TWI430805B - 使用ｆｇｆ２３融合多肽之方法及組合物 - Google Patents

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Description

使用FGF23融合多肽之方法及組合物
本申請案主張2010年1月29日申請之美國申請案第12/696693號之優先權，該申請案之內容係以全文引用的方式併入本文中。
纖維母細胞生長因子(FGF)組成表現於許多生物體中之同源多肽生長因子家族(Ornitz及Itoh,Genome Biol. 2:reviews,3005.1-3005.12(2001))。在脊椎動物物種中，FGF在基因結構與胺基酸序列方面高度保留，彼此間具有13%至71%之胺基酸一致性。在人類中，有22個已知的FGF家族成員(FGF15為人類FGF19之小鼠直系同源物，因此不存在人類FGF15)。雖然在發育早期，FGF調控細胞增殖、遷移及分化，但在成年生物體中，FGF維持體內平衡，起組織修復作用且對損傷作出反應。
FGF藉由結合並藉此活化細胞表面FGF受體來執行作為生長因子之功能。FGF受體(FGFR)為酪胺酸激酶受體，其藉由FGFR自磷酸化、FRS2(FGF受體受質2)及ERK1/2(細胞外信號調控蛋白質激酶1/2)之磷酸化以及活化Egr-1(早期生長反應-1)來活化信號轉導。FGF亦對硫酸肝素蛋白聚糖具有高親和力。當結合至FGF時，硫酸肝素增強FGFR之活化。
α-Klotho基因編碼具有細胞外域及短細胞質域之130 kDa單次跨膜I型跨膜蛋白。α-Klotho蛋白質之細胞外域包含兩個子域，稱為KL-D1及KL-D2。此兩個子域與細菌及植物之β-葡糖苷酶享有序列同源性。α-Klotho蛋白質之細胞外域可藉由跨膜域結合至細胞表面，或可裂解並釋放至細胞外環境中。局部低細胞外Ca2+ 濃度似乎有助於細胞外域之裂解。
除α-Klotho以外，亦已鑑別α-Klotho之同源物β-Klotho(Ito等人,Mech. Dev. 98:115-9(2000))。β-Klotho亦為具有細胞外KL-D1及KL-D2子域之單次跨膜I型跨膜蛋白。
α-Klotho表現之調節已顯示在哺乳動物中產生與老化相關之特徵。經同種接合以喪失α-Klotho基因之功能突變的小鼠發展類似於人類老化之特徵，包括壽命縮短、皮膚萎縮、肌肉萎縮、動脈硬化、肺氣腫及骨質疏鬆症(Kuro-o等人,Nature,390:45-51(1997))。相反，α-Klotho基因在小鼠中過度表現相對於野生型小鼠可延長壽命並增加對氧化性應力之抗性(Kurosu等人,Science 309:1829-1833(2005)；Yamamoto等人,J. Biol. Chem. 280:38029-38034(2005))。
最近研究已顯示FGF23缺乏型小鼠與α-Klotho缺乏型小鼠之生物學特徵驚人地相似(Shimada等人,J. Clin. Invest. 113:561-568(2004)；Yoshida等人,Endocrinology 143:683-689(2002))，表明FGF23與α-Klotho之間存在功能串擾。此等研究致使在經同源FGF受體進行結合與信號傳導方面，將α-Klotho鑑別為FGF23專性搭配物(Urakawa等人,Nature 22:1524-6(2007))。α-Klotho基因主要表現於腎臟、副甲狀腺及脈絡叢中。假定α-Klotho之組織特異性表現限制向彼等組織傳導信號之FGF23之活化。
與FGF23/α-Klotho相似，β-Klotho在經其各別同源FGF受體進行結合與信號傳導方面為FGF19及FGF21之專性搭配物(Ogawa等人,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7(2007)；Lin等人,J. Biol. Chem. 282:27227-84(2007)；及Wu等人,J. Biol. Chem. 282:29069-72(2007))。該等研究亦已顯示，β-Klotho涉及調控組織特異性代謝活性。β-Klotho最初顯示與FGF21一起充當調控脂肪組織中之碳水化合物及脂質代謝之輔因子。β-Klotho連同FGF19一起調控肝臟中之膽汁酸代謝，因而可解釋β-Klotho缺乏型小鼠中之膽汁合成升高(Ito等人,J Clin Invest. 2005年8月；115(8):2202-8)。
美國專利第6,579,850號描述包含α-Klotho多肽之多肽及組合物。揭示人類及小鼠α-Klotho多肽。該專利亦揭示包含該等多肽之組合物適用於治療類似於過早老化之症候群、治療成人疾病及抑制老化。
美國專利第7,223,563號描述編碼FGF23多肽序列之分離之核酸或包含該分離之核酸的重組細胞。該專利進一步關於診斷及治療低磷酸鹽血性病症及高磷酸鹽血性病症、骨質疏鬆症、皮膚肌炎及冠狀動脈病的方法。
美國專利第7,259,248號描述編碼FGF21多肽序列之分離之核酸。該專利進一步關於診斷及治療肝臟疾病、與胸腺功能相關之病狀的方法，以及治療睪丸病狀之方法。
本發明係關於用融合多肽或可溶性多肽預防或治療年齡相關之病狀或代謝障礙的方法、用途、套組及組合物。本發明之融合多肽係由以下形成：FGF(例如FGF23)；及Klotho蛋白質或其活性片段(例如sKlotho)及/或Fc片段(例如FcLALA)；及視情況存在之連接子。在一些實施例中，FGF23經突變。在一些實施例中，本發明提供Klotho融合多肽，其包含Klotho蛋白質或其活性片段及纖維母細胞生長因子或其活性片段。在一些實施例中，該融合多肽包含Klotho多肽、FGF(諸如FGF23)及經修飾之Fc片段。該Fc片段可例如具有降低與Fc-γ受體之結合及增加之血清半衰期。包含sKlotho、FGF23及FcLALA(具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段)之融合蛋白質描述於SEQ ID NO. 46、47、48及49中。在一些實施例中，該融合多肽或蛋白質包含FGF(例如FGF23)或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)；及經修飾之Fc片段或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)。包含FGF23及FcLALA之融合蛋白質描述於SEQ ID NO. 50、51、52及53中。在一些實施例中，該融合多肽在FGF23中具有一或多個減少聚集及/或蛋白酶介導之裂解的突變。
在第一態樣中，本發明提供一種融合多肽，其具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子或其活性片段。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對之Fc-γ受體之親和力(例如降低之Ka或增加之Kd)及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。Klotho細胞外域可源自α或β Klotho同功異型物。此外，雖然主要參考纖維母細胞生長因子19、纖維母細胞生長因子21及纖維母細胞生長因子23描述Klotho融合多肽之FGF組分，但涵蓋23種已知FGF中之任一者均可用於實施本發明。本申請案之讀者可假定個別且特定地涵蓋α或β細胞外域與各人類FGF蛋白質或其活性片段之每一組合中之每一者。
根據本發明，Klotho蛋白質之細胞外域可包括Klotho蛋白質之KL-D1及KL-D2域中之一者或兩者，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)。在一些實施例中，本發明之Klotho融合多肽具有Klotho蛋白質之至少兩個細胞外子域或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)。舉例而言，該至少兩個細胞外子域可為呈串聯重複形式之至少兩個KL-D1域、呈串聯重複形式之至少兩個KL-D2域，或至少一個KL-D1域及至少一個KL-D2域。在多個實施例中，本發明之融合多肽包含全長α Klotho蛋白質之肽基酸28-292，或胺基酸28-982(SEQ ID NO:7)。在另一實施例中，本發明之融合多肽包含全長β Klotho蛋白質之胺基酸52-997。
在本發明之一實施例中，融合多肽之組分包含：(a)包含纖維母細胞生長因子23(FGF23)之多肽或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)，其中FGF23在Q156、C206及C244處中一或多個位置具有突變；及(b)具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段，或包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)；及視情況存在之(c)連接子。該等組分可例如由肽鍵化學連接或同框融合。其亦可經由連接子連接。多肽連接子之非限制性實例為SEQ ID NO: 11、12、13、14、15、16、17及18。該等連接子可包含至少一個且至多約30個SEQ ID NO: 11、12、13、14、15、16、17及18之重複單元。在另一非限制性實施例中，融合物包含(2)FGF或其活性片段及(3)經修飾之Fc片段。該融合物之各種組分可以任何順序以操作方式連接；多肽(1)可以操作方式連接至(2)或(3)之多肽的N末端；(2)之多肽可以操作方式連接至(1)或(3)之多肽的N末端；(3)之多肽可以操作方式連接至(1)或(2)之多肽的N末端。
根據本發明，Klotho蛋白質之細胞外子域、纖維母細胞生長因子及(視情況存在之)具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段可以多種定向及方式彼此以操作方式連接。舉例而言，Klotho蛋白質之細胞外子域可以操作方式連接至纖維母細胞生長因子之N末端，或者纖維母細胞生長因子可以操作方式連接至Klotho蛋白質之細胞外子域之N末端。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含Klotho蛋白質之sKlotho及連接子。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含α Klotho蛋白質之sKlotho及連接子。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含β Klotho蛋白質之sKlotho及連接子。在又一實施例中，本發明提供一種人類FGF蛋白質或其活性片段(例如無信號肽)及連接子。在一實施例中，本發明提供融合蛋白質、核酸分子或醫藥組合物，其係用於療法中或用作用於治療病理性病症的藥物。本發明亦涵蓋包含本發明之融合蛋白質之醫藥組合物及其用於治療或預防年齡相關之病狀或代謝障礙的用途。在一些實施例中，該融合蛋白質進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含具有信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(直接或經由連接子間接)與FGF-23融合。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含無信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(直接或經由連接子間接)與FGF-23融合。在另一實施例中，本發明提供具有信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(直接或經由連接子間接)與無信號之FGF-23融合。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含無信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(直接或經由連接子間接)與無信號肽之FGF-23融合。在一些實施例中，該融合蛋白質進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含具有信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(直接或經由連接子間接)與FGF-23(R179Q)變異體融合。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含無信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(直接或經由連接子間接)與FGF-23(R179Q)變異體融合。在另一實施例中，本發明提供具有信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(直接或經由連接子間接)與無信號肽之FGF-23(R179Q)變異體融合。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含無信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(直接或經由連接子間接)與無信號肽之FGF-23(R179Q)變異體融合。在一些實施例中，該融合蛋白質進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含：(a)包含纖維母細胞生長因子23(FGF23)之多肽或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)，其中FGF23在Q156、C206及C244處中一或多個位置具有突變；及(b)具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段，或包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域的多肽，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)；及視情況存在之(c)連接子。該等融合多肽揭示於SEQ ID NO: 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67及68中。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含(1)具有信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)；(2)連接子；及(3)無信號肽之FGF-23(R179Q)變異體，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含(1)無信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)；(2)連接子；及(3)無信號肽之FGF-23(R179Q)變異體，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)。在一些實施例中，本發明之融合多肽經糖基化。在一些實施例中，該融合蛋白質進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含(1)具有信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(SEQ ID NO: 44或SEQ ID NO: 45)或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)；(2)包含SEQ ID NO: 11之連接子；及(3)無信號肽之FGF-23(R179Q)變異體(SEQ ID NO: 43)，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含(1)無信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(SEQ ID NO: 7)，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)；(2)包含SEQ ID NO: 11之連接子；及(3)無信號肽之FGF-23(R179Q)變異體(SEQ ID NO: 43)，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)。在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含SEQ ID NO: 19、20、40或41之胺基酸序列。在一些實施例中，本發明之融合多肽經糖基化。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含具有信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(SEQ ID NO: 44或SEQ ID NO: 45)，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)；及包含SEQ ID NO: 11之連接子。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含無信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(SEQ ID NO: 7)；及包含SEQ ID NO: 11之連接子。在一些實施例中，本發明之融合多肽經糖基化。在一些實施例中，該融合蛋白質進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含人類FGF蛋白質或其活性片段(例如無信號肽)；及包含SEQ ID NO: 11之連接子。在一些實施例中，本發明之融合多肽經糖基化。在一些實施例中，該融合蛋白質進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含人類FGF蛋白質(例如FGF23)或其活性片段(例如無信號肽)；連接子(例如包含SEQ ID NO: 11之連接子)；及sKlotho(具有信號肽或無信號肽)，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)，或Fc-γ受體(例如FcLALA)；其中該FGF(例如FGF23)具有一或多個處於以下殘基處之突變：R179、Q156、C206及/或C244。在多個實施例中，該等突變為R179Q、Q156A、C206S及/或C244S。即使此等突變在人類、恆河猴(rhesus)、牛、小鼠及大鼠FGF23中為保留性突變，使其突變亦不妨礙FGF23活性。相反，使此等胺基酸突變因減少聚集、減少不想要之蛋白酶誘導之裂解及增加自細胞之蛋白質產生而出乎意料地增強蛋白質之品質。在多個實施例中，該包含一或多個FGF23突變之融合蛋白質經糖基化。
在一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物(例如呈肌肉內投藥形式)，其包含(例如作為唯一醫藥學活性成分)融合多肽(例如經糖基化或未糖基化)，該融合多肽包含(1)無信號肽之FGF-23(R179Q)變異體(SEQ ID NO: 43)或包含減少聚集及/或蛋白酶介導之裂解之其他突變的變異體，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)；(2)視情況存在之連接子，其包含SEQ ID NO: 11；及(3)具有信號肽之αKlotho蛋白質之sKlotho(SEQ ID NO: 44或SEQ ID NO: 45)，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)，或具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段；及該醫藥組合物用於治療病理性病症之療法或藥物的用途，例如治療及/或預防年齡相關之病狀(諸如肌肉萎縮)。在另一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物(例如呈肌肉內投藥形式)，其包含(例如作為唯一醫藥學活性成分)融合多肽(例如經糖基化或未糖基化)，該融合多肽包含(1)無信號肽之FGF-23(R179Q)變異體(SEQ ID NO: 43)或包含減少聚集及/或蛋白酶介導之裂解之其他突變的變異體，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)；(2)連接子，其包含SEQ ID NO: 11；及(3)無信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(SEQ ID NO: 7)，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)，或具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)；及該醫藥組合物用於治療病理性病症之療法或藥物的用途，例如治療及/或預防年齡相關之病狀(諸如肌肉萎縮)。在一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物(例如呈肌肉內投藥形式)，其包含(例如作為唯一醫藥學活性成分)融合多肽(例如經糖基化或未經糖基化)，該融合多肽包含SEQ ID NO: 19、20、40或41之胺基酸序列；及該醫藥組合物用於治療病理性病症之療法或藥物的用途，例如治療及/或預防年齡相關之病狀(諸如肌肉萎縮)。
在一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物(例如呈肌肉內投藥形式)，其包含(例如作為唯一醫藥學活性成分)融合多肽(例如經糖基化或未經糖基化)，該融合多肽包含具有信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(SEQ ID NO: 44或SEQ ID NO: 45)；及包含SEQ ID NO: 11之連接子；及該醫藥組合物用於治療及/或預防年齡相關之病狀(諸如肌肉萎縮)的用途。在另一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物(例如呈肌肉內投藥形式)，其包含(例如作為唯一醫藥學活性成分)融合多肽(例如經糖基化或未經糖基化)，該融合多肽包含無信號肽之α Klotho蛋白質之sKlotho(SEQ ID NO: 7)；及包含SEQ ID NO: 11之連接子；及該醫藥組合物用於治療病理性病症之療法或藥物的用途，例如治療及/或預防年齡相關之病狀(諸如肌肉萎縮)。在一些實施例中，該融合蛋白質進一步包含經修飾之Fc片段。
在一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含(例如作為唯一醫藥學活性成分)融合多肽(例如經糖基化或未經糖基化)，該融合多肽包含人類FGF蛋白質或其活性片段(例如無信號肽)；及包含SEQ ID NO: 11之連接子。
