CN102725413A - 使用fgf23融合多肽的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开内容涉及用于预防或治疗年龄相关病况或代谢病症的方法、试剂盒和组合物。本文公开内容的融合多肽包括FGF23或其活性片段。在一种实施方式中，融合多肽包含：(a)包含成纤维细胞生长因子23(FGF23)的多肽，或其功能活性变体或衍生物，其中FGF23在位置Q156、C206和C244中的一处或多处具有突变；以及(b)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段，或包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽，或其功能活性变体或衍生物；以及任选地，(c)连接子。Klotho融合蛋白在治疗和预防多种年龄相关的病况和代谢病症中是有用的。在另一实施方式中，融合多肽包含FGF(例如FGF23)或其功能活性变体或衍生物；以及经修饰的Fc片段或其功能活性变体或衍生物。在融合多肽的多种实施方式中，FGF23具有减少聚集和蛋白酶介导的切割的突变。

Description

使用FGF23融合多肽的方法和组合物
本申请要求2010年1月29日提交的美国申请序列号No.12/696693的优先权益，该申请的内容通过引用整体并入本文。
1.背景
成纤维细胞生长因子(FGF)构成在很多生物中表达的同源多肽生长因子的家族(Ornitz和Itoh，Genome Biol.2：reviews，3005.1-3005.12(2001))。在脊椎动物物种中，FGF在基因结构和氨基酸序列上高度保守，互相之间具有13-71％的氨基酸同一性。在人中，有22个已知的FGF家族成员(FGF15是人FGF19的小鼠直向同源体，因此没有人FGF15)。在早期发育中，FGF调控细胞增殖、迁移和分化，但是在成年生物中，FGF保持内稳态、在组织修复中发挥功能并且应答损伤。
FGF通过结合并由此活化细胞表面FGF受体来作为生长因子发挥功能。FGF受体(FGFR)是酪氨酸激酶受体，它们通过FGFR的自身磷酸化、FRS2(FGF受体底物2)和ERK1/2(细胞外信号调控的蛋白激酶1/2)的磷酸化以及活化Egr-1(早期生长应答-1)来活化信号转导。FGF还具有针对硫酸肝素蛋白多糖的高亲和性。当与FGF结合时，硫酸肝素增强FGFR的活化。
α-Klotho基因编码130kDa的具有细胞外结构域和短的细胞质结构域的单通过(single pass)I型跨膜蛋白。α-Klotho蛋白的细胞外结构域包含被称为KL-D1和KL-D2的两个亚结构域。这两个亚结构域与细菌和植物的β-葡糖苷酶享有序列同源性。α-Klotho蛋白的细胞外结构域可通过跨膜结构域与细胞表面结合，或可被切割并释放进细胞外环境。细胞外结构域的切割似乎由局部低细胞外Ca2+浓度协助。
除α-Klotho之外，α-Klotho的同源体，β-Klotho也已被鉴定(Ito等，Mech.Dev.98：115-9(2000))。β-Klotho也是具有细胞外KL-D1和KL-D2亚结构域的单通过I型跨膜蛋白。
在哺乳动物中，已显示α-Klotho表达的调节产生了衰老相关的特征。α-Klotho基因中失功能突变的纯合的小鼠发展出了类似人类衰老的特征，包括缩短的寿命、皮肤萎缩、肌消减、动脉硬化、肺气肿和骨质疏松(Kuro-o等，Nature，390：45-51(1997))。相反，相对于野生型小鼠，α-Klotho基因在小鼠中的过表达延长了寿命，并增加了对氧化胁迫的抗性(Kurosu等，Science 309：1829-1833(2005)；Yamamoto等，J.Biol.Chem.280：38029-38034(2005))。
近来的研究已显示，在FGF23缺陷型小鼠和α-Klotho缺陷型小鼠之间有惊人相似的生物学特征(Shimada等，J.Clin.Invest.113：561-568(2004)；Yoshida等Endocrinology 143：683-689(2002))，这表明FGF23和α-Klotho之间有功能性交叉感知(crosstalk)。这些研究导致在通过其关联(cognate)FGF受体结合和信号传递这两方面，将α-Klotho鉴定为FGF23的必需搭档(Urakawa等，Nature 22：1524-6(2007))。α-Klotho基因主要表达于肾、甲状旁腺和脉络丛中。提出假说：α-Klotho的组织特异性表达将FGF23信号传递的活化限制于那些组织。
与FGF23/α-Klotho相似，在通过它们各自的关联FGF受体信号传递和结合这两方面，β-Klotho是FGF19和FGF21的必需搭档(Ogawa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 104：7432-7(2007)；Lin等，J.Biol Chem.282：27227-84(2007)；和Wu等，J.Biol.Chem.282：29069-72(2007))。此类研究也已显示，β-Klotho涉及组织特异性代谢活性的调控。最初显示β-Klotho作为辅助因子与FGF21一起发挥作用，用于调控脂肪组织中的碳水化合物和脂类代谢。β-Klotho联合FGF19调控肝中的胆汁酸代谢，由此解释了在β-Klotho缺陷型小鼠中升高的胆汁合成(Ito等，J Clin Invest.2005Aug；115(8)：2202-8)。
美国专利No.6,579,850描述了包含α-Klotho多肽的多肽和组合物。公开了人和小鼠的α-Klotho多肽。该专利还公开：包含所述多肽的组合物在治疗类似过早衰老的综合征、治疗成人疾病和遏制衰老中是有用的。
美国专利No.7,223,563描述了经分离的编码FGF23多肽序列的核酸或包含此类经分离的核酸的重组细胞。该专利还涉及诊断和治疗低磷酸盐血和高磷酸盐血病症、骨质疏松、皮肌炎和冠状动脉疾病的方法。
美国专利No.7,259,248描述了经分离的编码FGF21多肽序列的核酸。该专利还涉及诊断和治疗肝疾病、与胸腺功能相关的病况的方法，以及治疗睾丸病况的方法。
2.发明概述
本文公开内容涉及使用融合多肽或可溶多肽预防或治疗年龄相关病况或代谢病症的方法、用途、试剂盒和组合物。本文公开内容的融合多肽由FGF(例如FGF23)；以及Klotho蛋白或其活性片段(例如sKlotho)和/或Fc片段(例如FcLALA)；以及任选地，连接子形成。在一些实施方式中，FGF23是被突变的。在一些实施方式中，本文公开内容提供了下述Klotho融合多肽，其包含Klotho蛋白或其活性片段以及成纤维细胞生长因子或其活性片段。在一些实施方式中，融合多肽包含Klotho多肽、FGF(例如FGF23)和经修饰的Fc片段。例如Fc片段能够具有减少的与Fc-γ-受体的结合以及增加的血清半寿期。在SEQ ID NO.46、47、48和49中描述了包含sKlotho、FGF23和FcLALA(具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段)的融合蛋白。在一些实施方式中，融合多肽或蛋白质包含FGF(例如，FGF23)，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)；以及经修饰的Fc片段，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)。在SEQ ID NO.50、51、52和53中描述了包含FGF23和FcLALA的融合蛋白。在一些实施方式中，融合多肽在FGF23中具有一个或多个突变，所述突变减少了聚集和/或蛋白酶介导的切割。
在第一个方面，本文公开内容提供了具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域以及成纤维细胞生长因子的融合多肽或其活性片段。在一些实施方式中，融合体还包含经修饰的Fc片段，所述片段具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性(例如，减少的Ka或增加的Kd)和/或增加的血清半寿期。Klotho细胞外结构域可源于α或βKlotho同工型。此外，虽然Klotho融合多肽的FGF组分主要是参照成纤维细胞生长因子-19、成纤维细胞生长因子-21和成纤维细胞生长因子-23来描述的，但考虑二十三种已知的FGF中的任一种能够在实践本文公开内容中使用。本申请的读者可认为：α或β细胞外结构域与每种人FGF蛋白或其活性片段的每种组合中的每种均被独立并具体地考虑。
根据本文公开内容，Klotho蛋白的细胞外结构域能够包括Klotho蛋白的KL-D1和KL-D2结构域的之一或两者，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)。在一些实施方式中，本文公开内容的Klotho融合多肽具有Klotho蛋白的至少两个细胞外亚结构域，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)。例如，所述至少两个细胞外亚结构域能够是串联重复的至少两个KL-D1结构域、串联重复的至少两个KL-D2结构域，或者至少一个KL-D1结构域和至少一个KL-D2结构域。在多种实施方式中，本文公开内容的融合多肽包含全长αKlotho蛋白的氨基酸28-292，或氨基酸28-982(SEQ ID NO：7)。在另一实施方式中，本文公开内容的融合多肽包含全长βKlotho蛋白的氨基酸52-997。
在本文公开内容的一种实施方式中，融合多肽的组分包含：(a)包含成纤维细胞生长因子23(FGF23)的多肽，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)，其中，FGF23在位置Q156、C206和C244中的一处或多处具有突变；以及(b)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段，或包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)；以及，任选地(c)连接子。例如，组分能够化学连接或通过肽键符合读框融合。它们也可经由连接子连接。多肽连接子的非限制性实例是SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17和18。此类连接子可包含SEQ ID NO：11、12、13、14、15、16、17和18的至少一个以及至多约30个重复。在另一非限制性的实施方式中，融合体包含(2)FGF或其活性片段，和(3)经修饰的Fc片段。融合体的多种组分能够以任何顺序有效连接；多肽(1)能够有效连接至(2)或(3)的多肽的N-末端；(2)的多肽能够有效连接至(1)或(3)的多肽的N-末端；(3)的多肽能够有效连接至(1)或(2)的多肽的N-末端。
根据本文公开内容，Klotho蛋白的细胞外亚结构域、成纤维细胞生长因子和(任选的)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段能够以多种定向和方式互相有效连接。例如，Klotho蛋白的细胞外亚结构域能够与成纤维细胞生长因子的N-末端有效连接，或者备选地成纤维细胞生长因子能够与Klotho蛋白的细胞外亚结构域的N-末端有效连接。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了包含Klotho蛋白的sKlotho和连接子的融合多肽。在另一实施方式中，本文公开内容提供了包含αKlotho蛋白的sKlotho和连接子的融合多肽。在另一实施方式中，本文公开内容提供了包含βKlotho蛋白的sKlotho和连接子的融合多肽。在又一实施方式中，本文公开内容提供了人FGF蛋白或其活性片段(例如，没有信号肽)和连接子。在一种实施方式中，本文公开内容提供了融合蛋白、核酸分子或药物组合物，它们用于疗法或作为用于病理学病症的治疗的药剂。包含本文公开内容的融合蛋白的药物组合物和它们用于治疗或预防年龄相关的病况或代谢疾病的用途也涵盖在本文公开内容内。在一些实施方式中，融合蛋白还包含经修饰的Fc片段，所述Fc片段具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho，其(直接或经由连接子间接)融合至FGF-23。在另一实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含不具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho，其(直接或经由连接子间接)融合至FGF-23。在另一实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho，其(直接或经由连接子间接)融合至不具有信号肽的FGF-23。在另一实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含不具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho，其(直接或经由连接子间接)融合至不具有信号肽的FGF-23。在一些实施方式中，融合蛋白还包含经修饰的Fc片段，所述Fc片段具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho，其(直接或经由连接子间接)融合至FGF-23(R179Q)变体。在另一实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含不具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho，其(直接或经由连接子间接)融合至FGF-23(R179Q)变体。在另一实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho，其(直接或经由连接子间接)融合至不具有信号肽的FGF-23(R179Q)变体。在另一实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含不具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho，其(直接或经由连接子间接)融合至不具有信号肽的FGF-23(R179Q)变体。在一些实施方式中，融合蛋白还包含经修饰的Fc片段，所述Fc片段具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含：(a)包含成纤维细胞生长因子23(FGF23)的多肽，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)，其中，FGF23在位置Q156、C206和C244中的一处或多处具有突变；以及(b)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段，或包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)；以及任选地(c)连接子。在SEQ IDNO：54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67和68中公开了此类融合多肽。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含：(1)具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)；(2)连接子；和(3)不具有信号肽的FGF-23(R179Q)变体，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一种保守氨基酸替换和/或一种氨基酸缺失的变体)。在另一实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含：(1)不具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)；(2)连接子；和(3)不具有信号肽的FGF-23(R179Q)变体，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一种保守氨基酸替换和/或一种氨基酸缺失的变体)。在一些实施方式中，本文公开内容的融合多肽是糖基化的。在一些实施方式中，融合蛋白还包含经修饰的Fc片段，所述Fc片段具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含：(1)具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho(SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45)，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)；(2)包含SEQ ID NO：11的连接子；和(3)不具有信号肽的FGF-23(R179Q)变体(SEQ ID NO：43)，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一种保守氨基酸替换和/或一种氨基酸缺失的变体)。在另一实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含：(1)不具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho(SEQ ID NO：7)，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)；(2)包含SEQ IDNO：11的连接子；和(3)不具有信号肽的FGF-23(R179Q)变体(SEQID NO：43)，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一种保守氨基酸替换和/或一种氨基酸缺失的变体)。在一种实施方式中，本文公开内容提供了包含SEQ ID NO：19、20、40或41的氨基酸序列的融合多肽。在一些实施方式中，本文公开内容的融合多肽是糖基化的。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho(SEQ ID NO：44或SEQ IDNO：45)，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)；和包含SEQ ID NO：11的连接子。在另一实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含：不具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho(SEQ ID NO：7)；和包含SEQID NO：11的连接子。在一些实施方式中，本文公开内容的融合多肽是糖基化的。在一些实施方式中，融合蛋白还包含经修饰的Fc片段，所述Fc片段具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含人FGF蛋白或其活性片段(例如，不具有信号肽的)；以及包含SEQ ID NO：11的连接子。在一些实施方式中，本文公开内容的融合多肽是糖基化的。在一些实施方式中，融合蛋白还包含经修饰的Fc片段，所述Fc片段具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了下述融合多肽，所述融合多肽包含人FGF蛋白(例如，FGF23)或其活性片段(例如，不具有信号肽的)；连接子(例如，包含SEQ ID NO：11的连接子)；以及sKlotho(具有或不具有信号肽)，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一种保守氨基酸替换和/或一种氨基酸缺失的变体)或Fc-γ-受体(例如，FcLALA)；其中所述FGF(例如，FGF23)在R179、Q156、C206和/或C244这些残基处具有一处或多处突变。在多种实施方式中，突变是R179Q、Q156A、C206S和/或C244S。虽然这些突变在人、恒河猴、牛、小鼠和大鼠FGF23中保守，但突变它们不会妨碍FGF23活性。相反，突变这些氨基酸通过降低聚集、降低不想要的蛋白酶诱导的切割和增加来自细胞的蛋白质生产，出人意料地增强了蛋白的品质。在多种实施方式中，包含一种或多种FGF23突变的融合蛋白是糖基化的。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了包含(例如，作为单独的药物活性成分)下述融合多肽(例如，糖基化的或非糖基化的)的药物组合物(例如，以肌内施用形式的)和所述药物组合物在疗法中的用途或作为治疗病理性病症的药剂的用途(例如治疗和/或预防年龄相关的病况，例如肌萎缩)，所述融合多肽包含：(1)不具有信号肽的FGF-23(R179Q)变体(SEQ ID NO：43)，或包含降低聚集和/或蛋白酶介导的切割的额外突变的变体，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)；(2)任选地，包含SEQ ID NO：11的连接子；和(3)具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho(SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45)，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)，或具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。在另一实施方式中，本文公开内容提供了包含(例如，作为单独的药物活性成分)下述融合多肽(例如，糖基化的或非糖基化的)的药物组合物(例如，以肌内施用形式的)和所述药物组合物在疗法中的用途或作为治疗病理性病症的药剂的用途(例如治疗和/或预防年龄相关的病况，例如肌萎缩)，所述融合多肽包含：(1)不具有信号肽的FGF-23(R179Q)变体(SEQ ID NO：43)，或包含降低聚集和/或蛋白酶介导的切割的额外突变的变体，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)；(2)包含SEQ ID NO：11的连接子；和(3)不具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho(SEQ ID NO：7)，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一种保守氨基酸替换和/或一种氨基酸缺失的变体)，或具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一种保守氨基酸替换和/或一种氨基酸缺失的变体)。在一种实施方式中，本文公开内容提供了包含(例如，作为单独的药物活性成分)下述融合多肽(例如，糖基化的或非糖基化的)的药物组合物(例如，以肌内施用形式的)和所述药物组合物在疗法中的用途或作为治疗病理性病症的药剂的用途(例如治疗和/或预防年龄相关的病况，例如肌萎缩)，所述融合多肽包含SEQ ID NO：19、20、40或41的氨基酸序列。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了包含(例如作为单独的药物活性成分)下述融合多肽(例如糖基化的或非糖基化的)的药物组合物(例如，以肌内施用形式的)和所述药物组合物用于治疗和/或预防年龄相关病况(例如肌萎缩)的用途，所述融合多肽包含：具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho(SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45)；以及包含SEQ ID NO：11的连接子。在另一实施方式中，本文公开内容提供了包含(例如，作为单独的药物活性成分)下述融合多肽(例如，糖基化的或非糖基化的)的药物组合物(例如，以肌内施用形式的)和所述药物组合物在疗法中的用途或作为治疗病理性病症的药剂的用途(例如治疗和/或预防年龄相关的病况，例如肌萎缩)，所述融合多肽包含不具有信号肽的、αKlotho蛋白的sKlotho(SEQ ID NO：7)；以及包含SEQ ID NO：11的连接子。在一些实施方式中，融合蛋白还包含经修饰的Fc片段。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了包含(例如作为单独的药物活性成分)下述融合多肽(例如糖基化的或非糖基化的)的药物组合物，所述融合多肽包含人FGF蛋白或其活性片段(例如不具有信号肽的)；和包含SEQ ID NO：11的连接子。
包含本文公开内容的融合蛋白的药物组合物及它们在疗法中的用途或作为治疗病理性病症的药剂的用途(例如治疗或预防年龄相关的病况(例如，肌萎缩)或代谢病症(例如，糖尿病))也涵盖在本文公开内容内。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：19具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的融合多肽。在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：20具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的融合多肽。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：40具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的融合多肽。在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：41具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的融合多肽。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：46具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：47具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：48具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：49具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：50具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：51具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：52具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：53具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：54具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：55具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：56具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：57具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：58具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：59具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：60具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：61具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：62具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：63具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：64具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：65具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：66具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：67具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了与SEQ ID NO：68具有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的融合多肽。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了包含(直接或经由连接子间接)与FGF-19或其活性片段融合的、具有信号肽的、βKlotho蛋白的sKlotho的融合多肽。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。在另一实施方式中，本文公开内容提供了包含(直接或经由连接子间接)与FGF-19或其活性片段融合的、不具有信号肽的、βKlotho蛋白的sKlotho的融合多肽。在另一实施方式中，本文公开内容提供了包含(直接或经由连接子间接)与FGF-21或其活性片段融合的、具有信号肽的、βKlotho蛋白的sKlotho的融合多肽。在另一实施方式中，本文公开内容提供了包含(直接或经由连接子间接)与FGF-21或其活性片段融合的、不具有信号肽的、βKlotho蛋白的sKlotho的融合多肽。
本文公开内容提供了编码任何本文所述Klotho融合多肽的核酸序列和含有所述核酸的宿主细胞。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。
本文公开内容还提供了具有任何本文考虑的Klotho融合多肽的组合物。本文公开内容的组合物还能够包括肝素。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。
本文公开内容还提供了用于在个体中治疗或预防年龄相关病况的方法。对个体(例如，人)施用治疗有效剂量的药物组合物以治疗或预防年龄相关的病况，所述药物组合物含有Klotho融合多肽，所述融合多肽具有Klotho蛋白(例如，αKlotho蛋白)的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子或其活性片段。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。特别地，本文公开内容提供了治疗或预防肌消减的方法，所述方法包括向个体(例如人)施用治疗有效量的融合多肽，所述融合多肽具有αKlotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子(或其活性片段)。
此外，本文公开内容提供了在个体中治疗或预防代谢病症的方法。对个体(例如人)施用治疗有效剂量的药物组合物以治疗代谢病症，所述药物组合物含有本文公开内容的融合多肽，所述融合多肽具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子(或其活性片段)。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。特别地，本文公开内容的具有β-Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子21的融合多肽对于治疗代谢病症是有用的。
本文公开内容的Klotho-FGF23融合多肽能够用于在个体中治疗或预防高磷酸盐血或钙质沉着症。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。施用药理有效剂量的、含有本文公开内容的具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子的Klotho融合多肽的药物组合物，以治疗或预防高磷酸盐血或钙质沉着症。特别地，本文公开内容的具有αKlotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子23的Klotho融合多肽对于治疗高磷酸盐血或钙质沉着症是有用的。
本文公开内容的Klotho-FGF23融合多肽能够用于在个体中治疗或预防慢性肾病或慢性肾衰竭。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。施用治疗有效剂量的、含有本文公开内容的具有Klotho蛋白(例如αKlotho蛋白)的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子的Klotho融合多肽的药物组合物，以治疗或预防慢性肾病或慢性肾衰竭。
本文公开内容的Klotho-FGF23融合多肽能够用于在个体中治疗或预防癌症(例如乳腺癌)。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。施用治疗有效剂量的、含有本文公开内容的具有Klotho蛋白(例如αKlotho蛋白)的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子的Klotho融合多肽的药物组合物，以治疗或预防癌症或乳腺癌。
本文公开内容提供了用于药品的融合多肽，所述融合多肽包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域和FGF或其活性片段。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。在一种实施方式中，本文公开内容提供了用于治疗或预防肌萎缩的融合多肽，所述融合多肽包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域和FGF或其活性片段。本文公开内容还提供了治疗或预防年龄相关病况(例如肌萎缩)的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效剂量的、包含可溶Klotho蛋白的药物组合物。
本文公开内容还提供了上述肽和包含所述肽的融合多肽或药物组合物，它们用于疗法、作为药剂或用于在个体中对病理学病症(例如年龄相关的病况、代谢病症、高磷酸盐血或钙质沉着症、慢性肾病或慢性肾衰竭)的治疗或预防癌症或乳腺癌。此外，本文公开内容还提供了本发明的多肽、核酸或药物组合物在制造用于治疗病理性病症(特别是用于治疗上述病症，优选地，年龄相关的病况如肌萎缩)的药剂中的用途。
本文公开内容还包括用于在个体中治疗或预防年龄相关的病症或代谢病症的试剂盒。试剂盒包括使用说明书以及经纯化的Klotho融合多肽，所述融合多肽具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。
本文公开内容还提供了用于生产本文公开内容的Klotho融合多肽的试剂盒。本文公开内容的试剂盒包括使用说明和编码具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子的Klotho融合多肽的核酸。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。
在本文公开内容的一种实施方式中，融合多肽包含：(a)包含成纤维细胞生长因子的多肽，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一个保守氨基酸替换和/或一个氨基酸缺失的变体)；和(b)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段，或其功能活性变体或衍生物(例如，包含至少一种保守氨基酸替换和/或一种氨基酸缺失的变体)。
在本文公开内容的一种实施方式中，(a)的多肽和(b)的多肽通过多肽连接子连结。连接子能够重复1至30次，或者更多次。
在本文公开内容的一种实施方式中，多肽连接子包含选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18构成的组的氨基酸序列。
在本文公开内容的一种实施方式中，(a)的多肽通过肽键连结至所述多肽连接子的N-末端，并且(b)的多肽通过肽键连结至所述多肽连接子的C-末端。
在本文公开内容的一种实施方式中，融合多肽还包含信号肽。
在本文公开内容的一种实施方式中，信号肽是IgG信号肽。
在本文公开内容的一种实施方式中，成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子-23或成纤维细胞生长因子-23变体(R179Q)。
在本文公开内容的一种实施方式中，成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子-19或成纤维细胞生长因子-21。
在本文公开内容的一种实施方式中，融合多肽包含与SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53的氨基酸序列具有95％或更多同一性的氨基酸序列。
在本文公开内容的一种实施方式中，融合多肽包含SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53的氨基酸序列。
在本文公开内容的一种实施方式中，融合多肽包含FcLALA。
3.附图简述
图1图解了本文公开内容的Klotho融合多肽的若干不同实施方式。示出的融合多肽包括与成纤维细胞生长因子有效连接的一个或多个Klotho细胞外亚结构域。含有一个或多个Klotho细胞外亚结构域的多肽包括，例如，Klotho的细胞外亚结构域(例如，人Klotho的aa 1至982)或Klotho的活性片段。
图2图解了本文公开内容的若干Klotho融合多肽及其组分(例如Klotho细胞外结构域，FGF)的氨基酸序列和核酸序列。在SEQ ID NO.46、47、48和49中描述了包含sKlotho、FGF23和FcLALA(具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段)的融合蛋白。在SEQ ID NO.50、51、52和53中描述了包含FGF23和FcLALA的融合蛋白。
图3A-3C描绘了sKlotho-FGF23融合蛋白的蛋白质表达。图3A显示，通过用抗-FGF23抗体进行Western印迹杂交，在条件培养基中检测到了sKlotho-FGF23融合蛋白。图3B显示，通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色，在条件培养基中检测到了sKlotho-FGF23融合蛋白。图3C显示了通过SDS-PAGE和考马斯蓝染色分析的经高度纯化的sKlotho-FGF23-6xHis融合蛋白。
图4图解了Egr-1荧光素酶测定的结果，所述测定比较了在不存在或存在肝素(20μg/ml)时用含有Klotho融合多肽、仅FGF23多肽、仅可溶Klotho(sKlotho)多肽以及与FGF23多肽组合的可溶Klotho多肽的条件培养基处理的细胞中Egr-1的活化水平。
图5A-5B描绘了Egr-1荧光素酶测定的结果，所述测定比较了在不存在或存在肝素时用经纯化的Klotho融合多肽、FGF23多肽或可溶Klotho多肽处理的细胞中Egr-1的活化水平。图5A显示了比较在不存在或存在肝素(20μg/ml)时用仅FGF23、sKlotho-His(10nM或20nM)或FGF23和sKlotho-His(10nM或20nM)的组合处理的细胞中Egr-1的活化水平的实验的结果。图5B显示了用sKlotho-FGF23-His融合体(0nM、0.6nM、1.21nM、2.41nM、4.83nM、9.65nM和19.3nM)处理的细胞中Egr-1荧光素酶报道基因的活性。
图6A-6B图解了用经纯化的sKlotho融合多肽进行的处理对C2C12肌细胞的作用。图6A显示了在不存在或存在地塞米松(100μM)时用IGF-1(10nM)、FGF2(20ng/ml)或经纯化的Klotho融合多肽(20nM)处理的C2C12肌细胞中的肌管直径的测量。图6B显示了在不存在或存在雷帕霉素(40nM)时通过IGF-1(10nM)、FGF2(20ng/ml)或经纯化的Klotho融合多肽(20nM)的C2C12肌细胞中信号传递途径蛋白质的磷酸化。
图7显示了通过sKlotho-FGF23(R179Q)-FcLALA融合蛋白的EGR-1-luc报道基因的活化。
图8显示了通过FGF23(R179Q)-FcLALA蛋白的EGR-1-luc报道基因的活化。
图9显示了FGF23(R179Q)对FGF23(R179Q)-FcLALAv2的药物代谢动力学谱。
图10A和10B显示了在地塞米松诱导的肌萎缩之后sKlotho-FGF23融合体增强肌生长的体内效力。
图11。该图显示了通过FGF23(R179Q)-FcLALA和Q156A、C206S、C244S和C206S/C244S突变体的EGR-1-luc报道基因的活化。
图12显示了FGF23(R179Q)-FcLaLa的WT(野生型)、Q156A、C206S、C244S和C206S/C244S突变体的蛋白品质和二聚化。
4.发明详述
本文公开内容涉及用于预防或治疗年龄相关的病况或代谢病症的方法、试剂盒和组合物；以及涉及所述组合物在疗法中、作为药剂或其用于病理性病症的治疗的用途。本文公开内容的融合多肽包括Klotho蛋白或其活性片段。在一些实施方式中，本文公开内容的融合多肽包括与成纤维细胞生长因子多肽或其活性片段有效连接的Klotho蛋白或其活性片段。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的结合FcRn的能力和/或增加的血清中稳定性的经修饰的Fc片段。在另一实施方式中，融合多肽包含FGF(例如，FGF23)和具有减少的结合FcRn的能力和/或增加的血清中稳定性的经修饰的Fc片段。
本文公开内容的融合蛋白或sKlotho在治疗和预防包括肌肉减少症、皮肤萎缩、肌消减、脑萎缩、动脉粥样硬化、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松、骨关节炎、免疫无活性(immunologic incompetence)、高血压、痴呆、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏症、白内障、年龄相关的黄斑变性、前列腺癌、中风、缩短的预期寿命、失忆、皱纹、受损的肾功能和年龄相关的听力损失的多种年龄相关病况以及包括II型糖尿病、代谢综合征、高血糖和肥胖的代谢病症中是有用的。
本文公开内容至少部分基于下述发现：尽管有物理约束(例如，Klotho和FGF多肽两者的大尺寸)，Klotho-FGF融合多肽在活化FGF受体中是高度有效的。考虑到这两种蛋白质的融合将可能干扰异源二聚化，因而融合可能扰乱蛋白质(例如蛋白质的结合结构域)的活性，或者如果以“顺式(cis)”形式放在一起蛋白可能被错误地空间定向，该发现是出乎意料的。
本文描述的融合多肽是有利的，因为它们允许施用较之单独施用Klotho或FGF或作为分开的多肽一起施用具有增强的活性的单个治疗性蛋白质。使用作为单个融合多肽的Klotho和FGF，而非使用两个分开的多肽(即，Klotho多肽和分开的FGF多肽)，在活化FGF受体上更为有效。
定义
“Klotho多肽”、“Klotho蛋白”或“Klotho”在本文中使用时包括野生型“Klotho”的活性片段、衍生物、模拟物、变体和经化学修饰的化合物或其杂交体。Klotho活性片段具有与FGF多肽结合的能力。通常，Klotho活性多肽至少含有Klotho亚结构域(例如，KL-D1和KL-D2)。野生型Klotho具有如在自然界中发现的氨基酸序列。适用于本文公开内容的Klotho多肽实例包括α-Klotho(SEQ ID NO：2)和β-Klotho(SEQ IDNO：4)。α-Klotho和β-Klotho的核苷酸和氨基酸序列分别见GenBank数据库中的登录号No.NM_004795；NP_004786和NM_175737；NP__783864。Klotho多肽包括美国专利No.6,579,850中描述的那些，该专利的内容通过引用以其整体并入本文。Klotho多肽还包括来自人之外的其它物种的那些，包括来自小鼠(NP_038851)、大鼠(NP_112626)、兔(NP_001075692)的α-Klotho和来自小鼠(NP_112457)的β-Klotho。被预测具有α-Klotho的物种包括黑猩猩(XP_522655)、猕猴(XP_001101127)、马(XP_001495662)、母牛(XP_001252500)、鸭嘴兽(XP_001510981)和鸡(XP_417105)。被预测具有β-Klotho的物种包括黑猩猩(XP_526550)、猕猴(XP_001091413)、马(XP_001495248)、狗(XP_536257)、大鼠(XP_001078178)、鸭嘴兽(XP_001512722)和鸡(XP_423224)。Klotho多肽具有与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，即，与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或其活性片段的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。
“融合多肽”或“融合蛋白”在本文中使用时将表示包含并非天然存在于相同多肽中的两种或更多种不同的多肽或其活性片段的多肽。在一些实施方式中，两种或更多种不同的多肽共价地有效连接到一起，例如，化学连接或通过肽键符合读框融合。在本文中使用时，“Klotho融合多肽”是包括来自Klotho多肽或其活性片段的氨基酸序列的融合多肽。作为非限制性实例，融合多肽能够包含：Klotho(例如，sKlotho)、FGF(例如，FG23)和(任选地)经修饰的Fc片段(例如，具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段)。这类型的融合多肽的实例示于SEQ ID NO.46至49中。在另一实施方式中，融合蛋白包含FGF(例如，FGF23)和经修饰的Fc(例如，FcLALA)。在SEQ ID NO.50、51、52和53中描述包含FGF23和FcLALA的融合蛋白。FcLALA是具有LALA突变(L234A、L235A)的Fc片段，其引发具有降低的效率的ADCC，并且较弱地结合和活化人补体。Hessell等2007Nature449：101-104。
“成纤维细胞生长因子”和“FGF”在本文中可互换使用，并且将表示在动物，包括人受试者中调控细胞增殖、迁移、分化、内稳态、组织修复和对损伤的应答的多肽。FGF具有结合成纤维细胞生长因子受体并且调控其活性的能力，包括FGFR的自身磷酸化、FRS2(FGF受体底物2)和ERK1/2(细胞外信号调控的蛋白激酶1/2)的磷酸化，和活化Egr-1(早期生长应答-1).术语“FGF”包括野生型“FGF”的活性片段、衍生物、模拟物、变体和化学修饰的化合物或其杂交体，例如本领域已知的，和如美国专利No.7,223,563和美国专利U.S.Patent No.7,259,248中描述的，其内容通过引用整体并入本文。野生型FGF具有如自然界中所发现的氨基酸序列。适用于本文公开内容的成纤维细胞生长因子实例包括成纤维细胞生长因子-19(FGF19；SEQ ID NO：31)、成纤维细胞生长因子-21(FGF21；SEQ ID NO：33)和成纤维细胞生长因子-23(FGF23；SEQ ID NO：35)。FGF多肽包括来自人之外的其它物种的那些，包括鼠FGF。通常，FGF多肽具有与SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：35的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列；即，具有与SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：35或其活性片段的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或100％同一性的氨基酸序列。在SEQ ID NO：47的aa 1002-1228；SEQ ID NO：49的aa1002-1228；SEQ ID NO：51的aa 1-251和SEQ ID NO：53的aa 1-251中；以及与这些序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或100％同一性的序列中提供FGF(特别是FGF23)的另外的非限制性实例。在SEQ ID NO：46、48、50和52中提供编码这些序列的核苷酸。
