MXPA03001150A - Gen y proteina relacionados con esquizofrenia. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a polinucleotidos del gen PAPAP, polipeptidos codificados por el gen PAPAP, y anticuerpos dirigidos especificamente contra dichos polipeptidos; la invencion se refiere tambien a metodos para el tratamiento o diagnostico de esquizofrenia, trastorno bipolar o trastornos relacionado con el SNC; la invencion se refiere tambien a la interaccion de PAPAP con el gen candidato de esquizofrenia, g34872.

Description

GEN Y PROTEINA RELACIONADOS CON ESQUIZOFRENIA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención está dirigida a polinucleótidos del gen PAPAP, polipéptidos codificados por el gen PAPAP, y anticuerpos dirigidos específicamente contra dichos polipéptidos. La invención se refiere también a métodos para el tratamiento o diagnóstico de esquizofrenia, trastorno bipolar o trastornos relacionados con el SNC. La invención se refiere también a la interacción de PAPAP con el gen candidato de esquizofrenia, g34872.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los avances en el armamentario tecnológico disponible para los investigadores básicos y clínicos, han permitido realizar estudios cada vez más sofisticados del funcionamiento del cerebro y el sistema nervioso en salud y enfermedad. Se han fomentado numerosas hipótesis neurobiológicas y farmacológicas con respecto a los mecanismos neuroquímicos y genéticos que intervienen en los trastornos del sistema nervioso central (SNC), incluyendo trastornos psiquiátricos y enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, los trastornos del SNC tienen etiologías complejas y poco entendidas, así como también síntomas que son traslapantes, poco caracterizados y difíciles de medir. Como resultado, se requerirá que los esfuerzos de desarrollo de fármacos y los regímenes de tratamiento futuros, sean más sofisticados y enfocados sobre causas multigénicas, y se necesitarán nuevas pruebas para segmentar poblaciones de enfermedad y proveer información de diagnóstico y pronóstico más precisa respecto a pacientes que sufren de trastornos del SNC. Los trastornos del SNC pueden abarcar una amplia gama de trastornos, y una gama correspondientemente amplia de factores genéticos. Ejemplos de trastornos del SNC incluyen trastornos neurodegenerativos, trastornos psicóticos, trastornos del humor, autismo, dependencia de sustancias y alcoholismo, retraso mental y otras enfermedades psiquiátricas que incluyen trastornos cognoscitivos, de ansiedad, de la alimentación, del control de impulsos y de personalidad. Los trastornos se pueden definir usando la clasificación del Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders, cuarta edición (DSM-IV). Incluso cuando se considera sólo un pequeño subconjunto de trastornos del SNC, es evidente a partir de la falta de tratamiento adecuado y el conocimiento de la base molecular de los trastornos psicóticos esquizofrenia y trastorno bipolar, que se requieren nuevos objetivos para invención terapéutica y métodos de tratamiento mejorados. Para la esquizofrenia y el trastorno bipolar, todas las moléculas conocidas que se usan para el tratamiento de esquizofrenia tienen efectos secundarios, y actúan sólo contra los síntomas de la enfermedad. Existe una fuerte necesidad de nuevas moléculas sin efectos secundarios asociados y dirigidas contra objetivos que intervienen en los mecanismos causales de esquizofrenia y trastorno bipolar. Por lo tanto, herramientas que faciliten el descubrimiento y la caracterización de estos objetivos, son necesarios y útiles. La agregación de esquizofrenia y trastorno bipolar en familias, la evidencia de estudios de adopción y de gemelos, y la falta de variación en incidencia mundial, indican que la esquizofrenia y el trastorno bipolar son condiciones principalmente genéticas, aunque factores de riesgo ambiental intervienen también hasta cierto nivel como causas necesarias, suficientes o interactivas. Por ejemplo, la esquizofrenia ocurre en 1 % de la población general. Sin embargo, si existe un abuelo con esquizofrenia, el riesgo de desarrollar la enfermedad aumenta hasta aproximadamente 3%; un padre con esquizofrenia, hasta aproximadamente 10%. Cuando ambos padres tienen esquizofrenia, el riesgo se eleva hasta aproximadamente 40%.

Identificación del gen de susceptibilidad a esquizofrenia en el cromosoma 13q31-q33 La identificación de genes involucrados en una característica particular tal como un trastorno específico del sistema nervioso central tal como la esquizofrenia, se puede llevar a cabo a través de dos estrategias principales que se usan actualmente para mapeo genético: análisis del ligamiento y estudios de asociación. El análisis del ligamiento requiere el estudio de familias con individuos afectados múltiples, y es ahora útil en la detección de características monooligogénicas u oligogénicas heredadas. A la inversa, los estudios de asociación examinan la frecuencia de alelos de marcador en individuos con características no relacionadas (T+), en comparación con controles con características negativas (T-), y se usan en general en la detección de herencia poligénica. La vinculación genética o "ligamiento" genético, se basa en el análisis de cuál de dos secuencias vecinas en un cromosoma contiene las últimas recombinaciones por entrecruzamiento durante la meiosis. Para hacer esto, marcadores cromosómicos tales como marcadores de microsatélites, se han localizado con precisión en el genoma. El análisis del ligamiento genético calcula las probabilidades de recombinaciones en el gen objetivo con los marcadores cromosómicos usados, de acuerdo al árbol genealógico, la transmisión de la enfermedad y la transmisión de los marcadores. De esta manera, si un alelo particular de un marcador determinado es transmitido con la enfermedad con jnás frecuencia de la que tendría por azar (nivel de recombinación entre 0 y 0.5), es posible deducir que el gen objetivo en cuestión se encuentra en la vecindad del marcador. Mediante el uso de esta técnica, ha sido posible localizar varios genes que demuestran una predisposición genética de cánceres familiares. Para que se puedan incluir en un estudio de ligamiento genético, las familias afectadas por una forma hereditaria de la enfermedad deben satisfacer los criterios de "informatividad": varios sujetos afectados (y cuyo ADN constitucional esté disponible) por generación, y que tengan cuando mucho un gran número de consanguíneos. Los resultados de estudios de ligamiento previos apoyaron la hipótesis de que el cromosoma 13 probablemente alojaba un locus de susceptibilidad a esquizofrenia en 13q32 (Blouin JL et al., 1998, Nature Genetics, 20: 70-73; Un MW et al., 1997, Hum. Genet., 99(3): 417-420). Estas observaciones que sugerían la presencia de un locus de esquizofrenia en el locus del cromosoma 13q32, se habían obtenido llevando a cabo estudios de ligamiento. El análisis del ligamiento se había aplicado con éxito al mapeo de características genéticas simples que muestran claros patrones de herencia mendeliana y que tienen una alta penetración, pero este método sufre de varios inconvenientes. En primer término, el análisis del ligamiento está limitado por su confianza en la elección de un modelo genético adecuado para • cada característica estudiada. Además, la ¦¦ resolución que se puede lograr • mediante el análisis del ligamiento es limitada, y se requieren estudios • complementarios para refinar el análisis de las regiones típicas de 20::Mb. identificadas inicialmente a través de este método. Además, se ha mostrado que es difícil llevar a cabo el análisis del ligamiento cuando se aplica a características genéticas complejas, tales como las debidas a la acción combinada de factores ambientales y/o genes múltiples. En dichos casos, se requieren un esfuerzo y un costo muy grandes para reclutar el número adecuado de familias afectadas que se requieren para aplicar el análisis del ligamiento a estas situaciones. Por último, el análisis del ligamiento no se puede aplicar al estudio de características para las cuales no existen grandes familias informativas. Más recientemente, en lugar de usar estudios del ligamiento, se identificó un gen novedoso relacionado con trastorno bipolar y esquizofrenia referido como el gen g34872 localizado en el locus del cromosoma 13q31- q33, usando un método alternativo para llevar a cabo estudios de asociación. Este método alternativo consistió en generar marcadores bialélicos (principalmente polimorfismos de nucleótidos individuales) en la región de interés, identificando marcadores en desequilibrio del ligamiento con esquizofrenia, y llevando a cabo estudios de asociación en poblaciones control y de casos de trastorno bipolar y esquizofrenia no relacionadas. En resumen, se construyó un BAC contiguo que abarca la región genómica candidato usando 27 STSs públicas localizadas en la región del , cromosoma 13q31-q33, para seleccionar una biblioteca de BAC patentada equivalente a 7 genomas. A partir de estos materiales, se generaron nuevas STSs que permiten la construcción de un mapa físico denso de la región. En total, 275 STSs permitieron identificar 255 BACs que fueron dimensionados y mapeados mediante hibridación cromosómica in situ para verificación. Se generaron nuevos marcadores bialélicos mediante secuenciación parcial de extremos de inserción a partir de subclones de algunas de las inserciones de BAC localizadas hacia al región del cromosoma humano 13q31-q33. En una primera fase del análisis, se analizó una primera serie de 34 marcadores bialélicos en 9 diferentes BACs a través del locus candidato del cromosoma 13q31-q33 en casos y controles esquizofrénicos, identificando de esta manera una subregión que muestra una asociación con esquizofrenia. Después de este primer análisis, se generaron otros marcadores bialélicos como se describió anteriormente, para proveer un mapa de muy alta densidad de la región objetivo. Una serie mínima de 35 BACs fue identificada y totalmente secuenciada, la cual dio como resultado varias contigüidades que incluyen una contigüidad de más de 900 kb, que comprenden secuencias de la región objetivo. Estos marcadores bialélicos se usaron es estudios de asociación para retinar una subregión particular de interés, la cual contenía un gen de esquizofrenia candidato, q34872. Los marcadores bialélicos fueron genotipificados en varios estudios llevados a cabo en diferentes poblaciones para confirmar la asociación con la subregión. Se llevaron a cabo primero estudios de asociación en dos muestras de selección diferentes de casos y controles de esquizofrenia, a partir de una población canadiense francesa que comprendía 139: casos y 141 controles, y 215 casos y 241 controles, respectivamente, así como también casos y controles de trastorno bipolar de una población argentina. Los resultados obtenidos después de varios estudios usando esta población, indicaron una región genómica de alrededor de 150 kb, que muestra una asociación significativa con esquizofrenia. Esta asociación se confirmó entonces en estudios separados usando casos y controles de una población estadounidense con esquizofrenia, así como también en otras muestras de las poblaciones canadiense francesa y argentina. Se encontró que la región genómica de aproximadamente 150 kb asociada con la esquizofrenia, contiene al gen candidato g34872. Además de que se caracterizó la estructura de intrones y exones del gen g34872, se identificó una gama de variantes de empalme de ARN mensajero, incluyendo variantes de empalme de ARN mensajero específicas de tejidos, y se demostró la existencia del ARN mensajero. Después, un fragmento peptídico derivado del producto del polipéptido de g34872, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID No. 5, demostró un decremento en la frecuencia del movimiento locomotor, y un incremento en la estereotipia cuando se inyectó intraperitonealmente en ratones. Otra discusión de la identificación del gen g34872, se provee en la solicitud de patente de E.U.A. copendiente número de serie 09/539,333, titulada "Schizophrenia associated • genes, proteins and biallelic markers", y en la solicitud de patente internacional copendiente No. PCT/IB00/00435, ambas presentadas el 30 de marzo de 2000, e incorporadas en su totalidad en la presente como referencia. Existe una gran necesidad de identificar genes que intervienen en esquizofrenia y trastorno bipolar. Existe también la necesidad de identificar genes que intervienen en la vía de g34872, y genes cuyos productos ¡nteractúan funcionalmente con los productos del gen g34872. Estos genes pueden proveer nuevos puntos de intervención en el tratamiento de esquizofrenia o trastorno bipolar, y permitir un mejor estudio y caracterización del gen g34872 y la vía biológica relacionada con el mismo. El conocimiento de estos genes y las vías biológicas relacionadas que intervienen en esquizofrenia, le permitirá a los investigadores entender la etiología de la esquizofrenia y el trastorno bipolar, y llevará a fármacos y medicaciones que serán dirigidos contra la causa de las enfermedades. Existe también una gran necesidad de nuevos métodos para detectar una susceptibilidad a la esquizofrenia y el trastorno bipolar, así como también para prevenir o seguir el desarrollo de la enfermedad. Las herramientas de diagnóstico podrían probar también que son extremadamente útiles. Por supuesto, la identificación temprana de sujetos que están en riesgo de desarrollar esquizofrenia, permitiría administrar un tratamiento temprano y/o profiláctico. Además, las evaluaciones precisas de la eficacia final de un medicamento, así como la tolerancia final del paciente al mismo, pueden permitir que Jos médicos clínicos mejoren la relación de beneficio/riesgo de los regímenes de tratamiento de la esquizofrenia y el trastorno bipolar. La presente invención se refiere de esta manera a un gen y proteína novedosos que interactúan con un péptido de g34872. Los inventores han clonado dicho gen novedoso, referido como el gen PAPAP, y demuestran que el producto del gen PAPAP interactúa con el péptido de g34872.. El conocimiento de un miembro de unión a g34872, permite el desarrollo, de medicamentos para el tratamiento de enfermedad del SNC mediada por g34872 y/o PAPAP, y permite el estudio de g34872, proveyendo medios para la detección de PAPAP, g34872 y complejos o interacciones de g34872-PAPAP.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención pertenece a moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia genómica de un gen humano novedoso que codifica para una proteína de PAPAP. La secuencia genómica de PAPAP comprende secuencias reguladoras localizadas hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de la porción transcrita de dicho gen, estas secuencias reguladoras siendo también parte de la invención. La invención se refiere también a la secuencia de ADNc completa que codifica para la proteína de PAPAP, así como también a polipéptidos y anticuerpos de PAPAP que reconocen específicamente, el polipéptido de PAPAP. Incluido también es un complejo de PAPAP-g34872 libre de proteína con el cual está asociada naturalmente, así como también anticuerpos que reconocen específicamente a dicho complejo. Sondas o iniciadores de oligonucleótidos que hibridan específicamente con una secuencia genómica o de ADNc de PAPAP, forman también parte de la presente invención, así como también métodos de detección y amplificación de ADN que usan dichos iniciadores y sondas. Otro objetivo de la invención, consiste de vectores recombinantes que comprenden cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente, y en particular de vectores recombinantes que comprenden una secuencia reguladora de PAPAP o una secuencia que codifica para una proteína de PAPAP, así como también de células hospederas y animales no humanos transgénicos que comprenden dichas secuencias de ácido nucleico o vectores recombinantes. La invención está dirigida también a métodos para la selección de sustancias o moléculas que inhiben la expresión de PAPAP, así como también a métodos para la selección de sustancias o moléculas que interactúan con un polipéptido de PAPAP, que modulan la actividad de un polipéptido de PAPAP, o que interrumpen, evitan, desestabilizan o intensifican la unión y/o las interacciones de los péptidos y/o proteínas de PAPAP y g34872. Por último, la invención está dirigida al uso del polipéptido de : PAPAP, anticuerpos para el mismo, y agonistas y antagonistas de la actividad : de PAPAP, en el tratamiento de trastornos del SNC.

BREVE DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS PROVISTAS EN EL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID No 1 contiene una secuencia de ADNc de PAPAP. SEQ ID No 2 contiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc de SEQ ID No 1. SEQ ID No 3 contiene una secuencia de ADN genómico de PAPAP. SEQ ID No 4 contiene una secuencia de ADN que codifica para una proteína de fusión de fosfatasa alcalina-péptido de g34872 descrita en el ejemplo 1. SEQ ID No 5 contiene una secuencia de ADN que codifica para un péptido de g34872 usada para identificar y clonar el gen PAPAP, que se describe en el ejemplo 1. SEQ ID No 6 contiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADN de SEQ ID No 4.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Identificación del gen PAPAP localizado en el cromosoma 1 p35-p36 Los inventores han usado un método de clonación de expresión para identificar la proteína de PAPAP, como se describe en mayor detalle en el ejemplo 1. En resumen, los inventores crearon una fusión en el marco de lectura de una secuencia de ADNc que codifica para un fragmento peptídico de un péptido de g34872 con el C-terminal de fosfatasa alcalina (AP) secretada, en un vector que contiene una secuencia de señal de secreción localizada hacia el extremo 5' de la inserción que dirigió la proteína de fusión para ser secretada en el medio, en donde el medio que contiene a la proteína de fusión puede ser colectado, puesto a prueba para actividad de AP,- y usado en una prueba de ligando/receptor ¡n situ. Los inventores llevaron a cabo entonces la prueba de ligando/receptor in situ. Moléculas de ADNc de una genoteca de ADNc de cerebro humano, fueron clonadas en un vector de expresión y transfectadas en células COS-1. La proteína de fusión de AP secretada se usó como sonda para clonar PAPAP, Incubando las células con medio que contenía proteína de fusión de AP-péptido de g34872. Cuando se detectó un clon positivo, la prueba se repitió usando reservas más pequeñas de moléculas de ADNc, hasta que se Identificara un clon individual. La presente invención se refiere de esta manera a polinucleótidos y polipéptidos relacionados con el gen PAPAP. Sondas e iniciadores de oligonucleótidos que hibridan específicamente con una secuencia genómica o de ADNc del gen PAPAP, forman también parte dé la invención. Otro objetivo de la invención, consiste en vectores recomblnantes que comprenden cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente invención, y en particular vectores recombinantes que comprenden una región reguladora de PAPAP o una secuencia que codifica para la proteína de PAPAP, así como también células hospederas que comprenden dichas secuencias de ácido nucleico o vectores recombinantes. La invención abarca también métodos para seleccionar moléculas que inhiben la expresión del gen PAPAP, las cuales modulan la actividad de la proteína de PAPAP, o interrumpen, evitan, desestabilizan o intensifican la unión y/o las interacciones de los péptidos y/o proteínas de PAPAP y g34872. La invención se refiere también a anticuerpos dirigidos específicamente contra dichos polipéptidos que son útiles como reactivos de diagnóstico. El gen PAPAP y proteína del mismo identificados se pueden usar en el diseño de pruebas para el diagnóstico de esquizofrenia o trastorno bipolar, y para el diseño de pruebas para la detección confiable de susceptibilidad genética a esquizofrenia, trastorno bipolar y trastornos relacionados. Acidos nucleicos de PAPAP y polipéptidos del mismo, así como también anticuerpos dirigidos hacia dichos polipéptidos, se pueden usar en el tratamiento de dichos trastornos. El gen PAPAP y la proteína y los anticuerpos para el mismo, se pueden usar también para diseñar protocolos de diseño de fármacos para proveer una evaluación precisa y eficiente del potencial terapéutico y los efectos secundarios del régimen de tratamiento o los medicamentos nuevos o ya existentes. Además, los polipéptidos y ácidos nucleicos de PAPAP se pueden usar para investigación en el estudio de g34872 y PAPAP, y su intervención en enfermedades del SNC.

Definiciones Antes de describir la invención en mayor detalle, se dan las siguientes definiciones para ilustrar y definir el significado y alcance de los términos usados para describir la invención. El término "gen PAPAP", cuando se usa en la presente, abarca secuencias genómicas, de ARN mensajero y de ADNc que codifican para la proteína de PAPAP, incluyendo las regiones reguladoras no traducidas del ADN genómico. El término "proteína heteróloga", cuando se usa en la presente, se usa para designar cualquier proteína o polipéptido diferente de la proteína de PAPAP. Más particularmente, la proteína heteróloga es un compuesto que se puede usar como marcador en otros experimentos con una región reguladora de PAPAP. El término "aislado" requiere que el material sea removido de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si está ocurriendo naturalmente). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que ocurre naturalmente presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o ADN o polipéptido, separado de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, o algunos de ellos, está aislado. Dicho polinucleótido podría ser parte de un vector, y/o dicho polinucleótido o polipéptido podría ser parte de una composición, y sin embargo estar aislado porque el vector o composición no forma parte de su ambiente natural. Por ejemplo, un polinucleótido que ocurre naturalmente presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido, separado de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, o algunos de los mismos, está aislado. Excluidos específicamente de la definición de "aislado" son: cromosomas que ocurren naturalmente (tales como difusiones de cromosomas), genotecas de cromosomas artificiales, genotecas genómicas y genotecas de ADNc que existen como una preparación de ácido nucleico in vitro o como una preparación de células hospederas transformadas/transfectadas, en donde las células hospederas son una preparación heterogénea in vitro o sembradas como una población heterogénea de colonias individuales. También excluidas específicamente son las genotecas anteriores, en donde un polinucleótido especificado constituye menos de 5% del número de inserciones de ácido nucleico en las moléculas del vector. También excluidas específicamente, son las preparaciones de ARN de células intactas o de ADN genómico de células intactas (incluyendo dichas preparaciones de células intactas que son separadas mecánicamente por esfuerzo cortante, o digeridas enzimática mente). También excluidas específicamente, son las preparaciones de células intactas anteriores como una preparación ¡n vitro o como una mezcla heterogénea separada mediante electrofóresis (incluyendo transferencias blot de las mismas), en donde el polinucleótido de la invención no ha sido separado adicionalmente de los polinucleótidos heterólogos en el medio de electrofóresis (por ejemplo, separación adicional separando una banda individual de una población de bandas heterogéneas en un gel de agarosa o nylon blot). Como se usa en la presente, el término "purificado" significa que no requiere pureza absoluta y, más bien, se usa como una definición relativa. La purificación del material de partida o material natural es de por lo menos un orden de magnitud, de preferencia dos o tres órdenes, y más preferiblemente se contemplan expresamente cuatro o cinco órdenes de magnitud. Como ejemplo, la purificación de una concentración de 0.1% a una concentración de 10%, es de dos órdenes de magnitud. Como ejemplo, clones de ADNc individuales aislados de una genoteca de ADNc, han sido purificados convencionalmente para homogeneidad electroforética. Las secuencias obtenidas de estos clones no se podrían obtener directamente de la genoteca o de ADN humano total. Los clones de ADNc no están ocurriendo naturalmente como tales, sino más bien se obtienen mediante manipulación de una sustancia de ocurrencia natural parcialmente purificada (ARN mensajero). La conversión de ARN mensajero en una genoteca de ADNc, implica la creación de una sustancia sintética (ADNc), y se pueden aislar clones de ADNc individuales puros a partir de la genoteca sintética mediante selección clonal. De esta manera, la creación de una genoteca de ADNc a partir del ARN mensajero, y el aislamiento subsecuente de clones individuales a partir de esa genoteca, dan como resultado una purificación de aproximadamente 10 -106 veces el mensaje nativo. Como se usa en la presente, el término "purificado" significa que no requiere pureza absoluta y, más bien, se usa como una definición relativa. -La purificación del material de partida o material natural es de por lo. menos un > orden de magnitud, de preferencia dos o tres órdenes, y más preferiblemente, se contemplan expresamente cuatro o cinco órdenes de magnitud. Como ejemplo, la purificación de una concentración de 0.1% a una concentración de 10%, es de dos órdenes de magnitud. Como ejemplo, clones de ADNc individuales aislados de una genoteca de ADNc, han sido purificados convencionalmente para homogeneidad electroforética. Las secuencias obtenidas de estos clones no se podrían obtener directamente de la genoteca o de ADN humano total. Los clones de ADNc no están ocurriendo naturalmente como tales, sino más bien se obtienen mediante manipulación de una sustancia de ocurrencia natural parcialmente purificada (ARN mensajero). La conversión de ARN mensajero en una genoteca de ADNc, implica la creación de una sustancia sintética (ADNc), y se pueden aislar clones de ADNc individuales puros a partir de la genoteca sintética mediante selección clonal. De esta manera, la creación de una genoteca de ADNc a partir del ARN mensajero, y el aislamiento subsecuente de clones individuales a partir de esa genoteca, dan como resultado una purificación de aproximadamente 10 -106 veces el mensaje nativo. . El término "purificado" se usa además en la presente para describir un polipéptido o polinucleótido de la invención que ha sido separado de otros compuestos que incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos o ¦ polinucleótidos, carbohidratos, lípidos, etc. El término "purificado" se puede:, usar , para especificar la separación de polipéptidos monoméricos de la> invención de formas oligoméricas tales como homo- o hetero- dímeros,; trímeros, etc. El término "purificado" se puede usar también para especificar la separación de polinucleótidos cerrados covalentemente de polinucleótidos lineales. Un polinucleótido es sustancialmente puro cuando por lo menos aproximadamente 50%, de preferencia de 60 a 75% de una muestra exhibe una secuencia de polinucleótidos y conformación individuales (lineal contra cerrado covalentemente). Un polipéptido o polinucleótido sustancialmente puro comprende típicamente de alrededor de 50%, de preferencia de 60 a 90% en peso/peso, de una muestra de polipéptido o polinucleótido, respectivamente, más usualmente de alrededor de 95%, y de preferencia es más de aproximadamente 99% puro. La pureza u homogeneidad del polipéptido y polinucleótido, se indica mediante un número de medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis de una muestra en gel de agarosa o poliacrilamida, visualizando entonces una banda individual después de teñir el gel. Para ciertos propósitos, se puede proveer resolución mayor mediante el uso de CLAR u otros medios bien conocidos en la técnica. Como una modalidad alternativa, la purificación de los polipéptidos y polinucleótidos . de la presente invención se puede expresar como "por lo menos" un. porcentaje de pureza respecto a polipéptidos o polinucleótidos heterólogos. (ADN, ARN o ambos). Como una modalidad preferida, los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención son por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, .95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% puros.: respecto a polipéptidos y polinucleótidos heterólogos, respectivamente. Como otra modalidad preferida, los polipéptidos y polinucleótidos tienen una pureza que varía desde cualquier número, hasta la posición de milésimas, entre 90% y 100% (por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido por lo menos 99.995% puro) respecto a polipéptidos o polinucleótidos heterólogos, respectivamente, o como una relación en peso/peso respecto a todos los compuestos y moléculas diferentes de los existentes en el vehículo. Cada número que represente un porcentaje de pureza, hasta la posición de milésimas, se puede reclamar como especie o pureza individual. El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos sin considerar la longitud del polímero; de esta manera, péptidos, oligopéptidos y proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Este término tampoco especifica o excluye las modificaciones de los polipéptidos post-expresión, por ejemplo, los polipéptidos que incluyen la unión covalente de grupos glicosilo, grupos acetilo, grupos fosfato, grupos de lípidos, y similares, son abarcados expresamente por el término polipéptido. Incluidos también dentro de la definición, son los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos que no ocurren naturalmente, aminoácidos que sólo ocurren naturalmente en un sistema biológico no relacionado, aminoácidos modificados de sistemas de mamífero, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como también otras, modificaciones conocidas en la técnica, tanto de ocurrencia natural como no natural. . El término "polipéptido recombinante" se usa en la presente para referirse a polipéptidos que han sido diseñados artificialmente y que comprenden por lo menos dos secuencias de polipéptidos que no se encuentran como secuencias de polipéptidos contiguas en su ambiente natural inicial, o para referirse a polipéptidos que han sido expresados a partir, de un polinucleótido recombinante. El término "polipéptido purificado" se usa en la presente para describir un polipéptido de la invención que ha sido separado de otros compuestos que incluyen, pero no están limitados a, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos y otras proteínas. Un polipéptido es sustancialmente puro cuando por lo menos alrededor de 50%, de preferencia de 60 a 75% de una muestra, exhibe una secuencia de polipéptidos individual. Un polipéptido sustancialmente puro comprende típicamente alrededor de 50%, de preferencia de 60 a 90% en peso/peso de una muestra de proteína, más usualmente alrededor de 95%, y de preferencia es más de aproximadamente 99% puro. La pureza u homogeneidad del polipéptido se indica mediante un número de medios bien conocidos en la técnica, tales como electrofóresis de una muestra en gel de poliacrilamida, visualizando después una banda de polipéptido individual después de teñir el gel. Para ciertos propósitos, se puede proveer mayor resolución mediante el uso de CLAR u otros medios bien conocidos en la técnica. Como se usa en la presente, el término "animal no humano" se refiere a cualquier vertebrado no humano, aves y más usualmente mamíferos,: de preferencia primates, animales de granja tales como cerdos, cabras,: ovejas, burros y caballos, conejos o roedores, más preferiblemente ratas o ratones. Como se usa en la presente, el término "animal" se usa para referirse a cualquier vertebrado, de preferencia un mamífero. Los términos "animal" y "mamífero" abarcan expresamente sujetos humanos, a menos que vayan precedidos del término "no humano". Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que están formados de por lo menos un dominio de unión, en donde el dominio de unión del anticuerpo se forma del plegamiento de dominios variables de una molécula de anticuerpo para formar espacios de unión tridimensionales con una distribución de carga y forma de superficie interna complementaria a las características de un determinante antigénico de un antígeno, el cual permite una reacción ¡nmunológica con el antígeno. Los anticuerpos incluyen proteínas recombinantes que comprenden los dominios de unión, así como también fragmentos que incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2. Como se usa en la presente, un "determinante antigénico" es la porción de una molécula de antígeno, en este caso un polipéptido de PAPAP, que determina el carácter específico de la reacción antígeno-anticuerpo. Un "epítope" se refiere a un determinante antigénico de un polipéptido. Un epítope puede comprender tan pocos como 3 aminoácidos en una-conformación espacial que es única para el epítope. En general, un epítope comprende por lo menos 6 de dichos aminoácidos, y más usualmente por lo: menos 8 a 10 de dichos aminoácidos. Métodos para determinar Ios-aminoácidos que constituyen un epítope, incluyen cristalografía de. rayos X, resonancia magnética nuclear bidimensional y mapeo de epítopes, por ejemplo, el método Pepscan descrito por Geysen et al. 1984; publicación del PCT No. WO 84/03564; y publicación del PCT No. WO 84/03506. A lo largo de la presente especificación, la expresión "secuencia de nucleótidos" se puede usar para designar indistintamente un polinucleótido o un ácido nucleico. En forma más precisa, la expresión "secuencia de nucleótidos" abarca el material nucleico mismo, y de esta manera no se restringe a la información de secuencias (es decir, la sucesión de letras seleccionadas entre las letras de las cuatro bases) que caracterizan bioquímicamente a una molécula específica de ADN o ARN. Como se usan recíprocamente en la presente, los términos "ácidos nucleicos", "oligonucleótidos" y "polinucleótidos", incluyen ARN, ADN o secuencias híbridas de ARN/ADN de más de un nucleótido en forma de cadena sencilla o de dúplex. El término "nucleótido" se usa en la presente como adjetivo para describir moléculas que comprenden ARN, ADN o secuencias híbridas de ARN/ADN de cualquier longitud en forma de cadena sencilla o de dúplex. El término "nucleótido" se usa también en la presente como sustantivo para referirse a nucleótidos individuales o variedades de nucleótidos, y significa una molécula, o unidad individual en una molécula de ácido nucleico más grande, que comprende una purina o pirimidina, una ;·· porción azúcar de ribosa o desoxirribosa, y un grupo fosfato, o - enlace fosfodiéster en el caso de nucleótidos dentro de un oligonucleótido o polinucleótido. Aunque el término "nucleótido" se usa también en la presente para abarcar "nucleótidos modificados" los cuales comprenden por lo menos una modificación (a) de un grupo de enlace alternativo, (b) una forma análoga de purina, (c) una forma análoga de pirimidina, o (d) un azúcar análogo, para ejemplos de grupos de enlace análogos, purina, pirimidinas y azúcares véase, por ejemplo, la publicación del PCT No. WO 95/04064. Las secuencias de polinucleótidos de la invención se pueden preparar mediante cualquier método conocido, incluyendo métodos de síntesis, recombinantes, de generación ex vivo, o una combinación de los mismos, así como también el uso de cualquier método de purificación conocido en la técnica.

Una secuencia que está "enlazada operablemente" a una secuencia reguladora tal como un promotor, significa que dicho elemento regulador está en la posición y orientación correctas con relación al ácido nucleico, para controlar el inicio de la ARN polimerasa y la expresión del ácido nucleico de interés. Como se usa en la presente, el término "enlazado operablemente" se refiere a un enlace de elementos de polinucleótidos en una relación funcional. Por ejemplo, un promotor o intensificador está enlazado operablemente a una secuencia de codificación, si afecta la transcripción de la ¦ secuencia de codificación. . Los términos "característica" y "fenotipo" se usan, recíprocamente en la presente, y se refieren a cualquier propiedad visible, detectable o de otra manera medible de un organismo, tal como síntomas de, o susceptibilidad a, una enfermedad, por ejemplo. Típicamente, los términos "característica" o "fenotipo" se usan en la presente para referirse a síntomas de, o susceptibilidad a, una enfermedad, una respuesta benéfica a, o efectos secundarios relacionados con, un tratamiento. De preferencia, dicha característica puede ser, sin que sea limitada a, cánceres, enfermedades del desarrollo y enfermedades neurológicas. El término "alelo" se usa en la presente para referirse a variantes de una secuencia de nucleótidos. Un polimorfismo bialélico tiene dos formas. Los organismos diploides pueden ser homocigóticos o heterocigóticos para una forma alélica. El término "genotipo", como se usa en la presente, se refiere a la identidad de los alelos presentes en un individuo o una muestra. En el contexto de la presente invención, un genotipo se refiere de preferencia a la descripción de los alelos de marcadores bialélicos presentes en un individuo o una muestra. El término "genotipificación" de una muestra o un individuo para un marcador bialélico, implica determinar el alelo específico o el nucleótido específico llevado por un individuo en un marcador bialélico. El término "mutación", como se usa en la presente, se refiere a una diferencia en la secuencia de ADN entre diferentes genomas o individuos que tiene una frecuencia menor de 1 %. El termino "polimorfismo", como se usa en la presente, se refiere a la ocurrencia de dos o más secuencias genómicas o alelos alternativos entre diferentes genomas o individuos. "Polimórfico" se refiere a la condición en la cual- dos o más variantes de una secuencia genómica específica, se pueden encontrar en una población. Un "sitio polimórfico" es el locus en el cual la variación ocurre. Un polimorfismo de nucleótido individual es el reemplazo de un nucleótido por otro nucleótido en el sitio polimórfico. La deleción de un nucleótido individual o la inserción de un nucleótido individual, da lugar también a polimorfismos de nucleótidos individuales. En el contexto de la presente invención, "polimorfismo de nucleótido individual" se refiere de preferencia a una sustitución de nucleótido individual. Típicamente, entre diferentes individuos, el sitio polimórfico puede ser ocupado por dos nucleótidos diferentes. Los términos "polimorfismo bialélico" y "marcador bialélico" se usan recíprocamente en la presente, para referirse a un polimorfismo de nucleótido individual que tiene dos alelos con una frecuencia claramente alta en la población. Un "alelo de marcador bialélico" se refiere a las variantes de nucleótidos presentes en un sitio de marcador bialélico. El término "hacia el extremo" 5', se usa en la presente para referirse a una posición que está hacia el extremo 5' del poiinucleótido a partir de un punto de referencia específico. Los términos "base pareada" y "base pareada de Watson & Crick", se usan recíprocamente en la presente para referirse a nucleótidos que se pueden unir mediante hidrógenos a algún otro en virtud de sus identidades de secuencias en forma similar a la presente en el ADN de doble hélice con residuos de timidina o uracilo unidos a residuos de adenina, mediante dos ¦ enlaces de hidrógeno, y residuos de citosina y guanina unidos por tres enlaces de hidrógeno (véase Stryer, L, Biochemistry, cuarta edición, 1995). ·, ,·. Los términos "complementarias" o "complemento del mismo", como se usan en la presente, se refieren a las secuencias de polinucleótidos. que son capaces de formar apareamiento de bases de Watson & Crick con otro poiinucleótido especificado en la totalidad de la región complementaria. Para el propósito de la presente invención, se considera que un primer poiinucleótido es complementario a un segundo poiinucleótido cuando cada base en el primer poiinucleótido está apareada con su base complementaria. Las bases complementarias son, en general, A y T (o A y U), o C y G. "Complemento" se usa en la presente como sinónimo de "poiinucleótido complementario", "ácido nucleico complementario" y "secuencia de nucleótidos complementara". Estos términos se aplican a pares de polinucleótidos con base sólo en sus secuencias, y no alguna serie de condiciones en particular bajo las cuales los dos polinucleótidos realmente se unirían.