本發明亦涵蓋包含本發明之融合蛋白質之醫藥組合物及其用於治療病理性病症之療法或藥物的用途，例如治療或預防年齡相關之病狀(例如肌肉萎縮)或代謝障礙(例如糖尿病)。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 19之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 20之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 40之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 41之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 46之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 47之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 48之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 49之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 50之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 51之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 52之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 53之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 54之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 55之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 56之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 57之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 58之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 59之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 60之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 61之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 62之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 63之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 64之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 65之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 66之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 67之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其與SEQ ID NO: 68之一致性為至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。
在一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含具有信號肽之β Klotho蛋白質之sKlotho(直接或經由連接子間接)與FGF-19或其活性片段融合。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含無信號肽之β Klotho蛋白質之sKlotho(直接或經由連接子間接)與FGF-19或其活性片段融合。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含具有信號肽之β Klotho蛋白質之sKlotho(直接或經由連接子間接)與FGF-21或其活性片段融合。在另一實施例中，本發明提供一種融合多肽，其包含無信號肽之β Klotho蛋白質之sKlotho(直接或經由連接子間接)與FGF-21或其活性片段融合。
本發明提供編碼本文所述之任何Klotho融合多肽之核酸序列及含有該等核酸之宿主細胞。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
本發明亦提供具有本文所涵蓋之任何Klotho融合多肽的組合物。本發明之組合物可進一步包括肝素。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
本發明亦提供一種治療或預防個體之年齡相關之病狀的方法。向個體(例如人類)投與治療有效劑量之醫藥組合物以治療或預防年齡相關之病狀，該醫藥組合物含有具有Klotho蛋白質(例如α Klotho蛋白質)之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子或其活性片段的Klotho融合多肽。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。詳言之，本發明提供一種治療或預防肌肉萎縮之方法，該方法包含向個體(例如人類)投與治療有效量之具有αKlotho蛋白質之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子(或其活性片段)的融合多肽。
另外，本發明亦提供一種治療或預防個體之代謝障礙的方法。向個體投與治療有效劑量之醫藥組合物以治療代謝障礙，該醫藥組合物含有具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子(或其活性片段)的本發明之融合多肽。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。詳言之，具有β-Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子21的本發明之融合多肽適用於治療代謝障礙。
本發明之Klotho-FGF23融合多肽可用於治療或預防個體之高磷酸鹽血症或鈣質沉著。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。投與藥理學有效劑量之含有本發明Klotho融合多肽之醫藥組合物以治療或預防高磷酸鹽血症或鈣質沉著，該融合多肽具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子。詳言之，具有α Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子23之本發明Klotho融合多肽適用於治療高磷酸鹽血症或鈣質沉著。
本發明之Klotho-FGF23融合多肽可用於治療或預防個體之慢性腎病或慢性腎衰竭。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。投與治療有效劑量之含有本發明Klotho融合多肽之醫藥組合物以治療或預防慢性腎病或慢性腎衰竭，該融合多肽具有Klotho蛋白質(例如α Klotho蛋白質)之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子。
本發明之Klotho-FGF23融合多肽可用於治療或預防個體之癌症(例如乳癌)。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。投與治療有效劑量之含有本發明Klotho融合多肽之醫藥組合物以治療或預防癌症或乳癌，該融合多肽具有Klotho蛋白質(例如α Klotho蛋白質)之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子。
本發明提供包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域及FGF或其活性片段之融合多肽，其用於醫學中。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。在一實施例中，本發明提供包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域及FGF或其活性片段之融合多肽，其用於治療或預防肌肉萎縮。本發明亦提供一種治療或預防年齡相關之病狀(例如肌肉萎縮)的方法，該方法包含投與有需要之個體治療有效劑量之包含可溶性Klotho蛋白質之醫藥組合物。
此外，本發明提供上述肽及融合多肽或包含該等肽之醫藥組合物，其用於療法中、用作藥物或用於治療個體之病理性病症，例如年齡相關之病狀、代謝障礙、高磷酸鹽血症或鈣質沉著、慢性腎病或慢性腎衰竭，或用於預防癌症或乳癌。另外，本發明進一步提供本發明之多肽、核酸或醫藥組合物之用途，其用於製造治療病理性病症、尤其治療上述病症，較佳如肌肉萎縮之年齡相關之病狀的藥物。
本發明亦包括治療或預防個體之年齡相關之病症或代謝障礙的套組。該套組包括使用說明書及具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子的純化Klotho融合多肽。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
本發明亦提供一種用於產生本發明之Klotho融合多肽的套組。本發明之套組包括使用說明書及編碼具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子之Klotho融合多肽的核酸。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
在本發明之一實施例中，該融合多肽包含：(a)包含纖維母細胞生長因子的多肽，或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)；及(b)具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段或其功能活性變異體或衍生物(例如包含至少一個保留性胺基酸取代及/或一個胺基酸缺失之變異體)。
在本發明之一實施例中，(a)之多肽及(b)之多肽由多肽連接子連接。該連接子可重複1至30次或30次以上。
在本發明之一實施例中，該多肽連接子包含選自由以下組成之群的肽基酸序列：SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17及SEQ ID NO: 18。
在本發明之一實施例中，(a)之多肽由肽鍵連接至該多肽連接子之N末端，且(b)之多肽由肽鍵連接至該多肽連接子之C末端。
在本發明之一實施例中，該融合多肽進一步包含信號肽。
在本發明之一實施例中，該信號肽為IgG信號肽。
在本發明之一實施例中，該纖維母細胞生長因子為纖維母細胞生長因子-23或纖維母細胞生長因子-23變異體(R179Q)。
在本發明之一實施例中，該纖維母細胞生長因子為纖維母細胞生長因子-19或纖維母細胞生長因子-21。
在本發明之一實施例中，融合多肽包含與SEQ ID NO: 51或SEQ ID NO: 53之肽基酸序列之一致性為95%或95%以上的胺基酸序列。
在本發明之一實施例中，融合多肽包含SEQ ID NO: 51或SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。
在本發明之一實施例中，融合多肽包含FcLALA。
本發明係關於預防或治療年齡相關之病狀及代謝障礙之方法、套組及組合物；及該等組合物在治療病理性病症之療法、藥物或使用中之用途。本發明之融合多肽包括Klotho蛋白質或其活性片段。在一些實施例中，本發明之融合多肽包括Klotho蛋白質或其活性片段以操作方式連接至纖維母細胞生長因子多肽或其活性片段。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低結合FcRn之能力及/或增加之血清穩定性的經修飾之Fc片段。在另一實施例中，該融合多肽包含FGF(例如FGF23)及具有降低結合FcRn之能力及/或增加之血清穩定性的經修飾之Fc片段。
本發明之融合蛋白質或sKlotho適用於治療及預防各種年齡相關之病狀，包括肌肉減少症、皮膚萎縮、肌肉萎縮、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質疏鬆症、骨關節炎、免疫機能不全、高血壓、癡呆症、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、白內障、年齡相關之黃斑部變性、前列腺癌、中風、預期壽命縮短、記憶損失、皺紋、腎功能損傷及年齡相關之聽力損失；及代謝障礙，包括II型糖尿病、代謝症候群、高血糖症及肥胖症。
本發明至少部分基於如下發現結果：儘管存在物理約束(例如Klotho與FGF多肽之尺寸較大)，但Klotho-FGF融合多肽在活化FGF受體方面高度有效。此發現結果出乎意料，此係因為此兩種蛋白質之融合可能會干擾異源二聚且因而干擾蛋白質之活性之故；舉例而言，若該等蛋白質之結合域呈「順式」結構，則其可能受融合擾亂或該等蛋白質可能在空間上誤定向。
本文所述之融合多肽為有利的，此係因為相較於單獨投與或以獨立之多肽形式一起投與的Klotho或FGF，其投與具有增強之活性的單一治療性蛋白質之故。使用呈單一融合多肽而非兩種獨立之多肽(亦即Klotho多肽及獨立之FGF多肽)形式的Klotho及FGF在活化FGF受體方面更有效。
定義
如本文所使用之「Klotho多肽」、「Klotho蛋白質」或「Klotho」包括野生型「Klotho」之活性片段、衍生物、模擬物、變異體及經化學修飾之化合物或其雜交物。Klotho活性片段能夠結合FGF多肽。一般而言，Klotho活性多肽含有至少一個Klotho子域(例如KL-D1及KL-D2)。野生型Klotho具有自然界中所發現之胺基酸序列。適用於本發明之實例Klotho多肽包括α-Klotho(SEQ ID NO: 2)及β-Klotho(SEQ ID NO: 4)。α-Klotho及β-Klotho之核苷酸及胺基酸序列可分別以寄存編號NM_004795；NP_004786及NM_175737；NP_783864於GenBank資料庫中獲得。Klotho多肽包括美國專利第6,579,850號中所述之多肽，該專利之內容係以全文引用的方式併入本文中。Klotho多肽包括來自除人類以外之其他物種的多肽，包括來自小鼠(NP_038851)、大鼠(NP_112626)、兔(NP_001075692)之α-Klotho及來自小鼠之β-Klotho(NP_112457)。預計具有α-Klotho之物種包括黑猩猩(XP_522655)、獼猴(XP_001101127)、馬(XP_001495662)、乳牛(XP_001252500)、鴨嘴獸(XP_001510981)及雞(XP_417105)。預計具有β-Klotho之物種包括黑猩猩(XP_526550)、獼猴(XP_001091413)、馬(XP_001495248)、狗(XP_536257)、大鼠(XP_001078178)、鴨嘴獸(XP_001512722)及雞(XP_423224)。Klotho多肽具有與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列實質上一致的胺基酸序列；亦即，與SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 4之胺基酸序列或其活性片段之一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
如本文所使用之「融合多肽」或「融合蛋白質」應意謂包含不天然存在於同一多肽中之兩種或兩種以上不同多肽或其活性片段的多肽。在一些實施例中，該兩種或兩種以上不同多肽以操作方式共價連接在一起，例如由肽鍵化學連接或同框融合。如本文所使用之「Klotho融合多肽」為包括來自Klotho多肽或其活性片段之胺基酸序列的融合多肽。作為非限制性實例，融合多肽可包含Klotho(例如sKlotho)、FGF(例如FG23)及(視情況存在之)經修飾之Fc片段(例如具有降低對FC-γ受體之結合親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段)。此類型融合多肽之實例提供於SEQ ID NO. 46至49中。在另一實施例中，融合蛋白質包含FGF(例如FGF23)及經修飾之Fc(例如FcLALA)。包含FGF23及FcLALA之融合蛋白質描述於SEQ ID NO. 50、51、52及53中。FcLALA為具有LALA突變(L234A、L235A)之Fc片段，其以較低效率引發ADCC且以較弱程度結合並活化人類補體。Hessell等人,2007 Nature 449:101-104。
「纖維母細胞生長引子」及「FGF」在本文中可互換使用，且應指在動物(包括人類個體)中調控細胞增殖、遷移、分化、體內平衡、組織修復及對損傷之反應的多肽。FGF能夠結合纖維母細胞生長因子受體且調控其活性，包括FGFR自磷酸化、FRS2(FGF受體受質2)及ERK1/2(細胞外信號調控蛋白質激酶1/2)之磷酸化及活化Egr-1(早期生長反應-1)。術語「FGF」包括野生型「FGF」之活性片段、衍生物、模擬物、變異體及經化學修飾之化合物或其雜交物，例如如此項技術中已知且如美國專利第7,223,563號及美國專利第7,259,248號中所述，該等專利之內容係以全文引用的方式併入本文中。野生型FGF具有自然界中所發現之胺基酸序列。適用於本發明之實例纖維母細胞生長因子包括纖維母細胞生長因子-19(FGF19；SEQ ID NO: 31)、纖維母細胞生長因子-21(FGF21；SEQ ID NO: 33)及纖維母細胞生長因子-23(FGF23；SEQ ID NO: 35)。FGF多肽包括來自除人類以外之其他物種之多肽，包括鼠類FGF。一般而言，FGF多肽具有與SEQIDNO：31、SEQID NO: 33或SEQ ID NO: 35之胺基酸序列實質上一致的胺基酸序列；亦即具有與SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 33或SEQ ID NO: 35或其活性片段之胺基酸序列之一致性為至少70%、73%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上或100%的胺基酸序列。FGF、尤其FGF23之其他非限制性實例提供於SEQ ID NO: 47之aa1002-1228；SEQID NO:49之aa 1002-1228；SEQ ID NO:51之aa 1-251；及SEQ ID NO:53之aa 1-251；及與此等序列之一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上或100%的序列。編碼此等序列之核苷酸提供於SEQ IDNO:46、48、50及52中。
術語「FGF」包括全長多肽之活性片段。能夠結合相應FGF受體之活性FGF片段在此項技術中為已知的且亦涵蓋用於本發明中。基於本文所揭示之序列，熟習此項技術者將瞭解，可使用標準重組技術產生FGF之重疊片段，該技術如例如Sambrook等人(1989,Molecular Cloning ： A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York)及Ausubel等人(1997,Current Protocols in Molecular Biology,Green&Wiley,New York)中所述。基於本文所提供之揭示內容，熟習此項技術者將瞭解，可利用此項技術中熟知及本文所述之方法來測試FGF片段之生物活性，包括結合FGF受體。類似地，可用FGF片段轉染具有必需的FGF信號轉導機構(亦即FGF受體)之細胞培養模型，隨後測試FGF信號傳導相對於野生型FGF之變化。
基於FGF核心同源性域(長約120個胺基酸)之同源性，FGF分成7個子族，該域側接有在長度與初級序列方面高度可變之N末端及C末端序列，尤其在不同FGF子族中(Goetz等人,Molecular and Cellular Biology,2007,第27卷,3417-3428)。FGF活性多肽一般含有至少一個FGF核心同源性域。在一些實施例中，除FGF核心同源性域以外，FGF活性多肽亦可含有側接序列，該等側接序列可能賦予額外的FGF受體結合特異性。FGF19、FGF21及FGF23分在FGF19子族中，此係因為此等配位體之核心區相對於其他FGF享有較高序列一致性(FGF19相對於FGF21：38%一致性；FGF19相對於FGF23：36%一致性)之故。FGF19子族成員類似於內分泌系統之信號傳導分子起作用且調控對經典FGF罕見之多樣性生理學過程(例如FGF19：能量及膽汁酸體內平衡；FGF21：葡萄糖及脂質代謝；及FGF23：磷酸鹽及維生素D體內平衡)。
如本文所使用之「纖維母細胞生長因子受體」及「FGFR」係指此項技術中已知之FGFR1-4中之任一者，或其剪接變異體(例如FGFR1c)。適用於本發明之實例纖維母細胞生長因子受體包括纖維母細胞生長因子受體-19(例如FGFR4-β Klotho)、纖維母細胞生長因子受體-21(例如FGFR1c-α Klotho)及纖維母細胞生長因子受體-23(例如FGFR1c-α Klotho、FGFR3-α Klotho、FGFR4-α Klotho)。
如本文所使用之「細胞外域」係指跨膜蛋白質之存在於細胞外之片段(例如不包括細胞內或跨膜區)。「Klotho蛋白質之細胞外域」、「可溶性Klotho」或「sKlotho」(例如SEQ ID NO: 7；SEQ ID NO: 39)係指能夠結合纖維母細胞生長因子及/或能夠藉由結合纖維母細胞生長因子而使纖維母細胞生長因子結合纖維母細胞生長因子受體的Klotho多肽之細胞外域。Klotho細胞外域對應於全長α Klotho序列(SEQ ID NO: 2)之胺基酸殘基28-982及全長βKlotho序列(SEQ ID NO: 4)之胺基酸殘基52-997。
「Klotho蛋白質之細胞外子域」及「Klotho蛋白質之細胞外子域」在本文中可互換使用，且應指能夠結合纖維母細胞生長因子及/或能夠藉由結合纖維母細胞生長因子而使纖維母細胞生長因子結合纖維母細胞生長因子受體的Klotho多肽之細胞外域中之區。在多個實施例中，該融合物包含：包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域的多肽；包含纖維母細胞生長因子之多肽；及視情況存在之具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。Klotho細胞外域具有兩個重複之同源子域，亦即KL-D1(SEQ ID NO: 5)及KL-D2(SEQ ID NO: 6)。KL-D1及KL-D2分別對應於全長α Klotho多肽(SEQ ID NO: 2)之胺基酸殘基58-506及517-953，且分別對應於全長βKlotho多肽(SEQ ID NO: 4)之胺基酸殘基77-508及571- 967，且適用於本發明。一般而言，含有至少一個Klotho子域之多肽為Klotho活性多肽。用於本發明多肽之Klotho細胞外子域可為分別具有與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 37之胺基酸序列實質上一致之胺基酸序列的α Klotho或βKlotho K-D1域。此外，Klotho KL-D1域可具有與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上的胺基酸序列。Klotho細胞外子域亦可為分別與SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列實質上一致的α或β Klotho多肽KL-D2域。在另一實施例中，KL-D2域具有與SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 38之肽基酸序列之一致性為至少70%、76%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上的胺基酸序列。在一些實施例中，該融合物包含Klotho蛋白質之至少兩個細胞外子域(例如KL-D1及KL-D2；呈串聯重複形式之KL-D1及KL-D1；呈串聯重複形式之KL-D2及KL-D2等)。
