JP2003518628A - 化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 １つ以上の食欲調節試験法において、試験化合物としてＧＰＲ１２受容体の１つ以上のアゴニストまたはアンタゴニストを使用し、食欲調節剤として使用するための活性化合物を選択することを含む、食欲調節剤を提供する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は代謝の調節、および特に食欲調節（appetite control）または肥満に
関与するヒトの遺伝子に関する。本発明はまた前記遺伝子と相互作用するリガン
ドの同定および治療薬の提供にも関するものである。

【０００２】 肥満は今日重要な健康問題である。現在アメリカの人口の２２．５％が臨床的
な肥満と考えられ、イギリスでは１８．５％が、他の多くの先進諸国でもこの傾
向に追随している。この問題は２１世紀の最も進行している非伝染性疾患として
論じられてきた。現在存在している治療法はM. LeanによりExp. Clin. Endocrin
ol. Diabetes, 1998, 106, Suppl. 2, 22-26にまとめられている。これらの治療
法にはダイエットおよび極端な例として外科手術を含む。

【０００３】 肥満に関する遺伝的な素地および影響が詳細に研究されるようになったのは、
ごく近年のことに過ぎない。一部の算出によれば、ヒトの肥満に関する表現型の
バリエーションの４０−７０％が遺伝性である。ヒトの肥満遺伝子の研究につい
ては、Comuzzieら (Science, 1998, 280, 1374-1377)により簡便に要約されてい
る。特にレプチン（ＬＥＰ）、すなわちｏｂ遺伝子の産物、およびレプチン受容
体（ＬＥＰＲ）について現在詳細に研究されている。レプチンは脂肪組織により
分泌されるホルモンで、その受容体と共に、エネルギーのバランスと貯蔵を調節
およびコントロールして最適レベルとするように進化した複雑な生理学的システ
ムの構成要素である(Freidman JM and Halaas JL (1998) Nature 395, 763-769)
。レプチンはまた、栄養摂取の状態を他のいくつかの生理学的システムに中継す
る重要な役割を担っているようである。一般的な肥満の病因へのレプチンの関与
は大いなる研究テーマであり、ヒトの肥満の複雑な性質を際立たせている。ヒト
の肥満遺伝子マップを現在入手することができ、ヒトの肥満の表現型と関連づけ
られた遺伝子および他のマーカーの数は現在２００に達している。肥満および食
行動異常の治療を目的として多数の製品が開発されており、これらは広範囲の生
物学的標的に対して作用する。選択された標的はいわゆるＧタンパク質共役型受
容体（ＧＰＣＲ）と同様に、酵素、ホルモン、神経伝達物質を含む。ＧＰＣＲは
これまで同定された遺伝子の最大のファミリーの１つである。このファミリーの
８００以上のタンパク質が、今日までに広く様々な種からクローニングされてい
る。ＧＰＣＲ ＧＰＲ１２をコードするｍＲＮＡがネズミの食欲／肥満モデルに
おいて特異的に発現することが、今回の研究で明らかになった。したがってＧＰ
Ｒ１２に作用する非ペプチド性の化合物が、食物摂取および代謝過程のコントロ
ールに有用性を示すことになると考えられる。

【０００４】 ＧＰＲ１２は公知の遺伝子である。ヒトについてはSongらにより初めて発表さ
れた(Genomics, 1995, 28, 347-349)。ヒトのｃＤＮＡは、プローブとしてラッ
トの相同遺伝子を用いたヒトのコスミドライブラリーのスクリーニングにより単
離された。ヒトのＧＰＲ１２ｃＤＮＡは１個のエキソンより得られ、３３４アミ
ノ酸のタンパク質をコードする。これは現在オーファン受容体である。マウスと
ラットの遺伝子もまた知らせている (Saeki Y, FEBS Lett., 1993, 336:317-322
およびEidne K.A., FEBS Lett., 1991, 292:243-248)。

【０００５】 以上より本発明の第一の態様においては、１つ以上の食欲調節試験法において
試験化合物としてＧタンパク質共役型受容体ＧＰＲ１２の１つ以上のアゴニスト
および／またはアンタゴニストを使用すること、および食欲調節剤として使用す
るために活性化合物を選択することを含む、食欲調節剤を提供する方法を提供す
る。

【０００６】 好都合な食欲調節試験法として、食欲調節および肥満における試験化合物の役
割を試験するための、動物モデルの使用を含む。これらの方法は典型的には、実
験動物への腹腔内注射、皮下注、静注、経口強制飼養、またはカニューレによる
中枢神経系への直接注入による化合物の投与を含む。食物摂取、体温、代謝速度
、行動の活動度および体重変化への影響は、すべて、標準的な方法で測定できる
。

【０００７】 適切なアンタゴニストまたはアゴニストを、ＧＰＲ１２受容体のアゴニストお
よび／またはアンタゴニストのスクリーニングにより、最初に同定してもよい。 したがって本発明のさらなる態様において、以下を含む食欲調節剤を提供する
ための方法を提供する、（ｉ）ＧＰＲ１２受容体のアゴニストおよび／またはア
ンタゴニストに対する当受容体のスクリーニング、および（ｉｉ）１つ以上の食
欲調節試験法において試験化合物として同定された１つ以上のアゴニストおよび
／またはアンタゴニストを使用し、食欲調節剤として使用するために活性化合物
の選択すること。ＧＰＲ１２受容体は、ヒト、サル、ラット、マウスおよびイヌ
を含むあらゆる哺乳類の種から得られる。スクリーニングの目的としては、ヒト
のＧＰＲ１２受容体が都合がよい。

