화합물의 활성을 증가 또는 감소시킬 수 있는 약물은 정신 질환을 앓고 있는 또는 이런 질환에 소인이 있는 개체에서 증상을 완화 또는 예방하는데 사용할 수 있다.
대안으로, PAPAP 활성은 유전자 요법을 활용하여 PAPAP-조절 화합물을 인코드하는 유전자의 발현으로 증가 또는 감소시킬 수 있다. 유전자 요법에 사용하기 적합한 벡터와 프로모터의 예는 전술한 바 있다. PAPAP 활성은 PAPAP 펩티드, PAPAP 수용체, 이와 관련된 단백질 또는 이들 단백질의 단편과 결합하는 항체를 제조함으로써 증가 또는 감소시킬 수도 있다. 이런 항체는 PAPAP와 PAPAP 수용체 또는 이와 관련된 단백질간 상호작용을 조절할 수 있다. 항체 및 이들의 수득하는 방법은 전술한 바 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 정신 질환의 치료를 위한 화합물을 확인하는 세포 분석법을 제시한다. 상기 분석법은 PAPAP 발현, PAPAP 단백질 활성의 측정, 또는 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 정신 질환의 다른 적합한 질환 종점의 결정에 기초한다. 정신 질환의 치료를 위한 화합물에는 야생형 PAPAP 단백질의 활성을 저해할 수 있는 파생된 단백질이나 펩티드가 포함되는데, 이들은 야생형 PAPAP 단백질에 결합하는 능력으로 확인할 수 있다. 또한, 화합물에는 조합 화학 기초한 기술을 비롯하여 당업자에게 공지된 다양한 합성법으로 수득할 수 있는 항체, 소형 분자, 약물이 포함된다. 화합물을 확인하는 방법 및 조성물을 제조하고 약물을 투여하는 방법은 전술한 바 있다.
CNS 질환에 소인을 진단 또는 검출하는 방법에서 PAPAP
정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환을 앓고 있는 또는 이들에 소인이 있는 개체는 비정상적 수준의 PAPAP를 발현할 수 있다. 혈장, 체액 또는 신체 조직에서 PAPAP 활성이 증가된 또는 감소된 개체는 정신분열증, 양극성 장애, 다양한 CNS 질환 또는 통상적인 질환 기전에 의한 정신 질환의 발병 위험이 높다. 따라서, 본 발명은 개체가 이런 질환[예, Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders(DSM-Ⅳ) 분류에 따라 정의된 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환, 기분 장애, 자폐증, 약물 의존과 알코올 중독, 정신 지체 및 인식 장애, 정신장애, 불안 장애, 섭식 장애, 충동 조절 장애, 인격 장애를 비롯한 다른 정신 질환]이 발병된 또는 발병할 가능성이 높은 지를 결정하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 개체가 PAPAP 단백질 및/또는 PAPAP mRNA 발현을 비롯한 PAPAP 활성의 비정상적 수준, 또는 혈장, 체액 또는 신체 조직에서 PAPAP 단백질의 비정상적 수준을 보이는 지를 측정하는 것으로 구성된다. 특히, PAPAP 단백질의 수준은 예로써 웨스턴 블랏 또는 단백질 전기영동을 활용하여 측정할 수 있다. 또한, PAPAP의 검출은 본 발명에 따른 PAPAP 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 실시할 수 있다. 항체에 대한 특이적인 결합의 검출은 시료에서 PAPAP 폴리펩티드의 존재를 암시한다(예, ELISA). 이는 PAPAP와 관련된 병리 상태를 반영할 수도 있다.