如本文所使用之「經修飾之Fc片段」應意謂包含經修飾之序列之抗體之Fc片段。Fc片段為包含CH2、CH3及部分鉸鏈區之抗體之一部分。經修飾之Fc片段可源自例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。FcLALA為具有LALA突變(L234A、L235A)之經修飾之Fc片段，其以較低效率引發ADCC且以較弱程度結合並活化人類補體。Hessell等人,2007 Nature 449:101-104。Fc片段之其他修飾描述於例如美國專利第7,217,798號中。舉例而言，在各種經修飾之Fc片段中：(a)胺基酸殘基250為麩胺酸且胺基酸殘基428為苯丙胺酸；或(b)胺基酸殘基250為麩醯胺酸且胺基酸殘基428為苯丙胺酸；或(c)胺基酸殘基250為麩醯肽酸且胺基酸殘基428為白胺酸。在一些實施例中，胺基酸殘基250及428與存在於未經修飾之Fc融合蛋白質中之殘基的不同之處在於胺基酸殘基250為麩胺酸或麩醯胺酸且胺基酸殘基428為白胺酸或苯丙胺酸，且其中胺基酸殘基以EU編號系統編號，如美國專利第7,217,798號中所述。在一些實施例中，經修飾之Fc融合蛋白質對FcRn之親和力在pH 6.0下高於在pH 8.0下。經修飾之Fc片段較佳具有降低對FcRn之親和力及/或增加之血清半衰期。經修飾之Fc片段之非限制性實例包括SEQ ID NO: 47之aa(胺基酸)1234-1459；SEQ ID NO: 49之aa 1234至1450；SEQ ID NO: 51之aa 257至482；及SEQ ID NO: 53之aa 257至473；及與此等序列之一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上或100%的序列。編碼此等序列之核苷酸提供於SEQ ID NO: 46、48、50及52中。
如本文所使用之「信號肽」應意謂將蛋白質之轉譯後轉運導向內質網且可裂解脫除之肽鏈(3-60個胺基酸長)。適用於本發明之實例信號肽包括Klotho信號肽(SEQ ID NO: 19)及IgG信號肽(SEQ ID NO: 20)。應注意：在由生產細胞株分泌及裂解後，信號肽(例如對應於SEQ ID NO: 19及SEQ ID NO: 20之肽的信號肽)裂解脫除。因而，信號肽由生產細胞株分泌及裂解後，SEQ ID NO: 19之肽將產生SEQ ID NO: 41之肽。
如本文所使用之「連接子」應意謂共價連接兩個或兩個以上多肽或核酸以使其彼此連接的官能基(例如化合物或多肽)。如本文所使用之「肽連接子」係指用於將兩個蛋白質偶合在一起(例如偶合Klotho之細胞外域與纖維母細胞生長因子-23)之一或多個胺基酸。適用於本發明之肽連接子包括但不限於具有由SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17及SEQ ID NO: 18表示之胺基酸序列的多肽。多肽連接子可包含至少1個且至多約30個任何此等胺基酸序列之重複單元。
如本文所使用之「以操作方式連接」應意謂連接兩個或兩個以上生物分子以至少保留與該等生物分子相關之生物功能、活性及/或結構。在提及多肽時，該術語意謂兩個或兩個以上多肽之連接產生保留各多肽組分之至少一些各別個別活性的融合多肽。該兩個或兩個以上多肽可直接或經由連接子連接。在提及核酸時，該術語意謂第一聚核苷酸經置放鄰接第二聚核苷酸，當適當分子(例如轉錄活化蛋白質)結合該第二聚核苷酸時，第二聚核苷酸引導第一聚核苷酸之轉錄。
如本文所使用之「特異性結合」應指第一分子在其可能曝露之許多不同類型分子中結合標靶分子的能力，此係因為該第一分子能夠採納有助於在其自身與該另一靶分子之間形成非共價相互作用的特定結構之故。第一分子結合標靶而形成穩定複合物，而該第一分子與任何其他非特異性分子之識別、接觸或複合物形成實質上較少。
如本文所使用之「多肽變異體」或「蛋白質變異體」係指一或多個胺基酸已經來自參考序列之不同胺基酸取代的多肽。此項技術中已充分瞭解，一些胺基酸可經具有廣泛相似特性之其他胺基酸取代而不改變多肽之活性性質(保留性取代)，如下文中所述。此等術語亦涵蓋一或多個胺基酸已經添加或缺失、或經不同胺基酸置換之多肽，例如蛋白質同功異型物。適用於本發明之纖維母細胞生長因子-23之實例變異體為纖維母細胞生長因子-23變異體(R179Q)。
如本文所使用之「醫藥組合物」應意謂含有可投與個體以治療或預防疾病或病症之化合物(例如本發明之融合多肽)的組合物。
如本文所使用之「個體(Individual或subject)」應指哺乳動物，包括但不限於人類或非人類哺乳動物，諸如牛、馬、犬、綿羊或貓。
如本文所使用之「治療」應意謂降低、抑制、減輕、減弱、阻滯或穩定疾病之發展或進程。在本發明之情況下，投與本發明之多肽可用於治療年齡相關之病狀，包括肌肉減少症、皮膚萎縮、肌肉萎縮、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質疏鬆症、骨關節炎、免疫機能不全、高血壓、癡呆症、亨廷頓氏病、阿茲海默氏病、白內障、年齡相關之黃斑部變性、前列腺癌、中風、預期壽命縮短、記憶損失、皺紋、腎功能損傷及年齡相關之聽力損失；及代謝障礙，包括II型糖尿病、代謝症候群、高血糖症及肥胖症。
如本文所使用之「預防」應指降低病症之發生率或降低個體罹患病症或其相關症狀之風險。在本發明之情況下，投與本發明之多肽可用於預防年齡相關之病狀，包括肌肉減少症、皮膚萎縮、肌肉萎縮、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質疏鬆症、骨關節炎、免疫機能不全、高血壓、癡呆症、亨廷頓氏病、阿茲海默氏病、白內障、年齡相關之黃斑部變性、前列腺癌、中風、預期壽命縮短、記憶損失、皺紋、腎功能損傷及年齡相關之聽力損失；及代謝障礙，包括II型糖尿病、代謝症候群、高血糖症及肥胖症。預防可為完全預防，例如完全不存在年齡相關之病狀或代謝障礙。預防亦可為部分預防，從而使個體中發生年齡相關之病狀或代謝障礙的可能性與未接受本發明之個體相比發生可能性較小。
如本文所使用之「疾病」應意謂損傷或干擾細胞、組織或器官之正常功能的任何病狀或病症。
如本文所使用之「年齡相關之病狀」應意謂在群體中之發病率或在個體中之嚴重程度與年齡進程有關的任何疾病或病症。在一實施例中，年齡相關之病狀為在100,000名以上個體之所選群體中，60歲以上之人類個體中之發病率相對於介於30-40歲之間的人類個體至少高1.5倍的疾病或病症。與本發明相關之年齡相關之病狀包括但不限於肌肉減少症、皮膚萎縮、肌肉萎縮、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質疏鬆症、骨關節炎、免疫機能不全、高血壓、癡呆症、亨廷頓氏病、阿茲海默氏病、白內障、年齡相關之黃斑部變性、前列腺癌、中風、預期壽命縮短、記憶損失、皺紋、腎功能損傷及年齡相關之聽力損失。
如本文所使用之「代謝障礙」應意謂藉由影響細胞中之能量產生或細胞、組織、器官或個體中之毒素積聚而損傷或干擾細胞、組織或器官之正常功能的任何疾病或病症。與本發明相關之代謝障礙包括但不限於II型糖尿病、代謝症候群、高血糖症及肥胖症。
「有效劑量」或「有效量」為足以實現有利或所要之臨床結果的量。在本發明之情況下，其為有效產生預定藥理學治療性或預防性結果的Klotho融合多肽或sRlotho之量。治療有效劑量可預防或改善病症或病症之一或多種症狀(例如年齡相關之病狀或代謝障礙)。治療有效劑量將視所治療之個體及疾病病狀、個體之體重及年齡、疾病病狀之嚴重程度、投藥方式及其類似物而變化，該劑量可由一般熟習此項技術者容易地確定。
如本文所使用之「Klotho核酸分子」為編碼Klotho蛋白質之基因。實例人類Klotho基因提供為GenBank寄存編號NM_004795(SEQ ID NO: 1)。Klotho之其他非限制性實例提供為SEQ ID NO: 47之aa 1-982及SEQ ID NO: 49之aa 1-982；及與此等序列之一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上或100%的序列。
如本文所使用之「片段」係指多肽或核酸分子之一部分。此部分較佳含有參考核酸分子或多肽之完整長度之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或多達3000個核苷酸或胺基酸。
術語「實質上一致」係指多肽或核酸分子與參考胺基酸序列(例如本文所述之胺基酸序列中之任一者)或核酸序列(例如本文所述之核酸序列中之任一者)展現至少50%之一致性。該序列在胺基酸層面或核酸層面上較佳與用於比較之序列之一致性為至少60%、70%、75%、80%或85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
本發明係關於預防或治療年齡相關之病狀及代謝障礙之方法、套組及組合物；及該等組合物在治療病理性病症之療法、藥物或使用中之用途。在一些實施例中，本發明提供一種融合多肽，其具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域。在一些實施例中，該融合多肽進一步包含纖維母細胞生長因子或其活性片段。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。在其他實施例中，該融合物包含FGF(例如FGF19、FGF21、FGF23或FGF23變異體R179Q)融合至經修飾之Fc(例如FcLALA)。FcLALA為具有LALA突變(L234A、L235A)之Fc片段，其以較低效率引發ADCC且以較弱程度結合並活化人類補體。Klotho細胞外域可源自α或β Klotho同功異型物。此外，雖然主要參考纖維母細胞生長因子-19、纖維母細胞生長因子-21及纖維母細胞生長因子-23描述Klotho融合多肽之FGF組分，但涵蓋23種已知FGF或其活性片段中任一者均可用於實施本發明。
Klotho蛋白質之細胞外域可包括Klotho蛋白質之KL-D1域及KL-D2域中之一者或兩者。在一些實施例中，Klotho融合多肽具有Klotho蛋白質之至少兩個細胞外子域。舉例而言，該至少兩個細胞外子域可為呈串聯重複形式之至少兩個KL-D1域、呈串聯重複形式之至少兩個KL-D2域，或至少一個KL-D1域及至少一個KL-D2域。
Klotho蛋白質之細胞外子域及纖維母細胞生長因子(或其活性片段)可以各種定向及方式彼此以操作方式連接。舉例而言，Klotho蛋白質之細胞外子域可以操作方式連接至纖維母細胞生長因子之N末端，或者纖維母細胞生長因子可以操作方式連接至Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之N末端。
本發明之融合多肽可包括Klotho細胞外域中之一者或兩者，亦即KL-D1(SEQ ID NO: 5)及KL-D2(SEQ ID NO: 6)。KL-D1及KL-D2分別對應於全長α Klotho多肽(SEQ ID NO: 2)之胺基酸殘基58-506及517-953以及全長β Klotho多肽(SEQ ID NO: 4)之胺基酸殘基77-508及571-967，且適用於本發明。Klotho融合多肽可具有胺基酸序列與SEQ ID NO: 5之胺基酸序列實質上一致之α Klotho多肽之KL-D1域，或胺基酸序列與SEQ ID NO: 37之胺基酸序列實質上一致之β Klotho多肽之KL-D1域。特定言之，Klotho融合多肽可具有與SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 37之胺基酸序列之一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上的胺基酸序列。Klotho融合多肽可具有胺基酸序列與SEQ ID NO: 6之胺基酸序列實質上一致之α Klotho多肽之KL-D2域，或胺基酸序列與SEQ IDNO: 38之胺基酸序列實質上一致之β Klotho多肽之KL-D2域。特定言之，Klotho融合多肽可具有分別與SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 38之胺基酸序列之一致性為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上的胺基酸序列。
在一些實施例中，本發明之Klotho融合多肽為可溶的，且能夠結合FGF受體。
本發明之Klotho融合多肽可含有多肽連接子，其連接具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域的多肽及纖維母細胞生長因子及(視情況存在之)經修飾之Fc片段。適合的連接子在此項技術中為熟知的，且一般含有若干Gly及若干Ser殘基，例如(Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 11)、Gly4 Ser多肽(SEQ ID NO: 12)、Gly(SEQ ID NO: 13)、GlyGly(SEQ ID NO: 14)、Gly Ser(SEQ ID NO: 15)、Gly2 Ser(SEQ ID NO: 16)、Ala(SEQ ID NO: 17)及Ala Ala(SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，連接子將具有至少2個且至多約30個由SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18中之任一者所表示之胺基酸序列的重複單元。
當多肽連接子存在於本發明之Klotho融合多肽中時，具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域的多肽可由肽鍵連接至連接子多肽之N末端，而FGF係由肽鍵連接至多肽連接子之C末端。或者，FGF可由肽鍵連接至連接子多肽之N末端，而具有Klotho之至少一個細胞外子域的多肽係由肽鍵連接至多肽連接子之C末端。化學連接子亦可用於連接該兩個多肽。
本發明之Klotho融合多肽可包括信號肽。用於K1o tho 融合多肽之實例信號肽包括但不限於Klotho信號肽(SEQ ID NO: 8)及IgG信號肽(SEQ ID NO: 9)。
在一些實施例中，本發明提供一種FGF(例如FGF19、FGF21、FGF23或FGF23變異體R179Q)與經修飾之Fc(例如FcLALA)之融合物。該融合物亦可視情況包含位於FGF與Fc部分之間的連接子。該融合物亦可視情況包含信號肽。在多個實施例中，本發明涵蓋編碼此等融合多肽之核酸、包含此等核酸之載體，及含有此等核酸之宿主細胞。
Klotho及纖維母細胞生長因子多肽
預期本發明之Klotho融合多肽展現可比於自然界中之FGF之生物活性，諸如結合FGF受體及誘導FGF受體、FRS2(FGF受體受質2)及ERK1/2(細胞外信號調控蛋白質激酶1/2)之磷酸化及活化Egr-1(早期生長反應-1)基因。FGF為結合FGF受體之分泌之肽生長因子。熟習此項技術者可容易地獲得FGF之胺基酸及核酸序列。舉例而言，FGF19、FGF21及FGF23之實例核苷酸序列可分別以寄存編號NM_005117、NM_019113及NM_020638於GenBank資料庫中獲得，且在本文中分別稱為SEQ ID NO: 30、32及34。FGF19、FGF21及FGF23之實例胺基序列可分別以寄存編號NP_005108、NP_061986及NP_065689於GenBank資料庫中獲得，且在本文中分別稱為SEQ ID NO: 31、35及35。另外，FGF可包括一或多個有助於表現蛋白質之變化，例如FGF23(R179Q)變異體(SEQ ID NO: 36)。
Klotho蛋白質為具有細胞外域及短細胞質域之130 kDa單次跨膜I型跨膜蛋白。熟習此項技術者可容易地獲得Klotho之肽基酸及核酸序列。舉例而言，α-Klotho 及β-Klotho之實例核苷酸序列可分別以寄存編號NM_004795及NM_l75737於GenBank資料庫中獲得，且在本文中分別稱為SEQ ID NO: 7及8。α-Klotho及β-Klotho之實例胺基酸序列可分別以寄存編號NP_004786及NP_783864於GenBank資料庫中獲得，且在本文中分別稱為SEQ ID NO: 2及4。
本發明之Klotho融合多肽可結合纖維母細胞生長因子受體，且具有以操作方式連接至纖維母細胞生長因子-19(SEQ ID NO: 31)、纖維母細胞生長因子-21(SEQ ID NO: 33)、纖維母細胞生長因子-23(SEQ ID NO: 35)或其變異體(包括纖維母細胞生長因子-23變異體(R179Q)(SEQ ID NO: 36))之α-Klotho或β-Klotho細胞外域。
特定言之，本發明之Klotho融合多肽可包括以操作方式偶合至纖維母細胞生長因子-23(SEQ ID NO: 35)或纖維母細胞生長因子-23變異體(R179Q)(SEQ ID NO: 36)之α-Rlotho(SEQ ID NO: 2)。另外，本發明之Klotho融合多肽可具有以操作方式偶合至纖維母細胞生長因子-19(SEQ ID NO: 31)之β-Klotho(SEQ ID NO: 4)。本發明之Klotho融合多肽可包括以操作方式偶合至纖維母細胞生長因子-21(SEQ ID NO: 33)之β-Klotho(SEQ ID NO: 4)。
本發明包括各種Klotho及FGF基因以及彼等基因所編碼之蛋白質的同源物。在提及基因時，「同源物」係指與該基因之至少一部分或者其互補股或其部分實質上一致的核苷酸序列，其限制條件為該核苷酸序列編碼與同源物所屬基因所編碼之蛋白質具有實質上相同之活性/功能的蛋白質。本文所述之基因之同源物可由假定同源物之胺基酸或核苷酸序列與基因或其所編碼之蛋白質之序列(例如編碼Klotho及FGF之基因或其互補股的核苷酸序列)之間的一致性百分比來鑑別。一致性百分比可藉由例如目視檢查或藉由使用此項技術中已知或如本文所述之各種電腦程式來確定。序列一致性通常使用序列分析軟體(例如Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，Wis. 53705；BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程式)來量測。該軟體係藉由給各種取代、缺失及/或其他修飾分配同源性程度來匹配一致或相似之序列。保留性胺基酸取代通常包括以下各組中之取代：甘胺酸及丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸及白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺及麩醯胺酸；絲胺酸及蘇胺酸；離胺酸及精胺酸；及苯丙肽酸及酪肽酸。
因而，甘胺酸突變成丙胺酸為保留性胺基酸取代，丙胺酸突變成甘胺酸亦然；纈胺酸突變成異白胺酸或白肽酸為保留性胺基酸取代，以纈胺酸或白胺酸置換異白胺酸亦然，以纈胺酸或異白胺酸置換白胺酸亦然，等等。本發明提供具有至少一個保留性胺基酸取代之本文所揭示之所有胺基酸序列的變異體。
在確定一致性程度之一種實例方法中，可使用BLAST程式，可能性得分介於e-3 與e-100 之間指示密切相關之序列。
在一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 19之融合多肽。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 20之融合多肽。
在一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 40之融合多肽。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 41之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 46之融合多肽。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 47之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 48之融合多肽。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 49之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 50之融合多肽。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 51之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 52之融合多肽。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 53之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 54之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 55之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 56之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 57之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 58之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 59之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 60之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 61之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 62之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 63之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 64之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 65之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 66之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 67之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
在另一實施例中，本發明提供SEQ ID NO: 68之融合多肽，或其包含至少一個保留性胺基酸取代之變異體。