Variantes y fragmentos 1 - Polinucleótidos La invención se refiere también a variantes y fragmentos de los polinucleótidos descritos en la presente, en particular de un gen PAPAP que contiene uno o más marcadores bialélicos de conformidad con la invención. Las variantes de polinucleótidos, como el término se usa en la presente, son polinucleótidos que difieren de un polinucleótido de referencia./ Una variante de un polinucleótido puede ser una variante que ocurre naturalmente, tal como una variante alélica que ocurre naturalmente, o puede ser una variante que no se sabe que ocurre naturalmente. Dichas variantes del polinucleótido que no ocurren naturalmente, se pueden obtener mediante técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. En general, las diferencias son limitadas, de modo que las secuencias de nucleótidos de la referencia y la variante son estrechamente similares en general y, en muchas regiones, idénticas. Las variantes de polinucleótidos de conformidad con la invención incluyen, sin ser limitadas a, secuencias de nucleótidos que son por Jo menos 95% idénticas con un polinucleótido de SEQ ID Nos 1 ó 3, o a cualquier fragmento de polinucleótido de por lo menos 12 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido de SEQ ID Nos 1 ó 3, y de preferencia por lo menos 99% idénticas, más particularmente por lo menos 99.5% idénticas, y muy preferiblemente por lo menos 99.8% idénticas, con un polinucleótido de SEQ ID Nos 1 ó 3, o con cualquier fragmento de polinucleótido de por lo menos 12 nucleótidos consecutivos de un polinucleótido de SEQ ID Nos 1 ó 3. Los cambios de nucleótidos presentes en un polinucleótido variante pueden ser silenciosos, lo cual significa que no alteran los aminoácidos codificados por el polinucleótido. Sin embargo, los cambios de nucleótidos pueden dar también como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y. truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia. Las sustituciones, deleciones o adiciones pueden incluir uno o más nucleótidos. Las variantes pueden ser, alteradas en regiones codificantes o no codificantes, o ambas. Las alteraciones en las regiones codificantes pueden producir sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. En el contexto de la presente invención, las modalidades particularmente preferidas son aquellas en las cuales los polinucleótidos codifican para polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que la proteína de PAPAP madura, o aquellas en las cuales los polinucleótidos codifican para polipéptidos que mantienen o incrementan una actividad biológica particular, mientras reducen una segunda actividad biológica. Un fragmento de polinucleótido es un polinucleótido que tiene una secuencia que es enteramente igual como parte de, pero no toda, una secuencia de nucleótidos determinada, de preferencia la secuencia de nucleótidos de un gen PAPAP, y variantes de la misma. E! fragmento puede ser una porción de un intrón o un exón de un gen PAPAP. Puede ser también una porción de las regiones reguladoras de PAPAP. Dichos fragmentos pueden ser "autoestables", es decir, no siendo parte de, o fusionados a, otros polinucleótidos, o pueden estar comprendidos dentro de un polinucleótido individual más grande del cual forman una parte o región. Por supuesto, varios de estos fragmentos pueden estar presentes dentro de un polinucleótido más grande individual. Opcionalmente, dichos fragmentos pueden consistir de, o consistir esencialmente de, un espacio contiguo de por lo menos 8, 10, 12, 5, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 250, 500 ó 100 nucleótidos de longitud. 2 - Polipéptidos La invención se refiere también a variantes, fragmentos, análogos y derivados de los polipéptidos descritos en la presente, incluyendo proteínas de PAPAP mutadas. La variante puede ser 1 ) una en la cual uno o más de los residuos de aminoácido son sustituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado, y dicho residuo de aminoácido sustituido puede ser codificado o no por el código genético, o 2) una en la cual uno o más de los residuos de aminoácido incluye un grupo sustituyente, o 3) una en la cual el PAPAP mutado se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto que incrementa la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o 4) una en la cual los aminoácidos adicionales se fusionan al PAPAP mutado, tal: como una secuencia guía o secretoria o una secuencia que se usa para purificación del PAPAP mutado o una secuencia de preproteína. Se considera que dichas variantes están dentro del alcance de los expertos en la técnica. Un fragmento de polipéptido es un polipéptido que tiene una secuencia que es enteramente igual como parte de, pero no toda, una ; ¦ secuencia de polipéptido determinada, de preferencia un polipéptido ; codificado por un gen PAPAP, y variantes.del mismo. En el caso de una sustitución de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de conformidad con la invención, uno o varios aminoácidos pueden ser reemplazados por aminoácidos "equivalentes". La: expresión aminoácido "equivalente", se usa en la presente para designar cualquier aminoácido que puede ser sustituido por uno de los aminoácidos que tenga propiedades similares, de modo que el experto en la técnica de química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanezcan sustancialmente sin cambios. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios equivalentes: (1 ) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, He, Leu, et, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His.

Una modalidad específica de una molécula de péptido de PAPAP modificada de interés de conformidad con la presente invención incluye, pero no está limitada a, una molécula de péptido que es resistente a proteólisis, y es un péptido en el cual el enlace peptídico -CONH- es modificado y reemplazado por un enlace reducido (CH2NH), un enlace retroinverso (NHCO), un enlace metilenoxi (CH2-0), un enlace tiometileno (CH2-S), un enlace carba (CH2CH2), un enlace cetometileno (CO-CH2), un enlace hidroxietileno (CHOH-CH2), un enlace (N-N), en enlace E-alceno, o, también un enlace -CH=CH-. La invención abarca también un polipéptido de PAPAP de humano o un fragmento o una variante del mismo, en el cual por lo menos un enlace peptídico ha sido modificado como se - describió anteriormente. · : Dichos fragmentos pueden ser "autoestables", es decir, no siendo parte de, o fusionados con, otros polipéptidos, o pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido individual más grande del cual forman una parte o región. Sin embargo, varios fragmentos pueden estar comprendidos dentro de un polipéptido más grande individual. Como ejemplos representativos de fragmentos de polipéptidos de la invención, se pueden mencionar los que tienen de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 a 15, 10 a 20, 15 a 40 ó 30 a 55 aminoácidos de longitud. Preferidos son los fragmentos que contienen por lo menos una mutación de aminoácido en la proteína de PAPAP.

Identidad entre ácidos nucleicos o polipéptidos Los términos "porcentaje de identidad de secuencias" y "porcentaje de homología", se usan recíprocamente en la presente para referirse a comparaciones entre polinucleótidos y polipéptidos, y se determinan comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia del polinucieótido o polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios), en comparación con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o deleciones) para alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el numero de posiciones en las cuales el residuo de aminoácido o base de ácido nucleico idéntico ocurre en ambas secuencias, para dar el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100, para dar el porcentaje de identidad de secuencias. La homología se evalúa usando cualquiera de una variedad de algoritmos y programas de comparación de secuencias conocidos en la técnica. Dichos algoritmos y programas incluyen, pero de ninguna manera están limitados a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA y CLUSTALW (Pearson y Lipman, 1988; Altschul et al., 1990; Thompson et al., 1994; Higgins et al., 1996; Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1993). En una modalidad particularmente preferida, las homologías de secuencias de ácido nucleico y proteína se evalúan usando la herramienta de búsqueda de alineación local básica ("BLAST"), la cual es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, 1990; Altschul et al., 1990, 1993, 1997). En particular, cinco programas BLAST específicos se usan para llevar a cabo la siguiente tarea: (1 ) BLASTP y BLAST3 comparan una secuencia de aminoácidos en cuestión con una base de datos de secuencias de proteína; (2) BLASTN compara una secuencia de nucleótidos en cuestión con una base de datos de secuencias de nucleótidos; (3) BLASTX compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de lectura de una secuencia de nucleótidos en cuestión (ambas cadenas) con una base de datos de secuencias de proteína; (4) TBLASTN compara una secuencia de proteínas en cuestión con una base de datos de secuencias de nucleótidos traducida en los. seis marcos de lectura (ambas cadenas); y (5) TBLASTX compara las traducciones de seis marcos de lectura de una secuencia de nucleótidos en cuestión con las traducciones de seis marcos de lectura de una base de secuencias de nucleótidos. Los programas BLAST identifican secuencias homologas identificando segmentos similares, los cuales son referidos en la presente como "pares de segmentos de alta puntuación", entre una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos en cuestión y una secuencia de prueba la cual se obtiene de preferencia de una base de datos de secuencias de proteína o de ácido nucleico. Los pares de segmentos de alta puntuación se identifican de preferencia (es decir, se alinean) mediante una matriz de puntuación, muchos de los cuales se conocen en la técnica. De preferencia, la matriz de puntuación usada es la matriz BLOSUM62 (Gonnet et al., 1992; Henikoff y Henikoff, 1993). Menos preferiblemente, las matrices PAM o PAM250 se pueden usar también (véase, por ejemplo, Schwartz y Dayhoff, eds, 1987). Los programas BLAST evalúan el significado estadístico de todos los pares de segmentos de alta puntuación identificados, y seleccionan de preferencia los segmentos que satisfacen un umbral de significancia especificado por el usuario, tal como un porcentaje de homología especificado por el usuario. De preferencia, la significancia estadística de un par de segmentos de alta puntuación se evalúa usando la fórmula de significancia estadística de Karlin (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, 1990). Los programas BLAST se pueden usar con los parámetros de omisión o con parámetros modificados provistos por el usuario.

Condiciones de hibridación severa Con el propósito de definir dicho ácido nucleico hibridante de conformidad con la invención, las condiciones de hibridación severa son las siguientes: El paso de hibridación se realiza a 65°C en presencia de 6x de regulador de pH SSC, 5x de solución de Denhard, SDS a 0.5% y 100 µ?/ml de ADN de esperma de salmón. El paso de hibridación va seguido de cuatro pasos de lavado: dos lavados durante 5 minutos, de preferencia a 65°C en un regulador de pH de 2x de SSC y SDS a 0.1%; un lavado durante 30 minutos, de preferencia a 65°C en un regulador de pH de 2x de SSC y SDS a 0.1%; un lavado durante 10 minutos, de preferencia a 65°C en un regulador de pH de 0.1 x de SSC y SDS a 0.1%; estas condiciones de hibridación siendo adecuadas para una molécula de ácido nucleico de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. No es necesario decir que las condiciones de hibridación descritas, anteriormente serán adaptadas de acuerdo a la longitud del ácido, nucleico deseado, siguiendo técnicas bien conocidas por los expertos en la materia.. Las condiciones de hibridación adecuadas se pueden adaptar, por ejemplo,' de, acuerdo a las enseñanzas descritas en la obra de Hames y Higgins (1985).

Secuencias qenómicas del gen PAPAP La presente invención se refiere a las secuencias genómicas de PAPAP. La presente invención abarca el gen PAPAP, o secuencias= genómicas de PAPAP que consisten de, que consisten esencialmente de, o que comprenden, la secuencia de SEQ ID No 3, una secuencia complementaria a la misma, así como también fragmentos y variantes de la misma. Estos polinucleótidos pueden ser purificados, aislados o recombinantes. Los ácidos nucleicos de PAPAP incluyen polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente de, o que consisten, de un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID No 3, o los complementos de los mismos. Los ácidos nucleicos de PAPAP pueden incluir también polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente de, o que consisten, de un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 900, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos seleccionados del grupo de posiciones de nucleótido 1 a 3038, 1 a 421 , 422 a, 557, 2158 a 2218 y 2620 a 3039 de SEQ ID No 3, o los complementos. de los mismos. La invención abarca también un polinucleótido purificado, aislado o recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo. menos 70, 75, 80, 85, 90 o 95% de identidad de nucleótidos con una secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 3 o una secuencia complementaria a¡ la misma, o un fragmento de la misma. Las diferencias de nucleótidos. respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 3, se pueden distribuir en general aleatoriamente por todo el ácido nucleico. Sin embargo, los. ácidos nucleicos preferidos son aquellos en donde las diferencias de nucleótidos con respecto a la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 3 se localizan predominantemente fuera de las secuencias de codificación contenidas en los exones. Estos ácidos nucleicos, así como también sus fragmentos y variantes, se pueden usar como iniciadores o sondas de oligonucleótidos para detectar la presencia de una copia del gen PAPAP en una muestra de prueba, o en forma alternativa, para amplificar una secuencia de nucleótidos objetivo dentro de las secuencias de PAPAP. Otro objetivo de la invención, consiste de un ácido nucleico purificado, aislado o recombinante que híbrida con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 3 o una secuencia complementaria a la misma o una variante de la misma, bajo las condiciones de hibridación severa definidas anteriormente. Aunque esta sección se titula "secuencias genómicas de PAPAP", se debe observar que los fragmentos de ácido nucleico de cualquier tamaño y secuencia pueden ser abarcados también por los polinucleótidos descritos en esta sección, flanqueando las secuencias genómicas de PAPAP en cualquier lado o entre dos o más de dichas secuencias genómicas. ·.·.

Secuencias de ADNc de PAPAP Se ha mostrado que la expresión del gen PAPAP lleva a la producción de por lo menos una especie de ARN mensajero, cuya secuencia . de ácido nucleico se describe en SEQ ID No 1. Otro objetivo de la invención, es un ácido nucleico purificado, aislado o recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ . ID No 1 , secuencias complementarias a la misma, así como también variantes alélicas, y fragmentos de la misma. Además, los polinucleótidos preferidos de la invención incluyen moléculas de ADNc de PAPAP purificadas, aisladas o recombinantes que consisten de, que consisten esencialmente de, o que comprenden, la secuencia de SEQ ID No 1. Acidos nucleicos particularmente preferidos de la invención, incluyen polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente de, o que consisten, de un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID No 1 , o los complementos de los mismos. Los ácidos nucleicos de la invención incluyen también polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 100 nucleótidos de SEQ ID No 1 , o los complementos de los mismos, en donde dicho espacio contiguo, comprende por lo menos 1 , 2, 3, 5 ó 10 de las siguientes posiciones de nucleótido de SEQ ID No 1 : 1 a 140, 141 a 460, 460 a 690, 87 a 346 y 691 y 1104: Otras modalidades preferidas de la invención, incluyen polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo, de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, : 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID No 1, o los complementos de los mismos, en donde dicho espacio contiguo comprende un marcador bialélico. La invención pertenece también a un ácido nucleico purificado o aislado que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 95% de identidad de nucleótidos con un polinucleótido de SEQ ID No 1, en forma ventajosa 99% de identidad de nucleótidos, de preferencia 99.5% de identidad de nucleótidos, y más preferiblemente 99.8% de identidad de nucleótidos con un polinucleótido de SEQ ID No 1 , o una secuencia complementaria al mismo, o un fragmento biológicamente activo del mismo. Otro objetivo de la invención, se refiere a ácidos nucleicos purificados, aislados o recombinantes que comprenden un polinucleótido que híbrida, bajo condiciones de hibridación severa definidas en la presente, con un polinucleótido de SEQ ID No 1 , o una secuencia complementaria al mismo, o una variante del mismo, o un fragmento biológicamente activo del mismo. El ADNc de SEQ ID No 1 incluye una región 5 -UTR que parte del nucleótido en la posición 1 , y termina en el nucleótido en la posición 86 de SEQ ID No 1. El ADNc de SEQ ID No 1 incluye una región 3 -UTR que parte del nucleótido en la posición 347, y termina en el nucleótido en la posición . 1104 de SEQ ID No 1. La señal de poliadenilación parte del nucleótido en la : posición 1085, y termina en el nucleótido en la posición 1 04 de SEQ ID No 1. ; Por consiguiente, la invención se refiere , a un ácido nucleico ¦ purificado, aislado y recombinante que comprende una secuencia de: - nucleótidos de 5'UTR del ADNc dé PAPAR, una secuencia complementaria a la misma, o una variante alélica de la misma. La invención se refiere también a un ácido nucleico purificado, aislado y recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos de 3'UTR del ADNc de PAPAP, una secuencia complementaria a la misma, o una variante alélica de la misma. Aunque esta sección se titula "secuencias de ADNc de PAPAP", se debe observar que fragmentos de ácido nucleico de cualquier tamaño y secuencia pueden ser abarcados también por los polinucleótidos descritos en esta sección, flanqueando las secuencias genómicas de PAPAP en cualquier lado o entre dos o más de dichas secuencias genómicas.

Regiones de codificación El marco de lectura abierto de PAPAP está contenido en el ARN mensajero correspondiente de SEQ ID No 1. Más precisamente, la secuencia de codificación (CDS) de PAPAP efectiva incluye la región entre la posición de. nucleótido 87 (primer nucleótido del codón ATG), y la posición de nucleótido 346 (nucleótido final del codón de TGA) de SEQ ID No 1. La presente, invención describe también polinucleótidos aislados, purificados y recombinantes que codifican para polipéptidos que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 ó 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No 2. El polinucleótido descrito , anteriormente que contiene la secuencia dé codificación del gen PAPAP, puede ser expresado en una célul hospedera deseada o un organismo hospedero deseado, cuando este. polinucleótido se pone bajo el control de señales de expresión adecuadas. Las' señales de expresión pueden ser las señales de expresión contenidas en las: regiones reguladoras del gen PAPAP de la invención o, en contraste, las : señales pueden ser secuencias nucleicas reguladoras exógenas. Dicho polinucleótido, cuando se pone bajo las señales de expresión adecuadas, puede ser insertado también en un vector para su expresión y/o amplificación.

Secuencias reguladoras de PAPAP Como se mencionó, la secuencia genómica del gen PAPAP contiene secuencias reguladoras en la región flanqueante 5' no codificante y en la región flanqueante 3' no codificante que limitan la región de codificación de PAPAP que contiene los tres exones de este gen. Los polinucleótidos derivados de las regiones reguladoras 5' y 3', son útiles para detectar la presencia de por lo menos una copia de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 3, o un fragmento de la misma en una muestra de prueba. La actividad promotora de las regiones reguladoras 5' contenidas en PAPAP, se puede evaluar como se describe a continuación. Para identificar los fragmentos de polinucleótido biológicamente activos o variantes de SEQ ID No 3 relevantes, el experto en la técnica -deberá referirse a la obra de Sambrook et al. (Sambrook, 1989), que describe el uso de un vector recombinante que posee un gen marcador (es decir, beta galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, etc.), cuya expresión se detectará cuando se pone bajo el control de un fragmento de polinucleótido biológicamente activo o variantes de SEQ ID No 3. Las secuencias genómicas localizadas hacia el extremo 5' del primer exón del gen PAPAP, son clonadas en un vector reportero de promotor adecuado, tal como pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer, p gal-Basic, ppgal-Enhancer, o vectores reporteros de promotor pEGFP-1 , disponibles de Clontech, o vectores de gen reportero de luciferasa sin promotor pGL2-basic o pGL3-basic, de Promega. En resumen, cada uno de estos vectores reporteros de promotor incluye sitios de clonación múltiples situados hacia el extremo 5' de un gen reportero que codifica para una proteína que se puede poner a prueba fácilmente, tal como fosfatasa alcalina, luciferasa, ß-galactosidasa o proteína fluorescente verde secretadas. Las secuencias hacia el extremo 5' de la región de codificación de PAPAP, son insertadas en los sitios de clonación hacia el extremo 5' del gen reportero en ambas orientaciones, e introducidas en una célula hospedera adecuada. El. nivel de proteína del reportero se pone a prueba y se compara con el nivel obtenido de un vector que carece de una inserción en el sitio de clonación. La. presencia de un nivel de expresión elevado en el vector que contiene a la inserción con respecto al vector control, indica la presencia de un promotor en la inserción. Si es necesario, las secuencias hacia el extremo 5' pueden ser clonadas en vectores que contengan un intensificador para incrementar los niveles de transcripción a partir de secuencias de promotor débiles. Un nivel . ¦ de expresión significativo arriba del observado con el vector que carece de. una inserción, indica que una secuencia de promotor está presente en la,. secuencia hacia el extremo 5' insertada. La secuencia de promotor dentro del ADN genómico hacia el • extremo 5' se puede definir además construyendo deleciones 5' y/o 3' anidadas en el ADN hacia el extremo 5', usando técnicas convencionales tales: como exonucleasa III o digestión adecuada con endonucleasa de restricción. Los fragmentos de deleción resultantes pueden ser insertados en el vector reportero de promotor para determinar si la deleción ha reducido o suprimido la actividad del promotor, tal como se describe, por ejemplo, en Coles et al. (1998), cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. De esta manera, se pueden definir los límites de los promotores. Si se desea, se pueden identificar sitios reguladores individuales potenciales dentro del promotor usando mutagénesis dirigida a sitio o exploración del enlazador para suprimir los sitios de unión del factor de transcripción potenciales dentro del promotor individualmente o en combinación. Los efectos de estas mutaciones sobre los niveles de transcripción, se pueden determinar insertando las mutaciones en sitios de clonación en vectores reporteros del promotor. Este tipo de prueba es bien conocida por los expertos, en la.técnica, y se describe en el documento WO 97/17359, patente de E.U.A.;. No. 5,374,544; EP 582 796; patente de E.U.A. No. 5,698,389; documento US 5,643,746; patente de E.U-.A. No. 5,502,176; y patente de E.U.A. 5,266,488;, cpyas descripciones se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. ¦ . - ¡ - ' La fuerza y el carácter específico del promotor del gen PAPAP, se pueden evaluar a-través de los niveles de expresión de un polinucleótido detectable enlazado operablemente al promotor de PAPAP en diferentes tipos . de células y tejidos. El polinucleótido detectable puede ser un polinucleótido que híbrida específicamente con una sonda de oligonucleótidos predefinida, o un polinucleótido que codifica para una proteína detectable, incluyendo un polipéptido de PAPAP o un fragmento o una variante del mismo. Este tipo de . prueba es bien conocida por los expertos en la técnica, y se describe en la patente de E.U.A. No. 5,502,176; y en la patente de E.U.A. No. 5,266,488; cuyas descripciones se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. Algunos de los métodos se describen en más detalle a continuación. Polinucleótidos que poseen los elementos reguladores localizados en el extremo 5' y en el extremo 3' de la región de codificación de PAPAP, se pueden usar en forma ventajosa para controlar la actividad de transcripción y de traducción de un polinucleótido heterólogo de interés. De esta manera, la presente invención se refiere también a un ácido nucleico purificado o aislado que comprende un polinucleótido que sé selecciona del grupo que consiste de las regiones reguladoras 5' ó 3', o una secuencia complementaria a las mismas, o ün fragmento biológicamente: activo o variante de las mismas. En un aspecto, la "región reguladora 5"': comprende la secuencia de nucleótidos localizada entre las posiciones 1 y 421 de SEQ ID No 3. En un aspecto, la "región reguladora 3"' comprende la--secuencia de nucleótidos localizada entre las posiciones 3040 y 3189 de SEQ ID No 3. La invención pertenece también a un ácido nucleico purificado o aislado que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 95% de identidad de nucleótidos con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de las regiones reguladoras 5' y 3', en forma ventajosa 99% de identidad de nucleótidos, de preferencia 99.5% de identidad de nucleótidos, y más preferiblemente 99.8% de identidad de nucleótidos, con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de las regiones reguiadoras 5' y 3', o una secuencia complementaria a las mismas, o una variante de las mismas, o un fragmento biológicamente activo de las mismas. Otro objetivo de la invención, consiste de ácidos nucleicos purificados, aislados o recombinantes que comprenden un polinucleótido que híbrida, bajo las condiciones de hibridación severa definidas en la presente,' con un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de las secuencias de nucleótidos de las regiones reguladoras 5' y 3', o una secuencia -complementaria a las mismas, o una variante de las mismas, o un fragmento, biológicamente activo de las mismas. Los fragmentos preferidos de la región reguladora 5' tienen una longitud de alrededor de 1500 ó 1000 nucleótidos, dé preferencia de aproximadamente 500 nucleótidos, más preferiblemente de alrededor de 00. nucleótidos, incluso más preferiblemente de 300 nucleótidos, y muy preferiblemente de alrededor de 200 nucleótidos. Los fragmentos preferidos de la región reguladora.3', tienen por lo menos 50, 00, 150, 200, 300 ó 4060 bases de longitud. Los derivados del polinucleótido "biológicamente activo" de SEQ ID No 3, son polinucleótidos que comprenden o que consisten alternativamente de un fragmento de dicho polinucleótido, el cual es funcional como región reguladora que expresa un polipéptido recombinante o un polinucleótido recombinante en una célula hospedera recombinante. Podría actuar como un intensificador o como un represor. Para el propósito de la invención, un ácido nucleico o polinucleótido es "funcional" como región reguladora que expresa un polipéptido recombinante o un polinucleótido recombinante, si dicho polinucleótido regulador contiene secuencias de nucleótidos que contienen información reguladora de transcripción y traducción, y dichas secuencias están "enlazadas operablemente" con secuencias de nucleótidos que codifican para el polipéptido deseado o el polinucleótido deseado. Los polinucleótidos reguladores de la invención se pueden preparar a partir de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No 3, mediante digestión usando enzimas de restricción adecuadas como se describe, por ejemplo, en la obra de Sambrook et al. (1989). Los polinucleótidos reguladores se pueden preparar también mediante digestión de SEQ ID No 3 por una enzima exonucleasa, tal como Bal31 (Wabiko et aL, 1986). Estos polinucleótidos reguladores se pueden preparar también mediante síntesis química de ácidos nucleicos, como se describe en otra parte en la especificación. Los polinucleótidos reguladores de conformidad con la invención, pueden ser parte de un vector de expresión recombinante que se puede usar para expresar una secuencia de codificación en una célula hospedera u organismo hospedero deseado. Los vectores de expresión recombinantes de conformidad con la invención, se describen en otras partes en la especificación. Un polinucleótido regulador 5' preferido de la invención, incluye la región no traducida 5' (5'-UTR) del ADNc de PAPAP, o un fragmento biológicamente activo o variante de la misma.

Un polinucleótido regulador 3' preferido de la invención, incluye la región no traducida 3' (3 -UTR) del ADNc de PAPAP, o un fragmento biológicamente activo o variante de la misma. Otro objetivo de la Invención, consiste de un ácido nucleico purificado aislado que comprende: a) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos reguladora seleccionada del grupo que consiste de: (i) una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido de la región reguladora 5', o una secuencia complementaria a la misma; (ii) una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido que tiene por lo menos 95% de identidad de nucleótidos con la secuencia de nucleótidos de la región reguladora 5', o una secuencia complementaria a la misma; (iii) una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido que híbrida bajo condiciones de hibridación severa, con una secuencia de nucleótidos de la región reguladora 5', o una secuencia complementaria a la misma; y (iv) un fragmento biológicamente activo o variante de los polinucleótidos de los incisos (i), (ii) y (iii); b) un polinucleótido que codifica para un polipéptido deseado o un ácido nucleico de interés, enlazado operablemente al ácido nucleico definido en el inciso (a) anterior; c) opcionalmente, un ácido nucleico que comprende un polinucleótido regulador 3', de preferencia un polinucleótido regulador 3' del gen PAPAP. En una modalidad específica del ácido nucleico definido anteriormente, dicho ácido nucleico incluye la región no traducida 5' (5 -UTR) del ADNc de PAPAP, o un fragmento biológicamente activo o variante de la misma. En una segunda modalidad específica del ácido nucleico definido anteriormente, dicho ácido nucleico incluye la región no traducida 3' (3 -UTR) del ADNc de PAPAP, o un fragmento biológicamente activo b variante de la misma. El polinucleótido regulador de la región reguladora 5', o sus fragmentos biológicamente activos o variantes, está enlazado operablemente en el extremo 5' del polinucleótido que codifica para el polipéptido o polinucleótido deseado. El polinucleótido regulador de la región reguladora 3', o sus fragmentos biológicamente activos o variantes, está enlazado operablemente en forma ventajosa en el extremo 3' del polinucleótido que codifica para el polipéptido o polinucleótido deseado. El polipéptido deseado codificado por el ácido nucleico descrito anteriormente, puede ser de diferente naturaleza u origen, abarcando proteínas de origen procariótico o eucariótico. Entre los polipéptidos expresados bajo el control de una región reguladora de PAPAP, se incluyen antígenos de bacterias, hongos o virus. También abarcadas son proteínas eucarióticas tales como proteínas intracelulares tales como proteínas "de mantenimiento", receptores tipo proteínas unidas a membrana, y mediadores endógenos tipo proteínas secretadas tales como citocinas. El polipéptido deseado puede ser la proteína de PAPAP, especialmente la proteína de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 2, o un fragmento o una variante de la misma. Los ácidos nucleicos deseados codificados por el polinucleótido descrito anteriormente, usualmente una molécula de ARN, pueden ser complementarios a un polinucleótido de codificación deseado, por ejemplo, a la secuencia de codificación de PAPAP, y de esta manera útiles como un polinucleótido antisentido. Dicho polinucleótido se puede incluir en un vector de expresión recombinante para expresar el polipéptido deseado o el ácido nucleico deseado en una célula hospedera u organismo hospedero deseado. Vectores recombinantes adecuados que contienen un polinucleótido tal como el descrito en la presente, se describen en otras partes en la especificación.

Construcciones de polinucleótidos Los términos "construcción de polinucleótido" y "polinucleótido recombinante", se usan recíprocamente en la presente para referirse a polinucleótidos lineales o circulares, purificados o aislados, que han sido diseñados artificialmente, y que comprenden por lo menos dos secuencias de nucleótidos que no se encuentran como secuencias de nucleótidos contiguas en su ambiente natural inicial.

Construcción de ADN que permite dirigir la expresión temporal v espacial del gen PAPAP en células hospederas recombinantes y en animales transgénicos Para estudiar las consecuencias fisiológicas y fenotípicas de la falta de síntesis de la proteína de PAPAP, tanto al nivel de célula como al nivel de organismo multicelular, la invención abarca también construcciones de ADN y vectores recombinantes que permiten una expresión condicional de un alelo específico de la secuencia genómica o de ADNc de PAPAP, y también de una copia de esta secuencia genómica o de ADNc que aloja sustituciones, deleciones o adiciones de una o más bases con respecto a la secuencia de nucleótidos de PAPAP de SEQ ID Nos 1 y 3, o un fragmento de la misma, estas sustituciones, deleciones o adiciones de bases estando localizadas en un exón, un intrón o una secuencia reguladora, pero de preferencia en la secuencia reguladora 5' o en un exón de la secuencia genómica de PAPAP, o dentro del ADNc de PAPAP de SEQ ID No 1. En una modalidad preferida, la secuencia de PAPAP comprende un marcador bialélico. La presente invención describe vectores recombinantes que comprenden cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente invención. Más particularmente, las construcciones de polinucleótidos de conformidad con la presente invención, pueden comprender cualquiera de los polinucleótidos descritos en ia sección de "secuencias genómicas del gen PAPAP", la sección de "secuencias de ADNc de PAPAP", la sección de "regiones de codificación" y la sección de "sondas e iniciadores de oligonucleótidos". Una primera construcción de ADN preferida se basa en el operón de resistencia a tetraciclina tet del transposón Tn 0 de £. coli para el control de la expresión del gen PAPAP, tal como es descrito por Gossen et al. (1992, 1995) y Furth et al. (1994). Dicha construcción de ADN contiene siete secuencias del operador tet de Tn10 (tetop), que están fusionadas a un promotor mínimo o una secuencia reguladora 5' del gen PAPAP, dicho promotor mínimo o dicha secuencia reguladora de PAPAP estando, enlazados operablemente a un polinucleótido de interés que codifica para un oligonucleótido sentido o antisentido, o para un polipéptido, incluyendo un polipéptido de PAPAP, o un fragmento peptídico del mismo. Esta construcción de ADN es funcional como sistema de expresión condicional para la secuencia de nucleótidos de interés cuando la misma célula comprende también una secuencia de nucleótidos que codifica para el represor de tipo silvestre (tTA) o el represor muíante (rTA) fusionado al dominio de activación de la proteína viral VP16 del virus de herpes simple, puesta bajo el control de un promotor tal como el intensificador/promotor HCMVIE1 o M TV-LTR. Por supuesto, una construcción de ADN preferida de la invención, comprende el polinucleótido que contiene las secuencias del operador tet y el polinucleótido que contiene una secuencia que codifica para el represor tTA o rTA.

En una modalidad específica, la construcción de ADN de expresión condicional contiene la secuencia que codifica para el represor de tetraciclina mutante rTA, y la expresión del polinucleótido de interés es silenciosa en ausencia de tetraciclina, e inducida en su presencia.

