WO2019151539A1 - 薬剤を筋肉に送達するための方法 - Google Patents

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高橋　健一
啓之 薗田
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Definitions

  • the present invention relates to the transport of a drug that should exhibit physiological activity in muscle to the muscle, and more specifically, a conjugate obtained by binding a desired drug to an anti-transferrin antibody, and administration of the conjugate.
  • the present invention relates to a method for exerting physiological activity of a desired drug in muscles.
  • Drugs that contain lysosomal enzymes as active ingredients used in enzyme replacement therapy include human acid ⁇ -glucosidase (hGAA) as a therapeutic agent for glycogenosis type 2 (Pompe disease), human iduronic acid-2-sulfatase ( hI2S) for mucopolysaccharidosis type 2 (Hunter's disease), human ⁇ -galactosidase A (h ⁇ -GalA) for Fabry disease, human glucocerebrosidase for Gaucher disease Therapeutic drugs are sold.
  • hGAA human acid ⁇ -glucosidase
  • hI2S human iduronic acid-2-sulfatase
  • h ⁇ -GalA mucopolysaccharidosis type 2
  • Therapeutic drugs are sold.
  • ⁇ Lysosomal enzymes administered to patients by enzyme replacement therapy are taken up into cells and exert their functions.
  • human acid ⁇ -glucosidase (hGAA) human iduronic acid-2-sulfatase (hI2S) and human ⁇ -galactosidase A (h ⁇ -GalA) are modified with N-type sugar chains containing mannose-6-phosphate (M6P) It is taken up into cells through the binding of M6P and M6P receptors.
  • M6P mannose-6-phosphate
  • human glucocerebrosidase a therapeutic agent for Gaucher's disease
  • an N-type sugar chain whose reducing end is mannose
  • cells of the reticuloendothelial system such as macrophages that are targets via mannose and mannose receptors. Is taken in.
  • the bis-phosphate type sugar chain containing two M6Ps is M6P-receptive compared to the mono-phosphate type containing one M6P. Affinity to the body is more than 100 times higher, and M6P contained in sugar chains greatly affects the efficiency of lysosomal enzyme uptake into cells.
  • the human lysosomal enzyme used for enzyme replacement therapy is a recombinant protein produced by introducing and expressing a gene encoding the human lysosomal enzyme in a host cell such as a CHO cell using genetic recombination technology.
  • Recombinant human lysosomal enzyme produced as a recombinant protein needs to be appropriately glycosylated in order to exert its medicinal effects.
  • hGAA, h ⁇ -GalA and hI2S can be modified with a sugar chain containing mannose-6-phosphate, while human glucocerebrosidase is appropriately modified with a sugar chain whose reducing end is mannose. It is indispensable for exerting medicinal effects.
  • rhGAA human acid ⁇ -glucosidase
  • the main target organ that should exert its medicinal effects is muscle, especially skeletal muscle.
  • rhGAA which is used for enzyme replacement therapy, has an average number of M6Ps in a sugar chain of 1 or less per molecule. Therefore, most of the sugar chains are mono-phosphate type. Modification is not sufficient (Non-patent Document 1). Therefore, the efficiency of rhGAA uptake in the target organ is low, and the dose per dose is as extremely high as 20 mg / kg. Depending on the patient's symptoms, the dose may be increased to 40 mg / kg, but the function of the administered enzyme is still not fully functioning.
  • ⁇ A method using a ligand-receptor system other than the M6P-M6P receptor has been developed as a method for efficiently incorporating rhGAA into a target organ.
  • a fusion protein obtained by fusing RAP (receptor-associated protein), a ligand of the low-density lipoprotein receptor family (LDL receptor), and hGAA is not dependent on M6P in experiments using cultured cells. It is known to be taken in (Non-Patent Document 2). According to this method, even rhGAA, which is not sufficiently modified with a sugar chain containing M6P, can be incorporated into cells through the binding of RAP and its receptor.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently incorporating a drug to be functioned in muscle into a muscle when it is administered in vivo, and a related technique.
  • the present inventors have made extensive studies, and as a result, should have a medicinal effect in muscle, but as it is, recombinant human acidic ⁇ - which is not transported to muscle sufficiently.
  • the present inventors have found that glucosidase can be efficiently transported to muscle by forming a conjugate with an anti-human transferrin receptor. That is, the present invention includes the following. 1. A conjugate of an anti-human transferrin receptor antibody and a drug, wherein the drug has a physiological activity that should exert its function in muscle. 2. 2.
  • the anti-human transferrin receptor antibody is a Fab antibody, F (ab ′) 2 antibody, or F (ab ′) antibody. 3.
  • the anti-human transferrin receptor antibody is a single chain antibody selected from the group consisting of scFab, scF (ab ′), scF (ab ′) 2 and scFv. 4).
  • the single chain antibody is obtained by binding the light chain and heavy chain of the anti-human transferrin receptor antibody via a linker sequence. 5). 5.
  • the conjugate according to 7 above comprising: 9. 9. The conjugate according to 8 above, wherein the linker sequence is composed of 15 amino acid residues in which the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is continuous three times.
  • the anti-human transferrin receptor antibody comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 in the variable region of the light chain and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 in the variable region of the heavy chain. 10.
  • the conjugate according to any one of 9 above. 11 The amino acid sequence of the variable region of the light chain has 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, and the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain is the amino acid represented by SEQ ID NO: 23 11.
  • the amino acid sequence of the variable region of the light chain has 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22, and the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain is the amino acid represented by SEQ ID NO: 23 11.
  • the conjugate according to 10 above, wherein the amino acid sequence of the variable region of the light chain is such that 1 to 10 amino acids constituting the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 are substituted with other amino acids. 14 11.
  • the amino acid sequence of the variable region of the light chain is the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain in which 1 to 10 amino acids constituting the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 are substituted with other amino acids 11.
  • the amino acid sequence of the variable region of the light chain is the amino acid sequence of the variable region of the heavy chain, wherein 1 to 3 amino acids constituting the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 are substituted with other amino acids 11.
  • the anti-human transferrin receptor antibody comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 in the light chain and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 in the heavy chain.
  • the amino acid sequence of the light chain has 80% or more homology with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 24, and the amino acid sequence of the heavy chain has 80% or more of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 25 20.
  • the amino acid sequence of the light chain has 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24, and the amino acid sequence of the heavy chain has 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 20.
  • the linker sequence is one glycine, one serine, an amino acid sequence (Gly Ser), an amino acid sequence (Gly Gly Ser), an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and these amino acid sequences 26.
  • the conjugate according to the above 25 which comprises an amino acid sequence selected from the group consisting of 1 to 10 consecutive amino acid sequences. 27. 29.
  • the light chain of the humanized anti-hTfR antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and the heavy chain of the humanized anti-hTfR antibody is the C-terminal side of the humanized anti-hTfR antibody via a linker sequence (Gly Ser). 30.
  • the conjugate according to 29 above which is bound to ⁇ -galactosidase A and comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 as a whole. 31. 29.
  • the conjugate according to the above 28, wherein the lysosomal enzyme is human acid ⁇ -glucosidase.
  • the light chain of the humanized anti-hTfR antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, and the heavy chain of the humanized anti-hTfR antibody is the C-terminal side of the humanized anti-hTfR antibody via a linker sequence (Gly Ser).
  • the conjugate according to 31 above which is bound to acid ⁇ -glucosidase and comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 as a whole.
  • a pharmaceutical composition for improving muscle function comprising the conjugate according to any one of 1 to 32 above.
  • 34. 29. A pharmaceutical composition for improving muscle dysfunction associated with lysosomal disease, comprising the conjugate according to 28. 35.
  • 31. A pharmaceutical composition for improving muscle dysfunction associated with Fabry disease, comprising the conjugate according to 29 or 30 above.
  • 36. 33. A pharmaceutical composition for improving muscular dysfunction associated with Pompe disease, comprising the conjugate according to 31 or 32 above. 37. 37. The pharmaceutical composition according to any one of the above 33 to 36, wherein the muscle is any one of skeletal muscle, cardiac muscle, and smooth muscle. 38.
  • a drug intended to function in muscle particularly a peptide or protein having physiological activity
  • an anti-human transferrin receptor when a drug intended to function in muscle, particularly a peptide or protein having physiological activity, is combined with an anti-human transferrin receptor, it is efficiently applied to muscle when administered in vivo. Can be delivered well. That is, by using a drug as a conjugate with a human transferrin receptor, it is possible to provide a more effective therapeutic agent for diseases associated with muscle dysfunction.
  • the figure which shows the determination result of glycogen contained in the heart (1) shows the quantification results of the wild type control group, (2) the KO control group, (3) the hGAA administration group, and (4) the hGAA-anti-hTfR antibody administration group.
  • Vertical bars indicate SD values.
  • the vertical axis represents glycogen concentration (mg / g wet tissue weight).
  • quantitative_assay result of the glycogen contained in a diaphragm. (1) to (4), the vertical bar and the vertical axis are the same as in FIG.
  • the term “muscle” refers to a tissue mainly composed of skeletal muscle, myocardium, or smooth muscle, and particularly composed of tissue or myocardium mainly composed of skeletal muscle. Refers to an organization.
  • the term “muscle tissue” is understood to be synonymous with muscle.
  • a drug that should exert its physiological activity in muscle is a drug that cannot sufficiently exert its physiological activity in muscle because it is not efficiently transported to muscle when the drug is directly administered to blood.
  • a drug may be a low molecular compound, a peptide, or a protein.
  • the peptide is capable of exerting physiological activity in muscle (bioactive peptide), but by itself, it cannot be efficiently transported to muscle when administered in vivo, and preferably 2 to 100 peptides. For example, 2 to 50, 5 to 100 amino acid residues.
  • protein is capable of exerting physiological activity in muscle (bioactive protein), but it alone cannot be efficiently transported to muscle when administered in vivo.
  • acidic ⁇ - Lysosomal enzymes such as glucosidase (GAA) and ⁇ -galactosidase A ( ⁇ -GalA) are included.
  • GAA glucosidase
  • ⁇ -GalA ⁇ -galactosidase A
  • Such peptides and proteins may have an artificial amino acid sequence, or may have an amino acid sequence encoded by an animal gene.
  • the animal species of the gene encoding the peptide or protein is not particularly limited, but is preferably a mammal, more preferably a human, monkey, rat, domestic animal (horse, pig, sheep, etc.), pet animal. (Cats, dogs, etc.), more preferably humans.
  • lysosomal enzymes that should exert their functions include ⁇ -L-iduronidase (IDUA), iduronic acid-2-sulfatase in addition to GAA and ⁇ -GalA.
  • IDUA ⁇ -L-iduronidase
  • iduronic acid-2-sulfatase in addition to GAA and ⁇ -GalA.
  • IDS glucocerebrosidase
  • GUA glucocerebrosidase
  • GUA glucocerebrosidase
  • GM2 activating protein ⁇ -hexosaminidase A, ⁇ -hexosaminidase B, N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase, ⁇ -mannosidase (LAMAN), ⁇ -mannosidase, galactosylceramidase (GALC), saposin C, allylsulfatase A (ARSA), ⁇ -L-fucosidase (FUCA1), aspartylglucosaminidase, ⁇ -N-acetylgalactosaminidase, acid sphingomyeliner (ASM), ⁇ -glucuronidase (GUSB), heparan N-sulfatase (SGSH), ⁇ -N-acetylglucosaminidase (NA
  • These enzymes can be more efficiently delivered to the muscle when administered in vivo by forming a conjugate with an anti-human transferrin receptor antibody. Therefore, these conjugates can be used as a medicament for improving muscle dysfunction associated with lysosomal disease.
  • Iduronic acid-2-sulfatase (IDS) fused with anti-hTfR antibody is a therapeutic agent for muscle dysfunction in Hunter syndrome
  • ⁇ -galactosidase A is a therapeutic agent for muscle dysfunction in Fabry disease
  • ⁇ -L-iduronidase ( IDUA) is a therapeutic agent for muscular dysfunction in Harrah's syndrome or Halar-Scheier syndrome
  • glucocerebrosidase (GBA) is a therapeutic agent for muscular dysfunction in Gaucher disease
  • ⁇ -galactosidase is a GM1-gangliosidosis type 1-3
  • GM2 activation protein is a muscular dysfunction agent in GM2-gangliosidosis AB variant
  • ⁇ -hexosaminidase A is a muscular dysfunction agent in Sandhoff disease and Tissax disease ⁇ -hex Sosaminidase B is a therapeutic agent for muscle dysfunction in Sandhoff disease
  • ⁇ -L-fucosidase (FUCA1) is fucosidosis Muscle machine in As an dysfunction agent, aspartyl glucosaminidase is a muscular dysfunction agent in aspartyl glucosamineuria, and ⁇ -N-acetylgalactosaminidase is a muscular dysfunction agent in Schindler disease and Kawasaki disease.
  • Nase is a therapeutic agent for muscle dysfunction in Niemann-Pick disease
  • GUSB ⁇ -glucuronidase
  • GUSB is a therapeutic agent for muscle dysfunction in Sly syndrome
  • heparan N-sulfatase SGSH
  • ⁇ -N-acetylglucosaminidase NAGLU
  • acetyl CoA ⁇ -glucosaminide N-acetyltransferase and N-acetylglucosamine-6-sulfate sulfatase are acid ceramidases (A) as therapeutic agents for muscle dysfunction in San Filippo syndrome.
  • amylo-1,6-glucosidase is a therapeutic agent for muscle dysfunction in coli disease (Forbes coli disease)
  • sialidase is a therapeutic agent for muscular dysfunction in sialidase deficiency
  • Palmitoyl protein thioesterase-1 (PPT-1) is a therapeutic agent for muscular dysfunction in neuronal ceroid lipofuscinosis or Santavuori-Haltia disease
  • tripeptidyl peptidase-1 TPP-1) is neuronal ceroid lipofuscin.
  • hyaluronidase-1 As a therapeutic agent for muscle dysfunction in symptom or Jansky-Bielschowsky disease, hyaluronidase-1 as a therapeutic agent for muscular dysfunction in hyaluronidase deficiency, acid ⁇ -glucosidase (GAA) as a therapeutic agent for muscular dysfunction in Pompe disease, CLN1 and 2 have Batten disease Kicking can be used as a functional disorder treatment agent of muscle.
  • the anti-hTfR antibody of the present invention reaches the brain parenchyma, the hippocampal nerve-like cells, the Purkinje cells of the cerebellum, etc. after passing through the blood-brain barrier.
  • the efficacy of the protein can be enhanced by fusing it with a protein whose efficacy should function in these tissues or cells.
  • medical use is not limited to these diseases.
  • the term “lysosomal enzyme” or a term indicating an individual lysosomal enzyme means a substance having a natural amino acid sequence, but is not limited thereto, as long as it has a lysosomal enzyme.
  • the lysosomal enzymes include those obtained by adding mutations such as substitutions, deletions and additions to the amino acid sequence of natural lysosomal enzymes.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to 3. Yes, even more preferably 1-2.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to 3. , Even more preferably 1 to 2. Mutations combining these amino acid substitutions and deletions can also be added to lysosomal enzymes.
  • an amino acid is added to a lysosomal enzyme, it is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and even more preferably in the amino acid sequence of the lysosomal enzyme or on the N-terminal side or C-terminal side.
  • Preferably 1 to 2 amino acids are added.
  • the amino acid sequence of the lysosomal enzyme to which the mutation has been added preferably has 80% or more homology with the amino acid sequence of the original lysosomal enzyme, more preferably 90% or more, more preferably 95%. The above homology is shown. The same applies to proteins and peptides other than lysosomal enzymes.
  • the lysosomal enzyme when it has lysosomal enzyme activity, it should have an activity of 3% or more with respect to the activity inherent to the natural lysosomal enzyme when combined with an anti-hTfR antibody.
  • the activity is preferably 10% or more, more preferably 20% or more, still more preferably 50% or more, 80% of the activity inherent to the natural lysosomal enzyme. It is still more preferable that it is above.
  • the lysosomal enzyme bound to the anti-hTfR antibody is mutated. The same applies to proteins and peptides other than lysosomal enzymes.
  • amino acids in the amino acid sequence of peptides or proteins include, for example, aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Gly, Ala, Leu). , Ile, Val), amide type amino acid (Gln, Asn), basic amino acid (Lys, Arg, His), acidic amino acid (Glu, Asp), amino acid having a hydroxyl group (Ser, Thr), branched amino acid (Val, Leu, Ile), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser, Thr, Met), amino acids with non-polar side chains (Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met) etc.
  • the term “homology” or “identity” means that amino acid residues homologous to all amino acid residues in an optimal alignment when two amino acid sequences are compared using a homology calculation algorithm. Percentage (%). It is well known in the technical field of the present invention and easily understood by those skilled in the art to compare two amino acid sequences with homology (or identity) expressed in such a ratio.
  • BLAST Altschul SF. J Mol. Biol. 215
  • Pearson and Lipman's similarity search method Proc. Natl.
  • lysosomal enzymes will be described in detail by taking acid ⁇ -glucosidase and ⁇ -galactosidase A as examples.
  • Acid ⁇ -glucosidase is a lysosomal enzyme having an activity of degrading glycogen.
  • Pompe disease (glycemic disease type II) is a disease in which a large amount of glycogen accumulates in the lysosomes of cells due to genetic deficiency in most or all of the acid ⁇ -glucosidase activity. Disability is central to symptoms. Pompe disease is classified into infant type, infant type, and adult type. Infant type develops mainly in the first half of infancy and shows cardiovascular symptoms due to afferent cardiac hypertrophy, muscle weakness due to skeletal muscle invasion, muscle tone decline due to glycogen accumulation in the myocardium, and is characterized by congenital myopathy symptoms To do. Infant type is mainly skeletal muscle symptom, and shows motor development delay and progressive muscle weakness from the second half of infancy. In adults, muscle weakness is the main symptom.
  • ⁇ -Galactosidase A is a lysosomal enzyme having an activity to hydrolyze terminal ⁇ -galactosyl bonds of glycolipids and glycoproteins.
  • Trihexosylceramide is one of the substrates of ⁇ -galactosidase A and undergoes hydrolysis by the enzyme at its terminal hexose part.
  • Fabry disease is a disease caused by genetic deficiency in most or all of ⁇ -GalA activity. The clinical features of Fabry disease are renal failure, keratoangioma, and cardiovascular abnormalities such as ventricular hypertrophy and mitral valve failure. In addition, an atypical type of Fabry disease, which primarily affects the heart, may be particularly distinguished as cardiac Fabry disease.
  • enzyme replacement therapy is performed in which lysosomal enzymes produced using genetic recombination technology are administered to patients as drugs.
  • lysosomal enzymes produced using genetic recombination technology are administered to patients as drugs.
  • enzyme replacement therapy using Myozyme (registered trademark) which is a recombinant human acid ⁇ -glucosidase prepared by genetic recombination technology
  • Fabrazyme or Ripregal which is a recombinant human ⁇ -galactosidase A produced by a gene recombination technique
  • One of the tissues in which the lysosomal enzyme used as a medicine in these enzyme replacement therapies should exert an effect is muscle. Therefore, there is a possibility that muscular dysfunction associated with lysosomal disease can be further improved by increasing the amount of lysosomal enzyme supplied to the muscle.
  • the term “human acid ⁇ -glucosidase” or “hGAA” particularly means hGAA having the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as that of natural hGAA, but is not limited thereto.
  • hGAA includes those obtained by adding substitutions, deletions, additions or the like to the amino acid sequence of natural hGAA.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and further preferably 1 to 3. , Even more preferably 1 to 2.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 3, Even more preferably, it is 1-2.
  • the mutation which combined substitution and deletion of these amino acids can also be added to hGAA.
  • an amino acid is added to hGAA, it is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, even more preferably in the amino acid sequence of hGAA or on the N-terminal side or C-terminal side. 1-2 amino acids are added. Mutations combining these amino acid additions, substitutions and deletions can also be added to hGAA.
  • the amino acid sequence of hGAA to which the mutation has been added preferably has 80% or more homology with the original hGAA amino acid sequence, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more. Shows homology.
  • hGAA has hGAA activity
  • it means that it has an activity of 3% or more with respect to the activity inherent in natural type hGAA when bound to anti-hTfR antibody.
  • the activity is preferably 10% or more, more preferably 20% or more, still more preferably 50% or more, 80% or more with respect to the activity inherent to natural hGAA. Even more preferably.
  • hGAA conjugated with anti-hTfR antibody is mutated.
  • the term “human ⁇ -galactosidase A” or “h ⁇ -GalA” particularly means h ⁇ -GalA having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 that is the same as that of the natural h ⁇ -GalA.
  • the present invention is not limited to this, and as long as it has h ⁇ -GalA activity, h ⁇ -GalA includes those obtained by adding substitution, deletion, addition, or the like to the amino acid sequence of natural h ⁇ -GalA.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to 3 And even more preferably 1-2.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 3. Yes, even more preferably 1-2.
  • a mutation combining these amino acid substitutions and deletions can be added to h ⁇ -GalA.
  • an amino acid is added to h ⁇ -GalA, it is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, in the amino acid sequence of h ⁇ -GalA or on the N-terminal side or C-terminal side. Even more preferably, 1-2 amino acids are added.
  • Mutations combining these amino acid additions, substitutions and deletions can also be added to h ⁇ -GalA.
  • the amino acid sequence of h ⁇ -GalA to which the mutation has been added preferably has 80% or more homology with the original amino acid sequence of h ⁇ -GalA, more preferably 90% or more, more preferably Shows 95% or more homology.
  • h ⁇ -GalA when it is combined with anti-hTfR antibody, it has an activity of 3% or more with respect to the activity inherent to natural h ⁇ -GalA. It means having. However, the activity is preferably 10% or more, more preferably 20% or more, still more preferably 50% or more, with respect to the activity inherent to natural h ⁇ -GalA. It is still more preferable that it is% or more. The same applies when h ⁇ -GalA conjugated with an anti-hTfR antibody is mutated.
  • the term “antibody” mainly includes human antibodies, mouse antibodies, humanized antibodies, chimeric antibodies of human antibodies and other mammalian antibodies, and chimeric antibodies of mouse antibodies and other mammalian antibodies. However, as long as it has the property of specifically binding to a specific antigen, it is not limited to these, and there is no particular limitation on the animal species of the antibody.
  • human antibody refers to an antibody whose entire protein is encoded by a human-derived gene.
  • An antibody encoded by a gene in which the original human gene is mutated without changing the original amino acid sequence for the purpose of increasing the expression efficiency of the gene is also included in the “human antibody”.
  • An antibody obtained by combining two or more genes encoding a human antibody and replacing a part of a human antibody with a part of another human antibody is also included in the “human antibody”.
  • a human antibody has three complementarity determining regions (CDRs) of immunoglobulin light chains and three complementarity determining regions (CDRs) of immunoglobulin heavy chains.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 Three CDRs of the immunoglobulin light chain are referred to as CDR1, CDR2, and CDR3 in order from the N-terminal side.
  • the three CDRs of the immunoglobulin heavy chain are also referred to as CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the N-terminal side.
  • An antibody obtained by replacing the CDR of one human antibody with the CDR of another human antibody to modify the antigen specificity, affinity, etc. of the human antibody is also included in the human antibody.
  • an antibody in which a mutation such as substitution, deletion, addition or the like is added to the amino acid sequence of the original antibody by modifying the gene of the original human antibody is also included in the “human antibody”.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5, and further preferably 1 to 3. It is a piece.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1-20, more preferably 1-5, and still more preferably 1-3. is there.
  • An antibody to which a mutation that combines substitution and deletion of these amino acids is added is also a human antibody.
  • an amino acid When an amino acid is added, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids are added in the amino acid sequence of the original antibody or on the N-terminal side or C-terminal side. .
  • Antibodies to which mutations that combine these amino acid additions, substitutions, and deletions are added are also human antibodies.
  • the amino acid sequence of the mutated antibody preferably shows 80% or more homology with the original antibody amino acid sequence, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more. And more preferably 98% or more homology. Therefore, in the present invention, the term “human-derived gene” includes not only the original gene derived from human but also a gene obtained by modifying the gene.
  • mouse antibody refers to an antibody whose entire protein has the same amino acid sequence as that of an antibody encoded by a mouse-derived gene. Therefore, an antibody encoded by a gene in which the original mouse gene is mutated without changing the original amino acid sequence for the purpose of increasing the gene expression efficiency is also included in the “mouse antibody”. .
  • An antibody in which two or more genes encoding mouse antibodies are combined and a part of a certain mouse antibody is replaced with a part of another mouse antibody is also included in the mouse antibody.
  • a mouse antibody has three complementarity determining regions (CDRs) of an immunoglobulin light chain and three complementarity determining regions (CDRs) of an immunoglobulin heavy chain.
  • CDR1, CDR2, and CDR3 Three CDRs of the immunoglobulin light chain are referred to as CDR1, CDR2, and CDR3 in order from the N-terminal side.
  • the three CDRs of the immunoglobulin heavy chain are also referred to as CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the N-terminal side.
  • an antibody in which the antigen specificity or affinity of a mouse antibody is modified by replacing the CDR of a certain mouse antibody with the CDR of another mouse antibody is also included in the mouse antibody.
  • an antibody in which a mutation such as substitution, deletion or addition is added to the amino acid sequence of the original antibody by modifying the gene of the original mouse antibody is also included in the “mouse antibody”.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to 3. It is a piece.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1-20, more preferably 1-5, and still more preferably 1-3. is there.
  • An antibody to which a mutation in which substitution and deletion of these amino acids are combined is added is also a mouse antibody.
  • an amino acid preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 amino acids are added in the amino acid sequence of the original antibody or on the N-terminal side or C-terminal side. .
