JP2016190847A - Ｆｇｆ２３融合ポリペプチドを使用する方法および組成物 - Google Patents

Ｆｇｆ２３融合ポリペプチドを使用する方法および組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】加齢関連状態または代謝障害の予防または処置するための方法、キットおよび組成物の提供。【解決手段】（ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメント、またはクロトー(Klotho)タンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチド。該融合ポリペプチドを有効成分とする加齢関連状態または代謝障害の予防または処置するための方法、キットおよび組成物。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１０年１月２９日付け米国出願シリアル番号１２／６９６６９３（この
内容を出典明示によりその全体を本明細書に包含させる）の優先権を主張する。
１．背景
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）は、多数の生物体において発現される相同ポリペプチド
増殖因子のファミリーを構成する（Ornitz and Itoh, Genome Biol. 2: reviews, 3005.1
-3005.12 (2001)）。脊椎動物種において、ＦＧＦは、遺伝子構造およびアミノ酸配列の
両方において高度に保存されており、互いに１３−７１％のアミノ酸同一性を有する。ヒ
トにおいて、２２の既知のＦＧＦファミリーメンバーがある（ＦＧＦ１５はヒトＦＧＦ１
９のマウスオルソログであり、したがってヒトＦＧＦ１５はない）。初期の発達において
、ＦＧＦは細胞増殖、移動および分化を調節するが、成体において、ＦＧＦはホメオスタ
シス、組織修復機能および損傷応答を維持する。
ＦＧＦは、細胞表面ＦＧＦ受容体に結合し、それにより活性化されることにより増殖因
子として機能する。ＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）は、ＦＧＦＲの自己リン酸化、ＦＲＳ２（
ＦＧＦ受容体基質２）およびＥＲＫ１／２（細胞外シグナル−調節タンパク質キナーゼ１
／２）のリン酸化を介してシグナル伝達を活性化する、およびＥｇｒ−１（初期増殖応答
−１）を活性化する、チロシンキナーゼ受容体である。ＦＧＦは、また、へパラン硫酸プ
ロテオグリカンに対して高親和性を有する。ＦＧＦに結合するとき、へパラン硫酸はＦＧ
ＦＲの活性化を高める。
アルファ−クロトー(Klotho)遺伝子は、細胞外ドメインおよび短い細胞質ドメインを有
する１３０ｋＤａのＩ型の１回膜貫通タンパク質をコードする。アルファ−クロトータン
パク質の細胞外ドメインは、ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２と称される２つのサブドメイン
を含む。これらの２つのサブドメインは、細菌および植物のβ−グルコシダーゼと配列相
同性を共有している。アルファ−クロトータンパク質の細胞外ドメインは、膜貫通ドメイ
ンにより細胞表面に結合しているか、または開裂し、細胞外環境へ放出され得る。細胞外
ドメインの開裂は、その場の低い細胞外Ｃａ２＋濃度によって、促進されるようである。
アルファ−クロトーに加えて、アルファ−クロトーのホモログであるベータ−クロトー
が同定されている（Itoら Mech. Dev. 98:115-9 (2000)）。ベータ−クロトーも、細胞外
ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２サブドメインを有するＩ型の１回膜貫通タンパク質である。
アルファ−クロトー発現の調節によって、哺乳動物における老化関連特性を生産するこ
とが証明されている。アルファ−クロトー遺伝子において機能喪失変異のマウスホモ接合
体は、寿命の短縮、皮膚萎縮、筋肉疲労、動脈硬化症、肺気腫および骨粗鬆症を含むヒト
の老化に類似した特性を発生させる（Kuro-oら Nature, 390:45-51 (1997)）。対照的に
、マウスにおけるアルファ−クロトー遺伝子の過剰発現は、寿命を延長させ、野生型マウ
スと比較して酸化ストレスに対する抵抗性を増加させる（Kurosuら Science 309:1829-18
33 (2005); Yamamotoら J. Biol. Chem. 280:38029-38034 (2005)）。
最近の研究によって、ＦＧＦ２３およびアルファ−クロトー間の機能的なクロストーク
を示すＦＧＦ２３−欠損マウスおよびアルファ−クロトー−欠損マウス間で著しく類似の
生物学的特性が証明された（Shimadaら J. Clin. Invest. 113:561-568 (2004); Yoshida
ら Endocrinology 143:683-689 (2002)）。これらの研究では、ＦＧＦ２３と相同のＦＧ
Ｆ受容体を介する結合およびシグナル伝達の両方に関して、ＦＧＦ２３の必須のパートナ
ーとしてアルファ−クロトーの同定に至った（Urakawaら Nature 22:1524-6 (2007)）。
アルファ−クロトー遺伝子は、主に腎臓、副甲状腺および脈絡叢において発現する。アル
ファ−クロトーの組織特異的発現は、これらの組織におけるＦＧＦ２３シグナル伝達の活
性化を限定するという仮説が立てられている。
ＦＧＦ２３／アルファ−クロトーと同様に、ベータ−クロトーは、ＦＧＦ１９およびＦ
ＧＦ２１それぞれの相同のＦＧＦ受容体を介する結合およびシグナル伝達の両方に関して
、ＦＧＦ１９およびＦＧＦ２１の必須のパートナーである（Ogawaら Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 104:7432-7 (2007); Linら J. Biol Chem. 282:27227-84 (2007);およびWuら J
. Biol. Chem. 282:29069-72 (2007)）。このような研究は、また、組織特異的な代謝活
性の調節におけるベータ−クロトーの関与を証明した。ベータ−クロトーは、脂肪組織に
おける炭水化物および脂質代謝を調節するための補因子として、ＦＧＦ２１と共に作用す
ることが最初に示された。ＦＧＦ１９とともにベータ−クロトーは、肝臓における胆汁酸
代謝を調節し、したがって、ベータ−クロトー欠損マウスにおける胆汁合成の増加を説明
する（Itoら J Clin Invest. 2005 Aug;115(8):2202-8）。
米国特許第６，５７９，８５０号は、アルファ−クロトーポリペプチドを含むポリペプ
チドおよび組成物を記載している。ヒトおよびマウスアルファ−クロトーポリペプチドを
記載している。該特許は、該ポリペプチドを含む組成物が早期老化に類似した症候群の処
置、成人疾患の処置および老化の抑制において有用であることも記載している。
米国特許第７，２２３，５６３号は、ＦＧＦ２３ポリペプチド配列をコードする単離さ
れた核酸またはこのような単離された核酸を含む組換え細胞を記載している。該特許はさ
らに、低リン酸血症性および高リン酸血症性障害、骨粗鬆症、皮膚筋炎および冠動脈疾患
を診断および処置する方法に関する。
米国特許第７，２５９，２４８号は、ＦＧＦ２１ポリペプチド配列をコードする単離さ
れた核酸を記載している。該特許はさらに、肝臓疾患、胸腺機能関連状態を診断および処
置する方法ならびに精巣の状態を処置する方法に関する。
２．発明の概要
本明細書は、融合ポリペプチドまたは可溶性ポリペプチドでの加齢関連状態または代謝
障害を予防または処置するための方法、使用、キットおよび組成物に関する。本明細書の
融合ポリペプチドは、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２３）、およびクロトータンパク質または
その活性なフラグメント（例えば、ｓクロトー）および／またはＦｃフラグメント（例え
ば、ＦｃＬＡＬＡ）のいずれか、および、所望により、リンカーから形成される。いくつ
かの態様において、ＦＧＦ２３は変異される。いくつかの態様において、本明細書は、ク
ロトータンパク質またはその活性なフラグメントおよび線維芽細胞増殖因子またはその活
性なフラグメントを含むクロトー融合ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において
、融合ポリペプチドは、クロトーポリペプチド、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２３）および修
飾されたＦｃフラグメントを含む。Ｆｃフラグメントは、例えば、減少したＦｃ−ガンマ
−受容体への結合および増加した血清半減期を有することができる。ｓクロトー、ＦＧＦ
２３およびＦｃＬＡＬＡ（減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしく
は増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメント）を含む融合タンパク質は、
配列番号４６、４７、４８および４９に記載されている。いくつかの態様において、融合
ポリペプチドまたはタンパク質は、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２３）またはその機能的に活
性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／または
１つのアミノ酸欠失を含む変異体）、および修飾されたＦｃフラグメントまたはその機能
的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／
または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）を含む。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む
融合タンパク質は、配列番号５０、５１、５２および５３に記載されている。いくつかの
態様において、融合ポリペプチドは、凝集および／もしくはプロテアーゼ介在開裂を減少
させるＦＧＦ２３において１つ以上の変異を有する。
第１の局面において、本明細書は、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブ
ドメインおよび線維芽細胞増殖因子またはそれらの活性なフラグメントを有する融合ポリ
ペプチドを提供する。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガ
ンマ−受容体に対する親和性（例えば、減少したＫａまたは増加したＫｄ）および／また
は増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。クロトー細胞
外ドメインは、アルファまたはベータクロトーアイソフォームのいずれか由来であり得る
。さらに、クロトー融合ポリペプチドのＦＧＦ成分は、線維芽細胞増殖因子−１９、線維
芽細胞増殖因子−２１および線維芽細胞増殖因子−２３に関して主に記載されているが、
任意の２３個の既知のＦＧＦを本明細書の実施において使用することができると考慮され
る。本出願の読者は、それぞれのヒトＦＧＦタンパク質またはそれらの活性なフラグメン
トとアルファまたはベータ細胞外ドメインとのそれぞれの全ての組合せを、個々におよび
具体的に考慮すると想定し得る。
本明細書において、クロトータンパク質の細胞外ドメインは、クロトータンパク質のＫ
Ｌ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ２ドメインまたはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体
（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む
変異体）の１つまたは両方を含むことができる。いくつかの態様において、本明細書のク
ロトー融合ポリペプチドは、クロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメイン
またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存アミノ
酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）を有する。例えば、少なくとも
２つの細胞外サブドメインは、タンデムリピートにおける少なくとも２つのＫＬ−Ｄ１ド
メイン、タンデムリピートにおける少なくとも２つのＫＬ−Ｄ２ドメイン、または少なく
とも１つのＫＬ−Ｄ１ドメインおよび少なくとも１つのＫＬ−Ｄ２ドメインであり得る。
種々の態様において、本明細書の融合ポリペプチドは、全長アルファクロトータンパク質
のアミノ酸２８−２９２またはアミノ酸２８−９８２（配列番号：７）を含む。別の態様
において、本明細書の融合ポリペプチドは、全長ベータクロトータンパク質のアミノ酸５
２−９９７を含む。
本明細書の１つの態様において、融合ポリペプチドの成分は、（ａ）線維芽細胞増殖因
子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なく
とも１つの保存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）を含むポ
リペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４４の１つ以上の位
置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親
和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメント、または
クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドのいずれ
か、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保
存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）、および、所望により
（ｃ）リンカーを含む。成分は、例えば、ペプチド結合によりインフレームにて化学的に
連結または融合され得る。それらはまた、リンカーを介して連結され得る。ポリペプチド
リンカーの非限定的な例は、配列番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７およ
び１８である。このようなリンカーは、少なくとも１個、最大約３０個の繰り返しの配列
番号：１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８を含み得る。別の非限定的
な態様において、融合ポリペプチドは、（２）ＦＧＦまたはその活性なフラグメントおよ
び（３）修飾されたＦｃフラグメントを含む。融合ポリペプチドの種々の成分は、任意の
順に作動可能に連結され得る。（１）のポリペプチドは、（２）または（３）のポリペプ
チドのＮ−末端に作動可能に連結され得る、（２）のポリペプチドは、（１）または（３
）のポリペプチドのＮ−末端に作動可能に連結され得る、（３）のポリペプチドは、（１
）または（２）のポリペプチドのＮ−末端に作動可能に連結され得る。
本明細書において、クロトータンパク質の細胞外サブドメイン、線維芽細胞増殖因子お
よび減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期
を有する（任意の）修飾されたＦｃフラグメントは、種々の方向および方法において互い
に作動可能に連結され得る。例えば、クロトータンパク質の細胞外サブドメインは、線維
芽細胞増殖因子のＮ−末端に作動可能に連結することができ、あるいは、線維芽細胞増殖
因子は、クロトータンパク質の細胞外サブドメインのＮ−末端に作動可能に連結すること
ができる。
１つの態様において、本明細書は、クロトータンパク質のｓクロトーおよびリンカーを
含む融合ポリペプチドを提供する。別の態様において、本明細書は、アルファクロトータ
ンパク質のｓクロトーおよびリンカーを含む融合ポリペプチドを提供する。別の態様にお
いて、本明細書は、ベータクロトータンパク質のｓクロトーおよびリンカーを含む融合ポ
リペプチドを提供する。さらに別の態様において、本明細書は、ヒトＦＧＦタンパク質ま
たはその活性なフラグメント（例えば、シグナルペプチドを有さない）およびリンカーを
提供する。１つの態様において、本明細書は、病理学的疾患の治療における使用のための
、または処置における使用のための医薬としての、融合タンパク質、核酸分子または医薬
組成物を提供する。加齢関連状態または代謝障害を処置または予防するための、本明細書
の融合タンパク質を含む医薬組成物およびその使用はまた、本明細書により包含される。
いくつかの態様において、融合タンパク質は、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親
和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに
含む。
１つの態様において、本明細書は、ＦＧＦ−２３に（リンカーを介して直接的または間
接的に）融合されたシグナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓクロトー
を含む融合ポリペプチドを提供する。別の態様において、本明細書は、ＦＧＦ−２３に（
リンカーを介して直接的または間接的に）融合されたシグナルペプチドを有さないアルフ
ァクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。別の態様におい
て、本明細書は、シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３に（リンカーを介して直接的
または間接的に）融合されたシグナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓ
クロトーを提供する。別の態様において、本明細書は、シグナルペプチドを有さないＦＧ
Ｆ−２３に（リンカーを介して直接的または間接的に）融合されたシグナルペプチドを有
さないアルファクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。い
くつかの態様において、融合タンパク質は、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和
性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含
む。
１つの態様において、本明細書は、ＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体に（リンカーを
介して直接的または間接的に）融合されたシグナルペプチドを有するアルファクロトータ
ンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。別の態様において、本明細書
は、ＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体に（リンカーを介して直接的または間接的に）融
合されたシグナルペプチドを有さないアルファクロトータンパク質のｓクロトーを含む融
合ポリペプチドを提供する。別の態様において、本明細書は、シグナルペプチドを有さな
いＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体に（リンカーを介して直接的または間接的に）融合
されたシグナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓクロトーを提供する。
別の態様において、本明細書は、シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ
）変異体に（リンカーを介して直接的または間接的に）融合されたシグナルペプチドを有
さないアルファクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。い
くつかの態様において、融合タンパク質は、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和
性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含
む。
１つの態様において、本明細書は、（ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）また
はその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸置
換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）を含むポリペプチドであって、ＦＧ
Ｆ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプ
チド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加
した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメント、またはクロトータンパク質の少な
くとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドのいずれか、またはそれらの機能的
に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／ま
たは１つのアミノ酸欠失を含む変異体）、および、所望により（ｃ）リンカーを含む融合
ポリペプチドを提供する。このような融合ポリペプチドは、配列番号：５４、５５、５６
、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７および６８に記
載されている。
１つの態様において、本明細書は、（１）シグナルペプチドを有するアルファクロトー
タンパク質のｓクロトーまたはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少な
くとも１つの保存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）、（２
）リンカー、および（３）シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異
体またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存アミ
ノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）を含む融合ポリペプチドを提
供する。別の態様において、本明細書は、（１）シグナルペプチドを有さないアルファク
ロトータンパク質のｓクロトー、またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例え
ば、少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体
）、（２）リンカー、および（３）シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９
Ｑ）変異体、またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つ
の保存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）を含む融合ポリペ
プチドを提供する。いくつかの態様において、本明細書の融合ポリペプチドは、グリコシ
ル化される。いくつかの態様において、融合タンパク質は、減少したＦｃ−ガンマ−受容
体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメ
ントをさらに含む。
１つの態様において、本明細書は、（１）シグナルペプチドを有するアルファクロトー
タンパク質のｓクロトー（配列番号：４４または配列番号：４５）またはその機能的に活
性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／または
１つのアミノ酸欠失を含む変異体）、（２）配列番号：１１を含むリンカー、および（３
）シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体（配列番号：４３）ま
たはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸
置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）を含む融合ポリペプチドを提供す
る。別の態様において、本明細書は、（１）シグナルペプチドを有さないアルファクロト
ータンパク質のｓクロトー（配列番号：７）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘
導体（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を
含む変異体）、（２）配列番号：１１を含むリンカー、および（３）シグナルペプチドを
有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体（配列番号：４３）またはその機能的に活性
な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／または１
つのアミノ酸欠失を含む変異体）を含む融合ポリペプチドを提供する。１つの態様におい
て、本明細書は、配列番号：１９、２０、４０または４１のアミノ酸配列を含む融合ポリ
ペプチドを提供する。いくつかの態様において、本明細書の融合ポリペプチドは、グリコ
シル化される。
１つの態様において、本明細書は、シグナルペプチドを有するアルファクロトータンパ
ク質のｓクロトー（配列番号：４４または配列番号：４５）またはその機能的に活性な変
異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／または１つの
アミノ酸欠失を含む変異体）、および配列番号：１１を含むリンカーを含む融合ポリペプ
チドを提供する。別の態様において、本明細書は、シグナルペプチドを有さないアルファ
クロトータンパク質のｓクロトー（配列番号：７）、および配列番号：１１を含むリンカ
ーを含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、本明細書の融合ポリペ
プチドは、グリコシル化される。いくつかの態様において、融合タンパク質は、減少した
Ｆｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾
されたＦｃフラグメントをさらに含む。
１つの態様において、本明細書は、ヒトＦＧＦタンパク質またはその活性なフラグメン
ト（例えば、シグナルペプチドを有さない）、および配列番号：１１を含むリンカーを含
む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、本明細書の融合ポリペプチド
は、グリコシル化される。いくつかの態様において、融合タンパク質は、減少したＦｃ−
ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾された
Ｆｃフラグメントをさらに含む。
１つの態様において、本明細書は、ヒトＦＧＦタンパク質（例えば、ＦＧＦ２３）また
はその活性なフラグメント（例えば、シグナルペプチドを有さない）、リンカー（例えば
、配列番号：１１を含むリンカー）、およびｓクロトー（シグナルペプチドを有するか、
または有さない）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも
１つの保存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体））またはＦｃ
−ガンマ−受容体（例えば、ＦｃＬＡＬＡ）を含む融合ポリペプチドであって、ＦＧＦ（
例えば、ＦＧＦ２３）がこれらの残基で１つ以上の変異：Ｒ１７９、Ｑ１５６、Ｃ２０６
、および／またはＣ２４４を有する融合ポリペプチドを提供する。種々の態様において、
変異は、Ｒ１７９Ｑ、Ｑ１５６Ａ、Ｃ２０６Ｓおよび／またはＣ２４４Ｓである。これら
の変異は、ヒト、アカゲザル、ウシ、マウスおよびラットＦＧＦ２３において保存されて
いるにもかかわらず、それらの変異はＦＧＦ２３活性を防止しない。むしろ、これらのア
ミノ酸の変異は、凝集を減少させること、望ましくないプロテアーゼ誘導開裂を減少させ
ること、および細胞からのタンパク質生産を増加させることにより、タンパク質の質を予
想外に増強する。種々の態様において、１つ以上のＦＧＦ２３変異を含む融合タンパク質
は、グリコシル化される。
１つの態様において、本明細書は、（１）シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（
Ｒ１７９Ｑ）変異体（配列番号：４３）、または凝集および／もしくはプロテアーゼ介在
開裂を減少させるさらなる変異を含む変異体、またはその機能的に活性な変異体もしくは
誘導体（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失
を含む変異体）、（２）所望により、配列番号：１１を含むリンカー、および（３）シグ
ナルペプチドを有するアルファクロトータンパク質のｓクロトー（配列番号：４４または
配列番号：４５）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも
１つの保存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）、または減少
したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する
修飾されたＦｃフラグメントを含む、融合ポリペプチド（例えば、グリコシル化された、
またはグリコシル化されていない）を含む（例えば、単一の薬学的に活性な成分として）
医薬組成物（例えば、筋肉内投与形態における）、ならびに病理学的疾患の処置、例えば
、加齢関連状態、例えば、筋萎縮の処置および／または予防のための治療における、また
は医薬としての、該医薬組成物の使用を提供する。別の態様において、本明細書は、（１
）シグナルペプチドを有さないＦＧＦ−２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体（配列番号：４３）、
または凝集および／もしくはプロテアーゼ介在開裂を減少させるさらなる変異を含む変異
体、またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存ア
ミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）、（２）配列番号：１１を
含むリンカー、および（３）シグナルペプチドを有さないアルファクロトータンパク質の
ｓクロトー（配列番号：７）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、
少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）、
または減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減
期を有する修飾されたＦｃフラグメントまたはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体
（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む
変異体）を含む、融合ポリペプチド（例えば、グリコシル化された、またはグリコシル化
されていない）を含む（例えば、単一の薬学的に活性な成分として）医薬組成物（例えば
、筋肉内投与形態における）、ならびに病理学的疾患の処置、例えば、加齢関連状態、例
えば、筋萎縮の処置および／または予防のための治療における、または医薬としての医薬
組成物の使用を提供する。１つの態様において、本明細書は、配列番号：１９、２０、４
０または４１のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチド（例えば、グリコシル化された、ま
たはグリコシル化されていない）を含む（例えば、単一の薬学的に活性な成分として）医
薬組成物（例えば、筋肉内投与形態における）、ならびに病理学的疾患の処置、例えば、
加齢関連状態、例えば、筋萎縮の処置および／または予防のための治療における、または
医薬としての医薬組成物の使用を提供する。
１つの態様において、本明細書は、シグナルペプチドを有するアルファクロトータンパ
ク質のｓクロトー（配列番号：４４または配列番号：４５）および配列番号：１１を含む
リンカーを含む、融合ポリペプチド（例えば、グリコシル化された、またはグリコシル化
されていない）を含む（例えば、単一の薬学的に活性な成分として）医薬組成物（例えば
、筋肉内投与形態における）、ならびに加齢関連状態、例えば、筋萎縮を処置および／ま
たは予防するための医薬組成物の使用を提供する。別の態様において、本明細書は、シグ
ナルペプチドを有さないアルファクロトータンパク質のｓクロトー（配列番号：７）およ
び配列番号：１１を含むリンカーを含む、融合ポリペプチド（例えば、グリコシル化され
た、またはグリコシル化されていない）を含む（例えば、単一の薬学的に活性な成分とし
て）医薬組成物（例えば、筋肉内投与形態における）、ならびに病理学的疾患の処置、例
えば、加齢関連状態、例えば、筋萎縮の処置および／または予防のための治療における、
または医薬としての医薬組成物の使用を提供する。いくつかの態様において、融合タンパ
ク質は、修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。
１つの態様において、本明細書は、ヒトＦＧＦタンパク質またはその活性なフラグメン
ト（例えば、シグナルペプチドを有さない）および配列番号：１１を含むリンカーを含む
、融合ポリペプチド（例えば、グリコシル化された、またはグリコシル化されていない）
を含む（例えば、単一の薬学的に活性な成分として）医薬組成物を提供する。
本明細書の融合タンパク質を含む医薬組成物および病理学的疾患の処置、例えば、加齢
関連状態（例えば、筋萎縮）または代謝障害（例えば、糖尿病）の処置のための治療にお
ける、または医薬としてのその使用もまた、本明細書により包含される。
１つの態様において、本明細書は、配列番号：１９と少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少
なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも
９８％、少なくとも９９％同一である融合ポリペプチドを提供する。別の態様において、
本明細書は、配列番号：２０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％
、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なく
とも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９
％同一である融合ポリペプチドを提供する。
１つの態様において、本明細書は、配列番号：４０と少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少
なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも
９８％、少なくとも９９％同一である融合ポリペプチドを提供する。別の態様において、
本明細書は、配列番号：４１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％
、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なく
とも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９
％同一である融合ポリペプチドを提供する。
１つの態様において、本明細書は、配列番号：４６と少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少
なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも
９８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。別の
態様において、本明細書は、配列番号：４７と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少
なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも
９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、
少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：４８と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。別の態
様において、本明細書は、配列番号：４９と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少な
くとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９
５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少
なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
１つの態様において、本明細書は、配列番号：５０と少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少
なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも
９８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。別の
態様において、本明細書は、配列番号：５１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少
なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも
９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、
少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
１つの態様において、本明細書は、配列番号：５２と少なくとも８５％、少なくとも９
０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少
なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも
９８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。別の
態様において、本明細書は、配列番号：５３と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少
なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも
９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、
少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５４と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５５と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５６と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５７と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５８と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５９と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６０と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６１と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６２と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６３と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６４と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６５と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６６と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６７と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６８と少なくとも８５％、少なくとも９０
％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少な
くとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９
８％、少なくとも９９％または１００％同一である融合ポリペプチドを提供する。
１つの態様において、本明細書は、ＦＧＦ−１９またはその活性なフラグメントに融合
した（リンカーを介して直接的または間接的に）シグナルペプチドを有するベータクロト
ータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。いくつかの態様において
、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは
増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。別の態様におい
て、本明細書は、ＦＧＦ−１９またはその活性なフラグメントに融合した（リンカーを介
して直接的または間接的に）シグナルペプチドを有さないベータクロトータンパク質のｓ
クロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。別の態様において、本明細書は、ＦＧＦ−
２１またはその活性なフラグメントに融合した（リンカーを介して直接的または間接的に
）シグナルペプチドを有するベータクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプ
チドを提供する。別の態様において、本明細書は、ＦＧＦ−２１またはその活性なフラグ
メントに融合した（リンカーを介して直接的または間接的に）シグナルペプチドを有さな
いベータクロトータンパク質のｓクロトーを含む融合ポリペプチドを提供する。
本明細書は、本明細書に記載されているクロトー融合ポリペプチドのいずれかをコード
する核酸配列および該核酸を含む宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、融合ポ
リペプチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した
血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。
本明細書はまた、本明細書において考慮されるクロトー融合ポリペプチドのいずれかを
有する組成物を提供する。本明細書の組成物は、ヘパリンをさらに含み得る。いくつかの
態様において、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性およ
び／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。
本明細書はまた、個体における加齢関連状態を処置または予防するための方法を提供す
る。個体（例えば、ヒト）に、加齢関連状態を処置または予防するように、クロトータン
パク質の少なくとも１つの細胞外サブドメイン（例えば、アルファクロトータンパク質）
および線維芽細胞増殖因子またはその活性なフラグメントを有するクロトー融合ポリペプ
チドを含む治療有効用量の医薬組成物を投与する。いくつかの態様において、融合ポリペ
プチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清
半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。特に、本明細書は、アルファ
クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび線維芽細胞増殖因子（
またはその活性なフラグメント）を有する治療有効量の融合ポリペプチドを個体（例えば
、ヒト）に投与することを含む、筋肉疲労を処置または予防する方法を提供する。
さらに、本明細書は、個体における代謝障害を処置または予防するための方法を提供す
る。個体に、代謝障害を処置するように、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外
サブドメインおよび線維芽細胞増殖因子（またはその活性なフラグメント）を有する本明
細書の融合ポリペプチドを含む治療有効用量の医薬組成物を投与する。いくつかの態様に
おいて、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／も
しくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。特に、ベ
ータ−クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび線維芽細胞増殖
因子２１を有する本明細書の融合ポリペプチドは、代謝障害を処置するために有用である
。
本明細書のクロトー−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドは、個体における高リン血症または
石灰沈着症を処置または予防するために使用することができる。いくつかの態様において
、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは
増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。クロトータンパ
ク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび線維芽細胞増殖因子を有する本明細書
のクロトー融合ポリペプチドを含む薬理学的有効用量の医薬組成物を、高リン血症または
石灰沈着症を処置または予防するために投与する。特に、アルファクロトータンパク質の
少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび線維芽細胞増殖因子２３を有する本明細書の
クロトー融合ポリペプチドは、高リン血症または石灰沈着症を処置するために有用である
。
本明細書のクロトー−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドは、個体における慢性腎臓疾患また
は慢性腎不全を処置または予防するために使用することができる。いくつかの態様におい
て、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしく
は増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。クロトータン
パク質（例えば、アルファクロトータンパク質）の少なくとも１つの細胞外サブドメイン
および線維芽細胞増殖因子を有する本明細書のクロトー融合ポリペプチドを含む治療有効
用量の医薬組成物を、慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置または予防するために投与す
る。
本明細書のクロトー−ＦＧＦ２３融合ポリペプチドは、個体における癌（例えば、乳癌
）を処置または予防するために使用することができる。いくつかの態様において、融合ポ
リペプチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した
血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。クロトータンパク質（例
えば、アルファクロトータンパク質）の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび線維
芽細胞増殖因子を有する本明細書のクロトー融合ポリペプチドを含む治療有効用量の医薬
組成物を、癌または乳癌を処置または予防するために投与する。
本明細書は、医薬における使用のためのクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外
サブドメインおよびＦＧＦまたはそれらの活性なフラグメントを含む融合ポリペプチドを
提供する。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容
体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメ
ントをさらに含む。１つの態様において、本明細書は、筋萎縮の処置または予防における
使用のためのクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよびＦＧＦま
たはそれらの活性なフラグメントを含む融合ポリペプチドを提供する。本明細書はまた、
可溶性クロトータンパク質を含む治療有効用量の医薬組成物を必要とする個体に投与する
ことを含む、加齢関連状態（例えば、筋萎縮）を処置または予防する方法を提供する。
本明細書は、さらに、個体における病理学的疾患、例えば、加齢関連状態、代謝障害、
高リン血症または石灰沈着症、慢性腎臓疾患または慢性腎不全の医薬としての治療におけ
る使用のための、または処置における使用のための、または癌または乳癌を予防するため
の、上記ペプチドおよび融合ポリペプチドまたは該ペプチドを含む医薬組成物を提供する
。さらに、本明細書は、病理学的疾患の処置、特に上記障害、好ましくは加齢関連状態、
例えば、筋萎縮の処置のための医薬の製造における、本発明のポリペプチド、核酸または
医薬組成物の使用をさらに提供する。
本明細書はまた、個体における加齢関連状態または代謝障害を処置または予防するため
のキットを含む。キットは、使用のための指示書およびクロトータンパク質の少なくとも
１つの細胞外サブドメインおよび線維芽細胞増殖因子を有する精製されたクロトー融合ポ
リペプチドを含む。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガン
マ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃ
フラグメントをさらに含む。
本明細書はまた、本明細書のクロトー融合ポリペプチドを生産するためのキットを提供
する。本明細書のキットは、使用のための指示書およびクロトータンパク質の少なくとも
１つの細胞外サブドメインおよび線維芽細胞増殖因子を有するクロトー融合ポリペプチド
をコードする核酸を含む。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ
−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾され
たＦｃフラグメントをさらに含む。
本明細書の１つの態様において、融合ポリペプチドは、（ａ）線維芽細胞増殖因子また
はその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例えば、少なくとも１つの保存アミノ酸置
換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体）を含むポリペプチド、および（ｂ）
減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有
する修飾されたＦｃフラグメントまたはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体（例え
ば、少なくとも１つの保存アミノ酸置換および／または１つのアミノ酸欠失を含む変異体
）を含む。
本明細書の１つの態様において、（ａ）のポリペプチドおよび（ｂ）のポリペプチドは
、ポリペプチドリンカーにより連結される。リンカーは、１から３０回またはそれ以上繰
り返し得る。
本明細書の１つの態様において、ポリペプチドリンカーは、配列番号：１１、配列番号
：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号
：１７および配列番号：１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む
本明細書の１つの態様において、（ａ）のポリペプチドは該ポリペプチドリンカーのＮ
−末端にペプチド結合により連結されており、（ｂ）のポリペプチドは該ポリペプチドリ
ンカーのＣ−末端にペプチド結合により連結されている。
本明細書の１つの態様において、融合ポリペプチドはシグナルペプチドをさらに含む。
本明細書の１つの態様において、シグナルペプチドはＩｇＧシグナルペプチドである。
本明細書の１つの態様において、線維芽細胞増殖因子は、線維芽細胞増殖因子−２３ま
たは線維芽細胞増殖因子−２３変異体（Ｒ１７９Ｑ）である。
本明細書の１つの態様において、線維芽細胞増殖因子は、線維芽細胞増殖因子−１９ま
たは線維芽細胞増殖因子−２１である。
本明細書の１つの態様において、融合ポリペプチドは、配列番号：５１または配列番号
：５３のアミノ酸配列と９５％以上同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書の１つの態様において、融合ポリペプチドは配列番号：５１または配列番号：
５３のアミノ酸配列を含む。
本明細書の１つの態様において、融合ポリペプチドはＦｃＬＡＬＡを含む。
３．図面の簡単な説明
図１は、本明細書のクロトー融合ポリペプチドのいくつかの異なる態様を説明する。示されている融合ポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子に作動可能に連結した１つ以上のクロトー細胞外サブドメインを含む。１つ以上のクロトー細胞外サブドメインを含むポリペプチドは、例えば、クロトーの細胞外ドメイン（例えば、ヒトクロトーのアミノ酸１から９８２）またはクロトーの活性なフラグメントを含む。
図２は、本明細書のいくつかのクロトー融合ポリペプチドおよびそれらの成
図３Ａ−３Ｃは、ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合タンパク質のタンパク質発 図３Ｂは、ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により馴化培地中で検出されたことを示す。 図３Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー染色により分析された、高度に精製されたｓクロトー−ＦＧＦ２３−６ｘＨｉｓ融合タンパク質を示す。
図４は、ヘパリン（２０μｇ／ｍｌ）の存在または非存在下で、クロトー融チドのみ、および可溶性クロトーポリペプチドとＦＧＦ２３ポリペプチドのいずれかを含む馴化培地で処理された細胞における、Ｅｇｒ−１の活性化レベルを比較するＥｇｒ−１ルシフェラーゼアッセイの結果を説明する。
図５Ａ−５Ｂは、ヘパリンの存在または非存在下で、精製されたクロトー融 図５Ｂは、ｓクロトー−ＦＧＦ２３−Ｈｉｓ融合物（０ｎＭ、０．６ｎＭ、１．２１ｎＭ、２．４１ｎＭ、４．８３ｎＭ、９．６５ｎＭおよび１９．３ｎＭ）で処理された細胞における、Ｅｇｒ−１ルシフェラーゼレポーター活性を示す。
図６Ａ−６Ｂは、Ｃ２Ｃ１２筋肉細胞における精製されたｓクロトー融合ポ 図６Ｂは、ラパマイシン（４０ｎＭ）の存在または非存在下で、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）、または精製されたクロトー融合ポリペプチド（２０ｎＭ）によるＣ２Ｃ１２筋肉細胞におけるシグナル伝達経路タンパク質のリン酸化を示す。
図７は、ｓクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡ融合タンパク質によるＥＧＲ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化を示す。 図８は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡタンパク質によるＥＧＲ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化を示す。 図９は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ） 対 ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２の薬物動態学プロフィールを示す。
図１０Ａおよび１０Ｂは、デキサメタゾン誘導筋萎縮後の、筋肉成長を増強することにおけるｓクロトー−ＦＧＦ２３融合物のインビボ有効性を示す。 この図は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡならびにＱ１５６Ａ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４ＳおよびＣ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異体によるＥＧＲ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化を示す。 図１２は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬａＬａのＷＴ（野生型）、Ｑ１５６Ａ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４ＳおよびＣ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異体のタンパク質の質および二量化を示す。
４．詳細な説明
本明細書は、加齢関連状態および代謝障害を予防または処置するための方法、キットお
よび組成物、ならびに病理学的疾患の治療における該組成物の医薬としての使用または処
置における使用に関する。本明細書の融合ポリペプチドは、クロトータンパク質またはそ
の活性なフラグメントを含む。いくつかの態様において、本明細書の融合ポリペプチドは
、線維芽細胞増殖因子ポリペプチドまたはその活性なフラグメントに作動可能に連結した
クロトータンパク質またはその活性なフラグメントを含む。いくつかの態様において、融
合ポリペプチドは、減少したＦｃＲｎへの結合する能力および／または増加した血清にお
ける安定性を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。別の態様において、融合
ポリペプチドは、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２３）および減少したＦｃＲｎへの結合する能
力および／または増加した血清における安定性を有する修飾されたＦｃフラグメントを含
む。
本明細書の融合タンパク質またはｓクロトーは、種々の加齢関連状態、例えば、サルコ
ペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、
骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、
白内障、加齢黄斑変性症、前立腺癌、卒中、期待寿命の低下(diminished life expectanc
y)、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢性難聴、ならびに代謝障害、例えば、ＩＩ型
糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖および肥満の処置および予防において有用
である。
本発明は、少なくとも一部分において、物理的制約条件（例えば、クロトーおよびＦＧ
Ｆポリペプチド両方の大きいサイズ）にもかかわらず、クロトー−ＦＧＦ融合ポリペプチ
ドがＦＧＦ受容体の活性化において非常に有効である発見に基づく。これらの２つのタン
パク質の融合物がヘテロ二量化、したがってタンパク質の活性化を妨げるであろう；例え
ば、タンパク質の結合ドメインが融合物により乱され得るか、例えば、タンパク質の結合
ドメインが融合物により乱され得るか、または「シス」構造を構築するとき、タンパク質
が空間的に間違った方向に向けられ得ることを考慮すると、この発見は予期されないもの
である。
単独で、または別のポリペプチドと一緒に投与されるクロトーまたはＦＧＦと比較して
活性を増強させる、単一の治療タンパク質の投与を可能にするため、本明細書に記載され
ている融合ポリペプチドには利点がある。２つの別々のポリペプチド（すなわち、クロト
ーポリペプチドおよび別のＦＧＦポリペプチド）よりもむしろ単一の融合ポリペプチドと
してのクロトーおよびＦＧＦの使用が、ＦＧＦ受容体の活性化にさらに有効である。
定義
本明細書において使用される「クロトーポリペプチド」、「クロトータンパク質」また
は「クロトー」は、野生型「クロトー」の活性なフラグメント、誘導体、模倣物、変異体
および化学的に修飾された化合物またはそれらのハイブリッドを含む。活性なクロトーフ
ラグメントは、ＦＧＦポリペプチドに結合する能力を有する。一般的に、活性なクロトー
ポリペプチドは少なくとも１つのクロトーサブドメイン（例えば、ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ
−Ｄ２）を含む。野生型クロトーは天然で見出されたとおりのアミノ酸配列を有する。本
明細書において使用するために適当な例のクロトーポリペプチドは、アルファ−クロトー
（配列番号：２）およびベータ−クロトー（配列番号：４）を含む。アルファ−クロトー
およびベータ−クロトーのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベ
ースにおいてそれぞれ受入番号ＮＭ＿００４７９５、ＮＰ＿００４７８６およびＮＭ＿１
７５７３７、ＮＰ＿７８３８６４において見出せる。クロトーポリペプチドは米国特許第
６，５７９，８５０号（この内容をその全体において出典明示により本明細書に包含させ
る）において記載されているものを含む。クロトーポリペプチドは、マウス（ＮＰ＿０３
８８５１）、ラット（ＮＰ＿１１２６２６）、ウサギ（ＮＰ＿００１０７５６９２）のア
ルファ−クロトーおよびマウス（ＮＰ＿１１２４５７）のベータ−クロトーを含むヒト以
外の他の種のものを含む。アルファ−クロトーを有することが予測される種は、チンパン
ジー（ＸＰ＿５２２６５５）、マカク（ＸＰ＿００１１０１１２７）、ウマ（ＸＰ＿００
１４９５６６２）、ウシ（ＸＰ＿００１２５２５００）、カモノハシ（ＸＰ＿００１５１
０９８１）およびニワトリ（ＸＰ＿４１７１０５）を含む。ベータ−クロトーを有するこ
とが予測される種は、チンパンジー（ＸＰ＿５２６５５０）、マカク（ＸＰ＿００１０９
１４１３）、ウマ（ＸＰ＿００１４９５２４８）、イヌ（ＸＰ＿５３６２５７）、ラット
（ＸＰ＿００１０７８１７８）、カモノハシ（ＸＰ＿００１５１２７２２）およびニワト
リ（ＸＰ＿４２３２２４）を含む。クロトーポリペプチドは、配列番号：２または配列番
号：４のアミノ酸配列と実質的に同一である。すなわち、配列番号：２または配列番号：
４のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６
％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列またはそれらの活性
なフラグメントを有する。
本明細書において使用される「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」は、天然
に同じポリペプチドに存在しない２つ以上の別々のポリペプチドまたはそれらの活性なフ
ラグメントを含むポリペプチドを意味する。いくつかの態様において、２つ以上の別々の
ポリペプチドは、ペプチド結合によりインフレームで、互いに作動可能に共有結合、例え
ば、化学的に結合または融合されている。本明細書において使用される「クロトー融合ポ
リペプチド」は、クロトーポリペプチドのアミノ酸配列またはその活性なフラグメントを
含む融合ポリペプチドである。融合ポリペプチドは、非限定的な例として、クロトー（例
えば、ｓクロトー）、ＦＧＦ（例えば、ＦＧ２３）、および減少したＦＣ−ガンマ−受容
体に対する結合親和性および／もしくは増加した血清半減期）を有する（所望により）修
飾されたＦｃフラグメント（例えば、修飾されたＦｃフラグメントを含み得る。融合ポリ
ペプチドのこの型の例は、配列番号４６から４９にに示される。別の態様において、融合
タンパク質は、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ２３）および修飾されたＦｃ（例えば、ＦｃＬＡ
ＬＡ）を含む。ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合タンパク質は、配列番号５０、
５１、５２および５３に記載されている。ＦｃＬＡＬＡは、効率低下でＡＤＣＣを誘導し
、弱くヒト補体に結合し、活性化するＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有する
Ｆｃフラグメントである。Hessellら 2007 Nature 449:101-104。
「繊維芽細胞増殖因子」および「ＦＧＦ」は、本明細書において互換的に使用され、ヒ
ト対象を含む動物における細胞増殖、移動、分化、ホメオスタシス、組織修復および損傷
応答を調節するポリペプチドを示す。ＦＧＦは、繊維芽細胞増殖因子受容体に結合し、Ｆ
ＧＦＲの自己リン酸化、ＦＲＳ２（ＦＧＦ受容体基質２）およびＥＲＫ１／２（細胞外シ
グナル−調節タンパク質キナーゼ１／２）のリン酸化およびＥｇｒ−１（初期増殖応答−
１）の活性化を含む活性を調節する能力を有する。「ＦＧＦ」なる用語は、例えば、当分
野で既知である、ならびに米国特許第７，２２３，５６３号および米国特許第７，２５９
，２４８号（これらの内容をその全体において出典明示により本明細書に包含させる）に
おいて記載されている、野生型「ＦＧＦ」の活性なフラグメント、誘導体、模倣物、変異
体および化学的に修飾された化合物またはそれらのハイブリッドを含む。野生型ＦＧＦは
天然で見出されたとおりのアミノ酸配列を有する。本発明において使用するために適当な
例の繊維芽細胞増殖因子は、繊維芽細胞増殖因子−１９（ＦＧＦ１９；配列番号：３１）
、繊維芽細胞増殖因子−２１（ＦＧＦ２１；配列番号：３３）および繊維芽細胞増殖因子
−２３（ＦＧＦ２３；配列番号：３５）を含む。ＦＧＦポリペプチドは、マウスＦＧＦを
含むヒト以外の他の種のものを含む。一般的に、ＦＧＦポリペプチドは、配列番号：３１
、配列番号：３３または配列番号：３５のアミノ酸配列と実質的に同一である。すなわち
、配列番号：３１、配列番号：３３または配列番号：３５のアミノ酸配列と少なくとも７
０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％また
はそれ以上または１００％同一であるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列またはそれらの
活性なフラグメントを有する。ＦＧＦ、特にＦＧＦ２３のさらなる非限定的な例は、配列
番号：４７のａａ１００２−１２２８、配列番号：４９のａａ１００２−１２２８、配列
番号：５１のａａ１−２５１および配列番号：５３のａａ１−２５１、ならびに、これら
の配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％
、９８％、９９％またはそれ以上または１００％同一である配列で提供される。これらの
配列をコードするヌクレオチドは、配列番号：４６、４８、５０および５２において提供
される。
「ＦＧＦ」なる用語は完全長ポリペプチドの活性なフラグメントを含む。対応するＦＧ
Ｆ受容体に結合することができる活性なＦＧＦフラグメントは、当分野で既知であり、本
明細書の使用において考慮される。本明細書に記載されている配列に基づいて、ＦＧＦの
重複フラグメントが、例えば、Sambrookら (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)およびAusubelら (1997, Curre
nt Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York)に記載されている標準
組換え技術を使用して生産することができることは、当業者に理解される。本明細書に存
在する記載に基づいて、ＦＧＦフラグメントの生物学的活性がＦＧＦ受容体への結合を含