Construcciones de ADN que permiten recombinación homologa: vectores de reemplazo Una segunda construcción de ADN preferida comprenderá, del extremo 5' al extremo 3': (a) una primera secuencia de nucleótidos que está incluida en la secuencia genómica de PAPAP; (b) una secuencia de nucleótidos que comprende un marcador de selección positiva, tal como, el marcador para resistencia a neomicina (neo); y (c) una segunda secuencia*de nucleótidos que está incluida en la secuencia genómica de PAPAP y que se localiza en el genoma hacia el extremo 3' de la primera secuencia ¡de nucleótidos (a) de PAPAP. En una modalidad preferida, esta construcción de ADN comprende también un marcador de selección negativa localizado hacia el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos (a), o hacia el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos (c). De preferencia, el marcador de selección negativa comprende el gen de timidina cinasa (tk) (Thomas et al., 1996), el gen de higromicina beta (Te Riele et al., 1990), el gen hprt Van der Lugt et al., 1991 ; Reid et al., 1990) o el gen del fragmento de toxina A de difteria (Dt-A) (Nada et al., 1993; Yagi et al., 1990). De preferencia, el marcador de selección positiva se localiza dentro de una secuencia exónica de PAPAP, de modo que interrumpe la secuencia que codifica para una proteína de PAPAP. Estos vectores de reemplazo son descritos, por ejemplo, por Thomas et al. (1986; 1987), Mansour et al. (1988) y Koller et al. (1992). La primera y segunda secuencias de nucleótidos (a) y (c) se pueden localizar indistintamente dentro de una secuencia reguladora de PAPAP, una secuencia ¡ntrónica, una secuencia exónica, o una secuencia que contenga secuencias reguladoras y/o intrónicas y/o exónicas. El tamaño de las secuencias de nucleótidos (a) y (c) varía de 1 a 50 kb, de preferencia de 1 a 10 kb, más preferiblemente de 2 a 6 kb, y muy preferiblemente de 2 a 4 kb.

Construcciones de ADN que permiten recombinación homologa: sistema Cre-LoxP Estas nuevas construcciones de ADN, hacen uso del sistema de recombinación específica de sitio del fago P1. El fago P1 posee una ¦¦ recombinasa denominada Cre, que interactúa específicamente con un sitio loxP de 34 pares de bases. El sitio loxP está formado de dos secuencias palindrómicas de 13 pares de bases, separadas por una secuencia conservada de 8 pares de bases (Hoess et al., 1986). La recombinación por la enzima Cre entre dos sitios loxP que tienen una orientación idéntica, lleva a la deleción del fragmento de ADN. El sistema Cre-/oxP usado en combinación con una técnica de recombinación homologa, ha sido descrito primero por Gu et al. (1993, 1994).

En resumen, una secuencia de nucleótidos de interés que será insertada en una posición dirigida del genoma, aloja por lo menos dos sitios loxP en la misma orientación, y localizados en los extremos respectivos de una secuencia de nucleótidos que será separada del genoma recombinante. El evento de excisión requiere la presencia de la enzima recombinasa (Cre) dentro del núcleo de la célula hospedera recombinante. La enzima recombinasa se puede producir en el tiempo deseado, (a) incubando las células hospederas recombinantes en un medio de cultivo que contenga esta enzima, inyectando la enzima Cre directamente en la célula deseada, tal como es descrito por Araki et al. (1995), o mediante lipofección de la enzima en las células, como es descrito por Baubonis et al. (1993); (b) transfectando la célula hospedera con un vector que comprenda la secuencia de codificación de Cre enlazada operablemente a un promotor funcional en la célula hospedera recombinante, cuyo promotor es opcionalmente .inducible, dicho vector siendo introducido en la célula hospedera recombinante, tal como es descrito por Gu et al. (1993) y Sauer et al. (1998); (c) introduciendo en el genoma de la célula hospedera, un polinucleótido que comprenda la secuencia de codificación de Cre enlazada operablemente a un promotor funcional en la célula hospedera recombinante, cuyo promotor es opcionalmente inducible, y dicho polinucleótido siendo insertado en el genoma de la célula hospedera mediante un evento de inserción aleatoria o un evento de recombinación homologa, tal como es descrito por Gu et al. (1994). En una modalidad específica, el vector que contiene la secuencia que será insertada en el gen PAPAP mediante recombinación homologa, se construye de tal forma que los marcadores seleccionares son flanqueados por sitios loxP de la misma orientación, si es posible, mediante tratamiento por la enzima Cre, para eliminar los marcadores seleccionares mientras deja las secuencias de PAPAP de interés que han sido insertadas mediante un evento de recombinación homologa. De nuevo, se requieren dos marcadores seleccionables: un marcador de selección positiva para seleccionar para el evento de recombinación, y un marcador de selección negativa para seleccionar para el evento de recombinación homologa. Vectores y métodos que usan el sistema Cre-/oxP, son descritos por Zou et al. (1994). De esta manera, una tercera construcción de ADN preferida de la invención comprende, del extremo 5' al extremo 3': (a) una primera secuencia de nucleótidos que está incluida en la secuencia genómica de PAPAP; (b) una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido que codifica para un marcador de selección positiva, dicha secuencia de nucleótidos comprendiendo además dos secuencias que definen un sitio reconocido por una recombinasa, tal como un sitio loxP, los dos sitios: estando situados en la misma orientación; y (c) una segunda secuencia de nucleótidos que está incluida en la secuencia genómica de PAPAP y que se localiza en el genoma hacia el extremo 3' de la primera secuencia de nucleótidos (a) de PAPAP. Las secuencias que definen un sitio reconocido por una recombinasa, tal como un sitio loxP, se localizan de preferencia dentro de la secuencia de nucleótidos (b) en posiciones adecuadas que limitan la secuencia de nucleótidos para la cual se busca la excisión condicional. En una modalidad específica, dos sitios loxP se localizan en cada lado de la secuencia del marcador de selección positiva, para permitir su excisión en un tiempo deseado después de la ocurrencia del evento de recombinación homologa. En una modalidad preferida de un método que usa la tercera construcción de ADN descrita anteriormente, la excisión del fragmento de polinucleótido limitado por los dos sitios reconocidos por una recombinasá, de preferencia dos sitios loxP, se lleva a cabo en un tiempo deseado, debido a la presencia, dentro del genoma de la célula hospedera recombinante, de una secuencia que codifica para la enzima Cre enlazada operablemente a una secuencia de promotor, de preferencia un promotor inducible, más preferiblemente una secuencia de promotor específica de tejidos, , y muy preferiblemente una secuencia de promotor que es inducible y específica de tejidos, tal como es descrito por Gu et al. (1994). La presencia de la enzima Cre dentro del genoma de la célula hospedera recombinante, puede resultar de la cruza de dos animales transgénicos, el primer animal transgénico teniendo la secuencia derivada de PAPAP de interés que contiene los sitios loxP como se describió anteriormente, y el segundo animal transgénico teniendo la secuencia de codificación de Cre enlazada operablemente a una secuencia de promotor adecuada, tal como es descrito por Gu et al. (1994).

El control espacial y temporal de la expresión de la enzima Cre, se puede lograr también con un vector basado en adenovirus que contenga el gen de Cre, permitiendo de esta manera la infección de las células, o la infección in vivo de órganos, para la liberación de la enzima Cre, tal como es descrito por Antón y Graham (1995) y Kanegae et al. (1995). Las construcciones de ADN descritas anteriormente se pueden usar para introducir una secuencia de nucleótidos deseada de la invención, de preferencia una secuencia genómica de PAPAP o una secuencia de ADNc de PAPAP, y más preferiblemente una copia alterada de una secuencia genómica o de ADNc de PAPAP, dentro de una posición predeterminada del genoma dirigido, llevando a la generación de una copia alterada de un gen dirigido (recombinación homologa de expresión bloqueada), o al reemplazo de una copia del gen dirigido por otra copia suficientemente homologa que permita que ocurra un evento de recombinación homologa (recombinación homologa de expresión reemplazada). En una modalidad específica, las construcciones de ADN descritas anteriormente se pueden usar para introducir una secuencia genómica de PAPAP o una secuencia de ADNc de PAPAP que comprenda por lo menos un marcador bialélico.

Construcciones de ADN antisentido nuclear Otras composiciones que contienen un vector de la invención, comprenden un fragmento de oligonucleótido de la secuencia nucleica del ADNc de SEQ ID No, de preferencia un fragmento que incluye el codón de inicio del gen PAPAP, como una herramienta antisentido que inhibe la expresión del gen PAPAP correspondiente. Métodos preferidos que usan polinucleótidos antisentido de conformidad con la presente invención, son los procedimientos descritos por Sczakiel et al. (1995), o los descritos en la solicitud del PCT No WO 95/24223, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. De preferencia, las herramientas antisentido se seleccionan entre los polinucleótidos (de 15-200 pares de bases de longitud) que son complementarios al extremo 5' del ARN mensajero de PAPAP. En . una modalidad, se usa una combinación de diferentes polinucleótidos antisentido complementarios a diferentes partes del gen dirigido deseado. Los polinucleótidos antisentido preferidos de conformidad con la presente invención, son complementarios a una secuencia de las moléculas de ARN mensajero de PAPAP, que contienen el codón de inicio de la traducción ATG o un sitio de empalme. Otros polinucleótidos' antisentido preferidos de conformidad con la invención, son complementarios al sitio de empalme del ARN mensajero de PAPAP. De preferencia, ios polinucleótidos antisentido de la invención tienen una señal de poliadenilación 3' que ha sido reemplazada con una secuencia de ribozima autoescindible, de modo que se producen transcritos de ARN polimerasa II sin poli(A) en sus extremos 3', estos polinucleótidos antisentido siendo incapaces de salir del núcleo, tal como es descrito por Liu et al. (1994). En una modalidad preferida, estos polinucleótidos antisentido de PAPAP comprenden también, dentro del cassette de ribozima, una estructura de tallo y espira de histona que estabiliza los transcritos escindidos contra la degradación exonucleolítica 3'-5\ tal como la estructura descrita por Eckner et al (1991).

Sondas e iniciadores de oliqonucleótidos Los polinucleótidos derivados del gen PAPAP, son útiles para detectar la presencia de por lo menos una copia de una secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nos 1 ó 3, o un fragmento, complemento, o variante de la misma, en una muestra de prueba. Sondas e iniciadores particularmente preferidos de la invención, incluyen polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 8, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID No 3, o los complementos de los mismos. Las sondas e iniciadores incluyen también polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID No 3, o los complementos de los mismos, en donde dicho espacio contiguo comprende por lo menos una de las siguientes posiciones de nucleótido de SEQ ID No 3: 1 a 3038, 1 a 421 , 422 a 557, 2158 a 2118 y 2620 a 3039. Otras sondas e iniciadores preferidos de la invención, incluyen polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes, que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID No 1 , o los complementos de los mismos. Otras sondas e iniciadores preferidos de la invención, incluyen polinucleótidos aislados, purificados o recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 500 ó 1000 nucleótidos de SEQ ID No 1 , o los complementos de los mismos, en donde dicho espacio contiguo comprende por lo menos una de las siguientes posiciones de nucleótido de SEQ ID No 1 : 1 a 140, 141 a 460, 460 a 690, 87 a 346 y 691 a 1104. De esta manera, la invención se refiere también a sondas de : ácido nucleico caracterizadas porque hibridan específicamente, bajo las condiciones de hibridación severa definidas anteriormente, con un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de las secuencias de: nucleótidos de SEQ ID Nos 1 y 3, o una variante de las mismas, o una secuencia complementaria a las mismas. En una modalidad, la invención abarca polinucleótidos aislados, purificados y recombinantes que consisten de, o que consisten esencialmente de, un espacio contiguo de 8 a 50 nucleótidos de cualquiera de SEQ ID Nos 1 , 3, y el complemento de los mismos, en donde dicho espacio incluye un marcador bialélico relacionado con PAPAP en dicha secuencia, o un marcador bialélico en desequilibrio de enlace con PAPAP; opcionalmente, en donde dicho espacio contiguo tiene 18 a 35 nucleótidos de longitud, y dicho marcador bialélico está dentro de 4 nucleótidos del centro de dicho polinucleótido; opcionalmente, en donde dicho polinucleótido consiste de dicho espacio contiguo, y dicho espacio contiguo tiene 25 nucleótidos de longitud, y dicho marcador bialélico está en el centro de dicho polinucleótido; opcionalmente, en donde el extremo 3' de dicho espacio contiguo está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido; y opcionalmente, en donde el extremo 3' de dicho espacio contiguo se localiza en el extremo 3' de dicho polinucleótido, y dicho marcador bialélico está presente en el extremo 3' de dicho polinucleótido. En otra modalidad, la invención abarca polinucleótidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden, que consisten esencialmente de, o que consisten esencialmente, de un espacio contiguo de 8 a .50 mucleótidos de SEQ ID. Nos 1 , 3, o los complementos de los mismos, en donde el extremo 3' de dicho espacio contiguo se localiza en el extremo 3' de: dicho polinucleótido, y en donde el extremo 3' de dicho polinucleótido se localiza dentro de 20 nucleótidos hacia el extremo 5' de un marcador bialélico relacionado con PAPAP en dicha secuencia, o un marcador bialélico en desequilibrio de enlace con el mismo. En otra modalidad, la invención abarca polinucleótidos para su uso en pruebas de hibridación, pruebas de secuenciación y pruebas de detección de no apareamientos basadas en enzimas, para determinar la identidad del nucleótido en un marcador bialélico relacionado con PAPAP en SEQ ID Nos 1 , 3, o los complementos del mismo, así como también polinucleótidos para su uso en segmentos de amplificación de nucleótidos que comprenden un marcador bialélico relacionado con PAPAP en SEQ ID Nos 1 , 3, o los complementos del mismo. La invención se refiere al uso de los polinucleótidos de conformidad con la invención, para determinar la identidad del nucleótido en un marcador bialélico relacionado con PAPAP, de preferencia en prueba de hibridación, prueba de secuenciación, prueba de microsecuenciación, o una prueba de detección de no apareamientos basada en enzimas y en segmentos de amplificación de nucleótidos que comprenden un marcador bialélico relacionado con PAPAP. Una sonda o un iniciador de conformidad con la invención, tiene entre 8 y 1000 nucleótidos de longitud, o sé especifica que tenga por lo menos 12, 15, 18, 20, 25, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 250, 500 ó 1000 nucleótidos de longitud. Más particularmente, la longitud de estas sondas e iniciadores puede variar de 8, 10, 15, 20 ó 30 a 100 nucleótidos, de preferencia de 10 a 50, más preferiblemente de 15 a 30 nucleótidos. Sondas e iniciadores más cortos tienden a carecer de carácter específico por una secuencia de ácido nucleico objetivo, y requieren en general temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde. Sondas e iniciadores más largos son costosos de producir, y pueden a veces autohibridar para formar estructuras de pasador. La longitud adecuada para los iniciadores y sondas bajo una serie de condiciones de prueba particulares, puede ser determinada empíricamente por los expertos en la técnica. La formación de híbridos estables, depende de la temperatura de fusión (Tm) del ADN. La Tm depende de la longitud de la sonda o iniciador, la resistencia iónica de la solución, y el contenido de G+C. Cuanto mayor es el contenido de G+C de la sonda o iniciador, mayor es la temperatura de fusión, debido a que los pares de G:C son mantenidos por tres enlaces de hidrógeno, mientras que los pares de A:T sólo tienen dos. El contenido de GC en las sondas de la invención, varía usualmente entre 10 y 75%, de preferencia entre 35 y 60%, y más preferiblemente entre 40 y 55%. Las sondas e iniciadores se pueden preparar mediante cualquier método adecuado incluyendo, por ejemplo, clonación y restricción de secuencias adecuadas y síntesis química directa mediante un método tal como el método dé fosfodiéster de Narang et al. (1979), el método de fosfodiéster de Brown et al. (1979), el método de dietilfosforamidita . de Beaucage et al. (1981), y el método de soporte sólido que se describe ;en el documento EP 0 707 592. Las sondas de detección son en general secuencias de ácido nucleico o análogos de ácido nucleico sin carga tales como, por ejemplo, los ácidos nucleicos peptídicos que se describen en la solicitud de patente internacional WO 92/20702, y los análogos de morfolino que se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,185,444; 5,034,506 y 5,142,047. La sonda puede tener que hacerse "no extendible", porque no se pueden añadir otros dNTPs a la sonda. Por sí mismos, los análogos son usualmente no extendibles, y las sondas de ácido nucleico se pueden hacer no extendibles modificando el extremo 3' de la sonda, de modo que el grupo hidroxilo deje de participar en la elongación. Por ejemplo, el extremo 3' de la sonda se puede funcionalizar con la marca de captura o detección para consumir así, o de otra manera bloquear, el grupo idroxilo. En forma alternativa, el grupo hidroxilo 3' simplemente puede ser escindido, reemplazado o modificado. La solicitud de patente de E.U.A. número de serie 07/049,061 , presentada en abril 19, 1993, describe modificaciones que se pueden usar para hacer que una sonda sea no extendible. Cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención puede ser marcado, si así se desea, incorporando cualquier marca conocida en la técnica, para que sea detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunológicos o químicos. Por ejemplo, marcas útiles incluyen sustancias radiactivas (que incluyen 32P, 35S, 3H, 25l), colorantes fluorescentes (que incluyen 5-bromodesoxiuridina, fluoresceína, acetilaminofluoreno, digooxigenina), o biotina. De preferencia, los polinucleótidos son marcados en sus extremos 3' y 5'. Ejemplos de marcación no radiactiva de fragmentos de ácido nucleico, se describen en la patente francesa No. FR-7810975, o son descritos por Urdea et al (1988) o Sánchez-Pescador et al (1988). Además, las sondas de conformidad con la presente invención, pueden tener características estructurales tales que permiten la amplificación de señales, dichas características estructurales siendo, por ejemplo, sondas de ADN ramificado, como las descritas por Urdea et al. en 1991 , o en la patente europea No. EP 0 225 807 (Chiron). Una marca se puede usar también para capturar el iniciador, para facilitar la inmovilización del iniciador o un producto de extensión del iniciador, tal como ADN amplificado, sobre un soporte sólido. Una marca de captura es unida a los iniciadores o sondas, y puede ser un miembro de unión específica que forme un par de unión con el miembro de unión específica del reactivo de fase sólida (por ejemplo, biotina y estreptavidina). Por lo tanto, dependiendo del tipo de marca llevada por un polinucleótido o una sonda, se puede usar para capturar o para detectar el ADN objetivo. Además, se entenderá que los polinucleótidos, iniciadores o sondas provistos en la presente pueden, por sí mismos, servir como la marca de captura. Por ejemplo, en el caso en donde un miembro de unión del reactivo de fase sólida . sea una secuencia de ácido nucleico, se puede seleccionar de modo que se una a una porción complementaria de un iniciador o sonda para inmovilizar de esta manera al iniciador o sonda a la fase sólida. En casos en donde una sonda de polinucleótido sirve por sí misma como el miembro de unión, los expertos en la técnica reconocerán que la sonda contendrá una secuencia o "cola" que no es complementaria al objetivo. En el caso en donde un iniciador de polinucleótido sirve por sí mismo como la marca de captura, por io menos una porción del iniciador estará libre para hibridar con un ácido nucleico sobre una fase sólida. Las técnicas de marcación de ADN son bien conocidas por los expertos en la materia. Las sondas de la presente invención son útiles para un número de propósitos. Se pueden usar notablemente en hibridación Southern con ADN genómico. Las sondas se pueden usar también para detectar productos de amplificación de PCR. Se pueden usar también para detectar no apareamientos en el gen PAPAP o ARN mensajero de PAPAP usando otras técnicas. Cualquiera de los polinucleótidos, iniciadores y sondas de la presente invención, puede ser inmovilizado convenientemente sobre un soporte sólido. Los soportes sólidos son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen las paredes de cavidades de una bandeja de. reacción, tubos de prueba, perlas de poliestireno, perlas magnéticas, tiras de nitrocelulosa, membranas, micropartículas tales como partículas de látex, eritrocitos de oveja (u otro animal), duracytes®, y otros. El soporte.sólido no es crítico, y puede ser seleccionado por los expertos en la técnica: De esta manera, partículas de látex, micropartículas, perlas magnéticas o no magnéticas, membranas, tubos de plástico, paredes de cavidades de microtítulo, chips de vidrio o silicio, eritrocitos de oveja (o de otro animal adecuado), y duracytes®, son también ejemplos adecuados. Métodos adécuados para inmovilizar ácidos nucleicos sobre fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrofóbicas, covalentes, y similares. Un soporte sólido, como se usa en la presente, se refiere a cualquier material que sea insoluble, o que se pueda hacer insoluble mediante una reacción subsecuente. El soporte sólido se puede seleccionar por su capacidad intrínseca para unirse al reactivo de captura, e inmovilizarlo. En forma alternativa, la fase sólida puede retener un receptor adicional que tenga la capacidad de atraer al reactivo de captura, e inmovilizarlo. El receptor adicional puede incluir una sustancia con carga que esté cargada opuestamente con respecto al reactivo de captura mismo, o con respecto a una sustancia cargada conjugada con el reactivo de captura. Como otra alternativa, la molécula receptora puede ser cualquier miembro de unión específico que sea inmovilizado sobre el soporte sólido (o adherido al mismo), y que tenga la capacidad de inmovilizar al reactivo de captura mediante una reacción de unión específica. La molécula receptora permite la unión indirecta del reactivo de captura a un material de soporte sólido antes de la realización de la prueba, o durante la realización de la misma. La fase sólida puede ser de esta manera un plástico, plástico derivatizado, metal magnético o no magnético, superficie de vidrio o de silicio de un tubo de prueba, cavidad de microtítulo, hoja, perla, micropartícula, chip, eritrocitos de oveja (o de otro animal adecuado), duracytes®, , y otras configuraciones conocidas por los expertos en la técnica. Los polinucleótidos de la invención pueden ser unidos a, o inmovilizados sobre, un soporte sólido, individualmente o en grupos de por lo menos 2, 5, 8, 10, 12, 15, 20 ó 25 polinucleótidos distintos de la invención, a un soporte sólido individual. Además, polinucleótidos diferentes de los de la invención, pueden ser adheridos al mismo soporte sólido como uno o más polinucleótidos de la invención. Por consiguiente, la invención comprende también un método para detectar la presencia de un ácido nucleico, el cual comprende un nucleótido de SEQ ID Nos 1 ó 3, un fragmento o una variante del mismo, y una secuencia complementaria al mismo, en una muestra, dicho método comprendiendo los pasos de: a) poner en contacto una sonda de ácido nucleico o una pluralidad de sondas de ácido nucleico que puedan hibridar con una secuencia de nucleótidos incluida en un ácido nucleico de SEQ ID Nos 1 ó 3, un fragmento o una variante de la misma, y una secuencia complementaria a la misma, y la muestra que se va a poner a prueba; y b) detectar el complejo híbrido formado entre la sonda y un ácido nucleico en la muestra. La invención se refiere además a un equipo para detectar la presencia de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nos 1 ó 3, un fragmento o una variante de la misma, y una secuencia complementaria a la misma en una muestra, dicho, equipo . comprendiendo: a) una sonda de ácido nucleico o una pluralidad de sondas de ácido nucleico que puedan hibridar con una secuencia de nucleótidos' incluida en un ácido nucleico de SEQ ID Nos 1 ó 3, un fragmento o una variante de la misma, y una secuencia complementaria a la misma; y b) opcionalmente, los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción de hibridación. En una primera modalidad preferida de este método y equipo de detección, dicha sonda de ácido nucleico o la pluralidad de sondas de ácido nucleico es marcada con una molécula detectable. En una segunda modalidad preferida de dicho método y equipo, dicha sonda de ácido nucleico o la pluralidad de sondas de ácido nucleico, ha sido inmovilizada sobre un substrato.

Disposiciones de oligonucleótidos Un substrato que comprende una pluralidad de iniciadores o sondas de oligonucleótidos de la invención, se puede usar para detectar o amplificar secuencias dirigidas en el gen PAPAP, y se puede usar también para detectar mutaciones en las secuencias codificantes o no codificantes del gen PAPAP. Cualquier polinucleótido provisto en la presente puede ser unido en áreas traslapantes o en posiciones aleatorias sobre el soporte sólido. En forma alternativa, los polinucleótidos de la invención pueden ser adheridos en -una disposición ordenada, en donde cada polinucleótido es adherido a una región distinta del soporte sólido que no traslapa con el sitio de adhesión de cualquier otro polinucleótido. De preferencia, dicha disposición ordenada de polinucleótidos está diseñada para ser "dirigible", en donde las posiciones distintas son registradas y pueden ser accesadas como parte de un procedimiento de prueba. Las disposiciones de polinucleótidos dirigibles comprenden típicamente una pluralidad de diferentes sondas de oligonucleótidos que son acopladas a una superficie de un substrato en diferentes posiciones conocidas. El conocimiento de la ubicación precisa de cada posición de polinucleótido, hace que estas disposiciones "dirigibles" sean particularmente útiles en pruebas de hibridación. Cualquier tecnología de disposición dirigible conocida en la técnica se puede usar con los polinucleótidos de la invención. Una modalidad particular de estas disposiciones de polinucleótidos se conoce como Genechips™, y se ha descrito en general en la patente de E.U.A. 5,143,854; publicaciones del PCT WO 90/15070 y 92/10092. Estas disposiciones se pueden producir en general usando métodos de síntesis mecánica o métodos de síntesis dirigida con luz que incorporan una combinación de métodos fotolitográficos y síntesis: de oligonucleótidos de fase sólida (Fodor et al., 1991). La inmovilización de las disposiciones de oligonucleótidos sobre soportes sólidos, se ha hecho posible gracias al desarrollo de una tecnología identificada en general como "síntesis de polímeros inmovilizados a muy grande escala" (VLSIPS™) en la cual, típicamente, las sondas son inmovilizadas en una disposición de alta densidad sobre una superficie sólida de un chip. Ejemplos de tecnologías de VLSIPS™ se proveen en las patentes de E.U.A. 5,143,854 y 5,412,087, y en las publicaciones del PCT WO 90/15070, WO 92/10092 y WO 95/11995, las cuales describen métodos para formar disposiciones de oligonucleótidos mediante técnicas tales como técnicas de síntesis dirigida con luz. En el diseño de estrategias enfocadas a proveer disposiciones de nucleótidos inmovilizados sobre soportes sólidos, se desarrollaron otras estrategias de presentación para ordenar y exhibir las disposiciones de oligonucleótidos sobre los chips, en un intento por aumentar al máximo los patrones de hibridación y la información de secuencias. Ejemplos de dichas estrategias de presentación se describen en las publicaciones del PCT WO 94/12305, WO 94/11530, WO 97/29212 y WO 97/31256, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad en la presente como referencia. En otra modalidad de las disposiciones de oligonucleótidos de la invención, se puede usar en forma ventajosa una matriz de sonda de oligonucleótidos para detectar mutaciones que ocurren en el gen PAPAP, y de preferencia en su región reguladora. Para este propósito en particular, las sondas son diseñadas específicamente para que tengan una secuencia de nucleótidos que permita su hibridación con los genes que poseen mutaciones conocidas (mediante deleción, inserción o sustitución de uno o varios nucleótidos). Por mutaciones conocidas, se entiende mutaciones en el gen PAPAP que han sido identificadas, por ejemplo, de acuerdo a la técnica usada por Huang et al. ( 996) o Samson et al. (1996). Otra técnica que se usa para detectar mutaciones en el gen PAPAP, es el uso de una disposición de ADN de alta densidad. Cada sonda de oligonucleótidos que constituye un elemento unitario de la disposición de ADN de alta densidad, está diseñada para acoplar una subsecuencia específica del ADNc o ADN genómico de PAPAP. De esta manera, una disposición que consista de oligonucleótidos complementarios a subsecuencias de la secuencia del gen objetivo, se usa para determinar la identidad de la secuencia objetivo con la secuencia del gen de tipo silvestre, para medir su cantidad y para detectar diferencias entre la secuencia objetivo y la secuencia del gen de tipo silvestre de referencia del gen PAPAP. En dicho diseño, denominado disposición enlosada 4L, se implementa una serie de cuatro sondas (A, C, G, T), de preferencia oligoméros de 15 nucleótidos. En cada serie de cuatro sondas, ei complemento perfecto hibridará más fuertemente que las sondas no apareadas. Por consiguiente, se explora un objetivo de ácido nucleico de longitud L para mutaciones con una disposición enlosada que contiene 4L sondas, la serie de sondas completa conteniendo todas las mutaciones posibles en la secuencia de referencia de tipo silvestre conocida. Las señales de hibridación de la disposición enlosada de la serie de sondas de 15 elementos, son perturbadas por un cambio de base individual en la secuencia objetivo. Como consecuencia, existe una pérdida característica de señal, o una "huella" para las sondas que flanquean la posición de una mutación. Esta técnica fue descrita por Chee et al. en 1996. Por consiguiente, la invención se refiere a una disposición de moléculas de ácido nucleico que comprenden por lo menos un polinücleótido descrito anteriormente como sondas e iniciadores. De preferencia, la invención se refiere a una disposición de ácido nucleico que comprende por lo menos dos polinucleótidos descritos anteriormente como sondas e iniciadores.

Proteínas y fragmentos de polipéptidos de PAPAP El término "polipéptidos de PAPAP", se usa en la presente para abarcar todas las proteínas y polipéptidos de la presente invención. También formando parte de la invención, son los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención, así como también polipéptidos de fusión que comprenden dichos polipéptidos. La invención abarca proteínas de PAPAP de humanos, incluyendo proteínas de PAPAP aisladas o purificadas que consisten de, que consisten esencialmente de, o que comprenden, la secuencia de SEQ ID No 2. Como se describe en la presente, los presentes inventores han dado evidencia de que la proteína de PAPAP está asociada con la proteína o péptido de g34872, implicados como un factor de susceptibilidad genética para esquizofrenia y trastorno bipolar, así como también trastornos relacionados con el SNC. La invención se refiere al polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID Nos 1 ó 3, o una secuencia complementaria de la misma o un fragmento para la misma. Lá presente invención describe polipéptidos aislados, purificados y recombinantes que comprenden un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No 2. En otras modalidades preferidas, el tramo contiguo de aminoácidos comprende el sitio de una mutación o mutación funcional, incluyendo una deleción, adición, intercambio o truncamiento de los aminoácidos en la secuencia de proteína de PAPAP. La invención abarca también polipéptidos purificados, aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 ó 99% de identidad de aminoácidos, con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 2, o un fragmento de la misma. Los polipéptidos variantes se incluyen en la presente invención, sin importar si tienen su actividad biológica normal. Esto es porque aún cuando una molécula de polipéptido particular no tenga actividad biológica, el experto en la técnica sabría cómo usar el polipéptido, por ejemplo, como una vacuna o para generar anticuerpos. Otros usos de los polipéptidos de la presente invención que no tienen actividad de PAPAP incluyen, entre otros, como marcas de epítopes, en el mapeo de epítopes y como marcadores de peso molecular en geles de SDS-PAGE, o en columnas de filtración en gel de tamiz molecular usando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Como se describe más adelante, los polipéptidos de la presente invención se pueden usar también para enfrentar anticuerpos policlonales y monoclonales, los cuales son útiles en pruebas para detectar la expresión de la proteína de PAPAP, o como agonistas y antagonistas capaces de intensificar o inhibir la función de la proteína de PAPAP. Además, dichos polipéptidos se pueden usar en el sistema de dos híbridos de levadura, para "capturar" proteínas de unión a la proteína de PAPAP, que son también agonistas y antagonistas candidatos de conformidad con la presente invención. En otras modalidades, la presente invención se refiere también a complejos formados por polipéptidos de PAPAP y g34872. De esta manera, la invención comprende un complejo purificado, aislado o producido en forma recombinante de por lo menos un polipéptido de PAPAP, y por lo menos un polipéptido de g34872, en donde dicho polipéptido de PAPAP comprende por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No 2. En una modalidad preferida, dicho polipéptido de g34872 comprende por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a "10 aminoácidos de SEQ ID No 5. Además, como lo sugiere el análisis adicional de la estructura del polipéptido de PAPAP, el polipéptido de PAPAP de la invención puede comprender un sitio de N-glicosilación (ASP) en las posiciones de aminoácido 69-72 (NNTD de aminoácidos). Además, el polipéptido de PAPAP de la invención puede comprender un sitio de fosforilación de proteína cinasa C en las posiciones de aminoácido 26-28 (SCR), 53-55 (SKR), 71-73 (TDK) y 80-82 (SPK). Además, el polipéptido de PAPAP puede comprender un sitio de N- . miristoilación en las posiciones de aminoácido 18-23 (GGDZGQ),: 22-27 (GQIFSC) y 37-42 (GAGQNK). Otro aspecto estructural incluye motivos, de ASP & GLU racemasa en las posiciones de aminoácido 8 a 16 y 9 a 16 (aminoácidos D — PYG). Además de su asociación con esquizofrenia y trastorno bipolar por interacción con g34872, el polipéptido de PAPAP comparte también homología de secuencias con la proteína cinasa II dependiente de calcio/calmodulina (CAMKII) (No. de acceso AS2711561), para la cual se había presentado previamente evidencia de intervención en neurotransmisión. En un aspecto, PAPAP puede actuar como un chaperón molecular; por ejemplo, PAPAP puede intensificar o prevenir la interacción o unión de g34872 y un receptor de g34872. En otro aspecto, PAPAP puede interactuar funcionalmente en una vía de señalización que incluye a g34872. Las proteínas de PAPAP se aislan de preferencia de muestras de tejido humano o de mamífero, o se expresan a partir de genes de humano o de mamífero. Los polipéptidos de PAPAP de la invención, se pueden obtener usando métodos de expresión de rutina conocidos en la técnica. El polinucleótido que codifica para el polipéptido deseado, es ligado en un vector de expresión adecuado para cualquier hospedero conveniente. Se usan sistemas de hospedero procarióticos y eucarióticos en la formación de los polipéptidos recombinantes, y un sumario de algunos de los sistemas más comunes. El polipéptido es aislado entonces de células lisadas, o del medio de cultivo, y purificado al grado necesario para su uso deseado. La purificación se realiza mediante cualquier técnica conocida en la materia, por ejemplo, extracción diferencial, fraccionamiento con sales, cromatografía, centrifugación, y similares. Véase, por ejemplo, Methods in Enzymology para una variedad de métodos para purificar proteínas. Además, se producen fragmentos de proteína más cortos mediante síntesis química. En forma alternativa, las proteínas de la invención se extraen de células o tejidos de animales humanos o no humanos. Métodos para purificar proteínas se conocen en la técnica, e incluyen el uso de detergentes o agentes caotrópicos para desorganizar partículas, seguidos de extracción diferencial y separación de los polipéptidos mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, sedimentación de acuerdo a densidad, y electrofóresis en gel.