  • An antibody to which a mutation in which addition, substitution and deletion of these amino acids are combined is added is also a mouse antibody.
  • the amino acid sequence of the mutated antibody preferably has 80% or more homology with the original antibody amino acid sequence, more preferably 90% or more, and even more preferably 95% or more homology. More preferably 98% or more homology. Therefore, the term “mouse-derived gene” in the present invention includes not only the original gene derived from the mouse but also a gene obtained by modifying the gene.
  • the term “humanized antibody” means that the amino acid sequence of a part of the variable region (for example, especially all or part of the CDR) is derived from a mammal other than human and the other region is derived from human. It refers to an antibody.
  • a humanized antibody the three complementarity determining regions (CDRs) of immunoglobulin light chains constituting human antibodies and the three complementarity determining regions (CDRs) of immunoglobulin heavy chains are compared with those of other mammals.
  • the antibody produced by replacing by CDR is mentioned.
  • mice, rats, rabbits, horses, or Non-human primates Preferably, however, mice, rats, rabbits, horses, or Non-human primates, more preferably mice and rats, such as mice.
  • chimeric antibody refers to an antibody obtained by linking two or more different antibody fragments derived from two or more different species.
  • a chimeric antibody composed of a human antibody and another mammalian antibody is an antibody in which a part of a human antibody is replaced with a part of a non-human mammal antibody.
  • An antibody consists of an Fc region, Fab region, and hinge region.
  • Specific examples of such chimeric antibodies include chimeric antibodies in which the Fc region is derived from a human antibody while the Fab region is derived from an antibody of another mammal.
  • the hinge region is derived from either a human antibody or another mammalian antibody.
  • chimeric antibodies in which the Fc region is derived from another mammal while the Fab region is derived from a human antibody can be mentioned. Again, the hinge portion may be derived from either a human antibody or another mammalian antibody.
  • an antibody consists of a variable region and a constant region.
  • the heavy chain constant region (C H ) and the light chain constant region (C L ) are derived from a human antibody, while the heavy chain variable region (V H ) and the light chain constant region Variable regions (V L ) are derived from other mammalian antibodies, conversely, heavy chain constant regions (C H ) and light chain constant regions (C L ) are derived from other mammalian antibodies.
  • the variable region of the heavy chain (V H ) and the variable region of the light chain (V L ) are derived from human antibodies are also included.
  • the species of other mammals are not particularly limited as long as they are mammals other than humans, but are preferably mice, rats, rabbits, horses, or non-human primates, more preferably mice. It is.
  • a chimeric antibody comprising a mouse antibody and another mammalian antibody is an antibody in which a part of a mouse antibody is replaced with a part of a mammal antibody other than a mouse.
  • Specific examples of such chimeric antibodies include chimeric antibodies in which the Fc region is derived from a mouse antibody while the Fab region is derived from an antibody of another mammal, and conversely, the Fc region is derived from another mammal.
  • chimeric antibodies in which the Fab region is derived from a mouse antibody are not particularly limited as long as they are mammals other than mice, but are preferably primates other than rats, rabbits, horses, and humans.
  • the chimeric antibody of human antibody and mouse antibody is particularly called “human / mouse chimeric antibody”.
  • human / mouse chimeric antibodies the Fc region is derived from a human antibody while the Fab region is derived from a mouse antibody, and conversely, the Fc region is derived from a mouse antibody while the Fab region is derived from a human antibody.
  • the hinge part is derived from either a human antibody or a mouse antibody.
  • the heavy chain constant region (C H ) and the light chain constant region (C L ) are derived from a human antibody, while the heavy chain variable region (V H ) and The light chain variable region (V L ) is derived from a mouse antibody, conversely, the heavy chain constant region (C H ) and the light chain constant region (C L ) are derived from a mouse antibody, while the heavy chain In which the variable region (V H ) and the light chain variable region (V L ) are derived from human antibodies.
  • an antibody inherently has a basic structure consisting of a total of four polypeptide chains, two immunoglobulin light chains and two immunoglobulin heavy chains.
  • the term “antibody” refers to those having this basic structure, (1) One consisting of a total of two polypeptide chains, one immunoglobulin light chain and one immunoglobulin heavy chain, (2) a single-chain antibody obtained by binding a linker sequence to the C-terminal side of an immunoglobulin light chain and further binding an immunoglobulin heavy chain to the C-terminal side, and (3) C of the immunoglobulin heavy chain Also included is a single chain antibody comprising a linker sequence at the terminal side and an immunoglobulin light chain at the C-terminal side.
  • Fab refers to one light chain including a variable region and a CL region (light chain constant region), and one light chain including a variable region and a C H 1 region (part 1 of the heavy chain constant region).
  • a heavy chain is a molecule in which cysteine residues present in each chain are linked by a disulfide bond.
  • the heavy chain may further include a part of the hinge part in addition to the variable region and the C H 1 region (part 1 of the constant region of the heavy chain).
  • the hinge part is connected to the hinge part. It lacks a cysteine residue that exists and binds the heavy chains of antibodies.
  • a light chain and a heavy chain are a cysteine residue present in the constant region of the light chain ( CL region) and a cysteine residue present in the constant region of the heavy chain (C H 1 region) or the hinge region. Are linked by a disulfide bond formed between them.
  • Fab is composed of one light chain and one heavy chain because it lacks a cysteine residue that exists at the hinge and binds antibody heavy chains.
  • Light chain constituting the Fab includes a variable region and a C L region.
  • the heavy chain constituting the Fab may be composed of a variable region and a C H 1 region, and may include a part of the hinge portion in addition to the variable region and the C H 1 region.
  • the hinge part is selected so as not to contain a cysteine residue that bonds between the heavy chains so that a disulfide bond is not formed between the two heavy chains in the hinge part.
  • the heavy chain includes all or part of the hinge part including a cysteine residue that binds heavy chains in addition to the variable region and the C H 1 region.
  • F (ab ′) 2 refers to a molecule in which two F (ab ′) s are linked by a disulfide bond between cysteine residues present at each hinge region.
  • a polymer such as a dimer or trimer formed by binding a plurality of antibodies directly or via a linker is also an antibody.
  • the present invention is not limited to these, and any antibody that includes a part of an immunoglobulin molecule and has a property of specifically binding to an antigen is included in the “antibody” in the present invention.
  • the term “immunoglobulin light chain” includes those derived from the immunoglobulin light chain and having all or part of the amino acid sequence of the variable region.
  • the term “immunoglobulin heavy chain” includes those derived from immunoglobulin heavy chains and having all or part of the amino acid sequence of the variable regions. Therefore, as long as it has all or part of the amino acid sequence of the variable region, for example, a deletion of the Fc region is also an immunoglobulin heavy chain.
  • Fc or Fc region refers to a fragment consisting of C H 2 region (heavy chain constant region part 2) and C H 3 region (heavy chain constant region part 3) in an antibody molecule. This is the area that contains it.
  • a light chain and a heavy chain constituting Fab, F (ab ′) or F (ab ′) 2 shown in (4) above are combined via a linker sequence to form single-chain antibodies, respectively.
  • scFab, scF (ab ′), and scF (ab ′) 2 are also included.
  • the linker sequence is linked to the C-terminal side of the light chain, and the heavy chain is further bound to the C-terminal side.
  • a linker sequence may be bound to the C-terminal side of the heavy chain, and a light chain may be further bound to the C-terminal side.
  • scFvs obtained by combining a light chain variable region and a heavy chain variable region via a linker sequence to form a single chain antibody are also included in the antibody of the present invention.
  • a linker sequence may be bound to the C-terminal side of the light chain variable region, and a heavy chain variable region may be further linked to the C-terminal side.
  • a linker sequence may be bound to the terminal side, and a light chain variable region may be bound to the C-terminal side.
  • single-chain antibody refers to a linker sequence bound to the C-terminal side of an amino acid sequence containing all or part of the variable region of an immunoglobulin light chain, and further to the immunoglobulin heavy chain on the C-terminal side.
  • a linker sequence is bonded to the C-terminal side of an amino acid sequence containing all or part of the variable region of an immunoglobulin heavy chain, and further, an amino acid containing all or part of the variable region of an immunoglobulin light chain on the C-terminal side.
  • a protein having a sequence bound thereto and capable of specifically binding to a specific antigen is also a “single chain antibody” in the present invention.
  • the immunoglobulin heavy chain usually lacks the Fc region.
  • variable region of an immunoglobulin light chain has three complementarity determining regions (CDRs) that are involved in the antigen specificity of the antibody.
  • variable region of an immunoglobulin heavy chain has three CDRs. These CDRs are the main areas that determine the antigen specificity of an antibody.
  • the single chain antibody preferably includes all three CDRs of the immunoglobulin heavy chain and all three CDRs of the immunoglobulin light chain. However, as long as the antigen-specific affinity of the antibody is maintained, it may be a single chain antibody from which one or more CDRs are deleted.
  • the number of linker sequences arranged between the light chain and heavy chain of an immunoglobulin is preferably 2 to 50, more preferably 8 to 50, still more preferably 10 to 30, even more preferably.
  • Such a linker sequence is not limited in its amino acid sequence as long as the anti-hTfR antibody in which both chains are linked thereby retains affinity for hTfR, but is preferably composed of glycine alone or glycine and serine.
  • amino acid sequence Gly-Ser amino acid sequence Gly-Ser, amino acid sequence Gly-Gly-Ser, amino acid sequence Gly-Gly-Gly, amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 3), amino acid sequence Gly- Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 4), or a sequence in which these amino acid sequences are repeated 2 to 10 times, or 2 to 5 times.
  • variable region of an immunoglobulin light chain is bound to the C-terminal side of the amino acid sequence consisting of the entire variable region of the immunoglobulin heavy chain via a linker sequence
  • amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser A linker sequence consisting of a total of 15 amino acids corresponding to a sequence of 3 of (SEQ ID NO: 3) is preferred.
  • the term “human transferrin receptor” or “hTfR” refers to a membrane protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.
  • the anti-hTfR antibody of the present invention is against the portion from the 89th cysteine residue from the N-terminal side to the C-terminal phenylalanine (extracellular region of hTfR) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the present invention is not limited to this.
  • the term “monkey transferrin receptor” or “monkey TfR” is a membrane protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 derived from cynomolgus monkey (MacacaMacfascicularis).
  • the portion from the 89th cysteine residue to the C-terminal phenylalanine (extracellular region of monkey TfR) from the N-terminal side in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is not limited to this.
  • a recombinant human transferrin receptor (rhTfR) is produced using a cell into which an expression vector incorporating the hTfR gene has been introduced, and an animal such as a mouse is immunized using this rhTfR.
  • the method of obtaining is common.
  • Hybridoma cells having antibody-producing ability can be prepared by taking out antibody-producing cells against hTfR from the immunized animal and fusing them with myeloma cells.
  • cells that produce antibodies against hTfR can also be obtained by immunizing immune system cells obtained from animals such as mice with rhTfR by in vitro immunization.
  • the animal species from which the immune system cells are derived is not particularly limited, but preferably primates including mice, rats, rabbits, guinea pigs, dogs, cats, horses, and humans, and more Preferred are mouse, rat and human, and more preferred are mouse and human.
  • mouse immune system cells for example, spleen cells prepared from mouse spleen can be used.
  • human immune system cells cells prepared from human peripheral blood, bone marrow, spleen and the like can be used. When human immune system cells are immunized by in vitro immunization, human antibodies against hTfR can be obtained.
  • Hybridoma cells having the ability to produce antibodies can be prepared by immunizing immune system cells by in vitro immunization and then fusing the cells with myeloma cells.
  • mRNA is extracted from cells after immunization to synthesize cDNA, and a DNA fragment containing the genes encoding immunoglobulin light and heavy chains is amplified by PCR reaction using this cDNA as a template.
  • antibody genes can be reconstructed.
  • the hybridoma cells obtained by the above method include cells that produce antibodies that recognize proteins other than hTfR as antigens. Further, not all of the hybridoma cells that produce anti-hTfR antibodies produce anti-hTfR antibodies that exhibit a desired affinity for hTfR.
  • artificially reconstructed antibody genes include genes encoding antibodies that recognize proteins other than hTfR as antigens. Further, not all genes encoding anti-hTfR antibodies may have desired characteristics such as encoding anti-hTfR antibodies exhibiting a desired affinity for hTfR.
  • an artificially reconstructed antibody gene requires a step of selecting a gene encoding an antibody having desired characteristics (such as high affinity for hTfR) from the antibody gene.
  • the recombinant hTfR is added to the plate and retained, then the culture supernatant of the hybridoma cell is added, and then A method is used in which antibodies that are not bound to the recombinant hTfR are removed from the plate and the amount of antibody retained on the plate is measured. According to this method, the higher the affinity of the antibody contained in the culture supernatant of hybridoma cells added to the plate for hTfR, the greater the amount of antibody retained on the plate.
  • a cell line that measures the amount of antibody retained on the plate and produces a hybridoma cell corresponding to the plate on which more antibody is retained produces an anti-hTfR antibody having a relatively high affinity for hTfR.
  • a DNA fragment containing a gene encoding an anti-hTfR antibody is amplified using the PCR method, A gene encoding a high affinity antibody can also be isolated.
  • the artificially reconstructed antibody gene is once incorporated into an expression vector, Introduce into host cells.
  • the cell used as the host cell may be any prokaryotic cell or eukaryotic cell as long as the antibody gene can be expressed by introducing an expression vector incorporating the artificially reconstructed antibody gene.
  • cells derived from mammals such as humans, mice and Chinese hamsters are preferred, and CHO cells derived from Chinese hamster ovary or NS / 0 cells derived from mouse myeloma are particularly preferred.
  • an expression vector used for expression by incorporating a gene encoding an antibody gene can be used without particular limitation as long as the gene can be expressed when introduced into a mammalian cell.
  • the gene incorporated in the expression vector is arranged downstream of a DNA sequence (gene expression control site) that can regulate the frequency of gene transcription in mammalian cells.
  • a DNA sequence gene expression control site
  • Examples of gene expression control sites that can be used in the present invention include a cytomegalovirus-derived promoter, SV40 early promoter, human elongation factor-1 alpha (EF-1 ⁇ ) promoter, human ubiquitin C promoter, and the like.
  • Mammalian cells introduced with such an expression vector express an antibody encoded by the above artificially reconstructed gene incorporated in the expression vector.
  • recombinant hTfR is added to the plate.
  • the cell culture supernatant is contacted with the recombinant hTfR, then the antibody not bound to the recombinant hTfR is removed from the plate, and the amount of the antibody retained on the plate is measured. Used. According to this method, the higher the affinity of the antibody contained in the cell culture supernatant for hTfR, the greater the amount of antibody retained on the plate.
  • the amount of antibody retained on the plate is measured, and the cell corresponding to the plate retaining more antibody is defined as a cell line producing an anti-hTfR antibody having a relatively high affinity for hTfR.
  • a gene encoding an anti-hTfR antibody having high affinity for hTfR can be selected.
  • a gene encoding a high affinity antibody can be isolated from the cell line thus selected by amplifying a DNA fragment containing the gene encoding the anti-hTfR antibody using the PCR method.
  • Selection of a gene encoding an anti-hTfR antibody having high affinity from the above artificially reconstructed antibody gene is carried out by incorporating the artificially reconstructed antibody gene into an expression vector and introducing this expression vector into Escherichia coli. Then, using the culture supernatant obtained by culturing this E. coli or the solution containing the antibody obtained by dissolving E. coli, the E. coli having the desired gene is obtained in the same manner as in the case of selecting the above hybridoma cells. It can also be done by selecting.
  • the selected E. coli strain expresses a gene encoding an anti-hTfR antibody having a relatively high affinity for hTfR. From this E.
  • a gene encoding an anti-hTfR antibody having a relatively high affinity for hTfR can be isolated.
  • the antibody gene may be incorporated into the expression vector so that the secretory signal sequence is bound to the N-terminal side.
  • a method of contacting with the phage, then removing the phage not bound to the recombinant hTfR from the plate, and measuring the amount of the phage retained on the plate is used.
  • the higher the affinity of the antibody retained on the phage particle for hTfR the greater the amount of phage retained on the plate.
  • the amount of phage retained on the plate is measured, and phage particles corresponding to the plate retaining more phage are produced as phage particles that produce an anti-hTfR antibody having a relatively high affinity for hTfR.
  • a gene encoding an anti-hTfR antibody having high affinity for hTfR can be selected.
  • a gene encoding a high affinity antibody can be isolated from the phage particles thus selected by amplifying a DNA fragment containing the gene encoding the anti-hTfR antibody using the PCR method.
  • CDNA or phage DNA is prepared from a cell such as a hybridoma cell producing an antibody having a high affinity for the anti-hTfR antibody or a phage particle having an antibody having a high affinity for the anti-hTfR antibody, Using this as a template, a DNA fragment containing a gene encoding a light chain of an anti-hTfR antibody, a heavy chain of an anti-hTfR antibody, or a single-chain antibody of an anti-hTfR antibody, all or a part thereof, is obtained by PCR or the like. Can be amplified and isolated.
  • a DNA fragment containing a gene encoding all or part of the variable region of the light chain of the anti-hTfR antibody, or a DNA containing a gene encoding all or part of the variable region of the heavy chain of the anti-hTfR antibody Fragments can also be isolated by amplification by PCR or the like.
  • All or part of the gene encoding the light chain and heavy chain of the anti-hTfR antibody having high affinity is incorporated into an expression vector, and a host cell such as a mammalian cell is transformed using this expression vector. By culturing the obtained transformed cells, anti-hTfR antibodies having high affinity can be produced.
  • the amino acid sequence of the anti-hTfR antibody can be translated from the base sequence of the isolated gene encoding the anti-hTfR antibody, and a DNA fragment encoding this amino acid sequence can be synthesized artificially. When a DNA fragment is artificially synthesized, the expression level of an anti-hTfR antibody in a host cell can be increased by selecting an appropriate codon.
  • the gene encoding the anti-hTfR antibody after the mutation has been added is preferably 80% or more of homology with the original gene, more preferably 90% or more of homology.
  • the homology is not particularly limited as long as the affinity for hTfR is not lost.
  • the gene after the mutation is preferably at least 80% homologous to the original gene.
  • the homology is not particularly limited as long as the affinity for hTfR is not lost.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to Three, and even more preferably 1-2.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to 3.
  • the mutation which combined substitution and deletion of these amino acids can also be added.
  • an amino acid is added to the variable region of the light chain, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 in the amino acid sequence of the light chain variable region or on the N-terminal side or C-terminal side. Up to 3, more preferably 1 to 2 amino acids are added. Mutations combining these amino acid additions, substitutions and deletions can also be added.
  • the amino acid sequence of the variable region of the light chain to which the mutation has been added preferably has 80% or more homology with the amino acid sequence of the original light chain variable region, more preferably 90% or more. More preferably, the homology is 95% or more.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and further preferably 1 to 2 It is.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1 to 2.
  • the mutation which combined substitution and deletion of these amino acids can also be added.
  • an amino acid is added, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 amino acids are added in the amino acid sequence or on the N-terminal side or C-terminal side. Mutations combining these amino acid additions, substitutions and deletions can also be added.
  • Each amino acid sequence of each CDR to which mutation has been added preferably has 80% or more homology with the original amino acid sequence of each CDR, more preferably 90% or more, and still more preferably, Shows 95% or more homology.
  • the gene after the mutation is preferably at least 80% homologous to the original gene.
  • the homology is not particularly limited as long as the affinity for hTfR is not lost.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to Three, and even more preferably 1-2.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and still more preferably 1 to 3.
  • the mutation which combined substitution and deletion of these amino acids can also be added.
  • amino acids are added to the variable region of the heavy chain, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 in the amino acid sequence of the heavy chain variable region or on the N-terminal side or C-terminal side. Up to 3, more preferably 1 to 2 amino acids are added. Mutations combining these amino acid additions, substitutions and deletions can also be added.
  • the amino acid sequence of the mutated heavy chain variable region preferably has 80% or more homology with the original heavy chain variable region amino acid sequence, more preferably 90% or more homology, More preferably, the homology is 95% or more.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and further preferably 1 to 2 It is.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and still more preferably 1 to 2.
  • the mutation which combined substitution and deletion of these amino acids can also be added.
  • an amino acid is added, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2 amino acids are added in the amino acid sequence or on the N-terminal side or C-terminal side. Mutations combining these amino acid additions, substitutions and deletions can also be added.
  • Each amino acid sequence of each CDR to which mutation has been added preferably has 80% or more homology with the original amino acid sequence of each CDR, more preferably 90% or more, and still more preferably, Shows 95% or more homology.
  • substitution of amino acids in the light chain and heavy chain amino acid sequences of the anti-hTfR antibody with other amino acids include aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Gly, Ala, Leu, Ile, Val), amide type amino acids (Gln, Asn), basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids having a hydroxyl group (Ser, Thr), branched amino acids (Val, Leu) , Ile), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser, Thr, Met), amino acids with non-polar side chains (Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met), etc. Substitution of amino acids.
  • the anti-hTfR antibody when a mutation was added to the anti-hTfR antibody and an amino acid was added to the C-terminus or N-terminus, the anti-hTfR antibody was bound to a drug (including a physiologically active protein) that should function in muscle via the amino acid.
  • the amino acid shall form part of an anti-hTfR antibody in the conjugate.
  • the anti-hTfR antibody obtained by expressing can be modified into an antibody having desired characteristics by introducing mutations such as substitution, deletion, addition and the like into its amino acid sequence.
  • the introduction of a mutation into the amino acid sequence of the anti-hTfR antibody is performed by adding a mutation to the gene corresponding to the amino acid sequence.
  • An anti-hTfR antibody can appropriately adjust the affinity of the antibody for hTfR by adding mutations such as substitution, deletion, and addition to the amino acid sequence of the variable region of the antibody. For example, when the affinity between an antibody and an antigen is high and the dissociation constant in an aqueous solution is extremely low, the antibody does not dissociate from the antigen when administered in vivo, resulting in functional inconvenience. It can happen. In such a case, by introducing a mutation into the variable region of the antibody, the dissociation constant is adjusted stepwise to 2-5 times, 5-10 times, 10-100 times, etc. of the original antibody. The best matching antibody can be obtained. Conversely, by introducing the mutation, the dissociation constant is adjusted stepwise to 1/2 to 1/5 times, 1/5 to 1/10 times, 1/10 to 1/100 times, etc. of the original antibody. You can also.
  • the introduction of mutations such as substitutions, deletions and additions into the amino acid sequence of the anti-hTfR antibody can be carried out by, for example, using a gene encoding the anti-hTfR antibody as a template to a specific site in the base sequence of the gene by a method such as PCR. It can be carried out by introducing mutations or introducing mutations randomly.
  • the introduction of a mutation into the amino acid sequence of the anti-hTfR antibody is performed by, for example, incorporating a gene encoding the anti-hTfR antibody, which is a single chain antibody, into the phagemid.
  • a phage with a single chain antibody expressed on the capsid surface was prepared, and the phage was propagated by introducing a mutation into the gene encoding the single chain antibody by allowing a mutagen or the like to act.
  • a phage expressing a single-chain antibody having a desired dissociation constant can be selected from the phage by the above-described method or purified by using an antigen column under certain conditions.
  • the antibody having a relatively high affinity for hTfR obtained by the above method for selecting cells producing a high affinity antibody is an antibody of a non-human animal, it should be a humanized antibody.
  • a humanized antibody replaces an appropriate region of a human antibody with the amino acid sequence of a part of the variable region of an antibody of a non-human animal (for example, all or part of a CDR, in particular) while maintaining specificity for an antigen. (Transplanted).
  • the three complementarity determining regions (CDRs) of immunoglobulin light chains constituting human antibodies and the three complementarity determining regions (CDRs) of immunoglobulin heavy chains are compared with those of other mammals. Examples include antibodies replaced with CDRs.
  • the biological species from which the CDR incorporated into the human antibody is derived is not particularly limited as long as it is a mammal other than human, but is preferably a mouse, rat, rabbit, horse, primate other than human, more preferably a mouse. And a rat, more preferably a mouse.
  • the CDR of the antibody of the non-human mammal but also the amino acid sequence of the region outside the CDR involved in the CDR structure maintenance or antigen binding, the corresponding part of the accepting human antibody is replaced.
  • the area outside the CDR is also called a framework area (FR).
  • humanized antibodies are prepared by transplanting the CDRs of non-human mammal antibodies (and possibly peripheral FRs) instead of the CDRs (and optionally peripheral FRs) of the variable regions of human antibodies. including.
  • CDR the region of a non-human mammal antibody that is transplanted into the variable region of the original human antibody generally contains the CDR itself or the CDR and its surrounding FR.
  • CDR the FR transplanted together with the CDR is also involved in CDR structure maintenance or antigen binding, and is considered to have a function of substantially determining complementarity of the antibody.
  • CDR The term "" refers to a region that is or can be transplanted from a non-human mammal antibody to a humanized antibody when producing a humanized antibody. That is, even in the region generally designated as FR, it is considered to have a function of determining the complementarity of the antibody because it is involved in CDR structure maintenance or antigen binding. As long as it is, it is included in the CDR in the present invention.
  • Human antibody light chains include ⁇ chains and ⁇ chains.
  • the light chain constituting the anti-hTfR antibody may be either a ⁇ chain or a ⁇ chain.
  • Human heavy chains include ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, and ⁇ chain, which correspond to IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE, respectively.
  • the heavy chain constituting the anti-hTfR antibody may be any of ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain and ⁇ chain, but is preferably a ⁇ chain.
  • the ⁇ chain of human heavy chain includes ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3 and ⁇ 4 chains, which correspond to IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, respectively.