【０００８】 哺乳類のＧＰＲ１２受容体は好都合なことに市販の入手可能なＲＮＡ、脳のｃ
ＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡライブラリーより、慣
用の分子生物学的技術、例えばライブラリースクリーニングおよび／またはポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて単離することができる。これらの技術はMo
lecular Cloning − A Laboratory Manual,2^nd edition, Sambrook, Fritsch &
Maniatis、Cold Spring Harbor Pressに非常に詳細に述べられている。

【０００９】 得られた哺乳類のＧＰＲ１２受容体をコードするｃＤＮＡを、次に市販の入手
可能な哺乳類の発現ベクター、例えば一連のｐｃＤＮＡ３（InVitrogen Ltd等、
以下参照）にクローニングする。これに代わる哺乳類の発現ベクターはDavies e
t al. J of Pharmacol & Toxicol. Methods, 33, 153-158により公開されている
。標準的なトランスフェクション技術を用いて、一般的な入手可能な培養哺乳類
細胞系、例えばＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ内にこれらのＤＮＡを導入し、
この受容体を発現するクローン誘導体を単離する。これに代わる発現システムは
、我々の英国特許第２２５１６２２号に記載のＭＥＬ細胞発現システムである。

【００１０】 これらの細胞に自然のリガンドを投与すると、トランスフェクションされた受
容体の活性化を引き起こし、細胞内のシグナルとなる分子、例えばサイクリック
ＡＭＰ、分子内カルシウムイオンまたはアラキドン酸の代謝物放出のレベルに変
化をもたらす。これらの変化はいずれも、標準的な公開された方法および市販の
入手可能な試薬により測定できる。加えて、これらの細胞内の変化を“報告する
”“レポーター”遺伝子、例えば大腸菌のＬａｃＺ、ルシフェラーゼ、淡緑青色
（aquorin）もしくは緑色の蛍光タンパク質、で予めトランスフェクションした
これらの細胞系の誘導体内に、さらにこれらのｃＤＮＡをトランスフェクション
することができる。

【００１１】 ＧＰＲ１２の自然のリガンドはまだ明らかにされていない。ＧＰＲ１２でトラ
ンスフェクションした細胞を用いて、ＧＰＲ１２を活性化する自然のリガンドを
発見する。この作業に使用するリガンドは市販品を原料とするか、もしくは化学
的に合成する ( Lembo et al.,1999, Nature Cell Biol., 1, 267-271 )、また
は哺乳類の原料、例えば動物の脳の抽出物から精製してもよい(Saurai et al.,
1998, cell, 92, 573-585)。一度同定できれば、精製し、放射能標識または蛍光
標識した材料（例えばAmersham PLC & Advanced Bioconcept Ltd）をリガンドと
して使用して、標準的な公開されているリガンド結合アッセイ技術により、これ
らのトランスフェクションされた受容体に結合するリガンドを検出することがで
きる。

【００１２】 これらのトランスフェクションした細胞系を用いて、これらの受容体を活性化
し細胞内の指標となる分子の変化を引き起こす低分子量化合物を同定することが
でき、これらの低分子量化合物を“アゴニスト”と定義する。

【００１３】 加えてあるいはその代わりに、同様のアッセイを用いてＧＰＲ１２リガンドの
活性化効果と拮抗する低分子量化合物を同定することができ、これらを“アンタ
ゴニスト”と定義する。

【００１４】 試験化合物は２個以上のアミノ酸のポリペプチド、例えば６個のアミノ酸まで
、１０個もしくは１２個のアミノ酸まで、２０個のアミノ酸まで、または２０個
以上のアミノ酸、例えば５０個のアミノ酸までである。薬剤のスクリーニングを
目的とすれば、好ましい化合物は低分子量の化学的化合物および潜在的に治療効
果のある物質である。これらは例えば分子量にして約１０００ドルトン未満、例
えば８００、６００、または４００ドルトン未満である。所望の場合は試験化合
物は化学化合物のライブラリーに含まれるものでよい。これはライブラリーの個
々の化合物の好都合なあらゆる数を含み得る、例えば適切な化合物、例えばペプ
チド、ペプトイド(peptoids)ならびに他のオリゴマー化合物（環状または直鎖）
、および鋳型（合成）に基づくさらに小さな分子、例えばベンゾジアゼピン、ヒ
ダントイン、ビアリール、炭素環式化合物ならびに多環式化合物（例えばナフタ
レン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイド等）、炭水化物誘導体ならびに
アミノ酸誘導体、ジヒドロピリジン、ベンズヒドリル、および複素環（例えばト
リアジン、インドール、チアゾリジン等）を、１０個から１００個まで、１００
０個まで、１００万個まで等、という単位で含みうる。ここに引用した数および
列記した化合物のタイプは説明のためであり、これに限定されるものではない。
好ましい化学化合物ライブラリーは低分子量の化学化合物および潜在的に治療効
果のある物質を含む。

