JP6370577B2

JP6370577B2 - 抗老化物質のスクリーニング方法

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Publication number: JP6370577B2
Application number: JP2014063045A
Authority: JP
Inventors: 井上　喜博; 喜博井上
Original assignee: Kyoto Institute of Technology NUC
Current assignee: Kyoto Institute of Technology NUC
Priority date: 2014-03-26
Filing date: 2014-03-26
Publication date: 2018-08-08
Anticipated expiration: 2034-03-26
Also published as: JP2015184230A

Description

本発明は、抗老化物質のスクリーニング方法に関する。

従来、美容又は健康を目的とした食品組成物の配合成分として、コラーゲンペプチド、ヒアルロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミンなど種々の成分が利用されている（特許文献１〜３）。

これら成分は、美容と健康に対し有用な効果を有すると認識されているが、その効果に関しては満足のいくものではなかった。

生体内で産生される活性酸素は、体内のタンパク質、脂質、遺伝子を酸化し、癌や生活習慣病などの種々の疾患、そして生体老化の原因にもなるとされている。これに対して、生体内には抗酸化物質が含まれており、活性酸素の発生を抑制したり、発生した活性酸素を除去したりする効果があり、この中には実際に老化を抑える効果を示すものも知られている。

これまでの抗酸化物質の評価は、候補物質の抗酸化能を試験管内で物理化学的に、たとえばイオンの還元反応などで測定することにより評価していた。

しかしながら、このような評価系で抗酸化能を示した物質が、生体に対し実用的な抗酸化能を示すとは限らない。培養細胞や細菌を用いた抗酸化活性の検査法が用いられているが、抗酸化候補物質の吸収、代謝などの影響を評価することはできない。

抗酸化物質のスクリーニング法としてマウスやラットなどの実験動物を用いた生体老化評価法が望ましいが、この方法では、大量の候補物質を用いる必要があり、老化の評価になると動物の寿命に対応した年単位の期間が必要になる。

特開２００４−１２３６３７号公報特開２００３−１１９１４７号公報特開２００１−０４８７８９号公報

本発明は、短期間で信頼性の高い抗老化物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。

本発明は、以下のスクリーニング方法を提供するものである。
項１．活性酸素の除去能が低下したショウジョウバエに候補物質を摂取させ、以下の(i)〜(iv)
(i)寿命
(ii)行動量、
(iii)脳内の運動神経数、
(iv)筋肉内の異常タンパク質の量
の少なくとも１つの項目について評価し、その評価結果に基づき抗老化物質を選別することを特徴とする、抗老化物質のスクリーニング方法。
項２．活性酸素の除去能が低下したショウジョウバエが、Cu/Zn-SOD変異体、Mn-SOD変異体、Trxr-1突然変異体のいずれかである、項１に記載のスクリーニング方法。
項３．評価項目が、(i)寿命と、(ii)〜(iv)の少なくとも１つの項目の組み合わせである、項１又は２に記載のスクリーニング方法。

本発明によれば、以下の効果が得られる：
１. 抗老化効果のある天然物を迅速、低コストで評価可能。
２. 抗老化効果のある化合物を迅速、低コストで評価可能。
３. 抗老化物質が効く生体内の組織（脳神経、筋肉系、消化管）の同定。
４. 活性酸素を産生させる酸化ストレス物質の探索にも利用可。