다른 측면에서, 한 개이상의 PAPAP 이중대립유전자 마커, 다형성 또는 변이체 역시 특정 유전형의 결과로 검출가능한 형질을 발현하는 개체 또는 이후의 시점에서 검출가능한 형질이 발생할 가능성이 높은 유전형을 갖는 개체를 확인할 수 있는 진단 검사를 개발하는데 사용할 수 있다. 본 진단 방법으로 분석된 형질은 정신분열증, 양극성장애, 관련된 질환에 대한 소인, 검출가능한 증상의 발병 연령, 질환에 대한 치료와 관련된 유익한 반응이나 부작용을 비롯한 임의의 검출가능한 형질을 진단하는데 사용할 수 있다. 이런 진단은 질환의 모니터링, 예후 및/또는 예방이나 치료 요법에 유용할 수 있다. 이들 진단 기술은 PAPAP 핵산 서열에 관한 지식에 기초하고, 가족 연구, 단일 정자 DNA 분석 또는 체세포 하이브리드와 같은 일배체형 확인(haplotyping)을 위한 개별 크로모좀의 분석을 가능하게 하는 방법을 비롯한 다양한 방법을 활용하여 검사 개체가 검출가능한 형질의 높은 발생 위험과연관하는 유전형을 갖는 지 또는 개체가 특정 돌연변이의 결과로 검출가능한 형질을 보이는 지를 확인한다. 이들 진단 기술에는 PAPAP 조절 서열 또는 사람 크로모좀 13q33 영역을 비롯한 PAPAP 서열내에 존재하는 특정 대립유전자의 검출이 포함될 수 있다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 SEQ ID Nos. 1이나 3의 뉴클레오티드서열, 이의 단편 또는 상보성 서열중 적어도 한가지를 포함하는 핵산의 검출에 관한다.
이들 방법은 개체로부터 핵산 시료를 구하고, 핵산 시료가 적어도 한 개의 대립유전자 또는 적어도 한 개의 이중대립유전자 마커 일배체형을 함유하는 지를 확인하는 단계로 구성되는데, 이들의 존재는 상기 형질이 발생할 위험이 높다는 것 또는 개체가 특정 PAPAP-관련된 다형성이나 돌연변이(형질-유발 대립유전자)를 보유한 결과로 이런 형질을 발현한다는 것을 암시한다.
이런 진단은 단일 이중대립유전자 마커 또는 일군의 이중대립유전자 마커에 기초할 수 있다. 이들 방법 각각에서, 핵산 시료는 검사 개체로부터 얻고, 본 발명에 따른 하나 또는 복수의 이중대립유전자의 이중대립유전자 마커 패턴을 측정한다. 한 구체예에서, 핵산 시료에 PCR 증폭을 실시하여, 검출가능한 표현형과 연관된 다형성이 동정된 영역을 확대한다. 증폭 산물은 서열분석하여 개체가 검출가능한 표현형과 관련된 하나 또는 복수의 PAPAP-관련된 다형성을 보유하는 지를 확인한다. 대안으로, 핵산 시료는 마이크로서열분석 반응시켜 개체가 사람 PAPAP 유전자에서 돌연변이 또는 다형성으로 인한 검출가능한 표현형과 연관된 하나 또는 복수의 PAPAP-관련된 다형성을 보유하는 지를 확인한다. 다른 구체예에서, 핵산 시료는 검출가능한 표현형과 연관된 하나 또는 복수의 PAPAP-관련된 대립유전자와 특이적으로 혼성화되는 하나 또는 복수의 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 프로브와 접촉시킨다. 한 구체예에서, 핵산 시료는 증폭 반응에서 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드와 함께 사용되는 경우에 증폭 산물을 생산할 수 있는 두 번째 올리고뉴클레오티드와 접촉시킨다. 증폭 반응에서 증폭 산물의 존재는 개체가 검출가능한 표현형과 연관된 하나 또는 복수의 PAPAP-관련된 대립유전자를 보유한다는 것을 암시한다. 적절한 구체예에서, 검출가능한 형질은 정신분열증 또는 양극성 장애이다. 진단 키트는 본 발명에 따른 임의의 폴리뉴클레오티드로 구성된다. 이들 진단 방법은 특정 환경에서 예방적 치료를 개시하거나 또는 중요한 일배체형을 보유한 개체가 경미한 증상과 같은 경고 신호를 예지할 수 있도록 하는데 활용될 수 있다는 점에서, 매우 유익하다.
약물에 대한 반응 또는 약물에 대한 부작용을 분석하고 예상하는 진단은 특정 약물로 개체를 치료할 지 결정하는데 활용할 수 있다. 가령, 이런 진단에서 개체가 특정 약물 치료에 긍정적으로 반응할 가능성이 높은 나타나는 경우에, 상기 약물은 개체에 투여할 수 있다. 반대로, 이런 진단에서 개체가 특정 약물 치료에 부정적으로 반응할 가능성이 높은 나타나는 경우에는, 다른 치료 과정을 처방할 수 있다.