【００１５】 本発明のさらなる態様において、食欲調節剤としてのＧＰＲ１２受容体アゴニ
ストの使用を提供する。 本発明のさらなる態様において、食欲調節剤としてのＧＰＲ１２受容体アンタ
ゴニストの使用を提供する。

【００１６】 本発明はヒトのＧＰＲ１２受容体のオルソローグおよび相同体の使用を含むと
解釈されるものとする。 “オルソローグ”という用語により、他の種における機能的に等しい受容体を
意味する。

【００１７】 “相同体”という用語により、同一種または異種における実質的に類似するお
よび／または関連する受容体を意味する。 上記定義のいずれについても、受容体は例えば少なくとも３０％、例えば少な
くとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、そして特に少なくとも７
０％、例えば少なくとも８０％、例えば８５％、または９０％もしくは９５％の
ペプチド配列が同一であり得ると思う。相同受容体は、機能のドメインを表す小
さな領域では、実質的により高いペプチド配列の同一性を有し得ると考えられる
。配列をコードするＤＮＡには上記のアミノ酸配列として述べたものより多くの
相違部分がある受容体でも、上記配列の範囲に含まれるペプチド配列と同一の受
容体を産生するものも含むものとする。ＧＰＲ１２受容体の好都合なバージョン
として、公開されている配列（Songら、同文献参照）および添付の配列リストに
示した配列番号Ｎｏ．１から６を含む。

【００１８】 ＧＰＲ１２受容体のフラグメントおよび配列の一部は、本発明のアッセイおよ
び分析的手法の有用な基質となり得る。唯一の限界は実際的な問題で、それらの
配列が関連のアッセイおよび／または分析的手法で使用する必要な機能要素を含
んでいなければならないことは理解されよう。

【００１９】 本発明のさらなる態様において、本発明の１つ以上の方法を用いて同定された
食欲調節剤の医薬的有効量を個体に投与することを含む、食欲調節の方法を提供
する。本発明の食欲調節剤は、治療を必要とする症状に標準的な方法で、例えば
経口、局所、非経口、口腔内から、経鼻もしくは直腸からの投与、または吸入に
より投与することができる。本発明の化合物をこれらの目的にそって当業者公知
の方法で製剤化する、例えば錠剤、カプセル、水性または油性溶液、懸濁液、エ
マルジョン、クリーム、軟膏、ゲル、または鼻用スプレー、座剤、吸入用微粒子
粉末もしくは噴霧剤、および非経口用（靜注、筋注もしくは輸液）の無菌水溶液
もしくは油性溶液もしくは懸濁液もしくは無菌エマルジョンとすることができる
。

【００２０】 ＧＰＲ１２受容体の知識よりまた、例えばアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを
用いて、in vivoでＧＰＲ１２受容体の発現を調節する能力を提供することもで
きる。したがって本発明のさらなる態様により、配列Ｎｏ．１、３および５に示
されたポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部と相補的なアンチセンスＤＮＡ
またはアンチセンスＲＮＡを含む、食欲調節剤を提供する。相補的という用語に
より、２つの分子が、ヌクレオチド塩基対の相互作用により他の分子との相互作
用を除外してハイブリッドを形成し、２本鎖の分子を形成できることを意味する
。

【００２１】 ＧＰＲ１２遺伝子のすべてまたは一部と対応するポリヌクレオチド配列と相互
作用するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡは、慣用の方法を用いて、すなわち標
準的な分子生物学および／または化学的合成法により作製することができる。ア
ンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明のＧＰＲ１２受容体遺伝子の全長また
はそのフラグメントに相補的となり得る。当該タンパク質のコード領域もしくは
その一部の近位であるかまたはそれを含む遺伝子領域に相補的な、約１２から約
３０個の範囲のヌクレオチドのオリゴマーを含むアンチセンス分子は、本発明の
好ましい態様である。所望ならば、アンチセンスＤＮＡまたはアンチセンスＲＮ
Ａを、in vivoでの分解されないようにあるいは細胞膜を通過しやすくするよう
に化学的に修飾することができ、そして／または、ｍＲＮＡを不活性化できる物
質、例えばリボザイム、をリンクさせることができ、本発明をこのような構成に
拡大していくことができる。

【００２２】 ＧＰＲ１２受容体に相補的なハイブリッドを形成できる配列を含むオリゴヌク
レオチドの、治療への使用を考察する。１９９７年６月１７日発行の米国特許第
５，６３９，５９５号の“新規薬剤および試薬の同定（Identification of Nove
l Drugs and Reagents）”に、in vivoで活性を示すオリゴヌクレオチド配列を
同定する方法が詳細に記載されており、これを参照として援用する。

【００２３】 ＧＰＲ１２受容体をコードする核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を、アン
チセンス療法のために合成することができる。これらのアンチセンス分子は、Ｄ
ＮＡ、ＤＮＡの安定な誘導体（例えばホスホロチエートまたはホスホン酸メチル
）、ＲＮＡ、ＲＮＡの安定な誘導体（例えば２’−Ｏ−アルキルＲＮＡ）または
その他のオリゴヌクレオチド類似体と考えられる。１９９７年７月２９日発行の
米国特許第５，６５２，３５５号の“ハイブリッドオリゴヌクレオチドホスホロ
チオエート（Hybrid Oligonucleotide Phosphorothioates）”および１９９７年
７月２９日発行の米国特許第５，６５２，３５６号の“逆方向キメラおよびハイ
ブリッドオリゴヌクレオチド（Inverted Chimeric and Hybrid Oligonucleotide
s）”は、生理学的に安定なアンチセンス分子の合成および効果について記載し
ており、これを参照として援用する。ＧＰＲ１２遺伝子のアンチセンス分子は、
マイクロインジェクション、リポソームによるカプセル化、またはアンチセンス
配列を保有するベクターによる発現により細胞内に導入することができる。