Cualquier ADNc de PAPAP, incluyendo SEQ ID No 1 , se puede usar para expresar proteínas y polipéptidos de PAPAP. El ácido nucleico que codifica para la proteina o el polipéptido de PAPAP que será expresado, es enlazado operablemente a un promotor en un vector de expresión usando tecnología de clonación convencional. La inserción de PAPAP en el vector de expresión puede comprender la secuencia de codificación completa para la proteína de PAPAP, o una porción de la misma. Por ejemplo, la inserción derivada de PAPAP puede codificar para un polipéptido que comprende por lo menos 10 aminoácidos consecutivos de la proteína de PAPAP de SEQ ID No 2. El vector de expresión es cualquiera de los sistemas de expresión de mamífero, levadura, insecto o bacteria conocidos en la técnica. Vectores y sistemas de expresión disponibles comercialmente están disponibles de una variedad de proveedores que incluyen Genetics Institute (Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, California), Promega (Madison, Wisconsin) e Invitrogen (San Diego, California). Si se desea, para intensificar la expresión y facilitar el plegamiento adecuado de la proteína, el contexto de codones y el apareamiento de codones de la secuencia son optimizados para el organismo de expresión particular en el cual el vector de expresión es introducido, como es explicado por Hatfield, et al., en la patente de E.U.A. No. 5,082,767, cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. En una modalidad, la secuencia de codificación completa del ADNc de PAPAP a través de la señal de poli A del ADNc, es enlazada operablemente a un promotor en el vector de expresión. En forma alternativa, si el ácido nucleico que codifica para una porción de la proteína de PAPAP carece de una metionina para servir como el sitio de inicio, se puede introducir una metionina de inicio cerca del primer codón del ácido nucleico usando técnicas convencionales. En forma similar, si la inserción del ADNc de PAPAP carece de una señal de poli A, esta secuencia se puede añadir a la construcción, por ejemplo, empalmando la señal de poli A de pSG5 (Stratagene), usando las endonucleasas de restricción Bgll y Salí, e incorporándola en el vector de expresión de mamífero, pXT1 (Stratagene). pXT1 contiene las LTRs y una porción del gen gag del virus de leucemia de murinos Moloney. La posición de las LTRs en la construcción, permite una transfección estable eficiente. El vector incluye el promotor de timidina cinasa del virus de herpes simple, y el gen de neomicina seleccionare. El ácido nucleico que codifica para la proteína de PAPAP, o una porción de la misma, se obtiene mediante PCR de un vector bacteriano que contiene el ADNc de PAPAP de SEQ ID No 2, usando oligonucleótidos iniciadores complementarios al ADNc de PAPAP, o porción del mismo, y que contienen secuencias de endonucleasa de restricción para Pst I incorporadas en el iniciador 5', y Bg1 II en el extremo 5' del iniciador 3' del ADNc correspondiente, asegurándose de que la secuencia que codifica para la proteína de PAPAP o una porción de la misma, sea posicionada adecuadamente con respecto a la señal de poli A. El fragmento purificado obtenido de la reacción de PCR resultante, es digerido con Pstl, rasurado en sus extremos con una exonucleasa, y digerido con Bg1 II, purificado y ligado a pXT1 , conteniendo ahora una señal de poli A, y digerido con Bg1 II. El producto ligado es transfectado en células NIH 3T3 de ratón usando Lipofectin (Life Technologies, Inc., Grand Island, New York) bajo condiciones descritas en la especificación del producto. Los transfectantes positivos se seleccionan después de desarrollar las células transfectadas en 600 µg/ml de G418 (Sigma, St. Louis, Missouri). Los procedimientos anteriores se pueden usar también para expresar una proteína de PAPAP muíante que determina un fenotipo detectable, o una porción del mismo. -..· . La protéína expresada es purificada usando técnicas de purificación convencionales, tales como precipitación con sulfato de amonio o separación cromatográfica basada en tamaño o carga. La proteína codificada por la inserción de ácido nucleico puede ser purificada también usando técnicas de inmunocromatografía estándar. En dichos procedimientos, una solución que contiene a la proteína de PAPAP expresada, o porción de la misma, tal como un extracto de células, es aplicada a una columna que tiene anticuerpos contra la proteína de PAPAP o porción de la misma que está adherida a la matriz de cromatografía. Se deja que la proteína expresada se una a la columna de inmunocromatografía. Después, la columna se lava para remover proteínas unidas en forma no específica. La proteína expresada específicamente unida, es liberada entonces de la columna y recuperada usando técnicas estándar. Para confirmar la expresión de la proteína de PAPAP o una porción de la misma, las proteínas expresadas de células hospederas que contienen un vector de expresión que contiene una inserción que codifica para la proteína de PAPAP o una porción de la misma, se pueden comparar con las proteínas expresadas en células hospederas que contienen al vector de expresión sin una inserción. La presencia de una banda en muestras de células que contienen al vector de expresión con una inserción que falta en muestras de células que contienen al vector de expresión sin una inserción, indica que la proteína de PAPAP, o una porción de la misma, está siendo expresada. En general, la banda tendrá la movilidad esperada para la proteína de PAPAP o porción de la misma. Sin embargo, la :banda puede tener uña movilidad diferente de la esperada como resultado de modificaciones tales como glicosilación, ubiquitinación o digestión enzimática. Se describen a continuación anticuerpos capaces de reconocer específicamente la proteína de PAPAP expresada, o una porción de la misma. Si la producción de anticuerpos no es posible, los ácidos nucleicos que codifican para la proteína de PAPAP, o una porción de la misma, son incorporados en los vectores de expresión diseñados para su uso en esquemas de purificación que usan polipéptidos quiméricos. En dichas estrategias, el ácido nucleico que codifica para la proteína de PAPAP, o una porción de la misma, es insertado en el marco de lectura con el gen que codifica para la otra mitad de la quimera. La otra mitad de la quimera es ß- globina, o una secuencia que codifica para polipéptidos de unión a níquel. Una matriz de cromatografía que tiene anticuerpos para ß-globina o níquel unido a la misma, se usa entonces para purificar la proteína quimérica. Se diseñan sitios de digestión por proteasa entre el gen de ß-globina o el polipéptido de unión a níquel y la proteína de PAPAP, o porción de la misma. De esta manera, los dos polipéptidos de la quimera se separan uno del otro mediante digestión con proteasa. Un vector de expresión útil para generar proteínas quiméricas de ß-globina, es pSG5 (Stratagene), el cual codifica para ß-globina de conejo. El intrón II del gen de ß-globina de conejo facilita el empalme del transcrito expresado, y la señal de poliadenilación incorporada en la construcción incrementa el nivel de expresión. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en la materia de biología molecular. Métodos estándar se publican en textos de métodos, tales como Davis et al., (1986), y muchos de los métodos están disponibles de Stratagene, Life Technologies, Inc., o de Promega. Se puede producir adicionalmente el polipéptido a partir de la construcción, usando sistemas de traducción in vitro tales como el equipo de traducción in vitro Express™ (Stratagene).

Anticuerpos que se unen a polipéptidos de PAPAP de la invención Cualquier polipéptido o proteína intacta de PAPAP se puede usar para generar anticuerpos capaces de unirse específicamente a una proteína de PAPAP expresada, o fragmentos de la misma, según se describe. Una composición de anticuerpos de la invención es capaz de unirse específicamente, o de unirse específicamente, a la proteína de PAPAP de SEQ ID No 2. Para que una composición de anticuerpos se una específicamente a PAPAP, debe demostrar por lo menos una afinidad de unión de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50% ó 100% mayor por una primera variante de longitud total de la proteína de PAPAP, que por una segunda variante de longitud total de la proteína de PAPAP en ELISA, RIA u otra prueba de unión basada en anticuerpos. En una modalidad preferida, la invención se refiere a composiciones de anticuerpo, ya sea policlonales o monoclonales, capaces de unirse selectivamente, o , de unirse selectivamente, a un polipéptido que contiene un epítope que comprende un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 ó 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 2, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No 2. En otras modalidades, la presente invención comprende composiciones de anticuerpo, ya sea policlonales o monoclonales, capaces de unirse selectivamente, o de unirse selectivamente, a un complejo de polipéptidos de PAPAP y g34872, en donde dicho polipéptido de PAPAP comprende por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por io menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No 2. En una modalidad preferida, dicho polipéptido de g34872 comprende por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos de SEQ ID No 5. Un epítope puede comprender tan pocos como 3 aminoácidos en una conformación espacial, lo cual es único para un epítope. En general, un epítope consiste de por lo menos 6 de dichos aminoácidos, y con más. frecuencia por lo menos 8 a 10 de dichos aminoácidos. En una modalidad preferida, los epítopes antigénicos comprenden un número de aminoácidos que es cualquier entero entre 3 y 50. Fragmentos que funcionan como epítopes se pueden producir mediante cualquier medio convencional. Se pueden determinar epítopes mediante un análisis antigénico de Jameson-Wolf, por ejemplo, realizado usando el programa de computadora PROTEAN, usando parámetros de omisión (Windows versión 4.0, DNASTAR, Inc., 1228 South Park Street Madison, Wl). Epítopes antigénicos predichos se muestran a continuación. Se señala que la lista de epítopes inmunógenos describe sólo residuos de aminoácido que comprenden epítopes que se ha predicho tienen el más alto grado de ¡nmunogenicidad mediante un algoritmo particular. Los polipéptidos de la presente invención que no se describen específicamente como inmunógenos, no son considerados como no antigénicos. Esto es porque pueden ser aún antigénicos ¡n vivo, pero solamente no reconocidos como tales por el algoritmo particular usado. En forma alternativa, los polipéptidos son quizá antigénicos in vitro usando métodos tales como una presentación visual ó despliegue de fagos. De esta manera, incluidos en la lista, son los residuos de aminoácido que comprenden sólo epítopes preferidos, no una lista completa. De hecho, todos los fragmentos de los polipéptidos de la presente invención de por lo menos 6 residuos de aminoácido de longitud, se incluyen en la presente invención, siendo útiles como epítopes antigénicos. Además, incluidos en la lista son sólo los residuos críticos de los epítopes determinados mediante el análisis de Jameson-Wolf. De esta manera, se pueden añadir otros residuos flanqueantes en los extremos N-terminal, C-¦ terminal o N- y C-terminales a las secuencias incluidas en la lista, para generar una porción que posea epítopes de por lo menos 6 residuos de longitud. Se pueden determinar residuos de aminoácido que comprendan otros epítopes inmunógenos mediante algoritmos similares al análisis de Jameson-Wolf, o mediante verificación ¡n vivo para una respuesta antigénica, usando los métodos descritos en la presente o los conocidos en la técnica. Los fragmentos de la presente invención que poseen epítopes, comprenden de preferencia de 6 a 50 aminoácidos (es decir, cualquier entero entre 6 y 50, inclusive) de un polipéptido de la presente invención. Asimismo, incluidos en la presente invención, son los fragmentos antigénicos entre los enteros de 6 y la secuencia de PAPAP de longitud total.

Epítopes inmunógenos de PAPAP preferidos Gly 8 para Lys-11 Asp-31 para Asn-33 Gln-40 para Leu-47 Gly-51 para Lys-54 Glu-59 para Arg-62; y Ser-80 para Thr-83 La invención se refiere también a un anticuerpo purificado o aislado capaz de unirse específicamente a una proteína de PAPAP mutada, o a un fragmento o variante de la misma, que comprende un epítope de la proteína de PAPAP mutada. En otra modalidad preferida, la presente invención se refiere a un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido que comprende por lo menos 10 aminoácidos consecutivos de una proteína de PAPAP, y que incluye por lo menos uno de los aminoácidos que puede ser codificado por las mutaciones que causan la característica. ' Animales, o mamíferos no humanos, ya sea de tipo silvestre o transgénicos, que expresen una especie diferente de PAPAP .de la que con la cual se desea la unión del anticuerpo, y animales que no expresen PAPAP (es decir, un animal con expresión bloqueada en PAPAP como se describe en la presente), son particularmente útiles para preparar anticuerpos. Los animales con expresión bloqueada en PAPAP, reconocerán todas o la mayor parte de las regiones expuestas de una proteína de PAPAP como antígenos extraños, y producirán por lo tanto anticuerpos con una disposición más amplia de epítopes de PAPAP. Además, polipéptidos más pequeños con sólo 10 a 30 aminoácidos, pueden ser útiles para obtener unión específica a cualquiera de las proteínas de PAPAP. Además, el sistema inmune humoral de animales que producen una especie de PAPAP que se asemeja a la secuencia antigénica, reconocerá de preferencia las diferencias entre la especie de PAPAP nativa del animal y la secuencia de antígeno, y producirán anticuerpos para estos sitios únicos en la secuencia de antígeno. Dicha técnica será particularmente útil para obtener anticuerpos que se unen específicamente a cualquiera de las proteínas de PAPAP. Preparaciones de anticuerpo obtenidas de acuerdo a cualquier protocolo, son útiles en inmunoensayos cuantitativos que determinan concentraciones de sustancias que poseen antígenos en muestras biológicas; se usan también semicuantitativamente o cuantitativamente para identificar la presencia del antígeno en una muestra biológica. Los anticuerpos se pueden usar también en composiciones terapéuticas para destruir células que expresan la proteína, o para reducir los niveles de la proteína en el cuerpo. Los anticuerpos dé la invención se pueden marcar mediante cualquiera de las marcas radiactivas, fluorescentes o enzimáticas conocidas en la técnica. - Por consiguiente, la invención está dirigida también a un método para detectar específicamente la presencia dé un polipéptido de PAPAP de conformidad con la invención en una muestra biológica, dicho método comprendiendo los siguientes pasos: a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo policlonal o monoclonal que se une específicamente a un polipéptido de PAPAP que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 2, o a un fragmento peptídico o variante del mismo; y b) detectar el complejo de antígeno-anticuerpo formado. La invención se refiere también a un equipo de diagnóstico para detectar la presencia in vitro de un polipéptido de PAPAP de conformidad con la presente invención en una muestra biológica, en donde dicho equipo comprende: a) un anticuerpo policlonal o monoclonal que se une específicamente a un polipéptido de PAPAP que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 2, o a un fragmento peptídico o variante del mismo, marcado opcionalmente; b) un reactivo que permite la detección de los complejos de antígeno-anticuerpo formados, dicho reactivo llevando opcionalmente una marca, o siendo capaz de ser reconocido por sí mismo por un reactivo marcado, más particularmente en el caso cuando el anticuerpo monoclonal ;o policlonal mencionado anteriormente no es marcado por sí mismo. De esta manera, la presente invención se refiere a anticuerpos y receptores de antígeno de células T (TCR) que se unen específicamente a los polipéptidos, y más específicamente, los epítopes de los polipéptidos de la presente invención incluyendo, pero no limitados a, IgG (incluyendo lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4), IgA (incluyendo lgA1 e lgA2), IgD, IgE o IgM e IgY. En una modalidad preferida, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno humanos de la presente invención e incluyen, pero no están limitados a, Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2, Fd, Fvs de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, Fvs unidos por enlaces disulfuro (sdFv), y fragmentos que comprenden un dominio de VL o VH. Los anticuerpos pueden ser de cualquier origen animal, incluyendo aves y mamíferos. De preferencia, los anticuerpos son de humano, murino, conejo, cabra, conejillo de Indias, camello, caballo o pollo. Los fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos de cadena sencilla, pueden comprender las regiones variables solas, o en combinación, con el total o parte de los siguientes: región de cremallera y dominios CH1, CH2 y CH3. Incluidas también en la invención, son las combinaciones de regiones variables y región de cremallera, y dominios CH1, CH2 y CH3. La presente invención incluye además anticuerpos quiméricos, humanizados y anticuerpos monoclonales y policlonales humanos, los cuales se unen específicamente a los polipéptidos de la. presente invención. La presente invención incluye además anticuerpos que son antiidiotípicos para los anticuerpos de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos, o pueden tener mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopes de un polipéptido de la presente invención, o pueden ser específicos para un polipéptido de la presente invención, así como también para composiciones heterólogas, tales como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Véase, por ejemplo, los documentos WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, A. et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69; y las patentes de E.U.A. 5,573,920, 4,474,893, 5,601 ,819, 4,714,681 y 4,925,648; Kostelny, S. A. et al. (1992) J. Immunol. 148:1547-1553. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser descritos o especificados en términos de los epítopes o porciones que poseen epítopes de un polipéptido de la presente Invención, los cuales son reconocidos o unidos específicamente por el anticuerpo. En el caso de las proteínas secretadas de la presente invención, los anticuerpos se pueden unir específicamente a una proteína de longitud total codificada por un ácido nucleico de la invención, una proteína madura (es decir, la proteína generada por digestión del polipéptido de señal) codificada por un ácido nucleico de la presente invención, un péptido de señal codificado por un ácido nucleico de la presente invención, o cualquier otro polipéptido de la presente invención. Por lo tanto, los epítopes o las porciones de polipéptido que poseen epítopes, se pueden especificar como se describe en la presente, por ejemplo, por posiciones N-terminal -y C-terminal, por tamaño en residuos de aminoácido contiguos, o de otra manera como se describe en la presente (incluyendo el listado de secuencias). Los anticuerpos que se unen específicamente a cualquier epítope o polipéptido de la presente invención, se pueden excluir también como especies individuales. Por lo tanto, la presente invención incluye anticuerpos que se unen específicamente a polipéptidos especificados de la presente invención, y permite la exclusión de los mismos. Los anticuerpos de la presente invención se pueden describir o especificar también en términos de su reactividad cruzada. Se incluyen anticuerpos que no se unen específicamente a cualquier otro análogo, ortólogo u homólogo de los polipéptidos de la presente invención. Los anticuerpos que no se unen a polipéptidos con menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55% y menos de 50% de identidad (calculada usando métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente) con un polipéptido de la presente invención, se incluyen también en la presente invención. También incluidos en la presente invención, son los anticuerpos que sólo unen polipéptidos codificados por polinucleótidos, los cuales hibridan con un polinucleótido de la presente invención bajo condiciones de hibridación severa (como se describe en la presente). Los anticuerpos de la presente invención se pueden describir o especificar también en términos de su afinidad de unión. Las afinidades de unión preferidas, incluyen aquellas con una constante de disociación, o Kd, menor de 5X10"6M, 10"6M, 5X10-7M, 10^7M, 5X10"8M, 10-8M, 5X10-9M, 10_9?, .5X1 (T 10M, 10-10M, 5X10"11M, 10-11M, 5X10"12M, 10"12M, 5X10'13M, 10'13M, 5X10" 4M, 10"14M, 5X10'15M y 10'15M. Los anticuerpos de la presente invención tienen usos que incluyen, pero no están limitados a, métodos conocidos en la técnica para purificar, detectar y dirigir los polipéptidos de la presente invención, incluyendo métodos terapéuticos y de diagnóstico in vitro e in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos tienen uso en inmunoensayos para medir cualitativamente y cuantitativamente niveles de los polipéptidos de la presente invención en muestras biológicas. Véase, por ejemplo, Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL (Coid Spring Harbor Laboratory Press, 2a. ed. 1988) (cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia). Los anticuerpos de la presente invención se pueden usar solos o en combinación con otras composiciones. Los anticuerpos pueden ser además fusionados en forma recombinante con un poiipéptido heterólogo en el N o C terminal, o conjugados químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con polipéptidos u otras composiciones. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden ser fusionados en forma recombinante o conjugados con moléculas útiles como marcas en pruebas de detección y moléculas efectoras tales como polipéptidos heterólogos, fármacos o toxinas. Véase, por ejemplo, los documentos WO 92/08495; WO 91/14438; y WO 89/12624; la patente de E.U.A. 5,314,995; y el documento EP 0 396 387. Los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, un poiipéptido de la presente invención o un fragmento antigénico del mismo, se puede administrar a un animal para inducir la producción de sueros que contengan anticuerpos policlonales. El término "anticuerpo monoclonal" no se limita a anticuerpos producidos mediante la tecnología de hibridomas. El término "anticuerpo" se refiere a un poiipéptido o grupo de polipéptidos que están formados de por lo menos un dominio de unión, en donde un dominio de unión se forma a partir del plegamiento de dominios variables de una molécula de anticuerpo, para formar espacios de unión tridimensionales con una forma de superficie interna y distribución de cargas complementaria a las características de un determinante antigénico de un antígeno, lo cual permite una reacción inmunológica con el antígeno. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un clon individual, incluyendo clon eucariótico, procariótico o de fago, y no el método por el cual se produce. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales usando una amplia variedad de técnicas conocidas en la materia, incluyendo el uso.de tecnología de hibridomas, tecnología recombinante y tecnología de presentación visual de fagos. Las técnicas de hibridomas incluyen las conocidas en la materia (véase, por ejemplo, Harlow et al. (1998); Hammerling, et al. (1981 )) (dichas referencias siendo incorporadas en su totalidad en la presente como referencia). Se pueden producir fragmentos Fab y F(ab')2, por ejemplo, a partir de anticuerpos producidos por hibridomas, mediante digestión proteolítica y mediante en uso de enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). En forma alternativa, los anticuerpos de la presente invención se pueden producir mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante o mediante química de síntesis, usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención se pueden preparar usando varios métodos de presentación visual de fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación visual de fagos, los dominios funcionales del anticuerpo son exhibidos sobre la superficie de una partícula de fago, la cual lleva secuencias de polinucleótidos que los codifican. Los fagos con una propiedad de unión deseada, se seleccionan de un repertorio o genoteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, de humano o murino) seleccionando directamente con antígenos, típicamente antígenos unidos o capturados con una superficie sólida o perla. Los fagos usados en estos métodos, son típicamente fagos filamentosos que incluyen fd y M13 con Fab, Fv o dominios de anticuerpo Fv estabilizados con enlaces disulfuro fusionados en forma recombinante al gen III del fago o la proteína del gen VIII del fago. Ejemplos de métodos de presentación visual de fagos que se pueden usar para obtener - los anticuerpos de la presente invención, incluyen los descritos en Brinkman U et al. (1995); Ames, R. S. et al. (1995); Kettleborough, C. A. et al. (1994); Persic, L. et al. (1997); Burton, D. R. et al. (1994); los documentos PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401 ; y las patentes de E.U.A. 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821 ,047, 5,571 ,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727 y 5,733,743 (dichas referencias siendo incorporadas en su totalidad en la presente como referencia. Como se describió en las referencias anteriores, después de la selección del fago, las regiones de codificación de anticuerpos del fago pueden ser aisladas y usadas para generar anticuerpos intactos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresadas en cualquier hospedero deseado que incluye células de mamífero, células de insecto, células de plantas, levaduras y bacterias. Por ejemplo, se pueden usar también técnicas para producir en forma recombinante fragmentos Fab, Fab', F(ab)2 y F(ab')2 usando métodos conocidos en la materia, tales como los que se describen en el documento WO 92/22324; Mullinax, R. L. et al. (1992); y Sawai, H. et al ( 995); y Better, M. et al. (1988) (dichas referencia siendo incorporadas en su totalidad en la presente como referencia). Ejemplos de técnicas que se pueden usar para producir Fvs de cadena sencilla y anticuerpos, incluyen los que se describen en las patentes de E.U.A. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al. (1991); Shu, L. et al.. (1993); y Skerra, A. et al. (1988). Para algunos usos, incluyendo uso in vivo de ¦ anticuerpos en humanos, y pruebas de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, Morrison (1985); Oi et al., (1986); Gillies, S. D. et al. (1989); Gillies S. D. et al. (1989); y patente de E.U.A. 5,807,715. Los anticuerpos pueden ser humanizados usando una variedad de técnicas que incluyen injerto de CDR (véase documentos EP 0 239 400; WO 91/09967; patente de E.U.A. 5,530,101 ; y 5,585,089), recubrimiento o recubrimiento de superficie (véase documentos EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E. A., (1991 ); Studnicka G. M. et al. (1994); Roguska M. A. et al. (1994), y entremezclado de cadenas (véase patente de E.U.A. 5,565,332). Se pueden obtener anticuerpos humanos mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo los métodos de presentación visual de fagos descritos anteriormente. Véase también las patentes de E.U.A. 4,444,887, 4,716,111 , 5,545,806 y 5,814,348; véase documentos WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 96/34096; WO 96/33735; y WO 91/10741 (dichas referencias siendo incorporadas en su totalidad en la presente como referencia). Incluidos también en la presente invención, son anticuerpos fusionados en forma recombinante o conjugados químicamente (incluyendo conjugaciones covalentes y no covalentes) con un polipéptido de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser específicos para antígenos diferentes de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos para dirigir los polipéptidos de la presente invención hacia tipos particulares de células, in vitro e in vivo, fusionando o conjugando :los polipéptidos de la presente invención con anticuerpos específicos para receptores particulares de la superficie celular. Se pueden usar, también anticuerpos fusionados o conjugados con los polipéptidos de la presente invención en inmunoensayos in vitro y métodos de purificación, usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harbor et al. citado anteriormente, y los documentos WO 93/21232 y EP 0 439 095; Naramura, M. et al. (1994); patente de E.U.A. 5,474,981 ; Gillies, S. O. et al. (1992); Fell, H. P. et al. (1991 ) (dichas referencias siendo incorporadas en su totalidad en la presente como referencia). La presente invención incluye además composiciones que comprenden los polipéptidos de la presente invención fusionados o conjugados con dominios de anticuerpo diferentes de las regiones variables. Por ejemplo, los polipéptidos de la presente invención pueden ser fusionados o conjugados con una región Fe de anticuerpo, o porción de la misma. La porción de anticuerpo fusionada a un polipéptido de la presente invención puede comprender la región de cremallera, dominio CH1 , dominio CH2 y dominio CH3, o cualquier combinación de dominios completos o porciones de los mismos. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser fusionados o conjugados con las porciones de anticuerpo anteriores, para incrementar la vida media In vivo de los polipéptidos, o para su uso en inmunoensayos usando métodos conocidos en la técnica. Los polipéptidos pueden ser también fusionados o conjugados con las porciones de anticuerpo anteriores, para formar multímeros. Por ejemplo, las porciones Fe fusionadas a los polipéptidos de la presente invención, pueden formar dímeros a través de enlaces disulfuro entre las porciones Fe. Se pueden obtener formas multiméricas superiores fusionando los polipéptidos con porciones de IgA e IgM. Métodos para fusionar o conjugar los polipéptidos de la presente invención a porciones de anticuerpo, se conocen en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. 5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851 , 5,112,946; los documentos EP 0 307 434, EP 0 367 166; WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi, A. et al. (1991); Zheng, X. X. et al. (1995); y Vil, H. et al. (1992) (dichas referencias siendo incorporadas en su totalidad en la presente como referencia).

La invención se refiere además a anticuerpos que actúan como agonistas o antagonistas de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos que interrumpen las interacciones receptor/ligando con los polipéptidos de la invención parcialmente o totalmente. Incluidos son los anticuerpos específicos de receptores y los anticuerpos específicos de ligandos. Incluidos son los anticuerpos específicos de receptores, los cuales no evitan la unión del ligando, pero evitan la activación del receptor. La activación (es decir, señalización) del receptor se puede determinar mediante técnicas descritas en-la presente o de otra manera conocidas en la técnica. Incluidos también son los anticuerpos específicos de receptores que evitan la unión del ligando y la activación del receptor. En forma similar, incluidos son los anticuerpos neutralizantes que unen el ligando, y evitan la unión del ligando al receptor, así como también anticuerpos que unen el ligando, evitando de esta manera la activación del receptor, pero no evitan que el ligando se una al receptor. Incluidos además son los anticuerpos que activan al receptor. Estos anticuerpos pueden actuar como agonistas para todas o menos que todas las actividades biológicas afectadas por la activación del receptor mediada por el ligando. Los anticuerpos pueden ser especificados como agonistas o antagonistas para actividades biológicas que comprenden actividades específicas descritas en la presente. Los agonistas de anticuerpo anteriores se pueden obtener usando métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, el documento WO 96/40281 ; patente de E.U.A. 5,811 ,097; Deng, B. et ai. (1998); Chen, Z. et al. (1998); Harrop, J. A. et al. (1998); Zhu, Z. et al. (1998); Yoon, D. Y. et al. (1998); Prat, M. et al. (1998); Pitard, V. et al. (1997); Liautard, J. et al. (1997); Calrson, N. G. et al. (1997); Taryman, R. E. et al. (1995); Muller, Y. A. et al. (1998); y Bartunek, P. et al. (1996) (dichas referencias siendo incorporadas en su totalidad en la presente como referencia). Como se describió anteriormente, los anticuerpos de los polipéptidos de la invención se puede usar, a su vez, para generar anticuerpos antiidiotípicos que "simulan" los polipéptidos de la invención, usando técnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Greenspan y Bona (1989) y Nissinoff (1991). Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos que se unen á, e inhiben competitivamente, la multimerización del pollpéptido o la unión de un polipéptido de la invención al ligando, para generar antiidiotipos que "simulan" la multimerización del polipéptido o el dominio de unión y, como consecuencia, se unen, y neutralizan, al polipéptido o su ligando. Dichos anticuerpos antiidiotípicos de neutralización se pueden usar para unir un polipéptido de la invención o para unir sus ligandos/receptores, y bloquear de esta manera su actividad biológica.

Vectores recombinantes El término "vector" se usa en la presente para designar una molécula de ADN o ARN circular o lineal, la cual es de cadena sencilla o de cadena doble, y la cual comprende por lo menos un polinucleótido de interés que se busca sea transferido en una célula hospedera o en un organismo hospedero unicelular o multicelular. La presente invención abarca una familia de vectores recombinantes que comprenden un polinucleótido regulador derivado de la secuencia genómica de PAPAP, y/o un polinucleótido de codificación de la secuencia genómica de PAPAP o la secuencia de ADNc. En general, un vector recombinante de la invención puede comprender cualquiera de los polinucleótidos descritos en la presente, incluyendo secuencias reguladoras, secuencias de codificación y construcciones de polinucleótidos, así como también cualquier iniciador o sonda de PAPAP, como se definió anteriormente. Más particularmente, los vectores recombinantes de la presente invención pueden comprender cualquiera de los polinucleótidos descritos en la sección de "secuencias genómicas del gen PAPAP", la sección de "secuencias de ADNc de PAPAP", la sección de "regiones de codificación", la sección de "construcciones de polinucleótidos" y la sección de "sondas e iniciadores de oligonucleótidos". En una primera modalidad preferida, un vector recombinante de la invención se usa para amplificar el polinucleótido insertado o derivado de una secuencia genómica de PAPAP de SEQ ID No 3, o un ADNc de SEQ ID No 1, o un ADNc de PAPAP, por ejemplo, el ADNc de SEQ ID No 1 en una célula hospedera adecuada, este polinucleótido siendo amplificado cada vez que el vector recombinante se replica. Una segunda modalidad preferida de los vectores recombinantes de conformidad con la invención, comprende vectores de expresión que comprenden un polinucleótido regulador o un ácido nucleico de codificación de la invención, o ambos. En de ciertas modalidades, se usan vectores de expresión para expresar el polipéptido de PAPAP, el cual entonces puede ser purificado y, por ejemplo, usado en pruebas de selección de ligandos o como un inmunógeno para enfrentar anticuerpos específicos dirigidos contra la proteína de PAPAP. En otras modalidades, los vectores de expresión se usan para construir animales transgénicos, y también para terapia génica.. La expresión requiere que las señales adecuadas sean provistas en los vectores, dichas señales incluyendo varios elementos reguladores tales como intensificadores/promotores de fuentes virales y de mamífero que dirigen la expresión de los genes de interés en las células hospederas. Marcadores de selección de fármaco dominantes para establecer clones de células estables y permanentes que expresan los productos, se incluyen generalmente en: los vectores de expresión de la invención, así como también los elementos que enlazan la expresión de los marcadores de selección de fármaco con la expresión del polipéptido. Más particularmente, la presente invención se refiere a vectores de expresión que incluyen ácidos nucleicos que codifican para una proteína de PAPAP, de preferencia la proteína de PAPAP de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 2, o variantes o fragmentos de la misma. La invención pertenece también a un vector de expresión recombinante útil para la expresión de la secuencia de codificación de PAPAP, en donde dicho vector comprende un ácido nucleico de SEQ ID No 1. Algunos de los elementos que se pueden encontrar en los vectores de la presente invención, se describen en más detalle en las siguientes secciones. 1. Características generales de los vectores de expresión de la invención Un vector recombinante de conformidad con la invención comprende, pero no está limitado a, un YAC (cromosoma artificial de levadura), un BAC (cromosoma artificial de bacteria), un fago; un fagémido, un. cósmido, un plásmido o incluso una molécula de ADN lineal que puede comprender un ADN cromosómico, no cromosómico, semisintético y sintético; Dicho vector recombinante puede comprender una unidad de transcripción que comprende un ensamble de: (1) un elemento o elementos genéticos que tienen una función reguladora en la expresión génica, por ejemplo, promotores o intensificadores. Los intensificadores son elementos de ADN que actúan en la posición cis, usualmente de alrededor de 10 a 300 pares de bases de longitud que actúan sobre el promotor para incrementar la transcripción; (2) una secuencia estructural o de codificación que es transcrita en ARN mensajero, y traducida finalmente en un polipéptido, dicha secuencia estructural o de codificación siendo enlazada operablemente a los elementos reguladores descritos en el inciso (1 ); y (3) secuencias adecuadas de inicio y término de la transcripción. Las unidades estructurales destinadas para su uso en sistemas de expresión de levadura o eucarióticos, incluyen de preferencia una secuencia guía que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula hospedera. En forma alternativa, cuando una proteína recombinante es expresada sin una secuencia guía o de transporte, puede incluir un residuo N-terminal. Este residuo puede ser escindido o no subsecuentemente a partir de la proteína recombinante expresada para proveer un producto final. En general, los vectores de expresión recombinantes incluirán orígenes de replicación, marcadores seleccionares que permiten la transformación de la célula hospedera, y un promotor derivado de . un gen altamente expresado que dirige la transcripción de. una secuencia estructural hacia el extremo 3'. La secuencia estructural heteróloga es ensamblada en fase adecuada con secuencias de inicio y término de la traducción, y de preferencia una secuencia guía capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplásmico o el medio extracelular. En una modalidad específica, en donde el vector está adaptado para transfectar y expresar secuencias deseadas en células hospederas de mamífero, los vectores preferidos comprenderán un origen de replicación en el hospedero deseado, un promotor e intensificador adecuados, y también algún sitio necesario de unión del ribosoma, señal de poliadenilación, sitios de empalme donadores y aceptares, secuencias de término de la transcripción, y secuencias no transcritas flanqueantes 5'. Secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40, por ejemplo, el origen de SV40, promotor temprano, intensificador y señales de poliadenilación y de empalme, se pueden usar para proveer los elementos genéticos no transcritos requeridos. La expresión in vivo de un polipéptido de PAPAP de SEQ ID No 2, o fragmentos o variantes del mismo, se puede usar para corregir un defecto genético relacionado con la expresión del gen nativo en un organismo hospedero, o para la producción de una proteína de PAPAP biológicamente activa. Por consiguiente, la presente invención comprende también vectores de expresión recombinantes diseñados principalmente para la producción in vivo del polipéptido de PAPAP de SEQ ID No 2, o fragmentos o variantes del mismo, mediante la introducción del material genético adecuado en el organismo del paciente que se va a tratar. Este material genético puede ser introducido in vitro en una célula que ha sido extraída previamente del organismo, la célula modificada siendo reintroducida subsecuentemente en dicho organismo, directamente in vivo en el tejido adecuado. 2. Elementos reguladores Promotores Las regiones de promotor adecuadas usadas en los vectores de expresión de conformidad con la presente invención, se seleccionan tomando en cuenta la célula hospedera en la cual el gen heterólogo será expresado. Se piensa que el promotor particular usado para controlar la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés no es importante, en tanto sea capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico en la célula dirigida. De esta manera, cuando una célula humana es dirigida, se prefiere posicionar el ácido nucleico que codifica para la región adyacente a, y bajo el control de, un promotor que sea capaz de ser expresado en una célula humana tal como, por ejemplo, un promotor viral o de humano. Un promotor adecuado puede ser heterólogo con respecto al ácido nucleico para el cual controla la expresión o, alternativamente, puede ser endógeno al polinucleótido nativo que contiene la secuencia de codificación que será expresada. Además, el promotor es por lo general heterólogo con respecto a las secuencias de vector recombinantes dentro de las cuales la secuencia de codificación/promotor de construcción ha sido . insertada. Se pueden seleccionar regiones de promotor de cualquier gen deseado usando, por ejemplo, vectores CAT (cloranfenicol transferasa), y más preferiblemente vectores pKK232-8 y pCM7. Promotores bacterianos preferidos son Lacl, LacZ, los promotores de ARN polimerasa de los bacteriófagos T3 o 17, los promotores gpt, lambda PR, PL y trp (véase documento EP 0036776), el promotor de polihedrina, o el promotor de proteína p10 de baculovirus (equipo Novagen) (Smith et al., 1983; O'Reilly et al., 1992), el promotor lambda PR, o también el promotor trc.