임상적 약물 실험은 본 발명에 따른 진단 방법을 적용할 수 있는 다른 분야이다. 정신분열증을 저해하는 약물에 대한 반응 또는 정신분열증을 저해하는 약물에 대한 부작용을 암시하는 하나 또는 복수의 마커는 전술한 방법으로 동정할 수있다. 이후, 이런 약물의 임상 실험에 잠재적 참가자는 스크리닝하여 이런 약물에 긍정적으로 반응성이 높은 개체와 부작용을 보일 가능성이 높은 개체를 확인할 수 있다. 이런 방식으로, 연구에 긍정적으로 반응하지 않을 가능성이 높은 개체를 실험에 포함시키는 결과로써 측정을 저하시키는 사례없이, 원치 않는 안전성 문제를 유발하지 않으면서 약물에 긍정적으로 반응하는 개체에서 약물 치료의 효능을 측정할 수 있다.
질환의 예방과 관리
예로써 자살의 위험으로 인해, 개체에서 정신분열증, 양극성 장애 또는 다른 정신 질환에 대한 취약성의 발견은 매우 중요하다. 결과적으로, 본 발명은 CNS 질환, 특히 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 질환을 치료하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
- DNA가 PAPAP-관련된 다형성, 이중대립유전자 마커 또는 일군의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하거나 또는 CNS 질환과 연관된 비정상적 PAPAP mRNA 발현이나 PAPAP 단백질 활성을 나타내는 개체를 선별하고;
- 상기 개체에서 CNS 질환이나 관련된 증상의 출현(및 선택적으로 발달)을 추적하고;
- 적절한 단계에서 CNS 질환이나 이의 증상을 저해하는 치료 약물을 상기 개체에 투여한다.
본 발명의 다른 구체예는 CNS 질환을 치료하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
- DNA가 PAPAP-관련된 다형성, 이중대립유전자 마커 또는 일군의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하거나 또는 CNS 질환과 연관된 비정상적 PAPAP mRNA 발현이나 PAPAP 단백질 활성을 나타내는 개체를 선별하고;
- CNS 질환의 예방 약물을 상기 개체에 투여하고;
- 상기 개체에서 CNS 질환이나 관련된 증상의 출현 및 발달을 추적하고;
- 적절한 단계에서 CNS 질환이나 이의 증상을 저해하는 치료 약물을 상기 개체에 투여한다.
또한, 본 발명은 이런 질환으로 고생하는 개체의 치료에서, 다음의 단계로 구성되는 CNS 질환의 치료 방법에 관한다:
- DNA가 PAPAP-관련된 다형성, 이중대립유전자 마커 또는 일군의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하거나 또는 CNS 질환이나 이의 증상의 중대함(gravity)과 연관된 비정상적 PAPAP mRNA 발현이나 PAPAP 단백질 활성을 나타내는 개체를 선별하고;
- CNS 질환이나 이의 증상을 저해하는 치료 약물을 상기 개체에 투여한다.
또한, 본 발명은 선별된 개체군에서 CNS 질환을 치료하는 방법에 관한다. 상기 방법은 다음과 같이 구성된다:
- CNS 질환으로 고생하고 있고 DNA가 PAPAP-관련된 다형성, 이중대립유전자 마커 또는 일군의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하거나 또는 CNS 질환이나 이의 증상을 저해하는 효과량의 약물 치료에 대한 긍정적인 반응과 연관된 비정상적 PAPAP mRNA 발현이나 PAPAP 단백질 활성을 나타내고;
- 및/또는 DNA가 PAPAP-관련된 다형성, 이중대립유전자 마커 또는 일군의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하지 않거나 또는 CNS 질환이나 이의 증상을 저해하는 효과량의 약물 치료에 대한 부정적인 반응과 연관된 비정상적 PAPAP mRNA 발현 혹은 PAPAP 단백질 활성을 나타내는 개체를 선별하고;
- 적절한 간격으로 상기 약물의 효과량을 선별된 개체에 투여한다.
본 발명에서, 약물에 대한 "긍정적인 반응"은 상기 질환과 관련된 증상의 감소로 정의할 수 있다. 본 발명에서, 약물에 대한 "부정적인 반응"은 상기 약물 투여후에 증상 감소로 결과하지 못하거나 또는 부작용을 초래하는 상기 질환에 대한 긍정적인 반응의 부재로 정의할 수 있다.