【００２４】 トランスジェニック動物の技術もまた、新規の実験モデルという条件で、肥満
および食行動異常のコントロールに関する試験化合物の効果を評価するために有
用である。以下に簡単に概説するような、そして例えば "Gene Targeting; A Pr
actical Approac", IRL Press, 1993の実施例に記載されているような標準的な
方法を用いて、ＧＰＲ１２を欠失、不活性化または修飾してもよい。好ましくは
、標的遺伝子またはその一部（例えばコード領域の横に位置する相同の配列）を
、その機能を失うように遺伝子内に挿入する選択マーカー（例えばＮｅｏ）と共
に、ベクター内にクローニングする。このベクターを直鎖化し、次に（例えば１
２９／Ｏｌａ株のマウス由来の）胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を（通常エレクトロポ
レーションにより）形質転換させると、その後ある割合の幹細胞に相同組み換え
が起こる。遺伝子破壊を含む幹細胞を増殖させ、（例えばＣ５７ＢＬ／６Ｊマウ
ス由来の）胚盤胞に注入し、さらに生育させるため仮母親内に移植する。キメラ
の子はコートカラーマーカーにより同定することができる。キメラを育て、ＥＳ
由来の配偶子と宿主の胚盤胞由来の配偶子を区別できる遺伝子マーカーを持つマ
ウスと交配させることにより、生殖系列へのＥＳ細胞の寄与を確認する。ＥＳ由
来の配偶子の半分は遺伝子修飾を伴うだろう。子孫を（例えばサザンブロット法
により）スクリーニングし、遺伝子破壊を含むものを同定する（子孫の約５０％
）。これらの選択された子孫はヘテロ接合体と考えられ、したがってもう１個の
ヘテロ接合体と共に育てることにより、ホモ接合体の子孫を作製することができ
る（子孫の約２５％）。

【００２５】 標的遺伝子欠失のトランスジェニック動物（“ノックアウト”）を、公知の技
術、例えば前核へのＤＮＡのマイクロインジェクション、スフェロプラスト融合
、または脂質を介してのＥＳ細胞のトランスフェクションにより作製されたトラ
ンスジェニック動物と交配させて、内因性の遺伝子がノックアウトされ非自己遺
伝子で置き換えられたトランスジェニック動物を作製することができる。標的遺
伝子破壊を含むＥＳ細胞は、特定の変化を含む標的遺伝子配列を用いての形質転
換により、さらに修飾することができる。相同組み換え後、変化させた遺伝子を
ゲノムに導入する。その後これらの胚性幹細胞を上に記載のトランスジェニック
の作製に使用することができる。

【００２６】 トランスジェニック動物は１つの表現型を提示するため、食欲調節および肥満
におけるＧＰＲ１２の役割を反映し、したがって試験化合物の効果を評価する有
用な実験モデルを提供することになる。したがって本発明のさらなる態様におい
て、ＧＰＲ１２が欠失、不活性化または修飾されており、食欲調節および肥満に
おける試験化合物の効果の評価に使用することのできる、トランスジェニック動
物を提供する。

【００２７】 ＧＰＲ１２受容体はまた診断の基礎として、例えばＤＮＡ配列の直接の比較ま
たはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションアッセイにより、例えばヒトにおけ
る発現レベルの決定に使用することができる。診断のアッセイとして核酸増幅技
術、例えばＰＣＲおよび特に当方の欧州特許第０ ３３２ ４３５号に記載の増
幅不適応変異システム（the Amplification Refractory Mutation System (ARMS
)）の使用を含み得る。このようなアッセイは遺伝子の対立遺伝子の変異体、例
えば挿入、欠失および／または突然変異（例えば１つ以上のポイントの突然変異
）の決定に利用できる。このような変異体はヘテロ接合体のこともホモ接合体の
こともある。別のアプローチを用いて、肥満患者において類似の分子をコードす
る遺伝子の変異を同定した例がある (Yeo et al., 1998, Nature Genetics, 20,
111-112)。

【００２８】 本発明のさらなる態様において、ＧＰＲ１２受容体を、他の細胞内タンパク質
および細胞膜に関与するタンパク質との相互関係を維持しつつ、しかもそのエフ
ェクター機能および生物学的活性を失わせるように、遺伝子工学的に操作するこ
とができる。遺伝子的に修飾されたタンパク質は優性ネガティブ変異体として知
られている。適当な細胞のタイプ内での優性ネガティブ変異体の過剰な発現は、
内因性タンパク質の効果をダウンレギュレーションし、それにより食欲調節にお
けるこの遺伝子の生物学的な役割りが明らかになる。

