BR112015012152B1

BR112015012152B1 - Proteína de fusão terapêutica direcionada que compreende uma enzima lisossomal, ácido nucleico, composição farmacêutica, método para produzir a dita proteína e usos da proteína para tratar uma doença de armazenamento lisossomal e mucopolissacaridose tipo iiib

Info

Publication number: BR112015012152B1
Application number: BR112015012152-7A
Authority: BR
Inventors: Mika Aoyagi-Scharber; Teresa Margaret Christianson; Melita Dvorak-Ewell; Daniel J. Wendt; Shinong Long; Jonathan LeBowitz; Daniel Solomon Gold
Original assignee: Biomarin Pharmaceutical Inc
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2023-04-25
Also published as: JP2019206556A; US20140161788A1; KR102262882B1; EP2925776A1; IL272854A; US10301369B2; TWI711632B; DK3115372T3; ZA201503509B; IL272854B; IL262976B; HK1216026A1; CN104822701A; EP3115372B1; KR20150088317A; PL3115372T3; US11254725B2; US9834588B2; HUE039334T2; TW201827468A

Abstract

PROTEÍNA DE FUSÃO TERAPÊUTICA DIRECIONADA QUE COMPREENDE UMA ENZIMA LISOSSOMAL, ÁCIDO NUCLEICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODO PARA PRODUZIR A DITA PROTEÍNA E USOS DA PROTEÍNA PARA TRATAR UMA DOENÇA DE ARMAZENAMENTO LISOSSOMAL E MUCOPOLISSACARIDOSE TIPO IIIB. A presente invenção se refere em geral a proteínas de fusão terapêuticas úteis para tratar doenças de armazenamento lisossômico e métodos para tratar essas doenças. Proteínas de fusão terapêuticas exemplares compreendem uma enzima lisossômica, umafração de alvo lisossômico, por exemplo, um peptídeo IGF- II e um peptídeo espaçador. Também são fornecidas composições e métodos para tratar Mucopolissacaridose Tipo IIIB (Síndrome de Sanfilippo B) compreendendo uma proteína de fusão terapêutica direcionada compreendendo alfa-N-acetilglicosaminidase (Naglu), uma fração de alvo lisossômica, por exemplo, um peptídeo IGF-II e um peptídeo espaçador.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001]Este pedido reivindica o benefício prioritário do Pedido Provisório US 61/730.378, depositado em 27 de Novembro de 2012 e Pedido Provisório US 61/788.968, depositado em 15 de março de 2013, aqui incorporados por referência na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002]A presente invenção refere-se em geral a proteínas de fusão terapêuticas úteis para tratar doenças de armazenamento lissomal e métodos para o tratamento de tais doenças. Exemplos de proteínas de fusão terapêuticas compreendem uma enzima lisossômica, uma porção de direcionamento lisossômico, por exemplo, um peptídeo IGF-II, e um peptídeo espaçador. Considera-se que a enzima lisossômica é alfa-N-acetilglicosaminidase (Naglu) e a doença é mucopolissacaridose do tipo IIIB (Síndrome de Sanfilippo B).

FUNDAMENTOS

[003]Normalmente, as enzimas lisossômicas de mamíferos são sintetizadas no citoplasma e atravessam o ER, onde são glicosiladas com carboidrato N-ligado, tipo manose elevada. No Golgi, o carboidrato elevado de manose é modificado em enzimas lisossômicas por adição de manose-6-fosfato (M6P), que tem como alvo estas proteínas para o lisossoma. As proteínas modificadas com M6P são liberadas para o lisossoma pela interação com qualquer um dos dois receptores de M6P. A forma mais favorável de modificação é quando dois M6Ps são adicionados a um carboidrato de manose elevada.

[004]Mais de quarenta doenças de armazenamento lisossômico (LSD) são causadas, direta ou indiretamente, pela ausência de uma ou mais enzimas lisossômicas no lisossoma. Terapia de reposição enzimática para LSDs está sendo ativamente perseguida. Terapia geralmente requer que as proteínas LSD sejam coletadas e liberadas às lisossomas de uma variedade de tipos de células em uma forma dependente da M6P. Uma abordagem possível envolve a purificação de uma proteína LSD e modificação da mesma para incorporar uma fração de carboidrato com M6P. Este material modificado pode ser absorvido pelas células de forma mais eficiente do que as proteínas não modificadas LSD devido à interação com os receptores de M6P na superfície da célula.

[005]Os inventores do presente pedido de patente já desenvolveram uma tecnologia de direcionamento baseada em peptídeos que permite a administração mais eficiente de enzimas terapêuticas para os lisossomas. Esta tecnologia proprietária é denominada Direcionamento Lisossômico Independente de Glicosilação (GILT) porque um marcador de peptídeo substitui M6P como a fração de direcionamento dos lisossomas. Os detalhes da tecnologia GILT são descritos na publicação de Pedido US 2003-0082176, 2004-0006008, 2003-0072761, 20050281805, 2005-0244400, e publicações internacionais WO 03/032913, WO 03/032727, WO 02/087510, WO 03/102583, WO 2005/078077, as divulgações de todos os quais são aqui incorporados por referência.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[006]A presente invenção proporciona novas composições e métodos para melhorar a identificação lisossômica eficiente baseada na tecnologia GILT. Entre outras coisas, a presente invenção proporciona métodos e composições para direcionar enzimas lisossômicas para os lisossomas, utilizando peptídeos de direcionamento lisossômico. A presente invenção também proporciona métodos e composições para direcionar enzimas lisossômicas para os lisossomas, utilizando um peptídeo de direcionamento lisossômico, que reduziu ou diminuiu a afinidade de ligação para o receptor de IGF-I e/ou reduziu ou diminuiu a afinidade de ligação para o receptor de insulina, e/ou é resistente a clivagem por furina. A presente invenção também proporciona proteínas de fusão de enzimas lisossômicas que compreendem uma enzima lisossômica e IGF-II e peptídeos espaçadores que proporcionam uma melhor produção e absorção em lisossomas da proteína de fusão de enzima lisossômica. Em certas modalidades, a enzima lisossômica é alfa-N- acetilglicosaminidase (Naglu).

[007] Em um aspecto, a invenção fornece uma proteína de fusão de direcionamento que compreende uma enzima lisossômica, um marcador de peptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica aos aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro e um peptídeo espaçador entre a enzima lisossômica e o marcador de peptídeo IGF-II. Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende um ou mais GGGPS (SEQ ID NO: 14) ou GGGSP (SEQ ID NO: 15) de sequências de aminoácidos, e, opcionalmente, compreende ainda um ou mais de (i) GAP (SEQ ID NO: 9), (ii) GGGGS (SEQ ID NO: 12), (iii) GGGS (SEQ ID NO: 16), (iv) AAAAS (SEQ ID NO: 17), (v) AAAS (SEQ ID NO: 18), (vi) PAPA (SEQ ID NO: 19), (vii) TPAPA (SEQ ID NO: 20), (viii) AAAKE (SEQ ID NO: 21) ou (ix) GGGGA (SEQ ID NO: 60).

[008]Exemplos de enzimas lisossômicas aqui contemplados incluem os estabelecidos na Tabela 1.