본 발명에 적합한 CNS 질환은 정신분열증과 양극성 장애이다. 하지만, 본 발명에는 관련된 질환, 특히 관련된 CNS 질환을 예방, 진단, 관리, 치료하는 방법 역시 포함된다. 예로써, 관련된 질환에는 정신 장애, 기분 장애, 자폐증, 약물 의존과 알코올 중독, 정신 지체 및 인식 장애, 불안 장애, 섭식 장애, 충동 조절 장애, 인격 장애를 비롯한 다른 정신 질환이 포함될 수 있다[Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders(DSM-Ⅳ)].
또한, 본 발명은 개체가 약물 치료에 긍정적으로 반응하는 지를 확인하는 방법에 관한다. 상기 방법은 약물에 긍정적으로 반응하는 첫 번째 개체군 및 약물에 부정적으로 반응하는 두 번째 개체군을 확인하는 단계로 구성된다. 하나 또는 복수의 이중대립유전자 마커는 상기 약물에 대한 긍정적인 반응과 연관된 첫 번째 개체군에서 동정되거나 또는 상기 약물에 대한 부정적인 반응과 연관된 첫 번째 개체군에서 동정된다. 이런 이중대립유전자 마커는 본원에서 밝힌 기술로 동정할 수 있다.
이후, 검사 시료로부터 DNA 시료를 얻는다. DNA 시료는 분석하여 이 시료가 약물에 대한 긍정적인 반응과 연관된 하나 또는 복수의 이중대립유전자 마커의 대립유전자 및/또는 약물에 대한 부정적인 반응과 연관된 하나 또는 복수의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하는 지를 확인한다.
일부 구체예에서, DNA 시료가 약물에 대한 긍정적인 반응과 연관된 하나 또는 복수의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하거나 및/또는 DNA 시료가 약물에 대한 부정적인 반응과 연관된 하나 또는 복수의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하지 않는 경우에, 약물은 개체에 투여할 수 있다. 적절한 구체예에서, 약물은 정신분열증 또는 양극성 장애를 저해하는 약물이다.
본 발명에 따른 방법을 활용한 약물 효능의 평가는 상기 약물에 긍정적으로 반응할 가능성이 높은 개체군에서 실시할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 약물을 사용하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 개체로부터 DNA 시료를 얻고, 상기 DNA 시료가 약물에 대한 긍정적인 반응과 연관된 하나 또는 복수의 이중대립유전자 마커의 대립유전자 및/또는 약물에 대한 부정적인 반응과 연관된 하나 또는 복수의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하는 지를 확인하고, DNA 시료가 약물에 대한 긍정적인 반응과 연관된 하나 또는 복수의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하거나 및/또는 DNA 시료가 약물에 대한 부정적인 반응과 연관된 하나 또는 복수의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하지 않는 경우에, 상기 약물을 개체에 투여하는 단계로 구성된다.
또한, 본 발명은 약물, 특히 정신분열증, 양극성 장애 또는 이와 관련된 증상을 저해하는 약물의 임상적 검사 방법에 관한다. 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
- 약물, 특히 정신분열증, 양극성 장애 또는 이와 관련된 증상을 저해하는 약물을 이질성 개체군에 투여하고;
- 상기 약물에 긍정적으로 반응하는 첫 번째 개체군과 상기 약물에 부정적으로 반응하는 두 번째 개체군을 확인하고;
- 상기 약물에 긍정적으로 반응하는 첫 번째 개체군에서 이중대립유전자 마커를 확인하고;
- DNA가 상기 약물에 대한 긍정적인 반응과 관련된 이중대립유전자 마커를 포함하는 개체를 선별하고;
- 상기 약물을 선별된 개체에 투여한다.
이런 방법은 정상적으로 투여된 환자 개체군의 일부에서 원치 않는 부작용을 초래하거나 및/또는 효과가 없는 약물의 투여로 인한 이익/위험 비율에 극히 유용한 것으로 보인다.
개체가 정신분열증 또는 양극성 질환으로 진단되면, 선별 검사를 실시하여 상기 개체의 DNA가 치료에 대한 긍정적인 반응 또는 부작용이나 무반응을 비롯한 치료에 대한 부정적인 반응과 관련된 이중대립유전자 마커 혹은 일군의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하는 지를 확인한다.