如本文所使用之術語「同源性」及「同源」不限於具有理論性共同基因祖先之指定蛋白質，而是包括基因上可能無關但已經演化能執行類似功能及/或具有類似結構的蛋白質。本文所述之各種蛋白質之功能同源性亦涵蓋具有同源物所屬之相應蛋白質之活性的蛋白質。關於具有功能同源性之蛋白質，不需要其在胺基酸序列方面具有顯著一致性，而是因具有相似或一致活性而定義為具有功能同源性之蛋白質。舉例而言，關於Klotho分子，該多肽應具有結合FGF多肽且使FGF能夠結合FGFR之功能特徵。關於FGF分子，該多肽應具有結合FGFR且引起FGFR活化(例如磷酸化)之功能特徵。評定FGF與FGF受體之結合及/或FGF信號傳導路徑之活化的檢定在此項技術中為已知的且描述於本文中(參見實例2)。評定Klotho活性之檢定在此項技術中亦為已知的且描述於本文中(例如結合FGF多肽)。具有結構同源性之蛋白質定義為具有類似的三級(或四級)結構且未必需要與其編碼基因具有胺基酸一致性或核酸一致性。在某些情況下，結構同源物可包括僅在蛋白質之活性位點或結合位點處維持結構同源性的蛋白質。
除結構及功能同源性以外，本發明進一步涵蓋與本文所述之各種Klotho及FGF胺基酸序列具有胺基酸一致性的蛋白質。為了測定兩個胺基酸序列之一致性/同源性百分比，出於最佳比較目的，比對該等序列(例如可在一個蛋白質之胺基酸序列中引入間隙以與另一蛋白質之胺基酸序列最佳比對)。接著比較相應胺基酸位置之肽基酸殘基。當一個序列中之位置被與另一序列中相應位置相同之胺基酸殘基佔據時，則該等分子在該位置處為一致的。兩個序列之一致性百分比為該等序列所享有之一致位置之數目的函數(亦即一致性%=一致位置數/總位置數×100)。
本文所述之本發明分子之胺基酸序列具有與本文所述之胺基酸序列之一致性或同源性為至少約60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上的胺基酸序列。
本文所述之本發明分子之核酸序列具有與本文所述之核苷酸序列雜交或與其之一致性或同源性為至少約60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上的核苷酸序列。
適合用於本發明之融合多肽中的核酸分子可具有Klotho或FGF核苷酸序列，其在嚴格條件下分別與編碼Klotho或FGF之核酸分子之補體雜交。如本文所使用之術語「在嚴格條件下雜交」意欲描述彼此間之同源性為至少約70%、80%、85%、90%或90%以上之核苷酸序列通常仍彼此雜交的雜交及洗滌條件。該等嚴格條件為熟習此項技術者所知，且可在Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology ,Wiley Interscience,New York(2001),6.3.1-6.3.6中獲得。嚴格雜交條件之特定非限制性實例為在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45℃下雜交，接著在0.2×SSC、0.1% SDS中在50-65℃下洗滌一或多次。
本發明之Klotho-FGF融合多肽
在本發明之一些實施例中，Klotho融合多肽具有多肽鏈，該多肽鏈具有Klotho多肽或其活性片段之第一多肽序列及編碼FGF或其活性片段之第二多肽序列。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
本發明包括與SEQ ID NO: 19-28中所示之胺基酸序列之同源性為至少約95%或95%以上之融合多肽。SEQ ID NO: 19之胺基酸序列編碼具有連接至FGF23(R179Q)變異體(SEQ ID NO: 36)之N末端之Klotho細胞外域的Klotho融合多肽。SEQ ID NO: 20之胺基酸序列編碼具有連接至Klotho細胞外域之N末端之IgG信號肽且缺乏連接至FGF23(R179Q)變異體之N末端之信號肽的Klotho融合多肽。SEQ ID NO: 21之胺基酸序列編碼具有連接至FGF23(R179Q)變異體之N末端之KL-D1細胞外子域的Klotho融合多肽。SEQ ID NO: 22之胺基酸序列編碼具有連接至FGF23(R179Q)變異體之N末端之KL-D2細胞外子域的Klotho融合多肽。SEQ ID NO: 23之胺基酸序列編碼具有連接至FGF23(R179Q)變異體之N末端之兩個KL-D1細胞外子域的Klotho融合多肽。SEQ ID NO: 24之胺基酸序列編碼具有連接至FGF23(R179Q)變異體之N末端之兩個KL-D2細胞外子域的Klotho融合多肽。SEQ ID NO: 25之胺基酸序列編碼具有連接至Klotho細胞外域之N末端之FGF23(R179Q)變異體的Klotho融合多肽。SEQ ID NO: 26之胺基酸序列編碼具有連接至KL-D1細胞外子域之N末端之FGF23(R179Q)變異體的Klotho融合多肽。SEQ ID NO: 27之胺基酸序列編碼具有連接至KL-D2細胞外子域之N末端之FGF23(R179Q)變異體的Klotho融合多肽。SEQ ID NO: 28之胺基酸序列編碼具有連接至兩個KL-D1細胞外子域之N末端之FGF23(R179Q)變異體的Klotho融合多肽。SEQ ID NO: 29之肽基酸序列編碼具有連接至兩個KL-D2細胞外子域之N末端之FGF23(R179Q)變異體的Klotho融合多肽。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
本發明之Klotho融合多肽可包括與SEQ ID NO: 7中所述之胺基酸序列之一致性為至少約95%的胺基酸序列。SEQ ID NO: 7之胺基酸序列編碼缺乏信號肽之Klotho細胞外域。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。
標的融合蛋白質描述於本文中且可使用此項技術中已知之方法製造。舉例而言，可如美國專利第6,194,177號中所述構築本發明之融合多肽。Klotho多肽之用途描述於美國專利第6,579,850號中。FGF核酸分子之用途描述於美國專利第7,223,563號中。
在一些實施例中，利用PCR選殖編碼Klotho之核酸分子且與編碼FGF之核酸分子同框連接。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。使編碼該融合多肽之核酸以操作方式連接至啟動子以進行表現。隨後將編碼該融合多肽之核酸分子轉染於宿主細胞中來表現。可藉由定序來證實最終構築體之序列。
當製備本發明之融合蛋白質時，編碼Klotho之細胞外子域之核酸分子將同框融合至編碼FGF之核酸分子及(視情況存在之)編碼經修飾之Fc片段之核酸。所得核酸分子之表現使得Klotho之細胞外子域融合至FGF多肽之N末端。亦可能存在Klotho之細胞外子域融合至FGF多肽之C末端的融合物。製造融合蛋白質之方法在此項技術中為熟知的。
本發明之融合多肽具有至少兩個共價連接之多肽，其中一個多肽來自一個蛋白質序列或域，例如Klotho，而另一多肽來自另一蛋白質序列或域，例如FGF。在一些實施例中，該融合物進一步包含具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。在另一實施例中，本發明包含FGF融合至經修飾之Fc片段。本發明融合多肽之Klotho及/或FGF及/或(視情況存在之)經修飾之Fc片段可由熟習此項技術者所熟知之方法接合。此等方法包括化學法與重組法。
編碼欲併入本發明融合多肽中之域的核酸可使用重組遺傳學領域中之常規技術獲得。揭示用於本發明中之一般方法的基礎教科書包括Sambrook及Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual(1990)；及Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編,1994-1999)。在編碼本發明之Klotho融合多肽之核酸中，可使用分別由SEQ ID NO: 1及SEQ ID NO: 3表示之編碼α-Klotho或β-Klotho之核酸序列。在編碼Klotho融合多肽之核酸中，可使用分別由SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32及SEQ ID NO: 34表示之編碼FGF19、FGF21或FGF23之核酸序列。本文所述之本發明分子之核酸序列包含與SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 32或SEQ ID NO: 34雜交或與其之一致性或同源性為至少約60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上的核苷酸序列。
編碼融合物之各種組分[Klotho及/或FGF肽及/或(視情況存在之)經修飾之Fc片段]之核酸序列可使用多種方法中之任一種獲得。舉例而言，可藉由與探針雜交自cDNA及基因體DNA庫選殖編碼多肽之核酸序列，或使用擴增技術用寡核苷酸引子分離編碼多肽之核酸序列。更通常，藉由使用DNA或RNA模板，使用擴增技術來擴增並分離Klotho及FGF序列(參見例如Dieffenfach及Dveksler,PCR Primers: A Laboratory Manual(1995))。或者，可合成產生重疊寡核苷酸並接合以產生一或多個域。亦可使用抗體作為探針自表現庫中分離編碼Klotho或FGF之核酸。
根據本發明，融合物之各種組分[Klotho及/或FGF及/或(視情況存在之)經修飾之Fc片段]可直接或經由共價連接子連接，包括胺基酸連接子，諸如聚甘胺酸連接子，或另一類型之化學連接子，包括碳水化合物連接子、脂質連接子、脂肪酸連接子、聚醚連接子，諸如PEG等(參見例如Hermanson,Bioconjugate techniques(1996))。形成融合物/融合多肽之多肽通常為C末端連接至N末端，但其亦可為C末端連接至C末端、N末端連接至N末端或N末端連接至C末端。一或多個多肽域可插入本發明融合多肽內之內部位置。融合蛋白質之多肽可呈任何順序。融合多肽可如下產生：藉由將來自一個蛋白質序列之胺基酸鏈(例如Klotho之細胞外子域)共價連接至來自另一蛋白質序列之胺基酸鏈(例如FGF)，藉由製備連續編碼融合蛋白質之重組聚核苷酸。融合蛋白質中之不同胺基酸鏈可直接剪接在一起，或可經由化學連接基團或胺基酸連接基團間接剪接在一起。胺基酸連接基團之長度可為約200個胺基酸或200個胺基酸以上，或一般為1至100個胺基酸。在一些實施例中，將脯胺酸殘基併入連接子中以防止由連接子形成顯著的二級結構元件。連接子通常可為合成作為重組融合蛋白質之一部分的可撓性胺基酸子序列。該等可撓性連接子為熟習此項技術者所知。
根據本發明，融合物之胺基酸序列[Klotho之細胞外子域及/或FGF及/或(視情況存在之)經修飾之Fc片段]可經由肽連接子連接。實例肽連接子在此項技術中為熟知的且描述於本文中。舉例而言，肽連接子一般包括若干Gly及若干Ser殘基，諸如：(Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 11)、Gly4 Ser多肽(SEQ ID NO: 12)、Gly(SEQ ID NO: 13)、Gly Gly(SEQ ID NO: 14)、Gly Ser(SEQ ID NO: 15)、Gly2 Ser(SEQ ID NO: 16)、Ala(SEQ ID NO: 17)及Ala Ala(SEQ ID NO: 18)。特定言之，用於本發明之融合蛋白質中之肽連接子可充當可撓性鉸鏈。
在Klotho併入本發明融合蛋白質中之前，可排除Klotho或FGF之信號序列。融合蛋白質之Klotho或FGF之信號序列可包括例如由SEQ ID NO: 19表示之多肽。然而，亦可省去該等序列，或以不同蛋白質之信號序列置換，例如IgG信號序列(SEQ ID NO: 9)。一般而言，本發明之醫藥組合物將含有Klotho及FGF之成熟形式。
一般而言，在Klotho或FGF部分併入融合多肽中之前，自其中之一者或兩者中排除內含子。
本發明之融合多肽可包括一或多個聚合物共價連接至一或多個反應性胺基酸側鏈。舉例而言，該等聚合物包括但不限於聚乙二醇(PEG)，其可連接至一或多個游離半胱胺酸硫氫基殘基，藉此在蛋白質曝露於氧化條件時阻斷雙硫鍵之形成及聚集。此外，預期本發明融合多肽之聚乙二醇化將提供諸如增加之半衰期、溶解性及蛋白酶抗性之改良特性。或者，本發明之融合多肽可藉由共價加成聚合物與游離肽基(諸如離胺酸ε或N末端胺基)來修飾。用於共價修飾之特定特異性半胱胺酸及離胺酸將為不涉及受體結合、肝素結合或呈適當蛋白質摺疊的半胱肽酸及離胺酸。熟習此項技術者將顯而易知，可採用檢定融合多肽之生物化學活性及/或生物活性之方法來確定特定胺基酸殘基之修飾是否依照要求影響蛋白質活性。涵蓋其他類似之適合修飾，且其在此項技術中為已知的。
本發明亦關於與SEQ ID NO: 19-28中所示之胺基酸序列之同源性為至少約95%或95%以上的融合多肽的表現。
本發明涵蓋一種融合多肽，其包含：(a)包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域或其功能活性變異體或衍生物的多肽；(b)包含纖維母細胞生長因子或其功能活性變異體或衍生物之多肽；及(c)具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段。「其功能活性變異體或衍生物」意謂與相應野生型多肽相比，包含較長、較短或改變之胺基酸序列同時保留生物活性的變異體或衍生物。因而，Klotho蛋白質之細胞外子域或纖維母細胞生長因子之「功能活性變異體或衍生物」與野生型Klotho蛋白質之細胞外子域或纖維母細胞生長因子相比，包含較少、較多或改變之胺基酸序列，但仍保留野生型多肽序列之至少一種生物活性。本文所揭示之多肽之功能活性變異體或衍生物亦可包含本文所揭示之多肽之相同胺基酸序列，但在轉譯後修飾(例如聚乙二醇化、甲基化及/或糖基化)方面不同或具有添加之其他部分或元件。在多個實施例中，FGF23之變異體或衍生物包含R179Q或不包含R179Q。
在一實施例中，功能活性變異體或衍生物多肽包括與本文所揭示之序列(例如Klotho蛋白質之至少一個細胞外域或纖維母細胞生長因子)之一致性為至少約60%的胺基酸序列。該多肽較佳與本文所揭示之序列之一致性為至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或99%以上。
如本文所使用，使用Karlin及Altschul之算法(PNAS USA 87:2264-2268,1990，在Karlin及Altschul,PNAS USA 90:5873-5877,1993中加以改進)確定兩個胺基酸序列(或兩個核酸序列)之一致性百分比。將該算法併入Altschul等人(J. Mol. Biol. 215:403-410,1990)之NBLAST及XBLAST程式中。用NBLAST程式、得分=100、字長=12來執行BLAST核苷酸搜尋。用XBLAST程式、得分=50、字長=3來執行BLAST蛋白質搜尋。比較時，為獲得間隙比對，利用GappedBLAST，如Altschul等人(Nucleic Acids Res. 25:3389-3402,1997)中所述。當利用BLAST及GappedBLAST程式時，使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之缺省參數獲得與本發明核酸分子同源之核苷酸序列。
一致性或一致意謂胺基酸序列(或核酸序列)相似性且具有技術領域中所公認之含義。具有一致性之序列享有一致或類似之胺基酸(或核酸)。因而，與參考序列享有85%胺基酸序列一致性之候選序列要求在該候選序列與參考序列比對之後，該候選序列中85%之胺基酸與參考序列中之相應胺基酸一致，及/或構成保留性胺基酸變化。
本文所揭示之多肽之功能活性變異體保留與原始多肽或片段實質上相同之功能活性。本發明包括天然存在之功能活性變異體(諸如對偶基因變異體及物種變異體)及非天然存在之功能活性變異體，且其可由例如突變誘發技術或由直接合成來產生。
功能活性變異體或衍生物與本文所揭示之多肽的不同之處在於約或至少例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60或60個以上胺基酸殘基。若此比較需要比對，則比對該等序列以獲得最大同源性。變異位點可存在於多肽中之任何位置，只要活性與本文所揭示之多肽實質上相似即可。
關於如何用表現型沉默之胺基酸取代製造變異體及衍生物的指導提供於Bowie等人,Science,247:1306-1310(1990)中，該文獻教示研究肽基酸序列對改變之容許度的兩種主要策略。
第一種策略採用在演化過程期間自然選擇對胺基酸取代之容許度。藉由比較不同物種之胺基酸序列，可鑑別物種間之保留之胺基酸位置。參見例如圖5。此等保留性胺基酸對蛋白質功能而言可能較為重要。相反，取代能為自然選擇所容許之胺基酸位置指示對蛋白質功能而言不重要之位置。因而，容許胺基酸取代之位置可經修飾，而仍維持多肽之特異性結合活性。
第二種策略使用基因工程改造在經選殖之基因的特定位置處引入胺基酸變化以鑑別對蛋白質功能而言重要之區。舉例而言，可使用定點突變誘發或丙胺酸掃描突變誘發(在分子中之每個殘基處引入單一丙胺酸突變)(Cunningham等人,Science,244:1081-1085(1989))。
向蛋白質之胺基酸中引入突變之方法為熟習此項技術者所熟知。參見例如Ausubel(編),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994);T. Maniatis,E. F. Fritsch及J. Sambrook,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。亦可使用諸如「QuikChange. TM. Site-Directed Mutagenesis Kit」(Stratagene)之市售套組引入突變。熟習此項技術者可藉由置換不影響多肽功能之胺基酸來產生多肽之多肽功能活性變異體或衍生物。
變異體或衍生物可具有例如一或多個保留性取代而仍保留至少一種生物活性。保留性取代為胺基酸被具有類似特性之另一胺基酸取代，如此熟習肽化學技術者將預期多肽之二級結構及親水性質實質上不變化。一般而言，以下各組胺基酸表示保留性變化：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；及(5)phe、tyr、trp、his。
特定實例變異體及衍生物包括但不限於包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽的功能活性變異體及衍生物，例如包含Klotho之細胞外域(例如SEQ ID NO: 5或6)之至少約100、150、200、250、300、350、375、400或425個連續胺基酸且與野生型序列(如SEQ ID NO: 5或6中所揭示)相比具有不超過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60或60個以上胺基酸殘基差異同時保留該野生型多肽之至少一種生物活性的多肽。舉例而言，包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 5或6之至少約400個連續胺基酸且具有不超過約100個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 5或6之至少約400個連續胺基酸且具有不超過約50個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 5或6之至少約425個連續胺基酸且具有不超過約25個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 5或6之至少約425個連續胺基酸且具有不超過約10個胺基酸殘基差異的多肽。在另一實例中，包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 7之至少約100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、925、950或982個連續胺基酸且與野生型序列相比具有不超過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、110、120、140、150、160、170、180、190或200個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 7之至少約500個連續胺基酸且具有不超過約100個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽的功能活性變異體或衍生物包含包含SEQ ID NO: 7之至少約600個連續胺基酸且具有不超過約100個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 7之至少約700個連續胺基酸且具有不超過約100個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 7之至少約800個連續胺基酸且具有不超過約100個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 7之至少約900個連續胺基酸且具有不超過約100個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 7之至少約900個連續胺基酸且具有不超過約50個胺基酸殘基差異的多肽。
特定實例變異體及衍生物包括但不限於包含纖維母細胞生長因子之多肽的功能活性變異體及衍生物，例如包含纖維母細胞生長因子(例如FGF19(SEQ ID NO: 31)、FGF21(SEQ ID NO: 33)或FGF23(SEQ ID NO: 35))之至少約100、125、150、150、175、200、225或250個連續胺基酸且與野生型序列(如SEQ ID NO: 31、33或35中所揭示)相比具有不超過約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60或60個以上胺基酸殘基差異，同時保留該野生型多肽之至少一種生物活性的多肽。在多個實施例中，變異體或衍生物可包含R179Q變異或不包含R179Q變異。舉例而言，包含纖維母細胞生長因子之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 31、33或35之至少約150個連續胺基酸且具有不超過約25個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含纖維母細胞生長因子之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 31、33或35之至少約175個連續胺基酸且具有不超過約25個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含纖維母細胞生長因子之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 31、33或35之至少約200個連續胺基酸且具有不超過約25個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含纖維母細胞生長因子之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO: 35之至少約225個連續胺基酸且具有不超過約50個胺基酸殘基差異的多肽。舉例而言，包含纖維母細胞生長因子之多肽的功能活性變異體或衍生物包含：包含SEQ ID NO:35之至少約225個連續胺基酸且具有不超過約25個胺基酸殘基差異的多肽。
本發明融合多肽之表現