[009]Em várias modalidades, a proteína de fusão terapêutica de direcionamento compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 85% idêntica a uma proteína α-N-acetilglicosaminidase (Naglu) humana (Figura 1, SEQ ID NO: 1), um marcador de peptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica aos aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro e um peptídeo espaçador localizado entre a sequência de aminoácidos Naglu e o marcador de peptídeo IGF-II. Em várias modalidades, o espaçador compreende a sequência de aminoácidos GAP (SEQ ID NO: 9), GPS (SEQ ID NO: 10), ou GGS (SEQ ID NO: 11). Em várias modalidades, a sequência do espaçador compreende os aminoácidos Gly-Pro-Ser (GPS) (SEQ ID NO: 10) entre os aminoácidos da IGF-II humano maduro e os aminoácidos de Naglu humana.

[010]Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende um ou mais Sequências de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 12) ou GGGS (SEQ ID NO: 16) . Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais GGGPS (SEQ ID NO: 14) ou GGGSP (SEQ ID NO: 15) de sequências de aminoácidos. Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos AAAAS (SEQ ID NO: 17) ou AAAS (SEQ ID NO: 18). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos APAP (SEQ ID NO: 19) ou TPAPA (SEQ ID NO: 20). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos AAAKE (SEQ ID NO: 21). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos GGGGA (SEQ ID NO: 60).

[011]Em várias modalidades, o espaçador de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (GGGGS)n (SEQ ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n- GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n- GAP (SEQ ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 163169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 170218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 219-267), GAP- (GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 268-316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n- PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 544-551), (GGGGA)n (SEQ ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n- GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 334-340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 397-445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n- PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP- (Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 552-559); em que n é de 1 a 7. Em várias modalidades, n é 1 a 4.

[012]Em várias modalidades, a presente invenção proporciona um peptídeo IGF-II para utilização como marcador de peptídeo para o direcionamento do peptídeo ou proteína de fusão compreendendo o peptídeo para um lisossoma de mamífero. Em várias modalidades, a presente invenção proporciona uma muteína de IGF-II. Em várias modalidades, a invenção proporciona uma muteína de IGF-II resistente à furina tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a IGF-II humano maduro (AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLAL LETYCATPAKSE) (SEQ ID NO: 5) e uma mutação que elimina, pelo menos, um sítio de clivagem de protease furina.

[013]Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma muteína de IGF-II que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a IGF-II humano maduro. Em várias modalidades, o marcador de peptídeo de muteína de IGF-II compreende os aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro. Em várias modalidades, a muteína de IGF-II compreende uma mutação que reduz ou diminui a afinidade de ligação para o receptor de insulina, em comparação com o IGF-II de tipo selvagem humano.

[014]Em algumas modalidades, a muteína de IGF-II diminuiu a afinidade de ligação para o receptor de IGF-I em relação à afinidade de IGF-II humano de ocorrência natural para o receptor do IGF-I.

[015]Em várias modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína de fusão terapêutica de direcionamento contendo uma enzima lisossômica; e uma muteína de IGF-II tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a IGF-II humano maduro, em que a muteína de IGF-II é resistente à clivagem por furina e liga-se ao receptor de manose-6-fosfato humano independente de cátions em um modo independente de manose-6-fosfato.

[016]Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona uma proteína de fusão terapêutica de direcionamento contendo uma enzima lisossômica; e uma muteína de IGF-II tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a IGF-II humano maduro, e tendo reduzida afinidade de ligação para o receptor da insulina relativamente à afinidade de IGF-II humano de ocorrência natural para o receptor de insulina. Em uma modalidade relacionada, a muteína de IGF-II é resistente à clivagem por furina e liga-se ao receptor de manose-6-fosfato humano independente de cátions em uma forma independente de 6-fosfato-manose.

[017]Em várias modalidades, uma muteína de IGF-II adequada para a invenção inclui uma mutação em uma região que corresponde aos aminoácidos 3040 de IGF-II humano maduro. Em algumas modalidades, uma muteína de IGF-II adequada para a invenção inclui uma mutação em uma região que corresponde aos aminoácidos 34-40 de IGF-II humano maduro de tal modo que a mutação elimina, pelo menos, um sítio de clivagem de furina protease. Em algumas modalidades, uma mutação adequada é uma substituição, deleção e/ou inserção de aminoácido. Em algumas modalidades, a mutação é uma substituição de aminoácido na posição correspondente à Arg37 ou Arg40 de IGF-II humano maduro. Em algumas modalidades, a substituição de aminoácido é uma substituição Lys ou Ala.

[018]Em algumas modalidades, uma mutação adequada é uma deleção ou substituição de resíduos de aminoácidos correspondentes às posições selecionadas a partir do grupo consistindo de 30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 3239, 34-37, 33-39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40 de IGF-II humano maduro, e suas combinações.

[019]Em várias modalidades, uma muteína de IGF-II de acordo com a invenção contém adicionalmente uma deleção ou uma substituição de aminoácidos correspondentes às posições 2-7 de IGF-II humano maduro. Em várias modalidades, uma muteína de IGF-II de acordo com a invenção inclui ainda uma deleção ou uma substituição de aminoácidos correspondentes às posições de 1-7 de IGF-II humano maduro. Em várias modalidades, uma muteína de IGF-II de acordo com a invenção contém adicionalmente uma deleção ou uma substituição de aminoácidos correspondentes às posições 62-67 de IGF-II humano maduro. Em várias modalidades, uma muteína de IGF-II de acordo com a invenção contém ainda uma substituição de aminoácido em uma posição correspondente a Tyr27, Leu43, Ser26 ou de IGF-II humano maduro. Em várias modalidades, uma muteína de IGF-II de acordo com a invenção contém pelo menos uma substituição de aminoácido selecionado a partir do grupo que consiste em Tyr27Leu, Leu43Val, Ser26Phe e suas combinações. Em várias modalidades, uma muteína de IGF-II de acordo com a invenção contém os aminoácidos correspondentes às posições 48-55 de IGF-II humano maduro. Em várias modalidades, uma muteína de IGF-II de acordo com a invenção contém, pelo menos, três aminoácidos selecionados a partir do grupo que consiste em aminoácidos correspondentes às posições 8, 48, 49, 50, 54, e 55 de IGF-II humano maduro. Em várias modalidades, uma muteína de IGF-II da invenção contém, em posições correspondentes às posições 54 e 55 do IGF-II, aminoácidos maduros humanos cada um dos quais é não carregado ou carregado negativamente a pH 7,4. Em várias modalidades, a muteína de IGF-II diminuiu a afinidade de ligação para o receptor de IGF-I em relação à afinidade de IGF-II humano de ocorrência natural para o receptor do IGF-I. Em várias modalidades, a muteína de IGF-II é IGF2 Δ8-67 R37A (isto é, aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro com a Arg na posição 37 de IGF-II humano maduro) substituído por Ala.

[020]Em várias modalidades, o marcador de peptídeo está ligado ao N- terminal ou C-terminal da enzima lisossômica, portanto, é um marcador N-terminal ou um marcador C-terminal, respectivamente. Em várias modalidades, o marcador é um marcador de peptídeo C-terminal.

[021]Em algumas modalidades, uma enzima lisossômica adequada para a invenção é alfa-N-acetilglicosaminidase (Naglu) humana (Figura 1), ou um fragmento funcional da mesma ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, uma enzima lisossômica adequada para a invenção inclui aminoácidos 1-743 de alfa-N- acetilglicosaminidase humana ou os aminoácidos 24-743 de alfa-N- acetilglicosaminidase humana, desprovida de uma sequência de sinal.