  • the heavy chain constituting the anti-hTfR antibody is a ⁇ chain
  • the ⁇ chain may be any of ⁇ 1 chain, ⁇ 2 chain, ⁇ 3 chain and ⁇ 4 chain, but is preferably ⁇ 1 chain or ⁇ 4 chain .
  • the light chain of the human antibody may be either ⁇ chain or ⁇ chain
  • the heavy chain of the human antibody is ⁇ 1 chain, ⁇ 2
  • the chain may be any of a chain, ⁇ 3 chain and ⁇ 4 chain, but is preferably a ⁇ 1 chain or a ⁇ 4 chain.
  • one preferred embodiment of the anti-hTfR antibody is one in which the light chain is a ⁇ chain and the heavy chain is a ⁇ 4 chain, and the light chain is a ⁇ chain and the heavy chain is a ⁇ 1 chain.
  • a drug (including a bioactive protein) to be bound to an anti-hTfR antibody to be a conjugate is a drug that should function in muscle.
  • a method of binding an anti-hTfR antibody and such a drug there is a method of binding via a non-peptide linker or a peptide linker.
  • Non-peptide linkers include polyethylene glycol, polypropylene glycol, copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, polyoxyethylated polyols, polyvinyl alcohol, polysaccharides, dextrans, polyvinyl ethers, biodegradable polymers, lipid polymers, Chitins and hyaluronic acid, derivatives thereof, or combinations thereof can be used.
  • a peptide linker is a peptide chain composed of 1 to 50 amino acids linked by peptide or a derivative thereof, and the N-terminus and C-terminus thereof form a covalent bond with either an anti-hTfR antibody or a drug, respectively. , Anti-hTfR antibody and drug are combined.
  • a combination of the anti-hTfR antibody of the present invention and a drug using PEG as a non-peptide linker is particularly referred to as an anti-hTfR antibody-PEG-drug.
  • An anti-hTfR antibody-PEG-drug can be produced by combining an anti-hTfR antibody and PEG to produce an anti-hTfR antibody-PEG, and then combining the anti-hTfR antibody-PEG and the drug.
  • the anti-hTfR antibody-PEG-drug can also be produced by combining a drug and PEG to produce a drug-PEG, and then combining the drug-PEG and the anti-hTfR antibody.
  • PEG modified with functional groups such as carbonate, carbonylimidazole, carboxylic acid active ester, azlactone, cyclic imidothione, isocyanate, isothiocyanate, imidate, or aldehyde is used for conjugation with anti-hTfR antibodies and drugs. It is done.
  • the functional group introduced into these PEGs reacts mainly with the anti-hTfR antibody and the amino group in the drug molecule, whereby the PEG and the hTfR antibody and the drug are covalently bonded.
  • PEG having an average molecular weight of about 300, about 500, about 1000, about 2000, about 4000, about 10,000, about 20000, etc. can be suitably used as a non-peptide linker.
  • an anti-hTfR antibody-PEG comprises an anti-hTfR antibody and polyethylene glycol having an aldehyde group as a functional group (ALD-PEG-ALD), and the molar ratio of ALD-PEG-ALD to the antibody is 11, 12.5, It is obtained by mixing the mixture so as to be 15, 110, 120, etc., and adding a reducing agent such as NaCNBH 3 to the reaction.
  • the anti-hTfR antibody-PEG-drug is obtained by reacting the anti-hTfR antibody-PEG with the drug in the presence of a reducing agent such as NaCNBH 3 .
  • anti-hTfR antibody-PEG-drug can also be obtained by first combining drug and ALD-PEG-ALD to produce drug-PEG and then linking drug-PEG and anti-hTfR antibody. it can.
  • the anti-hTfR antibody and the target protein are linked to the C-terminal side or N-terminal side of the heavy chain or light chain of the anti-hTfR antibody via a linker sequence.
  • the N-terminus or C-terminus of the target protein can be directly bound by a peptide bond, respectively.
  • the fusion protein obtained by binding the anti-hTfR antibody and the target protein encodes a linker sequence directly or on the 3 ′ end side or 5 ′ end side of the cDNA encoding the heavy chain or light chain of the anti-hTfR antibody.
  • the expression vector for mammalian cells incorporating the cDNA fragment encoding the light chain of the anti-hTfR antibody is the same.
  • an expression vector for mammalian cells incorporating a cDNA fragment encoding the heavy chain of an anti-hTfR antibody is also provided. It is introduced into the same host cell.
  • the anti-hTfR antibody is a single chain antibody
  • the fusion protein obtained by binding the anti-hTfR antibody and the target protein is directly or on the 5 ′ end side or 3 ′ end side of the cDNA encoding the target protein, or a linker sequence.
  • a DNA fragment ligated with a cDNA encoding a single-stranded anti-hTfR antibody with an intervening DNA sequence inserted into an expression vector for eukaryotic cells such as mammalian cells, yeast, or prokaryotic cells such as E. coli
  • an expression vector for eukaryotic cells such as mammalian cells, yeast, or prokaryotic cells such as E. coli
  • a fusion protein should be understood as a form of conjugate.
  • a fusion protein of the type in which a target protein is bound to the C-terminal side of the light chain of an anti-hTfR antibody is an anti-human transferrin receptor antibody comprising an amino acid sequence containing all or part of the light chain variable region and a heavy chain
  • the target protein is bound to the C-terminal side of the light chain of this anti-human transferrin receptor antibody.
  • the light chain of the anti-hTfR antibody and the target protein may be bound directly or via a linker.
  • the fusion protein of the type in which the target protein is bound to the C-terminal side of the heavy chain of the anti-hTfR antibody is an anti-human transferrin receptor antibody comprising an amino acid sequence containing all or part of the light chain variable region and a heavy chain And an amino acid sequence containing all or part of the variable region, and the target protein is bound to the C-terminal side of the heavy chain of the anti-human transferrin receptor antibody.
  • the heavy chain of the anti-hTfR antibody and the target protein may be bound directly or via a linker.
  • the type of fusion protein in which the target protein is bound to the N-terminal side of the light chain of the anti-hTfR antibody is that the anti-human transferrin receptor antibody has an amino acid sequence containing all or part of the variable region of the light chain and a heavy chain And the amino acid sequence including all or part of the variable region, and the target protein is bound to the N-terminal side of the light chain of the anti-human transferrin receptor antibody.
  • the light chain of the anti-hTfR antibody and the target protein may be bound directly or via a linker.
  • a fusion protein of the type in which a target protein is bound to the N-terminal side of the heavy chain of an anti-hTfR antibody is an anti-human transferrin receptor antibody comprising an amino acid sequence containing all or part of the light chain variable region and a heavy chain It includes an amino acid sequence including all or part of the variable region, and the target protein is bound to the N-terminal side of the heavy chain of the anti-human transferrin receptor antibody.
  • the heavy chain of the anti-hTfR antibody and the target protein may be bound directly or via a linker.
  • the linker sequence arranged between the anti-hTfR antibody and the target protein is preferably 1 to 50, more preferably 1 to 17, more preferably 1 to 10, and still more preferably 1 to 5
  • the number of amino acids constituting the linker sequence is 1, 2, 3, 1-17, 1-10. The number can be adjusted as appropriate, such as 10 to 40, 20 to 34, 23 to 31 and 25 to 29.
  • Such a linker sequence allows the anti-hTfR antibody linked thereby to retain affinity with hTfR, and the target protein linked by the linker sequence can exert the physiological activity of the protein under physiological conditions.
  • the amino acid sequence is preferably composed of glycine and serine.
  • the amino acid sequence is composed of any one amino acid of glycine or serine, amino acid sequence Gly-Ser, amino acid sequence Gly -Gly-Ser, amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 3), amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 4), or amino acid sequences 1 to 10 Or a sequence of 1 to 50 amino acids consisting of 2 to 5 consecutive, 2 to 17, 2 to 10 10 to 40, 20-34 amino, 23-31 amino, or has a sequence such as consisting of 25-29 amino acids.
  • those having the amino acid sequence Gly-Ser can be suitably used as the linker sequence.
  • the anti-hTfR antibody is a humanized antibody or a human antibody
  • the anti-hTfR antibody and the target protein are linked to the N-terminus (or C-terminus) of the heavy or light chain of the anti-hTfR antibody via a linker sequence or directly.
  • the C-terminus (or N-terminus) of the target protein can be bound by a peptide bond.
  • the N-terminal (or C-terminal) of the ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain, ⁇ chain or ⁇ chain of the anti-hTfR antibody is linked by a peptide bond via a linker sequence or directly.
  • the target protein is bound to the N-terminal side (or C-terminal side) of the light chain of the anti-hTfR antibody, it is directly or directly via the linker sequence at the N-terminal (or C-terminal) of the ⁇ chain or ⁇ chain of the anti-hTfR antibody.
  • the C-terminus (or N-terminus) of the target protein is bound by a peptide bond.
  • the anti-hTfR antibody consists of a Fab region or a Fab region and all or part of the hinge part (Fab, F (ab ′) 2 and F (ab ′)
  • the target protein is The N-terminus (or C-terminus) of the heavy chain or light chain constituting Fab, F (ab ′) 2 and F (ab ′) is linked to the C-terminus (or N-terminus) via a linker sequence or directly.
  • Each can be bound by a peptide bond.
  • the amino acid sequence including all or part of the variable region of the immunoglobulin light chain and the variable region of the immunoglobulin heavy chain is generally bonded via a linker sequence.
  • the linker sequence is bonded to the C-terminal side of the light chain-derived amino acid sequence, and the heavy chain-derived amino acid sequence is further bonded to the C-terminal side.
  • a linker sequence may be bound to the C-terminal side of the heavy chain-derived amino acid sequence, and a light chain-derived amino acid sequence may be further bound to the C-terminal side.
  • a single chain antibody is scFv.
  • the linker sequence disposed between the light chain and the heavy chain of the immunoglobulin is preferably 2 to 50, more preferably 8 to 50, still more preferably 10 to 30, and even more preferably 12 to 18.
  • a peptide chain composed of 15 to 25, for example, 15 or 25 amino acids is as long as the anti-hTfR antibody having both chains linked thereby retains affinity with hTfR and the target protein bound to the antibody can exert its physiological activity under physiological conditions.
  • the amino acid sequence is not limited, but is preferably composed of glycine alone or glycine and serine.
  • amino acid sequence Gly-Ser the amino acid sequence Gly-Gly-Ser, the amino acid sequence Gly-Gly-Gly, the amino acid sequence Gly-Gly-Gly, Amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 3), amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 4), or 2 to 10 of these amino acid sequences, or 2 to It has an array consisting of 5 consecutive.
  • a preferred embodiment of the linker sequence includes a sequence consisting of 15 amino acids consisting of 3 consecutive amino acid sequences Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 3).
  • such a fusion protein is obtained by, for example, transforming a host cell such as a mammalian cell with an expression vector incorporating a DNA fragment having a base sequence encoding the fusion protein, It can be produced by culturing the host cell.
  • each linker sequence is named in order from the N-terminal side, such as a first linker sequence and a second linker sequence.
  • the target protein to be fused with the anti-hTfR antibody is not particularly limited as long as the protein should function in muscle.
  • a preferable target protein is, for example, a lysosomal enzyme encoded by a causative gene of lysosomal disease that causes dysfunction in muscle.
  • Such lysosomal enzymes include human acid ⁇ -glucosidase (hGAA) and human ⁇ -galactosidase A, but are not limited thereto, ⁇ -L-iduronidase (IDUA), iduronic acid-2-sulfatase (IDS), Glucocerebrosidase (GBA), ⁇ -galactosidase, GM2 activating protein, ⁇ -hexosaminidase A, ⁇ -hexosaminidase B, N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase, ⁇ -mannosidase (LAMAN), ⁇ -mannosidase, galactosylceramidase (GALC), saposin C, allylsulfatase A (ARSA), ⁇ -L-fucosidase (FUCA1), aspartylglucosaminidase, ⁇ -N-acetylgalactosaminidas
  • fusion protein of an anti-hTfR antibody and a lysosomal enzyme will be described in detail using acid ⁇ -glucosidase and ⁇ -galactosidase A as examples.
  • a fusion protein of an anti-hTfR antibody and human acid ⁇ -glucosidase (hGAA) is administered to a patient with Pompe disease, it is taken into the patient's muscle cells and transported to the lysosome. Thus, glycogen accumulated in lysosomes of myocytes from patients with Pompe disease is degraded.
  • hGAA human acid ⁇ -glucosidase
  • muscles composed mainly of skeletal muscle cells and muscles composed mainly of cardiomyocytes are targeted.
  • this fusion protein degrades skeletal muscle cells and glycogen accumulated in cardiomyocytes.
  • Various symptoms such as muscle weakness and muscle tone decrease due to muscle invasion can be improved. That is, the fusion protein of anti-hTfR antibody and human acid ⁇ -glucosidase can be used as a therapeutic agent for skeletal muscle dysfunction or / and heart disorder in Pompe disease.
  • a preferred specific example of the fusion protein of anti-hTfR antibody and human acid ⁇ -glucosidase is a fusion protein of human acid ⁇ -glucosidase and anti-hTfR antibody, wherein the light chain of the humanized anti-hTfR antibody is the amino acid of SEQ ID NO: 24
  • the heavy chain of the humanized anti-hTfR antibody is linked to human acid ⁇ -glucosidase via the linker sequence Gly-Ser on the C-terminal side, and is represented by SEQ ID NO: 27 as a whole.
  • a fusion protein of human acid ⁇ -glucosidase and an anti-hTfR antibody wherein the light chain of the anti-hTfR antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 and the heavy chain of the anti-hTfR antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25
  • a fusion protein of an anti-hTfR antibody and human ⁇ -galactosidase A (h ⁇ -GalA) is administered to a Fabry disease patient, it is taken into the patient's muscle cells and transported to the lysosome.
  • the trihexosylceramide accumulated in the lysosomes of myocytes from Fabry patients is degraded.
  • muscles consisting mainly of cardiomyocytes are targeted.
  • Fabry's disease has cardiovascular abnormalities
  • the administration of this fusion protein improves the symptoms of cardiovascular abnormalities such as ventricular hypertrophy because trihexosylceramide accumulated in cardiomyocytes is degraded. can do.
  • This fusion protein is particularly effective for cardiac Fabry disease, which is an atypical type of Fabry disease that primarily damages the heart. That is, the fusion protein of anti-hTfR antibody and human ⁇ -galactosidase A can be used as a therapeutic agent for heart disorders in Fabry disease, particularly cardiac Fabry disease.
  • a preferred specific example of a fusion protein of anti-hTfR antibody and human ⁇ -galactosidase A is a fusion protein of human ⁇ -galactosidase A and anti-hTfR antibody, wherein the light chain of the humanized anti-hTfR antibody is the amino acid of SEQ ID NO: 24
  • the heavy chain of the humanized anti-hTfR antibody is linked to human ⁇ -galactosidase A via the linker sequence Gly-Ser on the C-terminal side, and is represented by SEQ ID NO: 29 as a whole.
  • a fusion protein having the amino acid sequence described above.
  • a fusion protein of human ⁇ -galactosidase A and an anti-hTfR antibody comprising a light chain of an anti-hTfR antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 and a heavy chain of an anti-hTfR antibody having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25
  • the conjugate obtained by binding the anti-hTfR antibody of the present invention and a drug can be used as a pharmaceutical composition to be administered into blood to exert a medicinal effect in muscle.
  • a drug is generally administered to a patient by intravenous injection such as intravenous drip injection, subcutaneous injection, or intramuscular injection, but the administration route is not particularly limited.
  • the conjugate obtained by binding the anti-hTfR antibody of the present invention and a drug can be supplied to a medical institution as a pharmaceutical composition in the form of a lyophilized product or an aqueous liquid.
  • a pharmaceutical composition previously dissolved in a solution containing a stabilizer, a buffer, and an isotonic agent can be supplied as a preparation sealed in a vial or syringe.
  • a preparation enclosed in a syringe is generally called a prefilled syringe preparation.
  • the concentration of the conjugate contained in the aqueous liquid should be appropriately adjusted depending on the dosage, but is, for example, 1 to 4 mg / mL.
  • the stabilizer contained in the aqueous liquid is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, but a nonionic surfactant can be preferably used.
  • a nonionic surfactant polysorbate, poloxamer, etc. can be used alone or in combination.
  • Polysorbate 20 and polysorbate 80 are particularly suitable as the polysorbate, and poloxamer 188 (polyoxyethylene (160) polyoxypropylene (30) glycol) is particularly suitable as the poloxamer.
  • the concentration of the nonionic surfactant contained in the aqueous liquid is preferably 0.01 to 1 mg / mL, more preferably 0.01 to 0.5 mg / mL, More preferably, it is ⁇ 0.5 mg / mL.
  • amino acids such as histidine, arginine, methionine, glycine can also be used.
  • the concentration of the amino acid contained in the aqueous liquid is preferably 0.1 to 40 mg / mL, more preferably 0.2 to 5 mg / mL, 0.5 More preferably, it is ⁇ 4 mg / mL.
  • the buffer contained in the aqueous liquid is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, but a phosphate buffer is preferable, and a sodium phosphate buffer is particularly preferable.
  • a phosphate buffer is preferable, and a sodium phosphate buffer is particularly preferable.
  • concentration of sodium phosphate is preferably 0.01 to 0.04M.
  • the pH of the aqueous liquid preparation adjusted with a buffering agent is preferably 5.5 to 7.2.
  • the isotonic agent contained in the aqueous liquid is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable, but sodium chloride and mannitol can be used preferably alone or in combination as an isotonic agent.
  • hTfR Construction of hTfR expression vector Using human spleen Quick Clone cDNA (Clontech) as a template, primer hTfR5 '(SEQ ID NO: 7) and primer hTfR3' (SEQ ID NO: 8), human transferrin reception by PCR A gene fragment encoding the body (hTfR) was amplified. The amplified gene fragment encoding hTfR was digested with MluI and NotI and inserted between MluI and NotI of the pCI-neo vector (Promega). The obtained vector was named pCI-neo (hTfR).
  • Example 2 Preparation of recombinant hTfR After introduction of pE-mIRES-GS-puro (hTfR) into CHO-K1 cells by electroporation, CD OptiCHO containing methionine sulfoximine (MSX) and puromycin Cells were selectively cultured using TM medium (Invitrogen) to obtain recombinant hTfR-expressing cells. The recombinant hTfR-expressing cells were cultured to prepare recombinant hTfR.
  • MSX methionine sulfoximine
  • TM medium Invitrogen
  • Example 3 Immunization of mice using recombinant hTfR Mice were immunized using the recombinant hTfR prepared in Example 2 as an antigen. Immunization was performed by intravenously or intraperitoneally administering an antigen to mice.
  • Example 4 Preparation of hybridoma About one week after the last administration of the antigen, the spleen of the mouse was removed and homogenized to isolate the spleen cells. The obtained spleen cells were fused with a mouse myeloma cell line (P3.X63.Ag8.653) using the polyethylene glycol method. After cell fusion, the cells were suspended in RPMI1640 medium containing (1 X) HAT supplement (Life Technologies) and 10% Ultra low IgG fetal calf serum (Life Technologies). 200 ⁇ L / well was dispensed on each plate.
  • RPMI1640 medium containing (1 X) HAT supplement (Life Technologies) and 10% Ultra low IgG fetal calf serum (Life Technologies). 200 ⁇ L / well was dispensed on each plate.
  • each well was observed under a microscope, and a well containing a single colony was selected.
  • the culture supernatant was collected and used as the hybridoma culture supernatant for the following screening.
  • Example 5 Screening of high-affinity antibody-producing cell line Recombinant hTfR solution (Sino Biologics) was diluted with 50 mM sodium carbonate buffer (pH 9.5 to 9.6) to adjust the concentration to 5 ⁇ g / mL. This was used as a solid phase solution. After adding 50 ⁇ L of the solid phase solution to each well of a Nunc MaxiSorp TM flat-bottom 96 well plate (base material: polystyrene, Nunc), the plate is allowed to stand at room temperature for 1 hour, and the recombinant hTfR is placed on the plate. Adsorbed and fixed.
  • mice anti-hTfR antibody was conjugated to recombinant hTfR.
  • a culture supernatant of a hybridoma that did not produce a mouse anti-hTfR antibody was added to a well with 50 ⁇ L added thereto.
  • a cell line that produces antibodies (high affinity anti-hTfR antibodies) having high affinity for hTfR from 14 types of hybridoma cells corresponding to the culture supernatant added to wells showing high measured values.
  • Antibody-producing cell line were numbered clone 1 to clone 14.
  • Anti-hTfR antibodies produced by clone 1 to clone 14 were designated anti-hTfR antibody number 1 to anti-hTfR antibody number 14, respectively.
  • Example 6 Analysis of amino acid sequence of variable region of high affinity anti-hTfR antibody Clone strain 3 was further selected from clone 1 to clone 14 selected in Example 5. Clone strain 3 cDNA was prepared, and the genes encoding the light and heavy chains of the antibody were amplified using this cDNA as a template. The base sequence of the amplified gene was translated, and the amino acid sequences of the variable regions of the light and heavy chains of anti-hTfR antibody No. 3 produced by this cell line were determined.
  • Anti-hTfR antibody No. 3 contained the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the light chain variable region and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 in the variable region of the heavy chain.
  • the variable region of the light chain comprises an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 or 12 in CDR1, SEQ ID NO: 13 or 14 in CDR2, and SEQ ID NO: 15 in CDR3.
  • the variable region of the heavy chain is It comprised the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 or 17 in CDR1, SEQ ID NO: 18 or 19 in CDR2, and SEQ ID NO: 20 or 21 in CDR3.
  • CDRs are not limited to the above amino acid sequences, and regions containing these amino acid sequences and amino acid sequences consisting of three or more consecutive amino acids containing a part of these amino acid sequences are considered to be CDRs. It was.
  • Example 7 Measurement of affinity of anti-hTfR antibody to human TfR and monkey TfR Biolayer interferometry (BLI) was used to measure the affinity of anti-hTfR antibody to human TfR and monkey TfR. This was performed using OctetRED96 (ForteBio, a division of Pall Corporation), a biomolecular interaction analysis system. Briefly explain the basic principle of biolayer interferometry. When light of a specific wavelength is projected onto the biomolecule layer (layer) fixed on the sensor chip surface, the light is reflected from the two surfaces of the biomolecule layer and the internal reference layer, and the interference wave of the light is reflected. Arise.
  • human TfR the amino acid in the extracellular region of hTfR from the 89th cysteine residue to the C-terminal phenylalanine from the N-terminal side in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with a histidine tag added to the N-terminal Recombinant human TfR having the sequence (r human TfR: Sino Biological) was used.
  • monkey TfR the extracellular region of cynomolgus monkey TfR from the 89th cysteine residue to the C-terminal phenylalanine from the N-terminal side in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with a histidine tag added to the N-terminal Recombinant monkey TfR having the amino acid sequence (r monkey TfR: Sino Biological) was used.
  • Three clones selected in Example 6 were prepared from (1X) HAT supplement (Life Technologies) and 10% Ultra low IgG fetal calf serum (Life Technologies) so that the cell concentration was about 2 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • 1X HAT supplement
  • 10% Ultra low IgG fetal calf serum Life Technologies
  • the cell concentration was about 2 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • a 1 L Erlenmeyer flask add 200 mL of the cell suspension, and in a humid environment consisting of 5% CO 2 and 95% air at 37 ° C with a stirring speed of about 70 rpm. Cultured for ⁇ 7 days. The culture supernatant was collected by centrifugation and filtered through a 0.22 ⁇ m filter (Millipore) to obtain a culture supernatant.
  • Protein G column (column volume: 1 mL, GE Healthcare) equilibrated with 20 mM Tris buffer (pH 8.0) in 3 volumes of 150 mM NaCl in advance. Loaded. Next, after washing the column with 5 column volumes of the same buffer, the adsorbed antibody was eluted with 4 column volumes of 50 mM glycine buffer (pH 2.8) containing 150 mM NaCl. Fractions were collected. 1 M Tris buffer (pH 8.0) was added to the eluted fraction to adjust to pH 7.0. This was used as a purified product of anti-hTfR antibody No. 3 in the following experiments.
  • Each of the purified anti-hTfR antibody No. 3 was diluted in two steps with HBS-P + (10 mM HEPES containing 150 ⁇ mM NaCl, 50 ⁇ m EDTA and 0.05% Surfactant P20), and 0.78125-50 ⁇ m (0.117-7.5 ⁇ g / mL) Seven levels of antibody solutions were prepared. This antibody solution was used as a sample solution.
  • r human TfR and r monkey TfR were each diluted with HBS-P + to prepare 25 ⁇ g / mL solutions, which were used as rhuman TfR-ECD (Histag) solution and r monkey TfR-ECD (Histag) solution, respectively. .
  • the sample solution prepared by the above two-stage dilution was added to a 96-well plate, black (greiner bio-one) at 200 ⁇ L / well. Further, the above-prepared r human TfR-ECD (Histag) solution and r monkey TfR-ECD (Histag) solution were added to predetermined wells at 200 ⁇ L / well respectively. 200 ⁇ L / well of HBS-P + was added to the baseline, dissociation and wash wells. 200 ⁇ L / well of 10 mM Glycine-HCl (pH 1.7) was added to each well for regeneration. To the wells for activation, 0.5 mM NiCl 2 solution was added at 200 ⁇ L / well. This plate and a biosensor (Biosensor / Ni-NTA: ForteBio, a division of Pall Corporation) were installed at a predetermined position of OctetRED96.