為了表現本發明之融合蛋白質，可利用此項技術中熟知之技術將由本文所述或此項技術中已知之任何方法所獲得之DNA分子插入適當表現載體中。舉例而言，可由均聚加尾反應(homopolymeric tailing)或由涉及使用合成DNA連接子之限制酶連接反應或由鈍端連接反應，將雙股cDNA選殖於適合載體中。通常使用DNA連接酶來連接DNA分子，且可藉由用鹼性磷酸酶處理，來避免不合需要之接合。
因此，本發明包括載體(例如重組質體及噬菌體)，該等載體包括如本文所述之核酸分子(例如基因或編碼基因之重組核酸分子)。術語「重組載體」包括已經過改變、修飾或工程改造，其與獲得該重組載體之原生或天然核酸分子中所包括之核酸序列相比含有較多、較少或不同核酸序列的載體(例如質體、噬菌體、噬菌粒、病毒、黏質體、F-質粒(fosmid)或其他純化之核酸載體)。舉例而言，重組載體可包括編碼以操作方式連接至如本文所定義之調控序列(例如啟動子序列、終止子序列及/或人工核糖體結合位點(RBS))之Klotho-FGF23融合物的核苷酸序列。允許表現其中所包括之基因或核酸之重組載體稱為「表現載體」。
對於真核宿主，視宿主之性質，可利用不同轉錄及轉譯調控序列。其可源自病毒來源，諸如腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒、猴病毒(Simian virus)或其類似物，其中該調控信號與具有高表現量之特定基因相關。實例包括但不限於疱疹病毒(Herpes virus)之TK啟動子、SV40早期啟動子、酵母ga14基因啟動子等。可選擇允許壓制或活化之轉錄起始調控信號，從而可調節基因表現。
在本文所述之一些本發明分子中，由具有編碼融合多肽之一或多個多肽鏈之核苷酸序列的一或多個DNA分子以操作方式連接至一或多個調控序列，該等調控序列能夠將所要DNA分子整合於宿主細胞中。可選擇已經過所引入之DNA穩定轉型之細胞，舉例而言，藉由引入一或多個允許選擇含有表現載體之宿主細胞的標記物。可選擇之標記基因可直接連接至欲表現之核酸序列，或藉由共同轉染引入同一細胞中。亦可能需要其他元件，以便最佳合成本文所述之蛋白質。一般熟習此項技術者將顯而易知其他可使用元件。
在選擇特定質體或病毒載體時，重要之因素包括但不限於與不含載體之接受者細胞區別以便識別且選擇含有載體之接受者細胞的簡易性；特定宿主中所要之載體的複本數；及是否需要使載體能夠在不同物種之宿主細胞之間「穿梭(shuttle)」。
構築包括用於表現之DNA序列的載體後，即可藉由此項技術中已知之各種適合方法中之一或多種將其引入適當宿主細胞中，包括但不限於例如轉型、轉染、結合、原生質體融合、電穿孔、磷酸鈣沈澱、直接顯微注射等。
宿主細胞可為原核或真核。真核宿主細胞之實例包括例如哺乳動物細胞，諸如人類細胞、猴細胞、小鼠細胞及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。該等細胞有助於蛋白質之轉譯後修飾，包括例如正確摺疊或糖基化。另外，亦可使用酵母細胞表現本發明之融合多肽。類似於大部分哺乳動物細胞，酵母細胞亦能夠進行蛋白質之轉譯後修飾，包括例如糖基化。存在許多重組DNA策略，該等策略利用可用於在酵母中產生蛋白質之強啟動子序列及高複本數質體。酵母轉錄及轉譯機制可識別所選殖之哺乳動物基因產物上之前導序列，從而能夠分泌帶有前導序列之肽(亦即前肽(pre-peptide))。以高產率產生本發明融合多肽之特定方法為藉由在DHFR缺乏型CHO細胞中使用二氫葉酸還原酶(DHFR)擴增，藉由使用連續遞增量之甲胺喋呤，如美國專利第4,889,803號中所述。所獲得之多肽可呈糖基化形式。
在宿主細胞中引入一或多種載體後，宿主細胞通常在選擇性培養基中生長，該培養基選擇生長含載體之細胞。可藉由此項技術中已知或本文所述之任何方法進行重組蛋白質之純化，例如任何習知程序，涉及萃取、沈澱、層析及電泳。可用於純化蛋白質之另一純化程序為親和層析法，其使用結合標靶蛋白質之單株抗體。一般而言，使含有重組蛋白質之粗製劑穿過固定有適合單株抗體之管柱。蛋白質通常經由特異性抗體結合管柱，而雜質則穿過管柱。洗滌管柱後，藉由例如改變pH值或離子濃度使蛋白質自凝膠中溶離。
評定融合多肽活性之檢定
本文所述之檢定(參見實例2)及此項技術中已知之檢定可用於偵測本發明融合多肽之Klotho或FGF活性。適合的活性檢定包括受體結合檢定、細胞增殖檢定及細胞信號傳導檢定。舉例而言，可用於確定融合多肽是否具有Klotho或FGF活性之結合檢定包括檢定融合多肽與FGF受體之結合。FGF受體結合檢定包括但不限於競爭性與非競爭性檢定。舉例而言，可藉由使表現FGF受體之細胞與經標記之FGF(例如放射性標記)接觸並增加未標記之Klotho-FGF融合多肽之濃度來偵測FGF受體結合。向含有該細胞之反應混合物中添加競爭以結合同一受體之兩種配位體。隨後洗滌該等細胞且量測經標記之FGF。在存在未標記之融合多肽的情況下經標記之FGF之量相對於其受體降低，指示Klotho-FGF融合多肽結合該受體。或者，可標記Klotho-FGF融合多肽，且偵測融合多肽與細胞之直接結合。
亦可藉由確定融合多肽是否誘導細胞反應來量測Klotho或FGF活性。舉例而言，在一些實施例中，偵測Klotho-FGF融合多肽之生物活性的檢定涉及使表現FGF受體之細胞與融合多肽接觸，檢定細胞反應，諸如C2Cl2細胞中之細胞增殖或Egr-1活化、肌管直徑，並比較在存在及不存在融合多肽之情況下的細胞反應。在存在融合多肽複合物之情況下的細胞反應相對於不存在融合多肽複合物之情況有所增加，指示融合多肽具有生物活性。又，亦可量測來自受體之下游信號傳導事件增加作為生物活性之指標(例如FGFR、FRS2、ERK1/2、p70S6K等之磷酸化)。
醫藥組合物及治療方法
本發明亦關於醫藥組合物，其含有一或多種本發明融合多肽及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。該等醫藥組合物可進一步包括醫藥學有效劑量之肝素。該等醫藥組合物可包括於套組或容器中。該套組或容器可與關於融合多肽之延長活體內半衰期或活體外存放期的說明書一起封裝。該套組或容器可視情況隨附呈政府機構指定之形式的規定醫藥或生物產品之製造、使用或銷售的通知，該通知反映機構批准可用於人類投藥製造、使用或銷售。該等組合物可用於治療、預防或改善患者、較佳哺乳動物且最佳人類之疾病或疾病症狀(例如年齡相關之病狀或代謝障礙)之方法中，其係藉由將醫藥組合物投與患者來使用。
一般而言，本發明醫藥組合物之治療有效量為每公斤體重約0.0001 mg至0.001 mg；0.001 mg至約10 mg或約0.02mg至約5 mg。融合多肽之治療有效量通常為例如約0.001 mg至約0.01 mg、約0.01 mg至約100 mg或約100 mg至約1000 mg。融合多肽之治療有效量較佳為約0.001 mg/kg至2 mg/kg。
融合多肽之最佳醫藥調配物可由熟習此項技術者視投藥途徑及所要劑量來確定。(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版(1990),Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，該文獻之全部揭示內容係以引用方式併入本文中)。
本發明之融合多肽可以可呈固體、液體或氣體(氣霧劑)形式之醫藥組合物形式投藥。典型投藥途徑可包括但不限於經口、表面(topical)、非經腸、舌下、直腸、陰道、皮內及鼻內。非經腸投藥包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腹膜內、胸膜內、胸骨內注射或輸注技術。較佳非經腸投與該等組合物。更佳靜脈內投與該等組合物。本發明之醫藥組合物可經調配以使本發明之多肽在組合物投與個體後具生物可用性。組合物可呈一或多個劑量單位形式，例如其中錠劑可為單一劑量單位，而呈氣霧劑形式之本發明多肽的容器可容納複數個劑量單位。
製備醫藥組合物時所使用之物質在所使用之量下可無毒的。熟習此項技術者將顯而易知，醫藥組合物中之活性成分之最佳劑量將視多種因素而定。相關因素包括但不限於個體類型(例如人類)、個體之總體健康狀況、個體需要治療之年齡相關之病狀或代謝障礙的類型、組合物作為多藥物療程之一部分的使用、本發明多肽之特定形式、投藥方式及所採用之組合物。
醫藥學上可接受之載劑或媒劑可為微粒，以致組合物呈例如錠劑或散劑形式。載劑可為液體，而組合物為例如口服糖漿或可注射液體。此外，載劑可為氣體，以致提供適用於例如吸入投藥之氣霧劑組合物。
術語「載劑」係指與本發明多肽一起投藥之稀釋劑、佐劑或賦形劑。該等醫藥載劑可為液體，諸如水及油，包括石油、動物油、植物油或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。載劑可為鹽水、阿拉伯膠、明膠、澱粉糊、滑石、角蛋白、膠狀二氧化矽、尿素及其類似物。此外，可使用助劑、穩定劑、增稠劑、潤滑劑及著色劑。在一實施例中，當投與個體時，本發明多肽及醫藥學上可接受之載劑為無菌的。當本發明多肽經靜脈內投藥時，水為特定載劑。鹽水溶液及右旋糖水溶液及甘油溶液亦可用作液體載劑，尤其用於可注射溶液。適合的醫藥載劑亦包括賦形劑，諸如澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇及其類似物。本發明組合物需要時亦可含有微量潤濕劑或乳化劑或pH值緩衝劑。
組合物可預定用於經口投藥，且若如此，則組合物較佳呈固體或液體形式，其中半固體、半液體、懸浮液及凝膠形式包括在本文所認為之固體或液體形式內。
作為供經口投藥之固體組合物，組合物可調配成散劑、顆粒劑、壓製錠劑、丸劑、膠囊、口香糖、粉片(wafer)或其類似形式。該固體組合物通常含有一或多種惰性稀釋劑。此外，可存在一或多種以下物質：黏合劑，諸如乙基纖維素、羧甲基纖維素、微晶纖維素或明膠；賦形劑，諸如澱粉、乳糖或糊精；崩解劑，諸如海藻酸、海藻酸鈉、澱粉羥基乙酸鈉(Primogel)、玉米澱粉及其類似物；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或史提若特(Sterotex)；助流劑，諸如膠體二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；調味劑，諸如胡椒薄荷、柳酸甲酯或橙味劑；及著色劑。
當醫藥組合物呈膠囊、例如明膠膠囊形式時，除以上類型之物質以外，其亦可含有液體載劑，諸如聚乙二醇、環糊精或脂肪油。
醫藥組合物可呈液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。液體可適用於經口投藥或藉由注射遞送。當預定用於經口投藥時，組合物可含有一或多種甜味劑、防腐劑、染料/著色劑及口味增強劑。在用於注射投藥之組合物中，亦可包括一或多種界面活性劑、防腐劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑及等張劑。
本發明之液體組合物不論是溶液、懸浮液還是其他類似形式，亦可包括一或多種以下物質：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液(較佳為生理鹽水)、林格氏溶液(Ringer's solution)、等張氯化鈉；固定油，諸如可充當溶劑或懸浮介質之合成單酸甘油酯或二酸甘油酯、聚乙二醇、丙三醇、環糊精、丙二醇或其他溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及張力調節劑，諸如氯化鈉或右旋糖。非經腸組合物可密封於安瓿、拋棄式注射器或由玻璃、塑膠或其他材料製成之多劑量小瓶中。生理鹽水為特定的具體佐劑。可注射組合物較佳為無菌的。
醫藥組合物含有有效量之本發明化合物(例如融合多肽)以便獲得適合的劑量。醫藥組合物可能含有已知有效量之化合物，如目前針對各別病症所開具之處方。
本發明多肽用於將有效預防、治療及/或管理年齡相關之病狀或代謝障礙的預防性及/或治療性療程中之投藥途徑可基於目前此項技術中已知之其他治療劑之規定的投藥途徑。本發明之多肽可經任何適宜途徑投與，例如藉由輸注或快速注射、藉由經上皮或皮膚黏膜內皮(例如口腔黏膜、直腸及腸黏膜等)吸收。投藥可為全身性的或局部的。各種遞送系統為已知的，例如微粒、微膠囊、膠囊等，且可適用於投與本發明之多肽。可向個體投與超過一種本發明多肽。投藥方法可包括但不限於經口投藥及非經腸投藥；非經腸投藥包括但不限於皮內、肌肉內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外、舌下、鼻內、腦內、心室內、鞘內、陰道內、經皮、直腸、藉由吸入，或表面投與耳、鼻、眼或皮膚。
本發明之多肽可以非經腸方式投與。特定言之，本發明之多肽可經靜脈內投與。
亦可採用經肺投藥，例如藉由使用吸入器或噴霧器，及與霧化劑一起調配，或經由於氟碳化合物或合成肺用界面活性劑中灌注。本發明多肽亦可與慣用黏合劑及載劑(諸如三酸甘油酯)一起調配成栓劑。
本發明之多肽可於控制釋放系統中遞送。舉例而言，可使用泵(參見Sefton,CRC Crit .Ref .Biomed .Eng . 1987,14 ,201；Buchwald等人,Surgery 1980,88 : 507；Saudek等人,N .Engl .J .Med . 1989,321:574)。聚合材料亦可用於本發明多肽之控制釋放(參見Medical Applications of Controlled Release ,Langer及Wise(編),CRC Pres.,Boca Raton,FL,1974；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance ,Smolen及Ball(編),Wiley,New York,1984；Ranger及Peppas,J .Macromol .Sci .Rev .Macromol .Chem . 1983,23 ,61；亦參見Levy等人,Science 1985,228,190；During等人,Ann .Neurol .,1989,25 ,351；Howard等人,J .Neurosurg .,1989,71 ,105)。特定言之，控制釋放系統可置於本發明多肽之標靶(例如腦)附近，因而僅需要全身性劑量之一部分(參見例如Goodson,Medical Applications of Controlled Release ,同上文 ,第2卷,1984,第115-138頁)。可使用Langer(Science 1990,249 ,1527-1533)之綜述中所論述之其他控制釋放系統。
用於達成控制或持續釋放本發明多肽之聚合材料揭示於例如美國專利第5,679,377號、美國專利第5,916,597號、美國專利第5,912,015號、美國專利第5,989,463號、美國專利第5,128,326號、PCT公開案第WO 99/15154號及PCT公開案第WO 99/20253號中。用於持續釋放調配物中之聚合物之實例包括但不限於聚(2-羥基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯醯胺、聚(乙二醇)、聚乳酸交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)及聚原酸酯。用於持續釋放調配物中之聚合物較佳為惰性的、不含可浸出雜質、儲存穩定、無菌且生物可降解。
一般而言，本發明醫藥組合物之治療有效量為每公斤體重約0.0001 mg至0.001 mg；0.001 mg至約10 mg或約0.02 mg至約5 mg。
在其他實施例中，預防性及/或治療性療程涉及投與患者一或多次劑量的有效量之本發明多肽，其中該有效量之劑量達成至少0.01 μg/mL至至少400 μg/mL之本發明多肽之血漿含量。
預防性及/或治療性療程可涉及投與患者複數個劑量的有效量之本發明多肽，其中該複數個劑量維持至少0.01 μg/mL至400 μg/mL之本發明多肽之血漿含量。可投與預防性及/或治療性療程至少1天、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月或9個月。
預防性及/或治療性療程可涉及投與本發明多肽與一或多種其他治療劑組合。目前用於預防、治療及/或管理年齡相關之病狀或代謝障礙之一或多種治療劑的推薦劑量可自此項技術中之任何參考文獻獲得，包括但不限於Hardman等人編,Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics,第10版 ,McGraw-Hill,New York,2001；Physician's Desk Reference (第60版,2006)，該等文獻係以全文引用的方式併入本文中。
本發明包括治療需要Klotho蛋白質及FGF之促效活性之病症的方法。此外，本發明包括所揭示之蛋白質、融合蛋白質、核酸分子或醫藥組合物之用途，其係用於治療需要Klotho蛋白質及FGF之促效活性之病理性病症的療法或藥物中。本發明之該等方法或用途之實例包括但不限於年齡相關之病狀或代謝障礙。
本發明包括治療或預防個體之年齡相關之病狀的方法；及所揭示之蛋白質、融合蛋白質、核酸分子或醫藥組合物在用於治療或預防個體之年齡相關之病狀之療法或藥物中的用途。向需要治療之個體投與藥理學有效劑量之醫藥組合物以便治療或預防年齡相關之病狀，該醫藥組合物含有具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子及(視情況存在之)經修飾之Fc片段的Klotho融合多肽。在一些實施例中，Klotho融合多肽與藥理學有效劑量之肝素共同投藥。年齡相關之病狀包括肌肉減少症、皮膚萎縮、肌肉萎縮、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質疏鬆症、骨關節炎、免疫機能不全、高血壓、癡呆症、亨廷頓氏病、阿茲海默氏病、白內障、年齡相關之黃斑部變性、前列腺癌、中風、預期壽命縮短、記憶損失、皺紋、腎功能損傷及年齡相關之聽力損失。在一些實施例中，Klotho融合多肽含有α Klotho蛋白質之至少一個細胞外域。在一特定實施例中，向需要治療肌肉萎縮之個體投與含有α Klotho蛋白質之至少一個細胞外域及纖維母細胞生長因子23之Klotho融合蛋白質。
本發明亦關於一種治療或預防個體之代謝障礙的方法；及所揭示之蛋白質、融合蛋白質、核酸分子或醫藥組合物在用於治療或預防個體之代謝障礙之療法或藥物中的用途。向需要治療之個體投與藥理學有效劑量之醫藥組合物，該醫藥組合物含有可治療代謝障礙之Klotho融合多肽，其具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子，且可視情況含有具有降低對FcRn之結合及/或增加之血清半衰期及/或穩定性的經修飾之Fc片段。在一些實施例中，Klotho融合多肽與藥理學有效劑量之肝素共同投藥。該方法可用於治療或預防II型糖尿病、代謝症候群、高血糖症及肥胖症。在一特定實施例中，向需要治療代謝障礙之個體投與含有β-Klotho蛋白質之至少一個細胞外域及纖維母細胞生長因子21的Klotho融合蛋白質。
本發明亦提供治療或預防個體之高磷酸鹽血症或鈣質沉著的方法，及所揭示之蛋白質、融合蛋白質、核酸分子或醫藥組合物在用於治療或預防個體之高磷酸鹽血症或鈣質沉著之療法或藥物中的用途。向需要治療之個體投與藥理學有效劑量之醫藥組合物以治療高磷酸鹽血症或鈣質沉著，該醫藥組合物含有具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域、纖維母細胞生長因子及(視情況存在之)經修飾之Fc片段的Klotho融合多肽。在一些實施例中，Klotho融合多肽與藥理學上有效劑量之肝素共同投藥。在一特定實施例中，向需要治療高磷酸鹽血症或鈣質沉著之個體投與含有α Klotho蛋白質之至少一個細胞外域及纖維母細胞生長因子23及(視情況存在之)經修飾之Fc片段的Klotho融合蛋白質。
本發明亦關於一種治療或預防個體之慢性腎病或慢性腎衰竭的方法，及所揭示之蛋白質、融合蛋白質、核酸分子或醫藥組合物在用於治療或預防個體之慢性腎病或慢性腎衰竭之療法或藥物中的用途。向需要治療之個體投與藥理學有效劑量之醫藥組合物以治療慢性腎病或慢性腎衰竭，該醫藥組合物含有具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域、纖維母細胞生長因子及(視情況存在之)經修飾之Fc片段的Klotho融合多肽。在一些實施例中，Klotho融合多肽與藥理學有效劑量之肝素共同投藥。在一些實施例中，向需要治療慢性腎病或慢性腎衰竭之個體投與含有α Klotho蛋白質之至少一個細胞外域的Klotho融合蛋白質。
本發明亦包括治療或預防個體之癌症的方法，及所揭示之蛋白質、融合蛋白質、核酸分子或醫藥組合物在用於治療或預防個體之癌症之療法或藥物中的用途。向需要治療之個體投與藥理學有效劑量之醫藥組合物以治療癌症，該醫藥組合物含有具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域、纖維母細胞生長因子及(視情況存在之)經修飾之Fc片段的Klotho融合多肽。該方法可用於治療或預防乳癌。在一些實施例中，Klotho融合多肽與藥理學有效劑量之肝素共同投藥。在一些實施例中，向需要治療癌症之個體投與含有α Klotho蛋白質之至少一個細胞外域的Klotho融合蛋白質。
在藉由投與含有Klotho融合多肽之醫藥組合物來治療病症之方法中；或當在治療中使用含有Klotho融合多肽之醫藥組合物時，Klotho融合多肽及(視情況存在之)經修飾之Fc片段具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域及纖維母細胞生長因子。在一特定實施例中，Klotho融合蛋白質含有βKlotho蛋白質之至少一個細胞外域及纖維母細胞生長因子21。
在另一實施例中，該融合物包含FGF(例如FGF19、FGF21、FGF23或FGF23變異體)及具有降低對FcRn之結合及/或增加之血清穩定性的經修飾之Fc片段。此類型之融合物可用於如上文所述之各種疾病中，或用於治療或預防此項技術中已知之任何FGF相關之疾病。該融合物可投與有需要之個體。
該等融合多肽組合物可根據熟習此項技術者已知及本文所述之任何投藥方法進行投藥。特定的具體投藥方法包括皮下或靜脈內。本文中描述其他有效的投藥模式。
治療方法及評定效力之檢定
提供向個體投與本文所述之融合多肽的本發明方法或用途可用於治療多種病症，包括年齡相關之病症或代謝障礙。不受任何特定理論限制，融合多肽可用於治療存在Klotho或FGF失調之病症。實例病症包括代謝障礙及年齡相關之病症。舉例而言，FGF23或Klotho剔除小鼠顯示多種類似表現型，包括低身體活性、生長停滯、肌肉萎縮、皮膚萎縮、動脈粥樣硬化、壽命較短等。(參見Razzaque及Lanske,J. of Endrocrinology ,194:1-10(2007)，其係以引用的方式併入本文中)。
詳言之，本發明之融合多肽尤其適用於治療老化相關之病症，包括肌肉萎縮。不受理論限制，Klotho及FGF23控制礦物質(例如磷酸鹽及鈣)及維生素D體內平衡之能力可為此等蛋白質調節老化及肌肉萎縮之方法。
另一方面，本發明之融合多肽可用於治療代謝障礙。舉例而言，β-Klotho及FGF19已顯示藉由調控膽固醇7-α-羥化酶(CYP7A1)來控制膽汁酸體內平衡。膽汁體內平衡障礙之非限制性實例為膽汁淤滯。β-Klotho及FGF21已顯示誘導脂肪細胞中之脂肪分解，且因此減少脂肪儲存並增加葡萄糖攝取。脂肪分解/脂肪儲存障礙之非限制性實例為肥胖症以及相關代謝及心血管疾病。