む当分野で既知の、および本明細書に記載されている方法により試験することができるこ
とは、当業者に理解される。同様に、必要なＦＧＦシグナル伝達機構（すなわちＦＧＦ受
容体）を有する細胞培養モデルは、ＦＧＦフラグメントでトランスフェクトされ、次に野
生型ＦＧＦと比較してＦＧＦシグナル伝達における変化に関して試験され得る。
ＦＧＦは、特に異なるＦＧＦサブファミリー中で、長さおよび一次配列両方において高
度に異なるＮ−およびＣ−末端配列の横に配置されている、ＦＧＦ核相同性ドメイン（約
１２０アミノ酸長）の相同性に基づいて７つのサブファミリーに分類される（Goetzら Mo
lecular and Cellular Biology, 2007, Vol 27, 3417-3428）。ＦＧＦ活性ポリペプチド
は、一般的に少なくとも１つのＦＧＦ核相同性ドメインを含む。いくつかの態様において
、ＦＧＦ活性ポリペプチドは、ＦＧＦ核相同性ドメインに加えて、結合ＦＧＦ受容体にお
いてさらなる特異性を与え得るフランキング配列を含み得る。リガンドの核領域が他のＦ
ＧＦと比較して高い配列同一性を共有するため（ＦＧＦ１９対ＦＧＦ２１：３８％同一性
、ＦＧＦ１９対ＦＧＦ２３：３６％同一性）、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２３
はＦＧＦ１９サブファミリーに分類される。ＦＧＦ１９サブファミリーメンバーは内分泌
腺系のシグナル伝達分子と同様に作用し、古典的なＦＧＦに珍しくない異なる生理学的プ
ロセスを調節する（例えば、ＦＧＦ１９：エネルギーおよび胆汁酸ホメオスタシス、ＦＧ
Ｆ２１、グルコースおよび脂質代謝、およびＦＧＦ２３、リン酸塩およびビタミンＤホメ
オスタシス）。
本明細書において使用される「繊維芽細胞増殖因子受容体」および「ＦＧＦＲ」は、当
分野で既知のＦＧＦＲ１−４のいずれか、またはそれらのスプライス変異体（例えば、Ｆ
ＧＦＲ１ｃ）を示す。本明細書において使用するために適当な例の繊維芽細胞増殖因子受
容体は、繊維芽細胞増殖因子受容体−１９（例えば、ＦＧＦＲ４−ベータクロトー）、繊
維芽細胞増殖因子受容体−２１（例えば、ＦＧＦＲ１ｃ−アルファクロトー）および繊維
芽細胞増殖因子受容体−２３（例えば、ＦＧＦＲ１ｃ−アルファクロトー、ＦＧＦＲ３−
アルファクロトー、ＦＧＦＲ４−アルファクロトー）を含む。
本明細書において使用される「細胞外ドメイン」は、細胞の外側に存在する（例えば、
細胞内または膜貫通領域を含まない）膜貫通タンパク質のフラグメントを示す。「クロト
ータンパク質の細胞外ドメイン」、「可溶性クロトー」または「ｓクロトー」（例えば、
配列番号：７；配列番号：３９）は、繊維芽細胞増殖因子に結合することができる、およ
び／または繊維芽細胞増殖因子に結合することにより繊維芽細胞増殖因子が繊維芽細胞増
殖因子受容体に結合することを可能にすることができるクロトーポリペプチドの細胞外ド
メインを示す。クロトー細胞外ドメインは、全長アルファクロトー配列（配列番号：２）
のアミノ酸残基２８−９８２および全長ベータクロトー配列（配列番号：４）のアミノ酸
残基５２−９９７に対応する。
「クロトータンパク質の細胞外サブドメイン」は、繊維芽細胞増殖因子を結合すること
ができる、および／または繊維芽細胞増殖因子への結合により繊維芽細胞増殖因子の繊維
芽細胞増殖因子受容体への結合を可能にすることができる、クロトーポリペプチドの細胞
外ドメインの領域を示す。種々の態様において、融合ポリペプチドは、クロトータンパク
質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチド、線維芽細胞増殖因子を含
むポリペプチド、および、所望により、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性お
よび／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントを含む。クロト
ー細胞外ドメインは、繰り返されている２つの相同サブドメイン、すなわち、ＫＬ−Ｄ１
（配列番号：５）およびＫＬ−Ｄ２（配列番号：６）を有する。ＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−
Ｄ２は、それぞれ、全長アルファクロトーポリペプチド（配列番号：２）のアミノ酸残基
５８−５０６および５１７−９５３、ならびに、それぞれ、全長ベータクロトーポリペプ
チド（配列番号：４）のアミノ酸残基７７−５０８および５７１−９６７に対応し、本明
細書において使用するために適当である。一般的に、少なくとも１つのクロトーサブドメ
インを含むポリペプチドは活性なクロトーポリペプチドである。本明細書のポリペプチド
において使用するためのクロトー細胞外サブドメインは、それぞれ配列番号：５または配
列番号：３７のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するアルファクロト
ーまたはベータクロトーＫＬ−Ｄ１ドメインであり得る。さらに、クロトーＫＬ−Ｄ１ド
メインは、配列番号：５または配列番号：３７のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５
％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上
同一であるアミノ酸配列を有し得る。クロトー細胞外サブドメインは、また、それぞれ配
列番号：６または配列番号：３８のアミノ酸配列と実質的に同一であるアルファまたはベ
ータクロトーポリペプチドＫＬ−Ｄ２ドメインであり得る。さらなる態様において、ＫＬ
−Ｄ２ドメインは、配列番号：６または配列番号：３８のアミノ酸配列と少なくとも７０
％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または
それ以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、融合ポリペプチド
は、クロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメイン（例えば、ＫＬ−Ｄ１お
よびＫＬ−Ｄ２、タンデムリピートにおけるＫＬ−Ｄ１およびＫＬ−Ｄ１、タンデムリピ
ートにおけるＫＬ−Ｄ２およびＫＬ−Ｄ２など）を含む。
本明細書において使用される「修飾されたＦｃフラグメント」は、修飾された配列を含
む抗体のＦｃフラグメントを意味する。Ｆｃフラグメントは、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒン
ジ領域の部分を含む抗体の一部である。修飾されたＦｃフラグメントは、例えば、ＩｇＧ
１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来であり得る。ＦｃＬＡＬＡは、効率低下でＡ
ＤＣＣを誘導し、弱くヒト補体に結合し、活性化するＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３
５Ａ）を有する修飾されたＦｃフラグメントであるHessellら 2007 Nature 449:101-104
。Ｆｃフラグメントに対するさらなる修飾は、例えば、米国特許第７，２１７，７９８号
に記載されている。例えば、種々の修飾されたＦｃフラグメントにおいて、（ａ）アミノ
酸残基２５０はグルタミン酸であり、アミノ酸残基４２８はフェニルアラニンである、ま
たは（ｂ）アミノ酸残基２５０はグルタミンであり、アミノ酸残基４２８はフェニルアラ
ニンである、または（ｃ）アミノ酸残基２５０はグルタミンであり、アミノ酸残基４２８
はロイシンである。いくつかの態様において、アミノ酸残基２５０および４２８は、アミ
ノ酸残基２５０がグルタミン酸またはグルタミンであり、アミノ酸残基４２８がロイシン
またはフェニルアラニンである修飾されていないＦｃ融合タンパク質において存在する残
基が異なっており、アミノ酸残基は米国特許第７，２１７，７９８号に記載されているＥ
Ｕ番号制により番号付けされる。いくつかの態様において、修飾されたＦｃ−融合タンパ
ク質は、ｐＨ８．０でよりもｐＨ６．０でＦｃＲｎに対するより高い親和性を有する。好
ましくは、修飾されたＦｃフラグメントは、減少したＦｃＲｎに対する親和性および／も
しくは増加した血清半減期を有する。修飾されたＦｃフラグメントの非限定的な例は、配
列番号：４７のａａ（アミノ酸）１２３４−１４５９、配列番号：４９のａａ１２３４か
ら１４５０、配列番号：５１のａａ２５７から４８２および配列番号：５３のａａ２５７
から４７３、ならびに、これらの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９
０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上または１００％同一であ
る配列を含む。これらの配列をコードするヌクレオチドは、配列番号：４６、４８、５０
および５２において提供される。
本明細書において使用される「シグナルペプチド」は、小胞体へのタンパク質の翻訳後
輸送を指向して、切断され得るペプチド鎖（３−６０アミノ酸長）を意味する。本明細書
において使用するために例の典型的なシグナルペプチドはクロトーシグナルペプチド（配
列番号：１９）およびＩｇＧシグナルペプチド（配列番号：２０）を含む。産生細胞系に
より分泌および開裂されると、シグナルペプチド（例えば、配列番号：１９および配列番
号：２０に対応するペプチドの）は開裂されることに注意すること。したがって、産生細
胞系によるシグナルペプチドの分泌および開裂後、配列番号：１９のペプチドは配列番号
：４１のペプチドを産生する。
本明細書において使用される「リンカー」は、互いに結合することができるように、共
有結合が２つ以上のポリペプチドまたは核酸を結合する機能の基（例えば、化学物質また
はポリペプチド）を意味する。本明細書において使用される「ペプチドリンカー」は、２
つのタンパク質を互いに結合する（例えば、クロトーの細胞外ドメインおよび繊維芽細胞
増殖因子−２３を結合する）ために使用される１つ以上のアミノ酸を意味する。本明細書
において使用するために適当なペプチドリンカーは、配列番号：８、配列番号：９、配列
番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列
番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８により示されている
アミノ酸配列を有するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。ポリペプチドリン
カーは、これらのアミノ酸配列のいずれかの少なくとも１、最大約３０の繰り返しを含み
得る。
本明細書において使用される「作動可能に連結している」は、生体分子と関連する生物
学的機能、活性および／または構造を少なくとも保持することができるような２つ以上の
生体分子の結合を意味する。ポリペプチドに関して、該用語は、２つ以上のポリペプチド
の結合がそれぞれのポリペプチド成分の少なくともいくつかのそれぞれの個々の活性を保
持する融合ポリペプチドとなることを意味する。２つ以上のポリペプチドは直接、または
リンカーを介して結合し得る。核酸に関して、該用語は、適当な分子（例えば、転写活性
化タンパク質）が第２のポリヌクレオチドに結合しているとき、第１のポリヌクレオチド
が第１のポリヌクレオチドの転写を指向する第２のポリヌクレオチドに隣接して配置され
ることを意味する。
本明細書において使用される「特異的に結合する」は、第１の分子がそれ自体と他の標
的分子間の非共有相互作用の形成をもたらす特定の構造を取ることができるため、第１の
分子が暴露され得る多くの異なる型の分子の中から１つの標的分子に結合することができ
ることを示す。第１の分子は安定な複合体を形成する標的に結合するが、他の何らかの非
特異的な分子に対して、実質的にあまり、認識せず、接触せず、または第１の分子と複合
体を形成しない。
本明細書において使用される「ポリペプチド変異体」または「タンパク質変異体」は、
１つ以上のアミノ酸が参照配列から異なるアミノ酸により置換されているポリペプチドを
示す。いくつかのアミノ酸が、以下に記載されているポリペプチド（保存的置換）の活性
の性質を変化することなく広範に同様の性質を有して、他のものにより置換され得ること
は当分野で理解されている。これらの用語は、また、１つ以上のアミノ酸が付加されたか
、もしくは欠失されたか、または異なるアミノ酸で置換されたポリペプチド、例えば、タ
ンパク質アイソフォームを包含する。本明細書において使用するために適当な繊維芽細胞
増殖因子−２３の変異体の例は、繊維芽細胞増殖因子−２３変異体（Ｒ１７９Ｑ）である
。
本明細書において使用される「医薬組成物」は、個体における疾患または障害を処置ま
たは予防するために投与され得る化合物（例えば、本明細書の融合ポリペプチド）を含む
組成物を意味する。
本明細書において使用される「個体」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、
例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジまたはネコを含むが、これらに限定されない哺乳動物
を示す。
本明細書において使用される「処置」は、疾患の発症または進行を減少、抑制、減衰、
軽減、阻止または安定させることを意味する。本明細書との関係において、本明細書のポ
リペプチドの投与は、サルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬
化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチン
トン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、前立腺癌、卒中、期待寿命の低下
、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢関連難聴を含む加齢関連状態、ならびにＩＩ型
糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖および肥満を含む代謝障害を処置するため
に使用され得る。
本明細書において使用される「予防」は、対象における障害の発症を減少させる、また
は障害またはそれに関連する症状を有する危険性を減少させることを意味する。本明細書
との関係において、本明細書のポリペプチドの投与は、サルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲
労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫
不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、
前立腺癌、卒中、期待寿命の低下、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢関連難聴を含
む加齢関連状態、ならびにＩＩ型糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖および肥
満を含む代謝障害を予防するために使用され得る。予防は、加齢関連状態または代謝障害
の完全な、例えば、全体の欠如であり得る。予防は、また、対象における加齢関連状態ま
たは代謝障害の発症の可能性が本明細書を受けていない対象よりも発症する可能性を低く
するような、部分的なものであり得る。
本明細書において使用される「疾患」は、細胞、組織または臓器の正常機能を損なう、
または妨げるすべての状態または障害を意味する。
本明細書において使用される「加齢関連状態」は、母集団における発生率または個体に
おける重症度が年齢の進行と関連があるすべての疾患または障害を意味する。１つの態様
において、加齢関連状態は、１００，０００個体以上の選択された母集団中で、３０−４
０歳のヒト個体と比較して６０歳以上のヒト個体中で発生率が少なくとも１．５倍である
疾患または障害である。本明細書に関連する加齢関連状態は、サルコペニア、皮膚萎縮、
筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症
、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変
性症、前立腺癌、卒中、期待寿命の低下、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢関連難
聴を含むが、これらに限定されない。
本明細書において使用される「代謝障害」は、細胞におけるエネルギー生産または細胞
、組織、臓器もしくは個体における毒素の蓄積に影響することにより、細胞、組織または
臓器における正常機能を損なう、または妨げるすべての疾患または障害を意味する。本明
細書に関連する代謝障害は、ＩＩ型糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖および
肥満を含むが、これらに限定されない。
「有効用量」または「有効量」は、有益な、または望ましい臨床結果をもたらすために
十分な量である。本明細書との関係において、それは、意図された薬理学的、治療または
予防結果を引き起こすために十分なクロトー融合ポリペプチドまたはｓクロトーの量であ
る。治療有効用量は、障害または障害の１つ以上の症状（例えば、加齢関連状態または代
謝障害）の予防または改善をもたらす。治療有効用量は、対象および処置される疾患状態
、対象の体重および年齢、疾患状態の重症度、投与様式などに依存して変化し、当業者に
よって容易に決定することができる。
本明細書において使用される「クロトー核酸分子」は、クロトータンパク質をコードす
る遺伝子である。例のヒトクロトー遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００４７９
５（配列番号：１）で提供される。クロトーのさらなる非限定的な例は、配列番号：４７
のａａ１−９８２および配列番号：４９のａａ１−９８２、ならびに、これらの配列と少
なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、
９９％またはそれ以上または１００％同一である配列で提供される。
本明細書において使用される「フラグメント」は、ポリペプチドまたは核酸分子の一部
を示す。この一部は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも
１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ
以上を含む。フラグメントは１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０ま
たは１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０
００または最大３０００ヌクレオチドまたはアミノ酸を含み得る。
「実質的に同一」なる用語は、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されている
アミノ酸配列のいずれか１つ）または核酸配列（例えば、本明細書に記載されている核酸
配列のいずれか１つ）と少なくとも５０％同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を示
す。好ましくは、このような配列は、アミノ酸レベルまたは核酸において、比較のために
使用される配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％または８５％、９０％、９
１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以
上同一である。
本明細書は、加齢関連状態および代謝障害を予防または処置するための方法、キットお
よび組成物、および病理学的疾患の治療における使用のための、または、処置における使
用のための医薬としての、該組成物の使用に関する。いくつかの態様において、本明細書
は、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを有する融合ポリペプチ
ドを提供する。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、線維芽細胞増殖因子また
はその活性なフラグメントをさらに含む。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは
、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を
有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。他の態様において、融合ポリペプチド
は、修飾されたＦｃ（例えば、ＦｃＬＡＬＡ）に融合したＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１９、
ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３またはＦＧＦ２３変異体Ｒ１７９Ｑ）を含む。ＦｃＬＡＬＡは、
効率低下でＡＤＣＣを誘導し、弱くヒト補体に結合し、活性化するＬＡＬＡ変異（Ｌ２３
４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有するＦｃフラグメントである。クロトー細胞外ドメインはアルフ
ァまたはベータクロトーアイソフォームのいずれか由来であり得る。さらに、クロトー融
合ポリペプチドのＦＧＦ成分は繊維芽細胞増殖因子−１９、繊維芽細胞増殖因子−２１お
よび繊維芽細胞増殖因子−２３に関して主に記載されているが、２３の既知のＦＧＦまた
はそれらの活性なフラグメントのすべてが本明細書の実施において使用することができる
と考えられる。
クロトータンパク質の細胞外ドメインは、クロトータンパク質のＫＬ−Ｄ１およびＫＬ
−Ｄ２ドメインの１つまたは両方を含むことができる。いくつかの態様において、クロト
ー融合ポリペプチドは、クロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメインを有
する。例えば、少なくとも２つの細胞外サブドメインは、タンデムリピートにおける少な
くとも２つのＫＬ−Ｄ１ドメイン、タンデムリピートにおける少なくとも２つのＫＬ−Ｄ
２ドメイン、または少なくとも１つのＫＬ−Ｄ１ドメインおよび少なくとも１つのＫＬ−
Ｄ２ドメインであり得る。
クロトータンパク質の細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子（またはそれらの
活性なフラグメント）は、種々の方向および様式において互いに作動可能に連結すること
ができる。例えば、クロトータンパク質の細胞外サブドメインは繊維芽細胞増殖因子のＮ
−末端に作動可能に連結されていてよく、あるいは繊維芽細胞増殖因子はクロトータンパ
ク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインのＮ−末端に作動可能に連結されていてもよ
い。
本明細書の融合ポリペプチドは、クロトー細胞外ドメイン、すなわち、ＫＬ−Ｄ１（配
列番号：５）およびＫＬ−Ｄ２（配列番号：６）の１つまたは両方を含み得る。ＫＬ−Ｄ
１およびＫＬ−Ｄ２は、それぞれ全長アルファクロトーポリペプチド（配列番号：２）の
アミノ酸残基５８−５０６および５１７−９５３ならびに全長ベータクロトーポリペプチ
ド（配列番号：４）のアミノ酸残基７７−５０８および５７１−９６７に対応し、本明細
書において使用するために適当である。クロトー融合ポリペプチドは、配列番号：５のア
ミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するアルファクロトーポリペプチドま
たは配列番号：３７のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するベータク
ロトーポリペプチドのＫＬ−Ｄ１ドメインを有し得る。具体的には、クロトー融合ポリペ
プチドは、配列番号：５または配列番号：３７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８
５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミ
ノ酸配列を有し得る。クロトー融合ポリペプチドは、配列番号：６のアミノ酸配列と実質
的に同一であるアミノ酸配列を有するアルファクロトーポリペプチドまたは配列番号：３
８のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するベータクロトーポリペプチ
ドのＫＬ−Ｄ２ドメインを有し得る。具体的には、クロトー融合ポリペプチドは、それぞ
れ配列番号：６または配列番号：３８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９
０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列
を有し得る。
いくつかの態様において、本明細書のクロトー融合ポリペプチドは可溶性であり、ＦＧ
Ｆ受容体に結合することができる。
本明細書のクロトー融合ポリペプチドは、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞
外サブドメインを有するポリペプチドおよび繊維芽細胞増殖因子および（任意の）修飾さ
れたＦｃフラグメントを接続するポリペプチドリンカーを含むことができる。適当なリン
カーは当分野で既知であり、一般的にいくつかのＧｌｙおよびいくつかのＳｅｒ残基、例
えば、（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３（配列番号：１１）、Ｇｌｙ４ Ｓｅｒポリペプチド（配
列番号：１２）、Ｇｌｙ（配列番号：１３）、Ｇｌｙ Ｇｌｙ（配列番号：１４）、Ｇｌ
ｙ Ｓｅｒ（配列番号：１５）、Ｇｌｙ２ Ｓｅｒ（配列番号：１６）、Ａｌａ（配列番
号：１７）およびＡｌａ Ａｌａ（配列番号：１８）を含む。いくつかの態様において、
リンカーは配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番
号：１６、配列番号：１７または配列番号：１８のいずれかに記載されているアミノ酸配
列の少なくとも２から最大約３０までの繰り返しを有する。
ポリペプチドリンカーが本明細書のクロトー融合ポリペプチドに存在するとき、クロト
ータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを有するポリペプチドは、ポリペプ
チドリンカーのＣ−末端にペプチド結合により接続されているＦＧＦと、リンカーポリペ
プチドのＮ−末端にペプチド結合により接続されていてもよい。あるいは、ＦＧＦは、ポ
リペプチドリンカーのＣ−末端にペプチド結合により接続されている、クロトーの少なく
とも１つの細胞外サブドメインを有するポリペプチドと、リンカーポリペプチドのＮ−末
端にペプチド結合により接続されていてもよい。化学的リンカーが、また、２つのポリペ
プチドを連結するために使用することができる。
本明細書のクロトー融合ポリペプチドはシグナルペプチドを含み得る。クロトー融合ポ
リペプチドにおいて使用するためのシグナルペプチドの例は、クロトーシグナルペプチド
（配列番号：８）およびＩｇＧシグナルペプチド（配列番号：９）を含むが、これらに限
定されない。
いくつかの態様において、本明細書は、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、Ｆ
ＧＦ２３またはＦＧＦ２３変異体Ｒ１７９Ｑ）および修飾されたＦｃ（例えば、ＦｃＬＡ
ＬＡ）間の融合ポリペプチドを提供する。融合ポリペプチドはまた、所望によりＦＧＦお
よびＦｃ部分間のリンカーを含み得る。融合ポリペプチドはまた、所望によりシグナルペ
プチドを含み得る。種々の態様において、本明細書は、これらの融合ポリペプチドをコー
ドする核酸、これらの核酸を含むベクターおよびこれらの核酸を含む宿主細胞を含む。
４．１．クロトーおよび繊維芽細胞増殖因子ポリペプチド
本明細書のクロトー融合ポリペプチドは、天然のＦＧＦに相当する生物学的活性を示す
、例えば、ＦＧＦ受容体に結合し、ＦＧＦ受容体、ＦＲＳ２（ＦＧＦ受容体基質２）およ
びＥＲＫ１／２（細胞外シグナル−調節タンパク質キナーゼ１／２）のリン酸化を誘導し
、Ｅｇｒ−１（初期増殖応答−１）遺伝子を活性化させることが期待される。ＦＧＦは、
ＦＧＦ受容体に結合する分泌ペプチド増殖因子である。ＦＧＦのアミノ酸および核酸配列
は、当業者が容易に利用することができる。例えば、例のＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１および
ＦＧＦ２３の核酸配列（配列番号：３０、３２および３４として本明細書に記載されてい
る）は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、それぞれアクセッションナンバー：ＮＭ
＿００５１１７、ＮＭ＿０１９１１３およびＮＭ＿０２０６３８の下に見出すことができ
る。例のＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１およびＦＧＦ２３のアミノ配列（配列番号：３１、３３
および３５として本明細書に記載されている）は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて
、それぞれアクセッションナンバー：ＮＰ＿００５１０８、ＮＰ＿０６１９８６およびＮ
Ｐ＿０６５６８９の下に見出すことができる。さらに、ＦＧＦはタンパク質の発現に役立
つ１つ以上の変化を含み得る（例えば、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体（配列番号：３
６））。
クロトータンパク質は、細胞外ドメインおよび短い細胞質ドメインを有する１３０ｋＤ
ａの１回膜貫通型タンパク質である。クロトーのアミノ酸および核酸配列は、当業者が容
易に利用することができる。例えば、例のアルファ−クロトーおよびベータ−クロトーの
核酸配列（配列番号：７および８として本明細書に記載されている）は、ＧｅｎＢａｎｋ
データベースにおいて、それぞれアクセッションナンバー：ＮＭ＿００４７９５およびＮ
Ｍ＿１７５７３７の下に見出すことができる。例のアルファ−クロトーおよびベータ−ク
ロトーのアミノ酸配列（配列番号：２および４として本明細書に記載されている）は、Ｇ
ｅｎＢａｎｋデータベースにおいて、それぞれアクセッションナンバー：ＮＰ＿００４７
８６およびＮＰ＿７８３８６４の下に見出すことができる。
本明細書のクロトー融合ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子受容体に結合することが
でき、繊維芽細胞増殖因子−１９（配列番号：３１）、繊維芽細胞増殖因子−２１（配列
番号：３３）、繊維芽細胞増殖因子−２３（配列番号：３５）またはそれらの変異体（繊
維芽細胞増殖因子−２３変異体（Ｒ１７９Ｑ）（配列番号：３６）を含む）のいずれかに
作動可能に連結しているアルファ−クロトーまたはベータ−クロトー細胞外ドメインを有
する。
具体的には、本明細書のクロトー融合ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子−２３（配
列番号：３５）または繊維芽細胞増殖因子−２３変異体（Ｒ１７９Ｑ）（配列番号：３６
）に作動可能に連結しているアルファ−クロトー（配列番号：２）を含み得る。さらに、
本明細書のクロトー融合ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子−１９（配列番号：３１）
に作動可能に連結しているベータ−クロトー（配列番号：４）を有し得る。本明細書のク
ロトー融合ポリペプチドは、繊維芽細胞増殖因子−２１（配列番号：３３）に作動可能に
連結しているベータ−クロトー（配列番号：４）を含み得る。
本明細書は、種々のクロトーおよびＦＧＦ遺伝子およびこれらの遺伝子によってコード
されるタンパク質のホモログを含む。遺伝子に関して、「ホモログ」は、遺伝子の少なく
とも一部と実質的に同一である核酸配列もしくはその相補鎖またはそれらの一部を意味す
る、ただし、核酸配列が遺伝子によってコードされるタンパク質と実質的に同じ活性／機
能を有するタンパク質をコードする。本明細書に記載されている遺伝子のホモログは、推
定ホモログのアミノ酸または核酸配列と遺伝子またはそれらによってコードされるタンパ
ク質配列間の同一性パーセントにより同定することができる（例えば、クロトーおよびＦ
ＧＦをコードする遺伝子に対する核酸配列またはそれらの相補鎖）。同一性パーセントは
、例えば、視覚的検査により、または当分野で既知の、または本明細書に記載されている
種々のコンピュータープログラムを使用することにより測定され得る。配列同一性は、一
般的に、配列分析ソフトウェア（例えば、Sequence Analysis Software Package of the
Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 Univ
ersity Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAPまたはPILEUP/PRETTYBOXプ
ログラム）を使用して測定される。このようなソフトウェアは、種々の置換、欠失および
／または他の修飾に関して相同性の程度を割り当てることにより、同一または同様の配列
を合わせる。保存アミノ酸置換は、一般的に、以下のグループ内の置換を含む。
グリシンおよびアラニン、
バリン、イソロイシンおよびロイシン、
アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンおよびグルタミン、
セリンおよびスレオニン、
リジンおよびアルギニン、ならびに
フェニルアラニンおよびチロシン。
したがって、アラニンへのグリシンの変異、グリシンへのアラニンの変異、イソロイシ
ンまたはロイシンへのバリンの変異、イソロイシンのバリンまたはロイシンでの置換、ロ
イシンのバリンまたはイソロイシンでの置換などは、保存アミノ酸置換である。本明細書
は、少なくとも１つの保存アミノ酸置換を有する本明細書に記載されている全てのアミノ
酸配列の変異体を提供する。
同一性の程度を測定するための手段の例において、密接な関連配列を示すプロバビリテ
ィスコアｅ−３からｅ−１００を使用するＢＬＡＳＴプログラムが使用され得る。
１つの態様において、本明細書は、配列番号：１９の融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：２０の融合ポリペプチドを提供する。