  • the dissociation constant (K D ) of anti-hTfR antibody No. 3 with human TfR was 1 ⁇ 10 ⁇ 12 M or less
  • the dissociation constant (K D ) with monkey TfR was 1 ⁇ 10 ⁇ 12 M or less.
  • Example 8 Preparation of humanized anti-hTfR antibody An attempt was made to humanize the amino acid sequences contained in the variable regions of the light and heavy chains of anti-hTfR antibody No. 3. Then, a humanized light chain variable region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 22 and a humanized heavy chain variable region having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 23 were obtained. Further, for the light chain, the light chain having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 in the variable region was obtained. As for the heavy chain, a heavy chain having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 23 in the variable region was obtained.
  • the heavy chain of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 is of the IgG4 type.
  • the dissociation constant (K D ) of the humanized anti-hTfR antibody thus obtained with human TfR was measured by the method described in Example 7. As a result, the dissociation constant (K D ) of humanized anti-hTfR antibody with human TfR was 1 ⁇ 10 ⁇ 12 M or less, and the dissociation constant (K D ) with monkey TfR was about 1 ⁇ 10 ⁇ 9 M.
  • Example 9 Construction of gene encoding fusion protein of anti-TfR antibody and hGAA
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 26) encoding a light chain of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 24 was synthesized. This DNA fragment has, on the 5 ′ side, an MluI sequence and a sequence encoding a leader peptide that functions as a secretion signal, in order from the 5 ′ end, and a NotI sequence on the 3 ′ side.
  • the human acid ⁇ -glucosidase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was bound to the C-terminal side of the heavy chain of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 via a linker sequence comprising Gly-Ser as a whole.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 28) encoding a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 was synthesized. This DNA fragment has an MluI sequence and a sequence encoding a leader peptide functioning as a secretion signal in order from the 5 'end on the 5' side, and a NotI sequence on the 3 'side.
  • Example 10 Construction of fusion protein expression vector of anti-TfR antibody and hGAA
  • the pEF / myc / nuc vector (Invitrogen) was digested with KpnI and NcoI, and the region containing the EF-1 ⁇ promoter and its first intron was excised and blunt-ended with T4 DNA polymerase.
  • pCI-neo (Invitrogen) was digested with BglII and EcoRI to excise the region containing the CMV enhancer / promoter and intron, and then blunt-ended with T4 DNA polymerase. A region containing the above EF-1 ⁇ promoter and its first intron was inserted into this to construct a pE-neo vector.
  • the pE-neo vector was digested with SfiI and BstXI, and the approximately 1 kbp region containing the neomycin resistance gene was excised.
  • the hygromycin gene was amplified by PCR reaction using pcDNA3.1 / Hygro (+) (Invitrogen) as a template and using the primer Hyg-Sfi5 ′ (SEQ ID NO: 30) and the primer Hyg-BstX3 ′ (SEQ ID NO: 31). .
  • the amplified hygromycin gene was digested with SfiI and BstXI and inserted into the pE-neo vector excised from the above neomycin resistance gene to construct a pE-hygr vector.
  • the pE-hygr vector and pE-neo vector were digested with MluI and NotI, respectively.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 26) encoding the light chain of the anti-hTfR antibody synthesized in Example 9 and a DNA fragment (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 26) encoding a protein obtained by binding the heavy chain of the anti-hTfR antibody and human acid ⁇ -glucosidase. 28) was digested with MluI and NotI and inserted between MluI-NotI of pE-hygr vector and pE-neo vector, respectively.
  • the obtained vectors were respectively pE-hygr (LC), a light chain expression vector for humanized anti-hTfR antibody, pE-, a protein expression vector obtained by binding heavy chain of anti-hTfR antibody and human acid ⁇ -glucosidase. neo (HC-hGAA).
  • Example 11 Preparation of cells for expression of hGAA-humanized anti-hTfR antibody fusion protein
  • CHO cells (CHO-K1: obtained from American Type Culture Collection) were obtained by the following method using GenePulser (Bio-Rad), pE-hygr (LC) and pE-neo (HC) constructed in Example 10. -hGAA).
  • Cell transformation was generally performed by the following method. 5 ⁇ 10 5 CHO-K1 cells were seeded in a 3.5 cm culture dish supplemented with CD OptiCHO TM medium (Life Technologies) and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the medium was replaced with Opti-MEM TM I medium (Life Technologies), and the cells were suspended to a density of 5 ⁇ 10 6 cells / mL. 100 ⁇ L of cell suspension was collected, and 5 ⁇ L each of pE-hygr (LC1) and pE-neo (HC1) plasmid DNA solutions diluted to 100 ⁇ g / mL with Opti-MEM TM I medium was added thereto. Electroporation was performed using GenePulser (Bio-Rad), and the plasmid was introduced into the cells. The cells were cultured overnight at 37 ° C. under 5% CO 2 and then selectively cultured in CD OptiCHO TM medium supplemented with 0.5 mg / mL hygromycin and 0.8 mg / mL G418.
  • LC1 pE-hygr
  • HC1 pE-neo
  • the ELISA method at this time was generally carried out by the following method.
  • PBS Starting Block
  • culture supernatant or human IgG standard diluted with PBS-BT (PBS supplemented with 0.5% BSA and 0.05% Tween 20) was added to each well. 100 ⁇ L each was added to the plate and the plate was allowed to stand at room temperature for at least 1 hour. After washing the plate 3 times with PBS-T, 100 ⁇ L of HRP-labeled anti-human IgG polyclonal antibody solution diluted with PBS-BT was added to each well, and the plate was allowed to stand at room temperature for at least 1 hour.
  • Example 12 Production of hGAA-anti-hTfR antibody An hGAA-anti-hTfR antibody was produced by the following method.
  • the hGAA-anti-hTfR antibody high-expressing strain obtained in Example 11 is diluted with CD OptiCHO TM medium so that the cell concentration is about 2 ⁇ 10 5 cells / mL, and 200 mL of cells are added to a 1 L Erlenmeyer flask.
  • the suspension was added and cultured at 37 ° C. in a humid environment consisting of 5% CO 2 and 95% air for 6-7 days with a stirring speed of about 70 rpm.
  • the culture supernatant was collected by centrifugation and filtered through a 0.22 ⁇ m filter (Millipore) to obtain a culture supernatant.
  • To the collected culture supernatant add 20 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 150 mL NaCl in 5 column volumes and add 20 mM Tris buffer in 150 mM NaCl (3 column volumes) (pH 8.0).
  • a Protein A column (column volume: 1 mL, Bio-Rad) that had been equilibrated in advance with pH 8.0 was loaded.
  • the column was washed by supplying 5 times the volume of the same buffer, and then adsorbed with 4 times the volume of 50 mM glycine buffer (pH 2.8) containing 150 mM NaCl.
  • the hTfR antibody was eluted.
  • the pH of the eluate containing this hGAA-anti-hTfR antibody was adjusted to pH 7.0 by adding 1 M Tris buffer (pH 8.0), and then buffer exchanged to PBS using an Amicon Ultra 30 kDa membrane (Millipore). This was used as a purified product of hGAA-anti-hTfR antibody.
  • Example 13 Measurement of uptake of hGAA into cells using human skeletal muscle Human skeletal muscle cells (PromoCell) were measured at 8.0 X with Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use) (PromoCell). 10 Dilute to 4 cells / mL and inoculate 250 ⁇ L of each well into a 96-well plate coated with Cellnest TM (Fujifilm). After culturing at 37 ° C and 5% CO 2 for 3 days, the medium is replaced with Skeletal Muscle Cell Differentiation Medium (Ready-to-use) (PromoCell). Then, every two days, the medium is changed with a differentiation-inducing medium, and differentiation is induced for 6 days.
  • hGAA-anti-hTfR antibody 100 ⁇ L of hGAA-anti-hTfR antibody and serial dilution of hGAA (0.005 to 20.0 ⁇ g / mL) prepared in the differentiation induction medium to each well as test substances. Incubate at 37 °C, 5% CO 2 for another 20 hours.
  • a cell extract is prepared in the same manner from cells in wells to which no test substance is added, and this is used as a pool extract.
  • a standard curve sample is prepared by serially diluting hGAA-anti-hTfR antibody and commercially available medical hGAA with pooled extract.
  • the test substance can be quantified by the following ELISA method.
  • Rabbit anti-hGAA polyclonal antibody obtained by immunizing rabbits with hGAA was diluted to 5 ⁇ g / mL with 20 mmol / L sodium carbonate buffer (pH 9.0), and 100 ⁇ L each was added to each well of a 96-well plate (Maxisorp TM ). And shake on a plate shaker at room temperature for 1 hour. Remove the antibody solution, add 300 ⁇ L of blocking buffer (PBS containing 1% BSA) to each well, and let stand at room temperature for 1 hour. Then wash each well 3 times with 300 ⁇ L PBS-T. Next, add 100 ⁇ L each of the calibration curve sample and each cell extract to each well and shake for 1 hour at room temperature on a plate shaker.
  • PBS containing 1% BSA blocking buffer
  • TMB Microwell Peroxidase Substrate (2-Component System, KPL) equivalent mixture of TMB Peroxidase Substrate and TMB Peroxidase Substrate Solution B to each well for color reaction at room temperature. After sufficient color development is obtained, add 100 ⁇ L of 1 mol / L phosphoric acid to each well to stop the reaction. The absorbance at a wavelength of 450 nm is measured with a microplate reader, a calibration curve is created using SoftMax Pro (Molecular Device), and the measured value of each test substance is interpolated in this to determine the concentration of each test substance. calculate. Divide the test substance concentration in each cell extract by the protein concentration to obtain the amount of the test substance in the cell (ng / mg protein).
  • Example 14 Preparation of CD71-KI / GAA-KO mice CD71-KI / GAA-KO mice in which the acid ⁇ -glucosidase gene (GAA gene) was knocked out and the human transferrin receptor gene (CD71 gene) was knocked in , Produced by general genetic engineering techniques.
  • the preparation method is as follows.
  • a targeting vector (GAA knockout vector) capable of knocking out the mouse GAA gene was constructed by inserting a stop codon and a neomycin resistance gene into the BamHI site present in exon 6 of the mouse GAA gene.
  • This targeting vector includes the base sequence represented by SEQ ID NO: 32.
  • the targeting vector was linearized and then introduced into C57BL / 6 strain ES cells by electroporation.
  • ES clones After the introduction, selective culture using neomycin drug resistance as an index was performed to obtain drug-resistant ES clones.
  • the obtained drug-resistant ES clones were screened by genomic PCR and Southern blot, and clones in which specific homologous recombination was established (homologous recombination ES clones) were selected.
  • Chimera embryos were prepared by aggregation using homologous recombinant ES clones and ICR line 8-cell embryos. A chimeric mouse was born by transplanting a chimeric embryo into a recipient mouse.
  • CD71-KI / GAA-KO mice were produced by mating CD71-KI heterozygous mice and GAA-KO homozygous mice and screening the resulting mice.
  • CD71-KI hetero mice were prepared according to the method described in Sonoda H., et al. MolecularrapTherapies 26. 1366-74 (2016).
  • Example 15 Measurement of the amount of hGAA incorporated into cells using mice
  • the purified product of hGAA-anti-hTfR antibody produced in Example 12 and commercially available medical hGAA were each 4 mg using physiological saline. / mL solution.
  • hGAA-anti-hTfR antibody and hGAA were administered to CD71-KI / GAA-KO mice from the tail vein, respectively.
  • Both hGAA-anti-hTfR antibody and hGAA were administered every other week for a total of 4 doses with a dose of 20 mg.
  • mice Two weeks after the last dose, the mice were exsanguinated and the heart, diaphragm, soleus, anterior tibialis, and quadriceps were collected. The collected tissue was washed with physiological saline. The glycogen concentration (mg / g wet tissue weight) contained in these muscle tissues was measured by the method described in Example 16.
  • the group administered with the hGAA-anti-hTfR antibody was designated as the hGAA-anti-hTfR antibody-ad group, and the group administered with the commercially available medical hGAA was designated as the hGAA-administered group.
  • CD71-KI / GAA-KO mice administered with an equal amount of physiological saline were used as the KO control group.
  • wild type mice administered with an equal amount of physiological saline were used as a wild type control group. Each group had 5 mice.
  • FIGS. 1 shows the measurement results of the heart
  • FIG. 2 shows the diaphragm
  • FIG. 3 shows the soleus
  • FIG. 4 shows the anterior tibial muscle
  • FIG. 5 shows the quadriceps femoris.
  • the amount of glycogen contained in each muscle tissue is about 7.5% in the heart, 6.5% in the diaphragm, and flounder in the hGAA-anti-hTfR antibody administration group when the amount of glycogen contained in each tissue in the hGAA administration group is 100%.
  • the muscle decreased to about 13.5%, the anterior tibialis about 13.5%, and the quadriceps to about 6%.
  • hGAA-anti-hTfR antibody is a disease in which a large amount of glycogen accumulates in lysosomes of cells due to genetic deficiency in most or all of acid ⁇ -glucosidase activity. Disability is central to symptoms.
  • hGAA-anti-hTfR antibody is more promising as a therapeutic agent in the method of enzyme supplementation in patients with Pompe disease because it can efficiently degrade glycogen accumulated in the heart muscle and skeletal muscle of patients with Pompe disease compared to hGAA. is there.
  • Example 16 Method for measuring the amount of glycogen contained in a tissue
  • a bead crusher BEADS CRUSHER ⁇ T-12, Taitec Co., Ltd.
  • the tissue obtained in Example 15 and 15 SUSs having a diameter of 0.5 mm Beads were added and water for injection was added.
  • the bead crusher was activated to disrupt the tissue.
  • the obtained tissue crushed material was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected as a sample solution and stored frozen until measurement.
  • Glycogen concentration was measured using Glycogen Colorimetric / Fluorometric Assay Kit (Biovision) in the following procedure.
  • a standard curve sample (Glycogen® Standard) was diluted in stages with pure water, and this diluted solution was added to each well of F96® Black® plate (Nunc) by 50 ⁇ L. Similarly, 50 ⁇ L of the sample solution was added to each well. At this time, each calibration curve sample diluent and specimen solution were added to 2 wells, respectively. Hydrolysis Enzyme Mix was added and mixed with 2 ⁇ ⁇ ⁇ each containing a calibration curve sample and 1 well containing a sample, and reacted at room temperature for 30 minutes to decompose glycogen into glucose.
  • a drug that should function in the muscle and cannot be sufficiently taken into the muscle as it is is efficiently taken into the muscle by using a conjugate bound to the anti-transferrin receptor antibody. It can be applied to the development of new therapeutic agents for muscle diseases.
  • a protein that needs to be administered in a large amount to function in muscle, such as hGAA can be greatly reduced by using a fusion protein to which the present invention is applied. There is also.
  • SEQ ID NO: 3 amino acid sequence of linker example 1
  • SEQ ID NO: 4 amino acid sequence of linker example 2
  • SEQ ID NO: 7 primer hTfR5 ′
  • synthetic sequence SEQ ID NO: 8 primer hTfR3 ′
  • synthetic sequence SEQ ID NO: 9 mouse anti-hTfR antibody number 3
  • Amino acid sequence of the variable region of the light chain of SEQ ID NO: 10 amino acid sequence of the variable region of the heavy chain of mouse anti-hTfR antibody # 3
  • SEQ ID NO: 11 amino acid sequence of the light chain CDR1 of mouse anti-hTfR antibody # 3
  • SEQ ID NO: 12 amino acid sequence 2 of light chain CDR1 of mouse anti-hTfR antibody # 3
  • SEQ ID NO: 13 amino acid sequence 1 of light chain CDR2 of mouse anti-hTfR antibody # 3
  • SEQ ID NO: 14 Amino acid sequence 2 of light chain CDR2 of mouse anti-hTfR antibody # 3
  • SEQ ID NO: 26 humanized anti-hTfR antibody No. 3 light chain amino acid sequence
  • synthetic sequence sequence No. 27 amino acid sequence of humanized anti-hTfR antibody No. 3 heavy chain and hGAA fusion protein
  • SEQ ID NO: 28 nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of humanized anti-hTfR antibody No.

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Abstract

【課題】筋組織で機能させるべき薬剤であって，生体内に投与したときに，そのままでは筋組織へ十分に取り込まれない薬剤を，筋組織，特に骨格筋又は心筋により構成される筋組織に，効率よく取り込ませるための技術を提供すること。 【解決手段】抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と薬剤との結合体であって，該薬剤が筋組織で機能を発揮させるべき生理活性を有する薬剤，例えば，酸性α-グルコシダーゼ，α－ガラクトシダーゼＡ等のリソソーム酵素である，結合体。

Description

薬剤を筋肉に送達するための方法
　本発明は，筋肉において生理活性を発揮させるべき薬剤の筋肉への輸送に関し，詳しくは，所望の薬剤を抗トランスフェリン抗体と結合させてなる結合体，及び，当該結合体を投与することにより，当該所望の薬剤の生理活性を筋肉において発揮させる方法に関する。
　近年，リソソーム酵素の機能欠損により発症するリソソーム病に対する酵素補充療法が確立され，患者の生命予後及び生活の質（ＱＯＬ）が向上している。酵素補充療法に用いられるリソソーム酵素を有効成分として含む医薬品としては，ヒト酸性α-グルコシダーゼ（hGAA）を主剤とする糖原病2型（ポンぺ病）の治療薬，ヒトイズロン酸-2-スルファターゼ（hI2S）を主剤とするムコ多糖症2型（ハンター病）の治療薬，ヒトα-ガラクトシダーゼＡ（hα-GalA）を主剤とするファブリー病の治療薬，ヒトグルコセレブロシダーゼを主剤とするゴーシェ病の治療薬等が販売されている。
