ES2605302T3 - Métodos y composiciones que utilizan polipéptidos de fusión FGF23 - Google Patents

Métodos y composiciones que utilizan polipéptidos de fusión FGF23 Download PDF

Info

Publication number
ES2605302T3
ES2605302T3 ES11705830.5T ES11705830T ES2605302T3 ES 2605302 T3 ES2605302 T3 ES 2605302T3 ES 11705830 T ES11705830 T ES 11705830T ES 2605302 T3 ES2605302 T3 ES 2605302T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
polypeptide
seq
klotho
fgf23
fusion
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11705830.5T
Other languages
English (en)
Inventor
David Glass
Shou-Ih Hu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis AG filed Critical Novartis AG
Application granted granted Critical
Publication of ES2605302T3 publication Critical patent/ES2605302T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/12—Ophthalmic agents for cataracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2445—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01021—Beta-glucosidase (3.2.1.21)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01003—Long-chain-fatty-acid-CoA ligase (6.2.1.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

Un polipéptido de fusión que comprende: (a) un polipéptido que comprende una variante o un derivado funcionalmente activo del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23) que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244; y (b) cualquiera de un fragmento Fc modificado que tiene una afinidad disminuida para el receptor Fc-gamma y/o una semivida en suero aumentada, o un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho o una variante o derivado funcionalmente activo de la misma; y, opcionalmente, (c) un enlazante.