【００２９】 同様にＧＰＲ１２受容体はまた、そのエフェクター機能および生物学的活性を
高めるように、遺伝子工学的に操作することもできる。得られた過剰活性のタン
パク質は優性ポジティブ変異体として知られている。適当な細胞のタイプ内での
優性ポジティブ変異体の過剰な発現は、内因性の本来のタンパク質の生物学的反
応を増幅し、食欲調節におけるその役割に着目させることになる。これはまた、
リガンド不在下で構造的に活性な受容体のアンタゴニストを検出するスクリーニ
ングでの有用性を有する。

【００３０】 以上により本発明のさらなる態様において、ＧＰＲ１２受容体の優性ネガティ
ブ変異体ならびに優性ポジティブ変異体、および食欲調節におけるＧＰＲ１２受
容体の生物学的な役割を評価する際のそれらの使用を提供する。

【００３１】 本発明を具体的に示すが、以下の特定の記述および配列リストの参照内容によ
りこれに限定されるものではない［使用する特定の技術の多くは標準的な分子生
物学のテキスト、例えばSambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular cloning, a
Laboratory Manual, Second Edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory
Pressに詳述されている。したがってそれに関する参考文献は同書の適所を参照
するものとする。］： ＧＰＲ１２のＰＣＲクローニング ヒトおよびラットのＧＰＲ１２をコードする配列（配列は以下参照）のＡＴＧ
開始コドンのすぐ５’側、および終止コドンのすぐ３’側に対応する、長さ３０
ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプライマーを合成する。ラットまたはヒトの
脳のＲＮＡの市販の原料を鋳型として、これらのプライマーとの標準的なＲＴ−
ＰＣＲ反応で使用する。ＲＴ−ＰＣＲのプライマーはタグ配列、例えばｍｙｃ、
Ｈｉｓ６をコードするヌクレオチドを組み込み、後の段階でタンパク質の精製が
容易となるように設計する。市販の入手可能なＲＴ−ＰＣＲキットを製品の指示
に従って、また先に引用したSambrook の参考文献に記載されたように使用する
。ＰＣＲベクターの産物を標準的な技術（同書参照）を用いてプラスミドベクタ
ー pBluescript (Stratagene Ltd.)にクローニングする。プラスミドＤＮＡを単
離し（同書参照）、ＤＮＡ配列分析を行い（同書参照）、公開の配列（以下に記
載）と同一のＧＰＲ１２配列を含むクローンを同定する。ＧＰＲ１２ｃＤＮＡと
対応する挿入断片を、標準的な消化法を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ酵
素により、このＤＮＡより解離する。次にこの挿入断片を、標準的な技術を用い
て（同書参照）適切に調整されたプラスミドＤＮＡにクローニングする。これら
のプラスミドが、以下に記載する本研究で使用する発現ベクターである。

【００３２】 発現ベクターへのクローニング （ｉ）さまざまな哺乳類の発現ベクターは、当明細書で考察した変異体と同様
にＧＰＲ１２分子組み換え体の発現にも用いることができる。組み換え体の発現
に適する市販の入手可能な哺乳類の発現ベクターは以下を含むが、これに限定さ
れない； pcDNA3 シリーズ(InVitrogen)、 pMC1neo (Stratagene)、pXT1 (Strat
agene)、pSG5 (Stratagene)、 EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1 (8-2) (ATCC
37110)、pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224)、pRSVgpt (ATCC 37199)、 pRSVn
eo (ATCC 37198)、 pSV2-dhfr (ATCC 37146)、 pUCTag (ATCC 37460)ならびに l
ZD35 (ATCC 37565)、 pLXIN ならびに pSIR (CLONTECH)、 pIRES-EGFP (CLONTEC
H)。次にＧＰＲ１２ｃＤＮＡの挿入断片を含むプラスミドＤＮＡを精製し（同書
参照）、適当な宿主細胞に導入する。

【００３３】 （ｉｉ）ヒトベータグロブリン遺伝子の遺伝子座調節領域を利用したマウス赤
白血病細胞（ＭＥＬ）発現システムによる、ベクターの使用についての記載があ
る (Davies et al., J of Pharmacol & Toxicol. Methods, 33, 153-158)。この
ベクターシステムおよびその誘導体を使用する。次にＧＰＲ１２ｃＤＮＡ挿入断
片を含むプラスミドＤＮＡを精製し（同書参照）、適当な宿主細胞に導入する。

【００３４】 抗体産生 培養細胞および in vivo での生体分子の検出に関して、診断用の抗体を作製
するためにＧＰＲ１２を用いることができる。したがって本発明のなおさらなる
態様により、生理学的食行動異常の検出を目的とするさまざまな診断用アッセイ
の一部として使用できる、ＧＰＲ１２受容体ポリペプチド抗体を提供する。ＧＰ
Ｒ１２受容体の公知のアミノ酸配列から得られるペプチドに対する有効なポリク
ローナル抗体を産生する一例は、Jameson および Wolf （The antigenic Index:
A novel Algorithm for Predicting Antigenic Determinants, CABIOS, 4:181
(1988)）により開発され十分に確立されたアルゴリズムの方法を利用する。典型
的には１０−２０の間のアミノ酸残基からなるペプチド分子を化学的に合成し、
keyhole limpet（巻貝）のヘモシアニンに結合させ、GENOSYS BIOTECHNOLOGIES,
1442 Lake Front Circle, Suite 185, The Woodlands, Texas 77380の方法によ
り抗体産生に用いる。免疫アジュバントを用いてあるいは用いずに、適当な濃度
のＧＰＲ１２ペプチドで動物（ウサギが好ましい）を免疫することにより、特異
的抗体を作成してもよい。