抗老化物質の迅速な探索法：アスコルビン酸の寿命延長効果。強い抗酸化物質であるビタミンＣ／アスコルビン酸５０mMを摂食させると、顕著な寿命延長効果がみとめられ、老化抑制作用があることがわかった。これはSOD評価系を用いた結果であるが、本発明者はTrx-１評価系でも同様の効果を確認した。抗老化作用を持つ天然物の迅速な探索法：各種茶飲料の寿命延長効果。SOD評価系を用いて、5種のお茶を接取させて抗老化活性を調べると、コントロールに比べて、どのお茶も寿命曲線を右にシフトさせ、特にルイボスティ茶で抗老化活性が高いことが分かった。成虫行動量の定量化による評価法。本評価方法では、老化への影響を成虫の行動量により定量化して評価した。横軸は羽化後の日齢、縦軸は行動量であり、一定距離を移動できた個体の割合を示している。下に行くほど行動量が低下していることを表す。SOD1あるいはSOD2が低下した個体では、コントロールと比べて、成虫になって比較的早い段階から行動量の低下という老化症状が認められた。脳内のドーパミン神経数の減少を指標にした評価法。行動量低下は、体の中のどの組織の老化によるものなのかを決定するため、図４ではショウジョウバエ脳内のドーパミン神経を観察した。左が正常なハエの脳、右が活性酸素が蓄積した脳である。同じ羽化して５日目の若い成虫で、右ではすでにこのクラスター内の神経細胞の数が減少し、これはパーキンソン病に似た老化症状を意味する。右はそれを集計したもので、細胞質にあるSOD1、ミトコンドリアにあるSOD2がそれぞれ低下した個体では、ともに若い時期からドーパミン神経の有意な減少が認められた。筋肉内における異常タンパクの凝集体数を指標にした評価法。筋肉の老化を定量化する方法である。図５では、成虫が飛ぶのに必要な間接飛翔筋内で異常タンパクの凝集体の数を測定した。この凝集体は抗ポリユビキチン抗体による免疫染色法にて視覚化、蛍光顕微鏡にて観察し、加齢にともなう増加を定量化した。どちらのSODを低下させても、成虫になってすぐには検出されなかった異常なタンパクが蓄積していることが明らかになった。消化管における老化促進物質の酸化毒性の評価および遺伝子損傷の評価法。図６に示すように、直接、老化促進物質のパラコート農薬（10mMPQ）の効果を評価できる。パラコートを成虫に４８時間摂食させたところ、消化管内においてCatalase遺伝子の発現誘導がより広い範囲で観察されました（B矢印）。個体全体における同遺伝子のmRNA量も増加するので（C）、それで定量的な評価ができる。また老化促進物質が遺伝子DNAに与える影響についても評価できる（D-F）。DNAの損傷があるとGadd45遺伝子が発現する。そこでこの遺伝子の下流にGFPを融合した人工遺伝子をもつ系統を用いると、X線照射量に応じてGadd45遺伝子が発現するのにともなってGFPが誘導され、細胞が光る（D）。成虫にパラコート農薬を４８時間摂食させると体内に取り込まれた同物質がショウジョウバエの消化器官に損傷を与える。この系統ではそれにより損傷を受けた細胞がコントロールに比べてより強く光っている（E、矢印）。Fは、Gadd45遺伝子の増加を定量化した結果である。

本発明で使用するショウジョウバエは、活性酸素の消去に関与する少なくとも１つの遺伝子の機能が遺伝子のアミノ酸置換およびトランスポゾン挿入突然変異、ノックダウンなどにより低下もしくは欠損し、それにより活性酸素消去能の低下したショウジョウバエである。このような遺伝子としては、Cu/Zn-SOD、Mn-SODなどのSOD(スーパーオキシドヂスムターゼ)、Trxr-1などのチオレドキシンレダクターゼ、カタラーゼなどが挙げられ、好ましくはSOD，Trxレダクターゼが挙げられる。具体的なショウジョウバエの系統としては、以下のものが挙げられる：
・sod1[n1]突然変異体
・sod2[n283]突然変異体
・UAS-sod1RNAi[F103](Cu/Zn-SODをノックダウンするのに必要な系統)
・UAS-sod1RNAi[IR4](Cu/Zn-SODをノックダウンするのに必要な系統)
・UAS-sod2RNAi[IR-15](Mn-SODをノックダウンするのに必要な系統)
・UAS-sod2RNAi[HMS00783](Mn-SODをノックダウンするのに必要な系統)
・P{Act5C-Gal4}25F01 (全身の細胞でノックダウンをおこなうのに必要な系統)
・P{w^mW.hs=GawB}elav^C155 (筋肉細胞でノックダウンをおこなうのに必要な系統)
・P{w^mC=Gal4-Mef2.R}3 (神経細胞でノックダウンをおこなうのに必要な系統)
・Trxr-1[1]突然変異体
・P{Cat-LacZ}(Catalase遺伝子の発現調節領域の下流にLacZ遺伝子を置いた改変遺伝子をもつ系統)
・P{Gadd45-GFP} (Gadd45遺伝子の発現調節領域の下流にGFP遺伝子を置いた改変遺伝子をもつ系統)

本発明のスクリーニング方法により抗老化作用が明らかにされた候補物質は、寿命を延長することができるので、医薬品、食品(健康食品、特定保健用食品、機能性食品、サプリメントなど)などとして有用である。このような候補物質としては、抗酸化作用、細胞賦活作用などを有し、老化抑制作用が期待される天然物（天然物自体、その抽出物あるいは抽出物の分画あるいは天然物から単離した物質）、医薬品または生理活性物質などが挙げられる。さらに医薬品や食品などの老化促進のような有害作用(副作用)の確認目的でも本発明のスクリーニング方法を利用可能である。

候補物質は、飼料の中に添加するのが好ましいが、常温で気体の物質はショウジョウバエの密閉されたケージ(容器)中に気体として添加しても良い。飼料は、固形でも液体でも良く、ペースト状などの半固形の状態であっても良い。