Description

imagen1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones que utilizan polipéptidos de fusión FGF23
1. Antecedentes
Los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) constituyen una familia de factores de crecimiento de polipéptidos homólogos expresados en muchos organismos (Ornitz and Itoh, Genome Biol. 2: reviews, 3005.1-3005.12 (2001)). Entre las especies de vertebrados, los FGF están altamente conservados tanto en la estructura del gen como en la secuencia de aminoácidos, teniendo entre 13-71% de identidad de aminoácidos entre sí. En los seres humanos, hay 22 miembros conocidos de la familia de FGF (FGF15 es el ratón ortólogo de FGF19 humano, por lo tanto, no hay FGF15 humano). Durante el desarrollo temprano, los FGF regulan la proliferación celular, migración y diferenciación, pero en el organismo adulto, los FGF mantienen la homeostasis, funcionan en la reparación tisular y responden a la lesión.
Los FGF funcionan como factores de crecimiento uniéndose y activando de este modo los receptores FGF de la superficie celular. Los receptores de FGF (FGFRs) son receptores de tirosina quinasa que activan la transducción de señales mediante la autofosforilación de FGFR, la fosforilación de FRS2 (sustrato 2 de receptor FGF) y ERK1/2 (proteína quinasa 1/2 regulada por la señal extracelular) y la activación de Egr-1 (respuesta al crecimiento temprana1). Los FGF también tienen una alta afinidad por los proteoglicanos de sulfato de heparina. Cuando se unen a FGF, el sulfato de heparina mejora la activación de FGFR.
El gen alfa-Klotho codifica una proteína transmembrana de tipo I de paso simple de 130 kDa con un dominio extracelular y un dominio citoplasmático corto. El dominio extracelular de la proteína alfa-Klotho comprende dos subdominios denominados KL-D1 y KL-D2. Estos dos subdominios comparten homología de secuencia con βglucosidasa de bacterias y plantas. El dominio extracelular de la proteína alfa-Klotho puede estar unido a la superficie celular por el dominio transmembrana o puede ser escindido y liberado en el medio extracelular. La escisión del dominio extracelular parece estar facilitada por las concentraciones de Ca2+ extracelulares locales bajas.
Además de alfa-Klotho, se ha identificado un homólogo de alfa-Klotho, beta-Klotho (Ito et al., Mech. Dev. 98: 115-9 (2000)). Beta-Klotho es también una proteína transmembrana de un solo paso de tipo I con subdominios extracelulares KL-D1 y KL-D2.
Se ha demostrado que la modulación de la expresión de alfa-Klotho produce características relacionadas con el envejecimiento en mamíferos. Los ratones homocigóticos para una mutación de pérdida de función en el gen alfa-Klotho desarrollan características semejantes al envejecimiento humano, incluyendo vida útil acortada, atrofia de la piel, desgaste muscular, arteriosclerosis, enfisema pulmonar y osteoporosis (Kuro-o et al., Nature, 390:45-51 (1997)). Por el contrario, la sobreexpresión del gen alfa-Klotho en ratones prolonga su vida útil y aumenta la resistencia al estrés oxidativo con respecto a los ratones de tipo salvaje (Kurosu et al., Science 309:1829-1833 (2005); yamamoto et al., J. Biol. Chem. 280:38029-38034 (2005)).
Estudios recientes han demostrado características biológicas sorprendentemente similares entre ratones deficientes en FGF23 y ratones deficientes en alfa-Klotho (Shimada et al., J. Clin. Invest. 113:561-568 (2004); Yoshida et al. Endocrinology 143:683-689 (2002)), indicando diafonía funcional entre FGF23 y alfa-Klotho. Estos estudios condujeron a la identificación de alfa-Klotho como un socio obligatorio de FGF23, tanto en términos de unión como de señalización a través de sus receptores de FGF afines (Urakawa et al., Nature 22: 1524-6 (2007)). El gen alfa-Klotho se expresa principalmente en riñón, glándula paratiroidea y plexo coroideo. Se plantea la hipótesis de que la expresión de tejido específico de alfa-Klotho restringe la activación de señalización de FGF23 a los tejidos.
Al igual que FGF23/alfa-Klotho, el beta-Klotho es un socio obligatorio de FGF19 y FGF21, tanto en la unión como en la señalización a través de sus respectivos receptores de FGF afines (Ogawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:7432-7 (2007); Lin et al., J. Biol Chem. 282:27227-84 (2007); Wu et al., J Biol Chem. 283(48):33304-9(2008) y Wu et al., J. Biol. Chem. 282:29069-72 (2007)). Tales estudios también han demostrado la participación de beta-Klotho en la regulación de la actividad metabólica específica de los tejidos. Inicialmente se demostró que Beta-Klotho actuaba con FGF21 como un cofactor para regular el metabolismo de carbohidratos y lípidos en el tejido adiposo. Beta-Klotho en conjunción con FGF19 regula el metabolismo de los ácidos biliares en el hígado, lo que explica la síntesis elevada de bilis en ratones deficientes en beta-Klotho (Ito et al., J Clin Invest. 2005 Aug;115(8):2202-8).
La Patente de los Estados Unidos No. 6,579,850 describe polipéptidos y composiciones que comprenden un polipéptido alfa-Klotho. Se describen polipéptidos alfa-Klotho humanos y de ratón. La patente también reveló que las composiciones que comprenden los polipéptidos son útiles en el tratamiento de un síndrome semejante al envejecimiento prematuro, tratamiento de enfermedades de adultos y supresión del envejecimiento.
La Patente de los Estados Unidos No. 7,223,563 describe ácidos nucleicos aislados que codifican la secuencia del polipéptido FGF23 o células recombinantes que comprenden dicho ácido nucleico aislado. La patente se refiere
imagen2
10
15
20
25
30
35
40
45
50
además a métodos para diagnosticar y tratar trastornos hipofosfatemicos e hiperfosfatémicos, osteoporosis, dermatomiositis y enfermedad de las arterias coronarias.
La Patente de los Estados Unidos No. 7,259,248 describe ácidos nucleicos aislados que codifican la secuencia de polipéptido FGF21. La patente se refiere además a métodos para diagnosticar y tratar la enfermedad hepática, estados relacionados con la función tímica, y métodos para tratar las condiciones del testículo.
La Solicitud de Patente Internacional WO2009/095372 se refiere a polipéptidos de fusión que comprenden un subdominio extracelular de una proteína Klotho; y un polipéptido que comprende un factor de crecimiento de fibroblastos. La solicitud de patente se refiere además a métodos para tratar o prevenir una afección relacionada con la edad en un individuo. El potencial terapéutico de las moléculas descritas fue discutido con más detalle por Razzaque M.S (véase Expert Opinion in therapeutic patents, Informa Healthcare, GB, vol. 20, no. 7, 1 de junio de 2010)
La Solicitud de Patente Internacional WO2009/117622 se refiere a polipéptidos FG23 que comprenden ciertas modificaciones, como modificaciones post-translacionales, aminoácidos codificados no naturalmente o unidades estructurales poli (etilenglicol). La solicitud de patente describe además un método para tratar pacientes que tienen un trastorno modulado por FGF-23 que comprende administrar al paciente los polipéptidos FgF23 modificados.
La Solicitud de Patente de los Estados Unidos US2006160181 describe una nueva secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido FG23 y un proceso para la producción del polipéptido FGF23.
2. Resumen de la invención
La presente invención se refiere a los siguientes aspectos:
1) Un polipéptido de fusión que comprende: (a) un polipéptido que comprende una variante o un derivado funcionalmente activo del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23) que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244; y (b) cualquiera de un fragmento Fc modificado que tiene una afinidad disminuida para el receptor Fc-gamma y/o una semivida en suero aumentada, o un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho o una variante o derivado funcionalmente activo de la misma; y, opcionalmente, (c) un enlazante.
2) El polipéptido de fusión del aspecto 1, en donde el polipéptido de (a) está unido operativamente al extremo N del polipéptido de (b); o en donde el polipéptido de (b) está unido operativamente al extremo N del polipéptido de (a).
3) El polipéptido de fusión de cualquiera de los aspectos 1 o 2, en donde el polipéptido de (a) y el polipéptido de (b) están conectados por un enlazante de polipéptido.
4) El polipéptido de fusión del aspecto 3, en donde el enlazante de polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 18; o en donde el enlazante de polipéptido comprende al menos 1 y hasta aproximadamente 30 repeticiones de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 18.
5) El polipéptido de fusión de cualquiera de los aspectos 1-4, en donde el polipéptido de (a) está conectado por un enlace peptídico al extremo N de un enlazante de polipéptido, y el polipéptido de (b) está conectado por un enlace peptídico al extremo C de dicho enlazante de polipéptido; o en donde el polipéptido de (a) está conectado por un enlace peptídico al extremo C de dicho enlazante de polipéptido, y el polipéptido de (b) está conectado por un enlace peptídico al extremo N de dicho enlazante de polipéptido.
6) El polipéptido de fusión de cualquiera de los aspectos anteriores, en donde el subdominio extracelular de la proteína Klotho es un dominio KL-D1 o un dominio KL-D2; o en donde el polipéptido de (b) comprende al menos dos subdominios extracelulares de la proteína Klotho.
7.
El polipéptido de fusión del aspecto 6, en donde los al menos dos subdominios extracelulares de la proteína Klotho son al menos dos dominios KL-D1 en repeticiones en tándem; o en donde los al menos dos subdominios extracelulares de la proteína Klotho son al menos dos dominios KL-D2 en repeticiones en tándem; o en donde los al menos dos subdominios extracelulares de la proteína Klotho comprenden un dominio KL-D1 y un dominio KL-D2; o donde el polipéptido de (b) es el dominio extracelular de la proteína Klotho.
8.
El polipéptido de fusión de cualquiera de los aspectos anteriores, que comprende además un péptido señal.
9.
El polipéptido de fusión del aspecto 8, en donde el péptido señal es el péptido señal Klotho o el péptido señal IgG.
imagen3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
10.
El polipéptido de fusión de cualquiera de los aspectos previos que se une específicamente a un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos.
11.
El polipéptido de fusión de cualquiera de los aspectos anteriores, en donde la proteína Klotho es alfa-Klotho; o en donde la proteína Klotho es beta-Klotho.
12.
El polipéptido de fusión de cualquiera de los aspectos anteriores, en donde la variante funcionalmente activa del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23) tiene una mutación en todas las posiciones R179, Q156, C206 y C244.
13.
El polipéptido de fusión del aspecto 1 que comprende una secuencia de aminoácidos que es 95% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, o 68.
14.
El polipéptido de fusión del aspecto 1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO:
68.
15.
El polipéptido de fusión del aspecto 1-3 o 5, que comprende FcLALA.
16.
Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de fusión de cualquiera de los aspectos anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable.
17.
Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el polipéptido de fusión de cualquiera de los aspectos 1-15.
18.
Una célula huésped que contiene el ácido nucleico del aspecto 17.
19.
Un polipéptido de fusión que comprende:
(a)
un polipéptido que comprende una variante o derivado funcionalmente activo de FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244; y
(b)
cualquiera de un fragmento Fc modificado que tiene una afinidad disminuida para el receptor Fc-gamma y/o una semivida en suero aumentada, o un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho o una variante o derivado funcionalmente activo de la misma; y, opcionalmente, (c) un enlazante, para uso como medicamento.
20. Un polipéptido de fusión que comprende:
(a)
un polipéptido que comprende una variante o derivado funcionalmente activo de FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244; y
(b)
cualquiera de un fragmento Fc modificado que tiene una afinidad disminuida para el receptor Fc-gamma y/o una semivida en suero aumentada, o un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho o una variante o derivado funcionalmente activo de la misma; y, opcionalmente, (c) un enlazante, para uso en el tratamiento o prevención de una afección o enfermedad en un individuo seleccionado del grupo que consiste en una afección relacionada con la edad, un trastorno metabólico, hiperfosfatemia, calcinosis, enfermedad renal crónica, Atrofia muscular y cáncer.
21.
El polipéptido de fusión del aspecto 20, en donde la afección relacionada con la edad se selecciona del grupo que consiste en sarcopenia, atrofia de la piel, desgaste muscular, atrofia cerebral, aterosclerosis, arteriosclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, presión arterial alta, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, cáncer de próstata, accidente cerebrovascular, disminución de la esperanza de vida, pérdida de memoria, arrugas, deterioro de la función renal y pérdida auditiva relacionada con la edad.
22.
El polipéptido de fusión del aspecto 20, en donde el trastorno metabólico se selecciona del grupo que consiste en diabetes de Tipo II, síndrome metabólico, hiperglucemia y obesidad.
23.
El polipéptido de fusión del aspecto 20, en donde el cáncer es cáncer de mama.
24.
El polipéptido de fusión del aspecto 19-23, donde el polipéptido de fusión comprende: (a) un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína alfa Klotho; y (b) un polipéptido que comprende una variante o derivado funcionalmente activo de FGF23 que tiene una mutación en todas las posiciones de Q156, C206 y C244 y R179.
25.
El polipéptido de fusión del aspecto 19-24 para su uso en el tratamiento o prevención de la atrofia muscular.
imagen4
5
10
15
20
25
30
35
40
45
26.
El polipéptido de fusión de cualquiera de los aspectos 19-25, en donde la proteína Klotho es una proteína Klotho humana.
27.
Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión soluble de SEQ ID NO: 68 o 58
3. Breve descripción de los dibujos
La figura 1 ilustra varios polipéptidos de fusión Klotho diferentes de la divulgación. Los polipéptidos de fusión representados incluyen uno o más subdominios extracelulares de Klotho unidos operativamente a un factor de crecimiento de fibroblastos. Los polipéptidos que contienen uno o más subdominios extracelulares de Klotho incluyen, por ejemplo, un dominio extracelular de Klotho (por ejemplo, aa 1 a 982 de Klotho humano), o un fragmento activo de Klotho.
La figura 2 ilustra las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de varios polipéptidos de fusión Klotho de la divulgación y sus componentes (por ejemplo, dominio extracelular de Klotho, FGF). Las proteínas de fusión que comprenden sKlotho, FGF23 y FcLALA (un fragmento Fc modificado que tiene afinidad disminuida para el receptor Fc-gamma y/o semivida en suero aumentada) se describen en SEQ ID NOs. 46, 47, 48 y 49. Las proteínas de fusión que comprenden FGF23 y FcLALA se describen en SEQ ID NOs. 50, 51, 52 y 53.
Las Figuras 3A-3C representan la expresión proteica de una proteína de fusión de sKlotho-FGF23. La figura 3A muestra que la proteína de fusión sKlotho-FGF23 se detectó en medio acondicionado mediante transferencia Western con anticuerpos anti-FGF23. La figura 3B muestra que la proteína de fusión sKlotho-FGF23 se detectó en medio acondicionado por SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie. La figura 3C muestra una proteína de fusión sKlotho-FGF23-6xHis altamente purificada, analizada por SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie.
La figura 4 ilustra los resultados de un ensayo de luciferasa de Egr-1 que compara el nivel de activación de Egr-1 en células tratadas con medio acondicionado que contiene un polipéptido de fusión de Klotho, un polipéptido de FGF 23 solamente, y un polipéptido de Klotho (sKlotho) soluble en combinación con un polipéptido FGF 23 en ausencia o presencia de heparina (20 µg/mL).
Las Figuras 5A-5B representan los resultados de un ensayo de luciferasa Egr-1 comparando el nivel de activación de Egr-1 en células tratadas con polipéptido de fusión de Klotho purificado, polipéptido FGF 23 o polipéptido Klotho soluble en ausencia o presencia de heparina. La figura 5A muestra los resultados de un experimento que compara el nivel de activación de Egr-1 en células tratadas con FGF 23 solo, sKlotho -His (10 nM o 20 nM) y una combinación de FGF 23 y sKlotho -His (10 nM o 20 nM) En ausencia o presencia de heparina (20 µg/mL). La figura 5B muestra la actividad informadora de luciferasa Egr-1 en células tratadas con la fusión sKlotho-FGF23-His (0 nM, 0.6 nM, 1.21 nM, 2.41 nM, 4.83 nM, 9.65 nM, y 19.3 nM).
Las Figuras 6A-6B ilustran el efecto del tratamiento con un polipéptido de fusión de sKlotho purificado en células de músculo C2C12.
La figura 6A muestra medidas de diámetro de miotubo en células de músculo C2C12 tratadas con IGF-1 (10 nM), FGF2 (20 ng/mL) o un polipéptido de fusión de Klotho purificado (20 nM), en ausencia o presencia de dexametasona (100 µM). La figura 6B muestra la fosforilación de las proteínas de la ruta de señalización en las células del músculo C2C12 mediante IGF-1 (10 nM), FGF2 (20 ng/mL) o un polipéptido de fusión Klotho purificado (20 nM), en ausencia
o presencia de rapamicina (40 nM).
La figura 7 muestra la activación del gen indicador EGR-1-luc por las proteínas de fusión sKlotho-FGF23 (R179Q) -FcLALA.
La figura 8 muestra la activación del gen indicador EGR-1-luc por las proteínas FGF23 (R179Q)-FcLALA.
La figura 9 muestra el perfil farmacocinético de FGF23 (R179Q) frente a FGF23 (R179Q)-FcLALAv2.
Las figuras 10A y 10B muestran la eficacia in vivo de la fusión de sKlotho-FGF23 en el aumento del crecimiento muscular después de la atrofia muscular inducida por dexametasona.
Figura 11. Esta figura muestra la activación del gen indicador EGR-1-luc por los mutantes FGF23(R179Q)-FcLALA y Q156A, C206S, C244S y C206S/C244S.
La figura 12 muestra las cualidades proteicas y la dimerización de mutantes WT (tipo salvaje), Q156A, C206S, C244S y C206S/C244S de FGF23(R179Q)-FcLaLa.
4. Descripción detallada
imagen5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La presente invención se refiere a composiciones y polipéptidos de fusión y al uso de dichas composiciones y polipéptidos de fusión en terapia, como medicamento o para uso en el tratamiento de un trastorno patológico. Los polipéptidos de fusión de la invención. Comprenden un FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244 y un fragmento Fc modificado con capacidad disminuida para unirse a FcRn y/o mayor estabilidad en suero o un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho o una variante o derivado funcionalmente activo de la misma.
Las proteínas de fusión de la presente invención son útiles en el tratamiento y prevención de una variedad de afecciones relacionadas con la edad incluyendo sarcopenia, atrofia de la piel, desgaste muscular, atrofia cerebral, aterosclerosis, arteriosclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, hipertensión, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, cáncer de próstata, accidente cerebrovascular, disminución de la esperanza de vida, pérdida de memoria, arrugas, deterioro de la función renal y pérdida auditiva relacionada con la edad; y trastornos metabólicos, incluyendo diabetes tipo II, síndrome metabólico, hiperglucemia y obesidad.
La presente divulgación está basada al menos en parte en el hallazgo de que a pesar de las restricciones físicas (por ejemplo, gran tamaño de los polipéptidos Klotho y FGF), los polipéptidos de fusión de Klotho-FGF son altamente efectivos en la activación de un receptor de FGF. Este hallazgo es inesperado dado que la fusión de estas dos proteínas probablemente interferiría con la heterodimerización y, por lo tanto, con las actividades de las proteínas; Por ejemplo, los dominios de unión de las proteínas pueden ser perturbados por la fusión o las proteínas pueden estar mal orientadas espacialmente si se juntan en una formación "cis".
Los polipéptidos de fusión descritos en la presente invención son ventajosos porque permiten la administración de una única proteína terapéutica que tiene actividad mejorada en comparación con Klotho o FGF administrados solos
o juntos como polipéptidos separados. El uso de Klotho y FGF como un único polipéptido de fusión en lugar de dos polipéptidos separados (esto es, un polipéptido Klotho y un polipéptido FGF separado) es más eficaz para activar el receptor FGF.
Definiciones
"Polipéptido Klotho", "proteína Klotho", o "Klotho" como se utiliza en este documento, incluye fragmentos activos, derivados, miméticos, variantes y compuestos modificados químicamente o híbridos de los mismos de tipo "Klotho" de tipo salvaje. Un fragmento activo de Klotho tiene la capacidad de unirse a un polipéptido de FGF. Generalmente, un polipéptido activo de Klotho contiene al menos un subdominio Klotho (por ejemplo, KL-D1 y KL-D2). El tipo natural Klotho tiene la secuencia de aminoácidos como se encuentra en la naturaleza. Ejemplo Los polipéptidos Klotho apropiados para su uso con la presente invención incluyen alfa-Klotho (SEQ ID NO: 2) y beta-Klotho (SEQ ID NO: 4). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del alfa-Klotho y del beta-Klotho se encuentran en la base de datos GenBank con el número de acceso NM_004795; NP_004786 y NM_175737; NP_783864, respectivamente. Los polipéptidos de Klotho incluyen los descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 6,579,850. Los polipéptidos de Klotho incluyen aquellos de otras especies además de seres humanos, incluyendo alfa-Klotho de ratón (NP_038851), rata (NP_112626), conejo (NP_001075692) y beta-Klotho de ratón (NP_112457). Las especies que se pronosticó que tenían alfa-Klotho incluyen chimpancé (XP_522655), macaco (XP_001101127), caballo (XP_001495662), vaca (XP_001252500), ornitorrinco (XP_001510981) y pollo (XP_417105). Las especies que se pronosticó tener beta-Klotho incluyen chimpancé (XP_526550), macaco (XP_001091413), caballo (XP_001495248), perro (XP_536257), rata (XP_001078178), ornitorrinco (XP_001512722) y pollo (XP_423224). Los polipéptidos de Klotho tienen una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4; esto es, al menos al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
o más idéntica en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4, o fragmento activo del mismo.
"Polipéptido de fusión" o "proteína de fusión", como se utiliza en este documento, significará un polipéptido que comprende dos o más polipéptidos diferentes o fragmentos activos de los mismos que no están presentes naturalmente en el mismo polipéptido. En algunas realizaciones, los dos polipéptidos diferentes están unidos operativamente conjuntamente covalentemente, por ejemplo, ligados químicamente o fusionados en el marco por un enlace peptídico. Como se usa en este documento, un "polipéptido de fusión de Klotho" es un polipéptido de fusión que incluye una secuencia de aminoácidos de un polipéptido Klotho o fragmento activo del mismo. Un polipéptido de fusión puede comprender FGF23) y un fragmento Fc modificado (por ejemplo, un fragmento Fc modificado con afinidad de unión disminuida al receptor FC-gamma y/o semivida en suero aumentada) o una proteína Klotho. Ejemplos de polipéptidos de fusión se presentan en SEQ ID NOs. 46 a 49. En una realización, las proteínas de fusión comprenden un FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244 y un Fc modificado (por ejemplo, FcLALA). Las proteínas de fusión que comprenden variantes de FGF23 se describen en SEQ ID NOs. 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, o 68. FcLALA es un fragmento Fc con una mutación LALA (L234A, L235A), que desencadena ADCC con la eficiencia disminuida, y se une y activa el complemento humano débilmente. Hessell et al. 2007 Nature 449: 101-104.
"Factor de crecimiento de fibroblastos" y "FGF" se usan indistintamente en este documento y se referirán a polipéptidos que regulan la proliferación celular, la migración, la diferenciación, la homeostasis, la reparación de
15
25
35
45
55
tejidos y la respuesta a una lesión en un animal, incluyendo un sujeto humano. Los FGF tienen la capacidad de unirse a un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y regular su actividad, incluyendo la autofosforilación de FGFR, la fosforilación de FRS2 (sustrato del receptor FGF2) y ERK1/2 (proteína quinasa regulada por señal extracelular1/2) y que activa Egr-1 (respuesta de crecimiento temprano-1). El término “FGF” incluye fragmentos activos, derivados, miméticos, variantes y compuestos modificados químicamente o sus híbridos de tipo "FGF" de tipo salvaje, por ejemplo, como se conoce en la técnica y como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 7,223,563 y en la Patente de los Estados Unidos 7,259,248. El FGF de tipo salvaje tiene una secuencia de aminoácidos tal como se encuentra en la naturaleza. Ejemplos de crecimiento de fibroblastos incluyen factor de crecimiento de fibroblastos-19 (FGF19; SEQ ID NO: 31), factor de crecimiento de fibroblastos-21 (FGF21; SEQ ID NO: 33) y factor de crecimiento de fibroblastos-23 (FGF23; SEQ ID NO: 35). Los polipéptidos de FGF incluyen los de otras especies además de seres humanos, incluyendo FGF de murinos. Generalmente, los polipéptidos de FGF tienen una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 35. Ejemplos de FGF23 se proporcionan en aa 1002-1228 de SEQ ID NO: 47; aa 1002-1228 de SEQ ID NO: 49; aa 1-251 de SEQ ID NO: 51 y aa 1-251 de SEQ ID NO: 53. Los nucleótidos que codifican estas secuencias se proporcionan en SEQ ID NO: 46, 48, 50 y 52.
El término "FGF", incluye fragmentos activos del polipéptido de longitud completa. Los fragmentos de FGF activos que son capaces de unirse a sus correspondientes receptores de FGF son conocidos en la técnica. Un experto en la técnica apreciaría, basándose en las secuencias descritas en este documento, que los fragmentos solapantes de los FGF pueden ser generados usando tecnología recombinante estándar, por ejemplo, la descrita en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) y Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, New York). Un experto en la técnica apreciaría, basándose en la descripción presentada en este documento, que la actividad biológica de fragmentos de FGF podría ensayarse por métodos bien conocidos en la técnica y descritos en este documento, incluyendo la unión al receptor de FGF. De forma similar, los modelos de cultivo celular que poseen la maquinaria de transducción de señales de FGF necesaria (esto es, el receptor de FGF) pueden se transfectados con fragmentos de FGF y posteriormente probarse para detectar alteraciones en la señalización de FGF, en relación con FGF de tipo salvaje.
Los FGF se agrupan en siete subfamilias basadas en la homología del dominio de homología de núcleo de FGF (aproximadamente 120 aminoácidos de longitud), que está flanqueada por secuencias de los extremos N y C que son altamente variables tanto en longitud como en secuencia primaria, particularmente entre diferentes subfamilias de FGF (Goetz et al., Molecular and Cellular Biology, 2007, Vol. 27, 3417-3428). FGF19, FGF21, y FGF23 se agrupan en la subfamilia de FGF19 porque la región central de estos ligandos comparte una alta identidad de secuencia con respecto a otros FGF (FGF19 frente a FGF21: 38% de identidad, FGF19 frente a FGF23: 36% de identidad). Los miembros de la subfamilia FGF19 actúan análogamente a las moléculas de señalización del sistema endocrino y regulan diversos procesos fisiológicos poco frecuentes a los FGF clásicos (por ejemplo, FGF 19: energía y homeostasis de los ácidos biliares, FGF21: metabolismo de glucosa y lípidos y FGF 23: homeostasis de fosfato y vitamina D).
"Receptor del factor de crecimiento de fibroblastos" y "FGFR" como se utiliza en este documento se refieren a cualquiera de los FGFR 1-4 conocidos en la técnica, o variantes de empalme de la misma (por ejemplo, FGFR1c). Ejemplos de receptores de factor de crecimiento de fibroblastos incluyen receptor-19 de factor de crecimiento de fibroblastos (por ejemplo, FGFR4-beta Klotho), receptor de factor de crecimiento de fibroblastos-21 (por ejemplo, FGFR1c-alfa Klotho) y receptor de factor de crecimiento de fibroblastos-23 (por ejemplo, FGFR1c-alfa Klotho, FGFR3-alfa Klotho, FGFR4-alfa Klotho).
"Dominio extracelular", como se utiliza en este documento, se refiere al fragmento de una proteína transmembrana existente fuera de una célula (por ejemplo, sin incluir la región intracelular o transmembrana). El "dominio extracelular de la proteína Klotho", "Klotho soluble" o "sKlotho" (por ejemplo, SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 39), se refiere a un dominio extracelular del polipéptido Klotho que es capaz de unirse a Factor de crecimiento de fibroblastos, y/o capaz de permitir la unión de un factor de crecimiento de fibroblastos a un receptor de factor de crecimiento de fibroblastos uniéndose al factor de crecimiento de fibroblastos. El dominio extracelular de Klotho corresponde a los residuos de aminoácidos 28-982 de la secuencia alfa-Klotho de longitud completa (SEQ ID NO: 2) y a los residuos de aminoácidos 52-997 de la secuencia beta-Klotho de longitud completa (SEQ ID NO: 4).
En este documento, se usan indistintamente "subdominio extracelular de la proteína Klotho" y "subdominio extracelular de la proteína Klotho" y se referirán a una región en el dominio extracelular del polipéptido Klotho que es capaz de unirse a un factor de crecimiento de fibroblastos y/o es capaz de permitir la unión de un factor de crecimiento de fibroblastos a un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos mediante la unión al factor de crecimiento de fibroblastos. El dominio extracelular de Klotho tiene dos subdominios homólogos que se repiten, esto es, KL-D1 (SEQ ID NO: 5) y KL-D2 (SEQ ID NO: 6). KL-D1 y KL-D2 corresponden respectivamente a los residuos de aminoácidos 58-506 y 517-953 del polipéptido alfa-Klotho de longitud completa (SEQ ID NO: 2) y respectivamente a los residuos de aminoácidos 77-508 y 571-967 del (SEQ ID NO: 4) y son apropiados para su uso con la presente invención. Generalmente, un polipéptido que contiene al menos un subdominio de Klotho es un polipéptido activo de Klotho. El subdominio extracelular de Klotho para uso con el polipéptido de la invención puede ser un dominio alfa Klotho o beta Klotho KL-D1 con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de
imagen6
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 37, respectivamente. Además, el dominio KL-D1 de Klotho puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 37. El subdominio de Klotho extracelular también puede ser un dominio KL-D2 de polipéptido alfa Klotho o beta que es sustancialmente idéntico a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 O SEQ ID NO: 38, respectivamente. En una realización adicional, el dominio KL-D2 tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 38. En algunas realizaciones, la fusión comprende al menos dos subdominios extracelulares de la proteína Klotho (por ejemplo, KL-D1 y KL-D2, KL-D1 y KL-D1 en repeticiones en tándem, KL-D2 y KL-D2 en repeticiones en tándem, etc.).
"Fragmento Fc modificado", como se utiliza en este documento, significará un fragmento Fc de un anticuerpo que comprende una secuencia modificada. El fragmento Fc es una porción de un anticuerpo que comprende CH2, CH3 y parte de la región bisagra. El fragmento Fc modificado se puede derivar, por ejemplo, de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. FcLALA es un fragmento Fc modificado con una mutación LALA (L234A, L235A), que desencadena ADCC con una eficiencia disminuida, y se une y activa el complemento humano débilmente. Hessell et al. 2007 Nature 449: 101
104. Modificaciones adicionales al fragmento Fc se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 7,217,798. Por ejemplo, en diversos fragmentos Fc modificados: (a) el residuo de aminoácido 250 es ácido glutámico y el residuo de aminoácido 428 es fenilalanina; o (b) el residuo de aminoácido 250 es glutamina y el residuo de aminoácido 428 es fenilalanina; o (c) el residuo de aminoácido 250 es glutamina y el residuo de aminoácido 428 es leucina. En algunas realizaciones, los residuos de aminoácidos 250 y 428 difieren de los residuos presentes en una proteína de fusión Fc no modificada; siendo el residuo de aminoácido 250 el ácido glutámico o glutamina y el residuo de aminoácido 428 es leucina o fenilalanina y en donde los residuos de aminoácidos están numerados por el sistema de numeración EU, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 7,217,798. En algunas realizaciones, la proteína de fusión Fc modificada tiene una mayor afinidad por FcRn a pH 6.0 que a pH
8.0. Preferiblemente, el fragmento Fc modificado tiene afinidad disminuida a FcRn y/o semivida en suero aumentada. Ejemplos no limitativos de fragmentos Fc modificados incluyen que en aa (aminoácidos) 1234-1459 de SEQIDNO:47;aa1234 a 1450 de SEQIDNO: 49;aa 257 a 482deSEQIDNO:51;yaa257a473deSEQID NO: 53; y secuencias que son al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más o 100% idénticas a estas secuencias. Los nucleótidos que codifican estas secuencias se proporcionan en las SEQ ID NOs: 46, 48, 50 y 52.
"Péptido señal", como se utiliza en este documento, significará una cadena peptídica (de 3 a 60 aminoácidos de longitud) que dirige el transporte postraduccional de una proteína al retículo endoplásmico y puede escindirse. Ejemplos de péptidos señal apropiados para su uso con la presente invención incluyen el péptido señal Klotho (SEQ ID NO: 19) y el péptido señal IgG (SEQ ID NO: 20). Obsérvese que, tras la secreción y escisión por la línea celular productora, el péptido señal (por ejemplo, de los péptidos correspondientes a la SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20) se escinde. Así, después de la secreción y escisión del péptido señal por las líneas celulares productoras, el péptido de SEQ ID NO: 19 generaría el péptido de SEQ ID NO: 41.
"Enlazante", como se utiliza en este documento, significará un grupo funcional (por ejemplo, un compuesto químico o un polipéptido) que une covalentemente dos o más polipéptidos o ácidos nucleicos de manera que estén conectados entre sí. Como se usa en este documento, un "enlazante peptídico" se refiere a uno o más aminoácidos utilizados para acoplar dos proteínas conjuntamente (por ejemplo, para acoplar el dominio extracelular de Klotho y factor de crecimiento de fibroblastos-23). Los enlazantes peptídicos apropiados para su uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos con secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18. Un enlazante de polipéptido puede comprender al menos 1 y hasta aproximadamente 30 repeticiones de cualquiera de estas secuencias de aminoácidos.