　酵素補充療法で患者に投与されたリソソーム酵素は，細胞内に取り込まれてその機能を発揮する。例えば，ヒト酸性α-グルコシダーゼ（hGAA），ヒトイズロン酸-2-スルファターゼ（hI2S）及びヒトα-ガラクトシダーゼＡ（hα-GalA）は，マンノース-6-リン酸（M6P）を含むN型糖鎖により修飾されており，M6PとM6P受容体の結合を介して細胞内に取り込まれる。また，ゴーシェ病の治療薬であるヒトグルコセレブロシダーゼは，還元末端がマンノースであるN型糖鎖により修飾されており，マンノースとマンノース受容体を介して標的であるマクロファージなど細網内皮系の細胞に取り込まれる。M6PとM6P受容体の結合を介した細胞内への取り込みについてみると，2個のM6Pを含むbis-phosphate型糖鎖は，1個のM6Pを含むmono-phosphate型と比較して，M6P受容体に対する親和性が100倍以上高く，糖鎖に含まれるM6Pはリソソーム酵素の細胞内への取り込み効率に大きく影響を与える。
　酵素補充療法に用いられるヒトリソソーム酵素は，遺伝子組換え技術を用いてCHO細胞等のホスト細胞にヒトリソソーム酵素をコードする遺伝子を導入して発現させることにより製造された組換え蛋白質である。組換え蛋白質として製造された組換えヒトリソソーム酵素は，その薬効を発揮するため，適切に糖鎖修飾される必要がある。つまり，hGAA，hα-GalA及びhI2Sにあってはマンノース-6-リン酸を含む糖鎖により修飾されることが，ヒトグルコセレブロシダーゼにあっては還元末端がマンノースである糖鎖により適切に修飾されることが，薬効を発揮するうえで不可欠である。
　組換えヒト酸性α-グルコシダーゼ（rhGAA）の場合，薬効を発揮させるべき主要な標的臓器は筋肉，特に骨格筋である。しかし，酵素補充療法に用いられているrhGAAは，糖鎖に含まれるM6Pの数が，1分子あたり平均1個以下であり，よって糖鎖の多くはmono-phosphate型であり，M6Pによる糖鎖修飾が十分ではない（非特許文献１）。そのため，標的臓器におけるrhGAAの取り込み効率が低く，その１回当たりの投与量は20mg/kgと極めて多量である。患者の症状如何によっては，投与量は40mg/kgにまで増量されるが，それでもなお，投与された酵素の機能が十分に発揮されていないと考えられる。
　rhGAAを効率よく標的臓器に取り込ませる方法として，M6P-M6P受容体以外のリガンド-受容体系を利用する方法が開発されている。例えば，低密度リポ蛋白質受容体ファミリー（LDL受容体）のリガンドであるRAP（receptor-associated protein）とhGAAとを融合させた融合蛋白質は，培養細胞を用いた実験において，M6P非依存的に細胞内に取り込まれることが知られている（非特許文献２）。この方法によれば，M6Pを含む糖鎖による修飾が十分ではないrhGAAであっても，RAPとその受容体の結合を介して，細胞内に取り込ませることができるとされている。
Zhu Y. et al., Biochem J. 389, 619-28 (2005) Prince WS. et al., J Biol. Chem. 279, 35037-46 (2004)
　本発明の目的は，筋肉で機能させるべき薬剤を，生体内に投与したときに，筋肉に効率よく取り込ませる方法及びその関連技術を提供することである。
　上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，筋肉で薬効を発揮すべきであるが，そのままでは十分に筋肉に輸送されることのない組換えヒト酸性α-グルコシダーゼが，抗ヒトトランスフェリン受容体との結合体とすることにより筋肉に効率よく輸送されることを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を含むものである。
１．抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と薬剤との結合体であって，該薬剤が筋肉において機能を発揮させるべき生理活性を有するものである，結合体。
２．該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，Ｆａｂ抗体，Ｆ（ａｂ’）２抗体，又はＦ（ａｂ’）抗体である，上記１に記載の結合体。
３．該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，ｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），ｓｃＦ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖからなる群から選ばれる一本鎖抗体である，上記１に記載の結合体。
４．該一本鎖抗体が，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖と重鎖とをリンカー配列を介して結合させたものである，上記３に記載の結合体。
５．該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖と重鎖とを，該軽鎖のＣ末端側において，該リンカー配列を介して結合させたものである，上記４に記載の結合体。
６．該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖と重鎖とを，該重鎖のＣ末端側において，該リンカー配列を介して結合させたものである，上記４に記載の結合体。
７．該リンカー配列が，８～５０個のアミノ酸残基からなるものである，上記４～６の何れかに記載の結合体。
８．該リンカー配列が，アミノ酸配列（Ｇｌｙ　Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ），配列番号３，及び配列番号４で示されるものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるものである，上記７に記載の結合体。
９．該リンカー配列が，配列番号４で示されるアミノ酸配列が３回連続する１５個のアミノ酸残基からなるものである，上記８に記載の結合体。
１０．該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域に配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むものであり，重鎖の可変領域に配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むものである，上記１～９の何れかに記載の結合体。
１１．該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するものであり，該重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するものである，上記１０に記載の結合体。
１２．該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するものであり，該重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するものである，上記１０に記載の結合体。
１３．該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列を構成する１～１０個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものである，上記１０に記載の結合体。
１４．該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列を構成する１～３個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものである，上記１０に記載の結合体。
１５．該重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２３で示されるアミノ酸配列を構成する１～１０個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものである，上記１０に記載の結合体。
１６．該重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２３で示されるアミノ酸配列を構成する１～３個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものである，上記１０に記載の結合体。
１７．該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列を構成する１～１０個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものであり，該重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２３で示されるアミノ酸配列を構成する１～１０個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものである，上記１０に記載の結合体。
１８．該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列を構成する１～３個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものであり，該重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２３で示されるアミノ酸配列を構成する１～３個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものである，上記１０に記載の結合体。
１９．該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖に配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むものであり，重鎖に配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むものである，上記１０に記載の結合体。
２０．該軽鎖のアミノ酸配列が，配列番号２４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するものであり，該重鎖のアミノ酸配列が，配列番号２５で示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するものである，上記１９に記載の結合体。
２１．該軽鎖のアミノ酸配列が，配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するものであり，該重鎖のアミノ酸配列が，配列番号２５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するものである，上記１９に記載の結合体。
２２．薬剤がペプチド又は蛋白質である，上記１～２１の何れかに記載の結合体。
２３．上記２２の結合体であって，以下の（１）～（４）からなる群から選択されるもの，
（１）該蛋白質が，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＣ末端側にペプチド結合により結合したもの，
（２）該蛋白質が，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＮ末端側にペプチド結合により結合したもの，
（３）該蛋白質が，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の重鎖のＣ末端側にペプチド結合により結合したもの，及び
（４）該蛋白質が，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の重鎖のＮ末端側にペプチド結合により結合したもの。
２４．該蛋白質が，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体に，リンカー配列を介して結合したものである，上記２３に記載の結合体。
２５．該リンカー配列が，１～５０個のアミノ酸残基からなるものである，上記２４に記載の結合体。
２６．該リンカー配列が，１個のグリシン，１個のセリン，アミノ酸配列（Ｇｌｙ　Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ），配列番号３のアミノ酸配列，配列番号４のアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列が１～１０個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるものである，上記２５に記載の結合体。
２７．該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体がヒト化抗ヒトトランスフェリン受容体抗体である，上記１～２８の何れかの結合体。
２８．該蛋白質が，リソソーム酵素である，上記２２～２７の何れかに記載の結合体。
２９．該リソソーム酵素が，ヒトα－ガラクトシダーゼＡである，上記２８に記載の結合体。
３０．該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が配列番号２４のアミノ酸配列を含むものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖がそのＣ末端側で，リンカー配列（Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）を介して，該ヒトα－ガラクトシダーゼＡと結合しており，全体として配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含むものである，上記２９に記載の結合体。
３１．該リソソーム酵素がヒト酸性α-グルコシダーゼ，である，上記２８に記載の結合体。
３２．該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が配列番号２４のアミノ酸配列を含むものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖がそのＣ末端側で，リンカー配列（Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）を介して，該ヒト酸性α-グルコシダーゼと結合しており，全体として配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含むものである，上記３１に記載の結合体。
３３．上記１～３２の何れかに記載の結合体を含有してなる，筋肉の機能を改善するための医薬組成物。
３４．上記２８に記載の結合体を含有してなる，リソソーム病に伴う筋肉の機能障害を改善するための，医薬組成物。
３５．上記２９又は３０に記載の結合体を含有してなる，ファブリー病に伴う筋肉の機能障害を改善するための，医薬組成物。
３６．上記３１又は３２に記載の結合体を含有してなる，ポンペ病に伴う筋肉の機能障害を改善するための，医薬組成物。
３７．該筋肉が，骨格筋，心筋，又は平滑筋の何れかである，上記３３～３６の何れかに記載の医薬組成物。
３８．リソソーム病に伴う筋肉の機能障害を改善するための医薬組成物の製造のための，上記２８～３２の何れかに記載の結合体の使用。
３９．ファブリー病に伴う筋肉の機能障害を改善するための医薬組成物の製造のための，上記２９又は３０に記載の結合体の使用。
４０．ポンペ病に伴う筋肉の機能障害を改善するための医薬組成物の製造のための，上記３１又は３２に記載の結合体の使用。
４１．上記１～３２の何れかに記載の結合体の，筋肉の機能を改善するための医薬組成物としての使用。
４２. 薬剤を筋肉に送達するための方法であって，該薬剤を抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と結合させた結合体として製造するステップ，及び該結合体を個体に投与するステップことを含む，方法。
４３．該結合体が，上記１～３２の何れかに記載の結合体である，請求項４２に記載の方法。
４４．該結合体の投与により該個体の筋肉の機能が改善されるステップを更に含む，上記４２又は４３に記載の方法。
４５．該個体が，筋肉の機能障害を有するものである，上記４２～４４の何れかに記載の方法。
４６．該個体が，リソソーム病に伴う筋肉の機能障害を有するものである，上記４２～４４の何れかに記載の方法。
４７．該リソソーム病が，ファブリー病又はポンペ病である，上記４６に記載の方法。
　本発明によれば，筋肉において機能させようとする薬剤，特に生理活性を有するペプチド又は蛋白質を，抗ヒトトランスフェリン受容体との結合体とすることにより，生体内に投与したときに，筋肉に効率よく送達させることができる。つまり，薬剤をヒトトランスフェリン受容体との結合体とすることにより，筋肉の機能障害を伴う疾患のより効果的な治療剤を提供することが可能となる。
心臓に含まれるグリコーゲンの定量結果を示す図。(1)は野生型コントロール群，(2)はKOコントロール群，(3)はhGAA投与群，(4)はhGAA-抗hTfR抗体投与群の定量結果を示す。縦バーはSD値を示す。縦軸はグリコーゲン濃度(mg/g湿組織重量)を示す。 横隔膜に含まれるグリコーゲンの定量結果を示す図。(1)～(4)，縦バー及び縦軸については図１と同様である。 ヒラメ筋に含まれるグリコーゲンの定量結果を示す図。(1)～(4)，縦バー及び縦軸については図１と同様である。 前脛骨筋に含まれるグリコーゲンの定量結果を示す図。(1)～(4)，縦バー及び縦軸については図１と同様である。 大腿四頭筋に含まれるグリコーゲンの定量結果を示す図。(1)～(4)，縦バー及び縦軸については図１と同様である。
　本発明で「筋肉」というときは，主に骨格筋，心筋，又は平滑筋の何れかにより構成される組織のことをいい，特に，主に骨格筋により構成される組織又は心筋により構成される組織のことをいう。また，「筋組織」との用語は，筋肉と同義と解される。
　本発明において，筋肉において生理活性を発揮させるべき薬剤は，その薬剤をそのまま血中に投与したときには，筋肉に効率よく輸送されないため，筋肉においてその生理活性を十分に発揮させることができない薬剤である。かかる薬剤は低分子化合物でもよく，ペプチド，又は蛋白質であってもよい。ここで，ペプチドは筋肉で生理活性を発揮し得るものであるが（生理活性ペプチド），それのみでは，生体内に投与したときに筋肉に効率よく輸送されないものであり，好ましくは２～１００個のアミノ酸残基からなるものであり，例えば，２～５０個，５～１００個のアミノ酸残基からなるものである。またここで，蛋白質は筋肉で生理活性を発揮し得るものであるが（生理活性蛋白質），それのみでは，生体内に投与したときに筋肉に効率よく輸送されないものであり，例えば，酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ），α－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧａｌＡ）等のリソソーム酵素が含まれる。また，かかるペプチド及び蛋白質は，人工的なアミノ酸配列を有するものでもよく，また動物の遺伝子にコードされているアミノ酸配列を有するものでもよい。ここで，ペプチド又は蛋白質をコードする遺伝子の動物種に特に限定はないが，好ましくは哺乳動物であり，より好ましくは，ヒト，サル，ネズミ，家畜動物（ウマ，ブタ，羊等），愛玩動物（ネコ，イヌ等）であり，より好ましくはヒトである。
　リソソーム病に伴う筋肉の機能障害を改善させるための医薬として，その機能を発揮させるべきリソソーム酵素には，ＧＡＡ，α－ＧａｌＡ以外に，α－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ），イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ），グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ），β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ），β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ），サポシンＣ，アリルスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ），α－Ｌ－フコシダーゼ（ＦＵＣＡ１），アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ），β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ），ヘパランＮ－スルファターゼ（ＳＧＳＨ），α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ），アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ（ＡＣ），アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１（ＰＰＴ－１），トリペプチジルペプチダーゼ－１（ＴＰＰ－１），ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１，ＣＬＮ２等がある。これらの酵素は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体との結合体とすることにより，生体内に投与したときに，より効率よく筋肉に送達させることができる。従って，これらの結合体は，リソソーム病に伴う筋肉の機能障害を改善させるための医薬として用いることができる。
　抗ｈＴｆＲ抗体と融合させたイズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ）はハンター症候群における筋肉の機能障害治療剤として，α－ガラクトシダーゼＡはファブリー病における筋肉の機能障害治療剤として，α－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）はハーラー症候群又はハーラー・シャイエ症候群における筋肉の機能障害治療剤として，グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）はゴーシェ病における筋肉の機能障害治療剤として，βガラクトシダーゼはＧＭ１－ガングリオシドーシス１～３型における筋肉の機能障害治療剤として，ＧＭ２活性化蛋白質はＧＭ２－ガングリオシドーシスＡＢ異型における筋肉の機能障害治療剤として，β－ヘキソサミニダーゼＡはサンドホフ病及びティサックス病における筋肉の機能障害治療剤として，β－ヘキソサミニダーゼＢはサンドホフ病における筋肉の機能障害治療剤として，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼはＩ－細胞病における筋肉の機能障害治療剤として，α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ）はα－マンノシドーシスにおける筋肉の機能障害治療剤として，β－マンノシダーゼはβ－マンノシドーシスにおける筋肉の機能障害治療剤として，ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）はクラッベ病における筋肉の機能障害治療剤として，サポシンＣはゴーシェ病様蓄積症における筋肉の機能障害治療剤として，アリルスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）は異染性白質変性症（異染性白質ジストロフィー）における筋肉の機能障害治療剤として，α－Ｌ－フコシダーゼ（ＦＵＣＡ１）はフコシドーシスにおける筋肉の機能障害治療剤として，アスパルチルグルコサミニダーゼはアスパルチルグルコサミン尿症における筋肉の機能障害治療剤として，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼはシンドラー病及び川崎病における筋肉の機能障害治療剤として，酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）はニーマン・ピック病における筋肉の機能障害治療剤として，β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）はスライ症候群における筋肉の機能障害治療剤として，ヘパランＮ－スルファターゼ（ＳＧＳＨ），α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ），アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ及びＮ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼはサンフィリッポ症候群における筋肉の機能障害治療剤として，酸性セラミダーゼ（ＡＣ）はファーバー病における筋肉の機能障害治療剤として，アミロ－１，６－グルコシダーゼはコリ病（フォーブス・コリ病）における筋肉の機能障害治療剤として，シアリダーゼはシアリダーゼ欠損症における筋肉の機能障害治療剤として，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１（ＰＰＴ－１）は，神経セロイドリポフスチン症又はSantavuori-Haltia病における筋肉の機能障害治療剤として，トリペプチジルペプチダーゼ－１（ＴＰＰ－１）は，神経セロイドリポフスチン症又はJansky-Bielschowsky病における筋肉の機能障害治療剤として，ヒアルロニダーゼ－１はヒアルロニダーゼ欠損症における筋肉の機能障害治療剤として，酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）はポンペ病における筋肉の機能障害治療剤として，ＣＬＮ１及び２はバッテン病における筋肉の機能障害治療剤として使用できる。特に，本発明の抗ｈＴｆＲ抗体は，血液脳関門を通過した後に，大脳の脳実質，海馬の神経様細胞，小脳のプルキンエ細胞等に到達し，又大脳の線条体の神経様細胞及び中脳の黒質の神経様細胞にも到達すると予想されるので，これら組織又は細胞において薬効を機能させるべき蛋白質と融合させることにより，その蛋白質の薬効を強化し得る。但し，医薬用途はこれらの疾患に限られるものではない。
　なお，本発明において，「リソソーム酵素」の語，若しくは個々のリソソーム酵素を示す語は，特に天然型のアミノ酸配列を有するものを意味するが，これに限らず，リソソーム酵素を有するものである限り，天然型のリソソーム酵素のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えたものもリソソーム酵素に含まれる。リソソーム酵素のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。リソソーム酵素のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異をリソソーム酵素に加えることもできる。リソソーム酵素にアミノ酸を付加させる場合，リソソーム酵素のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異をリソソーム酵素に加えることもできる。変異を加えたリソソーム酵素のアミノ酸配列は，元のリソソーム酵素のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。リソソーム酵素以外の蛋白質，ペプチドについても同様である。
　なおここで，リソソーム酵素がリソソーム酵素活性を有するというときは，抗ｈＴｆＲ抗体と結合させたときに，天然型のリソソーム酵素が本来有する活性に対して，３％以上の活性を有していることをいう。但し，その活性は，天然型のリソソーム酵素が本来有する活性に対して，１０％以上であることが好ましく，２０％以上であることがより好ましく，５０％以上であることが更に好ましく，８０％以上であることが更により好ましい。抗ｈＴｆＲ抗体と結合させたリソソーム酵素が変異を加えたものである場合も同様である。また，リソソーム酵素以外の蛋白質，ペプチドについても同様である。
　なお，ペプチド又は蛋白質（リソソーム酵素，抗体を含む）のアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸による置換としては，例えば，芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ），脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ），アミド型アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ），塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ），酸性アミノ酸（Ｇｌｕ，Ａｓｐ），水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ），分枝アミノ酸（Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ），側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ），非極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸どうしの置換が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は，蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち，保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり，種々の文献に記載されている（例えば，Bowieら, Science, 247:1306-1310(1990)を参照）。
　また，本発明において「相同性」又は「同一性」とは，相同性計算アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列を比較した場合の，最適なアラインメントにおける，全アミノ酸残基に対する相同なアミノ酸残基の割合（％）を意味する。２つのアミノ酸配列をかかる割合で示される相同性（又は同一性）で比較することは，本発明の技術的分野において周知であり，当業者にとって容易に理解されるものである。本発明において，元の蛋白質（抗体を含む）のアミノ酸配列と変異を加えた蛋白質のアミノ酸配列との相同性を算出するための相同性計算アルゴリズムとして，BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990))，Pearson及びLipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))，Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等が周知である。また，アメリカ国立衛生研究所がインターネット上で提供するBLASTプログラムの一つであるblastpは，２つのアミノ酸配列の相同性を算出するための手段として周知である。
　以下，リソソーム酵素について，酸性α－グルコシダーゼとα－ガラクトシダーゼＡを例に採り詳述する。
　酸性α－グルコシダーゼ（ＧＡＡ）は，グリコーゲンを分解する活性を有するリソソーム酵素である。ポンぺ病（糖原病II型）は，遺伝的に酸性α－グルコシダーゼ活性のほとんど又は全部を欠損することにより，細胞のライソソームにグリコーゲンが大量に蓄積する疾患であり，心筋及び骨格筋の機能障害が症状の中心となる。ポンぺ病は，乳児型，幼児型，成人型に分類される。乳児型は，主に乳児期前半に発症し，心筋へのグリコーゲン蓄積等により，求心性心肥大による循環器症状，骨格筋侵襲による筋力低下，筋緊張低下を示し，先天性ミオパシー症状を特徴とする。幼児型は，骨格筋症状が主で，乳児期後半より，運動発達遅延，進行性の筋力低下を示す。成人型は筋力低下が主症状である。
　α－ガラクトシダーゼＡ（α－ＧａｌＡ）は，糖脂質及び糖蛋白質の末端α－ガラクトシル結合を加水分解する活性を有するライソソーム酵素である。トリヘキソシルセラミドは，α－ガラクトシダーゼＡの基質の一つであり，その末端ヘキソース部分において当該酵素による加水分解を受ける。ファブリー病は，遺伝的にα－ＧａｌＡ活性のほとんど又は全部を欠損することにより引き起こされる疾患である。ファブリー病の臨床学的特徴は，腎不全，角化血管腫，及び心血管系異常，例えば心室肥大及び僧帽弁不全である。また，主に心臓が障害される非典型的なタイプのファブリー病は，特に心ファブリー病として区別されることがある。
　リソソーム酵素を欠損するリソソーム病患者の治療法として，遺伝子組換え技術を用いて作製したリソソーム酵素を医薬として患者に投与する酵素補充療法が行われている。例えば，ポンぺ病患者に対しては，遺伝子組換え技術により作製した組換えヒト酸性α－グルコシダーゼであるマイオザイム（登録商標）を用いた酵素補充療法が行われている。また，ファブリー病患者に対しては，遺伝子組換え技術により作製した組換えヒトα－ガラクトシダーゼＡであるファブラザイム又はリプレガル（登録商標）を用いた酵素補充療法が行われている。これら酵素補充療法で医薬として用いられているリソソーム酵素が効果を発揮すべき組織の一つが筋肉である。従って，筋肉へのリソソーム酵素の供給量を増加させることにより，リソソーム病に伴う筋肉の機能障害をより改善させることができる可能性がある。
　なお，本発明において，「ヒト酸性α－グルコシダーゼ」又は「ｈＧＡＡ」の語は，特に天然型のｈＧＡＡと同一の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するｈＧＡＡを意味するが，これに限らず，ｈＧＡＡ活性を有するものである限り，天然型のｈＧＡＡのアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えたものもｈＧＡＡに含まれる。ｈＧＡＡのアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。ｈＧＡＡのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異をｈＧＡＡに加えることもできる。ｈＧＡＡにアミノ酸を付加させる場合，ｈＧＡＡのアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異をｈＧＡＡに加えることもできる。変異を加えたｈＧＡＡのアミノ酸配列は，元のｈＧＡＡのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。
　なおここで，ｈＧＡＡがｈＧＡＡ活性を有するというときは，抗ｈＴｆＲ抗体と結合させたときに，天然型のｈＧＡＡが本来有する活性に対して，３％以上の活性を有していることをいう。但し，その活性は，天然型のｈＧＡＡが本来有する活性に対して，１０％以上であることが好ましく，２０％以上であることがより好ましく，５０％以上であることが更に好ましく，８０％以上であることが更により好ましい。抗ｈＴｆＲ抗体と結合させたｈＧＡＡが変異を加えたものである場合も同様である。
　また，本発明において，「ヒトα－ガラクトシダーゼＡ」又は「ｈα－ＧａｌＡ」の語は，特に天然型のｈα－ＧａｌＡと同一の配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するｈα－ＧａｌＡのことを意味するが，これに限らず，ｈα－ＧａｌＡ活性を有するものである限り，天然型のｈα－ＧａｌＡのアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えたものもｈα－ＧａｌＡに含まれる。ｈα－ＧａｌＡのアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。ｈα－ＧａｌＡのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異をｈα－ＧａｌＡに加えることもできる。ｈα－ＧａｌＡにアミノ酸を付加させる場合，ｈα－ＧａｌＡのアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異をｈα－ＧａｌＡに加えることもできる。変異を加えたｈα－ＧａｌＡのアミノ酸配列は，元のｈα－ＧａｌＡのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。
　なおここで，ｈα－ＧａｌＡがｈα－ＧａｌＡ活性を有するというときは，これを抗ｈＴｆＲ抗体と結合させたときに，天然型のｈα－ＧａｌＡが本来有する活性に対して，３％以上の活性を有していることをいう。但し，その活性は，天然型のｈα－ＧａｌＡが本来有する活性に対して，１０％以上であることが好ましく，２０％以上であることがより好ましく，５０％以上であることが更に好ましく，８０％以上であることが更により好ましい。抗ｈＴｆＲ抗体と結合させたｈα－ＧａｌＡが変異を加えたものである場合も同様である。
　本発明において，「抗体」の語は，主としてヒト抗体，マウス抗体，ヒト化抗体，ヒト抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体，及びマウス抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体のことをいうが，特定の抗原に特異的に結合する性質を有するものである限り，これらに限定されるものではなく，また，抗体の動物種にも特に制限はない。
　本発明において，「ヒト抗体」の語は，その蛋白質全体がヒト由来の遺伝子にコードされている抗体のことをいう。遺伝子の発現効率を上昇させる等の目的で，元のヒトの遺伝子に，元のアミノ酸配列に変化を与えることなく変異を加えた遺伝子にコードされる抗体も，「ヒト抗体」に含まれる。また，ヒト抗体をコードする２つ以上の遺伝子を組み合わせて，あるヒト抗体の一部を，他のヒト抗体の一部に置き換えた抗体も，「ヒト抗体」に含まれる。ヒト抗体は，免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：complementary determining regionの略称）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。免疫グロブリン軽鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。免疫グロブリン重鎖の３箇所のＣＤＲも，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。あるヒト抗体のＣＤＲを，他のヒト抗体のＣＤＲに置き換えることにより，ヒト抗体の抗原特異性，親和性等を改変した抗体も，ヒト抗体に含まれる。