术语“FGF”包括全长多肽的活性片段。能结合其对应的FGF受体的活性FGF片段是本领域已知的，并且也被考虑用于本文公开内容。基于本文公开的序列，本领域技术人员将理解，能够使用标准重组技术，例如Sambrook等(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)和Ausubel等(1997，CurrentProtocols in Molecular Biology，Green & Wiley，New York)中描述的生成FGF的重叠片段。基于本文所示的公开内容，本领域技术人员将理解，能够通过本领域公知的和本文描述的方法测试FGF片段的生物学活性，包括与FGF受体的结合。相似地，可用FGF片段转染具有必要FGF信号转导机制(即，FGF受体)的细胞培养模型，并随后测试FGF信号传递相对于野生型FGF的变化。
基于FGF核心同源性结构域(大约120个氨基酸长)的同源性，FGF被分组进七个亚家族，所述结构域侧翼是在长度和一级序列方面均高度可变(特别是在不同的FGF亚家族之间)的N-和C-末端序列(Goetz等，Molecular and Cellular Biology，2007，第27卷，3417-3428)。一般地FGF活性多肽至少含有FGF核心同源性结构域。在一些实施方式中，除了FGF核心同源性结构域之外，FGF活性多肽还可含有可赋予结合FGF受体额外特异性的侧翼序列。FGF19、FGF21和FGF23被分组进FGF19亚家族，因为相对于其它FGF而言，这些配体的核心区域共享高度的序列同一性(FGF19对FGF21：38％同一性；FGF19对FGF23：36％同一性)。FGF19亚家族成员以类似的方式对内分泌系统的信号传递分子发挥作用，并且调控对于经典FGF来说不常见的不同的生理过程(例如，FGF19：能量和胆汁酸内稳态；FGF21：葡萄糖和脂类代谢；以及FGF23：磷酸盐和维生素D内稳态)。
“成纤维细胞生长因子受体”和“FGFR”在本文中指任一本领域已知的FGFR 1-4或其剪接变体(例如，FGFR1c)。适用于本文公开内容的成纤维细胞生长因子受体的实例包括成纤维细胞生长因子受体-19(例如，FGFR4-βKlotho)、成纤维细胞生长因子受体-21(例如，FGFR1c-αKlotho)和成纤维细胞生长因子受体-23(例如，FGFR1c-αKlotho、FGFR3-αKlotho、FGFR4-αKlotho)。
“细胞外结构域”在本文中使用时指跨膜蛋白的存在于细胞之外的片段(例如，不包括细胞内或跨膜区域)。“Klotho蛋白的细胞外结构域”、“可溶Klotho”或“sKLotho”(例如SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：3)指Klotho多肽的细胞外结构域，其能结合成纤维细胞生长因子，和/或通过结合成纤维细胞生长因子而使得成纤维细胞生长因子能与成纤维细胞生长因子受体结合。Klotho细胞外结构域对应于全长αKlotho序列(SEQ ID NO：2)的氨基酸残基28-982和全长βKlotho序列(SEQ ID NO：4)的氨基酸残基52-997。
“Klotho蛋白的细胞外亚结构域”和“Klotho蛋白的细胞外亚结构域”在本文中可互换使用，它们指Klotho多肽的细胞外结构域中的下述区域，所述区域能结合成纤维细胞生长因子，和/或通过结合成纤维细胞生长因子使得成纤维细胞生长因子能与成纤维细胞生长因子受体结合。在多种实施方式中，融合体包含：包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽；包含成纤维细胞生长因子的多肽；和任选地，具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。Klotho细胞外结构域具有重复的两个同源的亚结构域，即KL-D1(SEQ ID NO：5)和KL-D2(SEQID NO：6)。KL-D1和KL-D2分别地对应于全长αKlotho多肽(SEQ IDNO：2)的氨基酸残基58-506和517-953，以及分别地对应于全长βKlotho多肽(SEQ ID NO：4)的氨基酸残基77-508和571-967，并且它们适用于本文公开内容。通常，含有至少一个Klotho亚结构域的多肽是Klotho活性多肽。用于本文公开内容的多肽的Klotho细胞外亚结构域可为具有分别与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：37的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列的αKlotho或βKlotho KL-D1结构域。此外，Klotho KL-D1结构域可具有与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：37的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列。Klotho细胞外亚结构域也可为分别与SEQ ID NO：6或SEQ IDNO：38的氨基酸序列基本相同的α或βKlotho多肽KL-D2结构域。在其它实施方式中，KL-D2结构域具有与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：38的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，融合体包含Klotho蛋白的至少两个细胞外亚结构域(例如，KL-D1和KL-D2；串联重复的KL-D1和KL-D1；串联重复的KL-D2和KL-D2，等等)。
“经修饰的Fc片段”在本文中使用时表示包含经修饰的序列的抗体Fc片段。Fc片段是包含CH2、CH3和部分铰链区域的抗体的部分。经修饰的Fc片段能够源于，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。FcLALA是具有LALA突变(L234A、L235A)的经修饰的Fc片段，其引发具有降低的效率的ADCC，并且较弱地结合和活化人补体。Hessell等2007Nature449：101-104。例如在美国专利No.7,217,798中描述了对Fc片段的额外修饰。例如，在多种经修饰的Fc片段中：(a)氨基酸残基250是谷氨酸，并且氨基酸残基428是苯丙氨酸；或(b)氨基酸残基250是谷氨酰胺，并且氨基酸残基428是苯丙氨酸；或(c)氨基酸残基250是谷氨酰胺，并且氨基酸残基428是亮氨酸。在一些实施方式中，通过氨基酸残基250是谷氨酸或谷氨酰胺并且氨基酸残基428是亮氨酸或苯丙氨酸，氨基酸残基250和428不同于存在于未经修饰的Fc-融合蛋白中的残基，并且其中氨基酸残基是通过EU编号系统来编号的，如美国专利No.7,217,798中描述的。在一些实施方式中，经修饰的Fc-融合蛋白在pH6.0下对FcRn的亲和性比在pH8.0下更高。优选地，经修饰的Fc片段具有减少的对FcRn的亲和性和/或增加的血清半寿期。经修饰的Fc片段的非限制性的实例包括SEQ ID NO：47的aa(氨基酸)1234-1459；SEQ ID NO：49的aa 1234至1450；SEQ ID NO：51的aa 257至482；和SEQ ID NO：53的aa 257至473；以及与这些序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或100％同一性的序列。在SEQ ID NO：46、48、50和52中提供了编码这些序列的核苷酸。
“信号肽”在本文中使用时表示指导蛋白质翻译后运输至内质网的肽链(3-60个氨基酸长)，并且可被切除。适用于本文公开内容的信号肽实例包括Klotho信号肽(SEQ ID NO：19)和IgG信号肽(SEQ ID NO：20)。注意：由生产细胞系分泌并切割后，信号肽(例如，对应于SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的肽的)被切除。因此，在由生产细胞系分泌和切割信号肽之后，SEQ ID NO：19的肽将生成SEQ ID NO：41的肽。
“连接子”在本文中使用时将表示将两个或更多个多肽或核酸共价联结起来使得它们互相连结的官能团(例如，化学的或多肽的)。在本文中使用时，“肽连接子”表示用于将两个蛋白质偶联到一起的一个或多个氨基酸(例如，偶联Klotho的细胞外结构域和成纤维细胞生长因子-23)。适用于本文公开内容的肽连接子包括但不限于：具有SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的多肽。多肽连接子能够包含任何这些氨基酸序列的至少1个至和至多大约30个重复。
“有效连接”在本文中使用时将表示两个或多个生物分子的连接，使得与生物分子关联的生物学功能、活性和/或结构至少被保留。提到多肽时，该术语表示两个或多个多肽的连接导致产生了融合多肽，所述融合多肽至少保留了每种多肽组分各自个体的一些活性。两个或多个多肽可直接连接或经由连接子连接。提到核酸时，该术语表示将第一条多核苷酸放在第二条多核苷酸邻近处，当合适的分子(例如转录活化蛋白)与第二条多核苷酸结合时，第二条多核苷酸指导第一条多核苷酸的转录。
“特异性结合”在本文中使用时将指由于第一个分子采取有助于在其自身和其他靶分子之间形成非共价相互作用的特别的结构的能力，第一个分子与其可被暴露于的许多不同类型的分子中的靶分子结合的能力。第一个分子与靶结合，形成稳定复合体，而在第一分子与任何其它非特异性分子之间的识别、接触或复合体形成基本更少。
“多肽变体”或“蛋白质变体”在本文中使用时指下述多肽，其中较之参照序列一个或多个氨基酸已被不同氨基酸替换。本领域中熟知，一些氨基酸可被另一些具有大体相似的性质的氨基酸替换，而不改变多肽的活性的本质(保守替换)，如下文所述。这些术语也涵盖其中一个或多个氨基酸已被添加、缺失或用不同氨基酸代替的多肽，例如，蛋白质同工型。适用于本文公开内容的成纤维细胞生长因子-23的变体的实例是成纤维细胞生长因子-23变体(R179Q)。
“药物组合物”在本文中使用时将表示含有可被施用以在个体中治疗或预防疾病或病症的化合物(例如，本文公开内容的融合多肽)的组合物。
“个体”或“受试者”在本文中使用时将指哺乳动物，包括但不限于人或非人的哺乳动物，例如牛、马、犬科动物、羊或猫科动物。
“治疗”在本文中使用时将表示减少、遏制、减弱、减轻、阻止或稳定疾病的发展或进程。在本文公开内容的上下文中，本文公开内容的多肽的施用可用于治疗包括肌肉减少症、皮肤萎缩、肌消减、脑萎缩、动脉粥样硬化、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松、骨关节炎、免疫无活性、高血压、痴呆、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏症、白内障、年龄相关的黄斑变性、前列腺癌、中风、缩短的预期寿命、失忆、皱纹、受损的肾功能和年龄相关的听力损失的年龄相关的病况；以及包括II型糖尿病、代谢综合征、高血糖和肥胖的代谢病症。
“预防”在本文中使用时将表示在受试者中减少病症的发生或减少获得病症或其关联的症状的风险。在本文公开内容的上下文中，本文公开内容的多肽的施用可用于预防包括肌肉减少症、皮肤萎缩、肌消减、脑萎缩、动脉粥样硬化、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松、骨关节炎、免疫无活性、高血压、痴呆、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏症、白内障、年龄相关的黄斑变性、前列腺癌、中风、缩短的预期寿命、失忆、皱纹、受损的肾功能和年龄相关的听力损失年龄相关的病况；以及包括II型糖尿病、代谢综合征、高血糖和肥胖的代谢病症。预防能够是完全的，例如，完全不存在年龄相关的病况或代谢病症。预防也可为部分的，使得受试者中年龄相关的病况或代谢病症发生的可能性要比未接受本文公开内容的受试者更少可能发生。
“疾病”在本文中使用时将表示损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病况或病症。
“年龄相关病况”在本文中使用时将表示其在人群中的发病率或在个体中的严重程度与年龄进程相关的任何疾病或病症。在一种实施方式中，年龄相关的病况是下述疾病或病症，在多于100,000名个体的选择的群体中，所述疾病或病症在年龄大于60岁的人类个体中的发病率比年龄在30-40岁之间的人类个体中的发病率至少高1.5倍。与本文公开内容相关的年龄相关的病况包括但不限于肌肉减少症、皮肤萎缩、肌消减、脑萎缩、动脉粥样硬化、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松、骨关节炎、免疫无活性、高血压、痴呆、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏症、白内障、年龄相关的黄斑变性、前列腺癌、中风、缩短的预期寿命、失忆、皱纹、受损的肾功能和年龄相关的听力损失。
“代谢病症”在本文中使用时将表示通过影响细胞中的能量生产或毒素在细胞、组织、器官或个体中的积累而损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何疾病或病症。与本文公开内容相关的代谢病症包括但不限于II型糖尿病、代谢综合征、高血糖和肥胖。
“有效剂量”或“有效量”是足以实现有益的或想要的临床结果的量。在本文公开内容的上下文中，其是能有效产生意欲的药理、治疗或预防结果的Klotho融合多肽或sKlotho的量。治疗有效剂量导致预防或改善病症或病症的一种或多种症状(例如，年龄相关的病况或代谢病症)。治疗有效剂量将取决于受试者和受治疗的疾病病况、受试者的重量和年龄、疾病病况的严重程度、施药方式等而不同，其能够被本领域普通技术人员容易地确定。
“Klotho核酸分子”在本文中使用时是编码Klotho蛋白的基因。在GenBank登录号No.NM_004795(SEQ ID NO：1)中提供了人Klotho基因的实例。在SEQ ID NO：47的aa 1-982和SEQ ID NO：49的aa 1-982；以及与这些序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多或100％同一性的序列中提供了Klotho的另外的非限制性的实例。
“片段”在本文中使用时指多肽或核酸分子的部分。优选地，该部分含有参照核酸分子或多肽的全长的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或至多3000个核苷酸或氨基酸。
术语“基本相同”指展示出与参照氨基酸序列(例如，任一本文描述的氨基酸序列)或核酸序列(例如，任一本文描述的核酸序列)至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，此类序列在氨基酸水平或核酸水平上与用于比较的序列具有至少60％、70％、75％、80％或85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性。
本文公开内容涉及用于预防或治疗年龄相关的病况或代谢病症的方法、试剂盒和组合物；以及涉及所述组合物在疗法中、作为药剂或其用于对病理性病症的治疗的用途。在一些实施方式中，本文公开内容提供了具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的融合多肽。在一些实施方式中，融合多肽还包含成纤维细胞生长因子或其活性片段。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。在其它实施方式中，融合体包含与经修饰的Fc(例如，FcLALA)融合的FGF(例如FGF19、FGF21、FGF23或FGF23变体R179Q)。FcLALA是具有LALA突变(L234A、L235A)的Fc片段，其引发具有降低的效率的ADCC，并且较弱地结合和活化人补体。Klotho细胞外结构域可源于α或βKlotho同工型。此外，虽然Klotho融合多肽的FGF组分主要是参照成纤维细胞生长因子-19、成纤维细胞生长因子-21和成纤维细胞生长因子-23来描述的，但考虑二十三种已知FGF或其活性片段中的任一种能够用于实践本文公开内容。
Klotho蛋白的细胞外结构域能够包括Klotho蛋白的KL-D1和KL-D2结构域中的一个或二者。在一些实施方式中，Klotho融合多肽具有Klotho蛋白的至少两个细胞外亚结构域。例如，至少两个细胞外亚结构域能够是串联重复的至少两个KL-D1结构域，串联重复的至少两个KL-D2结构域，或者至少一个KL-D1结构域和至少一个KL-D2结构域。
Klotho蛋白的细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子(或其活性片段)能够以多种定向和方式互相有效连接。例如，Klotho蛋白的细胞外亚结构域能够有效连接至成纤维细胞生长因子的N-末端，或者备选地，成纤维细胞生长因子能够有效连接至Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的N-末端。
本文公开内容的融合多肽可包括KLotho细胞外结构域(即KL-D1(SEQ ID NO：5)和KL-D2(SEQ ID NO：6))中的一个或二者。KL-D1和KL-D2分别对应于全长αKlotho多肽(SEQ ID NO：2)的氨基酸残基58-506和517-953，以及全长βKlotho多肽(SEQ ID NO：4)的氨基酸残基77-508和571-967，并且适用于本文公开内容。Klotho融合多肽可具有αKlotho多肽的KL-D1结构域(所述结构域具有与SEQ ID NO：5的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列)或βKlotho多肽的KL-D1结构域(所述结构域具有与SEQ ID NO：37的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列)。具体地，Klotho融合多肽可具有与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：37具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列。Klotho融合多肽可具有αKlotho多肽的KL-D2结构域(所述结构域具有与SEQ ID NO：6的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列)或βKlotho多肽的KL-D2结构域(所述结构域具有与SEQ ID NO：38的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列)。具体地，Klotho融合多肽可具有分别与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：38具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文公开内容的Klotho融合多肽是可溶的，并且能结合FGF受体。
本文公开内容的Klotho融合多肽能够含有多肽连接子，其将具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽与成纤维细胞生长因子和(任选的)经修饰的Fc片段连结起来。合适的连接子是本领域公知的，并且含有若干Gly和若干Ser残基，例如(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO：11)、Gly4Ser多肽(SEQ ID NO：12)、Gly(SEQ ID NO：13)、Gly Gly(SEQ IDNO：14)、Gly Ser(SEQ ID NO：15)、Gly2 Ser(SEQ ID NO：16)、Ala(SEQ ID NO：17)和Ala Ala(SEQ ID NO：18)。在一些实施方式中，连接子将具有至少2个以及至多30个重复的、由SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18中任一所示的氨基酸序列。
当本文公开内容的Klotho融合多肽中存在多肽连接子时，具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽可通过肽键连结至连接子多肽的N-末端，而FGF则通过肽键连结至多肽连接子的C-末端。备选地，FGF可通过肽键连结至连接子多肽的N-末端，而具有Klotho的至少一个细胞外亚结构域的多肽则通过肽键连结至多肽连接子的C-末端。也能够使用化学连接子连接两个多肽。
本文公开内容的Klotho融合多肽可包括信号肽。和Klotho融合多肽使用的信号肽的实例包括但不限于Klotho信号肽(SEQ ID NO：8)和IgG信号肽(SEQ ID NO：9)。
在一些实施方式中，本文公开内容提供了FGF(例如，FGF19、FGF21、FGF23或FGF23变体R179Q)和经修饰的Fc(例如，FcLALA)之间的融合体。融合体还能够任选地包含FGF和Fc部分之间的连接子。融合体还能够任选地包含信号肽。在多种实施方式中，本文公开内容涵盖编码这些融合多肽的核酸、包含这些核酸的载体和含有这些核酸的宿主细胞。
4.1Klotho和成纤维细胞生长因子多肽
预期本文公开内容的Klotho融合多肽展示出与自然界中FGF相当的生物学活性，例如与FGF受体的结合并诱导FGF受体、FRS2(FGF受体底物2)和ERK1/2(细胞外信号调控的蛋白激酶1/2)的磷酸化，以及活化Egr-1(早期生长应答-1)基因。FGF是与FGF受体结合的分泌的肽生长因子。FGF的氨基酸序列和核酸序列是本领域技术人员易于获得的。例如，FGF19、FGF21和FGF23的核苷酸序列的实例能够分别以登录号NM_005117、NM_019113和NM_020638在GenBank数据库中找到，并在本文中分别为SEQ ID NO：30、32和34。FGF19、FGF21和FGF23的氨基酸序列的实例能够分别以登录号NP_005108、NP_061986和NP_065689在GenBank数据库中找到，并在本文中分别为SEQ ID NO：31、35和35。此外，FGF可包括一种或多种变动，所述变动辅助蛋白质的表达，例如，FGF23(R179Q)变体(SEQ ID NO：36)。
Klotho蛋白是130kDa的单通过I型跨膜蛋白，其具有细胞外结构域和短的细胞质结构域。Klotho的氨基酸序列和核酸序列是本领域技术人员容易获得的。例如，α-Klotho和β-Klotho的核苷酸序列的实例能够分别以登录号NM_004795和NM_175737在GenBank数据库中找到，并在本文中分别为SEQ ID NO：7和8。α-Klotho和β-Klotho的氨基酸序列的实例能够分别以登录号NP_004786和NP_783864在GenBank数据库中找到，并在本文中分别为SEQ ID NO：2和4。
本文公开内容的Klotho融合多肽能够与成纤维细胞生长因子受体结合，并且具有与成纤维细胞生长因子-19(SEQ ID NO：31)、成纤维细胞生长因子-21(SEQ ID NO：33)、成纤维细胞生长因子-23(SEQ ID NO：35)或其变体(其包括成纤维细胞生长因子-23变体(R179Q)(SEQ ID NO：36))有效连接的α-Klotho或β-Klotho细胞外结构域。
具体地，本文公开内容的Klotho融合多肽可包括与成纤维细胞生长因子-23(SEQ ID NO：35)或成纤维细胞生长因子-23变体(R179Q)(SEQID NO：36)有效偶联的α-Klotho(SEQ ID NO：2)。此外，本文公开内容的Klotho融合多肽可具有与成纤维细胞生长因子-19(SEQ ID NO：31)有效偶联的β-Klotho(SEQ ID NO：4)。本文公开内容的Klotho融合多肽可包括与成纤维细胞生长因子-21(SEQ ID NO：33)有效偶联的β-Klotho(SEQ ID NO：4)。
本文公开内容包括多种Klotho和FGF基因的同源体和这些基因编码的蛋白质。提到基因时“同源体”指在基因的至少部分上基本相同的核苷酸序列，或其互补链或部分，前提是核苷酸序列编码如下的蛋白质，所述蛋白质与是所述核苷酸序列同源体的基因所编码的蛋白质具有基本相同的活性/功能。本文描述的基因的同源体能够通过可能的同源体的氨基酸或核苷酸序列与基因或它们编码的蛋白的序列(例如，编码Klotho和FGF的基因的核苷酸序列或它们的互补链)之间的百分比同一性来鉴定。例如可通过目测检查或通过使用本领域已知的或本文描述的多种计算机程序，来测定百分比同一性。一般地，使用序列分析软件(例如Genetics ComputerGroup，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710UniversityAvenue，Madison，Wis.53705的序列分析软件包，BLAST，BESTFIT，GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列同一性。此类软件通过对多种替换、缺失和/或其它修饰指定同源性程度，匹配相同或相似的序列。一般地保守氨基酸替换包括下述组内的替换：
甘氨酸和丙氨酸；
缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；
天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；
丝氨酸和苏氨酸；
赖氨酸和精氨酸；以及
苯丙氨酸和酪氨酸。
因此，将甘氨酸突变为丙氨酸将是保守氨基酸替换，将丙氨酸突变成甘氨酸也是；将缬氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸将是保守氨基酸替换，用缬氨酸或亮氨酸取代异亮氨酸也是，用缬氨酸或异亮氨酸取代亮氨酸也是，等等。本文公开内容提供了具有至少一个保守氨基酸替换的、本文公开的所有氨基酸序列的变体。
在测定同一性程度的示例性手段中，可使用BLAST程序，使用e-3和e-100之间的概率分数，这指示紧密相关的序列。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：19的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：20的融合多肽。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：40的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：41的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：46的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：47的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：48的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：49的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：50的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：51的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在一种实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：52的融合多肽。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：53的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：54的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：55的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：56的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：57的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：58的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：59的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：60的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：61的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：62的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：63的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：64的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：65的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：66的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：67的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在另一实施方式中，本文公开内容提供了SEQ ID NO：68的融合多肽，或包含至少一个保守氨基酸替换的其变体。
在本文中使用时，术语“同源性”和“同源”并不限于指具有理论上共同遗传祖先的蛋白质，还包括可能遗传不相关但是已进化为执行相似的功能和/或具有相似的结构的蛋白质。与本文描述的多种蛋白质的功能同源性也涵盖下述蛋白质，所述蛋白质具有是其同源体的相应蛋白质的活性。对于具有功能同源性的蛋白质，并不需要它们在其氨基酸序列中具有显著的同一性，而相反，具有功能同源性的蛋白质是通过具有相似或相同的活性来如此定义的。例如，关于Klotho分子，多肽应当具有结合FGF多肽和使得FGF能与FGFR结合的功能特征。关于FGF分子，多肽应当具有结合FGFR并导致FGFR活化(例如磷酸化)的功能特征。用于评估FGF与FGF受体的结合和/或FGF信号传递途径的活化的测定是本领域已知的，并且描述于本文中(见实施例2)。用于评估Klotho活性的测定也是本领域已知的，并且描述于本文中(例如，与FGF多肽的结合)。具有结构同源性的蛋白质被定义为具有类似的三级(或四级)结构但是不必须需要编码它们的基因的氨基酸同一性或核酸同一性。在某些情况下，结构同源体可包括仅在蛋白质的活性位点或结合位点保持结构同源性的蛋白质。
除了结构和功能同源性之外，本文公开内容还涵盖与本文所述的多种Klotho和FGF氨基酸序列具有氨基酸同一性的蛋白质。为测定两条氨基酸序列的百分比同一性/同源性，就最优比较目的对序列进行比对(例如，能够在一条蛋白质的氨基酸序列中引入空位，用于与另一蛋白质的氨基酸序列的最优比对)。然后比较相应氨基酸位置上的氨基酸残基。当一条序列中的位置被与另一序列中相应位置的相同的氨基酸残基占据时，那么两条分子在该位置是相同的。两条序列之间的百分比同一性是序列共享的相同位置的数目的函数(即，％同一性＝相同位置#/总位置#，乘以100)。
本文描述的公开内容的分子的氨基酸序列具有与本文描述的氨基酸序列具有至少大约60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性或同源的氨基酸序列。
本文描述的公开内容的分子的核酸序列具有与本文描述的核苷酸序列杂交或与本文描述的核苷酸序列具有至少大约60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性或同源的核苷酸序列。
适合用于本文公开内容的融合多肽的核酸分子可具有在严格条件下分别与编码Klotho或FGF的核酸分子的互补序列杂交的Klotho或FGF核苷酸序列。在本文中使用时，术语“在严格条件下杂交”旨在描述用于杂交和洗涤的条件，所述条件下，互相之间至少大约70％、80％、85％、90％或更多同源的核苷酸序列一般保持互相杂交。此类严格条件是本领域技术人员已知的，并能够在Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，New York(2001)，6.3.1-6.3.6中找到。严格杂交条件的具体的、非限制性的实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于大约45℃杂交，接着在0.2X SSC、0.1％SDS中于50-65℃洗涤一次或多次。
4.2本文公开内容的Klotho-FGF融合多肽
在本文公开内容的一些实施方式中，Klotho融合多肽具有下述多肽链，所述多肽链具有Klotho多肽或其活性片段的第一多肽序列以及编码FGF或其活性片段的第二多肽序列。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。
本文公开内容包括与SEQ ID NO：19-28所示的氨基酸序列至少大约95％更多同源的融合多肽。SEQ ID NO：19的氨基酸序列编码下述Klotho融合多肽，所述融合多肽具有N-末端连接至FGF23(R179Q)变体(SEQID NO：36)的Klotho细胞外结构域。SEQ ID NO：20的氨基酸序列编码下述Klotho融合多肽，所述融合多肽具有N-末端连接至缺少信号肽的、N-末端连接至FGF23(R179Q)变体的Klotho细胞外结构域的IgG信号肽。SEQ ID NO：21的氨基酸序列编码下述Klotho融合多肽，所述融合多肽具有N-末端连接至FGF23(R179Q)变体的KL-D1细胞外亚结构域。SEQ ID NO：22的氨基酸序列编码下述Klotho融合多肽，所述融合多肽具有N-末端连接至FGF23(R179Q)变体的KL-D2细胞外亚结构域。SEQ IDNO：23的氨基酸序列编码下述Klotho融合多肽，所述融合多肽具有N-末端连接至FGF23(R179Q)变体的两个KL-D1细胞外亚结构域。SEQ IDNO：24的氨基酸序列编码下述Klotho融合多肽，所述融合多肽具有N-末端连接至FGF23(R179Q)变体的两个KL-D2细胞外亚结构域。SEQ IDNO：25的氨基酸序列编码下述Klotho融合多肽，所述融合多肽具有N-末端连接至Klotho细胞外结构域的FGF23(R179Q)变体。SEQ ID NO：26的氨基酸序列编码下述Klotho融合多肽，所述融合多肽具有N-末端连接至KL-D1细胞外亚结构域的FGF23(R179Q)变体。SEQ ID NO：27的氨基酸序列编码下述Klotho融合多肽，所述融合多肽具有N-末端连接至KL-D2细胞外亚结构域的FGF23(R179Q)变体。SEQ ID NO：28的氨基酸序列编码下述Klotho融合多肽，所述融合多肽具有N-末端连接至两个KL-D1细胞外亚结构域的FGF23(R179Q)变体。SEQ ID NO：29的氨基酸序列编码下述Klotho融合多肽，所述融合多肽具有N-末端连接至两个KL-D2细胞外亚结构域的FGF23(R179Q)变体。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。
本文公开内容的Klotho融合多肽可包括与SEQ ID NO：7示出的氨基酸序列具有至少大约95％同一性的氨基酸序列。SEQ ID NO：7的氨基酸序列编码缺少信号肽的Klotho细胞外结构域。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。
本文描述了主题融合蛋白并且能够使用本领域已知的方法来制备它们。例如，可如美国专利No.6,194,177所述来构建本文公开内容的融合多肽。在美国专利No.6,579,850中描述Klotho多肽的用途。在美国专利No.7,223,563中描述FGF核酸分子的用途。
在一些实施方式中，通过PCR克隆编码Klotho的核酸分子，并将其与编码FGF的核酸分子以符合读框的方式连接。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。编码融合多肽的核酸被有效连接至启动子，以允许表达。随后将编码融合多肽的核酸分子转染进宿主细胞，以用于表达。能够通过测序来验证最终构建体的序列。
当制备本文公开内容的融合蛋白时，将编码Klotho的细胞外亚结构域的核酸分子以符合读框的方式融合至编码FGF的核酸分子以及(任选的)编码经修饰的Fc片段的核酸。得到的核酸分子的表达导致Klotho的细胞外亚结构域相对于FGF多肽N-末端融合。其中Klotho的细胞外亚结构域相对于FGF多肽C-末端融合的融合也是可能的。制备融合蛋白的方法是本领域公知的。
本文公开内容的融合多肽具有至少两条共价连接的多肽，其中一条多肽来自一个蛋白质序列或结构域(例如，Klotho)，另一多肽来自另一蛋白序列或结构域(例如，FGF)。在一些实施方式中，融合体还包含具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。在另一实施方式中，本文公开内容包含与经修饰的Fc片段融合的FGF。能够通过本领域技术人员公知的方法将本文公开内容的融合多肽的Klotho和/或FGF和/或(任选的)经修饰的Fc片段联接起来。这些方法包括化学方式和重组方式。
使用重组遗传学领域中的常规技术，能够获得编码结构域的核酸，所述结构域待被掺入本文公开内容的融合多肽。公开用于本文公开内容中的一般性方法的基础文本包括Sambrook和Russell，Molecular Cloning，ALaboratory Manual(第3版.2001)；Kriegler，Gene Transfer andExpression：A Laboratory Manual(1990)；和Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等编，1994-1999)。在编码本文公开内容的Klotho融合多肽的核酸中，可使用分别由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的编码α-Klotho或β-Klotho的核酸序列。在编码Klotho融合多肽的核酸中，可使用分别由SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：34所示的编码FGF19、FGF21或FGF23的核酸序列。本文描述的公开内容的分子的核酸序列包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：34杂交或与所述序列具有至少大约60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性或同源的核苷酸序列。
使用多种方法中的任一种能够获得编码融合体[Klotho，和/或FGF肽和/或(任选的)经修饰的Fc片段]的多种组分的核酸序列。例如，可通过用探针杂交从cDNA和基因组DNA文库克隆编码多肽的核酸序列，或者用寡核苷酸引物使用扩增技术分离所述核酸序列。更常见地，使用DNA或RNA模板，用扩增技术扩增和分离Klotho和FGF序列(见例如，Dieffenfach & Dveksler，PCR Primers：A Laboratory Manual(1995))。备选地，能够合成生产重叠的寡核苷酸，并联接起来以生产一个或多个结构域。使用抗体作为探针，还能够从表达文库分离编码Klotho或FGF的核酸。
根据本文公开内容，融合体[Klotho和/或FGF肽和/或(任选的)经修饰的Fc片段]的多种组分能够直接连接，或经由共价连接子连接，所述连接子包括氨基酸连接子，例如聚甘氨酸连接子，或者另一类型的化学连接子，包括碳水化合物连接子、脂类连接子、脂肪酸连接子、聚醚连接子(例如PEG)等等(见例如，Hermanson，Bioconjugate techniques(1996))。形成融合体/融合多肽的多肽一般地是C-末端至N-末端连接的，虽然它们也能够是C末端至C末端、N-末端至N-末端、或N-末端至C-末端连接的。本文公开内容的融合多肽内的内部位置中可插入一个或多个多肽结构域。融合蛋白的多肽能够是任何顺序的。可通过制备连续编码融合蛋白的重组多核苷酸，通过将来自一条蛋白序列(例如Klotho的细胞外亚结构域)的氨基酸的链共价连接至来自另一蛋白序列(例如FGF)的氨基酸的链，生产融合多肽。融合蛋白中不同的氨基酸链可被直接剪接到一起，或者可经由化学连接基团或氨基酸连接基团被间接剪接到一起。氨基酸连接基团长度能够是大约200个氨基酸或更长，或者通常1至100个氨基酸。在一些实施方式中，将脯氨酸残基掺入连接子，以预防连接子的显著二级结构元件的形成。连接子通常能够是作为重组融合蛋白的一部分合成的柔性的氨基酸亚序列。此类柔性连接子是本领域技术人员已知的。
根据本文公开内容，融合体[Klotho的细胞外亚结构域和/或FGF和/或(任选的)经修饰的Fc片段]的氨基酸序列可经由肽连接子连接。肽连接子的实例是本领域公知的，并被描述于本文中。例如，肽连接子通常包括若干Gly和若干Ser残基，例如(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO：11)、Gly4 Ser多肽(SEQ ID NO：12)、Gly(SEQ ID NO：13)、Gly Gly(SEQ ID NO：14)、Gly Ser(SEQ ID NO：15)、Gly2 Ser(SEQ ID NO：16)、Ala(SEQID NO：17)和Ala Ala(SEQ ID NO：18)。具体地，用于本文公开内容的融合蛋白的肽连接子可作为柔性铰链发挥作用。
可先于将Klotho掺入本文公开内容的融合蛋白排除Klotho或FGF的信号序列。可包括融合蛋白的Klotho或FGF的信号序列，例如SEQ ID NO：19所示的多肽。然而，此类序列也可被略去，并用不同蛋白质的信号序列(例如IgG信号序列(SEQ ID NO：9))取代。通常，本文公开内容的药物组合物将含有Klotho和FGF的成熟形式。
通常，先于掺入融合多肽，从Klotho或FGF部分中的一者或二者排除内含子。
本文公开内容的融合多肽可包括与一条或多条反应活性氨基酸侧链共价联结的一种或多种聚合物。举例而言(而非限制)，此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)，其可联结至一个或多个游离半胱氨酸巯基残基，从而当蛋白质暴露于氧化性条件时阻碍二硫键的形成和聚集。此外，预计本文公开内容的融合多肽的PEG化提供改进的性质，例如增加的半寿期、稳定性和蛋白酶抗性。备选地，可通过将聚合物共价添加至游离氨基(例如赖氨酸ε或N-末端氨基)，修饰本文公开内容的融合多肽。用于共价修饰的特别的具体半胱氨酸和赖氨酸将是不涉及受体结合、肝素结合或正确蛋白质折叠的那些。本领域技术人员将显而易见，可使用用于测定融合多肽的生物化学和/或生物学活性的方法，以确定对特别的氨基酸残基的修饰是否如要求地影响蛋白质活性。也考虑其它相似的合适修饰并且是本领域已知的。
本文公开内容还涉及与SEQ ID NO：19-28所示的氨基酸序列至少大约95％或更多同源的融合多肽的表达。
本文公开内容涵盖下述融合多肽，所述融合多肽包含：(a)包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽，或其功能活性变体或衍生物；(b)包含成纤维细胞生长因子的多肽，或其功能活性变体或衍生物；以及(c)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段。“其功能活性变体或衍生物”表示包含比相应的野生型多肽更长、更短或改变的氨基酸序列但同时保留有生物学活性的变体或衍生物。因此，Klotho蛋白的细胞外亚结构域或成纤维细胞生长因子的“功能活性变体或衍生物”包含较之野生型的Klotho蛋白的细胞外亚结构域或成纤维细胞生长因子而言更少、更多或改变的氨基酸序列，但仍保留野生型多肽序列的至少一种生物学活性。本文公开的多肽的功能活性变体或衍生物也能够包含本文公开的多肽的相同氨基酸序列，但在翻译后修饰(例如PEG化、甲基化和/或糖基化)中有所不同，或具有添加到其上的额外的部分或元件。在多种实施方式中，FGF23的变体或衍生物包含或者不包含R179Q。
在一种实施方式中，功能活性变体或衍生物多肽包括与本文公开的序列(例如，Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域或成纤维细胞生长因子)具有至少大约60％同一性的氨基酸序列。优选地，多肽与本文公开的序列至少具有55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多同一性。
在本文中使用时，使用按照Karlin和Altschul，PNAS USA90：5873-5877，1993)改良的、Karlin和Altschul(PNAS USA 87：2264-2268，1990)的算法测定两条氨基酸序列(或两条核酸序列)的百分比同一性。此类算法被并入Altschul等(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)的NBLAST和XBLAST程序。使用NBLAST程序，以分数＝100，字长＝12来执行BLAST核苷酸搜索。使用XBLAST程序，以分数＝50，字长＝3来执行BLAST蛋白质搜索。如Altschul等(Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)所述利用GappedBLAST以获得用于比较目的的有空位的比对。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，使用各程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数，来获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。
同一性或相同表示氨基酸序列(或核酸序列)的相似性并且具有本领域认可的含义。具有同一性的序列共享相同或相似的氨基酸(或核酸)。因此，与参照序列共享85％氨基酸序列同一性的候选序列需要：在用参照序列比对候选序列之后，候选序列中85％的氨基酸与参照序列中的相应氨基酸相同，和/或构成保守氨基酸改变。
本文公开的多肽的功能活性变体保留了与原始的多肽或片段基本相同的功能活性。天然存在的功能活性变体，例如等位变体和物种变体，和非天然存在的功能活性变体，被包括在本发明中，并且能够通过例如诱变技术或通过直接合成生产。
功能活性变体或衍生物与本文公开的多肽有大约或至少例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多个氨基酸残基不同。当该比较需要比对时，就最大同源性比对序列。变异(variation)的位点能够存在于多肽中的任何地方，只要活性与本文公开的多肽基本相似。
在Bowie等，Science，247：1306-1310(1990)中提供了关于如何制备具有表型沉默的氨基酸替换的变体和衍生物的指导，其教导了有两种主要策略用于研究氨基酸序列对改变的耐受性。