Los promotores eucarióticos incluyen promotor temprano inmediato del CMV, promotor de timidina cinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, LTRs de retrovirus, y metalotloneína-L de ratón. La selección de un vector y promotor convenientes, está bien dentro de la aptitud de los expertos en la técnica. La elección de un promotor está bien dentro de la aptitud de los expertos en la técnica de ingeniería genética. Por ejemplo, se puede consultar la obra de Sambrook et al. ( 989), o también los procedimientos descritos por Fulleret al. (1996).

Otros elementos reguladores Cuando se usa una inserción ADN, se deseará típicamente incluir una señal de poliadenilación para efectuar la poliadenilación adecuada del transcrito del gen. Se piensa que la naturaleza de la señal de poliadenilación no es crucial para la práctica exitosa de la invención, y se puede usar cualquiera de dichas secuencias, tales como la hormona . de crecimiento humano y las señales de poliadenilación de SV40. También contemplado como un elemento del cassette de expresión, es un terminador. Estos elementos pueden servir para intensificar los niveles de los mensajes, y para reducir al máximo la lectura a través del cassette en otras secuencias. 3. Marcadores seleccionares Dichos marcadores conferirían un cambio identificable célula, permitiendo la fácil identificación de células que contienen la construcción de expresión. Los genes del marcador seleccionables para selección de células hospederas transformadas, son de preferencia de dihidrofoliato reductasa o resistencia a neomicina para cultivo de células eucarióticas, TRP1 para S. cerevisiae o para resistencia a tetraciclina, rifampicina o ampicilina en E. coli, o leván sacarasa para micobacterias, este último marcador siendo un marcador de selección negativa. 4. Vectores preferidos Vectores bacterianos Como un ejemplo representativo pero no limitativo, los vectores de expresión útiles para su uso en bacterias, pueden comprender un marcador seleccionare y un origen de replicación bacteriano derivado de plásmidos disponibles comercialmente que comprenden elementos genéticos -de pBR322 (No. de ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, PKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison. WI, E.U.A.). Grandes números de otros vectores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica y están disponibles comercialmente, tales como los siguientes vectores bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 , pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); y pQE-30 (QIAexpress).

Vectores de bacteriófagos El vector del bacteriófago P1 puede contener grandes inserciones que varían de alrededor de 80 a aproximadamente 100 kb. La construcción de vectores del bacteriófago P1 tales como p158 o p158/neo8, es descrita notablemente por Sternberg (1992, 1994). Se pueden diseñar clones de P1 recombinantes que comprendan secuencias de nucleótidos de PAPAP para insertar grandes polinucleótidos de más de 40 kb (Linton et al., 1993). Para generar ADN de P1 para experimentos transgénicos, un protocolo preferido es el protocolo descrito por McCormick et al. ( 994). En resumen, E¡ coli (de preferencia la cepa NS3529) que aloja el plásmido de P1 , se desarrolla durante la noche en un medio de caldo adecuado que contenga 25 µg/ml de kanamicina. El ADN de P1 se prepara de E. coli mediante lisis -alcalina usando el equipo Plasmid Maxi Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA, E.U.A.), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN de P1 es purificado a partir del lisado bacteriano en dos columnas Qiagen-tip 500, usando los reguladores de pH de lavado y de elución contenidos en el equipo. Se lleva a cabo entonces una extracción con fenol/cloroformo antes de la precipitación del ADN con etanol a 70%. Después de solubilizar el ADN en regulador de pH TE (Tris-HCI a 10 mM, pH 7.4, EDTA a 1 mM), la concentración del ADN se evalúa mediante espectrofotometría.

Cuando el objetivo es expresar un clon de P1 que comprenda secuencias de nucleótidos de PAPAP en un animal transgénico, típicamente en ratones transgénicos, es deseable remover secuencias de vector del fragmento de ADN de P1 , por ejemplo, escindiendo el ADN de P1 en sitios de corte raros, dentro del polienlazador de P1 (Sf/'l, Not\ o Sa/I). La inserción de P1 es purificada entonces a partir de secuencias de vector en un gel de agarosa de campo pulsado, usando métodos similares a los reportados originalmente para el aislamiento de ADN de YACs (Schedl et al., 1993a; Peterson et al., 1993). En esta etapa, el ADN de la inserción .purificado resultante puede ser concentrado, si es necesario, en una unidad de filtración Ultrafree-MC Millipore (Millipore, Bedford, MA, E.U.A. - límite de peso ¦¦ molecular de 30,000), y dializado entonces ante regulador de pH de microinyección (Tris-HC1 a 10 mM, pH 7.4; EDTA a 250 µ??) que contenga NaCI a 100 mM, espermina a 30 µ? y espermidina a 70 µ? sobre una " membrana de microdiálisis (tipo VS, 0.025 µ? de Millipore). La integridad de la inserción de ADN de P1 purificada se evalúa mediante electrofóresis en gel de campo pulsado de agarosa a 1 % (Sea Kem GTG; FMC Bio-products), y tinción con bromuro de etidio.

Vectores de baculovirus Un vector adecuado para la expresión del polipéptido de PAPAP de SEQ ID No 2, o fragmentos o variantes del mismo, es un vector de baculovirus que pueda ser propagado en células de insecto y en líneas de células de insecto. Un sistema de vector de hospedero adecuado específico, es el vector de transferencia de baculovirus PVL 392/1393 (Pharmingen) que se usa para transfectar la línea de células SF9 (No. de ATCC CRL 1711 ) que se deriva de Spodoptera frugiperda. Otros vectores adecuados para la expresión del polipéptido PAPAP de SEQ ID No 2, o fragmentos o variantes del mismo, en un sistema de expresión de baculovirus, incluyen los descritos por Chai et al. (1993), Vlasak et al. (1983) y Lenhard et al. (1996).

Vectores virales En una modalidad específica, el vector se deriva de un adenovirus. Vectores de adenovirus preferidos de conformidad con la invención, son los descritos por Feldman y steg (1996) u Ohno et al. (1994). Otro adenovirus recombinante preferido de conformidad con esta modalidad específica de la presente invención, es el adenovirus humano tipo 2 ó 5 (Ad 2 o Ad 5), o un adenovirus de origen animal (véase la solicitud de patente francesa No. FR-93.05954). Se entiende en general que los vectores de retrovirus y los vectores de virus adenoasociados, son los sistemas de liberación de genes recombinantes de elección para la transferencia de polinucleótidos exógenos in vivo, en particular a mamíferos, incluyendo humanos. Estos vectores proveen liberación eficiente de genes en células, y los ácidos nucleicos transferidos son integrados establemente en el ADN cromosómico del hospedero. Retrovirus particularmente preferidos para la preparación o construcción de vehículos de liberación de genes in vitro o in vitro retrovirales de la presente invención, incluyen retrovirus seleccionados del grupo que consiste de virus inductor de focos de células de visón, virus del sarcoma de murinos, virus de reticuloendoteliosis y virus del sarcoma de Rous. Virus de leucemia de murinos particularmente preferidos, incluyen los virus 4070A, 1504A, de Abelson (No. de ATCC VR-999), de Friend (No. de ATCC VR-245), de Gross (No. de ATCC VR-590), de Rauscher (No. de ATCC VR-998) y el virus de leucemia de murinos Moloney (No. de ATCC VR-190; véase solicitud del PCT No WO 94/24298). Virus, del sarcoma de Rous particularmente preferidos, incluyen virus de Bryan de alto título (Nos. de ATCC VR-334, VR-657, VR-726, VR-659 y VR-728). Otros vectores retrovirales preferidos, son los descritos en Roth et al. (1996), solicitud del PCT No WO 93/25234, solicitud del PCT No WO 94/06920, Roux et al., 1989, Julan et al., 1992 y Neda et al. 1991. Otro sistema de vector viral que es contemplado por la invención, comprende los virus adenoasociados (AAV). Los virus adenoasociados son virus defectuosos de ocurrencia natural que requieren de otro virus, tales como un adenovirus o un virus de herpes, como virus auxiliar para replicación eficiente y un ciclo de vida productivo (Muzyczka et al., 1992). Son también uno de los pocos virus que pueden integrar su ADN en células que no están en división, y exhiben una alta frecuencia de integración estable (Flotte et al., 1992; Samulski et al., 1989; McLaughlin et al., 1989). Una característica ventajosa de los AAV se deriva de su eficacia reducida para transducir células primarias respecto a células transformadas.

Vectores de BAC El sistema de clonación del cromosoma artificial bacteriano (BAC) (Shizuya et al., 1992), se ha desarrollado para mantener establemente grandes fragmentos de ADN genómico (100-300 kb) en E. coli. Un vector de BAC preferido, comprende el vector pBeloBAC11 que ha sido descrito por Kim et al. (1996). Se preparan genotecas de BAC con este vector usando ADN genómico seleccionado por tamaño, que ha sido digerido parcialmente usando enzimas que permiten la ligación en los sitios Bam Hl o H¡nd\\\ en el. vector. . Flanqueando estos sitios de clonación, están sitios de inicio de la transcripción de ARN polimerasa de T7 y SP6 que se pueden usar para generar sondas de extremo mediante transcripción de ARN o métodos de PCR. Después de la construcción de una genoteca de BAC en E. coli, el ADN de BAC es purificado de la célula hospedera como un círculo superenrollado. La conversión de estas moléculas circulares en una forma lineal, precede a la determinación del tamaño y la introducción de los BACs en células receptoras. El sitio de clonación es flanqueado por dos sitios Not\, que permiten que segmentos clonados sean separados del vector mediante digestión con Not\. En forma alternativa, la inserción de ADN contenida en el vector pBeloBAC11 puede ser linealizada mediante tratamiento del vector de BAC con la enzima lambda terminasa disponible comercialmente que lleva a la digestión en el sitio cosN único, pero este método de digestión da como resultado un clon de BAC de longitud total que contiene la inserción de ADN y las secuencias de BAC. 5. Liberación de los vectores recombinantes Para efectuar la expresión de los polinucleotidos y las construcciones de polinucleotidos de la invención, estas construcciones deben ser liberadas en una célula. Esta liberación se puede lograr in vitro, como en procedimientos de laboratorio para transformar líneas de células, o in vivo o ex vivo, como en el tratamiento de ciertos estados de enfermedad. Un mecanismo es la infección viral, en donde la construcción de expresión es encapsuladá en una partícula viral infecciosa. Varios métodos no virales para la transferencia de polinucleotidos en células de mamífero cultivadas, se contemplan también en la presente invención e incluyen, sin ser limitadas a, precipitación con fosfato de calcio (Graham et al., 1973; Chen et al., 1987), DEAE-dextrán (Gopal, 1985), electroporación (Tu-Kaspa et al., 1986; Potter et al., 1984), microinyección directa (Harland et al., 1985), liposomas cargados de ADN (Nicolau et al., 1982; Fraley et al., 1979), y transfección mediada por receptores (Wu y Wu, 1987; 1988). Algunas de estas técnicas se pueden adaptar con éxito para uso in vivo o ex vivo. Una vez que el polinucleótido de expresión ha sido liberado en la célula, puede ser integrado establemente en el genoma de la célula receptora.

Esta integración puede ser en la posición y orientación cognadas mediante recombinación homologa (reemplazo de genes), o puede ser integrada en una posición aleatoria no específica (aumento de genes). En otras modalidades, el ácido nucleico puede ser mantenido establemente en las células como un segmento de ADN episómico separado. Dichos segmentos de ácido nucleico o "episomas", codifican para secuencias suficientes que permiten mantenimiento y replicación independientes de, o en sincronización con, el ciclo de la célula hospedera. Una modalidad específica de un método para liberar una proteína o péptido hacia el interior de una célula de un vertebrado in vivo, comprende el paso de introducir una preparación que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable y un polinucleótido desnudo que codifica . operativamente para el polipéptido de interés en el espacio intersticial de un tejido que comprende la célula, con lo cual el polinucleótido desnudo es absorbido en el interior de la célula, y tiene un efecto fisiológico. Esto es particularmente aplicable para transferencia in vitro, pero se puede aplicar también in vivo. Composiciones para su uso in vitro e in vivo que comprenden un polinucleótido "desnudo", se describen en la solicitud del PCT No. WO 90/11092 (Vical Inc.), y también en la solicitud del PCT No. WO 95/1 1307 (Instituto Pasteur, INSERM, Université d'Ottawa), así como también en los artículos de Tacson et al. (1996) y de Huygen et al. (1996). En otra modalidad de la invención, la transferencia de un polinucleótido desnudo de la invención, incluyendo una construcción de poiinucleótido de la invención, en células, se puede llevar a cabo mediante bombardeo de partículas (método biolístico), dichas partículas siendo microproyectiles recubiertos de ADN acelerados a una alta velocidad, que les permiten perforar las membranas celulares y entrar en las células sin destruirlas, tal como es descrito por Klein et al. (1987). En otra modalidad, el polinucleótido de la invención puede ser atrapado en un liposoma (Ghosh y Bacchawat, 1991 ; Wong et al., 1980; Nicolau et al., 1987). En una modalidad específica, la invención provee una composición . para la producción in vivo de la proteína o polinucleótido de PAPAP descritos en la presente. Comprende un polinucleótido desnudo que codifica operativamente para este polipéptido, en solución en un vehículo fisiológicamente aceptable, y adecuado para introducción en un tejido, para hacer que las células del tejido expresen dicha proteína o polipéptido. La cantidad de vector que será inyectada al organismo hospedero deseado, varía de acuerdo al sitio de inyección. Como dosis indicativa, se inyectará entre 0.1 y 100 µg del vector en el cuerpo de un animal, de preferencia el cuerpo de un mamífero, por ejemplo, el cuerpo de un ratón. En otra modalidad del vector de conformidad con la invención, puede ser introducido in vitro en una célula hospedera, de preferencia en una célula hospedera previamente cosechada del animal que será tratado, y más preferiblemente una célula somática tal como una célula muscular. En un paso subsecuente, la célula que ha sido transformada con el vector que codifica para el polipéptido de PAPAP, o el fragmento deseado del mismo, es reintroducida en el cuerpo del animal para liberar la proteína recombinante dentro del cuerpo, localmente o sistémicamente.

Células hospederas Otro objetivo de la invención, comprende una célula hospedera que ha sido transformada o transfectada con uno de los polinucleótidos descritos en la presente, y en particular un polinucleótido que comprende un polinucleótido regulador de PAPAP, o . la secuencia de codificación del. polipéptido de PAPAP de SEQ ID Nos 1 ó 3, o un fragmento o una variante, del mismo. Incluidas también son células hospederas que son transformadas (células procarióticas) o que son transfectadas (células eucarióticas) con un vector- recombinante tal como uno de los descritos anteriormente. Más particularmente, las células hospederas de la presente invención pueden comprender cualquiera de los polinucleótidos descritos en la sección de "secuencias genómicas del gen PAPAP", la sección de "secuencias de ADNc de PAPAP", la sección de "regiones de codificación", la sección de "construcciones de polinucleótidos" y la sección de "sondas e iniciadores de oligonucleótidos". Otra célula hospedera recombinante de conformidad con la invención, comprende cualquiera de los vectores descritos en la presente, más particularmente cualquiera de los vectores descritos en la sección de "vectores recombinantes". Las células hospederas preferidas usadas como receptores para los vectores de expresión de la invención, son las siguientes: a) Células hospederas procarióticas: cepas de Escherichia coli (cepa I.E.DH5-ot), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, y cepas de especies tales como Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. b) Células hospederas eucarióticas: células HeLa (Nos. de ATCC CCL2, CCL2.1 y CCL2.2), células Cv 1 (No. de ATCC CCL70), células COS (Nos. de ATCC CRL1650 y CRL 65 ), células Sf-9 (No. de ATCC CRL 711 ), células C127 (No. de ATCC CRL-1804), 3T3 (No. de ATCC CRL-6361 ), CHO (No. de ATCC CCL-61 ) y células 293 de riñon humano (Nos. de ATCC 45504 y CRL-1573) y BHK (Nos. de ECACC 84100501 y 8411 1301 ). c) Otras células hospederas de mamífero. Se puede hacer que la expresión del gen PAPAP en células de mamífero, típicamente células humanas, sea defectuosa o, en forma alternativa, vaya seguida de la inserción de una secuencia genómica o de ADNc de PAPAP, con el reemplazo de la contraparte del gen PAPAP en el genoma de una célula animal mediante un polinucleótido de PAPAP de conformidad con la invención. Estas alteraciones genéticas se pueden generar mediante eventos de recombinación homologa usando construcciones de ADN específicas que se han descrito previamente. Un tipo de células hospederas que se puede usar, son cigotos de mamífero, tales como cigotos de murino. Por ejemplo, cigotos de murino pueden sufrir microinyección con una molécula de ADNc purificada de interés, por ejemplo, una molécula de ADN purificada que ha sido ajustada previamente hasta una escala de concentración de 1 ng/ml - para inserciones de BAC - 3 ng/µ? - para inserciones de bacteriófago P1 - en Tris-HCl a 10 mM, pH 7.4, EDTA a 250 µ?, conteniendo NaCI a 100 mM, espermina a 30 µ? y espermidina a 70 µ?. Cuando el ADN que será microinyectado tiene un gran tamaño, se pueden usar poliaminas y altas concentraciones de sales para evitar el rompimiento mecánico de este ADN, según es descrito por Schedl et al (1993b). Cualquiera de los polinucleótidos de la invención, incluyendo las construcciones de ADN descritas en la presente, puede ser introducido en una línea de células madre embrionarias (ES), de preferencia una línea de células ES de ratón. Las líneas de células ES se derivan de células pluripotenciales no comprometidas de la masa de células interior de blastocitos de pre-implantación. Las líneas de células ES preferidas, son las siguientes: ES-E14TG2a (No. de ATCC CRL-1821 ), ES-D3 (No. de ATCC CRL1934 y No. de ATCC CRL-1 1632), YS001 (No. de ATCC CRL-1 1776) y 36.5 (No. de ATCC CRL-1116). Para mantener las células ES en un estado no comprometido, se cultivan en presencia de células nutricias de crecimiento inhibido que proveen las señales adecuadas para preservar este fenotipo embrionario y sirven como una matriz para la adherencia de células ES. Las células nutricias preferidas son fibroblastos embrionarios primarios que se establecen del tejido de embriones del día 13 - día 14 de virtuaimente cualquier cepa de ratón y que son mantenidos en cultivo, tal como es descrito por Abbondanzo et al. (1993), y son inhibidos en crecimiento mediante irradiación, tal como es descrito por Robertson (1987), o mediante la presencia de una concentración inhibidora de LIF, tal como es descrito por Pease y Williams (1990). Las construcciones en las células hospederas se pueden usar en una forma convencional para obtener el producto génico codificado por la secuencia recombinante. Después de transformación de un hospedero adecuado y crecimiento del hospedero hasta una densidad adecuada de células, el promotor seleccionado es inducido mediante medios adecuados, tales como cambio de temperatura o inducción química, y las células son cultivadas durante un período adicional. Las células se cosechan típicamente mediante centrifugación, son fracturadas mediante medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante retenido es para purificación adicional. Las células microbianas usadas en la expresión de proteínas, pueden ser fracturadas mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclización de congelación y deshielo, sonicación, disolución mecánica, o el uso de agentes de lisado de células. Dichos métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Activación del gen PAPAP La presente invención abarca también células hospederas primarias, secundarias e inmortalizadas homólogamente recombinantes originadas de vertebrados, de preferencia originadas de mamíferos, y en particular originadas de humano, que han sido diseñadas para: a) insertar polinucleótidos exógenos (heterólogos) en el ADN cromosómico endógeno de un gen dirigido, b) eliminar ADN cromosómico endógeno, y/o c) reemplazar ADN cromosómico endógeno con polinucleótidos exógenos. Las inserciones, deleciones y/o reemplazos de secuencias de polinucleótidos, pueden ser para las secuencias de codificación del gen dirigido y/o para regiones reguladoras,; tales como secuencias de promotor e intensificador, asociadas operablemente: con el gen dirigido. La presente invención se refiere además a un método para producir una célula hospedera homólogamente recombinante in vitro o in vivo, en donde la expresión de un gen dirigido no expresado normalmente en la célula, es alterada. De preferencia, la alteración causa la expresión del gen dirigido bajo condiciones de crecimiento normal, o bajo condiciones adecuadas para producir el polipéptido codificado por el gen dirigido. El método comprende los pasos de: (a) transfectar la célula in vitro o in vivo con una construcción de polinucleótidos, la construcción de polinucleótidos comprendiendo: (i) una secuencia de direccionamiento; (ii) una secuencia reguladora y/o una secuencia de codificación; y (iii) un sitio donador de empalme deteriorado, si es necesario, produciendo de esta manera una célula transfectada; y (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo bajo condiciones adecuadas para recombinación homologa. La presente invención se refiere además a un método para alterar la expresión de un gen dirigido en una célula in vitro o in vivo, en donde el gen no es expresado normalmente en la célula, el cual comprende los pasos de: (a) transfectar la célula in vitro o in vivo con una construcción de polinucleótidos, la construcción de polinucleótidos comprendiendo: (i) una secuencia de direccionamiento; (ii) una secuencia reguladora y/o una secuencia de codificación; y (iii) un sitio donador de empalme deteriorado, si es necesario, produciendo de esta manera una célula transfectada; - (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo bajo condiciones adecuadas para recombinación homologa, produciendo de esta manera una célula homólogamente recombinante; y (c) mantener la célula homólogamente -recombinante in vitro o in vivo bajo condiciones adecuadas para la expresión La presente invención se refiere además a un método para producir un polipéptido de la presente invención, alterando la expresión de un gen endógeno dirigido en una célula in vitro o in vivo, en donde el gen no es expresado normalmente en la célula, el cual comprende los pasos de: (a) transfectar la célula in vitro con una construcción de polinucleótidos a, la construcción de polinucleótidos a comprendiendo: (i) una secuencia de direccionamiento; (ii) una secuencia reguladora y/o una secuencia de codificación; y (iii) un sitio donador de empalme deteriorado, si es necesario, produciendo de esta manera una célula transfectada; (b) mantener la célula transfectada in vitro o in vivo bajo condiciones adecuadas para recombinación homologa, produciendo de esta manera una célula homólogamente recombinante; y (c) mantener la célula homólogamente recombinante in vitro o in vivo bajo condiciones adecuadas para la expresión del gen, produciendo de esta manera el polipéptido. La presente invención se refiere además a una construcción de polinucleótidos que altera la expresión de un gen dirigido en un tipo de célula, en el cual el gen no es expresado normalmente. Esto ocurre cuando la construcción de polinucleótidos a es insertada en el ADN cromosómico de la célula objetivo, en donde la construcción de polinucleótidos a comprende: a) . una secuencia de direccionamiento; b) una secuencia reguladora y/o una secuencia de codificación; y c) un sitio donador de empalme deteriorado, si es necesario. Incluidas también son construcciones de polinucleótidos a, como se describió anteriormente, en donde la construcción comprende además un polinucleótido A que codifica para un polipéptido, y está en el marco de lectura con el gen endógeno dirigido después de recombinación homologa con ADN cromosómico. Las composiciones se pueden producir, y los métodos se pueden llevar a cabo, mediante técnicas conocidas en la materia, tal como se describe en las patentes de E.U.A. Nos: 6,054,288; 6,048,729; 6,048,724; 6,048,524; 5,994,127; 5,968,502; 5,965,125; 5,869,239; 5,817,789; 5,783,385; 5,733,761 ; 5,641 ,670; y 5,580,734; publicaciones internacionales Nos: WO 96/29411 y WO 94/12650; y artículos científicos que incluyen Koller et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989) (cuyas descripciones se incorporan en su totalidad en la presente como referencia).

Animales transqénicos Los términos "animales transgénicos" o "animales hospederos", como se usan en la presente, designan animales que tienen su genoma genéticamente y artificialmente manipulado para incluir uno de los ácidos nucleicos de conformidad con la invención. Los animales preferidos son mamíferos no humanos, e incluyen los que. pertenecen a un género seleccionado de Mus (por ejemplo, ratones), Ratíus (por ejemplo, ratas) y Oryctogalus (por ejemplo, conejos), que tienen su genoma artificialmente y genéticamente alterado mediante la inserción de un ácido nucleico de conformidad con la invención. En una modalidad, la invención abarca mamíferos y animales hospederos no humanos que comprenden un vector recombinante de la invención, o un gen PAPAP desorganizado mediante recombinación homologa con un vector con expresión bloqueada. Los animales transgénicos de la invención incluyen, dentro de una pluralidad de sus células, una secuencia de ADN recombinante o sintético clonado, más específicamente una secuencia de los ácidos nucleicos purificados o aislados que comprenden una secuencia de codificación de PAPAP, un polinucleótido regulador de PAPAP, una construcción de polinucleótidos, o una secuencia de ADN que codifica para un polinucleótido antisentido, tal como la que se describe en la presente especificación. En general, un animal transgénico de conformidad con la presente invención comprende cualquiera de los polinucleótidos, los vectores recombinantes y las células hospederas que se describen en la presente invención. Más particularmente, los animales transgénicos de la presente invención pueden comprender cualquiera de los polinucleótidos descritos en la sección de "secuencias genómicas del gen PAPAP", la sección de "secuencias de ADNc de PAPAP", la sección de "regiones de codificación", la sección de "construcciones de polinucleótidos", la sección de "sondas e iniciadores de oligonucleótidos", la sección de "vectores recombinantes" y la sección de "células hospederas". En una primera modalidad preferida, estos animales transgénicos pueden ser buenos modelos experimentales para estudiar las patologías diversas relacionadas con la diferenciación celular, en particular con relación a los animales transgénicos dentro de cuyo genoma han sido insertadas una o varias copias de un polinucleótido que codifica para una proteína de PAPAP nativa o, en forma alternativa, una proteína de PAPAP muíante. En una segunda modalidad preferida, estos animales transgénicos pueden expresar un polipéptido deseado de interés bajo el control de los polinucleótidos reguladores del gen PAPAP, dando como resultado buenos rendimientos en la síntesis de esta proteína de interés, y finalmente una expresión específica de tejidos de esta proteína de interés.

El diseño de los animales transgénicos de la invención, se puede llevar a cabo de acuerdo a técnicas convencionales bien conocidas por los expertos en la materia. Para más detalles respecto a la producción de animales transgénicos, y específicamente ratones transgénicos, se puede referir a las patentes de E.U.A. Nos 4,873,191 , expedida en octubre 10, 1989; 5,464,764, expedida en noviembre 7, 1995; y 5,789,215, expedida en agosto 4, 1998; estos documentos siendo incorporados en la presente como referencia y describiendo métodos que producen ratones transgénicos. Los animales transgénicos de la presente invención se producen mediante la aplicación de procedimientos que dan como resultado un animal con un genoma. que tiene material genético exógeno incorporado. El procedimiento consiste en obtener el material genético, o una porción , del mismo, el cual codifica para una secuencia de codificación de PAPAP, un polinucleótido regulador de PAPAP o una secuencia de ADN que codifica para un polinucleótido antisentido de PAPAP, tal como se describe en la presente especificación. Un polinucleótido recombinante de la invención es insertado en una línea de células madre ES o embrionarias. La inserción se lleva a cabo de preferencia usando electroporación, tal como es descrito por Thomas et al. (1987). Las células sometidas a electroporación se seleccionan (por ejemplo, mediante selección por marcadores seleccionares, mediante PCR o mediante análisis Southern blot), hasta encontrar células positivas que hayan integrado el polinucleótido recombinante exógeno en su genoma, de preferencia mediante un evento de recombinación homologa. Un procedimiento de selección positiva-negativa ilustrativo que se puede usar de conformidad con la invención, es descrito por Mansour et al. (1988). Después, las células positivas son aisladas, clonadas e inyectadas en blastocistos de ratón de 3.5 días, tal como es descrito por Bradley (1987). Los blastocistos son insertados entonces en un animal hospedero hembra, y se deja que crezcan a término. En forma alternativa, las células ES positivas son puestas en contacto con embriones en la etapa de 8 a 16 células de 2.5 días (mórulas), tal como es descrito por Wood et al. (1993) o por Nagy et al. (1993); las células ES siendo incorporadas para colonizar extensivamente el blastocisto, incluyendo las células que darán lugar a la línea germinal. La progenie de la hembra hospedera se pone a prueba para determinar qué animales son transgénicos, por ejemplo, cuáles incluyen la secuencia de ADN exógena insertada y cuáles son de tipo silvestre. De esta manera, la presente invención se refiere también a un animal transgénico que contiene un ácido nucleico, un vector de expresión recombinante o una célula hospedera recombinante de conformidad con la invención.

Líneas de células recombinantes derivadas de los animales transgénicos de la invención Otro objetivo de la invención, comprende células hospederas recombinantes obtenidas de un animal transgénico descrito en la presente. En una modalidad, la invención comprende células derivadas de mamíferos y animales hospederos no humanos que comprenden un vector recombinante de la invención, o un gen PAPAP desorganizado mediante recombinación. homologa con un vector con expresión bloqueada. Se pueden establecer líneas de células recombinantes in vitro a partir de células obtenidas de cualquier tejido de un animal transgénico de conformidad con la invención, por ejemplo, mediante transfección de cultivos de células primarias con vectores que expresan genes onc, tales como el. antígeno T grande de SV40, como es descrito por Chou (1989) y Shay et al. (1991).

: Pruebas para la identificación de compuestos para el tratamiento de esquizofrenia y trastorno bipolar La presente invención provee pruebas que se pueden usar para poner a prueba compuestos para su capacidad para tratar trastornos del SNC, y en particular, para mejorar síntomas de un trastorno del SNC mediados por PAPAP. En modalidades preferidas, los compuestos se ponen a prueba para su capacidad para mejorar síntomas de esquizofrenia o trastorno bipolar mediados por PAPAP. Los compuestos se pueden poner a prueba también para su capacidad para tratar trastornos relacionados que incluyen, entre otros, trastornos psicóticos, trastornos del humor, autismo, dependencia de sustancias y alcoholismo, retraso mental y otras enfermedades psiquiátricas que incluyen control cognoscitivo, de ansiedad, de la alimentación y de impulsos, y trastornos de personalidad, según se define en la clasificación del Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders, cuarta edición (DSM-IV). La presente invención provee también célula y animal, incluyendo primate y roedor, y modelos de esquizofrenia, trastorno bipolar y trastornos relacionados. En un aspecto, se proveen pruebas no basadas en células y pruebas basadas en animales y células para la identificación de dichos compuestos que influyen sobre la actividad de PAPAP. La actividad de PAPAP puede ser afectada por cualquier mecanismo; en ciertas modalidades, la actividad de PAPAP es afectada modulando el nivel de expresión del gen PAPAP, o la actividad del producto de gen PAPAP. En un aspecto, se . proveen pruebas no basadas en células y pruebas basadas en animales y células para la identificación de dichos compuestos que influyen sobre la actividad de g34872. La actividad de g34872 puede ser afectada modulando el nivel de expresión del gen PAPAP, o la actividad del producto del gen PAPAP. De preferencia, las pruebas para la identificación de dichos compuestos que afectan la actividad de g34872, son capaces de detectar la interacción de polipéptidos de PAPAP y g34872, o capaces de detectar complejos de PAPAP-g34872. Los presentes métodos permiten la identificación de compuestos que afectan la actividad de PAPAP o g34872, directamente o indirectamente. Las pruebas no basadas en células y las pruebas basadas en animales y células de la presente invención, se pueden usar para identificar compuestos que actúan sobre un elemento de una vía de PAPAP diferente del PAPAP mismo. Estos compuestos se pueden usar entonces como tratamiento terapéutico para modular PAPAP, y otros productos de genes que intervienen en esquizofrenia, trastorno bipolar y trastornos relacionados.