[022]Em várias modalidades, uma proteína de fusão terapêutica de direcionamento da invenção inclui ainda um espaçador entre a enzima lisossômica e a muteína de IGF-II.

[023]Em várias modalidades, o espaçador compreende uma estrutura alfa- helicoidal ou uma estrutura rígida.

[024]Em várias modalidades, o espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos Gly-Ala-Pro (GAP) (SEQ ID NO: 9), Gly-Pro-Ser (GPS) (SEQ ID NO: 10), ou Gly-Gly-Ser (GGS) (SEQ ID NO: 11).

[025]Em algumas modalidades, o espaçador é selecionado a partir do grupo constituído por EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22), GAP (SEQ ID NO: 9), GGGGS (SEQ ID NO: 12), GPSGSPG (SEQ ID NO: 23), GPSGSPGT (SEQ ID NO: 24), GPSGSPGH (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GPSGAP (SEQ ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGG GPSGAP (SEQ ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 59), GGGGA (SEQ ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [ou (GGGGA)8GGGPS] (SEQ ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [ou (GGGGA)8GGGPSH] (SEQ ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [ou (GGGGA)9GGGPS] (SEQ ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS H [ou (GGGGA)9GGGPSH] (SEQ ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 89), e GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 90).

[026]Em algumas modalidades, o espaçador é selecionado a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

[027]Em algumas modalidades, o espaçador é selecionado a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

[028]Em várias modalidades, a proteína de fusão compreende ainda um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[029]A presente invenção também proporciona ácidos nucleicos que codificam para a muteína de IGF-II ou a proteína de fusão terapêutica de direcionamento, tal como descrito em várias modalidades acima. A presente invenção proporciona ainda várias células contendo o ácido nucleico da invenção.

[030]A presente invenção proporciona composições farmacêuticas adequadas para o tratamento de doenças de armazenamento lisossômico que contém uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de fusão terapêutica de direcionamento da invenção. A invenção proporciona ainda métodos de tratamento de doenças de armazenamento lisossômico que compreendem a administração a um sujeito com necessidade de tratamento de uma proteína de fusão terapêutica de direcionamento de acordo com a invenção. Em algumas modalidades, a doença de armazenamento lisossômico é mucopolissacaridose do tipo IIIB (síndrome de Sanfilippo B).

[031]Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção de uma proteína de fusão terapêutica de direcionamento incluindo uma etapa de cultivar células de mamífero em um meio de cultura de células, em que as células de mamífero transportam o ácido nucleico da invenção, em particular, como descrito em várias modalidades aqui; e a cultura é realizada sob condições que permitem a expressão da proteína de fusão terapêutica de direcionamento.

[032]Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção de uma proteína de fusão terapêutica de direcionamento incluindo uma etapa de cultura de células de deficiente em furina (por exemplo, células de mamífero deficientes em furina) em um meio de cultura celular, em que a células deficientes em furina transportam um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão que compreende uma enzima lisossômica e uma muteína de IGF-II tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica a IGF-II humano maduro, em que a muteína de IGF-II, liga-se ao receptor de manose-6-fosfato independente de cátions em uma forma de independente de manose-6-fosfato; e em que a cultura é realizada sob condições que permitem a expressão da proteína de fusão terapêutica de direcionamento.

[033]Em várias modalidades, é contemplado que certas proteínas terapêuticas direcionadas compreendendo um espaçador, tal como descrito aqui exibem expressão aumentada de proteína ativa quando expressa de forma recombinante em comparação com proteínas terapêuticas direcionadas compreendendo um espaçador de peptídeo diferente. Em várias modalidades, é também contemplado que as proteínas terapêuticas de direcionamento aqui descritas podem ter um aumento da atividade em comparação com outras proteínas terapêuticas direcionadas da presente invenção. É contemplado que estas proteínas terapêuticas de direcionamento que exibem um aumento da expressão da proteína ativa e/ou tendo um aumento da atividade em comparação com outras proteínas terapêuticas direcionadas compreendendo um peptídeo espaçador diferentes são usadas para posterior experimentação.

[034]Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para o tratamento de uma doença de armazenamento lisossômico em um sujeito compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de fusão compreendendo uma enzima lisossômica, um marcador de peptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 70% idêntica aos aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro e um peptídeo espaçador localizado entre a sequência de aminoácidos da enzima lisossômica e o marcador de peptídeo IGF-II. Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos GGGPS (SEQ ID NO: 14) ou GGGSP (SEQ ID NO: 15), e, opcionalmente, compreende ainda um ou mais de (i) GAP (SEQ ID NO: 9), (ii) GGGGS (SEQ ID NO: 12), (iii) GGGS (SEQ ID NO: 16), (iv) AAAAS (SEQ ID NO: 17), (v) AAAS (SEQ ID NO: 18), (vi) PAPA (SEQ ID NO: 19), (vii) TPAPA (SEQ ID NO: 20), (viii) AAAKE (SEQ ID NO: 21) ou (ix) GGGGA (SEQ ID NO: 60).

[035]Em várias modalidades, o espaçador de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (GGGGS)n (SEQ ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n- GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n- GAP (SEQ ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 163169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 170218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 219-267), GAP- (GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 268-316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n- PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 544-551), (GGGGA)n (SEQ ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n- GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 334-340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 397-445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n- PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP- (Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 552-559); em que n é 1 a 7, opcionalmente n é 1 a 4.

[036]Em várias modalidades, o peptídeo espaçador tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22), GAP (SEQ ID NO: 9), GGGGS (SEQ ID NO: 12), GPSGSPG (SEQ ID NO: 23), GPSGSPGT (SEQ ID NO: 24), GPSGSPGH (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GPSGAP (SEQ ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGG GPSGAP (SEQ ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 59), GGGGA (SEQ ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [ou (GGGGA)8GGGPS] (SEQ ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [ou (GGGGA)8GGGPSH] (SEQ ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [ou (GGGGA)9GGGPS] (SEQ ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS H [ou (GGGGA)9GGGPSH] (SEQ ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 89), e GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 90).

[037]Em várias modalidades, o peptídeo espaçador tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

[038]Em várias modalidades, o peptídeo espaçador tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

[039]Exemplos de doenças de armazenamento lisossômico contemplados pelos métodos aqui incluem as definidas na Tabela 1. Considera-se que a doença de armazenamento lisossômico é tratada com uma proteína de fusão terapêutica de direcionamento que compreende a enzima deficiente na doença de armazenamento lisossômico, também apresentadas na Tabela 1.

[040]Em várias modalidades, a invenção proporciona um método para o tratamento de Mucopolissacaridose do tipo III-B (Síndrome de Sanfilippo B) em um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de fusão que compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 85% idêntica a uma proteína humana α-N-acetilglicosaminidase (Naglu) (SEQ ID NO: 1), um marcador de peptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica aos aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro e um peptídeo espaçador situado entre a sequência de aminoácidos Naglu e o marcador de peptídeo de IGF-II. Em várias modalidades, o espaçador compreende a sequência de aminoácidos GAP (SEQ ID NO: 9), GPS (SEQ ID NO: 10), ou GGS (SEQ ID NO: 11).

[041]Em várias modalidades, a sequência do espaçador compreende os aminoácidos Gly-Pro-Ser (GPS) (SEQ ID NO: 10) entre os aminoácidos de IGF-II humano maduro e os aminoácidos de Naglu humana.