본 발명에 따른 방법을 활용한 치료할 환자의 선별은 전술한 진단 방법을 통하여 실시할 수 있다. 바람직하게는, 선별되는 개체는 DNA가 부정적인 반응과 관련된 이중대립유전자 마커 혹은 일군의 이중대립유전자 마커의 대립유전자를 포함하지 않는 개체이다. 특정 치료에 대한 무반응이나 부작용에 대한 개체의 유전적 소인에 관한 지식은 의사가 정신분열증, 양극성 장애 또는 관련된 증상을 적합한 약물로 직접 치료할 수 있도록 한다.
환자의 유전적 소인이 확인되면, 의사는 부정적인 반응, 특히 부작용이 보고되지 않았거나 또는 경미하게 보고된 치료 약물을 선별할 수 있다.
본원에서, 다양한 간행물, 문헌, 공개된 특허 출원이 언급되었다. 이들 간행물, 특허, 공개된 특허 출원은 본원에 순전히 참고로 한다.
실시예 1
in situ 결합 분석(세포 염색)
AP 융합 구조체
PAP 펩티드 아미노산 서열(SEQ ID No 5)을인코드하는 cDNA 서열과 분리된 알칼리성 포스파타제(AP)의 C-말단의 인-프레임 융합체는 pAPtag 발현 벡터에 만들었다. 상기 벡터에 삽입된 융합 단백질 서열의 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 각각 SEQ ID No 4와 6에 도시한다.
상기 벡터는 삽입체의 상류에 위치하는 분비 신호 서열을 보유하는데, 이는 융합 단백질이 배지로 배출되도록 한다. 융합 단백질을 함유하는 배지는 수거하고AP 활성을 분석하며 in situ 수용체/리간드 분석에 사용한다.
이후, AP 융합 단백질은 293T 세포에 트랜스펙션시키고, 안정적인 형질감염체는 제이신 저항성으로 선별한다. 안정적인 형질감염체를 함유하는 배지는 매 3일마다 수거하고 AP 활성을 분석한다. 이런 AP-융합체 함유 배지는 하기와 같이 in situ 결합 분석에 사용한다.
사람 뇌 cDNA 라이브러리는 Stratagene cDNA 합성 키트로 작제한다. cDNA는 포유동물 발현 벡터 pMT21-neo(GenHunter)에 클론시킨다. 플라스미드 DNA는 QiaPrep Spin Miniprep kit(Qiagen)을 이용하여 ~1000 콜로니 풀로부터 얻는다. 이후, 이들 DNA 풀은 아래와 같이 COS-1 세포로 일시적으로 트랜스펙션시킨다. 사람 뇌 cDNA의 각 풀로부터 얻은 2 ㎎ DNA는 200u㎕ 무-혈청 배지(첨가물없는 DMEM 배지, Gibco-BRL)에 희석한다. DNA는 무-혈청 배지에서 상기 DNA에 12㎕(사용하기에 앞서 혼합) PLUS 시약을 첨가하여 PLUS 시약과 복합체를 형성시킨다. 200u㎕ DNA-PLUS-리포펙타민 시약 복합체는 트랜스펙션(항생제를 함유하지 않는 완전 배지) 하루전 6개의 웰 접시(35㎜)에 웰당 0.25 x 105세포로 도말된 Cos-1 세포를 함유하는 웰에 첨가한다. DNA/리포펙타민/PLUS 복합체 첨가에 앞서, 완전 배지는 세포로부터 제거하고 800㎕ 무-혈청 배지로 교체한다. 세포는 37℃, 5% CO2에서 3시간동안 배양한다; 이후, 각 웰에서 배지는 2㎖ 완전 배지로 교체한다.
수용체/리간드의 수용체 클로닝
배출된 AP 융합 단백질은 발현 클로닝 전략에 의해 PAPAP를 클론하는 프로브로 사용된다.