至少部分基於FGF23能夠刺激尿中之磷酸鹽分泌且藉此降低血清中之磷酸鹽含量的發現結果，本發明之Klotho-FGF23融合多肽可用於治療或預防個體之高磷酸鹽血症或鈣質沉著。舉例而言，已顯示導致患者之Klotho缺乏症的Klotho中之同種接合錯義突變可能引起嚴重腫瘤樣鈣質沉著及動脈鈣化(Ichikawa等人,J. Clin. Invest. 117:2684-2691(2007)，其係以引用的方式併入本文中)。向個體投與藥理學有效劑量之醫藥組合物以治療或預防高磷酸鹽血症或鈣質沉著，該醫藥組合物含有具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域、纖維母細胞生長因子及(視情況存在之)經修飾之Fc片段的Klotho融合多肽。詳言之，含有αKlotho蛋白質之至少一個細胞外域、纖維母細胞生長因子及(視情況存在之)經修飾之Fc片段的Klotho融合多肽適用於治療高磷酸鹽血症或鈣質沉著。
本發明之Klotho融合多肽亦可用於治療或預防個體之慢性腎病或慢性腎衰竭。舉例而言，已顯示與未受影響之腎臟相比，患有慢性腎衰竭之患者之腎臟中Klotho表現降低(Koh等人,Biochem. Biophys. Res. Comm. 280:1015-1020(2001)，其係以引用的方式併入本文中)。向個體投與藥理學有效劑量之醫藥組合物以治療或預防慢性腎病或慢性腎衰竭，該醫藥組合物含有具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域、纖維母細胞生長因子及(視情況存在之)經修飾之Fc片段的Klotho融合多肽。詳言之，含有α Klotho蛋白質之至少一個細胞外域的Klotho融合多肽適用於治療慢性腎病或慢性腎衰竭。
本發明之Klotho融合多肽亦可用於治療或預防個體之癌症。舉例而言，已顯示與正常乳癌組織相比，乳癌組織中Klotho表現降低(Wolf等人,Oncogene (2008)提前線上出版，其係以引用的方式併入本文中)。向個體投與藥理學有效劑量之醫藥組合物以治療或預防癌症或乳癌，該醫藥組合物含有具有Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域、纖維母細胞生長因子及(視情況存在之)經修飾之Fc片段的Klotho融合多肽。詳言之，含有α Klotho蛋白質之至少一個細胞外域的Klotho融合蛋白質適用於治療癌症或乳癌。
評估本發明Klotho融合多肽對年齡相關之病症或代謝障礙之效力及/或確定其有效劑量的方法包括基於生物體之檢定，例如使用哺乳動物(例如小鼠、大鼠、靈長類動物或一些其他非人類)或其他動物(例如爪蟾屬(Xenopus)、斑馬魚(zebrafish)或無脊椎動物，諸如蠅類或線蟲)。Klotho融合多肽可投與生物體一次或以療程(規律或不規律)投與。接著評估生物體之參數，例如年齡相關之參數。相關Klotho融合多肽使得參數相對於參考值(例如對照生物體之參數)發生變化。亦可評估其他參數(例如與毒性、清除率及藥物動力學相關之參數)。
可使用患有特定病症之動物評估本發明之Klotho融合多肽，例如本文所述之病症，例如年齡相關之病症、代謝障礙。此等病症亦可提供可觀察測試多肽對生理機能之效應的敏感系統。實例病症包括：去神經性、不用性萎縮；代謝障礙(例如肥胖及/或糖尿病動物之障礙，諸如db/db小鼠及ob/ob小鼠)；大腦、肝臟缺血；順鉑/紫杉醇/長春新鹼模型；各種組織(異種移植)移植物；轉殖基因骨模型；疼痛症候群(包括發炎性及神經性病症)；巴拉劑(Paraquat)、致基因毒性及氧化性應力模型；及腫瘤I模型。
為了量測年齡相關之病症，動物模型可為在熱量受限制時具有改變之表現型的動物。舉例而言，F344大鼠提供評估Klotho融合多肽之適用檢定系統。當熱量受限制時，F344大鼠之腎病發病率為0%至10%。然而當隨意餵食時，其腎病發病率為60%至100%。
為了評估本發明之Klotho融合多肽，將其投與動物(例如F344大鼠或其他適合的動物)且在例如一段時間後，評估該動物之參數。該動物可隨意或正常餵食(例如無熱量限制，但一些參數可在該等條件下評估)。通常，一群該等動物用於該檢定。一般而言，若測試多肽在經受熱量限制之類似動物之表現型方向上影響該參數，則可指出該測試多肽有利地改變該動物之壽命調節。該等測試多肽可產生熱量限制之至少一些壽命調節效應，例如該等效應之子集，而不必剝奪生物體之熱量攝取。
待測試之參數可為年齡相關或疾病相關之參數，例如與動物模型相關之病症之症狀。舉例而言，測試多肽可投與SH大鼠，且監測血壓。相對於未經多肽處理之類似參考動物，有利地指示之測試多肽可改善症狀。與病症或老化相關之其他參數可包括：抗氧化劑含量(例如抗氧化酶含量或活性)、應力抗性(例如巴拉劑抗性)、核心體溫、葡萄糖含量、胰島素含量、促甲狀腺激素含量、促乳素含量及黃體生成激素含量。
為了量測本發明多肽治療年齡相關之病症的有效性，可使用具有降低之Klotho表現的動物，例如具有突變Klotho之小鼠；參見Kuroo等人，Nature,390;45(1997)及美國公開案第2003/0119910號，兩者係以全文引用的方式併入本文中。舉例而言，將測試多肽投與突變型小鼠且監測年齡相關之參數。相對於未經多肽處理之類似參考動物，有利地指示之測試多肽可改善症狀。可藉由量測體重、檢查生殖能力之獲取、量測血糖含量、觀察壽命、觀察皮膚、觀察運動功能(諸如行走)及其類似方式來評定與代謝障礙或老化相關之參數。亦可藉由量測胸腺重量、觀察胸腔內表面上所形成之鈣化節結之大小及其類似方式來評定。此外，Klotho基因或Klotho蛋白質之mRNA之定量測定亦適用於該評定。
又其他活體內模型及生物體檢定包括評估動物之代謝參數，例如與胰島素病症II型糖尿病相關之參數。實例代謝參數包括：葡萄糖濃度、胰島素濃度及胰島素敏感性。
另一實例系統提供例如於動物模型中之腫瘤。腫瘤可為自發腫瘤或誘導之腫瘤。舉例而言，腫瘤可由具有多種基因組成之細胞發展而來，例如其可為p53+或p53-。亦可能使用具有自體免疫障礙之生物體，例如易患SLE之NZB小鼠。為了評估骨疾病之特徵，可能例如使用進行卵巢切除術之動物作為模型，例如用於骨質疏鬆症。類似地，對於關節病，模型可基於佐劑關節炎(例如可用軟骨蛋白聚糖、高遷移率族蛋白質、鏈球菌細胞壁物質或膠原蛋白使小鼠免疫)；對於腎病，可使用kd/kd小鼠。亦可利用認知(尤其學習及記憶)動物模型。亦可利用糖尿病及其併發症之動物模型，例如鏈脲佐菌素模型。可使用犬科動物模型，例如用於評估中風及局部缺血。
在評定測試多肽是否能夠改變壽命調節時，可監測或評估許多年齡相關之參數或生物標記物。實例年齡相關之參數包括：(i)細胞或生物體之壽命；(ii)具有生物學年齡依賴性表現模式之細胞或生物體中之基因轉錄物或基因產物之存在或豐度；(iii)細胞或生物體對應力之抗性；(iv)細胞或生物體之一或多個代謝參數(實例參數包括循環胰島素含量、血糖含量；脂肪含量；核心體溫等)；(v)生物體中所存在之細胞或一組細胞之增殖能力；及(vi)細胞或生物體之身體外觀或行為。
術語「平均壽命」係指一群生物體死亡年齡之平均值。在一些情況下，在受控環境條件下使用一群基因一致生物體評定「平均壽命」。排除由災禍所致之死亡。若在受控環境條件下無法確定平均壽命(例如對人類而言)，則可使用足夠大群體之可靠統計資訊(例如來自保險統計表)作為平均壽命。
表徵兩個該等生物體(例如一個參考生物體與一個經Klotho融合多肽處理之生物體)之間的分子差異可揭示生物體之生理狀態的差異。參考生物體及經處理之生物體通常具有相同的實足年齡。如本文所使用之術語「實足年齡」係指自諸如妊娠、所定義之胚胎或胎兒階段，或更佳為出生之預選事件起所經過之時間。多種準則可用於確定生物體是否具有「相同」實足年齡以用於比較分析。通常所需的精確度為野生型生物體之平均壽命的函數。舉例而言，對於線蟲秀麗隱桿線蟲(C .elegans )，在一些受控條件下，其實驗室野生型品系N2平均存活約16天，具有相同年齡之生物體可能已存活相同天數。對於小鼠，具有相同年齡之生物體可能已存活相同週數或月數；對於靈長類動物或人類，為相同年數(或在2、3或5年內)等。一般而言，具有相同實足年齡之生物體可能已存活該物種野生型生物體之平均壽命之15%、10%、5%、3%、2%或1%以內之時間。生物體較佳為成年生物體，例如生物體已存活至少平均野生型生物體已成熟達到勝任繁殖之年齡的時間。
可在生物體展現明顯老化的身體特徵之前執行生物體篩選檢定。舉例而言，生物體可為僅存活相同物種野生型生物體之平均壽命之10%、30%、40%、50%、60%或70%的成年生物體。已報導，代謝、免疫能力及染色體結構中之年齡相關之變化。可評估測試個體(例如對於基於生物體之檢定)或患者(例如在用本文所述之治療劑治療之前、期間或之後)之任何此等變化。
亦可評估篩選檢定之個體生物體(或經治療個體)之與熱量限制相關之標記物。雖然此等標記物可能不與年齡相關，但其可指示當調節Klotho路徑時所改變之生理狀態。該標記物可為豐度在熱量受限制之動物中改變之mRNA或蛋白質。WO 01/12851及美國專利第6,406,853號描述實例標記物。來源於本文所述之動物之細胞或類似於本文所述之動物模型的細胞模型可用於基於細胞之檢定。
用於評估測試多肽對肌肉萎縮之影響的模型包括：1)由去神經(例如藉由切斷大腿中部之右坐骨神經)所致之大鼠內側腓腸肌肌肉質量損失；2)由固定(例如藉由以90度彎曲固定右踝關節)所致之大鼠內側腓腸肌肌肉質量損失；3)由後肢懸置所致之大鼠內側腓腸肌肌肉質量損失；(參見例如U.S. 2003-0129686)；4)由用惡病質細胞激素介白素-1(IL-1)處理所致之骨骼肌萎縮(R. N. Cooney,S. R. Kimball,T. C. Vary,Shock 7,1-16(1997))；及5)由用糖皮質激素地塞米松(dexamethasone)處理所致之骨骼肌萎縮(A. L. Goldberg,J .Biol .Chem . 244,3223-9(1969))。
AMD之實例動物模型包括：雷射誘導之模擬滲出性(濕潤)黃斑部變性之小鼠模型(Bora等人,Proc .Natl .Acad .Sci . U S A.,100:2679-84(2003))；表現組織蛋白酶D之突變形式從而產生與AMD之「區域性萎縮(geographic atrophy)」形式相關之特徵的轉殖基因小鼠(Rakoczy等人,Am .J .Pathol .,161:1515-24(2002))；及在視網膜色素上皮中過度表現VEGF從而產生CNV之轉殖基因小鼠。Schwesinger等人,Am .J .Pathol . 158:1161-72(2001)。
帕金森氏病(Parkinson's disease)之實例動物模型包括藉由用多巴胺激導性神經毒素(dopaminergic neurotoxin)1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)處理而導致似帕金森氏病(Parkinsonian)的靈長類動物(參見例如美國專利公開案第20030055231號及Wichmann等人,Ann .N.Y. Acad .Sci .,991:199-213(2003))；6-羥基多巴胺病變大鼠(例如Lab. Anim. Sci.,49:363-71(1999))；及轉殖基因無脊椎動物模型(例如Lakso等人,J. Neurochem. 86:165-72(2003)及Link,Mech. Ageing Dev. ,122:1639-49(2001))。
II型糖尿病之實例分子模型包括：具有缺陷性Nkx-2.2或Nkx-6.1之轉殖基因小鼠(美國專利第6,127,598號)；Zucker糖尿病性肥胖fa/fa(ZDF)大鼠(美國專利第6,569,832號)；及恆河猴(Rhesus monkey)，其自發罹患肥胖症且隨後往往發展成明顯2型糖尿病(Hotta等人,Diαbetes ,50:1126-33(2001)；及具有顯性負IGF-I受體(KR-IGF-IR)之患有2型糖尿病樣抗胰島素症的轉殖基因小鼠。
神經病之實例動物及細胞模型包括：長春新鹼(vincristine)誘導之感覺運動神經病小鼠(美國專利第5,420,112號)或兔(OgaWa等人,Neurotoxicology, 21:501-11(2000))；用於自主神經病研究之鏈脲佐菌素(STZ)-糖尿病性大鼠(Schmidt等人,Am. J. Pathol .,163:21-8(2003))；及進行性運動神經病(pmn)小鼠(Martin等人,Genomics ,75:9-16(2001))。
高磷酸鹽血症或腫瘤樣鈣質沉著之實例動物模型包括Klotho剔除小鼠及FGF23剔除小鼠(Yoshida等人,Endocrinology 143:683-689(2002))。
慢性腎病或慢性腎衰竭之實例動物模型包括COL4A3+/-小鼠(Beirowski等人,J. Am. Soc. Nephrol. 17:1986-1994(2006))。
癌症之實例動物模型包括向裸小鼠中移植或植入癌細胞或癌組織，如此項技術中已知(Giovanella等人,Adv. Cancer Res . 44:69-120(1985))。舉例而言，乳癌之動物模型包括移植或植入乳癌細胞或組織之裸小鼠(例如Yue等人,Cancer Res. 54:5092-5095(1994)；Glinsky等人,Cancer Res . 56:5319-5324(1996)；VisonneauAm. J. Path. 152:1299-1311(1998))。
組合物可投與個體，例如成年個體，尤其健康成年個體或患有年齡相關之疾病的個體。在後一種情況下，該方法可包括評估個體例如以表徵年齡相關之疾病之症狀或其他疾病標記物，且藉此將個體鑑別為患有神經退化性疾病(例如阿茲海默氏病)或年齡相關之疾病或鑑別為易患該疾病。
骨骼肌萎縮
提供向個體投與Klotho融合多肽之本發明方法或用途可用於治療骨骼肌萎縮。肌肉萎縮包括許多神經肌肉性、代謝性、免疫性及神經性病症及疾病以及饑餓、營養缺乏、代謝應力、糖尿病、老化、肌肉萎縮症或肌病。肌肉萎縮在老化過程期間發生。肌肉萎縮亦由肌肉之使用減少或不用所致。症狀包括骨骼肌組織質量下降。在人類男性中，肌肉質量在50歲與80歲之間下降三分之一。肌肉萎縮之一些分子特徵包括泛素連接酶調升及肌原纖維蛋白質損失(Furuno等人,J. Biol. Chem .,265:8550-8557,1990)。可例如藉由量測3-甲基-組胺酸產生來追蹤此等蛋白質之分解，3-甲基-組胺酸為肌動蛋白之特定組分且在某些肌肉中為肌球蛋白之組分(Goodman,Biochem. J. 241:121-12,1987及Lowell等人,Metabolism,35:1121-112,1986；Stein及Schluter,Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 272: E688-E696,1997)。亦可指示肌酸激酶(細胞損壞標記物)之釋放(Jackson等人,Neurology,41: 101-104,1991)。
非胰島素依賴性糖尿病
提供向個體投與Klotho融合多肽之本發明方法或用途可用於治療非胰島素依賴性糖尿病。非胰島素依賴性糖尿病亦稱為「成年發作」糖尿病及2型糖尿病。2型糖尿病亦包括「非肥胖2型」及「肥胖2型」。II型糖尿病之特徵可在於(1)胰島素之胰臟β-胰島細胞分泌降低以致產生小於保持血糖含量平衡所必需之量的胰島素，及/或(2)「胰島素抗性」，其中身體不能正常應答胰島素。(美國專利第5,266,561號及美國專利第6,518,069號)。舉例而言，葡萄糖刺激之胰島素含量通常不能上升至高於4.0 nmol/L。(美國專利第5,266,561號)。II型糖尿病之實例症狀包括：空腹高血糖症(美國專利第5,266,561號)；疲勞；極度善渴；尿頻；視力障礙；及感染率增加。II型糖尿病之分子適應症包括胰臟中之胰島類澱粉沈積。
神經病
神經病可包括由全身性疾病、遺傳病症或影響運動神經、感覺神經、感覺運動神經或自主神經之毒性劑所致之中樞及/或周圍神經功能障礙。(參見例如美國專利申請案第20030013771號)。症狀可視神經損傷之誘因及受影響神經之特定類型而變化。舉例而言，運動神經病之症狀包括執行身體任務時或如同肌肉虛弱般笨拙、微量勞力後筋疲力盡、站立或行走困難，及神經肌肉反射衰減或不存在。(美國專利申請案第20030013771號)自主神經病之症狀包括便秘、心臟紊亂及姿勢性低血壓反射衰減。(美國專利申請案第20030013771號)，感覺神經病之症狀包括疼痛及麻木；手、腿或足顫動；及對觸摸極度敏感，且視網膜病症狀包括視力障礙、暴盲、黑點及閃光。
阿茲海默氏病
提供向個體投與Klotho融合多肽之本發明方法或用途可用於治療阿茲海默氏病(AD)。阿茲海默氏病為造成神經元之不可逆損失之複合型神經退化性疾病。僅提供亦為年齡相關之病狀的神經退化性疾病之一個實例。阿茲海默氏病之臨床標誌包括記憶、判斷、實體環境定向及語言之進行性損傷。AD之神經病理學標誌包括區域特異性神經元損失、類澱粉斑塊及神經原纖維纏結。類澱粉斑塊為含有類澱粉肽(亦稱為Ap或Ap42)之細胞外斑塊，該類澱粉肽為8-類澱粉前驅蛋白質(亦稱為APP)之裂解產物。神經原纖維纏結為由異常過度磷酸化之微管相關蛋白質之長絲構成的不可溶細胞內聚集體，拉緊之類澱粉斑塊及神經原纖維纏結可能造成導致由細胞凋亡所致之神經元損失的繼發性事件(Clark及Karlawish,Ann. Intern. Med . 138(5):400-410(2003))。舉例而言，p-類澱粉在所培養之神經元中誘導卡斯蛋白酶-2(caspase-2)依賴性細胞凋亡(Troy等人,J Neurosci . 20(4):1386-1392)。活體內斑塊沈積可以類似方式引發近端神經元之細胞凋亡。
可使用多種準則來評估個體之AD，包括遺傳準則、生物化學準則、生理學準則及認識準則。AD之症狀及診斷為醫學從業者所知。下文提供AD之一些實例症狀及標記物。關於此等適應症及與AD相關之其他已知適應症之資訊可用作「AD相關參數」。AD相關參數可包括定性或定量資訊。定量資訊之一個實例為一或多個尺度之數值，例如蛋白質之濃度或斷層攝影圖。定性資訊可包括評定，例如醫師之註解或二元評定(「是」/「否」)等。AD相關參數包括指示個體經診斷未患AD或未患AD之特定適應症的資訊，例如AD之不典型認識測試結果或與AD無關之遺傳APOE多形現象。
進行性認識損傷為AD之標誌。此損傷可呈現為記憶、判斷、決策、實體環境定向及語言之衰退(Nussbaum及Ellis,New Eng J. Med. 348(14):1356 35 1364(2003))。排除癡呆症之其他形式可有助於進行AD診斷。神經元死亡在AD患者中造成進行性大腦萎縮。成像技術(例如磁共振成像或電腦輔助斷層攝影)可用於偵測腦中之AD相關病變及/或腦萎縮。
AD患者可展現由疾病之病變所致的生物化學異常。舉例而言，AD患者之腦脊液中之tan蛋白質含量升高(Andreasen,N.等人,Arch Neurol. 58:349-350(2001))。
在AD患者之CSF中，類澱粉β42(A,B42)肽之含量可能降低。在AD患者之血漿中，Ap42含量可能增加(Ertekein-Taner,N.等人,Science 290:2303 2304(2000))。用於偵測來自個體之樣品中之生物化學異常的技術包括此項技術中已知之細胞法、免疫法及其他生物學方法。關於一般性指導，參見例如以下文獻中所述之技術：Sambrook及Russell,Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(2001)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989))；Harrow E.及Lane,D.(1988) Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY及其更新版本。
舉例而言，抗體、其他免疫球蛋白及其他特異性結合配位體可用於偵測生物分子，例如與AD相關之蛋白質或其他抗原。舉例而言，一或多種特異性抗體可用於探測樣品。可能採用各種格式，例如ELISA、基於螢光之檢定、西方墨點法及蛋白質陣列。此項技術中描述產生多肽陣列之方法，例如De Wildt等人,(2000).Nature Biotech. 18,989-994；Lucking等人,(1999).Anal. Biochem. 270,103-111；Ge,H.(2000).Nucleic Acids Res. 28,e3,I-VII；MacBeath,G.及Schreiber,S.L.(2000). Science 289,1760至1763；及WO 99/51773A1。
在一個檢定中，使用AD之非人類動物模型(例如小鼠模型)例如來評估多肽或治療療程。舉例而言，美國專利第6,509,515號描述一個天然能夠用於學習及記憶測試之該類模型動物。該動物在腦組織中以使該動物自出生起在短時間內(一般為自出生起一年內，較佳為自出生起2至6個月內)發展進行性神經病症之含量表現類澱粉前驅蛋白質(APP)序列。將APP蛋白質序列引入處於胚胎期、較佳單細胞期或受精卵母細胞期且一般不晚於約8個細胞之期的動物或動物祖先中。受精卵或胚胎接著在作為養育雌性之假懷孕動物體內發育至產期。將類澱粉前驅蛋白質基因引入動物胚胎中以便以引起類澱粉前驅體蛋白質之超內源性表現及在腦皮質邊緣區域(在諸如AD之進行性神經病病況中顯著影響的腦區域)中發展進行性神經學疾病的狀態在染色體層面上併入。受影響之轉殖基因動物模型中之神經膠樣變性及臨床表現為神經病。神經病之進行性態樣之特徵在於探索性及/或運動性行為減少及去氧葡萄糖攝取/利用減少及腦皮質邊緣區域中肥厚性神經膠樣變性。此外，所見變化與在一些老化動物中所見者類似。US 5,387,742；5,877,399；6,358,752及6,187,992中亦描述其他動物模型。
帕金森氏病
提供向個體投與Klotho融合多肽之本發明方法或用途可用於治療帕金森氏病。帕金森氏病包括黑質中之多巴胺激導性神經元之神經退化，其造成調控運動功能之黑質紋狀體多巴胺系統退化。此病變又造成運動功能障礙(參見例如Lotharius等人,Nαt .Rev .Neurosci ., 3:932-42(2002))。實例運動症狀包括：運動不能、駝背姿勢(stooped posture)、步履艱難、姿勢不穩定、強直症、肌肉僵硬及顫抖。實例非運動症狀包括：抑鬱症、缺乏動機、被動、癡呆症及胃腸功能失調(參見例如Fahn,Ann. N.Y .Acad.Sci .,991:1-14(2003)及Pfeiffer,Lancet Neurol .,2:107-16(2003))。在0.5%至1%之65至69歲之人士及1%至3%之80歲及80歲以上之人士中觀察到帕金森氏病。(參見例如Nussbaum等人,N. Engl. J. Med .,348:1356-64(2003))。帕金森氏病之分子標記物包括芳族L胺基酸去羧基酶(AADC)減少(參見例如美國申請案第20020172664號)；及黑質紋狀體神經元中之多巴胺含量損失(參見例如Fahn,Ann.N.Y. Acad. Sci .,991:1-14(2003)及Lotharius等人,Nat. Rev. Neurosci.,3:932-42(2002))。在一些家族性情況下，PD與編碼α-突觸核蛋白及parkin(E3泛素連接酶)蛋白質之單一基因中的突變相關。(例如Riess等人,J. Neurol. 250增刊1:I3 10(2003)及Nussbaum等人,N. Engl. J. Med.,348:1356-64(2003))。神經元特異性C末端泛素水解酶基因中之錯義突變亦與帕金森氏病相關。(例如Nussbaum等人,N. Engl. J. Med.,348:1356-64(2003))
亨廷頓氏病
提供向個體投與Klotho融合多肽之本發明方法或用途可用於治療亨廷頓氏病。評估本發明Klotho融合多肽對亨廷頓氏病之效力及/或確定其有效劑量的方法包括基於生物體之檢定，例如使用哺乳動物(例如小鼠、大鼠、靈長類動物或一些其他非人類)或其他動物(例如爪蟾屬、斑馬魚或無脊椎動物，諸如蠅類或線蟲)。可利用許多亨廷頓氏病動物模型系統。參見例如Brouillet,FunctionalNeurology 15(4): 239-251(2000)；Ona等人,Nature 399: 263-267(1999)；Bates等人Hum Mol Genet . 6(10):1633-7(1997)；Hansson等人,J. of Neurochemistry 78: 694-703；及Rubinsztein,D. C.,Trends in Genetics ,第1S卷,第4期,第202-209頁(關於HD之各種動物及非人類模型之綜述)。
