ES2479417T3

ES2479417T3 - Métodos y composiciones que utilizan polipéptidos de fusión Klotho-FGF

Info

Publication number: ES2479417T3
Application number: ES09706624.5T
Authority: ES
Inventors: David Glass; Shou-Ih Hu
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2008-01-28
Filing date: 2009-01-26
Publication date: 2014-07-24
Anticipated expiration: 2029-01-26
Also published as: MX2010008206A; CA2712634A1; ECSP10010372A; CA2712634C; AU2009209696A1; US9458209B2; EP2247614A1; CL2009000166A1; AU2009209696B2; CA2854933A1; AR070690A1; US8481031B2; CO6300826A2; BRPI0906722A2; EA201001204A1; US20130324458A1; CR11580A; EP2247614B1; PE20091405A1; MA32031B1

Abstract

Un polipéptido de fusión, el cual comprende: (a) un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho; y (b) un polipéptido que comprende un factor de crecimiento de fibroblastos, en donde (i) la proteína Klotho es alfa-Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos es el factor de crecimiento de fibroblastos 23 o la variante del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (R179Q).

Description

Métodos y composiciones que utilizan polipéptidos de fusión Klotho-FGF

1. Antecedentes

El gen alfa-Klotho codifica una proteína transmembrana tipo l de una sola pasada de 130 kDa con un dominio extracelular y un dominio citoplasmático corto. EI dominio extracelular de Ia proteína alfa-Klotho comprende dos subdominios denominados como KL-D1 y KL-D2. Estos dos subdominios comparten homología de secuencia con la β-glucosidasa de bacterias y plantas. El dominio extracelular de la proteína alfa-Klotho se puede enlazar a la superficie de la célula mediante el dominio transmembrana o se puede escindir y liberar dentro del medio extracelular. La escisión del dominio extracelular parece ser facilitado por las bajas concentraciones extracelulares locales de Ca2+ .

Además de aIfa-Klotho, se ha identificado un homólogo de alfa-Klotho, beta-Klotho, (Ito y colaboradores, Mech. Dev.

98: 115 -9 (2000)). Beta-Klotho también es una proteína transmembrana tipo l de una sola pasada con los subdominios extracelulares KL-D1 y KL-D2.

Se ha demostrado que la modulación de la expresión de alfa-Klotho produce características relacionadas con el envejecimiento en mamíferos. Ratones homocigóticos para una mutación de pérdida de función en el gen alfa-Klotho desarrollan características que se parecen al envejecimiento humano, incluyendo un período de vida más corto, atrofia de la piel, pérdida de masa muscular, arterioesclerosis, enfisema pulmonar, y osteoporosis (Kuro-o y colaboradores, Nature, 390: 45 -51 (1997)). En contraste, la sobreexpresión del gen alfa-Klotho en ratones extiende el período de vida y aumenta Ia resistencia al estrés oxidativo en relación con los ratones de tipo silvestre (Kurosu y colaboradores, Science 309: 1829 -1833 (2005); Yamamoto y colaboradores, J. Biol. Chem. 280: 38029 -38034 (2005)). Las posibles aplicaciones médicas de Klotho y la participación de Klotho en el metabolismo de la vitamina D y minerales ha sido revisado por Ureña-Torres y colaboradores (Kidney International (2007) 71, 730 -737).

Los factores de crecimiento de fibroblastos (los FGF) constituyen una familia de factores de crecimiento de polipéptidos homólogos expresados en muchos organismos (Ornitz e Itoh, Genome Biol. 2: revisiones, 3005.1 3005.12 (2001)). Entre las especies de vertebrados, los FGF están altamente conservados tanto en la estructura del gen como en la secuencia de aminoácidos, con una identidad de aminoácidos entre 13 al 71% entre sí. En los seres humanos, existen 22 miembros conocidos de la familia del FGF (FGF15 es el ortólogo de ratón del FGF19 humano, y, por consiguiente, no existe FGF15 humano). Durante el desarrollo temprano, los FGF regulan la proliferación, migración, y diferenciación celular, pero en el organismo adulto, los FGF mantienen la homeostasis, actúan en la reparación del tejido, y responden a lesiones.

Los FGF funcionan como factores de crecimiento mediante el enlace, y por lo tanto la activación de los receptores del FGF de la superficie de la célula. Los receptores del FGF (FGFR) son receptores de tirosina quinasa que activan la transducción de la señal a través de la autofosforilación del FGFR, la fosforilación del FRS2 (sustrato 2 del receptor del FGF) y ERK1/2 (proteína quinasa 1/2 regulada por una señal extracelular), y la activación de Egr-1 (respuesta de crecimiento temprano 1). Los FGF también tienen una alta afinidad por los proteoglicanos de sulfato de heparina. Cuando se enlazan con los FGF, el sulfato de heparina mejora la activación de los FGFR.

Estudios recientes han demostrado características biológicas sorprendentemente similares entre ratones deficientes en FGF23 y ratones deficientes en aIfa-Klotho (Shimada y colaboradores, J. Clin. lnvest. 113: 561 -568 (2004); Yoshida y colaboradores, Endocrinology 143: 683 -689 (2002)), lo que indica una interferencia funcional entre FGF23 y aIfa-Klotho. Estos estudios condujeron a la identificación de alfa-Klotho como un compañero obligatorio de FGF23, en términos tanto de enlace como de señalización a través de sus receptores del FGF similares (Urakawa y colaboradores, Nature 22: 1524 -6 (2007)). El gen alfa-Klotho se expresa principalmente en riñón, glándula paratiroidea, y plexo coroideo. Se plantea la hipótesis de que la expresión específica en el tejido de alfa-Klotho restringe la activación de la señalización de FGF23 para estos tejidos.

De una manera similar a FGF23/alfa-Klotho, beta-Klotho es un compañero obligatorio de FGF19 y FGF21, tanto en el enlace como en la señalización a través de sus receptores del FGF similares respectivos (Ogawa y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 104: 7432 -7 (2007); Lin y colaboradores, J. Biol Chem. 282: 27227 -84 (2007); y Wu y colaboradores, J. Biol. Chem. 282: 29069 -72 (2007)). Estos estudios también han demostrado el involucramiento de beta-Klotho en la regulación de Ia actividad metabólica específica del tejido. Inicialmente se demostró que beta-Klotho actúa con FGF21 como un cofactor para regular el metabolismo de carbohidratos y lípidos en el tejido adiposo. Beta-Klotho en conjunto con FGF19 regula el metabolismo del ácido biliar en el hígado, explicando por consiguiente la elevada síntesis de bilis en los ratones deficientes en beta-Klotho (Ito y colaboradores, J Clin Invest. Agosto 2005; 115(8): 2202 -8).

La patente de los Estados Unidos No. 6.579.850 describe polipéptidos y composiciones que comprenden un polipéptido alfa-Klotho. Se divulgan polipéptidos aIfa-Klotho humanos y de ratón. La patente también da a conocer que las composiciones que comprenden los polipéptidos son útiles en el tratamiento de un síndrome que se parece al envejecimiento prematuro, en el tratamiento de enfermedades de adultos, y en la supresión del envejecimiento.

La patente de los Estados Unidos No. 7.223.563 describe ácidos nucleicos aislados que codifican la secuencia del polipéptido FGF23, o células recombinantes que comprenden este ácido nucleico aislado. La patente se refiere además a métodos de diagnóstico y tratamiento de trastornos hipofosfatémicos e hiperfosfatémicos, osteoporosis, dermatomiositis, y arteriopatía coronaria.

La patente de los Estados Unidos No. 7.259.248 describe ácidos nucleicos aislados que codifican la secuencia del polipéptido FGF21. La patente se refiere además a métodos de diagnóstico y el tratamiento de una enfermedad hepática, condiciones relacionadas con la función tímica, y métodos de tratamiento de condiciones de los testículos.

2. Resumen de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos de fusión Klotho. Los polipéptidos de fusión Klotho de Ia presente invención se forman a partir de una proteína Klotho o un fragmento activo de la misma y un factor de crecimiento de fibroblastos 23 o un fragmento activo del mismo.

Se divulgan además un polipéptido de fusión que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos o un fragmento activo del mismo. EI dominio extracelular de Klotho se puede derivar a partir de cualquiera de las isoformas alfa o beta Klotho. El componente del FGF del polipéptido de fusión Klotho se describe primordialmente con referencia al factor de crecimiento de fibroblastos 19, al factor de crecimiento de fibroblastos 21, y al factor de crecimiento de fibroblastos 23. El lector de la presente solicitud puede asumir que cada uno de cada combinación del dominio extracelular alfa o beta con cada proteína del FGF humano o un fragmento activo de la misma son individualmente y específicamente contemplados.

De acuerdo con la presente invención, el dominio extracelular de la proteína Klotho puede incluir uno o ambos de los dominios KL-D1 y KL-D2 de una proteína alfa Klotho. En algunas forma de realizaciones, el polipéptido de fusión alfa-Klotho de la invención tiene al menos dos subdominios extracelulares. Por ejemplo, los dos subdominios extracelulares pueden ser dos dominios KL-D1 en repeticiones en tándem, dos dominios KL-D2 en repeticiones en tándem, o un dominio KL-D1 y un dominio KL-D2. En una forma de realización, el polipéptido de fusión de la invención comprende los aminoácidos 28 a 292 de la proteína alfa-Klotho de longitud completa.

De acuerdo con la presente invención, un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína alfa Klotho y un FGF-23 o un fragmento activo del mismo se pueden enlazar entre si de una manera covalente, por ejemplo, se pueden enlazar o fusionar químicamente en el marco mediante un enlace peptídico. También se pueden enlazar por medio de un enlazador. Los ejemplos no limitantes del enlazador de polipéptidos son las SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, y 18. Estos enlazadores pueden comprender al menos una y hasta aproximadamente 30 repeticiones de las SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18.

De acuerdo con la presente invención, el subdominio extracelular de una proteína alfa-Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos 23 se pueden enlazar operativamente entre sí en una variedad de orientaciones y formas. Por ejemplo, el subdominio extracelular de la proteína alfa-Klotho se puede enlazar operativamente al terminal N del factor de crecimiento de fibroblastos 23 o, de una forma alternativa, el factor de crecimiento de fibroblastos 23 se puede enlazar operativamente al terminal N de un subdominio extracelular de la proteína alfa-Klotho.

En una forma de realización, Ia presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende un sKlotho de una proteína alfa-Klotho y un enlazador. En otra forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende un sKlotho de la proteína alfa-Klotho y un enlazador. En otra forma de realización, Ia presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende un sKlotho de la proteína alfa-Klotho y un enlazador. Las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión de la invención, y sus usos para el tratamiento o la prevención de condiciones relacionadas con Ia edad son también abarcadas por la presente invención.

En una forma de realización, Ia presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende un sKlotho de la proteína alfa-Klotho con péptido de señal fusionado (directa o indirectamente a través de un enlazador) a FGF

23. En otra forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende un sKlotho de la proteína alfa-Klotho sin péptido de señal fusionado (directa o indirectamente a través de un enlazador) a FGF-23. En otra forma de realización, la presente invención proporciona sKlotho de Ia proteína aIfa-Klotho con péptido de señal fusionado (directa o indirectamente a través de un enlazador) a FGF-23 sin péptido de señal. En otra forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende sKlotho de la

proteína aIfa-Klotho sin péptido de señal fusionado (directa o indirectamente a través de un enlazador) a FGF-23 sin péptido de señal.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende un sKlotho de la proteína alfa-Klotho con péptido de señal fusionado (directa o indirectamente a través de un enlazador) a la variante de FGF-23 (R179Q). En otra forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende un sKlotho de Ia proteína alfa-Klotho sin péptido de señal fusionado (directa o indirectamente a través de un enlazador) a la variante de FGF-23 (R179Q). En otra forma de realización, la presente invención proporciona sKlotho de la proteína alfa-Klotho con péptido de señal fusionado (directa o indirectamente a través de un enlazador) a la variante de FGF-23 (R179Q) sin péptido de señal. En otra forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende sKlotho de la proteína alfa-Klotho sin péptido de señal fusionado (directa o indirectamente a través de un enlazador) a la variante de FGF-23 (R179Q) sin péptido de señal.

En una forma de realización, Ia presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende (1) sKlotho de la proteína alfa-Klotho con péptido de señal; (2) un enlazador; y (3) Ia variante de FGF-23 (R179Q) sin péptido de señal. En otra forma de realización, Ia presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende (1) sKlotho de la proteína alfa-Klotho sin péptido de señal; (2) un enlazador; y (3) la variante de FGF-23 (R179Q) sin péptido de señal. En algunas forma de realización, los polipéptidos de fusión de la invención están glicosilados.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende (1) sKlotho de la proteína alfa-Klotho con péptido de señal (SEQ ID No: 44 o SEQ ID No: 45); (2) un enlazador que comprende la SEQ lD NO: 11; y (3) Ia variante de FGF-23 (R179Q) sin péptido de señal (SEQ ID NO: 43). En otra forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende (1) sKlotho de la proteína alfa-Klotho sin péptido de señal (SEQ lD NO: 7); (2) un enlazador que comprende la SEQ ID NO: 11; y (3) la variante de FGF-23 (R179Q) sin péptido de señal (SEQ ID NO: 43). En una forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 19, 20, 40 o

41. En algunas formas de realización, los polipéptidos de fusión de la invención están glicosilados.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende sKlotho de la proteína aIfa-Klotho con péptido de señal (SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 45); y un enlazador que comprende la SEQ ID No: 11. En otra forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende sKlotho de la proteína alfa-Klotho sin péptido de señal (SEQ ID NO: 7); y un enlazador que comprende la SEQ lD NO: 11. En algunas formas de realización, los polipéptidos de fusión de la invención están glicosilados.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende una proteína del FGF humano o un fragmento activo de la misma (por ejemplo, sin el péptido de señal); y un enlazador que comprende la SEQ lD NO: 11. En algunas formas de realización, los polipéptidos de fusión de la invención están glicosilados.

En una forma de realización, Ia presente invención proporciona una composición farmacéutica (por ejemplo, en una forma de administración intramuscular), la cual comprende (por ejemplo, como un único ingrediente farmacéuticamente activo) un polipéptido de fusión (por ejemplo, glicosilado o no glicosilado) que comprende (1) sKlotho de la proteína alfa-Klotho con péptido de señal (SEQ ID NO: 44 o SEQ ID NO: 45); (2) un enlazador que comprende la SEQ ID NO: 11; y (3) la variante de FGF-23 (R179Q) sin péptido de señal (SEQ ID NO: 43); y los usos de la composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de condiciones relacionadas con la edad, tales como atrofia muscular. En otra forma de realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica (por ejemplo, en una forma de administración intramuscular), Ia cual comprende (por ejemplo, como un único ingrediente farmacéuticamente activo) un polipéptido de fusión (por ejemplo, glicosilado o no glicosilado) que comprende (1) sKlotho de la proteína aIfa-Klotho sin péptido de señal (SEQ ID NO: 7); (2) un enlazador que comprende la SEQ ID NO: 11; y (3) la variante de FGF-23 (R179Q) sin péptido de señal (SEQ ID NO: 43); y los usos de la composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de condiciones relacionadas con la edad, tales como atrofia muscular. En una forma de realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica (por ejemplo, en una forma de administración intramuscular), la cual comprende (por ejemplo, como un único ingrediente farmacéuticamente activo) un polipéptido de fusión (por ejemplo, glicosilado o no glicosilado) que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 19, 20, 40 o 41; y los usos de la composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de condiciones relacionadas con la edad, tales como atrofia muscular.

En una forma de realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica (por ejemplo, en una forma de administración intramuscular), la cual comprende (por ejemplo, como un único ingrediente farmacéuticamente activo) un polipéptido de fusión (por ejemplo, glicosilado o no glicosilado) que comprende FGF23 y sKlotho de la proteína aIfa-Klotho con péptido de señal (SEQ lD NO: 44 o SEQ ID NO: 45); y un enlazador que comprende la SEQ ID NO: 11; y los usos de la composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de

condiciones relacionadas con la edad, tales como atrofia muscular. En otra forma de realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica (por ejemplo, en una forma de administración intramuscular), la cual comprende (por ejemplo, como un único ingrediente farmacéuticamente activo) un polipéptido de fusión (por ejemplo, glicosilado o no glicosilado) que comprende FGF-23 y sKlotho de la proteína alfa-Klotho sin péptido de señal (SEQ ID NO: 7); y un enlazador que comprende la SEQ ID No: 11; y los usos de la composición farmacéutica para el tratamiento y/o la prevención de condiciones relacionadas con la edad, tales como atrofia muscular.

En una forma de realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, la cual comprende (por ejemplo, como un único ingrediente farmacéuticamente activo) un polipéptido de fusión (por ejemplo, glicosilado

: o no glicosilado) que comprende una alfa-Klotho o un fragmento activo de la misma y una proteína FGF-23 humana

: o un fragmento activo de la misma (por ejemplo, sin el péptido de señal); y un enlazador que comprende la SEQ ID NO: 11.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de fusión de la invención, y sus usos para el tratamiento o Ia prevención de condiciones relacionadas con la edad (por ejemplo, atrofia muscular) son también abarcadas por la presente invención.

En una forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que es al menos 95% idéntico a Ia SEQ ID No: 19. En otra forma de realización, la presente invención proporciona un polipéptido de fusión que es al menos 95% idéntico a Ia SEQ ID NO: 20.

En una forma de realización, Ia presente invención proporciona un polipéptido de fusión que es al menos 95% idéntico a la SEQ ID NO: 40. En otra forma de realización, Ia presente invención proporciona un polipéptido de fusión que es al menos el 95% idéntico a la SEQ ID NO: 41.

Adicionalmente se divulga un polipéptido de fusión que comprende un sKlotho de la proteína beta-Klotho con péptido de señal fusionado (directa o indirectamente a través de un enlazador) al FGF-19 o a un fragmento activo del mismo. Además se divulga un polipéptido de fusión que comprende un sKlotho de la proteína beta-Klotho sin péptido de señal fusionado (directa o indirectamente a través de un enlazador) al FGF-19 o a un fragmento activo del mismo. En otro aspecto, se divulga un polipéptido de fusión que comprende un sKlotho de la proteína beta-Klotho con péptido de señal fusionado (directa o indirectamente a través de un enlazador) al FGF-21 o a un fragmento activo del mismo. En aún otro aspecto, se divulga un polipéptido de fusión que comprende un sKlotho de la proteína beta-Klotho sin péptido de señal fusionado (directa o indirectamente a través de un enlazador) al FGF-21 o a un fragmento activo del mismo.

La invención proporciona secuencias de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de los polipéptidos de fusión Klotho descritos en Ia presente invención, y células huésped que contienen los ácidos nucleicos.

La invención también proporciona una composición que tiene cualquiera de los polipéptidos de fusión alfa-Klotho contemplados en la presente invención. Las composiciones de Ia invención pueden incluir además heparina.

La invención también proporciona un método para el tratamiento o la prevención de una condición relacionada con la edad en un individuo. A un individuo (por ejemplo, un ser humano) se le administra una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene el polipéptido de fusión Klotho de la invención, para tratar o prevenir Ia condición relacionada con la edad. En particular, se divulga un método para el tratamiento o la prevención de pérdida de masa muscular que comprende la administración a un individuo (por ejemplo, un ser humano) de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de fusión que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína alfa-Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos (o un fragmento activo del mismo).

Adicionalmente, se divulga un método para el tratamiento o la prevención de un trastorno metabólico en un individuo. A un individuo se le administra una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene un polipéptido de fusión de Ia invención, que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos (o un fragmento activo del mismo), con el fin de tratar el trastorno metabólico. Además se divulga un polipéptido de fusión de la invención que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína beta-Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos 21 es útil para el tratamiento de un trastorno metabólico.

Los polipéptidos de fusión de KIotho-FGF23 de la invención se pueden utilizar para el tratamiento o la prevención de hiperfosfatemia o calcinosis en un individuo. Se administra una dosis farmacológicamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene el polipéptido de fusión Klotho de la invención, que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos, para tratar o prevenir la hiperfosfatemia o la calcinosis. En particular, un polipéptido de fusión Klotho de la invención que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína alfa-Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos 23 es útil para el tratamiento de hiperfosfatemia o calcinosis.

