JP2017527294A - Ｍｉｒ−２９模倣物およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ｍｉＲＮＡの合成オリゴヌクレオチド模倣物に関する。詳細には、本発明は、ｍｉＲ−２９の、二本鎖の化学的に改変されたオリゴヌクレオチド模倣物を提供する。模倣物を含む医薬組成物、および、組織の線維状態などの、細胞外マトリックス遺伝子の調節不全に関連する状態の処置または予防におけるそれらの使用も記載されている。本発明は、例えば、成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、またはｍｉＲ−２９ｃ配列を含む、約２３〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖と、前記第１の鎖と実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する、約２２〜約２３リボヌクレオチドの第２の鎖とを含むｍｉＲ−２９模倣化合物であって、前記第１の鎖が、前記第２の鎖に対して３’ヌクレオチド突出部を有する、ｍｉＲ−２９模倣化合物を提供する。【選択図】図１３

Description

本願は、２０１４年９月８日に出願された米国仮出願第６２／０４７，５６２号への優先権の利益を主張し、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍｉＲＮＡ活性を増大させる合成ｍｉＲＮＡ模倣物またはｐｒｏｍｉＲに関する。詳細には、本発明は、ｍｉＲ−２９の模倣物、ならびに、コラーゲン沈着および関連する状態、例えば線維症などの軽減におけるそれらの使用に関する。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の遺伝学または薬理学的調節を使用して動物疾患モデルにおいて収集された機能獲得または機能喪失データに基づき、ｍｉＲＮＡが疾患の間に重要な役割を果たすことが現在広く認められている。これらの研究は、最近の前向きな臨床的有効性データ（Ｊａｎｓｓｅｎら、２０１３年）と合わせると、ｍｉＲＮＡの妥当性、およびｍｉＲＮＡが次のクラスの治療薬になることの実現可能性が裏付けられる。実際に、ｍｉＲＮＡは小さく、既知の配列を含むということにおいて、ｍｉＲＮＡには治療介入点として有利な点がいくつかある。さらに、単一のｍｉＲＮＡによって生物学的経路内の多数の標的ｍＲＮＡを制御することができるので、原理上、ｍｉＲＮＡを調節することにより、遺伝子ネットワーク全体に影響を及ぼすこと、および複雑な疾患表現型を改変することが可能になる（ｖａｎ ＲｏｏｉｊおよびＯｌｓｏｎ、２０１２年）。

多くの試験により、抗ｍｉＲと称される一本鎖ｍｉＲＮＡ阻害剤を使用した治療有効性が示されているが、ｍｉＲＮＡの機能を回復または増大させるための試みは遅れている（ｖａｎ Ｒｏｏｉｊら、２０１２年）。現在、ｍｉＲＮＡ機能は、ウイルスによる過剰発現によってか、または合成二本鎖ｍｉＲＮＡを使用することによって増大させることができる。これまで、所与のｍｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏにおける活性を回復させるためにその発現を駆動するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用が肝細胞癌および肺癌（ＫａｓｉｎｓｋｉおよびＳｌａｃｋ、２０１２年；Ｋｏｔａら、２００９年）ならびに球脊髄性筋萎縮症（Ｍｉｙａｚａｋｉら、２０１２年）のマウスモデルにおいて有効であることが示されているが、ｍｉＲＮＡレベルを上昇させるための、定式化されていない合成オリゴヌクレオチドに基づく手法の使用は十分に探究されていない。

マイクロＲＮＡ−２９（ｍｉＲ−２９）ファミリーは、細胞外マトリックスタンパク質を制御するそれらの能力がよく特徴付けられている（Ｈｅら、２０１３年）。このファミリーは、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂおよびｍｉＲ−２９ｃからなり、２つのバイシストロン性クラスター（ｍｉＲ−２９ａ／−２９ｂ−１およびｍｉＲ−２９ｂ−２／−２９ｃ）として表され、異なるメンバー間で成熟ｍｉＲＮＡの３’領域における配列の相同性が大きく、ミスマッチはほんのわずかである（ｖａｎ Ｒｏｏｉｊら、２００８年）。３種のメンバーは全て、種々の型の組織線維症において低下しており、ｍｉＲ−２９レベルを上昇させることの治療的利益が、心臓（ｖａｎ Ｒｏｏｉｊら、２００８年）、腎臓（Ｑｉｎら、２０１１年；Ｗａｎｇら、２０１２年；Ｘｉａｏら、２０１２年）、肝臓（Ｒｏｄｅｒｂｕｒｇら、２０１１年；Ｓｅｋｉｙａら、２０１１年；Ｚｈａｎｇら、２０１２年）、肺（Ｃｕｓｈｉｎｇら、２０１１年；Ｘｉａｏら、２０１２年）および全身性硬化症（Ｍａｕｒｅｒら、２０１０年）について示されている。

ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍｉＲ−２９活性を有効に増大させることができる、合成オリゴヌクレオチドｍｉＲ−２９の模倣物が当技術分野において必要とされている。そのようなｍｉＲ−２９模倣物またはｍｉＲ−２９ ｐｒｏｍｉＲは、種々の組織の線維状態を処置するために有用である。

本発明は、安定性および細胞内取り込みについて改変されたｍｉＲＮＡ模倣物を使用して、ｍｉＲ−２９の内在性機能を再現することができるという発見に一部基づく。例えば、肺線維症の状況におけるｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた治療的処置により、ブレオマイシンにより誘導されるｍｉＲ−２９の減少からの回復が起こり、肺線維症が遮断され、元に戻り、それと同時に疾患過程中に誘導されるｍｉＲ−２９標的遺伝子が抑制される。同様に、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いて皮膚切開を処置することにより、細胞外マトリックス遺伝子および線維化プロセスに関与する他の遺伝子の発現が下方制御される。したがって、本発明は、二本鎖ＲＮＡ ｍｉＲ−２９模倣化合物を提供する。

一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、（ａ）成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、またはｍｉＲ−２９ｃ配列を含む、約２３〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖と、（ｂ）第１の鎖と実質的に相補的な配列を含む、約２２〜約２３リボヌクレオチドの第２の鎖とを含み、第１の鎖は、第２の鎖に対して３’ヌクレオチド突出部を有する。ある特定の実施形態では、第１の鎖および第２の鎖は、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含有する。修飾されたヌクレオチドは、２’糖修飾、例えば、２’−アルキル（２’−Ｏ−メチル）または２’−フルオロ修飾であってよい。一実施形態では、第１の鎖は、１つまたは複数の２’−フルオロ修飾を有する。別の実施形態では、第２の鎖は、１つまたは複数の２’−Ｏ−メチル修飾を有する。一部の実施形態では、第２の鎖は、第１の鎖に対して１つ、２つ、３つ、またはそれ超のミスマッチを有する。一実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物の第２の鎖は、第１の鎖に対して、３’末端（第２の鎖の）から４位、１３位、および／または１６位におけるミスマッチを含有する。

一実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物の第２の鎖は、その３’末端においてコレステロール分子に結合している。ある特定の実施形態では、コレステロール分子は第２の鎖と少なくとも６炭素リンカーを通じて結合している。リンカーは、切断可能なリンカーであってよい。

一実施形態では、第１の鎖における３’突出部を含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合している。

一実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、配列番号２７の配列を含む第１の鎖と、配列番号５の配列を含む第２の鎖とを含む。

別の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、配列番号１９の配列を含む第１の鎖と、配列番号１の配列を含む第２の鎖とを含む。

さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、配列番号１９の配列を含む第１の鎖と、配列番号１５の配列を含む第２の鎖とを含む。

さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、配列番号３３の配列を含む第１の鎖と、配列番号１の配列を含む第２の鎖とを含む。

さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、配列番号３４の配列を含む第１の鎖と、配列番号１の配列を含む第２の鎖とを含む。

さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物は、配列番号３５の配列を含む第１の鎖と、配列番号２４の配列を含む第２の鎖とを含む。

本発明は、有効量の本明細書に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物または薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、肺、鼻、鼻腔内または眼への送達用に製剤化され、散剤、水溶液、水性エアロゾル、点鼻剤、エアロゾル、および／または点眼剤の形態であってよい。一部の実施形態では、医薬組成物は、ネブライザー、定量用量吸入器、乾燥粉末吸入器、またはソフトミスト吸入器などの吸入システムを用いて投与される。

本発明は、細胞において細胞外マトリックス遺伝子を制御する方法であって、細胞を、本明細書に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物と接触させるステップを含む方法も包含する。一実施形態では、細胞外マトリックス遺伝子の発現または活性は、ｍｉＲ−２９模倣化合物または組成物との接触後に低下する。一部の実施形態では、細胞外マトリックス遺伝子は、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１などのコラーゲン遺伝子である。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏにおけるものであってよい。

本発明は、組織線維症の処置または予防を必要とする対象において組織線維症を処置または予防する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、対象に、本明細書に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物を投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、組織線維症は、心臓線維症、肺線維症、腎線維症、肝線維症、眼線維症、肥厚性瘢痕（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒｒｉｎｇ）およびケロイドを含めた皮膚線維症、手、関節もしくは腱の線維症、ペイロニー病または強皮症である。一実施形態では、組織線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）である。

ある特定の実施形態では、組織線維症を処置または予防するための方法は、本明細書に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物または組成物を肺経路、経鼻経路、または鼻腔内経路によって投与するステップを含む。一実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣化合物または組成物を吸入によって送達する。

本発明は、細胞において非細胞外マトリックス遺伝子を制御する方法であって、細胞を、本明細書に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物と接触させるステップを含む方法も包含する。一実施形態では、非細胞外マトリックス遺伝子の発現または活性は、ｍｉＲ−２９模倣化合物または組成物との接触後に増大する。一部の実施形態では、非細胞外マトリックス遺伝子は、Ｉｔｇａ３またはＮｕｍｂなどの遺伝子である。細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏにおけるものであってよい。

本発明は、ｍｉＲ−２９アゴニストまたはｍｉＲ−２９アンタゴニストを用いた処置の有効性を評価するための方法であって、ｍｉＲ−２９アゴニストまたはｍｉＲ−２９アンタゴニストを用いた処置の前に対象の細胞または線維性組織における１種または複数種の遺伝子の発現のレベルを決定するステップであって、当該１種または複数種の遺伝子が、ｍｉＲ−２９によって調節される遺伝子のセットから選択されるステップと、ｍｉＲ−２９アゴニストまたはｍｉＲ−２９アンタゴニストを用いた処置後に対象の細胞／線維性組織における同じ１種または複数種の遺伝子の発現レベルを決定するステップと、処置の前後の発現レベルに基づいて、処置に効果があるか、効果が少ないか、または効果がないかを決定するステップとを含む方法も提供する。一実施形態では、ｍｉＲ−２９によって調節される１種または複数種の遺伝子は、表５から選択される。

図１Ａは、二本鎖ｍｉＲ−２９模倣物設計を示す図である。二本鎖ｍｉＲ−２９模倣物設計は、ｍｉＲ−２９ｂと同一であり、３’末端上にＵＵ突出部を有し、安定性が増大するように改変され、５’末端において化学的にリン酸化された「ガイド鎖」または「アンチセンス鎖」と、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み入れられるのを防止するため、ならびに安定性を増大させるために２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含有させ、細胞内取り込みを増強するためにコレステロールと結合させた「パッセンジャー鎖」または「センス鎖」とを含有する。センス鎖には、この鎖が抗ｍｉＲとして機能するのを防ぐためにいくつかのミスマッチを導入する。

図１Ｂは、ＮＩＨ ３Ｔ３におけるトランスフェクション実験についてのグラフである。この実験から、無処理または偽処理細胞のいずれかと比較して、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の量の増加に伴ったＣｏｌ１ａ１の用量依存的な減少が示される。Ｃｏｌ１ａ１を直接標的とするｓｉＲＮＡを陽性対照として共に用いた。^＊偽に対してｐ＜０．０５、＃無処理に対してｐ＜０．０５。

図１Ｃは、１０ｍｐｋ、５０ｍｐｋ、１００ｍｐｋ、または１２５ｍｐｋのｍｉＲ−２９ｂ模倣物を静脈内注射した４日後の種々の組織におけるｍｉＲ−２９ｂについてのノーザンブロット分析についての図である。この分析により、全ての組織への最高用量での送達が示され、生理食塩水を注射したマウスと比較して最も有効な送達は肺および脾臓に対して起こる。Ｕ６をローディング対照として使用する。