[042]Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais Sequências de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 12) ou GGGS (SEQ ID NO: 16). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos GGGPS (SEQ ID NO: 14) ou GGGSP (SEQ ID NO: 15). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos AAAAS (SEQ ID NO: 17) ou AAAS (SEQ ID NO: 18). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos APAP (SEQ ID NO: 19) ou TPAPA (SEQ ID NO: 20). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos AAAKE (SEQ ID NO: 21). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos GGGGA (SEQ ID NO: 60).

[043]Em várias modalidades, o espaçador de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (GGGGS)n (SEQ ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n- GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n- GAP (SEQ ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 163169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 170218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 219-267), GAP- (GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 268-316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n- PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 544-551), (GGGGA)n (SEQ ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n- GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 334-340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 397-445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n- PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP- (Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 552-559); em que n é 1 a 7, opcionalmente em que n é 1 a 4.

[044]Em várias modalidades, a invenção proporciona um método para reduzir níveis de glicosaminoglicanos (GAGs) in vivo compreendendo a administração a um sujeito que sofre de mucopolissacaridose do tipo IIIB (Síndrome de Sanfilippo B) uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão que compreende i) uma sequência de aminoácidos pelo menos 85% idêntica a uma proteína α-N- acetilglicosaminidase (Naglu) humana (SEQ ID NO: 1), ii) um marcador de peptídeo possuindo uma sequência de aminoácidos pelo menos 70% idêntica aos aminoácidos 8-67 de IGF-II maduro humano, e iii) um peptídeo espaçador localizado entre a sequência de aminoácidos Naglu e o marcador de peptídeo de IGF-II.

[045]Em várias modalidades, a sequência do espaçador compreende uma ou mais cópias de aminoácidos Gly-Ala-Pro (GAP) (SEQ ID NO: 9) entre os aminoácidos de IGF-II humano maduro e os aminoácidos de Naglu humana .

[046]Em várias modalidades, o peptídeo espaçador é selecionado a partir do grupo que consiste em EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22), GAP (SEQ ID NO: 9), GGGGS (SEQ ID NO: 12), GPSGSPG (SEQ ID NO: 23), GPSGSPGT (SEQ ID NO: 24), GPSGSPGH (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GPSGAP (SEQ ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGG GPSGAP (SEQ ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 59), GGGGA (SEQ ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [ou (GGGGA)8GGGPS] (SEQ ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [ou (GGGGA)8GGGPSH] (SEQ ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [ou (GGGGA)9GGGPS] (SEQ ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS H [ou (GGGGA)9GGGPSH] (SEQ ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 89), e GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 90).

[047]Em várias modalidades, o peptídeo espaçador é selecionado a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

[048]Em várias modalidades, o peptídeo espaçador é selecionado a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

[049]Em várias modalidades, o domínio de direcionamento lisossômico ou marcador de peptídeo IGF-II compreende os aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro (SEQ ID NO: 2, 4). Em várias modalidades, o marcador de peptídeo IGF-II compreende uma mutação no resíduo Arg37. Em várias modalidades, a mutação é uma substituição de alanina por arginina. Em várias modalidades, o domínio de direcionamento lisossômico ou marcador de peptídeo de IGF-II compreende IGF2 Δ8-67 R37A.

[050]Em várias modalidades, a proteína de fusão compreende os aminoácidos 1-743 de Naglu humana (SEQ ID NO: 1, 3). Em várias modalidades, a proteína de fusão compreende os aminoácidos 24-743 de Naglu humana.

[051]Em várias modalidades, a quantidade eficaz da proteína de fusão se situa na faixa de cerca de 0,1-1 mg/kg, cerca de 1-5 mg/kg, cerca de 2,5-20 mg/kg, cerca de 5-20 mg/kg, cerca de 10-50 mg/kg, ou de 20-100 mg/kg de peso corporal do sujeito. Em várias modalidades, a quantidade eficaz de proteína de fusão é de cerca de 2,5-20 mg por quilograma de peso corporal do sujeito.

[052]Em várias modalidades, a proteína de fusão é administrada por via intratecal, por via intravenosa, intramuscular, parenteral, transdérmica, ou por via transmucosa. Em várias modalidades, a proteína de fusão é administrada por via intratecal. Em várias modalidades, a administração intratecal compreende ainda opcionalmente a administração da proteína de fusão por via intravenosa.

[053]Em várias modalidades, a administração intratecal compreende a introdução da proteína de fusão em um ventrículo cerebral, zona lombar, ou cisterna magna.

[054]Em várias modalidades, a proteína de fusão é administrada cada dois meses, mensal, três vezes por semana, bissemanalmente, semanalmente, diariamente, ou a intervalos variáveis.

[055]Em várias modalidades, o tratamento resulta na redução dos níveis de glicosaminoglicano (GAG) em tecido cerebral. É ainda contemplado que o tratamento resulta na redução de grânulos de armazenamento lisossômico em um tecido cerebral.

[056]Também são contempladas composições que compreendem as proteínas de fusão terapêuticas de direcionamento, tal como aqui descrito para utilização no tratamento de doenças de armazenamento lisossômico. Doenças de depósito lisossômica exemplares incluem as estabelecidas na Tabela 1.

[057]Outras características, objetos e vantagens da presente invenção são evidentes na descrição detalhada que se segue. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada, enquanto indicando modalidades da presente invenção, é apresentada a título de ilustração apenas, e não de limitação. Várias alterações e modificações dentro do escopo da invenção se tornarão evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[058]Os desenhos são apenas para fins ilustrativos, e não para limitação.

[059]A Figura 1 descreve as sequências de aminoácidos de uma fração de uma proteína de fusão terapêutica exemplar que compreende (a) Naglu e (B) um peptídeo IGF-II que compreende os resíduos 8-67 do IGF-II e possuindo uma substituição de aminoácidos no resíduo 37, R37A (Arg37Ala).

[060]A Figura 2 representa as sequências de nucleotídeos de uma fração de uma proteína de fusão terapêutica exemplar compreendendo (A) Naglu e (B) um peptídeo IGF-II que compreende os resíduos 8-67 do IGF-II e que tem uma substituição de aminoácido no resíduo 37, R37A (Arg37Ala).

[061]A Figura 3 descreve sequências de espaçador exemplares contempladas para utilização na proteína de fusão terapêutica.

DEFINIÇÕES

[062]Melhoria: Tal como aqui utilizado, o termo “melhoria” entende-se a prevenção, redução ou tratamento paliativo de um estado, ou a melhoria do estado de um sujeito. Melhoria inclui, mas não exige a recuperação completa ou prevenção completa de uma condição de doença. Em algumas modalidades, melhoria inclui a redução de materiais acumulados dentro dos lisossomas dos tecidos doentes relevantes.

[063]Muteína IGF-II resistente à furina: Tal como aqui utilizado, o termo “muteína de IGF-II resistente à furina” refere-se a um peptídeo baseado em IGF-II que inclui uma sequência de aminoácidos alterada que suprime pelo menos um sítio de clivagem de furina protease nativo ou muda uma sequência próxima ou adjacente a um sítio de clivagem de furina protease nativo de tal modo que a clivagem de furina é impedida, inibida, reduzida, ou retardada, em comparação com um peptídeo humano de IGF-II tipo selvagem. Tal como aqui utilizado, uma muteína de IGF-II resistente à furina é também referida como uma muteína de IGF-II, que é resistente à furina.