Los polipéptidos de fusión de Klotho-FGF23 de la invención se pueden utilizar para el tratamiento o Ia prevención de una enfermedad renal crónica o insuficiencia renal crónica en un individuo. Se administra una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene el polipéptido de fusión Klotho de la invención, que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho (por ejemplo, una proteína alfa-Klotho) y un factor de crecimiento de fibroblastos, para tratar o prevenir una enfermedad renal crónica o insuficiencia renal crónica.

Los polipéptidos de fusión de KIotho-FGF23 de la invención se pueden utilizar para el tratamiento o la prevención de cáncer (por ejemplo, cáncer de mama) en un individuo. Se administra una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene el polipéptido de fusión Klotho de la invención, que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho (por ejemplo, una proteína alfa-Klotho) y un factor de crecimiento de fibroblastos, para tratar o prevenir cáncer, o cáncer de mama.

La presente invención proporciona polipéptidos de fusión que comprenden al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un FGF o un fragmento activo del mismo, para uso en medicina. En una forma de realización, la presente invención proporciona polipéptidos de fusión que comprenden al menos un subdominio extracelular de una proteína alfa-Klotho y un FGF-23 o un fragmento activo del mismo, para uso en el tratamiento o en la prevención de atrofia muscular. También se divulga un método para el tratamiento o Ia prevención de una condición relacionada con Ia edad (por ejemplo, atrofia muscular), el cual comprende administrar a un individuo que lo necesite, una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica, la cual comprende una proteína Klotho soluble.

También se divulgan kits para el tratamiento o la prevención de un trastorno relacionado con la edad o un trastorno metabólico en un individuo. EI kit incluye instrucciones para su uso y un polipéptido de fusión Klotho purificado que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos.

3. Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra varias formas de realización diferentes de polipéptidos de fusión Klotho que incluyen polipéptidos de la invención. Los polipéptidos de fusión representados incluyen uno o más subdominios extracelulares de Klotho operativamente enlazados a un factor de crecimiento de fibroblastos. Los polipéptidos que contienen uno o más subdominios extracelulares de Klotho incluyen, por ejemplo, un dominio extracelular de Klotho (por ejemplo, 1 a 982 aminoácidos del Klotho humana), o un fragmento activo de Klotho.

La Figura 2 ilustra las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de varios polipéptidos de fusión Klotho incluyendo aquellos de la invención y los componentes de los mismos (por ejemplo, el dominio extracelular de Klotho, FGF).

Las Figuras 3A-3C ilustran la expresión proteica de una proteína de fusión de sKlotho-FGF23. La Figura 3A muestra que se detectó Ia proteína de fusión de sKlotho-FGF23 en un medio acondicionado mediante transferencias tipo Western con anticuerpos anti-FGF23. La Figura 3B muestra que se detectó la proteína de fusión de sKlotho-FGF23 en un medio acondicionado mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie. La Figura 3C muestra una proteína de fusión de sKIotho-FGF23-6xHis altamente purificada, analizada mediante SDS-PAGE y teñida con azul de Coomassie.

La Figura 4 ilustra los resultados de un ensayo de Iuciferasa de Egr-1 que compara el nivel de activación de Egr-1 en células tratadas con un medio acondicionado que contiene ya sea un polipéptido de fusión Klotho, únicamente un polipéptido FGF-23, únicamente un polipéptido Klotho soluble (sKlotho), y un polipéptido Klotho soluble en combinación con un polipéptido FGF-23 en ausencia o en la presencia de heparina (20 µg/ml).

Las Figuras 5A-5B ilustran los resultados de un ensayo de Iuciferasa de Egr-1 que compara el nivel de activación de Egr-1 en células tratadas con un polipéptido de fusión Klotho purificado, un polipéptido FGF-23, o un polipéptido Klotho soluble en ausencia o en presencia de heparina. La Figura 5A muestra los resultados de un experimento que compara el nivel de activación de Egr-1 en células tratadas solo con FGF-23, sKlotho-His (10 nM o 20 nM), y una combinación de FGF-23 y sKlotho-His (10 nM o 20 nM) en ausencia o en presencia de heparina (20 µg/ml). La Figura 5B muestra Ia actividad reportera de luciferasa de Egr-1 en células tratadas con una fusión de sKlothoFGF23-His (0 nM; 0,6 nM; 1,21 nM; 2,41 nM; 4,83 nM; 9,65 nM; y 19,3 nM).

Las Figuras 6A-6B ilustran el efecto del tratamiento con un polipéptido de fusión sKlotho purificado sobre células musculares C2C12. La Figura 6A muestra las mediciones del diámetro del miotubo en células musculares C2C12 tratadas ya sea con lGF-1 (10 nM), FGF2 (20 ng/ml), o un polipéptido de fusión Klotho purificado (20 nM), en ausencia o en presencia de dexametasona (100 µM). La Figura 6B muestra la fosforilación de las proteínas de la ruta de señalización en células musculares C2C12 mediante lGF-1 (10 nM), FGF2 (20 ng/ml), o un polipéptido de fusión Klotho purificado (20 nM), en ausencia o en presencia de rapamicina (40 nM).

4. Descripción detallada

La presente invención se refiere a métodos, kits, y composiciones para prevenir o tratar condiciones relacionadas con la edad y trastornos metabólicos. Los polipéptidos de fusión de la invención incluyen una proteína Klotho o un fragmento activo de la misma operativamente enlazados a un polipéptido de factor de crecimiento de fibroblastos 23

o un fragmento activo del mismo. Las proteínas de fusión Klotho o sKlotho de la presente invención son útiles en el tratamiento y la prevención de una variedad de condiciones relacionadas con la edad, incluyendo sarcopenia, atrofia de la piel, pérdida de masa muscular, atrofia cerebral, ateroesclerosis, arterioesclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, presión sanguínea alta, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, cáncer de próstata, embolia, menor expectativa de vida, pérdida de memoria, arrugas, función renal deteriorada, y pérdida de audición relacionada con la edad; y trastornos metabólicos, incluyendo diabetes tipo ll, síndrome metabólico, hiperglicemia y obesidad.

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que a pesar de las limitaciones físicas (por ejemplo, el tamaño grande de ambos polipéptidos, Klotho y FGF), los polipéptidos de fusión de Klotho-FGF son altamente efectivos en la activación de un receptor del FGF. Este hallazgo es inesperado dado que la fusión de estas dos proteínas probablemente interferiría con la heterodimerización y, por consiguiente, con las actividades de las proteínas; por ejemplo, los dominios de enlazamiento de las proteínas se pueden perturbar por Ia fusión, o las proteínas se pueden orientar mal espacialmente si se juntan en una formación “cis".

Los polipéptidos de fusión de alfa-Klotho-FGF-23 descritos en Ia presente invención son convenientes debido a que permiten Ia administración de una sola proteína terapéutica que tiene una mejor actividad comparada con alfa-Klotho

o FGF-23 administrados solos o juntos como polipéptidos separados. El uso de alfa-Klotho y FGF-23 como un único polipéptido de fusión en lugar de como dos polipéptidos separados (es decir, un polipéptido Klotho y un polipéptido FGF separado) es más efectivo en la activación del receptor del FGF.

Definiciones

"Polipéptido Klotho", “proteína Klotho”, o “Klotho", como se utiliza en la presente invención, incluye fragmentos activos, derivados, miméticos, variantes, y compuestos químicamente modificados, o híbridos de los mismos de “Klotho” de tipo silvestre. Un fragmento activo de Klotho tiene la capacidad para enlazarse a un polipéptido FGF. En términos generales, un polipéptido activo Klotho contiene al menos un subdominio de Klotho (por ejemplo, KL-D1 y KL-D2). Klotho de tipo silvestre tiene la secuencia de aminoácidos como se encuentra en Ia naturaleza. Los ejemplos de polipéptidos Klotho adecuados para uso con la presente invención incluyen alfa-Klotho (SEQ ID NO: 2) y beta-Klotho (SEQ ID NO: 4). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos del alfa-Klotho y del beta-Klotho se encuentran en Ia base de datos del GenBank con el número de acceso NM_004795; NP_004786, y NM_175737; NP_783864, respectivamente. Los polipéptidos Klotho incluyen aquéllos descritos en la patente de los Estados Unidos No. 6.579.850. Los polipéptidos Klotho incluyen aquéllos de otras especies además de los seres humanos, incluyendo alfa-Klotho de ratón (NP_038851), rata (NP_112626), conejo (NP_001075692), y beta-Klotho de ratón (NP_112457). Las especies que se predice que tienen alfa-Klotho incluyen chimpancé (XP_522655), macaco (XP_001101127), caballo (XP_001495662), vaca (XP_001252500), ornitorrinco (XP_001510981), y pollo (XP_417105). Las especies que se predice que tienen beta-Klotho incluyen chimpancé (XP_526550), macaco (XP_001091413), caballo (XP_001495248), perro (XP_536257), rata (XP_001078178), ornitorrinco (XP_001512722), y pollo (XP_423224). Los polipéptidos Klotho tienen una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ lD NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4; es decir, al menos el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, idéntica a las secuencias de aminoácidos de Ia SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4, o un fragmento activo de las mismas.

"Polipéptido de fusión" o "proteína de fusión”, como se utilizan en la presente invención, significan un polipéptido que comprende dos o más polipéptidos diferentes o fragmentos activos de los mismos que no están presentes en forma natural en el mismo polipéptido. En algunas formas de realización, los dos o más polipéptidos diferentes se enlazan operativamente entre sí de una manera covalente, por ejemplo, se enlazan químicamente o se fusionan en el marco mediante un enlace peptídico. Como se utiliza en la presente invención, un “polipéptido de fusión Klotho” es un polipéptido de fusión que incluye una secuencia de aminoácidos de un polipéptido Klotho o un fragmento activo del mismo.

“Factor de crecimiento de fibroblastos" y "FGF” se utilizan de una manera intercambiable en la presente invención, y se refieren a los polipéptidos que regulan la proliferación, migración y diferenciación, homeostasis celular, reparación del tejido y respuesta a las lesiones en un animal, incluyendo un sujeto humano. Los FGF tienen la capacidad para enlazarse a un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos y regular su actividad, incluyendo autofosforilación de FGFR, fosforilación de FRS2 (sustrato 2 del receptor del FGF) y ERK1/2 (proteína quinasa 1/2 regulada por una señal extracelular), y activación de Egr-1 (respuesta de crecimiento temprano 1). EI término "FGF” incluye fragmentos activos, derivados, miméticos, variantes, y compuestos químicamente modificados, o híbridos de los

mismos del "FGF" de tipo silvestre, por ejemplo, como se conoce en el arte, y como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 7.223.563 y en la patente de los Estados Unidos No. 7.259.248. El FGF de tipo silvestre tiene una secuencia de aminoácidos como se encuentra en la naturaleza. Los ejemplos de factores de crecimiento de fibroblastos adecuados para uso con la presente invención incluyen el factor de crecimiento de fibroblastos 19 (FGF19; SEQ ID NO: 31), el factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21; SEQ lD NO: 33), y el factor de crecimiento de fibroblastos 23 (FGF23; SEQ ID NO: 35). Los polipéptidos del FGF incluyen aquéllos de otras especies además de los seres humanos, incluyendo los FGF de murino. En términos generales, los polipéptidos FGF tienen una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 o SEQ lD NO: 35; es decir, que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, idéntica idéntica a las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 35, o fragmentos activos de las mismas.

El término "FGF", incluye fragmentos activos del polipéptido de longitud completa. Los fragmentos activos del FGF que son capaces de enlazarse a sus receptores del FGF correspondientes, se conocen en el arte, y también se contemplan para uso en la presente invención. Alguien capacitado en el arte se daría cuenta, con base en las secuencias divulgadas en la presente invención, que se pueden generar fragmentos que se traslapan de los FGF empleando tecnología recombinante convencional, por ejemplo, la que se describe en Sambrook y colaboradores, (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York) y Ausubel y colaboradores, (1997, Current Protocols in Molecular Biology, Green & Wiley, Nueva York). Alguien capacitado en el arte se dará cuenta, con base en la divulgación presentada en la presente invención, que se podría analizar la actividad biológica de los fragmentos del FGF mediante los métodos bien conocidos en el arte y descritos en la presente invención, incluyendo el enlazamiento con el receptor del FGF. De una manera similar, los modelos de cultivo celular que poseen Ia maquinaria de transducción necesaria de señales del FGF (es decir, el receptor del FGF) se pueden transfectar con fragmentos del FGF, y posteriormente se pueden analizar para determinar las alteraciones en la señalización del FGF, en relación con el FGF de tipo silvestre.

Los FGF están agrupados en siete subfamilias, con base en la homología del dominio de homología del núcleo del FGF (aproximadamente 120 aminoácidos de largo), el cual está flanqueado por las secuencias del terminal N y del terminal C que son altamente variables tanto en la longitud como en la secuencia primaria, en particular entre diferentes subfamilias del FGF (Goetz y colaboradores, Molecular and Cellular Biology, 2007, Volumen 27, 3417 3428). Un polipéptido activo FGF contiene en términos generales al menos un dominio de homología del núcleo del FGF. En algunas formas de realización, un polipéptido activo del FGF puede contener, además de un dominio de homología del núcleo del FGF, secuencias de flanqueo que pueden conferir una especificidad adicional en el enlazamiento de receptores del FGF. FGF19, FGF21, y FGF23 están agrupados en la subfamilia FGF19, debido a que la región central de estos ligandos comparte una alta identidad de secuencia en relación con otros FGF (FGF19 versus FGF21: 38% de identidad; FGF19 versus FGF23: 36% de identidad). Los miembros de la subfamilia FGF19 actúan de una forma análoga a las moléculas de señalización del sistema endocrino, y regulan diversos procesos fisiológicos poco comunes para los FGF clásicos (por ejemplo, FGF19: homeostasis del ácido biliar y energía; FGF21: metabolismo de glucosa y lípidos; y FGF 23: homeostasis de fosfato y vitamina D).

"Receptor del factor de crecimiento de fibroblastos" y "FGFR", como se utilizan en la presente invención, se refieren a cualquiera de los FGFR 1 a 4 conocidos en el arte, o las variantes de empalme de los mismos (por ejemplo, FGFR1c). Los ejemplos de receptores del factor de crecimiento de fibroblastos adecuados para uso con Ia presente invención incluyen al receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 19 (por ejemplo, beta-Klotho del FGFR4), el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 21 (por ejemplo, alfa-Klotho de FGFR1c), y el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (por ejemplo, alfa-Klotho del FGFR1c, alfa-Klotho del FGFR3, alfa-Klotho del FGFR4).

"Dominio extracelular", como se utiliza en Ia presente invención, se refiere al fragmento de una proteína transmembrana que existe fuera de una célula (por ejemplo, sin incluir la región intracelular o transmembrana). El "dominio extracelular de Ia proteína Klotho", "Klotho soluble", o "sKlotho" (por ejemplo, la SEQ ID NO: 7; la SEQ ID NO: 39), se refieren a un dominio extracelular del polipéptido Klotho que es capaz de enlazarse a un factor de crecimiento de fibroblastos, y/o que es capaz de hacer posible el enlace de un factor de crecimiento de fibroblastos a un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos mediante el enlace con el factor de crecimiento de fibroblastos. El dominio extracelular de Klotho corresponde a los residuos de aminoácidos 28 a 982 de la secuencia de alfa-Klotho de longitud completa (SEQ ID NO: 2) y a los residuos de aminoácidos 52 a 997 de la secuencia de beta-Klotho de longitud completa (SEQ lD NO: 4).

"Subdominio extracelular de la proteína Klotho" y "subdominio extracelular del polipéptido Klotho" se utilizan de una manera intercambiable en la presente invención, y se refieren a una región en el dominio extracelular del polipéptido Klotho que es capaz de enlazarse a un factor de crecimiento de fibroblastos, y/o que es capaz de hacer posible el enlace de un factor de crecimiento de fibroblastos a un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos mediante el enlace con el factor de crecimiento de fibroblastos. EI dominio extracelular de Klotho tiene dos subdominios homólogos que se repiten, es decir, KL-D1 (SEQ ID NO: 5) y KL-D2 (SEQ ID NO: 6). KL-D1 y KL-D2 corresponden respectivamente a los residuos de aminoácidos 58 a 506 y 517 a 953 del polipéptido alfa-Klotho de longitud

completa (SEQ ID NO: 2), y respectivamente a los residuos de aminoácidos 77 a 508 y 571 a 967 del polipéptido beta-Klotho de longitud completa (SEQ lD NO: 4), y son adecuados para uso con la presente invención. En términos generales, un polipéptido que contiene al menos un subdominio de Klotho es un polipéptido activo Klotho. EI subdominio extracelular de Klotho para uso con el polipéptido de la invención puede ser un dominio KL-D1 de alfa-Klotho o beta-Klotho con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ lD NO: 5 o de la SEQ ID NO: 37, respectivamente. Además, el dominio KL-D1 de Klotho puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, idéntica a la secuencia de aminoácidos de Ia SEQ ID NO: 5 o de la SEQ lD NO: 37. EI subdominio extracelular de Klotho también puede ser un dominio KL-D2 del polipéptido alfa o beta-Klotho que es sustancialmente idéntico a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o de Ia SEQ ID NO: 38, respectivamente. En una forma de realización adicional, el dominio KL-D2 tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, idéntica a la secuencia de aminoácidos de laSEQ ID NO: 6 o de laSEQ lD NO: 38.

"Péptido de señal", como se utiliza en la presente invención, significa una cadena peptídica (de 3 a 60 aminoácidos de longitud) que dirige el transporte posterior a la traducción de una proteína hacia el retículo endoplasmático, y se puede escindir. Los ejemplos de péptidos de señal adecuados para uso con la presente invención incluyen el péptido de señal de Klotho (SEQ ID NO: 19) y el péptido de señal de IgG (SEQ ID NO: 20).

"Enlazador", como se utiliza en la presente invención, significa un grupo funcional (por ejemplo, químico o polipéptido) que une covalentemente a dos o más polipéptidos o ácidos nucleicos, de tal manera que se conectan entre sí. Como se utiliza en la presente invención, un “enlazador peptídico" se refiere a uno o más aminoácidos utilizados para acoplar dos proteínas entre sí (por ejemplo, para acoplar el dominio extracelular de Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos 23). Los enlazadores peptídicos adecuados para uso con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los polipéptidos con las secuencias de aminoácidos representadas por las SEQ lD NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ lD No: 11, SEQ lD NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ lD NO: 16, SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 18.

"Operativamente enlazadas", como se utiliza en la presente invención, significa el enlace de dos o más biomoléculas de tal manera que se retienen al menos las funciones, actividades, y/o estructura biológicas, asociadas con las biomoléculas. Con referencia a los polipéptidos, el término significa que el enlace de dos o más polipéptidos da como resultado un polipéptido de fusión que retiene al menos algunas de las actividades individuales respectivas de cada componente del polipéptido. Los dos o más polipéptidos se pueden enlazar directamente o por medio de un enlazador. Con referencia a los ácidos nucleicos, el término significa que un primer polinucleótido se coloca en posición adyacente a un segundo polinucleótido que dirige la transcripción del primer polinucleótido cuando se enlazan las moléculas apropiadas (por ejemplo, las proteínas activadoras de la transcripción) al segundo polinucleótido.

"Se enlaza específicamente", como se utiliza en la presente invención, se refiere a la capacidad de una primera molécula para enlazarse a una molécula objetivo entre muchos tipos diferentes de moléculas a las que pueda quedar expuesta, debido a la capacidad de la primera molécula para adoptar una estructura particular que conduzca a la formación de interacciones no covalentes consigo misma y la otra molécula objetivo. La primera molécula se enlaza al objetivo, formando un complejo estable, en tanto que hay sustancialmente menos reconocimiento, contacto, o formación de complejo de la primera molécula con cualesquiera otras moléculas no específicas.

"Variante de polipéptido" o "variante de proteína”, como se utilizan en la presente invención, se refieren a los polipéptidos en donde uno o más aminoácidos han sido sustituidos por aminoácidos diferentes de una secuencia de referencia. Es bien entendido en el arte que algunos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros con propiedades ampliamente similares, sin cambiar la naturaleza de la actividad del polipéptido (sustituciones conservadoras), como se describe posteriormente en la presente invención. Estos términos también abarcan los polipéptidos en donde se han agregado o suprimido o reemplazado uno o más aminoácidos con diferentes aminoácidos, por ejemplo, isoformas de proteína. Un ejemplo de una variante del factor de crecimiento de fibroblastos 23 adecuada para uso con la presente invención es la variante del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (R179Q).