１つの態様において、本明細書は、配列番号：４０の融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：４１の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
１つの態様において、本明細書は、配列番号：４６の融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：４７の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：４８の融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：４９の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する
１つの態様において、本明細書は、配列番号：５０の融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５１の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
１つの態様において、本明細書は、配列番号：５２の融合ポリペプチドを提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５３の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５４の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５５の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５６の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５７の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５８の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：５９の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６０の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６１の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６２の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６３の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６４の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６５の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６６の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６７の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
別の態様において、本明細書は、配列番号：６８の融合ポリペプチドまたは少なくとも
１つの保存アミノ酸置換を含むその変異体を提供する。
本明細書において使用される「相同性」および「相同」なる用語は、理論上共通の遺伝
的先祖を有するタンパク質を示すことに限定せず、進化した遺伝的に関連し得ないが、そ
れにもかかわらず、同様の機能を行い、および／または同様の構造を有するようなタンパ
ク質を含む。本明細書に記載されている機能的相同性の種々のタンパク質は、また、ホモ
ログである対応するタンパク質の活性を有するタンパク質を含む。機能的相同性を有する
タンパク質に関して、それらがそれらのアミノ酸配列において有意な同一性を有する必要
はなく、むしろ、機能的相同性を有するタンパク質は同様の、または同一の活性を有する
ことにより定義される。例えば、クロトー分子に関して、ポリペプチドはＦＧＦポリペプ
チドへの結合の機能的特徴と有し、ＦＧＦＲへのＦＧＦの結合が可能であるべきである。
ＦＧＦ分子に関して、ポリペプチドはＦＧＦＲに結合し、ＦＧＦＲの活性化（例えば、リ
ン酸化）を引き起こす機能的特徴を有するべきである。ＦＧＦ受容体へのＦＧＦ結合およ
び／またはＦＧＦシグナル伝達経路の活性化を評価するためのアッセイは、当分野で既知
であるか、または本明細書に記載されている（実施例２参照）。クロトー活性を評価する
ためのアッセイも、当分野で既知であるか、本明細書に記載されている（例えば、ＦＧＦ
ポリペプチドへの結合）。構造的相同性を有するタンパク質は、類似の三次（または四次
）構造を有するものとして定義されるが、それらをコードする遺伝子に対するアミノ酸同
一性または核酸同一性は必ずしも必要ではない。ある特定の状況では、構造的ホモログは
タンパク質の活性部位または結合部位のみで構造的相同性を維持するタンパク質を含み得
る。
構造的および機能的相同性に加えて、本明細書は、さらに本明細書に記載されている種
々のクロトーおよびＦＧＦアミノ酸配列とアミノ酸同一性を有するタンパク質を包含する
。２つのアミノ酸配列の同一性／相同性パーセントを決定するために、該２つの配列を最
適な比較目的のために並べる（例えば、一方のタンパク質のアミノ酸配列と最適なアライ
メントのために、ギャップをもう一方のタンパク質のアミノ酸配列に導入することができ
る）。次に、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。一方の配列の位置がもう
一方の配列の対応する位置に同じアミノ酸残基が存在するとき、それらの分子はその位置
で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列において共有される同一の位置
の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の位置の＃／位置の全＃×１００）。
本明細書に記載されている本明細書の分子のアミノ酸配列は、本明細書に記載されてい
るアミノ酸配列と少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％またはそれ以上同一または相同であるアミノ酸配列を有する。
本明細書に記載されている本明細書の分子の核酸配列は、本明細書に記載されている核
酸配列とハイブリダイズするか、または本明細書に記載されている核酸配列と少なくとも
約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそ
れ以上同一または相同である核酸配列を有する。
本明細書の融合ポリペプチドにおいて使用するために適当な核酸分子は、ストリンジェ
ント条件下で、クロトーまたはＦＧＦをコードする核酸分子の相補体にハイブリダイズす
るクロトーまたはＦＧＦ核酸配列を有し得る。本明細書において使用される「ストリンジ
ェント条件下でハイブリダイズする」なる用語は、互いに少なくとも約７０％、８０％、
８５％、９０％以上相同である核酸配列が一般的に互いにハイブリダイズの維持下にて、
ハイブリダイゼーションおよび洗浄する条件を表すことを意図する。このようなストリン
ジェント条件は当業者に既知であり、Ausubelら Current Protocols in Molecular Biolo
gy, Wiley Interscience, New York (2001), 6.3.1-6.3.6において見出すことができる。
特定の非限定的な例のストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、６×塩化ナトリ
ウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃でハイブリダイゼーション、次に０．
２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ中で５０−６５℃での１回以上の洗浄である。
４．２．本明細書のクロトー−ＦＧＦ融合ポリペプチド
本明細書のいくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドは、クロトーポリペプ
チドの第１のポリペプチド配列またはそれらの活性なフラグメントおよびＦＧＦをコード
する第２のポリペプチド配列またはそれらの活性なフラグメントを有するポリペプチド鎖
を有する。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容
体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメ
ントをさらに含む。
本明細書は、配列番号：１９−２８に存在するアミノ酸配列と少なくとも約９５％以上
相同である融合ポリペプチドを含む。配列番号：１９のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ
１７９Ｑ）変異体（配列番号：３６）のＮ−末端に結合しているクロトー細胞外ドメイン
を有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２０のアミノ酸配列は、Ｆ
ＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体のＮ−末端に結合しているシグナルペプチドを欠いている
クロトー細胞外ドメインのＮ−末端に結合しているＩｇＧシグナルペプチドを有するクロ
トー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２１のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ
１７９Ｑ）変異体のＮ−末端に結合しているＫＬ−Ｄ１細胞外サブドメインを有するクロ
トー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２２のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ
１７９Ｑ）変異体のＮ−末端に結合しているＫＬ−Ｄ２細胞外サブドメインを有するクロ
トー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２３のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２３（Ｒ
１７９Ｑ）変異体のＮ−末端に結合している２つのＫＬ−Ｄ１細胞外サブドメインを有す
るクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２４のアミノ酸配列は、ＦＧＦ２
３（Ｒ１７９Ｑ）変異体のＮ−末端に結合している２つのＫＬ−Ｄ２細胞外サブドメイン
を有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２５のアミノ酸配列は、ク
ロトー細胞外ドメインのＮ−末端に結合しているＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体を有す
るクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２６のアミノ酸配列は、ＫＬ−Ｄ
１細胞外サブドメインのＮ−末端に結合しているＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体を有す
るクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２７のアミノ酸配列は、ＫＬ−Ｄ
２細胞外サブドメインのＮ−末端に結合しているＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体を有す
るクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２８のアミノ酸配列は、２つのＫ
Ｌ−Ｄ１細胞外サブドメインのＮ−末端に結合しているＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体
を有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。配列番号：２９のアミノ酸配列は、２
つのＫＬ−Ｄ２細胞外サブドメインのＮ−末端に結合しているＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）
変異体を有するクロトー融合ポリペプチドをコードする。いくつかの態様において、融合
ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加し
た血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。
本明細書のクロトー融合ポリペプチドは、配列番号：７に記載されているアミノ酸配列
と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。配列番号：７のアミノ酸配列
はシグナルペプチドを欠いているクロトー細胞外ドメインをコードする。いくつかの態様
において、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／
もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。
対象融合タンパク質は本明細書に記載されており、当分野で既知の方法を使用して製造
することができる。例えば、本明細書の融合ポリペプチドは、米国特許第６，１９４，１
７７号に記載されているとおりに構築され得る。クロトーポリペプチドの使用は、米国特
許第６，５７９，８５０号に記載されている。ＦＧＦ核酸分子の使用は、米国特許第７，
２２３，５６３号に記載されている。
いくつかの態様において、クロトーをコードする核酸分子は、ＰＣＲによりクローニン
グされ、インフレームで、ＦＧＦをコードする核酸分子と結合される。いくつかの態様に
おいて、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／も
しくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメントをさらに含む。融合ポリ
ペプチドをコードする核酸は、発現を可能にするプロモーターに作動可能に連結している
。次に、融合ポリペプチドをコードする核酸分子を発現のための宿主細胞にトランスフェ
クトする。最終構築物の配列はシーケンシングにより確認することができる。
本明細書の融合タンパク質を製造するとき、クロトーの細胞外サブドメインをコードす
る核酸分子を、インフレームでＦＧＦをコードする核酸分子および修飾されたＦｃフラグ
メントをコードする（任意の）核酸に融合する。得られた核酸分子の発現は、ＦＧＦポリ
ペプチドに関してＮ−末端で融合しているクロトーの細胞外サブドメインを生じる。融合
物は、クロトーの細胞外サブドメインがＦＧＦポリペプチドに関してＣ−末端で融合して
いるものも可能である。融合タンパク質を製造するための方法は当分野で既知である。
本明細書の融合ポリペプチドは、一方のポリペプチドが１つのタンパク質配列またはド
メイン、例えばクロトー由来であり、そして、もう一方のポリペプチドが別のタンパク質
配列またはドメイン、例えばＦＧＦ由来である、共有結合されてた少なくとも２つのポリ
ペプチドを有する。いくつかの態様において、融合ポリペプチドは、減少したＦｃ−ガン
マ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃ
フラグメントをさらに含む。別の態様において、本明細書は、修飾されたＦｃフラグメン
トに融合したＦＧＦを含む。本明細書の融合ポリペプチドのクロトーおよび／またはＦＧ
Ｆおよび／または（任意の）修飾されたＦｃフラグメントは、当業者によく知られている
方法により連結することができる。これらの方法は化学的および組換え方法両方を含む。
本明細書の融合ポリペプチドに組み込まれるドメインをコードする核酸は、組換え遺伝
の分野における通常の技術を使用して得ることができる。本明細書において使用される一
般的な方法を記載している基本的な文献は、Sambrook and Russell, Molecular Cloning,
A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A L
aboratory Manual (1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubelら
eds., 1994-1999)を含む。本明細書のクロトー融合ポリペプチドをコードする核酸におい
て、配列番号：１および配列番号：３それぞれにより示されているアルファ−クロトーま
たはベータ−クロトーをコードする核酸配列が使用され得る。クロトー融合ポリペプチド
をコードする核酸において、配列番号：３０、配列番号：３２および配列番号：３４それ
ぞれにより示されているＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１またはＦＧＦ２３をコードする核酸配列
が使用され得る。本明細書に記載されている本明細書の分子の核酸配列は、配列番号：１
、配列番号：３、配列番号：３０、配列番号：３２または配列番号：３４とハイブリダイ
ズするか、または少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％、９９％またはそれ以上同一または相同である核酸配列を含む。
融合物の種々の成分［クロトーおよび／またはＦＧＦペプチドおよび／または（任意の
）修飾されたＦｃフラグメント］をコードする核酸配列は、種々の方法のいずれかを使用
して得ることができる。例えば、ポリペプチドをコードする核酸配列は、プローブとのハ
イブリダイゼーションによりｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーからクローニング
されるか、またはオリゴヌクレオチドプライマーとの増幅技術を使用して単離され得る。
より一般的には、増幅技術はＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型を使用してクロトーおよびＦＧＦ配
列を増幅および単離するために使用される（例えば、Dieffenfach & Dveksler, PCR Prim
ers: A Laboratory Manual (1995)、参照）。あるいは、重複オリゴヌクレオチドは合成
的に生産し、１つ以上のドメインを生産して連結することができる。クロトーまたはＦＧ
Ｆをコードする核酸は、また、プローブとして抗体を使用して発現ライブラリーから単離
することができる。
本明細書において、融合物の種々の成分［クロトー、および／またはＦＧＦおよび／ま
たは（任意の）修飾されたＦｃフラグメント］は、アミノ酸リンカーを含む共有結合リン
カー、例えば、ポリグリシンリンカー、または炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸
リンカー、ポリエーテルリンカーを含む別のタイプの化学リンカー、例えば、ＰＥＧなど
で直接、または、それらを介してのいずれかで連結することができる（例えば、Hermanso
n, Bioconjugate techniques (1996)、参照）。融合物／融合ポリペプチドを形成するポ
リペプチドは、一般的に、Ｃ−末端からＮ−末端に連結するが、それらは、Ｃ−末端から
Ｃ−末端、Ｎ−末端からＮ−末端またはＮ−末端からＣ−末端に連結することもできる。
１つ以上のポリペプチドドメインが、本明細書の融合ポリペプチド内の内部の位置に挿入
され得る。融合タンパク質のポリペプチドは任意の順番であり得る。融合ポリペプチドは
、隣接して融合タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドを製造することにより、
１つのタンパク質配列からのアミノ酸鎖、例えば、クロトーの細胞外サブドメインと別の
タンパク質配列からのアミノ酸鎖、例えば、ＦＧＦの共有結合により生産され得る。融合
タンパク質におけるアミノ酸の異なる鎖は、互いに直接的にスプライシングされるか、化
学結合基またはアミノ酸結合基を介して互いに間接的にスプライシングされ得る。アミノ
酸結合基は、約２００以上のアミノ酸長または一般的に１から１００アミノ酸長であり得
る。いくつかの態様において、プロリン残基がリンカーに組み込まれ、リンカーによる重
要な二次構造成分の構成を妨げる。リンカーは、しばしば、組換え融合タンパク質の一部
として合成されるフレキシブルなアミノ酸部分配列であり得る。このようなフレキシブル
なリンカーは当業者に既知である。
本明細書において、融合物［クロトーの細胞外サブドメインおよび／またはＦＧＦおよ
び／または（任意の）修飾されたＦｃフラグメント］のアミノ酸配列は、ペプチドリンカ
ーを介して連結されていてもよい。例のペプチドリンカーは当分野で既知であり、本明細
書に記載されている。例えば、ペプチドリンカーは、一般的に、いくつかのＧｌｙおよび
いくつかのＳｅｒ残基、例えば：（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ）３（配列番号：１１）、Ｇｌｙ４
Ｓｅｒポリペプチド（配列番号：１２）、Ｇｌｙ（配列番号：１３）、Ｇｌｙ Ｇｌｙ
（配列番号：１４）、Ｇｌｙ Ｓｅｒ（配列番号：１５）、Ｇｌｙ２ Ｓｅｒ（配列番号
：１６）、Ａｌａ（配列番号：１７）およびＡｌａ Ａｌａ（配列番号：１８）を含む。
特に、本明細書の融合タンパク質において使用するためのペプチドリンカーは、フレキシ
ブルなヒンジとして作用し得る。
クロトーまたはＦＧＦのシグナル配列は、本明細書の融合タンパク質へのクロトーの導
入前に、除去され得る。融合タンパク質のクロトーまたはＦＧＦに対するシグナル配列は
、例えば、配列番号：１９により示されているポリペプチドを含み得る。しかしながら、
このような配列は、また、除去されるか、または異なるタンパク質のシグナル配列、例え
ば、ＩｇＧシグナル配列（配列番号：９）で置き換えられ得る。一般的に、本明細書の医
薬組成物はクロトーおよびＦＧＦの成熟形態を含む。
一般的に、イントロンは、融合ポリペプチドへの導入の前に、クロトーまたはＦＧＦ部
分のいずれか１つまたは両方から除外される。
本明細書の融合ポリペプチドは、１つ以上の活性アミノ酸側鎖に共有結合した１つ以上
のポリマーを含み得る。非限定的な例として、このようなポリマーは、１つ以上の遊離の
システインスルフヒドリル残基と結合することができるポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）を含み、それにより、タンパク質が酸化条件に暴露されたとき、ジスルフィド結合およ
び凝集の形成をブロックすることができる。加えて、本明細書の融合ポリペプチドのペグ
化は、半減期、溶解度およびプロテアーゼ抵抗性の増加のようなこのような改良された特
性を提供することが期待される。あるいは、本明細書の融合ポリペプチドは、遊離アミノ
基、例えば、リシンイプシロンまたはＮ−末端アミノ基へのポリマーの共有結合的付加に
より修飾され得る。共有結合修飾に対して特定の特異的なシステインおよびリシンは、受
容体結合、ヘパリン結合または適当なタンパク質フォールディングに関連しないものある
。特定のアミノ酸残基の修飾が望ましいタンパク質の活性に影響するか否かを測定するた
めに、融合ポリペプチドの生化学的および／または生物学的活性をアッセイするための方
法が使用され得ることは、当業者に明らかである。他の同様の適当な修飾が考えられ、当
分野で既知である。
本明細書は、また、配列番号：１９−２８に存在するアミノ酸配列と少なくとも約９５
％以上相同である融合ポリペプチドの発現に関する。
本明細書は、（ａ）クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインまたは
それらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体を含むポリペプチド、（ｂ）線維芽細胞増
殖因子またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体を含むポリペプチド、および
（ｃ）減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減
期を有する修飾されたＦｃフラグメントを含む融合ポリペプチドを含む。「それらの機能
的に活性な変異体もしくは誘導体」は、生物学的活性を保持するが、対応する野生型ポリ
ペプチドよりもより長い、より短いまたは改変されたアミノ酸配列を含む変異体もしくは
誘導体を意味する。したがって、クロトータンパク質の細胞外サブドメインまたは線維芽
細胞増殖因子の「機能的に活性な変異体もしくは誘導体」は、野生型ポリペプチド配列の
少なくとも１つの生物学的活性を保持するが、野生型クロトータンパク質の細胞外サブド
メインまたは線維芽細胞増殖因子よりもより少ない、より多いまたは改変されたアミノ酸
配列を含む。本明細書に記載されているポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは誘
導体はまた、翻訳後修飾（例えば、ペグ化、メチル化および／またはグリコシル化）にお
いて変化しているか、またはそれに加えられたさらなる部分または因子を有するが、本明
細書に記載されているポリペプチドの同じアミノ酸配列を含み得る。種々の態様において
、ＦＧＦ２３の変異体もしくは誘導体は、Ｒ１７９Ｑを含むか、または含まない。
１つの態様において、機能的に活性な変異体もしくは誘導体ポリペプチドは、本明細書
に記載されている配列（例えば、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメイン
または線維芽細胞増殖因子）と少なくとも約６０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ま
しくは、ポリペプチドは、本明細書に記載されている配列と少なくとも５５％、６０％、
６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ
以上同一である。
本明細書において使用される２つのアミノ酸配列（または２つの核酸配列）の同一性パ
ーセントは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（PNAS USA 87:2264-2268, 1990）の
アルゴリズムを使用して決定され、Karlin and Altschul, PNAS USA 90:5873-5877, 1993
）において修飾される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（J. Mol. Biol
. 215:403-410, 1990）のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。
ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝
１２で行われる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０
、ワード長＝３で行われる。比較目的のためのギャップアラインメントを取得するために
、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402,
1997）に記載されているとおりに利用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄＢＬＡＳ
Ｔプログラムを利用するとき、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢ
ＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを、本発明の核酸分子に対して相同のヌクレオチド
配列を得るために使用し得る。
同一性または同一は、アミノ酸配列（または核酸配列）類似性を意味し、当分野で認識
される意味を有する。同一性を有する配列は、同一の、または同様のアミノ酸（または核
酸）を共有する。したがって、参照配列と８５％のアミノ酸配列同一性を共有する候補配
列が、参照配列と候補配列の以下のアラインメントの後に、候補配列における８５％のア
ミノ酸が、参照配列における対応するアミノ酸と同一であり、そして／または保存アミノ
酸変化を構成することを必要とする。
本明細書に記載されているポリペプチドの機能的に活性な変異体は、元のポリペプチド
またはフラグメントの実質的に同じ機能活性を保持する。天然機能的に活性な変異体、例
えば、対立遺伝子変異体および種変異体および非天然機能的に活性な変異体は、本発明に
おいて含まれ、例えば、変異誘発技術または直接合成により生産することができる。
機能的に活性な変異体もしくは誘導体は、本明細書に記載されているポリペプチドから
約または少なくとも、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、
５０、５５、６０またはそれ以上のアミノ酸残基で異なっている。この比較がアラインメ
ントを必要とするとき、配列は最大相同性となるようにアラインされる。変異部位は、本
明細書に記載されているポリペプチドと実質的に同様の活性を有する限り、ポリペプチド
中どこでも起こり得る。
表現型でサイレントアミノ酸置換を有する変異体および誘導体を作製する方法について
の案内は、Bowieら Science, 247:1306-1310 (1990)において提供され、これは、アミノ
酸配列の変化への耐用性を研究するための２つの主な戦略があることを教示している。
第１の戦略は、進化の過程の自然選択によるアミノ酸置換の耐用性を利用する。異なる
種中のアミノ酸配列を比較することにより、種間で保存されているアミノ酸位置を同定す
ることができる。例えば、図５参照。これらの保存されたアミノ酸は、タンパク質機能の
ために重要であろう。対照的に、置換が自然選択によって耐用性であるアミノ酸位置は、
タンパク質機能に重要でない位置を示す。したがって、アミノ酸置換に耐用性である位置
は修飾することができるが、ポリペプチドの特定の結合活性を維持している。
第２の戦略は、タンパク質機能に重要である領域を同定するために、クローン遺伝子の
特定の位置にアミノ酸変化を導入する遺伝子操作を使用する。例えば、部位特異的変異誘
発またはアラニン−スキャン変異誘発（分子中の全ての残基において単一のアラニン変異
の導入）を使用することができる（Cunninghamら Science, 244:1081-1085 (1989)）。
タンパク質のアミノ酸に変異を導入する方法は、当業者によく知られている。例えば、
Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.
(1994); T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Labora
tory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)）参
照。変異もまた、市販のキット、例えば、「QuikChange.TM. Site-Directed Mutagenesis
Kit」(Stratagene)を使用して導入することができる。ポリペプチドに対してポリペプチ
ドの機能に影響しないアミノ酸を置換することによるポリペプチドの機能的に活性な変異
体もしくは誘導体の産生は、当業者により成し遂げることができる。
変異体または誘導体は、例えば、少なくとも１つの生物学的活性を保持する１つ以上の
保存的置換を有し得る。保存的置換は、ペプチド化学の当業者が、ポリペプチドの二次構
造および水に対する性質が実質的に変化しないと予期されるように、アミノ酸を同様の特
性を有する別のアミノ酸に置換された置換である。一般的に、アミノ酸の以下のグループ
は保存変化を示す：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、
ｓｅｒ、ｔｈｒ、（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ、（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅ
ｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ、および（５）ｐｈｅ、ｔ
ｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。
変異体および誘導体の特定の例は、限定はしないが、クロトータンパク質の少なくとも
１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的に活性な変異体および誘導体、例
えば、野生型配列（配列番号：５または６に記載されている）とわずか約１、２、３、４
、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９
、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０またはそれ以上のアミノ酸残
基の違いを有する、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、３
７５、４００または４２５個の隣接するクロトーの細胞外ドメインのアミノ酸（例えば、
配列番号：５または６）を含み、野生型ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を
保持しているポリペプチドを含む。例えば、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞
外サブドメインを含むポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは誘導体は、わずか約
１００個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約４００個の隣接する配列番号：５ま
たは６のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。例えば、クロトータンパク質の少なくとも
１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは誘導体は
、わずか約５０個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約４００個の隣接する配列番
号：５または６のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。例えば、クロトータンパク質の少
なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは
誘導体は、わずか約２５個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約４２５個の隣接す
る配列番号：５または６のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。例えば、クロトータンパ
ク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的に活性な変異体
もしくは誘導体は、わずか約１０個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約４２５個
の隣接する配列番号：５または６のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。別の例において
クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的
に活性な変異体もしくは誘導体は、野生型配列とわずか約１、２、３、４、５、６、７、
８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、
３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１
００、１１０、１２０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００
個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００
、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００
、８５０、９００、９２５、９５０または９８２個の隣接する配列番号：７のアミノ酸を
含むポリペプチドを含む。例えば、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブド
メインを含むポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは誘導体は、わずか約１００個
のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約５００個の隣接する配列番号：７のアミノ酸
を含むポリペプチドを含む。例えば、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブ
ドメインを含むポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは誘導体は、わずか約１００
個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約６００個の隣接する配列番号：７のアミノ
酸を含むポリペプチドを含む。例えば、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サ
ブドメインを含むポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは誘導体は、わずか約１０
０個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約７００個の隣接する配列番号：７のアミ
ノ酸を含むポリペプチドを含む。例えば、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外
サブドメインを含むポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは誘導体は、わずか約１
００個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約８００個の隣接する配列番号：７のア
ミノ酸を含むポリペプチドを含む。例えば、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞
外サブドメインを含むポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは誘導体は、わずか約
１００個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約９００個の隣接する配列番号：７の
アミノ酸を含むポリペプチドを含む。例えば、クロトータンパク質の少なくとも１つの細
胞外サブドメインを含むポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは誘導体は、わずか
約５０個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約９００個の隣接する配列番号：７の
アミノ酸を含むポリペプチドを含む。
変異体および誘導体の特定の例は、限定はしないが、線維芽細胞増殖因子を含むポリペ
プチドの機能的に活性な変異体および誘導体、例えば、野生型配列（配列番号：３１、３
３または３５に記載されている）とわずか約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０
、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、
４０、４５、５０、５５、６０またはそれ以上のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも
約１００、１２５、１５０、１５０、１７５、２００、２２５または２５０個の隣接する
線維芽細胞増殖因子のアミノ酸、例えば、ＦＧＦ１９（配列番号：３１）、ＦＧＦ２１（
配列番号：３３）またはＦＧＦ２３（配列番号：３５）を含み、野生型ポリペプチドの少
なくとも１つの生物学的活性を保持しているポリペプチドを含む。種々の態様において、
変異体または誘導体は、Ｒ１７９Ｑ変異を含み得るか、または含むことができない。例え
ば、線維芽細胞増殖因子を含むポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは誘導体は、
わずか約２５個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約１５０個の隣接する配列番号
：３１、３３または３５のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。例えば、線維芽細胞増殖
因子を含むポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは誘導体は、わずか約２５個のア
ミノ酸残基の違いを有する少なくとも約１７５個の隣接する配列番号：３１、３３または
３５のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。例えば、線維芽細胞増殖因子を含むポリペプ
チドの機能的に活性な変異体もしくは誘導体は、わずか約２５個のアミノ酸残基の違いを
有する少なくとも約２００個の隣接する配列番号：３１、３３または３５のアミノ酸を含
むポリペプチドを含む。例えば、線維芽細胞増殖因子を含むポリペプチドの機能的に活性
な変異体もしくは誘導体は、わずか約５０個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約
２２５個の隣接する配列番号：３５のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。例えば、線維
芽細胞増殖因子を含むポリペプチドの機能的に活性な変異体もしくは誘導体は、わずか約
２５個のアミノ酸残基の違いを有する少なくとも約２２５個の隣接する配列番号：３５の
アミノ酸を含むポリペプチドを含む。
４．３．本明細書の融合ポリペプチドの発現
本明細書の融合タンパク質を発現するために、本明細書に記載されているいずれかの方
法または当分野で既知である方法により得られるＤＮＡ分子を、当分野で既知の技術によ
り適当な発現ベクターに挿入することができる。例えば、二本鎖ｃＤＮＡは、ホモポリマ
ーの付加または合成ＤＮＡリンカーの使用に関連する制限酵素結合または平滑末端ライゲ
ーションにより、適当なベクターにクローニングすることができる。ＤＮＡリガーゼは、
通常、ＤＮＡ分子をライゲートするために使用され、望ましくない結合はアルカリホスフ
ァターゼでの処理により避けることができる。
したがって、本明細書は、本明細書に記載されている核酸分子（例えば、遺伝子または
遺伝子をコードする組換え核酸分子）を含むベクター（例えば、組換えプラスミドおよび
バクテリオファージ）を含む。「組換えベクター」なる用語は、組換えベクターが由来す
る天然または非人工の核酸分子において含まれる核酸配列よりも、より多い、より少ない
、または異なる核酸配列を含むように、変化、修飾または加工されたベクター（例えば、
プラスミド、ファージ、ファスミド、ウイルス、コスミド、フォスミドまたは他の精製さ
れた核酸ベクター）を含む。例えば、組換えベクターは、本明細書において定義されてい
る調節配列、例えば、プロモーター配列、終結配列および／または人工リボソーム結合部
位（ＲＢＳ）に作動可能に連結しているクロトー−ＦＧＦ２３融合物をコードする核酸配
列を含み得る。ベクターに包含されている遺伝子または核酸の発現が可能である組換えベ
クターを「発現ベクター」と称する。
真核生物宿主において、異なる転写および翻訳調節配列は、宿主の性質に依存して使用
され得る。それらはアデノウイルス、ウシパピローマ・ウイルス、シミアン・ウイルスな
どのウイルス源由来であり得、調節シグナルは高レベルの発現を有する特定の遺伝子と関
連している。例えば、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター
、酵母菌ｇａ１４遺伝子プロモーターなどを含むが、これらに限定されない。転写開始調
節シグナルは、遺伝子の発現を調節することができるように抑制または活性化することが
できるものを選択され得る。
本明細書に記載されているいくつかの本明細書の分子において、融合ポリペプチドの１
つ以上のポリペプチド鎖をコードする核酸配列を有する１つ以上のＤＮＡ分子は、望まし
いＤＮＡ分子を宿主細胞に組み込むことができる１つ以上の調節配列に作動可能に連結し
ている。導入されたＤＮＡにより安定に形質転換された細胞は、例えば、発現ベクターを
含む宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入することにより、選択するこ
とができる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現する核酸配列に直接結合するか、または
共トランスフェクションにより同じ細胞に導入することができる。さらなる因子が、また
、本明細書に記載されているタンパク質の最適な合成のために必要であり得る。使用する
さらなる因子がどれであるかは、当業者に明白である。
特定のプラスミドまたはウイルスベクターの選択において重要な因子は、ベクターを含
む受容細胞が認識され、ベクターを含まない受容細胞から選択される容易さ、特定の宿主
において望ましいベクターのコピーの数、および、異なる種の宿主細胞間のベクターを「
往復する」ことができることが望ましいかどうかを含むが、これらに限定されない。
発現に関するＤＮＡ配列を含むようにベクターを構築するとき、例えば、形質転換、ト
ランスフェクション、コンジュゲーション(conjugation)、プロトプラスト融合、エレク
トロポレーション、リン酸カルシウム−沈降、直接マイクロインジェクションなどを含む
が、これらに限定されない、当分野で既知の１つ以上の種々の適当な方法により、適当な
宿主細胞に導入され得る。
宿主細胞は、原核生物または真核生物のいずれかであり得る。真核生物宿主細胞の例は
、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスター（
ＣＨＯ）細胞を含む。このような細胞は、例えば、正しいフォールディングまたはグリコ
シル化を含むタンパク質の翻訳後修飾を容易にする。さらに、酵母細胞も本明細書の融合
ポリペプチドを発現するために使用することができる。多くの哺乳動物細胞のように、酵
母細胞も、例えば、グリコシル化を含むタンパク質の翻訳後修飾を可能にする。酵母菌に
おけるタンパク質の生産のために利用することができる強いプロモーター配列および高コ
ピー数プラスミドのどれを利用するかにおいては、多くの組換えＤＮＡ戦略が存在する。
酵母菌の転写および翻訳機構は、クローニングされた哺乳動物の遺伝子産物におけるリー
ダー配列を認識することができ、それによりリーダー配列を有するペプチド（すなわち、
前ペプチド）の分泌を可能にする。本明細書の融合ポリペプチドの高収率生産の特定の方
法は、ＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞におけるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）増幅の使用
を介して、米国特許第４，８８９，８０３号に記載されているメトトレキサートのレベル
の連続的な増加の使用によるものである。得られたポリペプチドをグリコシル化してもよ
い。
１つ以上のベクターの導入後、宿主細胞を、通常、ベクター含有細胞の増殖を選択する
選択培地中で増殖させる。組換えタンパク質の精製は、当分野で既知の、または本明細書
に記載されているいずれかの方法、例えば、抽出、沈降、クロマトグラフィーおよび電気
泳動法に関するいずれかの慣用の方法により実施することができる。タンパク質を精製す
るために使用され得るさらなる精製方法は、標的タンパク質を結合するモノクローナル抗
体を使用するアフィニティークロマトグラフィーである。一般的に、組換えタンパク質を
含む粗製造物を、適当なモノクローナル抗体が固定されているカラムに通過させる。不純
物は通過するが、タンパク質は、通常、特異的な抗体を介してカラムに結合する。カラム
を洗浄後、タンパク質を、例えば、ｐＨまたはイオン強度を変化させることにより、ゲル
から溶離する。
４．４．融合ポリペプチド活性を評価するためのアッセイ
本明細書に記載されているアッセイ（実施例２、参照）および当分野で既知のものを、
本明細書の融合ポリペプチドのクロトーまたはＦＧＦ活性を検出するために使用すること
ができる。適当な活性アッセイは、受容体結合アッセイ、細胞増殖アッセイおよび細胞シ
グナル伝達アッセイを含む。例えば、融合ポリペプチドがクロトーまたはＦＧＦ活性を有
するか否かを測定するために使用され得る結合アッセイは、融合ポリペプチドのＦＧＦ受
容体への結合をアッセイすることを含む。ＦＧＦ受容体結合アッセイは、競合および非競
合アッセイ両方を含むが、これらに限定されない。例えば、ＦＧＦ受容体結合は、ＦＧＦ
受容体を発現する細胞を標識ＦＧＦ（例えば、放射性標識）と接触させ、非標識クロトー
−ＦＧＦ融合ポリペプチドの濃度を増加させることにより検出することができる。同じ受
容体への結合に対して競合する２つのリガンドを、細胞を含む反応混合物に加える。次に
細胞を洗浄し、標識ＦＧＦを測定する。非標識融合ポリペプチドの存在下で受容体に対す
る標識ＦＧＦの量の減少は、受容体へのクロトー−ＦＧＦ融合ポリペプチドの結合を示す
。あるいは、クロトー−ＦＧＦ融合ポリペプチドを標識し、細胞への融合ポリペプチドの
直接結合を検出してもよい。
クロトーまたはＦＧＦ活性は、また、融合ポリペプチドが細胞応答を誘導するか否かを
決定することにより測定することができる。例えば、いくつかの態様において、クロトー
−ＦＧＦ融合ポリペプチドの生物学的活性を検出するためのアッセイは、ＦＧＦ受容体を
発現する細胞を融合ポリペプチドと接触させ、細胞応答、例えば、細胞増殖またはＥｇｒ
−１活性化、Ｃ２Ｃ１２細胞における筋管直径をアッセイし、融合ポリペプチドの存在お
よび非存在下で細胞応答を比較することを含む。融合ポリペプチド複合体の非存在下と比
較して融合ポリペプチド複合体の存在下での細胞応答の増加は、融合ポリペプチドが生物
学的活性を有することを示す。また、受容体からの下流シグナル伝達事象の増加も、生物
学的活性（例えば、ＦＧＦＲ、ＦＲＳ２、ＥＲＫ１／２、ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化など）
の証拠として、測定することができる。
４．５．医薬組成物および処置法
本明細書は、また、１つ以上の本明細書の融合ポリペプチドおよび薬学的に許容される
希釈剤または担体を含む医薬組成物に関する。該医薬組成物は薬学的有効用量のヘパリン
をさらに含むことができる。このような医薬組成物はキットまたは容器に含まれ得る。こ
のようなキットまたは容器には、融合ポリペプチドのインビボ半減期またはインビトロ寿
命の延長に関する指示書と共にパッケージされていてもよい。所望により、このようなキ
ットまたは容器には、医薬または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する行政機
関により指示されている形での通知を添付することができ、この通知は、ヒト投与のため
の製造、使用または販売の行政機関による承認を反映する。このような組成物は、医薬組
成物を患者に投与することにより、患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにお
ける疾患または疾患症状（例えば、加齢関連状態または代謝障害）を処置、予防または改
善する方法において使用され得る。
一般的に、本明細書の医薬組成物の治療有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．
００１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重または約０．０２ｍ
ｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重である。一般的に、融合ポリペプチドの治療有効量は、
例えば、約０．００１ｍｇから約０．０１ｍｇ、約０．０１ｍｇから約１００ｍｇまたは
約１００ｍｇから約１０００ｍｇである。好ましくは、融合ポリペプチドの治療有効量は
、約０．００１ｍｇ／ｋｇから２ｍｇ／ｋｇである。
融合ポリペプチドに関する最適な医薬製剤は、投与経路および望ましい用量に依存して
当業者により決定することができる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 1
8th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa.、参照、この文献の全体を出典明示
により本明細書に包含させる）。
本明細書の融合ポリペプチドは、固体、液体または気体（エアロゾル）の形態であって
よい医薬組成物として投与され得る。典型的な投与経路は、経口、局所、非経腸、舌下、
経直腸、膣、皮内および鼻腔内を含むが、これらに限定されない。非経腸投与は、皮下注
射、静脈内、筋肉内、腹膜内、胸膜内、胸骨内注射または注入技術を含む。好ましくは、
組成物は非経腸的に投与される。さらに好ましくは、組成物は静脈内に投与される。本明
細書のポリペプチドが対象への組成物の投与時に生物学的に利用可能にするように、本明
細書の医薬組成物を処方することができる。例えば、錠剤が単一の投与単位であり、エア
ロゾル形態の本明細書のポリペプチドの容器が複数の投与単位を入れることができるとき
、組成物は１つ以上の投与単位の形態を取ることができる。
医薬組成物の製造において使用される物質は使用される量において非毒性であり得る。
医薬組成物における活性成分の最適な用量が種々の因子に依存することは当業者に明らか
である。関連因子は、対象の型（例えば、ヒト）、対象の健康全般、処置の必要な対象の
加齢関連状態または代謝障害の型、多剤レジメンの一部としての組成物の使用、本明細書
のポリペプチドの特定の形態、投与様式および使用される組成物を含むが、これらに限定
されない。
薬学的に許容される担体またはビヒクルは、組成物が、例えば、錠剤または粉末形態で
存在できるような粒子であり得る。担体は、例えば、経口シロップまたは注射可能な液体
である組成物と共に液体であり得る。加えて、担体は、例えば、吸入投与に有用なエアロ
ゾル組成物を提供するために気体であり得る。
「担体」なる用語は、本明細書のポリペプチドと一緒に投与される希釈剤、アジュバン
トまたは賦形剤を示す。このような医薬担体は、液体、例えば、水および油（石油、動物
性、植物性または合成のものを含む）、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油
などであり得る。担体は、塩水、アカシア・ゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク
、ケラチン、コロイダルシリカ、ウレアなどであり得る。加えて、補助剤、安定剤、増粘
剤、潤滑剤および着色剤を使用することができる。１つの態様において、対象に投与され
るとき、本明細書のポリペプチドおよび薬学的に許容される担体は滅菌される。本明細書
のポリペプチドが静脈内投与されるとき、水は特定の担体である。塩水および水性デキス
トロースおよびグリセロール溶液は、また、液体担体、特に注射可能溶液として使用され
得る。適当な医薬担体は、また、賦形剤、例えば、デンプン、グルコース、ラクトース、
スクロース、ゼラチン、モルト、ライス、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸
ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミル
ク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。望ましいとき
、本組成物は少量の湿潤剤もしくは乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含み得る。
組成物は、経口投与用であり得、そのとき、組成物は好ましくは固体または液体形態で
あり、半固体、半液体、懸濁液およびゲル形態が本明細書において固体または液体のいず
れかとして考慮される形態内に含まれる。
経口投与用の固体組成物として、組成物は、粉末、顆粒、圧縮錠剤、錠剤、カプセル、
チューインガム、ウエハースなどの形態に製剤化することができる。このような固体組成
物は一般的に１つ以上の不活性な希釈剤を含む。加えて、１つ以上の以下のものが存在し
得る、結合剤、例えば、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、微結晶性セル
ロースまたはゼラチン、賦形剤、例えば、デンプン、ラクトースまたはデキストリン、崩
壊剤、例えば、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル、コーンデンプンなど、
滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロテックス、流動促進剤、例えば、
コロイド状二酸化ケイ素、甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリン、香味剤、例え
ば、ペパーミント、サルチル酸メチルまたはオレンジ香味剤、ならびに着色剤。
医薬組成物がカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの形態であるとき、医薬組成物は、
上記の型の物質に加えて、液体担体、例えば、ポリエチレングリコール、シクロデキスト
リンまたは脂肪油を含むことができる。
医薬組成物は液体の形態、例えば、エリキシル、シロップ、溶液、エマルジョンまたは
懸濁液であり得る。液体は経口投与または注射による送達のために有用であり得る。経口
投与用のとき、組成物は１つ以上の甘味剤、防腐剤、色素／着色料および香味料を含み得
る。注射による投与用の組成物において、また、１つ以上の界面活性剤、保存剤、湿潤剤
、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤および等張剤を含み得る。
溶液、懸濁液または他の形態であろうとなかろうと、本明細書の液体組成物は、また、
１つ以上の以下のものを含むことができる、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、塩水溶液、
好ましくは生理食塩水、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム、固定油、例えば、溶媒また
は懸濁媒体として働くことができる合成モノもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコ
ール、グリセリン、シクロデキストリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒、抗菌剤
、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン、抗酸化剤、例えば、アスコルビン
酸または亜硫酸水素ナトリウム、キレート剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸、緩
衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および等張化剤、例えば、塩化ナトリ
ウムまたはデキストロース。非経腸用の組成物は、ガラス、プラスチックまたは他の物質
製であるアンプル、使い捨て注射器または複数回バイアルに包まれていてもよい。生理食
塩水は特定の好ましいアジュバントである。注射可能な組成物は好ましくは滅菌である。
医薬組成物は、適当な用量が得られる有効量の本明細書の化合物（例えば、融合ポリペ
プチド）を含む。医薬組成物は、それぞれの障害に対して現在処方されている既知の有効
量の化合物を含み得る。
加齢関連状態または代謝障害の予防、処置および／または管理において有効である予防
および／または治療レジメンにおいて使用される本明細書のポリペプチドの投与経路は、
当分野で既知の他の治療に対して現在処方されている投与形路に基づくことができる。本
明細書のポリペプチドは、任意の便利な経路、例えば、注入またはボーラス注射により、
上皮性または皮膚粘膜裏当てを介する吸収（例えば、経口粘膜、経直腸および腸粘膜など
）により投与することができる。投与は全身的または局所的であり得る。種々の送達系は
、例えば、マイクロ粒子、マイクロカプセル、カプセルなどが知られており、本明細書の
ポリペプチドを投与するために有用であり得る。１つ以上の本明細書のポリペプチドが対
象に投与され得る。投与の方法は、経口投与および非経腸投与、皮内、筋肉内、腹膜内、
静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、舌下、鼻腔内、大脳内、脳室内、髄腔内、膣内、経皮を
含むが、これらに限定されない非経腸投与、経直腸的、吸入による、または、眼、鼻、耳
または皮膚への局所的を含むが、これらに限定されない。
本明細書のポリペプチドは非経腸的に投与され得る。具体的には、本明細書のポリペプ
チドは静脈内に投与され得る。
肺投与は、また、例えば、吸入器または噴霧器、およびエアロゾル剤との製剤の使用に
より、またはフルオロ炭素または合成肺界面活性剤でのかん流を介して、使用することが
できる。本明細書のポリペプチドは、また、伝統的な結合剤および担体、例えば、トリグ
リセリドと一緒に坐薬として製剤化することができる。
本明細書のポリペプチドは制御放出系において送達することができる。例えば、ポンプ
を使用することができる（Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 1987, 14, 201; Buchw
aldら Surgery 1980, 88: 507; Saudekら N. Engl. J. Med. 1989, 321: 574、参照）。
ポリマー物質も、本明細書のポリペプチドの制御放出のために使用することができる（Me
dical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boc
a Raton, FL, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Perf
ormance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Ma
cromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 1983, 23, 61、参照；Levyら Science 1985, 228,
190; Duringら Ann. Neurol., 1989, 25, 351; Howardら J. Neurosurg., 1989, 71, 105
も参照）。具体的には、制御放出系を、本明細書のポリペプチドの標的、例えば、脳の近
接に置くことができ、したがって、全身投与量に対してほんのわずかしか必要としない（
例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, 1
984, pp. 115-138、参照）。Ｌａｎｇｅｒによる文献（Science 1990, 249, 1527-1533）
において論じられている他の制御放出系を使用することができる。
本明細書のポリペプチドの制御または持続放出を達成するために使用されるポリマー物
質は、例えば、米国特許第５，６７９，３７７号、米国特許第５，９１６，５９７号、米
国特許第５，９１２，０１５号、米国特許第５，９８９，４６３号、米国特許第５，１２
８，３２６号、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／１５１５４およびＰＣＴ公開ＷＯ９９／２０２５３
において記載されている。持続放出製剤において使用されるポリマーの例は、ポリ（２−
ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸
）、ポリ（エチレン−コ−ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド
（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）
、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（
ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）およびポリオルトエステルを含むが、これらに
限定されない。好ましくは、持続放出製剤において使用されるポリマーは、不活性で、浸
出される不純物を含まず、保存安定性、滅菌性かつ生分解性である。
一般的に、本明細書の医薬組成物の治療有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇから０．
００１ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ体重または約０．０２ｍ
ｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇ体重である。
他の態様において、予防および／または治療レジメンは、少なくとも０．０１μｇ／ｍ
Ｌから少なくとも４００μｇ／ｍＬの本明細書のポリペプチドの血漿レベルを達成する、
有効量の本明細書のポリペプチドを患者に１回以上投与することを含む。
予防および／または治療レジメンは、少なくとも０．０１μｇ／ｍＬから４００μｇ／
ｍＬの本明細書のポリペプチドの血漿レベルを維持する、有効量の本明細書のポリペプチ
ドを患者へ複数回投与することを含み得る。予防および／または治療レジメンにて、少な
くとも１日、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月または
９ヶ月間投与され得る。
予防および／または治療レジメンは、１つ以上のさらなる治療と組み合わせての本明細
書のポリペプチドの投与を含み得る。加齢関連状態または代謝障害の予防、処置および／
または管理のために現在使用されている１つ以上の治療の推奨される用量は、Hardmanら
eds., Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, 10t
h ed., Mc-Graw-Hill, New York, 2001; Physician’s Desk Reference (60th ed., 2006
)（この内容を出典明示により本明細書に包含させる）を含むが、これらに限定されない
当分野の参考文献から得ることができる。
本発明は、クロトータンパク質およびＦＧＦのアゴニスト活性が望ましい障害を処置す
るための方法を含む。本明細書は、クロトータンパク質およびＦＧＦのアゴニスト活性が
望ましい病理学的疾患の治療における、または処置のための医薬としての記載されている
タンパク質、融合タンパク質、核酸分子または医薬組成物の使用をさらに含む。本明細書
のこのような方法または使用の例は、加齢関連状態または代謝障害を含むが、これらに限
定されない。
本明細書は、個体における加齢関連状態を処置または予防するための方法、および個体
における加齢関連状態を処置または予防するための治療における、または医薬としての記
載されているタンパク質、融合タンパク質、核酸分子または医薬組成物の使用を含む。処
置の必要な対象は、加齢関連状態を処置または予防するように、クロトータンパク質の少
なくとも１つの細胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子および（任意の）修飾され
たＦｃフラグメントを有する、クロトー融合ポリペプチドを含む薬理学的有効用量の医薬
組成物を投与される。いくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドは薬理学的有
効用量のヘパリンと共投与される。加齢関連状態はサルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、
脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全
、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、前立
腺癌、卒中、期待寿命の低下、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢関連難聴を含む。
いくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドはアルファクロトータンパク質の少
なくとも１つの細胞外ドメインを含む。特定の態様において、アルファクロトータンパク
質の少なくとも１つの細胞外ドメインおよび繊維芽細胞増殖因子２３を含むクロトー融合
タンパク質は、筋肉疲労に対して処置の必要な対象に投与される。
本発明は、また、個体における代謝障害を処置または予防するための方法、および個体