第一种策略利用了通过进化期间的天然选择的氨基酸替换的耐受性。通过比较不同物种中的氨基酸序列，能够鉴定在物种间保守的氨基酸位置。见例如，图5。这些保守的氨基酸对于蛋白质功能可能是重要的。相反，其中的替换已经被天然选择耐受的氨基酸位置表明对于蛋白功质能不关键的位置。因此，耐受氨基酸替换的位置能够被修饰而仍保持多肽的特异性结合活性。
第二种策略使用遗传工程，以在克隆的基因的具体位置引入氨基酸改变，以鉴定对于蛋白质功能关键的区域。例如，能够使用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(在分子的每个残基引入单个丙氨酸突变)(Cunningham等，Science，244：1081-1085(1989))。
向蛋白质的氨基酸引入突变的方法是本领域技术人员公知的。见例如Ausubel(编)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Inc.(1994)；T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.(1989)。还能够使用可商购的试剂盒，例如“QuikChange.TM.定点诱变试剂盒”(Stratagene)引入突变。本领域技术人员能够通过取代不影响多肽功能的氨基酸，实现生成多肽的功能活性变体或多肽的衍生物。
变体或衍生物能够具有，例如，仍保留了至少一种生物学活性的一个或多个保守替换。保守替换是这样的替换，其中，氨基酸被替换为具有相似性质的另一氨基酸，使得肽化学领域的技术人员将预期多肽的二级结构和亲水性质基本不变。通常，下述氨基酸的组代表了保守改变：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。
特别的变体和衍生物的实例包括但不限于，包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽的功能活性变体和衍生物，例如，下述多肽，其包含Klotho的细胞外结构域(例如，SEQ ID NO：5或6)的至少大约100、150、200、250、300、350、375、400或425个连续氨基酸，且与野生型序列(如SEQ ID NO：5或6中公开的)具有不多于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多个氨基酸残基差异，同时保留了野生型多肽的至少一种生物学活性。例如，包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ IDNO：5或6的至少大约400个连续氨基酸，并且不多于大约100个氨基酸残基差异。例如，包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：5或6的至少大约400个连续氨基酸，并且不多于大约50个氨基酸残基差异。例如，包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：5或6的至少大约425个连续氨基酸，并且不多于大约25个氨基酸残基差异。例如，包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：5或6的至少大约425个连续氨基酸，并且不多于大约10个氨基酸残基差异。在另一实例中，包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：7的至少大约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、925、950或982个连续氨基酸，且与野生型序列不多于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80、85、90、95、100、110、120、140、150、160、170、180、190或200个氨基酸残基差异。例如，包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：7的至少大约500个连续氨基酸，并且不多于大约100个氨基酸残基差异。例如，包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：7的至少大约600个连续氨基酸，并且不多于大约100个氨基酸残基差异。例如，包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：7的至少大约700个连续氨基酸，并且不多于大约100个氨基酸残基差异。例如，包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：7的至少大约800个连续氨基酸，并且不多于大约100个氨基酸残基差异。例如，包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：7的至少大约900个连续氨基酸，并且不多于大约100个氨基酸残基差异。例如，包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：7的至少大约900个连续氨基酸，并且不多于大约50个氨基酸残基差异。
特别的变体和衍生物的实例包括但不限于，包含成纤维细胞生长因子的多肽的功能活性变体和衍生物，例如，下述多肽，其包含成纤维细胞生长因子(例如FGF19(SEQ ID NO：31)、FGF21(SEQ ID NO：33)或FGF23(SEQ ID NO：35))的至少大约100、125、150、150、175、200、225或250个连续氨基酸，且与野生型序列(如SEQ ID NO：31、33或35中公开的)不多于大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多个氨基酸残基差异，同时保留了野生型多肽的至少一种生物学活性。在多种实施方式中，变体或衍生物能够包含或不包含R179Q变异。例如，包含成纤维细胞生长因子的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：31、33或35的至少大约150个连续氨基酸，且不多于大约25个氨基酸残基差异。例如，包含成纤维细胞生长因子的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：31、33或35的至少大约175个连续氨基酸，且不多于大约25个氨基酸残基差异。例如，包含成纤维细胞生长因子的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：31、33或35的至少大约200个连续氨基酸，且不多于大约25个氨基酸残基差异。例如，包含成纤维细胞生长因子的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ IDNO：35的至少大约225个连续氨基酸，且不多于大约50个氨基酸残基差异。例如，包含成纤维细胞生长因子的多肽的功能活性变体或衍生物包含下述多肽，所述多肽包含SEQ ID NO：35的至少大约225个连续氨基酸，且不多于大约25个氨基酸残基差异。
4.3本文公开内容的融合多肽的表达
为表达本文公开内容的融合蛋白，通过本领域公知的技术，能够将通过任一本文描述的方法或本领域已知的方法获得的DNA分子插入合适的表达载体。例如，能够通过同聚物加尾或通过涉及使用合成DNA连接子的限制性酶或通过平末端连接将双链cDNA克隆进入合适的载体。通常使用DNA连接酶连接DNA分子，并且通过用碱性磷酸酶处理来避免不想要的联接。
因此，本文公开内容包括包含本文所述的核酸分子(例如，基因或编码基因的重组核酸分子)的载体(例如重组质粒和细菌噬菌体)。术语“重组载体”包括下述载体(例如，质粒、噬菌体、噬粒、病毒、黏粒、F黏粒，或其它经纯化的核酸载体)，所述载体已经被改变、修饰或工程化，从而使得其含有较之重组载体所源于的天然或自然核酸分子中包括的那些更多、更少或不同的核酸序列。例如，重组载体可包括与调控序列有效连接的编码Klotho-FGF23融合体的核苷酸序列，所述调控序列例如启动子序列、终止子序列和/或人工核糖体结合位点(RBS)，如本文所定义的。允许包括在其中的基因或核酸的表达的重组载体被称为“表达载体”。
对于真核宿主而言，取决于宿主的性质，可使用不同的转录和翻译调控序列。它们可源于病毒来源，例如腺病毒、牛乳头瘤病毒、类人猿病毒等，其中，调控信号与具有高表达水平的特别基因相关联。实例包括但不限于，疱疹病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母ga14基因启动子等等。可选择允许抑制或活化的转录起始调控信号，使得能够调节基因表达。
在本文所述的公开内容的一些分子中，具有编码融合多肽的一条或多条多肽链的核苷酸序列的一个或多个DNA分子与一条或多条调控序列有效连接，所述调控序列能将想要的DNA分子整合进宿主细胞。例如，通过引入允许选择含有表达载体的宿主细胞的一种或多种标志物，能够选择被引入的DNA分子已经稳定转化的细胞。可选择标志物基因能够与待表达的核酸序列直接连接，或者通过共转染引入相同的细胞。本文描述的蛋白质的最优合成还可能需要额外的元件。对本领域普通技术人员而言将要使用哪些额外元件是显而易见的。
选择特别的质粒或病毒载体的重要性因素包括但不限于：容易识别和从不含有载体的其它受体细胞选择含有载体的受体细胞；特别宿主中想要的载体的拷贝数；以及是否想要能够使载体在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”。
一旦载体被构建为包括用于表达的DNA序列，可通过本领域已知的多种合适方法中的一种或多种，将其引入合适的宿主细胞，所述方法包括但不限于，例如，转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等等。
宿主细胞可为原核的或真核的。真核宿主细胞的实例包括，例如，哺乳动物细胞，例如人、猴、小鼠和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。此类细胞协助蛋白质的翻译后修饰，包括，例如，正确折叠或糖基化。此外，也能够使用酵母细胞表达本文公开内容的融合多肽。与大多数哺乳动物细胞一样，酵母细胞也能够使得能对蛋白质进行翻译后修饰，包括例如，糖基化。存在多种重组DNA策略，其使用能够用于在酵母中生产蛋白质的强启动子序列和高拷贝数质粒。酵母转录和翻译机制能够识别克隆的哺乳动物基因产物上的引导子序列，由此使得能分泌具有引导子序列的肽(即，前肽)。高产量生产本文公开内容的融合多肽的特别的方法是通过在DHFR缺陷型CHO细胞中使用二氢叶酸还原酶(DHFR)扩增，这通过使用如美国专利No.4,889,803所述的连续增加的甲氨蝶呤水平来进行。获得的多肽可为糖基化形式的。
引入一种或多种载体之后，通常在选择性培养基中生长宿主细胞，所述培养基就含有载体的细胞的生长加以选择。能够通过任一本领域已知的或本文描述的方法纯化重组蛋白，例如，涉及萃取、沉淀、层析和电泳的任何传统方法。可用于纯化蛋白质的其他纯化方法是使用结合靶蛋白的单克隆抗体的亲和层析。通常，将含有重组蛋白质的粗糙制备物通过其上固定有合适单克隆抗体的柱。蛋白质通常经由特异性抗体结合到柱上，而杂质则通过柱。洗柱之后，例如通过改变pH或离子强度，从凝胶上洗脱蛋白质。
4.4用于评估融合蛋白质活性的测定
本文描述的测定(见实施例2)和本领域已知的测定能够用于检测本文公开内容的融合多肽的Klotho或FGF活性。合适的活性测定包括受体结合测定、细胞增殖测定和细胞信号传递测定。例如，可用于确定融合多肽是否具有Klotho或FGF活性的结合测定包括：测定融合多肽与FGF受体的结合。FGF受体结合测定包括但不限于：竞争性和非竞争性测定。例如，通过将表达FGF受体的细胞与经标记的FGF(例如放射性标记)接触并增加未经标记的Klotho-FGF融合多肽的浓度，能够检测FGF受体结合。将竞争与相同受体结合的两种配体添加至含有细胞的反应混合物中。随后洗涤细胞并测量经标记的FGF。存在未经标记的融合多肽时，对其受体的经标记的FGF的量的减少表明Klotho-FGF融合多肽与受体的结合。备选地，可标记Klotho-FGF融合多肽，并检测融合多肽与细胞的直接结合。
还能够通过测定融合多肽是否诱导细胞应答测量Klotho或FGF活性。例如，在一些实施方式中，用于检测Klotho-FGF融合多肽的生物学活性的测定涉及将表达FGF受体的细胞与融合多肽接触，测定细胞应答，比如，例如，细胞增殖或Egr-1活化，C2C12细胞中的肌管直径，以及比较存在和不存在融合多肽时的细胞应答。较之不存在融合多肽复合体，在存在融合多肽复合体时细胞应答的增加表明融合多肽具有生物学活性。此外，也能够测量作为生物学活性的标记的来自受体的下游信号传递事件(例如FGFR、FRS2、ERK1/2、p70S6K等等的磷酸化)的增加。
4.5药物组合物和治疗方法
本文公开内容还涉及药物组合物，其含有一种或多种本文公开内容的融合多肽以及可药用稀释剂或载剂。药物组合物还能够包括药物有效剂量的肝素。此类药物组合物可被包括进试剂盒或容器中。此类试剂盒或容器可与涉及融合多肽的延长的体内半寿期或体外保质期的说明书一起包装。任选地，此类试剂盒或容器还能够伴随有由管理药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的告知书，所述告知书反映了政府机构许可的对人施用的制造、使用或销售。此类组合物可用于通过向患者施用药物组合物在患者(优选是哺乳动物，最优选是人)中治疗、预防或改善疾病或疾病症状(例如年龄相关的病况或代谢病症)的方法中。
一般而言，本文公开内容的药物组合物的治疗有效量为从大约0.0001mg/kg至0.001mg/kg；0.001mg/kg至大约10mg/kg体重，或从大约0.02mg/kg至大约5mg/kg体重。通常，融合多肽的治疗有效量例如为从大约0.001mg至大约0.01mg，大约0.01mg至大约100mg，或从大约100mg至大约1000mg。优选地，融合多肽的治疗有效量为从大约0.001mg/kg至大约2mg/kg。
本领域普通技术人员可根据施用途径和想要的剂量来确定融合多肽的最优药物剂型。(见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，其全部公开内容都通过引用并入本文)。
本文公开内容的融合多肽可作为可为固体、液体或气体(气溶胶)形式的药物组合物来施用。典型的施药途径可包括但不限于：经口、局部、肠胃外、舌下、直肠、阴道、皮内或鼻内。肠胃外施药包括皮下注射、静脉内、肌内、腹膜内、胸膜内、胸骨内注射或输注技术。优选地，肠胃外施用组合物。更优选地，静脉内施用组合物。能够配制本文公开内容的药物组合物使得在向受试者施用组合物时，允许本文公开内容的多肽是生物可利用的。组合物能够采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂能够是单个剂量单位，而气溶胶形式的本文公开内容的多肽的容器能够容纳多个剂量单位。
用于制备药物组合物的材料以其使用的量而言能够是无毒的。本领域普通技术人员将明显知道，药物组合物中活性成分的最优剂量将取决于多个因素。相关因素包括但不限于，受试者类型(例如人)、受试者的整体健康、受试者需要治疗的年龄相关病况或代谢病症的类型、组合物作为多种药物方案的部分的用途、本文公开内容的多肽的特别形式、施药的方式以及使用的组合物。
可药用载剂或载体(vehicle)可为微粒，使得组合物例如是片剂或粉末的形式。载剂可为液体的，组合物例如是口服浆液或可注射液体。此外，载剂可为气态的，以提供在例如吸入施药中有用的气溶胶组合物。
术语“载剂”指用其施用本文公开内容的多肽的稀释剂、佐剂或赋形剂。此类药物载剂能够是液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的，例如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等那些。载剂能够是盐溶液、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、云母、角蛋白、胶体硅石、尿素等。此外，还能够使用辅助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一种实施方式中，施用给受试者时，本文公开内容的多肽和可药用载体是无菌的。当本文公开内容的多肽静脉内施用时，水是特别的载体。盐溶液和水性葡萄糖和甘油溶液也能够用为液体载剂，特别是用于可注射的溶液。合适的药物载剂也包括赋形剂，例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、云母、氯化钠、干脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要的话，本发明的组合物还能够含有少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。
组合物可意欲用于经口施用，如果这样的话，组合物优选是固体或液体形式的，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式也包括在本文认为是固体或液体的形式内。
作为用于经口施用的固体组合物，组合物能够被配制为粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、香口胶、干胶片等形式。此类固体组合物一般含有一种或多种惰性稀释剂。此外，能够存在下述物质中的一种或多种：粘合剂，例如乙基纤维素、羧甲基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂，例如淀粉、乳糖或糊精，崩解剂，例如褐藻酸、褐藻酸钠、Primogel、玉米淀粉等；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotex；助流剂，例如胶体二氧化硅；加甜剂，例如蔗糖或糖精，调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂，以及着色剂。
当药物组合物是胶囊的形式(例如明胶胶囊)时，其除了含有上述类型的材料之外，还能够含有液体载剂，例如聚乙二醇、环糊精或脂肪油。
药物组合物能够是液体的形式，例如酏剂、浆液、溶液、乳液或悬浮液。液体对于经口施用或通过注射递送是有用的。当意欲用于经口施用时，组合物能够含有加甜剂、防腐剂、染料/着色剂和香味增强剂中的一种或多种。在用于通过注射施用的组合物中，还能够包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
本文公开内容的液体组合物(无论它们是溶液、悬液或其它类似形式)还能够包括下述中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水，盐水溶液，优选地，生理盐水，Ringer’s溶液，等渗氯化钠，固定的油，例如能够用作溶剂或悬浮基质的合成的单甘油酯或二甘油酯，聚乙二醇，甘油，环糊精，丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。肠胃外组合物可被装入玻璃、塑料或其它材料制成的安瓿、可处理的注射器或多剂量管中。生理盐水是特别的具体的佐剂。可注射的组合物优选是无菌的。
药物组合物含有有效量的本文公开内容的化合物(例如融合多肽)，使得将获得合适的剂量。药物组合物可含有按照目前对它们各病症所处方的已知的有效量的化合物。
将在预防、治疗和/或管理年龄相关的病况或代谢病症中有效的、用于预防性和/或治疗性方案的本文公开内容的多肽的施用途径，能够基于针对本领域已知的其它治疗剂的目前处方的施用途径。本文公开内容的多肽能够通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注注射，通过经由上皮或黏膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠或肠道粘膜等等)的吸收。施药能够是全身的或局部的。多种递送系统是已知的，例如微颗粒、微胶囊、胶囊等等，并且它们可用于施用本文公开内容的多肽。可向受试者施用超过一种本文公开内容的多肽。施用方法可包括但不限于，经口施用和肠胃外施用；肠胃外施用包括但不限于，皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、舌下、鼻内、大脑内、心室内、鞘内、阴道内、透皮、直肠、通过吸入或者局部至耳、鼻、眼或皮肤。
本文公开内容的多肽可肠胃外施用。具体地，本文公开内容的多肽可静脉内施用。
还能够利用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及用气溶胶化剂配制，或者经由在碳氟或合成的肺部表面活性剂中灌注。本文公开内容的多肽还能够与传统粘合剂和载剂(例如甘油三酯)配制为栓剂。
本文公开内容的多肽能够在受控释放系统中递送。例如，能够使用泵(见Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.1987，14，201；Buchwald等，Surgery 1980，88：507；Saudek等，N.Engl.J.Med.1989，321：574)。还能够使用聚合材料，用于本文公开内容的多肽的受控释放(见MedicalApplications of Controlled Release，Langer和Wise(编)，CRC Pres.，BocaRaton，FL，1974；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen和Ball(编)，Wiley，New York，1984；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.1983，23，61；还见Levy等，Science 1985，228，190；During等，Ann.Neurol.，1989，25，351；Howard等，J.Neurosurg.，1989，71，105)。具体地，能够将受控释放系统放在本文公开内容的多肽的靶(例如脑)附近，从而仅需要全身剂量的一部分(见例如Goodson，in Medical Applications of Controlled Release，上述，第2卷，1984，第115页-138页)。能够使用Langer的综述(Science 1990，249，1527-1533)中讨论的其它受控释放系统。
用于实现本文公开内容的多肽的受控释放或持续释放的聚合材料被公开于例如，美国专利No.5,679,377；美国专利No.5,916,597；美国专利No.5,912,015；美国专利No.5,989,463；美国专利No.5,128,326；PCT公开No.WO 99/15154；和PCT公开No.WO 99/20253中。在持续释放剂型中使用的聚合物的实例包括但不限于聚(2-羟乙基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)，乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、丙交酯乙交酯共聚物(PLGA)和聚原酸酯。优选地，用于持续释放剂型中的聚合物是惰性的、不含可滤出的杂质、贮藏稳定、无菌并且可生物降解。
通常，本文公开内容的药物组合物的治疗有效量是从大约0.0001mg/kg至0.001mg/kg；0.001mg/kg至大约10mg/kg体重，或从大约0.02mg/kg至大约5mg/kg体重。
在其它实施方式中，预防性和/或治疗性方案涉及向患者施用一剂或多剂的有效量的本文公开内容的多肽，其中有效量的剂量达到本文公开内容的多肽至少0.01μg/mL至至少400μg/mL的血浆水平。
预防性和/或治疗性的方案可涉及向患者使用多次剂量的有效量的本文公开内容的多肽，其中所述多次剂量保持本文公开内容的多肽至少0.01μg/mL至400μg/mL的血浆水平。可施用预防性和/或治疗性方案至少1天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月或9个月。
预防性和/或治疗性方案可涉及组合施用本文公开内容的多肽和一种或多种额外的治疗剂。目前用于预防、治疗和/或管理年龄相关的病况或代谢病症的一种或多种治疗剂的推荐剂量能够从本领域的任何参考文献中获得，包括但不限于Hardman等编，Goodman & Gilman′s ThePharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics，第10版.，McGraw-Hill，New York，2001；Physician’s Desk Reference(第60版，2006)，其通过引用整体并入本文。
本文公开内容包括治疗病症的方法，其中，Klotho蛋白和FGF的激动活性是想要的。本文公开内容还包括公开的蛋白质、融合蛋白、核酸分子或药物组合物在疗法中的用途或作为用于治疗病理性病症的药剂的用途，其中，Klotho蛋白和FGF的激动活性是想要的。本文公开内容的此类方法的用途或实例包括但不限于年龄相关的病况或代谢病症。
本文公开内容包括在个体中治疗或预防年龄相关的病况的方法；以及本文公开的蛋白质、融合蛋白、核酸分子或药物组合物在疗法中的用途或作为用于在个体中治疗或预防年龄相关的疾病的药剂的用途。对需要治疗的个体施用药理有效剂量的、含有Klotho融合多肽的药物组合物以治疗或预防年龄相关的病况，所述融合多肽具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子以及(任选的)经修饰的Fc片段。在一些实施方式中，Klotho融合多肽与药理有效剂量的肝素共同施用。年龄相关的病况包括肌肉减少症、皮肤萎缩、肌消减、脑萎缩、动脉粥样硬化、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松、骨关节炎、免疫无活性、高血压、痴呆、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏症、白内障、年龄相关的黄斑变性、前列腺癌、中风、缩短的预期寿命、失忆、皱纹、受损的肾功能和年龄相关的听力损失。在一些实施方式中，Klotho融合多肽含有αKlotho蛋白的至少一个细胞外结构域。在特别的实施方式中，对需要针对肌消减的治疗的个体施用含有αKlotho蛋白的至少一个细胞外结构域和成纤维细胞生长因子23的Klotho融合蛋白。
本文公开内容还涉及在个体中治疗或预防代谢病症的方法；以及公开的蛋白质、融合蛋白、核酸分子或药物组合物在疗法中的用途或作为用于在个体中治疗或预防代谢病症的药剂的用途。对需要治疗的个体施用药理有效剂量的、含有Klotho融合多肽的药物组合物以治疗代谢病症，所述融合多肽具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子，以及(任选的)经修饰的、具有减少的与FcRn的结合和/或增加的血清半寿期和/或稳定性的Fc片段。在一些实施方式中，Klotho融合多肽与药理有效剂量的肝素共同施用。所述方法可用于对II型糖尿病、代谢综合征、高血糖和肥胖的治疗或预防中。在特别的实施方式中，对施用需要对代谢病症的治疗的个体施用含有β-KLotho蛋白的至少一个细胞外结构域和成纤维细胞生长因子21的Klotho融合蛋白。
本文公开内容还提供了在个体中治疗或预防高磷酸盐血或钙质沉着症的方法；以及公开的蛋白质、融合蛋白、核酸分子或药物组合物在疗法中的用途或作为用于在个体中治疗或预防高磷酸盐血或钙质沉着症的药剂的用途。对需要治疗的个体施用药理有效剂量的、含有Klotho融合多肽的药物组合物以治疗高磷酸盐血或钙质沉着症，所述融合多肽具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域、成纤维细胞生长因子以及(任选的)经修饰的Fc片段。在一些实施方式中，Klotho融合多肽与药理有效剂量的肝素共同施用。在特别的实施方式中，对需要对高磷酸盐血或钙质沉着症的治疗的个体施用含有αKlotho蛋白的至少一个细胞外结构域和成纤维细胞生长因子23和(任选的)经修饰的Fc片段的Klotho融合蛋白。
本文公开内容还涉及在个体中治疗或预防慢性肾病或慢性肾衰竭的方法；以及公开的蛋白质、融合蛋白、核酸分子或药物组合物在疗法中的用途或作为用于在个体中治疗或预防慢性肾病或慢性肾衰竭的药剂的用途。对需要治疗的个体施用药理有效剂量的、含有Klotho融合多肽的药物组合物以治疗慢性肾病或慢性肾衰竭，所述融合多肽具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域、成纤维细胞生长因子以及(任选的)经修饰的Fc片段。在一些实施方式中，Klotho融合多肽与药理有效剂量的肝素共同施用。在一些实施方式中，对需要对慢性肾病或慢性肾衰竭的治疗的个体施用含有αKlotho蛋白的至少一个细胞外结构域的Klotho融合蛋白。
本文公开内容还包括在个体中治疗或预防癌症的方法；以及公开的蛋白质、融合蛋白、核酸分子或药物组合物在疗法中的用途或作为用于在个体中治疗或预防癌症的药剂的用途。对需要治疗的个体施用药理有效剂量的、含有Klotho融合多肽的药物组合物以治疗癌症，所述多肽具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域、成纤维细胞生长因子以及(任选的)经修饰的Fc片段。所述方法可用于治疗或预防乳腺癌。在一些实施方式中，Klotho融合多肽与药理有效剂量的肝素共同施用。在一些实施方式中，对需要对癌症的治疗的个体施用含有αKlotho蛋白的至少一个细胞外结构域的Klotho融合蛋白。
在通过施用含有Klotho融合多肽的药物组合物治疗病症的方法中；或者当在疗法中使用含有Klotho融合多肽的药物组合物时，Klotho融合多肽和(任选的)经修饰的Fc片段具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域和成纤维细胞生长因子。在特别的实施方式中，Klotho融合蛋白含有βKlotho蛋白的至少一个细胞外结构域和成纤维细胞生长因子21。
在另一实施方式中，融合体包含FGF(例如FGF19、FGF21、FGF23或FGF23变体)和具有减少的对FcRn的结合和/或增加的血清稳定性的经修饰的Fc片段。该类型的融合体能够用于如上文所述的多种疾病，或用于治疗或预防本领域已知的任一FGF相关的疾病。能够对有需要的个体施用融合体。
能够根据本领域技术人员已知的和本文所述的任一施用方法施用融合多肽组合物。特别的具体的施用方法包括皮下或静脉内。本文还描述了其它有效的施用模式。
4.6治疗方法和用于评估效力的测定
提供了将本文描述的融合多肽施用给个体的本文公开内容的方法或用途能够用于治疗多种病症，包括年龄相关的病症或代谢病症。不被任何特别理论限定的情况下，融合多肽可用于治疗其中有Klotho或FGF功能障碍的病症。病症的实例包括代谢病症和年龄相关的病症。例如，FGF23或Klotho敲除的小鼠均展示出多种相似表型，包括低的身体活动、生长延迟、肌消减、皮肤萎缩、动脉粥样硬化、短寿等等(见Razzaque和Lanske，J.of Endrocrinology，194：1-10(2007)，其通过引用并入本文)。
特别地，本文公开内容的融合多肽在治疗衰老相关的病症，包括肌消减中是特别有用的。在不与理论结合的情况下，Klotho和FGF23控制矿物质(例如磷酸盐和钙)和维生素D内稳态的能力可能是这些蛋白调节衰老和肌萎缩的方式。
另一方面，本文公开内容的融合多肽可用于治疗代谢病症。例如，已经显示出β-Klotho和FGF19通过调控胆固醇7-α-羟化酶(CYP7A1)控制胆酸内稳态。胆汁内稳态病症的非限制性实例是胆汁郁积。已显示出β-Klotho和FGF21在脂肪细胞中诱导脂解，并且因此降低脂肪贮藏并增加葡萄糖摄取。脂解/脂肪贮藏病症的非限制性实例是肥胖和相关联的代谢疾病和心血管疾病。
至少部分基于FGF23能刺激尿中磷酸盐排出以及由此降低血清中的磷酸盐水平这一发现，本发明的Klotho-FGF23融合多肽能够用于在个体中治疗或预防高磷酸盐血或钙质沉着症。例如，已经显示，导致患者中Klotho缺陷的Klotho中的纯合错义突变能够导致严重的肿瘤样钙质沉着和动脉钙化(Ichikawa等，J.Clin.Invest.117：2684-2691(2007)，其通过引用并入本文)。对个体施用药理有效剂量的、含有Klotho融合多肽的药物组合物以治疗或预防高磷酸盐血或钙质沉着症，所述融合多肽具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域、成纤维细胞生长因子和(任选的)经修饰的Fc片段。特别地，含有αKlotho蛋白的至少一个细胞外结构域、成纤维细胞生长因子和(任选的)经修饰的Fc片段的Klotho融合多肽对于治疗高磷酸盐血或钙质沉着症是有用的。
本文公开内容的Klotho融合多肽还能够用于在个体中治疗或预防慢性肾病或慢性肾衰竭。例如，已经显示出，较之未受影响的肾，在具有慢性肾衰竭的患者的肾中Klotho表达被降低(Koh等，Biochem.Biophys.Res.Comm.280：1015-1020(2001)，其通过引用并入本文)。对个体施用药理有效剂量的、含有Klotho融合多肽的药物组合物以治疗或预防慢性肾病或慢性肾衰竭，所述融合多肽具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域、成纤维细胞生长因子和(任选的)经修饰的Fc片段。特别地，含有αKlotho蛋白的至少一个细胞外结构域的Klotho融合多肽对于治疗慢性肾病或慢性肾衰竭是有用的。
本文公开内容的Klotho融合多肽还能够用于在个体中治疗或预防癌症。例如，已经显示，较之普通乳腺癌组织，在乳腺癌组织中Klotho表达被降低(Wolf等，Oncogene(2008)提前在线发表，其通过引用并入本文)。对个体施用药理有效剂量的、含有Klotho融合多肽的药物组合物以治疗或预防癌症或乳腺癌，所述融合多肽具有Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域、成纤维细胞生长因子和(任选的)经修饰的Fc片段。特别地，含有αKlotho蛋白的至少一个细胞外结构域的Klotho融合多肽对于治疗癌症或乳腺癌是有用的。
用于评价效力和/或测定本文公开内容的Klotho融合多肽对年龄相关病症或代谢病症的有效剂量的方法包括，基于生物体的测定，例如，使用哺乳动物(例如小鼠、大鼠、灵长动物或一些其它非人类)或者其它动物(例如爪蟾、斑马鱼或无脊椎动物，例如苍蝇或线虫)。可将Klotho融合多肽一次性或者作为方案(规律或非规律)施用给生物。然后对生物的参数加以评价，例如，年龄相关联的参数。目标Klotho融合多肽导致参数相对于参照(例如对照生物的参数)的改变。也能够评价其它参数(例如，关于毒性、清除率和药物代谢动力学)。
可使用具有特别病症(例如本文所述的病症，例如年龄相关的病症、代谢病症)的动物评价本文公开内容的Klotho融合多肽。这些病症还能够提供敏化系统，其中能够观测测试多肽对生理的作用。病症的实例包括：去神经，失用性萎缩；代谢病症(例如肥胖和/或糖尿病动物的病症，例如db/db小鼠和ob/ob小鼠)；脑、肝缺血；顺铂/紫杉醇/长春新碱模型；多种组织(异种移植)移植物；转基因骨模型；疼痛综合征(包括炎性和神经性病症)；百草枯，遗传毒性和氧化胁迫模型；以及肿瘤I模型。
为测量年龄相关的病症，动物模型能够是当卡路里受限时具有改变的表型的动物。例如，F344大鼠提供了用于评价Klotho融合多肽的有用的测定系统。当卡路里受限时，F344大鼠具有0至10％的肾病发生率。但是，当被自由(ad libitum)喂饲时，它们具有60至100％的肾病发生率。
为评价本文公开内容的Klotho融合多肽，将其施用给动物(例如，F344大鼠或其它合适的动物)，并且例如在一段时间后评估动物的参数。能够对动物自由或正常喂饲(例如，不在卡路里受限的条件下，虽然能够在此类条件下评价一些参数)。一般地，此类动物的同龄组用于测定。通常，如果测试多肽以朝向受卡路里限制的相似动物的表型方向影响了参数，则能够指示测试多肽有利地改变了动物中的寿命调控。此类测试多肽可导致卡路里限制的至少一些寿命调控作用(例如此类作用的亚群)而不必剥夺生物的卡路里摄入。
待测试的参数可为年龄相关联的或疾病相关联的参数，例如，与动物模型相关联的疾病的症状。例如，能够对SH大鼠施用测试多肽，并监测血压。被指示为有利的测试多肽能够导致较之未用多肽处理的相似参照动物的症状改善。与病症或衰老相关的其它参数能够包括：抗氧化剂水平(例如抗氧化酶水平或活性)、胁迫抗性(例如百草枯抗性)、核心体温、葡萄糖水平、胰岛素水平、促甲状腺激素水平、催乳素水平和黄体化激素水平。
为测量本文公开内容的多肽对于治疗年龄相关病症的有效性，可使用具有减少的Klotho表达的动物，例如，具有突变体Klotho的小鼠；见Kuroo，等Nature，390；45(1997)和美国公开No.2003/0119910，两者都通过引用以其整体并入本文。例如，对突变体小鼠施用测试多肽并监测年龄相关的参数。被指示为有利的测试多肽能够导致较之未经多肽处理的相似参照动物的症状改善。能够通过测量体重、检查繁殖能力的获得、测量血糖水平、观测寿命、观测皮肤、观测运动功能(例如行走)等评估与代谢病症或衰老相关的参数。还能够通过测量胸腺重量、观测胸腔内表面上形成的钙化结节的大小等评估。此外，对Klotho基因或Klotho蛋白的mRNA的定量测定对于评估也是有用的。
还有一些其它体内模型和生物测定包括评价动物代谢参数，所述参数例如与胰岛素病症，II型糖尿病相关的参数。代谢参数的实例包括：葡萄糖浓度、胰岛素浓度和胰岛素敏感性。
另一系统实例以肿瘤为特征，例如在动物模型中。肿瘤能够是自发的或被诱导的。例如，肿瘤可从具有多种遗传构成的细胞发展而来，例如，它们能够是p53+或p53-。还能够使用自身免疫病症的生物，例如对SLE易感的NZB小鼠。为评价骨疾病的特征，例如能够使用经卵巢切除术的动物作为模型，例如，用于骨质疏松。相似地，对于关节疾病，模型能够基于佐剂性关节炎(例如以可用软骨蛋白聚糖、高迁移率组的蛋白质、链球菌细胞壁物质或胶原免疫小鼠)；对于肾的疾病，能够使用kd/kd小鼠。关于认知(特别是学习和记忆)的动物模型也是可获得的。糖尿病及其并发症的动物模型也是可获得的，例如链脲佐菌素模型。能够使用犬科动物模型，例如用于评价中风和缺血。
在评估测试多肽是否能改变寿命调控时，能够监测或评价多种年龄关联的参数或生物标志物。年龄关联的参数的实例包括：(i)细胞或生物的寿命；(ii)具有生物年龄依赖性表达模式的基因转录本或基因产物在细胞或生物中的存在或丰度；(iii)细胞或生物对胁迫的抗性；(iv)细胞或生物的一种或多种代谢参数(参数的实例包括循环的胰岛素水平、血糖水平；脂肪含量；核心体温等等)；(v)生物中存在的细胞或细胞群的增殖能力；以及(vi)细胞或生物的外表或行为。
术语“平均寿命”指生物的同龄组死亡的平均年龄。在一些情况下，使用处于受控的环境条件下遗传相同的生物的同龄组来评估“平均寿命”。由于灾祸导致的死亡不计入。在受控环境条件下无法测定平均寿命的情况下(例如对于人来说)，能够使用针对足够大的群体的可靠统计信息(例如来自精算表)作为平均寿命。
对两种此类生物(例如，一种参照生物，以及一种用Klotho融合多肽处理的生物)之间分子差异的表征能够揭示生物生理状态的差异。一般地参照生物和经处理的生物是相同实足年龄的。术语“实足年龄”在本文中使用时表示从预先选定的事件(例如受孕，规定的胚胎或胎儿阶段，或者更优选地，出生)开始经历的时间。能够使用多种标准确定就比较分析而言生物是否为“相同”实足年龄。一般地，要求的精确程度是野生型生物的平均寿命的函数。例如，对于在一些受控条件下实验室野生型株系N2生存至平均大约16天的线虫秀丽隐杆线虫而言，相同龄的生物可生存了相同的天数。对于小鼠而言，相同龄的生物可生存了相同的周数或月数；对于灵长动物或人而言，相同的年数(或者在2、3或5年内)；等等。通常，相同实足龄的生物可生存了该物种的野生型生物平均寿命的15、10、5、3、2或1％的时间量。优选地，生物是成年生物，例如，生物至少已生存了平均野生型生物已成熟至能够繁殖的年龄的时间量。
在生物展示出明显的衰老身体特征之前，能够进行生物筛选测定。例如，生物可为已生存了相同物种野生型生物平均寿命的仅10、30、40、50、60或70％的成年生物。已经报道了代谢、免疫能力和染色体结构的年龄关联的改变。能够在测试受试者(例如对于基于生物的测定)中，或对患者，评价任一这些改变(例如在用本文描述的治疗剂治疗之前、期间或之后)。
还能够在筛选测定的受试者生物(或被处理的受试者)中评价与卡路里限制相关联的标志物。虽然这些标志物可能并非年龄相关联的，但它们可能是当KLotho途径被调节时改变的生理状态的指示。标志物能够是其丰度在卡路里受限的动物中有所改变的mRNA或蛋白质。WO01/12851和美国专利No.6,406,853描述了标志物实例。源于本文描述的动物的细胞或与本文描述的动物模型类似的细胞模型能够用于基于细胞的测定。
用于评价测试多肽对肌萎缩的作用的模型包括：1)去神经导致的大鼠内侧腓肠肌肌质量损失，例如通过切断大腿中部右侧坐骨神经；2)固定导致的大鼠内侧腓肠肌肌质量损失，例如通过将右踝关节固定为90度弯曲；3)后肢悬挂导致的大鼠内侧腓肠肌肌质量损失；(见例如U.S.2003-0129686)；4)用恶病质细胞因子、白介素-1(IL-1)处理导致的骨骼肌萎缩(R.N.Cooney，S.R.Kimball，T.C.Vary，Shock 7，1-16(1997))；和5)用糖皮质激素、地塞米松处理导致的骨骼肌萎缩(A.L.Goldberg，J.Biol.Chem.244，3223-9(1969))。
AMD的动物模型实例包括：模拟渗出性(湿)黄斑变性的激光诱导的小鼠模型Bora等，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.，100：2679-84(2003)；表达导致与AMD的“地图状萎缩(geographic atrophy)”形式相关联的特征的组织蛋白酶D的突变形式的转基因小鼠(Rakoczy等，Am.J.Pathol.，161：1515-24(2002))；以及在视网膜色素上皮细胞中过表达VEGF导致CNV的转基因小鼠。Schwesinger等，Am.J.Pathol.158：1161-72(2001)。
帕金森氏病的动物模型实例包括：通过用多巴胺能神经毒素1-甲基-4苯基1，2，36-四氢吡啶(MPTP)处理造成的帕金森病的灵长动物(见例如美国专利公开No.20030055231和Wichmann等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，991：199-213(2003))；6-羟基多巴胺-伤害的大鼠(例如Lab.Anim.Sci.，49：363-71(1999))；以及转基因无脊椎动物模型(例如Lakso等，J.Neurochem.86：165-72(2003)和Link，Mech.Ageing Dev.，122：1639-49(2001))。
II型糖尿病的分子模型实例包括：具有缺陷的Nkx-2.2或Nkx-6.1的转基因小鼠(美国专利No.6,127,598)；Zucker糖尿病肥胖fa/fa(ZDF)大鼠。(美国专利No.6,569,832)和自发发展出肥胖以及随后常进展为显性2型糖尿病(overt type 2diabetes)的恒河猴(Hotta等，Diabetes，50：1126-33(2001))；以及具有显性失活的IGF-1受体(KR-IGF-IR)的转基因小鼠，其具有2型糖尿病样的胰岛素抵抗。
神经病的动物和细胞模型实例包括：小鼠(美国专利No.5,420,112)或兔(Ogawa等，Neurotoxicology，21：501-11(2000))中长春新碱诱导的感官运动神经病；用于研究自主神经病的链脲佐菌素(STZ)-糖尿病大鼠(Schmidt等，Am.J.Pathol.，163：21-8(2003))；和进行性运动神经病(pmn)小鼠(Martin等，Genomics，75：9-16(2001))。
高磷酸盐血或肿瘤样钙质沉着症的动物模型实例包括Klotho敲除小鼠和FGF23敲除小鼠(Yoshida等，Endocrinology 143：683-689(2002))。
慢性肾病或慢性肾衰竭的动物模型实例包括COL4A3+/-小鼠(Beirowski等，J.Am.Soc.Nephrol.17：1986-1994(2006))。
癌症的动物模型实例包括如本领域中已知地(Giovanella等，Adv.Cancer Res.44：69-120(1985))向裸鼠中移植或植入癌细胞或组织。例如，乳腺癌的动物模型包括移植或植入乳腺癌细胞或组织的裸鼠(例如Yue等，Cancer Res.54：5092-5095(1994)；Glinsky等，Cancer Res.56：5319-5324(1996)；Visonneau Am.J.Path.152：1299-1311(1998))。
能够对受试者，例如成年受试者，特别是健康的成年受试者或者具有年龄相关的疾病的受试者施用组合物。在后者的情况下，所述方法能够包括评价受试者，例如，以表征年龄相关疾病的症状或其它疾病标志物，以及由此鉴定受试者具有神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏症或年龄相关的疾病)或者对此类疾病易感。
骨骼肌萎缩
提供向个体施用Klotho融合多肽的本文公开内容的方法或用途能够用于治疗骨骼肌萎缩。肌萎缩包括大量的神经肌肉、代谢、免疫和神经病症和疾病以及饥饿、营养缺陷、代谢胁迫、糖尿病、衰老、肌营养不良或肌病。肌萎缩在衰老过程中发生。肌萎缩也源于肌的降低的使用或失用。症状包括骨骼肌组织质量的下降。在人类男性中，肌质量在50至80岁间下降三分之一。肌萎缩的一些分子特征包括泛素连接酶的上调以及肌原纤维蛋白的损失(Furuno等，J.Biol.Chem.，265：8550-8557，1990)。例如，通过测量3-甲基-组氨酸的生产能够跟踪这些蛋白质的分解，所述3-甲基-组氨酸是肌动蛋白的特异性组分，并且在某些肌中是肌球蛋白的特异性组分(Goodman，Biochem.J.241：121-12，1987和Lowell，等，Metabolism，35：1121-112，1986；Stein和Schluter，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.272：E688-E696，1997)。肌酸激酶(细胞损害标志物)的释放(Jackson，等，Neurology，41：101104，1991)也能够是指示性的。
非胰岛素依赖型糖尿病
提供向个体施用Klotho融合多肽的本文公开内容的方法或用途能够用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病。非胰岛素依赖型糖尿病也被称为“成人发病型”糖尿病和2型糖尿病。2型糖尿病也包括“非肥胖型2型”和“肥胖型2型”。II型糖尿病能够通过下述表征(1)降低的胰腺-β-胰岛-细胞的胰岛素分泌，使得生产的胰岛素少于保持血糖水平平衡的必需量，和/或(2)“胰岛素抵抗”，其中身体无法正常应答胰岛素(美国专利No.5,266,561和美国专利No.6,518,069)。例如，一般地，葡萄糖刺激的胰岛素水平无法升至4.0nmol/L以上(美国专利No.5,266,561)。II型糖尿病的症状实例包括：禁食时高血糖(美国专利No.5,266,561)；疲劳；烦渴；尿频；视觉模糊；以及增加的感染率。II型糖尿病的分子指示包括胰腺中的胰岛淀粉样蛋白沉积。
神经病
神经病能够包括由全身性疾病、遗传病况或毒性试剂导致的中枢和/或外周神经功能障碍，其影响运动、感官、感觉运动和自主神经(见例如美国专利申请No.20030013771)。症状能够取决于神经损害的原因和受影响的神经的特别类型而不同。例如，运动神经病的症状包括进行身体任务时笨拙，或肌虚弱、少量体力运动后筋疲力尽、站立或行走困难以及神经肌肉反射减弱或不存在(美国专利申请No.20030013771)。自主神经病的症状包括便秘，心律不齐以及姿势性低血压反射的减弱(美国专利申请No.20030013771)。感官神经病的症状包括疼痛和麻木；手、腿或足的刺痛感；以及对接触极度敏感，而视网膜病的症状包括视觉模糊、突然失去视觉、黑点和闪光。
阿尔茨海默氏症