"Composición farmacéutica", como se utiliza en la presente invención, significa una composición que contiene un compuesto (por ejemplo, un polipéptido de fusión de Ia invención) que se puede administrar para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un individuo.

"Individuo" o "sujeto”, como se utiliza en la presente invención, se referirán a un mamífero, incluyendo, pero no limitándose a, un mamífero humano o no humano, tal como un bovino, equino, canino, ovino, o felino.

"Tratar", como se utiliza en la presente invención, significa reducir, suprimir, atenuar, disminuir, detener, o estabilizar el desarrollo o el progreso de una enfermedad. En el contexto de Ia invención, la administración de los polipéptidos de la invención se puede utilizar para tratar condiciones relacionadas con la edad, incluyendo sarcopenia, atrofia de

la piel, pérdida de masa muscular, atrofia del cerebro, ateroesclerosis, arterioesclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, presión sanguínea alta, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular relacionada con Ia edad, cáncer de próstata, embolia, menor expectativa de vida, pérdida de memoria, arrugas, función renal deteriorada, y pérdida de audición relacionada con la edad; y trastornos metabólicos, incluyendo diabetes tipo Il, síndrome metabólico, hiperglicemia, y obesidad.

"Prevenir", como se utiliza en la presente invención, se refiere a una disminución en la ocurrencia de un trastorno, o una disminución en el riesgo de adquirir un trastorno o sus síntomas asociados en un sujeto. En el contexto de Ia invención, Ia administración de los polipéptidos de la invención se puede utilizar para prevenir condiciones relacionadas con la edad, incluyendo sarcopenia, atrofia de la piel, pérdida de masa muscular, atrofia del cerebro, ateroesclerosis, arterioesclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, presión sanguínea alta, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular relacionada con Ia edad, cáncer de próstata, embolia, menor expectativa de vida, pérdida de memoria, arrugas, función renal deteriorada, y pérdida de audición relacionada con Ia edad; y trastornos metabólicos, incluyendo diabetes tipo II, síndrome metabólico, hiperglicemia, y obesidad. La prevención puede ser completa, por ejemplo, la ausencia total de una condición relacionada con la edad o un trastorno metabólico. La prevención también puede ser parcial, de tal manera que la posibilidad de la ocurrencia de Ia condición relacionada con la edad

o del trastorno metabólico en un individuo tiene menos probabilidades de presentarse que si el sujeto no hubiera recibido la presente invención.

"Enfermedad", como se utiliza en la presente invención, significa cualquier condición o trastorno que dañe o interfiera con la función normal de una célula, tejido, u órgano.

"Condición relacionada con la edad", como se utiliza en la presente invención, significa cualquier enfermedad o trastorno cuya incidencia en una población o cuya severidad en un individuo se correlacione con el avance de la edad. En una forma de realización, la condición relacionada con la edad es una enfermedad o trastorno cuya incidencia es al menos 1,5 veces más alta entre los individuos humanos mayores de 60 años de edad en relación con los individuos humanos entre las edades de 30 a 40 años, y en una población seleccionada de más de 100.000 individuos. Las condiciones relacionadas con la edad relevantes para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, sarcopenia, atrofia de la piel, pérdida de masa muscular, atrofia del cerebro, ateroesclerosis, arterioesclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, presión sanguínea alta, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, cáncer de próstata, embolia, menor expectativa de vida, pérdida de memoria, arrugas, función renal deteriorada, y pérdida de audición relacionada con la edad.

“Trastorno metabólico”, como se utiliza en la presente invención, significa cualquier enfermedad o trastorno que dañe o interfiera con Ia función normal en una célula, tejido, u órgano, al afectar a la producción de energía en las células, o a la acumulación de toxinas en una célula, tejido, órgano, o individuo. Los trastornos metabólicos relevantes para Ia presente invención incluyen, pero no se limitan a, diabetes tipo II, síndrome metabólico, hiperglicemia, y obesidad.

Una “dosis efectiva" o "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para lograr un resultado clínico benéfico o deseado. En el contexto de la invención, es una cantidad de un polipéptido de fusión Klotho o sKlotho efectiva para producir el resultado farmacológico terapéutico o preventivo pretendido. Una dosis terapéuticamente efectiva da como resultado la prevención o la disminución del trastorno o de uno o más síntomas del trastorno, (por ejemplo, una condición relacionada con Ia edad o un trastorno metabólico). Las dosis terapéuticamente efectivas variarán dependiendo del sujeto y de Ia condición de la enfermedad que se esté tratando, del peso y edad del sujeto, de la gravedad de la condición de la enfermedad, de Ia forma de administración, y similares, los cuales pueden ser fácilmente determinados por una persona ordinariamente capacitada en el arte.

"Molécula de ácido nucleico para Klotho”, como se utiliza en la presente invención es un gen que codifica una proteína Klotho. Un ejemplo de un gen Klotho humano se proporciona en el GenBank con número de acceso NM_004795 (SEQ ID NO: 1).

“Fragmento", como se utiliza en la presente invención, se refiere a una porción de un polipéptido o molécula de ácido nucleico. Esta porción contiene, de preferencia, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más de la longitud total de la molécula de ácido nucleico o polipéptido de referencia. Un fragmento puede contener 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o hasta 3000 nucleótidos o aminoácidos.

El término "sustancialmente idéntico" se refiere a un polipéptido o molécula de ácido nucleico que exhiba al menos 50% de identidad con una secuencia de aminoácidos de referencia (por ejemplo, cualquiera de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente invención) o con una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, cualquiera de

las secuencias de ácidos nucleicos descritas en la presente invención). De preferencia, esta secuencia es al menos 60%, 70%, 75%, 80%, u 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más, idéntica a nivel de aminoácidos o de ácido nucleico con la secuencia utilizada para comparación.

Se divulgan métodos, kits, y composiciones para prevenir o tratar condiciones relacionadas con la edad y trastornos metabólicos. La invención proporciona un polipéptido de fusión que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína alfa-Klotho. El polipéptido de fusión comprende además un factor de crecimiento de fibroblastos 23 o un fragmento activo del mismo.

El dominio extracelular de la proteína alfa-Klotho puede incluir uno o ambos de los dominios KL-D1 y KL-D2. En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión alfa-Klotho tiene al menos dos subdominios extracelulares de una proteína alfa-Klotho. Por ejemplo, los dos subdominios extracelulares pueden ser dos dominios KL-D1 en repeticiones en tándem, dos dominios KL-D2 en repeticiones en tándem, o un dominio KL-D1 y un dominio KL-D2.

El subdominio extracelular de la proteína alfa-Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos 23 (o un fragmento activo del mismo) se pueden enlazar operativamente entre sí en una variedad de orientaciones y maneras. Por ejemplo, el subdominio extracelular de la proteína Klotho se puede enlazar operativamente al terminal N del factor de crecimiento de fibroblastos, o de una manera alternativa, el factor de crecimiento de fibroblastos se puede enlazar operativamente al terminal N de al menos un subdominio extracelular de Ia proteína Klotho.

El polipéptido de fusión de la invención puede incluir uno o ambos de los dominios extracelulares de Klotho, es decir, KL-D1 (SEQ ID NO: 5) y KL-D2 (SEQ ID NO: 6). KL-D1 y KL-D2 corresponden respectivamente a los residuos de aminoácidos 58 a 506 y 517 a 953 del polipéptido alfa-Klotho de longitud completa (SEQ ID NO: 2). EI polipéptido de fusión puede tener un dominio KL-D1 de un polipéptido alfa-Klotho que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5. De manera específica, el polipéptido de fusión Klotho puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% o más, idéntica a la SEQ lD NO:

5. El polipéptido de fusión puede tener un dominio KL-D2 de un polipéptido alfa-Klotho con una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ lD NO: 6. De manera específica, el polipéptido de fusión Klotho puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 95% o más, idéntica a la SEQ ID NO: 6.

En algunas formas de realización, el polipéptido de fusión Klotho de la invención es soluble y es capaz de enlazarse a un receptor del FGF.

Los polipéptidos de fusión alfa-Klotho de la invención pueden contener un enlazador de polipéptido que conecta el polipéptido que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína alfa-Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos 23. Los enlazadores adecuados son bien conocidos en el arte y, en términos generales, contienen varios residuos Gly y varios residuos Ser, por ejemplo, (Gly4Ser)3, (SEQ ID NO: 11), polipéptido Gly4 Ser (SEQ ID NO: 12), Gly (SEQ lD NO: 13), Gly Gly (SEQ ID NO: 14), Gly Ser (SEQ ID NO: 15), Gly2 Ser (SEQ lD NO: 16), Ala (SEQ ID NO: 17), y Ala Ala (SEQ lD NO: 18). En algunas formas de realización, el enlazador tendrá al menos 2 y hasta aproximadamente 30 repeticiones de una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NO: 12, SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ lD NO: 17, o SEQ ID NO: 18.

Cuando un enlazador de polipéptido está presente en el polipéptido de fusión alfa-Klotho de la invención, el polipéptido que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho se puede conectar mediante un enlace peptídico al terminal N del polipéptido enlazador con el FGF-23 conectado mediante un enlace peptídico al terminal C del enlazador de polipéptido. De manera alternativa, el FGF-23 se puede conectar mediante un enlace peptídico al terminal N del polipéptido enlazador con el polipéptido que tiene al menos un subdominio extracelular de alfa-Klotho conectado mediante un enlace peptídico al terminal C del enlazador de polipéptido. También se puede utilizar un enlazador químico para enlazar los dos polipéptidos.

El polipéptido de fusión alfa-Klotho de la invención puede incluir un péptido de señal. Los ejemplos de péptidos de señal para uso con el polipéptido de fusión alfa-Klotho incluyen, pero no se limitan a, el péptido de señal de Klotho (SEQ ID NO: 8) y el péptido de señal de IgG (SEQ lD NO: 9).

4.1. Polipéptidos de Klotho y del factor de crecimiento de fibroblastos

Se espera que los polipéptidos de fusión Klotho de la invención exhiban actividades biológicas comparables al FGF en Ia naturaleza, tales como el enlazamiento a un receptor del FGF e induciendo la fosforilación de un receptor del FGF, FRS2 (sustrato 2 del receptor del FGF) y ERK1/2 (proteína quinasa 1/2 regulada por señal extracelular) y activación del gen Egr-1 (respuesta de crecimiento temprano 1). EI FGF es un factor de crecimiento peptídico secretado que se enlaza al receptor del FGF. Las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico del FGF se encuentran fácilmente disponibles para aquellos capacitados en el arte. Por ejemplo, los ejemplos de secuencias de nucleótidos para FGF19, FGF21, y FGF23 se pueden encontrar en la base de datos del GenBank con los números

de acceso: NM_005117, NM_019113, y NM_020638, respectivamente, y en la presente invención como las SEQ ID NOs: 30, 32, y 34, respectivamente. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos para FGF19, FGF21, y FGF23 se pueden encontrar en la base de datos del GenBank con los números de acceso: NP_005108, NP_061986, y NP_065689, respectivamente, y en Ia presente invención como las SEQ ID NOs: 31, 35, y 35, respectivamente. Adicionalmente, el FGF puede incluir una o más alteraciones que ayudan en la expresión de la proteína, por ejemplo, la variante de FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 36).

La proteína Klotho es una proteína transmembrana tipo I de una sola pasada de 130 kDa con un dominio extracelular y un dominio citoplasmático corto. Las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de Klotho están fácilmente disponibles para aquellos capacitados en el arte. Por ejemplo, los ejemplos de secuencias de nucleótidos para alfa-Klotho y beta-Klotho se pueden encontrar en la base de datos del GenBank con los números de acceso: NM_004795 y NM_175737, respectivamente, y en la presente invención como las SEQ ID NOs: 7 y 8, respectivamente. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos para alfa-Klotho y beta-Klotho se pueden encontrar en la base de datos del GenBank con los números de acceso: NP_004786 y NP_783864, respectivamente, y en la presente invención como las SEQ ID NOs: 2 y 4, respectivamente.

El polipéptido de fusión Klotho de Ia invención se puede enlazar a un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos, y tiene un dominio extracelular de alfa-Klotho operativamente enlazado al factor de crecimiento de fibroblastos 23 (SEQ ID NO: 35), o las variantes del mismo (las cuales incluyen la variante del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (R179Q) (SEQ ID NO: 36)).

De una manera específica, el polipéptido de fusión Klotho de la invención puede incluir un alfa-Klotho (SEQ ID NO: 2), el cual está operativamente acoplado al factor de crecimiento de fibroblastos 23 (SEQ ID NO: 35) o a Ia variante del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (R179Q) (SEQ ID NO: 36). Adicionalmente, se divulga el polipéptido de fusión Klotho de la invención que tiene beta-Klotho (SEQ lD NO: 4), el cual está operativamente acoplado al factor de crecimiento de fibroblastos 19 (SEQ ID NO: 31).

La invención incluye homólogos de los diferentes genes y proteínas Klotho y FGF codificados por esos genes. Un "homólogo", en referencia a un gen, se refiere a una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica sobre al menos parte del gen o a su cadena complementaria o a una parte de la misma, siempre y cuando que la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene sustancialmente la misma actividad/función que Ia proteína codificada por el gen del cual es un homólogo. Los homólogos de los genes descritos en la presente invención se pueden identificar mediante el porcentaje de identidad entre las secuencias de aminoácidos o nucleótidos para los homólogos putativos, y las secuencias para los genes o proteínas codificadas por ellas (por ejemplo, las secuencias de nucleótidos para los genes que codifican Klotho y FGF o sus cadenas complementarias). El porcentaje de identidad se puede determinar, por ejemplo, mediante inspección visual, o utilizando diferentes programas informáticos conocidos en la técnica, o como se describe en la presente invención. La identidad de secuencia se mide típicamente utilizando un software de análisis de secuencias (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, programas BLAST, BESTFlT, GAP, o PlLEUP/PRETTYBOX). Este software empareja las secuencias idénticas o similares mediante la asignación de grados de homología con diferentes sustituciones, supresiones, y/u otras modificaciones. Las sustituciones conservadoras típicamente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, Ieucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. En un ejemplo de enfoque para determinar el grado de identidad, se puede utilizar un programa BLAST, con un puntaje de probabilidad entre e-3 y e -100 que indica una secuencia estrechamente relacionada.

Como se utilizan en la presente invención, los términos "homología" y "homólogo" no se limitan a la designación de las proteínas que tienen un ancestro genético teórico común, sino que incluyen las proteínas que pueden estar genéticamente no relacionadas que, no obstante, han evolucionado para llevar a cabo funciones similares y/o para tener estructuras similares. La homología funcional con las diferentes proteínas descritas en la presente invención, también abarca las proteínas que tienen una actividad de la proteína correspondiente, de la cual es un homólogo. Para que las proteínas tengan una homología funcional, no se requiere que tengan una identidad significativa en sus secuencias de aminoácidos, sino más bien, las proteínas que tienen una homología funcional son definidas de esta manera por tener actividades similares o idénticas. Por ejemplo, con respecto a una molécula de Klotho, el polipéptido debe tener las características funcionales de enlazamiento a un polipéptido del FGF, y debe hacer posible el enlace del FGF a un FGFR. Con respecto a una molécula del FGF, el polipéptido debe tener las características funcionales de enlazamiento a un FGFR, y debe provocar la activación del FGFR (por ejemplo, fosforilación). Los ensayos para evaluar el enlazamiento del FGF con el receptor del FGF y/o Ia activación de la ruta de señalización del FGF se conocen en la técnica, y se describen en la presente invención (véase el Ejemplo 2). Los ensayos para evaluar la actividad de Klotho también se conocen en la técnica y se describen en la presente invención (por ejemplo, el enlazamiento a un polipéptido del FGF). Las proteínas con una homología estructural se definen por tener una estructura terciaria (o cuaternaria) análoga, y no necesariamente requieren de la identidad de aminoácidos o de Ia identidad de ácidos nucleicos para que los genes las codifiquen. En ciertas circunstancias, los

homólogos estructurales pueden incluir proteínas que mantengan Ia homología estructural solamente en el sitio activo o en el sitio de enlace de la proteína.

Además de la homología estructural y funcional, la presente invención abarca además proteínas que tienen identidad de aminoácidos con las diferentes secuencias de aminoácidos de Klotho y FGF descritas en la presente invención. Para determinar el porcentaje de identidad/homología de dos secuencias de aminoácidos, se alinean las secuencias con el fin de lograr una comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en Ia secuencia de aminoácidos de una proteína para Ia alineación óptima con la secuencia de aminoácidos de otra proteína). Luego se comparan los residuos de aminoácidos en las posiciones de los aminoácidos correspondientes. Cuando una posición en una secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido que Ia posición correspondiente en Ia otra, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. EI porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = # de posiciones idénticas / # total de posiciones multiplicado por 100).

Las secuencias de aminoácidos de las moléculas de la invención descritas en la presente invención, tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 95% o más, idénticas u homólogas a una secuencia de aminoácidos descrita en la presente invención.

Las secuencias de ácido nucleico de las moléculas de la invención descritas en la presente invención, tienen una secuencia de nucleótidos que se hibrida a, o es al menos aproximadamente 95% o más, idéntica u homóloga a una secuencia de nucleótidos descrita en la presente invención.

Las moléculas de ácido nucleico apropiadas para uso en los polipéptidos de fusión de la invención, pueden tener una secuencia de nucleótidos de Klotho o FGF que se hibride bajo condiciones severas con el complemento de una molécula de ácido nucleico que codifica Klotho o FGF, respectivamente. Como se utiliza en la presente invención, el término “se híbrida bajo condiciones severas" pretende describir las condiciones para la hibridación y lavado bajo las cuales, las secuencias de nucleótidos al menos aproximadamente 70%, 80%, 85%, 90% o más homólogas entre sí, típicamente permanecen hibridadas entre sí. Estas condiciones severas son conocidas por aquellos capacitados en la técnica, y se pueden encontrar en Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York (2001), 6.3.1 -6.3.6. Un ejemplo específico, no limitante, de las condiciones de hibridación severas, es la hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) aproximadamente a 45°C, seguida por uno o más lavados en 0,2 X SSC, SDS al 0,1% a 50 -65°C.

4.2. Polipéptidos de fusión Klotho-FGF de la invención

Un polipéptido de fusión Klotho de la invención tiene una cadena polipeptídica que tiene una primera secuencia polipeptídica del polipéptido alfa-Klotho o un fragmento activo del mismo, y una segunda secuencia polipeptídica que codifica FGF-23 o un fragmento activo del mismo.

La invención incluye polipéptidos de fusión que son al menos aproximadamente 95% o más, homólogos a una secuencia de aminoácidos presentada en las SEQ ID NOs: 19 a 28. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene un dominio extracelular de Klotho enlazado a través del terminal N a la variante FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 36). La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene un péptido de señal de IgG enlazado a través del terminal N a un dominio extracelular de Klotho que carece de un péptido de señal enlazado a través del terminal N a la variante FGF23 (R179Q). La secuencia de aminoácidos de la SEQ lD NO: 21 codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene un subdominio extracelular KL-D1 enlazado a través del terminal N a la variante FGF23 (R179Q). La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22 codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene un subdominio extracelular KL-D2 enlazado a través del terminal N a la variante FGF23 (R179Q). La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene dos subdominios extracelulares KL-D1 enlazados a través del terminal N a la variante FGF23 (R179Q). La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No: 24 codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene dos subdominios extracelulares KL-D2 enlazados a través del terminal N a la variante FGF23 (R179Q). La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene la variante FGF23 (R179Q) enlazada a través del terminal N a un dominio extracelular de Klotho. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26 codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene la variante FGF23 (R179Q) enlazada a través del terminal N a un subdominio extracelular KL-D1. La secuencia de aminoácidos de Ia SEQ ID NO: 27 codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene Ia variante FGF23 (R179Q) enlazada a través del terminal N a un subdominio extracelular KL-D2. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28 codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene Ia variante FGF23 (R179Q) enlazada a través del terminal N a dos subdominios extracelulares KL-D1. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29 codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene la variante FGF23 (R179Q) enlazada a través del terminal N a dos subdominios extracelulares KL-D2.