　本発明において，元のヒト抗体の遺伝子を改変することにより，元の抗体のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，「ヒト抗体」に含まれる。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗体である。アミノ酸を付加させる場合，元の抗体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗体である。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を示し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示すものである。従って，本発明において「ヒト由来の遺伝子」というときは，ヒト由来の元の遺伝子に加えて，これに改変を加えることにより得られる遺伝子も含まれる。
　また，「マウス抗体」というときは，その蛋白質全体がマウス由来の遺伝子にコードされる抗体と同一のアミノ酸配列からなる抗体のことをいう。従って，遺伝子の発現効率を上昇させる等の目的で，元のマウスの遺伝子に，元のアミノ酸配列に変化を与えることなく変異を加えた遺伝子にコードされる抗体も，「マウス抗体」に含まれる。また，マウス抗体をコードする２つ以上の遺伝子を組み合わせて，あるマウス抗体の一部を，他のマウス抗体の一部に置き換えた抗体も，マウス抗体に含まれる。マウス抗体は，免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。免疫グロブリン軽鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。免疫グロブリン重鎖の３箇所のＣＤＲも，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。例えば，あるマウス抗体のＣＤＲを，他のマウス抗体のＣＤＲに置き換えることにより，マウス抗体の抗原特異性，親和性等を改変した抗体も，マウス抗体に含まれる。
　本発明において，元のマウス抗体の遺伝子を改変することにより，元の抗体のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，「マウス抗体」に含まれる。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，マウス抗体である。アミノ酸を付加する場合，元の抗体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，マウス抗体である。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは９５％以上の相同性を示し，更により好ましくは９８％以上の相同性を示すものである。従って，本発明において「マウス由来の遺伝子」というときは，マウス由来の元の遺伝子に加えて，これに改変を加えることにより得られる遺伝子も含まれる。
　本発明において，「ヒト化抗体」の語は，可変領域の一部（例えば，特にＣＤＲの全部又は一部）のアミノ酸配列がヒト以外の哺乳動物由来であり，それ以外の領域がヒト由来である抗体のことをいう。例えば，ヒト化抗体として，ヒト抗体を構成する免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を，他の哺乳動物のＣＤＲによって置き換えることにより作製された抗体が挙げられる。ヒト抗体の適切な位置に移植されるＣＤＲの由来となる他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウス及びラットであり，例えばマウスである。
　本発明において，「キメラ抗体」の語は，２つ以上の異なる種に由来する，２つ以上の異なる抗体の断片が連結されてなる抗体のことをいう。
　ヒト抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体とは，ヒト抗体の一部がヒト以外の哺乳動物の抗体の一部によって置き換えられた抗体である。抗体は，Ｆｃ領域，Ｆａｂ領域及びヒンジ部とからなる。このようなキメラ抗体の具体例として，Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域が他の哺乳動物の抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又は他の哺乳動物の抗体のいずれかに由来する。逆に，Ｆｃ領域が他の哺乳動物に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。この場合もヒンジ部は，ヒト抗体又は他の哺乳動物の抗体のいずれに由来してもよい。
　また，抗体は，可変領域と定常領域とからなるということもできる。キメラ抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）がヒト抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）が他の哺乳動物の抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）が他の哺乳動物の抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がヒト抗体に由来するものも挙げられる。ここで，他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウスである。
　マウス抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体とは，マウス抗体の一部がマウス以外の哺乳動物の抗体の一部に置き換えられた抗体である。このようなキメラ抗体の具体例として，Ｆｃ領域がマウス抗体に由来する一方でＦａｂ領域が他の哺乳動物の抗体に由来するキメラ抗体や，逆に，Ｆｃ領域が他の哺乳動物に由来する一方でＦａｂ領域がマウス抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ここで，他の哺乳動物の生物種は，マウス以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，ラット，ウサギ，ウマ，ヒト以外の霊長類である。
　ヒト抗体とマウス抗体のキメラ抗体は，特に，「ヒト／マウスキメラ抗体」という。ヒト／マウスキメラ抗体には，Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域がマウス抗体に由来するキメラ抗体や，逆に，Ｆｃ領域がマウス抗体に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又はマウス抗体のいずれかに由来する。ヒト／マウスキメラ抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）がヒト抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がマウス抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）がマウス抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がヒト抗体に由来するものも挙げられる。
　抗体は，本来，２本の免疫グロブリン軽鎖と２本の免疫グロブリン重鎖の計４本のポリペプチド鎖からなる基本構造を有する。但し，本発明において，「抗体」というときは，この基本構造を有するものに加え，
（１）１本の免疫グロブリン軽鎖と１本の免疫グロブリン重鎖の計２本のポリペプチド鎖からなるものや，以下に詳述するように，
（２）免疫グロブリン軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体，及び
（３）免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体も含まれる。また，
（４）本来の意味での抗体の基本構造からＦｃ領域が欠失したものであるＦａｂ領域からなるもの及びＦａｂ領域とヒンジ部の全部若しくは一部とからなるもの（Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２を含む）も，
本発明における「抗体」に含まれる。
　ここでＦａｂとは，可変領域とＣＬ領域（軽鎖の定常領域）を含む１本の軽鎖と，可変領域とＣＨ１領域（重鎖の定常領域の部分１）を含む１本の重鎖が，それぞれに存在するシステイン残基同士でジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Ｆａｂにおいて，重鎖は，可変領域とＣＨ１領域（重鎖の定常領域の部分１）に加えて，更にヒンジ部の一部を含んでもよいが，この場合のヒンジ部は，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠くものである。Ｆａｂにおいて，軽鎖と重鎖とは，軽鎖の定常領域（ＣＬ領域）に存在するシステイン残基と，重鎖の定常領域（ＣＨ１領域）又はヒンジ部に存在するシステイン残基との間で形成されるジスルフィド結合により結合する。Ｆａｂは，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠いているので，１本の軽鎖と１本の重鎖とからなる。Ｆａｂを構成する軽鎖は，可変領域とＣＬ領域を含む。Ｆａｂを構成する重鎖は，可変領域とＣＨ１領域からなるものであってもよく，可変領域，ＣＨ１領域に加えてヒンジ部の一部を含むものであってもよい。但しこの場合，ヒンジ部で２本の重鎖の間でジスルフィド結合が形成されないように，ヒンジ部は重鎖間を結合するシステイン残基を含まないように選択される。Ｆ（ａｂ’）においては，その重鎖は可変領域とＣＨ１領域に加えて，重鎖どうしを結合するシステイン残基を含むヒンジ部の全部又は一部を含む。Ｆ（ａｂ’）２は２つのＦ（ａｂ’）が互いのヒンジ部に存在するシステイン残基どうしでジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。また，複数の抗体が直接又はリンカーを介して結合してなる二量体，三量体等の重合体も，抗体である。更に，これらに限らず，免疫グロブリン分子の一部を含み，且つ，抗原に特異的に結合する性質を有するものは何れも，本発明でいう「抗体」に含まれる。即ち，本発明において免疫グロブリン軽鎖というときは，免疫グロブリン軽鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。また，免疫グロブリン重鎖というときは，免疫グロブリン重鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。従って，可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有する限り，例えば，Ｆｃ領域が欠失したものも，免疫グロブリン重鎖である。
　また，ここでＦｃ又はＦｃ領域とは，抗体分子中の，ＣＨ２領域（重鎖の定常領域の部分２），及びＣＨ３領域（重鎖の定常領域の部分３）からなる断片を含む領域のことをいう。
　更には，本発明において，「抗体」というときは，
（５）上記（４）で示したＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）又はＦ（ａｂ’）２を構成する軽鎖と重鎖を，リンカー配列を介して結合させて，それぞれ一本鎖抗体としたｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），及びｓｃＦ（ａｂ’）２も含まれる。ここで，ｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），及びｓｃＦ（ａｂ’）２にあっては，軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖を結合させてなるものでもよく，また，重鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖を結合させてなるものでもよい。更には，軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域をリンカー配列を介して結合させて一本鎖抗体としたｓｃＦｖも，本発明における抗体に含まれる。ｓｃＦｖにあっては，軽鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖の可変領域を結合させてなるものでもよく，また，重鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖の可変領域を結合させてなるものでもよい。
　本発明において，「一本鎖抗体」というときは，免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質をいう。例えば，上記（２），（３）及び（５）に示されるものは一本鎖抗体に含まれる。また，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質も，本発明における「一本鎖抗体」である。免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖が結合した一本鎖抗体にあっては，通常，免疫グロブリン重鎖は，Ｆｃ領域が欠失している。免疫グロブリン軽鎖の可変領域は，抗体の抗原特異性に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）を３つ有している。同様に，免疫グロブリン重鎖の可変領域も，ＣＤＲを３つ有している。これらのＣＤＲは，抗体の抗原特異性を決定する主たる領域である。従って，一本鎖抗体には，免疫グロブリン重鎖の３つのＣＤＲが全てと，免疫グロブリン軽鎖の３つのＣＤＲの全てとが含まれることが好ましい。但し，抗体の抗原特異的な親和性が維持される限り，ＣＤＲの１個又は複数個を欠失させた一本鎖抗体とすることもできる。
　一本鎖抗体において，免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の間に配置されるリンカー配列は，好ましくは２～５０個，より好ましくは８～５０個，更に好ましくは１０～３０個，更により好ましくは１２～１８個又は１５～２５個，例えば１５個若しくは２５個のアミノ酸残基から構成されるペプチド鎖である。そのようなリンカー配列は，これにより両鎖が連結されてなる抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲに対する親和性を保持する限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンのみ又はグリシンとセリンから構成されるものであり，例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４），又はこれらのアミノ酸配列が２～１０回，あるいは２～５回繰り返された配列を有するものである。例えば，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全領域からなるアミノ酸配列のＣ末端側に，リンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖の可変領域を結合させる場合，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）の３個が連続したものに相当する計１５個のアミノ酸からなるリンカー配列が好適である。
　本発明において，「ヒトトランスフェリン受容体」又は「ｈＴｆＲ」の語は，配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する膜蛋白質をいう。本発明の抗ｈＴｆＲ抗体は，その一実施態様において，配列番号５で示されるアミノ酸配列中Ｎ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの部分（ｈＴｆＲの細胞外領域）に対して特異的に結合するものであるが，これに限定されない。また，本発明において「サルトランスフェリン受容体」又は「サルＴｆＲ」の語は，特に，カニクイザル（Macaca fascicularis）由来の配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する膜蛋白質である。本発明の抗ｈＴｆＲ抗体は，その一実施態様において，配列番号６で示されるアミノ酸配列中Ｎ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの部分（サルＴｆＲの細胞外領域）に対しても結合するものであるが，これに限定されない。
　ｈＴｆＲに対する抗体の作製方法としては，ｈＴｆＲ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した細胞を用いて，組換えヒトトランスフェリン受容体（ｒｈＴｆＲ）を作製し，このｒｈＴｆＲを用いてマウス等の動物を免疫して得る方法が一般的である。免疫後の動物からｈＴｆＲに対する抗体産生細胞を取り出し，これとミエローマ細胞とを融合させることにより，抗体産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製することができる。
　また，マウス等の動物より得た免疫系細胞を体外免疫法によりｒｈＴｆＲで免疫することによっても，ｈＴｆＲに対する抗体を産生する細胞を取得できる。体外免疫法を用いる場合，その免疫系細胞が由来する動物種に特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，モルモット，イヌ，ネコ，ウマ，及びヒトを含む霊長類であり，より好ましくは，マウス，ラット及びヒトであり，更に好ましくはマウス及びヒトである。マウスの免疫系細胞としては，例えば，マウスの脾臓から調製した脾細胞を用いることができる。ヒトの免疫系細胞としては，ヒトの末梢血，骨髄，脾臓等から調製した細胞を用いることができる。ヒトの免疫系細胞を体外免疫法により免疫した場合，ｈＴｆＲに対するヒト抗体を得ることができる。
　体外免疫法により免疫系細胞を免疫した後，細胞をミエローマ細胞と融合させることにより，抗体産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製することができる。また，免疫後の細胞からｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し，このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応により免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し，これらを用いて人工的に抗体遺伝子を再構築することもできる。
　上記方法により得られたままのハイブリドーマ細胞には，ｈＴｆＲ以外の蛋白質を抗原として認識する抗体を産生する細胞も含まれる。また，抗ｈＴｆＲ抗体を産生するハイブリドーマ細胞の全てが，ｈＴｆＲに対して所望の親和性を示す抗ｈＴｆＲ抗体を産生するとも限らない。
　同様に，人工的に再構築した抗体遺伝子には，ｈＴｆＲ以外の蛋白質を抗原として認識する抗体をコードする遺伝子も含まれる。また，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子の全てが，ｈＴｆＲに対して所望の親和性を示す抗ｈＴｆＲ抗体をコードする等の所望の特性を備えるとも限らない。
　従って，上記で得られたままのハイブリドーマ細胞から，所望の特性（ｈＴｆＲに対する高親和性等）を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択するステップが必要となる。また，人工的に再構築した抗体遺伝子にあっては，当該抗体遺伝子から，所望の特性（ｈＴｆＲに対する高親和性等）を有する抗体をコードする遺伝子を選択するステップが必要となる。
　例えば，抗ｈＴｆＲ抗体に対して高親和性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する場合，組換えｈＴｆＲをプレートに添加してこれに保持させた後，ハイブリドーマ細胞の培養上清を添加し，次いで組換えｈＴｆＲと結合していない抗体をプレートから除去し，プレートに保持された抗体の量を測定する方法が用いられる。この方法によれば，プレートに添加したハイブリドーマ細胞の培養上清に含まれる抗体のｈＴｆＲに対する親和性が高いほど，プレートに保持される抗体の量が多くなる。従って，プレートに保持された抗体の量を測定し，より多くの抗体が保持されたプレートに対応するハイブリドーマ細胞を，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生する細胞株として選択することができる。この様にして選択された細胞株から，ｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し，このｃＤＮＡを鋳型として，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法を用いて増幅することにより，高親和性抗体をコードする遺伝子を単離することもできる。
　上記の人工的に再構築した抗体遺伝子から，高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択する場合は，一旦，人工的に再構築した抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み，この発現ベクターをホスト細胞に導入する。このとき，ホスト細胞として用いる細胞としては，人工的に再構築した抗体遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入することにより抗体遺伝子を発現させることのできる細胞であれば原核細胞，真核細胞を問わず特に限定はないが，ヒト，マウス，チャイニーズハムスター等の哺乳動物由来の細胞が好ましく，特にチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞，又はマウス骨髄腫に由来するＮＳ／０細胞が好ましい。また，抗体遺伝子をコードする遺伝子を組み込んで発現させるために用いる発現ベクターは，哺乳動物細胞内に導入させたときに，該遺伝子を発現させることができるものであれば特に限定なく用いることができる。発現ベクターに組み込まれた該遺伝子は，哺乳動物細胞内で遺伝子の転写の頻度を調節することができるＤＮＡ配列（遺伝子発現制御部位）の下流に配置される。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位としては，例えば，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター等が挙げられる。
　このような発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現ベクターに組み込まれた上述の人工的に再構築した遺伝子にコードされる抗体を発現するようになる。このようにして得た，人工的に再構築した抗体を発現する細胞から，抗ｈＴｆＲ抗体に対して高親和性を有する抗体を産生する細胞を選択する場合，組換えｈＴｆＲをプレートに添加してこれに保持させた後，組換えｈＴｆＲに細胞の培養上清を接触させ，次いで，組換えｈＴｆＲと結合していない抗体をプレートから除去し，プレートに保持された抗体の量を測定する方法が用いられる。この方法によれば，細胞の培養上清に含まれる抗体のｈＴｆＲに対する親和性が高いほど，プレートに保持された抗体の量が多くなる。従って，プレートに保持された抗体の量を測定し，より多くの抗体が保持されたプレートに対応する細胞を，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生する細胞株として選択することができ，ひいては，ｈＴｆＲに対して高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択できる。このようにして選択された細胞株から，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法を用いて増幅することにより，高親和性抗体をコードする遺伝子を単離することができる。
　上記の人工的に再構築した抗体遺伝子からの，高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子の選択は，人工的に再構築した抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを大腸菌に導入し，この大腸菌を培養して得た培養上清又は大腸菌を溶解させて得た抗体を含む溶液を用いて，上述のハイブリドーマ細胞を選択する場合と同様の方法で，所望の遺伝子を有する大腸菌を選択することによってもできる。選択された大腸菌株は，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を発現するものである。この大腸菌株から，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を単離できる。大腸菌の培養上清中に抗体を分泌させる場合には，Ｎ末端側に分泌シグナル配列が結合するように抗体遺伝子を発現ベクターに組み込めばよい。
　高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択する他の方法として，上述の人工的に再構築した抗体遺伝子にコードされた抗体をファージ粒子上に保持させて発現させる方法がある。このとき，抗体遺伝子は，一本鎖抗体をコードする遺伝子として再構築される。抗体をファージ粒子上に保持する方法は，国際公開公報（ＷＯ１９９７／０９４３６，ＷＯ１９９５／１１３１７）等に記載されており，周知である。人工的に再構築した抗体遺伝子にコードされた抗体を保持するファージから，抗ｈＴｆＲ抗体に対して高親和性を有する抗体を保持するファージを選択する場合，組換えｈＴｆＲを，プレートに添加して保持させた後，ファージと接触させ，次いでプレートから組換えｈＴｆＲと結合していないファージを除去し，プレートに保持されたファージの量を測定する方法が用いられる。この方法によれば，ファージ粒子上に保持された抗体のｈＴｆＲに対する親和性が高いほど，プレートに保持されたファージの量が多くなる。従って，プレートに保持されたファージの量を測定し，より多くのファージが保持されたプレートに対応するファージ粒子を，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生するファージ粒子として選択することができ，ひいては，ｈＴｆＲに対して高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を選択できる。このようにして選択されたファージ粒子から，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法を用いて増幅することにより，高親和性抗体をコードする遺伝子を単離することができる。
　上記の抗ｈＴｆＲ抗体に対して高親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞等の細胞，又は抗ｈＴｆＲ抗体に対して高親和性を有する抗体を有するファージ粒子から，ｃＤＮＡ又はファージＤＮＡを調製し，これを鋳型として，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖，又は抗ｈＴｆＲ抗体である一本鎖抗体の，全て又はその一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法等により増幅して単離することができる。同様にして，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法等により増幅して単離することもできる。
　この高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子の全て又はその一部を発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを用いて哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換し，得られた形質転換細胞を培養することにより，高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生させることができる。単離された抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子の塩基配列から抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列を翻訳し，このアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を人工的に合成することもできる。ＤＮＡ断片を人工的に合成する場合，適切なコドンを選択することにより，ホスト細胞における抗ｈＴｆＲ抗体の発現量を増加させることができる。
　元の抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えるために，単離されたＤＮＡ断片に含まれる抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子に，適宜変異を加えることもできる。変異を加えた後の抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子は，元の遺伝子と，好ましくは８０％以上の相同性を有するものであり，より好ましくは９０％以上の相同性を有するものであるが，ｈＴｆＲに対する親和性が失われない限り，相同性に特に制限はない。アミノ酸配列に変異を加えることにより，抗ｈＴｆＲ抗体と結合する糖鎖の数，糖鎖の種類を改変し，生体内における抗ｈＴｆＲ抗体の安定性を増加させること等もできる。
　抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子に変異を加える場合にあっては，変異を加えた後の遺伝子は，元の遺伝子と，好ましくは８０％以上の相同性を有するものであり，より好ましくは９０％以上の相同性を有するものであるが，ｈＴｆＲに対する親和性が失われない限り，相同性に特に制限はない。軽鎖の可変領域のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。軽鎖の可変領域にアミノ酸を付加させる場合，軽鎖の可変領域のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は，元の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。特に，ＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個であり，より好ましくは１～３個であり，更に好ましくは１～２個である。ＣＤＲのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個であり，より好ましくは１～３個であり，更に好ましくは１～２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。アミノ酸を付加させる場合，当該アミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～５個，より好ましくは１～３個，更に好ましくは１～２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列は，元の各ＣＤＲのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。
　抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域の全て又はその一部をコードする遺伝子に変異を加える場合にあっては，変異を加えた後の遺伝子は，元の遺伝子と，好ましくは８０％以上の相同性を有するものであり，より好ましくは９０％以上の相同性を有するものであるが，ｈＴｆＲに対する親和性が失われない限り，相同性に特に制限はない。重鎖の可変領域のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。重鎖の可変領域のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。重鎖の可変領域にアミノ酸を付加させる場合，重鎖の可変領域のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた重鎖の可変領域のアミノ酸配列は，元の重鎖の可変領域のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。特に，ＣＤＲのアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個であり，より好ましくは１～３個であり，更に好ましくは１～２個である。ＣＤＲのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個であり，より好ましくは１～３個であり，更に好ましくは１～２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。アミノ酸を付加させる場合，当該アミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～５個，より好ましくは１～３個，更に好ましくは１～２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた各ＣＤＲのそれぞれのアミノ酸配列は，元の各ＣＤＲのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の相同性を有し，より好ましくは９０％以上の相同性を示し，更に好ましくは，９５％以上の相同性を示す。
　上記の抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の可変領域への変異と，上記の抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域への変異とを組み合わせて，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と重鎖の可変領域の両方に変異を加えることもできる。
　上記の抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸への置換としては，例えば，芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ），脂肪族アミノ酸（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ），アミド型アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ），塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ），酸性アミノ酸（Ｇｌｕ，Ａｓｐ），水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ），分枝アミノ酸（Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ），側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ），非極性側鎖を有するアミノ酸（Ａｌａ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｒｏ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸どうしの置換が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は，蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち，保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり，種々の文献に記載されている（例えば，Bowieら, Science, 247:1306-1310(1990)を参照）。
　なお，抗ｈＴｆＲ抗体に変異を加えてＣ末端又はＮ末端にアミノ酸を付加した場合において，当該アミノ酸を介して抗ｈＴｆＲ抗体と筋肉において機能させるべき薬剤（生理活性蛋白質を含む）とを結合させたときは，当該アミノ酸は，結合体において抗ｈＴｆＲ抗体の一部を構成するものとする。
　上記の方法等によって選択されたｈＴｆＲに対して比較的高い親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体を産生する細胞を培養して得られる抗ｈＴｆＲ抗体，及び，高親和性を有する抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を発現させて得られる抗ｈＴｆＲ抗体は，そのアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を導入することにより所望の特性を有する抗体に改変させることもできる。抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列への変異の導入は，そのアミノ酸配列に対応する遺伝子に変異を加えることによって行われる。
　抗ｈＴｆＲ抗体は，その抗体の可変領域のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えることにより，抗体のｈＴｆＲに対する親和性を適宜調整することができる。例えば，抗体と抗原との親和性が高く，水性液中での解離定数が著しく低い場合，これを生体内に投与したときに，抗体が抗原と解離せず，その結果，機能上の不都合が生じる可能性がある。このような場合に，抗体の可変領域に変異を導入することにより，解離定数を，元の抗体の２～５倍，５～１０倍，１０～１００倍等と段階的に調整し，目的に合致した最も好ましい抗体を獲得し得る。逆に，当該変異の導入により，解離定数を，元の抗体の１／２～１／５倍，１／５～１／１０倍，１／１０～１／１００倍等と段階的に調整することもできる。
　抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列への置換，欠失，付加等の変異の導入は，例えば，抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子を鋳型にして，ＰＣＲ等の方法により，遺伝子の塩基配列の特定の部位に変異を導入するか，又はランダムに変異を導入することにより行うことができる。
　抗体とｈＴｆＲとの親和性の調整を目的とした，抗ｈＴｆＲ抗体のアミノ酸配列への変異の導入は，例えば，一本鎖抗体である抗ｈＴｆＲ抗体をコードする遺伝子をファージミドに組み込み，このファージミドを用いてカプシド表面上に一本鎖抗体を発現させたファージを作製し，変異原等を作用させることにより一本鎖抗体をコードする遺伝子上に変異を導入させながらファージを増殖させ，増殖させたファージから，所望の解離定数を有する一本鎖抗体を発現するファージを，上述の方法により選択するか，又は一定条件下で抗原カラムを用いて精製することにより，得ることができる。