提供向个体施用Klotho融合多肽的本文公开内容的方法或用途能够用于治疗阿尔茨海默氏症(AD)。阿尔茨海默氏症是复杂的神经退行性疾病，其导致神经元的不可逆损失。仅提供了也是年龄相关的病况的神经退行性疾病的一个实例。阿尔茨海默氏症的临床标志包括记忆、判断、对身体周围的定向和语言的进行性受损。AD的神经病理性标志包括区域特异性神经元损失、淀粉样斑块和神经原纤维缠结。淀粉样斑块是含有淀粉样肽(也称为Ap或Ap42)的细胞外斑块，所述淀粉样肽是8个淀粉样前体蛋白质的切割产物(也称为APP)。神经原纤维缠结是不可溶的细胞内聚集物，其由不正常地过度磷酸化的微管相关蛋白的细丝构成，绷紧的淀粉样斑块和神经原纤维缠结可造成导致通过凋亡的神经元损失的二级事件(Clark和Karlawish，Ann.Intern.Med.138(5)：400-410(2003))。例如，在培养的神经元中，p-淀粉样蛋白诱导半胱天冬酶-2-依赖性的凋亡(Troy等J Neurosci.20(4)：1386-1392)。体内斑块沉积能够以相似方式诱发邻近神经元的凋亡。
有多种标准，包括遗传学的、生物化学的、生理学的和认知标准，能够用于评价受试者中的AD。AD的症状和诊断是执业医师已知的。AD症状和标志物的一些实例示于下文。关于这些指示和已知与AD相关联的其它指示的信息能够用作为“AD相关参数”。AD相关参数能够包括定性或定量信息。定量信息的实例是一种或多种度量的数值，例如，蛋白质的浓度或X射线断层扫描图。定性信息能够包括评估，例如医师意见或二元(“是”/“否”)等等。AD相关的参数包括指示受试者未被诊断为AD或者不具有AD的特定指示的信息，例如，并非典型AD的认知测试结果或者与AD无关的遗传性APOE多态性。
进行性认知受损是AD的标志。这种受损能够表现为记忆、判断、做决定、对身体周围的定向以及语言的下降(Nussbaum和Ellis，New Eng J.Med.348(14)：1356 35 1364(2003))。排除痴呆的其它形式能够辅助作出AD诊断。神经元死亡导致AD患者中进行性脑萎缩。能够使用成像技术(例如核磁共振成像或计算机辅助的X射线断层术)，来检测脑中的AD相关联的伤害和/或脑萎缩。
AD患者可展示出疾病的病理导致的生物化学异常。例如，AD患者中，脑脊髓液中的tan蛋白水平升高(Andreasen，N.等Arch Neurol.58：349-350(2001))。
能够降低AD患者的CSF中淀粉样β42(A，B42)肽的水平。能够增加Ap42在AD患者血浆中的水平(Ertekein-Taner，N.，等Science 290：23032304(2000))。检测来自受试者的样品中生物化学异常的技术包括本领域已知的细胞、免疫和其它生物方法。关于一般性指导，见例如Sambrook &Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold SpringHarbor Laboratory，N.Y.(2001)，Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1989)，(Harrow，E.和Lane，D.(1988)Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)及其更新的版本中描述的技术。
例如，能够使用抗体、其它免疫球蛋白和其它特异性结合配体来检验与AD相关的生物分子，例如蛋白质或其它抗原。例如能够使用一种或多种特异性抗体探测样品。多种形式是可能的，例如ELISA、基于荧光的测定、Western印迹杂交和蛋白质阵列。在本领域中，例如De Wildt等(2000).Nature Biotech.18，989-994；Lucking等(1999).Anal.Biochem.270，103-111；Ge，H.(2000).Nucleic Acids Res.28，e3，I-VII；MacBeath，G.，和Schreiber，S.L.(2000).Science 289，1760至1763；和WO 99/5 1 773A1中描述了生产多肽阵列的方法。
在一种测定中，使用AD的非人动物模型(例如小鼠模型)，例如为评价多肽或治疗方案。例如，美国专利No.6,509,515描述了一种此类模型动物，其天然能用于学习和记忆测试。动物在脑组织中以使得动物在从出生之后的短时期内(通常从出生开始一年内，优选出生开始2至6个月内)发展出进行性死亡统计的病症的水平，表达淀粉样前体蛋白(APP)序列。在胚胎阶段，优选地，一细胞或受精卵母细胞的阶段，通常不晚于大约8细胞的阶段，将APP蛋白序列引入动物或动物的祖先。然后在作为代孕雌性的假孕者中将受精卵或胚胎发育至足孕。将淀粉样前体蛋白基因引入动物胚胎使得以下述状态掺入染色体，所述状态导致淀粉样前体蛋白的超级内源表达，以及在脑的皮层-边缘区域发展进行性死亡统计的疾病，所述区域是在进行性死亡统计疾病状态(例如AD)中被显著影响的脑的区域。在受影响的转基因动物中，神经胶质增生和临床表现模建死亡统计的疾病。神经疾病的进行型方面通过减少的探索和/或运动行为以及减少的脱氧葡糖摄取/利用以及脑的皮层-边缘区域中过度生长的神经胶质增生来表征。此外，观察到的改变与在一些衰老动物中观察到的相似。其它一些动物模型也被描述于US 5,387,742；5,877,399；6,358,752和6,187,992中。
帕金森氏病
提供向个体施用Klotho融合多肽的本文公开内容的方法或用途能够用于治疗帕金森氏病。帕金森氏病包括在黑质中多巴胺能神经元的神经退行性变，这导致调控运动功能的黑质纹状体多巴胺系统退行性变。该病理进而导致运动功能障碍(见例如，和Lotharius等，Nat.Rev.Neurosci.，3：932-42(2002))。运动症状的实例包括：运动不能(akinesia)、驼背姿势(stooped posture)、步态困难、姿势不稳、僵住(catalepsy)、肌僵硬和震颤。非运动症状的实例包括抑郁、缺乏动力、被动、痴呆和胃肠道功能障碍(见例如Fahn，Ann.N.Y.Acad.Sci.，991：1-14(2003)和Pfeiffer，Lancet Neurol.，2：107-16(2003))。在65至69岁的人中，已在百分之0.5至1的人中观察到帕金森氏病，并且在80岁和更老的人中，有百分之1至3(见例如，Nussbaum等，N.Engl.J.Med.，348：1356-64(2003))。帕金森氏病的分子标志物包括芳香族L氨基酸脱羧酶(AADC)的降低(见例如美国申请No.20020172664)；以及黑质纹状体神经元中多巴胺含量的损失(见例如Fahn，Ann.N.Y.Acad.Sci.，991：1-14(2003)和Lotharius等，Nat.Rev.Neurosci.，3：932-42(2002))。在一些家族病例中，PD与编码α-突触核蛋白和帕金蛋白(E3泛素连接酶)蛋白的单个基因中的突变相关(例如Riess等，J.Neurol.250Suppl 1：I3 10(2003)和Nussbaum等，N.Engl.J.Med.，348：1356-64(2003))。神经元特异性C-末端泛素水解酶基因中的错义突变也与帕金森氏病关联(例如，Nussbaum等，N.Engl.J.Med.，348：1356-64(2003))。
亨廷顿氏病
提供向个体施用Klotho融合多肽的本文公开内容的方法或用途能够用于治疗亨廷顿氏病。用于评价Klotho融合多肽对亨廷顿氏病的效力和/或测定其有效剂量的方法包括基于生物的测定，例如使用哺乳动物(例如小鼠、大鼠、灵长动物或一些其它非人类)或者其它动物(例如爪蟾、斑马鱼或无脊椎动物，例如苍蝇或线虫)。可获得亨廷顿氏病的多种动物模型系统。见例如Brouillet，Functional Neurology 15(4)：239-251(2000)；Ona等Nature 399：263-267(1999)，Bates等Hum Mol Genet.6(10)：1633-7(1997)；Hansson等J.of Neurochemistry 78：694-703；和Rubinsztein，D.C.，Trends in Genetics，第1S卷，No.4，第202-209页(关于HD的多种动物和非人模型的综述)。
此类动物模型的实例是转基因小鼠株系是R6/2品系(Mangiarini等Cell 87：493-506(1996))。R6/2小鼠是转基因的亨廷顿氏病小鼠，其过表达人HD基因的外显子1(在内源启动子控制下)。R6/2人HD基因的外显子1具有扩展的CAG/聚谷氨酰胺重复长度(平均150个CAG重复)。这些小鼠发展出具有人亨廷顿氏病的很多特征的进行性的、最终是致死性的神经疾病。在R6/2小鼠中观察到部分由亨廷顿蛋白(由HD外显子1编码)的N末端部分组成的异常聚集物，在细胞质和细胞核中均观察到45个(Davies等Cell 90：537-548(1997))。例如，转基因动物中的人亨廷顿蛋白是由包括至少55个CAG重复并且更优选地大约150个CAG重复的基因编码的。这些转基因动物能够发展出亨廷顿氏病样的表型。
这些转基因小鼠由降低的体重增加、降低的寿命以及表征为异常步态、静止时颤抖、后肢抱握的运动损伤和从出生后8至10周的活动过度表征(例如R6/2株系；见Mangiarini等Cell 87：493-506(1996))。表型朝运动机能减退的方向进行性恶化。这些转基因小鼠的脑也展示出神经化学异常和组织学异常，例如，神经递质受体(谷氨酸盐，多巴胺能的)的改变、减少的N-乙酰天冬氨酸(神经元完整性的标志物)浓度以及降低的纹状体和脑尺寸。因此，评价能够包括评估与神经递质水平、神经递质受体水平、脑尺寸和纹状体尺寸相关的参数。此外，这些动物的脑组织中存在含有人亨廷顿蛋白的转基因部分或全长的异常聚集物(例如，R6/2转基因小鼠株系)。见例如Mangiarini等Cell 87：493-506(1996)，Davies等Cell 90：537-548(1997)，Brouillet，Functional Neurology 15(4)：239-251(2000)和Cha等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：6480-6485(1998)。
为在动物模型中测试本申请中描述的测试多肽或已知多肽的作用，例如通过将测试多肽注射进动物循环中，对转基因动物施用不同浓度的测试多肽。可在动物中评价亨廷顿氏病样症状。然后监测亨廷顿氏病样症状(例如，如对于小鼠模型的上述那样)的进展以确定用测试多肽的处理是否导致症状的降低或延缓。在另一测定中，监测这些动物中亨廷顿蛋白聚集物的解聚。然后能够处死动物，获得脑切片。然后就含有转基因人亨廷顿蛋白、其部分或包含人亨廷顿蛋白或其部分的融合蛋白的聚集物的存在分析脑切片。该分析能够包括，例如，用抗亨廷顿蛋白抗体对脑组织切片染色，并添加识别抗亨廷顿蛋白的抗体的缀合有FITC的第二抗体(例如抗亨廷顿蛋白的抗体是小鼠抗人抗体，第二抗体是人抗体特异性的)，并通过荧光显微镜显示蛋白质聚集物。
可获得多种方法，来评价和/或监测亨廷顿氏病。已知该病的多种临床症状和标记。亨廷顿氏病导致运动失调、精神困难和认知改变。这些症状的程度、发病年龄和表现能够有所不同。运动失调能够包括被称为舞蹈症的快速、随机、舞蹈样的运动。
运动评价的实例包括：眼追踪(ocular pursuit)、眼急动启动(saccadeinitiation)、眼急动速度(saccade velocity)、构音困难、舌突出(tongueprotrusion)、指敲击能力(finger tap ability)、俯卧/仰卧、依序握拳-伸手-翻掌(a lo fist-hand-palm sequence)、手臂僵硬、运动徐缓、最大张力障碍(躯干、上下肢)、最大舞蹈症(例如躯干、面部、上下肢)、步态、踵趾行走(tandem walking)和后退步态。治疗实例能够导致总运动分数4(TMS-4)(UHDRS的分量表)在例如一年期间的改变。
癌症
提供向个体施用Klotho融合多肽的本文公开内容的方法或用途能够用于治疗癌症。癌症包括由不正常高水平的细胞分化、不正常低水平的凋亡或二者所导致的或导致不正常高水平的细胞分化、不正常低水平的凋亡或二者的任何疾病。癌症的实例包括但不限于：白血病(例如急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性成粒细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性骨髓单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病、非霍奇金氏病)、Waldenstrom′s巨球蛋白血症、重链病以及实体瘤，例如肉瘤和癌(例如纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、nile duct carcinoma、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、魏尔姆瘤(Wilm′s tumor)、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜膜细胞瘤)。淋巴细胞增生性病症也被认为是增殖性疾病。
本文中提到的所有专利、专利申请和公开的参考文献都通过引用整体并如本文。虽然本文公开内容是参照其实施方式特别显示和描述的，但是本领域技术人员应当理解，其中形式和细节上可进行多种改变，而不会偏离所附权利要求所包括的本文公开内容的范围。
5.实施例
实施例1Klotho融合多肽的表达和纯化
Klotho融合多肽的表达
通过用编码具有αKlotho的细胞外结构域和FGF23(R179Q)变体的Klotho融合多肽的表达载体瞬时转染HEK293T细胞制备本文公开内容的多肽。通过Klotho、FGF23和Klotho-FGF23(R179Q)融合蛋白的各自的表达质粒的瞬时转染，生成含有表达的多肽的条件培养基。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Cat#11668-019)，在6孔板中进行转染。转染后5小时，用3ml DMEM加1％FBS取代转染混合物。在添加3mlDMEM加1％FBS之后72小时，收集条件培养基。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离来自多种经瞬时转染的HEK293T细胞的条件培养基的样品，并通过Western印迹杂交(图3A)进行分析，或者用考马斯蓝染色(图3B)。
对多种样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(第1道：对照；第2道：FGF23；第3道，sKlotho；第4-6道，sKlotho-FGF23)。考马斯蓝染色揭示了高的，＞180kDa条带的表达(图3B，如右边箭头指示的)，其在含有未用编码Klotho融合多肽的载体转染的样品的第1-3道中不存在。通过Western印迹杂交评价分泌进培养基的Klotho融合多肽的品质(图3A)。使用抗-FGF23大鼠单克隆IgG2A(R&D Systems，Cat#MAB26291)作为第一抗体以通过Western印迹杂交检测Klotho融合多肽。Western印迹杂交验证了在经考马斯染色的凝胶中观察到的额外条带是Klotho融合多肽。Western印迹杂交验证了Klotho融合多肽具有Klotho融合多肽预期的分子量。该分析显示了Klotho-FGF23(R179Q)融合蛋白的表达。
Klotho融合多肽的纯化
从用编码具有Klotho的细胞外结构域和FGF23R179Q变体的Klotho融合多肽的表达载体瞬时转染的HEK293T细胞的培养物的条件培养基中，纯化本文公开内容的多肽。为生成条件培养基，转染编码sKlotho-FGF23-6xHis的表达载体(18ml OptiMEM 1(GIBCO，Cat#11058)中的500μg DNA与18ml 2μg/ml polyethlinimine(PEI)混合，进入在表达培养基中悬浮生长的HEK293细胞)(在Freestype 293表达培养基(GIBCO，Cat#12338)中的106个细胞/ml的464ml HEK293T细胞)。转染之后，允许培养物生长(120小时；37℃，于5％CO2培养箱中；125rpm下振荡)。在孵育结束时，通过离心(1000rpm进行5分钟)收获条件培养基。然后将条件培养基应用到镍-琼脂糖柱上。sKlotho-FGF23-6xHis与柱紧密结合并用50mM咪唑进行洗脱。然后将得到的经纯化的物质在PBS中透析，以移除咪唑。通过SDS-PAGE分离经纯化的sKlotho-FGF23-6xHis的样品(第1道，经纯化的sKlotho-FGF23-6xHis；第2道，分子量标志物)，并通过用考马斯蓝染色分析(图3C)。经染色的SDS-PAGE凝胶验证，经纯化的sKlotho-FGF23-6xHis具有预期的分子量。在装载经纯化的物质的道中，无法检测到对应于并非全长sKlotho-FGF23-6xHis的蛋白质的条带也显示sKlotho-FGF23-6xHis被纯化。
实施例2：评估Klotho融合多肽活性的体外测定
Egr-1-荧光素酶
在Egr-1-荧光素酶报道基因测定中，测试表达的Klotho融合多肽的生物学活性。Klotho融合多肽与FGF23受体的结合导致Egr-1的下游活化以及由Egr-1启动子调控的荧光素酶报道基因的表达。Egr-1-荧光素酶报道基因是基于Urakawa等(Nature，2006，第444卷，770-774)所报道的来构建的。用Egr-1-荧光素酶报道基因以及转染标准化报道基因(Renilla荧光素酶)一起转染48孔聚D-赖氨酸板中接种的HEK293T细胞。Egr-1荧光素酶报道基因转染之后五小时，用3ml DMEM加1％FBS取代转染混合物。添加3ml DMEM加1％FBS之后72小时，收集条件培养基。五小时后，用待测活性的样品取代转染混合物。在初始的实验中，在Egr-1-荧光素酶报道基因测定中，在存在或不存在20μg/ml肝素(Sigma，Cat#H8537；作为2mg/ml贮液溶解于DMEM中)的情况下，测试50％条件培养基(仅有培养基，或含有Klotho、FGF23、Klotho和FGF23，以及Klotho-FGF23(R179Q)融合蛋白)和具有1％FBS的50％DMEM(图4)。进一步的实验使用确定的量的经纯化的多肽(图5A和5B)。20小时后在被动裂解缓冲液(Promega，Cat#E194A)中裂解细胞，并使用Dual-Glo荧光素酶测定系统(Promega，Cat#E2940)测定荧光素酶活性。
在初始的实验中，在未经分级的条件培养基中展示Klotho融合多肽活性。使用Egr-1-荧光素酶报道基因(图4)，这些实验对荧光素酶报道基因的表达的倍数改变加以定量。含有FGF23和Klotho蛋白的细胞外结构域的组合的条件培养基活化了Egr-1-荧光素酶，仅含有FGF23的条件培养基或仅含有Klotho的细胞外结构域的条件培养基没有活化Egr-1-荧光素酶。含有融合蛋白sKlotho-FGF23(R179Q)的条件培养基活化了Egr-1-荧光素酶报道基因，这与仅含有FGF23或Klotho的条件培养基相反。在这些实验中，含有融合蛋白sKlotho-FGF23(R179Q)的条件培养基对Egr-1-荧光素酶报道基因的活化显著好于含有FGF23和Klotho的组合的条件培养基。在存在肝素时，由含有融合蛋白sKlotho-FGF23(R179Q)的条件培养基和含有FGF23和Klotho的组合的条件培养基的诱导显著增强。表1列出了条件培养基中多种FGF-Klotho融合多肽的相对表达，以及在Egr-1-荧光素酶报道基因测定中对应于多种FGF-Klotho融合多肽的未经分级的条件培养基的相对活性。
表1sKlotho-FGF23融合变体的表达和活性
Figure BDA00001944139900741
＊缺少活性可能是低表达的结果。
使用确定的量的、使用实施例1中描述的纯化方法纯化自条件培养基的蛋白质进行Egr-1-荧光素酶报道基因测定。与之前使用含有表达的多肽的未经分级的条件培养基的结果一致，用经纯化的FGF23和sKlotho的组合的处理导致荧光素酶报道基因活性，但仅用经纯化的FGF23处理则不导致活性(图5A)。来自经纯化的FGF23和sKLotho的组合的荧光素酶报道基因活性还依赖于经纯化的sKlotho的剂量，并且该作用可通过肝素(20μg/ml)的存在增强。在Egr-1-荧光素酶报道基因测定中，可在低至大约1.21nM(1.2倍改变)和至少多至大约19.3nM(2.4倍改变)的浓度下检测sKlotho-FGF23-6xHis融合多肽对荧光素酶活性的作用(图5B)。在存在肝素(20μg/ml)时，sKlotho-FGF23-6xHis融合多肽的活性对荧光素酶活性显著增强。在存在肝素时，可在低至大约0.6nM的浓度下检测到sKlotho-FGF23-6xHis融合多肽对荧光素酶活性的作用(2.0倍改变)。结果显示，经纯化的sKlotho-FGF23-6xHis以剂量依赖性方式诱导了EGR-1-luc报道基因，并且显示了用sKlotho-FGF23-6xHis进行的处理。
实施例3评估Klotho融合多肽对肌细胞的作用的体外测定
对C2C12成肌细胞测试表达的Klotho融合多肽的生物学作用。用IGF-1、FGF2或sKlotho-FGF23处理C2C12成肌细胞导致肌管生长和信号传递蛋白的磷酸化。将C2C12成肌细胞以40,000个细胞/孔的密度接种于6孔的聚-D-赖氨酸和纤连蛋白涂布的板中的生长培养基中(3份DMEM和1份F12)、10％FBS、1％Glut；1％P/S；1％亚油酸；0.1％ITS：[胰岛素(10mg/ml)、转铁蛋白(5.5mg/ml)和硒(5ng/ml)]。成肌细胞达到汇合后(3天)，将培养基换为分化培养基(DMED，具有2％马血清；1％Glut；1％P/S)。
对于肌管直径实验，汇合培养基换为分化培养基之后三天，在不存在或存在地塞米松(100μM)的情况下，在分化培养基中用IGF-1(10nM)、FGF2(20ng/ml)或sKlotho-FGF23(20nM)处理细胞24小时。在处理结束时，用戊二醛(PBS中5％)固定细胞，并且收集多张荧光图像。使用Pipeline Pilot程序测量肌管直径，以确定过度生长或萎缩。
对于信号传递蛋白磷酸化实验，汇合培养基换为分化培养基之后三天，用没有FBS的DMEM使细胞饥饿四小时，然后在不存在或存在雷帕霉素(40nM)的情况下，用IGF-1(10nM)、FGF2(20ng/ml)或sKlotho-FGF23(20nM)处理30分钟。在存在蛋白酶和磷酸酶抑制剂的情况下，在RIPA缓冲液中裂解细胞。进行Western印迹杂交分析并用图中示出的不同抗体来探测膜，并在X射线胶片上显影，胶片被扫描。
该研究的结果显示，sKlotho-FGF23导致肌管直径较之对照增加，并且诱导了与IGF-1和FGF2的结果相似的C2C12肌管过度生长(图5A)。此外，基于肌管直径测量，用sKlotho-FGF23、IGF-1和FGF2进行处理能够部分逆转地塞米松诱导的肌管萎缩。在不存在或存在地塞米松时，在肌管形态学上，未观察到sKlotho-FGF23和FGF2之间的差异(通过微管厚度测量的)。sKlotho-FGF23、IGF-1和FGF2的营养作用是统计学显著的。
与对C2C12肌管的作用一致，在C2C12肌管中，sKlotho-FGF23融合蛋白信号传递导致p70S6K和ERK而非AKT或FoxO的磷酸化(图5B)。sKlotho-FGF23对信号传递的作用与FGF2对信号传递的作用相似，但是与IGF-1对信号传递的作用不同。观察到通过sKlotho-FGF23的ERK磷酸化的程度小于通过IGF-1或FGF2的ERK磷酸化的程度。通过sKlotho-FGF23的p70S6K的磷酸化是雷帕霉素敏感性的。在涉及C2C12细胞的实验中，无需肝素来活化信号传递。这些结果显示，sKlotho-FGF23融合多肽活化了C2C12肌管中的信号传递。
实施例4包含sKlotho、FGF23和FcLALA的融合多肽
使用sKlotho、FGF23和抗体的经修饰的Fc片段构建多种融合多肽。这些经修饰的Fc分子具有改变的(减少的)与FcRn的结合，并且由此具有增加的血清半寿期。它们还具有改性的生物可利用性以及向粘膜表面和体内其它靶的改变的运送。在此实例中，FGF23和sKlotho融合至FcLALA，这在美国专利No.7,217,798和Hessell等2007Nature449：101-104中描述过。在这些融合多肽的多种组分之间介入的是连接子，如Lode等1998Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2475-2480中所述。这些融合体被插入构建体，例如pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并被表达于HEK293细胞中。
A.sKlotho-FGF23-FcLALA v1
构建融合体，其包含：sKlotho、连接子、FGF23、另一连接子和FcLALA。该实施方式被命名为sKlotho-FGF23-FcLALA v1，示于下文的SEQ ID NO：46和47中。
sKlotho-FGF23-FcLALA v1的核苷酸序列(其中起始ATG作为1)示为SEQ ID NO：46。
sKlotho-FGF23-FcLALA v1的氨基酸序列在下文中示为SEQ ID NO：47。
在该序列中，融合体的多种组分如下所示：
sKlotho：1-982；连接子1：983-1001；FGF23：1002-1228；连接子2；1229-1233；FcLALA：1234-1459。
B.sKlotho-FGF23-FcLALA v2
构建融合体，其包含：sKlotho、连接子、FGF23、另一连接子和FcLALA。该实施方式被命名为sKlotho-FGF23-FcLALA v2，示于下文的SEQ ID NO：48和49中。
sKlotho-FGF23-FcLALA v2的核苷酸序列(其中起始ATG作为1)示为SEQ ID NO：48。
sKlotho-FGF23-FcLALA v2的氨基酸序列在下文中示为SEQ ID NO：49。
在该序列中，融合体的多种组分如下所示：
sKlotho：(aa或氨基酸)1-982；连接子1：983-1001；FGF23：1002-1228；连接子2；1229-1233；FcLALA：1234-1450。
如本文所述或如本领域已知的那样，能够通过以多种组合来组合FGF、Klotho、经修饰的Fc片段和(任选地)连接子序列及其变体和其衍生物构建其它融合多肽。
实施例5包含FGF23和FcLALA的融合多肽
如美国专利No.7,217,798所述，使用FGF23和抗体的经修饰的Fc片段来构建多种融合多肽。这些经修饰的Fc分子具有改变的(减少的)与FcRn的结合，并且由此具有增加的血清半寿期。它们还具有经改性的生物可利用性以及向粘膜表面和体内其它靶的改变的运送。在此实例中，FGF23融合至FcLALA。在这些融合多肽的多种组分之间介入的是连接子，如Lode等1998Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：2475-2480所述。这些融合体被插入构建体，例如pcDNA3.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，并被表达于HEK293细胞中。
C.FGF23-FcLALA v1
构建融合体，其包含：FGF23、连接子和FcLALA。此构建体被命名为FGF23-FcLALA v1，并在下文中示为SEQ ID NO：50和51。
FGF23-FcLALA v1的核苷酸序列(其中起始ATG作为1)在下文中示为SEQ ID NO：50。
FGF23(R179Q)-FcLALA v1的氨基酸序列在下文中示为SEQ ID NO：51。
在该序列中，融合体的多种组分如下所示：
FGF23：(aa)1-251；连接子：252-256；FcLALA：257-482。
D.FGF23-FcLALA v2
构建融合体，其包含：FGF23-FcLALA v2，其包含FGF23和FcLALA。
FGF23-FcLALA v2的核苷酸序列(其中起始ATG作为1)在下文示为SEQ ID NO：52。
FGF23(R179Q)-FcLALA v2的氨基酸序列在下文中示为SEQ ID NO：53。
在该序列中，融合体的多种组分如下所示：
FGF23：1-251；连接子：252-256；FcLALA：257-473。
如本文所述或如本领域已知的那样，能够通过以多种组合来组合FGF序列、经修饰的Fc片段和(任选地)连接子，及其变体和其衍生物构建其它融合多肽。
E.测定了通过sKlotho-FGF23(R179Q)-FcLALA融合蛋白的Egr-1-luc报道基因的活化；通过FGF23(R179Q)-FcLALA蛋白的Egr-1-luc报道基因的活化；以及FGF23(R179Q)对FGF23(R179Q)-FcLaLav2的药物代谢动力学谱。
图7显示了通过sKlotho-FGF23(R179Q)-FcLALA融合蛋白的Egr-1-luc报道基因的活化。用Egr-1-luc报道基因瞬时转染HEK293T细胞，并用指示的条件培养基在不存在或存在20μg/ml肝素的情况下孵育细胞。然后18小时后测定荧光素酶活性。结果显示，sklotho-FGF23-FcLALA融合蛋白诱导了报道基因活性。在存在肝素时这些诱导显著增强。sKF-Fcv1：sKlotho-FGF23-FcLALAv1；sKF-Fcv2：sKlotho-FGF23-FcLALAv2
图8显示了通过FGF23(R179Q)-FcLALA蛋白的Egr-1-luc报道基因的活化。用Egr-1-luc报道基因与Klotho的全长跨膜形式一起瞬时转染HEK293T细胞，并用指示的30％条件培养基孵育细胞。然后18小时后测定荧光素酶活性。结果显示，FGF23-FcLALA融合蛋白以与FGF23相似的方式诱导了报道基因活性。
图9显示了FGF23(R179Q)对FGF23(R179Q)-FcLALAv2的药物代谢动力学谱。用FGF23(R179Q)-6xHis或FGF23(R179Q)-FcLALAv2以2mg/kg对每组四只小鼠进行皮下注射。在指示的时间，收集血清样品，并通过ELISA分析FGF23。血清中的FGF23(R179Q)-FcLALA浓度在24小时的时间点保持升高，而FGF23(R179Q)-6xHis则回到基础水平。该结果表明，添加FcLALA，FGF23(R179Q)的体内半寿期显著提高。
实施例6在地塞米松诱导的肌萎缩之后sKlotho-FGF23融合体在增强肌生长中的体内效力
实验数据显示，地塞米松诱导的肌萎缩之后，sKlotho-FGF23的肌内注射显著增强了肌质量的生长。在此实验中，使用了对应于SEQ ID NO：41的肽。
图10显示了腓肠肌-比目鱼肌-跖肌(GSP)肌肉的绝对重量(A)和百分比重量改变(B)，显示地塞米松诱导的肌萎缩之后，较之肌内注射sKlotho(sKLO)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)而言，sKlotho-FGF23(KLOFGF)的肌内注射显著增强了肌质量的再生长。
将八只15周龄雄性C57BL/6小鼠按照体重随机分入8组，每组10只小鼠。四组获得没有DEX的水(W21d)，而另外四组以2.4mg/kg/天获得饮用水中的DEX(D21d)达三周。三周后，停止DEX处理，并立即处死一个W21d组和一个D21d组，以建立DEX处理诱导的肌萎缩程度。允许剩余的三组W21d或D21d小鼠恢复另外14天(R14d)，在此期间它们分别获得2x50μl PBS、sKlotho-FGF23(KLOFGF；1.6mg/ml)或sKlotho(sKLO；1.6mg/ml)的肌内注射，每隔一天注射至右侧腓肠肌-比目鱼肌-跖肌肌肉复合体内。最后一次肌内注射后24小时，处死小鼠，测定肌重量，并表达为绝对重量(A)或较之W21d+PBS组的百分比改变。
这些数据显示了地塞米松诱导的肌萎缩之后sKlotho-FGF23融合体在增强肌生长中的体内效力。
实施例7融合蛋白的FGF23部分中的额外突变，所述突变降低了聚集、降低了不想要的蛋白酶诱导的切割并且增加了生产。
研究了在sKlotho-FGF23和FGF23-FcLaLa融合多肽的FGF23部分内的若干突变。这些包括Q156、C206和C244(其中数字基于FGF23氨基酸序列)。各突变的实例包括Q156A、C206S和C244S，并且在任何这些位点中的突变能够与在R179的突变(例如R179Q)组合。在图2的SEQID NO：54至68中提供序列实例。
怀疑C206和C244涉及二聚化；而Q156是由发明人鉴定为蛋白酶敏感位点的位点。将这些氨基酸突变为任何其它氨基酸增强了蛋白质的品质，这是通过降低聚集、降低不想要的蛋白酶诱导的切割以及增加细胞的蛋白质生产来实现的，并且没有干扰FGF23活性。这是出人意料的结果，因为这三个位点在人、恒河猴、牛、小鼠和大鼠中发现的FGF23蛋白中是保守的。这种保守显示于下文与SEQ ID NO：69、70、71、72和73之间的比较中，Q156、C206和C244采用粗体下划线字体。
hFGF23        MLGARLRLWVCALCSVCSMSVLRAYPNASPLLGSSWGGLIHLYTATARNSYHLQIHKNGH
恒河猴        MLGARLRLWVCALCSVCSMSVIRAYPNASPLLGSSWGGLIHLYTATARNSYHLQIHKNGH
牛            MLGARLGLWVCTLSCV-----VQAYPNSSPLLGSSWGGLTHLYTATARNSYHLQIHGDGH
小鼠          MLGTCLRLLVGVLCTVCSLGTARAYPDTSPLLGSNWGSLTHLYTATARTSYHLQIHRDGH
大鼠          MLGACLRLLVGALCTVCSLGTARAYSDTSPLLGSNWGSLTHLYTATARNSYHLQIHRDGH
hFGF23        VDGAPHQTIYSALMIRSEDAGFVVITGVMSRRYLCMDFRGNIFGSHYFDPENCRFQHQTL
恒河猴        VDGAPHQTIYSALMIRSEDAGFVVITGVMSRRYLCMDFRGNIFGSHYFNPENCRFRHWTL
牛            VDGSPQQTVYSALMIRSEDAGFVVITGVMSRRYLCMDFTGNIFGSHHFSPESCRFRQRTL
小鼠          VDGTPHQTIYSALMITSEDAGSVVITGAMTRRFLCMDLHGNIFGSLHFSPENCKFRQWTL
大鼠          VDGTPHQTIYSALMITSEDAGSVVIIGAMTRRFLCMDLRGNIFGSYHFSPENCRFRQWTL
hFGF23        ENGYDVYHSPQYHFLVSLGRAKRAFLPGMNPPPYS
Figure BDA00001944139900811
FLSRRNEIPLIHFNTPI-PRRHTR
恒河猴        ENGYDVYHSPQHHFLVSLGRAKRAFLPGMNPPPYS
Figure BDA00001944139900812
FLSRRNEIPLIHFNTPR-PRRHTR
牛            ENGYDVYHSPQHRFLVSLGRAKRAFLPGTNPPPYA
Figure BDA00001944139900813
FLSRRNEIPLPHFAATARPRRHTR
小鼠          ENGYDVYLSQKHHYLVSLGRAKRIFQPGTNPPPFS
Figure BDA00001944139900814
FLARRNEVPLLHFYTVR-PRRHTR
大鼠          ENGYDVYLSPKHHYLVSLGRSKRIFQPGTNPPPFS
Figure BDA00001944139900815
FLARRNEVPLLHFYTAR-PRRHTR
hFGF23        SAEDDSERDPLNVLKPRARMTPAPAS
Figure BDA00001944139900816
SQELPSAEDNSPMASDPLGVVRGGRVNTHAGGT
恒河猴        SAEDDSERDPLNVLKPRARMTPAPASSQELPSAEDNSPVASDPLGVVRGGRVNTHAGGT
牛            SAHDSG--DPLSVLKPRARATPVPAA
Figure BDA00001944139900818
SQELPSAEDSGPAASDPLGVLRGHRLDVRAGSA
小鼠          SAEDPPERDPLNVLKPRPRATPVPVS
Figure BDA00001944139900819
SRELPSAEEGGPAASDPLGVLRRGRGDARGGAG
大鼠          SAEDPPERDPLNVLKPRPRATPIPVS
Figure BDA000019441399008110
SRELPSAEEGGPAASDPLGVLRRGRGDARRGAG
hFGF23        GPEG
Figure BDA000019441399008111
RPFAKFI(SEQ ID NO：69)
恒河猴        GPEA
Figure BDA000019441399008112
RPFPKFI(SEQ ID NO：70)
牛            GAER
Figure BDA000019441399008113
RPFPGFA(SEQ ID NO：71)
小鼠          GADR
Figure BDA000019441399008114
RPFPRFV(SEQ ID NO：72)
大鼠          GTDR
Figure BDA000019441399008115
RPFPRFV(SEQ ID NO：73)
图11中显示了这三种突变不妨碍FGF23活性的事实。该图显示了通过FGF23(R179Q)-FcLALA和Q156A、C206S、C244S和C206S/C244S突变体的Egr-1-luc报道基因的活化。
用EGR-1-luc报道基因与Klotho的全长跨膜形式和指示的FGF23-FcLaLa突变体一起瞬时转染HEK293T细胞。然后18小时后测定荧光素酶活性。结果显示，C206S、C244S、C206S/C244S(三个独立克隆)和Q156A(三个独立克隆)突变体在活化EGR-1-Luc报道基因活性中，与FGF23-FcLALA融合蛋白同等有效。
图12中显示的数据显示，突变C244和C206改变了FGF23的二聚化和聚集。该图显示了FGF23(R179Q)-FcLaLa的WT、Q156A、C206S、C244S和C206S/C244S突变体的蛋白质品质。使用FGF23抗体，通过Western印迹杂交分析来自用指示的FGF23-FcLaLa表达载体瞬时转染的HEK293T细胞的条件培养基。结果显示，C206S/244S突变阻止了蛋白质二聚化并且Q156A突变具有降低的蛋白水解片段。
因此，令人吃惊地，虽然这些Q156、C206和C244残基在物种间保守，它们也能够被突变，而不会降低FGF23活性，并且能够通过降低聚集和切割以及通过提高生产增强蛋白质的品质。
除非另有定义，本文中使用的技术和科学术语具有与熟悉本文公开内容所属领域的专家通常所理解的相同的含义。
除非另有指示，没有详细地具体描述的所有方法、步骤、技术和操作能够并且已经按照本身已知的方式进行，这将是技术人员所清楚的。再次例如，可参考本文提到的标准手册和一般背景技术以及其中提到的其它参考文献。
本发明的权利要求是非限制性的，并且提供于下文中。
虽然本文中已经详细公开了特定的实施方式和权利要求，但这仅是出于阐述的目的以举例方式来进行的，这不旨在对所附权利要求的范围或任何相应的未来申请的权利要求主题的范围加以限制。特别地，发明人考虑可对本文公开内容进行多种替换、变化和改良，而不偏离如权利要求所定义的本文公开内容的宗旨和范围。相信对核酸起始材料或目的克隆的选择是本领域普通技术人员在知晓本文描述的实施方式的基础上能常规进行的。其它方面、优点和改良被认为在下述权利要求的范围内。在今后提交的相应申请中重写权利要求的范围可能是由于多个国家专利法的限制，而不应当被理解为放弃权利要求的主题。
序列表(图2)
人Klotho核酸序列(NM_004795)(SEQ ID NO：1)
编码蛋白质区域：9-3047
   1 cgcgcagcat gcccgccagc gccccgccgc gccgcccgcg gccgccgccgccgtcgctgt
  61 cgctgctgct ggtgctgctg ggcctgggcg gccgccgcct gcgtgcggagccgggcgacg
 121 gcgcgcagac ctgggcccgt ttctcgcggc ctcctgcccc cgaggccgcgggcctcttcc
 181 agggcacctt ccccgacggc ttcctctggg ccgtgggcag cgccgcctaccagaccgagg
 241 gcggctggca gcagcacggc aagggtgcgt ccatctggga tacgttcacccaccaccccc
 301 tggcaccccc gggagactcc cggaacgcca gtctgccgtt gggcgccccgtcgccgctgc
 361 agcccgccac cggggacgta gccagcgaca gctacaacaa cgtcttccgcgacacggagg
 421 cgctgcgcga gctcggggtc actcactacc gcttctccat ctcgtgggcgcgagtgctcc
 481 ccaatggcag cgcgggcgtc cccaaccgcg aggggctgcg ctactaccggcgcctgctgg
 541 agcggctgcg ggagctgggc gtgcagcccg tggtcaccct gtaccactgggacctgcccc
 601 agcgcctgca ggacgcctac ggcggctggg ccaaccgcgc cctggccgaccacttcaggg
 661 attacgcgga gctctgcttc cgccacttcg gcggtcaggt caagtactggatcaccatcg
 721 acaaccccta cgtggtggcc tggcacggct acgccaccgg gcgcctggcccccggcatcc
 781 ggggcagccc gcggctcggg tacctggtgg cgcacaacct cctcctggctcatgccaaag
 841 tctggcatct ctacaatact tctttccgtc ccactcaggg aggtcaggtgtccattgccc
 901 taagctctca ctggatcaat cctcgaagaa tgaccgacca cagcatcaaagaatgtcaaa
 961 aatctctgga ctttgtacta ggttggtttg ccaaacccgt atttattgatggtgactatc
1021 ccgagagcat gaagaataac ctttcatcta ttctgcctga ttttactgaatctgagaaaa
1081 agttcatcaa aggaactgct gacttttttg ctctttgctt tggacccaccttgagttttc
1141 aacttttgga ccctcacatg aagttccgcc aattggaatc tcccaacctgaggcaactgc
1201 tttcctggat tgaccttgaa tttaaccatc ctcaaatatt tattgtggaaaatggctggt
1261 ttgtctcagg gaccaccaag agagatgatg ccaaatatat gtattacctcaaaaagttca
1321 tcatggaaac cttaaaagcc atcaagctgg atggggtgga tgtcatcgggtataccgcat
1381 ggtccctcat ggatggtttc gagtggcaca gaggttacag catcaggcgtggactcttct
1441 atgttgactt tctaagccag gacaagatgt tgttgccaaa gtcttcagccttgttctacc
1501 aaaagctgat agagaaaaat ggcttccctc ctttacctga aaatcagcccctagaaggga
1561 catttccctg tgactttgct tggggagttg ttgacaacta cattcaagtagataccactc
1621 tgtctcagtt taccgacctg aatgtttacc tgtgggatgt ccaccacagtaaaaggctta
1681 ttaaagtgga tggggttgtg accaagaaga ggaaatccta ctgtgttgactttgctgcca
1741 tccagcccca gatcgcttta ctccaggaaa tgcacgttac acattttcgcttctccctgg
1801 actgggccct gattctccct ctgggtaacc agtcccaggt gaaccacaccatcctgcagt
1861 actatcgctg catggccagc gagcttgtcc gtgtcaacat caccccagtggtggccctgt
1921 ggcagcctat ggccccgaac caaggactgc cgcgcctcct ggccaggcagggcgcctggg
1981 agaaccccta cactgccctg gcctttgcag agtatgcccg actgtgctttcaagagctcg
2041 gccatcacgt caagctttgg ataacgatga atgagccgta tacaaggaatatgacataca
2101 gtgctggcca caaccttctg aaggcccatg ccctggcttg gcatgtgtacaatgaaaagt
2161 ttaggcatgc tcagaatggg aaaatatcca tagccttgca ggctgattggatagaacctg
2221 cctgcccttt ctcccaaaag gacaaagagg tggccgagag agttttggaatttgacattg
2281 gctggctggc tgagcccatt ttcggctctg gagattatcc atgggtgatgagggactggc
2341 tgaaccaaag aaacaatttt cttcttcctt atttcactga agatgaaaaaaagctaatcc
2401 agggtacctt tgactttttg gctttaagcc attataccac catccttgtagactcagaaa
2461 aagaagatcc aataaaatac aatgattacc tagaagtgca agaaatgaccgacatcacgt
2521 ggctcaactc ccccagtcag gtggcggtag tgccctgggg gttgcgcaaagtgctgaact
2581 ggctgaagtt caagtacgga gacctcccca tgtacataat atccaacggaatcgatgacg
2641 ggctgcatgc tgaggacgac cagctgaggg tgtattatat gcagaattacataaacgaag
2701 ctctcaaagc ccacatactg gatggtatca atctttgcgg atactttgcttattcgttta
2761 acgaccgcac agctccgagg tttggcctct atcgttatgc tgcagatcagtttgagccca
2821 aggcatccat gaaacattac aggaaaatta ttgacagcaa tggtttcccgggcccagaaa
2881 ctctggaaag attttgtcca gaagaattca ccgtgtgtac tgagtgcagtttttttcaca
2941 cccgaaagtc tttactggct ttcatagctt ttctattttt tgcttctattatttctctct
3001 cccttatatt ttactactcg aagaaaggca gaagaagtta caaatagttctgaacatttt