EI polipéptido de fusión Klotho de la invención puede incluir una secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 7. La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 codifica un dominio extracelular de Klotho que carece de un péptido de señal.

Las proteínas de fusión objetivo se describen en la presente invención y se pueden elaborar empleando métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, los polipéptidos de fusión de la invención se pueden construir como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6.194.177. El uso de los polipéptidos Klotho se describe en Ia patente de los Estados Unidos No. 6.579.850. El uso de moléculas de ácido nucleico del FGF se describe en la patente de los Estados Unidos No. 7.223.563.

En algunas formas de realización, se clona una molécula de ácido nucleico que codifica el alfa-Klotho mediante PCR, y se liga, dentro del marco, con una molécula de ácido nucleico que codifica el FGF. El ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión de Klotho-FGF se enlaza operativamente a un promotor para permitir la expresión. La molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de fusión es posteriormente transfectado en una célula huésped para Ia expresión. La secuencia del constructo final se puede confirmar mediante secuenciación.

Cuando se preparan las proteínas de fusión de la presente invención, se fusionará una molécula de ácido nucleico que codifica un subdominio extracelular de Klotho dentro del marco con la molécula de ácido nucleico que codifica el FGF-23. La expresión de la molécula de ácido nucleico resultante da como resultado que el subdominio extracelular de alfa-Klotho se fusiona a través del terminal N en relación con el polipéptido del FGF-23. También son posibles las fusiones en donde el subdominio extracelular de alfa-Klotho se fusiona al terminal C en relación con el polipéptido del FGF-23. Los métodos para la elaboración de proteínas de fusión son bien conocidos en la técnica.

Los polipéptidos de fusión de la invención tienen al menos dos polipéptidos que se enlazan covalentemente, en donde un polipéptido proviene de una secuencia o dominio de proteína, por ejemplo, Klotho, y el otro polipéptido proviene de otra secuencia o dominio de proteína, por ejemplo, FGF. Klotho y FGF, de los polipéptidos de fusión de la invención, se pueden unir mediante métodos bien conocidos por aquellos capacitados en el arte. Estos métodos incluyen medios tanto químicos como recombinantes.

Los ácidos nucleicos que codifican los dominios que se van a incorporar en los polipéptidos de fusión de Ia invención, se pueden obtener empleando técnicas de rutina en el campo de la genética recombinante. Los textos básicos que dan a conocer los métodos generales de uso de esta invención incluyen Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a Edición, 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel y colaboradores, Editores, 1994 -1999). En los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de fusión Klotho de la invención, se puede utilizar la secuencia de ácido nucleico que codifica alfa-Klotho, representada por las SEQ ID NO: 1. En los ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de fusión alfa-Klotho, se puede utilizar la secuencia de ácido nucleico que codifica FGF23, representada por la SEQ ID NO: 34. Las secuencias de ácido nucleico de las moléculas de la invención descritas en la presente invención, comprenden una secuencia de nucleótidos que híbrida a, o es al menos aproximadamente 95% o más, idéntica u homóloga a la SEQ ID NO: 1 o la SEQ lD NO: 34.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican los péptidos Klotho y FGF, se pueden obtener utilizando cualquiera entre una variedad de métodos. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos se pueden clonar a partir de las bibliotecas de ADNc y de ADN genómico mediante hibridación con sondas, o se pueden aislar empleando técnicas de amplificación con cebadores de oligonucleótido. Más comúnmente, se emplean técnicas de amplificación para amplificar y aislar las secuencias de Klotho y FGF, utilizando una plantilla de ADN o de ARN (véase, por ejemplo, Dieffenfach & Dveksler, PCR Primers: A Laboratory Manual (1995)). De una manera alternativa, se pueden producir sintéticamente y unir oligonucleótidos que se superponen, para producir uno

o más de los dominios. Los ácidos nucleicos que codifican alfa-Klotho o FGF-23 también se pueden aislar a partir de bibliotecas de expresión utilizando anticuerpos como sondas.

De acuerdo con Ia presente invención, alfa-Klotho y FGF-23 se pueden enlazar ya sea directamente, o bien por medio de un enlazador covalente, incluyendo enlazadores de aminoácidos, tal como un enlazador de poliglicina, u otro tipo de enlazador químico, incluyendo, enlazadores de carbohidratos, enlazadores de lípidos, enlazadores de ácidos grasos, enlazadores de poliéter, tales como PEG, etc. (Véase por ejemplo, Hermanson, Bioconjugate techniques (1996)). Los polipéptidos que forman la fusión / el polipéptido de fusión, típicamente son terminal C enlazado al terminal N, aunque también pueden ser terminal C enlazado al término C, terminal N enlazado al terminal N, o terminal N enlazado al terminal C. Se pueden insertar uno o más dominios de polipéptido en una localización interna dentro de un polipéptido de fusión de Ia invención. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden. Los polipéptidos de fusión se pueden producir mediante el enlace covalente de una cadena de aminoácidos de una secuencia de proteína, por ejemplo, un subdominio extracelular de Klotho, a una cadena de aminoácidos de otra secuencia de proteína, por ejemplo, FGF-23, mediante la preparación de un polinucleótido recombinante que codifica en forma contigua la proteína de fusión. Las diferentes cadenas de aminoácidos en una proteína de fusión, se pueden empalmar directamente entre si, o se pueden empalmar

indirectamente entre sí por medio de un grupo enlazador químico o de un grupo enlazador de aminoácidos. EI grupo enlazador de aminoácidos puede ser de aproximadamente 200 aminoácidos o más de longitud, o, en términos generales, de 1 a 100 aminoácidos. En algunas formas de realización, se incorporan residuos de prolina en el enlazador para prevenir la formación de elementos estructurales secundarios significativos por parte del enlazador. Los enlazadores con frecuencia son subsecuencias flexibles de aminoácidos que se sintetizan como parte de una proteína de fusión recombinante. Estos enlazadores flexibles son conocidos por las personas capacitadas en la técnica.

De acuerdo con la presente invención, la secuencia de aminoácidos de un subdominio extracelular de alfa-Klotho o un fragmento del mismo se puede enlazar al FGF-23 por medio de un enlazador peptídico. Los ejemplos de enlazadores peptídicos son bien conocidos en el arte, y se describen en la presente invención. Por ejemplo, los enlazadores peptídicos, generalmente incluyen varios residuos GIy y varios residuos Ser, tales como: (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 11), polipéptido Gly4 Ser (SEQ ID NO: 12), GIy (SEQ ID NO: 13), GIy Gly (SEQ ID NO: 14), GIy Ser (SEQ ID NO: 15), Gly2 Ser (SEQ ID NO: 16), Ala (SEQ ID NO: 17), y Ala Ala (SEQ ID NO: 18). De una manera específica, un enlazador peptídico para uso en una proteína de fusión de Ia invención puede actuar como una articulación flexible.

La secuencia de señal de alfa-Klotho o FGF-23 se puede excluir antes de la incorporación de Klotho en una proteína de fusión de la invención. Se puede incluir la secuencia de señal para Klotho o FGF de la proteína de fusión, por ejemplo, el polipéptido representado por la SEQ ID NO: 19. Sin embargo, estas secuencias también se pueden omitir, y ser reemplazadas con la secuencia de señal de una proteína diferente, por ejemplo, Ia secuencia de señal de IgG (SEQ ID NO: 9). En términos generales, las composiciones farmacéuticas de la invención contendrán la forma madura de alfa-Klotho y FGF-23.

En términos generales, se excluyen los intrones de cualquiera o de ambas fracciones de alfa-Klotho o del FGF-23 antes de incorporarse en un polipéptido de fusión.

Los polipéptidos de fusión de la invención pueden incluir uno o más polímeros covalentemente unidos a una o más cadenas laterales de aminoácidos reactivos. A manera de ejemplo, y no de limitación, estos polímeros incluyen polietilenglicol (PEG), el cual se puede unir a uno o más residuos de sulfhidrilo de cisteína libres, bloqueando de esta manera Ia formación de enlaces de disulfuro y la agregación, cuando se expone la proteína a condiciones oxidantes. Además, se espera que la PEGiIación de los polipéptidos de fusión de la invención proporcione tales propiedades mejoradas, tales como una vida media más larga, mayor solubilidad y resistencia a Ia proteasa. Los polipéptidos de fusión de la invención, alternativamente, se pueden modificar mediante Ia adición covalente de polímeros a los grupos amino libres, tales como Ia Iisina épsilon o el grupo amino del terminal N. Las cisteínas y Iisinas preferidas para la modificación covalente serán aquéllas que no estén involucradas en el enlace del receptor, en el enlace de heparina, o en el plegado apropiado de la proteína. Será evidente para alguien capacitado en el arte, que se pueden emplear los métodos para ensayar la actividad bioquímica y/o biológica de los polipéptidos de fusión, con el objeto de determinar si la modificación de un residuo de aminoácido particular afecta la actividad de la proteína según se desee. Se contemplan y se conocen en al arte otras modificaciones adecuadas similares.

La invención también se refiere a la expresión de un polipéptido de fusión que es al menos aproximadamente 95% o más, homólogo a una secuencia de aminoácidos presentada en las SEQ ID NOs: 19 a 28.

4.3. Expresión de los polipéptidos de fusión de la invención

Con el objeto de expresar la proteína de fusión de la invención, las moléculas de ADN obtenidas mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente invención o aquéllos que son conocidos en el arte, se pueden insertar en vectores de expresión apropiados mediante técnicas bien conocidas en el arte. Por ejemplo, se puede clonar un ADNc bicatenario en un vector adecuado mediante prolongación con homopolímeros, o mediante enlace de enzimas de restricción, que involucra el uso de enlazadores de ADN sintéticos o mediante ligamiento de extremos romos. Las ligasas de ADN usualmente se utilizan para ligar las moléculas de ADN, y se puede evitar una unión indeseable mediante el tratamiento con fosfatasa alcalina.

Por consiguiente, la invención incluye vectores (por ejemplo, plásmidos recombinantes y bacteriófagos) que incluyen moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, genes o moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican genes), como se describe en la presente invención. EI término "vector recombinante" incluye un vector (por ejemplo, plásmido, fago, fásmido, virus, cósmido, fósmido, u otro vector de ácido nucleico purificado) que ha sido alterado, modificado, o diseñado por ingeniería genética de tal manera que contenga más, menos, o diferentes secuencias de ácido nucleico que aquéllas incluidas en la molécula de ácido nucleico nativa o natural a partir de la cual se derivó el vector recombinante. Por ejemplo, un vector recombinante puede incluir una secuencia de nucleótidos que codifica una fusión de alfa-KIotho-FGF23 operativamente enlazada a secuencias reguladoras, por ejemplo, secuencias promotoras, secuencias terminadoras y/o sitios de enlazamiento de un ribosoma artificial (los RBS), como se definen

en la presente invención. Los vectores recombinantes que permiten la expresión de los genes o ácidos nucleicos incluidos en ellos, son denominados como "vectores de expresión".

Para los huéspedes eucariotas, se pueden emplear diferentes secuencias reguladoras de transcripción y de traducción, dependiendo de la naturaleza del huésped. Se pueden derivar a partir de fuentes viral, tales como adenovirus, virus de papiloma bovino, virus de simio, o similares, en donde las señales reguladoras están asociadas con un gen particular que tiene a alto nivel de expresión. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el promotor TK del virus del Herpes, el promotor temprano del SV40, el promotor del gen de levadura ga14, etc. Se pueden seleccionar señales reguladoras del inicio de la transcripción, lo que permite la represión o activación, de tal manera que se puede modular Ia expresión de los genes.

En algunas de las moléculas de la invención descritas en la presente invención, una o más moléculas de ADN que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica una o más cadenas de polipéptido de un polipéptido de fusión, se enlazan operativamente a una o más secuencias reguladoras, que son capaces de integrar la molécula de ADN deseada en una célula huésped. Las células que han sido transformadas en forma estable mediante el ADN introducido se pueden seleccionar, por ejemplo, mediante la introducción de uno o más marcadores que permitan la selección de las células huésped que contengan el vector de expresión. Un gen marcador seleccionable o bien se puede enlazar directamente a una secuencia de ácido nucleico que se vaya a expresar, o se puede introducir en la misma célula mediante cotransfección. También se pueden necesitar elementos adicionales para la síntesis óptima de las proteínas descritas en la presente invención. Seria evidente para una persona ordinariamente capacitada en el arte cuáles elementos adicionales utilizar.

Los factores importantes en la selección de un plásmido o vector viral particular incluyen, pero no se limitan a, la facilidad con la cual las células receptoras que contienen al vector son reconocidas y seleccionadas de aquellas células receptoras que no contienen al vector; el número de copias del vector que se desean en un huésped particular; y si es deseable poder "lanzar" el vector entre células huésped de diferentes especies.

Una vez que se construye el(los) vector(es) para incluir una secuencia de ADN para Ia expresión, se puede(n) introducir en una célula huésped apropiada mediante uno o más de una variedad de métodos adecuados que son conocidos en el arte, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, microinyección directa, etc.

Las células huésped pueden ser o bien procariotas o eucariotas. Los ejemplos de las células huésped eucariotas incluyen, por ejemplo, células de mamífero, tales como células humanas, de mono, de ratón, y de ovario de hámster chino (CHO). Estas células facilitan las modificaciones de proteínas en forma posterior a la traducción, incluyendo, por ejemplo, plegamiento correcto o glicosilación. Adicionalmente, también se pueden utilizar células de levadura para expresar los polipéptidos de fusión de la invención. Como la mayoría de las células de mamífero, las células de levadura hacen posible las modificaciones de proteínas posteriores a la traducción, incluyendo, por ejemplo, glicosilación. Existen una cantidad de estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias promotoras fuertes, y plásmidos de alto número de copias que se pueden utilizar para Ia producción de proteínas en levadura. La maquinaria de transcripción y traducción de levadura puede reconocer a las secuencias guía sobre los productos génicos de mamífero clonados, haciendo posible de esta manera la secreción de los péptidos que portan las secuencias guía (es decir, prepéptidos). Un método particularmente preferido de producción de alto rendimiento de los polipéptidos de fusión de la invención es a través del uso de amplificación de dihidrofolato reductasa (DHFR) en células CHO deficientes en DHFR, mediante el uso de niveles sucesivamente crecientes de metotrexato, como se describe en Ia patente de los Estados Unidos No. 4.889.803. EI polipéptido obtenido puede estar en una forma glicosilada.

Después de la introducción de uno o más vectores, las células huésped normalmente se cultivan en un medio selectivo, el cual selecciona el crecimiento de las células que contienen al vector. La purificación de las proteínas recombinantes se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los métodos conocidos en el arte o descritos en la presente invención, por ejemplo, por medio de cualquiera de los procedimientos convencionales que involucran extracción, precipitación, cromatografía y electroforesis. Un proceso de purificación adicional que se puede emplear para Ia purificación de proteínas es la cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos monoclonales que se enlazan con una proteína objetivo. En términos generales, las preparaciones sin purificar que contengan una proteína recombinante se pasan a través de una columna sobre la cual se inmoviliza un anticuerpo monoclonal adecuado. La proteína usualmente se enlaza a la columna a través del anticuerpo especifico, mientras que las impurezas pasan a través de ella. Después de lavar la columna, se eluye la proteína del gen mediante el cambio del pH o de la fuerza iónica, por ejemplo.

4.4. Ensayos para evaluar la actividad del polipéptido de fusión

Los ensayos descritos en la presente invención (véase el Ejemplo 2) y aquéllos conocidos en el arte, se pueden utilizar para detectar la actividad de Klotho o FGF de los polipéptidos de fusión de la invención. Los ensayos de

actividad adecuados incluyen ensayos de enlazamiento del receptor, ensayos de proliferación celular, y ensayos de señalización celular. Por ejemplo, un ensayo de enlazamiento que se puede utilizar para determinar si un polipéptido de fusión tiene actividad de Klotho o FGF incluye ensayar el enlazamiento de un polipéptido de fusión a un receptor del FGF. Los ensayos de enlazamiento del receptor del FGF incluyen, pero no se limitan a, ensayos tanto competitivos como no competitivos. Por ejemplo, se puede detectar el enlazamiento del receptor del FGF poniendo en contacto las células que expresen un receptor del FGF con un FGF marcado (por ejemplo, un marcador radioactivo) y con concentraciones crecientes de un polipéptido de fusión de Klotho-FGF no marcado. Los dos ligandos que compiten por el enlazamiento con el mismo receptor, se agregan a una mezcla de reacción que contenga la célula. Posteriormente se lavan las células, y se mide el FGF marcado. Una disminución en Ia cantidad del FGF marcado enlazado con su receptor en presencia del polipéptido de fusión no marcado es indicativa del enlazamiento del polipéptido de fusión de Klotho-FGF al receptor. De forma alternativa, el polipéptido de fusión de Klotho-FGF se puede marcar, y se detecta el enlazamiento directo del polipéptido de fusión a Ia célula.

La actividad de Klotho o FGF también se puede medir mediante la determinación de si el polipéptido de fusión induce o no una respuesta celular. Por ejemplo, en algunas formas de realización, un ensayo para detectar Ia actividad biológica de un polipéptido de fusión de Klotho-FGF involucra poner en contacto las células que expresan un receptor del FGF con un polipéptido de fusión, analizar una respuesta celular, tal como, por ejemplo, proliferación celular o activación de Egr-1, el diámetro de miotubos en las células C2C12, y comparar la respuesta celular en presencia y en ausencia del polipéptido de fusión. Un aumento en la respuesta celular en presencia del complejo del polipéptido de fusión en relación con su ausencia, indica que el polipéptido de fusión tiene actividad biológica. También, se puede medir un aumento en un evento de señalización secuencia abajo desde el receptor como una indicación de la actividad biológica (por ejemplo, fosforilación de FGFR, FRS2, ERK1/2, p70S6K, etc.).

4.5. Composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento

La invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas que contienen uno o más polipéptidos de fusión de la invención y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir además una dosis farmacéuticamente efectiva de heparina. Estas composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un kit o contenedor. Este kit o contenedor se puede empacar con las instrucciones relacionadas a la vida media in vivo o a la vida útil in vitro prolongada de los polipéptidos de fusión. Opcionalmente, asociado con dicho kit

: o contenedor(es) puede haber una notificación en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso, o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, cuya notificación refleje la aprobación por parte de la agencia gubernamental, para la fabricación, uso, o venta para administración a humanos. Estas composiciones se pueden utilizar en métodos para el tratamiento, la prevención, o la mejoría de una enfermedad o de un síntoma de una enfermedad (por ejemplo, una condición relacionada con la edad o un trastorno metabólico) en un paciente, de preferencia un mamífero, y de una manera muy preferible un ser humano, mediante la administración de la composición farmacéutica al paciente.

En general, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica de la invención es de aproximadamente 0,0001 mg/kg a 0,001 mg/kg; de 0,001 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal,

: o de aproximadamente 0,02 mg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. Comúnmente, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de fusión es de aproximadamente 0,001 mg hasta aproximadamente 0,01 mg, de aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 100 mg, o de aproximadamente 100 mg hasta aproximadamente 1000 mg, por ejemplo. De preferencia, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de fusión es de aproximadamente 0,001 mg/kg a 2 mg/kg.

Las formulaciones farmacéuticas óptimas para un polipéptido de fusión pueden ser determinadas por alguien ordinariamente capacitado en el arte, dependiendo de la ruta de administración y de la dosificación deseada. (Véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18ava Edición (1990), Mack Publishing Co., Easton, Pa).

Los polipéptidos de fusión de la invención se pueden administrar como una composición farmacéutica que puede estar en la forma de un sólido, liquido, o gas (aerosol). Las vías de administración típicas pueden incluir, sin limitación, oral, tópica, parenteral, sublingual, rectal, vaginal, intradérmica, e intranasal. La administración parenteral incluye inyecciones subcutáneas, técnicas de inyección o infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intrapleural, o intraesternal. De preferencia, las composiciones se administran parenteralmente. Más preferiblemente, las composiciones se administran en forma intravenosa. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular para permitir que esté biodisponible un polipéptido de la invención después de la administración de la composición a un sujeto. Las composiciones pueden tomar la forma de una o más unidades de dosificación, en donde, por ejemplo, una tableta puede ser una unidad de dosificación única, y un contenedor de un polipéptido de la invención en forma de aerosol puede contener una pluralidad de unidades de dosificación.