図１Ｄは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣のリアルタイム数量化についてのグラフである。これにより、高用量レベルでのｍｉＲ−２９ｂのレベルの上昇が示され、肺および脾臓への送達が最も効率的である（群当たりｎ＝４）。^＊生理食塩水を注射した動物に対してｐ＜０．０５。

図１Ｅは、１２５ｍｐｋの模倣物を静脈内注射した１日後、２日後、４日後および７日後の種々の組織におけるｍｉＲ−２９ｂについてのノーザンブロット分析を示す図である。この分析により、検査した全ての組織においてｍｉＲ−２９ｂ模倣物の存在が示され、肺および脾臓においてより長く検出された。Ｕ６をローディング対照として使用する。

図１Ｆは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣のリアルタイム数量化を示すグラフである。これにより、測定した全ての組織においてｍｉＲ−２９ｂのレベルの上昇が示され、これは肺および脾臓において最も長く維持される（群当たりｎ＝４）。^＊生理食塩水を注射した動物に対してｐ＜０．０５。

図２Ａは、リアルタイムＰＣＲ分析についてのグラフである。この分析により、ｍｉＲ−２９ファミリーメンバーは全てブレオマイシンに応答して減少し、一方、ｍｉＲ−２９模倣物を用いた処置の結果、対照または生理食塩水を注射した動物のいずれかと比較してｍｉＲ−２９ｂの検出レベルが上昇したことが示される。^＊生理食塩水／生理食塩水に対してｐ＜０．０５。

図２Ｂは、リアルタイムＰＣＲ分析についてのグラフである。この分析により、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の患者の肺生検材料において、正常対照と比較して、ｍｉＲ−２９レベルの同等の低下が示される。^＊正常に対してｐ＜０．０５。

図２Ｃは、三色染色による組織学的検査についての図である。この検査により、ブレオマイシンに応答して著しい線維化反応および炎症反応が示され、これは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置によって鈍化した。スケールバーは１００μｍを示す。

図２Ｄは、総コラーゲン含有量についてアッセイするためのヒドロキシプロリン測定についてのグラフである。この測定により、生理食塩水を用いた処置群および対照を用いた処置群のどちらにおいてもブレオマイシンを用いた処置後に有意な増加が示され、一方、ｍｉＲ−２９模倣物を用いた処置群では、生理食塩水を用いて処置したマウスとブレオマイシンを用いて処置したマウスの間で統計学的差異はなかった。

図２Ｅ〜Ｇは、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液に対するサイトカイン測定についてのグラフである。この測定により、ブレオマイシンを用いて処置したマウス由来の肺からＢＡＬ液において有意に高い濃度のＩＬ−１２、ＩＬ−４およびＧ−ＣＳＦが検出可能であり、これは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物によって減少することが示された。（ｎ＝４）、^＊ｐ＜０．０５。 図２Ｅ〜Ｇは、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液に対するサイトカイン測定についてのグラフである。この測定により、ブレオマイシンを用いて処置したマウス由来の肺からＢＡＬ液において有意に高い濃度のＩＬ−１２、ＩＬ−４およびＧ−ＣＳＦが検出可能であり、これは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物によって減少することが示された。（ｎ＝４）、^＊ｐ＜０．０５。 図２Ｅ〜Ｇは、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液に対するサイトカイン測定についてのグラフである。この測定により、ブレオマイシンを用いて処置したマウス由来の肺からＢＡＬ液において有意に高い濃度のＩＬ−１２、ＩＬ−４およびＧ−ＣＳＦが検出可能であり、これは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物によって減少することが示された。（ｎ＝４）、^＊ｐ＜０．０５。

図２Ｈは、ブレオマイシンを用いた処置によりＢＡＬ液における免疫細胞の検出が増加し、これがｍｉＲ−２９ｂ模倣物の存在下では有意に低下したが、対照模倣物による効果はなかったことを示すグラフである。（ｎ＝４）、^＊生理食塩水／ブレオマイシンに対してｐ＜０．０５、＾対照／ブレオマイシンに対してｐ＜０．０５。

図３Ａ〜Ｂは、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１の発現が、リアルタイムＰＣＲによって測定したところ、ブレオマイシンを用いた処置により増加し、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の存在によってＣｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１が阻害されることを示すグラフである。ベースライン条件下ではＭｉＲ−２９ｂ模倣による標的抑制に対する効果はない（ｎ＝６〜８）、^＊ｐ＜０．０５ 図３Ａ〜Ｂは、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１の発現が、リアルタイムＰＣＲによって測定したところ、ブレオマイシンを用いた処置により増加し、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の存在によってＣｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１が阻害されることを示すグラフである。ベースライン条件下ではＭｉＲ−２９ｂ模倣による標的抑制に対する効果はない（ｎ＝６〜８）、^＊ｐ＜０．０５

図３Ｃは、ＢＡＬ液中のＩＧＦ１レベルがブレオマイシンを用いた処置後に上昇し、これが、ｍｉＲ−２９模倣物の存在下では、生理食塩水を用いて処置したマウスおよび対照模倣物を用いて処置したマウスの両方と比較して有意に鈍化することを示すグラフである（ｎ＝４）、^＊ｐ＜０．０５。

図３Ｄは、免疫組織化学的検査についての図である。この検査により、ブレオマイシンを用いた処置後にＩＧＦ１のロバストな検出が実証され、これは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置群では生理食塩水を用いて処置したマウスまたは対照模倣物を用いて処置したマウスと比較して低下した。スケールバーは５０μｍを示す。

図４Ａは、ヒドロキシプロリン評価についてのグラフである。この評価により、生理食塩水を用いた処置群および対照を用いた処置群のどちらにおいてもブレオマイシンを用いた処置後に有意な増加が示されたが、ｍｉＲ−２９模倣物を用いた処置群では、生理食塩水を用いて処置したマウスとブレオマイシンを用いて処置したマウスの間で統計学的差異はなかった。^＊Ｐ＜０．０５（ｎ＝８）

図４Ｂ〜Ｃは、Ｃｏｌ１ａ１（Ｂ）およびＣｏｌ３ａ１（Ｃ）についてのリアルタイムＰＣＲ分析についてのグラフである。この分析により、ブレオマイシンを用いた処置に伴う有意な増加が示された。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置によりＣｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１の両方がビヒクルを用いて処置した発現レベルまで正常化された。^＊Ｐ＜０．０５（ｎ＝８） 図４Ｂ〜Ｃは、Ｃｏｌ１ａ１（Ｂ）およびＣｏｌ３ａ１（Ｃ）についてのリアルタイムＰＣＲ分析についてのグラフである。この分析により、ブレオマイシンを用いた処置に伴う有意な増加が示された。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置によりＣｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１の両方がビヒクルを用いて処置した発現レベルまで正常化された。^＊Ｐ＜０．０５（ｎ＝８）

図４Ｄは、三色染色による組織学的検査についての図である。この検査により、ブレオマイシンに応答してロバストな線維症が示され、これは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置によって鈍化した。

図４Ｅ〜Ｆは、ＩＰＦの患者由来の初代肺線維芽細胞をビヒクルまたはＴＧＦ−βを用いて処置し、対照模倣物またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物をトランスフェクトした。Ｃｏｌ１ａ１（Ｅ）およびＣｏｌ３ａ１（Ｆ）についてリアルタイムＰＣＲを実施した。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置により、どちらのコラーゲンについても用量依存的な減少が示された。 図４Ｅ〜Ｆは、ＩＰＦの患者由来の初代肺線維芽細胞をビヒクルまたはＴＧＦ−βを用いて処置し、対照模倣物またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物をトランスフェクトした。Ｃｏｌ１ａ１（Ｅ）およびＣｏｌ３ａ１（Ｆ）についてリアルタイムＰＣＲを実施した。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置により、どちらのコラーゲンについても用量依存的な減少が示された。

図４Ｇ〜Ｈは、Ａ５４９細胞をビヒクルまたはＴＧＦ−βを用いて処置し、対照模倣物またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物をトランスフェクトした。Ｃｏｌ１ａ１（Ｇ）およびＣｏｌ３ａ１（Ｈ）についてリアルタイムＰＣＲを実施した。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置により、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１のどちらの発現についても量依存的な減少が示された。

図４Ｇ〜Ｈは、Ａ５４９細胞をビヒクルまたはＴＧＦ−βを用いて処置し、対照模倣物またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物をトランスフェクトした。Ｃｏｌ１ａ１（Ｇ）およびＣｏｌ３ａ１（Ｈ）についてリアルタイムＰＣＲを実施した。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置により、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１のどちらの発現についても量依存的な減少が示された。

図５は、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物により毒性の一般的な徴候は誘導されないことを示すグラフである。アスパラギン酸トランスアミナーゼまたはアラニントランスアミナーゼ（ＡＳＴおよびＡＬＴ）に変化がないことによって示される通り、ＭｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置によりいかなる肝毒性または腎毒性の顕性徴候も誘導されない。群当たりｎ＝４。

図６は、漸増用量のｍｉＲ−２９ｂ模倣物によってベースライン条件下で遺伝子発現の顕性変化を誘導することはできないことを示すグラフである。リアルタイムＰＣＲ分析により、漸増用量のｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いて処置した４日後の異なる組織におけるＣｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１についての発現は生理食塩水を注射したマウスと比較して有意に変化しないことが示される。群当たりｎ＝４、^＊生理食塩水の注射と比較してｐ＜０．０５。

図７は、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物によりｍｉＲ−２９ｂが特異的に増加することを示すグラフである。ＭｉＲ−２９ｂ模倣により、生理食塩水を注射したマウスと比較して、ｍｉＲ−２９ａまたはｍｉＲ−２９ｃのレベルには影響を及ぼすことなく、ｍｉＲ−２９ｂのレベルが特異的に上昇する。１日目におけるｍｉＲ−２９ｃの増加は、リアルタイムプローブのいくらかの交差反応性に起因する可能性がある。群当たりｎ＝４。

図８は、ベースライン条件下でｍｉＲ−２９ｂ模倣物によりいかなる標的変化も誘導されないことを示すグラフである。リアルタイムＰＣＲ分析により、１２５ｍｐｋのｍｉＲ−２９ｂ模倣物を注射した後の示されている時点において、生理食塩水を注射したマウスと比較して、Ｃｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１について有意な標的変化はないことが示された。群当たりｎ＝４。

図９は、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物がＲＡＷ細胞における遺伝子発現に影響を及ぼすことを示すグラフである。リアルタイムＰＣＲ分析により、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置後に、ビヒクルまたは対照模倣物と比較してＣｓｆ３、Ｉｇｆ１、およびＫｃの発現の有意な増加が示された。^＊ビヒクル注射と比較してｐ＜０．０５。

（図１０Ａ）図１０Ａは、ｍｉＲ２９ｂ模倣物および抗ｍｉＲがマウス皮膚における遺伝子発現に影響を及ぼすことを示す図である。マイクロアレイデータのヒートマップが示されており、上方制御された遺伝子が赤色で表され、下方制御された遺伝子が青色で表されており、色の強度によりＰＢＳ対照に対する倍数変化が表されている。ヒートマップの上の部分（細かい破線の枠）は、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置によって抑制され、抗ｍｉＲ−２９を用いた処置によって上方制御される遺伝子を含有し、ヒートマップの下の部分（幅が広い破線の枠）は、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置によって上方制御され、抗ｍｉＲ−２９を用いた処置によって抑制される遺伝子を含有する。全ての倍数変化および有意値を表５に示す。（図１０Ｂ）図１０Ｂは、ｍｉＲ２９ｂ模倣物および抗ｍｉＲがマウス皮膚における遺伝子発現に影響を及ぼすことを示すグラフである。図１０Ａに示されている２つの群に富化される機能性用語についてのＤＡＶＩＤ分析（ＮＣＢＩ）が示されている。細胞外マトリックス、（皮膚）機能、接着／細胞シグナル伝達および細胞分化／アポトーシスの遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語は、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置後に負に制御される経路の上位であり、細胞（核）構造およびＲＮＡプロセシングは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置後に正に制御される経路の上位である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける皮膚および急性皮膚創傷のマイクロアレイ解析により、配列番号２および配列番号１を含むｍｉＲ−２９ｂ模倣物、ならびに抗ｍｉＲ−２９（配列番号３６）を用いた皮内処置による２２８種の遺伝子の相反制御が示される。