3061 tctattcatt cattttgaaa taattatgca gacacatcag ctgttaaccatttgcacctc
3121 taagtgttgt gaaactgtaa atttcataca tttgacttct agaaaacatttttgtggctt
3181 atgacagagg ttttgaaatg ggcataggtg atcgtaaaat attgaataatgcgaatagtg
3241 cctgaatttg ttctcttttt gggtgattaa aaaactgaca ggcactataatttctgtaac
3301 acactaacaa aagcatgaaa aataggaacc acaccaatgc aacatttgtgcagaaatttg
3361 aatgacaaga ttaggaatat tttcttctgc acccacttct aaatttaatgtttttctgga
3421 agtagtaatt gcaagagttc gaatagaaag ttatgtacca agtaaccatttctcagctgc
3481 cataataatg cctagtggct tcccctctgt caaatctagt ttcctatggaaaagaagatg
3541 gcagatacag gagagacgac agagggtcct aggctggaat gttcctttcgaaagcaatgc
3601 ttctatcaaa tactagtatt aatttatgta tctggttaat gacatacttggagagcaaat
3661 tatggaaatg tgtattttat atgatttttg aggtcctgtc taaaccctgtgtccctgagg
3721 gatctgtctc actggcatct tgttgagggc cttgcacata ggaaacttttgataagtatc
3781 tgcggaaaaa caaacatgaa tcctgtgata ttgggctctt caggaagcataaagcaattg
3841 tgaaatacag tataccgcag tggctctagg tggaggaaag gaggaaaaagtgcttattat
3901 gtgcaacatt atgattaatc tgattataca ccatttttga gcagatcttggaatgaatga
3961 catgaccttt ccctagagaa taaggatgaa ataatcactc attctatgaacagtgacact
4021 actttctatt ctttagctgt actgtaattt ctttgagttg atagttttacaaattcttaa
4081 taggttcaaa agcaatctgg tctgaataac actggatttg tttctgtgatctctgaggtc
4141 tattttatgt ttttgctgct acttctgtgg aagtagcttt gaactagttttactttgaac
4201 tttcacgctg aaacatgcta gtgatatcta gaaagggcta attaggtctcatcctttaat
4261 gccccttaaa taagtcttgc tgattttcag acagggaagt ctctctattacactggagct
4321 gttttataga taagtcaata ttgtatcagg caagataaac caatgtcataacaggcattg
4381 ccaacctcac tgacacaggg tcatagtgta taataatata ctgtactatataatatatca
4441 tctttagagg tatgattttt tcatgaaaga taagcttttg gtaatattcattttaaagtg
4501 gacttattaa aattggatgc tagagaatca agtttatttt atgtatatatttttctgatt
4561 ataagagtaa tatatgttca ttgtaaaaat ttttaaaaca cagaaactatatgcaaagaa
4621 aaaataaaaa ttatctataa tctcagaacc cagaaatagc cactattaacatttcctacg
4681 tattttattt tacatagatc atattgtata tagttagtat ctttattaatttttattatg
4741 aaactttcct ttgtcattat tagtcttcaa aagcatgatt tttaatagttgttgagtatt
4801 ccaccacagg aatgtatcac aacttaaccg ttcccgtttg ttagactagtttcttattaa
4861 tgttgatgaa tgttgtttaa aaataatttt gttgctacat ttactttaatttccttgact
4921 gtaaagagaa gtaattttgc tccttgataa agtattatat taataataaatctgcctgca
4981 actttttgcc ttctttcata atc
Klotho氨基酸序列(NP_004786)(SEQ ID NO：2)
  1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LRAEPGDGAQ TWARFSRPPA PEAAGLFQGT
 61 FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP PGDSRNASLP LGAPSPLQPA
121 TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL
181 RELGVQPVVT LYHWDLPQRL QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP
241 YVVAWHGYAT GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP DFTESEKKFI
361 KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW IDLEFNHPQI FIVENGWFVS
 421 GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD
 481 FLSQDKMLLP KSSALFYQKL IEKNGFPPLP ENQPLEGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ
 541 FTDLNVYLWD VHHSKRLIKV DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA
 601 LILPLGNQSQ VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL LARQGAWENP
 661 YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG HNLLKAHALA WHVYNEKFRH
 721 AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE RVLEFDIGWL AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ
 781 RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT FDFLALSHYT TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN
 841 SPSQVAVVPW GLRKVLNWLK FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK
 901 AHILDGINLC GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS NGFPGPETLE
 961 RFCPEEFTVC TECSFFHTRK SLLAFIAFLF FASIISLSLI FYYSKKGRRS YK
β-Klotho核酸序列(NM_175737)(SEQ ID NO：3)
编码蛋白质区域：98-3232
   1 atcctcagtc tcGcagttca agctaatcat tgacagagct ttacaatcac aagcttttac
  61 tgaagctttg ataagacagt ccagcagttg gtggcaaatg aagccaggct gtgcggcagg
 121 atctccaggg aatgaatgga ttttcttcag cactgatgaa ataaccacac gctataggaa
 181 tacaatgtcc aacgggggat tgcaaagatc tgtcatcctg tcagcactta ttctgctacg
 241 agctgttact ggattctctg gagatggaag agctatatgg tctaaaaatc ctaattttac
 301 tccggtaaat gaaagtcagc tgtttctcta tgacactttc cctaaaaact ttttctgggg
 361 tattgggact ggagcattgc aagtggaagg gagttggaag aaggatggaa aaggaccttc
 421 tatatgggat catttcatcc acacacacct taaaaatgtc agcagcacga atggttccag
 481 tgacagttat atttttctgg aaaaagactt atcagccctg gattttatag gagtttcttt
 541 ttatcaattt tcaatttcct ggccaaggct tttccccgat ggaatagtaa cagttgccaa
 601 cgcaaaaggt ctgcagtact acagtactct tctggacgct ctagtgctta gaaacattga
 661 acctatagtt actttatacc actgggattt gcctttggca ctacaagaaa aatatggggg
 721 gtggaaaaat gataccataa tagatatctt caatgactat gccacatact gtttccagat
 781 gtttggggac cgtgtcaaat attggattac aattcacaac ccatatctag tggcttggca
 841 tgggtatggg acaggtatgc atgcccctgg agagaaggga aatttagcag ctgtctacac
 901 tgtgggacac aacttgatca aggctcactc gaaagtttgg cataactaca acacacattt
 961 ccgcccacat cagaagggtt ggttatcgat cacgttggga tctcattgga tcgagccaaa
1021 ccggtcggaa aacacgatgg atatattcaa atgtcaacaa tccatggttt ctgtgcttgg
1081 atggtttgcc aaccctatcc atggggatgg cgactatcca gaggggatga gaaagaagtt
1141 gttctccgtt ctacccattt tctctgaagc agagaagcat gagatgagag gcacagctga
1201 tttctttgcc ttttcttttg gacccaacaa cttcaagccc ctaaacacca tggctaaaat
1261 gggacaaaat gtttcactta atttaagaga agcgctgaac tggattaaac tggaatacaa
1321 caaccctcga atcttgattg ctgagaatgg ctggttcaca gacagtcgtg tgaaaacaga
1381 agacaccacg gccatctaca tgatgaagaa tttcctcagc caggtgcttc aagcaataag
1441 gttagatgaa atacgagtgt ttggttatac tgcctggtct ctcctggatg gctttgaatg
1501 gcaggatgct tacaccatcc gccgaggatt attttatgtg gattttaaca gtaaacagaa
1561 agagcggaaa cctaagtctt cagcacacta ctacaaacag atcatacgag aaaatggttt
1621 ttctttaaaa gagtccacgc cagatgtgca gggccagttt ccctgtgact tctcctgggg
1681 tgtcactgaa tctgttctta agcccgagtc tgtggcttcg tccccacagt tcagcgatcc
1741 tcatctgtac gtgtggaacg ccactggcaa cagactgttg caccgagtgg aaggggtgag
1801 gctgaaaaca cgacccgctc aatgcacaga ttttgtaaac atcaaaaaac aacttgagat
1861 gttggcaaga atgaaagtca cccactaccg gtttgctctg gattgggcct cggtccttcc
1921 cactggcaac ctgtccgcgg tgaaccgaca ggccctgagg tactacaggt gcgtggtcag
1981 tgaggggctg aagcttggca tctccgcgat ggtcaccctg tattatccga cccacgccca
2041 cctaggcctc cccgagcctc tgttgcatgc cgacgggtgg ctgaacccat cgacggccga
2101 ggccttccag gcctacgctg ggctgtgctt ccaggagctg ggggacctgg tgaagctctg
2161 gatcaccatc aacgagccta accggctaag tgacatctac aaccgctctg gcaacgacac
2221 ctacggggcg gcgcacaacc tgctggtggc ccacgccctg gcctggcgcc tctacgaccg
2281 gcagttcagg ccctcacagc gcggggccgt gtcgctgtcg ctgcacgcgg actgggcgga
2341 acccgccaac ccctatgctg actcgcactg gagggcggcc gagcgcttcc tgcagttcga
2401 gatcgcctgg ttcgccgagc cgctcttcaa gaccggggac taccccgcgg ccatgaggga
2461 atacattgcc tccaagcacc gacgggggct ttccagctcg gccctgccgc gcctcaccga
2521 ggccgaaagg aggctgctca agggcacggt cgacttctgc gcgctcaacc acttcaccac
2581 taggttcgtg atgcacgagc agctggccgg cagccgctac gactcggaca gggacatcca
2641 gtttctgcag gacatcaccc gcctgagctc ccccacgcgc ctggctgtga ttccctgggg
2701 ggtgcgcaag ctgctgcggt gggtccggag gaactacggc gacatggaca tttacatcac
2761 cgccagtggc atcgacgacc aggctctgga ggatgaccgg ctccggaagt actacctagg
2821 gaagtacctt caggaggtgc tgaaagcata cctgattgat aaagtcagaa tcaaaggcta
2881 ttatgcattc aaactggctg aagagaaatc taaacccaga tttggattct tcacatctga
2941 ttttaaagct aaatcctcaa tacaatttta caacaaagtg atcagcagca ggggcttccc
3001 ttttgagaac agtagttcta gatgcagtca gacccaagaa aatacagagt gcactgtctg
3061 cttattcctt gtgcagaaga aaccactgat attcctgggt tgttgcttct tctccaccct
3121 ggttctactc ttatcaattg ccatttttca aaggcagaag agaagaaagt tttggaaagc
3181 aaaaaactta caacacatac cattaaagaa aggcaagaga gttgttagct aaactgatct
3241 gtctgcatga tagacagttt aaaaattcat cccagttcc
β-氨基酸序列(NP_783864)(SEQ ID NO：4)
   1 mkpgcaagsp gnewiffstd eittryrntm sngglqrsvi lsalillrav tgfsgdgrai
  61 wsknpnftpv nesqlflydt fpknffwgig tgalqvegsw kkdgkgpsiw dhfihthlkn
 121 vsstngssds yiflekdlsa ldfigvsfyq fsiswprlfp dgivtvanak glqyystlld
 181 alvlrniepi vtlyhwdlpl alqekyggwk ndtiidifnd yatycfqmfg drvkywitih
 241 npylvawhgy gtgmhapgek gnlaavytvg hnlikahskv whnynthfrp hqkgwlsitl
 301 gshwiepnrs entmdifkcq qsmvsvlgwf anpihgdgdy pegmrkklfs vlpifseaek
 361 hemrgtadff afsfgpnnfk plntmakmgq nvslnlreal nwikleynnp riliaengwf
 421 tdsrvktedt taiymmknfl sqvlqairld eirvfgytaw slldgfewqd aytirrglfy
 481 vdfnskqker kpkssahyyk qiirengfsl kestpdvqgq fpcdfswgvt esvlkpesva
 541 sspqfsdphl yvwnatgnrl lhrvegvrlk trpaqctdfv nikkqlemla rmkvthyrfa
 601 ldwasvlptg nlsavnrqal ryyrcvvseg lklgisamvt lyypthahlg lpepllhadg
 661 wlnpstaeaf qayaglcfqe lgdlvklwit inepnrlsdi ynrsgndtyg aahnllvaha
 721 lawrlydrqf rpsqrgavsl slhadwaepa npyadshwra aerflqfeia wfaeplfktg
 781 dypaamreyi askhrrglss salprlteae rrllkgtvdf calnhfttrf vmheqlagsr
 841 ydsdrdiqfl qditrlsspt rlavipwgvr kllrwvrrny gdmdiyitas giddqaledd
 901 rlrkyylgky lqevlkayli dkvrikgyya fklaeekskp rfgfftsdfk akssiqfynk
 961 vissrgfpfe nsssrcsqtq entectvclf lvqkkplifl gccffstlvl llsiaifqrq
1021 krrkfwkakn lqhiplkkgk rvvs
人Klotho结构域1(KL-D1)氨基酸序列(SEQ ID NO：5)
  58                                                               qgt
  61 fpdgflwavg saayqteggw qqhgkgasiw dtfthhplap pgdsrnaslp lgapsplqpa
 121 tgdvasdsyn nvfrdtealr elgvthyrfs iswarvlpng sagvpnregl ryyrrllerl
 181 relgvqpvvt lyhwdlpqrl qdayggwanr aladhfrdya elcfrhfggq vkywitidnp
 241 yvvawhgyat grlapgirgs prlgylvahn lllahakvwh lyntsfrptq ggqvsialss
 301 hwinprrmtd hsikecqksl dfvlgwfakp vfidgdypes mknnlssilp dftesekkfi
 361 kgtadffalc fgptlsfqll dphmkfrqle spnlrqllsw idlefnhpqi fivengwfvs
 421 gttkrddaky myylkkfime tlkaikldgv dvigytawsl mdgfewhrgy sirrglfyvd
 481 flsqdkmllp kssalfyqkl iekngf
人Klotho结构域2(KL-D2)氨基酸序列(SEQ ID NO：6)
 517                                        gtfp cdfawgvvdn yiqvdttlsq
 541 ftdlnvylwd vhhskrlikv dgvvtkkrks ycvdfaaiqp qiallqemhv thfrfsldwa
 601 lilplgnqsq vnhtilqyyr cmaselvrvn itpvvalwqp mapnqglprl larqgawenp
 661 ytalafaeya rlcfqelghh vklwitmnep ytrnmtysag hnllkahala whvynekfrh
 721 aqngkisial qadwiepacp fsqkdkevae rvlefdigwl aepifgsgdy pwvmrdwlnq
 781 rnnfllpyft edekkliqgt fdflalshyt tilvdseked pikyndylev qemtditwln
 841 spsqvavvpw glrkvlnwlk fkygdlpmyi isngiddglh aeddqlrvyy mqnyinealk
 901 ahildginlc gyfaysfndr taprfglyry aadqfepkas mkhyrkiids ngf
Klotho细胞外结构域(没有信号肽)氨基酸序列(SEQ ID NO：7)
  28                                     epgdgaq twarfsrppa peaaglfqgt
  61 fpdgflwavg saayqteggw qqhgkgasiw dtfthhplap pgdsrnaslp lgapsplqpa
 121 tgdvasdsyn nvfrdtealr elgvthyrfs iswarvlpng sagvpnregl ryyrrllerl
181 relgvqpvvt lyhwdlpqrl qdayggwanr aladhfrdya elcfrhfggq vkywitidnp
241 yvvawhgyat grlapgirgs prlgylvahn lllahakvwh lyntsfrptq ggqvsialss
301 hwinprrmtd hsikecqksl dfvlgwfakp vfidgdypes mknnlssilp dftesekkfi
361 kgtadffalc fgptlsfqll dphmkfrqle spnlrqllsw idlefnhpqi fivengwfvs
421 gttkrddaky myylkkfime tlkaikldgv dvigytawsl mdgfewhrgy sirrglfyvd
481 flsqdkmllp kssalfyqkl iekngfpplp enqplegtfp cdfawgvvdn yiqvdttlsq
541 ftdlnvylwd vhhskrlikv dgvvtkkrks ycvdfaaiqp qiallqemhv thfrfsldwa
601 lilplgnqsq vnhtilqyyr cmaselvrvn itpvvalwqp mapnqglprl larqgawenp
661 ytalafaeya rlcfqelghh vklwitmnep ytrnmtysag hnllkahala whvynekfrh
721 aqngkisial qadwiepacp fsqkdkevae rvlefdigwl aepifgsgdy pwvmrdwlnq
781 rnnfllpyft edekkliqgt fdflalshyt tilvdseked pikyndylev qemtditwln
841 spsqvavvpw glrkvlnwlk fkygdlpmyi isngiddglh aeddqlrvyy mqnyinealk
901 ahildginlc gyfaysfndr taprfglyry aadqfepkas mkhyrkiids ngfpgpetle
961 rfcpeeftvc tecsffhtrk sl
Klotho信号肽氨基酸序列(SEQ ID NO：8)
  1 mpasapprrp rppppslsll lvllglggrr lra
IgG信号肽氨基酸序列(SEQ ID NO：9)
  1 msvltqvlal lllwltgtrc rrlra
(Gly4 Ser)3多肽连接子核酸序列(SEQ ID NO：10)
  1 ggaggtggag gttcaggagg tggaggttca ggaggtggag gttca
(Gly4 Ser)3多肽连接子氨基酸序列(SEQ ID NO：11)
  1 GGGGSGGGGS GGGGS
(Gly4 Ser)多肽连接子氨基酸序列(SEQ ID NO：12)
  1 GGGGS
(Gly)多肽连接子氨基酸序列(SEQ ID NO：13)
  1 G
(Gly Gly)多肽连接子氨基酸序列(SEQ ID NO：14)
  1 GG
(Gly Ser)多肽连接子氨基酸序列(SEQ ID NO：15)
  1 GS
(Gly2 Ser)多肽连接子氨基酸序列(SEQ ID NO：16)
  1 GGS
(Ala)多肽连接子氨基酸序列(SEQ ID NO：17)
   1 A
(Ala Ala)多肽连接子氨基酸序列(SEQ ID NO：18)
   1 AA
Klotho信号肽-Klotho细胞外结构域-FGF23(R179Q)
氨基酸序列(SEQ ID NO：19)
   1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LRAEPGDGAQ TWARFSRPPA
  51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
 101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
 151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
 201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
 251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
 301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
 351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
 401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
 451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
 501 IEKNGFPPLP ENQPLEGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ FTDLNVYLWD
 551 VHHSKRLIKV DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA
 601 LILPLGNQSQ VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL
 651 LARQGAWENP YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG
 701 HNLLKAHALA WHVYNEKFRH AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE
 751 RVLEFDIGWL AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT
 801 FDFLALSHYT TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN SPSQVAVVPW
 851 GLRKVLNWLK FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK
 901 AHILDGINLC GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS
 951 NGFPGPETLE RFCPEEFTVC TECSFFHTRK SLGSGGGGSG GGGSGGGGSL
1001 KYPNASPLLG SSWGGLIHLY TATARNSYHL QIHKNGHVDG APHQTIYSAL
1051 MIRSEDAGFV VITGVMSRRY LCMDFRGNIF GSHYFDPENC RFQHQTLENG
1101 YDVYHSPQYH FLVSLGRAKR AFLPGMNPPP YSQFLSRRNE IPLIHFNTPI
1151 PRRHTQSAED DSERDPLNVL KPRARMTPAP ASCSQELPSA EDNSPMASDP
1201 LGVVRGGRVN THAGGTGPEG CRPFAKFI＊
IgG信号肽-Klotho细胞外结构域-FGF23(R179Q)
氨基酸序列(SEQ ID NO：20)
   1 MSVLTQVLAL LLLWLTGLGG RRLRAEPGDG AQTWARFSRP PAPEAAGLFQ
  51 GTFPDGFLWA VGSAAYQTEG GWQQHGKGAS IWDTFTHHPL APPGDSRNAS
 101 LPLGAPSPLQ PATGDVASDS YNNVFRDTEA LRELGVTHYR FSISWARVLP
 151 NGSAGVPNRE GLRYYRRLLE RLRELGVQPV VTLYHWDLPQ RLQDAYGGWA
 201 NRALADHFRD YAELCFRHFG GQVKYWITID NPYVVAWHGY ATGRLAPGIR
 251 GSPRLGYLVA HNLLLAHAKV WHLYNTSFRP TQGGQVSIAL SSHWINPRRM
 301 TDHSIKECQK SLDFVLGWFA KPVFIDGDYP ESMKNNLSSI LPDFTESEKK
 351 FIKGTADFFA LCFGPTLSFQ LLDPHMKFRQ LESPNLRQLL SWIDLEFNHP
 401 QIFIVENGWF VSGTTKRDDA KYMYYLKKFI METLKAIKLD GVDVIGYTAW
 451 SLMDGFEWHR GYSIRRGLFY VDFLSQDKML LPKSSALFYQ KLIEKNGFPP
 501 LPENQPLEGT FPCDFAWGVV DNYIQVDTTL SQFTDLNVYL WDVHHSKRLI
 551 KVDGVVTKKR KSYCVDFAAI QPQIALLQEM HVTHFRFSLD WALILPLGNQ
 601 SQVNHTILQY YRCMASELVR VNITPVVALW QPMAPNQGLP RLLARQGAWE
 651 NPYTALAFAE YARLCFQELG HHVKLWITMN EPYTRNMTYS AGHNLLKAHA
 701 LAWHVYNEKF RHAQNGKISI ALQADWIEPA CPFSQKDKEV AERVLEFDIG
 751 WLAEPIFGSG DYPWVMRDWL NQRNNFLLPY FTEDEKKLIQ GTFDFLALSH
 801 YTTILVDSEK EDPIKYNDYL EVQEMTDITW LNSPSQVAVV PWGLRKVLNW
 851 LKFKYGDLPM YIISNGIDDG LHAEDDQLRV YYMQNYINEA LKAHILDGIN
 901 LCGYFAYSFN DRTAPRFGLY RYAADQFEPK ASMKHYRKII DSNGFPGPET
 951 LERFCPEEFT VCTECSFFHT RKSLGSGGGG SGGGGSGGGG SLKYPNASPL
1001 LGSSWGGLIH LYTATARNSY HLQIHKNGHV DGAPHQTIYS ALMIRSEDAG
1051 FVVITGVMSR RYLCMDFRGN IFGSHYFDPE NCRFQHQTLE NGYDVYHSPQ
1101 YHFLVSLGRA KRAFLPGMNP PPYSQFLSRR NEIPLIHFNT PIPRRHTQSA
1151 EDDSERDPLN VLKPRARMTP APASCSQELP SAEDNSPMAS DPLGVVRGGR
1201 VNTHAGGTGP EGCRPFAKFI＊
KL-D1-FGF23(R179Q)氨基酸序列(SEQ ID NO：21)
   1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LRAEPGDGAQ TWARFSRPPA
  51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
 101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
 151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
 201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
 251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
 301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
 351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
 401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
 451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
 501 IEKNGFPPLP ENQPLEGSGG GGSGGGGSGG GGSLKYPNAS PLLGSSWGGL
 551 IHLYTATARN SYHLQIHKNG HVDGAPHQTI YSALMIRSED AGFVVITGVM
 601 SRRYLCMDFR GNIFGSHYFD PENCRFQHQT LENGYDVYHS PQYHFLVSLG
 651 RAKRAFLPGM NPPPYSQFLS RRNEIPLIHF NTPIPRRHTQ SAEDDSERDP
 701 LNVLKPRARM TPAPASCSQE LPSAEDNSPM ASDPLGVVRG GRVNTHAGGT
 751 GPEGCRPFAK FI＊
KL-D2-FGF23(R179Q)氨基酸序列(SEQ ID NO：22)
   1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LPLPENQPLE GTFPCDFAWG
  51 VVDNYIQVDT TLSQFTDLNV YLWDVHHSKR LIKVDGVVTK KRKSYCVDFA
 101 AIQPQIALLQ EMHVTHFRFS LDWALILPLG NQSQVNHTIL QYYRCMASEL
 151 VRVNITPVVA LWQPMAPNQG LPRLLARQGA WENPYTALAF AEYARLCFQE
 201 LGHHVKLWIT MNEPYTRNMT YSAGHNLLKA HALAWHVYNE KFRHAQNGKI
 251 SIALQADWIE PACPFSQKDK EVAERVLEFD IGWLAEPIFG SGDYPWVMRD
 301 WLNQRNNFLL PYFTEDEKKL IQGTFDFLAL SHYTTILVDS EKEDPIKYND
 351 YLEVQEMTDI TWLNSPSQVA VVPWGLRKVL NWLKFKYGDL PMYIISNGID
 401 DGLHAEDDQL RVYYMQNYIN EALKAHILDG INLCGYFAYS FNDRTAPRFG
 451 LYRYAADQFE PKASMKHYRK IIDSNGFPGP ETLERFCPEE FTVCTECSFF
 501 HTRKSLGSGG GGSGGGGSGG GGSLKYPNAS PLLGSSWGGL IHLYTATARN
 551 SYHLQIHKNG HVDGAPHQTI YSALMIRSED AGFVVITGVM SRRYLCMDFR
 601 GNIFGSHYFD PENCRFQHQT LENGYDVYHS PQYHFLVSLG RAKRAFLPGM
 651 NPPPYSQFLS RRNEIPLIHF NTPIPRRHTQ SAEDDSERDP LNVLKPRARM
 701 TPAPASCSQE LPSAEDNSPM ASDPLGVVRG GRVNTHAGGT GPEGCRPFAK
 751 FI＊
(KL-D1)2-FGF23(R179Q)氨基酸序列(SEQ ID NO：23)
   1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LRAEPGDGAQ TWARFSRPPA
  51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
 101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
 151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
 201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
 251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
 301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
 351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
 401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
 451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
 501 IEKNGFPPLP ENQPLEGSGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW
 551 DTFTHHPLAP PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR
 601 ELGVTHYRFS ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT
 651 LYHWDLPQRL QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP
 701 YVVAWHGYAT GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ
 751 GGQVSIALSS HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES
 801 MKNNLSSILP DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE
 851 SPNLRQLLSW IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME
 901 TLKAIKLDGV DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP
 951 KSSALFYQKL IEKNGFPEFG SGGGGSGGGG SGGGGSLKYP NASPLLGSSW
1001 GGLIHLYTAT ARNSYHLQIH KNGHVDGAPH QTIYSALMIR SEDAGFVVIT
1051 GVMSRRYLCM DFRGNIFGSH YFDPENCRFQ HQTLENGYDV YHSPQYHFLV
1101 SLGRAKRAFL PGMNPPPYSQ FLSRRNEIPL IHFNTPIPRR HTQSAEDDSE
1151 RDPLNVLKPR ARMTPAPASC SQELPSAEDN SPMASDPLGV VRGGRVNTHA
1201 GGTGPEGCRP FAKFI＊
(KL-D2)2-FGF23(R179Q)氨基酸序列(SEQ ID NO：24)
   1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LPLPENQPLE GTFPCDFAWG
  51 VVDNYIQVDT TLSQFTDLNV YLWDVHHSKR LIKVDGVVTK KRKSYCVDFA
 101 AIQPQIALLQ EMHVTHFRFS LDWALILPLG NQSQVNHTIL QYYRCMASEL
 151 VRVNITPVVA LWQPMAPNQG LPRLLARQGA WENPYTALAF AEYARLCFQE
 201 LGHHVKLWIT MNEPYTRNMT YSAGHNLLKA HALAwHVYNE KFRHAQNGKI
 251 SIALQADWIE PACPFSQKDK EVAERVLEFD IGWLAEPIFG SGDYPWVMRD
 301 WLNQRNNFLL PYFTEDEKKL IQGTFDFLAL SHYTTILVDS EKEDPIKYND
 351 YLEVQEMTDI TWLNSPSQVA VVPWGLRKVL NWLKFKYGDL PMYIISNGID
 401 DGLHAEDDQL RVYYMQNYIN EALKAHILDG INLCGYFAYS FNDRTAPRFG
 451 LYRYAADQFE PKASMKHYRK IIDSNGFPGP ETLERFCPEE FTVCTECSFF
 501 HTRKSLGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ FTDLNVYLWD VHHSKRLIKV
 551 DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA LILPLGNQSQ
 601 VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL LARQGAWENP
 651 YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG HNLLKAHALA
 701 WHVYNEKFRH AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE RVLEFDIGWL
 751 AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT FDFLALSHYT
 801 TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN SPSQVAVVPW GLRKVLNWLK
 851 FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK AHILDGINLC
 901 GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS NGFGSGGGGS
 951 GGGGSGGGGS LKYPNASPLL GSSWGGLIHL YTATARNSYH LQIHKNGHVD
1001 GAPHQTIYSA LMIRSEDAGF VVITGVMSRR YLCMDFRGNI FGSHYFDPEN
1051 CRFQHQTLEN GYDVYHSPQY HFLVSLGRAK RAFLPGMNPP PYSQFLSRRN
1101 EIPLIHFNTP IPRRHTQSAE DDSERDPLNV LKPRARMTPA PASCSQELPS
1151 AEDNSPMASD PLGVVRGGRV NTHAGGTGPE GCRPFAKFI＊
FGF23(R179Q)-Klotho细胞外结构域氨基酸序列(SEQ ID NO：25)
   1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
  51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
 101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
 151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
 201 PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
 251 IGSGGGGSGG GGSGGGGSLK EPGDGAQTWA RFSRPPAPEA AGLFQGTFPD
 301 GFLWAVGSAA YQTEGGWQQH GKGASIWDTF THHPLAPPGD SRNASLPLGA
 351 PSPLQPATGD VASDSYNNVF RDTEALRELG VTHYRFSISW ARVLPNGSAG
 401 VPNREGLRYY RRLLERLREL GVQPVVTLYH WDLPQRLQDA YGGWANRALA
 451 DHFRDYAELC FRHFGGQVKY WITIDNPYVV AWHGYATGRL APGIRGSPRL
 501 GYLVAHNLLL AHAKVWHLYN TSFRPTQGGQ VSIALSSHWI NPRRMTDHSI
 551 KECQKSLDFV LGWFAKPVFI DGDYPESMKN NLSSILPDFT ESEKKFIKGT
 601 ADFFALCFGP TLSFQLLDPH MKFRQLESPN LRQLLSWIDL EFNHPQIFIV
 651 ENGWFVSGTT KRDDAKYMYY LKKFIMETLK AIKLDGVDVI GYTAWSLMDG
 701 FEWHRGYSIR RGLFYVDFLS QDKMLLPKSS ALFYQKLIEK NGFPPLPENQ