　上記の高親和性抗体を産生する細胞を選択する方法により得られた，ｈＴｆＲに対して相対的に高い親和性を有する抗体は，ヒト以外の動物の抗体である場合，ヒト化抗体とすることができる。ヒト化抗体とは，抗原に対する特異性を維持しつつ，ヒト以外の動物の抗体の可変領域の一部（例えば，特にＣＤＲの全部又は一部）のアミノ酸配列によってヒト抗体の適切な領域を置き換えて（移植して）得られる抗体である。例えば，ヒト化抗体として，ヒト抗体を構成する免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を，他の哺乳動物のＣＤＲで置き換えた抗体が挙げられる。ヒト抗体に組み込まれるＣＤＲが由来する生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，ヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウス及びラットであり，更に好ましくはマウスである。ここで，非ヒト哺乳動物の抗体のＣＤＲのみならず，ＣＤＲの構造保持あるいは抗原との結合に関与しているＣＤＲ外の領域のアミノ酸配列により，アクセプターとなるヒト抗体の対応する箇所を置き換えることが，ドナー抗体の持つ本来の活性を再現するために必要である場合があることも周知である。ＣＤＲ外の領域は，フレームワーク領域（ＦＲ）ともいう。つまり，ヒト化抗体の作製は，ヒト抗体の可変領域のＣＤＲ（と場合によりその周辺のＦＲ）に代えて，非ヒト哺乳動物の抗体のＣＤＲ（と場合によりその周辺のＦＲ）を移植する作業を含む。
　以上のように，ヒト化抗体において，元のヒト抗体の可変領域に移植される非ヒト哺乳動物の抗体の領域は，一般に，ＣＤＲそれ自体，又はＣＤＲとその周辺のＦＲを含む。但し，ＣＤＲとともに移植されるＦＲも，ＣＤＲの構造保持あるいは抗原との結合に関与しており，実質的に抗体の相補性を決定する機能を有すると考えられることから，本発明において「ＣＤＲ」の語は，ヒト化抗体を作製する場合に，非ヒト哺乳動物の抗体からヒト化抗体に移植される，又は移植され得る領域をいう。即ち，一般にＦＲとされる領域であっても，それがＣＤＲの構造保持あるいは抗原との結合に関与しており，実質的に抗体の相補性を決定する機能を有していると考えられるものである限り，本発明においてはＣＤＲに含める。
　抗ｈＴｆＲ抗体が，ヒト化抗体又はヒト抗体である場合について，以下に更に詳しく説明する。ヒト抗体の軽鎖には，λ鎖とκ鎖がある。抗ｈＴｆＲ抗体を構成する軽鎖は，λ鎖とκ鎖のいずれであってもよい。また，ヒトの重鎖には，γ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖及びε鎖があり，それぞれ，ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＥに対応している。抗ｈＴｆＲ抗体を構成する重鎖は，γ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖及びε鎖のいずれであってもよいが，好ましくはγ鎖である。更に，ヒトの重鎖のγ鎖には，γ１鎖，γ２鎖，γ３鎖及びγ４鎖があり，それぞれ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に対応している。抗ｈＴｆＲ抗体を構成する重鎖がγ鎖である場合，そのγ鎖は，γ１鎖，γ２鎖，γ３鎖及びγ４鎖のいずれであってもよいが，好ましくは，γ１鎖又はγ４鎖である。抗ｈＴｆＲ抗体が，ヒト化抗体又はヒト抗体であり，且つＩｇＧである場合，ヒト抗体の軽鎖はλ鎖とκ鎖のいずれでもあってもよく，ヒト抗体の重鎖は，γ１鎖，γ２鎖，γ３鎖及びγ４鎖のいずれであってもよいが，好ましくは，γ１鎖又はγ４鎖である。例えば，好ましい抗ｈＴｆＲ抗体の一つの態様として，軽鎖がλ鎖であり重鎖がγ４鎖であるもの，軽鎖がλ鎖であり重鎖がγ１鎖であるものが挙げられる。
　本発明において，抗ｈＴｆＲ抗体と結合させて結合体とすべき薬剤（生理活性蛋白質を含む）は，筋肉において機能させるべき薬剤である。抗ｈＴｆＲ抗体とそのような薬剤とを結合させる方法としては，非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーを介して結合させる方法がある。非ペプチドリンカーとしては，ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール，エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体，ポリオキシエチル化ポリオール，ポリビニルアルコール，多糖類，デキストラン，ポリビニルエーテル，生分解性高分子，脂質重合体，キチン類，及びヒアルロン酸，又はこれらの誘導体，若しくはこれらを組み合わせたものを用いることができる。ペプチドリンカーは，ペプチド結合した１～５０個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖若しくはその誘導体であって，そのＮ末端とＣ末端が，それぞれ抗ｈＴｆＲ抗体及び薬剤のいずれかと共有結合を形成することにより，抗ｈＴｆＲ抗体と薬剤とを結合させるものである。
　非ペプチドリンカーとしてＰＥＧを用いて本発明の抗ｈＴｆＲ抗体と薬剤とを結合させたものは，特に，抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧ－薬剤という。抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧ－薬剤は，抗ｈＴｆＲ抗体とＰＥＧを結合させて抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧを作製し，次いで抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧと薬剤とを結合させることにより製造することができる。又は，抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧ－薬剤は，薬剤とＰＥＧとを結合させて薬剤－ＰＥＧを作製し，次いで薬剤－ＰＥＧと抗ｈＴｆＲ抗体を結合させることによっても製造することができる。ＰＥＧを抗ｈＴｆＲ抗体及び薬剤と結合させる際には，カーボネート，カルボニルイミダゾール，カルボン酸の活性エステル，アズラクトン，環状イミドチオン，イソシアネート，イソチオシアネート，イミデート，又はアルデヒド等の官能基で修飾されたＰＥＧが用いられる。これらＰＥＧに導入された官能基が，主に抗ｈＴｆＲ抗体及び薬剤分子内のアミノ基と反応することにより，ＰＥＧとｈＴｆＲ抗体及び薬剤が共有結合する。このとき用いられるＰＥＧの分子量及び形状に特に限定はないが，その平均分子量（ＭＷ）は，好ましくはＭＷ＝５００～６００００であり，より好ましくはＭＷ＝５００～２００００である。例えば，平均分子量が約３００，約５００，約１０００，約２０００，約４０００，約１００００，約２００００等であるＰＥＧは，非ペプチドリンカーとして好適に使用することができる。
　例えば，抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧは，抗ｈＴｆＲ抗体とアルデヒド基を官能基として有するポリエチレングリコール（ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ）とを，該抗体に対するＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤのモル比が１１，１２．５，１５，１１０，１２０等になるように混合し，これにＮａＣＮＢＨ３等の還元剤を添加して反応させることにより得られる。次いで，抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧを，ＮａＣＮＢＨ３等の還元剤の存在下で，薬剤と反応させることにより，抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧ－薬剤が得られる。逆に，先に薬剤とＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤとを結合させて薬剤－ＰＥＧを作製し，次いで薬剤－ＰＥＧと抗ｈＴｆＲ抗体を結合させることによっても，抗ｈＴｆＲ抗体－ＰＥＧ－薬剤を得ることができる。
　薬剤が生理活性蛋白質（目的蛋白質）である場合にあっては，抗ｈＴｆＲ抗体と目的蛋白質とは，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，リンカー配列を介して又は直接に，それぞれ目的蛋白質のＮ末端又はＣ末端をペプチド結合により結合させることもできる。このように抗ｈＴｆＲ抗体と目的蛋白質とを結合させてなる融合蛋白質は，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖又は軽鎖をコードするｃＤＮＡの３’末端側又は５’末端側に，直接又はリンカー配列をコードするＤＮＡ配列を挟んで，目的蛋白質をコードするｃＤＮＡがインフレームで配置されたＤＮＡ断片を，哺乳動物細胞用の発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を培養することにより，得ることができる。この哺乳動物細胞には，目的蛋白質をコードするＤＮＡ断片を重鎖と結合させる場合にあっては，抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用の発現ベクターも，同じホスト細胞に導入され，また，目的蛋白質をコードするＤＮＡ断片を軽鎖と結合させる場合にあっては，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用の発現ベクターも，同じホスト細胞に導入される。抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体である場合，抗ｈＴｆＲ抗体と目的蛋白質とを結合させた融合蛋白質は，目的蛋白質をコードするｃＤＮＡの５’末端側又は３’末端側に，直接，又はリンカー配列をコードするＤＮＡ配列を挟んで，１本鎖抗ｈＴｆＲ抗体をコードするｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を，（哺乳動物細胞，酵母等の真核生物又は大腸菌等の原核生物細胞用の）発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入したこれらの細胞中で発現させることにより，得ることができる。なお，融合蛋白質は結合体の一形態として理解されるべきものである。
　抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖のＣ末端側に目的蛋白質を結合させたタイプの融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，目的蛋白質が，この抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＣ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と目的蛋白質とは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
　抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端側に目的蛋白質を結合させたタイプの融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，目的蛋白質が，この抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の重鎖のＣ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖と目的蛋白質とは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
　抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖のＮ末端側に目的蛋白質を結合させたタイプの融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，目的蛋白質が，この抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＮ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と目的蛋白質とは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
　抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＮ末端側に目的蛋白質を結合させたタイプの融合蛋白質は，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，目的蛋白質が，この抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の重鎖のＮ末端側に結合したものである。ここで抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖と目的蛋白質とは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。
　このとき抗ｈＴｆＲ抗体と目的蛋白質との間に配置されるリンカー配列は，好ましくは１～５０個，より好ましくは１～１７個，更に好ましくは１～１０個，更により好ましくは１～５個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖であるが，抗ｈＴｆＲ抗体に結合させるべき目的蛋白質によって，リンカー配列を構成するアミノ酸の個数は，１個，２個，３個，１～１７個，１～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個等と適宜調整できる。そのようなリンカー配列は，これにより連結された抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲとの親和性を保持し，且つ当該リンカー配列により連結された目的蛋白質が，生理的条件下で当該蛋白質の生理活性を発揮できる限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものであり，例えば，グリシン又はセリンのいずれか１個のアミノ酸からなるもの，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４），又はこれらのアミノ酸配列が１～１０個，あるいは２～５個連続してなる１～５０個のアミノ酸からなる配列，２～１７個，２～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，又は２５～２９個のアミノ酸からなる配列等を有するものである。例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒを有するものはリンカー配列として好適に用いることができる。
　抗ｈＴｆＲ抗体がヒト化抗体又はヒト抗体である場合，抗ｈＴｆＲ抗体と目的蛋白質とは，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端（又はＣ末端）に，リンカー配列を介して又は直接に，目的蛋白質のＣ末端（又はＮ末端）を，それぞれペプチド結合により結合させることができる。目的蛋白質を抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＮ末端側（又はＣ末端側）に結合させる場合，抗ｈＴｆＲ抗体のγ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖又はε鎖のＮ末端（又はＣ末端）に，リンカー配列を介し又は直接に，目的蛋白質のＣ末端（又はＮ末端）が，ペプチド結合によりそれぞれ結合される。抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖のＮ末端側（又はＣ末端側）に目的蛋白質を結合させる場合，抗ｈＴｆＲ抗体のλ鎖又はκ鎖のＮ末端（又はＣ末端）に，リンカー配列を介し又は直接に，目的蛋白質のＣ末端（又はＮ末端）が，ペプチド結合によりそれぞれ結合される。但し，抗ｈＴｆＲ抗体が，Ｆａｂ領域からなるもの又はＦａｂ領域とヒンジ部の全部若しくは一部とからなるもの（Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ａｂ’））の場合，目的蛋白質は，Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２及びＦ（ａｂ’）を構成する重鎖又は軽鎖のＮ末端（又はＣ末端）に，リンカー配列を介して又は直接に，そのＣ末端（又はＮ末端）をペプチド結合によりそれぞれ結合させることができる。
　抗ｈＴｆＲ抗体と目的蛋白質との融合蛋白質において，抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体である場合，免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とは，一般にリンカー配列を介して，結合される。このとき，ｈＴｆＲに対する抗ｈＴｆＲ抗体の親和性が保持される限り，軽鎖由来のアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に重鎖由来のアミノ酸配列が結合してもよく，またこれとは逆に，重鎖由来のアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に軽鎖由来のアミノ酸配列が結合してもよい。一本鎖抗体がｓｃＦｖであっても同様である。
　ここで免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の間に配置されるリンカー配列は，好ましくは２～５０個，より好ましくは８～５０個，更に好ましくは１０～３０個，更により好ましくは１２～１８個又は１５～２５個，例えば１５個若しくは２５個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖である。そのようなリンカー配列は，これにより両鎖が連結されてなる抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲと親和性を保持し且つ当該抗体に結合した目的蛋白質が，生理的条件下でその生理活性を発揮できる限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンのみ又はグリシンとセリンから構成されるものであり，例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３），アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４），又はこれらのアミノ酸配列が２～１０個，あるいは２～５個連続してなる配列を有するものである。リンカー配列の好ましい一態様として，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号３）が３個連続してなる１５個のアミノ酸からなる配列が挙げられる。
　抗ｈＴｆＲ抗体が一本鎖抗体である場合におけるこのような融合蛋白質は，例えば，融合蛋白質をコードする塩基配列を有するＤＮＡ断片を組み込んだ発現ベクターで哺乳動物細胞等のホスト細胞を形質転換させ，このホスト細胞を培養することにより製造することができる。
　なお，本発明において，１つのペプチド鎖に複数のリンカー配列が含まれる場合，便宜上，各リンカー配列はＮ末端側から順に，第１のリンカー配列，第２のリンカー配列というように命名する。
　抗ｈＴｆＲ抗体と融合させるべき目的蛋白質には，その蛋白質が筋肉において機能させるべきものである限り，特に制限はない。目的蛋白質として好ましいものとして，例えば，筋肉に機能障害を生じるリソソーム病の原因遺伝子にコードされるリソソーム酵素がある。このようなリソソーム酵素には，ヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ），ヒトα－ガラクトシダーゼＡがあるが，これに限らず，α－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ），イズロン酸－２－スルファターゼ（ＩＤＳ），グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ），β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ（ＬＡＭＡＮ），β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ），サポシンＣ，アリルスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ），α－Ｌ－フコシダーゼ（ＦＵＣＡ１），アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ），β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ），ヘパランＮ－スルファターゼ（ＳＧＳＨ），α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ（ＮＡＧＬＵ），アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ（ＡＣ），アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１（ＰＰＴ－１），トリペプチジルペプチダーゼ－１（ＴＰＰ－１），ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１，ＣＬＮ２等も含まれる。
　以下，抗ｈＴｆＲ抗体とリソソーム酵素との融合蛋白質について，酸性α－グルコシダーゼとα－ガラクトシダーゼＡを例に採り詳述する。
　抗ｈＴｆＲ抗体とヒト酸性α－グルコシダーゼ（ｈＧＡＡ）との融合蛋白質は，これをポンぺ病患者に投与したとき，該患者の筋細胞中に取り込まれ，リソソームまで運ばれる。そうして，ポンぺ病患者の筋細胞のリソソーム内に蓄積したグリコーゲンを分解する。ポンぺ病の場合，主に骨格筋細胞からなる筋肉及び主に心筋細胞からなる筋肉がターゲットとなる。ポンぺ病では心筋及び骨格筋の機能障害が症状の中心であるが，この融合蛋白質を投与することにより，骨格筋細胞及び心筋細胞に蓄積したグリコーゲンが分解されるので，求心性心肥大，骨格筋侵襲による筋力低下，筋緊張低下等の諸症状を改善することができる。つまり，抗ｈＴｆＲ抗体とヒト酸性α－グルコシダーゼの融合蛋白質は，ポンぺ病における，骨格筋の機能障害又は／及び心臓障害の治療剤として使用できる。
　抗ｈＴｆＲ抗体とヒト酸性α－グルコシダーゼの融合蛋白質の好適な具体例として，ヒト酸性α-グルコシダーゼと抗ｈＴｆＲ抗体の融合蛋白質であって，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が配列番号２４のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖がそのＣ末端側で，リンカー配列Gly-Serを介して，ヒト酸性α-グルコシダーゼと結合しており，全体として配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するものである，融合蛋白質が挙げられる。
　また，ヒト酸性α-グルコシダーゼと抗ｈＴｆＲ抗体の融合蛋白質であって，配列番号２４のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，配列番号２５のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端に，リンカー配列Gly-Serを介して，配列番号１で示されるヒト酸性α-グルコシダーゼが結合したものとを含む，融合蛋白質がある。
　抗ｈＴｆＲ抗体とヒトα－ガラクトシダーゼＡ（ｈα－ＧａｌＡ）の融合蛋白質は，これをファブリー病患者に投与したとき，該患者の筋細胞中に取り込まれ，リソソームまで運ばれる。そうして，ファブリー病患者の筋細胞のリソソーム内に蓄積したトリヘキソシルセラミドを分解する。ファブリー病の場合，主に心筋細胞からなる筋肉がターゲットとなる。ファブリー病では心血管系の異常が認められるが，この融合蛋白質を投与することにより，心筋細胞に蓄積したトリヘキソシルセラミドが分解されるので，心室肥大等の心血管系異常の諸症状を改善することができる。この融合蛋白質は，主に心臓が障害される非典型的なタイプのファブリー病である心ファブリー病に，特に有効である。つまり，抗ｈＴｆＲ抗体とヒトα－ガラクトシダーゼＡの融合蛋白質は，ファブリー病，特に心ファブリー病における，心臓障害の治療剤として使用できる。
　抗ｈＴｆＲ抗体とヒトα－ガラクトシダーゼＡの融合蛋白質の好適な具体例として，ヒトα－ガラクトシダーゼＡと抗ｈＴｆＲ抗体の融合蛋白質であって，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が配列番号２４のアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖がそのＣ末端側で，リンカー配列Gly-Serを介して，ヒトα－ガラクトシダーゼＡと結合しており，全体として配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するものである，融合蛋白質が挙げられる。
　また，ヒトα－ガラクトシダーゼＡと抗ｈＴｆＲ抗体の融合蛋白質であって，配列番号２４のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，配列番号２５のアミノ酸配列を有する抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖のＣ末端に，リンカー配列Gly-Serを介して，配列番号２で示されるヒトα－ガラクトシダーゼＡが結合したものとを含む，融合蛋白質がある。
　本発明の抗ｈＴｆＲ抗体と薬剤とを結合させた結合体は，血中に投与して筋肉において薬効を発揮させるべき医薬組成物として使用することができる。かかる薬剤は，一般に点滴静脈注射等による静脈注射，皮下注射，筋肉注射により患者に投与されるが，投与経路には特に限定はない。
　本発明の抗ｈＴｆＲ抗体と薬剤とを結合させた結合体は，医薬組成物として，凍結乾燥品，又は水性液剤等の形態で医療機関に供給することができる。水性液剤の場合，医薬組成物を，安定化剤，緩衝剤，等張化剤を含有する溶液に予め溶解したものを，バイアル又は注射器に封入した製剤として供給できる。注射器に封入された製剤は，一般にプレフィルドシリンジ製剤と呼称される。プレフィルドシリンジ製剤とすることにより，患者自身による薬剤の投与を簡易にすることができる。
　水性液剤として供給される場合，水性液剤に含有される結合体の濃度は，用法用量によって適宜調整されるべきものであるが，例えば１～４ｍｇ／ｍＬである。また，水性液剤に含有される安定化剤は，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，非イオン性界面活性剤が好適に使用できる。このような非イオン性界面活性剤としては，ポリソルベート，ポロキサマー等を単独で又はこれらを組合せて使用できる。ポリソルベートとしてはポリソルベート２０，ポリソルベート８０が，ポロキサマーとしてはポロキサマー１８８（ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール）が特に好適である。また，水性液剤に含有される非イオン性界面活性剤の濃度は，０．０１～１ｍｇ／ｍＬであることが好ましく，０．０１～０．５ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく，０．１～０．５ｍｇ／ｍＬであることが更に好ましい。安定化剤として，ヒスチジン，アルギニン，メチオニン，グリシン等のアミノ酸を使用することもできる。安定化剤として使用する場合の，水性液剤に含有されるアミノ酸の濃度は，０．１～４０ｍｇ／ｍＬであることが好ましく，０．２～５ｍｇ／ｍＬであることがより好ましく，０．５～４ｍｇ／ｍＬであることが更に好ましい。水性液剤に含有される緩衝剤は，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，リン酸塩緩衝剤が好ましく，特にリン酸ナトリウム緩衝剤が好ましい。緩衝剤としてリン酸ナトリウム緩衝剤を使用する場合の，リン酸ナトリウムの濃度は，好ましくは０．０１～０．０４Ｍである。また，緩衝剤によって調整される水性液剤のｐＨは，好ましくは５．５～７．２である。水性液剤に含有される等張化剤は，薬剤学的に許容し得るものである限り特に限定はないが，塩化ナトリウム，マンニトールを単独で又は組み合わせて等張化剤として好適に使用できる。
　以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔実施例１〕ｈＴｆＲ発現用ベクターの構築
　ヒト脾臓Quick Clone cDNA（Clontech社）を鋳型として，プライマーｈＴｆＲ５’（配列番号７）及びプライマーｈＴｆＲ３’（配列番号８）を用いて，ＰＣＲによりヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）をコードする遺伝子断片を増幅させた。増幅させたｈＴｆＲをコードする遺伝子断片を，MluIとNotIで消化し，pCI-neoベクター（Promega社）のMluIとNotI間に挿入した。得られたベクターを，pCI-neo(hTfR)と名付けた。次いで，このベクターを，MluIとNotIで消化して，ｈＴｆＲをコードする遺伝子断片を切り出し，国際公開公報（ＷＯ２０１２／０６３７９９）に記載された発現ベクターであるpE-mIRES-GS-puroのMluIとNotIの間に組み込むことにより，ｈＴｆＲ発現用ベクターであるpE-mIRES-GS-puro(hTfR)を構築した。
〔実施例２〕組換えｈＴｆＲの作製
　エレクトロポレーション法により，CHO-K1細胞にpE-mIRES-GS-puro(hTfR)を導入した後，メチオニンスルホキシミン（MSX）及びピューロマイシンを含むCD OptiCHOTM培地（Invitrogen社）を用いて細胞の選択培養を行い，組換えｈＴｆＲ発現細胞を得た。この組換えｈＴｆＲ発現細胞を培養して，組換えｈＴｆＲを調製した。
〔実施例３〕組換えｈＴｆＲを用いたマウスの免疫
　実施例２で調製した組換えｈＴｆＲを抗原として用いてマウスを免疫した。免疫は，マウスに抗原を静脈内投与又は腹腔内投与して行った。
〔実施例４〕ハイブリドーマの作製
　最後に抗原を投与した日の約1週間後にマウスの脾臓を摘出してホモジナイズし，脾細胞を分離した。得られた脾細胞をマウスミエローマ細胞株（Ｐ３．Ｘ６３．Ａｇ８．６５３）とポリエチレングリコール法を用いて細胞融合させた。細胞融合終了後，(1 X)HATサプリメント（Life Technologies社）及び10% Ultra low IgGウシ胎児血清（Life Technologies社）を含むRPMI1640培地に細胞を懸濁させ，細胞懸濁液を96ウェルプレート２０枚に200 μL／ウェルずつ分注した。炭酸ガス培養器（37℃，5% CO2）で細胞を10日間培養した後，各ウェルを顕微鏡下で観察し，単一のコロニーが存在するウェルを選択した。各ウェルの細胞がほぼコンフルエントになった時点で培養上清を回収し，これをハイブリドーマの培養上清として，以下のスクリーニングに供した。
〔実施例５〕高親和性抗体産生細胞株のスクリーニング
　組換えｈＴｆＲ溶液（Sino Biologics社）を50 mM炭酸ナトリウム緩衝液（pH 9.5～9.6）で希釈して5 μg/mLの濃度に調整し，これを固相溶液とした。固相溶液を，Nunc MaxiSorpTM flat-bottom 96ウェルプレート（基材：ポリスチレン， Nunc社）の各ウェルに50 μLずつ添加した後，プレートを室温で1時間静置し，組換えｈＴｆＲをプレートに吸着させて固定した。固相溶液を捨て，各ウェルを250 μLの洗浄液（PBS-T: 0.05% Tween20を含有するPBS）で3回洗浄した後，各ウェルにブロッキング液（1% BSAを含有するPBS）を200 μLずつ添加し，プレートを室温で1時間静置した。
　ブロッキング液を捨て，各ウェルを250 μLのPBS-Tで3回洗浄した後，各ウェルにハイブリドーマの培養上清を50 μLずつ添加し，プレートを室温で1時間静置し，培養上清に含まれるマウス抗ｈＴｆＲ抗体を組換えｈＴｆＲに結合させた。このとき，コントロールとして，マウス抗ｈＴｆＲ抗体を産生しないハイブリドーマの培養上清をウェルに50 μL添加したものを置いた。また，各培養上清を加えたウェルの横のウェルに，ハイブリドーマの培養用培地を50 μL添加したものを置き，これをモックウェルとした。測定はｎ＝２で実施した。次いで，溶液を捨て，各ウェルを250 μLのPBS-Tで3回洗浄した。
　上記の各ウェルに100 μLのHRP標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体溶液（プロメガ社）を添加し，プレートを室温で1分間静置した。次いで，溶液を捨て，各ウェルを250 μLのPBS-Tで3回洗浄した。次いで，各ウェルに50 μLの発色用基質液TMB Stabilized Substrate for Horseradish Peroxidase（プロメガ社）を添加し，室温で10～20分間静置した。次いで，各ウェルに100 μLの停止液（2 N 硫酸）を添加した後，プレートリーダーを用いて各ウェルの450 nmにおける吸光度を測定した。各培養上清及びコントロールの2つのウェルの平均値をとり，これらの平均値から，各培養上清及びコントロール毎に置いた2つのモックウェルの平均値をそれぞれ減じたものを測定値とした。
　高い測定値を示したウェルに添加した培養上清に対応する14種類のハイブリドーマ細胞を，ｈＴｆＲに対して高親和性を示す抗体（高親和性抗ｈＴｆＲ抗体）を産生する細胞株（高親和性抗体産生細胞株）として選択した。これら14種の細胞株を，クローン１株～クローン１４株と番号付けた。また，クローン１株～クローン１４株が産生する抗ｈＴｆＲ抗体を，それぞれ抗ｈＴｆＲ抗体番号１～抗ｈＴｆＲ抗体番号１４とした。
〔実施例６〕高親和性抗ｈＴｆＲ抗体の可変領域のアミノ酸配列の解析
　実施例５で選択したクローン１株～クローン１４株の中から更にクローン株３を選択した。クローン株３のｃＤＮＡを調製し，このｃＤＮＡを鋳型として抗体の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を増幅させた。増幅させた遺伝子の塩基配列を翻訳し，この細胞株の産生する抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖及び重鎖の可変領域のアミノ酸配列を決定した。
　抗ｈＴｆＲ抗体番号３は，軽鎖の可変領域に配列番号９で示されるアミノ酸配列と，重鎖の可変領域に配列番号１０で示されるアミノ酸配列とを含むものであった。また，その軽鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１１又は１２，ＣＤＲ２に配列番号１３又は１４，及びＣＤＲ３に配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含んでなり，その重鎖の可変領域は，ＣＤＲ１に配列番号１６又は１７，ＣＤＲ２に配列番号１８又は１９，及びＣＤＲ３に配列番号２０又は２１で示されるアミノ酸配列を含んでなるものであった。但し，ＣＤＲは上記のアミノ酸配列に限られず，これらのアミノ酸配列を含む領域，これらのアミノ酸配列の一部を含む連続した３個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列もＣＤＲとすることができると考えられた。
〔実施例７〕抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性の測定
　抗ｈＴｆＲ抗体とヒトＴｆＲ及びサルＴｆＲへの親和性の測定は，バイオレイヤー干渉法（BioLayer Interferometry：BLI）を用いた生体分子相互作用解析システムであるOctetRED96（ForteBio社, a division of Pall Corporation）を用いて実施した。バイオレイヤー干渉法の基本原理について，簡単に説明する。センサーチップ表面に固定された生体分子の層（レイヤー）に特定波長の光を投射したとき，生体分子のレイヤーと内部の参照となるレイヤーの二つの表面から光が反射され，光の干渉波が生じる。測定試料中の分子がセンサーチップ表面の生体分子に結合することにより，センサー先端のレイヤーの厚みが増加し，干渉波に波長シフトが生じる。この波長シフトの変化を測定することにより，センサーチップ表面に固定された生体分子に結合する分子数の定量及び速度論的解析をリアルタイムで行うことができる。測定は，概ねOctetRED96に添付の操作マニュアルに従って実施した。ヒトＴｆＲとしては，Ｎ末端にヒスチジンタグが付加した，配列番号１に示されるアミノ酸配列の中でＮ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの，ｈＴｆＲの細胞外領域のアミノ酸配列を有する組換えヒトＴｆＲ（ｒヒトＴｆＲ：Sino Biological社）を用いた。サルＴｆＲとしては，Ｎ末端にヒスチジンタグが付加した，配列番号２に示されるアミノ酸配列の中でＮ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの，カニクイザルのＴｆＲの細胞外領域のアミノ酸配列を有する組換えサルＴｆＲ（ｒサルＴｆＲ：Sino Biological社）を用いた。
　実施例６で選択したクローン３株を，細胞濃度が約2 Ｘ 105個/mLとなるように，(1X)HATサプリメント（Life Technologies社）及び10% Ultra low IgGウシ胎児血清（Life Technologies社）を含むRPMI1640培地で希釈し，1 Lの三角フラスコに200 mLの細胞懸濁液を加え，37℃で,5% CO2と95% 空気からなる湿潤環境で約70 rpmの撹拌速度で6～7日間培養した。培養上清を遠心操作により回収し，0.22 μmフィルター（Millipore社）でろ過して，培養上清とした。回収した培養上清を，予め150 mM NaClを含むカラム体積３倍容の20 mM Tris緩衝液（pH8.0）で平衡化しておいたProtein Gカラム（カラム体積：1 mL，GEヘルスケア社）に負荷した。次いで，カラム体積の5倍容の同緩衝液によりカラムを洗浄した後，150 mM NaClを含むカラム体積の4倍容の50 mMグリシン緩衝液（pH 2.8）で，吸着した抗体を溶出させ，溶出画分を採取した。溶出画分に1 M Tris緩衝液（pH 8.0）を添加してpH 7.0に調整した。これを抗ｈＴｆＲ抗体番号３の精製品としてとして以下の実験に用いた。
　精製した抗ｈＴｆＲ抗体番号３を，それぞれHBS-P+（150 mM NaCl,50 μM EDTA及び0.05% Surfactant P20を含む10mM HEPES）で2段階希釈し，0.78125～50 nM（0.117～7.5 μg/mL）の7段階の濃度の抗体溶液を調製した。この抗体溶液をサンプル溶液とした。ｒヒトＴｆＲとｒサルＴｆＲとを，それぞれHBS-P+で希釈し，25 μg/mLの溶液を調製し，それぞれｒヒトＴｆＲ－ＥＣＤ（Histag）溶液及びｒサルＴｆＲ－ＥＣＤ（Histag）溶液とした。