候補物質の飼料中の濃度は、例えば０．０００１〜５質量％程度が挙げられる。

ショウジョウバエが老化すると(i)寿命が短くなり、(ii)行動量が低下し、(iii)脳内の運動神経数が減少し、(iv)筋肉内に以上タンパク質が蓄積するようになる。したがって、寿命の延長、行動量及び脳内運動神経数の維持、筋肉内の異常タンパク質の蓄積がないことにより、候補物質が抗老化物質であると評価され、選別されることになる。（v）また、医薬品や食品に含まれる老化促進物質を食べたときに、消化管の細胞に対する影響を検出することができるようになる。幼虫あるいは成虫の体内に吸収された後に体内の組織、細胞、遺伝子に与える影響を評価することができる。

寿命は測定が最も容易な評価項目であるので、本発明のスクリーニング方法で評価するのが好ましい。

行動量は、一定距離を移動できたショウジョウバエ個体の割合で評価することができる。例えば一定の長さ(距離)を有する円筒などの筒状体の底にショウジョウバエを置き、筒状体の上部に到達したショウジョウバエ数をカウントすることにより、行動量を評価することができる。行動量は、ショウジョウバエの動きをCCDカメラなどで撮影し、画像解析により評価しても良い。

老化すると行動量が低下するが、行動量の低下を抑制できる候補物質は、行動力を伴った寿命の延長を実現できるので好ましい。

脳内の運動神経数は、例えば脳内のドーパミン神経細胞をTH免疫染色法にて標識、共焦点レーザー顕微鏡にて観察し、６つのドーパミン神経クラスター内の細胞数を計測することにより行う。脳内の運動神経数は加齢に伴い減少するので、これを定量化することで抗老化作用の程度を評価することができる。運動神経数を評価することで、運動能力を維持しつつ寿命を延長する抗老化物質を選別することができる。

筋肉内の異常タンパク質の蓄積は、成虫間接飛翔筋内にできた異常タンパク質凝集体を抗ポリユビキチン抗体による免疫染色法にて視覚化し、蛍光顕微鏡にて観察することで評価できる。加齢にともなう異常タンパク質の増加は、筋力の衰えと相関するので、筋肉内の異常タンパク質の蓄積を評価することで、加齢に伴う筋力の維持の程度を評価することができる。

(ii)〜(iv)により加齢時の運動能力を評価することができ、本発明のスクリーニング方法により寿命を延ばし、かつ、運動能力や運動量を向上させる物質を選別できる。

(v) 老化促進物質が細胞に作用するとカタラーゼ遺伝子の発現が上昇する。成虫消化管におけるカタラーゼ遺伝子の発現を調べることにより、体内に吸収された物質の有害性を評価することができる。さらに老化促進物質の中には、体内の増殖細胞に作用して、遺伝子DNAを酸化損傷するものがある。遺伝子損傷が起きると損傷修復酵素Gadd45の遺伝子が発現誘導されるので、それを検出することにより、老化促進物質が遺伝子DNAに与える損傷効果を評価できる。

以下、本発明を実施例に基づきより詳細に説明するが、本発明がこれら実施例に限定されないことはいうまでもない。

実施例１
アミノ酸置換により活性が低下したCu/Zn-SODをもつショウジョウバエの突然変異体（ sod[n1] ）を用い、直径２５mmプラスチックチューブに成虫を入れて飼育し、ビタミンＣ(アスコルビン酸)を1mM、10mM、25mM、50mM含む餌を摂取させて、寿命を測定した。結果を試験に用いたショウジョウバエの数（ｎ）とともに図１に示す。コントロールはビタミンＣを添加していない餌を用いた。

図１に示すように、ショウジョウバエの寿命は、アスコルビン酸濃度が50mMにおいて顕著に増加した。

この結果から、本発明のスクリーニング方法により、寿命を増加させる抗老化物質を選別できることが明らかになった。また、トランスポゾン挿入によりチオレドキシンレダクターゼ(Trx-1)の発現量が低下したショウジョウバエの突然変異体（Trxr-1[1]）を用いても同様な結果が得られることを本発明者は確認した。

実施例２
SODの活性低下したショウジョウバエの突然変異体（sod[n1]）を用い、煎茶、ルイボスティ、玉露、ほうじ茶、ジャスミン茶の抽出液1mlで標準飼料を作製し、直径２５mmプラスチックチューブに成虫２０匹を入れて飼育し、２４時間ごとの生存率を計測した。結果を試験に用いたショウジョウバエの数（ｎ）とともに図２に示す。

図２に示すように、各茶抽出物は、いずれも抽出物無添加のコントロールと比較して寿命延長効果を有しており、ルイボスティは成虫生存率を50％の日数が最も長く、最も寿命延長効果が大きいことが示された。