【００３５】 本発明のポリペプチドに対する単一特異的抗体は、ＧＰＲ１２に対して反応す
る抗体を含む哺乳類の抗血清から、Kohler および Milstein, Nature, 256:495
(1975)の技術により精製する。当要約書で使用する単一特異的抗体という用語は
、新規の標識を形質導入した分子に対して均一の結合特性を持つ、単一の抗体種
または複数の抗体種と定義する。当要約書で用いる均一の結合という用語は、特
定の抗原またはエピトープ、例えば配列Ｎｏ．２、４および６と関連する物質と
結合する抗体種の能力をいう。モノクローナル抗体は、プリスチンで感作された
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１マウスあたり約０．５ｍｌ、約２ｘ１０⁶から約６ｘ
１０⁶ハイブリドーマ細胞を感作後約４日間注射することにより in vivo で作製
する。細胞注入後約８−１２日間で腹水を採取し、当業者に公知の技術によりモ
ノクローナル抗体を精製する。抗ポリペプチドｍＡｂのin vitro での作製は、
約２％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中でハイブリドーマを増殖させることにより
行い、十分量の特異的ｍＡｂを得る。ｍＡｂは当業者公知の技術により精製する
。

【００３６】 宿主細胞のトランスフェクション／選択 （ｉ）哺乳類の発現ベクタープラスミドＤＮＡを培養哺乳類細胞に導入する（
同書参照）。真核細胞組み換え型の宿主細胞が特に好ましい。これらの例として
イースト、哺乳類の細胞（ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源を含むが
これに限定されない）、および昆虫の細胞（Drosophila および細胞系由来のカ
イコを含むがこれに限定されない）を含むがこれに限定されない。当目的に適す
る、市販で入手可能な哺乳類の種由来の細胞系は、以下を含むがこれに限定され
ない；L 細胞L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), L 細胞L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC
CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650
), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3
T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616),BS-C-1 (ATC
C CCL 26), MRC-5 (ATCC CCL 171) および HEK293 (ATCC CRL 1573)。加えてこ
のＤＮＡは、他のタンパク質、例えばβガラクトシダーゼ、またはＧタンパク質
突然変異体、例えばＧａ１６(Milligan et al, 1996, TiPS, 17, 235-237)を発
現するようにすでにトランスフェクトされ、選択されたこれらの細胞系の変異体
に導入することができる。ＧＰＲ１２ｃＤＮＡを発現する哺乳類の細胞のクロー
ンは、親のプラスミド上の適当な耐性遺伝子の存在による抗生物質への抵抗性に
基づいて選択された哺乳類細胞のクローンを選択し（Maniatis ら参照）、導入
された配列のＲＴ−ＰＣＲを行い、特異的な抗体を用いてタンパク質を検出する
ことにより同定する。

【００３７】 （ｉｉ）ベータ−グロブリン遺伝子座調節領域およびＧＰＲ１２ｃＤＮＡを含
むＤＮＡをＭＥＬ細胞に導入し、詳細に記述された方法（Davies ら、前掲同書
参照）にしたがってクローンを選択し、分析を行う。

【００３８】 ＧＰＲ１２を発現する宿主細胞内への発現ベクターの導入は、形質転換、トラ
ンスフェクション、リポフェクション、プロトプラス融合法、およびエレクトロ
ポレーションを含む多くの技術（ただしこれに限定されない）のいずれかにより
行うことができる。異質の発現のため本発明と合わせての使用に適用できる市販
の入手可能なキットは、特徴が十分に明らかにされているベクター、トランスフ
ェクション試薬ならびに条件、および細胞培養の材料を含むが、これらはかなり
定評もあり十分利用できる[CLONTECH, Palo Alto, CA; InVitrogen, Carlsbad,
CA; PHARMINGEN, San Diego, CA; STRATAGENE, LaJolla, CA.]。

【００３９】 ＧＰＲ１２受容体のリガンドの同定 ＧＰＲ１２受容体の自然のリガンドの同定に続いて、精製および、出発物質と
してラット、ブタまたはその他の動物の脳を用いてのアッセイのステップへと進
めることができる。ホモゲナイズした脳組織を慣用の生物学的方法により分画し
、そのフラクションを以下に記載のレポーター細胞アッセイにおける活性につい
てスクリーニングする。これらの方法の詳細なプロトコールは、Sakurai, et al
. 1998, Cell, 92:573-585より入手できる。続いての精製で、配列決定法（同書
参照）により特徴が明らかとなるＧＰＲ１２の精製リガンドを得る。

【００４０】 細胞結合アッセイ 上に記載の選択法により単離された哺乳類の細胞を標準的な技術を用いて培養
し、（一度同定できればその）１２５［Ｉ］リガンドに暴露させる。結合してい
ない材料を除去するため細胞を十分に洗浄した後、どの程度リガンドが結合して
いるかDaviesらにより詳述されている方法（前掲同書参照）を用いてガンママス
ターカウンター(Packard)にて定量する。このリガンドと最大の結合を示す細胞
のクローンを本方法の次の段階へと進める。