における代謝障害を処置または予防するための治療における、または医薬としての記載さ
れているタンパク質、融合タンパク質、核酸分子または医薬組成物の使用に関する。処置
の必要な個体は、代謝障害を処置するように、クロトータンパク質の少なくとも１つの細
胞外サブドメインおよび繊維芽細胞増殖因子およびＦｃＲｎへの減少した結合および／ま
たは増加した血清半減期および／または安定性を有する（任意の）修飾されたＦｃフラグ
メントを有する、クロトー融合ポリペプチドを含む薬理学的有効用量の医薬組成物を投与
される。いくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドは薬理学的有効用量のヘパ
リンと共投与される。該方法はＩＩ型糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖およ
び肥満の処置または予防において使用され得る。特定の態様において、ベータ−クロトー
タンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインおよび繊維芽細胞増殖因子２１を含むクロ
トー融合タンパク質は、代謝障害に対して処置の必要な対象に投与される。
本明細書はまた、個体における高リン血症または石灰沈着症を処置または予防するため
の方法、および個体における高リン血症または石灰沈着症を処置または予防するための治
療における、または医薬としての記載されているタンパク質、融合タンパク質、核酸分子
または医薬組成物の使用を提供する。処置の必要な個体は、高リン血症または石灰沈着症
を処置するように、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメイン、繊維芽
細胞増殖因子および（任意の）修飾されたＦｃフラグメントを有する、クロトー融合ポリ
ペプチドを含む薬理学的有効用量の医薬組成物を投与される。いくつかの態様において、
クロトー融合ポリペプチドは薬理学的有効用量のヘパリンと共投与される。特定の態様に
おいて、アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインおよび線維芽細
胞増殖因子２３および（任意の）修飾されたＦｃフラグメントを含むクロトー融合タンパ
ク質は、高リン血症または石灰沈着症に対して処置の必要な個体に投与される。
本明細書は、また、個体における慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置または予防する
ための方法、および個体における慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置または予防するた
めの治療における、または医薬としての記載されているタンパク質、融合タンパク質、核
酸分子または医薬組成物の使用を提供する。処置の必要な個体は、慢性腎臓疾患または慢
性腎不全を処置するように、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメイン
、繊維芽細胞増殖因子および（任意の）修飾されたＦｃフラグメントを有する、クロトー
融合ポリペプチドを含む薬理学的有効用量の医薬組成物を投与される。いくつかの態様に
おいて、クロトー融合ポリペプチドは薬理学的有効用量のヘパリンと共投与される。いく
つかの態様において、アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインを
含むクロトー融合タンパク質は、慢性腎臓疾患または慢性腎不全に対して処置の必要な個
体に投与される。
本明細書はまた、個体における癌を処置または予防するための方法、個体における癌を
処置または予防するための治療における、または医薬としての記載されているタンパク質
、融合タンパク質、核酸分子または医薬組成物の使用を含む。処置の必要な個体は、癌を
処置するように、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメイン、繊維芽細
胞増殖因子および（任意の）修飾されたＦｃフラグメントを有する、クロトー融合ポリペ
プチドを含む薬理学的有効用量の医薬組成物を投与される。該方法は乳癌の処置または予
防において使用され得る。いくつかの態様において、クロトー融合ポリペプチドは薬理学
的有効用量のヘパリンと共投与される。いくつかの態様において、アルファクロトータン
パク質の少なくとも１つの細胞外ドメインを含むクロトー融合タンパク質は、癌に対して
処置の必要な個体に投与される。
クロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物を投与することにより障害を処置する方法
において、または、治療においてクロトー融合ポリペプチドを含む医薬組成物を使用する
とき、クロトー融合ポリペプチドおよび（任意の）修飾されたＦｃフラグメントはクロト
ータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインおよび線維芽細胞増殖因子を有する
。特定の態様において、クロトー融合タンパク質は、ベータクロトータンパク質の少なく
とも１つの細胞外ドメインおよび繊維芽細胞増殖因子２１を含む。
別の態様において、融合ポリペプチドは、ＦＧＦ（例えば、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１、
ＦＧＦ２３またはＦＧＦ２３変異体）および減少したＦｃＲｎへの結合および／または増
加した血清安定性を有する修飾されたＦｃフラグメントを含む。この型の融合ポリペプチ
ドを、上記種々の疾患において使用することができる、または当分野で知られているあら
ゆるＦＧＦ関連疾患を処置または予防するために使用することができる。融合ポリペプチ
ドをそれを必要とする個体に投与することができる。
融合ポリペプチド組成物は、当業者に知られている、および本明細書に記載されている
投与方法にしたがって投与することができる。投与の特定の方法は皮下または静脈内を含
む。他の有効な投与様式は本明細書に記載されている。
４．６．処置法および有効性を評価するためのアッセイ方法
本明細書に記載されている融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本明細書
の方法または使用は、加齢関連状態または代謝障害を含む種々の障害を処置するために使
用することができる。何らかの特定の理論に限定されることなく、融合ポリペプチドは、
クロトーまたはＦＧＦの調節異常がある障害を処置するために使用され得る。例の障害は
代謝障害および加齢関連状態を含む。例えば、ＦＧＦ２３またはクロトーノックアウトマ
ウス両方は、低い物理的活性、成長遅延、筋肉疲労、皮膚萎縮、アテローム性動脈硬化症
、寿命の短縮などを含む種々の同様の表現型を示す（Razzaque and Lanske, J. of Endro
crinology, 194:1-10 (2007)、参照（これを出典明示により本明細書に包含させる））。
特に、本明細書の融合ポリペプチドは、筋肉疲労を含む老化関連障害の処置において特
に有用である。理論に束縛されることなく、ミネラル（例えば、リン酸塩およびカルシウ
ム）およびビタミンＤホメオスタシスをコントロールするクロトーおよびＦＧＦ２３の能
力は、これらのタンパク質が老化および筋萎縮を調節することを意味し得る。
他方では、本明細書の融合ポリペプチドは、代謝障害を処置するために使用され得る。
例えば、ベータ−クロトーおよびＦＧＦ１９は、コレステロール７−α−ヒドロキシラー
ゼ（ＣＹＰ７Ａ１）を調節することにより、胆汁酸ホメオスタシスをコントロールするこ
とが示されている。胆汁ホメオスタシス障害の非限定的な例は胆汁うっ滞である。ベータ
−クロトーおよびＦＧＦ２１は、脂肪細胞における脂肪分解を誘導し、したがって、脂肪
貯蔵を減少させ、グルコース摂取を増加させることが示されている。脂肪分解／脂肪貯蔵
障害の非限定的な例は代謝関連肥満および心臓血管疾患である。
少なくとも、ＦＧＦ２３が尿におけるリン酸塩の排出を刺激することができ、それによ
り血清中のリン酸塩レベルを減少させる発見の一部に基づいて、本明細書のクロトー−Ｆ
ＧＦ２３融合ポリペプチドは、個体における高リン血症または石灰沈着症を処置または予
防するために使用することができる。例えば、患者におけるクロトーの欠損となるクロト
ーにおけるホモ接合型ミスセンス変異が深刻な腫瘍性石灰沈着症および動脈石灰化を引き
起こし得ることが示されている（Ichikawaら J. Clin. Invest. 117:2684-2691 (2007)（
これを出典明示により本明細書に包含させる））。個体は、高リン血症または石灰沈着症
を処置または予防するように、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメイ
ン、線維芽細胞増殖因子および（任意の）修飾されたＦｃフラグメントを有するクロトー
融合ポリペプチドを含む薬理学的有効用量の医薬組成物を投与される。特に、アルファク
ロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメイン、繊維芽細胞増殖因子および（任意
の）修飾されたＦｃフラグメントを含むクロトー融合ポリペプチドは、高リン血症または
石灰沈着症を処置するために有用である。
本明細書のクロトー融合ポリペプチドはまた、個体における慢性腎臓疾患または慢性腎
不全を処置または予防するために使用され得る。例えば、クロトー発現が、慢性腎不全を
有さない患者の腎臓と比較して、慢性腎不全を有する患者の腎臓において減少しているこ
とが示されている（Kohら Biochem. Biophys. Res. Comm. 280:1015-1020 (2001)（これ
を出典明示により本明細書に包含させる））。個体は、慢性腎臓疾患または慢性腎不全を
処置または予防するように、クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメイン
、繊維芽細胞増殖因子および（任意の）修飾されたＦｃフラグメントを有する、クロトー
融合ポリペプチドを含む薬理学的有効用量の医薬組成物を投与される。特に、アルファク
ロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外ドメインを含むクロトー融合ポリペプチドは
慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置するために有用である。
本明細書のクロトー融合ポリペプチドはまた、個体における癌を処置または予防するた
めに使用され得る。例えば、クロトー発現が、正常乳癌組織と比較して、乳癌組織におい
て減少していることが示されている（Wolfら Oncogene (2008)オンライン先行出版（これ
を出典明示により包含させる））。個体は、癌または乳癌を処置または予防するように、
クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメイン、繊維芽細胞増殖因子および
（任意の）修飾されたＦｃフラグメントを有する、クロトー融合ポリペプチドを含む薬理
学的有効用量の医薬組成物を投与される。特に、アルファクロトータンパク質の少なくと
も１つの細胞外ドメインを含むクロトー融合タンパク質は癌または乳癌を処置するために
有用である。
加齢関連状態または代謝障害における本明細書のクロトー融合ポリペプチドの有効性を
評価する、および／または有効用量を決定するための方法は、例えば、哺乳動物（例えば
、マウス、ラット、霊長類またはいくつかの他の非ヒト）または他の動物（例えば、アフ
リカツメガエル、ゼブラフィッシュまたは無脊椎動物、例えば、昆虫または線虫）を使用
する生物ベースアッセイを含む。クロトー融合ポリペプチドは、１回またはレジメン（定
期的または不規則的）のとおりに生物体に投与することができる。次に生物体のパラメー
ター、例えば、加齢関連パラメーターを評価する。興味あるクロトー融合ポリペプチドは
、参照、例えば、コントロール生物体のパラメーターと比較して、パラメーターにおける
変化をもたらす。他のパラメーター（例えば、毒性、クリアランスおよび薬物動態学に関
連する）も評価され得る。
本明細書のクロトー融合ポリペプチドは、特定の障害、例えば、本明細書に記載されて
いる障害、例えば、加齢関連障害、代謝障害を有する動物を使用して、評価され得る。こ
れらの障害は、また、生理学における試験ポリペプチドの効果を観察することができる感
受性の系を提供することができる。例の障害は、脱神経、廃用性萎縮、代謝障害（例えば
、肥満および／または糖尿病動物、例えば、ｄｂ／ｄｂマウスおよびｏｂ／ｏｂマウスの
障害）、脳、肝臓虚血、シスプラチン／タキソール／ビンクリスチンモデル、種々の組織
（異種移植）移植物、トランスジェニック骨モデル、疼痛症候群（炎症性および神経障害
を含む）、パラコート、遺伝毒性および酸化ストレスモデル、および腫瘍Ｉモデルを含む
。
加齢関連状態を測定するために、動物モデルはカロリー制限されたときに変化した表現
型を有する動物であり得る。例えば、Ｆ３４４ラットは、クロトー融合ポリペプチドを評
価するために有用なアッセイ系を提供する。カロリー制限されたとき、Ｆ３４４ラットは
ネフロパシーに対して０から１０％の発生率を有する。しかしながら、自由食餌のとき、
それらはネフロパシーに対して６０から１００％の発生率を有する。
本明細書のクロトー融合ポリペプチドを評価するために、それを動物（例えば、Ｆ３４
４ラットまたは他の適当な動物）に投与し、動物のパラメーターを、例えば、期間後に評
価する。動物は自由食餌または通常であり得る（例えば、カロリー制限下ではないが、い
くつかのパラメーターはこのような条件下で評価することができる）。一般的に、このよ
うな動物のコホートはアッセイのために使用される。一般的に、試験ポリペプチドがカロ
リー制限と同様の動物対象の表現型の方向におけるパラメーターに作用するとき、試験ポ
リペプチドは動物における寿命調節を好ましく変化させるものとして示すことができる。
このような試験ポリペプチドは、生物体からカロリー摂取を奪うことなく、少なくともい
くつかのカロリー制限の寿命調節効果、例えば、このような効果の一部をもたらし得る。
試験すべきパラメーターは、年齢関連または疾患関連パラメーター、例えば、動物モデ
ルと関連する障害の症状であり得る。例えば、試験ポリペプチドをＳＨラットに投与する
ことができ、血圧をモニタリングする。好ましいと示される試験ポリペプチドは、該ポリ
ペプチドで処理されていない同様の参照動物と比較して、症状の改善を引き起こすことが
できる。障害または老化に関連する他のパラメーターは、抗酸化レベル（例えば、抗酸化
酵素レベルまたは活性）、ストレス抵抗性（例えば、パラコート抵抗性）、中核温、グル
コースレベル、インスリンレベル、甲状腺−刺激ホルモンレベル、プロラクチンレベルお
よび黄体形成ホルモンレベルを含み得る。
加齢関連状態を処置するための本明細書のポリペプチドの有効性を測定するために、減
少したクロトー発現を有する動物が使用され得る、例えば、変異クロトーを有するマウス
；Kurooら Nature, 390; 45 (1997)および米国出願番号第2003/0119910号、参照（これら
両方をそれら全体において出典明示により本明細書に包含させる）。例えば、試験ポリペ
プチドを変異マウスに投与し、加齢関連パラメーターをモニタリングする。好ましいと示
される試験ポリペプチドは、該ポリペプチドで処理されていない同様の参照動物と比較し
て、症状の改善を引き起こすことができる。代謝障害または老化に関連するパラメーター
は、体重の測定、生殖能力の獲得の検査、血糖レベルの測定、寿命の観察、皮膚の観察、
歩行のような運動機能の観察などにより評価することができる。評価は、また、胸腺体重
の測定、胸腔の内面上に形成された石灰化結節のサイズの観察などにより作ることができ
る。さらに、クロトー遺伝子またはクロトータンパク質に対するｍＲＮＡの定量も評価の
ために有用である。
さらに、他のインビボモデルおよび生物アッセイは、代謝パラメーター、例えば、イン
スリン障害、ＩＩ型糖尿病に関連するパラメーターに対して動物を評価することを含む。
例の代謝パラメーターは、グルコース濃度、インスリン濃度およびインスリン感受性を含
む。
別の系の例は、例えば、動物モデルにおける腫瘍を特徴とする。腫瘍は自発的なものま
たは誘導されたものであり得る。例えば、腫瘍は例えば、ｐ５３＋またはｐ５３−であり
得る種々の遺伝的構成を有する細胞から発生し得る。自己免疫疾患である生物体、例えば
、ＳＬＥにかかりやすいＮＺＢマウスを使用することも可能である。骨疾患の特徴を評価
するために、例えば、骨粗鬆症におけるモデルとして卵巣摘出した動物を使用することが
可能である。同様に、関節疾患において、モデルはアジュバント関節炎に基づき（例えば
、マウスが軟骨プロテオグリカン、高移動度グループタンパク質、連鎖球菌細胞壁物質ま
たはコラーゲンの免疫を有し得る）、腎臓疾患において、ｋｄ／ｋｄマウスを使用するこ
とができる。認知、特に学習および記憶の動物モデルも利用することができる。糖尿病お
よびその合併症の動物モデル、例えば、ストレプトゾトシンモデルも利用することができ
る。イヌモデルを、例えば、卒中および虚血を評価するために使用することができる。
試験ポリペプチドが寿命調節を変化することができるか否かの評価において、多くの加
齢関連パラメーターまたはバイオマーカーをモニタリングまたは評価することができる。
例の加齢関連パラメーターは、（ｉ）細胞または生物体の寿命、（ｉｉ）生物学的加齢依
存発現パターンを有する細胞または生物体における遺伝子転写物または遺伝子産物の存在
または不存在、（ｉｉｉ）ストレスに対する細胞または生物体の抵抗性、（ｉｖ）細胞ま
たは生物体の１つ以上の代謝パラメーター（例のパラメーターは循環インスリンレベル、
血中グルコースレベル、脂肪含有量、中核温などを含む）、（ｖ）細胞または生物体に存
在する複数の細胞の増殖能、および（ｖｉ）細胞または生物体の外見または挙動を含む。
「平均寿命」なる用語は、生物体のコホートの死の年齢の平均を意味する。いくつかの
場合において、「平均寿命」は、コントロール環境条件下で、遺伝的に同一の生物体のコ
ホートを使用して評価される。事故による死は除外される。平均寿命がコントロール環境
条件下で決定できないとき（例えば、ヒト）、十分に大きな母集団に対する信頼性のある
統計情報（例えば、保険数理表から）を平均寿命として使用することができる。
２つのこのような生物体、例えば、１つの参照生物体およびクロトー融合ポリペプチド
で処理された１つの生物体間の分子差の特性化は、生物体の生理学的状態における違いを
示すことができる。参照生物体および処理された生物体は、一般的に同じ実年齢である。
本明細書において使用される「実年齢」なる用語は、あらかじめ選択された事象、例えば
、受胎、定義されている胎生または胎児期、または、さらに好ましくは、出生からの経過
時間を示す。生物体が比較分析のための「同じ」実年齢であるかどうかを決定するために
、種々の基準が使用することができる。一般的に、必要とされる精度の程度は、野生型生
物体の平均寿命と相関関係である。例えば、実験室野生型株Ｎ２がいくつかのコントロー
ル条件下で平均約１６日間生存する線虫シー・エレガンスにおいて、同じ年齢の生物体は
同じ日数の生存であってよい。マウスに関して、同じ年齢の生物体は、同じ週または月数
、霊長類またはヒトに関して、同じ年数（または２、３または５年以内）などの生存であ
ってよい。一般的に、同じ実年齢の生物体は、その種の野生型生物体の平均寿命の１５、
１０、５、３、２または１％以内の時間の生存であってよい。好ましくは、生物体は成体
であり、例えば、生物体は、少なくとも平均野生型生物体が繁殖能を有する齢に成熟する
時間生存している。
生物スクリーニングアッセイは、生物体が老化の明白な物理的特徴を示す前に実施する
ことができる。例えば、生物体は、同じ種の野生型生物体の平均寿命の１０、３０、４０
、５０、６０または７０％だけ生存した成体であり得る。代謝、免疫能力および染色体構
造における加齢関連変化が報告されている。あらゆるこれらの変化を、試験対象（例えば
、生物体ベースアッセイにおける）または患者（例えば、本明細書に記載されている治療
処置の前、中または後）のいずれかに対して評価することができる。
カロリー制限と関連するマーカーは、また、スクリーニングアッセイの対象生物体（ま
たは処置される対象）を評価することができる。これらのマーカーは加齢関連ではないか
もしれないが、それらはクロトー経路が調節されるとき、変化する生理学的状態を示し得
る。マーカーはｍＲＮＡまたはタンパク質であってよく、これらの多くはカロリー制限さ
れた動物において変化する。ＷＯ０１／１２８５１および米国特許第６，４０６、８５３
号は例のマーカーを記載している。本明細書に記載されている動物細胞由来の細胞モデル
または本明細書に記載されている動物モデルの類似物を細胞ベースアッセイのために使用
することができる。
筋萎縮における試験ポリペプチドの効果を評価するためのモデルは、１）例えば、中部
の腿で右坐骨神経を切断することによる脱神経から生じるラット内側腓腹筋の筋肉量喪失
、２）固定、例えば、９０度の屈曲で固定された右足関節から生じるラット内側腓腹筋の
筋肉量喪失、３）後肢懸垂から生じるラット内側腓腹筋の筋肉量喪失（例えば、米国２０
０３−０１２９６８６、参照）、４）悪液質サイトカイン、インターロイキン−１（ＩＬ
−１）での処理から生じる骨格筋萎縮（R. N. Cooney, S. R. Kimball, T. C. Vary, Sho
ck 7, 1-16 (1997)）、および５）グルココルチコイド、デキサメタゾンでの処理から生
じる骨格筋萎縮（A. L. Goldberg, J Biol Chem 244, 3223-9 (1969)）を含む。
ＡＭＤに対する例の動物モデルは、滲出性（湿性）黄斑変性症を模倣するレーザー−誘
導マウスモデル Boraら Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 100:2679-84 (2003)、ＡＭＤ
の「地図状萎縮」型と関連する特徴となるカテプシンＤの変異型を発現するトランスジェ
ニックマウス（Rakoczyら Am. J. Pathol., 161:1515-24 (2002)）、およびＣＮＶとなる
網膜色素上皮においてＶＥＧＦを過剰発現するトランスジェニックマウスSchwesingerら
Am. J. Pathol. 158:1161-72 (2001)を含む。
パーキンソン病の動物モデルの例は、ドーパミン神経毒１−メチル−４フェニル１，２
，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）での処理によりパーキンソン病になった霊
長類（以下参照、例えば、米国特許公開第２００３００５５２３１号およびWichmannら A
nn. N.Y. Acad. Sci., 991:199-213 (2003)、６−ヒドロキシドーパミン−障害ラット（
例えば、Lab. Anim. Sci.,49:363-71 (1999)）、およびトランスジェニック無脊椎動物モ
デル（例えば、Laksoら J. Neurochem. 86:165-72 (2003)およびLink, Mech. Ageing Dev
., 122:1639-49 (2001)）を含む。
ＩＩ型糖尿病の分子モデルの例は、欠損Ｎｋｘ−２．２またはＮｋｘ−６．１を有する
トランスジェニックマウス、（米国特許第６，１２７，５９８号）、ズッカー糖尿病肥満
ｆａ／ｆａ（ＺＤＦ）ラット（米国特許第６，５６９，８３２号）、および自発的に肥満
を発症し、次に頻繁に明白な２型糖尿病に進行するアカゲザル（Hottaら Diabets, 50:11
26-33 (2001)、および２型糖尿病−様インスリン抵抗性を有するドミナント・ネガティブ
ＩＧＦ−Ｉ受容体（ＫＲ−ＩＧＦ−ＩＲ）を有するトランスジェニックマウスを含む。
ニューロパシーに対する例の動物および細胞モデルは、マウス（米国特許第５，４２０
，１１２号）またはウサギ（Ogawaら Neurotoxicology, 21:501-11 (2000)）におけるビ
ンクリスチン誘導感覚運動ニューロパシー、自律性ニューロパシーの試験のためのストレ
プトゾトシン（ＳＴＺ）−糖尿病ラット（Schmidtら Am. J. Pathol., 163:21-8 (2003)
）、および進行性運動ニューロパシー（ｐｍｎ）マウス（Martinら genomics, 75:9-16 (
2001)）を含む。
高リン血症または腫瘍性石灰沈着症の動物モデルの例は、クロトーノックアウトマウス
およびＦＧＦ２３ノックアウトマウス（Yoshidaら Endocrinology 143:683-689 (2002)）
を含む。
慢性腎臓疾患または慢性腎不全の動物モデルの例は、ＣＯＬ４Ａ３＋／−マウス（Beir
owskiら J. Am. Soc. Nephrol. 17:1986-1994 (2006)）を含む。
癌の動物モデルの例は、当分野で既知であるヌードマウスへの癌細胞または組織の移植
または注入を含む（Giovanellaら Adv. Cancer Res. 44:69-120 (1985)）。例えば、乳癌
の動物モデルは、乳癌細胞または組織を移植または注入されたヌードマウスを含む（例え
ば、Yueら Cancer Res. 54:5092-5095 (1994); Glinskyら Cancer Res. 56:5319-5324 (1
996); Visonneau Am. J. Path. 152:1299-1311 (1998)）。
当該組成物は、対象、例えば、成体対象、特に健常成体対象または加齢関連疾患を有す
る対象に投与することができる。後者の場合、当該方法は、例えば、加齢関連疾患の症状
または他の疾患のマーカーを特徴付けるために対象を評価し、それにより神経変性疾患、
例えば、アルツハイマー病または加齢関連疾患を有するか、またはこのような疾患になり
やすい対象を同定することができる。
骨格筋萎縮
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本明細書の方法または使用
は、骨格筋萎縮を処置するために使用することができる。筋萎縮は、多数の神経筋、代謝
、免疫および神経障害および疾患ならびに飢餓、栄養欠損、代謝ストレス、糖尿病、老化
、筋ジストロフィーまたはミオパシーを含む。筋萎縮は老化プロセス中に起こる。筋萎縮
は、また、筋肉の使用の減少または不使用による。症状は骨格筋組織量の減少で引き起こ
される。ヒト男性において、筋肉量は５０から８０齢の間に１／３に減少する。筋萎縮の
いくつかの分子特徴は、ユビキチンリガーゼの上方調節および筋原線維タンパク質の喪失
を含む（Furunoら J. Biol. Chem., 265:8550-8557, 1990）。これらのタンパク質の崩壊
は、例えば、アクチンの特異的成分であり、ミオシンの特定の筋肉中の３−メチル−ヒス
チジン生産を測定することによって追跡することができる（Goodman, Biochem. J. 241:1
21-12, 1987 and Lowellら Metabolism, 35:1121-112, 1986; Stein and Schluter, Am.
J. Physiol. Endocrinol.Metab. 272: E688-E696, 1997）。クレアチンキナーゼの放出（
細胞損傷マーカー）（Jacksonら Neurology, 41: 101 104, 1991）も示され得る。
非インスリン依存糖尿病
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本明細書の方法または使用
は、非−インスリン−依存糖尿病を処置するために使用することができる。非−インスリ
ン−依存糖尿病は、「成人発症型」糖尿病および２型糖尿病とも呼ばれる。２型糖尿病は
、また、「非−２型肥満」および「２型肥満」を含む。ＩＩ型糖尿病は、（１）血中グル
コースレベルバランスを維持するために必要な量未満のインスリンが生産される、膵臓−
ベータ−島−細胞のインスリンの分泌の減少、および／または（２）体がインスリンに正
常に応答しない「インスリン抵抗性」（米国特許第５，２６６，５６１号および米国特許
第６，５１８，０６９号）により特徴付けることができる。例えば、グルコース−刺激イ
ンスリンレベルは、一般的に４．０ｎｍｏｌ／Ｌ以上に上がらない（米国特許第５，２６
６，５６１号）。例のＩＩ型糖尿病の症状は、空腹時の高血糖（米国特許第５，２６６，
５６１号）、疲労、過度の口渇、頻尿、視力障害および感染率の増加を含む。ＩＩ型糖尿
病の指標は膵島のアミロイド沈着を含む。
ニューロパシー
ニューロパシーは、運動、感覚、感覚運動または自律神経を冒す全身性疾患、遺伝性疾
患または毒物により引き起こされる中枢および／または末梢神経機能障害を含み得る（例
えば、米国特許出願第２００３００１３７７１号、参照）。症状は神経損傷の原因および
冒されている神経の特定の型に依存して変化し得る。例えば、運動ニューロパシーの症状
は、肉体作業の実施におけるぎこちなさまたは筋力低下、軽い運動後の極度の疲労、立位
または歩行の困難および神経筋反射の減衰または欠損を含む（米国特許出願第２００３０
０１３７７１号）。自律性ニューロパシーの症状は便秘、心臓の不規則性および姿勢低血
圧反射の減衰を含む（米国特許出願第２００３００１３７７１号）。感覚ニューロパシー
の症状は疼痛および無感覚、手、脚または足のチクチク感、ならびに接触に対する極端な
感度を含み、網膜症の症状は視力障害、突然の失明、黒斑および閃光を含む。
アルツハイマー病
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本明細書の方法または使用
は、アルツハイマー病（ＡＤ）を処置するために使用することができる。アルツハイマー
病は、ニューロンの不可逆性喪失を引き起こす複雑な神経変性疾患である。それは、加齢
関連状態でもある神経変性疾患の単に１つの例を提供する。アルツハイマー病の臨床的特
徴は、記憶、判断、物理的周囲に対する見当識、および言語における進行性の障害を含む
。ＡＤの神経病理学的特徴は領域特異的なニューロン脱落、アミロイド斑および神経原線
維変化を含む。アミロイド斑は、８−アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰとしても既知）
の分解産物であるアミロイドペプチド（ＡｐまたはＡｐ４２としても既知）を含む細胞外
の斑である。神経原線維変化は異常に高リン酸化された微小管関連タンパク質のフィラメ
ントから構成される不溶性細胞内凝集体であり、ｔａｕｔアミロイド斑および神経原線維
変化はアポトーシスによりニューロン脱落となる二次事象に寄与し得る（Clark and Karl
awish, Ann. Intern. Med. 138(5):400-410 (2003)）。例えば、ｐ−アミロイドは培養さ
れたニューロンにおいてカスパーゼ−２−依存アポトーシスを誘導する（TroyらJ Neuros
ci. 20(4):1386-1392）。斑の沈着は、in vivaで、同様の様式において近位ニューロンの
アポトーシスを誘導し得る。
遺伝学、生化学、生理学的および認知基準を含む種々の基準を、対象におけるＡＤを評
価するために使用することができる。ＡＤの症状および診断は医師に知られている。ＡＤ
のいくつかの症状およびマーカーの例は以下のものである。これらの徴候およびＡＤと関
連することが知られている他の徴候についての情報を、「ＡＤ関連パラメーター」として
使用することができる。ＡＤ関連パラメーターは定性的または定量的情報を含むことがで
きる。定量的情報の例は、１つ以上の特徴の数値、例えば、タンパク質の濃度または断層
マップである。定性的情報は評価、例えば、医師のコメントまたは二者択一（「イエス」
／「ノー」）などを含むことができる。ＡＤ−関連パラメーターは、対象がＡＤと診断さ
れないか、またはＡＤの特定の徴候を有さないことを示す情報、例えば、典型的なＡＤの
典型ではない認知試験結果、またはＡＤと関連しない遺伝的なＡＰＯＥ多型を含む。
進行性の認識機能障害はＡＤの特徴である。この障害は、記憶、判断、意思決定、周り
の物理的方向および言語の減衰として現れ得る（Nussbaum and Ellis, New Eng J. Med.
348(14):1356 35 1364 (2003)）。他の型の認知症の排除はＡＤの診断に役立てることが
できる。神経細胞死は、ＡＤ患者における進行性の脳萎縮を引き起こす。映像技術（例え
ば、磁気共鳴映像法またはコンピューター断層撮影）は、脳におけるＡＤ関連病変および
／または脳萎縮を検出するために使用することができる。
ＡＤ患者は疾患の病状によって生じる生化学的異常を示し得る。例えば、脳脊髄液にお
けるタウタンパク質のレベルはＡＤ患者において高まる（Andreasen, Nら Arch Neurol.
58:349-350 (2001)）。
アミロイドベータ４２（Ａ，Ｂ４２）ペプチドのレベルは、ＡＤ患者のＣＳＦにおいて
減少し得る。Ａｐ４２のレベルはＡＤ患者の血漿において増加し得る（Ertekein-Taner,
Nら Science 290:2303 2304 (2000)）。対象からのサンプルにおいて生化学異常を検出す
るための技術は、当分野で既知の細胞、免疫および他の生物学的方法を含む。一般的なア
ドバイスのために、例えば、Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, 3r Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001), Ausubelら Current
Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley Interscie
nce, N.Y. (1989), (Harrow, E. and Lane, D. (1988)Antibodies: A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)ならびにそれらの
最新版に記載されている技術、参照。
例えば、抗体、他の免疫グロブリンおよび他の特異的結合リガンドを、ＡＤと関連する
生体分子、例えば、タンパク質または他の抗原を検出するために使用することができる。
例えば、１つ以上の特異抗体を、サンプルを調べるために使用することができる。種々の
方法、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光−ベースアッセイ、ウエスタンブロットおよびタンパク
質アッセイが可能である。ポリペプチドアレイを生産する方法は、当分野において、例え
ば、De Wildtら (2000). Nature Biotech. 18, 989-994; Luckingら (1999). Anal. Bioc
hem. 270, 103-111; Ge, H. (2000). Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath, G.