Los materiales utilizados en la preparación de las composiciones farmacéuticas pueden ser no tóxicos en las cantidades utilizadas. Será evidente para aquéllos ordinariamente capacitados en el arte, que la dosificación óptima del(de los) ingrediente(s) activo(s) en la composición farmacéutica dependerá de una variedad de factores. Los

factores relevantes incluyen, sin limitación, el tipo de sujeto (por ejemplo, un ser humano), el estado de salud general del sujeto, el tipo de condición relacionada con la edad o el trastorno metabólico del que el sujeto que requiere del tratamiento, el uso de la composición como parte de un régimen de múltiples fármacos, Ia forma particular del polipéptido de Ia invención, la forma de administración, y la composición empleada.

EI portador o vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser un material formado por partículas, de tal manera que las composiciones estén, por ejemplo, en forma de tableta o polvo. El(los) portador(es) puede(n) ser líquido(s), siendo las composiciones, por ejemplo, un jarabe oral o un líquido inyectable. Además, el(los) portador(es) puede(n) ser gaseoso(s), para proporcionar una composición en aerosol útil, por ejemplo, en la administración por inhalación.

El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, o excipiente, con el que se administra un polipéptido de la invención. Estos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos, tales como agua y aceites, incluyendo aquéllos originados a partir del petróleo, de origen animal, vegetal, o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de semilla de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí, y similares. Los portadores pueden ser solución salina, goma de acacia, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea, y similares. Además, se pueden utilizar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes, y colorantes. En una forma de realización, cuando se administran a un sujeto, los polipéptidos de la invención y los portadores farmacéuticamente aceptables son estériles. El agua es un portador preferido cuando el polipéptido de la invención se administra en forma intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones de dextrosa acuosa y glicerol como portadores líquidos, en particular para soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos adecuados también incluyen excipientes tales como almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propilenglicol, agua, etanol, y similares. Las presentes composiciones, si se desea, también pueden contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes reguladores del pH.

La composición se puede usar para administración oral, y si es así, la composición está de preferencia en una forma sólida o líquida, en donde las formas semisólidas, semilíquidas, en suspensión, y en gel, están incluidas dentro de las formas consideradas en la presente invención, ya sea como sólidos o como líquidos.

Como una composición sólida para administración oral, la composición se puede formular en un polvo, gránulo, tableta comprimida, píldora, cápsula, goma de mascar, oblea, o una forma similar. Esta composición sólida típicamente contiene uno o más diluyentes inertes. Además, pueden estar presentes uno o más de los siguientes compuestos: aglutinantes tales como etiI celulosa, carboximetilcelulosa, celulosa microcristalina, o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes desintegrantes tales como ácido algínico, alginato de sodio, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; deslizantes tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina, un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo, o saborizante de naranja, y un agente colorante.

Cuando la composición farmacéutica está en la forma de una cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido, tal como polietilenglicol, ciclodextrina, o un aceite graso.

La composición farmacéutica puede estar en la forma de un líquido, por ejemplo, un elíxir, jarabe, solución, emulsión, o suspensión. EI líquido puede ser útil para administración oral o para suministro mediante inyección. Cuando se pretende para administración oral, una composición puede contener uno o más entre un agente edulcorante, conservantes, tinte/colorante, y mejorador del sabor. En una composición para administración mediante inyección, se pueden incluir también uno o más entre un agente tensoactivo, conservante, humectante, un agente dispersante, un agente de suspensión, un regulador, un estabilizante, y agente isotónico.

Las composiciones líquidas de la invención, ya sean soluciones, suspensiones, u otra forma similar, también pueden incluir uno o más de los siguientes compuestos: diluyentes estériles tales como agua para inyección, solución salina, de preferencia suero fisiológico, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites fijos tales como mono o diglicéridos sintéticos, los cales pueden servir como el disolvente o el medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, ciclodextrina, propilenglicol, u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; reguladores tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de Ia tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Una composición parenteral se puede colocar en una ampolleta, una jeringa desechable, o un vial de múltiples dosis elaborado en vidrio, plástico, u otro material. El suero fisiológico es un adyuvante preferido. Una composición inyectable es de preferencia estéril.

Las composiciones farmacéuticas contienen una cantidad efectiva de un compuesto de la invención (por ejemplo, el polipéptido de fusión), de tal manera que se obtendrá una dosificación adecuada. Las composiciones farmacéuticas pueden contener la cantidad efectiva conocida de los compuestos como se prescriben actualmente para sus trastornos respectivos.

La vía de administración del polipéptido de la invención utilizado en los regímenes profilácticos y/o terapéuticos que será efectivo en la prevención, tratamiento, y/o manejo de una condición relacionada con la edad o trastorno metabólico, se puede basar en las vías de administración actualmente prescritas para otros compuestos terapéuticos conocidos en el arte. Los polipéptidos de Ia invención se pueden administrar por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección de bolo, mediante absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucosos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal, y mucosa intestinal, etc.). La administración puede ser sistémica o local. Se conocen diferentes sistemas de suministro, por ejemplo, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etc., y pueden ser útiles para Ia administración de un polipéptido de la invención. Se puede administrar más de un polipéptido de Ia invención a un sujeto. Los métodos de administración pueden incluir, pero no se limitan a, administración oral y administración parenteral; Ia administración parenteral incluye, pero no se limita a, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, sublingual, intranasal, intracerebral, intraventricular, intratecal, intravaginal, transdérmica, rectal, mediante inhalación, o en forma tópica a los oídos, la nariz, los ojos, o la piel.

Los polipéptidos de la invención se pueden administrar en forma parenteral. Específicamente, los polipéptidos de la invención se pueden administrar en forma intravenosa.

También se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y Ia formulación con un agente formador de aerosol, o por medio de perfusión en un fluorocarbono o en un tensoactivo pulmonar sintético. Los polipéptidos de la invención también se pueden formular como un supositorio, con los aglutinantes y portadores tradicionales, tales como triglicéridos.

Los polipéptidos de la invención se pueden suministrar en un sistema de liberación controlada. Por ejemplo, se puede utilizar una bomba (véase Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 1987, 14, 201; Buchwald y colaboradores, Surgery 1980, 88: 507; Saudek y colaboradores, N. Engl. J. Med. 1989, 321: 574). También se pueden utilizar materiales poliméricos para la liberación controlada de los polipéptidos de la invención (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (Editores), CRC Pres., Boca Raton, FL, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (Editores), Wiley, Nueva York, 1984; Ranger y Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 1983, 23, 61; véase también Levy y colaboradores, Science 1985, 228, 190; Durante y colaboradores, Ann. NeuroI., 1989, 25, 351; Howard y colaboradores, J. Neurosurg., 1989, 71, 105). Específicamente, se puede colocar un sistema de liberación controlada en proximidad del objetivo de los polipéptidos de Ia invención, por ejemplo, el cerebro, requiriendo, por consiguiente, solamente una fracción de Ia dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controiled Release, ver más arriba, volumen 2, 1984, páginas 115 -138). Se pueden utilizar otros sistemas de liberación controlada discutidos en la revisión hecha por Langer (Science 1990, 249, 1527 -1533).

Los materiales poliméricos utilizados para lograr la liberación controlada o prolongada de los polipéptidos de la invención se dan a conocer, por ejemplo, en Ia patente de los Estados Unidos No. 5.679.377; en la patente de los Estados Unidos No. 5.916.597; en la patente de los Estados Unidos No. 5.912.015; en la patente de los Estados Unidos No. 5.989.463; en la patente de los Estados Unidos No. 5.128.326; en Ia publicación PCT No. WO 99/15154; y en la publicación PCT No. WO 99/20253. Los ejemplos de los polímeros utilizados en las formulaciones de liberación prolongada incluyen, pero no se limitan a, poli(2-hidroxi-etil-metacrilato), poli(metil metacrilato), poli(ácido acrílico), poli(etileno-co-vinil acetato), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (PLG), polianhídridos, poli(N-vinilpirrolidona), poli(vinil alcohol), poliacrilamida, poli(etilenglicol), poliláctidos (PLA), poli(Iáctido-co-glicólidos) (PLGA), y poliortoésteres. De preferencia, el polímero utilizado en una formulación de liberación prolongada es inerte, está libre de impurezas Iixiviables, es estable durante almacenamiento, estéril y biodegradable.

o de aproximadamente 0,02 mg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal.

En otras formas de realización, el régimen profiláctico y/o terapéutico involucra administrar a un paciente una o más dosis de una cantidad efectiva de un polipéptido de Ia invención, en donde la dosis de una cantidad efectiva alcanza un nivel en plasma de al menos 0,01 µg/mL hasta al menos 400 µg/mL del polipéptido de la invención.

Un régimen profiláctico y/o terapéutico puede involucrar la administración a un paciente de una pluralidad de dosis de una cantidad efectiva de un polipéptido de la invención, en donde la pluralidad de dosis mantiene un nivel en plasma de al menos 0,01 µg/mL a 400 µg/mL del polipéptido de Ia invención. El régimen profiláctico y/o terapéutico se puede administrar durante al menos 1 día, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, o 9 meses.

El régimen profiláctico y/o terapéutico puede involucrar Ia administración de un polipéptido de la invención en combinación con uno o más productos terapéuticos adicionales. Las dosificaciones recomendadas de los uno o más productos terapéuticos actualmente utilizados para la prevención, tratamiento, y/o manejo de una condición

relacionada con Ia edad o un trastorno metabólico, se pueden obtener a partir de cualquier referencia en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, Hardman y colaboradores, Editores, Goodman & GiIman's The Pharmacological Basis Of Basis Of Therapeutics, 10a Edición, Mc-Graw-Hill, Nueva York, 2001; Physician's Desk Reference (60ava Edición, 2006).

La invención incluye métodos de tratamiento de trastornos en donde sea deseable Ia actividad agonista de la proteína Klotho y FGF. Los ejemplos de estos métodos de Ia invención incluyen, pero no se limitan a, una condición relacionada con la edad o trastornos metabólicos.

La invención incluye métodos para el tratamiento o la prevención de una condición relacionada con la edad en un individuo. A un individuo que necesite del tratamiento, se le administra una dosis farmacológicamente efectiva de una composición farmacéutica que contenga un polipéptido de fusión Klotho, que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos, para tratar o prevenir la condición relacionada con la edad. En algunos casos, el polipéptido de fusión Klotho se administra conjuntamente con una dosis farmacológicamente efectiva de heparina. Las condiciones relacionadas con la edad incluyen sarcopenia, atrofia de la piel, pérdida de masa muscular, atrofia del cerebro, ateroesclerosis, arterioesclerosis, enfisema pulmonar, osteoporosis, osteoartritis, incompetencia inmunológica, presión sanguínea alta, demencia, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, cataratas, degeneración macular relacionada con la edad, cáncer de próstata, embolia, menor expectativa de vida, pérdida de memoria, arrugas, función renal deteriorada, y pérdida de audición relacionada con Ia edad. En un caso particular, se administra una proteína de fusión alfa-Klotho que contiene al menos un dominio extracelular de Ia proteína alfa-Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos 23, a un individuo que necesite el tratamiento para la pérdida de masa muscular.

La invención también se refiere a un método para el tratamiento o a Ia prevención de un trastorno metabólico en un individuo. A un individuo que necesite el tratamiento se le administra una dosis farmacológicamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene un polipéptido de fusión Klotho, que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos, para tratar el trastorno metabólico. En algunos casos, el polipéptido de fusión Klotho se administra conjuntamente con una dosis farmacológicamente efectiva de heparina. EI método se puede utilizar en el tratamiento o Ia prevención de diabetes tipo II, síndrome metabólico, hiperglicemia, y obesidad. En un caso particular, se administra una proteína de fusión Klotho que contiene al menos un dominio extracelular de una proteína beta-Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos 21, a un individuo que necesite el tratamiento para un trastorno metabólico.

La invención también proporciona métodos para el tratamiento o la prevención de hiperfosfatemia o calcinosis en un individuo. A un individuo que necesite el tratamiento se le administra una dosis farmacológicamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene un polipéptido de fusión Klotho, que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos, para tratar hiperfosfatemia o calcinosis. En algunos casos, el polipéptido de fusión Klotho se administra conjuntamente con una dosis farmacológicamente efectiva de heparina. En un caso particular, se administra una proteína de fusión Klotho que contiene al menos un dominio extracelular de una proteína alfa-Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos 23, a un individuo que necesite el tratamiento para una hiperfosfatemia o calcinosis.

La invención también se refiere a un método para el tratamiento o Ia prevención de enfermedad renal crónica o insuficiencia renal crónica en un individuo. A un individuo que necesite el tratamiento se le administra una dosis farmacológicamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene un polipéptido de fusión Klotho, que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos, para tratar una enfermedad renal crónica o insuficiencia renal crónica. En algunos casos, el polipéptido de fusión Klotho se administra conjuntamente con una dosis farmacológicamente efectiva de heparina. En algunos casos, se administra una proteína de fusión Klotho que contiene al menos un dominio extracelular de una proteína alfa-Klotho, a un individuo que necesite el tratamiento para una enfermedad renal crónica o insuficiencia renal crónica.

La invención también incluye métodos para el tratamiento o la prevención de cáncer en un individuo. A un individuo que necesite el tratamiento se le administra una dosis farmacológicamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene un polipéptido de fusión Klotho, que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos, para tratar cáncer. El método se puede utilizar en el tratamiento o la prevención de cáncer de mama. En algunos casos, el polipéptido de fusión Klotho se administra conjuntamente con una dosis farmacológicamente efectiva de heparina. En algunos casos, se administra una proteína de fusión Klotho que contiene al menos un dominio extracelular de una proteína alfa-Klotho, a un individuo que necesite de tratamiento para el cáncer.

En los métodos para el tratamiento de trastornos mediante la administración de una composición farmacéutica que contiene un polipéptido de fusión Klotho, el polipéptido de fusión Klotho tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos. En un caso particular, la proteína de fusión Klotho contiene al menos un dominio extracelular de una proteína beta-Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos 21.

La composición del polipéptido de fusión Klotho se puede administrar de acuerdo con cualquier método de administración conocido por aquellos capacitados en el arte y descritos en la presente invención. Los métodos de administración preferidos incluyen la administración subcutánea o intravenosa. En la presente invención se describen otros modos de administración efectivos.

4.6. Métodos de tratamiento y ensayos para evaluar la eficacia

Se divulgan métodos que disponen la administración del polipéptido de fusión Klotho a un individuo, que pueden ser usados para tratar una variedad de trastornos, incluyendo un trastorno relacionado con la edad o un trastorno metabólico. Sin querer limitarse por ninguna teoría en particular, los polipéptidos de fusión de Klotho/FGF se pueden utilizar para tratar trastornos en donde haya una mala regulación de Klotho o FGF. Los ejemplos de trastornos incluyen trastornos metabólicos y trastornos relacionados con Ia edad. Por ejemplo, los ratones con desactivación genética tanto de FGF23 como de Klotho exhiben una variedad de fenotipos similares, incluyendo baja actividad física, retardo en el crecimiento, pérdida de masa muscular, atrofia de la piel, ateroesclerosis, lapsos de vida cortos, etc. (Véase, Razzaque y Lanske, J. of Endrocrinology, 194: 1 -10 (2007)).

En particular, los polipéptidos de fusión de Klotho/FGF23 de la invención son particularmente útiles en el tratamiento de trastornos relacionados con el envejecimiento, incluyendo pérdida de masa muscular. Sin estar limitado por la teoría, Ia capacidad de Klotho y FGF23 para controlar Ia homeostasis de minerales (por ejemplo, fosfato y calcio) y de vitamina D, puede ser el medio mediante el cual estas proteínas modulan el envejecimiento y la atrofia muscular.

Por otra parte, los polipéptidos de fusión de Klotho/FGF19 y los polipéptidos de fusión de Klotho/FGF21, se pueden utilizar para el tratamiento de un trastorno metabólico. Por ejemplo, se ha demostrado que beta-Klotho y FGF19 controlan la homeostasis del ácido biliar mediante la regulación de la 7-α-hidroxilasa de colesterol (CYP7A1). Un ejemplo no limitante del trastorno de homeostasis biliar es la colestasis. Se ha demostrado que beta-Klotho y FGF21 inducen Iipólisis en adipocitos y, por consiguiente, un almacenamiento reducido de grasa y una ingestión de glucosa. Los ejemplos no limitantes de los trastornos de Iipólisis/almacenamiento de grasa son obesidad y enfermedades metabólicas y cardiovasculares asociadas.

Basándose al menos en parte en el descubrimiento de que FGF23 es capaz de estimular Ia excreción de fosfato en la orina, y por lo tanto de reducir los niveles de fosfato en el suero, los polipéptidos de fusión de alfa-Klotho-FGF23 de Ia invención se pueden utilizar para el tratamiento o Ia prevención de hiperfosfatemia o calcinosis en un individuo. Por ejemplo, se ha demostrado que una mutación homocigótica con cambio de sentido en Klotho lo que resulta en una deficiencia en Klotho en un paciente, puede provocar calcinosis tumoral grave y calcificación arterial (lchikawa y colaboradores, J. Clin. Invest. 117: 2684 -2691 (2007)). A un individuo se le administra una dosis farmacológicamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene el polipéptido de fusión Klotho, que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos, para tratar o prevenir la hiperfosfatemia o la calcinosis. En particular, un polipéptido de fusión Klotho que contiene al menos un dominio extracelular de una proteína alfa-Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos, es útil para el tratamiento de hiperfosfatemia o calcinosis.

Los polipéptidos de fusión Klotho también se pueden utilizar para el tratamiento o la prevención de enfermedad renal crónica o insuficiencia renal crónica en un individuo. Por ejemplo, se ha demostrado que la expresión de Klotho se reduce en el riñón de los pacientes con insuficiencia renal crónica, comparada con aquélla de los riñones no afectados (Koh y colaboradores, Biochem. Biophys. Res. Comm. 280: 1015 -1020 (2001)). A un individuo se le administra una dosis farmacológicamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene el polipéptido de fusión Klotho, que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos, para tratar o prevenir la enfermedad renal crónica o insuficiencia renal crónica. En particular, un polipéptido de fusión Klotho que contiene al menos un dominio extracelular de una proteína alfa-Klotho es útil para el tratamiento de la enfermedad renal crónica o insuficiencia renal crónica.

Los polipéptidos de fusión Klotho también se pueden utilizar para el tratamiento o la prevención de cáncer en un individuo. Por ejemplo, se ha demostrado que la expresión de Klotho se reduce en el tejido de cáncer de mama, comparado con el tejido de cáncer de mama normal (Wolf y colaboradores, Oncogene (2008), publicación en línea anticipada). A un individuo se le administra una dosis farmacológicamente efectiva de una composición farmacéutica que contiene el polipéptido de fusión Klotho, que tiene al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho y un factor de crecimiento de fibroblastos, para tratar o prevenir el cáncer, o cáncer de mama. En particular, una proteína de fusión Klotho que contiene al menos un dominio extracelular de una proteína alfa-Klotho es útil para el tratamiento de cáncer, o de cáncer de mama.

Los métodos para evaluar la eficacia y/o para determinar la dosis efectiva de un polipéptido de fusión Klotho de la invención sobre un trastorno relacionado con la edad o un trastorno metabólico, incluyen ensayos basados en el organismo, por ejemplo, utilizando un mamífero (por ejemplo, un ratón, rata, primate, o algún otro no humano), u otro

animal (por ejemplo, pulpo, pez cebra, o un invertebrado tal como una mosca o un nemátodo). El polipéptido de fusión Klotho se puede administrar al organismo una vez o como un régimen (regular o irregular). Se evalúa entonces un parámetro del organismo, por ejemplo, un parámetro asociado con la edad. Los polipéptidos de fusión Klotho que son de interés, dan como resultado un cambio en el parámetro en relación con uno de referencia, por ejemplo, un parámetro de un organismo de control. También se pueden evaluar otros parámetros (por ejemplo, relacionados con la toxicidad, la eliminación, y la farmacocinética).