該類動物模型之一個實例為轉殖基因小鼠品系R6/2細胞株(Mangiarini等人,Cell 87: 493-506(1996))。R6/2小鼠為轉殖基因亨廷頓氏病小鼠，其過度表現人類HD基因之外顯子1(在內源性啟動子控制下)。R6/2人類HD基因之外顯子1具有擴增之CAG/聚麩醯胺酸重複單元長度(平均150個CAG重複單元)。此等小鼠發展具有人類亨廷頓氏病之許多特徵的進行性最終致死性神經病。在R6/2小鼠中，在細胞質及細胞核中均觀察到部分由亨廷頓蛋白(Huntingtin)之N末端部分(由HD外顯子1編碼)組成的異常聚集體(Davies 等人,Cell 90: 537-548(1997))。舉例而言，轉殖基因動物中之人類亨廷頓蛋白係由包括至少55個CAG重複單元且更佳約150個CAG重複單元之基因編碼。此等轉殖基因動物可發展亨廷頓氏病樣表現型。
此等轉殖基因小鼠之特徵在於自出生後8至10週起體重增加減少、壽命縮短及以步履異常為特徵之運動損傷、靜止時震顫、後肢抱握及過動症(例如R6/2品系；參見Mangiarini等人,Cell 87：493-506(1996))。該表現型進行性向運動功能減退惡化。此等轉殖基因小鼠之腦亦顯示神經化學及組織學異常，諸如神經傳遞質受體(麩胺酸鹽、多巴胺激導性)之變化、N-乙醯基天冬胺酸(神經元完整性之標記物)之濃度降低，以及紋狀體及腦之大小減小。因此，評估可包括評定與神經傳遞質含量、神經傳遞質受體含量、腦大小及紋狀體大小相關之參數。此外，含有全長人類亨廷頓蛋白或其轉殖基因部分之異常聚集體存在於此等動物(例如R6/2轉殖基因小鼠品系)之腦組織中。參見例如Mangiarini等人,Cell 87: 493-506(1996)；Davies等人,Cell 90: 537-548(1997)；Brouillet,Functional Neurology 15(4): 239-251(2000)；及Chα 等人,Proc .Natl .Acad .Sci . USA 95: 6480-6485(1998)。
為了測試本申請案中所述之測試多肽或已知多肽在動物模型中之效應，將不同濃度之測試多肽投與轉殖基因動物，例如藉由將測試多肽注射至動物之循環中。可評估動物之亨廷頓氏病樣症狀。接著，監測如上文關於小鼠模型所述之亨廷頓氏病樣症狀之進展，以確定用測試多肽處理是否減少或延遲症狀。在另一檢定中，監測此等動物中之亨廷頓蛋白聚集體之去聚集。接著可處死動物並獲得腦切片。接著分析腦切片中含有轉殖基因人類亨廷頓蛋白、其部分或包含人類亨廷頓蛋白或其部分之融合蛋白質之聚集體的存在。此分析可包括例如用抗亨廷頓蛋白抗體對腦組織切片進行染色，及添加與識別抗亨廷頓蛋白抗體之FITC結合的二次抗體(例如該抗亨廷頓蛋白抗體為小鼠抗人類抗體且該二次抗體對人類抗體具特異性)，及藉由螢光顯微術目測蛋白質聚集體。
多種方法可用於評估及/或監測亨廷頓氏病。該疾病之多種臨床症狀及指標為已知的。亨廷頓氏病造成運動障礙、精神問題及認識變化。此等症狀之程度、發作年齡及表現可變化。運動障礙可包括稱為舞蹈病之快速、隨機、舞蹈樣運動。
實例運動評估包括：眼追蹤、眼急動起始(saccade initiation)、眼急動速度、發音困難、舌突起、手指輕敲能力、俯臥/仰臥、握拳-伸手-翻掌順序(a lo fist-hand-palm sequence)、手臂僵硬、運動徐緩、最大程度之肌張力不全(軀幹、上肢及下肢)、最大程度之舞蹈病(例如軀幹、面部、上肢及下肢)、步態、縱列行走及後退。實例治療可引起UHDRS之子量表總運動得分4(TMS-4)之變化，例如經一年的時間。
癌症
提供向個體投與Klotho融合多肽的本發明方法或用途可用於治療癌症。癌症包括由不適當之高細胞分裂量、不適當之低細胞凋亡量或兩者所造成或引起的任何疾病。癌症之實例包括但不限於白血病(例如急性白血病、急性淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、急性髓母細胞性白血病、急性早幼粒細胞白血病、急性髓單核細胞白血病、急性單核細胞性白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病)、真性紅血球過多症、淋巴瘤(霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、非霍奇金氏病)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重鏈病及實體腫瘤，諸如肉瘤及癌瘤(例如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌瘤、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓性癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威姆氏腫瘤(Wilm's tumor)、子宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌瘤、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果腺瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠質瘤(oligodenroglioma)、神經鞘瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經母細胞瘤及視網膜胚細胞瘤)。淋巴組織增殖障礙亦被視為增殖性疾病。
本文所引用之所有專利、專利申請案及公開的參考文獻係以全文引用的方式併入本文中。雖然已參考本發明之實施例特別展示並描述本發明，但熟習此項技術者應理解，在不背離隨附申請專利範圍所涵蓋之本發明範疇的情況下，可對其形式及細節進行各種改變。
實例 實例1. Klotho融合多肽之表現及純化
Klotho融合多肽之表現
藉由用編碼具有a Klotho之細胞外域及FGF23(R179Q)變異體之Klotho融合多肽的表現載體短暫轉染HEK293T細胞來製備本發明多肽。藉由短暫轉染Klotho、FGF23及Klotho-FGF23(R179Q)融合蛋白質之各別表現質體來產生含有經表現之多肽的條件培養基。在6孔板中使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，目錄號11668-019)執行轉染。轉染後5小時，用3 ml DMEM+1% FBS更換轉染混合物。添加3 ml DMEM+1% FBS後72小時，收集條件培養基。由SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離各種經短暫轉染之HEK293T細胞的條件培養基樣品，且由西方墨點法(Western blot)進行分析(圖3A)或用庫馬斯藍染色(Coomassie blue)(圖3B)。
對各種樣品執行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(泳道l，對照；泳道2，FGF23；泳道3，SKlotho；泳道4至6，sKlotho-FGF23)。庫馬斯藍染色顯示在含有未經編碼Klotho融合多肽之載體轉染之樣品的泳道1-3中不存在>180 kDa之高條帶表現(圖3B，由右邊的箭頭指示)。由西方墨點法評估分泌於培養基中之Klotho融合多肽之品質(圖3A)。使用抗FGF23大鼠單株IgG2A(R&D Systems，目錄號MAB26291)作為一次抗體來由西方墨點法偵測Klotho融合多肽。西方墨點法證實，庫馬斯染色凝膠中所觀察到之其他條帶為Klotho融合多肽。西方墨點法證實，Klotho融合多肽具有針對Klotho融合多肽所預期之分子量。此分析展示Klotho-FGF23(R179Q)融合蛋白質之表現。
Klotho融合多肽之純化
自來自經編碼具有α Klotho之細胞外域及FGF23 R179Q變異體之Klotho融合多肽之表現載體短暫轉染之HEK293T細胞之培養物的條件培養基中純化本發明之多肽。為了產生條件培養基，將編碼sKlotho-FGF23-6×His之表現載體(於18 ml OptiMEM 1(GIBCO，目錄號11058)中之500 μg DNA與18 ml 2 μg/ml聚伸乙基亞胺(PEI)混合)轉染至於表現培養基之懸浮液中生長的HEK293細胞(464 ml HEK293T細胞，以106 個細胞/毫升處於Freestype 293表現培養基(GIBCO，目錄號12338)中)中。轉染後，使培養物生長(120小時；37℃，於5% CO2 培育箱中；在125 rpm下搖動)。在培育結束時，藉由離心(1000 rpm，5分鐘)收集條件培養基。接著將條件培養基施加於鎳-瓊脂糖管柱。sKlotho-FGF23-6×HiS緊密結合至管柱，且用50 mM咪唑溶離。接著在PBS中透析所得純化之物質以移除咪唑。由SDS-PAGE(泳道1，純化之sKlotho-FGF23-6×His；泳道2，分子量標記物)分離純化之sKlotho-FGF23-6×His之樣品，且藉由用庫馬斯藍染色加以分析(圖3C)。染色之SDS-PAGE凝膠證實，純化之sKlotho-FGF23-6×His具有預期的分子量。在裝載有純化之物質之泳道中不能偵測到對應於除全長sKlotho-FGF23-6×His以外之蛋白質的條帶亦顯示，sKlotho-FGF23-6×His已經純化。
實例2.　評定Klotho融合多肽之活性的活體外檢定
Egr-1-螢光素酶
在Egr-1-螢光素酶報導子檢定中，測試經表現之αKlotho融合多肽之生物活性。Klotho融合多肽結合FGF23受體可活化下游Egr-1及在Egr-1啟動子調控下表現螢光素酶報導子。基於Urakawa等人(Nature,2006,第444卷,770-774)所報導，構築Egr-1-螢光素酶報導子基因。用Egr-1-螢光素酶報導子基因以及轉染正規化報導子基因(海腎螢光素酶)轉染接種於48孔聚-D-離胺酸板中之HEK293T細胞。Egr-1-螢光素酶報導子基因轉染後5小時，用3 ml DMEM+1% FBS更換轉染混合物。添加3 ml DMEM+1% FBS後72小時，收集條件培養基。5小時後，用欲測試活性之樣品更換轉染混合物。在初始實驗中，在Egr-1-螢光素酶報導子檢定中，在存在或不存在20 μg/ml肝素(Sigma，目錄號H8537；溶解於DMEM中的2 mg/ml儲備液)的情況下，測試50%條件培養基(單獨或含有Klotho、FGF23、Klotho與FGF23、及Klotho-FGF23(R179Q)融合蛋白質)及含1% FBS之50% DMEM(圖4)。其他實驗使用所規定量之純化之多肽(圖5A及5B)。20小時後將細胞溶解於被動溶解緩衝劑(Promega，目錄號E194A)中，且使用Dual-Glo Luciferase Assay System(Promega，目錄號E2940)測定螢光素酶活性。
在初始實驗中，在未分化條件培養基中顯示Klotho融合多肽活性。藉由使用Egr-1-螢光素酶報導子基因(圖4)，此等實驗定量螢光素酶報導子之表現的倍數變化。雖然含有FGF23與Klotho蛋白質之細胞外域之組合的條件培養基活化Egr-1-螢光素酶，但僅含有FGF23之條件培養基或僅含有Klotho之細胞外域之條件培養基不活化Egr-1-螢光素酶。與含有單獨FGF23或Klotho之條件培養基相反，含有融合蛋白質sKlotho-FGF23(R179Q)之條件培養基活化Egr-1-螢光素酶報導子基因。在此等實驗中，與含有FGF23與Klotho之組合的條件培養基相比，含有融合蛋白質sKlotho-FGF23(R179Q)之條件培養基顯著更佳地活化Egr-1-螢光素酶報導子基因。在存在肝素的情況下，含有融合蛋白質sKlotho-FGF23(R179Q)之條件培養基及含有FGF23與Klotho之組合的條件培養基之誘導顯著增強。表1列出在Egr-1-螢光素酶報導子檢定中，各種FGF-Klotho融合多肽在條件培養基中之相對表現及對應於各種FGF-Klotho融合多肽之未分化條件培養基之相對活性。
亦使用規定量之蛋白質執行Egr-1-螢光素酶報導子檢定，該等蛋白質係使用如實例1中所述之純化程序自條件培養基中純化而來。與使用含有經表現之多肽的未分化條件培養基之先前結果一致，用純化之FGF23與sKlotho之組合處理產生螢光素酶報導子活性，但用單獨純化之FGF23處理則不產生(圖5A)。由純化之FGF23與sKlotho之組合所產生之螢光素酶報導子活性進一步視純化之sKlotho之劑量而定，且該效應可因存在肝素(20 μg/ml)而增強。在Egr-1-螢光素酶報導子檢定中，可在低達約1.21 nM(1.2倍數變化)及至少多達約19.3 nM(2.4倍數變化)之濃度下偵測sKlotho-FGF23-6×His融合多肽對螢光素酶活性之效應(圖5B)。sKlotho-FGF23-6×His融合多肽對螢光素酶活性之活性在存在肝素(20 μg/ml)的情況下顯著增強。在存在肝素的情況下，可在低達約0.6 nM(2.0倍數變化)之濃度下偵測sKlotho-FGF23-6×His融合多肽對螢光素酶活性之效應。結果展示純化之sKlotho-FGF23-6×His劑量依賴性地誘導EGR-1-luc報導子基因，且用sKlotho-FGF23-6×His處理。
實例3.　評定Klotho融合多肽對肌細胞之效應的活體外檢定
測試表現之Klotho融合多肽對C2C12肌母細胞之生物效應。用IGF-1、FGF2或sKlotho-FGF23處理C2C12肌母細胞引起肌管生長及信號傳導蛋白質之磷酸化。將C2C12肌母細胞於生長培養基(3份DMEM及1份F12)、10% FBS、1% Glut；1% P/S；1%亞油酸；0.1% ITS[胰島素(10 mg/ml)、轉鐵蛋白(5.5 mg/ml)及硒(5 ng/ml)]中接種於經聚-D-離胺酸及纖維結合蛋白塗佈之6孔板中，密度為40,000個細胞/孔。在肌母細胞達到匯合後(3天)，將培養基更換成分化培養基(DMED，含2%馬血清；1% Glut；1% P/S)。
對於肌管直徑實驗，匯合後3天，將培養基更換成分化培養基，在分化培養基中，在不存在或存在地塞米松(100 μM)之情況下，用IGF-1(10 nM)、FGF2(20 ng/ml)或sKlotho-FGF23(20 nM)處理細胞24小時。處理結束時，用戊二醛(5%於PBS中)固定細胞，且收集多個螢光影像。使用Pipeline Pilot程式量測肌管直徑以確定肥大或萎縮。
對於信號傳導蛋白質磷酸化實驗，匯合後3天，將培養基更換成分化培養基，用不含FBS之DMEM使細胞挨餓4小時，接著在不存在或存在雷帕黴素(Rapamycin)(40 nM)的情況下，用IGF-1(10 nM)、FGF2(20 ng/ml)或sKlotho-FGF23(20 nM)處理30分鐘。在存在蛋白酶及磷酸酶抑制劑的情況下，將細胞溶解於RIPA緩衝液中。進行西方墨點分析，且用如圖中所指示之不同抗體探測膜，且顯影於X射線底片上，掃描該等底片。
此研究之結果展示，與對照相比，sKlotho-FGF23使肌管直徑增加，且與IGF-1及FGF2之結果類似，其誘導C2C12肌管肥大(圖5A)。此外，基於肌管直徑之量測值，用sKlotho-FGF23、IGF-1及 FGF2處理可部分逆轉由地塞米松誘導之肌管萎縮。在不存在或存在地塞米松的情況下，在肌管形態方面，在sKlotho-FGF23與FGF2之間未觀察到差異(以肌管厚度度量)。sKlotho-FGF23、IGF-1及 FGF2之營養效應為在統計上顯著的。
與對C2C12肌管之效應一致，sKlotho-FGF23融合蛋白質信號傳導在C2C12肌管中引起p70S6K及ERK之磷酸化，而不引起AKT或FoxO之磷酸化(圖5B)。sKlotho-FGF23對信號傳導之效應類似於FGF2，但不同於IGF-1。據觀察，由sKlotho-FGF23所產生之ERK磷酸化之程度小於IGF-1或FGF2。由sKlotho-FGF23所產生之p70S6K之磷酸化對雷帕黴素敏感。在涉及C2C12細胞之實驗中，不需要肝素來活化信號傳導。此等結果展示sKlotho-FGF23融合多肽在C2C12肌管中活化信號傳導。
實例4.　包含sKlotho、FGF23及FcLALA之融合多肽
使用sKlotho、FGF23及抗體之經修飾之Fc片段構築各種融合多肽。此等經修飾之Fc分子與FcRn之結合已改變(降低)，且因而血清半衰期增加。其生物可用性亦經改良且向黏膜表面及體內之其他標靶之轉運亦改變。在此實例中，FGF23及sKlotho融合至FcLALA，此描述於美國專利第7,217,798號及Hessell等人,2007 Nature 449:101-104中。此等融合多肽之各種組分之間插有連接子，如Lode等人,1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2475-2480中所述。此等融合物插入例如pcDNA3.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)之構築體中，且表現於HEK293細胞中。
A. sKlotho-FGF23-FcLALA v1
構築包含sKlotho、連接子、FGF23、另一連接子及FcLALA的融合物。此實施例，命名為sKlotho-FGF23-FcLALA v1，提供於下文之SEQ ID NO: 46及47中。
sKlotho-FGF23-FcLALA v1之核苷酸序列(其中起始 A TG為1)以SEQ ID NO: 46提供。
sKlotho-FGF23-FcLALA v1之胺基酸序列以SEQ ID NO: 47提供於下文中。
在此序列中，融合物之各種組分如下：
sKlotho：1-982；連接子1：983-1001；FGF23：1002-1228；連接子2：1229-1233；FcLALA：1234-1459。
B. sKlotho-FGF23-FcLALA v2
構築包含sKlotho、連接子、FGF23、另一連接子及FcLALA之融合物。此實施例命名為sKlotho-FGF23-FcLALA v2且以SEQ ID NO: 48及49提供於下文中。
sKlotho-FGF23-FcLALA v2之核苷酸序列(其中起始 A TG為1)以SEQ ID NO: 48提供。
sKlotho-FGF23-FcLALA v2之胺基酸序列以SEQ ID NO: 49提供於下文中。
在此序列中，融合物之各種組分如下：sKlotho：(aa或胺基酸)1-982；連接子1：983-1001；FGF23：1002-1228；連接子2：1229-1233；FcLALA：1234-1450。
可如本文所述或此項技術中已知，藉由以各種組合來組合FGF、Klotho、經修飾之Fc片段及(視情況存在之)連接子序列及其變異體及衍生物來構築其他融合多肽。
實例5.包含FGF23及FcLALA之融合多肽
使用FGF23及抗體之經修飾之Fc片段來構築各種融合多肽，如美國專利第7,217,798號中所述。此等經修飾之Fc分子與FcRn之結合已改變(降低)，且因而血清半衰期增加。其生物可用性亦經改良且向黏膜表面及體內之其他標靶之轉運亦改變。在此實例中，FGF23融合至FcLALA，此等融合多肽之各種組分之間插有連接子，如Lode等人,1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2475-2480中所述。此等融合物插入例如pcDNA3.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)之構築體中，且表現於HEK293細胞中。
C. FGF23-FcLALA v1
構築包含FGF23、連接子及FcLALA之融合物。此構築體命名為FGF23-FcLALA v1且以SEQ ID NO: 50及51提供於下文中。
FGF23-FcLALA v1之核苷酸序列(其中起始 A TG為1)以SEQ ID NO: 50提供於下文中。
FGF23(R179Q)-FcLALA v1之胺基酸序列以SEQ ID NO: 51提供於下文中。
在此序列中，融合物之各種組分如下：FGF23：(aa) 1-251；連接子：252-256；FcLALA：257-482。
D. FGF23-FcLALA v2
構築包含FGF23-FcLALA v2之融合物，FGF23-FcLALA v2包含FGF23及FcLALA。
FGF23-FcLALA v2之核苷酸序列(其中起始 A TG為1)以SEQ ID NO: 52提供於下文中。
FGF23(R179Q)-FcLALA v2之胺基酸序列以SEQ ID NO:53提供於下文中。
在此序列中，融合物之各種組分如下：FGF23：1-251；連接子：252-256；FcLALA：257-473。
可如本文所述或此項技術中已知，藉由以各種組合來組合FGF序列、經修飾之Fc片段及(視情況存在之)連接子及其變異體及衍生物來構築其他融合多肽。
E.測定由SKlotho-FGF23(R179Q)-FcLALA融合蛋白質所致之Egr-1-luc報導子基因的活化；由FGF23(R179Q)-FcLALA蛋白質所致之Egr-1-luc報導子基因的活化；及FGF23(R179Q)對FGF23(R179Q)-FcLaLav2之藥物動力學概況。
圖7展示由SKlotho-FGF23(R179Q)-FcLALA融合蛋白質所致之Egr-1-luc報導子基因的活化。用Egr-1-luc報導子基因短暫轉染HEK293T細胞，且在不存在或存在20 μg/ml肝素的情況下，與所指示之條件培養基一起培育。接著在18小時後，測定螢光素酶活性。結果展示sklotho-FGF23-FcLALA融合蛋白質誘導報導子基因活性。此等誘導在肝素存在下顯著增強。sKF-Fcvl：sKlotho-FGF23-FcLALAv1；sKF-Fcv2：sKlotho-FGF23-FcLALAv2。
圖8展示由FGF23(R179Q)-FcLALA蛋白質所致之Egr-1-luc報導子基因的活化。用Egr-1-luc報導子基因以及Klotho之全長跨膜形式短暫轉染HEK293T細胞，且與所指示之30%條件培養基一起培育。接著在18小時後，測定螢光素酶活性。結果展示FGF23-FcLALA融合蛋白質以與FGF23類似之方式誘導報導子基因活性。
圖9展示FGF23(R179Q)對FGF23(R179Q)-FcLALAv2之藥物動力學概況。每組4隻小鼠經皮下注射2 mg/kg的FGF23(R179Q)-6×His或FGF23(R179Q)-FcLALAv2。在所指示之時間，收集血清樣品，且由ELISA分析FGF23。血清中之FGF23(R179Q)-FcLALA濃度在24小時時間點時仍升高，而FGF23(R179Q)-6×His回到基礎含量。此結果指示在添加FcLALA時，FGF23(R179Q)之活體內半衰期顯著改良。
實例6. sKlotho-FGF23融合物在地塞米松誘導之肌肉萎縮後增強肌肉生長方面之活體內效力
實驗資料展示在地塞米松誘導之肌肉萎縮後，肌肉內注射sKlotho-FGF23顯著增強肌肉質量生長。在此實驗中，使用對應於SEQ ID NO: 41之肽。
圖10展示腓腸肌-比目魚肌-蹠肌(GSP)肌肉之絕對重量(A)及重量改變百分比(B)，展示與肌肉內注射sKlotho(sKLO)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)相比，肌肉內注射sKlotho-FGF23(KLOFGF)在地塞米松(DEX)誘導之肌肉萎縮後顯著增強肌肉質量之再生長。