図１１Ａは、皮内ｍｉＲ−２９ｂ模倣物（配列番号２／配列番号１）またはＰＢＳ対照を用いて処置したマウス切開創傷の定量的リアルタイム（ＲＴ）−ＰＣＲ分析についてのグラフである。データが群分けされた棒グラフとして示されており、例えば各処置群の最初の棒は右の一覧の最初の遺伝子の発現レベルを示す。ＲＴ−ＰＣＲにより、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置によって抑制されることが以前示されたコラーゲン、他の細胞外マトリックス遺伝子および他の直接および間接的な標的遺伝子（図１０ａ、ヒートマップの上半分）の発現が、急性皮膚創傷におけるｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置に伴って用量依存的に減少することが確認された。^＊＊＊＊処置および遺伝子を２つの評価因子として用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、ＰＢＳを用いて処置した切開に対してｐ＜０．０００１。

図１１Ｂは、定量的ＲＴ−ＰＣＲによると、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置で抑制解除されると以前同定された遺伝子（図１０Ａ、ヒートマップの下半分）の発現がｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置に伴って用量依存的に増加したことを示すグラフである。ＰＢＳを用いて処置した切開、処置および遺伝子を２つの評価因子として用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して^＊＊＊ｐ＜０．００１および^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、急性皮膚創傷におけるｍｉＲ−２９標的遺伝子の発現に有意に影響を及ぼす。

図１２は、ｍｉＲ−２９模倣物の活性およびヌクレオチド修飾の影響を示すグラフである。ＩＭＲ−９０ヒト肺線維芽細胞におけるトランスフェクション実験により、異なるｍｉＲ−２９模倣物は、コラーゲン遺伝子発現の抑制として測定される活性のレベルが異なることが示される。処置および遺伝子を２つの評価因子として用いた二元配置ＡＮＯＶＡを使用して、偽トランスフェクションに対して^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１および^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

図１３は、リンカー修飾を伴うｍｉＲ−２９ｂ模倣物のｉｎ ｖｉｖｏ活性を示すグラフである。切開創傷を有するマウスを、コレステロール部分と第２の／センス鎖の間の結合のみが異なる種々のｍｉＲ−２９ｂ模倣物を２０ｎｍｏｌで用いて処置した。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の活性を、５種のコラーゲン合成遺伝子の発現を測定することによって決定した。

図１４は、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の活性に対する５’リン酸化の影響を示すグラフである。ＲＡＢ−９皮膚線維芽細胞に、アンチセンス鎖に５’リン酸化を伴うｍｉＲ−２９ｂ模倣物（配列番号２／配列番号１）および伴わないｍｉＲ−２９ｂ模倣物（配列番号１９／配列番号１）を種々の濃度でトランスフェクトした。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の活性を、３種のコラーゲン合成遺伝子の発現を測定することによって決定した。

過去１０年間で、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）治療薬に対する大きな熱意が生じている。この興奮の一部は、ｍｉＲＮＡにより多数の関連するｍＲＮＡが制御されることも多いという事実に端を発する。そのように、単一のｍｉＲＮＡを調節することにより、特定の疾患に関与する多数の遺伝子を並行して制御することが可能になる。多くの試験により、ｍｉＲＮＡ阻害剤を使用した治療有効性が示されているが、ｍｉＲＮＡの機能を回復または増大させるための試みは遅れている。

ｍｉＲ−２９ファミリーの組織線維症における明白な機能に関して注目が集まっている。この線維芽細胞において富化されるｍｉＲＮＡファミリーは、線維性疾患において下方制御され、これにより、多くの細胞外マトリックス遺伝子の協調した増加が誘導される。本発明者らは、合成ＲＮＡ２重鎖の投与により、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるｍｉＲ−２９レベルを数日にわたって上昇させることができることを見いだした。さらに、これらのｍｉＲ−２９模倣物をブレオマイシンにより誘導される肺線維症の間に治療的送達することにより、内在性ｍｉＲ−２９機能が回復し、それにより、コラーゲン発現が減少し、肺線維症が遮断され、元に戻る。さらに、本発明のｍｉＲ−２９模倣物を皮膚切開に投与することにより、細胞外マトリックス遺伝子および線維化プロセスに関与する他の遺伝子が下方制御される。これらのデータにより、ｍｉＲＮＡを治療的に増加させるために有効なｍｉＲＮＡ模倣物の設計の実現性が支持され、また、ｍｉＲ−２９が、コラーゲン産生の増加を伴う種々の線維状態および障害を処置するための強力な治療用ｍｉＲＮＡであることが示される。したがって、本発明は、ｍｉＲ−２９模倣物、組成物およびその使用を提供する。

本発明によるマイクロＲＮＡ模倣化合物は、第１の鎖と第２の鎖とを含み、第１の鎖は成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂまたはｍｉＲ−２９ｃ配列を含み、第２の鎖は第１の鎖と実質的に相補的な配列を含み、また、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する。本開示全体を通して、「ｍｉｃｒｏＲＮＡ模倣化合物」という用語は、「ｐｒｏｍｉＲ−２９」「ｍｉＲ−２９アゴニスト」、「マイクロＲＮＡアゴニスト」、「マイクロＲＮＡ模倣物」、「ｍｉＲＮＡ模倣物」または「ｍｉＲ−２９模倣物」という用語と互換的に使用され得、「第１の鎖」という用語は、「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語と互換的に使用され得、「第２の鎖」という用語は、「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語と互換的に使用され得、「ｍｉＲ−２９アンタゴニスト」という用語は、「オリゴヌクレオチド阻害剤」、「抗ｍｉＲ−２９」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、「ｍｉＲ−２９アンタゴミル」または「抗マイクロＲＮＡオリゴヌクレオチド」という用語と互換的に使用され得る。

一実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は、成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、またはｍｉＲ−２９ｃ配列を含む約２３〜約２６ヌクレオチドを含み、第２の鎖は、第１の鎖と部分的に、実質的に、または完全に相補的な配列を含む約２２〜約２３ヌクレオチドを含む。種々の実施形態では、第１の鎖は約２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドを含み得、第２の鎖は約２２または２３ヌクレオチドを含み得る。

マイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖および第２の鎖を形成するヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、およびこれらの組合せを含み得る。ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖および第２の鎖は、リボヌクレオチドおよび／または修飾されたリボヌクレオチドを含む。「修飾されたヌクレオチド」という用語は、修飾されていないヌクレオチドと比較して核酸塩基および／または糖部分が修飾されているヌクレオチドを意味する。

ある特定の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物は、配列が成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、またはｍｉＲ−２９ｃ配列の全部または一部と同一である第１の鎖またはアンチセンス鎖と、配列が第１の鎖の配列と約７０％〜約１００％相補的である第２の鎖またはセンス鎖とを有する。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖は、成熟した天然に存在するｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、またはｍｉＲ−２９ｃ配列の配列全体と、間の全ての整数を含めて少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％同一である。ある特定の実施形態では、第１の鎖は、マウス、ヒト、またはラットｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、またはｍｉＲ−２９ｃ配列などの、成熟した天然に存在するｍｉＲＮＡの配列と約または少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。あるいは、第１の鎖は、配列アラインメントアルゴリズムおよび当技術分野で周知の方法によって比較して、成熟した天然に存在するｍｉＲＮＡと共通するヌクレオチド位を２０カ所、２１カ所、２２カ所、または２３カ所含み得る。

第１の鎖が、天然に存在するヌクレオチドの代わりに、修飾されたヌクレオチドを含む場合であっても、第１の鎖の配列は成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、またはｍｉＲ−２９ｃ配列と同一であるとみなされることが理解される。例えば、成熟した天然に存在するｍｉＲＮＡ配列が特定の位置にシチジンヌクレオチドを含む場合、模倣化合物の第１の鎖は、対応する位置に２’−フルオロ−シチジンなどの修飾されたシチジンヌクレオチドを含んでよい、または、成熟した天然に存在するｍｉＲＮＡ配列が特定の位置にウリジンヌクレオチドを含む場合、模倣化合物の第１の鎖のｍｉＲＮＡ領域は、対応する位置に２’−フルオロ−ウリジン、２’−Ｏ−メチル−ウリジン、５−フルオロウラシル、または４−チオウラシルなどの修飾されたウリジンヌクレオチドを含んでよい。したがって、修飾されたヌクレオチドが、成熟した天然に存在するｍｉＲＮＡ配列に存在するヌクレオチドと同じ塩基対合能を有する限りは、第１の鎖の配列は、成熟した天然に存在するｍｉＲＮＡ配列と同一であるとみなされる。一部の実施形態では、第１の鎖は、５’末端残基の修飾を含んでよい。例えば、第１の鎖は、５’末端一リン酸を有してよい。一部の他の実施形態では、第１の鎖は、５’末端一リン酸を含有しない。

一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣物の第２の鎖は、第１の鎖の配列と部分的に相補的である。例えば、第２の鎖の配列は、第１の鎖の配列と、間の全ての値を含めて少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的である。一部の他の実施形態では、第２の鎖は、第１の鎖の配列と実質的に相補的である。例えば、第２の鎖は、第１の鎖の配列と、間の全ての値を含めて少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％相補的である。さらなる一部の他の実施形態では、第２の鎖の配列は、第１の鎖と完全に相補的であってよい。ある特定の実施形態では、第２の鎖の相補的な領域の約１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドが第１の鎖と相補的であってよい。

第２の鎖が、天然に存在するヌクレオチドの代わりに、修飾されたヌクレオチドを含む場合であっても、第２の鎖の配列は第１の鎖と相補的であるとみなされることが理解される。例えば、第１の鎖配列が特定の位置にグアノシンヌクレオチドを含む場合、第２の鎖は、対応する位置に２’−Ｏ−メチル−シチジンなどの修飾されたシチジンヌクレオチドを含んでよい。

一部の実施形態では、第２の鎖は、第１の鎖に対してミスマッチを約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ含む。すなわち、第１の鎖と第２の鎖の間で最大１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのヌクレオチドが相補的でなくてよい。一実施形態では、ミスマッチは連続しておらず、第２の鎖全体を通して分布している。別の実施形態では、ミスマッチは連続しており、バルジが創出されていてよい。一実施形態では、第２の鎖は、第１の鎖に対してミスマッチを３つ含有する。ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ模倣物またはｍｉＲ−２９ｃ模倣物の第２の鎖は、第１の鎖に対して、３’末端（第２の鎖の）から４位、１３位、および／または１６位におけるミスマッチを含有する。一実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の第２の鎖は、第１の鎖に対して、３’末端（第２の鎖の）から４位、１３位、および／または１６位におけるミスマッチを含有する。別の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の第２の鎖は、第１の鎖に対して、３’末端（第２の鎖の）から４位、９位、１０位、１１位、１３位および／または１６位におけるミスマッチを含有する。

一部の実施形態では、模倣化合物の第１の鎖および／または第２の鎖は、鎖の５’末端または３’末端に突出部を有してよい。ある特定の実施形態では、第１の鎖は、３’突出部、すなわち、第２の鎖に対して２重鎖領域を越えて伸長した一本鎖領域を含む。第１の鎖の３’突出部は、約１ヌクレオチドから約４ヌクレオチドまでにわたってよい。ある特定の実施形態では、第１の鎖の３’突出部は、１つまたは２つのヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、第１の鎖における３’突出部を含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合している。第１の鎖に３’突出部を含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、またはこれらの組合せを含んでよい。ある特定の実施形態では、第１の鎖内の３’突出部は、２つのリボヌクレオチドを含む。一実施形態では、第１の鎖の３’突出部は、ホスホロチオエート結合によって結合した２つのウリジンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第１の鎖は突出部を含有しなくてよい。

一実施形態では、本発明のｍｉＲ−２９模倣物の第２の／センス鎖内のヌクレオチドはホスホジエステル結合によって結合しており、第１の／アンチセンス鎖内のヌクレオチドは、３’末端の最後の３ヌクレオチドがホスホロチオエート結合によって互いと結合している以外はホスホジエステル結合によって結合している。