【００４１】 膜の調整 上に記載の方法により同定された哺乳類細胞のクローンを培養し、集め、膜の
調製の材料として使用する。Daviesらにより詳述されている標準的な生物学的技
術（前掲同書参照）により、これらの細胞クローンから膜を調整する。

【００４２】 リガンド結合アッセイ ＧＰＲ１２の自然のリガンドが一度明らかになれば、 （ｉ）これらの哺乳類細胞のクローンから単離された細胞膜を用いて、Davies
らにより詳述されているような慣用のリガンド結合のアッセイ（前掲同書参照）
を確立する。または： （ｉｉ）上記の膜を、上記の放射性リガンドまたはＧＴＰｇ［Ｓ］３５と共に
用いて、Amersham Ltd.により開発された専有のＳＰＡビーズを用いた、シンチ
レーションプロキシミティーアッセイ（Scintillation Proximity Assay (SPA)
）を開発する。この技術のライセンスおよび詳細なプロトコールはAmersham Ltd
. より入手できる。

【００４３】 レポーター細胞のアッセイ―ｃＡＭＰ／Ｃａ＋＋／ＡＡの放出 ＧＰＲ１２を発現する細胞は上に記載のように同定する。これらの細胞はまた
、哺乳類のサイクリックＡＭＰ応答要素とカップルしたＬａｃＺ遺伝子を発現す
るように操作された(Egerton et al, J.Mol.Endocrinol, 1995, 14(2), 179-189
)。細胞内のｃＡＭＰレベルが上昇するとＬａｃＺ遺伝子の転写が比例して増加
し、標準的なベータ―ガラクトシダーゼアッセイ(Maniatis et al.、同書参照)
による測定が可能となる。

【００４４】 ＧＰＲ１２を発現する細胞はまた、Ｇタンパク質Ｇα１６を発現するように操
作される (Milligan et al., 1996, TiPS, 17, 235-237)。活性化に際して、細
胞は細胞内カルシウム濃度を増加することで反応する。蛍光化合物、例えばＦｕ
ｒａ２(Molecular Probes Ltd)（ただしこれに限定されない）に予め細胞を暴露
した後、市販の入手可能ないずれかの蛍光分析装置で読み取り、この増加を測定
する。 (Lembo et al., 1999, Nature Cell Biol., 1, 267-271 )。

【００４５】 ＧＰＲ１２を発現する細胞はまた、３［Ｈ］アラキドン酸にて細胞を予めイン
キュベーションし、（一度同定できればその）リガンドにより刺激した後、放射
能標識したアラキドン酸（ＡＡ）代謝物の放出の増加についてアッセイを行う（
Daviesら、前掲同書参照）。

【００４６】 化合物のスクリーニング ＧＰＲ１２のリガンドが明らかになった場合、化学化合物について、ＧＰＲ１
２受容体での自然のリガンドの活性を阻害する（拮抗する）能力、およびＧＰＲ
１２受容体の活性を増加させる（作動させる）能力を検査する。

【００４７】 （ｉ）個々の化合物のさまざまな量での存在下で上に記載のリガンド結合およ
びＳＰＡアッセイを行うことにより、ＧＰＲ１２受容体から自然のリガンドを置
き換えさせる能力のある化合物を明らかにすることができる。

【００４８】 （ｉｉ）これらの化合物をリガンドの存在下および不在下で哺乳類の細胞に与
え、上に記載のアッセイの結果に影響を与える化合物を同定する。 現在ＧＰＲ１２のリガンドは明らかにされていない。したがって所望の特性を
もつ化学化合物の同定には、以下の方法のほうがより適している。

【００４９】 アゴニスト：ＧＰＲ１２を含むレポーター細胞を、いかなるリガンドも存在し
ない条件下で化学的化合物に暴露させ、上述のように、アラキドン酸代謝物の放
出の増加同様に、細胞内ｃＡＭＰおよびＣａ＋＋の変化についてもアッセイを行
う。

【００５０】 アンタゴニスト：ＧＰＲ１２ｃＤＮＡを標準的な分子生物学的技術(Sambrook,
同書参照)により変異させ、上述のように哺乳類のレポーター細胞にトランスフ
ェクションする。次にレポーター遺伝子の活性を増加させる変異受容体を保有す
る細胞系を用いて、これらの構造的に活性な受容体に拮抗させることによりこの
レポーター遺伝子の活性を抑制する能力について、化学化合物のスクリーニング
を行う。

【００５１】 in vivo における化合物の検査 上に記載のアッセイにより同定される化合物の、動物モデルでの試験について
考察する。適当に製剤化した化合物は、経口強制投与、腹腔内注射、静注、筋注
もしくは脳血管内注射、または輸液により（ただしこれに限定されない）投与す
る。動物は標準的な実験用げっ歯類、イヌおよび霊長類、肥満Zuckerラット、肥
満（ob/ob）マウス、糖尿病マウス（db/db）および上に記載のトランスジェニッ
ク“ノックアウト”動物を含むものとするが、これに限定されない。これらの動
物には標準的な実験用飼料を与えてもよいが、あるいは過食症および体重増加を
誘発するよう調整された飼料（例えば高脂肪、高炭水化物）を含む（ただしこれ
に限定されない）変則的な飼料を与えてもよい(Stock, 1998, Clinical Obesity
, Oxford Press, 50-72)。食物摂取のパラメータ、水分摂取、体重変化、体脂肪
、タンパク質および水分組成、内因性パラメータ、代謝基質濃度、エネルギー消
費、および行動の活動度、（ただしこれに限定されない）に関する化合物の効果
が、標準的な生理学的、生物学的および神経生物学的方法により明確にされるこ
とだろう (Halford et al, 1998, Pharmacol. Biochem. Behav., 61, 159-168,
Shimada et al, 1998, Nature, 396, 670-674.)。