트랜스펙션 2일후, 세포 염색을 시작한다. 배양 배지는 6개의 웰 접시에서 세포로부터 제거한다. 부착된 세포는 2㎖ HBHA 세척 완충액(50㎖ 10X HBSS(1X), 0.25g BSA(0.5㎎/㎖), 10㎖의 1M HEPES pH 7.5(20mM), dH2O로 500㎖까지 부피 증가)으로 1회 세척하고, 실온에서 2㎖ PAP-AP 융합 단백질 함유 배지 또는 AP 함유 배지(네거티브 대조군)와 함께 90분동안 배양한다. 배지는 제거하고, 시료는 10분동안 2㎖ HBHA 완충액으로 적어도 5회 세척한다. HBHA 완충액은 완전히 제거하고, 세포는 2㎖ 고정 시약(60% 아세톤, 3% 폼알데하이드, 20mM HEPES pH 7.5)으로 30초동안 고정시킨다. 고정 시약은 즉시 제거하고, 시료는 웰당 2㎖ HIS 완충액(15㎖ 5M NaCl(150mM), 10㎖ 1 M HEPES pH 7.5(20mM), dH2O로 500㎖까지 부피 증가)으로 2회 세척한다. 시료는 HS 완충액에서 100분동안 65℃에서 배양하여 내인성 AP를 열불활화시킨다. HS 완충액은 제거하고, AP 결합된 세포 표면은 1㎖ AP 분석 시약(50㎖ 1 M Tris-HCl pH 9.5(100mM), 10㎖ 5 M NaCl(100mM), 2.5㎖ 1M MgCl2(5mM), 500㎖까지 부피 증가, NBT를 첨가하는 경우 최종 농도는 0.33㎎/㎖, BCIP를 첨가하는 경우 최종 농도는 0.17 ㎎/㎖)으로 염색한다.
양성 대조군이 검출되면, 분석은 단일 클론(PAPAP 핵산)이 동정될 때까지 좀더 소규모의 cDNA 풀로 분석을 반복한다.
실시예 2
PAPAP 단백질에 대한 항체 조성물의 제조
실질적으로 순수한 단백질 또는 펩티드는 PAPAP 단백질이나 이의 일부를 인코드하는 발현 벡터를 보유하는 트랜스펙션 또는 형질전환된 세포로부터 분리된다. 최종 제형에서 단백질의 농도는 예로써 Amicon 필터 장치에서 농축하여 수 ㎎/㎖ 수준까지 조정한다. 이후, 상기 단백질에 대한 단클론이나 다클론 항체는 다음과 같이 만들 수 있다.
A. 하이브리도마 융합체에 의한 단클론 항체 생산
PAPAP 단백질이나 이의 일부에 대한 단클론 항체는 Kohler, G. and Milstein, C.,(1975)의 전형적 방법 또는 이의 변형 방법에 따라 뮤린 하이브리도마로부터 만들 수 있다(Harlow, E. and D. Lane. 1988 참조).
간단히 말하면, 생쥐는 수주동안 수 ㎎의 PAPAP 단백질이나 이의 일부분을 반복적으로 접종한다. 이후, 생쥐는 죽이고, 비장의 항체 생산 세포를 분리한다. 비장 세포는 폴리에틸렌 글리콜로 골수종 세포와 융합시키고, 과량의 융합되지 않은 세포는 아미노프테린을 함유하는 선택 배지(HAT 배지)에 성장시켜 파괴시킨다. 성공적으로 융합된 세포는 희석하고, 희석액 일부는 마이크로역가 평판의 웰에 도말하는데, 여기서 배양액의 성장이 지속된다. 항체-생산 클론은 면역분석 과정, 예를 들면 ELISA(Engvall,(1980)) 및 이의 변형 방법으로 웰의 상등액에서 항체의 검출로 동정한다. 선별된 양성 클론은 증폭시키고, 이들의 단클론 항체 산물은 수거한다. 단클론 항체 생산의 상세한 과정은 Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2에서 기술한다.
B. 면역화에 의한 다클론 항체 생산
PAPAP 단백질이나 이의 일부분에서 이질성 에피토프에 대한 항체를 포함하는 다클론 항혈청은 적합한 사람아닌 동물을 PAPAP 단백질이나 이의 일부분으로 면역화시켜 만들 수 있는데, 이는 면역원성을 강화시키기 위하여 변화시키거나 또는 변화시키지 않을 수 있다. 바람직하게는, 사람아닌 동물은 생쥐, 쥐, 토끼, 염소 또는 말에서 선택되는 사람아닌 포유동물이다. 대안으로, PAPAP 농도가 짙은 정제되지 않은 제형은 항체를 만드는데 사용할 수 있다. 이런 단백질, 단편 또는 제형은 당분야에 공지된 적합한 어쥬번트(예, 수산화알루미늄, RIBI 등)의 존재하에 사람아닌 포유동물에 도입한다. 이에 더하여, 이런 단백질, 단편 또는 제형은 항원성을 증가시키는 약품으로 사전처리할 수 있는데, 이런 약품은 당업자에게 공지된 것으로, 여기에는 메틸화된 소 혈청 알부민(mBSA), 소 혈청 알부민(BSA), B형 간염 표면 항원, 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 등이 포함된다. 면역된 동물로부터 얻은 혈청은 공지된 과정에 따라 수거하고 처리하며 검사한다. 이런 혈청이 원치 않는 에피토프에 대한 다클론 항체를 함유하면, 다클론 항체는 면역친화성 크로마토그래피로 정제할 수 있다.