Pruebas basadas en células y no basadas en células En un aspecto, se pueden usar pruebas basadas en células que usan células recombinantes o no recombinantes, para identificar compuestos que modulan la actividad de PAPAP. En un aspecto, una prueba de la invención basada en células comprende un método para identificar un compuesto de prueba para el tratamiento de esquizofrenia, trastorno bipolar o trastorno relacionado con el SNC, el cual comprende (a) exponer una célula a un compuesto de prueba a una concentración y tiempo suficientes para mejorar un punto final relacionado con esquizofrenia, trastorno bipolar o trastorno relacionado con el SNC, y (b) determinar el nivel de actividad de PAPAP o interacción de complejos de PAPAP-g34872 en una célula. La actividad de PAPAP se puede medir, por ejemplo, poniendo a prueba una célula para nivel de transcripción de ARN mensajero, expresión del péptido de PAPAP y localización o actividad de la proteína. De preferencia, el compuesto de prueba es un compuesto capaz de, o que se sospecha es capaz de, mejorar un síntoma de esquizofrenia, trastorno bipolar o trastorno relacionado. Se pueden seleccionar compuestos de prueba capaces de modular la actividad de PAPAP para su uso en el desarrollo de medicamentos. Dichas pruebas basadas en células se describen además en la presente, en la sección titulada "métodos para la selección de ligandos que modulan la expresión del gen PAPAP". En otro aspecto, una prueba de la invención basada en células abarca un método para identificar un compuesto para el tratamiento de esquizofrenia o trastorno bipolar, el cual comprende (a) exponer una célula a un nivel de actividad de PAPAP suficiente para causar un punto final relacionado con esquizofrenia o con trastorno bipolar, y (b) exponer dicha célula a un compuesto de prueba. Se puede seleccionar entonces un compuesto de prueba de acuerdo a su capacidad para mejorar dicho punto final relacionado con esquizofrenia o con trastorno bipolar. La actividad de PAPAP se puede proveer mediante cualquier método adecuado incluyendo, pero no limitado a, proveer un vector que contenga una secuencia de nucleótidos de PAPAP, tratando dicha célula con un compuesto capaz de incrementar la expresión de PAPAP, y tratando dicha célula con un péptido de PAPAP. De preferencia, el compuesto de prueba es un compuesto capaz de, o que se sospecha es capaz de, mejorar un síntoma de esquizofrenia, trastorno bipolar o un trastorno relacionado; en forma alternativa, se sospecha que el compuesto de prueba exacerba un punto final de esquizofrenia, trastorno bipolar o un trastorno relacionado. Un compuesto de prueba capaz de mejorar cualquier síntoma o punto final detectable de esquizofrenia, trastorno bipolar o un trastorno relacionado, se puede seleccionar para su uso en el desarrollo de medicamentos. Líneas de células adecuadas pueden ser determinadas por los expertos en la técnica; de preferencia, se usa una línea de células de origen neuronal. En otra modalidad, la invención provee pruebas basadas en células y no basadas en células para PAPAP, para determinar si los péptidos de PAPAP se unen a la superficie celular, y para identificar compuestos para el tratamiento de esquizofrenia, trastorno bipolar y trastornos relacionados que interactúan con un receptor de PAPAP. En dicha modalidad, un polinucleótido de PAPAP, o fragmento del mismo, es clonado en vectores de expresión tales como los que se describen en la presente. Las proteínas son purificadas por s tamaño, carga, mediante inmunocromatografía u otras técnicas conocidas por los expertos en la materia. Después de la purificación, las proteínas se marcan usando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Las proteínas marcadas se incuban con células o líneas de células derivadas de una variedad de órganos o tejidos que permiten que las proteínas se unan a algún receptor presente sobre la superficie celular. Después de la incubación, las células se lavan para remover la proteína unida en forma no específica. Las proteínas marcadas se detectan mediante autorradiografía. En forma alternativa, las proteínas no marcadas pueden ser incubadas con las células, y detectadas con anticuerpos que tienen una marca detectable, tal como una molécula fluorescente, adherida a los mismos. El carácter específico de unión a la superficie celular se puede analizar llevando a cabo un análisis de competencia en el cual varias cantidades de proteína no marcada se incuban junto con la proteína marcada. La cantidad de proteína marcada unida a la superficie celular disminuye conforme la cantidad de proteína no marcada competitiva aumenta. Como control, varias cantidades de una proteína no marcada no relacionada con la proteína marcada, se incluyen en algunas reacciones de unión. La cantidad de proteína marcada unida a la superficie celular no disminuye en las reacciones de unión que contienen cantidades crecientes de proteína no marcada no relacionada, indicando que la proteína codificada por el ácido nucleico se une específicamente a la superficie celular. Un ejemplo de dicha prueba se demuestra en el ejemplo 1 , más adelante.- En un aspecto, se puede usar la unión a PAPAP para detectar y localizar un polipéptido de g34872. . En otra modalidad, la presente invención comprende pruebas de unión no basadas en células, en donde un polipéptido de PAPAP se prepara y purifica como en una de las pruebas de unión basadas en células descrita anteriormente. Después de la purificación, las proteínas son marcadas e incubadas con un extracto de membrana celular o aislado derivado de alguna célula deseada de cualquier órgano, tejido o combinación de órganos o tejidos de interés, para permitir que el polipéptido de PAPAP se una a algún receptor presente en una membrana. Después de la incubación, las membranas se lavan para remover la proteína no unida en forma específica. Las proteínas marcadas se pueden detectar mediante autorradiografía. El carácter específico de unión de PAPAP a la membrana se puede analizar llevando a cabo un análisis de competencia, en el cual varias cantidades de un compuesto de prueba se incuban junto con la proteína marcada. Cualquier compuesto de prueba deseado, incluyendo polipéptidos de prueba, se puede incubar con las células. Los compuestos de prueba se pueden detectar con anticuerpos que tengan una marca detectable, tal como una molécula fluorescente, adherida a los mismos. La cantidad de polipéptido de PAPAP marcado unido a la superficie celular, disminuye conforme la cantidad del compuesto de prueba competitivo aumenta. Como control, varias cantidades de una proteína no marcada o un compuesto no relacionado con el compuesto de prueba, se incluyen en algunas reacciones de unión. Compuestos, de prueba capaces de reducir la cantidad de PAPAP unido a membranas celulares, se pueden seleccionar como compuesto terapéutico candidato. En un aspecto, la unión a PAPAP se puede usar para detectar un polipéptido de g34872. En modalidades preferidas de las pruebas basadas en células y no basadas en células, dicho péptido de PAPAP contiene un espacio contiguo de por lo menos 4, 6 u 8 aminoácidos contiguos de SEQ ID No 2. Dichas pruebas basadas en células pueden comprender células de cualquier origen adecuado; células particularmente preferidas, son células humanas, células de primate, células de primate no humano y células de ratón.

Prueba basada en modelos de animales Se pueden usar también pruebas basadas en animales no humanos para identificar compuestos que modulan la actividad de PAPAP, para estudiar a PAPAP, así como también para estudiar a g34872, y la vía biológica de g34872. La invención abarca modelos de animales y pruebas basadas en animales adecuados, incluyendo animales transgénicos y no transgénicos, incluyendo animales que carecen del gen PAPAP, o que expresan condicionalmente un gen PAPAP, o que contienen una forma humana o alterada del gen PAPAP. De esta manera, la presente invención comprende tratar un animal afectado por esquizofrenia o trastorno bipolar o síntomas de los mismos, con un compuesto de prueba capaz de modular directamente o indirectamente la actividad de PAPAP. En un aspecto, una prueba de la invención basada en animales, abarca un método para identificar un compuesto de prueba para el tratamiento de esquizofrenia o trastorno bipolar, el cual comprende (a) exponer un animal a un compuesto de prueba a una concentración y tiempo suficientes para mejorar un punto final relacionado con esquizofrenia o trastorno bipolar, y (b) determinar el nivel de actividad de PAPAP o interacción de complejos de PAPAP-g34872, en un sitio en dicho animal. La actividad de PAPAP se puede medir en cualquier célula, tejido o sitio adecuado. De preferencia, el compuesto de prueba es un compuesto capaz de, o que se sospecha es capaz de, mejorar un síntoma de esquizofrenia, trastorno bipolar o trastorno relacionado. Opcionalmente, dicho compuesto de prueba es capaz, o se sospecha que es capaz, de modular la actividad de PAPAP. Se pueden seleccionar compuestos de prueba capaces de modular la actividad de PAPAP para su uso en el desarrollo de medicamentos. Varios ejemplos de compuestos de prueba se dan en la presente (por ejemplo, benzodiazepinas, inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina, etc.). En otro aspecto, una prueba de la invención basada en animales, abarca un método para identificar un compuesto para el tratamiento de esquizofrenia o trastorno bipolar, el cual comprende (a) exponer un animal a un nivel de actividad de PAPAP suficiente para causar un síntoma o punto final relacionado con esquizofrenia o relacionado con trastorno bipolar, y (b) exponer dicho animal a un compuesto de prueba. Se puede seleccionar entonces un compuesto de prueba de acuerdo con su capacidad para mejorar dichos puntos finales relacionados con esquizofrenia o relacionados con trastorno bipolar. La actividad de PAPAP se puede proveer mediante cualquier método adecuado que incluye, pero no está limitado a, proveer un vector que contenga una secuencia de nucleótidos de PAPAP, tratar dicho animal con un compuesto capaz de incrementar la expresión de PAPAP, y tratar dicha célula con un péptido de PAPAP. De preferencia, dicho animal se trata con un péptido de PAPAP que comprende un espacio contiguo de por lo menos 4, 6 o de preferencia 8 aminoácidos contiguos de SEQ ID No 2. De preferencia, el compuesto de prueba es un compuesto capaz de, o que se sospecha es capaz de, mejorar un síntoma de esquizofrenia, trastorno bipolar o trastorno relacionado; alternativamente, se piensa que el compuesto de prueba exacerba un síntoma de esquizofrenia, trastorno bipolar o trastorno relacionado. Se puede seleccionar un compuesto de prueba capaz de mejorar cualquier síntoma o punto final detectable de esquizofrenia, trastorno bipolar o trastorno relacionado, para su uso en el desarrollo de medicamentos. En una modalidad, un ratón es tratado con un péptido de PAPAP, expuesto a un compuesto de prueba, y síntomas indicativos de esquizofrenia, trastorno bipolar o un trastorno relacionado, se evalúan observando la estereotipia. En otras modalidades, dichos síntomas se evalúan llevando a cabo por lo menos una prueba del grupo que consiste de observación en jaulas, evaluación neurológica, hipotermia inducida por estrés, natación forzada, apoplejía por PTZ, actividad locomotora, suspensión de la cola, laberinto más elevado, reconocimiento de objetos nuevos, inhibición de preimpulsos, dolor térmico, laberinto en Y, y pruebas en cámara metabólica (pruebas Psychoscreen™j disponibles de Psychogenics Inc.) Otras pruebas se conocen, por ejemplo, en Crawley et al, Horm. Behav. 31 (3):197-211 (1997); Crawley, Brain Res 835(1):18-26 (1999). Cualquier compuesto de prueba adecuado se puede usar con los métodos de selección de la invención. Ejemplos de compuestos que se pueden seleccionar mediante los métodos de la presente invención, incluyen pequeñas moléculas orgánicas o inorgánicas, ácidos nucleicos que incluyen polinucleótidos de genotecas de polinucleótidos aleatorias y dirigidas, péptidos que incluyen péptidos derivados de genotecas de péptidos aleatorias y dirigidas, péptidos solubles, péptidos de fusión y fosfopéptidos, anticuerpos que incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados y antiidiotípicos, y anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos FAb, F(ab')2 y FAb de genotecas de expresión, y fragmentos de unión a epítope de los mismos. En ciertos aspectos, un compuesto capaz de mejorar o exacerbar un síntoma o punto final de esquizofrenia, trastorno bipolar o un trastorno relacionado puede incluir, a manera de ejemplo, fármacos antipsicóticos en general, neurolépticos, neurolépticos atípicos, antidepresivos, fármacos contra la ansiedad, agonistas y antagonistas noradrenérgicos, agonistas y antagonistas dopaminérgicos, inhibidores de la recaptación de serotonina y benzodiazepinas. En estas pruebas, el compuesto de prueba se puede administrar (por ejemplo, IV, IP, IM, oralmente o de otra forma) al animal, por ejemplo, en una variedad de niveles de dosis, El efecto del compuesto sobre la expresión de PAPAP se determina comparando los niveles de PAPAP, por ejemplo, en sangre, o en un tejido seleccionado, usando Northern blots, inmunoensayos, PCR, etc., como se describió anteriormente. Se puede usar cualquier animal adecuado. De preferencia, dicho animal es un primate, un primate no humano, un mamífero o un ratón. Se pueden usar también ratones humanizados como animales de prueba, es decir, ratones en los cuales la proteína endógena del ratón es escindida (bloqueada en su expresión) y la proteína humana homologa se añade otra vez mediante alternativas transgénicas estándar. Dichos ratones sólo expresan la forma humana de una proteína. Los ratones humanizados que expresan sólo el PAPAP humano, se pueden usar para estudiar respuestas ¡n vivo sintomáticas de trastornos del SNC en respuesta a agentes potenciales que regulan la proteína de PAPAP o niveles de A N mensajero, o interacciones o complejos de PAPAP-g34872. Como ejemplo, se han producido ratones transgénicos que poseen el gen apoE4 humano. Son cruzados entonces con una línea de ratones que carece del apoE endógeno, para producir un modelo de animal que posee proteínas humanas que se piensa son instrumentales en el desarrollo de la patología de Alzheimer. Dichos animales transgénicos son útiles para separar los pasos bioquímicos y fisiológicos de la enfermedad, y para el desarrollo de terapias para intervención en enfermedad (véase Loring, et al., Neurobiol. Aging 17:173 (1996), cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia).

Métodos para seleccionar sustancias que interactúan con un polipéptido de PAPAP Para el propósito de la presente invención, un ligando significa una molécula, tal como una proteína, un péptido, un anticuerpo o cualquier compuesto químico sintético capaz de unirse a la proteína de PAPAP, o uno de sus fragmentos o variantes, o que modula la expresión del polinucleótido que codifica para PAPAP, o un fragmento o variante del mismo. En el método de selección de ligandos de conformidad con la presente invención, una muestra biológica o una molécula definida que se pondrá a prueba como ligando putativo de la proteína de PAPAP, se pone en contacto con la proteína de PAPAP purificada correspondiente, por ejemplo, la proteína de PAPAP recombinante purificada correspondiente producida por una célula hospedera recombinante como se describió anteriormente, para formar un complejo entre esta proteína y la molécula de ligando putativa que se va a poner a prueba. Como ejemplo ilustrativo, para estudiar la interacción de la proteína de PAPAP, o un fragmento que comprende un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No 2, con fármacos o moléculas pequeñas, tales como moléculas generadas mediante alternativas de química combinatoria, se puede usar la microdiálisis acoplada al método de CLAR descrito por Wang et al. (1997), o el método de electrofóresis capilar de afinidad descrito por Bush et al. (1997),. cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia. En otros métodos, péptidos, fármacos, ácidos grasos, lipoproteínas o pequeñas moléculas que interactúan con la proteína de PAPAP, o un fragmento que comprende un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No 2, se pueden identificar usando pruebas tales como las siguientes. La molécula que se va a poner a prueba para unión es marcada con una marca detectable, tal como una marca fluorescente, radiactiva o enzimática, y puesta en contacto con la proteína de PAPAP inmovilizada, o un fragmento de la misma, bajo condiciones que permitan que ocurra unión específica.

Después de remover las moléculas unidas no en forma específica, las moléculas unidas se detectan usando medios adecuados. Otro objetivo de la presente invención, comprende métodos y equipos para la selección de sustancias candidatos que ¡nteractúan con el polipéptido de PAPAP. La presente invención pertenece a métodos para la selección de sustancias de interés que ¡nteractúan con una proteína de PAPAP o un fragmento o variante de la misma. Debido a su capacidad para unirse covalentemente o no covalentemente a una proteína de PAPAP o a un fragmento o variante de la misma, estas sustancias o moléculas se pueden usar en forma ventajosa in vitro e in vivo. In vitro, dichas moléculas dé interacción se pueden usar como medios de detección para identificar la presencia de una proteína de PAPAP en una muestra, de preferencia una muestra biológica. Un método para la selección de una sustancia candidato, comprende los siguientes pasos: a) proveer un polipéptido que comprenda, que consista esencialmente de, o que consista de, una proteína de PAPAP o un fragmento de la misma que comprenda un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No 2; b) obtener una sustancia candidato; c) poner en contacto dicho polipéptido con dicha sustancia candidato; d) detectar los complejos formados entre dicho polipéptido y dicha sustancia candidato. En una modalidad, la invención se refiere al uso de PAPAP para el estudio de la vía de g34872 en trastornos del SNC. Se pueden usar métodos para la selección de sustancias de interacción que detectan la interacción de PAPAP y g34872. De esta manera, la invención comprende también: a) proveer un polipéptido que comprenda, que consista esencialmente de, o que consista, de una proteína de PAPAP, o un fragmento que comprenda un espacio contiguo de por lo menos. 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente, por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No 2; b) obtener un polipéptido de g34872; c) poner en contacto dicho polipéptido de PAPAP con un polipéptido de g34872; d) detectar los complejos formados entre dicho polipéptido de PAPAP y dicho polipéptido de g34872. De preferencia, dicho polipéptido de g34872 comprende por lo menos 4, 6 o de preferencia 8 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No 5. La invención se refiere además a un equipo para la selección de una sustancia candidato que interactúa con el polipéptido de PAPAP, en donde dicho equipo comprende: a) una proteína de PAPAP que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID No 2, o un fragmento peptídico que comprende un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No 2; b) opcionalmente, medios útiles para detectar el complejo formado entre la proteína de PAPAP o un fragmento peptídico o una. variante de la misma, y la sustancia candidato. En una, modalidad preferida del equipo descrito anteriormente, los medios de detección comprenden anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra la proteína de PAPAP, o un fragmento peptídico o una variante de la misma. Varias sustancias o moléculas candidatos se pueden poner a prueba para interacción con un polipéptido de PAPAP. Estas sustancias , o moléculas incluyen, sin ser limitadas a, compuestos orgánicos naturales o sintéticos o moléculas de origen biológico tales como polipéptidos; cuando la sustancia o molécula candidato comprende un polipéptido, este polipéptido puede ser el producto de expresión resultante de un clon de fagos que pertenece a una genoteca de péptidos aleatoria basada en fagos o, alternativamente, el polipéptido puede ser el producto de expresión resultante de una genoteca de ADNc clonado en un vector adecuado para llevar a cabo una prueba de selección de dos híbridos. La invención pertenece también a equipos útiles para llevar a cabo el método de selección descrito anteriormente. De preferencia, dichos equipos comprenden un polipéptido de PAPAP o un fragmento o una variante del mismo, y opcionalmente medios útiles para detectar el complejo formado entre el polipéptido de PAPAP o su fragmento o variante, y la sustancia candidato. En una modalidad preferida, los medios de detección comprenden anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra el polipéptido PAPAP correspondiente, o un fragmento o una variante del mismo.

A. Liqandos candidatos obtenidos de qenotecas de péptidos aleatorias ¦¦ En una modalidad particular del método de selección, el ligando putativo es el producto de expresión de una inserción de ADN contenida en un vector de fagos (Parmley y Smith, 1988). Específicamente, se usan genotecas de fagos de péptidos aleatorias. Las inserciones de ADN aleatorias codifican para péptidos de 8 a 20 aminoácidos de longitud (Oldenburg K. R. et al., 1992; Valadon P., et al., 1996; Lucas A. H., 1994; Westerink M. A. J., 1995; Felici F. et al., 1991) De conformidad con esta modalidad particular, los fagos recombinantes que expresan una proteína que se une a la proteína de PAPAP inmovilizada son retenidos, y el complejo formado entre la proteína de PAPAP y el fago recombinante puede ser inmunoprecipitado subsecuentemente por un anticuerpo policlonal o monoclonal dirigido contra la proteína de PAPAP. Una vez que se ha construido la genoteca de ligandos en los fagos recombinantes, la población de fagos se pone en contacto con la proteína de PAPAP inmovilizada: Entonces, la preparación de complejos se lava para remover los fagos recombinantes unidos no en forma específica. Los fagos que se unen específicamente a la proteína de PAPAP, son eluidos entonces mediante el uso de un regulador de pH (pH ácido), o inmunoprecipitados por el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma anti-PAPAP, y esta población de fagos es amplificada subsecuentemente mediante una sobreinfección de bacterias (por ejemplo, E. coli). El paso de selección se puede repetir varias veces, de preferencia de 2 a 4 veces, para seleccionar los clones del fago recombinante más específicos. El último paso comprende caracterizar el péptido producido por los clones de fago recombinante seleccionados mediante expresión en bacterias infectadas y aislamiento, expresando la inserción de fagos en otro sistema de hospedero-vector, o secuenciando la inserción contenida en los fagos recombinantes seleccionados.

B. Ligandos candidatos obtenidos mediante experimentos de competencia En forma alternativa, se pueden identificar péptidos, fármacos o pequeñas moléculas que se unen a la proteína de PAPAP, o un fragmento que comprende un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No. 2, en experimentos de competencia. En dichas pruebas, la proteína de PAPAP, o un fragmento de la misma, es inmovilizada a una superficie, tal como una placa de plástico. Cantidades crecientes de los péptidos, fármacos o pequeñas moléculas, son puestas en contacto con la proteína de PAPAP inmovilizada, o un fragmento de la misma, en presencia de una marca detectable conocida como ligando de proteína de PAPAP. Por ejemplo, el ligando de PAPAP puede ser marcado detectablemente con una marca fluorescente, radiactiva o enzimática. La capacidad de la molécula de prueba para unirse a la proteína de PAPAP, o un fragmento de la misma, se determina : midiendo la cantidad del. ligando conocido marcado detectablemente unido en presencia de una molécula de prueba. Una disminución en la cantidad del ligando conocido unido a la proteína de PAPAP, o un fragmento de la misma,- cuando la molécula de prueba está presente, indica que la molécula de prueba es capaz de unirse a la proteína de PAPAP, o un fragmento de la misma.

C. Liqandos candidatos obtenidos mediante cromatografía de afinidad Proteínas u otras moléculas que interactúan con la proteína de PAPAP, o un fragmento que comprende un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No. 2, se pueden encontrar también usando columnas de afinidad que contengan la proteína de PAPAP, o un fragmento de la misma. La proteína de PAPAP, o un fragmento de la misma, puede ser adherida a la columna usando técnicas convencionales que incluyen acoplamiento químico a una matriz de columna adecuada tal como agarosa, Affi Gel®, u otras matices conocidas por los expertos en la técnica. En algunas modalidades de este método, la columna de afinidad contiene proteínas quiméricas en las cuales la proteína de PAPAP, o un fragmento de la misma, es fusionada a glutatión S transferasá (GST). Üna mezcla de proteínas celulares o grupo de proteínas expresadas, como se describió anteriormente, es aplicada a la columna :.de afinidad. Proteínas u otras moléculas que interactúan con la proteína de PAPAP, o un fragmento de la misma, unidas a la columna, pueden entonces ser aisladas y analizadas sobre geles de electrofóresis bidimensionales como se describe en Ramunsen et al. (1997), cuya descripción se incorpora en la presente como referencia. En forma alternativa, las proteínas retenidas sobre la columna de afinidad pueden ser purificadas mediante métodos basados en electrofóresis, y secuenciadas. El mismo método se puede usar para aislar anticuerpos, para seleccionar productos de presentación visual de fagos, o para seleccionar anticuerpos humanos de presentación visual de fagos.

D. Ligandos candidatos obtenidos mediante métodos de biosensor óptico Proteínas que interactúan con la proteína de PAPAP, o un fragmento que comprende un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No. 2, se pueden seleccionar también usando un Optical Biosensor, como se describe en Edwards y Leatherbarrow (1997), y también en Szabo et al. (1995), cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia. Esta técnica permite la detección de interacciones entre moléculas en tiempo real, sin la necesidad de moléculas marcadas. Esta técnica se basa en el. fenómeno de resonancia de plasmones de superficie (SPR). En resumen, la molécula de ligando. candidato que se va a poner a prueba, es unida a una superficie (tal como una matriz de carboximetil dextrán). Un haz de luz es dirigido hacía el lado de la superficie que no contiene la muestra que se va a poner a prueba, y es reflejado por dicha superficie. El fenómeno de SPR causa una disminución en la intensidad de la luz reflejada con una asociación específica de ángulo y longitud de onda. La unión de las moléculas de ligando candidatos causa un cambio en el índice de refracción sobre la superficie, cuyo cambio es detectado como un cambio en la señal de SPR. Para la selección de moléculas de ligando candidatos o sustancias que son capaces de interactuar con la proteína de PAPAP, o un fragmento de la misma, la proteína de PAPAP, o un fragmento de la misma, es inmovilizada sobre una superficie. Esta superficie comprende un lado de una célula a través del cual fluye la molécula candidato que se va a poner a prueba. La unión de la molécula candidato sobre la proteína de PAPAP, o un fragmento de la misma, se detecta como un cambio en la señal de SPR. Las moléculas candidatos puestas a prueba pueden ser proteínas, péptidos, carbohidratos, lípidos o pequeñas moléculas generadas mediante química combinatoria. Esta técnica se puede llevar a cabo también inmovilizando células eucarióticas o procarióticas o vesículas de lípidos que exhiben una proteína endógena o una proteína de PAPAP expresada en forma recombinante en su superficie. ¾ La ventaja principal del método, es que permite la determinación de la velocidad de asociación entre la proteína de PAPAP y las moléculas que interactúan con la proteína de PAPAP. De esta manera, es posible seleccionar específicamente moléculas de ligando que interactúan con la proteína de PAPAP, o un fragmento de la misma, a través de constantes de asociación fuertes o, la inversa, débiles.

E. Ligandos candidatos obtenidos mediante una prueba de selección de dos híbridos El sistema de dos híbridos de levadura está diseñado para estudiar interacciones de proteína-proteína in vivo (Fields y Song, 1989), y depende de la fusión de una proteína cebo al dominio de unión de ADN de la proteína Gal4 de levadura. Esta técnica se describe también en la patente de E.U.A. No. 5,667,973 y en la patente de E.U.A. No. 5,283,173 (Fields et al.), cuyas enseñanzas técnicas se incorporan en la presente como referencia. El procedimiento general de selección de genotecas mediante la prueba de dos híbridos, se puede llevar a cabo como es descrito por Harper et al. (1993), o como es descrito por Cho et al. (1998), o también por Fromont-Racine et al. (1997). La proteína o polipéptido cebo comprende, consiste esencialmente de, o consiste de, un polipéptido de PAPAP, o un fragmento que comprende un espacio contiguo de por lo menos 6 aminoácidos, de preferencia por lo menos 8 a 10 aminoácidos, más preferiblemente por lo menos 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ó 100 aminoácidos de SEQ ID No. 2. En forma más precisa, la secuencia de nucleótidos que codifica para el. polipéptido de PAPAP, o un fragmento o variante del mismo, .es fusionada a un polinucleótido que codifica para el dominio de unión de ADN de la proteína Gal4, en donde la secuencia de nucleótidos fusionada es insertada en un vector de expresión adecuado, por ejemplo, pAS2 o pM3. Entonces, se construye una genoteca de ADNc humano en un vector especialmente diseñado, de modo que la inserción de ADNc humano sea fusionada a una secuencia de nucleótidos en el vector que codifique para el dominio de transcripción de la proteína Gal4. De preferencia, el vector usado es el vector pACT. Los polipéptidos codificados por las inserciones de nucleótidos de la genoteca de ADNc humano, se denominan polipéptidos "praf.

Un tercer vector contiene un gen marcador detectable, tal como el gen de beta-galactosidasa o gen CAT, que se pone bajo el control de una secuencia reguladora que es sensible a la unión de una proteína Gal4 completa que contiene el dominio de activación de la transcripción y el dominio de unión de ADN. Por ejemplo, se puede usar el vector pG5EC. Se pueden usar dos diferentes cepas de levadura. Como ejemplo ilustrativo, pero no limitativo, las dos diferentes cepas de levadura pueden ser las siguientes: Y190, cuyo fenotipo es (MATa, Leu2-3, 112 ura3-12, trpl-901, his3-D200, ade2-101, gal4Dgal180D URA3 GAL-LacZ, LYS GAL-HIS3, cyh'); Y187, cuyo fenotipo es (MATa gal4 gal80 his3 trpl-901 ade2-101 ura3-52 leu2-3, -112 URA3 GAL-IacZmet), que es el tipo de apareamiento opuesto de Y190. En resumen, 20 pg de pAS2/PAPAP y 20 pg de genoteca de ADNc de pACT, son co-transformados en la cepa de levadura Y190. Los transformantes se seleccionan para crecimiento sobre medios mínimos que carecen de histidina, leucina y triptófano, pero que contienen el inhibidor de síntesis de histidina 3-AT (50 mM). Las colonias positivas se seleccionan para beta-galactosidasa mediante prueba de elevación en filtro. Las colonias doble positivo (His+, beta-gal*), se desarrollan entonces sobre placas que carecen de histidina y leucina, pero que contienen triptófano y cicloheximida (10 mg/ml), para seleccionar para la pérdida de plásmidos pAS2/PAPAP, pero para la retención de plásmidos de la genoteca de ADNc de pACT. Las cepas .

Y190 resultantes son apareadas con las cepas Y187 que expresan PAPAP o proteínas control no relacionadas, tales como ciclofilina B, lamina o SNF1 , como fusiones Gal4, como es descrito por Harper et al. (1993) y por Bram et al. (Bram RJ et al., 1993), y seleccionadas para beta-galactosidasa mediante prueba de elevación en filtro. Los clones de levadura que son beta-gal-después del apareamiento con las fusiones de Gal4 control, son considerados como falsos positivos. En otra modalidad del método de dos híbridos de conformidad con la invención, se puede evaluar la interacción entre PAPAP, o un fragmento variante del mismo, con proteínas celulares, usando el sistema de dos híbridos 2 Matchmaker (No. de catálogo K1604-1 , Clontech). Como se describe en el manual que acompaña al sistema de dos híbridos 2 Matchmaker (No. de catálogo K 604-1 , Clontech), cuya descripción de incorpora en la presente como referencia, ácidos nucleicos que codifican para la proteína de PAPAP, o una porción de la misma, son insertados en un vector de expresión, de modo que estén en el marco de lectura con el ADN que codifica para el dominio de unión de ADN del activador de transcripción de levadura GAl_4. Un ADNc deseado, de preferencia ADNc de humano, es insertado en un segundo vector de expresión, de modo que estén en el marco de lectura con ADN que codifica para el dominio de activación de GAL4. Los dos plásmidos de expresión son transformados en levaduras, y las levaduras se siembran en medio de selección que selecciona para la expresión de marcadores seleccionabas en cada uno de los vectores de expresión, así como también expresión del gen HIS3 dependiente de GAL4. Los transformantes que son capaces de desarrollarse en el medio que carece de histidina, se seleccionan para la expresión de lacZ dependiente de GAL4. Las células que son positivas en la selección de histidina y la prueba de lacZ, contienen interacción entre PAPAP y la proteína o péptido codificado por la inserción de ADN seleccionada inicialmente.

Método para la selección de sustancias que interactúan con las secuencias reguladoras del gen PAPAP La presente invención se refiere también a un método para seleccionar sustancias o moléculas que son capaces de ¡nteractuar con la secuencia reguladora del gen PAPAP tales como, por ejemplo, secuencias de promotor o de intensificador. Acidos nucleicos que codifican para proteínas que son capaces de intera.ctuar con las secuencias reguladoras del gen PAPAP, más particularmente una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de los polinucleótidos de la región reguladora 5' y 3', o un fragmento o una variante de los mismos, y de preferencia una variante que comprende uno de los marcadores bialélicos de la invención, se pueden identificar usando un sistema de un híbrido, tal como el descrito en el folleto incluido en el equipo del sistema de un híbrido de Matchmaker, de Clontech (No. de referencia de catálogo K1603-1), cuyas enseñanzas técnicas se incorporan en la presente como referencia. En resumen, la secuencia de nucleótidos objetivo es clonada hacia el extremo 5' de una secuencia de reportero seleccionable, y la construcción de ADN resultante es integrada en el genoma de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Las células de levadura que contienen la secuencia de reportero en su genoma, son transformadas entonces con una genoteca que comprende moléculas de fusión entre moléculas de ADNc que codifican para proteínas candidatos para unión en las secuencias reguladoras del gen PAPAP, y secuencias que codifican para el dominio de activador de un factor de transcripción de levadura, tal como GAL4. Las células de levadura recombinantes se siembran en un caldo de cultivo para seleccionar las células que expresan la secuencia de reportero. Las células de levadura recombinantes seleccionadas de esta manera, contienen una proteína de: fusión que es capaz de unirse en la secuencia reguladora objetivo del gen PAPAP. Entonces, las moléculas de ADNc que codifican para las proteínas de . fusión son secuenciadas, y pueden ser clonadas en vectores de expresión o transcripción in vltro. La unión de los polipéptidos codificados con las secuencias reguladoras objetivo del gen PAPAP, se puede confirmar mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tales como pruebas de retardo en gel, o pruebas de protección ante desoxirribonucleasa. Las pruebas de retardo en gel se pueden llevar a cabo también independientemente para seleccionar moléculas candidatos que sean capaces de interactuar con las secuencias reguladoras del gen PAPAP, tal como es descrito por Fried y Crothers (1981 ), Garner y Revzin ( 981 ) y Dent y Latchman (1993), cuyas enseñanzas se incorporan en la presente como referencia. Estas técnicas se basan en el principio de acuerdo al cual, un fragmento de ADN que está unido a una proteína, migra más lento que el mismo fragmento de ADN no unido. En resumen, la secuencia de nucleótidos objetivo es marcada. Entonces, la secuencia de nucleótidos objetivo marcada se pone en contacto con un extracto nuclear total de células que contengan factores de transcripción, o con moléculas candidatos diferentes que se van a poner a prueba. La interacción entre la secuencia reguladora objetivo del gen PAPAP y la molécula candidato o el factor de transcripción, se detecta después de electrofóresis capilar o en gel a través de un retraso en la migración.

Método para seleccionar ligandos que modulan la expresión del gen PAPAP Otra materia de la presente invención, es un método para seleccionar moléculas que modulan la expresión de la proteína de PAPAP. Dicho método de selección comprende los pasos de: a) cultivar una célula procariótica o eucariótica que ha sido transfectada con una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de PAPAP, o una variante o un fragmento de la misma, puesta bajo el control de su propio promotor; b) poner en contacto la célula cultivada con una molécula que se va a poner a prueba; c) cuantificar la expresión de la proteína de PAPAP, o una variante o un fragmento de la misma. En una modalidad, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de PAPAP, o una variante o un fragmento de la misma, comprende un alelo de por lo menos uno de los marcadores bialélicos relacionados con PAPAP, y los complementos del mismo. Mediante el uso de técnicas de recombinación de ADN bien conocidas por los expertos en la técnica, la secuencia de ADN que codifica para la proteína de PAPAP, es insertada en un vector de expresión, hacia el extremo 3' de la secuencia de su promotor. Como ejemplo ilustrativo, la secuencia de promotor del gen PAPAP, está contenida en el ácido nucleico de la región reguladora 5'. La cuantificación de la expresión de la proteína de PAPAP, se puede llevar a cabo al nivel de ARN mensajero o al nivel de proteína. En el último caso, se pueden usar anticuerpos policlonales o monoclonales para cuantificar las cantidades de la proteína de PAPAP que ha sido producidas, por ejemplo, en una prueba de ELISA o RIA. En una modalidad preferida, la cuantificación del ARN mensajero de PAPAP se lleva a cabo mediante amplificación de PCR cuantitativa del ADNc obtenido mediante una transcripción inversa del ARN mensajero total de la célula hospedera cultivada transfectada por PAPAP, usando un par de iniciadores específicos para PAPAP.