"Unido operativamente", como se utiliza en este documento, significará la unión de dos o más biomoléculas de manera que las funciones biológicas, las actividades y/o la estructura asociadas con las biomoléculas estén al menos retenidas. En referencia a polipéptidos, el término significa que la unión de dos o más polipéptidos da como resultado un polipéptido de fusión que retiene al menos algunas de las respectivas actividades individuales de cada componente polipéptido. Los dos o más polipéptidos pueden estar unidos directamente o por medio de un enlazante. En referencia a los ácidos nucleicos, el término significa que un primer polinucleótido está situado adyacente a un segundo polinucleótido que dirige la transcripción del primer polinucleótido cuando moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de la transcripción) están unidas al segundo polinucleótido.
"Se une específicamente", como se utiliza en este documento, se referirá a la capacidad de una primera molécula para unirse a una molécula diana de muchos tipos diferentes de moléculas a las que puede estar expuesto debido a la capacidad de la primera molécula para adoptar una estructura particular conducente a la formación de interacciones no covalentes entre sí y la otra molécula diana. La primera molécula se une al objetivo formando un complejo estable mientras que hay sustancialmente menos reconocimiento, contacto o formación compleja de la primera molécula con cualquier otra molécula no específica.
imagen7
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
"Variante de polipéptido" o "variante de proteína", como se utiliza en este documento, se refiere a polipéptidos en los que uno o más aminoácidos han sido sustituidos por diferentes aminoácidos a partir de una secuencia de referencia. Se entiende bien en la técnica que algunos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros con propiedades ampliamente similares sin cambiar la naturaleza de la actividad del polipéptido (sustituciones conservadoras) como se describe a continuación. Estos términos incluyen también polipéptidos en los que uno o más aminoácidos se han añadido o eliminado, o se han sustituido por diferentes aminoácidos, por ejemplo, isoformas de proteínas. Un ejemplo de variante del factor de crecimiento de fibroblastos 23, es la variante del factor de crecimiento de fibroblastos-23 (R179Q).
"Composición farmacéutica", como se utiliza en este documento, significará una composición que contiene un compuesto (por ejemplo, un polipéptido fusión de la divulgación) que se puede administrar para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un individuo.
"Individuo" o "sujeto", como se utiliza en este documento, se referirá a un mamífero, incluyendo, pero no limitado a, un mamífero humano o no humano, tal como un animal bovino, equino, canino, ovino o felino.
"Tratar", como se utiliza en este documento, significa disminuir, suprimir, atenuar, disminuir, detener o estabilizar el desarrollo o progresión de una enfermedad. En el contexto de la invención, la administración de los polipéptidos de la invención puede usarse para tratar afecciones relacionadas con la edad, incluyendo sarcopenia, atrofia de la piel, desgaste muscular, atrofia cerebral, aterosclerosis, arteriosclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, hipertensión, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, cáncer de próstata, accidente cerebrovascular, disminución de la esperanza de vida, pérdida de memoria, arrugas, deterioro de la función renal y pérdida auditiva relacionada con la edad; y trastornos metabólicos, incluyendo diabetes Tipo II, síndrome metabólico, hiperglucemia y obesidad.
"Prevenir", como se utiliza en este documento, se referirá a una disminución en la aparición de un trastorno o disminución en el riesgo de adquirir un trastorno o sus síntomas asociados en un sujeto. En el contexto de la invención, la administración de los polipéptidos de la invención puede usarse para prevenir afecciones relacionadas con la edad, incluyendo sarcopenia, atrofia de la piel, desgaste muscular, atrofia cerebral, aterosclerosis, arteriosclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, hipertensión, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, cáncer de próstata, accidente cerebrovascular, disminución de la esperanza de vida, pérdida de memoria, arrugas, deterioro de la función renal y pérdida auditiva relacionada con la edad; y trastornos metabólicos, incluyendo diabetes Tipo II, síndrome metabólico, hiperglucemia y obesidad. La prevención puede ser completa, por ejemplo, la ausencia total de una afección relacionada con la edad o un trastorno metabólico.
"Enfermedad", tal como se utiliza en este documento, significará cualquier afección o trastorno que dañe o interfiera con la función normal de una célula, tejido u órgano.
"Afección relacionada con la edad", como se utiliza en este documento, significará cualquier enfermedad o trastorno cuya incidencia en una población o gravedad en un individuo se correlaciona con la progresión de la edad. En una realización, la afección relacionada con la edad es una enfermedad o trastorno cuya incidencia es al menos 1.5 veces mayor entre los individuos humanos mayores de 60 años con respecto a los individuos humanos entre las edades de 30-40 y en una población seleccionada de más de 100,000 personas. Las afecciones relacionadas con la edad relevantes para la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, sarcopenia, atrofia de la piel, desgaste muscular, atrofia cerebral, aterosclerosis, arteriosclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, hipertensión, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, cáncer de próstata, accidente cerebrovascular, disminución de la esperanza de vida, pérdida de memoria, arrugas, deterioro de la función renal y pérdida auditiva relacionada con la edad.
"Trastorno metabólico", como se utiliza en este documento, significará cualquier enfermedad o trastorno que daña o interfiere con la función normal en una célula, tejido u órgano al afectar la producción de energía en las células o la acumulación de toxinas en una célula, tejido, órgano o individuo. Los trastornos metabólicos relevantes para la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, diabetes de Tipo II, síndrome metabólico, hiperglucemia, y obesidad.
Una "dosis eficaz" o "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para efectuar un resultado clínico beneficioso o deseado. En el contexto de la descripción, es una cantidad de un polipéptido de fusión eficaz para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo deseado. Una dosis terapéuticamente eficaz da como resultado la prevención o mejora del trastorno o uno o más síntomas del trastorno (por ejemplo, una afección relacionada con la edad o trastorno metabólico). Las dosis terapéuticamente eficaces variarán dependiendo del sujeto y de la afección a tratar, del peso y de la edad del sujeto, de la gravedad de la enfermedad, de la forma de administración y similares que pueda ser fácilmente determinada por un experto en el arte.
imagen8
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La "molécula de ácido nucleico de Klotho", tal como se utiliza en la presente invención, es un gen que codifica una proteína Klotho. Se proporciona un ejemplo de gen Klotho humano en el número de acceso GenBank NM_004795 (SEQ ID NO: 1). Ejemplos adicionales no limitativos de Klotho se proporcionan en aa 1-982 de SEQ ID NO: 47 y aa 1-982 de SEQ ID NO: 49; y secuencias que son al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más o 100% idénticas a estas secuencias.
"Fragmento", como se utiliza en este documento, se refiere a una porción de un polipéptido o molécula de ácido nucleico. Esta porción contiene, preferiblemente, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de toda la longitud de la molécula o polipéptido de ácido nucleico de referencia. Un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o hasta 3000 nucleótidos o aminoácidos.
El término "sustancialmente idéntico" se refiere a un polipéptido o molécula de ácido nucleico que presenta al menos un 50% de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en este documento) o secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en este documento). Preferiblemente, dicha secuencia es al menos 60%, 70%, 75%, 80% o 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica al nivel de aminoácidos o ácido nucleico a la secuencia utilizada para comparación.
La presente invención se refiere a composiciones para el uso de dichas composiciones en terapia, como un medicamento o para su uso en el tratamiento de un trastorno patológico. En algunas realizaciones, la invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende una variante FGF23 R179Q que tiene una o más mutaciones de las posiciones Q156, C206 y C244 fusionadas a un Fc modificado (por ejemplo, FcLALA). FcLALA es un fragmento Fc con una mutación LALA (L234A, L235A), que desencadena ADCC con una eficiencia disminuida, y se une y activa el complemento humano débilmente. El dominio extracelular de Klotho puede derivarse de las isoformas alfa o beta de Klotho.
El dominio extracelular de la proteína Klotho puede incluir uno o ambos de los dominios KL-D1 y KL-D2 de una proteína Klotho. En algunas realizaciones, el polipéptido de fusión Klotho tiene al menos dos subdominios extracelulares de una proteína Klotho. Por ejemplo, los al menos dos subdominios extracelulares pueden ser al menos dos dominios KL-D1 en repeticiones en tándem, al menos dos dominios KL-D2 en repeticiones en tándem o al menos un dominio KL-D1 y al menos un dominio KL-D2.
El subdominio extracelular de una proteína Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos (o un fragmento activo del mismo) pueden estar unidos operativamente entre sí en una variedad de orientaciones y formas. Por ejemplo, el subdominio extracelular de la proteína Klotho puede estar unido operativamente al extremo N del factor de crecimiento de fibroblastos 23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244 o, alternativamente, el factor de crecimiento de fibroblastos 23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244 puede estar unidad operativamente al extremo N del al menos un subdominio extracelular de la proteína Klotho.
El polipéptido de fusión de la invención puede incluir uno o ambos dominios extracelulares de Klotho, esto es, KLD1 (SEQ ID NO: 5) y KL-D2 (SEQ ID NO: 6). KL-D1 y KL-D2 corresponden respectivamente a los residuos de aminoácidos 58-506 y 517-953 del polipéptido alfa Klotho de longitud completa (SEQ ID NO: 2) ya los residuos de aminoácidos 77-508 y 571-967 del polipéptido de beta Klotho de longitud total (SEQ ID NO: 4) y son apropiados para su uso con la presente invención. El polipéptido de fusión de Klotho puede tener un dominio KL-D1 de un polipéptido alfa Klotho que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o de un polipéptido beta Klotho que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente Idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 37. Específicamente, el polipéptido de fusión de Klotho puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 37. El polipéptido de fusión Klotho puede tener un dominio KLD2 de un polipéptido alfa Klotho con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o de un polipéptido beta Klotho que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 38. Específicamente "el polipéptido de fusión Klotho puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 38 respectivamente.
Los polipéptidos de fusión de la invención pueden contener un enlazante de polipéptido que conecta el polipéptido que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos 23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244. Los enlazantes apropiados son bien conocidos en la técnica y generalmente contienen varios residuos de Gly y varios Ser, por ejemplo (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 11), polipéptido Gly4 Ser (SEQ ID NO: 12), Gly (SEQ ID NO: 13), Gly Gly (SEQ ID NO: 14), Gly Ser (SEQ ID NO: 15), Gly2 Ser (SEQ ID NO: 16), Ala (SEQ ID NO: 17), y Ala Ala (SEQ ID NO: 18). En algunas realizaciones, el enlazante tendrá al menos 2 y hasta aproximadamente 30 repeticiones de una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, o SEQ ID NO: 18.
imagen9
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Cuando un enlazante de polipéptido está presente en el polipéptido de fusión Klotho de la invención, el polipéptido que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho puede estar conectado por un enlace peptídico al extremo N del polipéptido enlazante con el FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244 conectadas por un enlace peptídico al extremo C del enlazante de polipéptido. Alternativamente, el FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244 pueden estar conectados por un enlace peptídico al extremo N del polipéptido enlazante con el polipéptido que tiene al menos un subdominio extracelular de Klotho conectado mediante un enlace peptídico al extremo C del polipéptido enlazante. También se puede usar un enlazante químico para unir los dos polipéptidos.
El polipéptido de fusión de la invención puede incluir un péptido señal. Los péptidos señal de ejemplo para uso con el polipéptido de fusión Klotho incluyen, pero no se limitan a, el péptido señal Klotho (SEQ ID NO: 8) y el péptido señal IgG (SEQ ID NO: 9).
En algunas realizaciones, la invención proporciona una fusión entre la variante R179Q de FGF23 que incluye otra(s) mutación(es) en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244 y un Fc modificado (por ejemplo, FcLALA). La fusión también puede comprender opcionalmente enlazantes entre las porciones FGF y Fc. La fusión también puede comprender opcionalmente un péptido señal. En diversas realizaciones, la invención abarca ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos de fusión y células huésped que contienen estos ácidos nucleicos.
4.1. Polipéptidos del factor de crecimiento de fibroblastos y Klotho
Se espera que los polipéptidos de fusión de Klotho de la invención muestren actividades biológicas comparables a FGF en naturaleza, tales como la unión a un receptor de FGF e inducción de la fosforilación de un receptor de FGF, FRS2 (sustrato de receptor FGF2) y ERK1/2 (Proteína de quinasa regulada por señal extracelular 1/2) y que active el gen Egr-1 (respuesta de crecimiento temprano-1). El FGF es un factor de crecimiento de péptido secretado que se une al receptor de FGF. Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de FGF están fácilmente disponibles para los expertos en el arte. Por ejemplo, pueden encontrarse secuencias de nucleótidos de ejemplo para FGF19, FGF21 y FGF23 en la base de datos de GenBank en los números de acceso NM_005117, NM_019113 y NM_020638, respectivamente, y en este documento como SEQ ID NO: 30, 32 y 34, respectivamente. Se pueden encontrar secuencias amino de ejemplo para FGF19, FGF21 y FGF23 en la base de datos GenBank en los números de acceso: NP_005108, NP_061986 y NP_065689, respectivamente, y en este documento como SEQ ID NO: 31, 35 y 35, respectivamente. Adicionalmente, FGF puede incluir una o más alteraciones que ayudan en la expresión de la proteína, por ejemplo, la variante FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 36).
La proteína Klotho es una proteína transmembrana de tipo I de paso simple de 130 kDa con un dominio extracelular y un dominio citoplasmático corto. Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de Klotho están fácilmente disponibles para los expertos en el arte. Por ejemplo, pueden encontrarse secuencias de nucleótidos de ejemplo para alfa-Klotho y beta-Klotho en la base de datos GenBank en los números de acceso NM_004795 y NM_175737, respectivamente, y en este documento como SEQ ID NOs: 7 y 8, respectivamente. Ejemplo de secuencias de aminoácidos para alfa-Klotho y beta-Klotho se pueden encontrar en la base de datos GenBank en los números de acceso: NP_004786 y NP_783864, respectivamente, y en este documento como SEQ ID NO: 2 y 4, respectivamente.
El polipéptido de fusión de Klotho de la invención se puede unir a un receptor de factor de crecimiento de fibroblastos y tiene un dominio extracelular alfa-Klotho o beta-Klotho unido operativamente a la variante de factor de crecimiento de fibroblastos-23 (R179Q) incluyendo mutación(es) adicional(es) o más de las posiciones Q156, C206 y C244.
Específicamente, el polipéptido de fusión de Klotho de la invención puede incluir un alfa-Klotho (SEQ ID NO: 2) que está acoplado operativamente a la variante R179Q del factor de crecimiento de fibroblastos 23 incluyendo una o más mutaciones en uno o más de las posiciones Q156, C206 y C244. Además, el polipéptido de fusión de Klotho de la invención puede tener beta-Klotho (SEQ ID NO: 4), que está acoplado operativamente a la variante R179Q del factor de crecimiento de fibroblastos-23 que incluye mutación adicional en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244.
La invención incluye homólogos de los diversos genes Klotho y FGF y proteínas codificadas por dichos genes. Un "homólogo" en referencia a un gen se refiere a una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica sobre al menos parte del gen o su cadena complementaria o una parte de la misma, con la condición de que la secuencia de nucleótidos codifique una proteína que tenga sustancialmente la misma actividad/función como la proteína codificada por el gen que es un homólogo de. Los homólogos de los genes descritos en este documento pueden identificarse por el porcentaje de identidad entre secuencias de aminoácidos o nucleótidos para homólogos putativos y las secuencias de los genes o proteínas codificadas por ellos (por ejemplo, secuencias de nucleótidos para genes que codifican Klotho y FGF o sus hebras complementarias). El porcentaje de identidad se puede determinar, por ejemplo, mediante inspección visual o utilizando diversos programas informáticos conocidos en la técnica o como se describe en este documento. La identidad de secuencia se mide por lo general usando software de análisis de
10
15
20
25
30
35
40
secuencia (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, programas BLAST, BESTFIT, GAP,
o PILEUP/PRETTYBOX). Dicho software coincide con secuencias idénticas o similares asignando grados de homología a diversas sustituciones, supresiones y/u otras modificaciones. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos por lo general incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos:
glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Por lo tanto, la mutación de una glicina a alanina sería una sustitución conservadora de aminoácidos, al igual que la
mutación de una alanina a una glicina; la mutación de una valina en una isoleucina o leucina sería una subestación conservadora de aminoácidos, al igual que la sustitución de una isoleucina por valina o leucina, al igual que la sustitución de leucina por valina o isoleucina, etc. La invención proporciona variantes de todas las secuencias de aminoácidos descritas en este documento con al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En un enfoque de ejemplo para determinar el grado de identidad, se puede usar un programa BLAST, con una puntuación de probabilidad entre e-3 y e-100 indicando una secuencia estrechamente relacionada. La presente divulgación proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 19. La presente divulgación proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 20.
La presente divulgación proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 40. La presente divulgación proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 41, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
La presente divulgación proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 46.
La presente divulgación proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 47, o una variante de la misma que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos. La presente divulgación proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 48. La presente divulgación proporciona un polipéptido de fusión de la SEQ ID NO: 49, o una variante del mismo que
comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos. La presente divulgación proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 50. La presente divulgación proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 51, o una variante del mismo que
comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos. La presente divulgación proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 52. La presente divulgación proporciona un polipéptido de fusión de la SEQ ID NO: 53, o una variante del mismo que
comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En una realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 54, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos. En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 55, o una variante del
mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos. En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 56, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 57, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de la SEQ ID NO: 58, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de la SEQ ID NO: 59, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 60, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 61, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 62, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 63, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 64, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 65, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 66, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 67, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión de SEQ ID NO: 68, o una variante del mismo que comprende al menos una sustitución conservadora de aminoácidos.
Como se utiliza en este documento, los términos “homología” y “homólogo” no se limitan a designar proteínas que tienen un ancestro genético común teórico, sino que incluyen proteínas que pueden ser genéticamente no relacionadas y que, sin embargo, han evolucionado para realizar funciones similares y/o tienen estructuras similares. La homología funcional con las diversas proteínas descritas en este documento también abarca proteínas que tienen una actividad de la proteína correspondiente de la que es un homólogo. Para que las proteínas tengan homología funcional, no se requiere que tengan identidad significativa en sus secuencias de aminoácidos, sino que más bien las proteínas que tienen homología funcional se definen así por tener actividades similares o idénticas. Por ejemplo, con respecto a una molécula de Klotho, el polipéptido debe tener las características funcionales de unión a un polipéptido de FGF y permitir la unión del FGF a un FGFR. Con respecto a una molécula de FGF, el polipéptido debe tener las características funcionales de unión a un FGFR y provocar la activación de FGFR (por ejemplo, fosforilación). Los ensayos para evaluar la fijación de FGF al receptor de FGF y/o la activación de la ruta de señalización de FGF se conocen en la técnica y se describen en este documento (véase el ejemplo 2). Los ensayos para evaluar la actividad de Klotho también se conocen en la técnica y se describen en este documento (por ejemplo, unión a un polipéptido de FGF). Las proteínas con homología estructural se definen como teniendo una estructura terciaria (o cuaternaria) análoga y no necesariamente requieren identidad de aminoácidos o identidad de ácido nucleico para los genes que las codifican. En ciertas circunstancias, los homólogos estructurales pueden incluir proteínas que mantienen la homología estructural sólo en el sitio activo o sitio de unión de la proteína.
La presente invención abarca además proteínas que tienen identidad de aminoácidos con las diversas secuencias de aminoácidos de Klotho y FGF23 descritas en este documento. Para determinar el porcentaje de identidad/homología de dos secuencias de aminoácidos, las secuencias se alinean con fines de comparación óptimos (por ejemplo, se pueden introducir vacíos en la secuencia de aminoácidos de una proteína para una alineación óptima con la secuencia de aminoácidos de otra proteína). A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos. Cuando una posición en una secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido que la posición correspondiente en la otra, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (esto es, % identidad = # de posiciones idénticas/número total de posiciones multiplicado por 100).
imagen10
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de fusión que comprenden: (a) un polipéptido que comprende una variante o derivado funcionalmente activo del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23) que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244; y (b) cualquiera de un fragmento Fc modificado que tiene una afinidad disminuida para el receptor Fc gamma y/o una semivida en suero aumentada, o un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho o una variante o derivado funcionalmente activo de la misma que tienen una secuencia de aminoácido que es 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica u homóloga a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 o 68.
Las moléculas de ácido nucleico apropiadas para uso en los polipéptidos de fusión de la invención pueden tener una secuencia de nucleótidos Klotho o FGF23 que hibrida bajo condiciones estrictas al complemento de una molécula de ácido nucleico que codifica Klotho o FGF23, respectivamente. Como se usa en este documento, el término "hibrida bajo condiciones rigurosas" pretende describir las condiciones para la hibridación y el lavado bajo las cuales secuencias de nucleótidos al menos aproximadamente 70%, 80%, 85%, 90% o más homólogas una con la otra por lo general permanecen hibridadas entre sí. Tales condiciones rigurosas son conocidas por los expertos en el arte y se pueden encontrar en Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York (2001), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo específico no limitativo de condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en cloruro de sodio 6X/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en 0.2 X SSC, SDS al 0.1% a 50-65ºC.
4.2. Polipéptidos de fusión de Klotho-FGF
En algunas realizaciones de la invención, un polipéptido de fusión Klotho tiene una cadena polipéptida que tiene una primera secuencia polipéptida de un polipéptido Klotho o un fragmento activo del mismo y una segunda secuencia polipéptido que codifica FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244 o un fragmento activo de la misma.
La invención incluye polipéptidos de fusión que son al menos aproximadamente 95% o más homólogos a una secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 54-68.
El polipéptido de fusión Klotho de la invención puede incluir una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 codifica un dominio extracelular de Klotho que carece de un péptido señal.
Las proteínas de fusión objeto de la presente invención se describen en el presente documento y se pueden preparar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos de fusión de la invención pueden construirse como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,194,177. El uso de polipéptidos de Klotho se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,579,850. El uso de moléculas de ácido nucleico de FGF se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 7,223,563.
En algunas realizaciones, una molécula de ácido nucleico que codifica el Klotho se clona por PCR y se une, en el marco, con una molécula de ácido nucleico que codifica FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244 o una variante o derivado funcionalmente activo de la misma. El ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión está unido operativamente a un promotor para permitir la expresión. La molécula de ácido nucleico que codifica la fusión del polipéptido se transfecta posteriormente en una célula huésped para su expresión. La secuencia de la construcción final puede ser confirmada por secuenciación.
Cuando se preparan las proteínas de fusión de la presente invención, una molécula de ácido nucleico que codifica un subdominio extracelular de Klotho se fusionará en marco a la molécula de ácido nucleico que codifica FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 Y C244 o una variante o derivado funcionalmente activo de la misma. La expresión de la molécula de ácido nucleico resultante da lugar a que el subdominio extracelular de Klotho se fusione en el extremo N en relación con el FGF polipéptido. También son posibles las fusiones en las que el subdominio extracelular de Klotho es extremo C fusionado en relación con el polipéptido FGF. Los métodos para preparar proteínas de fusión son bien conocidos en la técnica.
En otra realización, la invención comprende un FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244 o una variante o derivado funcionalmente activo de la misma fusionada a un fragmento Fc modificado. Los polipéptidos de fusión de la invención, se pueden unir por métodos bien conocidos para los expertos en el arte.
Estos métodos incluyen medios químicos y recombinantes.
Los ácidos nucleicos que codifican los dominios que se van a incorporar en los polipéptidos de fusión de la invención pueden obtenerse usando técnicas rutinarias en el campo de la genética recombinante. Los textos básicos que revelan los métodos generales de uso en esta divulgación incluyen Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current
imagen11
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994-1999). En ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de fusión Klotho de la invención, se puede usar la secuencia del ácido nucleico que codifica alfa-Klotho o beta-Klotho, representada por SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, respectivamente.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los diversos componentes de la fusión [Klotho, y/o péptido FGF y/o el fragmento Fc modificado (opcional) pueden obtenerse usando cualquiera de una variedad de métodos. Por ejemplo, la secuencia del ácido nucleico que codifica los polipéptidos puede clonarse a partir de bibliotecas de ADNc y ADN genómico por hibridación con sondas, o aislarse usando técnicas de amplificación con cebadores oligonucleotídicos. Más comúnmente, se utilizan técnicas de amplificación para amplificar y aislar las secuencias de Klotho y FGF utilizando una plantilla de ADN o ARN (véase, por ejemplo, Dieffenfach & Dveksler, PCR Primers: A Laboratory Manual (1995)). Alternativamente, los oligonucleótidos solapantes se pueden producir sintéticamente y unirse para producir uno o más de los dominios. Los ácidos nucleicos que codifican Klotho o FGF también se pueden aislar de las bibliotecas de expresión usando anticuerpos como sondas.
De acuerdo con la presente divulgación, los diversos componentes de la fusión pueden estar unidos ya sea directamente o a través de un enlazante covalente, incluyendo enlazantes de aminoácidos, tales como un enlazante de poliglicina, u otro tipo de enlazante químico, incluyendo, enlazantes de carbohidratos, ligandos lipídicos, Ligandos ácidos, ligandos poliéter, tales como PEG, etc. (Véase, por ejemplo, Hermanson, Bioconjugate techniques (1996)). Los polipéptidos que forman el polipéptido de fusión/fusión están por lo general extremos C ligados a extremos N, aunque también pueden estar ligados extremos C a extremos C, extremos N a extremos N o extremos N a extremos
C. Se pueden insertar uno o más dominios polipéptidos Uno o más dominios de polipéptido pueden insertarse en un lugar interno dentro de un polipéptido de fusión de la invención. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. Los polipéptidos de fusión se pueden producir enlazando covalentemente una cadena de aminoácidos de una secuencia de proteína, por ejemplo, un subdominio extracelular de Klotho, a una cadena de aminoácidos de otra secuencia de proteína, por ejemplo, FGF, mediante la preparación de un polinucleótido recombinante que codifica contiguamente la proteína de fusión. Las diferentes cadenas de aminoácidos en una proteína de fusión pueden unirse directamente entre sí o pueden unirse indirectamente entre sí a través de un grupo de unión química o un grupo de unión de aminoácido. El grupo de unión de aminoácidos puede tener aproximadamente 200 aminoácidos o más de longitud, o generalmente 1 a 100 aminoácidos. En algunas realizaciones, los residuos de prolina se incorporan en el enlazante para evitar la formación de elementos estructurales secundarios significativos por el enlazante. Los enlazantes a menudo pueden ser subsecuencias de aminoácidos flexibles que se sintetizan como parte de una proteína de fusión recombinante. Dichos enlazantes flexibles son conocidos por los expertos en el arte.
De acuerdo con la presente invención, la secuencia de aminoácidos de la fusión puede estar unida a través de un enlazante peptídico. Ejemplos de enlazantes peptídicos son bien conocidos en la técnica y se describen en este documento. Por ejemplo, los enlazantes peptídicos generalmente incluyen varios residuos de Gly y varios Ser, tales como: (Gly4 Ser)3, (SEQ ID NO: 11), Gly4 Ser polipéptido (SEQ ID NO: 12), Gly (SEQ ID NO: 13), Gly Gly (SEQ ID NO: 14), Gly Ser (SEQ ID NO: 15), Gly2 Ser (SEQ ID NO: 16), Ala (SEQ ID NO: 17) y Ala Ala (SEQ ID NO: 18). Específicamente, un enlazante peptídico para uso en una proteína de fusión de la invención puede actuar como una bisagra flexible.
La secuencia señal de Klotho o FGF23 puede excluirse antes de la incorporación de Klotho en una proteína de fusión de la invención. La secuencia señal para Klotho o FGF23 de la proteína de fusión puede incluirse, por ejemplo, el polipéptido representado por SEQ ID NO: 19. Sin embargo, tales secuencias también pueden omitirse y reemplazarse con la secuencia señal de una proteína diferente, por ejemplo, la IgG (SEQ ID NO: 9). Generalmente, las composiciones farmacéuticas de la invención contendrán la forma madura de Klotho y FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244 o una variante o derivado funcionalmente activo de la misma.
Generalmente, los intrones se excluyen de uno o ambos de las unidades estructurales restos Klotho o FGF23 antes de su incorporación en un polipéptido de fusión.