[064]Sítio de clivagem de furina protease: Tal como aqui utilizado, o termo “sítio de clivagem de furina protease” (também referido como “sítio de clivagem de furina” ou “sequência de clivagem de furina”) refere-se à sequência de aminoácidos de um peptídeo ou uma proteína que serve como uma sequência de reconhecimento para clivagem enzimática por furina protease ou proteases tipo furina. Tipicamente, um sítio de clivagem de furina protease tem uma sequência de consenso Arg-X-X- Arg (SEQ ID NO: 6), X é qualquer aminoácido. O sítio de clivagem é posicionado após o resíduo de arginina de carboxi terminal (Arg) na sequência. Em algumas modalidades, um sítio de clivagem de furina pode ter uma sequência de consenso Lis/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO: 7), X é qualquer aminoácido. O sítio de clivagem é posicionado após o resíduo de arginina do carboxi terminal (Arg) na sequência.

[065]Furina: Tal como aqui utilizado, o termo “furina” refere-se a qualquer protease que é capaz de reconhecer e clivar o sítio de clivagem de furina protease, tal como aqui definido, incluindo furina ou proteases do tipo furina. A furina também é conhecida como enzima de clivagem de aminoácido básico pareado (PACE). A furina pertence à família convertase de pró-proteína tipo subtilisina. O gene que codifica furina era conhecido como FUR (Região à montante de FES).

[066]Células deficientes em furina: Tal como aqui utilizado, o termo “células deficientes em furina” refere-se a quaisquer células cuja atividade de furina protease é inibida, reduzida ou eliminada. As células deficientes de furina incluem ambas células de mamíferos e de não mamíferos que não produzem furina ou produzem quantidade reduzida de furina ou furina protease com defeito.

[067]Glicosilação Independente de direcionamento lisossômico: Tal como aqui utilizado, o termo “direcionamento lisossômico independente de glicosilação” (também referida como “GILT”) referem-se ao direcionamento lisossômico que é o independente de manose-6-fosfato.

[068]Alfa-N-acetilglicosaminidase humana: Tal como aqui utilizado, o termo “alfa-N-acetilglicosaminidase humana” (também referida como “Naglu”) refere-se ao precursor (isto é, contendo a sequência de peptídeo de sinal nativa de Naglu) ou processada (isto é, desprovida da sequência de peptídeo sinal nativa de Naglu) de tipo selvagem de alfa-N-acetilglicosaminidase humana ou um fragmento ou variante funcional da mesma, que é capaz de reduzir os níveis de glicosaminoglicano (GAG) nos lisossomas ou de mamífero que podem resgatar ou melhorar um ou mais sintomas de MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B). Tal como aqui utilizado, o termo “funcional”, tal como se relaciona com Naglu refere-se a uma enzima Naglu que é capaz de ser absorvida por lisossomas de mamíferos e que tem atividade enzimática suficiente para reduzir o material de armazenamento, ou seja, glicosaminoglicano (GAG), no lisossoma de mamífero.

[069]Muteína de IGF-II: Tal como aqui utilizado, o termo “muteína de IGF-II” refere-se a um peptídeo baseado em IGF-II que inclui uma sequência de aminoácidos alterada. Tal como aqui utilizado, o termo “muteína de IGF-II resistente à furina” refere-se a um peptídeo baseado em IGF-II que inclui uma sequência de aminoácidos alterada que suprime pelo menos um sítio de clivagem de furina protease nativa ou muda uma sequência próxima ou adjacente a um sítio de clivagem de furina protease nativa tal que a clivagem de furina é impedida, inibida, reduzida, ou retardada, em comparação com um peptídeo de IGF-II humano tipo selvagem. Tal como aqui utilizado, uma muteína de IGF-II resistente à furina é também referida como uma muteína de IGF-II, que é resistente à furina.

[070]Melhorar, aumentar ou reduzir: Tal como aqui utilizado, os termos “melhorar”, “aumentar” ou “reduzir”, ou seus equivalentes gramaticais, indicam valores que são relativos a uma medição de linha de base, tais como uma medição no mesmo indivíduo antes do início do tratamento aqui descrito, ou uma medição em um indivíduo de controle (ou vários indivíduos de controle) na ausência do tratamento aqui descrito. Um “indivíduo de controle” é um indivíduo afligido com a mesma forma de doença de depósito lisossômica (por exemplo, MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B)) como o indivíduo a ser tratado, que tem aproximadamente a mesma idade que o indivíduo sendo tratado (para garantir que as diferentes fases da doença no indivíduo tratado e o indivíduo de controle são comparáveis).

[071] Indivíduo, sujeito, paciente: Tal como aqui utilizados, os termos “sujeito”, “indivíduo” ou “paciente” referem-se a um sujeito mamífero humano ou não humano. O indivíduo (também referido como “paciente” ou “sujeito”) sendo tratado é um indivíduo (feto, criança, um adolescente ou adulto humano) que sofre de uma doença de armazenamento lisossômico, por exemplo, a MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B) (isto é, ou de início infantil, juvenil ou adulto de tipo grave/clássica ou tipo atenuado de MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B)) ou tendo o potencial para desenvolver uma doença de depósito lisossômica (por exemplo, MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B)).

[072]Doenças de armazenamento lisossômico: Tal como aqui utilizado, “doenças de armazenamento lisossômico” referem-se a um grupo de distúrbios genéticos que resultam da deficiência em pelo menos uma das enzimas (por exemplo, hidrolases ácidas) que são necessárias para quebrar macromoléculas para reduzir para peptídeos, aminoácidos, monossacarídeos, ácidos nucleicos e ácidos graxos em lisossomas. Como resultado, os indivíduos que sofrem de doenças de depósito lisossômica têm materiais acumulados em lisossomas. As doenças de armazenamento lisossômico exemplificativas estão listadas na Tabela 1.

[073]Enzima lisossômica: Tal como aqui utilizado, o termo “enzima lisossômica” refere-se a qualquer enzima que é capaz de reduzir os materiais acumulados nos lisossomas de mamífero ou que podem resgatar ou melhorar um ou mais sintomas da doença de armazenamento lisossômico. As enzimas lisossômicas adequadas para a invenção incluem ambas enzimas do tipo-selvagem ou lisossômicas modificadas e podem ser produzidas utilizando métodos sintéticos e recombinantes ou purificados a partir de fontes naturais. Enzimas lisossômicas exemplificativos estão listadas na Tabela 1.

[074]Espaçador: Tal como aqui utilizado, o termo “espaçador” (também referida como “ligante”) refere-se a uma sequência de peptídeo entre duas frações de proteína em uma proteína de fusão. Um espaçador é geralmente concebido para ser flexível ou interpor uma estrutura, tal como uma alfa-hélice, entre as duas frações de proteína. Um espaçador pode ser relativamente pequeno, como por exemplo, a sequência Gly-Ala-Pro (GAP) (SEQ ID NO: 9), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS) (SEQ ID NO: 12), Gly-Gly-Gly-Gly-Ala (GGGGA) (SEQ ID NO: 60) ou Gly- Gly-Gly-Gly-Gly-Pro (GGGGGP) (SEQ ID NO: 13), ou pode ser mais longo, tal como, por exemplo, 10-25 aminoácidos de comprimento, 25-50 aminoácidos de comprimento, ou 35-55 aminoácidos de comprimento. Sequências de espaçador exemplificativas são divulgadas em maiores detalhes na Descrição Detalhada.