El polipéptido de fusión Klotho de la invención se puede evaluar utilizando un animal que tenga un trastorno particular, por ejemplo, un trastorno descrito en Ia presente invención, por ejemplo, un trastorno relacionado con la edad, o un trastorno metabólico. Estos trastornos también pueden proporcionar un sistema sensibilizado en el que se puedan observar los efectos o la fisiología del polipéptido de prueba. Los ejemplos de trastornos incluyen: desenervación, atrofia por desuso; trastornos metabólicos (por ejemplo, trastorno de animales obesos y/o diabéticos tales como el ratón db/db y el ratón ob/ob); isquemia cerebral, de hígado; modelos de cisplatina / taxol / vincristina; diferentes trasplantes de tejido (xenoinjerto); modelos óseos transgénicos; síndromes de dolor (incluyendo trastornos inflamatorios y neuropáticos); modelos de estrés por Paraquat, genotóxicos, y de estrés oxidativo; y modelos de tumor I.

Para medir un trastorno relacionado con la edad, el modelo animal puede ser un animal que tenga un fenotipo alterado cuando sea calóricamente restringido. Por ejemplo, las ratas F344 proporcionan un sistema de ensayo útil para evaluar un polipéptido de fusión Klotho. Cuando son calóricamente restringidas, las ratas F344 tienen de 0 a 10% de incidencia de nefropatía. Sin embargo, cuando se alimentan a placer, tienen una incidencia de nefropatía del 60 al 100%.

Con el fin de evaluar un polipéptido de fusión Klotho de la invención, se administra al animal (por ejemplo, una rata F344 u otro animal adecuado), y se evalúa un parámetro del animal, por ejemplo, después de un período de tiempo. EI animal se puede alimentar a placer o normalmente (por ejemplo, no bajo restricción calórica, aunque se pueden evaluar algunos parámetros bajo tales condiciones). Típicamente, se utiliza una cohorte de estos animales para el ensayo. En términos generales, se puede indicar un polipéptido de prueba por alterar favorablemente la regulación del lapso de vida en el animal, si el polipéptido de prueba afecta al parámetro en Ia dirección del fenotipo de un sujeto animal similar para la restricción calórica. Estos polipéptidos de prueba pueden causar al menos algunos de los efectos reguladores del lapso de vida de la restricción calórica, por ejemplo, un subconjunto de tales efectos, sin que se tenga que privar al organismo de la ingesta calórica.

EI parámetro que se vaya a probar puede ser un parámetro asociado con la edad o asociado con una enfermedad, por ejemplo, un síntoma del trastorno asociado con el modelo animal. Por ejemplo, el polipéptido de prueba se puede administrar a una Rata SH, y se monitorea la presión sanguínea. Un polipéptido de prueba que sea favorablemente indicado puede provocar una mejoría del síntoma en relación con un animal de referencia similar no tratado con el polipéptido. Otros parámetros relevantes para un trastorno o para el envejecimiento pueden incluir: niveles de antioxidantes (por ejemplo, niveles o actividad de enzimas antioxidantes), resistencia al estrés (por ejemplo, resistencia al Paraquat), temperatura corporal central, niveles de glucosa, niveles de insulina, niveles de hormona estimulante de la tiroides, niveles de prolactina, y niveles de la hormona Ieutinizante.

Con el fin de medir Ia efectividad de los polipéptidos de Ia invención para el tratamiento de un trastorno relacionado con la edad, se puede utilizar un animal que tenga una expresión reducida de Klotho, por ejemplo, un ratón con un Klotho mutante; véase Kuroo y colaboradores, Nature, 390; 45 (1997) y la publicación de patente de los Estados Unidos No. 2003/0119910.

Por ejemplo, se administra el polipéptido de prueba al ratón mutante, y se controlan los parámetros relacionados con la edad. Un polipéptido de prueba que sea favorablemente el indicado, puede provocar la mejoría del síntoma en relación con un animal de referencia similar no tratado con el polipéptido. Un parámetro relevante para un trastorno metabólico o para el envejecimiento, se puede evaluar mediante la medición del peso corporal, el examen sobre la adquisición de capacidad reproductiva, la medición del nivel de azúcar en sangre, la observación del lapso de vida, la observación de la piel, la observación de las funciones motoras, tales como caminar, y similares. La evaluación también se puede hacer mediante la medición del peso del timo, la observación del tamaño de los nódulos calcificados formados sobre la superficie interna de la cavidad torácica, y similares. Además, también es útil para la evaluación la determinación cuantitativa del ARNm para el gen Klotho o para la proteína Klotho.

Incluso otros modelos in vivo y ensayos de organismos incluyen evaluar a un animal para determinar un parámetro metabólico, por ejemplo, un parámetro relevante para un trastorno de insulina, o diabetes tipo II. Los ejemplos de parámetros metabólicos incluyen: concentración de glucosa, concentración de insulina, y sensibilidad a la insulina.

Otro ejemplo de sistema proporciona tumores, por ejemplo, en un modelo animal. Los tumores pueden ser espontáneos o inducidos. Por ejemplo, los tumores se pueden desarrollar a partir de células que tengan una variedad de constituciones genéticas, por ejemplo, pueden ser p53+ o p53-. También es posible utilizar organismos

que tengan un trastorno autoinmune, por ejemplo, un ratón NZB, el cual está predispuesto a SLE. Con el objeto de evaluar las características de la enfermedad ósea, es posible, por ejemplo, utilizar un animal que tenga una ovariotomía como modelo. Por ejemplo, para la osteoporosis. De una manera similar, para enfermedad de las articulaciones, el modelo se puede basar en artritis adyuvante (por ejemplo, los ratones se pueden inmunizar con proteoglicanos de cartílago, proteínas del grupo de alta movilidad, material de pared celular estreptocócica, o colágenos); para enfermedad del riñón, se pueden utilizar ratones kd/kd. También están disponibles modelos animales de cognición, en particular de aprendizaje y de memoria. También están disponibles modelos animales de diabetes y sus complicaciones, por ejemplo, el modelo de estreptozocina. Se pueden utilizar modelos caninos, por ejemplo, para evaluar embolia e isquemia.

En la evaluación de si un polipéptido de prueba es capaz de alterar la regulación del lapso de vida, se pueden monitorear o evaluar una cantidad de parámetros o biomarcadores asociados con la edad. Los ejemplos de parámetros asociados con la edad incluyen: (i) lapso de vida de la célula o del organismo; (ii) presencia o abundancia de un transcripto genético o de un producto genético en la célula u organismo que tenga un patrón de expresión dependiente de la edad biológica; (iii) resistencia de la célula u organismo al estrés; (iv) uno o más parámetros metabólicos de la célula u organismo (los ejemplos de parámetros incluyen los niveles circulantes de insulina, los niveles de glucosa en sangre; el contenido de grasa; la temperatura corporal central, etc.; (v) la capacidad proliferativa de la célula o de un conjunto de células presentes en el organismo; y (vi) la apariencia física

o el comportamiento de la célula u organismo.

El término "lapso de vida promedio" se refiere al promedio de la edad de muerte de una cohorte de organismos. En algunos casos, el "lapso de vida promedio" se evalúa utilizando una cohorte de organismos genéticamente idénticos bajo condiciones medio ambientales controladas. Se desechan las muertes debidas a un percance. Cuando no se puede determinar el lapso de vida promedio (por ejemplo, para seres humanos) bajo condiciones medio ambientalmente controladas, se puede utilizar información estadística confiable (por ejemplo, a partir de las tablas actuariales) para una población suficientemente grande, como el lapso de vida promedio.

La caracterización de las diferencias moleculares entre dos de estos organismos, por ejemplo, un organismo de referencia y un organismo tratado con un polipéptido de fusión Klotho, puede revelar una diferencia en el estado fisiológico de los organismos. EI organismo de referencia y el organismo tratado son típicamente de Ia misma edad cronológica. El término "edad cronológica", como se utiliza en Ia presente invención, se refiere al tiempo transcurrido desde un evento previamente seleccionado, tal como la concepción, una etapa embrionaria o fetal definida, o, más preferiblemente, el nacimiento. Se pueden emplear una variedad de criterios para determinar si los organismos son de la "misma" edad cronológica para el análisis comparativo. Típicamente, el grado de precisión requerido es una función del lapso de vida promedio de un organismo de tipo silvestre. Por ejemplo, para el nemátodo C. elegans, para el cual la cepa de tipo silvestre N2 de laboratorio vive un promedio de aproximadamente 16 días bajo algunas condiciones controladas, los organismos de la misma edad pueden haber vivido durante el mismo número de días. Para ratones, un organismo de la misma edad puede haber vivido durante el mismo número de semanas o meses; para primates o seres humanos, el mismo número de años (o dentro de 2, 3, o 5 años); y así sucesivamente. En términos generales, los organismos de la misma edad cronológica pueden haber vivido durante una cantidad de tiempo dentro del 15, 10, 5, 3, 2 o 1% del lapso de vida promedio de un organismo de tipo silvestre de esa especie. De preferencia, los organismos son organismos adultos, por ejemplo, los organismos ha vivido durante al menos una cantidad de tiempo en el que el organismo de tipo silvestre promedio ha madurado hasta una edad en Ia cual es competente para reproducirse.

EI ensayo de criba del organismo se puede llevar a cabo antes de que los organismos exhiban las características físicas evidentes del envejecimiento. Por ejemplo, los organismos pueden ser adultos que hayan vivido solamente el 10, 30, 40, 50, 60, o 70 por ciento del lapso de vida promedio de un organismo de tipo silvestre de Ia misma especie. Se han reportado cambios asociados con Ia edad en el metabolismo, competencia inmune, y estructura cromosómica. Cualquiera de estos cambios se puede evaluar, ya sea en un sujeto de prueba (por ejemplo, para un ensayo basado en el organismo), o para un paciente (por ejemplo, antes, durante, o después del tratamiento con un compuesto terapéutico descrito en la presente invención).

También se puede evaluar un marcador asociado con la restricción calórica en el organismo de un sujeto de un ensayo de cribado (o de un sujeto tratado). Aunque estos marcadores pueden no estar asociados con la edad, pueden ser indicativos de un estado fisiológico que se altera cuando se modula Ia ruta de Klotho. EI marcador puede ser un ARNm o una proteína cuya abundancia cambia en los animales calóricamente restringidos. La publicación internacional No. WO 01/12851 y la patente de los Estados Unidos No. 6.406.853 describen ejemplos de marcadores. Se pueden utilizar modelos celulares derivados a partir de células de un animal descrito en la presente invención o análogas a un modelo animal descrito en Ia presente invención, para un ensayo basado en células.

Los modelos para evaluar el efecto de un polipéptido de prueba sobre atrofia muscular incluyen: 1) pérdida de masa muscular del gastrocnemio medial de rata resultante de desenervación, por ejemplo, mediante el corte del nervio ciático derecho a la mitad del muslo; 2) pérdida de masa muscular del gastrocnemio medial de rata resultante de

inmovilización, por ejemplo, mediante la fijación de la articulación del tobillo derecho a 90 grados de flexión; 3) pérdida de masa muscular del gastrocnemio medial de rata resultante de la suspensión de la extremidad trasera; (véase, por ejemplo, Ia solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2003-0129686); 4) atrofia de músculo esquelético resultante del tratamiento con la citoquina caquéctica: interleucina-1 (lL-1) (R. N. Cooney, S. R. Kimball,

T. C. Vary, Shock 7, 1 -16 (1997)); y 5) atrofia de músculo esquelético resultante del tratamiento con el glucocorticoide, dexametasona (A. L. Goldberg, J Biol Chem 244, 3223 -9 (1969)).

Los ejemplos de modelos animales para AMD incluyen: modelo de ratón inducido por láser que estimula la degeneración macular exudativa (húmeda), Bora y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA, 100: 2679 -84 (2003); un ratón transgénico que expresa una forma mutada de catepsina D, que da como resultado características asociadas con la forma de "atrofia geográfica" de la AMD (Rakoczy y colaboradores, Am. J. Pathol., 161: 1515 -24 (2002)); y un ratón transgénico que sobreexpresa el VEGF en el epitelio del pigmento retinal, que da como resultado CNV. Schwesinger y colaboradores, Am. J. Pathol. 158: 1161 -72 (2001).

Los ejemplos de modelos animales de enfermedad de Parkinson incluyen primates que se vuelven Parkinsonianos mediante el tratamiento con la neurotoxina dopaminérgica 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidro-piridina (MPTP) (véase, por ejemplo, la publicación de la patente de los Estados Unidos No. 20030055231, y Wichmann y colaboradores, Ann. N. Y. Acad. Sci, 991: 199 -213 (2003); ratas lesionadas con 6-hidroxidopamina (por ejemplo, Lab. Anim. Sci.,

49: 363 -71 (1999)); y modelos invertebrados transgénicos (por ejemplo, Lakso y colaboradores, J. Neurochem. 86: 165 -72 (2063), y Link, Mech. Ageing Dev., 122: 1639 -49 (2001)).

Los ejemplos de modelos moleculares de diabetes Tipo II incluyen: un ratón transgénico que tiene el Nkx-2.2 o el Nkx-6.1 defectuosos; (patente de los Estados Unidos No. 6.127.598); rata fa/fa grasosa diabética de Zucker (ZDF) (patente de los Estados Unidos No. 6.569.832); y monos Rhesus, los cuales desarrollan espontáneamente obesidad, y posteriormente, progresan con frecuencia hasta diabetes tipo 2 manifiesta (Hotta y colaboradores, Diabetes, 50: 1126 -33 (2001); y un ratón transgénico con un receptor de IGF-l negativo dominante (KR-IGF-IR) que tiene resistencia a la insulina como la diabetes Tipo 2.

Los ejemplos de modelos animales y celulares para neuropatía incluyen: neuropatía sensorial-motora inducida por vincristina en ratones (patente de los Estados Unidos No. 5.420.112) o en conejos (Ogawa y colaboradores, Neurotoxicology, 21: 501 -11 (2000)); una rata diabética por estreptozocina (STZ) para el estudio de neuropatía autónoma (Schmidt y colaboradores, Am. J. Pathol., 163: 21 -8 (2003)); y un ratón con neuropatía motora progresiva (pmn) (Martin y colaboradores, Genomics, 75: 9 -16 (2001)).

Los ejemplos de modelos animales de hiperfosfatemia o calcinosis tumoral incluyen ratones con desactivación genética de Klotho y ratones con desactivación genética de FGF23 (Yoshida y colaboradores, Endocrinology 143: 683 -689 (2002)).

Los ejemplos de modelos animales de enfermedad renal crónica o insuficiencia renal crónica incluyen ratones COL4A3+/-(Beirowski y colaboradores, J. Am. Soc. Nephrol. 17: 1986 -1994 (2006)).

Los ejemplos de modelos animales de cáncer incluyen el trasplante o implante de células o tejido canceroso en ratones sin pelo, como se conoce en el arte (Giovanella y colaboradores, Adv. Cancer Res. 44: 69 -120 (1985)). Por ejemplo, los modelos animales de cáncer de mama incluyen ratones sin pelo trasplantados o implantados con células o tejido de cáncer de mama (por ejemplo, Yue y colaboradores, Cancer Res. 54: 5092 -5095 (1994); Glinsky y colaboradores, Cancer Res. 56: 5319 -5324 (1996); Visonneau Am. J. Path. 152: 1299 -1311 (1998)).

Las composiciones se pueden administrar a un sujeto, por ejemplo, a un sujeto adulto, en particular a un sujeto adulto sano o a un sujeto que tenga una enfermedad relacionada con la edad. En el último caso, el método puede incluir la evaluación de un sujeto, por ejemplo, para caracterizar un síntoma de una enfermedad relacionada con la edad u otro marcador de enfermedad, e identificar de esta manera a un sujeto por tener una enfermedad neurodegenerativa, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer o una enfermedad relacionada con la edad, o por estar predispuesto a dicha enfermedad.

Atrofia de músculo esquelético

Los métodos que disponen la administración del polipéptido de fusión Klotho a un individuo, se pueden utilizar para tratar atrofia del músculo esquelético. La atrofia muscular incluye numerosos trastornos y enfermedades neuromusculares, metabólicas, inmunológicas y neurológicas, así como hambre, deficiencia nutricional, estrés metabólico, diabetes, envejecimiento, distrofia muscular, o miopatía. La atrofia muscular se presenta durante el proceso de envejecimiento. La atrofia muscular también resulta del uso reducido o desuso del músculo. Los síntomas incluyen una declinación en la masa de tejido muscular esquelético. En los hombres, la masa muscular declina por una tercera parte entre las edades de 50 y 80 años. Algunas características moleculares de la atrofia muscular incluyen la sobrerregulación de las ligasas de ubiquitina, y la pérdida de proteínas miofibrilares (Furuno y

colaboradores, J. Biol. Chem., 265: 8550 -8557, 1990). La descomposición de estas proteínas puede ser seguida, por ejemplo, mediante la medición de la producción de 3-metil-histidina, que es un constituyente especifico de la actina, y en ciertos músculos, de miosina (Goodman, Biochem. J. 241: 121 -12, 1987 y Lowell y colaboradores, Metabolism, 35: 1121 -112, 1986; Stein y Schluter, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 272: E688 -E696, 1997). La liberación de creatina quinasa (un marcador de daño celular) (Jackson, y colaboradores, Neurology, 41: 101 -104, 1991) también puede ser una indicación.

Diabetes no dependiente de insulina

Los métodos que disponen la administración del polipéptido de fusión Klotho a un individuo, se pueden utilizar para tratar la diabetes no dependiente de insulina. La diabetes no dependiente de insulina también se denomina como diabetes “de aparición en adultos" y diabetes Tipo 2. La diabetes Tipo 2 también incluye "tipo 2 sin obesidad" y "tipo 2 con obesidad". La diabetes Tipo ll se puede caracterizar por (1) secreción reducida de insulina por parte de las células beta de islotes pancreáticos, de tal manera que se producen cantidades menores que las necesarias de insulina, para mantener en equilibrio los niveles de glucosa en sangre, y/o (2) "resistencia a la insulina", en donde el cuerpo fracasa en responder normalmente a la insulina. (Patente de los Estados Unidos No. 5.266.561 y patente de los Estados Unidos No. 6.518.069). Por ejemplo, los niveles de insulina estimulados por glucosa típicamente fracasan en elevarse por encima de 4,0 nmol/L. (Patente de los Estados Unidos No. 5.266.561). Los ejemplos de síntomas de Ia diabetes Tipo ll incluyen: hiperglicemia en ayunas (patente de los Estados Unidos No. 5.266.561); fatiga; sed excesiva; micción frecuente; visión borrosa; y un mayor índice de infecciones. Las indicaciones moleculares de la diabetes Tipo ll incluyen depósito amiloide de islotes en el páncreas.

Neuropatía

La neuropatía puede incluir una disfunción de nervios centrales y/o periféricos causada por una enfermedad sistémica, una condición hereditaria, o un agente tóxico que afecte a los nervios motores, sensoriales, sensomotores, o autónomos. (Véase, por ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20030013771). Los síntomas pueden variar dependiendo de Ia causa del daño del nervio y de los tipos particulares de nervios afectados. Por ejemplo, los síntomas de neuropatía motora incluyen torpeza para llevar a cabo tareas físicas, o como debilidad muscular, agotamiento después de un ejercicio menor, dificultad para estar de pie o caminando, y atenuación o ausencia de un reflejo neuromuscular. (Solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20030013771); los síntomas de neuropatía autónoma incluyen constipación, irregularidades cardíacas, y atenuación del reflejo hipotensivo postural. (Solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20030013771); los síntomas de neuropatía sensorial incluyen dolor y entumecimiento; hormigueo en las manos, piernas o pies; y sensibilidad extrema al tacto; y los síntomas de retinopatía incluyen visión borrosa, perdida de visión repentina, puntos negros, y luces intermitentes.

Enfermedad de Alzheimer

Los métodos que disponen la administración del polipéptido de fusión Klotho a un individuo, se pueden utilizar para tratar la enfermedad de Alzheimer (AD). La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa compleja que trae como resultado la pérdida irreversible de neuronas. Proporciona simplemente un ejemplo de una enfermedad neurodegenerativa que también es una condición relacionada con la edad. Las indicaciones clínicas de la enfermedad de Alzheimer incluyen deterioro progresivo de la memoria, del juicio, y de la orientación en los alrededores físicos, y del lenguaje. Las indicaciones neuropatológicas de la AD incluyen pérdida neuronal específica de una región, placas amiloideas, y haces neurofibrilares. Las placas amiloideas son placas extracelulares que contienen el péptido amiloide (también conocido como Ap o Ap42), el cual es un producto de la disociación de la proteína precursora del 8-amiloide (también conocida como APP). Los haces neurofibrilares son agregados intracelulares insolubles compuestos de filamentos de la proteína asociada con microtúbulos anormalmente hiperfosforilados, las placas amiloideas tensas y los haces neurofibrilares pueden contribuir a los eventos secundarios que conducen a una pérdida neuronal por apoptosis (Clark y Karlawish, Ann. Intern. Med. 138(5): 400 410 (2003). Por ejemplo, el p-amiloide induce la apoptosis que depende de la caspasa-2 en neuronas cultivadas (Troy y colaboradores, J Neurosci. 20(4): 1386 -1392). EI depósito de placas in vivo puede desencadenar la apoptosis de las neuronas proximales de una manera similar.