Los polipéptidos de fusión de la invención pueden incluir uno o más polímeros unidos covalentemente a una o más cadenas laterales de aminoácidos reactivas. A título de ejemplo, sin limitación, tales polímeros incluyen polietilenglicol (PEG), que se puede unir a uno o más residuos cisteína-sulfhidrilo libres, bloqueando así la formación de enlaces disulfuro y la agregación cuando la proteína se expone a condiciones oxidantes. Además, se espera que la PEGilación de los polipéptidos de fusión de la invención proporcione tales propiedades mejoradas, como la semivida, la solubilidad y la resistencia a la proteasa. Los polipéptidos de fusión de la invención pueden alternativamente ser modificados por la adición covalente de polímeros a grupos amino libres tales como la lisina epsilon o el grupo amino N-terminal. Las cisteínas específicas y las lisinas para la modificación covalente serán aquellas que no están implicadas en la unión al receptor, la unión a la heparina o en el plegamiento de proteínas adecuado. Será evidente para un experto en la técnica que los métodos para ensayar la actividad bioquímica y/o biológica de los polipéptidos de fusión se pueden emplear con el fin de determinar si la modificación de un residuo de aminoácido particular afecta la actividad de la proteína según se desee. Otras modificaciones adecuadas similares se contemplan y se conocen en la técnica.
imagen12
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Por "una variante o derivado funcionalmente activo de la misma" se entiende una variante o derivado que comprende una secuencia de aminoácidos más larga, más corta o alterada que el correspondiente polipéptido de tipo salvaje, conservando al mismo tiempo la actividad biológica. Por lo tanto, "una variante o derivado funcionalmente activo" de un subdominio extracelular de una proteína Klotho o un factor de crecimiento de fibroblastos comprende menos, más o una secuencia de aminoácidos alterada que un subdominio extracelular de tipo salvaje de una proteína Klotho o un factor de crecimiento de fibroblastos, pero aún conserva al menos una actividad biológica de la secuencia polipéptido de tipo salvaje. Una variante o derivado funcionalmente activo de un polipéptido descrito en este documento puede comprender también la misma secuencia de aminoácidos de un polipéptido descrito en este documento, pero varía en la modificación postraduccional (por ejemplo, pegilación, metilación y/o glicosilación) o tiene restos o elementos adicionales añadidos a ella.
Como se usa en el presente documento, se determina el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos (o de dos secuencias del ácido nucleico) usando el algoritmo de Karlin y Altschul (PNAS USA 87: 2264-2268, 1990), modificado como en Karlin y Altschul, PNAS USA 90: 5873 -5877, 1993). Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403 -410, 1990). Las búsquedas de nucleótidos BLAST se realizan con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12. Las búsquedas de proteína BLAST se realizan con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3. Para obtener la alineación gapped para fines de comparación GappedBLAST se utiliza como se describe en Altschul et al. (Nucleic Acids Res. 25: 3389 -3402, 1997). Cuando se utilizan programas BLAST y GappedBLAST, se usan los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a una molécula de ácido nucleico de la invención.
Identidad o idéntico significa semejanza de secuencia de aminoácidos (o secuencia del ácido nucleico) y tiene un significado reconocido en la técnica. Las secuencias con identidad comparten aminoácidos idénticos o similares (o ácidos nucleicos). De este modo, una secuencia candidata que comparte la identidad de secuencia de aminoácidos del 85% con una secuencia de referencia requiere que, después de la alineación de la secuencia candidata con la secuencia de referencia, el 85% de los aminoácidos de la secuencia candidata son idénticos a los aminoácidos correspondientes en la secuencia de referencia, y/o constituyen cambios conservadores de aminoácidos.
Las variantes funcionalmente activas de un polipéptido descrito en este documento retienen sustancialmente la misma actividad funcional del polipéptido o fragmento original. Las variantes funcionalmente activas que ocurren de forma natural, tales como variantes alélicas y variantes de especies y variantes funcionalmente activas que no ocurren naturalmente, se incluyen en la invención y pueden producirse, por ejemplo, mediante técnicas de mutagénesis o mediante síntesis directa.
Una variante o derivado funcionalmente activo difiere en aproximadamente o por lo menos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más residuos de aminoácidos de un polipéptido descrito en este documento. Cuando esta comparación requiere alineación, las secuencias están alineadas para obtener la máxima homología. El sitio de variación puede ocurrir en cualquier parte del polipéptido, siempre que la actividad sea sustancialmente similar a un polipéptido descrito en este documento.
En Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990) se proporciona orientación sobre cómo hacer variantes y derivados con sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas, que enseña que hay dos estrategias principales para estudiar la tolerancia de una secuencia de aminoácidos a cambiar.
La primera estrategia explora la tolerancia de las sustituciones de aminoácidos por selección natural durante el proceso de evolución. Comparando secuencia de aminoácidos en diferentes especies, se pueden identificar las posiciones de aminoácidos que se han conservado entre las especies. Véase, por ejemplo, la figura 5. Estos aminoácidos conservados son probablemente importantes para la función de la proteína. Por el contrario, las posiciones de aminoácidos en las que las sustituciones han sido toleradas por selección natural indican posiciones que no son críticas para la función de la proteína. De este modo, las posiciones que toleran la sustitución de aminoácidos pueden modificarse mientras se mantiene la actividad de unión específica del polipéptido.
La segunda estrategia utiliza la ingeniería genética para introducir cambios de aminoácidos en posiciones específicas de un gen clonado para identificar las regiones críticas para la función de la proteína. Por ejemplo, puede usarse mutagénesis dirigida o mutagénesis de escaneo de alanina (la introducción de mutaciones de alanina individuales en cada resto en la molécula) (Cunningham et al., Science, 244: 1081-1085 (1989)).
Los métodos para introducir una mutación en aminoácidos de una proteína son bien conocidos para los expertos en el arte. Véase, por ejemplo, Ausubel (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994);
T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, laboratorio Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las mutaciones también se pueden introducir usando kits comercialmente disponibles tales como "QuikChangeTM" Site-Directed Mutagenesis Kit" (Stratagene). La generación de un polipéptido variante o derivado funcionalmente activo a un polipéptido sustituyendo un aminoácido que no influye en la función de un polipéptido puede ser realizada por un experto en el arte.
imagen13
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Una variante o derivado puede tener, por ejemplo, una o más sustituciones conservadoras mientras conserva al menos una actividad biológica. Una sustitución conservadora es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de modo que un experto en la técnica de la química peptídica esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido permanecieran sustancialmente inalteradas. En general, los siguientes grupos de aminoácidos representan cambios conservadores: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.
4.3. Expresión de polipéptidos de fusión
Con el fin de expresar la proteína de fusión de la divulgación, las moléculas de ADN obtenidas por cualquiera de los métodos descritos en este documento o aquellas conocidas en la técnica, pueden insertarse en vectores de expresión apropiados mediante técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un ADNc de doble hebra puede clonarse en un vector adecuado por cola homopolimérica o por unión de enzima de restricción que implica el uso de enlazantes de ADN sintéticos o por ligadura de extremos romos. Generalmente se usan ligasas de ADN para ligar las moléculas de ADN y se puede evitar la unión indeseable mediante tratamiento con fosfatasa alcalina.
Por lo tanto, la divulgación incluye vectores (por ejemplo, plásmidos recombinantes y bacteriófagos) que incluyen moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, genes o moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican genes) como se describe en este documento. El término "vector recombinante" incluye un vector (por ejemplo, plásmido, fago, fásmido, virus, cósmido, fosmid u otro vector de ácido nucleico purificado) que ha sido alterado, modificado o diseñado de tal manera que contenga más, menos o diferentes secuencias del ácido nucleico que las incluidas en la molécula nativa de ácido nucleico o natural de la que se derivó el vector recombinante. Por ejemplo, un vector recombinante puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de Klotho-FGF23 unido operativamente a secuencias reguladoras, por ejemplo, secuencias promotoras, secuencias terminadoras y/o sitios de unión a ribosomas artificiales (RBS), como se define en este documento. Los vectores recombinantes que permiten la expresión de los genes o ácidos nucleicos incluidos en ellos se denominan "vectores de expresión".
Para los huéspedes eucariotas, pueden emplearse diferentes secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción, dependiendo de la naturaleza del huésped. Pueden derivarse de fuentes virales, tales como adenovirus, virus del papiloma bovino, virus Simian o similares, donde las señales reguladoras están asociadas con un gen particular que tiene un alto nivel de expresión. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el promotor TK del virus Herpes, el promotor temprano SV40, el promotor del gen ga14 de la levadura, etc. Se pueden seleccionar señales reguladoras de la iniciación transcripcional que permitan la represión o la activación, de modo que la expresión de los genes puede ser modulada.
En algunas de las moléculas de la divulgación descritas en este documento, una o más moléculas de ADN que tienen una secuencia de nucleótidos que codifican una o más cadenas polipéptidas de un polipéptido de fusión están unidas operativamente a una o más secuencias reguladoras, que son capaces de integrar la molécula de ADN deseada en Una célula huésped. Las células que se han transformado establemente mediante el ADN introducido se pueden seleccionar, por ejemplo, introduciendo uno o más marcadores que permiten la selección de células hospedadoras que contienen el vector de expresión. Un gen marcador seleccionable puede estar enlazado directamente a una secuencia del ácido nucleico a expresar, o puede introducirse en la misma célula por cotransfección. También pueden ser necesarios elementos adicionales para la síntesis óptima de las proteínas descritas en este documento. Serıa evidente para un experto en la materia los elementos adicionales a utilizar.
Los factores de importancia en la selección de un plásmido o vector viral particular incluyen, pero no se limitan a, la facilidad con la que las células receptoras que contienen el vector son reconocidas y seleccionadas de aquellas células receptoras que no contienen el vector; El número de copias del vector que se desea en un huésped particular; y si es deseable ser capaz de "lanzar" el vector entre células huésped de diferentes especies.
Una vez construido el(los) vector(es) para incluir una secuencia de ADN para la expresión, se puede introducir en una célula huésped apropiada por uno o más de una variedad de métodos apropiados que son conocidos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, etc.
Las células huésped pueden ser procarióticas o eucarióticas. Ejemplos de células huésped eucarióticas incluyen, por ejemplo, células de mamífero, tales como células de humano, mono, ratón y ovario de hámster chino (CHO). Tales células facilitan modificaciones postraduccionales de proteínas, incluyendo, por ejemplo, plegamiento o glicosilación correctos. Además, las células de levadura también se pueden utilizar para expresar polipéptidos de fusión de la divulgación. Al igual que la mayoría de las células de mamífero, las células de levadura también permiten modificaciones postraduccionales de proteínas, incluyendo, por ejemplo, glicosilación. Existen varias estrategias de ADN recombinante que utilizan fuertes secuencias promotoras y plásmidos de alto número de copias que pueden utilizarse para la producción de proteínas en levaduras. La maquinaria de transcripción y traducción de levaduras puede reconocer secuencias líderes en productos génicos clonados de mamífero, permitiendo de este modo la secreción de péptidos que llevan secuencias líderes (esto es, pre péptidos). Un método particular de producción de alto rendimiento de los polipéptidos de fusión de la divulgación es mediante el uso de la amplificación de
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
dihidrofolato reductasa (DHFR) en células CHO deficientes en DHFR, mediante el uso de niveles sucesivamente crecientes de metotrexato como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,889,803. El polipéptido obtenido puede estar en forma glicosilada.
Después de la introducción de uno o más vector(es), las células huésped se cultivan usualmente en un medio selectivo, que se selecciona para el crecimiento de células que contienen el vector. La purificación de las proteínas recombinantes puede llevarse a cabo por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica o descritos en este documento, por ejemplo, cualquier procedimiento convencional que implique extracción, precipitación, cromatografía y electroforesis. Un procedimiento de purificación adicional que puede usarse para purificar proteínas es la cromatografía de afinidad usando anticuerpos monoclonales que se unen a una proteína diana. Generalmente, las preparaciones brutas que contienen una proteína recombinante se hacen pasar a través de una columna sobre la cual se inmoviliza un anticuerpo monoclonal adecuado. La proteína generalmente se une a la columna a través del anticuerpo específico mientras las impurezas pasan. Después de lavar la columna, la proteína se eluye del gel cambiando el pH o la fuerza iónica, por ejemplo.
4.4. Ensayos para evaluar la actividad del polipéptido de fusión
Los ensayos descritos en este documento (véase el ejemplo 2) y los conocidos en la técnica se pueden utilizar para detectar la actividad de Klotho o FGF de los polipéptidos de fusión de la divulgación. Los ensayos de actividad apropiados incluyen ensayos de unión a receptores, ensayos de proliferación celular y ensayos de señalización celular. Por ejemplo, un ensayo de unión que puede usarse para determinar si un polipéptido de fusión tiene actividad de Klotho o FGF incluye, ensayar la unión de un polipéptido de fusión a un receptor de FGF. Los ensayos de unión al receptor de FGF incluyen, pero no se limitan a, ensayos tanto competitivos como no competitivos. Por ejemplo, la unión al receptor de FGF puede detectarse poniendo en contacto células que expresan un receptor de FGF con un FGF marcado (por ejemplo, marcador radioactivo) y concentraciones crecientes de un polipéptido de fusión de Klotho-FGF no marcado. Los dos ligandos que compiten por unirse al mismo receptor se añaden a una mezcla de reacción que contiene la célula. Las células se lavan posteriormente y se mide el FGF marcado. Una disminución de la cantidad de FGF marcado a su receptor en presencia del polipéptido de fusión no marcado es indicativa de la unión del polipéptido de fusión de Klotho-FGF al receptor. Alternativamente, el polipéptido de fusión de Klotho-FGF puede marcarse y se detecta la unión directa del polipéptido de fusión a la célula.
La actividad de Klotho o FGF también se puede medir determinando si la fusión polipéptido induce una respuesta celular. Por ejemplo, un ensayo para detectar la actividad biológica de un polipéptido de fusión de Klotho-FGF implica poner en contacto células que expresan un receptor de FGF con un polipéptido de fusión, ensayar una respuesta celular tal como, por ejemplo, proliferación celular o activación de Egr-1, En células C2C12, y comparando la respuesta celular en presencia y ausencia de la fusión polipéptido. Un aumento de la respuesta celular en presencia del complejo fusión polipéptido en relación con la ausencia indica que la fusión polipéptido tiene actividad biológica. También, un incremento en un evento de señalización aguas abajo del receptor también puede medirse como indicadores de actividad biológica (por ejemplo, fosforilación de FGFR, FRS2, ERK1/2, p70S6K, etc.).
4.5 Composiciones y tratamientos farmacéuticos
La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen uno o más polipéptidos de fusión de la invención y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir además una dosis farmacéuticamente eficaz de heparina. Tales composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un kit o recipiente. Dicho kit o recipiente puede ser empaquetado con instrucciones que pertenecen a la semivida in vivo extendida o a la vida útil in vitro de los polipéptidos de fusión. Opcionalmente asociado con dicho kit
o contenedor(es) puede haber un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que refleja la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta para la administración en humanos. Dichas composiciones se pueden utilizar en procedimientos de tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad o un síntoma de enfermedad (por ejemplo, afección relacionada con la edad o trastorno metabólico) en un paciente, preferiblemente un mamífero y lo más preferiblemente un ser humano, administrando la composición farmacéutica al paciente.
En general, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la invención es desde aproximadamente 0.0001 mg/kg a 0.001 mg/kg; 0.001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg peso corporal o desde aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg peso corporal. Comúnmente, una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de fusión es desde aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 0.01 mg, aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 100 mg, o desde aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1000 mg, por ejemplo. Preferiblemente, una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de fusión es desde aproximadamente 0.001 mg/kg a 2 mg/kg.
Las formulaciones farmacéuticas óptimas para un polipéptido de fusión pueden determinarse por uno de los expertos en el arte, dependiendo de la ruta de administración y la dosificación deseada. (Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa.).
imagen14
15
25
35
45
Los polipéptidos de fusión de la invención se pueden administrar como una composición farmacéutica que puede estar en forma de un sólido, líquido o gas (aerosol). Las rutas de administración típicas pueden incluir, sin limitación, oral, tópica, parenteral, sublingual, rectal, vaginal, intradérmica e intranasal. La administración parenteral incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, intraesternal o técnicas de infusión. Preferiblemente, las composiciones se administran parenteralmente. Más preferiblemente, las composiciones se administran intravenosamente. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse de manera que permitan que un polipéptido de la invención sea biodisponible tras la administración de la composición a un sujeto. Las composiciones pueden tomar la forma de una o más unidades de dosificación, donde, por ejemplo, un comprimido puede ser una unidad de dosificación única, y un recipiente de un polipéptido de la invención en forma de aerosol puede contener una pluralidad de unidades de dosificación.
Los materiales utilizados en la preparación de las composiciones farmacéuticas pueden ser no tóxicos en las cantidades usadas. Será evidente para los expertos en el arte que la dosificación óptima del(los) ingrediente(s) activo(s) en la composición farmacéutica dependerá de una diversidad de factores. Los factores relevantes incluyen, sin limitación, el tipo de sujeto (por ejemplo, humano), la salud general del sujeto, el tipo de afección relacionada con la edad o el trastorno metabólico del sujeto que necesita tratamiento, el uso de la composición como parte de un régimen de múltiples fármacos, la forma particular del polipéptido de la invención, la forma de administración y la composición empleada.
El portador farmacéuticamente aceptable o vehículo puede ser en partículas, por lo que las composiciones están, por ejemplo, en forma de comprimido o polvo. El o los portadores pueden ser líquidos, siendo las composiciones, por ejemplo, un jarabe oral o un lıquido inyectable. Además, el o los vehículos pueden ser gaseosos, con el fin de proporcionar una composición de aerosol útil, por ejemplo, en la administración por inhalación.
El término “vehículo” se refiere a un diluyente, adyuvante o excipiente, con el que se administra un polipéptido de la invención. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, incluyendo los de petróleo, origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. Los portadores pueden ser solución salina, goma arábiga, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, se pueden usar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. El agua es un portador particular cuando el polipéptido de la invención se administra intravenosamente. También se pueden emplear disoluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como vehículos líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos apropiados incluyen también excipientes tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada seca, glicerol, propileno, agua, etanol y similares. Las presentes composiciones, si se desea, pueden contener también cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores de pH.
La composición puede estar destinada a la administración oral y, en caso afirmativo, la composición está preferiblemente en forma sólida o líquida, en la que se incluyen formas semisólidas, semilíquidas, de suspensión y gel dentro de las formas consideradas en este documento como sólidas o líquidas.
Como composición sólida para administración oral, la composición puede formularse en polvo, gránulo, comprimido, píldora, cápsula, goma de mascar, oblea o forma similar. Dicha composición sólida por lo general contiene uno o más diluyentes inertes. Además, pueden estar presentes uno o más de los siguientes: aglutinantes tales como etilcelulosa, carboximetilcelulosa, celulosa microcristalina o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes desintegrantes tales como ácido algínico, alginato de sodio, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina, un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja, y un agente colorante.
Cuando la composición farmacéutica está en forma de una cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, puede contener, además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido tal como polietilenglicol, ciclodextrina o un aceite graso.
La composición farmacéutica puede estar en forma de un líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser útil para administración oral o para administración por inyección. Cuando está destinado a la administración oral, una composición puede contener uno o más de un agente edulcorante, conservantes, colorante y potenciador del sabor. En una composición para administración por inyección, también se pueden incluir uno o más de un surfactante, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, reguladores, estabilizador y agente isotónico.
Las composiciones líquidas de la invención, ya sean soluciones, suspensiones u otras formas similares, pueden incluir también uno o más de los siguientes: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, preferiblemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro sódico isotónico, aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, ciclodextrina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o
imagen15
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
metilparabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; soluciones reguladoras tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. Una composición parenteral puede encerrarse en una ampolla, una jeringuilla desechable o un vial de dosis múltiples hecho de vidrio, plástico u otro material. La solución salina fisiológica es un adyuvante específico particular. Preferiblemente, una composición inyectable es estéril.
Las composiciones farmacéuticas contienen una cantidad eficaz de un compuesto de la invención de tal manera que se obtendrá una dosificación adecuada. Las composiciones farmacéuticas pueden contener la cantidad eficaz conocida de los compuestos tal como se prescriben actualmente para sus trastornos respectivos.
La ruta de administración del polipéptido de la invención utilizada en los regímenes profilácticos y/o terapéuticos que serán eficaces en la prevención, tratamiento y/o manejo de una afección relacionada con la edad o desorden metabólico puede basarse en las rutas de administración actualmente prescritas para otros agentes terapéuticos conocidos en la técnica. Los polipéptidos de la invención se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.). La administración puede ser sistémica o local. Se conocen varios sistemas de suministro, por ejemplo, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etc., y pueden ser útiles para administrar un polipéptido de la invención. Se pueden administrar más de un polipéptido de la invención a un sujeto. Los métodos de administración pueden incluir, pero no se limitan a, administración oral y administración parenteral; la administración parenteral incluye, pero no limitado a vía intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, sublingual, intranasal, intracerebral, intraventricular, intratecal, intravaginal, transdérmica, rectal, por inhalación o por vía tópica a las orejas, nariz, ojos o piel.
Los polipéptidos de la invención se pueden administrar por vía parenteral. Específicamente, los polipéptidos de la invención se pueden administrar por vía intravenosa.
La administración pulmonar también se puede emplear, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente aerosolizante, o mediante la perfusión en un fluorocarbono o surfactante pulmonar sintético. Los polipéptidos de la invención también se pueden formular como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos.
Los polipéptidos de la invención se pueden administrar en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, se puede usar una bomba (véase CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 1987, 14, 201; Buchwald et al., Surgery 1980, 88: 507; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 1989, 321: 574). Los materiales poliméricos también se pueden usar para la liberación controlada de los polipéptidos de la invención (ver Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FL, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York, 1984; Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 1983, 23, 61; véase también Levy et al., Science 1985, 228, 190; During et al., Ann. Neurol., 1989, 25, 351; Howard et al., J. Neurosurg., 1989, 71, 105). Específicamente, se puede colocar un sistema de liberación controlada en la proximidad del objetivo de los polipéptidos de la invención, por ejemplo, el cerebro, requiriendo de este modo sólo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, 1984, pp. 115-138). Se pueden usar otros sistemas de liberación controlada discutidos en la revisión de Langer (Science 1990, 249, 1527-1533).
Los materiales poliméricos utilizados para conseguir la liberación controlada o sostenida de los polipéptidos de la invención se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 5,679,377; Patente de los Estados Unidos No. 5,916,597; Patente de los Estados Unidos No. 5,912,015; Patente de los Estados Unidos No. 5,989,463; Patente de los Estados Unidos No. 5,128,326; Publicación PCT No. WO 99/15154; y Publicación PCT No. WO 99/20253. Ejemplos de polímeros usados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero no se limitan a, poli (metacrilato de 2-hidroxietilo), poli (metacrilato de metilo), poli (ácido acrílico), poli (etileno-co-acetato de vinilo) poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli (N-vinilpirrolidona), poli (alcohol vinílico), poliacrilamida, poli (etilenglicol), polilactidos (PLA), poli (lactida-co-glicólidos) (PLGA) y Poliortoésteres. Preferiblemente, el polímero usado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas lixiviables, estable al almacenamiento, estéril y biodegradable.
En general, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la invención es desde aproximadamente 0.0001 mg/kg a 0.001 mg/kg; 0.001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg peso corporal o desde aproximadamente 0.02 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg peso corporal.
Un régimen profiláctico y/o terapéutico implica administrar a un paciente una o más dosis de una cantidad eficaz de un polipéptido de la invención, en donde la dosis de una cantidad eficaz alcanza un nivel en plasma de al menos
0.01 µg/mL a al menos 400 µg/mL del polipéptido de la invención.
Un régimen profiláctico y/o terapéutico puede implicar la administración a un paciente de una pluralidad de dosis de una cantidad eficaz de un polipéptido de la invención, en donde la pluralidad de dosis mantiene un nivel de plasma de al menos 0.01 µg/mL a 400 µg/mL del polipéptido de la invención. El régimen profiláctico y/o terapéutico se puede
imagen16
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
administrar durante al menos 1 día, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses o 9 meses.
El régimen profiláctico y/o terapéutico puede implicar la administración de un polipéptido de la invención en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Las dosis recomendadas de uno o más terapéuticas actualmente utilizadas para la prevención, tratamiento y/o manejo de una afección relacionada con la edad o trastorno metabólico puede obtenerse a partir de cualquier referencia en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, Hardman et al., eds., Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, 2001; Physician’s Desk Reference (60th ed., 2006). La invención además incluye las proteínas de fusión o la composición farmacéutica de la invención para uso en terapia o como medicamento para el tratamiento de un trastorno patológico en el que es deseable la actividad agonística de la proteína Klotho y el FGF, incluyendo, pero no limitándose a afección relacionada con la edad o trastornos metabólicos. La invención incluye proteínas de fusión inventivas o composición farmacéutica para uso en terapia o como medicamento para tratar o prevenir una afección relacionada con la edad en un individuo. Las afecciones relacionadas con la edad incluyen sarcopenia, atrofia de la piel, desgaste muscular, atrofia cerebral, aterosclerosis, arteriosclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, hipertensión arterial, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, cáncer de próstata, accidente cerebrovascular, disminución de la esperanza de vida, pérdida de memoria, arrugas, deterioro de la función renal y pérdida auditiva relacionada con la edad. La invención también se refiere a proteínas de fusión de la invención o una composición farmacéutica para uso en terapia o como medicamento para tratar o prevenir el trastorno metabólico en un individuo. La invención también proporciona proteínas de fusión inventivas o composición farmacéutica para uso en terapia o como medicamento para tratar o prevenir la hiperfosfatemia o calcinosis en un individuo. La invención también se refiere a proteínas de fusión inventivas o composición farmacéutica para uso en terapia o como medicamento para tratar o prevenir la enfermedad renal crónica o la insuficiencia renal crónica en un individuo. La invención también incluye proteínas de fusión de la invención o composición farmacéutica para uso en terapia o como medicamento para tratar o prevenir el cáncer en un individuo. Las composiciones de polipéptido de fusión se pueden administrar según cualquier método de administración conocido por los expertos en el arte y descrito en este documento. Los métodos específicos de administración específicos incluyen subcutánea o intravenosa. En este documento se describen otros modos de administración eficaces.
4.6. Tratamientos y ensayos para evaluar la eficacia
Ambos FGF23 o Klotho en ratones con deficiencia genética muestran una variedad de fenotipos similares, incluyendo baja actividad física, retardo del crecimiento, desgaste muscular, atrofia de la piel, aterosclerosis, períodos de vida cortos, etc. (Véase Razzaque and Lanske, J. of Endrocrinology, 194:1-10(2007).
En particular, los polipéptidos de fusión de la invención son particularmente útiles en el tratamiento de trastornos relacionados con el envejecimiento, incluyendo el desgaste muscular. Sin estar ligado a la teoría, la capacidad de Klotho y FGF23 para controlar la homeostasis mineral (por ejemplo, fosfato y calcio) y vitamina D puede ser el medio por el cual estas proteínas modulan el envejecimiento y la atrofia muscular.
Se ha demostrado que Beta-Klotho y FGF19 controlan la homeostasis de los ácidos biliares mediante la regulación del colesterol 7-α-hidroxilasa (CYP7A1). Un ejemplo no limitante de trastorno de la homeostasis biliar es la colestasis. Se ha demostrado que el beta-Klotho y el FGF21 inducen la lipólisis en los adipocitos y, por tanto, reducen el almacenamiento de grasa y aumentan la captación de glucosa. Ejemplos no limitativos de trastornos de lipólisis/almacenamiento de grasa son obesidad y enfermedades metabólicas y cardiovasculares asociadas.
Basándose al menos en parte en el hallazgo de que FGF23 es capaz de estimular la excreción de fosfato en la orina y por lo tanto reducir los niveles de fosfato en el suero, los polipéptidos de fusión de Klotho-FGF23 de la divulgación se pueden utilizar para tratar o prevenir la hiperfosfatemia o calcinosis en un individuo. Por ejemplo, se ha demostrado que una mutación homocigótica errónea en Klotho que resulta en una deficiencia en Klotho en un paciente puede causar calcinosis tumoral severa y calcificación de arteria (Ichikawa et al., J. Clin. Invest. 117:26842691 (2007).
Se ha demostrado que la expresión de Klotho se reduce en el riñón de los pacientes con insuficiencia renal crónica, comparada con la de los riñones no afectados (Koh et al., Biochem. Biophys. Res. Comn. 280:1015-1020 (2001)).