La presente invención se refiere también a un método para seleccionar sustancias y moléculas que sean capaces de incrementar, o en contraste de disminuir, el nivel de expresión del gen PAPAP. Dicho método puede permitir que el experto en la técnica seleccione sustancias que ejercen un efecto regulador sobre el nivel de expresión del gen PAPAP, y las cuales pueden ser útiles como ingredientes activos incluidos en composiciones farmacéuticas para el tratamiento de pacientes que sufren de esquizofrenia, trastorno bipolar o trastornos relacionados con el sistema nervioso central. De esta manera, como parte también de ia presente invención, es un método para seleccionar una sustancia o molécula candidato que modula la expresión del gen PAPAP, este método comprendiendo los siguientes pasos: proveer una célula hospedera recombinante que contiene un ácido. nucleico, en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos en la región reguladora 5', o un fragmento biológicamente activo o variante de la misma, localizada hacia el extremo 5' de un polinucleótido que codifica para una proteína detectable; obtener una sustancia candidato; y determinar la capacidad de la sustancia candidato para modular los niveles de expresión del polinucleótido que codifica para la proteína detectable. En otra modalidad, el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la región reguladora 5', o un fragmento biológicamente activo o variante de la misma, incluye también una región 5'UTR del ADNc de PAPAP de SEQ ID No. 1 , o uno de sus fragmentos biológicamente activos o variantes del mismo. Entre los polinucleótidos preferidos que codifican para una proteína detectable, se pueden citar polinucleótidos que codifican para beta-galactosidasa, proteína fluorescente verde (GFP) y cloranfenicol acetil transferasa (CAT). La invención pertenece también a equipos útiles para llevar a cabo el método de selección descrito en la presente. De preferencia, dichos equipos comprenden un vector recombinante que permite la expresión de una secuencia de nucleotidos de la región reguladora 5' o un fragmento biológicamente activo o variante de la misma localizada hacia el extremo.5', y enlazada operablemente a un polinucleótido que codifica para una proteína. detectable o la proteína de PAPAP, o un fragmento o una variante de la misma. Otra modalidad es un método para la selección de una sustancia o molécula candidato que modula la expresión del gen PAPAP, en donde dicho método comprende los siguientes pasos: a) proveer una célula hospedera recombinante que contiene un ácido nucleico, en donde dicho ácido nucleico comprende una secuencia 5'UTR del ADNc de PAPAP de SEQ ID No. 1 , o uno de sus fragmentos biológicamente activos o variantes, la secuencia 5'UTR o su fragmento biológicamente activo o variante siendo enlazada operablemente a un polinucleótido que codifica para una proteína detectable; b) obtener una sustancia candidato; y c) determinar la capacidad de la sustancia candidato para modular los niveles de expresión del polinucleótido que codifica para la proteína detectable. En una modalidad específica del método de selección anterior, el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de la secuencia 5'UTR del ADNc de PAPAP de SEQ ID No. 1 , o uno de sus fragmentos biológicamente activos o variantes, incluye una secuencia de promotor que es endógena con respecto a la secuencia 5'UTR de PAPAP. En otra modalidad específica del método de selección anterior, el ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de la secuencia 5'UTR del ADNc de PAPAP de SEQ ID ¦ No. 1 , o uno de sus fragmentos biológicamente activos o variantes, incluye una secuencia de promotor que es exógena con respecto a la secuencia 5'UTR de PAPAP definida en la presente. En otra modalidad preferida, el ácido nucleico que comprende la secuencia 5'UTR del ADNc de PAPAP de SEQ ID No. 1 , o los fragmentos biológicamente activos de la misma, incluye un marcador bialélico relacionado con PAPAP, o los complementos del mismo.

La presente invención comprende además un equipo para la selección de una sustancia candidato que modula la expresión del gen PAPAP, en donde dicho equipo comprende un vector recombinante que comprende un ácido nucleico que incluye una secuencia 5'UTR del ADNc de PAPAP de SEQ ID No. 1 , o uno de sus fragmentos biológicamente activos o variantes, la secuencia 5'UTR o su fragmento biológicamente activo o variante estando enlazada operablemente a un polinucleótido que codifica para una proteína detectable. Para el diseño de vectores recombinantes adecuados útiles para llevar a cabo los métodos de selección descritos anteriormente, se hará referencia a la sección de la presente especificación, en donde se detallan los ¦ vectores recombinantes preferidos de la invención. Los niveles y patrones de expresión de PAPAP se pueden analizar mediante hibridación en solución con sondas largas, como se describe en la solicitud de patente internacional No. WO 97/05277, cuyos contenidos se incorporan en la presente como referencia. En resumen, el ADNc de PAPAP o el ADN genómico de PAPAP descrito anteriormente, o fragmentos del mismo, es insertado en un sitio de clonación inmediatamente hacia el extremo 3' de un promotor de ARN polimerasa de bacteriófago (T3, T7 o SP6) para producir ARN antisentido. De preferencia, la inserción de PAPAP comprende por lo menos 100 o más nucleótidos consecutivos de la secuencia de ADN genómico o las secuencias de ADNc. El plásmido es linealizado y transcrito en presencia de ribonucleótidos que comprenden ribonucleótidos modificados (es decir, biotina-UTP y DIG-UTP). Un exceso de este ARN doblemente marcado es hibridado en solución con ARN mensajero aislado de células o tejidos de interés. La hibridación se lleva a cabo bajo condiciones severas estándar (40-50°C durante 16 horas en formamida a 80%, regulador de pH de NaCI a 0.4M, pH 7-8). La sonda no hibridada es removida mediante digestión con ribonucleasa específica para ARN de cadena sencilla (es decir, ribonucleasas CL3, T1 , Phy M, U2 o A). La presencia de la modificación de biotina-UTP permite la captura del híbrido sobre una placa de microtitulación recubierta con estreptavidina. La presencia de la modificación de DIG, permite que el híbrido sea detectado y cuantificado mediante ELISA usando un anticuerpo anti-DIG acoplado con fosfatasa alcalina. El análisis cuantitativo de la expresión del gen PAPAP, se puede llevar a cabo también usando disposiciones. Como se usa en la presente, el término disposición significa una disposición dimensional, bidimensional o multidimensional de una pluralidad de ácidos nucleicos de longitud suficiente para permitir la detección específica de la expresión de moléculas de ARN mensajero capaces de hibridar con la misma. Por ejemplo, las disposiciones pueden contener una pluralidad de ácidos nucleicos derivados de genes cuyos niveles de expresión se van a evaluar. Las disposiciones pueden incluir al ADN genómico de PAPAP, las secuencias de ADNc de PAPAP, o las secuencias complementarias a las mismas o fragmentos de las mismas, en particular las que comprenden por lo menos un marcador bialélico relacionado con PAPAP. De preferencia, los fragmentos tienen por lo menos 15 nucleótidos de longitud. En otras modalidades, los fragmentos tienen por lo menos 25 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, los fragmentos tienen por lo menos 50 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, los fragmentos tienen por lo menos 100 nucleótidos de longitud. En otra modalidad preferida, los fragmentos tienen más de 100 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, los fragmentos pueden tener más de 500 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, el análisis cuantitativo de la expresión del gen PAPAP, se puede llevar a cabo con una microdisposición de ADN complementaria, como es descrito por Schena et al. (1995 y 1996). Moléculas de ADNc de PAPAP de longitud total, o fragmentos de las mismas, son amplificadas mediante PCR, y dispuestas a partir de una placa de microtítulo de 96 cavidades sobre portaobjetos sililados usando robótica de alta velocidad. Las disposiciones impresas son incubadas en una cámara húmeda que permite la rehidratación de los elementos de la disposición, y enjuagadas, una vez en SDS a 0.2% durante 1 minuto, dos veces en agua durante 1 minuto, y una vez durante 5 minutos en solución de borohidruro de sodio. Las disposiciones son sumergidas en agua durante 2 minutos a 95°C, transferidas en SDS a 0.2% durante 1 minuto, enjuagadas 2 veces con agua, secadas al aire, y almacenadas en la oscuridad a 25°C. ARN mensajero de células o tejidos es aislado u obtenido comercialmente, y se preparan sondas mediante un ciclo individual de transcripción inversa. Las sondas son hibridadas con microdisposiciones de 1 cm2 bajo un cubreobjetos de 14 x 14 mm durante 6-12 horas a 60°C. Las disposiciones se lavan durante 5 minutos a 25°C en regulador de pH de lavado de baja severidad (1 x de SSC/SDS a 0.2%), entonces durante 10 minutos a temperatura ambiente en regulador de pH de lavado de baja severidad (0.1 x de SSC/SDS a 0.2%). Las disposiciones son exploradas en 0.1 x de SSC usando un dispositivo de exploración con láser de fluorescencia adaptado con un equipo de filtración usual. Se obtienen mediciones precisas de expresión diferencial tomando el promedio de las relaciones de dos hibridaciones independientes. El análisis cuantitativo de la expresión del gen PAPAP, se puede llevar a cabo también con moléculas de ADNc de PAPAP de longitud total, o fragmentos de las mismas en disposiciones de ADN complementarias, como es descrito por Pietu et al. (1996). El ADNc de PAPAP de longitud total, o fragmentos del mismo, es amplificado mediante PCR y depositado sobre membranas. Entonces, las moléculas de ARN mensajero que se originan de varios tejidos o células son marcadas con nucleótidos radiactivos. Después de hibridación y lavado en condiciones controladas, las moléculas de ARN mensajero hibridadas son detectadas mediante formación de imágenes luminiscentes o autorradiografía. Se llevan a cabo experimentos por duplicado, y se realiza entonces un análisis cuantitativo de las moléculas de ARN mensajero expresadas diferencialmente.

En forma alternativa, el análisis de expresión usando el ADN genómico de PAPAP, el ADNc de PAPAP, o fragmentos de los mismos, se puede llevar a cabo a través de disposiciones de nucleótidos de alta densidad, como es descrito por Lockhart et al. (1996) y Sosnowsky et al. (1997). Oligonucleótidos de 15-50 nucleótidos de las secuencias del ADN genómico de PAPAP, las secuencias de ADNc de PAPAP, o las secuencias complementarias a las mismas, son sintetizados directamente sobre el chip (Lockhart et al, citado anteriormente), o sintetizados y dirigidos entonces hacia el chip (Sosnowsky et at, citado anteriormente). De preferencia,, los oligonucleótidos tienen alrededor de 20 nucleótidos de longitud. Sondas de ADNc de PAPAP marcadas con un compuesto adecuado tal como biotina, digooxigenina o colorante fluorescente, son sintetizadas a partir de la población de ARN mensajero adecuada, y entonces fragmentadas aleatoriamente hasta un tamaño promedio de 50 a 100 nucleótidos. Dichas sondas son hibridadas entonces con el chip. Después del lavado como es descrito por Lockhart et al., citado anteriormente, y aplicación de diferentes campos eléctricos (Sosnowsky et al., 1997), los colorantes o compuestos de marcación son detectados y cuantificados. Se llevan a cabo dos hibridaciones por duplicado. El análisis comparativo de la intensidad de la señal que se origina de las sondas de ADNc sobre el mismo oligonucleótido objetivo en diferentes muestras de ADNc, indica una expresión diferencial del ARN mensajero de PAPAP.

Métodos para inhibir la expresión de un gen PAPAP Otras composiciones terapéuticas de conformidad con la presente invención comprenden en forma ventajosa un fragmento de oligonucleótido de la secuencia nucleica de PAPAP, como una herramienta antisentido o una herramienta de triple hélice que inhibe la expresión del gen PAPAP correspondiente.

Alternativa antisentido Métodos preferidos que usan polinucleótidos antisentido de conformidad con la presente invención, son los procedimientos descritos por Sczakiel et al. (1995). De preferencia, las herramientas antisentido se seleccionan entre los polinucleótidos (de 15-200 pares de bases de longitud) qué- son complementarios al extremo 5' del ARN mensajero de PAPAP. En otra modalidad, se usa una combinación de diferentes polinucleótidos antisentido complementarios a diferentes partes del gen dirigido deseado. Los polinucleótidos antisentido preferidos de conformidad con la presente invención, son complementarios a una secuencia de las moléculas de ARN mensajero de PAPAP, que contiene el codón de inicio de la traducción ATG, o un sitio donador o aceptor de empalme. Los ácidos nucleicos antisentido deben tener una longitud y temperatura de fusión suficientes para permitir la formación de un dúplex intracelular que tenga estabilidad suficiente para inhibir la expresión del ARN mensajero de PAPAP en el dúplex. Estrategias para el diseño de ácidos nucleicos antisentido adecuados para su uso en terapia génica se describen en Green et al. (1986) e Izant y Weintraub (1984), cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia. En algunas estrategias, se obtienen moléculas antisentido invirtiendo la orientación de la región de codificación de PAPAP con respecto a un promotor para transcribir la cadena opuesta de la que es transcrita normalmente en la célula. Las moléculas antisentido pueden ser transcritas usando sistemas de transcripción in vitro, tales como los que usan polimerasa de T7 o SP6, para generar el transcrito. Otra alternativa consiste en la transcripción de ácidos nucleicos antisentido de PAPAP in vivo, enlazando operablemente ADN que contenga la secuencia antisentido con un promotor en un vector de expresión adecuado. En forma alternativa, estrategias antisentido adecuadas, son las descritas por Rossi et al., (1991 ) y las que se describen en las solicitudes internacionales Nos. WO 94/23026, WO 95/04141 , WO 92/18522, y en la solicitud de patente europea No. EP 0 572 287 A2. Una alternativa a la tecnología antisentido que se usa de conformidad con la presente invención, comprende el uso de ribozimas que se unirán a una secuencia objetivo mediante su cola de polinucleótidos complementaria, y que separarán el ARN correspondiente hidrolizando su sitio objetivo (a saber, las "ribozimas de cabeza de martillo"). En resumen, el ciclo simplificado de una ribozima de cabeza de martillo comprende (I) unión específica de la secuencia al ARN objetivo mediante secuencias antisentido complementarias; (2) hidrólisis específica de sitio del motivo escindible de la cadena objetivo; y (3) liberación de los productos de escisión, que da lugar a otro sitio catalítico. Por supuesto, el uso de polinucleotidos antisentido de cadena larga (de por lo menos 30 bases de longitud) o ribozimas con brazos antisentido largos, es ventajoso. Un sistema de liberación preferido para ribozimas antisentido, se logra enlazando covalentemente estas ribozimas antisentido a grupos lipofílicos, o mediante el uso de liposomas como un vector conveniente. Se preparan ribozimas antisentido preferidas de conformidad con la presente invención, como es descrito por Sczakiel et al. (1995), los procedimientos de preparación específicos que se refieren en dicho artículo, siendo incorporados en la presente como referencia.

Alternativa de triple hélice El ADN genómico de PAPAP se puede usar también para inhibir la expresión del gen PAPAP con base en la formación de triple hélice intracelular. Se usan oligonucleótidos de triple hélice para inhibir la transcripción a partir de un genoma. Son particularmente útiles para estudiar alteraciones en la actividad celular cuando está asociada con un gen en particular. En forma similar, se puede usar una porción del ADN genómico de PAPAP para estudiar el efecto de inhibir la transcripción de PAPAP dentro de una célula. Tradicionalmente, se ' consideró a las secuencias de homopurina como las de mayor utilidad para estrategias de triple hélice. Sin embargo, las secuencias de homopirimidina pueden inhibir también la expresión de los genes. Dichos oligonucleótidos de homopirimidina se unen a la ranura principal en las secuencias de homopurina: homopirimidina. De esta manera, ambos tipos de secuencias del ADN genómico de PAPAP, se contemplan dentro del alcance de esta invención. Para llevar a cabo estrategias de terapia génica usando la alternativa de triple hélice, las secuencias del ADN genómico de PAPAP son exploradas primero para identificar tramos de homopirimidina u homopurina de 10 elementos o 20 elementos que se podrían usar en estrategias basadas en triple hélice para inhibir la expresión de PAPAP. Después de la .·; identificación de los tramos de homopirimidina u homopurina candidatos, su eficiencia para inhibir la expresión de PAPAP se evalúa introduciendo cantidades variables de oligonucleótidos que contienen las secuencias candidatos en células de cultivo de tejidos que expresan el gen PAPAP. Los oligonucleótidos pueden ser introducidos en las células usando una variedad de métodos conocidos por los expertos en la técnica incluyendo, pero no estando limitados a, precipitación con fosfato de calcio, DEAE-dextrán, electroporación, transfección mediada por liposomas o captación nativa. Las células tratadas son monitoreadas para función celular alterada, o expresión de PAPAP reducida, usando técnicas tales como Northern blotting, pruebas de protección ante ribonucleasa, o estrategias basadas en PCR para monitorear los niveles de transcripción del gen PAPAP en células que han sido tratadas con el oligonucleótido. Los oligonucleótidos que son efectivos para inhibir la expresión de genes en células de cultivo de tejidos, pueden ser introducidos entonces in vivo usando las técnicas descritas anteriormente, en la alternativa antisentido, a una dosificación calculada con base en los resultados in vitro, como se describe en la alternativa antisentido. En algunas modalidades, los anómeros naturales (beta) de las unidades de oligonucleótido pueden ser reemplazados con anómeros alfa para hacer que los oligonucleótidos sean más resistentes a las nucleasas.

Además, un agente de intercalación tal como bromuro de etidio, o su similar, puede ser unido al extremo 3' del oligonucleótido alfa para estabilizar la triple . hélice. Para información sobre la generación de oligonucleótidos adecuados para la formación de triple hélice, véase Griffin et al. (1989), cita que se incorpora en la presente como referencia.

Composiciones y formulaciones farmacéuticas Compuestos moduladores de PAPAP Mediante el uso de los métodos descritos en la presente, se pueden identificar compuestos que modulan selectivamente la actividad de PAPAP, o que modulan la interacción de PAPAP-g34872 in vitro e in vivo. Los compuestos identificados mediante el procedimiento de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos que tienen carácter específico de unión por péptido de PAPAP. Se espera también que homólogos de PAPAP puedan ser útiles para modular la actividad mediada por PAPAP, y la condición fisiológica relacionada asociada con esquizofrenia o trastorno bipolar. En general, se espera que los métodos de prueba de la presente invención basados en la función de PAPAP en trastornos del sistema nervioso central, se puedan usar para identificar compuestos capaces de intervenir en la vía de enfermedad.

Indicaciones Aunque PAPAP ha demostrado una asociación con esquizofrenia y trastorno bipolar, las indicaciones que involucran a PAPAP pueden incluir varios trastornos del sistema nervioso central. Se espera que los trastornos del sistema nervioso central tengan bases genéticas complejas y que compartan con frecuencia ciertos síntomas. En particular, como se describe en la presente, las indicaciones pueden incluir esquizofrenia y otros trastornos psicóticos, trastornos neurodegenerativos, trastornos del humor, autismo, dependencia de sustancias y alcoholismo, retraso mental, y otras enfermedades psiquiátricas que incluyen trastornos cognoscitivos, de ansiedad, de la alimentación, del control de impulsos y de personalidad, como se define en la clasificación del Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders, cuarta edición (DSM-IV).

Formulaciones farmacéuticas y vías de administración Los compuestos identificados usando los métodos de la presente invención, pueden ser administrados a un mamífero, incluyendo un paciente humano, solos o en composiciones farmacéuticas en donde se mezclan con vehículos o excipientes adecuados a dosis terapéuticamente efectivas para tratar o mejorar trastornos relacionados con esquizofrenia o trastorno bipolar. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere además a esa cantidad del compuesto suficiente para dar como resultado la mejora de los síntomas, según se. determina mediante los métodos descritos en la presente. De preferencia, una dosificación terapéuticamente efectiva es adecuada para administración o uso periódico continuo. Técnicas para la formulación y administración de los compuestos de la presente invención, se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publising Co., Easton, PA, última edición.

Vías de administración Vías de administración adecuadas incluyen administración oral, rectal, transmucosa o intestinal, liberación parenteral que incluye inyección intramuscular, subcutánea e intramedular, así como también inyección intratecal, intraventricular directa, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular. Un método particularmente útil para administrar compuestos para tratar enfermedades del sistema nervioso central, consiste en la implantación quirúrgica de un dispositivo para liberar el compuesto durante un período prolongado, tal como en liberación intratecal que implica infusión en el fluido espinal a través de una bomba implantada (disponible de Medtronic, Inc., Minneapolis, MN). Se contemplan particularmente formulaciones de liberación sostenida de los medicamentos inventados.

Composición/formulación Las composiciones y los medicamentos farmacéuticos para su uso de conformidad con la presente invención, se pueden formular en forma convencional usando uno o más vehículos, fisiológicamente aceptables que comprendan excipientes y auxiliares. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida. Para inyección, los agentes de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, de preferencia en reguladores de pH fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hanks, solución de Ringer o regulador/de pH de solución salina fisiológica tal como regulador de pH de fosfato o bicarbonato. Para administración transmucosa, se usan penetrantes adecuados en la formulación para la barrera que será permeada. Dichos penetrantes se conocen generalmente en la técnica. Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar oralmente incluyen cápsulas idóneas para empuje hechas de gelatina, así como también cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plastificador, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas idóneas para empuje pueden contener los ingredientes activos en mezcla con llenadores tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los compuestos activos pueden ser disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para dicha administración. Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas en forma convencional. Para administración mediante inhalación, los compuestos para su uso de conformidad con la presente invención son liberados convenientemente en forma de una presentación de rocío en aerosol a partir de empaques presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente gaseoso adecuado, por ejemplo, dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proveyendo una válvula para liberar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina, para su uso en un inhalador o insuflador, que contengan una mezcla del compuesto en polvo y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón. Los compuestos se pueden formular para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en contenedores de dosis múltiples, con un conservador añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes. Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrán. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizadores o agentes adecuados que incrementen la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. En forma alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma liofilizada o de polvo para constitución con un vehículo adecuado, tal como agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso. Además de las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos se pueden formular también como una preparación de depósito. Dichas formulaciones de acción duradera se pueden administrar mediante implantación (por ejemplo, subcutáneamente o intramuscularmente), o mediante inyección intramuscular. De esta manera, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble. Además, los compuestos pueden ser liberados usando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contengan el agente terapéutico. Varios materiales de liberación sostenida se han establecido y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden liberar, dependiendo de su naturaleza química, los compuestos durante unas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden usar otras estrategias para la estabilización de la proteína. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender también vehículos o excipientes de fase sólida o de gel. Ejemplos de dichos vehículos o excipientes incluyen, pero no están limitados a, carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina, y polímeros tales como polietilenglicoles.

Dosificación efectiva Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en la presente invención, incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr su propósito deseado. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad efectiva para prevenir el desarrollo de, o para mejorar, los síntomas existentes del sujeto que está siendo tratando. La determinación de las cantidades efectivas está bien dentro de la aptitud de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada provista en la presente. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de pruebas de cultivo de células, y se puede formular una dosis en modelos de animales. Dicha información se puede usar para determinar en forma más precisa dosis útiles en humanos. Una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a esa cantidad del compuesto que da como resultado la mejora de los síntomas en un paciente. La toxicidad y la eficacia terapéutica de dichos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o animales experimentales, por ejemplo, determinando la LD50 (la dosis letal para 50% de la población de prueba) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos, es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación entre LD50 y ED50. Se prefieren compuestos que exhiban altos índice terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de estas pruebas en cultivo de células y estudios en animales, se pueden usar para formular una escala de dosificación para uso en humanos. La dosificación de dichos compuestos está de preferencia dentro de una escala de concentraciones circulantes que incluyen la ED50, con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de esta escala, dependiendo de la forma de dosificación usada y la vía de administración usada. La formulación, vía de administración y dosificación exactas, pueden ser elegidas por cada médico en vista de la condición del paciente (véase, por ejemplo, Fingí et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", capítulo 1 ).

Prevención, diagnóstico v tratamiento de enfermedades psiquiátricas Como se describió anteriormente, un aspecto de la presente invención se refiere a la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedad psiquiátrica, en particular esquizofrenia y trastorno bipolar. La presente invención describe de esta manera medicamentos que actúan sobre PAPAP. En modalidades preferidas, los medicamentos de la invención actúan sobre PAPAP, actuando directamente sobre PAPAP, una subunidad asociada con un complejo de PAPAP, un complejo de PAPAP-g34872, o indirectamente, actuando sobre la vía de PAPAP. Por ejemplo, los medicamentos pueden modular, y más preferiblemente disminuyen el nivel de actividad de PAPAP, que ocurre en una célula o tejido particular, o incrementan o disminuyen la actividad de la proteína de PAPAP. En ciertas modalidades, la invención comprende de esta manera el uso de un compuesto capaz de incrementar o disminuir la expresión de PAPAP o la actividad de la proteína de PAPAP, en la preparación o fabricación de un medicamento. De preferencia, dicho compuesto se usa para el tratamiento de una enfermedad psiquiátrica, de preferencia para el tratamiento de esquizofrenia o trastorno bipolar. De preferencia, dicho compuesto actúa directamente uniéndose a PAPAP, g34872, o un receptor de PAPAP. Dicho g34872 puede ser cualquier polipéptido de g34872, incluyendo el polipéptido de SEQ ID No. 5, o un polipéptido descrito en la solicitud de patente copendiente No. 09/539,333, titulada "Schizophrenia associated genes, proteins and biallelic markers", presentada el 30 de marzo de 2000. Dichos medicamentos pueden incrementar o disminuir también la actividad de un compuesto análogo a PAPAP, un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 25% de identidad de aminoácidos con la secuencia de SEQ ID No. 2, un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos- que tiene por lo menos 50% de identidad de aminoácidos con la secuencia de SEQ ID No. 2, y un compuesto que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de aminoácidos con la secuencia de SEQ ID No. 2. Medicamentos que incrementen o diminuyan la actividad de estos compuestos en un individuo, se pueden usar para mejorar o prevenir síntomas en individuos que sufren de, o están predispuestos a, una enfermedad psiquiátrica, como se describe en la presente.

En forma alternativa, la actividad de PAPAP se puede incrementar o disminuir mediante la expresión de los genes que codifican para los compuestos identificados que modulan la actividad de PAPAP, usando terapia génica. Ejemplos de vectores y promotores adecuados para su uso en terapia génica, se describieron anteriormente. La actividad de PAPAP se puede incrementar o disminuir también preparando un anticuerpo que se une a un péptido de PAPAP, un receptor de PAPAP, o una proteína relacionada con el mismo, así como también fragmentos de estas proteínas. Dichos anticuerpos pueden modular la interacción entre PAPAP y un receptor de PAPAP, o una proteína relacionada con el mismo. Anticuerpos y métodos para obtenerlos, se describen también en la presente. Como se describió anteriormente, la presente invención provee pruebas en células para identificar compuestos para el tratamiento de enfermedad psiquiátrica. Las pruebas se basan en la detección de la expresión de PAPAP, medición de la actividad de la proteína de PAPAP, o se basan en la determinación de otros puntos finales adecuados de esquizofrenia, trastorno bipolar o un trastorno psiquiátrico relacionado. Los compuestos para el tratamiento de enfermedad psiquiátrica, incluyen proteínas o péptidos derivados que sean capaces de inhibir la actividad de una proteína de PAPAP de tipo silvestre, los cuales se pueden identificar determinando su capacidad para unirse a una proteína de PAPAP de tipo silvestre. Los compuestos incluyen también anticuerpos y pequeñas moléculas y fármacos que se pueden obtener usando varias alternativas de síntesis conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo técnicas basadas en química combinatoria. Métodos para identificar compuestos, y métodos para preparar formulaciones y administrar medicamentos, se describen también en la presente.

PAPAP en métodos de diagnóstico o detección de predisposición a trastornos del SNC Los individuos afectados por, o predispuestos a, esquizofrenia, trastorno bipolar o un trastorno relacionado, pueden expresar niveles anormales de PAPAP. Los individuos que tienen actividad de PAPAP incrementada o disminuida en su plasma, fluidos corporales o tejidos del cuerpo, pueden estar en riesgo de desarrollar esquizofrenia, trastorno bipolar, o una variedad de trastornos del SNC o condiciones psiquiátrica relacionadas con el mecanismo común de enfermedad. Un aspecto de la presente invención, es un método para determinar si un individuo está en riesgo de sufrir, o está sufriendo actualmente, dicho trastorno (por ejemplo, esquizofrenia, trastorno bipolar u otros trastornos psicóticos, trastornos del humor, autismo, dependencia de sustancias o alcoholismo, retraso mental, u otras enfermedades psiquiátricas que incluyen trastornos cognoscitivos, de ansiedad, de la alimentación, del control de impulsos y de personalidad, como se define en la clasificación del Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders, cuarta edición (DSM-IV), el cual comprende determinar si el individuo tiene un nivel anormal de actividad de PAPAP, incluyendo actividad de la proteína de PAPAP y/o expresión del ARN mensajero de PAPAP, o nivel anormal de la proteína de PAPAP en plasma, fluidos corporales, o tejidos del cuerpo. El nivel de PAPAP o compuestos análogos en plasma, fluidos corporales o tejidos del cuerpo, se puede determinar usando varias alternativas. En particular, el nivel de proteína de PAPAP se puede determinar usando, por ejemplo, Western blots o electrofóresis de proteínas. La detección de PAPAP se puede llevar a cabo también usando un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de PAPAP de la invención. La detección de la unión específica al anticuerpo, indica la presencia de un polipéptido de PAPAP en la muestra (por ejemplo, mediante ELISA). Esto podría reflejar un estado patológico asociado con PAPAP. ¦ En otro aspecto, uno o más marcadores bialélicos de PAPAP, polimorfismos o variantes del mismo, se pueden usar también para desarrollar pruebas de diagnóstico capaces de identificar a individuos que expresan una característica detectable como resultado de un genotipo específico, o individuos cuyo genotipo los pone en riesgo de desarrollar una característica detectable en un tiempo subsecuente. La característica analizada usando los presentes diagnósticos, se puede usar para diagnosticar cualquier característica detectable, incluyendo predisposición a esquizofrenia o trastorno bipolar o un trastorno relacionado, tal como los descritos en los ejemplos anteriores, edad de inicio de síntomas detectables, una respuesta benéfica a, o efectos secundarios relacionados con, el tratamiento contra uno de dichos trastornos. Dicho diagnóstico puede ser útil en el monitoreo, pronóstico y/o terapia profiláctica o curativa del trastorno. Estas técnicas de diagnóstico se basan en el conocimiento de la secuencia de ácido nucleico de PAPAP, y pueden usar varias metodologías para determinar si un sujeto de prueba tiene un genotipo asociado con un riesgo incrementado de desarrollar una característica detectable, o si el individuo sufre de una característica detectable como resultado de una mutación particular, incluyendo métodos que permiten el análisis de cromosomas individuales para haplotipificación, tales como estudios familiares, análisis de ADN del semen, o híbridos somáticos. Estas técnicas de diagnóstico pueden implicar la detección de alelos específicos presentes dentro de la secuencia de PAPAP, en las secuencias reguladoras de PAPAP o, en general, en la región del cromosoma humano 13q33. Más particularmente, la invención se refiere a la detección de un ácido nucleico que comprende por lo menos una de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID Nos. 1 ó 3, o un fragmento de las mismas, o una secuencia complementaria a las mismas. Estos métodos implican obtener una muestra de ácido nucleico del individuo, y determinar si la muestra de ácido nucleico contiene por lo menos un alelo o por lo menos un haplotipo de marcador bialélico, indicativo de un riesgo de desarrollar la característica, o indicativo de que el individuo expresa la característica como resultado de poseer una mutación o polimorfismo particular (alelo que causa la característica) relacionado con PAPAP.

El diagnóstico se puede basar en un marcador bialélico individual, o en un grupo de marcadores bialélicos. En cada uno de estos métodos, se obtiene una muestra de ácido nucleico del sujetó de prueba, y se determina el patrón de marcador bialélico de uno o más de un marcador bialélico de la invención. En una modalidad, se lleva a cabo una amplificación de PCR en la muestra de ácido nucleico, para amplificar regiones en las cuales se han identificado polimorfismos asociados con un fenotipo detectable. Los productos de amplificación son secuenciados para determinar si el individuo posee uno o más polimorfismos relacionados con PAPAP asociados con un fenotipo detectable. En forma alternativa, la muestra de ácido nucleico se somete a reacciones de microsecuenciación para determinar si el individuo posee uno o más polimorfismos relacionados con PAPAP asociados con un fenotipo detectable que resulta de una mutación o un polimorfismo en el gen PAPAP humano. En otra modalidad, la muestra de ácido nucleico se pone en contacto con una o más sondas de oligonucleótido específicas de alelos, las cuales hibridan específicamente con uno o más alelos relacionados con PAPAP asociados con un fenotipo detectable. En otra modalidad, la muestra de ácido nucleico se pone en contacto con un segundo oligonucleótido capaz de generar un producto de amplificación cuando se usa con el oligonucleótido específico de alelos en una reacción de amplificación. La presencia de un producto de amplificación en la reacción de amplificación, indica que el individuo posee uno o más alelos relacionados con PAPAP asociados con un fenotipo detectable. En una modalidad preferida, la característica detectable es esquizofrenia o trastorno bipolar. Los equipos de diagnóstico comprenden cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención. Estos métodos de diagnóstico son extremadamente valiosos ya que, en ciertas circunstancias, se pueden usar para iniciar tratamientos preventivos, o para permitir que un individuo que posee un haplotipo significativo prevenga signos de advertencia, tales como síntomas menores. El diagnóstico, el cual analiza y predice una respuesta a un fármaco o efectos secundarios a un fármaco, se puede usar para determinar si un individuo se debe tratar con un fármaco particular. Por ejemplo, si el diagnóstico indica una probabilidad de que un individuo responderá positivamente al tratamiento con un fármaco particular, el fármaco se puede' administrar al individuo. A la inversa, si el diagnóstico indica que un individuo probablemente responderá en forma negativa al tratamiento con un fármaco particular, se puede prescribir un curso de tratamiento alternativo. Una respuesta negativa se puede definir como la ausencia de una respuesta eficaz o la presencia de efectos secundarios tóxicos. Las pruebas clínicas del fármaco representan otra aplicación para los métodos de diagnóstico de la presente invención. Uno o más marcadores indicativos de respuesta a un agente que actúa contra esquizofrenia o a efectos secundarios a un agente que actúa contra esquizofrenia, se pueden identificar usando los métodos descritos anteriormente. Después, se pueden seleccionar participantes potenciales en pruebas clínicas de dicho agente para identificar a los individuos que probablemente responderán en forma favorable al fármaco, y para excluir a los que probablemente experimentarán efectos secundarios. De esta manera, la eficacia de la farmacoterapia se puede medir en individuos quienes responden positivamente al fármaco, sin disminuir la medición como resultado de la inclusión de individuos que probablemente responderán en forma positiva en el estudio, y sin problemas de seguridad arriesgados no deseables.