, and Schreiber, S.L. (2000). Science 289, 1760 to 1 763;およびＷＯ９９／５ １
７７３Ａ１において記載されている。
１つのアッセイにおいて、ＡＤの非ヒト動物モデル（例えば、マウスモデル）が、例え
ば、ポリペプチドまたは治療レジメンを評価するために使用される。例えば、米国特許第
６，５０９，５１５号は、天然に学習および記憶試験で使用することができる１つのこの
ようなモデル動物を記載している。該動物は、該動物が誕生から短期間内、一般的に誕生
から１年以内、好ましくは誕生から２から６月以内に進行性の神経障害を発症するような
レベルで脳組織においてアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）配列を発現する。ＡＰＰタ
ンパク質配列を胚形成期の動物または動物の原細胞、好ましくは１つの細胞または受精卵
母細胞期および一般的に約８細胞期より遅くない細胞に導入する。次に受精卵または胚を
、里親のメスとして擬似−妊娠期に発達させる。アミロイド前駆タンパク質遺伝子を、脳
の皮質辺縁領域、進行性の神経疾患状態、例えばＡＤにおいて顕著に影響される脳の領域
において、アミロイド前駆タンパク質の過剰な内因性発現および進行性の神経疾患の発症
を引き起こす状態において、染色体に組み込まれるように動物胚に導入する。グリオーシ
スおよび臨床症状が、トランスジェニック動物モデルにおいて神経疾患を起こす。神経疾
患の進行性の局面は、探索および／または運動行動の減少およびデオキシグルコース摂取
／利用の減少および脳の皮質辺縁領域における異常肥大グリオーシスにより特徴付けられ
る。さらに、見られる変化は、いくつかの老化動物において見られるものと同様である。
他の動物モデルは、また、ＵＳ５，３８７，７４２、５，８７７，３９９、６，３５８，
７５２および６，１８７，９９２に記載されている。
パーキンソン病
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本明細書の方法または使用
は、パーキンソン病を処置するために使用することができる。パーキンソン病は、運動機
能を調節する黒質線条体ドーパミン系の変性となる、黒質におけるドーパミンニューロン
の神経変性を含む。この病状は、同様に、運動機能障害を引き起こす（例えば、Lothariu
sら Nat. Rev. Neurosci., 3:932-42 (2002)、参照）。例の運動症状は、無動症、前屈姿
勢、歩行困難、姿勢の不安定、強硬症、筋硬直および振戦を含む。例の非運動症状は、鬱
病、意欲の欠如、消極的な態度、認知症および消化器機能障害を含む（例えば、Fahn, An
n. N.Y. Acad. Sci., 991:1-14 (2003)およびPfeiffer, Lancet Neurol., 2:107-16 (200
3)、参照）。パーキンソン病は６５から６９歳の個体の０．５から１パーセントおよび８
０歳以上の個体の１から３パーセントで観察された（例えば、Nussbaumら N. Engl. J. M
ed., 348:1356-64 (2003)、参照）。パーキンソン病の分子マーカーは、芳香族性Ｌアミ
ノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）の減少（例えば、米国出願第２００２０１７２６６
４号、参照）、および黒質線条体におけるドーパミン含量の喪失（例えば、Fahn, Ann. N
.Y. Acad. Sci., 991:1-14 (2003)およびLothariusら Nat. Rev. Neurosci., 3:932-42 (
2002)、参照）を含む。いくつかの家族性症例において、ＰＤはアルファ−シヌクレイン
およびパーキン（Ｅ３ユビキチンリガーゼ）タンパク質をコードする単一の遺伝子の変異
に関連する（例えば、Riessら J. Neurol. 250 Suppl 1:I3 10 (2003)およびNussbaumら
N. Engl. J. Med., 348:1356-64 (2003)）。ニューロン特異的Ｃ−末端ユビキチンヒドロ
ラーゼ遺伝子におけるミスセンス変異もパーキンソン病と関連する（例えば、Nussbaumら
N. Engl. J. Med., 348:1356-64 (2003)）。
ハンチントン病
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本明細書の方法または使用
は、ハンチントン病を処置するために使用することができる。ハンチントン病におけるク
ロトー融合ポリペプチドの有効性を評価および／または有効用量を決定するための方法は
、例えば、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類または他の何らかの非ヒト）また
は他の動物（例えば、アフリカツメガエル、ゼブラフィッシュまたは無脊椎動物、例えば
、昆虫または線虫）を使用する生物ベースアッセイを含む。ハンチントン病において多く
の動物モデル系が利用できる。例えば、Brouillet, Functional Neurology 15(4): 239-2
51 (2000); Onaら Nature 399: 263-267 (1999), Batesら Hum Mol Genet. 6(10):1633-7
(1997); Hanssonら J. of Neurochemistry 78: 694-703;およびRubinsztein, D. C., Tr
ends in Genetics, Vol. 1S, No. 4, pp. 202-209（ＨＤの種々の動物および非ヒトモデ
ルにおける確認）、参照。
このような動物モデルの例は、Ｒ６／２系のトランスジェニックマウス系である（Mang
iariniらCell 87: 493-506 (1996)）。Ｒ６／２マウスはヒトＨＤ遺伝子のエクソン１を
過剰発現する（内因性プロモーターのコントロール下）トランスジェニックハンチントン
病マウスである。Ｒ６／２ヒトＨＤ遺伝子のエクソン１は広範なＣＡＧ／ポリグルタミン
繰り返し（平均で１５０のＣＡＧ繰り返し）を有する。これらのマウスは、ヒトハンチン
トン病の多くの特徴を有する進行性の最終的に致命的な神経疾患を発症する。ハンチンチ
ン（ＨＤエクソン１によってコードされる）のＮ末端部分により構成される異常凝集体が
、Ｒ６／２マウスにおいて、細胞質および細胞の核において両方とも４５で観察される（
Daviesら Cell 90: 537-548 (1997)）。例えば、トランスジェニック動物におけるヒトハ
ンチンチンタンパク質は、少なくとも５５のＣＡＧ繰り返しおよびさらに好ましくは約１
５０のＣＡＧ繰り返しを含む遺伝子によってコードされる。これらのトランスジェニック
動物はハンチントン病様表現型を発現することができる。
これらのトランスジェニックマウスは、誕生後８から１０週の体重増加の減少、寿命の
減少および異常な足取りにより特徴付けられる運動障害、静止振戦、後肢抱擁および過活
動により特徴付けられる（例えば、Ｒ６／２系；Mangiariniら Cell 87: 493-506 (1996)
、参照）。表現型は運動機能低下の方向へ悪化する。これらのトランスジェニックマウス
の脳は、神経化学的および組織学的異常、例えば、神経伝達物質受容体（グルタミン酸塩
、ドーパミン）の変化、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（完全なニューロンのマーカー）の
濃度の減少ならびに線条体および脳サイズの減少を示す。したがって、評価は、神経伝達
物質レベル、神経伝達物質受容体レベル、脳サイズおよび線条体サイズに関連するパラメ
ーターを評価することを含むことができる。加えて、部分または完全長のトランスジェニ
ック・ヒトハンチンチンタンパク質を含む異常凝集体は、これらの動物（例えば、Ｒ６／
２トランスジェニックマウス系）の脳組織において存在する。例えば、Mangiariniら Cel
l 87: 493-506 (1996), Daviesら Cell 90: 537-548 (1997), Brouillet, Functional Ne
urology 15(4): 239-251 (2000)およびChaら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6480-648
5 (1998)、参照。
動物モデルにおける本明細書に記載されている試験ポリペプチドまたは既知のポリペプ
チドの効果を試験するため、異なる濃度の試験ポリペプチドを、例えば、試験ポリペプチ
ドを動物の循環系に注射することにより、トランスジェニック動物に投与する。ハンチン
トン病のような症状が動物において評価され得る。次に、例えば、マウスモデルに関して
上記されているハンチントン病のような症状の進行を、試験ポリペプチドでの処理が症状
の軽減または遅延をもたらすか否かを決定するためにモニタリングする。他のアッセイに
おいて、これらの動物におけるハンチンチンタンパク質凝集体の分離をモニタリングする
。次に動物を殺し、脳スライスを得ることができる。次に脳スライスを、トランスジェニ
ックヒトハンチンチンタンパク質、その一部、またはヒトハンチンチンタンパク質もしく
はその一部を含む融合タンパク質を含む凝集体の存在に関して分析する。この分析は、例
えば、脳組織のスライスを抗−ハンチンチン抗体で染色し、抗−ハンチントン抗体を認識
するＦＩＴＣを結合させた二次抗体を加え（例えば、抗−ハンチンチン抗体はマウス抗−
ヒト抗体であり、二次抗体はヒト抗体に特異的である）、蛍光顕微鏡法によりタンパク質
凝集体を視覚化することを含むことができる。
種々の方法がハンチントン病を評価および／またはモニタリングするために利用できる
。該疾患に対する種々の臨床的症状および兆候は知られている。ハンチントン病は、運動
障害、精神問題および認知変化を引き起こす。これらの症状の程度、発症年齢および症状
は変化し得る。運動障害は速いランダムなダンスのような動きを含むことができ、舞踏病
と呼ばれる。
例の運動評価は、追跡眼球運動、サッカード開始、サッカード速度、構音障害、挺舌、
指をたたく能力、回内／回外、げんこつ−手−手のひらの反復(a lo fist-hand-palm)、
腕の硬直、動作緩慢、最大のジストニア（体幹、上および下肢）、最大の舞踏病（例えば
、体幹、顔、上および下肢）、足取り、タンデム歩行および後方突進を含む。例の処置は
、例えば、１年間にわたって、Total Motor Score 4（ＴＭＳ−４）、ＵＨＤＲＳの下位
尺度を変化させることである。
癌
クロトー融合ポリペプチドを個体に投与することを提供する本明細書の方法または使用
は、癌を処置するために使用することができる。癌は、不適当に高レベルの細胞分裂、不
適当に低いレベルのアポトーシスまたはその両方により誘導されるか、または引き起こさ
れるすべての疾患を含む。癌の例は、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病
、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白
血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性
白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュト
レームマクログロブリン血症、重鎖病、および固形腫瘍、例えば、肉腫および癌腫（例え
ば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫(e
ndotheliosarcoma)、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング
腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮
癌腫、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様
癌、気管支癌腫、腎細胞癌腫、肝臓癌、胆管(nile duct)癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期
癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上
皮性癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞
腫、聴神経腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽腫および網膜芽腫）を含
むが、これらに限定されない。リンパ組織増殖性障害も増殖性疾患と考慮される。
本明細書で引用するすべての特許、特許出願および刊行物は、出典明示によりそれらの
全体を本明細書に包含する。本明細書はその態様について具体的に示され、記載されてい
るが、本明細書の範囲から逸脱することなく、形態における種々の変化および詳細が添付
の特許請求の範囲内に包含されることは理解される得ることは当業者に明らかである。
５．実施例
実施例１．クロトー融合ポリペプチドの発現および精製
クロトー融合ポリペプチドの発現
本明細書のポリペプチドは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をアルファクロトーの細胞外ドメイン
およびＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）変異体を有する、クロトー融合ポリペプチドをコードす
る発現ベクターで一時的にトランスフェクトすることにより作った。発現したポリペプチ
ドを含む条件培地を、クロトー、ＦＧＦ２３およびクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）
融合タンパク質のそれぞれの発現プラスミドの一時的なトランスフェクションにより製造
した。トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００（Invitrogen, Cat # 11668-
019）を使用して６−ウェルプレートにて行った。トランスフェクションの５時間後、ト
ランスフェクション混合物を、３ｍｌのＤＭＥＭプラス１％のＦＢＳで置き換えた。条件
培地を、３ｍｌのＤＭＥＭプラス１％のＦＢＳの添加７２時間後に回収した。種々の一時
的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の条件培地のサンプルをＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、ウエスタンブロットに
より分析するか（図３Ａ）、またはクマシーブルーで染色した（図３Ｂ）。
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を種々のサンプルで実施した（レーン１、
コントロール；レーン２、ＦＧＦ２３；レーン３、ｓクロトー；レーン４−６、ｓクロト
ー−ＦＧＦ２３）。クマシーブルー染色は、クロトー融合ポリペプチドをコードするベク
ターでトランスフェクトされていないサンプルを含むレーン１−３において存在しない、
＞１８０ｋＤａバンド（図３Ｂ、右側に矢印で示されている）の高い発現を示した。培地
に分泌されたクロトー融合ポリペプチドの質をウエスタンブロットにより評価した（図３
Ａ）。抗−ＦＧＦ２３ラットモノクローナルＩｇＧ２Ａ（R&D Systems, Cat# MAB26291）
を、ウエスタンブロットによるクロトー融合ポリペプチドを検出するための一次抗体とし
て使用した。クマシー染色ゲルにおいて観察されたさらなるバンドがクロトー融合ポリペ
プチドであることをウエスタンブロットで確認した。クロトー融合ポリペプチドがクロト
ー融合ポリペプチドの期待された分子量を有することをウエスタンブロットで確認した。
この分析はクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）融合タンパク質の発現を示す。
クロトー融合ポリペプチドの精製
本明細書のポリペプチドを、アルファクロトーの細胞外ドメインおよびＦＧＦ２３ Ｒ
１７９Ｑ変異体を有するクロトー融合ポリペプチドをコードする発現ベクターで一時的に
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養した条件培地から精製した。条件培地
を製造するために、ｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓをコードする発現ベクターを、
発現培地（Ｆｒｅｅｓｔｙｐｅ ２９３発現培地（GIBCO, Cat #12338）中で１０６細胞
／ｍｌで４６４ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞）で懸濁液中で培養されたＨＥＫ２９３細胞に
トランスフェクトした（１８ｍｌの２μｇ／ｍｌのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と混合
された１８ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ １（GIBCO, Cat #11058)中で５００μｇのＤＮＡ）。
トランスフェクション後、培養物を増殖させた（１２０時間、３７℃ ５％ＣＯ２インキ
ュベーター中、１２５ｒｐｍで振とう）。インキュベーション終了後、条件培地を遠心分
離（１０００ｒｐｍで５分）により回収した。次に条件培地をニッケル−アガロースカラ
ムに付した。ｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓがカラムにしっかりと結合し、５０ｍ
Ｍのイミダゾールで溶離した。次に得られた精製された物質をＰＢＳ中で透析し、イミダ
ゾールと取り除いた。精製されたｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×ＨｉｓのサンプルをＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分離し（レーン１、精製されたｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ
；レーン２、分子量マーカー）、クマシーブルーでの染色により分析した（図３Ｃ）。精
製されたｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓが期待された分子量を有することを染色さ
れたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで確認した。精製された物質で負荷されたレーンにおける完全
長ｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ以外のタンパク質に対応するバンドを検出しない
ということは、ｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓが精製されたことを示すものであっ
た。
実施例２．クロトー融合ポリペプチドの活性を評価するインビトロアッセイ
Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼ
発現したアルファクロトー融合ポリペプチドの生物学的活性を、Ｅｇｒ−１−ルシフェ
ラーゼレポーターアッセイで試験した。ＦＧＦ２３受容体へのクロトー融合ポリペプチド
の結合により、Ｅｇｒ−１プロモーターにより調節される、Ｅｇｒ−１の下流活性化およ
びルシフェラーゼレポーターの発現を引き起こした。Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポー
ター遺伝子はUrakawaら(Nature, 2006, Vol 444, 770-774)の報告に基づいて構築した。
４８−ウェル ポリ−Ｄ−リシン プレートに播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランス
フェクション正規化レポーター遺伝子（ウミシイタケルシフェラーゼ）と一緒にＥｇｒ−
１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子でトランスフェクトした。Ｅｇｒ−１ルシフェラー
ゼレポーター遺伝子のトランスフェクションの５時間後、トランスフェクション混合物を
３ｍｌのＤＭＥＭプラス１％のＦＢＳで置き換えた。条件培地を、３ｍｌのＤＭＥＭプラ
ス１％のＦＢＳの添加７２時間後に回収した。５時間後、トランスフェクション混合物を
活性を試験するサンプルと置き換えた。最初の実験において、２０μｇ／ｍｌのヘパリン
（Sigma, Cat#H8537；２ｍｇ／ｍｌの貯蔵物としてＤＭＥＭに溶解されている）の存在ま
たは非存在下で、５０％の条件培地（クロトー、ＦＧＦ２３、クロトーおよびＦＧＦ２３
、ならびにクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）融合タンパク質を含む）および１％のＦ
ＢＳを有する５０％のＤＭＥＭを、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイにお
いて試験した（図４）。さらなる実験では、定義された量の精製されたポリペプチドを使
用した（図５Ａおよび５Ｂ）。細胞を不活性な溶解緩衝剤（Promega, Cat #E194A）中で
２０時間で溶解し、ルシフェラーゼ活性をＤｕａｌ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（
Promega, Cat #E2940）を使用して決定した。
最初の実験において、クロトー融合ポリペプチド活性を非分画条件培地中で実施した。
Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用して、これらの実験ではルシフェラ
ーゼレポーターの発現における倍数変化を定量した（図４）。ＦＧＦ２３およびクロトー
タンパク質の細胞外ドメインの組合せを含む条件培地はＥｇｒ−１−ルシフェラーゼを活
性化させたが、ＦＧＦ２３のみを含む条件培地またはクロトーの細胞外ドメインのみを含
む条件培地ではＥｇｒ−１−ルシフェラーゼを活性化させなかった。融合タンパク質ｓク
ロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）を含む条件培地は、ＦＧＦ２３またはクロトーのいず
れか単独を含む条件培地と対照的に、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活
性化した。これらの実験において、融合タンパク質ｓクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ
）を含む条件培地は、ＦＧＦ２３およびクロトーの組合せを含む条件培地よりも有意に良
くＥｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーター遺伝子を活性化した。ヘパリンの存在下で、融
合タンパク質ｓクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）を含む条件培地およびＦＧＦ２３お
よびクロトーの組合せを含む条件培地による誘導ではわずかに高まった。表１は、Ｅｇｒ
−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける、条件培地における種々のＦＧＦ−ク
ロトー融合ポリペプチドの相対発現、および種々のＦＧＦ−クロトー融合ポリペプチドに
対応する非分画条件培地の相対活性を示す。
表１．ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合物変異体の発現および活性
Figure 2016190847
 ＊ 活性の欠如は、低発現の結果であり得る
Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイは、また、実施例１に記載されている
精製方法を使用して、条件培地から精製された定義された量のタンパク質を使用して行っ
た。発現したポリペプチドを含む非分画条件培地を使用する以前の結果と一致して、精製
されたＦＧＦ２３およびｓクロトーの組合せでの処理ではルシフェラーゼレポーター活性
が得られたが、精製されたＦＧＦ２３単独での処理では得られなかった（図５Ａ）。精製
されたＦＧＦ２３およびｓクロトーの組合せによるルシフェラーゼレポーター活性は、さ
らに精製されたｓクロトーの用量に依存し、該効果はヘパリンの存在（２０μｇ／ｍｌ）
により高められた。ルシフェラーゼ活性におけるｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ融
合ポリペプチドの効果は、Ｅｇｒ−１−ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、約
１．２１ｎＭ程度の低濃度（１．２倍変化）および少なくとも最大約１９．３ｎＭまで（
２．４倍変化）で検出することができた（図５Ｂ）。ルシフェラーゼ活性におけるｓクロ
トー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ融合ポリペプチドの活性は、ヘパリン（２０μｇ／ｍｌ）
の存在下で有意に高まった。ヘパリンの存在下で、ルシフェラーゼ活性におけるｓクロト
ー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓ融合ポリペプチドの効果は、約０．６ｎＭ程度の低濃度（２
．０倍変化）で検出することができた。該結果は、精製されたｓクロトー−ＦＧＦ２３−
６×Ｈｉｓが用量依存的にＥＧＲ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子を誘導したこと、および
ｓクロトー−ＦＧＦ２３−６×Ｈｉｓにおける処置を示した。
実施例３．筋肉細胞におけるクロトー融合ポリペプチドの効果を評価するインビトロアッ
セイ
発現したクロトー融合ポリペプチドの生物学的効果をＣ２Ｃ１２筋芽細胞で試験した。
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞をＩＧＦ−１、ＦＧＦ２またはｓクロトー−ＦＧＦ２３で処理するこ
とにより、筋管増殖およびシグナル伝達タンパク質のリン酸化を引き起こした。Ｃ２Ｃ１
２筋芽細胞を、６ウェルのポリ−Ｄ−リシンおよびフィブロネクチン被覆プレートにおい
て４０，０００細胞／ウェルの密度で、増殖培地中に（ＤＭＥＭおよびＦ１２、３対１）
、１０％のＦＢＳ、１％のＧｌｕｔ、１％のＰ／Ｓ、１％のリノール酸、０．１％のＩＴ
Ｓ：［インスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（５．５ｍｇ／ｍｌ）およびセ
レン（５ｎｇ／ｍｌ）］播種した。筋芽細胞がコンフルエンスに達した後（３日間）、培
地を分化培地に変えた（２％のウマ血清、１％のＧｌｕｔ、１％のＰ／Ｓを有するＤＭＥ
Ｄ）。
筋管直径実験のために、コンフルエント３日後、培地を分化培地に変え、細胞を、分化
培地中でデキサメタゾン（１００μＭ）の存在または非存在下で、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ
）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）またはｓクロトー−ＦＧＦ２３（２０ｎＭ）で２４時間
処理した。処置終了後、細胞をグルタルアルデヒド（ＰＢＳ中で５％）で固定し、多重蛍
光像を回収した。筋管直径をＰｉｐｅｌｉｎｅ Ｐｉｌｏｔプログラムを使用して測定し
、肥大または萎縮を測定した。
シグナル伝達タンパク質リン酸化実験のために、コンフルエント３日後、培地を分化培
地に変え、細胞を、ＦＢＳなしのＤＭＥＭで４時間飢餓にし、次にラパマイシン（４０ｎ
Ｍ）の存在または非存在下で、ＩＧＦ−１（１０ｎＭ）、ＦＧＦ２（２０ｎｇ／ｍｌ）ま
たはｓクロトー−ＦＧＦ２３（２０ｎＭ）で３０分処理した。細胞をプロテアーゼおよび
ホスファターゼ阻害剤の存在下でＲＩＰＡ緩衝剤中で溶解した。ウエスタンブロット分析
を行い、膜を図で示されるように異なる抗体で探査し、スキャンしたＸ線フィルムを現像
した。
この試験の結果は、ｓクロトー−ＦＧＦ２３が、コントロールと比較して筋管直径の増
加を引き起こし、ＩＧＦ−１およびＦＧＦ２の結果と同様にＣ２Ｃ１２筋管肥大を誘導す
ることを示した（図５Ａ）。加えて、ｓクロトー−ＦＧＦ２３、ＩＧＦ−１およびＦＧＦ
２での処理は、筋管直径の測定に基づいて、デキサメタゾンにより誘導された筋管萎縮を
部分的に逆転させることができた。デキサメタゾンの存在または非存在下で、筋管形態に
おける（筋管の厚さにより測定される）ｓクロトー−ＦＧＦ２３とＦＧＦ２間での差は、
観察されなかった。ｓクロトー−ＦＧＦ２３、ＩＧＦ−１およびＦＧＦ２の栄養作用は統
計学的に有意であった。
Ｃ２Ｃ１２筋管における効果と一致して、ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合タンパク質シグ
ナル伝達はｐ７０Ｓ６ＫおよびＥＲＫのリン酸化を誘導したが、Ｃ２Ｃ１２筋管における
ＡＫＴまたはＦオキソにおいて誘導しなかった（図５Ｂ）。シグナル伝達におけるｓクロ
トー−ＦＧＦ２３の効果はＦＧＦ２と同様であったが、ＩＧＦ−１と異なっていた。ｓク
ロトー−ＦＧＦ２３によるＥＲＫリン酸化の程度は、ＩＧＦ−１またはＦＧＦ２未満であ
ることが観察された。ｓクロトー−ＦＧＦ２３によるｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化は、ラパマ
イシン感受性であった。Ｃ２Ｃ１２細胞に関する実験において、ヘパリンはシグナル伝達
を活性化するために必要ではなかった。これらの結果は、ｓクロトー−ＦＧＦ２３融合ポ
リペプチドがＣ２Ｃ１２筋管においてシグナル伝達を活性化させたことを示す。
実施例４．ｓクロトー、ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合ポリペプチド
種々の融合ポリペプチドは、ｓクロトー、ＦＧＦ２３および抗体の修飾されたＦｃフラ
グメントを使用して構築される。これらの修飾されたＦｃ分子は、改変された（減少した
）ＦｃＲｎへの結合、したがって増加した血清半減期を有する。それらはまた、修飾され
たバイオアベイラビリティならびに改変された粘膜表面および体内の他の標的への輸送を
有する。本実施例において、ＦＧＦ２３およびｓクロトーは、米国特許第７，２１７，７
９８号およびHessellら 2007 Nature 449:101-104に記載されているＦｃＬＡＬＡに融合
される。これらの融合ポリペプチドの種々の成分間の仲介は、Lodeら 1998 Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 95: 2475-2480に記載されているリンカーである。これらの融合物は、構
築物、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen, Carlsbad, CA）に挿入され、ＨＥＫ２９
３細胞において発現される。
Ａ．ｓクロトー−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ１
ｓクロトー、リンカー、ＦＧＦ２３、別のリンカーおよびＦｃＬＡＬＡを含む融合物を
構築する。この態様は、ｓクロトー−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ１と称され、以下の
配列番号：４６および４７に示される。
ｓクロトー−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ１のヌクレオチド配列（１として開始ＡＴ
Ｇ）は配列番号：４６に示されている。
ｓクロトー−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ１のアミノ酸配列は、配列番号：４７とし
て以下に記載されている。
この配列において、融合物の種々の成分は以下のとおりである：
ｓクロトー：１−９８２；リンカー１：９８３−１００１；ＦＧＦ２３：１００２−１２
２８；リンカー２；１２２９−１２３３；ＦｃＬＡＬＡ：１２３４−１４５９。
Ｂ．ｓクロトー−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ２
ｓクロトー、リンカー、ＦＧＦ２３、別のリンカーおよびＦｃＬＡＬＡを含む融合物を
構築する。この態様は、ｓクロトー−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ２と称され、以下の
配列番号：４８および４９に示される。
ｓクロトー−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ２のヌクレオチド配列（１として開始ＡＴ
Ｇ）は配列番号：４８に示されている。
ｓクロトー−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ２のアミノ酸配列は、配列番号：４９とし
て以下に記載されている。
この配列において、融合物の種々の成分は以下のとおりである：
ｓクロトー：（ａａまたはアミノ酸）１−９８２；リンカー１：９８３−１００１；ＦＧ
Ｆ２３：１００２−１２２８；リンカー２；１２２９−１２３３；ＦｃＬＡＬＡ：１２３
４−１４５０。
他の融合ポリペプチドならびにその変異体および誘導体を、本明細書に記載されている
、または当分野で知られているとおりに、種々の組合せにおいて、ＦＧＦ、クロトー、修
飾されたＦｃフラグメントおよび（所望により）リンカー配列を組み合わせることにより
構築することができる。
実施例５．ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含む融合ポリペプチド
種々の融合ポリペプチドは、米国特許第７，２１７，７９８号に記載されているとおり
に、ＦＧＦ２３および抗体の修飾されたＦｃフラグメントを使用して構築される。これら
の修飾されたＦｃ分子は、改変された（減少した）ＦｃＲｎへの結合、したがって増加し
た血清半減期を有する。それらはまた、修飾されたバイオアベイラビリティならびに改変
された粘膜表面および体内の他の標的への輸送を有する。本実施例において、ＦＧＦ２３
は、ＦｃＬＡＬＡに融合される。これらの融合ポリペプチドの種々の成分間の仲介は、Lo
deら 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2475-2480に記載されているリンカーである
。これらの融合物は、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen, Carlsbad, CA）に挿入さ
れ、ＨＥＫ２９３細胞において発現される。
Ｃ．ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ１
ＦＧＦ２３、リンカーおよびＦｃＬＡＬＡを含む融合物を構築する。この構築物は、Ｆ
ＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ１と称され、以下の配列番号：５０および５１に示される。
ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ１のヌクレオチド配列（１として開始ＡＴＧ）は配列番
号：５０に示されている。
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ１のアミノ酸配列は、配列番号：５１とし
て以下に記載されている。
この配列において、融合物の種々の成分は以下のとおりである：
ＦＧＦ２３：（ａａ）１−２５１；リンカー：２５２−２５６；ＦｃＬＡＬＡ：２５７−
４８２。
Ｄ．ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ２
ＦＧＦ２３およびＦｃＬＡＬＡを含むＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ２を含む融合物を
構築する。
ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ ｖ２のヌクレオチド配列（１として開始ＡＴＧ）は配列番
号：５２に示されている。
ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２のアミノ酸配列は、配列番号：５３とし
て以下に記載されている。
この配列において、融合物の種々の成分は以下のとおりである：
ＦＧＦ２３：１−２５１；リンカー：２５２−２５６；ＦｃＬＡＬＡ：２５７−４７３。
他の融合ポリペプチドを、本明細書に記載されている、または当分野で知られていると
おりに、種々の組合せにおいて、ＦＧＦ配列、修飾されたＦｃフラグメントおよび（所望
により）リンカー、およびそれらの変異体および誘導体を組み合わせることにより構築す
ることができる。
Ｅ．ｓクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡ融合タンパク質によるＥｇｒ
−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡタン
パク質によるＥｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化、およびＦＧＦ２３（Ｒ１７
９Ｑ） 対 ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬａＬａｖ２の薬物動態学プロフィールを
決定する。
図７は、ｓクロトー−ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡ融合タンパク質による
Ｅｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子の活性化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、Ｅｇｒ−
１−ｌｕｃレポーター遺伝子で一過性にトランスフェクトし、２０μｇ／ｍｌのヘパリン
の非存在または存在下で示されている馴化培地でインキュベートする。次に、ルシフェラ
ーゼ活性を１８時間後に決定する。結果は、ｓクロトー−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ融合
タンパク質がレポーター遺伝子活性を誘導することを示す。これらの誘導は、ヘパリンの
存在において有意に増強される。ｓＫＦ−Ｆｃｖ１：ｓクロトー−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡ
ＬＡｖ１；ｓＫＦ−Ｆｃｖ２：ｓクロトー−ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡｖ２。
図８は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡタンパク質によるＥｇｒ−１−ｌｕ
ｃレポーター遺伝子の活性化を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、クロトーの全長膜貫通形態
と共にＥｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子で一過性にトランスフェクトし、示されてい
る３０％の馴化培地でインキュベートする。次に、ルシフェラーゼ活性を１８時間後に決
定する。結果は、ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ融合タンパク質がＦＧＦ２３と同様の様式に
おいてレポーター遺伝子活性を誘導することを示す。
図９は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ） 対 ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ
２の薬物動態学プロフィールを示す。グループあたり４匹のマウスに、ＦＧＦ２３（Ｒ１
７９Ｑ）−６×ＨｉｓまたはＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡｖ２を２ｍｇ／ｋ
ｇで皮下注射する。示されている時間に、血清サンプルを回収し、ＥＬＩＳＡによりＦＧ
Ｆ２３について分析する。血清中のＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡ濃度は、２
４時間時点で上昇を維持するが、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−６×Ｈｉｓは基底レベルに
戻る。結果は、ＦｃＬＡＬＡの添加で、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）のインビボ半減期が有
意に改善されることを示す。
実施例６．デキサメタゾン誘導筋萎縮後の筋肉成長の増強におけるｓクロトー−ＦＧＦ２
３融合物のインビボ有効性
実験データは、ｓクロトー−ＦＧＦ２３の筋肉内注射は、デキサメタゾン誘導筋萎縮後
の筋肉量の成長を有意に増強することを示す。この実験において、配列番号：４１に対応
するペプチドを使用する。
図１０は、腓腹筋−ヒラメ筋−足底筋（ＧＳＰ）筋肉の絶対重量（Ａ）および重量変化
パーセント（Ｂ）を示し、ｓクロトー−ＦＧＦ２３（ＫＬＯＦＧＦ）の筋肉内注射は、ｓ
クロトー（ｓＫＬＯ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の筋肉内注射と比較して、
デキサメタゾン（ＤＥＸ）−誘導筋萎縮後の筋肉量の再成長を有意に増強することを示す
。
８０匹の１５週齢のオスＣ５７ＢＬ／６マウスを、それぞれ１０匹のマウスで８つのグ
ループに体重においてランダム化する。２．４ｍｇ／ｋｇ／日で３週間、４つのグループ
にＤＥＸなしの水を与え（Ｗ２１ｄ）、他の４つのグループにＤＥＸありの飲料水を与え
る（Ｄ２１ｄ）。３週間後、ＤＥＸ処置を停止し、１つのＷ２１ｄおよび１つのＤ２１ｄ
グループを即座に殺し、ＤＥＸ処置により誘導される筋萎縮の程度を確立する。残りの３
つのグループのＷ２１ｄまたはＤ２１ｄマウスは、右側の腓腹筋−ヒラメ筋−足底筋の筋
肉複合体に１日おきに、２×５０μｌのＰＢＳ、ｓクロトー−ＦＧＦ２３（ＫＬＯＦＧＦ
；１．６ｍｇ／ｍｌ）またはｓクロトー（ｓＫＬＯ；１．６ｍｇ／ｍｌ）のいずれかを筋
肉内注射で与える別の１４日間（Ｒ１４ｄ）中に回復することができる。マウスを最後の
筋肉内注射２４時間後に殺し、筋肉体重を決定し、絶対重量（Ａ）またはＷ２１ｄ＋ＰＢ
Ｓグループと比較しての変化パーセントとして示す。
これらのデータは、デキサメタゾン誘導筋萎縮後の筋肉成長の増強におけるｓクロトー
−ＦＧＦ２３融合物のインビボ有効性を示す。
実施例７．凝集を減少させる、望ましくないプロテアーゼ誘導開裂を減少させる、および
生産を増加させる融合タンパク質のＦＧＦ２３部分におけるさらなる変異
いくつかの変異を、ｓクロトー−ＦＧＦ２３およびＦＧＦ２３−ＦｃＬａＬａ融合ポリ
ペプチドのＦＧＦ２３部分内で試験する。これらは、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４４
（数字はＦＧＦ２３アミノ酸配列に基づく）を含む。実施例の個々の変異は、Ｑ１５６Ａ
、Ｃ２０６ＳおよびＣ２４４Ｓを含み、これらの部位のいずれかでの変異は、Ｒ１７９（
例えば、Ｒ１７９Ｑ）での変異と組み合わせることができる。実施例の配列は、図２の配
列番号：５４から６８において提供される。
Ｃ２０６およびＣ２４４は、二量化に関与することと考えられ、Ｑ１５６は、プロテア
ーゼ感受性部位として本発明者らにより同定された部位である。他の任意のアミノ酸への
これらのアミノ酸の変異は、ＦＧＦ２３活性を妨害することなく、凝集を減少させること
、望ましくないプロテアーゼ誘導開裂を減少させること、および細胞からのタンパク質生
産を増加させることによりタンパク質の質を増強する。これは、これらの３つの位置がヒ
ト、アカゲザル、ウシ、マウスおよびラットにおいて見出されるＦＧＦ２３タンパク質に
おいて保存されているため、予期し得ない結果である。この保存は、太字で下線のＱ１５
６、Ｃ２０６およびＣ２４４にて、配列番号：６９、７０、７１、７２および７３間の比
較において以下に示される。
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これらの３つの変異がＦＧＦ２３活性を妨害しないという事実は、図１１に示される。
この図は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬＡＬＡならびにＱ１５６Ａ、Ｃ２０６Ｓ、
Ｃ２４４ＳおよびＣ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異体によるＥｇｒ−１−ｌｕｃレポーター遺
伝子の活性化を示す。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、クロトーの全長膜貫通形態と共にＥＧ
Ｒ−１−ｌｕｃレポーター遺伝子で一過性にトランスフェクトし、ＦＧＦ２３−ＦｃＬａ
Ｌａ変異体を示す。次に、ルシフェラーゼ活性を１８時間後に決定する。結果は、Ｃ２０
６Ｓ、Ｃ２４４Ｓ、Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ（３つの独立したクローン）およびＱ１５６
Ａ（３つの独立したクローン）変異体が、ＥＧＲ−１−Ｌｕｃレポーター遺伝子活性の活
性化において、ＦＧＦ２３−ＦｃＬＡＬＡ融合タンパク質と同等に有効であることを示す
。
Ｃ２４４およびＣ２０６の変異がＦＧＦ２３の二量化および凝集を変化させることを示
すデータは、図１２に示される。この図は、ＦＧＦ２３（Ｒ１７９Ｑ）−ＦｃＬａＬａの
ＷＴ、Ｑ１５６Ａ、Ｃ２０６Ｓ、Ｃ２４４ＳおよびＣ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異体のタン
パク質の質を示す。示されるＦＧＦ２３−ＦｃＬａＬａ発現ベクターで一過性にトランス
フェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の馴化培地を、ＦＧＦ２３抗体を使用してウェス
タンブロットにより分析する。結果は、Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２４４Ｓ変異がタンパク質二量化
を妨害し、Ｑ１５６Ａ変異が減少したタンパク質分解フラグメントを有することを示す。
したがって、驚くべきことに、これらのＱ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４４残基が種間
で保存されているにもかかわらず、それらは、ＦＧＦ２３活性を減少させることなく変異
させることができ、凝集および開裂を減少させること、および生産を改善することにより
、タンパク質の質を増強することができる。
他に定義がない限り、本明細書において使用されている技術的および科学的用語は、本
明細書が属する分野でよく知っている専門家により通常理解されるのと同じ意味を有する
。
他に示されていない限り、具体的に詳細に記載されていないすべての方法、工程、技術
および操作は、当業者に明らかであるため、それ自体既知の方法で行うことができるか、
または行われている。例えば、標準ハンドブックおよび本明細書に記載されている一般的
な背景技術および本明細書で引用されているさらなる文献も参照されたい。
特許請求の範囲は、非限定的であり、以下で提供される。
特定の態様および特許請求の範囲は、本明細書に詳細に記載されているが、これは、説
明の目的のためのほんの一例としてであり、特許請求の範囲、または、あらゆる対応する
さらなる出願の特許請求の範囲の対象の範囲に対して限定することを意図しない。特に、
種々の置換、変化および修飾が、特許請求の範囲により定義されている記載の精神および
範囲から逸脱することなく、本記載から作られ得ると本発明者らは考える。核酸出発物質
、興味あるクローンの選択は、本明細書に記載されている態様の知識を有する当業者に対
して日常的な事柄であると考えられる。他の局面、有利なものおよび修飾は、特許請求の
範囲内であると考える。後に出願された対応する出願における特許請求の範囲の補正は、
種々の国の特許法による限定のためであって、特許請求の範囲の対象を放棄すると解釈さ
れるべきではない。
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 以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］
（ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメント、またはクロトー(Klotho)タンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチド。
［２］
（ａ）のポリペプチドが、（ｂ）のポリペプチドのＮ−末端に作動可能に連結している、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［３］
（ｂ）のポリペプチドが、（ａ）のポリペプチドのＮ−末端に作動可能に連結している、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［４］
（ａ）のポリペプチドおよび（ｂ）のポリペプチドが、ポリペプチドリンカーにより連結している、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［５］
ポリペプチドリンカーが、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、［４］に記載の融合ポリペプチド。
［６］
ポリペプチドリンカーが、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１、最大約３０の繰り返しを含む、［４］に記載の融合ポリペプチド。
［７］
（ａ）のポリペプチドが、該ポリペプチドリンカーのＮ−末端にペプチド結合により連結しており、（ｂ）のポリペプチドが、該ポリペプチドリンカーのＣ−末端にペプチド結合により連結している、［４］に記載の融合ポリペプチド。
［８］
（ａ）のポリペプチドが、該ポリペプチドリンカーのＣ−末端にペプチド結合により連結しており、（ｂ）のポリペプチドが、該ポリペプチドリンカーのＮ−末端にペプチド結合により連結している、［４］に記載の融合ポリペプチド。
［９］
クロトータンパク質の細胞外サブドメインが、ＫＬ−Ｄ１ドメインまたはＫＬ−Ｄ２ドメインである、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［１０］
（ａ）のポリペプチドが、クロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメインを含む、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［１１］
クロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメインが、タンデムリピートにおける少なくとも２つのＫＬ−Ｄ１ドメインである、［１０］に記載の融合ポリペプチド。
［１２］
クロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメインが、タンデムリピートにおける少なくとも２つのＫＬ−Ｄ２ドメインである、［１０］に記載の融合ポリペプチド。
［１３］
クロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメインが、ＫＬ−Ｄ１ドメインおよびＫＬ−Ｄ２ドメインを含む、［１０］に記載の融合ポリペプチド。
［１４］
（ａ）のポリペプチドが、クロトータンパク質の細胞外ドメインである、［１］に記載の融合ポリペプチド
［１５］
シグナルペプチドをさらに含む、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［１６］
シグナルペプチドがクロトーシグナルペプチドである、［１５］に記載の融合ポリペプチド。
［１７］
シグナルペプチドがＩｇＧシグナルペプチドである、［１５］に記載の融合ポリペプチド。
［１８］
線維芽細胞増殖因子受容体に特異的に結合する、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［１９］
クロトータンパク質がアルファ−クロトーである、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［２０］
クロトータンパク質がベータ−クロトーである、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［２１］
線維芽細胞増殖因子が、線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）または線維芽細胞増殖因子−２３変異体（Ｒ１７９Ｑ）である、［１９］に記載の融合ポリペプチド。
［２２］
線維芽細胞増殖因子が、線維芽細胞増殖因子−１９または線維芽細胞増殖因子−２１である、［２０］に記載の融合ポリペプチド。
［２３］
配列番号：５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７または６８のアミノ酸配列と９５％以上同一であるアミノ酸配列を含む、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［２４］
配列番号：５８または配列番号：６８のアミノ酸配列を有する、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［２５］
ＦｃＬＡＬＡを含む、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［２６］
［１］に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［２７］
［１］に記載の融合ポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
［２８］
［２７］に記載の核酸を含む宿主細胞。
［２９］
［２７］に記載の核酸を含むベクター。
［３０］
（ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメント、またはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチドを含む治療有効用量の医薬組成物を必要とする個体に投与することを含む、個体における加齢関連状態を処置または予防するための方法。
［３１］
加齢関連状態が、サルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、前立腺癌、卒中、期待寿命の低下(diminished life expectancy)、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢性難聴からなる群から選択される、［３０］に記載の方法。
［３２］
クロトータンパク質がアルファクロトータンパク質である、［３０］に記載の方法。
［３３］
加齢関連状態が筋肉疲労であり、クロトータンパク質がアルファクロトータンパク質であり、線維芽細胞増殖因子が線維芽細胞増殖因子２３である、［３１］に記載の方法。
［３４］
（ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメント、またはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチドを含む治療有効用量の医薬組成物を必要とする個体に投与することを含む、個体における代謝障害を処置または予防するための方法。
［３５］
代謝障害が、ＩＩ型糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖および肥満からなる群から選択される、［３４］に記載の方法。
［３６］
融合ポリペプチドが、（ａ）ベータ−クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチド、および（ｂ）線維芽細胞増殖因子２１を含むポリペプチドを含む、［３４］に記載の方法。
［３７］
（ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメント、またはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチドを含む治療有効用量の医薬組成物を必要とする個体に投与することを含む、個体における高リン血症または石灰沈着症を処置または予防するための方法。
［３８］
融合ポリペプチドが、（ａ）アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチド、および（ｂ）線維芽細胞増殖因子２３を含むポリペプチドを含む、［３７］に記載の方法。
［３９］
（ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメント、またはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチドを含む治療有効用量の医薬組成物を必要とする個体に投与することを含む、個体における慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置または予防するための方法。
［４０］
クロトータンパク質がアルファクロトータンパク質である、［３９］に記載の方法。
［４１］
（ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメント、またはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチドを含む治療有効用量の医薬組成物を必要とする個体に投与することを含む、個体における癌を処置または予防するための方法。［４２］
癌が乳癌である、［４１］に記載の方法。
［４３］
クロトータンパク質がアルファクロトータンパク質である、［４１］に記載の方法。
［４４］
クロトータンパク質がヒトクロトータンパク質である、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［４５］
筋萎縮の処置または予防における使用のための、［１］に記載の融合ポリペプチド。
［４６］
配列番号：４７または配列番号：４９の可溶性クロトー融合タンパク質を含む治療有効用量の医薬組成物を必要とする個体に投与することを含む（本質的にからなる、またはからなる）、筋萎縮を処置または予防する方法。
［４７］
（ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしくは誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラグメント、またはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所望により（ｃ）リンカーを含む、治療有効用量の医薬組成物を必要とする個体に投与することを含む（本質的にからなる、またはからなる）、筋萎縮を処置または予防する方法。

Claims (47)

  1. （ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしく
    は誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４
    ４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−
    受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラ
    グメント、またはクロトー(Klotho)タンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを
    含むポリペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、お
    よび、所望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチド。
  2. （ａ）のポリペプチドが、（ｂ）のポリペプチドのＮ−末端に作動可能に連結している
    、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  3. （ｂ）のポリペプチドが、（ａ）のポリペプチドのＮ−末端に作動可能に連結している
    、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  4. （ａ）のポリペプチドおよび（ｂ）のポリペプチドが、ポリペプチドリンカーにより連
    結している、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  5. ポリペプチドリンカーが、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番
    号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８から
    なる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
  6. ポリペプチドリンカーが、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番
    号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８からなる群から選択さ
    れるアミノ酸配列の少なくとも１、最大約３０の繰り返しを含む、請求項４に記載の融合
    ポリペプチド。
  7. （ａ）のポリペプチドが、該ポリペプチドリンカーのＮ−末端にペプチド結合により連
    結しており、（ｂ）のポリペプチドが、該ポリペプチドリンカーのＣ−末端にペプチド結
    合により連結している、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
  8. （ａ）のポリペプチドが、該ポリペプチドリンカーのＣ−末端にペプチド結合により連
    結しており、（ｂ）のポリペプチドが、該ポリペプチドリンカーのＮ−末端にペプチド結
    合により連結している、請求項４に記載の融合ポリペプチド。
  9. クロトータンパク質の細胞外サブドメインが、ＫＬ−Ｄ１ドメインまたはＫＬ−Ｄ２ド
    メインである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  10. （ａ）のポリペプチドが、クロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメイン
    を含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  11. クロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメインが、タンデムリピートにお
    ける少なくとも２つのＫＬ−Ｄ１ドメインである、請求項１０に記載の融合ポリペプチド
    。
  12. クロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメインが、タンデムリピートにお
    ける少なくとも２つのＫＬ−Ｄ２ドメインである、請求項１０に記載の融合ポリペプチド
    。
  13. クロトータンパク質の少なくとも２つの細胞外サブドメインが、ＫＬ−Ｄ１ドメインお
    よびＫＬ−Ｄ２ドメインを含む、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
  14. （ａ）のポリペプチドが、クロトータンパク質の細胞外ドメインである、請求項１に記
    載の融合ポリペプチド
  15. シグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  16. シグナルペプチドがクロトーシグナルペプチドである、請求項１５に記載の融合ポリペ
    プチド。
  17. シグナルペプチドがＩｇＧシグナルペプチドである、請求項１５に記載の融合ポリペプ
    チド。
  18. 線維芽細胞増殖因子受容体に特異的に結合する、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  19. クロトータンパク質がアルファ−クロトーである、請求項１に記載の融合ポリペプチド
    。
  20. クロトータンパク質がベータ−クロトーである、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  21. 線維芽細胞増殖因子が、線維芽細胞増殖因子−２３（ＦＧＦ２３）または線維芽細胞増
    殖因子−２３変異体（Ｒ１７９Ｑ）である、請求項１９に記載の融合ポリペプチド。
  22. 線維芽細胞増殖因子が、線維芽細胞増殖因子−１９または線維芽細胞増殖因子−２１で
    ある、請求項２０に記載の融合ポリペプチド。
  23. 配列番号：５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６
    ５、６６、６７または６８のアミノ酸配列と９５％以上同一であるアミノ酸配列を含む、
    請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  24. 配列番号：５８または配列番号：６８のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合
    ポリペプチド。
  25. ＦｃＬＡＬＡを含む、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  26. 請求項１に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  27. 請求項１に記載の融合ポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
  28. 請求項２７に記載の核酸を含む宿主細胞。
  29. 請求項２７に記載の核酸を含むベクター。
  30. （ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしく
    は誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４
    ４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−
    受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラ
    グメント、またはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリ
    ペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所
    望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチドを含む治療有効用量の医薬組成物を必
    要とする個体に投与することを含む、個体における加齢関連状態を処置または予防するた
    めの方法。
  31. 加齢関連状態が、サルコペニア、皮膚萎縮、筋肉疲労、脳萎縮、アテローム性動脈硬化
    症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、骨関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチント
    ン病、アルツハイマー病、白内障、加齢黄斑変性症、前立腺癌、卒中、期待寿命の低下(d
    iminished life expectancy)、記憶障害、しわ、腎機能障害および加齢性難聴からなる群
    から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. クロトータンパク質がアルファクロトータンパク質である、請求項３０に記載の方法。
  33. 加齢関連状態が筋肉疲労であり、クロトータンパク質がアルファクロトータンパク質で
    あり、線維芽細胞増殖因子が線維芽細胞増殖因子２３である、請求項３１に記載の方法。
  34. （ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしく
    は誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４
    ４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−
    受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラ
    グメント、またはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリ
    ペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所
    望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチドを含む治療有効用量の医薬組成物を必
    要とする個体に投与することを含む、個体における代謝障害を処置または予防するための
    方法。
  35. 代謝障害が、ＩＩ型糖尿病、メタボリック・シンドローム、高血糖および肥満からなる
    群から選択される、請求項３４に記載の方法。
  36. 融合ポリペプチドが、（ａ）ベータ−クロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サ
    ブドメインを含むポリペプチド、および（ｂ）線維芽細胞増殖因子２１を含むポリペプチ
    ドを含む、請求項３４に記載の方法。
  37. （ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしく
    は誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４
    ４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−
    受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラ
    グメント、またはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリ
    ペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所
    望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチドを含む治療有効用量の医薬組成物を必
    要とする個体に投与することを含む、個体における高リン血症または石灰沈着症を処置ま
    たは予防するための方法。
  38. 融合ポリペプチドが、（ａ）アルファクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サ
    ブドメインを含むポリペプチド、および（ｂ）線維芽細胞増殖因子２３を含むポリペプチ
    ドを含む、請求項３７に記載の方法。
  39. （ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしく
    は誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４
    ４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−
    受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラ
    グメント、またはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリ
    ペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所
    望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチドを含む治療有効用量の医薬組成物を必
    要とする個体に投与することを含む、個体における慢性腎臓疾患または慢性腎不全を処置
    または予防するための方法。
  40. クロトータンパク質がアルファクロトータンパク質である、請求項３９に記載の方法。
  41. （ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしく
    は誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４
    ４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−
    受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラ
    グメント、またはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリ
    ペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所
    望により（ｃ）リンカーを含む、融合ポリペプチドを含む治療有効用量の医薬組成物を必
    要とする個体に投与することを含む、個体における癌を処置または予防するための方法。
  42. 癌が乳癌である、請求項４１に記載の方法。
  43. クロトータンパク質がアルファクロトータンパク質である、請求項４１に記載の方法。
  44. クロトータンパク質がヒトクロトータンパク質である、請求項１に記載の融合ポリペプ
    チド。
  45. 筋萎縮の処置または予防における使用のための、請求項１に記載の融合ポリペプチド。
  46. 配列番号：４７または配列番号：４９の可溶性クロトー融合タンパク質を含む治療有効
    用量の医薬組成物を必要とする個体に投与することを含む（本質的にからなる、またはか
    らなる）、筋萎縮を処置または予防する方法。
  47. （ａ）線維芽細胞増殖因子２３（ＦＧＦ２３）またはその機能的に活性な変異体もしく
    は誘導体を含むポリペプチドであって、ＦＧＦ２３が、Ｑ１５６、Ｃ２０６およびＣ２４
    ４の１つ以上の位置で変異を有するポリペプチド、および（ｂ）減少したＦｃ−ガンマ−
    受容体に対する親和性および／もしくは増加した血清半減期を有する修飾されたＦｃフラ
    グメント、またはクロトータンパク質の少なくとも１つの細胞外サブドメインを含むポリ
    ペプチドのいずれか、またはそれらの機能的に活性な変異体もしくは誘導体、および、所
    望により（ｃ）リンカーを含む、治療有効用量の医薬組成物を必要とする個体に投与する
    ことを含む（本質的にからなる、またはからなる）、筋萎縮を処置または予防する方法。
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