Se ha demostrado que la expresión de Klotho se reduce en el tejido del cáncer de mama, en comparación con el tejido normal del cáncer de mama (Wolf et al., Oncogene (2008) advance online publication).
Los métodos para evaluar la eficacia y/o la determinación de la dosis eficaz de un polipéptido de fusión de Klotho en un trastorno relacionado con la edad o trastorno metabólico incluyen ensayos basados en organismos, por ejemplo, utilizando un mamífero (por ejemplo, ratón, rata, primate o algún otro no-humano), u otro animal (por ejemplo, Xenopus, pez cebra, o un invertebrado tal como una mosca o un nematodo). La fusión de polipéptido Klotho se puede administrar al organismo una vez o como un régimen (regular o irregular). A continuación, se mide un parámetro del organismo, por ejemplo, un parámetro asociado a la edad. Los polipéptidos de fusión de Klotho que
imagen17
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
son de interés dan como resultado un cambio en el parámetro relativo a una referencia, por ejemplo, un parámetro de un organismo de control. También se pueden evaluar otros parámetros (por ejemplo, relacionados con toxicidad, eliminación y farmacocinética).
El polipéptido de fusión de Klotho puede evaluarse utilizando un animal que tiene un trastorno particular, por ejemplo, un trastorno descrito en este documento, por ejemplo, un trastorno relacionado con la edad, un trastorno metabólico. Estos trastornos también pueden proporcionar un sistema sensibilizado en el que se pueden observar los efectos del polipéptido en la fisiología. Los trastornos de ejemplo incluyen: denervación, atrofia de desuso; Trastornos metabólicos (p. Ej., trastorno de animales obesos y/o diabéticos tales como ratón db/db y ratón ob/ob); isquemia cerebral, hepática; Modelos cisplatino/taxol/vincristina; trasplantes de varios tejidos (xenografía); modelos óseos transgénicos; síndromes de dolor (incluyen trastornos inflamatorios y neuropáticos); modelos de estrés paraquat, genotóxico y de estrés oxidativo; y los modelos de tumor I.
Para medir un trastorno relacionado con la edad, el modelo animal puede ser un animal que tiene un fenotipo alterado cuando está restringido caloricamente. Por ejemplo, las ratas F344 proporcionan un sistema de ensayo útil para evaluar un polipéptido de fusión Klotho. Cuando están restringidas caloricamente, las ratas F344 tienen una incidencia de 0 a 10% de nefropatía. Sin embargo, cuando se alimentan ad libitum, tienen una incidencia del 60 al 100% de nefropatía.
Para evaluar un polipéptido de fusión Klotho, se administra al animal (por ejemplo, una rata F344 u otro animal adecuado) y se mide un parámetro del animal, por ejemplo, después de un período de tiempo. El animal puede ser alimentado ad libitum o normalmente (por ejemplo, no bajo restricción calórica, aunque algunos parámetros pueden evaluarse bajo tales condiciones). Por lo general, se utiliza una cohorte de tales animales para el ensayo. Generalmente, un polipéptido de prueba puede indicarse como alterando favorablemente la regulación de la vida útil en el animal si el polipéptido de prueba afecta al parámetro en la dirección del fenotipo de un animal similar sujeto a restricción calórica. Tales polipéptidos de prueba pueden causar al menos algunos de los efectos reguladores de la duración de la vida de la restricción calórica, por ejemplo, un subconjunto de tales efectos, sin tener que privar al organismo de la ingesta calórica.
El parámetro a ensayar puede ser un parámetro asociado a la edad o asociado a la enfermedad, por ejemplo, un síntoma del trastorno asociado con el modelo animal. Por ejemplo, el polipéptido de ensayo puede administrarse a una rata SH, y se monitoriza la presión sanguínea. Un polipéptido de prueba que se indica favorablemente puede provocar una mejoría del síntoma con respecto a un animal de referencia similar no tratado con el polipéptido. Otros parámetros relevantes para un trastorno o para el envejecimiento pueden incluir: niveles de antioxidantes (por ejemplo, niveles o actividad de las enzimas antioxidantes), resistencia al estrés (por ejemplo, resistencia al paraquat), temperatura corporal central, niveles de glucosa, niveles de insulina, niveles de hormona estimulante tiroidea, niveles de prolactina, y niveles de hormona leutinizante.
Para medir la efectividad de los polipéptidos de la invención para tratar un trastorno relacionado con la edad, puede usarse un animal que tiene una expresión reducida de Klotho, por ejemplo, ratón con un Klotho mutante; véase Kuroo, et al. Nature, 390; 45 (1997) y U.S. Pub. No. 2003/0119910. Por ejemplo, se administra la prueba polipéptido al ratón mutante y se monitorizan los parámetros relacionados con la edad. Un polipéptido de prueba que se indica favorablemente puede provocar una mejoría del síntoma con respecto a un animal de referencia similar no tratado con el polipéptido. Un parámetro relevante para un trastorno metabólico o para el envejecimiento puede evaluarse mediante la medición del peso corporal, el examen de la adquisición de capacidad reproductora, la medición del nivel de azúcar en sangre, la observación de la vida, la observación de la piel, y similares. La evaluación también se puede realizar midiendo el peso del timo, observando el tamaño de los nódulos calcificados formados en la superficie interna de las cavidades torácicas y similares. Además, la determinación cuantitativa de ARNm para el gen Klotho o la proteína Klotho también es útil para la evaluación.
Todavía otros modelos in vivo y ensayos de organismo incluyen la evaluación de un animal para un parámetro metabólico, por ejemplo, un parámetro relevante para un trastorno de insulina, diabetes de tipo II. Ejemplos de parámetros metabólicos incluyen: concentración de glucosa, concentración de insulina y sensibilidad a la insulina.
Otro ejemplo de sistema presenta tumores, por ejemplo, en un modelo animal. Los tumores pueden ser espontáneos
o inducidos. Por ejemplo, los tumores se pueden desarrollar a partir de células que tienen una variedad de constituciones genéticas, por ejemplo, pueden ser p53+ o p53-. También es posible utilizar organismos con un trastorno autoinmune, por ejemplo, un ratón NZB, que está predispuesto a SLE. Para evaluar las características de la enfermedad ósea, es posible, por ejemplo, utilizar un animal que tiene una ovariectomía como modelo, por ejemplo, para la osteoporosis. De manera similar, para la enfermedad de las articulaciones, el modelo puede estar basado en artritis adyuvante (por ejemplo, los ratones pueden inmunizarse con proteoglicanos de cartílago, proteínas de grupo de alta movilidad, material de pared de células estreptocócicas o colágenos); Para enfermedad renal, se pueden usar ratones kd/kd. Modelos animales de cognición, particularmente el aprendizaje y la memoria también están disponibles. Modelos animales de diabetes y sus complicaciones también están disponibles, por ejemplo, el modelo de estreptozotocina. Los modelos caninos se pueden utilizar, por ejemplo, para evaluar el accidente cerebrovascular y la isquemia.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Al evaluar si una prueba de polipéptido es capaz de alterar la regulación de la duración de la vida, una serie de parámetros asociados a la edad o biomarcadores pueden ser monitoreados o evaluados. Ejemplo de parámetros asociados a la edad incluyen: (i) vida útil de la célula o el organismo; (ii) presencia o abundancia de un transcrito genético o producto génico en la célula u organismo que tiene un patrón de expresión dependiente de la edad biológica; (iii) resistencia de la célula u organismo al estrés; iv) uno o más parámetros metabólicos de la célula o del organismo (por ejemplo, los parámetros incluyen los niveles circulantes de insulina, los niveles de glucosa en sangre, el contenido de grasa, la temperatura corporal central y demás); (v) capacidad proliferativa de la célula o un conjunto de células presentes en el organismo; y (vi) apariencia física o comportamiento de la célula u organismo.
El término "esperanza de semivida" se refiere al promedio de la edad de muerte de una cohorte de organismos. En algunos casos, la "esperanza de semivida" se mide utilizando una cohorte de organismos genéticamente idénticos bajo condiciones ambientales controladas. Se descartan las muertes por accidente. Cuando la duración semivida no puede determinarse (por ejemplo, para seres humanos) en condiciones ambientales controladas, puede utilizarse información estadística fiable (por ejemplo, de tablas actuariales) para una población suficientemente grande como la duración semivida.
La caracterización de las diferencias moleculares entre dos organismos tales, por ejemplo, un organismo de referencia y un organismo tratado con un polipéptido de fusión Klotho puede revelar una diferencia en el estado fisiológico de los organismos. El organismo de referencia y el organismo tratado tienen por lo general la misma edad cronológica. El término "edad cronológica" como se utiliza en este documento se refiere al tiempo transcurrido desde un evento preseleccionado, tal como la concepción, una etapa embriológica o fetal definida, o, más preferiblemente, el nacimiento. Se puede usar una variedad de criterios para determinar si los organismos tienen la misma edad cronológica para el análisis comparativo. Por lo general, el grado de precisión requerido es una función de la semivida de un organismo de tipo salvaje. Por ejemplo, para el nematodo C. elegans, para el cual la cepa de laboratorio de tipo salvaje N2 vive un promedio de aproximadamente 16 días en algunas condiciones controladas, los organismos de la misma edad pueden haber vivido durante el mismo número de días. Para los ratones, un organismo de la misma edad puede haber vivido durante el mismo número de semanas o meses; Para primates o seres humanos, el mismo número de años (o dentro de 2, 3 o 5 años); Etcétera. En general, los organismos de la misma edad cronológica pueden haber vivido durante un período de tiempo dentro de los 15, 10, 5, 3, 2 o 1% de la semivida de un organismo de tipo salvaje de esa especie. Preferentemente, los organismos son organismos adultos, por ejemplo, los organismos han vivido durante al menos una cantidad de tiempo en la que el organismo de tipo salvaje medio ha madurado hasta una edad en la que es capaz de reproducirse.
El ensayo de detección de organismos puede realizarse antes de que los organismos exhiban características físicas manifiestas del envejecimiento. Por ejemplo, los organismos pueden ser adultos que han vivido sólo 10, 30, 40, 50, 60, o 70% de la semivida de un organismo de tipo salvaje de la misma especie. Se han reportado cambios asociados con la edad en el metabolismo, competencia inmune y estructura cromosómica. Cualquiera de estos cambios se puede evaluar, ya sea en un sujeto de prueba (por ejemplo, para un ensayo basado en un organismo), o para un paciente (por ejemplo, antes, durante o después del tratamiento con un terapéutico descrito en el presente documento.
También se puede evaluar un marcador asociado con restricción calórica en un organismo sujeto de un ensayo de detección (o un sujeto tratado). Aunque estos marcadores pueden no estar asociados con la edad, pueden ser indicativos de un estado fisiológico que se altera cuando se modula la vía de Klotho. El marcador puede ser un ARNm o una proteína cuya abundancia cambia en animales con restricción calórica. WO01/12851 y la Patente de los Estados Unidos No. 6,406,853 describen marcadores de ejemplo. Los modelos celulares derivados de células de un animal descritos en este documento o análogos a un modelo animal en este documento descrito se pueden utilizar para un ensayo basado en células.
Los modelos para evaluar el efecto de un polipéptido de prueba sobre la atrofia muscular incluyen: 1) la pérdida de masa del músculo gastrocnemio medial de la rata que resulta de la desnervación, por ejemplo, cortando el nervio ciático derecho a mitad del muslo; 2) la pérdida de masa del músculo gastrocnemio medial de la rata resultante de la inmovilización, por ejemplo, mediante la fijación de la articulación derecha del tobillo a 90 grados de flexión; 3) pérdida de masa del músculo gastrocnemio medial de la rata resultante de la suspensión de la extremidad posterior; (Véase, por ejemplo, US 2003-0129686); 4) atrofia del músculo esquelético resultante del tratamiento con la citocina caquéctica, interleucina-1 (IL-1) (R. N. Cooney, S. R. Kimball, T. C. Vary, Shock 7, 1-16 (1997)); y 5) atrofia del músculo esquelético resultante del tratamiento con el glucocorticoide, dexametasona (A. L. Goldberg, J. Biol. Chem. 244, 3223-9 (1969).)
Ejemplos de modelos animales para AMD incluyen: modelo de ratón inducido por láser que simula la degeneración macular exudativa (húmeda) Bora et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 100:2679-84 (2003); un ratón transgénico que expresa una forma mutada de catepsina D que da como resultado características asociadas con la forma de AMR de "atrofia geográfica" (Rakoczy et al., Am. J. Pathol., 161:1515-24 (2002)); y un ratón transgénico que expresa VEGF en el epitelio pigmentario de la retina dando como resultado CNV. Schwesinger et al., Am. J. Pathol. 158:1161-72 (2001).
imagen18
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ejemplos de modelos animales de la enfermedad de Parkinson incluyen primates descritos con Parkinson por tratamiento con la neurotoxina dopaminérgica 1-etil-4 fenil 1, 2, 3,6-tetrahidropiridina (MPTP) (véase, por ejemplo, la Publicación de la Patente de los Estados Unidos No. 20030055231 y Wichmann et al., Ann. NY Acad. Sci., 991: 199213 (2003), ratas lesionadas con 6-hidroxidopamina (por ejemplo, Lab. Anim. Sci., 49: 363-71 (1999)) y modelos de invertebrados transgénicos (por ejemplo, Lakso et al., J. Neurochem. 86:165-72 (2003) y Link, Mech. Ageing Dev., 122:1639-49 (2001)).
Ejemplos de modelos moleculares de diabetes tipo II incluyen: un ratón transgénico que tiene Nkx-2.2 defectuoso o Nkx-6.1; (Patente de los Estados Unidos No. 6,127,598); rata Zucker Diabéticos Fatty fa/fa (ZDF). (Patente de los Estados Unidos No. 6,569,832); y monos Rhesus, que desarrollan espontáneamente obesidad y posteriormente progresan frecuentemente a diabetes tipo 2 abierta (Hotta et al., Diabetes, 50: 1126-33 (2001), y un ratón transgénico con un receptor IGF-I negativo dominante (KR-IGF -IR) que tiene resistencia a la insulina similar a la diabetes tipo 2.
Ejemplos de modelos animales y celulares para neuropatía incluyen: neuropatía sensorial-motora inducida por vincristina en ratones (Patente de los Estados Unidos No. 5,420,112) o conejos (Ogawa et al., Neurotoxicology, 21: 501-11 (2000)); Una rata diabética por estreptozotocina (STZ) para el estudio de la neuropatía autonómica (Schmidt et al., Am. J. Pathol., 163: 21-8 (2003)); y un ratón con neuropatía motora progresiva (pmn) (Martin et al., Genomics,
75: 9 -16 (2001)).
Ejemplos de modelos animales de hiperfosfatemia o calcinosis tumoral incluyen ratones con modificaicón genética Klotho y ratones con modificación genética FGF23 (Yoshida et al., Endocrinology 143: 683-689 (2002)).
Ejemplos de modelos animales de enfermedad renal crónica o insuficiencia renal crónica incluyen ratones COL4A3+/-(Beirowski et al., J. Am. Soc. Nephrol. 17:1986-1994 (2006)).
Ejemplos de modelos animales de cáncer incluyen el trasplante o la implantación de células o tejido de cáncer en ratones desnudos, como se conoce en la técnica (Giovanella et al., Adv. Cancer Res. 44: 69-120 (1985)). Por ejemplo, modelos animales de cáncer de mama incluyen ratones desnudos trasplantados o implantados con células
o tejidos de cáncer de mama (por ejemplo, Yue et al., Cancer Res. 54:5092-5095 (1994); Glinsky et al., Cancer Res. 56:5319-5324 (1996); Visonneau Am. J. Path. 152:1299-1311 (1998)).
Las composiciones se pueden administrar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto adulto, particularmente un sujeto adulto sano o un sujeto que tiene una enfermedad relacionada con la edad. En este último caso, el método puede incluir la evaluación de un sujeto, por ejemplo, para caracterizar un síntoma de una enfermedad relacionada con la edad u otro marcador de enfermedad, e identificar así un sujeto que tiene una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, Alzheimer o una enfermedad relacionada con la edad o estar predispuestos a tal enfermedad.
Atrofia del músculo esquelético
La atrofia muscular incluye numerosas enfermedades neuromusculares, metabólicas, inmunológicas y neurológicas, así como el hambre, la deficiencia nutricional, el estrés metabólico, la diabetes, el envejecimiento, la distrofia muscular o la miopatía. La atrofia muscular se produce durante el proceso de envejecimiento. La atrofia muscular también es el resultado de la reducción del uso o el desuso del músculo. Los síntomas incluyen una disminución en la masa del tejido muscular esquelético. En los machos humanos, la masa muscular disminuye en un tercio entre las edades de 50 y 80. Algunas características moleculares de la atrofia muscular incluyen la regulación positiva de ubiquitina ligasas y la pérdida de proteínas miofibrilares (Furuno et al., J. Biol. Chem., 265:8550-8557, 1990). La descomposición de estas proteínas puede ser seguida, por ejemplo, midiendo la producción de 3-metil-histidina, que es un constituyente específico de la actina y en ciertos músculos de la miosina (Goodman, Biochem. J. 241:121-12, 1987 and Lowell, et al., Metabolism, 35:1121-112, 1986; Stein and Schluter, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 272: E688-E696, 1997). La liberación de creatina quinasa (marcador de daño celular) (Jackson, et al., Neurology, 41: 101, 104, 1991) también puede ser indicativa.
Diabetes no insulino-dependiente
Non-insulin-dependent Diabetes
La diabetes no insulino-dependiente también se conoce como diabetes de "inicio adulto" y diabetes tipo 2. La diabetes tipo 2 también incluye "no obesos tipo 2" y "obesos tipo 2." La diabetes tipo II se puede caracterizar por: (1) reducción de la secreción de insulina pancreática-islote de insulina de manera que se producen cantidades de insulina inferiores a las necesarias para mantener los niveles de glucosa en sangre en equilibrio y/o (2) “resistencia a la insulina” donde el cuerpo no responde normalmente a la insulina. (Patente de los Estados Unidos No. 5,266,561 y Patente de los Estados Unidos No. 6,518,069). Por ejemplo, los niveles de insulina estimulados con glucosa por lo general no se elevan por encima de 4,0 nmol/l. (Patente de los Estados Unidos No. 5,266,561). Los ejemplos de síntomas de la diabetes de tipo II incluyen: hiperglucemia mientras ayuna (Patente de los Estados Unidos No.
imagen19
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
5,266,561); fatiga; sed excesiva; micción frecuente; visión borrosa; y un aumento de la tasa de infecciones. Las indicaciones moleculares de la diabetes tipo II incluyen la deposición de amiloide de islote en los páncreas.
Neuropatía
La neuropatía puede incluir una disfunción central y/o nerviosa periférica causada por una enfermedad sistémica, una condición hereditaria o un agente tóxico que afecte a los nervios motores, sensoriales, sensorimotores o autónomos. (Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20030013771). Los síntomas pueden variar dependiendo de la causa del daño del nervio y de los tipos particulares de nervios afectados. Por ejemplo, los síntomas de neuropatía motora incluyen torpeza en la realización de tareas físicas o como debilidad muscular, agotamiento después de un esfuerzo menor, dificultad para pararse o caminar y atenuación o ausencia de un reflejo neuromuscular. (Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20030013771), los síntomas de neuropatía autonómica incluyen estreñimiento, irregularidades cardiacas y atenuación del reflejo postural hipotensivo. (Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 20030013771), los síntomas de neuropatía sensorial incluyen dolor y entumecimiento; hormigueo en las manos, piernas o pies; y sensibilidad extrema al tacto, y los síntomas de la retinopatía incluyen visión borrosa, pérdida repentina de la visión, puntos negros, y luces que destellan.
Enfermedad de Alzheimer
La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa compleja que resulta en la pérdida irreversible de neuronas. Proporciona sólo un ejemplo de una enfermedad neurodegenerativa que también es una afección relacionada con la edad. Las características clínicas de la enfermedad de Alzheimer incluyen el deterioro progresivo de la memoria, el juicio, la orientación al entorno físico y el lenguaje. Las características neuropatológicas de AD incluyen pérdida neuronal específica de la región, placas amiloides y enredos neurofibrilares. Las placas amiloides son placas extracelulares que contienen el péptido amiloide (también conocido como Ap o Ap42), que es un producto de escisión de la proteína precursora 8-amiloide (también conocida como APP). Los enredos neurofibrilares son agregados intracelulares insolubles compuestos de filamentos de la proteína anormalmente hiperfosforilada asociada a microtúbulos, placas tensas de Amiloide y enredos neurofibrilares pueden contribuir a eventos secundarios que conducen a pérdida neuronal por apoptosis (Clark and Karlawish, Ann. Intern. Med. 138(5):400-410 (2003). Por ejemplo, el p-amiloide induce la apoptosis dependiente de caspasa-2 en neuronas cultivadas (Troy et al., J. Neurosci., 20 (4): 1386-1392.) La deposición de placas in vivo puede desencadenar la apoptosis de las neuronas proximales de una manera similar.
Se puede usar una variedad de criterios, incluyendo criterios genéticos, bioquímicos, fisiológicos y cognitivos, para evaluar la AD en un sujeto. Los médicos conocen los síntomas y el diagnóstico de la AD. A continuación, se presentan algunos ejemplos de síntomas y marcadores de AD. La información acerca de estas indicaciones y otras indicaciones que se sabe están asociadas con la AD se puede utilizar como un "parámetro relacionado con AD". Un parámetro relacionado con AD puede incluir información cualitativa o cuantitativa. Un ejemplo de información cuantitativa es un valor numérico de una o más dimensiones, por ejemplo, una concentración de una proteína o un mapa tomográfico. La información cualitativa puede incluir una evaluación, por ejemplo, los comentarios de un médico o un binario (“sí"/"no") y así sucesivamente. Un parámetro relacionado con AD incluye información que indica que el sujeto no ha sido diagnosticado con AD o no tiene una indicación particular de AD, por ejemplo, un resultado de prueba cognitiva que no es típico de AD o un polimorfismo genético de APOE no asociado con AD.
El deterioro cognitivo progresivo es un sello distintivo de la AD. Este deterioro puede presentarse como una disminución en la memoria, el juicio, la toma de decisiones, la orientación al entorno físico y el lenguaje (Nussbaum and Ellis, New Eng. J. Med. 348 (14): 1356 35 1364 (2003)). La exclusión de otras formas de demencia puede ayudar a hacer un diagnóstico de la AD. La muerte neuronal conduce a una atrofia cerebral progresiva en pacientes con AD. Se pueden usar técnicas de formación de imágenes (por ejemplo, imágenes por resonancia magnética o tomografía computarizada) para detectar lesiones asociadas con AD en la atrofia cerebral y/o cerebral.
Los pacientes con AD pueden presentar anomalías bioquímicas que resultan de la patología de la enfermedad. Por ejemplo, los niveles de proteína bronceada en el líquido cefalorraquídeo están elevados en pacientes con AD (Andreasen, N. et al. Arch Neurol. 58:349-350 (2001)).
Los niveles de péptido amiloide beta 42 (A, B42) pueden reducirse en el LCR de pacientes con AD. Los niveles de Ap42 pueden aumentarse en el plasma de pacientes con AD (Ertekein-Taner, N., et al. Science 290:2303 2304 (2000)). Las técnicas para detectar anormalidades bioquímicas en una muestra de un sujeto incluyen métodos celulares, inmunológicos y otros métodos biológicos conocidos en la técnica. Para una orientación general, véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3r Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1989), (Harrow, E. and Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), y sus ediciones actualizadas.
imagen20
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos, otras inmunoglobulinas y otros ligandos de unión específicos para detectar una biomolécula, por ejemplo, una proteína u otro antígeno asociado con AD. Por ejemplo, se pueden usar uno o más anticuerpos específicos para sondear una muestra. Son posibles diversos formatos, por ejemplo, ELISA, ensayos basados en fluorescencia, transferencias de Western y conjuntos de proteínas. Métodos de producción de matrices de polipéptidos se describen en la técnica, por ejemplo, en De Wildt et al. (2000). Nature Biotech. 18, 989994; Lucking et al. (1999). Anal. Biochem. 270, 103-111; Ge, H. (2000). Nucleic Acids Res. 28, e3, IVII; MacBeath, G., and Schreiber, S.L. (2000). Science 289, 1760 to 1 763; y WO 99/5 1 773A1.
En un ensayo, se utiliza un modelo animal no humano de AD (por ejemplo, un modelo ratón), por ejemplo, para evaluar un polipéptido o un régimen terapéutico. Por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,509,515 describe uno de tales animales modelo que naturalmente puede ser utilizado con ensayos de aprendizaje y memoria. El animal expresa una secuencia de proteína precursora amiloide (APP) a un nivel en tejidos cerebrales de tal manera que el animal desarrolla un trastorno necrológico progresivo en un corto período de tiempo desde el nacimiento, generalmente dentro de un año desde el nacimiento, preferiblemente dentro de 2 a 6 meses, desde nacimiento. La secuencia de la proteína APP se introduce en el animal, o en un antepasado del animal, en una etapa embrionaria, preferiblemente en una etapa celular, u ovocito fecundado, y generalmente no más tarde de aproximadamente la etapa de 8 células. El zigoto o embrión se desarrolla a término en una hembra pseudoembarazada. Los genes de la proteína precursora amiloide se introducen en un embrión animal de modo que se incorporen cromosómicamente en un estado que da como resultado una expresión súper endógena de la proteína precursora amiloide y el desarrollo de una enfermedad necrológica progresiva en las áreas cortico-límbicas del cerebro, Áreas del cerebro son prominentemente afectadas en estados de enfermedad necrológica progresiva como la AD. La gliosis y manifestaciones clínicas en animales transgénicos afectados modelan la enfermedad necrológica. Los aspectos progresivos de la enfermedad neurológica se caracterizan por la disminución del comportamiento exploratorio y/o locomotor y la disminución de la absorción/utilización de desoxiglucosa y la gliosis hipertrófica en las regiones cortico-límbicas del cerebro. Además, los cambios que se observan son similares a los que se observan en algunos animales envejecidos. Otros modelos animales también se describen en US 5,387,742; 5,877,399; 6,358,752; y 6, 187,992.
Enfermedad de Parkinson
La enfermedad de Parkinson incluye neurodegeneración de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra resultando en la degeneración del sistema de dopamina nigroestriatal que regula la función motora. Esta patología, a su vez, conduce a disfunciones motrices (véase, por ejemplo, Lotharius et al., Nat. Rev. Neurosci., 3:932-42 (2002)). Ejemplos de síntomas motores incluyen: acinesia, postura encorvada, dificultad de andar, inestabilidad postural, catalepsia, rigidez muscular y temblor. Ejemplos de síntomas no motores incluyen: depresión, falta de motivación, pasividad, demencia y disfunción gastrointestinal (véase, por ejemplo, Fahn, Ann. N.Y. Acad. Sci., 991:1-14 (2003) y Pfeiffer, Lancet Neurol., 2:107-16 (2003)). El Parkinson se ha observado en el 0.5 al 1 por ciento de las personas de 65 a 69 años de edad y del 1 al 3 por ciento entre las personas de 80 años de edad y mayores. (Véase, por ejemplo, Nussbaum et al., N. Engl. J. Med., 348:1356-64 (2003)). Los marcadores moleculares de la enfermedad de Parkinson incluyen la reducción de L aminoácido descarboxilasa aromático (AADC) (véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los Estados Unidos. No. 20020172664); y pérdida de contenido de dopamina en las neuronas nigroestriales (véase, por ejemplo, Fahn, Ann. N.Y. Acad. Sci., 991:1-14 (2003) y Lotharius et al., Nat. Rev. Neurosci., 3:932-42 (2002)). En algunos casos familiares, la EP está ligada a mutaciones en genes únicos que codifican la alfa-sinucleína y la parkina (una proteína E3 ubiquitina ligasa). (Por ejemplo, Riess et al., J. Neurol. 250 Suppl. 1: I3 10 (2003) y Nussbaum et al., N. Engl. J. Med., 348: 1356-64 (2003)). Una mutación de aminoácido en una neurona específica C-terminal gen ubiquitin hidrolasa también se asocia con el Parkinson. (Por ejemplo, Nussbaum et al., N. Engl. J. Med., 348:1356-64 (2003))
Enfermedad de Huntington
Los métodos para evaluar la eficacia y/o determinar la dosis eficaz de un polipéptido de fusión Klotho en la enfermedad de Huntington incluyen ensayos basados en organismos, por ejemplo, usando un mamífero (por ejemplo, un ratón, rata, primate u otro no humano), u otro animal (por ejemplo, Xenopus, pez cebra, o un invertebrado tal como una mosca o un nematodo). Existen varios sistemas de modelos animales para la enfermedad de Huntington. Véase, por ejemplo, Brouillet, Functional Neurology 15(4): 239-251 (2000); Ona et al. Nature 399: 263-267 (1999), Bates et al. Hum Mol Genet. 6(10):1633-7 (1997); Hansson et al. J. of Neurochemistry 78: 694-703; y Rubinsztein, D. C., Trends in Genetics, Vol. IS, No. 4, pp. 202-209 (una revisión sobre diversos modelos animales y no humanos de HD)
Un ejemplo de dicho modelo animal es la cepa transgénica ratón es la línea R6/2 (Mangiarini et al. Cell 87:493-506 (1996)). Los ratones R6/2 son ratones transgénicos de la enfermedad de Huntington, que sobreexpresan el exón 1 del gen humano HD (bajo el control del promotor endógeno). El exón 1 del gen R6/2 humano con la HD tiene una extensión CAG/poliglutina repetir longitudes (150 CAG repite en promedio). Estos ratones desarrollan una enfermedad neurológica progresiva, en última instancia fatal, con muchas características de la enfermedad de Huntington humana. Se observan agregados anormales, constituidos en parte por la parte N terminal de Huntingtin (codificada por HD exón 1), en ratones R6/2, ambos 45 en el citoplasma y núcleos de células (Davies et al., Cell 90:
imagen21
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
537-548 1997)). Por ejemplo, la proteína Huntingtin humana en el animal transgénico está codificada por un gen que incluye al menos 55 repeticiones CAG y más preferiblemente aproximadamente 150 repeticiones CAG. Estos animales transgénicos pueden desarrollar un fenotipo similar a la enfermedad de Huntington.
Estos ratones transgénicos se caracterizan por un aumento de peso reducido, una vida útil reducida y un deterioro motriz caracterizados por una marcha anormal, un temblor en reposo, un agarre en los miembros posteriores y una hiperactividad de 8 a 10 semanas después del nacimiento (por ejemplo, la cepa R6/2, Mangiarini et al. Cell 87: 493506 (1996)). El fenotipo empeora progresivamente hacia la hipocinesia. Los cerebros de estos ratones transgénicos también demuestran anomalías neuroquímicas e histológicas, tales como cambios en los receptores de neurotransmisores (glutamato, dopaminérgico), disminución de la concentración de N-acetilaspartato (un marcador de integridad neuronal) y estriado reducido y tamaño del cerebro. En consecuencia, la evaluación puede incluir la evaluación de parámetros relacionados con los niveles de neurotransmisores, los niveles de receptores de neurotransmisores, el tamaño del cerebro y el tamaño del cuerpo estriado. Además, se encuentran presentes en el tejido cerebral de estos animales agregados anormales que contienen la parte transgénica de la proteína Huntingtin humana o la proteína de Huntingtin de longitud completa (por ejemplo, la cepa ratón transgénico R6/2). Véase, por ejemplo, Mangiarini et al. Cell 87: 493-506 (1996), Davies et al. Cell 90: 537-548 (1997), Brouillet, Functional Neurology 15(4): 239-251 (2000) y Cha et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6480-6485 (1998).
Para probar el efecto del polipéptido o polipéptido conocido descrito en la aplicación en un modelo animal, se administran diferentes concentraciones de polipéptido de ensayo al animal transgénico, por ejemplo, inyectando el polipéptido de prueba en la circulación del animal. Un síntoma similar a la enfermedad de Huntington puede evaluarse en el animal. La progresión de los síntomas similares a la enfermedad de Huntington, por ejemplo, como se describió anteriormente para el modelo ratón, se monitoriza a continuación para determinar si el tratamiento con el polipéptido de prueba da como resultado una reducción o retraso de los síntomas. En otro ensayo, se controla la desagregación de los agregados de proteína Huntingtin en estos animales. El animal puede entonces ser sacrificado y se obtienen rebanadas cerebrales. Las rodajas de cerebro se analizan a continuación para determinar la presencia de agregados que contienen la proteína Huntingtin humana transgénica, una porción de la misma o una proteína de fusión que comprende proteína Huntingtin humana, o una parte de la misma. Este análisis puede incluir, por ejemplo, manchar las rodajas de tejido cerebral con anticuerpo anti-Huntingtin y añadir un anticuerpo secundario conjugado con FITC que reconoce el anticuerpo anti-Huntington (por ejemplo, el anticuerpo anti-Huntingtin es anticuerpo anti-humano y el anticuerpo anti-Huntington secundario es específico para el anticuerpo humano) y visualizar los agregados de proteínas mediante microscopía fluorescente.
Hay una variedad de métodos disponibles para evaluar y/o monitorear la enfermedad de Huntington. Se conocen una variedad de síntomas e indicios clínicos de la enfermedad. La enfermedad de Huntington causa un trastorno del movimiento, dificultades psiquiátricas y cambios cognitivos. El grado, la edad de inicio y la manifestación de estos síntomas pueden variar. El trastorno del movimiento puede incluir movimientos rápidos, al azar, como la danza llamada corea.
Ejemplos de evaluaciones motoras incluyen: persecución ocular, iniciación de sacadas, velocidad de sacadas, disartria, protrusión de la lengua, capacidad de tocar el dedo, pronación/supinación, secuencia de la palma de la mano del puño, rigidez de los brazos, bradicinesia, distonía máxima (tronco superior e inferior extremidades), corea máximo (por ejemplo., tronco, cara, extremidades superiores e inferiores), marcha, marcha en tándem y retropulsión. Un tratamiento de ejemplo puede provocar un cambio en la puntuación motora total 4 (TMS-4), una subescala de la UHDRS, por ejemplo, durante un período de un año.