また、図１,２の結果ともに２週間程度の短期間で結果が得られることが明らかになった。

実施例３
標準飼料１mlを入れた直径２５mmプラスチックチューブに成虫（下記）２０匹を入れて飼育し、２４時間ごとの生存率を計測した。使用した成虫は野生型(コントロール)、SOD1ノックダウン系統の＊１（Actin-Gal4/+; UAS-sod1[F103]/+）、SOD2ノックダウン系統の＊２（Actin-Gal4/+; UAS-sod2[IR15]/+）の３種である。＊１と＊２の系統については既に報告があり、研究者ならインディアナ大学ならびにウイーン大学系統センターから入手可能である。

SOD1またはSOD2をノックダウンすることで成虫の運動量はコントロールと比較して顕著に低下し、行動量を高める物質のスクリーニングに適していることが明らかになった(図３)。

実施例４
標準飼料１mlを入れた直径２５mmプラスチックチューブに成虫２０匹を入れて飼育し、羽化後５日目の脳内のドーパミン神経細胞をTH免疫染色法にて標識し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。６つのドーパミン神経クラスター内の細胞数を計測し、加齢にともなう減少を定量化した。結果を図４に示す。使用した成虫は野生型(コントロール)、SOD1ノックダウン系統の＊１（Actin-Gal4/+; UAS-sod1[F103]/+）、SOD2ノックダウン系統の＊２（Actin-Gal4/+; UAS-sod2[IR15]/+）の３種である。

SOD2をノックダウンした成虫では羽化して５日めの若い成虫で既にクラスター内の神経細胞の数が減少しており、正常成虫の左の図との違いは明らかである。これはパーキンソン病に似た老化症状であり、本発明により、パーキンソン病に罹患する確率を低下させる物質を選別できることが明らかになった。

実施例５
標準飼料１mlを入れた直径２５mmプラスチックチューブに成虫２０匹を入れて飼育し、羽化後５日目及び３０日目の成虫間接飛翔筋内にできた異常タンパク質凝集体を抗ポリユビキチン抗体による免疫染色法にて視覚化し、蛍光顕微鏡にて観察して加齢に伴う異常タンパク質の増加を定量化した。結果を図５に示す。使用した成虫は野生型(コントロール)、SOD1ノックダウン系統の＊１（Actin-Gal4/+; UAS-sod1[F103]/+）、SOD2ノックダウン系統の＊２（Actin-Gal4/+; UAS-sod2[IR15]/+）の３種である。

異常タンパク質は、30日後においてSOD1/2のノックダウンにより蓄積することが明らかになった。

実施例６
老化促進物質を食べたときにそれが最初に吸収される消化管において、その物質の有害性を評価した。成虫消化管におけるカタラーゼ遺伝子の発現をLacZレポーターにより検出した。老化促進物質のパラコート農薬10mMを４８時間摂食させた成虫を解剖して、消化管をLacZ染色した。消化管の細胞が酸化損傷されるとカタラーゼが強く誘導され、染色領域が広がった。これを指標にその有害性を評価することができる。さらに個体全体を用いてCatalase遺伝子の発現量をリアルタイムPCR法により定量化した。この方法により評価の精度をあげることができる。また、老化促進物質のパラコート農薬10mMを４８時間摂食させた。体内の増殖細胞において遺伝子DNAが酸化損傷するとGadd45遺伝子が発現誘導される。その誘導はGFPレポーターを用いて検出できる。リアルタイムPCR法によりmRNA量を定量化すれば評価の精度をあげることができる。これらの方法で老化促進物質が体内の遺伝子に及ぼす影響を評価することができる。

本発明のスクリーニング方法は、以下の用途に応用可能である。
(i)老化抑制効果のある天然物成分あるいは化合物入りの医薬品、健康食品の開発
(ii)老化抑制効果のある天然物成分あるいは化合物の作用機構の解明（商品の付加価値の向上）
(iii)活性酸素を産生させる有害医薬品、食品添加物の生体検査

Claims

活性酸素の除去能が低下したショウジョウバエに候補物質を摂取させ、以下の(i)〜(iv)
(i)寿命
(ii)行動量、
(iii)脳内の運動神経数、
(iv)筋肉内の異常タンパク質の量
の少なくとも１つの項目について評価し、その評価結果に基づき抗老化物質を選別する工程を含み、活性酸素の除去能が低下したショウジョウバエが、Cu/Zn-SOD変異体、Mn-SOD変異体又はTrxr-1突然変異体である、抗老化物質のスクリーニング方法。
評価項目が、(i)寿命と、(ii)〜(iv)の少なくとも１つの項目の組み合わせである、請求項１に記載のスクリーニング方法。
活性酸素の除去能が低下したショウジョウバエが、Cu/Zn-SOD変異体又はMn-SOD変異体であり、評価項目が、(i)寿命である、請求項１に記載のスクリーニング方法。