[075]Quantidade terapeuticamente eficaz: Tal como aqui utilizado, o termo “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade eficaz” refere-se a uma quantidade de uma proteína de fusão terapêutica de direcionamento que confere um efeito terapêutico no sujeito tratado, a uma proporção razoável de benefício/risco aplicável a qualquer tratamento médico. O efeito terapêutico pode ser objetivo (isto é, mensurável por algum ensaio ou marcador) ou subjetivo (isto é, sujeito dá uma indicação ou sente um efeito). Em particular, a “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade de uma proteína de fusão terapêutica ou composição eficaz para tratar, melhorar, ou prevenir uma doença ou condição desejada, ou para exibir um efeito terapêutico ou preventivo detectável, tal como através de melhora dos sintomas associados com a doença, a prevenção ou retardamento do aparecimento da doença, e/ou também diminuir a gravidade ou a frequência de sintomas da doença. Uma quantidade terapeuticamente eficaz é normalmente administrada em um regime de dosagem que pode compreender várias doses unitárias. Para qualquer proteína de fusão terapêutica particular, uma quantidade terapeuticamente eficaz (e/ou uma unidade de dosagem apropriada dentro de um regime de dosagem eficaz) pode variar, por exemplo, dependendo da via de administração, em combinação com outros agentes farmacêuticos. Além disso, a quantidade terapeuticamente eficaz específica (e/ou de dose unitária) para qualquer paciente particular pode depender de uma variedade de fatores incluindo o distúrbio sendo tratado e a gravidade do distúrbio; a atividade do agente farmacêutico específico empregado; a composição específica empregada; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, via de administração, e/ou a taxa de excreção ou metabolismo da proteína de fusão específica empregada; a duração do tratamento; e fatores semelhantes, como é bem conhecido nas técnicas médicas.

[076]Tratamento: Tal como aqui utilizado, o termo “tratamento” (também “tratar” ou “tratamento”) refere-se a qualquer administração de uma proteína de fusão terapêutica ou composição farmacêutica compreendendo a referida proteína de fusão terapêutica que alivia parcialmente ou completamente, melhora, alivia, inibe, atrasa o início do, reduz a gravidade de e/ou reduz a incidência de um ou mais sintomas ou características de uma doença, distúrbio e/ou estado particular. Tal tratamento pode ser de um sujeito que não apresenta sinais de doença relevante, distúrbio e/ou estado e/ou de um indivíduo que exibe apenas sinais precoces da doença, distúrbio e/ou condição. Alternativamente ou adicionalmente, esse tratamento pode ser de um sujeito que apresenta um ou mais sinais estabelecidos da doença em causa, distúrbio e/ou condição. Por exemplo, o tratamento pode referir-se a melhoria da função cardíaca (por exemplo, aumento de volume diastólico final e/ou sistólico final, ou redução, melhoria ou prevenção da cardiomiopatia progressiva que é tipicamente encontrada em, por exemplo, a doença de Pompe) ou de função pulmonar (por exemplo, aumento da capacidade vital de choro acima da capacidade da linha de base, e/ou normalização da dessaturação de oxigênio durante o choro); melhora no neurodesenvolvimento e/ou habilidades motoras (por exemplo, aumento de pontuação AIMS); redução de armazenamento (por exemplo, níveis de glicosaminoglicano (GAG), no tecido do indivíduo afetado pela doença; ou qualquer combinação destes efeitos Em algumas modalidades, o tratamento inclui a melhoria do clearance de glicosaminoglicano GAG), particularmente na redução ou prevenção de sintomas neuronais associados a MPS IIIB (síndrome de Sanfilippo B).

[077]Tal como utilizado neste pedido, os termos “cerca de” e “aproximadamente”, são usados como equivalentes. Quaisquer números utilizados neste pedido com ou sem cerca de/aproximadamente são destinados a cobrir quaisquer variações normais apreciadas por um dos especialistas na técnica relevante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[078]A presente invenção proporciona métodos e composições melhorados para direcionar as enzimas lisossômicas com base na tecnologia de direcionamento lisossômico independente de glicosilação (GILT). Entre outras coisas, a presente invenção proporciona muteínas de IGF-II que são resistentes a furina e/ou reduziram ou diminuíram a afinidade de ligação para o receptor de insulina, e/ou reduziram ou diminuíram a afinidade de ligação para o receptor de IGF-I e proteínas de fusão terapêuticas de direcionamento que contêm uma muteína de IGF-II da invenção. A presente invenção também fornece métodos para produzir e utilizar a mesma.

[079]Vários aspectos da invenção são descritos em detalhes nas seções seguintes. A utilização de seções não se destina a limitar a invenção. Cada seção pode ser aplicada a qualquer aspecto da invenção. Neste pedido de patente, o uso de “ou” significa “e/ou” a menos que indicado de outra forma.

Enzimas Lisossômicas

[080]Uma enzima lisossômica adequada para a presente invenção inclui qualquer enzima que é capaz de reduzir os materiais acumulados nos lisossomas de mamífero ou que podem resgatar ou melhorar um ou mais sintomas da doença de armazenamento lisossômico. Enzimas lisossômicas adequadas incluem ambas enzimas lisossômicas de tipo selvagem ou modificadas e podem ser produzidas utilizando métodos recombinantes ou sintéticos ou purificados a partir de fontes naturais. Enzimas lisossômicas exemplificativas estão listadas na Tabela 1. Tabela 1. Doenças por Armazenamento dos Lisossomas e defeitos de enzimas associadas

[081]Em algumas modalidades, uma enzima lisossômica aqui contemplada inclui uma sequência de polipeptídeo tendo 50-100%, incluindo 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e 100%, de identidade de sequência com a sequência de polinucleotídeo de ocorrência natural de uma enzima humana mostrada na Tabela 1, enquanto ainda codifica uma proteína que é funcional, isto é, capaz de reduzir os materiais acumulados, por exemplo, glicosaminoglicano (GAG), nos lisossomas de mamífero ou que podem resgatar ou melhorar um ou mais sintomas da doença de armazenamento lisossômico.

[082]A “percentagem (%) de identidade de sequência de aminoácidos” em relação às sequências de enzima lisossômica é definida como a percentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de enzima humana que ocorre naturalmente, após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para alcançar a percentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da percentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser conseguido de várias formas que estão dentro da especialidade na técnica, por exemplo, utilizando programas de computador disponíveis publicamente tais como os programas BLAST, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os especialistas na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências sendo comparado. De um modo preferencial, o software de WU-BLAST- 2 é utilizado para determinar a identidade de sequência de aminoácidos (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996). WU-BLAST-2 utiliza vários parâmetros de pesquisa, a maioria dos quais estão estabelecidos para os valores padrão. Os parâmetros ajustáveis são estabelecidos com os seguintes valores: vão de sobreposição = l, fração de sobreposição = 0,125, limiar de palavra (T) = 11 pontuação HSP (S) e parâmetros HSP S2 são valores dinâmicos e são estabelecidos pelo próprio programa, dependendo da composição da sequência em particular, no entanto, os valores mínimos podem ser ajustados e estão definidos como acima indicado.