 751 PLEGTFPCDF AWGVVDNYIQ VDTTLSQFTD LNVYLWDVHH SKRLIKVDGV
 801 VTKKRKSYCV DFAAIQPQIA LLQEMHVTHF RFSLDWALIL PLGNQSQVNH
 851 TILQYYRCMA SELVRVNITP VVALWQPMAP NQGLPRLLAR QGAWENPYTA
 901 LAFAEYARLC FQELGHHVKL WITMNEPYTR NMTYSAGHNL LKAHALAWHV
 951 YNEKFRHAQN GKISIALQAD WIEPACPFSQ KDKEVAERVL EFDIGWLAEP
1001 IFGSGDYPWV MRDWLNQRNN FLLPYFTEDE KKLIQGTFDF LALSHYTTIL
1051 VDSEKEDPIK YNDYLEVQEM TDITWLNSPS QVAVVPWGLR KVLNWLKFKY
1101 GDLPMYIISN GIDDGLHAED DQLRVYYMQN YINEALKAHI LDGINLCGYF
1151 AYSFNDRTAP RFGLYRYAAD QFEPKASMKH YRKIIDSNGF PGPETLERFC
1201 PEEFTVCTEC SFFHTRKSL＊
FGF23(R179Q)-KL-D1氨基酸序列(SEQ ID NO：26)
   1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
  51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
 101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
 151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
 201 PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
 251 IQGTFPDGFL WAVGSAAYQT EGGWQQHGKG ASIWDTFTHH PLAPPGDSRN
 301 ASLPLGAPSP LQPATGDVAS DSYNNVFRDT EALRELGVTH YRFSISWARV
 351 LPNGSAGVPN REGLRYYRRL LERLRELGVQ PVVTLYHWDL PQRLQDAYGG
 401 WANRALADHF RDYAELCFRH FGGQVKYWIT IDNPYVVAWH GYATGRLAPG
 451 IRGSPRLGYL VAHNLLLAHA KVWHLYNTSF RPTQGGQVSI ALSSHWINPR
 501 RMTDHSIKEC QKSLDFVLGW FAKPVFIDGD YPESMKNNLS SILPDFTESE
 551 KKFIKGTADF FALCFGPTLS FQLLDPHMKF RQLESPNLRQ LLSWIDLEFN
 601 HPQIFIVENG WFVSGTTKRD DAKYMYYLKK FIMETLKAIK LDGVDVIGYT
 651 AWSLMDGFEW HRGYSIRRGL FYVDFLSQDK MLLPKSSALF YQKLIEKNGF
 652 ＊
FGF23(R179Q)-KL-D2氨基酸序列(SEQ ID NO：27)
   1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
  51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
 101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
 151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
 201 PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
 251 IGTFPCDFAW GVVDNYIQVD TTLSQFTDLN VYLWDVHHSK RLIKVDGVVT
 301 KKRKSYCVDF AAIQPQIALL QEMHVTHFRF SLDWALILPL GNQSQVNHTI
 351 LQYYRCMASE LVRVNITPVV ALWQPMAPNQ GLPRLLARQG AWENPYTALA
 401 FAEYARLCFQ ELGHHVKLWI TMNEPYTRNM TYSAGHNLLK AHALAWHVYN
 451 EKFRHAQNGK ISIALQADWI EPACPFSQKD KEVAERVLEF DIGWLAEPIF
 501 GSGDYPWVMR DWLNQRNNFL LPYFTEDEKK LIQGTFDFLA LSHYTTILVD
 551 SEKEDPIKYN DYLEVQEMTD ITWLNSPSQV AVVPWGLRKV LNWLKFKYGD
 601 LPMYIISNGI DDGLHAEDDQ LRVYYMQNYI NEALKAHILD GINLCGYFAY
 651 SFNDRTAPRF GLYRYAADQF EPKASMKHYR KIIDSNGF＊
FGF23(R179Q)-(KL-D1)2氨基酸序列(SEQ ID NO：28)
   1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
  51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
 101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
 151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
 201 PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
 251 IQGTFPDGFL WAVGSAAYQT EGGWQQHGKG ASIWDTFTHH PLAPPGDSRN
 301 ASLPLGAPSP LQPATGDVAS DSYNNVFRDT EALRELGVTH YRFSISWARV
 351 LPNGSAGVPN REGLRYYRRL LERLRELGVQ PVVTLYHWDL PQRLQDAYGG
 401 WANRALADHF RDYAELCFRH FGGQVKYWIT IDNPYVVAWH GYATGRLAPG
 451 IRGSPRLGYL VAHNLLLAHA KVWHLYNTSF RPTQGGQVSI ALSSHWINPR
 501 RMTDHSIKEC QKSLDFVLGW FAKPVFIDGD YPESMKNNLS SILPDFTESE
 551 KKFIKGTADF FALCFGPTLS FQLLDPHMKF RQLESPNLRQ LLSWIDLEFN
 601 HPQIFIVENG WFVSGTTKRD DAKYMYYLKK FIMETLKAIK LDGVDVIGYT
 651 AWSLMDGFEW HRGYSIRRGL FYVDFLSQDK MLLPKSSALF YQKLIEKNGF
 701 QGTFPDGFLW AVGSAAYQTE GGWQQHGKGA SIWDTFTHHP LAPPGDSRNA
 751 SLPLGAPSPL QPATGDVASD SYNNVFRDTE ALRELGVTHY RFSISWARVL
 801 PNGSAGVPNR EGLRYYRRLL ERLRELGVQP VVTLYHWDLP QRLQDAYGGW
 851 ANRALADHFR DYAELCFRHF GGQVKYWITI DNPYVVAWHG YATGRLAPGI
 901 RGSPRLGYLV AHNLLLAHAK VWHLYNTSFR PTQGGQVSIA LSSHWINPRR
 951 MTDHSIKECQ KSLDFVLGWF AKPVFIDGDY PESMKNNLSS ILPDFTESEK
1001 KFIKGTADFF ALCFGPTLSF QLLDPHMKFR QLESPNLRQL LSWIDLEFNH
1051 PQIFIVENGW FVSGTTKRDD AKYMYYLKKF IMETLKAIKL DGVDVIGYTA
1101 WSLMDGFEWH RGYSIRRGLF YVDFLSQDKM LLPKSSALFY QKLIEKNGF＊
FGF23(R179Q)-(KL-D2)2氨基酸序列(SEQ ID NO：29)
   1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
  51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
 101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
 151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
 201 PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
 251 IGTFPCDFAW GVVDNYIQVD TTLSQFTDLN VYLWDVHHSK RLIKVDGVVT
 301 KKRKSYCVDF AAIQPQIALL QEMHVTHFRF SLDWALILPL GNQSQVNHTI
 351 LQYYRCMASE LVRVNITPVV ALWQPMAPNQ GLPRLLARQG AWENPYTALA
 401 FAEYARLCFQ ELGHHVKLWI TMNEPYTRNM TYSAGHNLLK AHALAWHVYN
 451 EKFRHAQNGK ISIALQADWI EPACPFSQKD KEVAERVLEF DIGWLAEPIF
 501 GSGDYPWVMR DWLNQRNNFL LPYFTEDEKK LIQGTFDFLA LSHYTTILVD
 551 SEKEDPIKYN DYLEVQEMTD ITWLNSPSQV AVVPWGLRKV LNWLKFKYGD
 601 LPMYIISNGI DDGLHAEDDQ LRVYYMQNYI NEALKAHILD GINLCGYFAY
 651 SFNDRTAPRF GLYRYAADQF EPKASMKHYR KIIDSNGFGT FPCDFAWGVV
 701 DNYIQVDTTL SQFTDLNVYL WDVHHSKRLI KVDGVVTKKR KSYCVDFAAI
 751 QPQIALLQEM HVTHFRFSLD WALILPLGNQ SQVNHTILQY YRCMASELVR
 801 VNITPVVALW QPMAPNQGLP RLLARQGAWE NPYTALAFAE YARLCFQELG
 851 HHVKLWITMN EPYTRNMTYS AGHNLLKAHA LAWHVYNEKF RHAQNGKISI
 901 ALQADWIEPA CPFSQKDKEV AERVLEFDIG WLAEPIFGSG DYPWVMRDWL
 951 NQRNNFLLPY FTEDEKKLIQ GTFDFLALSH YTTILVDSEK EDPIKYNDYL
1001 EVQEMTDITW LNSPSQVAVV PWGLRKVLNW LKFKYGDLPM YIISNGIDDG
1051 LHAEDDQLRV YYMQNYINEA LKAHILDGIN LCGYFAYSFN DRTAPRFGLY
1101 RYAADQFEPK ASMKHYRKII DSNGF＊
FGF19核酸序列(NM_005117)(SEQ ID NO：30)
编码蛋白质区域(464-1114)
   1 gctcccagcc aagaacctcg gggccgctgc gcggtgggga ggagttcccc gaaacccggc
  61 cgctaagcga ggcctcctcc tcccgcagat ccgaacggcc tgggcggggt caccccggct
 121 gggacaagaa gccgccgcct gcctgcccgg gcccggggag ggggctgggg ctggggccgg
 181 aggcggggtg tgagtgggtg tgtgcggggg gcggaggctt gatgcaatcc cgataagaaa
 241 tgctcgggtg tcttgggcac ctacccgtgg ggcccgtaag gcgctactat ataaggctgc
 301 cggcccggag ccgccgcgcc gtcagagcag gagcgctgcg tccaggatct agggccacga
 361 ccatcccaac ccggcactca cagccccgca gcgcatcccg gtcgccgccc agcctcccgc
 421 acccccatcg ccggagctgc gccgagagcc ccagggaggt gccatgcgga gcgggtgtgt
 481 ggtggtccac gtatggatcc tggccggcct ctggctggcc gtggccgggc gccccctcgc
 541 cttctcggac gcggggcccc acgtgcacta cggctggggc gaccccatcc gcctgcggca
 601 cctgtacacc tccggccccc acgggctctc cagctgcttc ctgcgcatcc gtgccgacgg
 661 cgtcgtggac tgcgcgcggg gccagagcgc gcacagtttg ctggagatca aggcagtcgc
 721 tctgcggacc gtggccatca agggcgtgca cagcgtgcgg tacctctgca tgggcgccga
 781 cggcaagatg caggggctgc ttcagtactc ggaggaagac tgtgctttcg aggaggagat
 841 ccgcccagat ggctacaatg tgtaccgatc cgagaagcac cgcctcccgg tctccctgag
 901 cagtgccaaa cagcggcagc tgtacaagaa cagaggcttt cttccactct ctcatttcct
 961 gcccatgctg cccatggtcc cagaggagcc tgaggacctc aggggccact tggaatctga
1021 catgttctct tcgcccctgg agaccgacag catggaccca tttgggcttg tcaccggact
1081 ggaggccgtg aggagtccca gctttgagaa gtaactgaga ccatgcccgg gcctcttcac
1141 tgctgccagg ggctgtggta cctgcagcgt gggggacgtg cttctacaag aacagtcctg
1201 agtccacgtt ctgtttagct ttaggaagaa acatctagaa gttgtacata ttcagagttt
1261 tccattggca gtgccagttt ctagccaata gacttgtctg atcataacat tgtaagcctg
1321 tagcttgccc agctgctgcc tgggccccca ttctgctccc tcgaggttgc tggacaagct
1381 gctgcactgt ctcagttctg cttgaatacc tccatcgatg gggaactcac ttcctttgga
1441 aaaattctta tgtcaagctg aaattctcta attttttctc atcacttccc caggagcagc
1501 cagaagacag gcagtagttt taatttcagg aacaggtgat ccactctgta aaacagcagg
1561 taaatttcac tcaaccccat gtgggaattg atctatatct ctacttccag ggaccatttg
1621 cccttcccaa atccctccag gccagaactg actggagcag gcatggccca ccaggcttca
1681 ggagtagggg aagcctggag ccccactcca gccctgggac aacttgagaa ttccccctga
1741 ggccagttct gtcatggatg ctgtcctgag aataacttgc tgtcccggtg tcacctgctt
1801 ccatctccca gcccaccagc cctctgccca cctcacatgc ctccccatgg attggggcct
1861 cccaggcccc ccaccttatg tcaacctgca cttcttgttc aaaaatcagg aaaagaaaag
1921 atttgaagac cccaagtctt gtcaataact tgctgtgtgg aagcagcggg ggaagaccta
1981 gaaccctttc cccagcactt ggttttccaa catgatattt atgagtaatt tattttgata
2041 tgtacatctc ttattttctt acattattta tgcccccaaa ttatatttat gtatgtaagt
2101 gaggtttgtt ttgtatatta aaatggagtt tgtttgtaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa
FGF19氨基酸序列(NP_005108)(SEQ ID NO：31)
   1 MRSGCVVVHV WILAGLWLAV AGRPLAFSDA GPHVHYGWGD PIRLRHLYTS GPHGLSSCFL
  61 RIRADGVVDC ARGQSAHSLL EIKAVALRTV AIKGVHSVRY LCMGADGKMQ GLLQYSEEDC
 121 AFEEEIRPDG YNVYRSEKHR LPVSLSSAKQ RQLYKNRGFL PLSHFLPMLP MVPEEPEDLR
 181 GHLESDMFSS PLETDSMDPF GLVTGLEAVR SPSFEK
FGF21核酸序列(NM_019113)(SEQ ID NO：32)
编码蛋白质区域151-780
   1 CTGTCAGCTG AGGATCCAGC CGAAAGAGGA GCCAGGCACT CAGGCCACCT GAGTCTACTC
  61 ACCTGGACAA CTGGAATCTG GCACCAATTC TAAACCACTC AGCTTCTCCG AGCTCACACC
 121 CCGGAGATCA CCTGAGGACC CGAGCCATTG ATGGACTCGG ACGAGACCGG GTTCGAGCAC
 181 TCAGGACTGT GGGTTTCTGT GCTGGCTGGT CTTCTGCTGG GAGCCTGCCA GGCACACCCC
 241 ATCCCTGACT CCAGTCCTCT CCTGCAATTC GGGGGCCAAG TCCGGCAGCG GTACCTCTAC
 301 ACAGATGATG CCCAGCAGAC AGAAGCCCAC CTGGAGATCA GGGAGGATGG GACGGTGGGG
 361 GGCGCTGCTG ACCAGAGCCC CGAAAGTCTC CTGCAGCTGA AAGCCTTGAA GCCGGGAGTT
 421 ATTCAAATCT TGGGAGTCAA GACATCCAGG TTCCTGTGCC AGCGGCCAGA TGGGGCCCTG
 481 TATGGATCGC TCCACTTTGA CCCTGAGGCC TGCAGCTTCC GGGAGCTGCT TCTTGAGGAC
 541 GGATACAATG TTTACCAGTC CGAAGCCCAC GGCCTCCCGC TGCACCTGCC AGGGAACAAG
 601 TCCCCACACC GGGACCCTGC ACCCCGAGGA CCAGCTCGCT TCCTGCCACT ACCAGGCCTG
 661 CCCCCCGCAC TCCCGGAGCC ACCCGGAATC CTGGCCCCCC AGCCCCCCGA TGTGGGCTCC
 721 TCGGACCCTC TGAGCATGGT GGGACCTTCC CAGGGCCGAA GCCCCAGCTA CGCTTCCTGA
 781 AGCCAGAGGC TGTTTACTAT GACATCTCCT CTTTATTTAT TAGGTTATTT ATCTTATTTA
 841 TTTTTTTATT TTTCTTACTT GAGATAATAA AGAGTTCCAG AGGAGAAAAA AAAAAAAAAA
 901 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA
FGF21氨基酸序列(NP_061986)(SEQ ID NO：33)
   1 MDSDETGFEH SGLWVSVLAG LLLGACQAHP IPDSSPLLQF GGQVRQRYLY TDDAQQTEAH
  61 LEIREDGTVG GAADQSPESL LQLKALKPGV IQILGVKTSR FLCQRPDGAL YGSLHFDPEA
 121 CSFRELLLED GYNVYQSEAH GLPLHLPGNK SPHRDPAPRG PARFLPLPGL PPALPEPPGI
 181 LAPQPPDVGS  SDPLSMVGPS QGRSPSYAS
FGF23核酸序列(NM_020638)(SEQ ID NO：34)
编码蛋白质区域147-902
   1 cggcaaaaag gagggaatcc agtctaggat cctcacacca gctacttgca agggagaagg
  61 aaaaggccag taaggcctgg gccaggagag tcccgacagg agtgtcaggt ttcaatctca
 121 gcaccagcca ctcagagcag ggcacgatgt tgggggcccg cctcaggctc tgggtctgtg
 181 ccttgtgcag cgtctgcagc atgagcgtcc tcagagccta tcccaatgcc tccccactgc
 241 tcggctccag ctggggtggc ctgatccacc tgtacacagc cacagccagg aacagctacc
 301 acctgcagat ccacaagaat ggccatgtgg atggcgcacc ccatcagacc atctacagtg
 361 ccctgatgat cagatcagag gatgctggct ttgtggtgat tacaggtgtg atgagcagaa
 421 gatacctctg catggatttc agaggcaaca tttttggatc acactatttc gacccggaga
 481 actgcaggtt ccaacaccag acgctggaaa acgggtacga cgtctaccac tctcctcagt
 541 atcacttcct ggtcagtctg ggccgggcga agagagcctt cctgccaggc atgaacccac
 601 ccccgtactc ccagttcctg tcccggagga acgagatccc cctaattcac ttcaacaccc
 661 ccataccacg gcggcacacc cggagcgccg aggacgactc ggagcgggac cccctgaacg
 721 tgctgaagcc ccgggcccgg atgaccccgg ccccggcctc ctgttcacag gagctcccga
 781 gcgccgagga caacagcccg atggccagtg acccattagg ggtggtcagg ggcggtcgag
 841 tgaacacgca cgctggggga acgggcccgg aaggctgccg ccccttcgcc aagttcatct
 901 agggtcgctg gaagggcacc ctctttaacc catccctcag caaacgcagc tcttcccaag
 961 gaccaggtcc cttgacgttc cgaggatggg aaaggtgaca ggggcatgta tggaatttgc
1021 tgcttctctg gggtcccttc cacaggaggt cctgtgagaa ccaacctttg aggcccaagt
1081 catggggttt caccgccttc ctcactccat atagaacacc tttcccaata ggaaacccca
1141 acaggtaaac tagaaatttc cccttcatga aggtagagag aaggggtctc tcccaacata
1201 tttctcttcc ttgtgcctct cctctttatc acttttaagc ataaaaaaaa aaaaaaaaaa
1261 aaaaaaaaaa aaaagcagtg ggttcctgag ctcaagactt tgaaggtgta gggaagagga
1321 aatcggagat cccagaagct tctccactgc cctatgcatt tatgttagat gccccgatcc
1381 cactggcatt tgagtgtgca aaccttgaca ttaacagctg aatggggcaa gttgatgaaa
1441 acactacttt caagccttcg ttcttccttg agcatctctg gggaagagct gtcaaaagac
1501 tggtggtagg ctggtgaaaa cttgacagct agacttgatg cttgctgaaa tgaggcagga
1561 atcataatag aaaactcagc ctccctacag ggtgagcacc ttctgtctcg ctgtctccct
1621 ctgtgcagcc acagccagag ggcccagaat ggccccactc tgttcccaag cagttcatga
1681 tacagcctca ccttttggcc ccatctctgg tttttgaaaa tttggtctaa ggaataaata
1741 gcttttacac tggctcacga aaatctgccc tgctagaatt tgcttttcaa aatggaaata
1801 aattccaact ctcctaagag gcatttaatt aaggctctac ttccaggttg agtaggaatc
1861 cattctgaac aaactacaaa aatgtgactg ggaagggggc tttgagagac tgggactgct
1921 ctgggttagg ttttctgtgg actgaaaaat cgtgtccttt tctctaaatg aagtggcatc
1981 aaggactcag ggggaaagaa atcaggggac atgttataga agttatgaaa agacaaccac
2041 atggtcaggc tcttgtctgt ggtctctagg gctctgcagc agcagtggct cttcgattag
2101 ttaaaactct cctaggctga cacatctggg tctcaatccc cttggaaatt cttggtgcat
2161 taaatgaagc cttaccccat tactgcggtt cttcctgtaa gggggctcca ttttcctccc
2221 tctctttaaa tgaccaccta aaggacagta tattaacaag caaagtcgat tcaacaacag
2281 cttcttccca gtcacttttt tttttctcac tgccatcaca tactaacctt atactttgat
2341 ctattctttt tggttatgag agaaatgttg ggcaactgtt tttacctgat ggttttaagc
2401 tgaacttgaa ggactggttc ctattctgaa acagtaaaac tatgtataat agtatatagc
2461 catgcatggc aaatatttta atatttctgt tttcatttcc tgttggaaat attatcctgc
2521 ataatagcta ttggaggctc ctcagtgaaa gatcccaaaa ggattttggt ggaaaactag
2581 ttgtaatctc acaaactcaa cactaccatc aggggttttc tttatggcaa agccaaaata
2641 gctcctacaa tttcttatat ccctcgtcat gtggcagtat ttatttattt atttggaagt
2701 ttgcctatcc ttctatattt atagatattt ataaaaatgt aacccctttt tcctttcttc
2761 tgtttaaaat aaaaataaaa tttatctcag cttctgttag cttatcctct ttgtagtact
2821 acttaaaagc atgtcggaat ataagaataa aaaggattat gggaggggaa cattagggaa
2881 atccagagaa ggcaaaattg aaaaaaagat tttagaattt taaaattttc aaagatttct
2941 tccattcata aggagactca atgattttaa ttgatctaga cagaattatt taagttttat
3001 caatattgga tttctggt
FGF23氨基酸序列(NP_065689)(SEQ ID NO：35)
   1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGH
  61 VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL
 121 ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTRS
 181 AEDDSERDPL NVLKPRARMT PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG
 241 PEGCRPFAKF I
FGF23(R179Q)氨基酸序列(SEQ ID NO：36)
   1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGH
  61 VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL
 121 ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS
 181 AEDDSERDPL NVLKPRARMT PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG
 241 PEGCRPFAKF I
人β-K1otho结构域1(b-KL-D1)氨基酸序列(SEQ ID NO：37)
77                    ydt fpknffwgig tgalqvegsw kkdgkgpsiw dhfihthlkn
121 vsstngssds yiflekdlsa ldfigvsfyq fsiswprlfp dgivtvansk glqyystlld
181 alvlrniepi vtlyhwdlpl alqekyggwk ndtiidifnd yatycfqmfg drvkywitih
241 npylvawhgy gtgmhapgek gnlaavytvg hnlikahskv whnynthfrp hqkgwlsitl
301 gshwiepnrs entmdifkcq qsmvsvlgwf anpihgdgdy pegmrkklfs vlpifseaek
361 hemrgtadff afsfgpnnfk plntmakmgq nvslnlreal nwikleynnp riliaengwf
421 tdsrvktedt taiymmknfl sqvlqairld eirvfgytaw slldgfewqd aytirrglfy
481 vdfnskqker kpkssahyyk qiirengf
人β-Klotho结构域2(b-KL-D2)氨基酸序列(SEQ ID NO：38)
571                                  trpaqctdfv nikkqlemlarmkvthyrfa
601 ldwasvlptg nlsavnrqal ryyrcvvseg lklgisamvt lyypthahlglpepllhadg
661 wlnpstaeaf qayaglcfqe lgdlvklwit inepnrlsdi ynrsgndtygaahnllvaha
721 lawrlydrqf rpsqrgavsl slhadwaepa npyadshwra aerflqfeiawfaeplfktg
781 dypaamreyi askhrrglss salprlteae rrllkgtvdf calnhfttrfvmheqlagsr
841 ydsdrdiqfl qditrlsspt rlavipwgvr kllrwvrrny gdmdiyitasgiddqaledd
901 rlrkyylgky lqevlkayli dkvrikgyya fklaeekskp rfgfftsdfkakssiqfynk
961 vissrgf
β-Klotho细胞外结构域(没有信号肽)氨基酸序列
(SEQ ID NO：39)
 52                                                         gfsgdgrai
 61 wsknpnftpv nesqlflydt fpknffwgig tgalqvegsw kkdgkgpsiw dhfihthlkn
121 vsstngssds yiflekdlsa ldfigvsfyq fsiswprlfp dgivtvanak glqyystlld
181 alvlrniepi vtlyhwdlpl alqekyggwk ndtiidifnd yatycfqmfg drvkywitih
241 npylvawhgy gtgmhapgek gnlaavytvg hnlikahskv whnynthfrp hqkgwlsitl
301 gshwiepnrs entmdifkcq qsmvsvlgwf anpihgdgdy pegmrkklfs vlpifseaek
361 hemrgtadff afsfgpnnfk plntmakmgq nvslnlreal nwikleynnp riliaengwf
421 tdsrvktedt taiymmknfl sqvlqairld eirvfgytaw slldgfewqd aytirrglfy
481 vdfnskqker kpkssahyyk qiirengfsl kestpdvqgq fpcdfswgvt esvlkpesva
541 sspqfsdphl yvwnatgnrl lhrvegvrlk trpaqctdfv nikkqlemla rmkvthyrfa
601 ldwasvlptg nlsavnrqal ryyrcvvseg lklgisamvt lyypthahlg lpepllhadg
661 wlnpstaeaf qayaglcfqe lgdlvklwit inepnrlsdi ynrsgndtyg aahnllvaha
721 lawrlydrqf rpsqrgavsl slhadwaepa npyadshwra aerflqfeia wfaeplfktg
781 dypaamreyi askhrrglss salprlteae rrllkgtvdf calnhfttrf vmheqlagsr
841 ydsdrdiqfl qditrlsspt rlavipwgvr kllrwvrrny gdmdiyitas giddqaledd
901 rlrkyylgky lqevlkayli dkvrikgyya fklaeekskp rfgfftsdfk akssiqfynk
961 vissrgfpfe nsssrcsqtq entectvclf lvqkkpl
没有信号肽的sKlotho-FGF23氨基酸序列(没有信号肽)
(SEQ ID NO：40)
                                        EPGDGAQ TWARFSRPPA
 51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
 201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
 251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
 301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
 351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
 401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
 451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
 501 IEKNGFPPLP ENQPLEGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ FTDLNVYLWD
 551 VHHSKRLIKV DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA
 601 LILPLGNQSQ VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL
 651 LARQGAWENP YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG
 701 HNLLKAHALA WHVYNEKFRH AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE
 751 RVLEFDIGWL AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT
 801 FDFLALSHYT TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN SPSQVAVVPW
 851 GLRKVLNWLK FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK
 901 AHILDGINLC GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS
 951 NGFPGPETLE RFCPEEFTVC TECSFFHTRK SLGSGGGGSG GGGSGGGGSL
1001 KYPNASPLLG SSWGGLIHLY TATARNSYHL QIHKNGHVDG APHQTIYSAL
1051 MIRSEDAGFV VITGVMSRRY LCMDFRGNIF GSHYFDPENC RFQHQTLENG
1101 YDVYHSPQYH FLVSLGRAKR AFLPGMNPPP YSQFLSRRNE IPLIHFNTPI
1151 PRRHTRSAED DSERDPLNVL KPRARMTPAP ASCSQELPSA EDNSPMASDP
1201 LGVVRGGRVN THAGGTGPEG CRPFAKFI＊
没有信号肽的sKlotho-FGF23(R179Q)(没有信号肽)氨基酸序列
(SEO ID NO：41)
                                         EPGDGAQ TWARFSRPPA
  51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
 101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
 151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
 201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
 251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
 301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
 351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
 401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
 451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
 501 IEKNGFPPLP ENQPLEGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ FTDLNVYLWD
 551 VHHSKRLIKV DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA
 601 LILPLGNQSQ VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL
 651 LARQGAWENP YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG
 701 HNLLKAHALA WHVYNEKFRH AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE
 751 RVLEFDIGWL AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT
 801 FDFLALSHYT TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN SPSQVAVVPW
 851 GLRKVLNWLK FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK
 901 AHILDGINLC GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS
 951 NGFPGPETLE RFCPEEFTVC TECSFFHTRK SLGSGGGGSG GGGSGGGGSL
1001 KYPNASPLLG SSWGGLIHLY TATARNSYHL QIHKNGHVDG APHQTIYSAL
1051 MIRSEDAGFV VITGVMSRRY LCMDFRGNIF GSHYFDPENC RFQHQTLENG
1101 YDVYHSPQYH FLVSLGRAKR AFLPGMNPPP YSQFLSRRNE IPLIHFNTPI
1151 PRRHTQSAED DSERDPLNVL KPRARMTPAP ASCSQELPSA EDNSPMASDP
1201 LGVVRGGRVN THAGGTGPEG CRPFAKFI＊
没有信号肽的FGF23(SEQ ID NO：42)
                               YPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGH
  61 VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL
 121 ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTRS
 181 AEDDSERDPL NVLKPRARMT PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG
 241 PEGCRPFAKF I
没有信号肽的FGF23(R179Q)(SEQ ID NO：43)
                              YPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS YHLQIHKNGH
 61 VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL
121 ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS
181 AEDDSERDPL NVLKPRARMT PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG
241 PEGCRPFAKF I
有Klotho信号肽的sKlotho(SEQ ID NO：44)
  1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LRAEPGDGAQ TWARFSRPPA
 51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
501 IEKNGFPPLP ENQPLEGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ FTDLNVYLWD
551 VHHSKRLIKV DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA
601 LILPLGNQSQ VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL
651 LARQGAWENP YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG
701 HNLLKAHALA WHVYNEKFRH AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE
751 RVLEFDIGWL AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT
801 FDFLALSHYT TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN SPSQVAVVPW
851 GLRKVLNWLK FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK
901 AHILDGINLC GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS
951 NGFPGPETLE RFCPEEFTVC TECSFFHTRK SL
有IgG信号肽的sKlotho(SEQ ID NO：45)
  1 MSVLTQVLAL LLLWLTGLGG RRLRAEPGDG AQTWARFSRP PAPEAAGLFQ
 51 GTFPDGFLWA VGSAAYQTEG GWQQHGKGAS IWDTFTHHPL APPGDSRNAS
101 LPLGAPSPLQ PATGDVASDS YNNVFRDTEA LRELGVTHYR FSISWARVLP
151 NGSAGVPNRE GLRYYRRLLE RLRELGVQPV VTLYHWDLPQ RLQDAYGGWA