Prevención y manejo de la enfermedad Debido al riesgo de suicidio, por ejemplo, es muy importante la detección de susceptibilidad a esquizofrenia y trastorno bipolar, así como también otra enfermedad psiquiátrica en individuos. Por consiguiente, la invención se refiere a un método para el tratamiento de un trastorno del SNC que incluye en particular esquizofrenia o trastorno bipolar, o un trastorno relacionado con los mismos, el cual comprende los siguientes pasos: - seleccionar un individuo cuyo ADN comprende alelos de un polimorfismo relacionado con PAPAP, marcador bialélico, o de un grupo de marcadores bialélicos, o quien presenta expresión normal del ARN mensajero de PAPAP o actividad de proteína de PAPAP asociada con un trastorno del SNC; - dar seguimiento a dicho individuo para la presencia (y opcionalmente el desarrollo) de los síntomas relacionados con dicho trastorno del SNC; y - administrar un tratamiento que actúe contra el trastorno del SNC o contra síntomas del mismo, a dicho individuo en una etapa adecuada de la enfermedad. Otra modalidad de la presente invención, comprende un método para el tratamiento de un trastorno del SNC, el cual comprende los siguientes pasos: - seleccionar un individuo cuyo ADN comprende alelos de un polimorfismo relacionado con PAPAP, marcador bialélico o de un grupo de marcadores bialélicos, o quien presenta expresión anormal del ARN mensajero de PAPAP o actividad de proteína de PAPAP asociada con un trastorno del SNC; - administrar un tratamiento preventivo de dicho trastorno del SNC a dicho individuo. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de un trastorno del SNC, el cual comprende los siguientes pasos: - seleccionar un individuo cuyo ADN comprende alelos de un polimorfismo relacionado con PAPAP, marcador bialélico o de un grupo de marcadores bialélicos, o quien presenta expresión anormal del ARN mensajero de PAPAP o actividad de proteína de PAPAP asociada con un trastorno del SNC; - administrar un tratamiento preventivo de un trastorno del SNC a dicho individuo; - dar seguimiento a dicho individuo para la presencia y el desarrollo de síntomas de dicho trastorno del SNC; y opcionalmente - administrar un tratamiento que actúe contra dicho trastorno del SNC, o contra síntomas del mismo, a dicho individuo en una etapa adecuada de la enfermedad. Para su uso en la determinación del curso de tratamiento de un individuo que sufre de enfermedad, la presente invención se refiere también a un método para el tratamiento de un trastorno del SNC, el cual comprende los siguientes pasos: - seleccionar un individuo que sufre de esquizofrenia o trastorno bipolar, cuyo ADN comprende alelos de un polimorfismo relacionado con PAPAP, marcador bialélico o de un grupo de marcadores bialélicos, o quien presenta expresión anormal del ARN mensajero de PAPAP o actividad de proteína de PAPAP asociada con la gravedad de un trastorno del SCN, o de síntomas del mismo; y - administrar un tratamiento que actúe contra dicho trastorno del SCN o síntomas del mismo, a dicho individuo. La invención se refiere también a un método para el tratamiento de un trastorno del SCN en una población seleccionada de individuos. El método comprende: - seleccionar un individuo que sufre de un trastorno del SCN y cuyo ADN comprende alelos de un polimorfismo relacionado con PAPAP, marcador bialélico o de un grupo de marcadores bialélicos, o quien presenta expresión anormal del ARN mensajero de PAPAP o actividad de proteína de PAPAP asociada con una respuesta positiva al tratamiento con una cantidad efectiva de un medicamento que actúa contra dicho trastornos del SNC o síntomas del mismo, y/o cuyo ADN no comprende alelos de un polimorfismo relacionado con PAPAP, marcador bialélico o de un grupo de marcadores bialélicos, o quien presenta expresión anormal del ARN mensajero de PAPAP o actividad de proteína de PAPAP asociada con una respuesta negativa al tratamiento con dicho medicamento; y - administrar, a intervalos adecuados, una cantidad efectiva de dicho medicamento a dicho individuo seleccionado. En el contexto de la presente invención, se puede definir que una "respuesta positiva" a un medicamento comprende una reducción de los síntomas relacionados con la enfermedad. En el contexto de la presente invención, se puede definir que una "respuesta negativa" a un medicamento comprende una falta de respuesta positiva al medicamento, que no lleva a una reducción de los síntomas o que lleva a un efecto secundario observado después de la administración del medicamento. Los trastornos del SNC preferidos en los métodos de la invención, son esquizofrenia y trastorno bipolar. Sin embargo, la presente invención comprende también cualquiera de los métodos de prevención, diagnóstico, pronóstico y tratamiento descritos en la presente, el método de prevención, diagnóstico, manejo y tratamiento relacionados con trastornos, en particular trastornos relacionados con el SCN. A manera de ejemplo, los trastornos relacionados pueden comprender trastornos psicóticos, trastornos del humor, autismo, dependencia de sustancias o alcoholismo, retraso mental, y otras enfermedades psiquiátricas que incluyen trastornos cognoscitivos, de ansiedad, de la alimentación, del control de impulsos y de personalidad, como se define en la clasificación del Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders, cuarta edición (DSM-IV). La invención se refiere también a un método para determinar si un sujeto probablemente responderá en forma positiva al tratamiento con un medicamento. El método comprende identificar una primera población de individuos que responde positivamente a dicho medicamento, y una segunda población de individuos que. responde negativamente a dicho medicamento. Se identifican uno o más marcadores bialélicos en la primera población que está asociada con una respuesta positiva a dicho medicamento, o se identifican uno o más marcadores bialélicos en la segunda población que está asociada con una respuesta negativa a dicho medicamento. Los marcadores bialélicos se pueden identificar usando las técnicas que se describen en la presente. Una muestra de ADN se obtiene entonces del sujeto que se va a poner a prueba. La muestra de ADN se analiza para determinar si comprende alelos de uno o más marcadores bialélicos asociados con una respuesta positiva al tratamiento con el medicamento, y/o alelos de uno o más marcadores bialélicos asociados con una respuesta negativa al tratamiento con el medicamento. En algunas modalidades, el medicamento se puede administrar al sujeto en una prueba clínica si la muestra de ADN contiene alelos de uno o más marcadores bialélicos asociados con una respuesta positiva al tratamiento con el medicamento, y/o si la muestra de ADN carece de alelos de uno o más marcadores bialélicos asociados con una respuesta negativa al tratamiento con el medicamento. En modalidades preferidas, el medicamento es un fármaco que actúa contra esquizofrenia o trastorno bipolar. Mediante el uso del método de la presente invención, se puede llevar a cabo la evaluación de la eficacia del fármaco en una población de individuos que probablemente responde en forma favorable al medicamento; . Otro aspecto de la invención es un método para usar un medicamento, el cual comprende obtener una muestra de ADN de un sujeto, determinar si la muestra de ADN contiene alelos de uno más marcadores bialélicos asociados con una respuesta positiva la medicamento, y/o si la muestra de ADN contiene alelos de uno o más marcadores bialélicos asociados con una respuesta negativa al medicamento, y administrar el: medicamento al sujeto si la muestra de ADN contiene alelos de uno o más marcadores bialélicos asociados con una respuesta positiva al medicamento, y/o si la muestra de ADN carece de alelos de uno o más marcadores bialélicos asociados con una respuesta negativa al medicamento.

La invención se refiere también a un método para la prueba clínica de un medicamento, de preferencia un medicamento que actúa contra esquizofrenia o trastorno bipolar, o síntomas de los mismos. El método comprende los siguientes pasos: - administrar un medicamento, de preferencia un medicamento susceptible de actuar contra esquizofrenia o trastorno bipolar, o síntomas de los mismos, a una población heterogénea de individuos, - identificar una primera población de individuos que responden = positivamente a dicho medicamento, y una segunda población de individuos que responden negativamente a dicho medicamento, identificar marcadores bialélicos en dicha primera población, que estén asociados con una respuesta positiva a. dicho medicamento, - seleccionar individuos cuyo ADN comprenda marcadores bialélicos asociados con una respuesta positiva a dicho medicamento, y - administrar dicho medicamento, a dichos individuos. Se considera que dichos métodos son extremadamente útiles para incrementar la relación de beneficio/riesgo que resulta de la administración de medicamentos que pueden causar efectos secundarios no deseables, y/o que son ineficaces para una porción de la población de pacientes a la cual se administran normalmente. Una vez que se ha diagnosticado que un individuo sufre de esquizofrenia o trastorno bipolar, se llevan a cabo pruebas de selección para determinar si el ADN de este individuo comprende alelos de un marcador bialélico, o de un grupo de marcadores bialélicos asociados con una respuesta positiva al tratamiento, o con una respuesta negativa al tratamiento que puede incluir efectos secundarios o insensibilidad. La selección del paciente que se va a tratar usando el método de la presente invención, se puede llevar a cabo mediante los métodos de detección descritos anteriormente. Los individuos que se seleccionarán, son de preferencia aquellos cuyo ADN nb comprende alelos de un marcador bialélico o de un grupo de marcadores bialélicos asociados con una respuesta negativa al tratamiento. El conocimiento de la predisposición genética de un individuo a insensibilidad o efectos secundarios a medicamentos particulares, le permite al médico clínico dirigir al tratamiento hacia fármacos adecuados, contra esquizofrenia o trastorno bipolar, o síntomas de los mismos. Una vez que se han determinado las predisposiciones genéticas del paciente, el médico clínico puede seleccionar el tratamiento adecuado para el cual no se ha reportado una respuesta negativa, en particular efectos secundarios, o se ha reportado sólo marginalmente para el paciente. A lo largo de esta solicitud, se citan varias publicaciones, patentes y solicitudes de patente publicadas. Las descripciones de estas publicaciones, patentes y especificaciones de patente publicadas referidas en esta solicitud, se incorporan de esta manera como referencia en la presente descripción, para describir en más detalle el estado de la técnica a la cual esta invención pertenece.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Prueba de unión del receptor in situ (tinción de células) Construcción de una fusión de AP Se creó una fusión en el marco de lectura de una secuencia de ADNc que codifica para la secuencia de aminoácidos del péptido de PAP (SEQ ID No. 5) con el C-terminal de fosfatasa alcalina (AP) secretada, en un vector de expresión pAPtag. La secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de : la secuencia de proteína (de fusión) insertada en el vector, se muestra en SEQ ID Nos. 4 y 6, respectivamente. Este vector contiene una secuencia de señal de secreción localizada hacia el extremo 5' de la inserción que dirige la proteína de fusión . que será secretada en los medios. Los medios que contienen la proteína de fusión pueden ser recogidos, puestos a prueba para actividad de AP, y usados en la prueba de receptor/ligando in situ. La proteína de fusión de AP fue transfectada entonces en células 293T, y se seleccionaron transfectantes estables mediante resistencia a Zeocin. Los medios de las células que contenían a los transfectantes estables, fueron colectados cada 3 días, y puestos a prueba para actividad de AP.

Estos medios que contienen la fusión de AP, se usan subsecuentemente para la prueba de unión del receptor in situ, como se indica a continuación.

Se construyó una genoteca de ADNc del cerebro humano usando el equipo de síntesis de ADNc Stratagene. El ADNc fue clonado en el vector de expresión de mamífero pMT21-neo (GenHunter). El ADN de plásmido fue obtenido de grupos de -1000 colonias usando el equipo QiaPrep Spin Miniprep (Qiagen). Estos grupos de ADN fueron entonces transfectados transitoriamente en células COS-1 como se indica. Dos microgramos de ADN de cada grupo de moléculas de ADNc de cerebro humano, fueron diluidos en 200 µ? de medio libre de suero (medio DMEM de Gibco-BRL sin aditivos). El ADN fue combinado con el reactivo PLUS, añadiendo 12 µ? de reactivo PLUS (mezclado antes de su uso) al ADN en medio libre de suero. Se añadieron 200 µ? dé los complejos de reactivo ADN-PLUS-Lipofectamine a las cavidades que contenían células Cos-1 sembradas a 0.25 x 105 células por cavidad en placas de 6 cavidades (35 mm), el día previo a la transfección (en medio completo que no contenía antibióticos). Antes de la adición del complejo de ADN/Lipofectamine/PLUS, el medio completo fue removido de las células, y reemplazado con 800 µ? de medio libre de suero. Las células fueron incubadas a 37°C en C02 a 5% durante 3 horas; entonces, el medio en cada cavidad fue reemplazado con 2 mi de medio completo.

Clonación del receptor a partir de la prueba de receptor/ligando La proteína de fusión de AP secretada se usó como sonda para clonar PAPAP mediante una estrategia de clonación de expresión.

Dos días después de la transfección, comenzó la tinción de las células. Se removió el medio de cultivo de las células en las placas de 6 cavidades. Las células adheridas fueron lavadas una vez con 2 mi de regulador de pH de lavado HBHA ((50 mi de 10 x de HBSS (1 X), 0.25 gramos de BSA (0.5 mg/ml), 0 mi de HEPES a 1M, pH 7.5 (20 mM), llevadas a 500 mi con dH20)), e incubadas durante 90 minutos a temperatura ambiente con 2 mi de medio que contenía proteína de fusión de PAP-AP, o medio que contenía AP (como control negativo). El medio fue removido, y la muestra fue lavada por lo menos 5 veces con 2 mi de regulador de pH HBHA. durante un período de 10 minutos. El regulador de pH de HBHA fue removido por completo, y las células fueron fijadas durante 30 segundos con 2 mi de reactivo de fijación (acetona a 60%, formaldehído a 3%, HEPES a 20 mM, pH 7.5). El reactivo de fijación fue removido de inmediato, y la muestra fue lavada 2 veces usando 2 mi de regulador de pH HS por cavidad ((15 mi de NaCI a 5. M (150 mM), 10 mi de HEPES a 1M, pH 7.5 (20 mM), llevada a 500 mi con dH20)). La muestra fue incubada en regulador de pH HS a 65°C durante 100 minutos, para inactivar con calor la AP endógena. El regulador de pH HS fue removido, y la actividad de la AP unida a la superficie de las células fue teñida con 1 mi de reactivo de prueba de AP (50 mi de Tris-HCI a 1M, pH 9.5 (100 mM), 10 mi de NaCI a 5M (100 mM), 2.5 mi de MgCI2 a 1 M (5 mM), llevado a 500 mi, al cual se añadió NBT a una concentración final de 0.33 mg/ml y BCIP, a una concentración final de 0.17 mg/ml.

Puesto que se detectó un clon positivo, la prueba se repitió usando grupos más pequeños de moléculas de ADNc, hasta que se identificara un clon individual (el ácido nucleico de PAPAP).

EJEMPLO 2 Preparación de composiciones de anticuerpo para la proteína de PAPAP Se aislan proteínas o polipéptidos sustancialmente puros a partir de células transfectadas o transformadas que contienen un . vector de expresión que codifica para la proteína de PAPAP, o una porción de la misma. ¦ La concentración de la proteína en la preparación final se ajusta, por ejemplo, mediante concentración en un dispositivo de filtración Amicon, hasta el nivel, de unos cuantos microgramos/ml. Se pueden preparar entonces anticuerpos monoclonales o policlonales para la proteína, de la manera siguiente: A. Producción de anticuerpos monoclonales mediante fusión de hibridomas Se pueden preparar anticuerpos monoclonales para epítopes en la proteína de PAPAP, o una porción de la misma, a partir de hibridomas de murino de acuerdo al método clásico de Kohier, G. y Miistein, C. (1975), o métodos derivados del mismo. Véase también Harlow, E. y D. Lañe, 988. En resumen, un ratón es inoculado repetitivamente con unos cuantos microgramos de la proteína de PAPAP, o una porción de la misma, durante un período de unas cuantas semanas. El ratón es sacrificado entonces, y se aislan las células del bazo que producen anticuerpos. Las células del bazo se fusionan mediante polietilenglicol con células de mieloma de ratón, y el exceso de células no fusionadas es destruido mediante crecimiento del sistema sobre medios selectivos que comprenden aminopterina (medios de HAT). Las células fusionadas con éxito son diluidas, y se colocan alícuotas de la dilución en las cavidades de una placa de microtítulo, en donde continúa el crecimiento del cultivo. Los clones que producen anticuerpos son identificados mediante detección de anticuerpo en el fluido sobrenadante a las cavidades mediante procedimientos de . : inmunoensayo tales como ELISA, como es descrito originalmente por Engvall (1980), y métodos derivados del mismo. Los clones positivos seleccionados ¦¦ pueden ser expandidos y se puede cosechar su producto de anticuerpos monoclonales para su uso. Procedimientos detallados para la producción de anticuerpos monoclonales, se describen en Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology. Elsevier, New York, sección 21-2.

B. Producción de anticuerpos policlonales mediante inmunización Se puede preparar antisuero policlonal que contenga anticuerpos para epítopes heterogéneos en la proteína de PAPAP o una porción de la misma, inmunizando a animales no humanos adecuados con la proteína de PAPAP o una porción de la misma, la cual puede ser no modificada o modificada para mejorar su inrnunogenicidad. Un animal no humano adecuado seleccionado es de preferencia un mamífero no humano, usualmente un ratón, rata, conejo, cabra o caballo. En forma alternativa, se puede usar una preparación cruda que ha sido enriquecida para concentración de PAPAP para generar anticuerpos. Dichas proteínas, fragmentos o preparaciones, se introducen en el mamífero no humano en presencia de un adyuvante adecuado (por ejemplo, hidróxido de aluminio, RIBI, etc) que sea conocido en la técnica. Además, la proteína, fragmento o preparación se puede pre-tratar con un agente que incremente la antigenicidad; dichos agentes se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, albúmina de suero de bovino metilada (mBSA), albúmina de suero de bovino (BSA), antígeno de superficie de hepatitis B y hemocianina de lapa (KLH). El suero del animal inmunizado es recogido, tratado y puesto ¡a- prueba de acuerdo a procedimientos conocidos. Si el suero contiene anticuerpos policlonales para epítopes no deseados, los anticuerpos policlonales se pueden purificar mediante cromatografía de ¡nmunoafinidad. La producción efectiva de anticuerpos policlonales es afectada por muchos factores relacionados con el antígeno y la especie hospedera. Asimismo, los animales hospederos varían en respuesta al sitio de inoculación y la dosis, con dosis inadecuadas o excesivas de antígeno dando como resultado antisueros de bajo título. Dosis pequeñas (nivel de nanogramos) de antígeno administradas en sitios intradérmicos múltiples, parecen ser más confiables. Técnicas para producir y procesar antisueros policlonales, se conocen en la materia; véase, por ejemplo, Mayer y Walker (1987). Un protocolo de inmunización efectiva para conejos se puede encontrar en Vaitukaitis, J. et al. (1971 ). Se pueden administrar inyecciones de refuerzo a intervalos regulares, y se puede cosechar el antisuero cuando ei título de anticuerpo de los mismos, determinado semicuantitativamente, por ejemplo, mediante inmunodifusión doble en agar contra concentraciones conocidas del antígeno, comienza a disminuir. Véase, por ejemplo, Ouchterlony, O. et al. (1973). La concentración en meseta del anticuerpo, está usualmente en la escala de 0.1 a 0.2 mg/ml de suero (alrededor de 12 µ?). La afinidad de los antisueros por el antígeno se determina preparando curvas de unión competitiva como es descrito, por ejemplo, por Fisher, D. (1980). Preparaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo al protocolo de anticuerpos monodonales o policlonales, son útiles en ¡nmunoensayos cuantitativos que determinan las concentraciones de sustancias que poseen antígenos en muestras biológicas; se usan también semicuantitativamente o cualitativamente para identificar la presencia de antígenos en una muestra biológica. Los anticuerpos se pueden usar también en composiciones terapéuticas para destruir células que expresan la proteína, o que reducen los niveles de la proteína en el cuerpo. Aunque se ha ilustrado y descrito la modalidad preferida de la invención, se apreciará que los expertos en la técnica pueden hacer varios cambios en la presente sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención.

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Asn Met Thr Asp Lys 60 65 70 gca cct ctg gtg tet aac tcc cea aag acá atg agt taa gggagagaat 354 Ala Pro Leu Val Ser Asn Ser Pro Lys Thr Met Ser * 75 80 85 aggaacggcg gtaacagtta ttggcaaaaa gcatgaaaag agaaagcact ttgaaattta 414 ttactagctt gtacccacga tgaaatcaac aacctgtatc tggtatatgc ccggagacag 474 attaggcgaa ggaggaagag agagagaaga aaggcttggg ccctctacaa ataaaataaa 534 aaaaaaaaat ttaaaataat aaaatcccta tateccatat aagaataaaa gagtctcagt 594 gcagtattgg caaaattaaa tccatttctt tttaatacgg gaatattggc attatagatc 654 tggattttga ccacttaatg aagcggcacc ccaggtgttt tgaggtgttg gcattcttcg 714 ctgatttggc tgttcccaat gtttacatta tttaatcttg caaaaatggt tctgtgcact 774 tggatgtgaa atgctgtcca gttttatttt ttttatgttg ttatccttgg atgtacaaaa 834 aattcagaaa atgatctctg tagatattct gttttatttt ggtcatcttt agaagttatc 894 aggaatgtgt ttaaaacaag aagagaactt ttctaaggaa tgatacatag aaaagatttt 954 attttaaaat gagttgtaaa gcttgtgttt ctttgttgct gcaagctatc tgcccaagtt 1014 aatgcaaatg gacacatttt ttatgtcaga aaaacacaca cacacacaca cacacacaca 1074 cacacacacg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1104 <210> 2 <211 > 85 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Trp Glu Val Leu Pro Tyr Gly Asp Glu Lys Leu Ser Pro Tyr Gly 1 5 10 15 Asp Gly Gly Asp Val Gly Gln lie Phe Ser Cys Arg Leu Gln Asp Thr 20 25 30 Asn Asn P e Phe Gly Ala Gly Gln Asn Lys Arg Pro Pro Lys Leu Gly 35 40 45 Gln lie Gly Arg Ser Lys Arg Val Val lie Glu Asp Asp Arg lie Asp 50 55 60 Asp Val Leu Lys Asn Met Thr Asp Lys Ala Pro Leu Val Ser Asn Ser 65 70 75 80 Pro Lys Thr Met Ser 85 <210> 3 <211> 3189 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 3 ccctcccctc cccctccgcc cctcgcagcc ccgccgctcg cagctcccag tctgcctccc 60 cgaaccggcg ccgccgcccg cactcgccgc aggaccggcc cgcccggctc ccggggtgcg 120 ccctcctcgg tcccgcgccc tccgggctcg cagggacgtc tcctccctcc cggctcgcgg 180 ccccgcccgg cccggccccc gcccagagcc ccagcgcgcc gaggatgtga gtcctgctcg 240 cctctggcgg agcagcagcc actcgcgcgc ggagccggag cgcagcgcag cgcagccgcg 300 ggcgctctcc gggccgctcg cgcgagtgcc gcgctcttgc cctagcggcg tcccccggcc . 360 tctcgccggc gccaccgccg cagcagcccg cgggccgtcc ccggccggcc gcccccggcc · 420 ccagcgccgc tgaccctgtc cgccgcgggc ggggacgcgg tcggaggagg cgccgcggcg 480 gagcccccgg acgcgaccat gtcggaggtg ctgccctacg gcgacgagaa gctgagcccc 540 tacggcgacg gcggcgacgt gggccagatc ttctcctgcc gcctgcagga caccaacaac 600 ttcttcggcg ccgggcagaa caagcggccg cccaagctgg gccagatcgg ccggagcaag 660 c999gtgagt tcgcggcccc cttgtctgac accccctttt tcccgcgccg cggcctgaac 720 aagggttgcg gaggtctccc acccgctgga gcccgttcag acctgacgga atcccttctt 780 gcagaattgg gggatcccgc actgcgggtc cggctgaagc gggtcgcagg aacgcgtccc 840 cctaagccgg' atccccggct gggtcaccct 99999s9 99 cggcttctag cagcagctgg 900 gggtctccac ccgcgcggca aagtttgctt tttgatttgc gccccccacc cccgcctttt 960 gcgcagtgta gtcacagctg cactcgctcc ataaccctgt ggggaggggg gcccaaggac 1020 ccccagggga cggcgtgggg acctgcgtgg ggaggatccc attcctgcgg ggaaggctag 1080 ggtgttcggg tcgcacgggc ttttcattgt tacttggctt gggagggggt ttgccaggcc 1140 tgggcgatcc gcgcgagagc tggaaaagcc ccagagaggc ggagacgcag agaggctccg 1200 agaggagctc cagagacgcg gggacaatga 99gg9acc9a 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tcaagggcaa cttccagacc 540 20 attggcttga gtgcagccgc ccgctttaac cagtgcaaca cgacacgcgg caacgaggtc .600 atctccgtga tgaatcgggc caagaaagca gggaagtcag tgggagtggt aaccaccaca 660 cgagtgcagc acgcctcgcc agccggcacc tacgcccaca cggtgaaccg caactggtac 720 tcggacgccg acgtgcctgc ctcggcccgc caggaggggt gccaggacat cgctacgcag 780 ctcatctcca acatggacat tgacgtgatc ctaggtggag gccgaaagta catgtttccc 840 atgggaaccc cagaccctga gtacccagat gactacagcc aaggtgggac caggctggac 900 gggaagaatc tggtgcagga atggctggcg aagcgccagg gtgcccggta tgtgtggaac 960 cgcactgagc tcatgcaggc ttccctggac ccgtctgtga cccatctcat gggtctcttt 1020 gagcctggag acatgaaata cgagatccac cgagactcca cactggaccc ctccctgatg 1080 gagatgacag aggctgccct gcgcctgctg agcaggaacc cccgcggctt cttcctcttc 1140 gtggagggtg gtcgcatcga ccatggtcat catgaaagca gggcttaccg ggcactgact 1200 gagacgatca tgttcgacga cgccattgag agggcgggcc agctcaccag cgaggaggac 1260 acgctgagcc tcgtcactgc cgaccactcc cacgtcttct ccttcggagg ctaccccctg 1320 cgagggagct ccatcttcgg gctggcccct ggcaaggccc gggacaggaa ggcctacacg 1380 gtcctcctat acggaaacgg tccaggctat gtgctcaagg acggcgcccg gccggatgtt 1440 accgagagcg agagcgggag ccccgagtat cggcagcagt cagcagtgcc cctggacgaa 1500 gagacccacg caggcgagga cgtggcggtg ttcgcgcgcg gcccgcaggc gcacctggtt 1560 cacggcgtgc aggagcagac cttcatagcg cacgtcatgg ccttcgccgc ctgcctggag 1620 ccctacaccg cctgcgacct ggcgcccccc gccggcacca ccgacgccgc gcacccgggt 1680 tatctcgagg aagcgctctc tctagaaggg cccgaacaaa aactcatctc agaagaggat 1740 ctgaatagcg ccgtcgacca tcatcatcat catcattga 1779 <210> 5 <211 > 90 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 cag cct cta gaa cga atg tgg acc tgc aac tac aac cag caá aaa gac 48 Gln- Pro Leu Glu Arg et" Trp T r Cys Asn Tyr Asn Gln Gln Lys Asp ' 1 5 10 15 cag tea tgc aac cae aag gaa ata act tet- acc aaa gct gaa 90 Gln Ser Cys Asn His Lys Glu lie Thr Ser Thr Lys Ala Glu •: 20 2 30 <210> 6 <211> 592 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Arg Árg Thr 20 25 30 Tyr Glu Ala Tyr Gln Pro Leu Glu Arg Met Trp Thr Cys Asn Tyr Asn 35 40 45 Gln Gln Lys Asp Gln Ser Cys Asn His Lys Glu lie Thr Ser Thr Lys 50 55 60 Ala Glu Arg Arg Ser Ser Gly lie lie Pro Val Glu Glu Glu Asn Pro 65 ¦ 70 75 80 Asp Phe Trp Asn Arg Glu Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ala Ala.Lys Lys 85 90 95 Leu Gln Pro Ala Gln Thr Ala Ala Lys Asn Leu lie lie Phe Leu Gly ¦ 100 105 110 Asp Gly Met Gly"Val ¾er Thr Val Thr Ala Ala Arg lie Leu Lys Gly 115 120 125 Gln Lys Lys Asp Lys Leu Gly Pro Glu lie Pro Leu Ala Met Asp Arg 130 135 140 Phe Pro Tyr Val Ala Leu Ser Lys Thr Tyr Asn Val Asp Lys His Val 145 150 155 160 Pro Asp Ser Gly Ala Thr Ala Thr Ala Tyr Leu Cys Gly Val Lys Gly 165 170 175 Asn Phe Gln Thr lie Gly Leu Ser Ala Ala Ala Arg Phe Asn Gln Cys 180 185 190 Asn Thr Thr Arg Gly Asn Glu Val lie Ser Val Met Asn Arg Ala Lys 195 200 205 Lys Ala Gly Lys Ser Val Gly Val Val Thr Thr Thr Arg Val Gln His 210 215 220 Ala Ser Pro Ala Gly Thr Tyr Ala His Thr Val Asn Arg Asn Trp Tyr 225 230 235 240 Ser Asp Ala Asp Val Pro Ala Ser Ala Arg Gln Glu Gly Cys Gln Asp 245 250 255 lie Ala Thr Gln Leu lie Ser Asn Met Asp lie Asp Val lie Leu Gly 250 265 270 Gly Gly Arg Lys Tyr Met Phe Pro Met Gly Thr Pro Asp Pro Glu Tyr 275 280 285 Pro Asp Asp Tyr Ser Gln Gly Gly Thr Arg Leu Asp Gly Lys Asn Leu 290 295 300 Val Gln Glu Trp Leu Ala Lys Arg Gln Gly Ala Arg Tyr Val Trp Asn 305 310 315 320 Arg Thr Glu Leu Met Gln Ala Ser Leu Asp Pro Ser Val Thr His Leu 325 330 335 Met Gly Leu Phe Glu Pro Gly Asp Met Lys Tyr Glu lie His Arg Asp- '340 345 350 Ser Thr Leu Asp Pro Ser Leu Met Glu Met Thr Glu Ala Ala Leu Arg 35'5r 360 365 Leu Leu Ser Arg' Asn Pro Arg Gly Phe Phe Leu Phe Val Glu Gly Gly, 370 375 380 Arg lie Asp His Gly His His Glu Ser Arg Ala Tyr Arg Ala Leu ¦Thr 385 390. 395 400 Glu Thr lie Met Phe Asp Asp Ala lie Glu Arg Ala Gly Gln Leu- Thr'. 405 410 415 Ser Glu Glu Asp Thr Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp His Ser His Val 420 425 430 Phe Ser Phe Gly Gly Tyr Pro Leu Arg Gly Ser Ser lie Phe Gly Leu 435 440 445 Ala Pro Gly Lys Ala Arg Asp Arg Lys Ala Tyr Thr Val Leu •Leu Tyr 450 455 460 Gly Asn Gly Pro Gly Tyr Val Leu Lys Asp Gly Ala Arg Pro Asp Val 465 470 475 480 Thr Glu Ser Glu Ser Gly Ser Pro Glu Tyr Arg Gln Gln Ser Ala Val 485 490 495 Pro Leu Asp Glu Glu Thr His Ala Gly Glu Asp Val Ala Val Phe Ala 500 505 510 Arg Gly Pro Gln Ala His Leu Val His Gly Val Gln Glu Gln Thr Phe 515 520 525 lie Ala His Val Met Ala Phe Ala Ala Cys Leu Glu Pro Tyr Thr Ala 530 535 540 Cys Asp Leu Ala Pro Pro Ala Gly Thr Thr Asp Ala Ala His Pro Gly 545 550 555 560 Tyr Leu Glu Glu Ala Leu Ser Leu Glu Gly Pro Glu Gln Lys Leu lie 565 570 575 Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His 580 585 590

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un polinucleótido aislado, purificado o recombinante que codifica para el polipéptido de PAPAP de SEQ ID No.

2. 2.- Un polinucleótido aislado, purificado o recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 , o el complemento de la misma.

3.- Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación .

4. - Una célula hospedera que comprende el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 3.

5. - Un animal o mamífero hospedero no humano que comprende el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 3.

6. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende una marca.

7. - Un polipéptido de PAPAP purificado o aislado codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1.

8.- Un polipéptido de PAPAP purificado o aislado que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2.

9.- Un método para producir un polipéptido de PAPAP, dicho método caracterizado porque comprende: a) proveer una célula hospedera que comprende el vector recombinante de conformidad con la reivindicación ; b) cultivar dicha célula hospedera bajo condiciones que llevan a la expresión de dicho polipéptido de PAPAP; y c) recuperar el polipéptido de PAPAP producido por dicha célula hospedera.

10.- Una composición de anticuerpo aislada o purificada que se une selectivamente al polipéptido de conformidad con la reivindicación 8.

11. - Un método para detectar específicamente la presencia de un polipéptido de PAPAP en una muestra biológica, dicho método caracterizado porque comprende: a) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido de PAPAP de conformidad con la reivindicación 8; y b) detectar el complejo de antígeno-anticuerpo formado entre dicho anticuerpo y dicho polipéptido.

12. - Un método para seleccionar una sustancia candidato, dicho método caracterizado porque comprende: a) proveer el polipéptido de conformidad con la reivindicación 8; b) poner en contacto dicho polipéptido con dicha sustancia candidato; y c) determinar si se forma un complejo entre, dicho polipéptido y dicha sustancia candidato.

13. - Un método para seleccionar una sustancia candidato, dicho método caracterizado porque comprende: a) cultivar una célula procariótica o eucariótica que ha sido transfectada con una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína de PAPAP, puesta bajo el control de su propio promotor; b) poner en contacto la célula cultivada con dicha molécula candidato; y c) detectar la expresión de dicha proteína de PAPAP presencia de dicha molécula candidato.