Alfa-N-acetilglicosaminidase

[083]Alfa-N-acetilglicosaminidase, Naglu, é produzida como uma molécula precursora que é processada para uma forma madura. Este processo ocorre geralmente por remoção do peptídeo sinal de 23 aminoácidos conforme a proteína entra no retículo endoplasmático. Tipicamente, a forma precursora é também referida como precursor de comprimento total ou de comprimento completo da proteína Naglu, que contém 743 aminoácidos (SEQ ID NO: 1). Os N-terminais de 23 aminoácidos são clivados conforme a proteína precursora entra no retículo endoplasmático, resultando em uma forma processada ou madura. Assim, é contemplado que os 23 aminoácidos N-terminais, geralmente não são necessários para a atividade da proteína Naglu. As sequências de aminoácidos da forma madura e forma precursora de tamanho completo de uma típica proteína tipo selvagem ou de ocorrência natural de Naglu humana estão apresentadas na Figura 1 e definidas em SEQ ID NO: 1. A sequência de nucleotídeos da região de codificação de Naglu humana é apresentada em SEQ ID NO: 3. A sequência de mRNA de Naglu humana é descrita no Genbank Número de acessão NM_000263. Em várias modalidades, a Naglu é Naglu humana, com (aminoácidos 1-743) ou sem (aminoácidos 24-743) sequência de sinal.

[084]A Patente US No. 6.255.096 descreve que o peso molecular de alfa-N- acetilglicosaminidase humana purificada (isto é, 82 kDa e 77 kDa) e alfa-N- acetilglicosaminidase de mamífero recombinante produzida em células CHO (isto é, 89 kDa e 79 kDa) são maiores do que o peso molecular deduzido do polipeptídeo Naglu (isto é, 70 kDa), sugerindo que o polipeptídeo purificado e recombinante são modificados pós-tradução. Ver também Weber et al., Hum Mol Genet 5:. 771-777, 1996.

Mucopolissacaridose III B (Síndrome de Sanfilippo B)

[085]Uma doença de depósito lisossômica exemplar é doença de Mucopolissacaridose III B (MPS IIIB), também conhecida como Síndrome de Sanfilippo tipo B. MPS IIIB, Síndrome de Sanfilippo B, é um distúrbio genético recessiva autossômico raro que é caracterizado por uma deficiência da enzima alfa- N-acetil-glicosaminidase (Naglu). Na ausência desta enzima, glicosaminoglicanos (GAG), por exemplo, o sulfato de heparano GAG, e moléculas GAG parcialmente degradadas não podem ser eliminadas do corpo e se acumulam nos lisossomas de vários tecidos, o que resulta na disfunção somática generalizada progressiva (Kakkis et al., N Engl J Med 344 (3): 182-8, 2001). Foi demonstrado que os GAGs se acumulam nos lisossomas de neurônios e células gliais, com menor acumulação fora do cérebro.

[086]Quatro formas distintas de MPS III, designadas MPS III-A, B, C, e D, foram identificadas. Cada uma representa uma deficiência em uma das quatro enzimas envolvidas na degradação de sulfato de heparano de GAG (Tabela 1). Todas as formas incluem graus variáveis dos mesmos sintomas clínicos, incluindo características grosseiras faciais, hepatoesplenomegalia, opacificação da córnea e deformidades esqueléticas. Mais concretamente, no entanto, é a perda grave e progressiva da capacidade cognitiva, que está ligada não apenas para a acumulação de sulfato de heparano em neurônios, mas também a elevação subsequente dos gangliossídeos GM2, GM3 e GD2 causado por acumulação GAG primário (Walkley et al., Ann NY Acad Sci. 845: 188-99,1998).

[087]O aspecto clínico característico da Síndrome de Sanfilippo B é a degeneração do sistema nervoso central (CNS), o que resulta em perda de, ou fracasso para atingir, grandes marcos do desenvolvimento. O declínio cognitivo progressivo culmina com a demência e mortalidade prematura. A doença geralmente se manifesta em crianças pequenas, e o tempo de vida de um indivíduo afetado geralmente não se estende para além da adolescência para vinte e poucos anos.

[088]Doenças MPS III todos têm sintomas semelhantes que normalmente se manifestam em crianças pequenas. Crianças afetadas são aparentemente normais, embora algum dismorfismo facial suave possa ser perceptível. A rigidez articular, hirsutismo e pelos grossos típico de outras mucopolissacaridoses geralmente não estão presentes até o final da doença. Depois de um intervalo livre de sintoma inicial, os pacientes costumam apresentar com uma desaceleração do desenvolvimento e/ou problemas de comportamento, seguido de declínio intelectual progressivo, resultando em demência grave e doença motora progressiva. Aquisição de expressão é muitas vezes lenta e incompleta. A doença progride para aumentar distúrbio comportamental incluindo acessos de raiva, hiperatividade, destrutividade, comportamento agressivo, pica e perturbações do sono. Como as crianças afetadas têm força muscular normal e mobilidade, os distúrbios comportamentais são muito difíceis de gerir. Na fase final da doença, as crianças se tornam cada vez mais imóveis e sem resposta, muitas vezes necessitam de cadeiras de rodas, e desenvolvem dificuldades de deglutição e crises convulsivas. O tempo de vida de uma criança afetada não costuma se estender além da adolescência para vinte e poucos anos.

[089]Uma enzima alfa-N-acetilglicosaminidase adequada para o tratamento de MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B) inclui um alfa-N-acetilglicosaminidase humana de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1 ou 3), ou um fragmento funcional ou variante de sequência do mesmo que mantém a capacidade de ser absorvida em lisossomas de mamífero e para hidrolisar ligações alfa, 1,4 no resíduo terminal de N- acetil-D-glicosamina em oligossacarídeos lineares.

[090]A eficácia do tratamento de MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B) utilizando proteínas de fusão recombinantes terapêuticas de direcionamento, como aqui descritas pode ser medida utilizando técnicas conhecidas na técnica, bem como por análise de biomarcadores lisossômicas e neuronais. As experiências iniciais são realizadas em animais Naglu knock-out (ver Li et al, Proc Natl Acad Sci USA 96:. 14505-510, 1999). Naglu Knockouts apresentam com grandes quantidades de sulfato de heparano no fígado e no rim e elevação de gangliosídeos no cérebro.

[091]Os ensaios incluem a análise da atividade de e biodistribuição da enzima exógena, a redução do armazenamento de GAG nos lisossomas, particularmente em células do cérebro, e a ativação de astrócitos e microglia. Os níveis de vários biomarcadores lisossômicas ou neuronais incluem, entre outros, proteína da membrana associado a lisossoma 1 (LAMP1), glipicano, gangliosídeos, colesterol, Subunidade c de ATP sintase mitocondrial (SCMAS), ubiquitina, P- GSK3b, beta-amiloide e P-tau. Análise de sobrevivência e comportamental também é realizada usando técnicas conhecidas no campo.

[092]As experiências têm demonstrado que a subunidade C de proteína ATP sintase Mitocondrial (SCMAS) se acumula nos lisossomas de animais MPS IIIB (Ryazantsev et al., Mol Genet Metab 90 (4): 393-401, 2007). LAMP-1 e GM130 também demonstraram ser elevadas em animais MPS IIIB (Vitry et al, Am J Pathol 177 (6): 2984-99, 2010).

[093]Em várias modalidades, o tratamento de uma doença de armazenamento lisossômico refere-se à diminuição de armazenamento lisossômico (por exemplo, de GAG) em vários tecidos. Em várias modalidades, o tratamento refere-se à diminuição de armazenamento lisossômico em tecidos alvo do cérebro, os neurônios da medula espinhal, e/ou tecidos alvo periféricos. Em certas modalidades, o armazenamento lisossômico é reduzido em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ou mais, em comparação com um controle. Em várias modalidades, o armazenamento lisossômico é reduzido em pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes ou mais, em comparação com um controle.