효과적인 다클론 항체 생산은 항원과 숙주 종류 모두에 관련된 다수 인자의 영향을 받는다. 또한, 숙주 동물은 접종 부위와 용량에 대하여 상이한 반응을 보이는데, 부족한 또는 과도한 용량의 항원은 저 역가 항혈청을 초래한다. 다수의 피내 부위에 투여된 소량(ng 수준)의 항원이 가장 안전한 것으로 생각된다. 다클론 항혈청을 생산하고 처리하는 기술은 당분야에 공지된 것이다(Mayer and Walker(1987)). 토끼에 대하여 효과적인 면역화 프로토콜은 Vaitukaitis, J. etal.(1971)에서 확인할 수 있다.
효능 촉진 주사는 정기적인 간격으로 제공하고, 항혈청은 예로써 공지된 농도의 항원에 대한 아가에서 이중 면역확산으로 반-정량적으로 측정하는 경우에 항체 역가 감소하기 시작하면 수거한다(Ouchterlony, O. et al.(1973)). 항체의 고원기 농도는 일반적으로 혈청 ㎖당 0.1 내지 0.2㎎(대략 12μM)이다. 항원에 대한 항혈청의 친화성은 경합 결합 곡선을 작성하여 확인한다(Fisher, D.,(1980))
단클론이나 다클론 프로토콜에 따라 만들어진 항체 제형은 생물 시료에서 항원-보유 물질의 농도를 측정하는 정량적 면역분석에 유용하다; 또한, 이들은 생물 시료에서 항원의 존재를 정성적으로 또는 정량적으로 확인하는데 사용된다. 이들 항체는 상기 단백질을 발현하는 세포를 죽이거나 또는 체내에서 상기 단백질의 수준을 감소시키는 치료 조성물에 사용할 수도 있다.
참고문헌

Claims (13)

  1. SEQ ID NO 2의 PAPAP 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드.
  2. SEQ ID NO 1의 뉴클레오티드 서열 또는 이의 보체로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된, 정제된, 재조합된 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 1 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  4. 제 3 항의 재조합 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  5. 제 3 항의 재조합 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 사람을 제외한 숙주 동물 또는 포유동물.
  6. 제 1 항에 있어서, 라벨을 추가로 보유하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  7. SEQ ID NO 1의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드되는 것을 특징으로 하는 정제된 또는 분리된 PAPAP 폴리펩티드.
  8. SEQ ID NO 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 정제된 또는 분리된 PAPAP 폴리펩티드.
  9. PAPAP 폴리펩티드를 생산하는 방법에 있어서,
    a) 제 1 항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하고;
    b) PAPAP 폴리펩티드의 발현을 유도하는 조건하에 상기 숙주 세포를 배양하고;
    c) 상기 숙주 세포에 의해 생산되는 PAPAP 폴리펩티드를 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 또는 정제된 항체 조성물.
  11. 생물 시료에서 PAPAP 폴리펩티드의 존재를 특이적으로 검출하는 방법에 있어서,
    a) 제 8 항의 PAPAP 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체와 생물 시료를 접촉시키고;
    b) 상기 항체와 폴리펩티드간에 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 후보 물질을 스크리닝하는 방법에 있어서,
    a) 제 8 항의 폴리펩티드를 제공하고;
    b) 상기 폴리펩티드와 후보 물질을 접촉시키고;
    c) 상기 폴리펩티드와 후보 물질간에 복합체가 형성되는 지를 확인하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 후보 물질의 스크리닝 방법에 있어서,
    a) 자체 프로모터의 조절하에 위치하는 PAPAP 단백질을 인코드하는 뉴클레오티드 서열로 트랜스펙션된 원핵 또는 진핵 세포를 배양하고;
    b) 배양된 세포와 후보 물질을 접촉시키고;
    c 상기 후보 물질의 존재하에 PAPAP 단백질의 발현을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
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