種々の実施形態では、本発明のｍｉＲ−２９模倣物は、修飾されたヌクレオチドを含む。例えば、一実施形態では、模倣物の第１の鎖は、１つまたは複数の２’−フルオロヌクレオチドを含む。別の実施形態では、第１の鎖は、いかなる修飾されたヌクレオチドも含まなくてよい。一実施形態では、第２の鎖は、１つまたは複数の２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドを含む。

種々の実施形態では、本発明によるｍｉＲ−２９模倣物は、下の表に列挙されている第１の鎖と第２の鎖とを含む。修飾の定義は表４に示されている。これらのｍｉＲ−２９模倣化合物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０１８４９３に記載されている使用および条件を含め、細胞において細胞外マトリックス遺伝子の発現を制御するため、ならびに関連する状態、例えば、組織線維症、皮膚線維症などを処置するために有用である。

ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ模倣物は、配列番号２７を含む第１の鎖と配列番号５を含む第２の鎖とを含む。他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ模倣物は、配列番号７を含む第１の鎖と配列番号５を含む第２の鎖とを含む。

一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、配列番号１９を含む第１の鎖と配列番号１を含む第２の鎖とを含む。一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、配列番号２を含む第１の鎖と配列番号１を含む第２の鎖とを含む。さらなる一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、配列番号１９を含む第１の鎖と配列番号１５を含む第２の鎖とを含む。さらなる一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、配列番号３３を含む第１の鎖と配列番号１を含む第２の鎖とを含む。さらなる一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、配列番号３４を含む第１の鎖と配列番号１を含む第２の鎖とを含む。さらなる一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は、配列番号１９を含む第１の鎖と配列番号３０を含む第２の鎖とを含む。

ある特定の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｃ模倣物は、配列番号３５を含む第１の鎖と配列番号２４を含む第２の鎖とを含む。他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ｃ模倣物は、配列番号２６を含む第１の鎖と配列番号２４を含む第２の鎖とを含む。

本発明のマイクロＲＮＡ模倣化合物に使用することができる修飾されたヌクレオチドは、塩基修飾または置換を伴うヌクレオチドを含んでよい。ＲＮＡ内の天然の塩基または修飾されていない塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるシトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）である（ＤＮＡはチミン（Ｔ）を有する）。対照的に、修飾された塩基は、複素環式塩基部分とも称され、それらとして、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ））、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシンを含む）、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの、他の合成の核酸塩基および天然の核酸塩基が挙げられる。

一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物は、修飾された糖部分を有するヌクレオチドを有してよい。代表的な修飾された糖としては、炭素環式または非環式糖、２’位、３’位または４’位のうちの１つまたは複数に置換基を有する糖、および糖の１つまたは複数の水素原子の代わりに置換基を有する糖が挙げられる。ある特定の実施形態では、糖は、２’位に置換基を有することにより修飾されたものである。追加的な実施形態では、糖は、３’位に置換基を有することにより修飾されたものである。他の実施形態では、糖は、４’位に置換基を有することにより修飾されたものである。糖は、これらの位置のうちの１つ超に修飾を有してよいこと、または、ＲＮＡ分子は、１つの位置に糖修飾を伴う１つまたは複数のヌクレオチドを含んでよく、異なる位置に糖修飾を伴う１つまたは複数のヌクレオチドも含んでよいことも意図されている。

ｍｉＲＮＡ模倣化合物において意図されている糖修飾としては、これだけに限定されないが、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、またはＮ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、またはＮ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニルまたはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される置換基が挙げられ、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換されていても置換されていなくてもよいＣ_１〜Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２〜Ｃ_１０アルケニルおよびアルキニルであってよい。

一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣化合物は、以下から選択される糖置換基を有する：Ｃ_１〜Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、または同様の置換基。一実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、これは、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても公知である）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。別の修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥおよび２’−ジメチルアミノエトキシエトキシとしても公知のＯ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基（同様に当技術分野において２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても公知である）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２−Ｎ（ＣＨ_３）_２を含む。

２’位（２’−）の糖置換基は、アラビノ（上）位にあってもリボ（下）位にあってもよい。１つの２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。他の同様の修飾が糖部分の他の位置、特に３’末端ヌクレオシドまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチド上の糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位になされてもよい。

ある特定の実施形態では、糖修飾は、２’−Ｏ−アルキル（例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル）、２’−ハロ（例えば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ）、および４’チオ修飾である。例えば、一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、またはｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物の第１の鎖は、１つまたは複数の２’フルオロヌクレオチドを含む。別の実施形態では、模倣化合物の第１の鎖は、修飾されたヌクレオチドを有さない。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、またはｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物の第２の鎖は、１つまたは複数の２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドを含む。

本発明のマイクロＲＮＡ模倣化合物の第１の鎖および第２の鎖は、１つまたは複数のホスホロチオエート結合、モルホリノ結合、またはホスホノカルボン酸結合などの骨格修飾も含んでよい（例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６９３，１８７号および同第７，０６７，６４１号を参照されたい）。例えば、一部の実施形態では、第１の鎖における３’突出部を含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合によって結合している。

一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ模倣化合物を、ｉｎ ｖｉｖｏにおける送達および安定性を容易にするために、ステロイド（コレステロール）、ビタミン、脂肪酸、炭水化物または配糖体、ペプチド、または他の小分子リガンドなどの担体分子とコンジュゲートする。担体分子は、マイクロＲＮＡ模倣化合物の第２の鎖の３’末端または５’末端にリンカーまたはスペーサー基を通じて付着していることが好ましい。種々の実施形態では、担体分子は、コレステロール、コレステロール誘導体、コール酸またはコール酸誘導体である。その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２０２，２２７号に開示されている担体分子の使用も構想される。ある特定の実施形態では、担体分子はコレステロールであり、第２の鎖の３’末端または５’末端に少なくとも６炭素リンカーを通じて付着している。一実施形態では、担体分子は、第２の鎖の３’末端に、６炭素リンカーまたは９炭素リンカーを通じて付着している。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能なリンカーである。種々の実施形態では、リンカーは、実質的に直鎖状の炭化水素部分を含む。炭化水素部分は、約３〜約１５個の炭素原子を有してよく、例えばエーテル結合またはチオエーテル結合など、比較的非極性である基を通じてコレステロールとコンジュゲートすることができる。ある特定の実施形態では、炭化水素リンカー／スペーサーは、任意選択で置換されているＣ２〜Ｃ１５飽和または不飽和炭化水素鎖（例えばアルキレンまたはアルケニレン）を含む。その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国付与前公開第２０１２／０１２８７６１号に記載されている種々のリンカー／スペーサー基を本発明において使用することができる。

種々の実施形態では、本発明は、線維状態の処置、好転、または予防を必要とする対象において線維状態を処置する、好転させる、または予防する方法であって、対象に、治療有効量の本明細書に記載のｍｉＲ−２９ａ模倣物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物、および／またはｍｉＲ−２９ｃ模倣物のうちの少なくとも１つを投与するステップを含む方法を提供する。本発明のｍｉＲ−２９模倣物を使用して処置することができる線維状態としては、これだけに限定されないが、肺線維症、心臓線維症、肝線維症、腎線維症、糖尿病性線維症、骨格筋線維症、および眼線維症などの組織線維症；ならびにケロイド、皮膚硬化症、全身性硬化症（強皮症）、肥厚性瘢痕（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒ）、手／関節／腱線維症、およびペイロニー病などの皮膚（ｄｅｒｍａｌ／ｃｕｔａｎｅｏｕｓ）線維症が挙げられる。一実施形態では、本発明のｍｉＲ−２９模倣物を使用して処置される線維状態は、特発性肺線維症である。ある特定の線維状態の処置におけるｍｉＲ−２９アゴニストの使用は、これによって参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４４０，６３６号に記載されている。

一実施形態では、本発明のｍｉＲ−２９模倣物を投与することにより、対象の細胞における１つまたは複数の細胞外マトリックス遺伝子の発現または活性が低下する。別の実施形態では、本発明のｍｉＲ−２９模倣物を投与することにより、対象の細胞における１つまたは複数のコラーゲン合成遺伝子の発現または活性が低下する。さらに別の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣物を投与することにより、皮膚発生、表皮発生、外胚葉発生および細胞恒常性に関与する１種または複数種の遺伝子の発現または活性が上方制御される。種々の遺伝子の発現または活性が本発明のｍｉＲ−２９模倣物によって制御される対象の細胞としては、線維芽細胞および表皮細胞が挙げられる。一部の実施形態では、ｍｉＲ−２９模倣物を投与することにより、線維症に付随する炎症反応が下方制御される。例えば、ｍｉＲ−２９模倣物を投与することにより、線維症患者における、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＧＣＳＦ、およびＴＮＦ−αなどの炎症促進性サイトカインのレベルが低下する。ｍｉＲ−２９模倣物を投与することにより、好中球、リンパ球、単球、およびマクロファージなどの免疫エフェクター細胞の線維性組織または臓器への浸潤も減少する。

ある特定の実施形態では、本発明は、細胞において細胞外マトリックス遺伝子を制御する方法であって、細胞を、本発明のｍｉＲ−２９模倣物と接触させるステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、細胞においてコラーゲン合成遺伝子を制御する方法であって、細胞を、本発明のｍｉＲ−２９模倣物と接触させるステップを含む方法を提供する。処置または接触に際して、ｍｉＲ−２９模倣物により、細胞外マトリックス遺伝子またはコラーゲン合成遺伝子の発現または活性が低下する。

本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」という用語は、これだけに限定することなく、ヒトおよび他の霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、家畜哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、ウサギ、齧歯類、例えばマウス、ラット、およびモルモットなど）、ならびに鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類の鳥類、アヒル、ガチョウなどの家禽、野鳥および猟鳥）を含めた任意の脊椎動物を指す。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。他の実施形態では、対象は、ヒトである。

本発明は、ｍｉＲ−２９アゴニスト（例えば、薬物またはｍｉＲ−２９模倣物）またはｍｉＲ−２９アンタゴニスト（例えば、薬物または抗ｍｉＲ−２９）を用いた処置の有効性を評価する方法も提供する。例えば、一実施形態では、治療有効性を評価するための方法は、ｍｉＲ−２９模倣物またはｍｉＲ−２９アンタゴニストを用いた処置の前に対象の細胞または線維性組織における１種または複数種の遺伝子の発現のレベルを決定するステップであって、１種または複数種の遺伝子が、ｍｉＲ−２９によって調節される遺伝子、例えば表５に列挙されている遺伝子のセットから選択されるステップと、ｍｉＲ−２９模倣物またはｍｉＲ−２９アンタゴニストを用いた処置の後に対象の細胞／線維性組織における同じ１種または複数種の遺伝子の発現レベルを決定するステップと、処置の前後の発現レベルに基づいて、処置に効果があるか、効果が少ないか、または効果がないかを決定するステップとを含む。すなわち、一実施形態では、表５に列挙されている遺伝子は、ｍｉＲ−２９模倣物またはｍｉＲ−２９アンタゴニストによる処置の臨床的有効性についてのバイオマーカーとしての機能を果たす。一実施形態では、処置の前後の遺伝子の発現に統計的有意差があることにより、処置が有効であることが示される。別の実施形態では、処置の前後の遺伝子の発現に少なくとも１倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、または４倍の差異があることにより、処置が有効であることが示される。

本発明は、治療有効量の本発明による１つまたは複数のｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、および／またはｍｉＲ−２９ｃのマイクロＲＮＡ模倣化合物またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。

一実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のｍｉＲ−２９ａ模倣化合物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含み、ここで、模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−２９ａ配列を含み、第２の鎖は第１の鎖と実質的に相補的である。別の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含み、ここで、模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列を含み、第２の鎖は第１の鎖と実質的に相補的である。さらに別の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量のｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含み、ここで、模倣化合物の第１の鎖は成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含み、第２の鎖は第１の鎖と実質的に相補的である。