201 NRALADHFRD YAELCFRHFG GQVKYWITID NPYVVAWHGY ATGRLAPGIR
251 GSPRLGYLVA HNLLLAHAKV WHLYNTSFRP TQGGQVSIAL SSHWINPRRM
301 TDHSIKECQK SLDFVLGWFA KPVFIDGDYP ESMKNNLSSI LPDFTESEKK
351 FIKGTADFFA LCFGPTLSFQ LLDPHMKFRQ LESPNLRQLL SWIDLEFNHP
401 QIFIVENGWF VSGTTKRDDA KYMYYLKKFI METLKAIKLD GVDVIGYTAW
451 SLMDGFEWHR GYSIRRGLFY VDFLSQDKML LPKSSALFYQ KLIEKNGFPP
501 LPENQPLEGT FPCDFAWGVV DNYIQVDTTL SQFTDLNVYL WDVHHSKRLI
551 KVDGVVTKKR KSYCVDFAAI QPQIALLQEM HVTHFRFSLD WALILPLGNQ
601 SQVNHTILQY YRCMASELVR VNITPVVALW QPMAPNQGLP RLLARQGAWE
651 NPYTALAFAE YARLCFQELG HHVKLWITMN EPYTRNMTYS AGHNLLKAHA
701 LAWHVYNEKF RHAQNGKISI ALQADWIEPA CPFSQKDKEV AERVLEFDIG
751 WLAEPIFGSG DYPWVMRDWL NQRNNFLLPY FTEDEKKLIQ GTFDFLALSH
801 YTTILVDSEK EDPIKYNDYL EVQEMTDITW LNSPSQVAVV PWGLRKVLNW
851 LKFKYGDLPM YIISNGIDDG LHAEDDQLRV YYMQNYINEA LKAHILDGIN
901 LCGYFAYSFN DRTAPRFGLY RYAADQFEPK ASMKHYRKII DSNGFPGPET
951 LERFCPEEFT VCTECSFFHT RKSL＊
sKlotho-FGF23-FcLALA v1(SEQ ID NO：46)
   1 ATGCCCGCCA GCGCCCCGCC GCGCCGCCCG CGGCCGCCGC CGCCGTCGCTGTCGCTGCTG
  61 CTGGTGCTGC TGGGCCTGGG CGGCCGCCGC CTGCGTGCGG AGCCGGGCGACGGCGCGCAG
 121 ACCTGGGCCC GTTTCTCGCG GCCTCCTGCC CCCGAGGCCG CGGGCCTCTTCCAGGGCACC
 181 TTCCCCGACG GCTTCCTCTG GGCCGTGGGC AGCGCCGCCT ACCAGACCGAGGGCGGCTGG
 241 CAGCAGCACG GCAAGGGTGC GTCCATCTGG GATACGTTCA CCCACCACCCCCTGGCACCC
 301 CCGGGAGACT CCCGGAACGC CAGTCTGCCG TTGGGCGCCC CGTCGCCGCTGCAGCCCGCC
 361 ACCGGGGACG TAGCCAGCGA CAGCTACAAC AACGTCTTCC GCGACACGGAGGCGCTGCGC
 421 GAGCTCGGGG TCACTCACTA CCGCTTCTCC ATCTCGTGGG CGCGAGTGCTCCCCAATGGC
 481 AGCGCGGGCG TCCCCAACCG CGAGGGGCTG CGCTACTACC GGCGCCTGCTGGAGCGGCTG
 541 CGGGAGCTGG GCGTGCAGCC CGTGGTCACC CTGTACCACT GGGACCTGCCCCAGCGCCTG
 601 CAGGACGCCT ACGGCGGCTG GGCCAACCGC GCCCTGGCCG ACCACTTCAGGGATTACGCG
 661 GAGCTCTGCT TCCGCCACTT CGGCGGTCAG GTCAAGTACT GGATCACCATCGACAACCCC
 721 TACGTGGTGG CCTGGCACGG CTACGCCACC GGGCGCCTGG CCCCCGGCATCCGGGGCAGC
 781 CCGCGGCTCG GGTACCTGGT GGCGCACAAC CTCCTCCTGG CTCATGCCAAAGTCTGGCAT
 841 CTCTACAATA CTTCTTTCCG TCCCACTCAG GGAGGTCAGG TGTCCATTGCCCTAAGCTCT
 901 CACTGGATCA ATCCTCGAAG AATGACCGAC CACAGCATCA AAGAATGTCAAAAATCTCTG
 961 GACTTTGTAC TAGGTTGGTT TGCCAAACCC GTATTTATTG ATGGTGACTATCCCGAGAGC
1021 ATGAAGAATA ACCTTTCATC TATTCTGCCT GATTTTACTG AATCTGAGAAAAAGTTCATC
1081 AAAGGAACTG CTGACTTTTT TGCTCTTTGC TTTGGACCCA CCTTGAGTTTTCAACTTTTG
1141 GACCCTCACA TGAAGTTCCG CCAATTGGAA TCTCCCAACC TGAGGCAACTGCTTTCCTGG
1201 ATTGACCTTG AATTTAACCA TCCTCAAATA TTTATTGTGG AAAATGGCTGGTTTGTCTCA
1261 GGGACCACCA AGAGAGATGA TGCCAAATAT ATGTATTACC TCAAAAAGTTCATCATGGAA
1321 ACCTTAAAAG CCATCAAGCT GGATGGGGTG GATGTCATCG GGTATACCGCATGGTCCCTC
1381 ATGGATGGTT TCGAGTGGCA CAGAGGTTAC AGCATCAGGC GTGGACTCTTCTATGTTGAC
1441 TTTCTAAGCC AGGACAAGAT GTTGTTGCCA AAGTCTTCAG CCTTGTTCTACCAAAAGCTG
1501 ATAGAGAAAA ATGGCTTCCC TCCTTTACCT GAAAATCAGC CCCTAGAAGGGACATTTCCC
1561 TGTGACTTTG CTTGGGGAGT TGTTGACAAC TACATTCAAG TAGATACCACTCTGTCTCAG
1621 TTTACCGACC TGAATGTTTA CCTGTGGGAT GTCCACCACA GTAAAAGGCTTATTAAAGTG
1681 GATGGGGTTG TGACCAAGAA GAGGAAATCC TACTGTGTTG ACTTTGCTGCCATCCAGCCC
1741 CAGATCGCTT TACTCCAGGA AATGCACGTT ACACATTTTC GCTTCTCCCTGGACTGGGCC
1801 CTGATTCTCC CTCTGGGTAA CCAGTCCCAG GTGAACCACA CCATCCTGCAGTACTATCGC
1861 TGCATGGCCA GCGAGCTTGT CCGTGTCAAC ATCACCCCAG TGGTGGCCCTGTGGCAGCCT
1921 ATGGCCCCGA ACCAAGGACT GCCGCGCCTC CTGGCCAGGC AGGGCGCCTGGGAGAACCCC
1981 TACACTGCCC TGGCCTTTGC AGAGTATGCC CGACTGTGCT TTCAAGAGCTCGGCCATCAC
2041 GTCAAGCTTT GGATAACGAT GAATGAGCCG TATACAAGGA ATATGACATACAGTGCTGGC
2101 CACAACCTTC TGAAGGCCCA TGCCCTGGCT TGGCATGTGT ACAATGAAAAGTTTAGGCAT
2161 GCTCAGAATG GGAAAATATC CATAGCCTTG CAGGCTGATT GGATAGAACCTGCCTGCCCT
2221 TTCTCCCAAA AGGACAAAGA GGTGGCCGAG AGAGTTTTGG AATTTGACATTGGCTGGCTG
2281 GCTGAGCCCA TTTTCGGCTC TGGAGATTAT CCATGGGTGA TGAGGGACTGGCTGAACCAA
2341 AGAAACAATT TTCTTCTTCC TTATTTCACT GAAGATGAAA AAAAGCTAATCCAGGGTACC
2401 TTTGACTTTT TGGCTTTAAG CCATTATACC ACCATCCTTG TAGACTCAGAAAAAGAAGAT
2461 CCAATAAAAT ACAATGATTA CCTAGAAGTG CAAGAAATGA CCGACATCACGTGGCTCAAC
2521 TCCCCCAGTC AGGTGGCGGT AGTGCCCTGG GGGTTGCGCA AAGTGCTGAACTGGCTGAAG
2581 TTCAAGTACG GAGACCTCCC CATGTACATA ATATCCAACG GAATCGATGACGGGCTGCAT
2641 GCTGAGGACG ACCAGCTGAG GGTGTATTAT ATGCAGAATT ACATAAACGAAGCTCTCAAA
2701 GCCCACATAC TGGATGGTAT CAATCTTTGC GGATACTTTG CTTATTCGTTTAACGACCGC
2761 ACAGCTCCGA GGTTTGGCCT CTATCGTTAT GCTGCAGATC AGTTTGAGCCCAAGGCATCC
2821 ATGAAACATT ACAGGAAAAT TATTGACAGC AATGGTTTCC CGGGCCCAGAAACTCTGGAA
2881 AGATTTTGTC CAGAAGAATT CACCGTGTGT ACTGAGTGCA GTTTTTTTCACACCCGAAAG
2941 TCTTTAGGAT CCGGAGGTGG AGGTTCAGGA GGTGGAGGTT CAGGAGGTGGAGGTTCACTT
3001 AAGTATCCCA ATGCCTCCCC ACTGCTCGGC TCCAGCTGGG GTGGCCTGATCCACCTGTAC
3061 ACAGCCACAG CCAGGAACAG CTACCACCTG CAGATCCACA AGAATGGCCATGTGGATGGC
3121 GCACCCCATC AGACCATCTA CAGTGCCCTG ATGATCAGAT CAGAGGATGCTGGCTTTGTG
3181 GTGATTACAG GTGTGATGAG CAGAAGATAC CTCTGCATGG ATTTCAGAGGCAACATTTTT
3241 GGATCACACT ATTTCGACCC GGAGAACTGC AGGTTCCAAC ACCAGACGCTGGAAAACGGG
3301 TACGACGTCT ACCACTCTCC TCAGTATCAC TTCCTGGTCA GTCTGGGCCGGGCGAAGAGA
3361 GCCTTCCTGC CAGGCATGAA CCCACCCCCG TACTCCCAGT TCCTGTCCCGGAGGAACGAG
3421 ATCCCCCTAA TTCACTTCAA CACCCCCATA CCACGGCGGC ACACCCAGAGCGCCGAGGAC
3481 GACTCGGAGC GGGACCCCCT GAACGTGCTG AAGCCCCGGG CCCGGATGACCCCGGCCCCG
3541 GCCTCCTGTT CACAGGAGCT CCCGAGCGCC GAGGACAACA GCCCGATGGCCAGTGACCCA
3601 TTAGGGGTGG TCAGGGGCGG TCGAGTGAAC ACGCACGCTG GGGGAACGGGCCCGGAAGGC
3661 TGCCGCCCCT TCGCCAAGTT CATCGGAGGT GGAGGTTCAA AAACCCACACGTGTCCTCCT
3721 TGTCCTGCCC CAGAAGCAGC AGGTGGTCCA TCAGTTTTTC TTTTCCCTCCCAAACCCAAG
3781 GATACGCTGA TGATCTCTCG CACGCCTGAG GTGACATGCG TCGTAGTAGACGTGAGCCAC
3841 GAAGATCCCG AGGTGAAGTT CAATTGGTAT GTGGACGGAG TAGAAGTGCATAACGCGAAA
3901 ACTAAGCCGC GCGAGGAACA ATATAACAGT ACTTACAGGG TGGTATCCGTGCTCACAGTC
3961 CTGCACCAGG ACTGGCTGAA CGGTAAGGAA TACAAGTGCA AAGTAAGCAACAAGGCACTT
4021 CCCGCGCCTA TTGAGAAAAC AATCTCCAAG GCGAAGGGAC AACCAAGAGAACCTCAGGTT
4081 TACACTCTCC CGCCTTCCAG GGAAGAGATG ACCAAAAATC AAGTTTCCCTGACTTGCCTC
4141 GTCAAAGGAT TCTACCCTTC CGACATTGCT GTTGAATGGG AAAGCAATGGACAACCAGAG
4201 AACAACTACA AGACAACACC CCCGGTGCTG GATAGTGACG GATCTTTCTTTCTCTACTCA
4261 AAGCTGACCG TGGATAAGTC CAGGTGGCAG CAGGGAAACG TGTTTTCCTGCTCTGTCATG
4321 CATGAAGCGC TGCATAATCA CTATACCCAG AAGTCTCTGA GCTTGAGCCCAGGCAAGTAA
sKlotho-FGF23-FcLALA v1(SEQ ID NO：47)
   1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LRAEPGDGAQ TWARFSRPPA
  51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
 101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
 151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
 201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
 251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
 301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
 351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
 401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
 451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
 501 IEKNGFPPLP ENQPLEGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ FTDLNVYLWD
 551 VHHSKRLIKV DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA
 601 LILPLGNQSQ VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL
 651 LARQGAWENP YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG
 701 HNLLKAHALA WHVYNEKFRH AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE
 751 RVLEFDIGWL AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT
 801 FDFLALSHYT TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN SPSQVAVVPW
 851 GLRKVLNWLK FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK
 901 AHILDGINLC GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS
 951 NGFPGPETLE RFCPEEFTVC TECSFFHTRK SLGSGGGGSG GGGSGGGGSL
1001 KYPNASPLLG SSWGGLIHLY TATARNSYHL QIHKNGHVDG APHQTIYSAL
1051 MIRSEDAGFV VITGVMSRRY LCMDFRGNIF GSHYFDPENC RFQHQTLENG
1101 YDVYHSPQYH FLVSLGRAKR AFLPGMNPPP YSQFLSRRNE IPLIHFNTPI
1151 PRRHTQSAED DSERDPLNVL KPRARMTPAP ASCSQELPSA EDNSPMASDP
1201 LGVVRGGRVN THAGGTGPEG CRPFAKFIGG GGSKTHTCPP CPAPEAAGGP
1251 SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVVVDVSH EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK
1301 TKPREEQYNS TYRVVSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL PAPIEKTISK
1351 AKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE
1401 NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ
1451 KSLSLSPGK＊
sKlotho-FGF23-FcLALA v2(SEQ ID NO：48)
   1 ATGCCCGCCA GCGCCCCGCC GCGCCGCCCG CGGCCGCCGC CGCCGTCGCTGTCGCTGCTG
  61 CTGGTGCTGC TGGGCCTGGG CGGCCGCCGC CTGCGTGCGG AGCCGGGCGACGGCGCGCAG
 121 ACCTGGGCCC GTTTCTCGCG GCCTCCTGCC CCCGAGGCCG CGGGCCTCTTCCAGGGCACC
 181 TTCCCCGACG GCTTCCTCTG GGCCGTGGGC AGCGCCGCCT ACCAGACCGAGGGCGGCTGG
 241 CAGCAGCACG GCAAGGGTGC GTCCATCTGG GATACGTTCA CCCACCACCCCCTGGCACCC
 301 CCGGGAGACT CCCGGAACGC CAGTCTGCCG TTGGGCGCCC CGTCGCCGCTGCAGCCCGCC
 361 ACCGGGGACG TAGCCAGCGA CAGCTACAAC AACGTCTTCC GCGACACGGAGGCGCTGCGC
 421 GAGCTCGGGG TCACTCACTA CCGCTTCTCC ATCTCGTGGG CGCGAGTGCTCCCCAATGGC
 481 AGCGCGGGCG TCCCCAACCG CGAGGGGCTG CGCTACTACC GGCGCCTGCTGGAGCGGCTG
 541 CGGGAGCTGG GCGTGCAGCC CGTGGTCACC CTGTACCACT GGGACCTGCCCCAGCGCCTG
 601 CAGGACGCCT ACGGCGGCTG GGCCAACCGC GCCCTGGCCG ACCACTTCAGGGATTACGCG
 661 GAGCTCTGCT TCCGCCACTT CGGCGGTCAG GTCAAGTACT GGATCACCATCGACAACCCC
 721 TACGTGGTGG CCTGGCACGG CTACGCCACC GGGCGCCTGG CCCCCGGCATCCGGGGCAGC
 781 CCGCGGCTCG GGTACCTGGT GGCGCACAAC CTCCTCCTGG CTCATGCCAAAGTCTGGCAT
 841 CTCTACAATA CTTCTTTCCG TCCCACTCAG GGAGGTCAGG TGTCCATTGCCCTAAGCTCT
 901 CACTGGATCA ATCCTCGAAG AATGACCGAC CACAGCATCA AAGAATGTCAAAAATCTCTG
 961 GACTTTGTAC TAGGTTGGTT TGCCAAACCC GTATTTATTG ATGGTGACTATCCCGAGAGC
1021 ATGAAGAATA ACCTTTCATC TATTCTGCCT GATTTTACTG AATCTGAGAAAAAGTTCATC
1081 AAAGGAACTG CTGACTTTTT TGCTCTTTGC TTTGGACCCA CCTTGAGTTTTCAACTTTTG
1141 GACCCTCACA TGAAGTTCCG CCAATTGGAA TCTCCCAACC TGAGGCAACTGCTTTCCTGG
1201 ATTGACCTTG AATTTAACCA TCCTCAAATA TTTATTGTGG AAAATGGCTGGTTTGTCTCA
1261 GGGACCACCA AGAGAGATGA TGCCAAATAT ATGTATTACC TCAAAAAGTTCATCATGGAA
1321 ACCTTAAAAG CCATCAAGCT GGATGGGGTG GATGTCATCG GGTATACCGCATGGTCCCTC
1381 ATGGATGGTT TCGAGTGGCA CAGAGGTTAC AGCATCAGGC GTGGACTCTTCTATGTTGAC
1441 TTTCTAAGCC AGGACAAGAT GTTGTTGCCA AAGTCTTCAG CCTTGTTCTACCAAAAGCTG
1501 ATAGAGAAAA ATGGCTTCCC TCCTTTACCT GAAAATCAGC CCCTAGAAGGGACATTTCCC
1561 TGTGACTTTG CTTGGGGAGT TGTTGACAAC TACATTCAAG TAGATACCACTCTGTCTCAG
1621 TTTACCGACC TGAATGTTTA CCTGTGGGAT GTCCACCACA GTAAAAGGCTTATTAAAGTG
1681 GATGGGGTTG TGACCAAGAA GAGGAAATCC TACTGTGTTG ACTTTGCTGCCATCCAGCCC
1741 CAGATCGCTT TACTCCAGGA AATGCACGTT ACACATTTTC GCTTCTCCCTGGACTGGGCC
1801 CTGATTCTCC CTCTGGGTAA CCAGTCCCAG GTGAACCACA CCATCCTGCAGTACTATCGC
1861 TGCATGGCCA GCGAGCTTGT CCGTGTCAAC ATCACCCCAG TGGTGGCCCTGTGGCAGCCT
1921 ATGGCCCCGA ACCAAGGACT GCCGCGCCTC CTGGCCAGGC AGGGCGCCTGGGAGAACCCC
1981 TACACTGCCC TGGCCTTTGC AGAGTATGCC CGACTGTGCT TTCAAGAGCTCGGCCATCAC
2041 GTCAAGCTTT GGATAACGAT GAATGAGCCG TATACAAGGA ATATGACATACAGTGCTGGC
2101 CACAACCTTC TGAAGGCCCA TGCCCTGGCT TGGCATGTGT ACAATGAAAAGTTTAGGCAT
2161 GCTCAGAATG GGAAAATATC CATAGCCTTG CAGGCTGATT GGATAGAACCTGCCTGCCCT
2221 TTCTCCCAAA AGGACAAAGA GGTGGCCGAG AGAGTTTTGG AATTTGACATTGGCTGGCTG
2281 GCTGAGCCCA TTTTCGGCTC TGGAGATTAT CCATGGGTGA TGAGGGACTGGCTGAACCAA
2341 AGAAACAATT TTCTTCTTCC TTATTTCACT GAAGATGAAA AAAAGCTAATCCAGGGTACC
2401 TTTGACTTTT TGGCTTTAAG CCATTATACC ACCATCCTTG TAGACTCAGAAAAAGAAGAT
2461 CCAATAAAAT ACAATGATTA CCTAGAAGTG CAAGAAATGA CCGACATCACGTGGCTCAAC
2521 TCCCCCAGTC AGGTGGCGGT AGTGCCCTGG GGGTTGCGCA AAGTGCTGAACTGGCTGAAG
2581 TTCAAGTACG GAGACCTCCC CATGTACATA ATATCCAACG GAATCGATGACGGGCTGCAT
2641 GCTGAGGACG ACCAGCTGAG GGTGTATTAT ATGCAGAATT ACATAAACGAAGCTCTCAAA
2701 GCCCACATAC TGGATGGTAT CAATCTTTGC GGATACTTTG CTTATTCGTTTAACGACCGC
2761 ACAGCTCCGA GGTTTGGCCT CTATCGTTAT GCTGCAGATC AGTTTGAGCCCAAGGCATCC
2821 ATGAAACATT ACAGGAAAAT TATTGACAGC AATGGTTTCC CGGGCCCAGAAACTCTGGAA
2881 AGATTTTGTC CAGAAGAATT CACCGTGTGT ACTGAGTGCA GTTTTTTTCACACCCGAAAG
2941 TCTTTAGGAT CCGGAGGTGG AGGTTCAGGA GGTGGAGGTT CAGGAGGTGGAGGTTCACTT
3001 AAGTATCCCA ATGCCTCCCC ACTGCTCGGC TCCAGCTGGG GTGGCCTGATCCACCTGTAC
3061 ACAGCCACAG CCAGGAACAG CTACCACCTG CAGATCCACA AGAATGGCCATGTGGATGGC
3121 GCACCCCATC AGACCATCTA CAGTGCCCTG ATGATCAGAT CAGAGGATGCTGGCTTTGTG
3181 GTGATTACAG GTGTGATGAG CAGAAGATAC CTCTGCATGG ATTTCAGAGGCAACATTTTT
3241 GGATCACACT ATTTCGACCC GGAGAACTGC AGGTTCCAAC ACCAGACGCTGGAAAACGGG
3301 TACGACGTCT ACCACTCTCC TCAGTATCAC TTCCTGGTCA GTCTGGGCCGGGCGAAGAGA
3361 GCCTTCCTGC CAGGCATGAA CCCACCCCCG TACTCCCAGT TCCTGTCCCGGAGGAACGAG
3421 ATCCCCCTAA TTCACTTCAA CACCCCCATA CCACGGCGGC ACACCCAGAGCGCCGAGGAC
3481 GACTCGGAGC GGGACCCCCT GAACGTGCTG AAGCCCCGGG CCCGGATGACCCCGGCCCCG
3541 GCCTCCTGTT CACAGGAGCT CCCGAGCGCC GAGGACAACA GCCCGATGGCCAGTGACCCA
3601 TTAGGGGTGG TCAGGGGCGG TCGAGTGAAC ACGCACGCTG GGGGAACGGGCCCGGAAGGC
3661 TGCCGCCCCT TCGCCAAGTT CATCGGAGGT GGAGGTTCAG CCCCAGAAGCAGCAGGTGGT
3721 CCATCAGTTT TTCTTTTCCC TCCCAAACCC AAGGATACGC TGATGATCTCTCGCACGCCT
3781 GAGGTGACAT GCGTCGTAGT AGACGTGAGC CACGAAGATC CCGAGGTGAAGTTCAATTGG
3841 TATGTGGACG GAGTAGAAGT GCATAACGCG AAAACTAAGC CGCGCGAGGAACAATATAAC
3901 AGTACTTACA GGGTGGTATC CGTGCTCACA GTCCTGCACC AGGACTGGCTGAACGGTAAG
3961 GAATACAAGT GCAAAGTAAG CAACAAGGCA CTTCCCGCGC CTATTGAGAAAACAATCTCC
4021 AAGGCGAAGG GACAACCAAG AGAACCTCAG GTTTACACTC TCCCGCCTTCCAGGGAAGAG
4081 ATGACCAAAA ATCAAGTTTC CCTGACTTGC CTCGTCAAAG GATTCTACCCTTCCGACATT
4141 GCTGTTGAAT GGGAAAGCAA TGGACAACCA GAGAACAACT ACAAGACAACACCCCCGGTG
4201 CTGGATAGTG ACGGATCTTT CTTTCTCTAC TCAAAGCTGA CCGTGGATAAGTCCAGGTGG
4261 CAGCAGGGAA ACGTGTTTTC CTGCTCTGTC ATGCATGAAG CGCTGCATAATCACTATACC
4321 CAGAAGTCTC TGAGCTTGAG CCCAGGCAAG TAA
sKlotho-FGF23-FcLALA v2(SEQ ID NO：49)
   1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LRAEPGDGAQ TWARFSRPPA
  51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
 101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
 151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
 201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
 251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
 301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
 351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
 401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
 451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
 501 IEKNGFPPLP ENQPLEGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ FTDLNVYLWD
 551 VHHSKRLIKV DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA
 601 LILPLGNQSQ VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL
 651 LARQGAWENP YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG
 701 HNLLKAHALA WHVYNEKFRH AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE
 751 RVLEFDIGWL AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT
 801 FDFLALSHYT TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN SPSQVAVVPW
 851 GLRKVLNWLK FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK
 901 AHILDGINLC GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS
 951 NGFPGPETLE RFCPEEFTVC TECSFFHTRK SLGSGGGGSG GGGSGGGGSL
1001 KYPNASPLLG SSWGGLIHLY TATARNSYHL QIHKNGHVDG APHQTIYSAL
1051 MIRSEDAGFV VITGVMSRRY LCMDFRGNIF GSHYFDPENC RFQHQTLENG
1101 YDVYHSPQYH FLVSLGRAKR AFLPGMNPPP YSQFLSRRNE IPLIHFNTPI
1151 PRRHTQSAED DSERDPLNVL KPRARMTPAP ASCSQELPSA EDNSPMASDP
1201 LGVVRGGRVN THAGGTGPEG CRPFAKFIGG GGSAPEAAGG PSVFLFPPKP
1251 KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
1301 STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ
1351 VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV
1401 LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
1451 ＊
FGF23-FcLALA v1(SEQ ID NO：50)
   1 ATGTTGGGGG CCCGCCTCAG GCTCTGGGTC TGTGCCTTGT GCAGCGTCTGCAGCATGAGC
  61 GTCCTCAGAG CCTATCCCAA TGCCTCCCCA CTGCTCGGCT CCAGCTGGGGTGGCCTGATC
 121 CACCTGTACA CAGCCACAGC CAGGAACAGC TACCACCTGC AGATCCACAAGAATGGCCAT
 181 GTGGATGGCG CACCCCATCA GACCATCTAC AGTGCCCTGA TGATCAGATCAGAGGATGCT
 241 GGCTTTGTGG TGATTACAGG TGTGATGAGC AGAAGATACC TCTGCATGGATTTCAGAGGC
 301 AACATTTTTG GATCACACTA TTTCGACCCG GAGAACTGCA GGTTCCAACACCAGACGCTG
 361 GAAAACGGGT ACGACGTCTA CCACTCTCCT CAGTATCACT TCCTGGTCAGTCTGGGCCGG
 421 GCGAAGAGAG CCTTCCTGCC AGGCATGAAC CCACCCCCGT ACTCCCAGTTCCTGTCCCGG
 481 AGGAACGAGA TCCCCCTAAT TCACTTCAAC ACCCCCATAC CACGGCGGCACACCCAGAGC
 541 GCCGAGGACG ACTCGGAGCG GGACCCCCTG AACGTGCTGA AGCCCCGGGCCCGGATGACC
 601 CCGGCCCCGG CCTCCTGTTC ACAGGAGCTC CCGAGCGCCG AGGACAACAGCCCGATGGCC
 661 AGTGACCCAT TAGGGGTGGT CAGGGGCGGT CGAGTGAACA CGCACGCTGGGGGAACGGGC
 721 CCGGAAGGCT GCCGCCCCTT CGCCAAGTTC ATCGGAGGTG GAGGTTCAAAAACCCACACG
 781 TGTCCTCCTT GTCCTGCCCC AGAAGCAGCA GGTGGTCCAT CAGTTTTTCTTTTCCCTCCC
 841 AAACCCAAGG ATACGCTGAT GATCTCTCGC ACGCCTGAGG TGACATGCGTCGTAGTAGAC
 901 GTGAGCCACG AAGATCCCGA GGTGAAGTTC AATTGGTATG TGGACGGAGTAGAAGTGCAT
 961 AACGCGAAAA CTAAGCCGCG CGAGGAACAA TATAACAGTA CTTACAGGGTGGTATCCGTG
1021 CTCACAGTCC TGCACCAGGA CTGGCTGAAC GGTAAGGAAT ACAAGTGCAAAGTAAGCAAC
1081 AAGGCACTTC CCGCGCCTAT TGAGAAAACA ATCTCCAAGG CGAAGGGACAACCAAGAGAA
1141 CCTCAGGTTT ACACTCTCCC GCCTTCCAGG GAAGAGATGA CCAAAAATCAAGTTTCCCTG
1201 ACTTGCCTCG TCAAAGGATT CTACCCTTCC GACATTGCTG TTGAATGGGAAAGCAATGGA
1261 CAACCAGAGA ACAACTACAA GACAACACCC CCGGTGCTGG ATAGTGACGGATCTTTCTTT
1321 CTCTACTCAA AGCTGACCGT GGATAAGTCC AGGTGGCAGC AGGGAAACGTGTTTTCCTGC
1381 TCTGTCATGC ATGAAGCGCT GCATAATCAC TATACCCAGA AGTCTCTGAGCTTGAGCCCA
1441 GGCAAGTAA
FGF23(R179Q)-FcLALAv1(SEQ ID NO：51)
   1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
  51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
 101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
 151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
 201 PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
 251 IGGGGSKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
 301 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
 351 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
 401 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
 451 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK＊
FGF23-FcLALA v2(SEQ ID NO：52)
   1 ATGTTGGGGG CCCGCCTCAG GCTCTGGGTC TGTGCCTTGT GCAGCGTCTGCAGCATGAGC
  61 GTCCTCAGAG CCTATCCCAA TGCCTCCCCA CTGCTCGGCT CCAGCTGGGGTGGCCTGATC
 121 CACCTGTACA CAGCCACAGC CAGGAACAGC TACCACCTGC AGATCCACAAGAATGGCCAT
 181 GTGGATGGCG CACCCCATCA GACCATCTAC AGTGCCCTGA TGATCAGATCAGAGGATGCT
 241 GGCTTTGTGG TGATTACAGG TGTGATGAGC AGAAGATACC TCTGCATGGATTTCAGAGGC
 301 AACATTTTTG GATCACACTA TTTCGACCCG GAGAACTGCA GGTTCCAACACCAGACGCTG
 361 GAAAACGGGT ACGACGTCTA CCACTCTCCT CAGTATCACT TCCTGGTCAGTCTGGGCCGG
 421 GCGAAGAGAG CCTTCCTGCC AGGCATGAAC CCACCCCCGT ACTCCCAGTTCCTGTCCCGG
 481 AGGAACGAGA TCCCCCTAAT TCACTTCAAC ACCCCCATAC CACGGCGGCACACCCAGAGC
 541 GCCGAGGACG ACTCGGAGCG GGACCCCCTG AACGTGCTGA AGCCCCGGGCCCGGATGACC
 601 CCGGCCCCGG CCTCCTGTTC ACAGGAGCTC CCGAGCGCCG AGGACAACAGCCCGATGGCC
 661 AGTGACCCAT TAGGGGTGGT CAGGGGCGGT CGAGTGAACA CGCACGCTGGGGGAACGGGC
 721 CCGGAAGGCT GCCGCCCCTT CGCCAAGTTC ATCGGAGGTG GAGGTTCAGCCCCAGAAGCA
 781 GCAGGTGGTC CATCAGTTTT TCTTTTCCCT CCCAAACCCA AGGATACGCTGATGATCTCT
 841 CGCACGCCTG AGGTGACATG CGTCGTAGTA GACGTGAGCC ACGAAGATCCCGAGGTGAAG
 901 TTCAATTGGT ATGTGGACGG AGTAGAAGTG CATAACGCGA AAACTAAGCCGCGCGAGGAA
 961 CAATATAACA GTACTTACAG GGTGGTATCC GTGCTCACAG TCCTGCACCAGGACTGGCTG
1021 AACGGTAAGG AATACAAGTG CAAAGTAAGC AACAAGGCAC TTCCCGCGCCTATTGAGAAA
1081 ACAATCTCCA AGGCGAAGGG ACAACCAAGA GAACCTCAGG TTTACACTCTCCCGCCTTCC
1141 AGGGAAGAGA TGACCAAAAA TCAAGTTTCC CTGACTTGCC TCGTCAAAGGATTCTACCCT
1201 TCCGACATTG CTGTTGAATG GGAAAGCAAT GGACAACCAG AGAACAACTACAAGACAACA
1261 CCCCCGGTGC TGGATAGTGA CGGATCTTTC TTTCTCTACT CAAAGCTGACCGTGGATAAG
1321 TCCAGGTGGC AGCAGGGAAA CGTGTTTTCC TGCTCTGTCA TGCATGAAGCGCTGCATAAT
1381 CACTATACCC AGAAGTCTCT GAGCTTGAGC CCAGGCAAGT AA
FGF23(R179Q)-FcLALAv2(SEQ ID NO：53)
  1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
 51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
201 PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
251 IGGGGSAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK
301 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS
351 NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP
401 SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
451 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK＊
sKlotho-FGF23(R1156Q，C1183S)的氨基酸序列(SEQ ID NO：54)
sKlotho：aa[氨基酸]1-982；连接子1：aa 983-1001；FGF23：aa 1002-1228
   1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LRAEPGDGAQ TWARFSRPPA
  51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
 101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
 151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
 201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
 251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
 301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
 351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
 401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
 451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
 501 IEKNGFPPLP ENQPLEGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ FTDLNVYLWD
 551 VHHSKRLIKV DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA
 601 LILPLGNQSQ VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL
 651 LARQGAWENP YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG
 701 HNLLKAHALA WHVYNEKFRH AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE
 751 RVLEFDIGWL AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT
 801 FDFLALSHYT TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN SPSQVAVVPW
 851 GLRKVLNWLK FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK
 901 AHILDGINLC GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS
 951 NGFPGPETLE RFCPEEFTVC TECSFFHTRK SLGSGGGGSG GGGSGGGGSL