Cáncer
El cáncer incluye cualquier enfermedad que es causada por o resulta en niveles inadecuadamente altos de división celular, inapropiadamente bajos niveles de apoptosis, o ambos. Los ejemplos de cánceres incluyen, sin limitación, leucemias (por ejemplo, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin, enfermedad de no Hodgkin), macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada y tumores sólidos tales como sarcomas y carcinomas (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándula sudorípara, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de los conductos nilo, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, cáncer de útero, cáncer testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodenroglioma, schwannoma, meningioma, melanoma, Neuroblastoma y retinoblastoma). Los trastornos linfoproliferativos también se consideran enfermedades proliferativas.
imagen22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
5. Ejemplos
Ejemplo 1. Expresión y purificación de polipéptidos de fusión klotho
Expresión del polipéptido de fusión Klotho
Los polipéptidos de la divulgación se hicieron por transfección transitoria de células HEK293T con un vector de expresión que codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene el dominio extracelular del alfa Klotho y la variante de FGF23 (R179Q). Los medios condicionados que contienen polipéptidos sobreexpresados fueron generados por transfección transitoria de los plásmidos de expresión respectivos para Klotho, FGF23, y la proteína de fusión Klotho-FGF23 (R179Q). Las transfecciones se realizaron en placas de 6 pozos utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Cat # 11668-019). Cinco horas después de la transfección, la mezcla de transfección se sustituyó con 3 mL de DMEM más 1% de FBS. Los medios acondicionados se recogieron 72 horas después de la adición de 3 mL de DMEM más 1% de FBS. Las muestras de medio condicionado de varias células HEK293T transfectadas transitoriamente fueron separados por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y se analizaron por transferencia Western (Figura 3A) o se tiñeron con azul de Coomassie (Figura 3B).
La electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida se lleva a cabo en varias muestras (carril 1, el control; carril 2, FGF23, el carril 3, sKlotho; carriles 4-6, sKlotho-FGF23). La tinción con azul de Coomassie revela la expresión de una alta, > 180 kDa cinta, (Figura 3B, indicada por la flecha a la derecha) que no estuvo presente en los carriles 1-3, que contenían muestras no habían sido transfectadas con el vector que codifica el polipéptido de fusión klotho. La calidad del polipéptido de fusión Klotho secretada en el medio se evaluó mediante transferencia Western (figura 3A). Un IgG2A anti-FGF23 de rata monoclonal (R&D Systems, Cat # MAB26291), se utilizó como el anticuerpo primario para detectar los polipéptidos de fusión Klotho por Western blot. La Western Blot confirmó que las bandas adicionales observadas en los geles teñidos con Coomassie fueron polipéptidos de fusión Klotho. La Western Blot confirmó que los polipéptidos de fusión Klotho tenían el peso molecular esperado para el polipéptido de fusión Klotho. Este análisis muestra la expresión de la proteína de fusión Klotho-FGF23 (R179Q).
Purificación del polipéptido de fusión Klotho
Los polipéptidos de la divulgación se purificaron a partir de medios acondicionados de un cultivo de células HEK293T transfectadas transitoriamente con un vector de expresión que codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene el dominio extracelular de alfa Klotho y la variante R179Q de FGF23. Para generar el medio acondicionado, se transfectó un vector de expresión que codifica sKlotho-FGF23-6xHis (500 µg de ADN en 18 mL de OptiMEM 1 (GIBCO, Cat # 11058) mezclado con 18 mL de polietilimina (PEI) 2 µg/mL en células HEK293 cultivadas En suspensión en medio de expresión (464 mL de células HEK293T a 106 células/mL en medio de expresión Freestype 293 (GIBCO, Cat # 12338)). Después de la transfección, se dejó crecer el cultivo (120 horas, 37ºC en una solución al 5% de ncubación de CO2, agitación a 125 rpm). Al final de la incubación, el medio acondicionado se recogió por centrifugación (1000 rpm durante cinco minutos), luego se aplicó el medio acondicionado a una columna de níquelagarosa. La sKlotho-FGF23-6xH se unió firmemente a la columna y se eluyó con imidazol 50 mM. El material purificado resultante se dializó luego en PBS para eliminar el imidazol. Una muestra de sKlotho-FGF23-6xHis purificada se separó por SDS-PAGE (carril 1, sKlotho-FGF23-6xHis purificado), carril 2, marcador de peso molecular) y se analizaron mediante tinción con azul de Coomassie (figura 3C). El gel SDS-PAGE teñido confirmó que el sKlotho-FGF23-6xHis purificado tenía el peso molecular esperado. La incapacidad para detectar bandas correspondientes a proteínas distintas de la sKlotho-FGF23-6xH de longitud completa en el carril cargado con el material purificado también mostró que la sKlotho-FGF23-6xHis se purificó.
Ejemplo 2. Ensayo in vitro evaluación del grado de la actividad del polipéptido de fusión Klotho.
Egr-1-luciferasa
La actividad biológica del polipéptido de fusión de alfa Klotho expresado se ensayó en ensayos de indicador de Egr1-luciferasa. La unión del polipéptido de fusión Klotho al receptor FGF23 dio como resultado la activación de Egr-1 y la expresión de un indicador de luciferasa regulado por el promotor Egr-1. El gen indicador Egr-1-luciferasa se construyó basado en el descrito por Urakawa et al. (Nature, 2006, Vol. 444, 770-774). Se transfectaron células HEK293T sembradas en placas de poli-D-lisina de 48 pozos con el gen indicador de Egr-1-luciferasa junto con un gen indicador de normalización de transfección (lucilferasa de Renilla). Cinco horas después de la transfección del gen indicador de luciferasa Egr-1, la mezcla de transfección se reemplazó con 3 mL de DMEM más 1% de FBS. Los medios acondicionados se recogieron 72 horas después de la adición de 3 mL de DMEM más 1% de FBS. Cinco horas más tarde, la mezcla de transfección se reemplazó con una muestra a ensayar para determinar la actividad. En los experimentos iniciales, un medio acondicionado al 50% (solo o que contenía Klotho, FGF23, Klotho y FGF23, y la proteína de fusión Klotho-FGF23 (R179Q)) y 50% DMEM con 1% de FBS en presencia o ausencia de 20 µg/mL de heparina (Sigma, Cat # H8537, disuelto en DMEM como 2 mg/mL de stock) se probaron en los ensayos de indicador de Egr-1-luciferasa (Figura 4). Otros experimentos usaron cantidades definidas de los polipéptidos purificados (figuras 5A y 5B). Las células se lisaron 20 horas más tarde en solución reguladora de lisis pasiva (Promega, Cat # E194A) y se determinaron las actividades de luciferasa usando el sistema de ensayo de luciferasa de Dual Glo (Promega, Cat # E2940).
imagen23
En los experimentos iniciales, se demostró la actividad del polipéptido de fusión de Klotho en medio acondicionado no fraccionado. Usando el gen indicador de Egr-1-luciferasa (Figura 4) estos experimentos cuantificaron los cambios 5 de pliegue en la expresión del indicador de luciferasa. El medio acondicionado que contiene una combinación de FGF23 y el dominio extracelular de Egr-1-luciferasa activada con proteína Klotho, pero el medio acondicionado que contiene solo FGF23 o medio acondicionado que contiene solo el dominio extracelular de Klotho, no activó la Egr-1luciferasa. El medio acondicionado que contiene la proteína de fusión sKlotho-FGF23 (R179Q) activó el gen indicador Egr-1-luciferasa en contraste con el medio acondicionado que contenía FGF23 o Klotho solo. En estos 10 experimentos, el medio acondicionado que contiene la proteína de fusión sKlotho-FGF23 (R179Q) activó el gen indicador Egr-1-luciferasa significativamente mejor que el medio acondicionado que contenía una combinación de FGF23 y Klotho. En presencia de heparina, las inducciones por medio acondicionado que contiene la proteína de fusión sKlotho-FGF23 (R179Q) y el medio acondicionado que contiene una combinación de FGF23 y Klotho se mejoraron significativamente. La Tabla 1 enumera la expresión relativa de diversos polipéptidos de fusión FGF
15 Klotho en medio acondicionado y la actividad relativa del medio condicionado no fraccionado correspondiente a los diversos polipéptidos de fusión FGF-Klotho en ensayos de indicador de Egr-1-luciferasa.
Tabla 1. Expresión y Actividades de las variantes de fusión sKlotho-FGF23
Construcciones de fusión sKlotho-FGF23
Expresión Actividad en gen indicador Egr-1-luc
1
sKlotho-FGF23 buena si
2
IgG sp-sKlotho-FGF23 buena si
3
sKL-D1-FGF23 buena no
4
sKL-D2-FGF23 no n.a.
5
s(KL-D1)2-FGF23 buena no
6
sKL-D1/D2-FGF23 no n.a.
7
ssKlotho(ΔN-26)-FGF23 pobre no*
8
sKLD1-D2(Δ692-965)-FGF23 pobre no*
9
sKL-D1-D2(Δ507-798)-FGF23 pobre no*
10
FGF23-sKlotho pobre no*
* La falta de actividad puede ser el resultado de la baja expresión
Los ensayos de indicador de Egr-1-luciferasa se realizaron también usando cantidades definidas de proteínas
20 purificadas a partir del medio acondicionado, usando el procedimiento de purificación como se describe en el Ejemplo 1. De acuerdo con resultados previos usando medio condicionado no fraccionado que contenía los polipéptidos expresados, la combinación de FGF23 y sKlotho purificado dio lugar a actividad informadora de luciferasa, pero el tratamiento con FGF23 purificado no lo hizo (Figura 5A). La actividad informadora de luciferasa a partir de la combinación de FGF23 y sKlotho purificado dependía adicionalmente de la dosis de sKlotho purificado,
25 pudiendo el efecto potenciarse por la presencia de heparina (20 µg/mL). Se pudo detectar un efecto del polipéptido de fusión de sKlotho-FGF23-6xH en la actividad de luciferasa a concentraciones tan bajas como aproximadamente
1.21 nM (cambio de 1.2 veces) y menos hasta aproximadamente 19.3 nM (cambio de 2.4 veces) en el indicador de Egr-1-luciferasa (Figura 5B). La actividad del polipéptido de fusión de sKlotho-FGF23-6xHis fue aumentada significativamente en presencia de heparina (20 µg/mL). En presencia de heparina, se pudo detectar el efecto del
30 polipéptido de fusión de sKlotho-FGF23-6xHs en la actividad de la luciferasa a una concentración tan baja como aproximadamente 0.6 nM (cambio de 2.0 veces). El resultado mostró que el sKlotho-FGF23-6xH purificado indujo de forma dependiente de la dosis el gen indicador EGR-1-luc, y que el tratamiento con sKlotho-FGF23-6xHis.
Ejemplo 3. Ensayo in vitro que evalúa el efecto del polipéptido de fusión de Klotho sobre células musculares.
El efecto biológico del polipéptido de fusión Klotho expresado se ensayó en mioblastos C2C12. El tratamiento de los 35 mioblastos C2C12 con IGF-1, FGF2, o sKlotho-FGF23 dio como resultado el crecimiento miotubo y la fosforilación de proteínas de señalización. Los mioblastos C2C12 se sembraron a una densidad de 40,000 células/pozo en placas recubiertas de 6 pozos de poli-D-lisina y fibronectina en medio de crecimiento (3 partes de DMEM y 1 parte de F12), FBS al 10%, Glut al 1%; P/S al 1%; ácido linólico al 1%; 0.1% de ITS: [insulina (10 mg/mL), transferrina (5.5 mg/mL), y selenio (5 ng/mL)]. Después de que los mioblastos alcanzaron la confluencia (3 días), el medio se transformó en medio de diferenciación (DMED con 2% de suero de caballo, 1% de Glut y 1% de P/S).
imagen24
Para los experimentos de diámetro de miotubo, tres días después de que los medios confluentes se cambiaron en medio de diferenciación, las células se trataron con IGF-1 (10 nM), FGF2 (20 ng/mL) o sKlotho-FGF23 (20 nM) en ausencia o presencia de dexametasona (100  M) durante 24 horas en medio de diferenciación. Al final del tratamiento, las células se fijaron con glutaraldehído (5% en PBS) y se recogieron múltiples imágenes fluorescentes. Se midió el diámetro de miotubos utilizando el programa Pipeline Pilot para determinar la hipertrofia o atrofia.
Para la fosforilación de la proteína de señalización, los experimentos, tres días después de que los medios confluentes se cambiaron en medio de diferenciación, las células se privaron durante cuatro horas con DMEM sin FBS y luego se trataron con IGF-1 (10 nM), FGF2 (20 ng/mL) o sKlotho-FGF23 (20 nM) en ausencia o presencia de rapamicina (40 nM) durante 30 min. Las células se lisaron en solución reguladora RIPA en presencia de inhibidores de proteasa y fosfatasa. Se realizó un análisis de transferencia Western y se sondaron las membranas con diferentes anticuerpos como se indica en la figura y se desarrollaron en películas de rayos X, que se escanearon.
Los resultados de este estudio mostraron que sKlotho-FGF23 dio como resultado un aumento en el diámetro de los miotubos en comparación con la hipertrofia de miotubos C2C12 inducida por el control, similar a los resultados para IGF-1 y FGF2 (Figura 5A). Además, el tratamiento con sKlotho-FGF23, IGF-1, y FGF2 podría revertir parcialmente la atrofia de miotubos inducida por dexametasona, basándose en las mediciones de diámetro de miotubo. No se observó diferencia entre sKlotho-FGF23 y FGF2 en la morfología de los miotubos (medida por el grosor de los miotubos) en ausencia o presencia de dexametasona. Los efectos tróficos de sKlotho-FGF23, IGF-1, y FGF2 fueron estadísticamente significativos.
En consonancia con los efectos sobre los miotubos C2C12, la señalización de la proteína de fusión de sKlotho-FGF23 condujo a la fosforilación de p70S6K y ERK, pero no AKT o FoxO, en los miotubos C2C12 (figura 5B). El efecto de sKlotho-FGF23 en la señalización fue similar al de FGF2, pero fue distinto del IGF-1. Se observó que la extensión de la fosforilación de ERK por sKlotho-FGF23 era menor que la de IGF-1 o FGF2. La fosforilación de p70S6K por sKlotho-FGF23 era sensible a la rapamicina. En los experimentos que implican células C2C12, no se requirió heparina para activar la señalización. Estos resultados muestran que una fusión de sKlotho-FGF23 polipéptido activó la señalización en los miotubos C2C12.
Ejemplo 4 Polipéptidos de fusión que comprenden sKlotho, FGF23 y FcLALA
Se construyen diversos polipéptidos de fusión utilizando sKlotho, FGF23, y un fragmento Fc modificado de un anticuerpo. Estas moléculas Fc modificadas han alterado (disminuido) la unión a FcRn y aumentó así la semivida en suero. También tienen biodisponibilidad modificada y transporte alterado a las superficies mucosas y otros objetivos en el cuerpo. En este ejemplo, FGF23 y sKlotho se fusionan a FcLALA, que se describe en la Patente de Estados Unidos No. 7,217,798 y Hessell et al. 2007 Nature 449: 101-104, Interviniendo entre los diversos componentes de estos polipéptidos de fusión son enlazantes, como se describe en Lode et al. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2475-2480. Estas fusiones se insertan en construcciones, por ejemplo, pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), y se expresan en células HEK293.
A. sKlotho -FGF23-FcLALA v1
Se construye una fusión que comprende: sKlotho, un enlazante, FGF23, otro enlazante, y FcLALA. Esta divulgación, denominada sKlotho-FGF23-FcLALA v1, se presenta en las SEQ ID NO: 46 y 47, a continuación.
La secuencia de nucleótidos de sKlotho-FGF23-FcLALA v1 (en donde inicia ATG como 1) se presenta como SEQ ID NO: 46.
La secuencia de aminoácidos de sKlotho-FGF23-FcLALA v1 se presenta a continuación como SEQ ID NO: 47.
En esta secuencia, los diversos componentes de la fusión son los siguientes:
sKlotho: 1-982; enlazante 1: 983-1001; FGF23: 1002-1228; enlazante 2; 1229-1233; FcLALA: 1234-1459.
B. sKlotho -FGF23 -FcLALA v2
Se construye una fusión que comprende: sKlotho, un enlazante, FGF23, otro enlazante, y FcLALA. Esta divulgación 50 se denomina sKlotho-FGF23-FcLALA v2 y se presenta como SEQ ID NO: 48 y 49, a continuación.
imagen25
5
10
15
20
25
30
35
40
La secuencia de nucleótidos de sKlotho-FGF23-FcLALA v2 (en donde inicia ATG como 1) se presenta como SEQ ID NO: 48.
La secuencia de aminoácidos de sKlotho-FGF23-FcLALA v2 se presenta a continuación como SEQ ID NO: 49.
En esta secuencia, los diversos componentes de la fusión son los siguientes:
sKlotho: (aa o aminoácidos) 1-982; enlazante 1: 983-1001; FGF23: 1002-1228; enlazante 2; 1229-1233; FcLALA: 1234-1450.
Se pueden construir otros polipéptidos de fusión combinados en diversas combinaciones FGF, Klotho, fragmentos Fc modificados, y (opcionalmente) secuencias enlazantes, y variantes y derivados de los mismos, tal como se describe en este documento o conocidos en la técnica.
Ejemplo 5. Polipéptidos de fusión que comprenden FGF23 y FcLALA.
Se construyen diversos polipéptidos de fusión utilizando FGF23, y un fragmento Fc modificado de un anticuerpo, tal como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 7,217,798. Estas moléculas Fc modificadas han alterado (disminuido) la unión a FcRn y aumentó así la semivida en suero. También tienen biodisponibilidad modificada y transporte alterado a las superficies mucosas y otros objetivos en el cuerpo. En este ejemplo, FGF23 se fusiona con FcLALA, interviniendo entre los diversos componentes de estos polipéptidos de fusión están los enlazantes, como se describe en Lode et al. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 2475-2480. Estas fusiones son construcciones insertadas, por ejemplo, pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA), y expresadas en células HEK293.
C. FGF23-FcLALA v1
Se construye una fusión que comprende: FGF23, un enlazante, y FcLALA. Esta construcción se designa FGF23-FcLALA v1 y se presenta a continuación como SEQ ID NOs: 50 y 51. La secuencia de nucleótidos de FGF23-FcLALA v1 (en donde inicia ATG como 1) se presenta a continuación como
SEQ ID NO: 50. La secuencia de aminoácidos de FGF23 (R179Q)-FcLALAv1 se presenta a continuación como SEQ ID NO: 51. En esta secuencia, los diversos componentes de la fusión son los siguientes: FGF23: (aa) 1-251; enlazante: 252-256; FcLALA: 257-482.
D. FGF23-FcLALA v2 Se construye una fusión que comprende: FGF23-FcLALA v2, que comprende FGF23 y FcLALA. La secuencia de nucleótidos de FGF23-FcLALA v2 (en donde inicia ATG como 1) se presenta a continuación como
SEQ ID NO: 52. La secuencia de aminoácidos de FGF23 (R179Q)-FcLALAv2 se presenta a continuación como SEQ ID NO: 53. En esta secuencia, los diversos componentes de la fusión son los siguientes: FGF23: 1-251; enlazante: 252-256; FcLALA: 257-473. Se pueden construir otros polipéptidos de fusión combinando en diversas combinaciones las secuencias FGF,
fragmentos Fc modificados, y (opcionalmente) enlazantes, y variantes y derivados de los mismos, tal como se describe en este documento o conocidos en la técnica.
E. Se determinan la activación del gen indicador Egr-1-luc mediante proteínas de fusión sKlotho-FGF23(R179Q)-FcLALA; Activación del indicador del gen Egr-1-luc mediante las proteínas FGF23(R179Q)-FcLALA; y perfil farmacocinético de FGF23(R179Q) frente a FGF23 (R179Q)-FcLaLav2.
La figura 7 muestra la activación del gen indicador Egr-1-luc mediante proteínas de fusión sKlotho-FGF23(R179Q)-FcLALA. Las células HEK293T se transfectan transitoriamente con el gen indicador Egr-1-luc y se incuban con el medio acondicionado indicado en ausencia o presencia de 20 µg/mL de heparina. Las actividades de luciferasa se determinan después 18 horas más tarde. El resultado muestra que las proteínas de fusión sklotho-FGF23-FcLALA inducen la actividad del gen indicador. Estas inducciones se potencian significativamente en presencia de heparina. sKF-Fcv1: sKlotho-FGF23-FcLALAv1; sKF-Fcv2: sKlotho-FGF23-FcLALAv2
imagen26
10
15
20
25
30
35
40
45
50
La figura 8 muestra la activación del gen indicador Egr-1-luc mediante las proteínas FGF23(R179Q)-FcLALA. Las células HEK293T se transfectan transitoriamente con el gen indicador Egr-1-luc junto con la forma transmembrana de longitud completa de Klotho y se incuba con el medio acondicionado al 30% indicado. Las actividades de la luciferasa se determinan después 18 horas más tarde. Los resultados muestran que las proteínas de fusión FGF23-FcLALA inducen la actividad del gen indicador de una manera similar a la FGF23.
La figura 9 muestra el perfil farmacocinético de FGF23(R179Q) frente a FGF23(R179Q)-FcLALAv2. Se inyectan cuatro ratones por grupo por vía subcutánea con FGF23(R179Q)-6xHis o FGF23(R179Q)-FcLALAv2 a 2 mg/kg. En los momentos indicados, las muestras de suero son recogidas y analizadas para FGF23 por ELISA. La concentración de FGF23(R179Q)-FcLALA en suero permanece elevada en el punto de tiempo de 24 h, mientras que FGF23(R179Q)-6xHis se vuelve al nivel basal. Estos resultados indican que con la adición de FcLALA, la semivida in vivo de FGF23 (R179Q) se mejora significativamente.
Ejemplo 6. Eficacia in vivo de la fusión de sKlotho-FGF23 en la potenciación del crecimiento muscular después de la atrofia muscular inducida por dexametasona
Los datos experimentales muestran que la inyección intramuscular de sKlotho-FGF23 aumentó significativamente el crecimiento de la masa muscular después de la atrofia muscular inducida por dexametasona. En este experimento, se utiliza el péptido correspondiente a la SEQ ID NO: 41.
La figura 10 muestra los pesos absolutos (A) y el cambio de peso porcentual (B) de los músculos gastrocnemiosóleo-plantar (GSP) que muestran que la inyección intramuscular de sKlotho-FGF23 (KLOFGF) aumentó significativamente el crecimiento de la masa muscular después de inducción de la atrofia muscular con dexametasona (DEX) en comparación con la inyección intramuscular de sKlotho (sKLO) o solución salina reguladora con fosfato (PBS).
Se asignaron al azar 80 ratones C57BL/6 machos, de 15 semanas de edad, por peso corporal a 8 grupos cada uno de 10 ratones. Cuatro grupos reciben agua sin DEX (W21d) mientras que los otros cuatro reciben DEX en agua potable a 2.4 mg/kg/día durante tres semanas (D21d). Después de las tres semanas, el tratamiento con DEX se detiene y un grupo W21d y uno D21d se sacrifica inmediatamente para establecer el grado de atrofia muscular inducida por el tratamiento con DEX. Se deja que los otros tres grupos de ratones W21d o D21d se recuperen durante otros 14 días (R14d) durante el cual reciben una inyección intramuscular de 2x50 µL de PBS, sKlotho-FGF23 (KLOFGF, 1.6 mg/mL) o sKlotho (sKLO, 1.6 mg/mL), respectivamente, cada dos días en el complejo muscular gastrocnemio-sóleo-plantar derecho. Los ratones se sacrifican 24 horas después de la última inyección intramuscular y los pesos musculares determinados y expresados como peso absoluto (a) o cambio porcentual en comparación con el grupo W21d + PBS.
Estos datos muestran la eficacia in vivo de la fusión de sKlotho-FGF23 en la potenciación del crecimiento muscular después de la atrofia muscular inducida por dexametasona.
Ejemplo 7. Mutaciones adicionales en la porción de FGF23 de proteínas de fusión que reducen la agregación, reducen la escisión no deseada inducida por proteasa, y aumentan la producción
Se investigan varias mutaciones dentro de la porción de FGF23 de los polipéptidos fusión de sKlotho-FGF23 y FGF23-FcLaLa. Estos incluyen Q156, C206 y C244 (en donde el número se basa en la secuencia de aminoácidos de FGF23). Ejemplos de mutaciones individuales incluyen Q156A, C206S y C244S, y las mutaciones en cualquiera de estos sitios pueden combinarse con una mutación en R179 (por ejemplo, R179Q). Se proporcionan secuencias de ejemplo en SEQ ID NO: 54 a 68 de la Figura 2.
Se sospecha que C206 y C244 están implicados en la dimerización; y Q156 es un sitio identificado por los inventores como un sitio sensible a proteasa. La mutación de estos aminoácidos a cualquier otro aminoácido mejora las cualidades de las proteínas, reduciendo la agregación, reduciendo la escisión indeseada inducida por la proteasa, y aumentando la producción de proteínas a partir de las células, sin interferir con la actividad del FGF23. Este es un resultado inesperado, ya que estas tres posiciones se conservan en las proteínas FGF23 encontradas en humanos, rhesus, bovinos, ratones y ratas. Esta conservación se muestra a continuación en la comparación entre SEQ ID NOs: 69, 70, 71, 72 y 73, con las Q156, C206 y C244 en fuente negrita y subrayada.
hFGF23
MLGARLRLWVCALCSVCSMSVLRAYPNASPLLGSSWGGLIHLYTATARNSYHLQIHKNGH
rhesus
MLGARLRLWVCALCSVCSMSVIRAYPNASPLLGSSWGGLIHLYTATARNSYHLQIHKNGH
bovino
MLGARLGLWVCTLSCV-----VQAYPNSSPLLGSSWGGLTHLYTATARNSYHLQIHGDGH
ratón
MLGTCLRLLVGVLCTVCSLGTARAYPDTSPLLGSNWGSLTHLYTATARTSYHLQIHRDGH
rata
MLGACLRLLVGALCTVCSLGTARAYSDTSPLLGSNWGSLTHLYTATARNSYHLQIHRDGH
imagen27
5
10
15
20
25
30
35
hFGF23
VDGAPHQTIYSALMIRSEDAGFVVITGVMSRRYLCMDFRGNIFGSHYFDPENCRFQHQTL
rhesus
VDGAPHQTIYSALMIRSEDAGFVVITGVMSRRYLCMDFRGNIFGSHYFNPENCRFRHWTL
bovino
VDGSPQQTVYSALMIRSEDAGFVVITGVMSRRYLCMDFTGNIFGSHHFSPESCRFRQRTL
ratón
VDGTPHQTIYSALMITSEDAGSVVITGAMTRRFLCMDLHGNIFGSLHFSPENCKFRQWTL
rata
VDGTPHQTIYSALMITSEDAGSVVITGAMTRRFLCMDLRGNIFGSYHFSPENCRFRQWTL
hFGF23
ENGYDVYHSPQYHFLVSLGRAKRAFLPGMNPPPYSQFLSRRNEIPLIHFNTPI-PRRHTR
rhesus
ENGYDVYHSPQHHFLVSLGRAKRAFLPGMNPPPYSQFLSRRNEIPLIHFNTPR-PRRHTR
bovino
ENGYDVYHSPQHRFLVSLGRAKRAFLPGTNPPPYAQFLSRRNEIPLPHFAATARPRRHTR
ratón
ENGYDVYLSQKHHYLVSLGRAKRIFQPGTNPPPFSQFLARRNEVPLLHFYTVR-PRRHTR
rata
ENGYDVYLSPKHHYLVSLGRSKRIFQPGTNPPPFSQFLARRNEVPLLHFYTAR-PRRHTR
hFGF23
SAEDDSERDPLNVLKPRARMTPAPASCSQELPSAEDNSPMASDPLGVVRGGRVNTHAGGT
rhesus
SAEDDSERDPLNVLKPRARMTPAPASCSQELPSAEDNSPVASDPLGVVRGGRVNTHAGGT
bovino
SAHDSG--DPLSVLKPRARATPVPAACSQELPSAEDSGPAASDPLGVLRGHRLDVRAGSA
ratón
SAEDPPERDPLNVLKPRPRATPVPVSCSRELPSAEEGGPAASDPLGVLRRGRGDARGGAG
rata
SAEDPPERDPLNVLKPRPRATPIPVSCSRELPSAEEGGPAASDPLGVLRRGRGDARRGAG
hFGF23
GPEGCRPFAKFI (SEQ ID NO: 69)
rhesus
GPEACRPFPKFI (SEQ ID NO: 70)
bovino
GAERCRPFPGFA (SEQ ID NO: 71)
ratón
GADRCRPFPRFV (SEQ ID NO: 72)
rata
GTDRCRPFPRFV (SEQ ID NO: 73)
El hecho de que estas tres mutaciones no impidan la actividad de FGF23 se muestra en la Figura 11. Esta figura muestra la activación del gen indicador Egr-1-luc por los mutantes FGF23(R179Q)-FcLALA y Q156A, C206S, C244S y C206S/C244S.
Las células HEK293T se transfectan transitoriamente con el gen indicador EGR-1-luc junto con la forma transmembrana de longitud completa de Klotho e indican mutantes FGF23-FcLaLa. Las actividades de luciferasa se determinan después 18 horas más tarde. Los resultados muestran que los mutantes C206S, C244S, C206S/C244S (tres clones independientes) y Q156A (tres clones independientes) son igualmente eficaces como las proteínas de fusión FGF23-FcLALA en la activación de la actividad del gen indicador EGR-1-Luc.
Los datos que muestran que la mutación C244 y C206 alteran la dimerización y la agregación de FGF23 se muestran en la Figura 12. Esta figura muestra las calidades proteicas de los mutantes WT, Q156A, C206S, C244S y C206S/C244S de FGF23(R179Q)-FcLaLa. El medio condicionado de células HEK293T transitorias transfectadas con los vectores de expresión de FGF23-FcLaLa indicados se analizan mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo FGF23. El resultado muestra que la mutación C206S/C244S previene la dimerización de la proteína y la mutación Q156A ha reducido los fragmentos proteolíticos
imagen28
Así, sorprendentemente, aunque estos residuos Q156, C206 y C244 se conservan entre especies, pueden mutarse sin reducir la actividad de FGF23 y pueden mejorar las cualidades de la proteína reduciendo la agregación y la escisión y mejorando la producción.
A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo 5 significado que el normalmente entendido por un especialista familiarizado con el campo al que pertenece la descripción.
A menos que se indique lo contrario, se pueden realizar todos los métodos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle y se han realizado de una manera conocida per se, como será evidente para el experto en la materia. Se hace referencia, por ejemplo, de nuevo a los manuales estándar y a la técnica de
10 referencia general mencionada en este documento y a las referencias adicionales citadas en el mismo.
Los inventores contemplan que se pueden hacer varias sustituciones, alteraciones y modificaciones a la divulgación sin apartarse del alcance de la invención, tal como se define en las reivindicaciones.
Listado de secuencias (Figura 2)
Secuencia de ácido nucleico de Klotho humano (NM_004795) (SEQ ID NO: 1)
15 Región codificante de la proteína: 9-3047
imagen29
imagen30
Secuencia de aminoácidos de Klotho (NP_004786) (SEQ ID NO: 2)
imagen31
imagen32
Secuencia de ácido nucleico de beta-Klotho (NM_175737) (SEQ ID NO: 3) Región codificante de la proteína: 98-3232
imagen33
imagen34
Secuencia de aminoácidos de beta-Klotho (NP_783864) (SEQ ID NO: 4)
imagen35
Secuencia de aminoácidos (KL-D1) de dominio Klotho 1 humana (SEQ ID NO: 5)
imagen36
Secuencia de aminoácidos (KL -D2) del dominio 2 de Klotho humano (SEQ ID NO: 6)
imagen37
Secuencia de aminoácidos (sin péptido señal) del dominio extracelular de Klotho (SEQ ID NO: 7)
imagen38
Secuencia de aminoácidos del péptido señal de Klotho (SEQ ID NO: 8) 1 mpasapprrp rppppslsll lvllglggrr lra Secuencia de aminoácidos del péptido señal IgG (SEQ ID NO: 9)
5 1 msvltqvlal lllwltgtrc rrlra Secuencia del ácido nucleico del enlazante del polipéptido (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 10) 1 ggaggtggag gttcaggagg tggaggttca ggaggtggag gttca Secuencia de aminoácidos del enlazante del polipéptido (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 11) 1 GGGGSGGGGS GGGGS
10 Secuencia de aminoácidos del enlazante del polipéptido (Gly4 Ser) (SEQ ID NO: 12) 1 GGGGS Secuencia de aminoácidos del enlazante del polipéptido (Gly) (SEQ ID NO: 13) 1G Secuencia de aminoácidos del enlazante del polipéptido (Gly Gly) (SEQ ID NO: 14)
15 1 GG Secuencia de aminoácidos del enlazante del polipéptido (Gly Ser) (SEQ ID NO: 15) 1 GS Secuencia de aminoácidos del enlazante del polipéptido (Gly2 Ser) (SEQ ID NO: 16) 1 GGS
20 Secuencia de aminoácidos del enlazante del polipéptido (Ala) (SEQ ID NO: 17) 1A Secuencia de aminoácidos del enlazante del polipéptido (Ala Ala) (SEQ ID NO: 18) 1 AA Secuencia de aminoácidos de FGF23 (R179Q) dominio extracelular de Klotho del péptido señal de Klotho (SEQ ID
25 NO: 19) Secuencia de aminoácidos de FGF23 (R179Q) del dominio extracelular de Klotho del péptido señal IgG (SEQ ID NO: 20)
imagen39
imagen40
Secuencia de aminoácidos de KL-D1-FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 21) Secuencia de aminoácidos de KL-D2-FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 22)
imagen41
imagen42
Secuencia de aminoácidos (KL-D1)2-FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 23) Secuencia de aminoácidos (KL-D2)2-FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 24)
imagen43
imagen44
Secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de Klotho FGF23 (R179Q) -(SEQ ID NO: 25) Secuencia de aminoácidos FGF23 (R179Q) -KL-D1 (SEQ ID NO: 26)
imagen45
imagen46
Secuencia de aminoácidos FGF23 (R179Q) -KL-D2 (SEQ ID NO: 27) Secuencia de aminoácidos FGF23 (R179Q) -(KL-D1)2 (SEQ ID NO: 28)
imagen47
imagen48
imagen49
Secuencia de aminoácidos FGF23 (R179Q) -(KL-D2)2 (SEQ ID NO: 29)
imagen50
imagen51
Secuencia del ácido nucleico FGF19 (NM_005117) (SEQ ID NO: 30) Región codificante de la proteína (464-1114)
imagen52
FGF19 secuencia de aminoácidos (NP_005108) (SEQ ID NO: 31)
imagen53
Secuencia del ácido nucleico FGF21 (NM_019113 ) (SEQ ID NO: 32) Región codificante de la proteína 151-780
imagen54
imagen55
Secuencia de aminoácidos FGF21 (NP_061986) (SEQ ID NO: 33)
imagen56
Secuencia del ácido nucleico FGF23 (NM_020638) (SEQ ID NO: 34) Región codificante de la proteína 147-902
imagen57
imagen58
Secuencia de aminoácidos FGF23 (NP_065689) (SEQ ID NO: 35)
imagen59
Secuencia de aminoácidos FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 36)
imagen60
Secuencia de aminoácidos del dominio beta-klotho humano 1 (b-KL-D1) (SEQ ID NO: 37)
imagen61
Secuencia de aminoácidos del dominio beta-klotho humano 2 (b-KL-D2) (SEQ ID NO: 38) Secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de Beta-Klotho (sin péptido señal) (SEQ ID NO: 39)
imagen62
imagen63
Secuencia de aminoácidos sKlotho sin péptido señal -FGF23 (sin péptido señal) (SEQ ID NO: 40) Secuencia de aminoácidos sKlotho sin péptido señal -FGF23 (R179Q) (sin péptido señal) (SEQ ID NO: 41)
imagen64
imagen65
imagen66
FGF23 sin péptido señal (SEQ ID NO: 42)
imagen67
FGF23(R179Q) sin péptido señal (SEQ ID NO: 43)
imagen68
sKlotho con péptido señal de Klotho (SEQ ID NO: 44) sKlotho con IgG péptido señal (SEQ ID NO: 45)
imagen69
imagen70
sKlotho-FGF23-FcLALA v1 (SEQ ID NO: 46)
imagen71
imagen72
imagen73
sKlotho-FGF23-FcLALA v1 (SEQ ID NO: 47)
imagen74
sKlotho-FGF23-FcLALA v2 (SEQ ID NO: 48)
imagen75
imagen76
imagen77
sKlotho-FGF23-FcLALA v2 (SEQ ID NO: 49)
imagen78
FGF23-FcLALA v1 (SEQ ID NO: 50) FGF23(R179Q)-FcLALAv1 (SEQ ID NO: 51)
imagen79
imagen80
imagen81
FGF23-FcLALA v2 (SEQ ID NO: 52)
imagen82
imagen83
FGF23(R179Q)-FcLALAv2 (SEQ ID NO: 53)
imagen84
Secuencia de aminoácido de sKlotho-FGF23 (R1156Q, C1183S) (SEQ ID NO: 54) sKlotho: aa [aminoácido] 1-982; enlazante 1: aa 983-1001; FGF23: aa 1002-1228
imagen85
Secuencia de aminoácido de sKlotho-FGF23 (R1156Q, C1221S) (SEQ ID NO: 55) sKlotho: 1-982; enlazante 1: 9831001; FGF23: 1002-1228;
imagen86
imagen87
Secuencia de aminoácido de sKlotho-FGF23 (R1156Q, Q1133A) (SEQ ID NO: 56) sKlotho: 1-982; enlazante 1: 9831001; FGF23: 1002-1228
imagen88
Secuencia de aminoácido de sKlotho-FGF23 (R1156Q, C1183S, C1221S) (SEQ ID NO: 57) sKlotho: 1-982; enlazante 1: 983-1001; FGF23: 1002-1228
imagen89
Secuencia de aminoácido de sKlotho-FGF23 (R1156Q, C1183S, C1221S, Q1133A) (SEQ ID NO: 58) sKlotho: 1-982; enlazante 1: 983-1001; FGF23: 1002-1228
imagen90
Secuencia de aminoácido de FGF23(R179Q; C206S)-FcLALAv1 (SEQ ID NO: 59) FGF23: 1-251; enlazante: 252256; FcLALA: 257-482
imagen91
Secuencia de aminoácido de FGF23(R179Q, C244S)-FcLALAv1 (SEQ ID NO: 60) FGF23: 1-251; enlazante: 252256; FcLALA: 257-482
imagen92
Secuencia de aminoácido de FGF23(R179Q, Q156A)-FcLALAv1 (SEQ ID NO: 61) FGF23: 1-251; enlazante: 252256; FcLALA: 257-482
imagen93
Secuencia de aminoácido de FGF23(R179Q, C206S, C244S)-FcLALAv1 (SEQ ID NO: 62) FGF23: 1-251; enlazante:252-256; FcLALA: 257-482
imagen94
imagen95
Secuencia de aminoácido de FGF23(R179Q, C206S, C244S, Q156A)-FcLALAv1 (SEQ ID NO: 63) FGF23: 1-251; enlazante: 252-256; FcLALA: 257-482
imagen96
Secuencia de aminoácido de FGF23(R179Q, C206S)-FcLALAv2 (SEQ ID NO: 64) FGF23: 1-251; enlazante: 252-256; FcLALA: 257-473
imagen97
Secuencia de aminoácido de FGF23(R179Q,C244S)-FcLALAv2 (SEQ ID NO: 65) FGF23: 1-251; enlazante: 252256;
FcLALA: 257-473
imagen98
Secuencia de aminoácido de FGF23(R179Q,Q156A)-FcLALAv2 (SEQ ID NO: 66) FGF23: 1-251; enlazante: 252256; FcLALA: 257-473