一部の実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の本発明のマイクロＲＮＡ模倣化合物を少なくとも２つと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。例えば、医薬組成物は、ｍｉＲ−２９ａ模倣物とｍｉＲ−２９ｂ模倣物の組合せ；ｍｉＲ−２９ａ模倣物とｍｉＲ−２９ｃ模倣物の組合せ；またはｍｉＲ−２９ｂ模倣物とｍｉＲ−２９ｃ模倣物の組合せを含んでよい。あるいは、組成物は、同じマイクロＲＮＡの模倣物を２つ含んでよい。さらなる一部の他の実施形態では、本発明は、治療有効量の３つの本発明のマイクロＲＮＡ模倣化合物と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。例えば、医薬組成物は、ｍｉＲ−２９ａ模倣物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物およびｍｉＲ−２９ｃ模倣物の組合せを含んでよい。

本発明によるマイクロＲＮＡ模倣化合物を少なくとも２つ含む医薬組成物では、第１の模倣化合物および第２の模倣化合物または第１の模倣化合物、第２の模倣化合物および第３の模倣化合物は等モル濃度で存在することが好ましい。他の混合比、例えば、約１：２、１：３、１：４、１：５、１：２：１、１：３：１、１：４：１、１：２：３、１：２：４なども、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、およびｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物のうちの少なくとも２つを含む医薬組成物の調製に関して構想される。

一部の実施形態では、１つまたは複数の本発明のマイクロＲＮＡ模倣化合物は、同時であるが別々の組成物として投与することができ、同時にとは、模倣化合物が短い期間内、例えば、互いに約５分以内、１０分以内、２０分以内、または３０分以内にもたらされることを指す。一部の他の実施形態では、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、および／またはｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物は、別々の組成物として異なる時間に投与することができる。

本発明は、追加的な治療剤をｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、および／またはｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物と一緒に投与することができる実施形態も包含する。一実施形態では、追加的な治療剤は、第２の抗線維化剤である。追加的な治療剤は、同時であるが別々の製剤として投与することもでき、逐次的に投与することもできる。他の実施形態では、追加的な治療剤は、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、および／またはｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物の投与の前後の異なる時間に投与することができる。臨床的適用が意図されている場合、医薬組成物を意図された適用に適した形態に調製する。一般に、これには、発熱物質、ならびにヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することが伴う。

巨大分子の複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、リポソームおよびエキソソームを含めた脂質に基づく系を、ｍｉＲ−２９ａ模倣化合物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣化合物、および／またはｍｉＲ−２９ｃ模倣化合物の送達ビヒクルとして使用することができる。一部の実施形態では、本発明のｍｉＲ−２９模倣物は、リポソーム粒子に製剤化することができ、これは、次いで吸入による送達のためにエアロゾル化することができる。

本発明の核酸を標的組織に送達するために適した市販の脂肪乳剤としては、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の同様の脂質乳剤が挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏにおける送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。そのような系の調製および使用は当技術分野において周知である。例示的な製剤は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ５，９８１，５０５；ＵＳ６，２１７，９００；ＵＳ６，３８３，５１２；ＵＳ５，７８３，５６５；ＵＳ７，２０２，２２７；ＵＳ６，３７９，９６５；ＵＳ６，１２７，１７０；ＵＳ５，８３７，５３３；ＵＳ６，７４７，０１４；およびＷＯ０３／０９３４４９にも開示されている。

ある特定の実施形態では、送達のために使用するリポソームは、米国付与前公開第２０１１００７６３２２号に詳しく記載されているＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）（Ｍａｒｉｎａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）のような両性リポソームである。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）の表面電荷は十分に可逆的であり、それにより、ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）が核酸を送達するために特に適したものになっている。ＳＭＡＲＴＩＣＬＥＳ（登録商標）は、注射によって送達することができ、安定なままであり、また、凝集体を含まず、細胞膜を横断して核酸を送達する。

一般に、送達ビヒクルを安定化し、標的細胞による取り込みを可能とするために適切な塩および緩衝液を使用することが所望される。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散させたｍｉＲ−２９模倣物（例えば、リポソームまたは他の複合体）を含む有効量の送達ビヒクルを含む。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という句は、動物またはヒトに投与された際に有害反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ヒトに投与するために適した医薬品などの医薬品の製剤化における使用が許容される溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤は、本発明の活性成分と適合しない場合を除く限りでは、治療用組成物へのその使用が意図されている。補足の活性成分も、組成物のポリヌクレオチドを不活化しないことを条件として、組成物に組み入れることができる。

一実施形態では、本発明の医薬組成物は、肺、経鼻、鼻腔内または眼への送達用に製剤化され、散剤、水溶液、水性エアロゾル、点鼻剤、エアロゾル、および／または点眼剤の形態であってよい。経鼻／鼻腔内投与用の固形製剤は、ラクトースまたはデキストランなどの賦形剤を含有してよい。経鼻／鼻腔内投与用の液体製剤は、エアロゾル、点鼻剤または定量噴霧剤の形態で使用するための水性溶液または油性溶液であってよい。肺／経鼻／鼻腔内投与用の製剤は、例えば、グリココール酸、コール酸、タウロコール酸、エトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、グリコデオキシコール酸、これらの酸の塩、およびシクロデキストリンなどの界面活性物質も含んでよい。

一部の実施形態では、吸入による肺／経鼻／鼻腔内投与用の製剤としては、これだけに限定されないが、乾燥粉末製剤、リポソーム製剤、ナノ懸濁製剤（ｎａｎｏ−ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、またはマイクロ懸濁製剤（ｍｉｃｒｏｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）が挙げられる。

一部の実施形態では、肺／経鼻／鼻腔内送達用の医薬組成物は、吸入デバイスを使用して投与される。「吸入デバイス」という用語は、ｍｉＲ−２９模倣物組成物を対象の呼吸気道に投与することができる任意のデバイスを指す。吸入デバイスとしては、定量用量吸入器（ＭＤＩ）、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、ジェットネブライザー、超音波ネブライザー、加熱式気化器、ソフトミスト吸入器、温熱エアロゾル吸入器、電気流体力学に基づく溶液ミスト化吸入器などのデバイスが挙げられる。吸入デバイスとしては、高効率ネブライザーも挙げられる。一部の実施形態では、ネブライザーは、ジェットネブライザー、超音波ネブライザー、脈動膜ネブライザー（ｐｕｌｓａｔｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ）、振動メッシュまたは多数の開口部を有するプレートを含むネブライザー、振動発生装置および水性チャンバーを含むネブライザー、または、エアロゾル化した水溶液の対象の肺への吸気流を補助することを特徴とする制御デバイスを使用するネブライザーである。ネブライザー、定量用量吸入器、およびソフトミスト吸入器は、容易に吸入することができる液滴サイズを含むエアロゾルを形成することによって医薬品を送達するものである。

一部の実施形態では、高効率ネブライザーを用いて投与される組成物は、１つまたは複数のｍｉＲ−２９模倣物と、例えば精製水、マンニトール、界面活性物質、ならびに塩化ナトリウムおよびナトリウムＥＤＴＡなどの塩など薬学的に許容される賦形剤または担体とを含む。

本発明の活性な組成物は、典型的な医薬調製物を含んでよい。本発明に従ったこれらの組成物の投与は、標的組織に到達可能な限りは、任意の一般的な経路によるものであってよい。この経路としては、経口、経鼻（例えば、吸入によるもの）、眼、または頬側が挙げられる。あるいは、投与は、静脈内、皮内、皮下、眼内または筋肉内注射によるものであってもよく、肺組織または心臓組織への直接注射によるものであってもよい。ｍｉＲＮＡ模倣物を含む医薬組成物は、治療剤を心臓に送達するためのカテーテル系または冠循環を隔離する系によって投与することもできる。治療剤を心臓および冠状動脈の脈管構造に送達するための種々のカテーテル系が当技術分野で公知である。本発明において使用するために適したカテーテルに基づく送達方法または冠状動脈隔離方法のいくつかの非限定的な例は、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４１６，５１０号；米国特許第６，７１６，１９６号；米国特許第６，９５３，４６６号、ＷＯ２００５／０８２４４０、ＷＯ２００６／０８９３４０、米国特許出願公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許出願公開第２００６／０１４８７４２号、および米国特許出願公開第２００７／００６０９０７号に開示されている。そのような組成物は、通常、本明細書に記載の薬学的に許容される組成物として投与される。

本発明の別の実施形態では、本明細書に記載のｍｉＲ−２９模倣物を含む組成物は、ステント、バルーン、またはカテーテルなどの医療機器のコーティングとして製剤化することができる。対象における心臓線維症を処置する方法において特に有用であり、ｍｉＲ−２９模倣物を使用して、金属ステントをコーティングして薬物溶出ステントを作製することができる。薬物溶出ステントは、細胞増殖および／または炎症を予防するために、狭窄したまたは疾患にかかっている動脈を広げ、化合物を放出する足場である。アゴニストまたは阻害剤を経時的に放出させるために薄いポリマーに包埋された金属ステントに模倣化合物を適用することができる。デバイスに基づく送達の方法およびデバイスをコーティングする方法は、薬物溶出ステントおよび他の埋め込み型デバイスのように、当技術分野で周知である。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，２９４，３２９号、同第７，２７３，４９３号、同第７，２４７，３１３号、同第７，２３６，８２１号、同第７，２３２，５７３号、同第７，１５６，８６９号、同第７，１４４，４２２号、同第７，１０５，０１８号、同第７，０８７，２６３号、同第７，０８３，６４２号、同第７，０５５，２３７号、同第７，０４１，１２７号、同第６，７１６，２４２号、および同第６，５８９，２８６号、およびＷＯ２００４／００４６０２を参照されたい。したがって、本発明は、ｍｉＲ−２９模倣物でコーティングしたバルーン、カテーテル、またはステントなどの医療機器を含む。

滅菌された注射用溶液は、適量の活性化合物を所望の任意の他の成分（例えば、上に列挙されている通り）と一緒に溶媒に組み入れ、その後、濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌活性成分を、基本的な分散媒および所望の他の成分、例えば上に列挙されているものを含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。

本発明の組成物は、一般には、中性または塩の形態に製剤化することができる。薬学的に許容される塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）に由来する酸付加塩（タンパク質の遊離のアミノ基と形成される）が挙げられる。タンパク質の遊離のカルボキシル基と形成される塩は、無機塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄）または有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）に由来するものであってもよい。

溶液は、製剤化されたら、投薬形態（ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）と適合する様式で、かつ治療的に有効な量で投与することが好ましい。製剤は、例えば注射剤、薬物放出カプセル剤、薬物溶出ステントまたは他のコーティングされた血管デバイスなど種々の剤形で容易に投与することができる。水溶液として非経口投与するためには、例えば、一般に、溶液を適切に緩衝させ、液体希釈剤をまず例えば十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張性にする。そのような水溶液は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、眼内投与、および腹腔内投与のために使用することができる。

本発明を以下のさらなる実施例によってさらに例示し、これらの実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。

本開示全体を通して参照される特許および非特許文献は全て、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（実施例１）
ｍｉＲ−２９模倣物のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
機能的有効性を試験するために、第１の鎖として配列番号２を含有し、第２の鎖として配列番号１を含有するｍｉＲ−２９ｂ模倣物をマウス線維芽細胞株（ＮＩＨ ３Ｔ３）にトランスフェクトし、ｍｉＲ−２９の公知の直接標的遺伝子（ｖａｎ Ｒｏｏｉｊら、２００８年）であるコラーゲン１ａ１（Ｃｏｌ１ａ１）発現に対する効果を、ｑＰＣＲを使用して測定した。ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の量を増加させることにより、無処理の細胞、偽トランスフェクト（いかなるオリゴも用いない）細胞または非標的対照（ＮＴＣ）オリゴを用いて処理した細胞と比較してＣｏｌ１ａ１の用量依存的な減少が示された。これにより、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物が機能的であることが示される。Ｃｏｌ１ａ１を直接標的とするｓｉＲＮＡを陽性対照として使用した（図１Ｂ）。

（実施例２）
ｍｉＲ−２９模倣物のｉｎ ｖｉｖｏ分布、安定性およびクリアランス
ｍｉＲ−２９模倣物のｉｎ ｖｉｖｏにおける適用性および分布を探究するために、マウスに、第１の鎖として配列番号２を含有し、第２の鎖として配列番号１を含有するｍｉＲ−２９ｂ模倣物を１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、または１２５ｍｇ／ｋｇで静脈内注射し、４日後に屠殺した。