Se pueden emplear una variedad de criterios, incluyendo criterios genéticos, bioquímicos, fisiológicos, y cognitivos, para evaluar Ia enfermedad de Alzheimer en un sujeto. Los síntomas y el diagnóstico de la AD son conocidos por los médicos. Algunos ejemplos de síntomas y marcadores de la enfermedad de Alzheimer se presentan a continuación. La información acerca de estas indicaciones y otras indicaciones que se sabe que están asociadas con la enfermedad de Alzheimer, se puede utilizar como un "parámetro relacionado con la enfermedad de Alzheimer". Un parámetro relacionado con la enfermedad de Alzheimer puede incluir información cualitativa o cuantitativa. Un ejemplo de información cuantitativa es un valor numérico de una o más dimensiones, por ejemplo, una concentración de una proteína o un mapa tomográfico. La información cualitativa puede incluir una evaluación, por ejemplo, los comentarios de un médico, o un binario ("sí" / "no"), etc. Un parámetro relacionado con la enfermedad de Alzheimer incluye información que indica que el sujeto no está diagnosticado con la enfermedad de Alzheimer, o

que no tiene una indicación particular de enfermedad de Alzheimer, por ejemplo, un resultado de una prueba cognitiva que no es típico de Ia enfermedad de Alzheimer, o un polimorfismo genético de APOE no asociado con la enfermedad de Alzheimer.

El deterioro cognitivo progresivo es una indicación de la enfermedad de Alzheimer. Este deterioro puede presentarse como una declinación en la memoria, en el juicio, en la toma de decisiones, en la orientación en los alrededores físicos, y en el lenguaje (Nussbaum y Ellis, New Eng J. Med. 348(14): 1356 35 1364 (2003)). La exclusión de otras formas de demencia puede ayudar en Ia elaboración de un diagnóstico de enfermedad de Alzheimer. La muerte neuronal conduce a atrofia cerebral progresiva en los pacientes de enfermedad de Alzheimer. Se pueden utilizar técnicas de toma de imágenes (por ejemplo, toma de imágenes de resonancia magnética, o tomografía asistida por ordenador) para detectar las lesiones asociadas con la enfermedad de Alzheimer en el cerebro y/o Ia atrofia del cerebro.

Los pacientes con enfermedad de Alzheimer pueden exhibir anormalidades bioquímicas que resultan de la patología de la enfermedad. Por ejemplo, los niveles de proteína tan en el fluido cerebroespinal, están elevados en los pacientes con enfermedad de Alzheimer (Andreasen, N. y colaboradores, Arch Neurol. 58: 349 -350 (2001)).

Los niveles del péptido amiloide beta 42 (A,B42) se pueden reducir en el CSF de los pacientes con enfermedad de Alzheimer. Los niveles de Ap42 se pueden incrementar en el plasma de los pacientes con enfermedad de Alzheimer (Ertekein-Taner, N. y colaboradores, Science 290: 2303 -2304 (2000)). Las técnicas para detectar las anormalidades bioquímicas en una muestra de un sujeto incluyen métodos celulares, inmunológicos, y otros métodos biológicos conocidos en la técnica. Para una guía general, véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook y Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001), Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley lnterscience, N.Y. (1989), (Harrow, E. y Lane, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), y las ediciones actualizadas de los mismos.

Por ejemplo, se pueden utilizar anticuerpos, otras inmunoglobulinas, y otros ligandos de enlazamiento específico para detectar una biomolécula, por ejemplo, una proteína u otro antígeno asociado con la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, se pueden utilizar uno o más anticuerpos específicos para sondear una muestra. Son posibles diferentes formatos, por ejemplo, los ELISA, ensayos basados en fluorescencia, transferencias tipo Western, y arreglos de proteínas. Los métodos para producir arreglos de polipéptidos se describen en la técnica, por ejemplo, en De Wildt y colaboradores, (2000). Nature Biotech. 18, 989 -994; Lucking y colaboradores, (1999). Anal. Biochem. 270, 103 -111; Ge, H. (2000). Nucleic Acids Res. 28, e3, I -Vll; MacBeath, G., y Schreiber, S. L. (2000). Science 289, 1760 a 1763; y la publicación internacional No. WO 99/51773A1.

En un ensayo, se utiliza un modelo animal no humano de la enfermedad de Alzheimer (por ejemplo, un modelo de ratón), por ejemplo, para evaluar un polipéptido o un régimen terapéutico. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.509.515 describe uno de tales modelos animales que es naturalmente adecuado para ser utilizado con las pruebas de aprendizaje y memoria. El animal expresa una secuencia de proteína precursora de amiloide (APP) en un nivel en los tejidos del cerebro, de tal manera que el animal desarrolla un trastorno necrológico progresivo dentro de un corto período de tiempo a partir del nacimiento, en términos generales dentro de un año a partir del nacimiento, de preferencia dentro de 2 a 6 meses a partir del nacimiento. La secuencia de la proteína precursora de amiloide se introduce en el animal, o en un ancestro del animal, en una etapa embrionaria, de preferencia en la etapa de una célula, o del oocito fertilizado, y, en términos generales, no después de aproximadamente la etapa de 8 células. Entonces se desarrolla el cigoto o embrión hasta término en un pseudo-embarazo como hembra adoptiva. Los genes de la proteína precursora de amiloide se introducen en un embrión animal, para incorporarse cromosómicamente en un estado que da como resultado la expresión súper endógena de la proteína precursora de amiloide y el desarrollo de una enfermedad necrológica progresiva en las áreas corticoIímbicas del cerebro, las áreas del cerebro que son prominentemente afectadas en los estados de enfermedad necrológica progresiva, tales como la enfermedad de Alzheimer. La gliosis y las manifestaciones clínicas en los animales transgénicos afectados, modelan la enfermedad necrológica. Los aspectos progresivos de la enfermedad neurológica se caracterizan por un comportamiento exploratorio y/o locomotor disminuido, y por una menor absorción/utilización de desoxiglucosa, y gliosis hipertrófica en las regiones corticoIímbicas del cerebro. Además, los cambios que se ven son similares a aquéllos que se ven en algunos animales durante el envejecimiento. También se describen otros modelos animales en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.387.742; 5.877.399; 6.358.752; y 6.187.992.

Enfermedad de Parkinson

Los métodos que disponen la administración del polipéptido de fusión Klotho a un individuo se pueden utilizar para tratar Ia enfermedad de Parkinson. La enfermedad de Parkinson incluye neurodegeneración de las neuronas dopaminérgicas en la substancia negra que da como resultado la degeneración del sistema de dopamina nigroestriatal que regula la función motora. Esta patología, a su vez, conduce a disfunciones motoras (véase, por ejemplo, Lotharius y colaboradores, Nat. Rev. Neurosci., 3: 932 -42 (2002)). Los ejemplos de síntomas motores

incluyen: aquinesia, postura encorvada, dificultad en el modo de andar, inestabilidad postural, catalepsia, rigidez muscular, y temblor. Los ejemplos de síntomas no motores incluyen: depresión, falta de motivación, pasividad, demencia, y disfunción gastrointestinal (véase, por ejemplo, Fahn, Ann. N.Y. Acad. Sci., 991: 1 -14 (2003) y Pfeiffer, Lancet NeuroI., 2: 107 -16 (2003)). La enfermedad de Parkinson ha sido observada en 0,5 al 1 por ciento de las personas de 65 a 69 años de edad, y del 1 al 3 por ciento entre las personas mayores de 80 años de edad. (Véase, por ejemplo, Nussbaum y colaboradores, N. Engl. J. Med., 348: 1356 -64 (2003)). Los marcadores moleculares de la enfermedad de Parkinson incluyen reducción en la descarboxilasa del aminoácido L aromático (AADC) (véase, por ejemplo, la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20020172664); y pérdida del contenido de dopamina en las neuronas nigroestriatales (véase, por ejemplo, Fahn, Ann. N. Y. Acad. Sci., 991: 1 -14 (2003) y Lotharius y colaboradores, Nat. Rev. Neurosci, 3: 932 -42 (2002)). En algunos casos familiares, la enfermedad de Parkinson está ligada a las mutaciones en los genes individuales que codifican las proteínas alfa-sinucleína y parkina (una ligasa de ubiquitina E3). (Por ejemplo, Riess y colaboradores, J. Neurol. 25D Suplemento 1: 13 10 (2003) y Nussbaum y colaboradores, N. Engl. J. Med., 348: 1356 -64 (2003)). Una mutación con cambio de sentido en un gen de hidrolasa de ubiquitina del terminal C específico de las neuronas también está asociado con la enfermedad de Parkinson. (Por ejemplo, Nussbaum y colaboradores, N. Engl. J. Med., 348: 1356 -64 (2003)).

Enfermedad de Huntington

Los métodos que disponen la administración del polipéptido de fusión Klotho a un individuo, se pueden utilizar para tratar la enfermedad de Huntington. Los métodos para evaluar la eficacia y/o para determinar Ia dosis efectiva de un polipéptido de fusión Klotho sobre la enfermedad de Huntington incluyen ensayos basados en el organismo, por ejemplo, utilizando un mamífero (por ejemplo, un ratón, rata, primate, o algún otro no humano), u otro animal (por ejemplo, pulpo, pez cebra, o un invertebrado, tal como una mosca o un nemátodo). Están disponibles una cantidad de sistemas de modelos animales para Ia enfermedad de Huntington. Véase, por ejemplo, Brouillet, Functional Neurology 15(4): 239 -251 (2000); Ona y colaboradores, Nature 399: 263 -267 (1999), Bates y colaboradores, Hum Mol Genet. 6(10): 1633 -7 (1997); Hansson y colaboradores, J. of Neurochemistry 78: 694 -703; y Rubinsztein, D. C., Trends in Genetics, Volumen 1S, No. 4, páginas 202 -209 (una revisión sobre diferentes modelos animales y no humanos de la enfermedad de Huntington).

Un ejemplo de estos modelos animales es la cepa transgénica de ratón de la línea R6/2 (Mangiarini y colaboradores, Cell 87: 493 -506 (1996)). Los ratones R6/2 son ratones transgénicos de enfermedad de Huntington, los cuales sobreexpresan el exón 1 del gen humano de la enfermedad de Huntington (bajo el control del promotor endógeno). El exón 1 del gen humano de la enfermedad de Huntington R6/2 tiene una longitud expandida de repetición de CAG/poliglutamina (150 repeticiones de CAG en promedio). Estos ratones desarrollan una enfermedad neurológica progresiva y finalmente fatal, con muchas características de la enfermedad de Huntington humana. En los ratones R6/2 se observan agregados anormales, constituidos en parte por la parte del terminal N de Huntingtina (codificada por el exón 1 de la enfermedad de Huntington), ambos con 45 en el citoplasma y en los núcleos de las células (Davies y colaboradores, Cell 90: 537 -548 (1997)). Por ejemplo, la proteína Huntingtina humana en el animal transgénico es codificada por un gen que incluye al menos 55 repeticiones de CAG, y más preferiblemente, aproximadamente 150 repeticiones de CAG. Estos animales transgénicos pueden desarrollar un fenotipo del tipo de Ia enfermedad de Huntington.

Estos ratones transgénicos se caracterizan por una reducción en la ganancia de peso, un lapso de vida reducido, y un deterioro motor caracterizado por un andar anormal, temblor en reposo, torcimiento de las extremidades traseras, e hiperactividad de las 8 a las 10 semanas después del nacimiento (por ejemplo, la cepa R6/2; véase Mangiarini y colaboradores, Cell 87: 493 -506 (1996)). EI fenotipo empeora progresivamente hacia la hipoquinesia. Los cerebros de estos ratones transgénicos también demuestran anormalidades neuroquímicas e histológicas, tales como cambios en los receptores de los neurotransmisores (glutamato, dopaminérgico), concentración reducida del aspartato de N-acetilo (un marcador de Ia integridad neuronal), y un tamaño reducido del estriato y del cerebro. Por lo tanto, la evaluación puede incluir la evaluación de los parámetros relacionados con los niveles de los neurotransmisores, con los niveles de los receptores de los neurotransmisores, con el tamaño del cerebro, y con el tamaño del estriato. Además, están presentes agregados anormales que contienen la parte transgénica de la proteína Huntingtina humana de longitud completa en el tejido cerebral de estos animales (por ejemplo, la cepa de ratón transgénico R6/2). Véase, por ejemplo, Mangiarini y colaboradores, Cell 87: 493 -506 (1996), Davies y colaboradores, Cell 90: 537 -548 (1997), Brouillet, Functional Neurology 15(4): 239 -251 (2000), y Cha y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 95: 6480 -6485 (1998).

Para analizar el efecto del polipéptido de prueba o del polipéptido conocido descrito en la solicitud en un modelo animal, se administran diferentes concentraciones del polipéptido de prueba al animal transgénico, por ejemplo, mediante la inyección del polipéptido de prueba en el torrente sanguíneo del animal. Se puede evaluar un síntoma del tipo de la enfermedad de Huntington en el animal. Se hace seguimiento entonces al progreso de los síntomas del tipo de la enfermedad de Huntington, por ejemplo, como se describió anteriormente para el modelo de ratón, para determinar si el tratamiento con el polipéptido de prueba da como resultado o no la reducción o el retraso de los síntomas. En otro ensayo, se hace seguimiento a la desagregación de los agregados de proteína Huntingtina en

estos animales. Luego se puede sacrificar al animal, y se obtienen rebanadas de cerebro. Luego se analizan las rebanadas de cerebro para determinar la presencia de agregados que contengan la proteína Huntingtina humana transgénica, una porción de la misma, o una proteína de fusión que contenga la proteína Huntingtina humana, o una porción de la misma. Este análisis puede incluir, por ejemplo, teñir las rebanadas de tejido cerebral con anticuerpo anti-Huntingtina, y agregar un anticuerpo secundario conjugado con FITC, que reconoce al anticuerpo antienfermedad de Huntington (por ejemplo, el anticuerpo anti-Huntingtina es un anticuerpo anti-humano de ratón, y el anticuerpo secundario es específico para el anticuerpo humano), y visualizar los agregados de proteína mediante el microscopía de fluorescencia.

Se encuentran disponibles una variedad de métodos para evaluar y/o hacer seguimiento a la enfermedad de Huntington. Se conocen una variedad de síntomas e indicaciones clínicas para la enfermedad. La enfermedad de Huntington provoca un trastorno del movimiento, dificultades psiquiátricas, y cambios cognitivos. El grado, la edad de inicio, y la manifestación de estos síntomas pueden variar. El trastorno del movimiento puede incluir movimientos rápidos y aleatorios como de baile denominados como corea.

Los ejemplos de evaluaciones motoras incluyen: persecución ocular, inicio espasmódico, velocidad espasmódica, disartria, lengua sobresaliente, capacidad táctil de dedos, pronador/supinador, secuencia puño-mano-palma, rigidez de los brazos, bradiquinesia, distonía máxima (tronco, y extremidades superiores e inferiores), corea máxima (por ejemplo, tronco, y extremidades superiores e inferiores), encorvamiento, caminar en fila, y retropulsión. Un ejemplo de tratamiento puede provocar un cambio en el Puntaje Motor Total de 4 (TMS-4), una subescala de la UHDRS, por ejemplo, durante un período de un año.

Cáncer

Los métodos que disponen la administración del polipéptido de fusión Klotho a un individuo, se puede utilizar para tratar el cáncer. Cáncer incluye cualquier enfermedad que sea causada por, o que dé como resultado niveles inapropiadamente altos de división celular, niveles inapropiadamente bajos de apoptosis, o ambos. Los ejemplos de cánceres incluyen, sin limitación, leucemias (por ejemplo, leucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, leucemia monocítica aguda, eritroleucemia aguda, leucemia crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfoma (enfermedad de Hodgkin, enfermedad no Hodgkin), macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadena pesada, y tumores sólidos tales como sarcomas y carcinomas (por ejemplo, fibrosarcoma, mixosarcoma, Iiposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, sarcoma endotelial, Iinfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, Ieiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer pancreático, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de conducto del Nilo, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer cervical, cáncer uterino, cáncer testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, schwannoma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, y retinoblastoma). Los trastornos linfoproliferativos también se consideran como enfermedades proliferativas.

5. Ejemplos

Ejemplo 1. Expresión y purificación de los polipéptidos de fusión Klotho

Expresión del polipéptido de fusión Klotho

Los polipéptidos de la invención se elaboraron mediante la transfección transitoria de células HEK293T con un vector de expresión que codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene el dominio extracelular de alfa-Klotho y la variante de FGF23 (R179Q). Los medios acondicionados que contenían los polipéptidos expresados se generaron mediante Ia transfección transitoria de los plásmidos de expresión respectivos para Klotho, FGF23, y la proteína de fusión de Klotho-FGF23 (R179Q). Las transfecciones se llevaron a cabo en placas de 6 pozos utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Cat. # 11668-019). Cinco horas después de la transfección, se reemplazó la mezcla de transfección con 3 ml de DMEM más FBS al 1%. Se recolectaron los medios acondicionados 72 horas después de Ia adición de 3 ml de DMEM más FBS al 1%. Las muestras de medio acondicionado de diferentes células HEK293T transitoriamente transfectadas se separaron mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), y se analizaron mediante transferencias tipo Western (Figura 3A) o se tiñeron con azul de Coomassie (Figura 3B).

La electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida se llevó a cabo sobre diferentes muestras (carril 1, Control; carril 2, FGF23; carril 3, sKlotho; carriles 4 -6, sKIotho-FGF23). La coloración con azul de Coomassie reveló la expresión de

una banda alta de >180 kDa (Figura 3B, indicada por la flecha de la derecha) que no estaba presente en los carriles 1 -3, que contenían muestras que no se habían transfectado con el vector que codifica el polipéptido de fusión Klotho. La calidad del polipéptido de fusión Klotho secretado en el medio se evaluó mediante transferencia tipo Western (Figura 3A). Se utilizó una IgG2A monoclonal de rata anti-FGF23 (R&D Systems, Cat. # MAB26291) como el anticuerpo primario para detectar los polipéptidos de fusión Klotho mediante transferencias tipo Western. La transferencia tipo Western confirmó que las bandas adicionales observadas en los geles teñidos con Coomassie eran polipéptidos de fusión Klotho. La transferencia tipo Western confirmó que los polipéptidos de fusión Klotho tenían el peso molecular esperado para el polipéptido de fusión Klotho. Este análisis muestra la expresión de la proteína de fusión Klotho-FGF23 (R179Q).

Purificación del polipéptido de fusión Klotho

Los polipéptidos de la invención se purificaron a partir del medio acondicionado a partir de un cultivo de células HEK293T transitoriamente transfectadas con un vector de expresión que codifica un polipéptido de fusión Klotho que tiene el dominio extracelular de alfa-Klotho y Ia variante R179Q de FGF23. Para generar el medio acondicionado, se transfectó un vector de expresión que codifica sKIotho-FGF23-6xHis (500 µg de ADN en 18 ml de OptiMEM 1 (GIBCO, Cat. # 11058) mezclado con 18 ml de 2 µg/ml de polietilenimina (PEI) en células HEK293 cultivadas en suspensión en el medio de expresión (464 ml de células HEK293T a razón de 106 células/ml en medio de expresión Freestype 293 (GIBCO, Cat. # 12338)). Después de la transfección, se permitió que el cultivo se desarrollara (120 horas; 37°C en una incubadora de CO2 al 5%; agitando a razón de 125 revoluciones por minuto). Al final de la incubación, se recolectó el medio acondicionado mediante centrifugación (1000 rpm durante cinco minutos). El medio acondicionado se aplicó luego a una columna de níquel-agarosa. La sKIotho-FGF23-6xHis se enlazó firmemente a la columna, y se eluyó con imidazol 50 mM. Se dializó luego el material purificado resultante en PBS para remover el imidazol. Se separó una muestra de sKlotho-FGF23-6xHis purificada mediante SDS-PAGE (carril 1, sKIotho-FGF23-6xHis purificada; carril 2, marcador de peso molecular), y se analizó mediante coloración con azul de Coomassie (Figura 3C). EI gel de SDS-PAGE teñido confirmó que la sKlotho-FGF23-6xHís purificada tenía el peso molecular esperado. La incapacidad para detectar las bandas correspondientes a proteínas diferentes a sKlothoFGF23-6xHis de longitud completa en el carril cargado con el material purificado, también mostró que se purificó la sKlotho-FGF23-6xHis.