【００５２】 配列リスト：添付の配列リストにて以下の配列を提供する。 配列番号Ｎｏ．１ ＨＳ１８５４８ ヒト ＧＰＲ１２ Ｇタンパク質共役型受容体遺伝子、完全な
コード鎖。 配列番号Ｎｏ．２ ＧＰＲＣ＿ヒト Ｇタンパク質共役型受容体ＧＰＲ１２と思われる。 配列番号Ｎｏ．３ マウス Ｇタンパク質共役型受容体のｍＲＮＡ ＧＰＣＲ０１ Ｄ２１０６1。
配列番号Ｎｏ．４ ＧＰＲＣ＿マウス Ｇタンパク質共役型受容体 ＧＰＲ１２（ＧＰＣＲ０１）と
思われる。 配列番号Ｎｏ．５ Ｕ１２１８４ ドブネズミ Ｇタンパク質共役型受容体ｍＲＮＡの完全なコード
鎖と推定される。 配列番号Ｎｏ．６ ＧＰＲＣ＿ラット Ｇタンパク質共役型受容体ＧＰＲ１２と思われる（Ｒ３３４
）。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 3/04 Ａ６１Ｐ 3/04 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/566 33/566 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ハート，ケビン・アンソニー イギリス国チェシャー エスケイ10・４テ ィージー，マクレスフィールド，アルダー レイ・パーク Ｆターム(参考） 2G045 AA40 FB03 4B024 AA01 BA63 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4C084 AA13 AA17 NA14 ZA702 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA70

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 食欲調節剤を提供する方法であって、 １つ以上の食欲調節試験法において、試験化合物としてＧタンパク質共役型受
   容体ＧＰＲ１２の１つ以上のアゴニストまたはアンタゴニストを使用すること、
   および 食欲調節剤として使用するために活性化合物を選択すること を含む方法。
2. 【請求項２】 （ｉ）ＧＰＲ１２受容体のアゴニストおよび／またはアンタゴ
   ニストに対する当受容体のスクリーニング、および（ｉｉ）試験化合物として同
   定された１つ以上のアゴニストおよび／またはアンタゴニストを１つ以上の食欲
   調節試験法において使用すること、および、食欲調節剤として使用するために活
   性化合物を選択することを含む請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ＧＰＲ１２受容体がヒトのＧＰＲ１２受容体である前記請求項
   のいずれか1項に記載の方法。
4. 【請求項４】 食欲調節剤としてのＧＰＲ１２受容体のアゴニストの使用。
5. 【請求項５】 食欲調節剤としてのＧＰＲ１２受容体のアンタゴニストの使用
   。
6. 【請求項６】 請求項１−３のいずれか１項に記載の方法を用いて同定された
   食欲調節剤の医薬的有効量を各個体に投与することを含む、食欲調節の方法。
7. 【請求項７】 配列番号Ｎｏ．１に示されたポリヌクレオチド配列またはその
   変異体の全長またはその一部と相補的なアンチセンスＤＮＡを含む、食欲調節剤
   。
8. 【請求項８】 配列番号Ｎｏ．１に示されたポリヌクレオチド配列またはその
   変異体の全長またはその一部と相補的なアンチセンスＲＮＡを含む、食欲調節剤
   。
9. 【請求項９】 ＧＰＲ１２遺伝子が欠失しているトランスジェニック動物。
10. 【請求項１０】 ＧＰＲ１２遺伝子が不活性化されているトランスジェニック
    動物。
11. 【請求項１１】 ＧＰＲ１２遺伝子が修飾されているトランスジェニック動物
    。
12. 【請求項１２】 食欲調節および肥満における試験化合物の効果の評価におけ
    る、請求項９−１１のいずれか1項に記載のトランスジェニック動物の使用。
13. 【請求項１３】 ＧＰＲ１２受容体の優勢ネガティブ変異体。
14. 【請求項１４】 ＧＰＲ１２受容体の優勢ポジティブ変異体。
15. 【請求項１５】 食欲調節におけるＧＰＲ１２の生物学的役割の評価における
    、請求項１４または請求項１５に記載の突然変異体の使用。
16. 【請求項１６】 試験化合物がポリペプチドである請求項１−３のいずれか1
    項に記載の方法。
17. 【請求項１７】 試験化合物が分子量１０００ドルトン未満の化学化合物であ
    る請求項１−３のいずれか1項に記載の方法。
18. 【請求項１８】 化合物のライブラリーについて試験を行う請求項１６または
    請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 ヒトにおけるＧＰＲ１２の発現レベルを決定するための診断
    用アッセイの使用。
20. 【請求項２０】 ＧＰＲ１２遺伝子の対立遺伝子の変異体を決定するための診
    断用アッセイの使用。