1001 KYPNASPLLG SSWGGLIHLY TATARNSYHL QIHKNGHVDG APHQTIYSAL
1051 MIRSEDAGFV VITGVMSRRY LCMDFRGNIF GSHYFDPENC RFQHQTLENG
1101 YDVYHSPQYH FLVSLGRAKR AFLPGMNPPP YSQFLSRRNE IPLIHFNTPI
1151 PRRHTQSAED DSERDPLNVL KPRARMTPAP ASSQELPSA EDNSPMASDP
1201 LGVVRGGRVN THAGGTGPEG CRPFAKFI＊
sKlotho-FGF23(R1156Q，C1221S)的氨基酸序列(SEQ ID NO：55)
sKlotho：1-982；连接子1：983-1001；FGF23：1002-1228；
   1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LRAEPGDGAQ TWARFSRPPA
  51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
 101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
 151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
 201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
 251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
 301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
 351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
 401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
 451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
 501 IEKNGFPPLP ENQPLEGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ FTDLNVYLWD
 551 VHHSKRLIKV DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA
 601 LILPLGNQSQ VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL
 651 LARQGAWENP YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG
 701 HNLLKAHALA WHVYNEKFRH AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE
 751 RVLEFDIGWL AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT
 801 FDFLALSHYT TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN SPSQVAVVPW
 851 GLRKVLNWLK FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK
 901 AHILDGINLC GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS
 951 NGFPGPETLE RFCPEEFTVC TECSFFHTRK SLGSGGGGSG GGGSGGGGSL
1001 KYPNASPLLG SSWGGLIHLY TATARNSYHL QIHKNGHVDG APHQTIYSAL
1051 MIRSEDAGFV VITGVMSRRY LCMDFRGNIF GSHYFDPENC RFQHQTLENG
1101 YDVYHSPQYH FLVSLGRAKR AFLPGMNPPP YSQFLSRRNE IPLIHFNTPI
1151 PRRHTQSAED DSERDPLNVL KPRARMTPAP ASCSQELPSA EDNSPMASDP
1201 LGVVRGGRVN THAGGTGPEG
Figure BDA00001944139901091
RPFAKFI＊
sKlotho-FGF23(R1156Q，Q1133A)的氨基酸序列(SEQ ID NO：56)
sKlotho：1-982；连接子1：983-1001；FGF23：1002-1228
   1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LRAEPGDGAQ TWARFSRPPA
  51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
 101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
 151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
 201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
 251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
 301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
 351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
 401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
 451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
 501 IEKNGFPPLP ENQPLEGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ FTDLNVYLWD
 551 VHHSKRLIKV DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA
 601 LILPLGNQSQ VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL
 651 LARQGAWENP YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG
 701 HNLLKAHALA WHVYNEKFRH AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE
 751 RVLEFDIGWL AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT
 801 FDFLALSHYT TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN SPSQVAVVPW
 851 GLRKVLNWLK FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK
 901 AHILDGINLC GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS
 951 NGFPGPETLE RFCPEEFTVC TECSFFHTRK SLGSGGGGSG GGGSGGGGSL
1001 KYPNASPLLG SSWGGLIHLY TATARNSYHL QIHKNGHVDG APHQTIYSAL
1051 MIRSEDAGFV VITGVMSRRY LCMDFRGNIF GSHYFDPENC RFQHQTLENG
1101 YDVYHSPQYH FLVSLGRAKR AFLPGMNPPP YS
Figure BDA00001944139901092
FLSRRNE IPLIHFNTPI
1151 PRRHTQSAED DSERDPLNVL KPRARMTPAP ASCSQELPSA EDNSPMASDP
1201 LGVVRGGRVN THAGGTGPEG CRPFAKFI＊
sKlotho-FGF23(R1156Q，C1183S，C1221S)的氨基酸序列(SEQ ID NO：57)
sKlotho：1-982；连接子1：983-1001；FGF23：1002-1228
   1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LRAEPGDGAQ TWARFSRPPA
  51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
 101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
 151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
 201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
 251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
 301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
 351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
 401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
 451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
 501 IEKNGFPPLP ENQPLEGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ FTDLNVYLWD
 551 VHHSKRLIKV DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA
 601 LILPLGNQSQ VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL
 651 LARQGAWENP YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG
 701 HNLLKAHALA WHVYNEKFRH AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE
 751 RVLEFDIGWL AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT
 801 FDFLALSHYT TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN SPSQVAVVPW
 851 GLRKVLNWLK FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK
 901 AHILDGINLC GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS
 951 NGFPGPETLE RFCPEEFTVC TECSFFHTRK SLGSGGGGSG GGGSGGGGSL
1001 KYPNASPLLG SSWGGLIHLY TATARNSYHL QIHKNGHVDG APHQTIYSAL
1051 MIRSEDAGFV VITGVMSRRY LCMDFRGNIF GSHYFDPENC RFQHQTLENG
1101 YDVYHSPQYH FLVSLGRAKR AFLPGMNPPP YSQFLSRRNE IPLIHFNTPI
1151 PRRHTQSAED DSERDPLNVL KPRARMTPAP AS
Figure BDA00001944139901101
SQELPSA EDNSPMASDP
1201 LGVVRGGRVN THAGGTGPEG
Figure BDA00001944139901102
RPFAKFI＊
sKlotho-FGF23(R1156Q，C1183S，C1221S，Q1133A)的氨基酸序列(SEQ IDNO：58)
sKlotho：1-982；连接子1：983-1001；FGF23：1002-1228
   1 MPASAPPRRP RPPPPSLSLL LVLLGLGGRR LRAEPGDGAQ TWARFSRPPA
  51 PEAAGLFQGT FPDGFLWAVG SAAYQTEGGW QQHGKGASIW DTFTHHPLAP
 101 PGDSRNASLP LGAPSPLQPA TGDVASDSYN NVFRDTEALR ELGVTHYRFS
 151 ISWARVLPNG SAGVPNREGL RYYRRLLERL RELGVQPVVT LYHWDLPQRL
 201 QDAYGGWANR ALADHFRDYA ELCFRHFGGQ VKYWITIDNP YVVAWHGYAT
 251 GRLAPGIRGS PRLGYLVAHN LLLAHAKVWH LYNTSFRPTQ GGQVSIALSS
 301 HWINPRRMTD HSIKECQKSL DFVLGWFAKP VFIDGDYPES MKNNLSSILP
 351 DFTESEKKFI KGTADFFALC FGPTLSFQLL DPHMKFRQLE SPNLRQLLSW
 401 IDLEFNHPQI FIVENGWFVS GTTKRDDAKY MYYLKKFIME TLKAIKLDGV
 451 DVIGYTAWSL MDGFEWHRGY SIRRGLFYVD FLSQDKMLLP KSSALFYQKL
 501 IEKNGFPPLP ENQPLEGTFP CDFAWGVVDN YIQVDTTLSQ FTDLNVYLWD
 551 VHHSKRLIKV DGVVTKKRKS YCVDFAAIQP QIALLQEMHV THFRFSLDWA
 601 LILPLGNQSQ VNHTILQYYR CMASELVRVN ITPVVALWQP MAPNQGLPRL
 651 LARQGAWENP YTALAFAEYA RLCFQELGHH VKLWITMNEP YTRNMTYSAG
 701 HNLLKAHALA WHVYNEKFRH AQNGKISIAL QADWIEPACP FSQKDKEVAE
 751 RVLEFDIGWL AEPIFGSGDY PWVMRDWLNQ RNNFLLPYFT EDEKKLIQGT
 801 FDFLALSHYT TILVDSEKED PIKYNDYLEV QEMTDITWLN SPSQVAVVPW
 851 GLRKVLNWLK FKYGDLPMYI ISNGIDDGLH AEDDQLRVYY MQNYINEALK
 901 AHILDGINLC GYFAYSFNDR TAPRFGLYRY AADQFEPKAS MKHYRKIIDS
 951 NGFPGPETLE RFCPEEFTVC TECSFFHTRK SLGSGGGGSG GGGSGGGGSL
1001 KYPNASPLLG SSWGGLIHLY TATARNSYHL QIHKNGHVDG APHQTIYSAL
1051 MIRSEDAGFV VITGVMSRRY LCMDFRGNIF GSHYFDPENC RFQHQTLENG
1101 YDVYHSPQYH FLVSLGRAKR AFLPGMNPPP YS
Figure BDA00001944139901103
FLSRRNE IPLIHFNTPI
1151 PRRHTQSAED DSERDPLNVL KPRARMTPAP AS
Figure BDA00001944139901104
SQELPSA EDNSPMASDP
1201 LGVVRGGRVN THAGGTGPEG
Figure BDA00001944139901105
RPFAKFI＊
FGF23(R179Q；C206S)-FcLALAv1的氨基酸序列(SEQ ID NO：59)
FGF23：1-251；连接子：252-256；FcLALA：257-482
   1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
  51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
 101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
 151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
 201 PAPAS
Figure BDA00001944139901106
SQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
 251 IGGGGSKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
 301 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
 351 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
 401 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
 451 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK＊
FGF23(R179Q，C244S)-FcLALAv1的氨基酸序列(SEQ ID NO：60)
FGF23：1-251；连接子：252-256；FcLALA：257-482
  1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
 51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
201 PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEG
Figure BDA00001944139901111
RPFAKF
251 IGGGGSKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
301 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
351 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
401 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
451 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK＊
FGF23(R179Q，Q156A)-FcLALAv1的氨基酸序列(SEQ ID NO：61)
FGF23：1-251；连接子：252-256；FcLALA：257-482
  1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
 51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
151 PPPYSFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
201 PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
251 IGGGGSKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
301 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
351 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
401 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
451 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK＊
FGF23(R179Q，C206S，C244S)-FcLALAv1的氨基酸序列(SEQ ID NO：62)
FGF23：1-251；连接子：252-256；FcLALA：257-482
  1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
 51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
201 PAPAS
Figure BDA00001944139901113
SQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEG
Figure BDA00001944139901114
RPFAKF
251 IGGGGSKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
301 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
351 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
401 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
451 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK＊
FGF23(R179Q，C206S，C244S，Q156A)-FcLALAv1的氨基酸序列(SEQ IDNO：63)
FGF23：1-251；连接子：252-256；FcLALA：257-482
  1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
 51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
151 PPPYS
Figure BDA00001944139901121
FLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
201 PAPAS
Figure BDA00001944139901122
SQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEG
Figure BDA00001944139901123
RPFAKF
251 IGGGGSKTHT CPPCPAPEAA GGPSVFLFPP KPKDTLMISR TPEVTCVVVD
301 VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ YNSTYRVVSV LTVLHQDWLN
351 GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE PQVYTLPPSR EEMTKNQVSL
401 TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS
451 RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP GK＊
FGF23(R179Q，C206S)-FcLALAv2的氨基酸序列(SEQ ID NO：64)
FGF23：1-251；连接子：252-256；FcLALA：257-473
  1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
 51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
201 PAPASSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
251 IGGGGSAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK
301 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS
351 NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP
401 SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
451 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK＊
FGF23(R179Q，C244S)-FcLALAv2的氨基酸序列(SEQ ID NO：65)
FGF23：1-251；连接子：252-256；FcLALA：257-473
  1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
 51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
201 PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEG
Figure BDA00001944139901125
RPFAKF
251 IGGGGSAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK
301 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS
351 NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP
401 SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
451 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK＊
FGF23(R179Q，Q156A)-FcLALAv2的氨基酸序列(SEQ ID NO：66)
FGF23：1-251；连接子：252-256；FcLALA：257-473
  1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
 51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
151 PPPYS
Figure BDA00001944139901131
FLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
201 PAPASCSQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEGCRPFAKF
251 IGGGGSAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK
301 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS
351 NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP
401 SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
451 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK＊
FGF23(R179Q，C206S，C244S)-FcLALAv2的氨基酸序列(SEQ ID NO：67)
FGF23：1-251；连接子：252-256；FcLALA：257-473
  1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
 51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR AKRAFLPGMN
151 PPPYSQFLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
201 PAPAS
Figure BDA00001944139901132
SQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEG
Figure BDA00001944139901133
RPFAKF
251 IGGGGSAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK
301 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS
351 NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP
401 SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
451 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK＊
FGF23(R179Q，C206S，C244S，Q156A)-FcLALAv2的氨基酸序列(SEQ IDNO：68)
FGF23：1-251；连接子：252-256；FcLALA：257-473
  1 MLGARLRLWV CALCSVCSMS VLRAYPNASP LLGSSWGGLI HLYTATARNS
 51 YHLQIHKNGH VDGAPHQTIY SALMIRSEDA GFVVITGVMS RRYLCMDFRG
101 NIFGSHYFDP ENCRFQHQTL ENGYDVYHSP QYHFLVSLGR  AKRAFLPGMN
151 PPPYS
Figure BDA00001944139901134
FLSR RNEIPLIHFN TPIPRRHTQS AEDDSERDPL NVLKPRARMT
201 PAPAS
Figure BDA00001944139901135
SQEL PSAEDNSPMA SDPLGVVRGG RVNTHAGGTG PEG
Figure BDA00001944139901136
RPFAKF
251 IGGGGSAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK
301 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS
351 NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP
401 SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS
451 CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK＊
Figure IDA00001944140600011
Figure IDA00001944140600021
Figure IDA00001944140600031
Figure IDA00001944140600041
Figure IDA00001944140600051
Figure IDA00001944140600061
Figure IDA00001944140600071
Figure IDA00001944140600081
Figure IDA00001944140600091
Figure IDA00001944140600101
Figure IDA00001944140600111
Figure IDA00001944140600121
Figure IDA00001944140600141
Figure IDA00001944140600151
Figure IDA00001944140600171
Figure IDA00001944140600181
Figure IDA00001944140600191
Figure IDA00001944140600201
Figure IDA00001944140600211
Figure IDA00001944140600221
Figure IDA00001944140600231
Figure IDA00001944140600251
Figure IDA00001944140600261
Figure IDA00001944140600271
Figure IDA00001944140600281
Figure IDA00001944140600291
Figure IDA00001944140600311
Figure IDA00001944140600321
Figure IDA00001944140600331
Figure IDA00001944140600351
Figure IDA00001944140600361
Figure IDA00001944140600371
Figure IDA00001944140600381
Figure IDA00001944140600391
Figure IDA00001944140600401
Figure IDA00001944140600411
Figure IDA00001944140600421
Figure IDA00001944140600431
Figure IDA00001944140600441
Figure IDA00001944140600461
Figure IDA00001944140600471
Figure IDA00001944140600481
Figure IDA00001944140600491
Figure IDA00001944140600501
Figure IDA00001944140600521
Figure IDA00001944140600531
Figure IDA00001944140600541
Figure IDA00001944140600551
Figure IDA00001944140600561
Figure IDA00001944140600581
Figure IDA00001944140600601
Figure IDA00001944140600611
Figure IDA00001944140600621
Figure IDA00001944140600631
Figure IDA00001944140600641
Figure IDA00001944140600651
Figure IDA00001944140600661
Figure IDA00001944140600671
Figure IDA00001944140600681
Figure IDA00001944140600691
Figure IDA00001944140600701
Figure IDA00001944140600711
Figure IDA00001944140600721
Figure IDA00001944140600751
Figure IDA00001944140600761
Figure IDA00001944140600771
Figure IDA00001944140600781
Figure IDA00001944140600801
Figure IDA00001944140600821
Figure IDA00001944140600831
Figure IDA00001944140600851
Figure IDA00001944140600861
Figure IDA00001944140600871
Figure IDA00001944140600881
Figure IDA00001944140600891
Figure IDA00001944140600901
Figure IDA00001944140600911
Figure IDA00001944140600931
Figure IDA00001944140600941
Figure IDA00001944140600951
Figure IDA00001944140600961
Figure IDA00001944140600971
Figure IDA00001944140600981
Figure IDA00001944140600991
Figure IDA00001944140601001
Figure IDA00001944140601011
Figure IDA00001944140601021
Figure IDA00001944140601051
Figure IDA00001944140601061
Figure IDA00001944140601071
Figure IDA00001944140601081
Figure IDA00001944140601091
Figure IDA00001944140601101
Figure IDA00001944140601111
Figure IDA00001944140601131
Figure IDA00001944140601141
Figure IDA00001944140601151
Figure IDA00001944140601161
Figure IDA00001944140601181
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Claims (47)

1.融合多肽，所述融合多肽包含：(a)包含成纤维细胞生长因子23(FGF23)的多肽，或其功能活性变体或衍生物，其中FGF23在位置Q156、C206和C244中的一处或多处具有突变；以及(b)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段，或包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽，或其功能活性变体或衍生物；以及任选地(c)连接子。
2.权利要求1的融合多肽，其中(a)的多肽有效连接至(b)的多肽的N-末端。
3.权利要求1的融合多肽，其中(b)的多肽有效连接至(a)的多肽的N-末端。
4.权利要求1的融合多肽，其中(a)的多肽和(b)的多肽通过多肽连接子连结。
5.权利要求4的融合多肽，其中多肽连接子包含选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18构成的组的氨基酸序列。
6.权利要求4的融合多肽，其中多肽连接子包含选自SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQID NO：17和SEQ ID NO：18构成的组的氨基酸序列的至少1个至至多大约30个重复。
7.权利要求4的融合多肽，其中(a)的多肽通过肽键连结至所述多肽连接子的N-末端，并且(b)的多肽通过肽键连结至所述多肽连接子的C-末端。
8.权利要求4的融合多肽，其中(a)的多肽通过肽键连结至所述多肽连接子的C-末端，并且(b)的多肽通过肽键连结至所述多肽连接子的N-末端。
9.权利要求1的融合多肽，其中Klotho蛋白的细胞外亚结构域是KL-D1或KL-D2结构域。
10.权利要求1的融合多肽，其中(a)的多肽包含Klotho蛋白的至少两个细胞外亚结构域。
11.权利要求10的融合多肽，其中Klotho蛋白的至少两个细胞外亚结构域是串联重复的至少两个KL-D1结构域。
12.权利要求10的融合多肽，其中Klotho蛋白的至少两个细胞外亚结构域是串联重复的至少两个KL-D2结构域。
13.权利要求10的融合多肽，其中Klotho蛋白的至少两个细胞外亚结构域包含KL-D1结构域和KL-D2结构域。
14.权利要求1的融合多肽，其中(a)的多肽是Klotho蛋白的细胞外结构域。
15.权利要求1的融合多肽，还包含信号肽。
16.权利要求15的融合多肽，其中信号肽是Klotho信号肽。
17.权利要求15的融合多肽，其中信号肽是IgG信号肽。
18.权利要求1的融合多肽，其与成纤维细胞生长因子受体特异性结合。
19.权利要求1的融合多肽，其中Klotho蛋白是α-Klotho。
20.权利要求1的融合多肽，其中Klotho蛋白是β-Klotho。
21.权利要求19的融合多肽，其中成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子-23(FGF23)或成纤维细胞生长因子-23变体(R179Q)。
22.权利要求20的融合多肽，其中所述成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子-19或成纤维细胞生长因子21。
23.包含与SEQ ID NO：54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67或68的氨基酸序列具有95％或更多同一性的氨基酸序列的权利要求1的融合多肽。
24.具有SEQ ID NO：58，或SEQ ID NO：68的氨基酸序列的权利要求1的融合多肽。
25.包含FcLALA的权利要求1的融合多肽。
26.包含权利要求1的融合多肽和可药用载剂的药物组合物。
27.包含编码权利要求1的融合多肽的序列的核酸。
28.含有权利要求27的核酸的宿主细胞。
29.包含权利要求27的核酸的载体。
30.在个体中治疗或预防年龄相关病况的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效剂量的、包含下述融合多肽的药物组合物，所述融合多肽包含：(a)包含成纤维细胞生长因子23(FGF23)的多肽，或其功能活性变体或衍生物，其中FGF23在位置Q156、C206和C244中的一处或多处具有突变；以及(b)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段，或包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽，或其功能活性变体或衍生物；以及任选地(c)连接子。
31.权利要求30的方法，其中所述年龄相关病况选自肌肉减少症、皮肤萎缩、肌消减、脑萎缩、动脉粥样硬化、动脉硬化、肺气肿、骨质疏松、骨关节炎、免疫无活性、高血压、痴呆、亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏症、白内障、年龄相关的黄斑变性、前列腺癌、中风、缩短的预期寿命、失忆、皱纹、受损的肾功能和年龄相关的听力损失构成的组。
32.权利要求30的方法，其中Klotho蛋白是αKlotho蛋白。
33.权利要求31的方法，其中年龄相关病况是肌消减，Klotho蛋白是αKlotho蛋白，并且成纤维细胞生长因子是成纤维细胞生长因子-23。
34.在个体中治疗或预防代谢病症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效剂量的、包含下述融合多肽的药物组合物，所述融合多肽包含：(a)包含成纤维细胞生长因子23(FGF23)的多肽，或其功能活性变体或衍生物，其中FGF23在位置Q156、C206和C244中的一处或多处具有突变；以及(b)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段，或包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽，或其功能活性变体或衍生物；以及任选地(c)连接子。
35.权利要求34的方法，其中代谢病症选自II型糖尿病、代谢综合征、高血糖和肥胖构成的组。
36.权利要求34的方法，其中融合多肽包含：(a)包含β-Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽；以及(b)包含成纤维细胞因子21的多肽。
37.在个体中治疗或预防高磷酸盐血或钙质沉着症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效剂量的、包含下述融合多肽的药物组合物，所述融合多肽包含：(a)包含成纤维细胞生长因子23(FGF23)的多肽，或其功能活性变体或衍生物，其中FGF23在位置Q156、C206和C244中的一处或多处具有突变；以及(b)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段，或包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽，或其功能活性变体或衍生物；以及任选地(c)连接子。
38.权利要求37的方法，其中融合多肽包含：(a)包含αKlotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽；以及(b)包含成纤维细胞因子23的多肽。
39.在个体中治疗或预防慢性肾病或慢性肾衰竭的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效剂量的、包含下述融合多肽的药物组合物，所述融合多肽包含：(a)包含成纤维细胞生长因子23(FGF23)的多肽，或其功能活性变体或衍生物，其中FGF23在位置Q156、C206和C244中的一处或多处具有突变；以及(b)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段，或包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽，或其功能活性变体或衍生物；以及任选地(c)连接子。
40.权利要求39的方法，其中Klotho蛋白是αKlotho蛋白。
41.在个体中治疗或预防癌症的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗有效剂量的、包含下述融合多肽的药物组合物，所述融合多肽包含：(a)包含成纤维细胞生长因子23(FGF23)的多肽，或其功能活性变体或衍生物，其中FGF23在位置Q156、C206和C244中的一处或多处具有突变；以及(b)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段，或包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽，或其功能活性变体或衍生物；以及任选地(c)连接子。
42.权利要求41的方法，其中癌症是乳腺癌。
43.权利要求41的方法，其中Klotho蛋白是αKlotho蛋白。
44.权利要求1的融合多肽，其中Klotho蛋白是人Klotho蛋白。
45.权利要求1的融合多肽用于治疗或预防肌萎缩。
46.治疗或预防肌萎缩的方法，所述方法包括(或基本由下述构成，或由下述构成)：向有需要的个体施用治疗有效剂量的药物组合物，所述药物组合物包含SEQ ID NO：47，或SEQ ID NO：49的可溶Klotho融合蛋白。
47.在个体中治疗或预防肌萎缩的方法，所述方法包括(或基本由下述构成，或由下述构成)：向有需要的个体施用治疗有效剂量的药物组合物，所述药物组合物包含：(a)包含成纤维细胞生长因子23(FGF23)的多肽，或其功能活性变体或衍生物，其中FGF23在位置Q156、C206和C244中的一处或多处具有突变；以及(b)具有减少的对Fc-γ-受体的亲和性和/或增加的血清半寿期的经修饰的Fc片段，或包含Klotho蛋白的至少一个细胞外亚结构域的多肽，或其功能活性变体或衍生物；以及任选地(c)连接子。
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