Ejemplo 2. Ensayo in vitro que evalúa la actividad del polipéptido de fusión Klotho.

Egr-1-luciferasa

Se analizó la actividad biológica del polipéptido de fusión alfa-Klotho expresado en ensayos del reportero de Egr-1-Iuciferasa. El enlazamiento del polipéptido de fusión Klotho al receptor de FGF23 dio como resultado la activación secuencia abajo de Egr-1, y la expresión de un reportero de Iuciferasa regulado por el promotor de Egr-1. El gen reportero de Egr-1-Iuciferasa se construyó con base en aquél reportado por Urakawa y colaboradores (Nature, 2006, Volumen 444, 770 -774). Las células HEK293T sembradas en una placa de poli-D-lisina de 48 pozos, se transfectaron con el gen reportero de Egr-1-Iuciferasa junto con un gen reportero de normalización de la transfección (Iuciferasa de Renilla). Cinco horas después de la transfección del gen reportero de Egr-1-Iuciferasa, se reemplazó la mezcla de transfección con 3 ml de DMEM más FBS al 1%. Se recolectaron los medios acondicionaos 72 horas después de la adición de 3 ml de DMEM más FBS al 1%. Cinco horas más tarde, se reemplazó la mezcla de transfección con una muestra a la cual se le analizó su actividad. En los experimentos iniciales, se analizó el medio acondicionado al 50% (solo o conteniendo Klotho, FGF23, Klotho y FGF23, y Ia proteína de fusión de Klotho-FGF23 (R179Q)), y DMEM al 50% con FBA al 1% en presencia o en ausencia de 20 µg/ml de heparina (Sigma, Cat. # H8537; disuelta en DMEM como un patrón de 2 mg/ml) en los ensayos del reportero de Egr-1-Iuciferasa (Figura 4). Otros experimentos utilizaron cantidades definidas de los polipéptidos purificados (Figuras 5A y 5B). Se lisaron las células 20 horas después en regulador de lisis pasivo (Promega, Cat. # E194A), y se determinaron las actividades de la Iuciferasa utilizando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega, Cat. # E2940).

En los experimentos iniciales, se demostró la actividad del polipéptido de fusión Klotho en un medio acondicionado no fraccionado. Utilizando el gen reportero de Egr-1-Iuciferasa (Figura 4), estos experimentos cuantificaron los cambios de plegamiento en la expresión del reportero de Iuciferasa. EI medio acondicionado que contenía una combinación de FGF23 y el dominio extracelular de una proteína Klotho activó la Egr-1-Iuciferasa, pero el medio acondicionado que contenía solamente FGF23 o el medio acondicionado que contenía solamente el dominio extracelular de Klotho, no activó la Egr-1-luciferasa. El medio acondicionado que contenía Ia proteína de fusión sKIotho-FGF23 (R179Q) activó al gen reportero de Egr-1-Iuciferasa en contraste con el medio acondicionado que contenía o bien FGF23 o bien Klotho solos. En estos experimentos, el medio acondicionado que contenía la proteína de fusión sKIotho-FGF23 (R179Q) activó al gen reportero de Egr-1-Iuciferasa significativamente mejor que el medio acondicionado que contenía una combinación de FGF23 y Klotho. En presencia de heparina, mejoraron significativamente las inducciones mediante el medio acondicionado que contenía la proteína de fusión sKIotho-FGF23 (R179Q) y el medio acondicionado que contenía una combinación de FGF23 y Klotho. La Tabla 1 enlista la expresión relativa de diferentes polipéptidos de fusión de FGF-Klotho en el medio acondicionado, y la actividad

relativa del medio acondicionado no fraccionado correspondiente a los diferentes polipéptidos de fusión de FGF-Klotho en los ensayos del reportero de Egr-1-luciferasa.

Tabla 1. Expresión y actividades de las variantes de fusión de sKIotho-FGF23

Constructos de fusión sKlotho-FGF23: Expresión Actividad en el gen reportero de Egr-1-luc

1: sKlotho-FGF23 buena sí

2: IgG sp-sKlotho-FGF23 buena sí

3: sKL-D1-FGF23 buena no

4: sKL-D2-FGF23 no n.a.

5: s(KL-D1)2-FGF23 buena no

6: sKL-D1/D2-FGF23 no n.a.

7: ssKlotho(∆N-26)-FGF23 pobre no*

8: sKLD1-D2(∆692-965)-FGF23 pobre no*

9: sKL-D1-D2(∆507-798)-FGF23 pobre no*

10: FGF23-sKlotho pobre no*

* la falta de actividad puede ser el resultado de la baja expresión

También se llevaron a cabo ensayos del reportero de Egr-1-luciferasa utilizando cantidades definidas de proteínas purificadas a partir del medio acondicionado, utilizando el procedimiento de purificación como se describe en el Ejemplo 1. De una forma consistente con los resultados anteriores utilizando el medio acondicionado no fraccionado que contenía los polipéptidos expresados, el tratamiento con una combinación de FGF23 y sKlotho purificados dio como resultado la actividad del reportero de Iuciferasa, pero el tratamiento con FGF23 purificado solo no lo hizo (Figura 5A). La actividad del reportero de Iuciferasa a partir de la combinación de FGF23 y sKlotho purificados fue adicionalmente dependiente de la dosis de sKlotho purificado, y se podría mejorar el efecto mediante Ia presencia de heparina (20 µg/ml). Se podría detectar un efecto del polipéptido de fusión de sKIotho-FGF23-6xHis sobre la actividad de la Iuciferasa en concentraciones tan bajas como aproximadamente de 1,21 nM (cambio de 1,2 veces) y al menos hasta aproximadamente 19,3 nM (cambio de 2,4 veces) en los ensayos del reportero de Egr-1-luciferasa (Figura 5B). La actividad del polipéptido de fusión de sKIotho-FGF23-6xHis sobre la actividad de Iuciferasa mejoró de una manera significativa en presencia de heparina (20 µg/ml). En presencia de heparina, se pudo detectar el efecto del polipéptido de fusión de sKIotho-FGF23-6xHis sobre la actividad de Iuciferasa en una concentración tan baja como de aproximadamente 0,6 nM (cambio de 2,0 veces). El resultado mostró que sKIotho-FGF23-6xHis purificada indujo, de una forma dependiente de la dosis, al gen reportero de EGR-1-Iuc y ese tratamiento con sKIotho-FGF23-6xHis.

Ejemplo 3. Ensayo in vitro que evalúa el efecto del polipéptido de fusión Klotho sobre células musculares.

Se analizó el efecto biológico del polipéptido de fusión Klotho expresado, sobre mioblastos C2C12. EI tratamiento de mioblastos C2C12 con IGF-1, FGF2, o sKiotho-FGF23 dio como resultado el crecimiento de miotubos y Ia fosforilación de las proteínas de señalización. Se sembraron los mioblastos C2012 con una densidad de 40.000 células/pozo en placas de 6 pozos recubiertas con poli-D-lisina y fibronectina, en el medio de cultivo (3 partes de DMEM y 1 parte de F12), FBS al 10%, Glut al 1%; P/S al 1%; ácido Iinólico al 1%; ITS al 0,1%: [insulina (10 mg/ml), transferrina (5,5 mg/ml), y selenio (5 ng/ml)]. Después de que los mioblastos alcanzaron la confluencia (3 días), se cambió el medio por medio de diferenciación (DMED con suero de caballo al 2%; Glut al 1%; P/S al 1%).

Para los experimentos del diámetro de miotubos, tres días después se cambió el medio confluente por medio de diferenciación, se trataron las células con IGF-1 (10 nM), FGF2 (20 ng/ml), o sKIotho-FGF23 (20 nM) en ausencia o en presencia de dexametasona (100 µM) durante 24 horas en el medio de diferenciación. Al final del tratamiento, se fijaron las células con glutaraldehído (al 5% en PBS), y se recolectaron múltiples imágenes fluorescentes. El diámetro de los miotubos se midió utilizando el programa Pipeline Pilot para determinar la hipertrofia o la atrofia.

Para los experimentos de fosforilación de la proteína de señalización, se cambió tres días después el medio confluente por el medio de diferenciación, se mantuvo las células sin alimentación durante cuatro horas con DMEM sin FBS, y luego se trataron con IGF-1 (10 nM), FGF2 (20 ng/ml) o sKlotho-FGF23 (20 nM) en ausencia o en presencia de Rapamicina (40 nM) durante 30 minutos. Se lisaron las células en regulador RIPA en presencia de inhibidores de proteasa y fosfatasa. Se llevó a cabo el análisis de transferencia tipo Western, y se sondearon las membranas con diferentes anticuerpos, como se indica en la figura, y se revelaron sobre películas de rayos X, que se escanearon.

Los resultados de este estudio demostraron que sKlotho-FGF23 dio como resultado un aumento en el diámetro de los miotubos, en comparación con el control e indujo hipertrofia de miotubos C2C12, de una manera similar a los resultados para IGF-1 y FGF2 (Figura 6A). Además, el tratamiento con sKlotho-FGF23, IGF-1, y FGF2 pudo revertir parcialmente Ia atrofia de los miotubos inducida por dexametasona, con base en las mediciones del diámetro de los

miotubos. No se observó diferencia alguna entre sKlotho-FGF23 y FGF2 sobre Ia morfología de los miotubos (medida por el espesor de los miotubos) en ausencia o en presencia de dexametasona. Los efectos tróficos de sKlotho-FGF23, IGF-1, y FGF2 fueron estadísticamente significativos.

De una manera consistente con los efectos sobre los miotubos C2C12, la señalización de la proteína de fusión de sKlotho-FGF23 condujo a la fosforilación de p7oS6K y ERK, pero no de AKT o FoxO, en los miotubos C2C12 (Figura 6B). EI efecto de sKIotho-FGF23 sobre Ia señalización fue similar a aquél de FGF2, pero fue distinto de aquél de lGF-1. Se observó que Ia extensión de la fosforilación de ERK mediante sKIotho-FGF23 era menor que aquélla de lGF-1 o FGF2. La fosforilación de p70S6K mediante sKIotho-FGF23 fue sensible a la rapamicina. En los experimentos que involucran células C2C12, no se requirió de heparina para activar la señalización. Estos resultados muestran que un polipéptido de fusión de sKIotho-FGF23 activó la señalización en los miotubos C2612.

Listado de secuencias

<110> Novartis AG

<120> Métodos de Composiciones que utilizan polipéptidos de fusión Klotho FGF

<130> 52377-US-NP

<160> 45

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 5003

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 1012

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 3279

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 1044

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 449

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 437

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 949

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 33

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 25

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 45

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 10 ggaggtggag gttcaggagg tggaggttca ggaggtggag gttca 45

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 12 Gly Gly Gly Gly Ser 15

<210> 13

<211> 1

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 13 Gly

<210> 14

<211> 2

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 2

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 3

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 1

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 2

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 1228

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 1220

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 762

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 752

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 1215

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 1189

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 1219

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 700

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 688

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 1149

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 1125

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 2157

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 216

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 31 <210> 32

<211> 940

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 209

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 33 <210> 34

<211> 3018

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 251

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 251

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 431

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 397

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 946

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 1195

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 1195

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 42

<210> 43

<211> 227

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 43 <210> 44

<211> 982

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 44

<210> 45

<211> 974

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 45

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un polipéptido de fusión, el cual comprende: (a) un polipéptido que comprende al menos un subdominio extracelular de una proteína Klotho; y (b) un polipéptido que comprende un factor de crecimiento de fibroblastos, en donde (i) la proteína Klotho es alfa-Klotho y el factor de crecimiento de fibroblastos es el factor de crecimiento de fibroblastos 23 o la variante del factor de crecimiento de fibroblastos 23 (R179Q).
2.

El polipéptido de fusión de Ia reivindicación 1, en donde el polipéptido de (a) y el polipéptido de (b) se conectan mediante un enlazador de polipéptido.
3.

El polipéptido de fusión de Ia reivindicación 2, en donde el enlazador de polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID No: 16, SEQ ID NO: 17, y SEQ ID NO: 18.
4.

EI polipéptido de fusión de la reivindicación 2, en donde el enlazador de polipéptido comprende al menos 1 y hasta aproximadamente 30 repeticiones de una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID No: 17, y SEQ ID NO: 18.
5.

El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4, en donde el polipéptido de (a) es el dominio extracelular de la proteína alfa-Klotho.
6.

El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde el subdominio extracelular de la proteína alfa-Klotho es un dominio KL-D1 o un dominio KL-D2.
7.

EI polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en donde el polipéptido de (a) comprende al menos dos subdominios extracelulares de la proteína alfa-Klotho.
8.

El polipéptido de fusión de la reivindicación 7, en donde los dos subdominios extracelulares de Ia proteína alfa-Klotho son dos dominios KL-D1 en repeticiones en tándem, o en donde los dos subdominios extracelulares de la proteína alfa-Klotho son dos dominios KL-D2 en repeticiones en tándem.
9.

El polipéptido de fusión de Ia reivindicación 7, en donde los dos subdominios extracelulares de la proteína alfa-Klotho son un dominio KL-D1 y un dominio KL-D2.
10.

El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, el cual comprende además un péptido de señal.
11.

EI polipéptido de fusión de la reivindicación 10, en donde el péptido de señal es el péptido de señal alfa-Klotho.
12.

El polipéptido de fusión de la reivindicación 10, en donde el péptido de señal es el péptido de señal IgG.
13.

El polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, que se enlaza específicamente a un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos.
14.

EI polipéptido de fusión de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 -15, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es 95% o más, idéntica a Ia secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de Ia SEQ ID NO: 19. SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 40 y SEQ ID NO: 41.
15.

EI polipéptido de fusión de la reivindicación 1, el cual tiene la secuencia de aminoácidos de Ia SEQ ID NO: 19.
16.

El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, el cual tiene la secuencia de aminoácidos de Ia SEQ ID NO: 20.
17.

El polipéptido de fusión de la reivindicación 1, el cual tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 40.
18.

EI polipéptido de fusión de Ia reivindicación 1, el cual tiene Ia secuencia de aminoácidos de Ia SEQ ID NO: 41.
19.

El polipéptido de fusión de Ia reivindicación 1, el cual comprende una secuencia de aminoácidos que es 95% o más, idéntica a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias expuestas en Ia SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 35.
20.

Una composición farmacéutica, la cual comprende el polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -19 y un portador farmacéuticamente aceptable.
21.

Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -19.
22.

Una célula huésped que contiene el ácido nucleico de la reivindicación 21.
23.

Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 21.
24.

Un polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -19 para uso en el tratamiento o la prevención de una condición relacionada con la edad en un individuo, que comprende administrar a un individuo que requiera del mismo una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende dicho polipéptido de fusión.
25.

Un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 24 para uso en el tratamiento o la prevención de una condición relacionada con la edad en un individuo, en donde la condición relacionada con la edad se selecciona del grupo que consiste de sarcopenia, pérdida de masa muscular.
26.

El polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 -19, en donde Ia proteína Klotho es una proteína Klotho humana.
27.

La composición farmacéutica de Ia reivindicación 20, Ia cual comprende además heparina.
28.

EI polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 -25, para uso en el tratamiento o la prevención de una condición relacionada con la edad en un individuo, el cual comprende además administrar una dosis terapéuticamente efectiva de heparina.
29.

EI polipéptido de fusión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24 -25 o 28, para uso en el tratamiento o la prevención de una condición relacionada con la edad en un individuo, en donde dicho individuo es un humano.
30.

EI polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -19 y 26, para uso en medicina.
31.

EI polipéptido de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 1 -19 y 26, para uso en el tratamiento o en la prevención de atrofia muscular.
32.

Una composición farmacéutica que comprende: un polipéptido de la reivindicación 1 para uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno en un individuo.

Figura 2 Secuencia de ácido nucleico de Klotho humano (NM_004795) (SEQ ID NO: 1)

Región de codificación de la proteína: 9 -3047

Secuencia de aminoácidos de Klotho (NP_004786) (SEQ ID NO: 2)

Secuencia de ácido nucleico de beta-Klotho (NM_175737) (SEQ ID NO: 3)

Región de codificación de la proteína: 98-3232

Secuencia de aminoácidos de beta-Klotho (NP-783864) (SEQ ID NO: 4)

Secuencia de aminoácidos del dominio 1 de Klotho humano (KL-D1) (SEQ ID NO: 5)

Secuencia de aminoácidos del dominio 2 de Klotho humano (KL-D2) (SEQ ID NO: 6)

Secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de Klotho (sin péptido de señal) (SEQ ID NO: 7) Secuencia de aminoácidos del péptido señal de Klotho (SEQ ID NO: 8)

Secuencia de aminoácidos del péptido señal de IgG (SEQ ID NO: 9)

Secuencia de ácido nucleico del enlazador de polipéptido (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 10)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Gly4 Ser)3 (SEQ ID NO: 11)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Gly4 Ser) (SEQ ID NO: 12)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Gly) (SEQ ID NO: 13)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Gly Gly) (SEQ ID NO: 14)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Gly Ser) (SEQ ID NO: 15)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Gly2 Ser) (SEQ ID NO: 16) Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Ala) (SEQ ID NO: 17)

Secuencia de aminoácidos del enlazador de polipéptido (Ala Ala) (SEQ ID NO: 18)

Secuencia de aminoácidos del FGF23 (R179Q) -del dominio extracelular de Klotho -del péptido señal de Klotho (SEQ ID NO: 19)

Secuencia de aminoácidos del FGF23 (R179Q) -del dominio extracelular de Klotho -del péptido señal de IgG (SEQ ID NO: 20)

Secuencia de aminoácidos de KL-D1-FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 21)

Secuencia de aminoácidos de KL-D2-FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 22)

Secuencia de aminoácidos de (KL-D1)2-FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 23) Secuencia de aminoácidos (KL-D2)2-FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 24)

Secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de Klotho del FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 25) Secuencia de aminoácidos de KL-D1 del FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 26)

Secuencia de aminoácidos de KL-D2 del FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 27) Secuencia de aminoácidos de (KL-D1)2 del FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 28)

Secuencia de aminoácidos de (KL-D2)2 del FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 29)

Secuencia de ácido nucleico de FGF19 (NM_005117) (SEQ ID NO: 30)

Región de codificación de la proteína (464-1114)

Secuencia de aminoácidos de FGF19 (NM_005108) (SEQ ID NO: 31)

Secuencia de ácido nucleico de FGF21 (NM_019113) (SEQ ID NO: 32)

Región de codificación de la proteína 151-780

Secuencia de aminoácidos de FGF21 (NP_061986) (SEQ ID NO: 33)

Secuencia de ácido nucleico de FGF23 (NM_020638) (SEQ ID NO: 34)

Región de codificación de la proteína 147-902

Secuencia de aminoácidos de FGF23 (NP_065689) (SEQ ID NO: 35)

Secuencia de aminoácidos de FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 36)

Secuencia de aminoácidos del dominio 1 de beta-Klotho humano (b-KL-D1) (SEQ ID NO: 37)

Secuencia de aminoácidos del dominio 2 de beta-Klotho humano (b-KL-D2) (SEQ ID NO: 38)

Secuencia de aminoácidos del dominio extracelular de beta-Klotho humano (sin péptido de señal) (SEQ ID NO: 39)

Secuencia de aminoácidos del FGF23 del péptido señal sin sKlotho (sin péptido de señal) (SEQ ID NO: 40)

Secuencia de aminoácidos del FGF23 (R179Q) del péptido señal sin sKlotho (sin péptido de señal) (SEQ ID NO: 41)

Péptido señal sin FGF23 (SEQ ID NO: 42)

Péptido señal sin FGF23 (R179Q) (SEQ ID NO: 43) Péptido señal Klotho con sKlotho (SEQ ID NO: 44)

Péptido señal de IgG con sKlotho (SEQ ID NO: 45)