全ＲＮＡを心臓組織試料から、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（フェノールおよびグアニジンイソチオシアネートの溶液）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用することによって単離した。マイクロＲＮＡを検出するためのノーザンブロットを以前に記載されている通り実施した（ｖａｎ Ｒｏｏｉｊら、２００８年）。Ｕ６プローブがローディング対照としての機能を果たした（ＩＤＴ）。示されている組織由来の全ＲＮＡ１０μｇを２０％アクリルアミド変性ゲルにローディングし、電気泳動により、Ｚｅｔａ−ｐｒｏｂｅ ＧＴゲノムブロッティングメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に転写した。転写後、ブロットを架橋し、８０℃で１時間加熱乾燥した。ｍｉＲＮＡ検出の感度を最大にするために、オリゴヌクレオチドプローブをＳｔａｒｆｉｒｅ Ｏｌｉｇｏｓ Ｋｉｔ（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）およびα−^３２Ｐ ｄＡＴＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍまたはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて標識した。Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中、３９℃で終夜プローブをメンブレンにハイブリダイズさせ、その後、０．１％ＳＤＳを含有する０．５×ＳＳＣを用いて３９℃で１０分にわたって２回洗浄した。ブロットについて感光を行い、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ分析（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって数量化した。Ｕ６プローブがローディング対照としての機能を果たした（ＡＢＩ）。ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒおよびＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し、放射性シグナルの強度を使用して発現の倍数変化を数量化した。

リアルタイムＰＣＲ分析のために、ＲＮＡを心臓組織から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出し、その後、各組織試料由来のＲＮＡ１〜２μｇを使用し、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素を製造者の仕様書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って使用してｃＤＮＡを生成した。Ｔａｑｍａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＡＢＩ）を製造者の推奨に従って使用し、全ＲＮＡ１０〜１００ｎｇを用いてｍｉＲＮＡまたは遺伝子の変化を検出した。Ｕ６をｍｉＲＮＡ解析についての対照として使用し、ＧＡＰＤＨを遺伝子分析についての対照として使用した。

多数の組織に対するノーザンブロット分析により、腎臓または肝臓試料中のｍｉＲ−２９ｂは生理食塩水対照と比較してわずかに増加するか全く増加しないことが示された。心臓への分布は検出されたが、これはかなり変動するものと思われ、脾臓への送達は最高用量でのみ観察することができた。しかし、肺への送達は、注射の４日後に最高用量の３つ全てで観察することができた（図１Ｃ）。血漿において肝機能（トランスアミナーゼ、ＡＬＴ）への影響は観察されなかった。これにより、これらのｍｉＲＮＡ模倣物がこれらの用量で耐容性がよいことが示される（図５）。リアルタイムＰＣＲにより、同様の結果が実証され、生理食塩水を注射した動物と比較してｍｉＲ−２９ｂ模倣物が肺にロバストに用量依存的に分布した（図１Ｄ）。さらに、ｍｉＲ−２９標的のリアルタイムＰＣＲ分析では、最高用量での脾臓におけるＣｏｌ３ａ１について以外は、処置した動物におけるｍＲＮＡレベルでの制御は示されなかった（図６）。これにより、標的遺伝子が無ストレス動物では定常状態であり、模倣物は標的遺伝子が上昇した場合にそれらを低下させることか、または、機能的送達が不適切であったか不十分であったことが示唆される。

ｍｉＲＮＡ模倣物のｉｎ ｖｉｖｏにおける安定性に関してより多くの洞察を得るために、マウスに１２５ｍｐｋのｍｉＲ−２９ｂ模倣物を注射し、１日後、２日後、４日後、または７日後に屠殺した。注射の１日後に、検査した全ての組織においてノーザンブロットおよびリアルタイムＰＣＲ分析のどちらによってもロバストなｍｉＲ−２９ｂ模倣物の存在を検出することができたが、その後の組織クリアランスは著しく異なった（図１Ｅおよび１Ｆ）。肝臓および腎臓では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物が急速に消え、１日目の後の検出は最小であった。肺および脾臓では、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の最も著しい検出が経時的に実証され、これは少なくとも処置後４日間持続した（図１Ｅおよび１Ｆ）。増加は、リアルタイムＰＣＲによって測定したところｍｉＲ−２９ｂに特異的であり、ｍｉＲ−２９ａおよびｍｉＲ−２９ｃレベルに対してはいかなる影響もなかった（図７）。同様に、ｍｉＲ−２９標的のリアルタイムＰＣＲ分析では、無ストレス動物におけるｍＲＮＡレベルでの下方制御は示されなかった（図８）。

これらのデータをまとめると、定式化されていないｍｉＲ−２９ｂ模倣物により、ｍｉＲＮＡレベルを上昇させることができ、クリアランスおよび送達効率は組織依存性であり、ベースライン条件下で遺伝子発現に対してはいかなる明白な影響もないことが示される。
（実施例３）
ｍｉＲ−２９ｂ模倣物によりブレオマイシンにより誘導される肺線維症が鈍化する

組織線維症の現行の処置は、大部分が炎症反応を標的とすることに依拠するものであるが、これらの処置は、疾患の進行の予防において最終的には効力がなく、これにより、新しい機構的な洞察および治療的手法の必要性が強調される（Ｆｒｉｅｄｍａｎら、２０１３年）。最近の試験により、肺線維症におけるｍｉＲＮＡの関与が示されている（Ｐａｎｄｉｔら、２０１１年）。

ｍｉＲ−２９ｂ模倣物は肺に優先的に分布するので、ストレスおよびその後の標的遺伝子発現の誘導により、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置に応答した、ｍＲＮＡ標的遺伝子および下流の治療効果の検出可能な変化が可能になるかどうかという問いを探究した。これを試験するために、肺線維症のブレオマイシンにより誘導されるモデルを以前に記載されている通り使用した（Ｐａｎｄｉｔら、２０１０年）。詳細には、マウスを、４０％イソフルラン溶液に浸漬したペーパータオルを有するチャンバー内に入れることによって麻酔した。０．０３７５Ｕのブレオマイシン（Ｈｏｓｐｉｒａ、ＩＬ）を０．９％生理食塩水５０μｌ中に入れて気管内に投与した。初期線維症に対するｍｉＲ−２９ｂ模倣の効果を決定するために、対照（生理食塩水を用いて処置した）およびブレオマイシンを用いて処置したマウスに、１００ｍｇ／ｋｇの、第１の鎖として配列番号２を含有し、第２の鎖として配列番号１を含有するｍｉＲ−２９ｂ模倣物、対照模倣物または同等の体積の生理食塩水を２つの時点：ブレオマイシンを用いた処置の３日後および１０日後に注射し、１４日目に動物を屠殺し、肺を採取した。確立された線維症に対するｍｉＲ−２９ｂ模倣の効果を決定するために、ブレオマイシンまたは生理食塩水による処置後１０日目、１４日目および１７日目にｍｉＲ−２９ｂ模倣物を投与し、２１日目にマウスを屠殺した。どちらのプロトコールにおいても、組織学的分析、ヒドロキシプロリンアッセイおよびＲＮＡ抽出のために肺を採取した。

予測通り、ブレオマイシンを用いた処置の１４日後にｍｉＲ−２９レベルが低下したが、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置の結果、ｍｉＲ−２９ｂの検出レベルは、リアルタイムＰＣＲによって測定したところ、高レベルの変動を伴うが対照または生理食塩水を注射した動物のいずれかと比較して上昇した（図２Ａ）。同様のｍｉＲ−２９レベルの低下がヒトにおいて観察されるかどうかを決定するために、肺移植を受けた特発性肺線維症（ＩＰＦ）の患者由来の生検材料または肺外植片の外科的残遺物から１６の肺組織試料を得た。試料は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋから入手した。特発性肺線維症（ＩＰＦ）の患者の肺生検材料において、正常対照と比較したｍｉＲ−２９レベルの同等の低下が観察された（図２Ｂ）。

組織学的検査に関しては、群当たり動物２匹、動物当たり２つのスライスで、肺組織切片（４μｍ）をＭａｓｓｏｎ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ（コラーゲン／結合組織）で染色した。パラフィン除去、水和、およびブロッキングの後、製造者（ＡＢＣ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒｍ Ｖｅｃｔｏｒ’ｓ ｌａｂ、ＵＳＡ）の推奨に従って免疫染色を実施した。切片を一次抗体（Ｉｇｆ１、ＰＢＳ中１：１００に希釈）と一緒に４℃で終夜インキュベートし、二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）と一緒に室温で１時間インキュベートした。切片をヘマトキシリンで対比染色した。陰性対照として、一次抗体を非免疫血清で置き換えた。最後に、封入剤（ＤＡＫＯ、ＵＳＡ）を用いて切片を封入し、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡を使用して分析した。組織学的分析により、ブレオマイシンを用いた処置に対して明白かつロバストな線維化反応および炎症反応が示され、これは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置によって鈍化した（図２Ｃ）。

さらに、総コラーゲン含有量に関して、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ（Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）からのヒドロキシプロリン比色定量アッセイキットを製造者の説明書に従って用いて肺ヒドロキシプロリンを分析した。簡単に述べると、対照マウスおよび実験マウス由来の肺を一定の重量まで乾燥させ、１２ＮのＨＣｌ中、１２０℃で３時間にわたって加水分解した。消化物をＣｈｌｏｒａｍｉｎｅ Ｔ試薬と反応させ、ＤＭＡＢ試薬で可視化した。マイクロプレートリーダーで５６０ｎｍにおける吸光度を測定した。データはヒドロキシプロリンのμｇ数／右肺として表されている。

ヒドロキシプロリン分析により、生理食塩水を用いた処置群および対照を用いた処置群のどちらにおいてもブレオマイシンを用いた処置後に有意な増加が示されたが、ｍｉＲ−２９模倣物を用いた処置群では生理食塩水を用いて処置したマウスとブレオマイシンを用いて処置したマウスの間に統計学的差異はなかった。これにより、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置により、ブレオマイシンにより誘導される肺線維症が鈍化することが示される（図２Ｄ）。

自然免疫エフェクターシグナル伝達経路は、線維症を惹起することによって筋線維芽細胞分化転換の重要な駆動因子としての機能を果たす。ブレオマイシンにより誘導される肺線維症の状況におけるｍｉＲ−２９ｂ模倣物の治療効果をさらに特徴付けるために、これらのマウスに対して気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施し、Ｂｉｏ−Ｒａｄからのヒトサイトカイン／ケモカインパネルを使用してサイトカインレベルを評価した。全手順を製造者の説明書に従って実施した。簡単に述べると、ＢＡＬを５倍希釈し、９６ウェルフィルタープレートでアッセイを実施した。検出ステップに関しては、試料をＲ−フィコエリトリンとコンジュゲートしたストレプトアビジンと一緒に３０分インキュベートし、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ懸濁液アレイシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で分析した。Ｂｉｏｐｌｅｘ Ｍａｎａｇｅｒ ｓｏｆｔｗａｒｅ ６．０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して生データを解析した。製造者から供給されるサイトカイン標準物質を使用して試料の濃度を算出した。検出範囲を下回った分析物はデータ解釈には含めなかった。また、検出範囲を下回る特定の分析物を有する試料は中央値の算出の間排除した。

ブレオマイシンを用いて処置したマウス由来の肺からのＢＡＬ液では有意に高い濃度のＩＬ−１２、ＩＬ−４およびＧ−ＣＳＦが検出可能であり、これは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いると低下した（図２Ｅ〜２Ｇ）。さらに、ＢＡＬ液中の検出可能な免疫細胞のブレオマイシンにより誘導される増加がｍｉＲ−２９ｂ模倣物の存在下では有意に低下した（図２Ｈ）。これにより、ｍｉＲ−２９ｂによる免疫応答に対する阻害効果が示され、これは、抗線維化効果の二次的なものである可能性がある。ｍｉＲ−２９模倣にマクロファージに対する直接効果があるかどうかを決定するために、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物または対照をマクロファージ細胞であるＲＡＷ２６４．７にトランスフェクトし、トランスフェクトの２４時間後および４８時間後に細胞の上清を採取した。ＩＦＮ−ｒ、ＩＬ−１Ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＫＣ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２Ｐ７０、およびＴＮＦ−αを評価し、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物と対照の間に有意差は観察されなかった（データは示していない）。リアルタイムＰＣＲ分析では、Ｔｇｆｂ１、Ｃｔｇｆ、ＦＧＦ１、またはＰＤＧＦの発現に有意差はなかったが、Ｃｓｆ３、Ｉｇｆ１、およびＫｃの発現には有意差が観察された（図９およびデータは示していない）。