　上記２段階希釈して調製したサンプル溶液を，96 well plate, black（greiner bio-one社）に200 μL/ウェルずつ添加した。また，上記調製したｒヒトＴｆＲ－ＥＣＤ（Histag）溶液及びｒサルＴｆＲ－ＥＣＤ（Histag）溶液を，所定のウェルにそれぞれ200 μL/ウェルずつ添加した。ベースライン，解離用及び洗浄用のウェルには，HBS-P+を200 μL/ウェルずつ添加した。再生用のウェルには，10 mM Glycine-HCl（pH 1.7）を200 μL/ウェルずつ添加した。活性化用のウェルには，0.5 mM NiCl2溶液を200 μL/ウェルずつ添加した。このプレートと，バイオセンサー（Biosensor/Ni-NTA：ForteBio社，a division of Pall Corporation）を，OctetRED96の所定の位置に設置した。
　OctetRED96を下記の表１に示す条件で作動させてデータを取得後，OctetRED96付属の解析ソフトウェアを用いて，結合反応曲線を１：１結合モデルあるいは２：１結合モデルにフィッティングし，抗ｈＴｆＲ抗体と，ｒヒトＴｆＲ及びｒサルＴｆＲに対する会合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）を測定し，解離定数（ＫＤ）を算出した。なお，測定は25～30℃の温度下で実施した。
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　抗ｈＴｆＲ抗体番号３のヒトＴｆＲとの解離定数（ＫＤ）は１Ｘ１０－１２Ｍ以下であり，サルＴｆＲとの解離定数（ＫＤ）は１Ｘ１０－１２Ｍ以下であった。これらの結果は，抗ｈＴｆＲ抗体番号３が，ヒトＴｆＲのみならずサルＴｆＲとも高い親和性を有する抗体であることを示すものである。
〔実施例８〕ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の作製
　抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖及び重鎖の可変領域に含まれるアミノ酸配列のヒト化を試みた。そして，配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するヒト化された軽鎖の可変領域と，配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するヒト化された重鎖の可変領域を得た。更に，軽鎖については，可変領域に配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有する，配列番号２４で示されるアミノ酸配列の軽鎖を得た。また，重鎖については，可変領域に配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有する，配列番号２５で示されるアミノ酸配列の重鎖を得た。なお，配列番号２５で示されるアミノ酸配列の重鎖はＩｇＧ４タイプのものである。こうして得られたヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲとの解離定数（ＫＤ）を実施例７に記載の方法で測定した。その結果，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のヒトＴｆＲとの解離定数（ＫＤ）は１Ｘ１０－１２Ｍ以下であり，サルＴｆＲとの解離定数（ＫＤ）は約１Ｘ１０－９Ｍであった。これらの結果は，得られた抗ｈＴｆＲ抗体番号３のヒト化抗体が，ヒトＴｆＲのみならずサルＴｆＲとも高い親和性を有する抗体であることを示すものである。
〔実施例９：抗ＴｆＲ抗体とｈＧＡＡの融合蛋白質をコードする遺伝子の構築〕
　配列番号２４で示されるアミノ酸配列の軽鎖をコードするDNA断片（配列番号２６）を合成した。このDNA断片は，5’側には，5’端から順にMluI配列と，分泌シグナルとして機能するリーダーペプチドをコードする配列とを有し，3’側にはNotI配列を有する。
　また，配列番号２５で示されるアミノ酸配列の重鎖のＣ末端側に，Ｇｌｙ－Ｓｅｒからなるリンカー配列を介して，配列番号１で示されるアミノ酸配列のヒト酸性α-グルコシダーゼが結合した，全体として配列番号２７で示されるアミノ酸配列の蛋白質をコードするＤＮＡ断片（配列番号２８）を合成した。このＤＮＡ断片は，5’側には，5’端から順にMluI配列と，分泌シグナルとして機能するリーダーペプチドをコードする配列とを有し，3’側にはNotI配列を有する。
〔実施例１０：抗ＴｆＲ抗体とｈＧＡＡとの融合蛋白質発現ベクターの構築〕
　pEF/myc/nucベクター（インビトロジェン社）を，KpnIとNcoIで消化し，EF-1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を切り出し，これをT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。pCI-neo（インビトロジェン社）を，BglII及びEcoRIで消化して，CMVのエンハンサー／プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に，T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のEF-1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域を挿入して，pE-neoベクターを構築した。pE-neoベクターを，SfiI及びBstXIで消化し，ネオマイシン耐性遺伝子を含む約1 kbpの領域を切除した。pcDNA3.1/Hygro(+)（インビトロジェン社）を鋳型にしてプライマーＨｙｇ－Ｓｆｉ５’（配列番号３０）及びプライマーＨｙｇ－ＢｓｔＸ３’（配列番号３１）を用いて，ＰＣＲ反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した。増幅したハイグロマイシン遺伝子を，SfiI及びBstXIで消化し，上記のネオマイシン耐性遺伝子を切除したpE-neoベクターに挿入して，pE-hygrベクターを構築した。
　pE-hygrベクター及びpE-neoベクターをそれぞれMluIとNotIで消化した。実施例９で合成した抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖をコードするDNA断片（配列番号２６）と，抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とヒト酸性α-グルコシダーゼとを結合させた蛋白質をコードするDNA断片（配列番号２８）をMluIとNotIで消化し，それぞれpE-hygrベクターとpE-neoベクターのMluI-NotI間に挿入した。得られたベクターを，それぞれヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖発現用ベクターのpE-hygr(LC)と抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖とヒト酸性α-グルコシダーゼとを結合させた蛋白質発現用ベクターのpE-neo(HC-hGAA)とした。
〔実施例１１：ｈＧＡＡ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質発現用細胞の作製〕
　CHO細胞（CHO-K1：American Type Culture Collectionから入手）を，下記の方法により，GenePulser（Bio-Rad社）を用いて，実施例１０で構築したpE-hygr(LC)及びpE-neo(HC-hGAA)で形質転換した。細胞の形質転換は概ね以下の方法で行った。5 X 105個のCHO-K1細胞をCD OptiCHOTM培地（Life Technologies社）を添加した3.5 cm培養ディッシュに播種し，37℃, 5% CO2の条件下で一晩培養した。培地をOpti-MEMTM I培地（Life Technologies社）に交換し，細胞を5 X 106細胞/mLの密度となるように懸濁した。細胞懸濁液100 μLを採取し，これにOpti-MEMTM Ｉ培地で100 μg/mLに希釈したpE-hygr(LC1)及びpE-neo(HC1)プラスミドDNA溶液を5 μLずつ添加した。GenePulser（Bio-Rad社）を用いて，エレクトロポレーションを実施し，細胞にプラスミドを導入した。細胞を，37℃, 5% CO2の条件下で一晩培養した後，0.5 mg/mLのハイグロマイシン及び0.8 mg/mLのG418を添加したCD OptiCHOTM培地で選択培養した。
　次いで，限界希釈法により，1ウェルあたり1個以下の細胞が播種されるように，96ウェルプレート上に選択培養で選択された細胞を播種し，各細胞が単クローンコロニーを形成するように約10日間培養した。単クローンコロニーが形成されたウェルの培養上清を採取し，培養上清中のヒト化抗体含量をＥＬＩＳＡ法にて調べ，ｈＧＡＡ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質高発現細胞株を選択した。
　このときのＥＬＩＳＡ法は概ね以下の方法で実施した。96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc社）の各ウェルに，ヤギ抗ヒトIgGポリクローナル抗体溶液を0.05 M炭酸水素塩緩衝液（pH 9.6）で4 μg/mLに希釈したものを100 μLずつ加え，室温で少なくとも1時間静置して抗体をプレートに吸着させた。次いで，PBS-Tで各ウェルを3回洗浄後，Starting Block (PBS) Blocking Buffer（Thermo Fisher Scientific社）を各ウェルに200 μLずつ加えてプレートを室温で30分静置した。各ウェルをPBS-Tで3回洗浄した後，PBS-BT（PBSに0.5% BSA及び0.05% Tween20を添加したもの）で適当な濃度に希釈した培養上清又はヒトＩｇＧ標準品を，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。プレートをPBS-Tで3回洗浄した後，PBS-BTで希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧポリクロ－ナル抗体溶液を，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置した。PBS-Tで各ウェルを3回洗浄後，リン酸－クエン酸緩衝液（pH 5.0）を含む0.4 mg/mL o-フェニレンジアミンを100 μLずつ各ウェルに加え，室温で8～20分間静置した。次いで，1 mol/L 硫酸を100 μLずつ各ウェルに加えて反応を停止させ，96ウェルプレートリーダーを用いて，各ウェルの490 nmにおける吸光度を測定した。高い測定値を示したウェルに対応する細胞を，ｈＧＡＡ－ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体融合蛋白質高発現細胞株とした。この細胞株が発現するｈＧＡＡとヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の融合蛋白質を，hGAA-抗hTfR抗体とした。
〔実施例１２〕hGAA-抗hTfR抗体の製造
　hGAA-抗hTfR抗体を，以下の方法で製造した。実施例１１で得たhGAA-抗hTfR抗体高発現株を，細胞濃度が約2 X 105個/mLとなるように，CD OptiCHOTM培地で希釈し，1 Lの三角フラスコに200 mLの細胞懸濁液を加え，37℃で，5% CO2と95% 空気からなる湿潤環境で約70 rpmの撹拌速度で6～7日間培養した。培養上清を遠心操作により回収し，0.22 μmフィルター（Millipore社）でろ過して，培養上清とした。回収した培養上清に，カラム体積の5倍容の150 mL NaClを含む20 mM Tris緩衝液（pH 8.0）を添加し，カラム体積の3倍容の150 mM NaClを含む20 mM Tris緩衝液（pH 8.0）で予め平衡化しておいたProtein Aカラム（カラム体積：1 mL，Bio-Rad社）に負荷した。次いで，カラム体積の5倍容の同緩衝液を供給してカラムを洗浄した後，150 mM NaClを含むカラム体積の4倍容の50 mM グリシン緩衝液（pH 2.8）で，吸着したhGAA－抗hTfR抗体を溶出させた。このhGAA－抗hTfR抗体を含む溶出液のpHを1 M Tris緩衝液（pH 8.0）を添加してpH 7.0に調整し，次いでアミコンウルトラ３０ｋＤａ膜（Millipore社）を用いてPBSにバッファー交換した。これをhGAA-抗hTfR抗体の精製品とした。
〔実施例１３〕ヒト骨格筋を用いた細胞内へのhGAAの取り込み量の測定
　ヒト骨格筋細胞（PromoCell社）をSkeletal Muscle Cell Growth Medium(Ready-to-use) （PromoCell社）にて8.0 X 104個/mLに希釈し，250μLずつCellnestTM（富士フイルム）でコートした96穴プレートの各ウェルに播種する。37℃, 5% CO2下で3日間培養後，培地を骨格筋細胞分化誘導用の培地Skeletal Muscle Cell Differentiation Medium (Ready-to-use) （PromoCell社）に交換する。そして，2日毎に分化誘導用培地で培地交換を行い，6日間分化誘導する。培地を除去した後，分化誘導用培地を用いて調製したhGAA-抗hTfR抗体ならびにhGAAの段階希釈液（0.005～20.0 μg/mL）を，被検物質として，それぞれ100 μLずつ各ウェルに添加し，37℃，5% CO2下で更に20時間培養する。
　培養後，培地を除き，300 μLのPBSで各ウェルを3回洗浄する。M-PERTM（with 0.5% Protease Inhibitor Cocktail，Thermo Fisher Scientific社）を100 μLずつ各ウェルに添加し，プレートシェーカーにて室温で25分間振とうして細胞抽出液を調製する。各ウェルから20 μLの抽出液を分取し，BCA protein assay kit（Pierce社）を用いて抽出液中に含まれる蛋白質を定量する。また，20 μLの抽出液を分取後の各ウェルに，PBS-BTを80 μLずつ添加し，プレートシェーカーにて室温で10分間振とうし，ELISA測定に供する細胞抽出液を調製する。
　被検物質を無添加のウェルの細胞から同様にして細胞抽出液を調製し，これをプール抽出液とする。hGAA-抗hTfR抗体ならびに市販の医療用hGAAを，プール抽出液で段階希釈し，検量線試料を調製する。被検物質は以下のELISA法により定量できる。
　ウサギをhGAAで免疫して得たウサギ抗hGAAポリクローナル抗体を，20 mmol/L 炭酸ナトリウム緩衝液(pH 9.0)で5 μg/mLに希釈し，100 μLずつ96穴プレート(MaxisorpTM)の各ウェルに添加し，プレートシェーカーにて室温で1時間振とうする。抗体溶液を除き，ブロッキング緩衝液（1% BSAを含むPBS）を300 μLずつ各ウェルに添加し，室温で1時間静置する。次いで，300 μLのPBS-Tで各ウェルを3回洗浄する。次いで，検量線試料ならびに各細胞抽出液をそれぞれ100 μLずつ各ウェルに添加し，プレートシェーカーにて室温で1時間振とうする。300 μLの洗浄液で各ウェルを3回洗浄後，PBS-BTで調製したBiotin標識化ウサギ抗hGAA抗体（自社調製）を100 μLずつ各ウェルに添加し，プレートシェーカーにて室温で1時間振とうする。300 μLの洗浄液で各ウェルを3回洗浄後，0.5% BSA/PBS(with 0.05% Tween20)で希釈したNeutrAvidin-HRP conjugate(Pierce社)を100 μLずつ各ウェルに添加し，プレートシェーカーにて室温で15分間振とうし，次いで300 μLの洗浄液で各ウェルを3回洗浄する。TMB Microwell Peroxidase Substrate (2-Component System，KPL 社)のTMB Peroxidase Substrateと TMB Peroxidase Substrate Solution Bの等量混合液を100 μLずつ各ウェルに添加して室温で発色反応させる。十分な発色が得られた後，100 μLずつ1 mol/Lリン酸を各ウェルに添加し，反応を停止させる。マイクロプレートリーダーで波長450 nmにおける吸光度を測定し，SoftMax Pro（Molecular Device社）を用いて検量線を作製し，これに各被検物質の測定値を内挿して，各被検物質の濃度を算出する。各細胞抽出液の被検物質濃度を蛋白濃度で除し，被検物質の細胞内取り込み量(ng/mg 蛋白質)とする。
〔実施例１４〕CD71-KI/GAA-KOマウスの作製
　酸性α-グルコシダーゼ遺伝子（GAA遺伝子）をノックアウトし，且つヒトトランスフェリン受容体遺伝子（CD71遺伝子）をノックインしたCD71-KI/GAA-KOマウスを，一般的な遺伝子工学的手法により作製した。作成方法は概ね以下のとおりである。マウスGAA遺伝子のエクソン6に存在するBamHI部位に終止コドンとネオマイシン耐性遺伝子を挿入することにより，マウスGAA遺伝子をノックアウトすることのできるターゲティングベクター（GAAノックアウトベクター）を構築した。このターゲティングベクターは，配列番号３２で示される塩基配列を含む。ターゲティングベクターを線状化した後，C57BL/6系統のES細胞にエレクトロポレーション法により導入した。導入後，ネオマイシン薬剤耐性を指標とした選択培養を行い，薬剤耐性ESクローンを取得した。得られた薬剤耐性ESクローンをゲノムPCRおよびサザンブロットによってスクリーニングし，特異的な相同組換えが成立したクローン（相同組換えESクローン）を選別した。相同組換えESクローンとICR系統の8細胞期胚を用い，アグリゲーション法でキメラ胚を作製した。レシピエントマウスにキメラ胚を移植してキメラマウスを出産させた。
　キメラマウスを自然交配させてGAA-KOヘテロマウスを作製し，さらに交配を重ねてGAA-KOホモマウスを作製した。CD71-KIヘテロマウスとGAA-KOホモマウスを交配させ，得られたマウスをスクリーニングしてCD71-KI/GAA-KOマウスを作製した。なお，CD71-KIヘテロマウスは，Sonoda H., et al. Molecular Therapy 26. 1366-74 (2018)に記載の方法に準じて作製した。
〔実施例１５〕マウスを用いた細胞内へのhGAAの取り込み量の測定
　実施例１２で作製したhGAA-抗hTfR抗体の精製品及び市販の医療用hGAAを，それぞれ生理食塩水を用いて4 mg/mLの溶液とした。これらの溶液を用いて，CD71-KI/GAA-KOマウスに，hGAA-抗hTfR抗体とhGAAをそれぞれ尾静脈より投与した。hGAA-抗hTfR抗体とhGAAの何れも１回当たりの投与量を20mgとして，隔週で計4回投与した。最後の投与の２週間後に，マウスを放血死させて，心臓，横隔膜，ヒラメ筋，前脛骨筋，及び大腿四頭筋を採取した。採取した組織は生理食塩水で洗浄した。これら筋組織に含まれるグリコーゲン濃度（mg/g湿組織重量）を実施例１６に記載の方法で測定した。hGAA-抗hTfR抗体を投与した群をhGAA-抗hTfR抗体投与群，市販の医療用hGAAを投与した群をhGAA投与群とした。また，等量の生理食塩水を投与したCD71-KI/GAA-KOマウスをKOコントロール群とした。更に，等量の生理食塩水を投与した野生型マウスを野生型コントロール群とした。各群ともマウス5匹とした。
　各筋組織に含まれるグリコーゲン量の測定結果を図１～５に示す。図１は心臓，図２は横隔膜，図３はヒラメ筋，図４は前脛骨筋，図５は大腿四頭筋の測定結果をそれぞれ示す。各筋組織に含まれるグリコーゲン量は，hGAA投与群の各組織に含まれるグリコーゲン量を100%としたとき，hGAA-抗hTfR抗体投与群では，心臓で約7.5%，横隔膜で約6.5%，ヒラメ筋で約13.5%，前脛骨筋で約13.5%，大腿四頭筋で約6%にまで低下した。これらの結果は，市販の医療用hGAAと比較してhGAA-抗hTfR抗体が筋組織に蓄積したグリコーゲン量を効率よく分解できることを示すものである。ポンぺ病（糖原病II型）は，遺伝的に酸性α－グルコシダーゼ活性のほとんど又は全部を欠損することにより，細胞のリソソームにグリコーゲンが大量に蓄積する疾患であり，心筋及び骨格筋の機能障害が症状の中心となる。すなわち，hGAA-抗hTfR抗体はhGAAと比較してポンぺ病患者の心筋及び骨格筋に蓄積したグリコーゲンを効率よく分解することができるので，ポンペ病患者の酵素補充量法における治療剤として有望である。
〔実施例１６〕組織中に含まれるグリコーゲン量の測定法
　ビーズ破砕機（BEADS CRUSHER μT-12，タイテック社）にセットしたホルダーに，実施例１５で得た組織と15個の直径0.5 mmのSUSビーズを入れ，更に注射用水を加えた。ビーズ破砕機を作動させて組織を破砕した。得られた組織破砕物を15,000 rpm，10分間，4℃で遠心し，上清を検体溶液として採取し，測定時まで凍結保存した。
　グリコーゲン濃度の測定は，Glycogen Colorimetric/Fluorometric Assay Kit（Biovision社）を用い，概ね以下の手順で測定した。検量線試料（Glycogen Standard）を純水で段階的に希釈し，この希釈液をF96 Black plate（Nunc社）のウェルに50 μLずつ添加した。また，検体溶液を同様にウェルに50 μLずつ添加した。このとき，各検量線試料希釈液及び検体溶液を，それぞれ2ウェルに添加した。Hydrolysis Enzyme Mixを検量線試料を添加した2ウェル及び検体を添加した1ウェルに1 μLずつ添加混合し，室温にて30分間反応させ，グリコ―ゲンをグルコースに分解させた。更に，全てのウェルに蛍光試薬を含有するReaction Mixを50 μLずつ添加し，遮光下室温で30分間反応させた。蛍光プレートリーダー（SPECTRA max GEMINI XPS，モレキュラーデバイス社）を用いて蛍光強度を測定し(Ex/Em = 535/587 nm) ，検量線試料の理論濃度 (X) とシグナル平均値 (Y) からLinear fit curveにより作成した検量線より，Hydrolysis Enzyme Mixを添加した検体溶液及び添加していない検体溶液のグルコース濃度を算出した。次いで，Hydrolysis Enzyme Mixを添加した検体溶液のグルコース濃度測定値から添加していない検体溶液のグルコース濃度を減じ，この値を検体溶液のグリコーゲン濃度とした。検体溶液の調製に用いた組織の重量と，求めたグリコーゲン濃度から，各組織のグリコーゲン濃度(mg/g湿組織重量)を求めた。
　本発明によれば，筋肉で機能させるべき薬剤であって，そのままでは筋肉へ十分に取り込まれない薬剤を，抗トランスフェリン受容体抗体と結合させた結合体とすることにより，筋肉に効率よく取り込まれるようにすることができるので，筋肉の疾患の新たな治療薬の開発に応用できる。また，筋肉で機能させるために大量に投与する必要のある蛋白質，例えばｈＧＡＡを，本発明を応用した融合蛋白質とすることによって，その投与量を大幅に減ずることができるので，医療経済上のメリットもある。
配列番号３：リンカー例１のアミノ酸配列
配列番号４：リンカー例２のアミノ酸配列
配列番号７：プライマーｈＴｆＲ５’，合成配列
配列番号８：プライマーｈＴｆＲ３’，合成配列
配列番号９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１２：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１３：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１４：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１５：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列
配列番号１６：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１７：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１８：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１９：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号２０：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号２１：マウス抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号２２：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２３：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２４：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２５：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖のアミノ酸配列
配列番号２６：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖とhGAAの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号２８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖とhGAAの融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２９：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体番号３の重鎖とhα-GalAの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号３０：プライマーＨｙｇ－Ｓｆｉ５’，合成配列
配列番号３１：プライマーＨｙｇ－ＢｓｔＸ３’，合成配列
配列番号３２：GAAノックアウトベクターの塩基配列，合成配列

Claims (47)

  1. 　抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と薬剤との結合体であって，該薬剤が筋肉において機能を発揮させるべき生理活性を有するものである，結合体。
  2. 　該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，Ｆａｂ抗体，Ｆ（ａｂ’）２抗体，又はＦ（ａｂ’）抗体である，請求項１に記載の結合体。
  3. 　該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，ｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），ｓｃＦ（ａｂ’）２及びｓｃＦｖからなる群から選ばれる一本鎖抗体である，請求項１に記載の結合体。
  4. 　該一本鎖抗体が，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖と重鎖とをリンカー配列を介して結合させたものである，請求項３に記載の結合体。
  5. 　該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖と重鎖とを，該軽鎖のＣ末端側において，該リンカー配列を介して結合させたものである，請求項４に記載の結合体。
  6. 　該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖と重鎖とを，該重鎖のＣ末端側において，該リンカー配列を介して結合させたものである，請求項４に記載の結合体。
  7. 　該リンカー配列が，８～５０個のアミノ酸残基からなるものである，請求項４～６の何れかに記載の結合体。
  8. 　該リンカー配列が，アミノ酸配列（Ｇｌｙ　Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ），配列番号３，及び配列番号４で示されるものからなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項７に記載の結合体。
  9. 　該リンカー配列が，配列番号４で示されるアミノ酸配列が３回連続する１５個のアミノ酸残基からなるものである，請求項８に記載の結合体。
  10. 　該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖の可変領域に配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むものであり，重鎖の可変領域に配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含むものである，請求項１～９の何れかに記載の結合体。
  11. 　該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するものであり，該重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するものである，請求項１０に記載の結合体。
  12. 　該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものであり，該重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものである，請求項１０に記載の結合体。
  13. 　該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列を構成する１～１０個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものである，請求項１０に記載の結合体。
  14. 　該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列を構成する１～３個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものである，請求項１０に記載の結合体。
  15. 　該重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２３で示されるアミノ酸配列を構成する１～１０個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものである，請求項１０に記載の結合体。
  16. 　該重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２３で示されるアミノ酸配列を構成する１～３個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものである，請求項１０に記載の結合体。
  17. 　該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列を構成する１～１０個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものであり，該重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２３で示されるアミノ酸配列を構成する１～１０個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものである，請求項１０に記載の結合体。
  18. 　該軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列を構成する１～３個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものであり，該重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，配列番号２３で示されるアミノ酸配列を構成する１～３個のアミノ酸が，他のアミノ酸に置換されたものである，請求項１０に記載の結合体。
  19. 　該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体が，軽鎖に配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含むものであり，重鎖に配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むものである，請求項１０に記載の結合体。
  20. 　該軽鎖のアミノ酸配列が，配列番号２４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するものであり，該重鎖のアミノ酸配列が，配列番号２５で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するものである，請求項１９に記載の結合体。
  21. 　該軽鎖のアミノ酸配列が，配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものであり，該重鎖のアミノ酸配列が，配列番号２５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものである，請求項１９に記載の結合体。
  22. 　薬剤がペプチド又は蛋白質である，請求項１～２１の何れかに記載の結合体。
  23. 　請求項２２の結合体であって，以下の（１）～（４）からなる群から選択されるもの，
    （１）該蛋白質が，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＣ末端側にペプチド結合により結合したもの，
    （２）該蛋白質が，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖のＮ末端側にペプチド結合により結合したもの，
    （３）該蛋白質が，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の重鎖のＣ末端側にペプチド結合により結合したもの，及び
    （４）該蛋白質が，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の重鎖のＮ末端側にペプチド結合により結合したもの。
  24. 　該蛋白質が，該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体に，リンカー配列を介して結合したものである，請求項２３に記載の結合体。
  25. 　該リンカー配列が，１～５０個のアミノ酸残基からなるものである，請求項２４に記載の結合体。
  26. 　該リンカー配列が，１個のグリシン，１個のセリン，アミノ酸配列（Ｇｌｙ　Ｓｅｒ），アミノ酸配列（Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ），配列番号３のアミノ酸配列，配列番号４のアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列が１～１０個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項２５に記載の結合体。
  27. 　該抗ヒトトランスフェリン受容体抗体がヒト化抗ヒトトランスフェリン受容体抗体である，上記１～２８の何れかの結合体。
  28. 　該蛋白質が，リソソーム酵素である，請求項２２～２７の何れかに記載の結合体。
  29. 　該リソソーム酵素が，ヒトα－ガラクトシダーゼＡである，請求項２８に記載の結合体。
  30. 　該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が配列番号２４のアミノ酸配列を含むものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖がそのＣ末端側で，リンカー配列（Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）を介して，該ヒトα－ガラクトシダーゼＡと結合しており，全体として配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含むものである，請求項２９に記載の結合体。
  31. 　該リソソーム酵素がヒト酸性α-グルコシダーゼ，である，請求項２８に記載の結合体。
  32. 　該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が配列番号２４のアミノ酸配列を含むものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖がそのＣ末端側で，リンカー配列（Ｇｌｙ　Ｓｅｒ）を介して，該ヒト酸性α-グルコシダーゼと結合しており，全体として配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含むものである，請求項３１に記載の結合体。
  33. 　請求項１～３２の何れかに記載の結合体を含有してなる，筋肉の機能を改善するための医薬組成物。
  34. 　請求項２８に記載の結合体を含有してなる，リソソーム病に伴う筋肉の機能障害を改善するための，医薬組成物。
  35. 　請求項２９又は３０に記載の結合体を含有してなる，ファブリー病に伴う筋肉の機能障害を改善するための，医薬組成物。
  36. 　請求項３１又は３２に記載の結合体を含有してなる，ポンペ病に伴う筋肉の機能障害を改善するための，医薬組成物。
  37. 　該筋肉が，骨格筋，心筋，又は平滑筋の何れかである，請求項３３～３６の何れかに記載の医薬組成物。
  38. 　リソソーム病に伴う筋肉の機能障害を改善するための医薬組成物の製造のための，請求項２８～３２の何れかに記載の結合体の使用。
  39. 　ファブリー病に伴う筋肉の機能障害を改善するための医薬組成物の製造のための，請求項２９又は３０に記載の結合体の使用。
  40. 　ポンペ病に伴う筋肉の機能障害を改善するための医薬組成物の製造のための，請求項３１又は３２に記載の結合体の使用。
  41. 　請求項１～３２の何れかに記載の結合体の，筋肉の機能を改善するための医薬組成物としての使用。
  42. 　薬剤を筋肉に送達するための方法であって，該薬剤を抗ヒトトランスフェリン受容体抗体と結合させた結合体として製造するステップ，及び該結合体を個体に投与するステップことを含む，方法。
  43. 　該結合体が，請求項１～３２の何れかに記載の結合体である，請求項４１に記載の方法。
  44. 　該結合体の投与により該個体の筋肉の機能が改善されるステップを更に含む，請求項４２又は４３に記載の方法。
  45. 　該個体が，筋肉の機能障害を有するものである，請求項４２～４４の何れかに記載の方法。
  46. 　該個体が，リソソーム病に伴う筋肉の機能障害を有するものである，請求項４２～４４の何れかに記載の方法。
  47. 　該リソソーム病が，ファブリー病又はポンペ病である，請求項４６に記載の方法。
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