Claims (27)

  1. imagen1
    REIVINDICACIONES
    1.
    Un polipéptido de fusión que comprende: (a) un polipéptido que comprende una variante o un derivado funcionalmente activo del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23) que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244; y (b) cualquiera de un fragmento Fc modificado que tiene una afinidad disminuida para el receptor Fc-gamma y/o una semivida en suero aumentada, o un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho o una variante o derivado funcionalmente activo de la misma; y, opcionalmente, (c) un enlazante.
  2. 2.
    El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, en donde el polipéptido de (a) está unido operativamente al extremo N del polipéptido de (b); o en donde el polipéptido de (b) está unido operativamente al extremo N del polipéptido de (a).
  3. 3.
    El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el polipéptido de (a) y el polipéptido de (b) están conectados por un enlazante de polipéptido.
  4. 4.
    El polipéptido de fusión de la reivindicación 3, en donde el enlazante de polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 18; o en donde el enlazante de polipéptido comprende al menos 1 y hasta aproximadamente 30 repeticiones de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 18.
  5. 5.
    El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el polipéptido de (a) está conectado por un enlace peptídico al extremo N de un enlazante de polipéptido, y el polipéptido de (b) está conectado por un enlace peptídico al extremo C de dicho enlazante de polipéptido; o en donde el polipéptido de (a) está conectado por un enlace peptídico al extremo C de dicho enlazante de polipéptido, y el polipéptido de (b) está conectado por un enlace peptídico al extremo N de dicho enlazante de polipéptido.
  6. 6.
    El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el subdominio extracelular de la proteína Klotho es un dominio KL-D1 o un dominio KL-D2; o en donde el polipéptido de (b) comprende al menos dos subdominios extracelulares de la proteína Klotho.
  7. 7.
    El polipéptido de fusión de la reivindicación 6, en donde los al menos dos subdominios extracelulares de la proteína Klotho son al menos dos dominios KL-D1 en repeticiones en tándem; o en donde los al menos dos subdominios extracelulares de la proteína Klotho son al menos dos dominios KL-D2 en repeticiones en tándem; o en donde los al menos dos subdominios extracelulares de la proteína Klotho comprenden un dominio KL-D1 y un dominio KL-D2; o en donde el polipéptido de (b) es el dominio extracelular de la proteína Klotho.
  8. 8.
    El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un péptido señal.
  9. 9.
    El polipéptido de fusión de la reivindicación 8, en donde el péptido señal es el péptido señal de Klotho o el péptido señal IgG.
  10. 10.
    El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se une específicamente a un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos.
  11. 11.
    El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína Klotho es alfa-Klotho; o en donde la proteína Klotho es beta-Klotho.
  12. 12.
    El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la variante funcionalmente activa del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23) tiene una mutación en todas las posiciones R179, Q156, C206 y C244.
  13. 13.
    El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que es 95% o más idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, o 68.
  14. 14.
    El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 o SEQ ID NO: 68.
  15. 15.
    El polipéptido de fusión de las reivindicaciones 1-3 o 5, que comprende FcLALA.
  16. 16.
    Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador farmacéuticamente aceptable.
  17. 17.
    Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
  18. 18.
    Una célula huésped que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 17.
  19. 19.
    Un polipéptido de fusión que comprende:
    239
    imagen2
    (a) un polipéptido que comprende una variante o derivado funcionalmente activo de FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244; y (b) cualquiera de un fragmento Fc modificado que tiene una afinidad disminuida para el receptor Fc-gamma y/o una semivida en suero aumentada, o un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho o una variante o derivado funcionalmente activa de la misma; y, opcionalmente, (c) un enlazante, para uso como medicamento.
  20. 20. Un polipéptido de fusión que comprende:
    (a) un polipéptido que comprende una variante o derivado funcionalmente activo de FGF23 que tiene una mutación en R179 y una mutación en una o más de las posiciones Q156, C206 y C244; y (b) cualquiera de un fragmento Fc modificado que tiene una afinidad disminuida para el receptor Fc-gamma y/o una semivida en suero aumentada, o un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho o una variante o derivado funcionalmente activo de la misma; y, opcionalmente, (c) un enlazante, para uso en el tratamiento o prevención de una afección o enfermedad en un individuo seleccionado del grupo que consiste en una afección relacionada con la edad, un trastorno metabólico, hiperfosfatemia, calcinosis, enfermedad renal crónica, atrofia muscular y cáncer.
  21. 21.
    El polipéptido de fusión de la reivindicación 20, en donde la afección relacionada con la edad se selecciona del grupo que consiste en sarcopenia, atrofia de la piel, desgaste muscular, atrofia cerebral, aterosclerosis, arteriosclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, presión arterial alta, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, cáncer de próstata, accidente cerebrovascular, disminución de la esperanza de vida, pérdida de memoria, arrugas, deterioro de la función renal y pérdida auditiva relacionada con la edad.
  22. 22.
    El polipéptido de fusión de la reivindicación 20, en donde el trastorno metabólico se selecciona del grupo que consiste en diabetes de Tipo II, síndrome metabólico, hiperglucemia y obesidad.
  23. 23.
    El polipéptido de fusión de la reivindicación 20, en donde el cáncer es cáncer de mama.
  24. 24.
    El polipéptido de fusión de las reivindicaciones 19-23, en donde el polipéptido de fusión comprende: (a) un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína alfa Klotho; y (b) un polipéptido que comprende una variante o derivado funcionalmente activo de FGF23 que tiene una mutación en todas las posiciones de Q156, C206 y C244 y R179.
  25. 25.
    El polipéptido de fusión de las reivindicaciones 19-24 para su uso en el tratamiento o la prevención de la atrofia muscular.
  26. 26.
    El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 19-25, en donde la proteína Klotho es una proteína Klotho humana.
  27. 27.
    Una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión soluble de SEQ ID NO: 68 o 58.
    240
ES11705830.5T 2010-01-29 2011-01-27 Métodos y composiciones que utilizan polipéptidos de fusión FGF23 Active ES2605302T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/696,693 US8420088B2 (en) 2008-01-28 2010-01-29 Methods and compositions using FGF23 fusion polypeptides
US696693 2010-01-29
PCT/EP2011/051112 WO2011092234A1 (en) 2010-01-29 2011-01-27 Methods and compositions using fgf23 fusion polypeptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2605302T3 true ES2605302T3 (es) 2017-03-13