將80隻15週齡雄性C57BL/6小鼠根據體重隨機分成8組，每組10隻小鼠。4組接受無DEX之水(W21d)，而另外4組接受每天2.4 mg/kg之於飲用水中之DEX，持續3週(D21d)。3週後，停止DEX處理，且立即處死一組W21d及一組D21d以確定由DEX處理所誘導之肌肉萎縮的程度。使其餘3組W21d或D21d小鼠再恢復14天(R14d)，期間其分別接受每隔一天向右腓腸肌-比目魚肌-蹠肌複合物中肌肉內注射2×50 μl PBS、sKlotho-FGF23(KLOFGF；1.6 mg/ml)或sKlotho(sKLO；1.6 mg/ml)。最後一次肌肉內注射後24小時，處死小鼠，且測定肌肉重量並以絕對重量(A)或與W21d+PBS組相比之變化百分比表示。
此等資料展示sKlotho-FGF23融合物在地塞米松誘導之肌肉萎縮後增強肌肉生長方面的活體內效力。
實例7.　融合蛋白質之FGF23部分中之可減少聚集、減少不想要之蛋白酶誘導之裂解且增加產量之其他突變
研究sKlotho-FGF23及FGF23-FcLaLa融合多肽之FGF23部分內的若干突變。此等突變包括Q156、C206及C244(其中數字係基於FGF23胺基酸序列)。實例個別突變包括Q156A、C206S及C244S，且任何此等位點處之突變均可與R179處之突變(例如R179Q)組合。實例序列提供於圖2之SEQ ID NO: 54至68中。
C206及C244疑似涉及二聚作用；且Q156為發明者鑑別為蛋白酶敏感位點的位點。此等胺基酸突變成任何其他胺基酸均因可在不干擾FGF23活性的情況下減少聚集、減少不想要之蛋白酶誘導之裂解及增加細胞之蛋白質產生而增強蛋白質之品質。此結果為出乎意料之結果，因為此三個位置在人類、恆河猴、牛、小鼠及大鼠中所發現之FGF23蛋白質中為保留性位置。此保留性藉由比較SEQ ID NO: 69、70、71、72及73展示於下文中，其中Q156、C206及C244加粗並加下劃線。
此三個突變不防礙FGF23活性之事實展示於圖11中。此圖展示由FGF23(R179Q)-FcLALA及Q156A、C206S、C244S及C206S/C244S突變體所致之EGR-1-luc報導子基因的活化。
用Egr-1-luc報導子基因以及Klotho之全長跨膜形式及所指示之FGF23-FcLaLa突變體短暫轉染HEK293T細胞。接著在18小時後，測定螢光素酶活性。結果展示在活化EGR-1-Luc報導子基因活性方面，C206S、C244S、C206S/C244S(3個獨立純系)及Q156A(3個獨立純系)突變體與FGF23-FcLALA融合蛋白質同等有效。
展示突變C244及C206會改變FGF23之二聚及聚集的資料展示於圖12中。此圖展示FGF23(R179Q)-FcLaLa之WT、Q156A、C206S、C244S及C206S/C244S突變體之蛋白質品質。由西方墨點法，使用FGF23抗體分析來自經所指示之FGF23-FcLaLa表現載體短暫轉染之HEK293T細胞的條件培養基。結果展示C206S/C244S突變防礙蛋白質二聚且Q156A突變具有減少之蛋白水解片段。
因而，令人驚訝的是，儘管此等Q156、C206及C244殘基在各物種中為保留性，但其可突變而不降低FGF23活性，且可藉由減少聚集及裂解且藉由改良產量來增強蛋白質之品質。
除非另外定義，否則本文所用之技術及科學術語具有與熟悉本發明所屬領域之專家通常所理解相同之含義。
除非另外指示，否則如熟習此項技術者顯而易知，未特定詳細描述之所有方法、步驟、技術及操作可以本身已知之方式執行且已經以本身已知之方式加以執行。再例如參考標準手冊及本文提及之一般背景技術，及其中所引用之其他參考文獻。
本發明之申請專利範圍為非限制性的且提供於下文中。
儘管本文已詳細揭示特定實施例及申請專利範圍，但此揭示僅以實例方式出於說明之目的進行，且不意欲限制隨附申請專利範圍之範疇，或任何相應未來申請案之申請專利範圍之標的物的範疇。詳言之，發明者涵蓋在不背離如申請專利範圍所界定之本發明之精神及範疇的情況下，可對本發明進行各種替代、改變及修改。咸信，相關核酸起始物質或純系之選擇為瞭解本文所述實施例之熟習此項技術者所常見之問題。認為其他態樣、優勢及修改均在隨附申請專利範圍之範疇內。隨後申請之相應申請案中申請專利範圍之範疇的改寫可歸因於不同國家或地區之專利法之限制且不應解釋為放棄申請專利範圍之標的物。
序列表(圖2 )
人類Klotho核酸序列(NM_004795)(SEQ ID NO: 1)
蛋白質編碼區：9-3047
Klotho胺基酸序列(NP_004786)(SEQ ID NO: 2)
β-Klotho核酸序列(NM_175737)(SEQ ID NO: 3)
蛋白質編碼區：98-3232
β-Klotho胺基酸序列(NP_783864)(SEQ ID NO: 4)
人類Klotho域1(KL-D1)胺基酸序列(SEQ ID NO: 5)
人類Klotho域2(KL-D2)胺基酸序列(SEQ ID NO: 6)
Klotho細胞外域(無信號肽)胺基酸序列(SEQ ID NO: 7)
Klotho信號肽胺基酸序列(SEQ ID NO: 8)
IgG信號肽胺基酸序列(SEQ ID NO: 9)
(Gly 4 Ser) 3 多肽連接子核酸序列(SEQ ID NO: 10)
(Gly 4 Ser) 3 多肽連接子胺基酸序列(SEQ ID NO: 11)
(Gly 4 Ser)多肽連接子胺基酸序列(SEQ ID NO: 12)
(Gly)多肽連接子胺基酸序列(SEQ ID NO: 13)
(Gly Gly)多肽連接子胺基酸序列(SEQ ID NO: 14)
(Gly Ser)多肽連接子胺基酸序列(SEQ ID NO: 15)
(Gly 2 Ser)多肽連接子胺基酸序列(SEQ ID NO: 16)
(Ala)多肽連接子胺基酸序列(SEQ ID NO: 17)
(AlaAla)多肽連接子胺基酸序列(SEQ ID NO: 18)
Klotho信號肽-Klotho細胞外域-FGF23(R179Q)胺基酸序列(SEQ ID NO: l9)
IgG信號肽-Klotho細胞外域-FGF23(R179Q)胺基酸序列(SEQ ID NO: 20)
KL-D1-FGF23(R179Q)胺基酸序列(SEQ ID NO: 21)
KL-D2-FGF23(R179Q)胺基酸序列(SEQ ID NO:22)
( KL-D1) 2 -FGF23(R179Q)胺基酸序列(SEQ ID NO: 23)
(KL-D2) 2 -FGF23(R179Q)胺基酸序列(SEQ ID NO: 24)
FGF23(R179Q)-Klotho細胞外域胺基酸序列(SEQ ID NO: 25)
F GF23(R179Q)-KL-D1胺基酸序列(SEQ ID NO: 26)
FGF23(R179Q)-KL-D2胺基酸序列(SEQ ID NO: 27)
FGF23(R179Q)-(KL-D1) 2 胺基酸序列(SEQ ID NO: 28)
FGF23(R179Q)-(KL-D2) 2 胺基酸序列(SEQ ID NO: 29)
FGF19核酸序列(NM_005117)(SEQ ID NO: 30)
蛋白質編碼區(464-1114)
FGF19胺基酸序列(NP_005108)(SEQ ID NO: 31)
FGF21核酸序列(NM_019113)(SEQ ID NO: 32)
蛋白質編碼區151-780
FGF21胺基酸序列(NP_061986)(SEQ ID NO:33)
FGF23核酸序列(NM_020638)(SEQ ID NO:34)
蛋白質編碼區147-902
FGF23胺基酸序列(NP_065689)(SEQ ID NO: 35)
FGF23(R179Q)胺基酸序列(SEQ ID NO: 36)
人類β-Klotho域1(b-KL - D1)胺基酸序列(SEQ ID NO: 37)
人類β-Klotho域2(b-KL-D2)胺基酸序列(SEQ ID NO: 38)
β-Klotho細胞外域(無信號肽)胺基酸序列(SEQ ID NO: 39)
無信號肽之sKlotho-FGF23胺基酸序列(無信號肽)(SEQ ID NO: 40)
無信號肽sKlotho-FGF23(R179Q)(無信號肽)胺基酸序列(SEQ ID NO:41)
無信號肽之FGF23(SEQ ID NO: 42)
無信號肽之FGF23(R179Q)(SEQ ID NO: 43)
具有Klotho信號肽之sKlotho(SEQ ID NO: 44)
具有IgG信號肽之sKlotho(SEQ ID NO: 45)
sKlotho-FGF23-FcLALAv1(SEQ ID NO: 46)
sKlotho-FGF23-FcLALA v1(SEQ ID NO: 47)
sKlotho-FGF23-FcLALA v2(SEQ ID NO: 48)
sKlotho-FGF23-FcLALA v2(SEQ ID NO: 49)
FGF23-FcLALA v1(SEQ ID NO: 50)
FGF23(R179Q)-FcLALAv1(SEQ ID NO: 51)
FGF23-FcLALA v2(SEQ ID NO: 52)
F GF23(R179Q)-FcLALAv2(SEQ ID NO: 53)
sKlotho-FGF23(R1156Q,C1183S)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 54)
sKlotho：aa[胺基酸]1-982；連接子1：aa 983-1001；FGF23：aa 1002-1228
sKlotho-FGF23(R1156Q,C1221S)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 55)
sKlotho：1-982；連接子1：983-1001；FGF23：1002-1228；
s Klotho-FGF23(R1156Q,Q1133A)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 56)
sKlotho：1-982；連接子：983-1001；FGF23：1002-1228
sKlotho-FGF23(R1156Q,C1183S,C1221S)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 57)
sKlotho：1-982；連接子：983-1001；FGF23：1002-1228
sKlotho-FGF23(R1156Q,C1183S,C1221S,Q1133A)之胺基酸序列(SEQ ID NO: 58)
sKlotho：1-982；連接子：983-1001；FGF23：1002-1228
FGF23(R179Q;C206S)-FcLALAv1之胺基酸序列(SEQ ID NO: 59)
FGF23：1-251；連接子：252-256；FcLALA：257-482
FGF23(R179Q,C244S)-FcLALAv1之胺基酸序列(SEQ ID NO: 60)
FGF23：1-251；連接子：252-256；FcLALA：257-482
FGF23(R179Q,Q156A)-FcLALAv1之胺基酸序列(SEQ ID NO: 61)
FGF23：1-251；Linker：252-256；FcLALA：257-482
FGF23(R179Q,C206S,C244S)-FcLALAv1之胺基酸序列(SEQ ID NO: 62)
FGF23：1-251；連接子：252-256；FcLALA：257-482
FGF23(R179Q,C206S,C244S,Q156A)-FcLALAv1之胺基酸序列(SEQ ID NO: 63)
FGF23：1-251；連接子：252-256；FcLALA：257-482
FGF23(R179Q,C206S)-FcLALAv2之胺基酸序列(SEQ ID NO: 64)
FGF23：1-251；連接子：252-256；FcLALA：257-473
FGF23(R179Q,C244S)-FcLALAv2之胺基酸序列(SEQ ID NO: 65)
FGF23：1-251；連接子：252-256；FcLALA：257-473
FGF23(R179Q,Q156A)-FcLALAv2之胺基酸序列(SEQ ID NO: 66)
FGF23：1-251；連接子：252-256；FcLALA：257-473
FGF23(R179Q,C206S,C244S)-FcLALAv2之胺基酸序列(SEQ ID NO: 67)
FGF23：1-251；連接子：252-256；FcLALA：257-473
FGF23(R179Q,C206S,C244S,Q156A)-FcLALAv2之胺基酸序列(SEQ ID NO: 68)
FGF23：1-251；連接子：52-256；FcLALA：257-473
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<213>　溫帶牛
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<213>　小家鼠
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<213>　褐家鼠
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圖1說明本發明之Klotho融合多肽之若干不同實施例。所提供之融合多肽包括一或多個以操作方式連接至纖維母細胞生長因子之Klotho細胞外子域。含有一或多個Klotho細胞外子域之多肽包括例如Klotho之細胞外域(例如人類Klotho之aa 1至982)或Klotho之活性片段。
圖2說明本發明之若干Klotho融合多肽及其組分(例如Klotho細胞外域、FGF)之胺基酸序列及核酸序列。包含sKlotho、FGF23及FcLALA(具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段)之融合蛋白質描述於SEQ ID NO. 46、47、48及49中。包含FGF23及FcLALA之融合蛋白質描述於SEQ ID NO. 50、51、52及53中。
圖3A至圖3C描述sKlotho-FGF23融合蛋白質之蛋白質表現。圖3A展示在條件培養基中由西方墨點法以抗FGF23抗體偵測sKlotho-FGF23融合蛋白質。圖3B展示在條件培養基中由SDS-PAGE及庫馬斯藍染色偵測sKlotho-FGF23融合蛋白質。圖3C展示由SDS-PAGE及庫馬斯藍染色分析之經高度純化之sKlotho-FGF23-6×His融合蛋白質。
圖4說明比較在不存在或存在肝素(20 μg/ml)之情況下經含有Klotho融合多肽、僅FGF23多肽、僅可溶性Klotho(sKlotho)多肽及可溶性Klotho多肽與FGF23多肽之組合的條件培養基處理之細胞中之Egr-1活化量的Egr-1螢光素酶檢定之結果。
圖5A至圖5B描述比較在不存在或存在肝素之情況下經純化Klotho融合多肽、FGF23多肽或可溶性Klotho多肽處理之細胞中之Egr-1活化量的Egr-1螢光素酶檢定之結果。圖5A展示在不存在或存在肝素(20 μg/ml)之情況下經單獨FGF23、sKlotho-His(10 nM或20 nM)及FGF23與sKlotho-His(10 nM或20 nM)之組合處理之細胞中之Egr-1活化量之實驗的結果。圖5B展示經sKlotho-FGF23-His融合物(0 nM、0.6 nM、1.21 nM、2.41 nM、4.83 nM、9.65 nM及19.3 nM)處理之細胞中的Egr-1螢光素酶報導子活性。
圖6A至圖6B說明用純化sKlotho融合多肽處理對C2C12肌細胞之效應。圖6A展示在不存在或存在地塞米松(100 μM)之情況下經IGF-1(10 nM)、FGF2(20 ng/ml)或純化Klotho融合多肽(20 nM)處理之C2C12肌細胞中之肌管直徑的量測值。圖6B展示在不存在或存在雷帕黴素(40 nM)之情況下C2C12肌細胞中由IGF-1(10 nM)、FGF2(20 ng/ml)或純化Klotho融合多肽(20 nM)所致之信號傳導路徑蛋白質的磷酸化。
圖7展示由sKlotho-FGF23(R179Q)-FcLALA融合蛋白質所致之EGR-1-luc報導子基因的活化。
圖8展示由FGF23(R179Q)-FcLALA蛋白質所致之EGR-1-luc報導子基因的活化。
圖9展示FGF23(R179Q)對FGF23(R179Q)-FcLALAv2之藥物動力學概況。
圖10A及圖10B展示sKlotho-FGF23融合物在地塞米松誘導之肌肉萎縮後增強肌肉生長方面的活體內效力。
圖11.此圖展示由FGF23(R179Q)-FcLALA及Q156A、C206S、C244S及C206S/C244S突變體所致之EGR-1-luc報導子基因的活化。
圖12展示FGF23(R179Q)-FcLaLa之 WT(野生型)、Q156A、C206S、C244S及C206S/C244S突變體之蛋白質品質及二聚。
(無元件符號說明)

Claims (45)

  1. 一種融合多肽，其包含：(a)纖維母細胞生長因子23(FGF23)之功能活性變異體或衍生物，其中該變異體或衍生物在Q156、C206及C244處中一或多個位置具有突變；及(b)具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的經修飾之Fc片段，或包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域(extracellular subdomain)的多肽。
  2. 如請求項1之融合多肽，其中該(a)之多肽以操作方式連接至該(b)之多肽之N末端。
  3. 如請求項1之融合多肽，其中該(b)之多肽以操作方式連接至該(a)之多肽之N末端。
  4. 如請求項1之融合多肽，其中該(a)之多肽及該(b)之多肽係由多肽連接子連接。
  5. 如請求項4之融合多肽，其中該多肽連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18。
  6. 如請求項4之融合多肽，其中該多肽連接子包含至少1個且至多約30個選自由以下組成之群之胺基酸序列的重複單元：SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17及SEQ ID NO：18。
  7. 如請求項4之融合多肽，其中該(a)之多肽係由肽鍵連接至該多肽連接子之N末端，且該(b)之多肽係由肽鍵連接 至該多肽連接子之C末端。
  8. 如請求項4之融合多肽，其中該(a)之多肽係由肽鍵連接至該多肽連接子之C末端，且該(b)之多肽係由肽鍵連接至該多肽連接子之N末端。
  9. 如請求項1之融合多肽，其中該Klotho蛋白質之細胞外子域為KL-D1域或KL-D2域。
  10. 如請求項1之融合多肽，其中該(a)之多肽包含該Klotho蛋白質之至少兩個細胞外子域。
  11. 如請求項10之融合多肽，其中該Klotho蛋白質之該至少兩個細胞外子域為呈串聯重複形式之至少兩個KL-D1域。
  12. 如請求項10之融合多肽，其中該Klotho蛋白質之該至少兩個細胞外子域為呈串聯重複形式之至少兩個KL-D2域。
  13. 如請求項10之融合多肽，其中該Klotho蛋白質之該至少兩個細胞外子域包含KL-D1域及KL-D2域。
  14. 如請求項1之融合多肽，其中該(a)之多肽為該Klotho蛋白質之細胞外域。
  15. 如請求項1之融合多肽，其進一步包含信號肽。
  16. 如請求項15之融合多肽，其中該信號肽為Klotho信號肽。
  17. 如請求項15之融合多肽，其中該信號肽為IgG信號肽。
  18. 如請求項1之融合多肽，其特異性結合纖維母細胞生長因子受體。
  19. 如請求項1之融合多肽，其中該Klotho蛋白質為α-Klotho。
  20. 如請求項1之融合多肽，其中該Klotho蛋白質為β-Klotho。
  21. 如請求項19之融合多肽，其中該纖維母細胞生長因子為纖維母細胞生長因子-23(FGF23)或纖維母細胞生長因子-23變異體(R179Q)。
  22. 如請求項20之融合多肽，其中該纖維母細胞生長因子為纖維母細胞生長因子-19或纖維母細胞生長因子-21。
  23. 如請求項1之融合多肽，其具有SEQ ID NO：58或SEQ ID NO：68之胺基酸序列。
  24. 如請求項1之融合多肽，其包含FcLALA。
  25. 如請求項1之融合多肽，其中該Klotho蛋白質為人類Klotho蛋白質。
  26. 如請求項1之融合多肽，其中該融合多肽進一步包含連接子。
  27. 一種融合多肽，其包含：(a)包含纖維母細胞生長因子23(FGF23)之功能活性變異體或衍生物之多肽，其中該變異體或衍生物在Q156、C206及C244處中一或多個位置具有突變；及(b)具有降低對Fc-γ受體之親和力及/或增加之血清半衰期的Fc片段或經修飾之Fc片段，或包含Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域的多肽。
  28. 如請求項1至27中任一項之融合多肽，其係用於治療或預防肌肉萎縮。
  29. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至27中任一項之融合多肽及醫藥學上可接受之載劑。
  30. 一種核酸，其包含編碼如請求項1至27中任一項之融合多肽的序列。
  31. 一種宿主細胞，其含有如請求項30之核酸。
  32. 一種載體，其包含如請求項30之核酸。
  33. 一種如請求項1至27中任一項之融合多肽之用途，其係用於製造治療或預防年齡相關之病狀的藥物。
  34. 如請求項33之用途，其中該年齡相關之病狀係選自由以下組成之群：肌肉減少症、皮膚萎縮、肌肉萎縮、腦萎縮、動脈粥樣硬化、動脈硬化、肺氣腫、骨質疏鬆症、骨關節炎、免疫機能不全、高血壓、癡呆症、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)、白內障、年齡相關之黃斑部變性、前列腺癌、中風、預期壽命縮短、記憶損失、皺紋、腎功能損傷及年齡相關之聽力損失。
  35. 如請求項34之用途，其中該年齡相關之病狀為肌肉萎縮，該Klotho蛋白質為α Klotho蛋白質，且該纖維母細胞生長因子為纖維母細胞生長因子23。
  36. 一種如請求項1至27中任一項之融合多肽之用途，其係用於製造治療或預防代謝障礙之藥物。
  37. 如請求項36之用途，其中該代謝障礙係選自由以下組成之群：II型糖尿病、代謝症候群、高血糖症及肥胖症。
  38. 如請求項36之用途，其中該融合多肽包含：(a)包含β- Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽；及(b)包含纖維母細胞生長因子21之多肽。
  39. 一種如請求項1至27中任一項之融合多肽之用途，其係用於製造治療或預防高磷酸鹽血症或鈣質沉著之藥物。
  40. 如請求項39之用途，其中該融合多肽包含：(a)包含α-Klotho蛋白質之至少一個細胞外子域之多肽；及(b)包含纖維母細胞生長因子23之多肽。
  41. 一種如請求項1至27中任一項之融合多肽之用途，其係用於製造治療或預防慢性腎病或慢性腎衰竭之藥物。
  42. 一種如請求項1至27中任一項之融合多肽之用途，其係用於製造治療或預防癌症之藥物。
  43. 如請求項42之用途，其中該癌症為乳癌。
  44. 一種包含SEQ ID NO：47或SEQ ID NO：49之可溶性Klotho融合蛋白質之醫藥組合物的用途，其係用於製造治療或預防肌肉萎縮之藥物。
  45. 一種如請求項1至27中任一項之融合多肽之用途，其係用於製造治療或預防肌肉萎縮之藥物。
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