ｍｉＲ−２９が多くの異なる細胞外マトリックス関連遺伝子の制御を通じて機能することは十分に検証されているので（ｖａｎ ＲｏｏｉｊおよびＯｌｓｏｎ、２０１２年）、これらの標的遺伝子のサブセットの制御を確認した。ブレオマイシンを用いた処置に伴って、生理食塩水を用いた処置群および対照を用いた処置群のどちらにおいてもＣｏｌ１ａ１の有意な増加およびＣｏｌ３ａ１発現の上昇の傾向が観察されたが、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の存在下では、ブレオマイシンを用いて処置したマウスにおけるＣｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１の検出は有意に鈍化した（図３Ａおよび３Ｂ）。興味深いことに、ブレオマイシンを用いた処置後のＢＡＬ液中のＩｇｆ１レベルの上昇は、ｍｉＲ−２９模倣物の存在下では、生理食塩水を用いて処置したマウスおよび対照を用いて処置したマウスのどちらと比較しても有意に鈍化した（図３Ｃ）。さらに、Ｉｇｆ１についての免疫組織化学的検査により、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いて処置した群では生理食塩水または対照と比較して、ブレオマイシン後にＩｇｆ１がロバストに減少することが実証された（図３Ｄ）。

初期（３日目および１０日目）ｍｉＲ−２９模倣がブレオマイシンにより誘導される線維症を予防するために十分であることが確立された後、確立された線維症に影響を及ぼすｍｉＲ−２９模倣の能力を調査した。この目的のために、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の投与をブレオマイシン後１０日目に開始し、１４日目および１７日目に投薬を繰り返し、その後、２１日目に肺を採取した。右肺のヒドロキシプロリン評価により、生理食塩水を用いて処置した肺および対照を用いて処置した肺のどちらにおいてもブレオマイシンに伴う有意な増加が示されたが、この影響はｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置により鈍化した（図４Ａ）。さらに、ブレオマイシンを用いた処置により、Ｃｏｌ１ａ１発現およびＣｏｌ３ａ１発現が有意に増加し、これも、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置に伴って正常化した（図４Ｂおよび４Ｃ）。三色染色による組織学的評価から、この効果、および、それにより、生理食塩水を用いた処置または対照を用いた処置ではブレオマイシンにより有意な線維症が誘導され、それはｍｉＲ−２９ｂ模倣を用いると鈍化することが確証された（図４Ｄ）。

これらの観察された効果は肺線維芽細胞からのコラーゲン産生の制御により媒介されたものと考えられたが、他のコラーゲン産生細胞による効果を除外することはできなかった。この問題に取り組むために、ＩＰＦ患者由来の初代線維芽細胞および肺上皮の細胞株であるＡ５４９細胞を含めた異なる肺細胞から、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の効果をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて評価した。予測通り、ＩＰＦ患者由来の初代肺線維芽細胞ではＴＧＦ−αに応答してＣｏｌ１ａ１およびＣｏｌ３ａ１の増加が示された（図４Ｅおよび４Ｆ）。この効果は、２４時間および４８時間のどちらの時点でもｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置に伴って用量依存的に鈍化した（図４Ｅ、４Ｆおよびデータは示していない）。同様に、Ａ５４９細胞は、ＴＧＦ−αに応答し、Ｃｏｌ１ａ１発現およびＣｏｌ３ａ１発現がロバストに増加する（図４Ｇおよび４Ｈ）。やはり、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置により、ＴＧＦ−αを用いた処置条件ならびにベースライン条件の両方においてコラーゲン誘導を遮断することができる（図４Ｇおよび４Ｈ）。コラーゲン誘導に対する効果は、Ａ５４９細胞では、初代ＩＰＦ細胞と比較してはるかにロバストである。しかし、これは、おそらくＩＰＦ患者由来の初代線維芽細胞では発現がすでに高いことに起因する。さらに、マクロファージ株であるＴｈｐ−１におけるｍｉＲ−２９の効果も調査したが、刺激に関係なく細胞においてコラーゲン発現を観察することはできなかった（データは示していない）。これらのデータから、ｍｉＲ−２９ｂ模倣により、線維芽細胞および上皮細胞におけるコラーゲンにより誘導される発現を鈍化させることが示唆される。これらのデータは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ−トランスポゾンシステムを使用したｍｉＲ−２９の遺伝子移入により、ブレオマイシンにより誘導される肺線維症を予防および処置することができたことが示されたＸｉａｏらによる論文と一致し（Ｘｉａｏら、２０１２年）、これにより、ｍｉＲ−２９を増加させることの治療的潜在性がさらに強調される。

本明細書に記載のデータから、喪失したまたは下方制御されたｍｉＲＮＡの機能を回復させるためにマイクロＲＮＡ模倣物を使用することの実現性が示される。しかし、適切なｍｉＲＮＡ機能にはＲＩＳＣへの組み入れが必要であるので、合成オリゴヌクレオチド模倣物の構造的特徴の慎重な設計が必要であることに留意することが重要である。さらに、本出願におけるデータから、適切な細胞型または組織への送達により、有効なｍｉＲＮＡ模倣がもたらされることが示される。例えば、肺線維症の場合では、吸入経路によって直接送達することにより、従来の投与経路と比較してより良好な処置有効性がもたらされる。
（実施例４）
ｍｉＲ−２９ｂ模倣物により、皮膚における細胞外マトリックス産生が鈍化する

臓器線維症に加えて、いくつかの試験により、肥厚性瘢痕（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒ）およびケロイドなどの皮膚線維症、ならびに全身性硬化症（強皮症）の皮膚および他の形態におけるｍｉＲ−２９の役割が示されている。例えば、全身性硬化症の患者から得た線維芽細胞および皮膚切片では、健康な対照と比較してｍｉＲ−２９ａレベルの劇的な低下が示された（Ｍａｕｒｅｒら、２０１０年）。全身性硬化症の線維芽細胞において過剰発現させると、ｍｉＲ−２９ａは、ＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方でＩ型コラーゲンおよびＩＩＩ型コラーゲンの発現をロバストに低下させることができた。逆に、正常な線維芽細胞においてｍｉＲ−２９を阻害した結果、これらのコラーゲンが増加した。さらに、ブレオマイシンを用いて処置した皮膚でも同様にｍｉＲ−２９の有意な減少が示された。これにより、ｍｉＲ−２９の下方制御が線維症の兆候に多数に広範に適用可能であることが示唆される（Ｍａｕｒｅｒら、２０１０年）。これらの結果は、別の試験においてさらに検証され、健康な対照皮膚線維芽細胞にｍｉＲ−２９ａをトランスフェクションすることにより、コラーゲン発現が有意に下方制御された。さらに、皮膚線維芽細胞においてｍｉＲ−２９ａを過剰発現させることにより、分泌されるＴＩＭＰ−１が減少し、コラーゲンゲル分解が増加した。これらの結果は、全身性硬化症の患者由来の線維芽細胞においても同様に検証された（Ｃｉｅｃｈｏｍｓｋａら、２０１４年）。これらの試験を合わせると、ｍｉＲ−２９模倣には、皮膚線維症を含めた線維症の局所形態および全身性硬化症における治療的潜在性があることが示される。

皮膚におけるｍｉＲ−２９アゴニズムまたはアンタゴニズムの効果を決定するために、マウス切開創傷モデルを使用した。詳細には、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、吸入チャンバーを使用して２〜５％吸入イソフルランで麻酔し、全ての手順にわたってノーズコーンで１％イソフルラン下に維持した。全ての外科手技に関してブプレノルフィン（０．１ｍｇ／ｋｇ）を鎮痛薬として使用した。動物を麻酔し、シェービングおよびＮａｉｒ脱毛クリームの投与によって脱毛し、皮膚部位をベタジンおよびアルコールによる外科的洗浄によって切開のために調製した。マウスの背中に１〜２つの１ｃｍの長さの皮膚切開を作出した。切開を２〜５の結節縫合で閉じ、Ｔｅｇａｄｅｒｍ ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ半密封包帯（３Ｍ）で覆った。切開創傷創出の３日後に、切開皮膚創傷を有するマウスまたは有さないマウスを、ビヒクル（ＰＢＳ）、１００ｎｍｏｌのｍｉＲ−２９ｂ模倣物（第１の鎖として配列番号２を含み、第２の鎖として配列番号１を含む）または１００ｎｍｏｌの抗ｍｉＲ−２９の皮内注射を用いて、オリゴヌクレオチド化合物またはビヒクル（ＰＢＳ）を、切開正中線の側面のいずれかへの５０μＬ体積での皮内注射を２回行うか、無傷の皮膚に近接して１００μＬ体積での皮内注射を単回行うかより処置した。抗ｍｉＲ−２９は、５’−ｌＧｓ．ｄＡｓ．ｄＴｓ．ｄＴｓ．ｌＴｓ．ｌＣｓ．ｄＡｓ．ｌＡｓ．ｄＡｓ．ｌＴｓ．ｌＧｓ．ｄＧｓ．ｌＴｓ．ｄＧｓ．ｌＣｓ．ｌＴｓ−３’（配列番号３６）の配列を有し、ここで、「ｌ」はロックドヌクレオチドを表し、「ｄ」はデオキシリボヌクレオチドを表し、「ｓ」はホスホロチオエート結合を表す。ｍＲＮＡ発現を分析するために、オリゴヌクレオチド化合物の投与の２４時間後にマウスを屠殺し、処置部位（複数可）の皮膚を採取し、液体窒素でスナップ凍結した。

全ＲＮＡを皮膚から、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して抽出し、ＧＡＰＤＨ、Ｂ２Ｍ、ＨＰＲＴ１およびＰＰＩＢを皮膚試料の遺伝子分析の対照として使用した以外は上記の通り、リアルタイムＰＣＲ分析を実施した。

マイクロアレイ解析に関しては、試料当たり１μｇの全ＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔアレイ（Ｍｏｕｓｅ ＧＥ（Ｖ２）、４×４４ｋ−０２６６５５）でのマウス普遍的参照ＲＮＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ）と比較したマイクロアレイ解析のためにＭＯｇｅｎｅに送付した。解析はＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏを使用して行われ、Ｒソフトウェアプログラムを使用してヒートマップが作成された。

マイクロアレイ解析を使用して、ＰＢＳ対照に対して正に制御される遺伝子および負に制御される遺伝子を同定した。２２８種の遺伝子が相反的に制御された（ｍｉＲ−２９ｂ模倣物と抗ｍｉＲ−２９の間でｐ＜０．０５または倍数変化＞１．５）（図１０および表５）。これらのｍｉＲ−２９により制御される遺伝子および他の種におけるそれらのオルソログは、ｍｉＲ−２９アゴニストまたはｍｉＲ−２９アンタゴニストを用いた処置への応答を示す翻訳バイオマーカーとして利用することができる。

２つの群に富化される機能性用語のＤＡＶＩＤ分析（ＮＣＢＩ）を図１０Ｂに示す。驚くことではないが、細胞外マトリックス、（皮膚）機能、接着／細胞シグナル伝達および細胞分化／アポトーシスの遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語は、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置後に負に制御される経路の上位である。細胞（核）構造およびＲＮＡプロセシングは、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置後に正に制御される経路の上位である。

ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置の皮膚における効果をさらに確認するために、急性切開創傷を有するマウスを、ＰＢＳ、２０ｎｍｏｌ、５０ｎｍｏｌ、または１００ｎｍｏｌのｍｉＲ−２９ｂ模倣物（第１の鎖として配列番号２を含み、第２の鎖として配列番号１を含む）の皮内注射を用いて処置した。皮膚におけるｍｉＲ−２９調節の直接または間接的な標的であると同定された２４種の遺伝子（１９種はｍｉＲ−２９ｂ模倣物によって抑制され、抗ｍｉＲ−２９によって上方制御されるものであり、５種はｍｉＲ−２９ｂ模倣物によって上方制御され、抗ｍｉＲ−２９によって抑制されるものである）に対して定量的逆転写酵素ＰＣＲ分析を実施した。細胞外マトリックス遺伝子（コラーゲン、ＥＬＮなど）および線維化プロセスに関与する他の遺伝子（例えば、ＭＭＰ２、ＴＧＦＢ２）は、皮膚において、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置によって抑制されることが示されたが（図１１Ａ）、選択された細胞表面受容体（ＩＴＧＡ３、ＬＢＲ、ＮＵＭＢ、ＳＤＣ４）および受容体エンドサイトーシスに関連する因子（ＳＮＸ２７）は、皮膚において、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物を用いた処置に伴って増加することが示された（図１１Ｂ）。これらの試験により、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物が皮膚において局所的に処置された場合に活性であることが示され、また、臓器線維症に対する効果に加えて、ｍｉＲ−２９模倣が種々の病因の皮膚線維症に対する有効な療法であり得ることが示唆される。これらの試験により、上記の遺伝子が、皮膚においてその発現がｍｉＲ−２９ｂ模倣物の活性と相関する翻訳バイオマーカーであることも同定された。これらの翻訳バイオマーカーは、正常な健康な志願者および皮膚強皮症の患者におけるｍｉＲ−２９ｂ模倣物の安全性および有効性を試験する臨床試験において利用することができる。
（実施例５）
ｍｉＲ−２９模倣物の活性およびヌクレオチド修飾の影響

標的遺伝子の発現の制御におけるｍｉＲ−２９ａ模倣物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物、およびｍｉＲ−２９ｃ模倣物の有効性を決定するために、異なるｍｉＲ−２９ａ模倣物、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物、およびｍｉＲ−２９ｃ模倣物を１０ｎＭの濃度でＩＭＲ−９０ヒト肺線維芽細胞にトランスフェクトし、コラーゲン発現を定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。これらの試験により、多数のコラーゲン遺伝子の発現の抑制において、第１の鎖として配列番号２７を含み、第２の鎖として配列番号５を含むｍｉＲ−２９ａ模倣物および第１の鎖として配列番号１９を含み、第２の鎖として配列番号１を含むｍｉＲ−２９ｂ模倣物が最も有効であり、第１の鎖として配列番号３５を含み、第２の鎖として配列番号２４を含むｍｉＲ−２９ｃ模倣物の有効性はより低いことが実証される（図１２）。これらの効果は、細胞型または標的遺伝子に特異的なものである可能性があるが、３種の模倣物の細胞外マトリックス遺伝子発現を抑制する能力に実際に差異があることが示される。

同じ実験において、ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の有効性に対するヌクレオチド修飾の影響も試験した。これらの試験により、第１の鎖として配列番号１９を含有し、第２の鎖として配列番号１を含有するｍｉＲ−２９ｂ模倣物が、第１の鎖として配列番号１９を含み、第２の鎖として配列番号３０を含む、第１および第２の配列およびパターンが同じであるがセンス（パッセンジャー）鎖とコレステロールの間の化学的リンカーが異なるｍｉＲ−２９ｂ模倣物と同様に機能することが示される。２’Ｏ−メチル修飾のチェッカーボードパターンにより、ｍｉＲ−２９模倣物（第１の鎖として配列番号３１を含み、第２の鎖として配列番号２８を含む模倣物および第１の鎖として配列番号３２を含み、第２の鎖として配列番号２９を含む模倣物）が完全に効力のないものになる。アンチセンス（第１の／ガイド）鎖の全てのＣ残基およびＵ残基の修飾（第１の鎖として配列番号３３を含み、第２の鎖として配列番号１を含む模倣物）では、模倣活性が部分的に低下する。同様に、アンチセンス鎖の３’突出部の除去（第１の鎖として配列番号２４を含み、第２の鎖として配列番号１を含む模倣物）では模倣活性が部分的に低下する。図１２を参照されたい。

これらの試験により、特定の細胞株（ＩＭＲ−９０）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ活性に基づいて、および、特定の標的遺伝子（ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ５）を有効性の読み取りとして使用して、化合物の取り込みとは独立して、ｍｉＲ−２９模倣化合物を層別化することが可能になり、また、これらの試験は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて受動的な送達によって試験するかまたはｉｎ ｖｉｖｏにおいて試験する化合物を選択するための基礎として使用することができる。
（実施例６）
リンカー修飾を伴うｍｉＲ−２９ｂ模倣物のｉｎ ｖｉｖｏ活性

切開創傷を有するマウスを、コレステロール部分と第２の／センス鎖の間の結合のみが異なる種々のｍｉＲ−２９ｂ模倣物を２０ｎｍｏｌで用いて処置した。コレステロールとセンス鎖の間に６炭素リンカーを含有する模倣化合物（第１の鎖として配列番号１９を含み、第２の鎖として配列番号１を含む模倣物）およびコレステロールとセンス鎖の間に同じ６炭素リンカーを含有するが切断可能な部分（ｄＴ．ｄＴ）によって接続された化合物（配列番号１９／配列番号１５）では、標的遺伝子の抑制において同様の活性が示された（図１３）。図１３のＮ／Ｓは、第１の鎖として配列番号１９を含み、第２の鎖として配列番号１を含むｍｉＲ−２９ｂ模倣物の活性と、第１の鎖として配列番号１９を含み、第２の鎖として配列番号１５を含む模倣物の活性に有意差が観察されなかったことを表す。９炭素リンカーを含有するｍｉＲ−２９ｂ模倣物（配列番号１９／配列番号１７）および５’末端にリンカーを含有するｍｉＲ−２９ｂ模倣物（配列番号１９／配列番号１６）は、標的遺伝子の抑制において有効ではなかった（図１３）。
（実施例７）
ｍｉＲ−２９ｂ模倣物の活性に対する５’リン酸化の影響

ＲＡＢ−９皮膚線維芽細胞細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１４１４）に、アンチセンス鎖上の５’リン酸化を伴うｍｉＲ−２９ｂ模倣物（第１の鎖として配列番号２を含有し、第２の鎖として配列番号１を含有する模倣物）およびアンチセンス鎖上の５’リン酸化を伴わないｍｉＲ−２９ｂ模倣物（第１の鎖として配列番号１９を含有し、第２の鎖として配列番号１を含有する模倣物）を種々の濃度でトランスフェクトした。２種の模倣物の活性に関して、Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ１ａ２またはＣｏｌ３ａ１の発現によって測定される標的遺伝子の抑制に有意差は観察されなかった（図１４においてＮ／Ｓとして表される）。どちらのｍｉＲ−２９ｂ模倣物によっても標的遺伝子の発現がビヒクル、偽トランスフェクションまたは対照模倣物を用いた処置と比較して有意に（ｐ＜０．０００１）抑制された。図１４を参照されたい。
参考文献

Claims (37)

1. 成熟ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−２９ｂ、またはｍｉＲ−２９ｃ配列を含む、約２３〜約２６リボヌクレオチドの第１の鎖と、
   前記第１の鎖と実質的に相補的な配列を含み、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有する、約２２〜約２３リボヌクレオチドの第２の鎖と
   を含むｍｉＲ−２９模倣化合物であって、前記第１の鎖が、前記第２の鎖に対して３’ヌクレオチド突出部を有する、ｍｉＲ−２９模倣化合物。
2. 前記第１の鎖が、１つまたは複数の２’フルオロヌクレオチドを有する、請求項１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
3. 前記第１の鎖が、修飾されたヌクレオチドを有さない、請求項１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
4. 前記第２の鎖内の前記少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾されたヌクレオチドである、請求項１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
5. 前記第２の鎖が、前記第１の鎖に対してミスマッチを１つ、２つ、または３つ有する、請求項１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
6. 前記第２の鎖が、前記第１の鎖に対して、３’末端から４位、１３位、および／または１６位におけるミスマッチを含有する、請求項５に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
7. 前記第２の鎖が、その３’末端または５’末端においてコレステロール分子と結合している、請求項１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
8. 前記コレステロール分子が、前記第２の鎖と少なくとも６炭素リンカーを通じて結合している、請求項７に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
9. 前記第１の鎖における前記３’突出部を含むヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合によって結合している、請求項１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
10. 前記第１の鎖が、成熟ｍｉＲ−２９ｂ配列を含む、請求項１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
11. 前記第１の鎖が、配列番号２、１８〜２１、または３１〜３４から選択される配列を含む、請求項１０に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
12. 前記第２の鎖が、１、８〜１７、または２８〜３０から選択される配列を含む、請求項１０に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
13. 前記第１の鎖が配列番号１９の配列を含み、前記第２の鎖が配列番号１の配列を含む、請求項１０に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
14. 前記第１の鎖が配列番号１９の配列を含み、前記第２の鎖が配列番号１５の配列を含む、請求項１０に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
15. 前記第１の鎖が配列番号３３の配列を含み、前記第２の鎖が配列番号１の配列を含む、請求項１０に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
16. 前記第１の鎖が配列番号３４の配列を含み、前記第２の鎖が配列番号１の配列を含む、請求項１０に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
17. 前記第１の鎖が、成熟ｍｉＲ−２９ａ配列を含む、請求項１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
18. 前記第１の鎖が、配列番号６、７または２７の配列を含む、請求項１７に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
19. 前記第２の鎖が、配列番号３〜５から選択される配列を含む、請求項１８に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
20. 前記第１の鎖が配列番号２７の配列を含み、前記第２の鎖が配列番号５の配列を含む、請求項１７に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
21. 前記第１の鎖が、成熟ｍｉＲ−２９ｃ配列を含む、請求項１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
22. 前記第１の鎖が、配列番号２５、２６、または３５の配列を含む、請求項２１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
23. 前記第２の鎖が、配列番号２２〜２４から選択される配列を含む、請求項１９に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
24. 前記第１の鎖が配列番号３５の配列を含み、前記第２の鎖が、配列番号２４の配列を含む、請求項２１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物。
25. 有効量の請求項１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物または薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
26. 吸入用組成物である、請求項２５に記載の医薬組成物。
27. 細胞において細胞外マトリックス遺伝子を制御する方法であって、前記細胞を、請求項１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物または請求項２５に記載の医薬組成物と接触させるステップを含む方法。
28. 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２７に記載の方法。
29. 前記細胞が線維芽細胞または上皮細胞である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記細胞がｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおけるものである、請求項２７に記載の方法。
31. 組織線維症の処置または予防を必要とする対象において組織線維症を処置または予防する方法であって、前記対象に、請求項１に記載のｍｉＲ−２９模倣化合物または請求項２５に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法。
32. 前記組織線維症が、心臓線維症、肺線維症、腎線維症、肝線維症、強皮症、眼線維症、皮膚線維症である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記皮膚線維症が、肥厚性瘢痕（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒｒｉｎｇ）、ケロイド、手、関節または腱の線維症、およびペイロニー病からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記投与が吸入によるものである、請求項３１に記載の方法。
35. 前記ｍｉＲ−２９模倣化合物または前記医薬組成物が、定量用量吸入器、乾燥粉末吸入器、ネブライザー、加熱式気化器、ソフトミスト吸入器、温熱エアロゾル吸入器、または電気流体力学に基づく溶液ミスト化吸入器によって投与される、請求項３１に記載の方法。
36. ｍｉＲ−２９アゴニストまたはｍｉＲ−２９アンタゴニストを用いた処置の有効性を評価するための方法であって、前記ｍｉＲ−２９アゴニストまたはｍｉＲ−２９アンタゴニストを用いた処置の前に対象の細胞または線維性組織における１種または複数種の遺伝子の発現のレベルを決定するステップであって、前記１種または複数種の遺伝子が、ｍｉＲ−２９によって調節される遺伝子のセットから選択されるステップと、前記ｍｉＲ−２９アゴニストまたはｍｉＲ−２９アンタゴニストを用いた処置後に前記対象の細胞／線維性組織における同じ１種または複数種の遺伝子の発現レベルを決定するステップと、前記処置の前後の前記発現レベルに基づいて、前記処置に効果があるか、効果が少ないか、または効果がないかを決定するステップとを含む方法。
37. ｍｉＲ−２９によって調節される前記１種または複数種の遺伝子が、表５から選択される、請求項３６に記載の方法。