Family

ID=43828141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11705830.5T Active ES2605302T3 (es) 2010-01-29 2011-01-27 Métodos y composiciones que utilizan polipéptidos de fusión FGF23

Country Status (16)

Country Link
US (3) US8420088B2 (es)
EP (2) EP3124612A1 (es)
JP (2) JP5964243B2 (es)
KR (1) KR20130032296A (es)
CN (3) CN103204941B (es)
AR (1) AR080043A1 (es)
AU (1) AU2011209380B2 (es)
CA (1) CA2787285A1 (es)
EA (1) EA201201047A1 (es)
ES (1) ES2605302T3 (es)
MX (1) MX336391B (es)
PL (1) PL2529016T3 (es)
PT (1) PT2529016T (es)
TW (2) TWI430805B (es)
UY (1) UY33204A (es)
WO (1) WO2011092234A1 (es)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8420088B2 (en) 2008-01-28 2013-04-16 Novartis Ag Methods and compositions using FGF23 fusion polypeptides
TW200936156A (en) 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
PL2726511T3 (pl) 2011-07-01 2019-12-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Kompozycje, zastosowania i sposoby leczenia zaburzeń oraz chorób metabolicznych
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
EP3798228A1 (en) 2012-11-28 2021-03-31 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
CN102961739A (zh) * 2012-12-12 2013-03-13 黄曙 Klotho蛋白的用途
SG11201504815QA (en) 2012-12-27 2015-07-30 Ngm Biopharmaceuticals Inc Methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
WO2014152993A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Use of klotho nucleic acids or proteins for treatment of diabetes and diabetes-related conditions
KR101492710B1 (ko) * 2013-04-03 2015-02-13 중앙대학교 산학협력단 Fgf23 유전자를 이용한 전립선암 진단용 마커 및 이를 이용한 전립선암 예측 및 진단 방법
JP6159930B2 (ja) * 2013-10-24 2017-07-12 地方独立行政法人東京都健康長寿医療センター 筋幹細胞又は筋芽細胞、及びそれを用いた代謝変換に関与する物質のスクリーニング方法、並びにスクリーニング方法によって得られた物質を含む医薬組成物
NZ718962A (en) 2013-10-28 2019-12-20 Ngm Biopharmaceuticals Inc Cancer models and associated methods
CA2929181A1 (en) 2013-11-13 2015-05-21 Novartis Ag Mtor inhibitors for enhancing the immune response
AU2015209131B2 (en) 2014-01-24 2020-06-25 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
JP6370577B2 (ja) * 2014-03-26 2018-08-08 国立大学法人京都工芸繊維大学 抗老化物質のスクリーニング方法
WO2015183890A2 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of metabolic disorders and diseases
EP3155005A4 (en) 2014-06-16 2018-07-11 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
CN114129709A (zh) 2014-10-23 2022-03-04 恩格姆生物制药公司 包含肽变异体的药物组合物及其使用方法
US10434144B2 (en) 2014-11-07 2019-10-08 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
BR112017011398A2 (pt) * 2014-12-04 2018-04-03 Novartis Ag métodos e composições que usam polipeptídeos variantes de klotho
EP3957317A1 (en) 2015-02-06 2022-02-23 The Regents of The University of California Methods and compositions for improved cognition
WO2017019957A2 (en) 2015-07-29 2017-02-02 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Binding proteins and methods of use thereof
CA3003616C (en) 2015-11-09 2020-07-28 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders
AU2017272349B2 (en) * 2016-06-02 2022-12-01 Klotho Therapeutics, Inc. Therapeutic recombinant klotho proteins and compositions and methods involving the same
EA037848B1 (ru) 2016-07-14 2021-05-27 Общество С Ограниченной Ответственностью "Биохимический Агент" Гибридный белок, полинуклеотид, генетическая конструкция, продуцент, препарат для регенерации хряща (варианты)
CN107759694B (zh) * 2016-08-19 2023-01-13 安源医药科技（上海）有限公司 双特异性抗体及其制备方法与用途
US11123438B2 (en) 2016-08-19 2021-09-21 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
CA3034399A1 (en) 2016-08-26 2018-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating fibroblast growth factor 19-mediated cancers and tumors
AU2020257570A1 (en) * 2019-04-19 2021-10-28 Genethon Gene therapy of fibroblast growth factor 23 related hypophosphatemic diseases
WO2021128065A1 (zh) * 2019-12-25 2021-07-01 广州菲康生物技术有限公司 人fgf-23的荧光免疫层析试纸和人fgf-23的荧光免疫层析检测试剂盒
US11028132B1 (en) 2020-04-07 2021-06-08 Yitzhak Rosen Half-life optimized linker composition
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
US20250154487A1 (en) * 2023-11-10 2025-05-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Engineered alpha klotho polypeptides and uses thereof

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL71691A (en) 1984-04-27 1991-04-15 Yeda Res & Dev Production of interferon-ypsilon
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
US5266561A (en) 1988-01-11 1993-11-30 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Treatment of type 2 diabetes mellitus
CA2071867A1 (en) 1989-11-06 1991-05-07 Edith Mathiowitz Method for producing protein microspheres
ES2217250T3 (es) 1990-06-15 2004-11-01 Scios Inc. Mamifero transgenico, no humano que muestra la patologia de formacion amiloides de la enfermedad de alzheimer.
US5408038A (en) * 1991-10-09 1995-04-18 The Scripps Research Institute Nonnatural apolipoprotein B-100 peptides and apolipoprotein B-100-apolipoprotein A-I fusion peptides
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5420112A (en) 1992-06-12 1995-05-30 Lewis; Michael E. Prevention and treatment of peripheral neuropathy
US5541094A (en) * 1992-09-25 1996-07-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyoxylic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures prepared using a microbial transformant
US5877399A (en) 1994-01-27 1999-03-02 Johns Hopkins University Transgenic mice expressing APP-Swedish mutation develop progressive neurologic disease
US6187992B1 (en) 1994-12-05 2001-02-13 Merck & Co., Inc. Transgenic mouse having a disrupted amyloid precursor protein gene
AU710347B2 (en) 1995-08-31 1999-09-16 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
US6194177B1 (en) 1996-02-20 2001-02-27 Applied Research Systems Ars Holding N.V. DNA encoding a hybrid heterodimeric protein
WO1997033572A1 (en) 1996-03-15 1997-09-18 Somerset Pharmaceuticals, Inc. Method for preventing and treating peripheral neurophathy by administering selegiline
US6358752B1 (en) 1996-09-27 2002-03-19 Cornell Research Foundation, Inc. Liposome-enhanced test device and method
AU739057B2 (en) 1996-12-26 2001-10-04 Shirankai Kyoto University Faculty Of Medicine Alumni Association Inc. Novel polypeptide, novel DNA, and novel antibody
US6127598A (en) 1997-07-25 2000-10-03 The Regents Of The University Of California NKX-2.2 and NKX-6.1 transgenic mouse models for diabetes, depression, and obesity
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
AU3463699A (en) 1998-04-03 1999-10-25 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
US7060479B2 (en) * 1999-12-08 2006-06-13 Serono Genetics Institute, S.A. Full-length human cDNAs encoding potentially secreted proteins
US20030055231A1 (en) 1998-10-28 2003-03-20 Jian Ni 12 human secreted proteins
DE60026287T2 (de) 1999-04-22 2006-08-17 Liposcience, Inc. Nmr-verfahren zur bestimmung des risikos zur entwicklung von diabetes type 2
AU782102B2 (en) 1999-08-12 2005-07-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Identification of genetic markers of biological age and metabolism
US6569832B1 (en) 1999-11-12 2003-05-27 Novo Nordisk A/S Inhibition of beta cell degeneration
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
US6406853B1 (en) 1999-12-23 2002-06-18 The Regents Of The University Of California Interventions to mimic the effects of calorie restriction
JP2006238894A (ja) * 2000-02-15 2006-09-14 Amgen Inc 線維芽細胞成長因子−２３分子およびその使用
US20060160181A1 (en) * 2000-02-15 2006-07-20 Amgen Inc. Fibroblast Growth Factor-23 molecules and uses thereof
JP2003531583A (ja) 2000-03-08 2003-10-28 カイロン コーポレイション ヒトｆｇｆ−２３遺伝子および遺伝子発現産物
JP2004504063A (ja) * 2000-07-19 2004-02-12 アドバンスド　リサーチ　＆　テクノロジー　インスティテュート 新規線維芽細胞増殖因子（ｆｇｆ２３）および使用方法
AU2002243750A1 (en) 2001-01-30 2002-08-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel nucleic acid and polypeptide molecules
US7588757B2 (en) 2001-03-14 2009-09-15 Genzyme Corporation Methods of treating Parkinson's disease using recombinant adeno-associated virus virions
CA2443719A1 (en) * 2001-04-26 2002-11-07 Geneprot, Inc. Human fibroblast growth factor-related compositions
EP1327443A1 (en) 2001-12-21 2003-07-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic or preventing agent for the diseases caused by a decrease in the expression level of the klotho protein
US7217798B2 (en) 2003-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of Fc-fusion protein serum half-lives by mutagenesis
US20050004348A1 (en) * 2002-12-23 2005-01-06 Miyamoto Ken-Ichi Novel type II Na/Pi cotransporters and type II Na/Pi cotransporter expression regulatory factors
TW200936156A (en) 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
US8420088B2 (en) 2008-01-28 2013-04-16 Novartis Ag Methods and compositions using FGF23 fusion polypeptides
WO2009117622A2 (en) * 2008-03-19 2009-09-24 Ambrx, Inc. Modified fgf-23 polypeptides and their uses
EP2358749B1 (en) 2008-10-10 2018-07-18 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
US20120052069A1 (en) 2009-05-05 2012-03-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
US8461111B2 (en) 2009-05-20 2013-06-11 Florida State University Research Foundation Fibroblast growth factor mutants having improved functional half-life and methods of their use
US20110195077A1 (en) 2010-01-29 2011-08-11 Novartis Ag Methods and compositions using fgf23 fusion ppolypeptides
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules

Also Published As

Publication number Publication date
MX2012008780A (es) 2012-12-17
PL2529016T3 (pl) 2017-02-28
CA2787285A1 (en) 2011-08-04
JP2013517781A (ja) 2013-05-20
US20160031961A1 (en) 2016-02-04
UY33204A (es) 2011-08-31
US20100215657A1 (en) 2010-08-26
CN103204941B (zh) 2016-05-04
TW201414488A (zh) 2014-04-16
CN102725413A (zh) 2012-10-10
PT2529016T (pt) 2016-12-12
CN103204941A (zh) 2013-07-17
EP2529016A1 (en) 2012-12-05
JP5964243B2 (ja) 2016-08-03
US20130224196A1 (en) 2013-08-29
AR080043A1 (es) 2012-03-07
CN102725413B (zh) 2016-05-11
JP2016190847A (ja) 2016-11-10
EP3124612A1 (en) 2017-02-01
EP2529016B1 (en) 2016-08-24
TWI430805B (zh) 2014-03-21
CN105968208A (zh) 2016-09-28
US8932589B2 (en) 2015-01-13
AU2011209380A1 (en) 2012-08-09
AU2011209380B2 (en) 2013-09-12
TW201129373A (en) 2011-09-01
US9475857B2 (en) 2016-10-25
TWI569805B (zh) 2017-02-11
WO2011092234A1 (en) 2011-08-04
MX336391B (es) 2016-01-18
KR20130032296A (ko) 2013-04-01
EA201201047A1 (ru) 2013-02-28
US8420088B2 (en) 2013-04-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2605302T3 (es) Métodos y composiciones que utilizan polipéptidos de fusión FGF23
ES2479417T3 (es) Métodos y composiciones que utilizan polipéptidos de fusión Klotho-FGF
US9139631B2 (en) Methods and compositions using FGF23 variant polypeptides with reduced aggregation and cleavage
EP3227319B1 (en) Methods and compositions using klotho variant polypeptides
US20170233446A1 (en) Methods and compositions using klotho-fgf fusion polypeptides