[094]Em várias modalidades, o tratamento refere-se a um aumento da atividade da enzima em vários tecidos. Em várias modalidades, o tratamento refere- se a um aumento da atividade da enzima em tecidos cerebrais alvo, os neurônios da medula espinhal e/ou tecidos alvo periféricos. Em várias modalidades, a atividade da enzima é aumentada em cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70 %, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% ou mais, em comparação com um controle. Em várias modalidades, a atividade da enzima é aumentada de pelo menos 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes maior, 10 vezes maior ou mais, em comparação com um controle. Em várias modalidades, um aumento da atividade enzimática é de pelo menos cerca de 10 nmol/h/mg, 20 nmol/h/mg, 40 nmol/h/mg, 50 nmol/h/mg, 60 nmol/h/mg, 70 nmol/h/mg, 80 nmol/h/mg, 90 nmol/h/mg, 100 nmol/h/mg, 150 nmol/h/mg, 200 nmol/h/mg, 250 nmol/h/mg, 300 nmol/h/mg, 350 nmol/h/mg, 400 nmol/h/mg, 450 nmol/h/mg, 500 nmol/h/mg, 550 nmol/h/mg, 600 nmol/h/mg ou mais. Em várias modalidades, a enzima lisossômica é Naglu.

Terapia de Reposição Enzimática

[095]Terapia de reposição enzimática (ERT) é uma estratégia terapêutica para corrigir uma deficiência da enzima por infusão da enzima em falta para a corrente sanguínea. À medida que o sangue perfunde tecidos do paciente, a enzima é absorvida por células e transportada para o lisossoma, onde a enzima atua para eliminar material que tenha acumulado nos lisossomas devido à deficiência da enzima. Para terapia de reposição enzimática lisossômica ser eficaz, a enzima terapêutica deve ser liberada para os lisossomas nas células apropriadas em tecidos onde o defeito de armazenamento é manifesto. Terapias de reposição enzimática lisossômica convencionais são liberadas usando carboidratos naturalmente ligados à proteína para engatar receptores específicos na superfície das células alvo. Um receptor, o receptor de M6P independente de cátions (CI-MPR), é particularmente útil para direcionar enzimas lisossômicas de reposição porque a CI-MPR está presente na superfície da maioria dos tipos de células.

[096]Os termos “receptor de manose-6-fosfato independente de cátions (CI- MPR)”, “receptor de M6P/IGF-II”, “receptor de CI-MPR/IGF-II”, “receptor do IGF-II” ou “Receptor de IGF2”, ou as abreviaturas dos mesmos, são usados aqui indiscriminadamente, referindo-se ao receptor celular que se liga ao M6P e IGF-II.

Terapia de combinação para tornar o sujeito tolerante à Terapia de Reposição Enzimática

[097]Verificou-se que, durante a administração de agentes, tais como proteínas recombinantes e outros agentes terapêuticos, um sujeito pode montar uma resposta imune contra estes agentes, que leva à produção de anticorpos que se ligam e interferem com a atividade terapêutica, assim como causa reações imunológicas agudas ou crônicas. Este problema é mais significativo para proteínas terapêuticas, pois as proteínas são antígenos do complexo e, em muitos casos, o sujeito é imunologicamente naive para os antígenos. Assim, em certos aspectos da presente invenção, pode ser útil para tornar o indivíduo que recebe a enzima terapêutica tolerante à terapia de reposição enzimática. Neste contexto, a terapia de reposição enzimática pode ser administrada ao sujeito como uma terapia de combinação com um regime que torne tolerante.

[098]A Patente US 7.485.314 (aqui incorporada por referência) revela o tratamento de distúrbios de armazenamento lisossômico, usando a indução de tolerância imunológica. Em resumo, a utilização de um dito regime de indução de tolerância pode ser útil para impedir a montagem de uma resposta imune à terapia de reposição enzimática e diminuindo desse modo ou de outro modo tornando ineficazes os potenciais efeitos benéficos da terapia de reposição enzimática objeto.

[099]Em um método, a invenção contempla a reduzir ou prevenir uma resposta imune específica para o antígeno clinicamente significativa à proteína de fusão recombinante terapêutica, por exemplo, compreendendo Naglu, utilizada para tratar um distúrbio de armazenamento lisossômico, por exemplo, mucopolissacaridose IIIB (MPS IIIB ou Sanfilippo Síndrome B), onde a proteína de fusão é administrada por via intratecal. O método emprega um regime inicial de 3060 dias de um agente imunossupressor das células T, tais como a ciclosporina A (CsA) e de um agente anti-proliferativo, tais como, azatioprina (Aza), combinado com infusões semanais por via intratecal de doses baixas de enzima, por exemplo, Naglu. A resposta de IgG forte típica para infusões semanais de enzima se tornarem muito reduzida ou evitada utilizando um regime de 60 dias de drogas imunossupressoras, ciclosporina A (CsA) e azatioprina (Aza), combinado com infusões intravenosas semanais intratecais ou de baixas doses de proteínas de fusão compreendendo enzima. Usando tais regimes de indução de tolerância, será possível tornar o sujeito tolerante para as doses terapêuticas mais elevadas de proteína de fusão terapêutica durante até 6 meses, sem um aumento no título de anticorpos contra Naglu, ou na verdade qualquer outra enzima que pode ser utilizada para a reposição enzimática de doença de depósito lisossômica. Tais regimes de tolerização foram descritos na Patente US No. 7.485.314.

Direcionamento Lisossômico Independente de Glicosilação

[0100]A tecnologia de direcionamento lisossômico independente de glicosilação (GILT) foi desenvolvida para direcionar enzimas terapêuticas para os lisossomas. Especificamente, a tecnologia GILT usa um marcador de peptídeo em vez de M6P para envolver o CI-MPR para direcionamento lisossômico. Tipicamente, um marcador GILT é uma proteína, peptídeo, ou outra fração que se liga a CI-MPR em uma forma independente de manose-6-fosfato. Vantajosamente, esta tecnologia imita o mecanismo biológico normal para captação de enzimas lisossômicas, ainda faz isso de uma maneira independente de manose-6-fosfato.

[0101]Um marcador GILT preferencial é derivado de fator de crescimento tipo insulina II humano (IGF-II). IGF-II é um ligante de alta afinidade para a CI-MPR, que é também referido como o receptor do IGF-II. A ligação de enzimas terapêuticas marcadas para GILT para o receptor de M6P/IGF-II direciona a proteína para o lisossoma pela via de endocitose. Este método tem inúmeras vantagens sobre os métodos que envolvem glicosilação incluindo simplicidade e eficácia de custo, porque uma vez que a proteína é isolada, nenhuma outra modificação precisa ser feita.

[0102]A descrição detalhada da tecnologia GILT e marcador GILT e pode ser encontrados na Publicação US 20030082176, 20040006008, 20040005309, 20050281805 e, os ensinamentos de todas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

Tag GILT resistente a Furina

[0103]Durante o curso do desenvolvimento de enzimas lisossômicas marcadas para GILT para tratamento de doença de armazenamento lisossômico, tornou-se aparente que o marcador GILT derivado de IGF-II pode ser submetido a clivagem proteolítica por furina durante a produção em células de mamíferos (ver a seção de exemplos). Furina protease tipicamente reconhece e cliva um sítio de clivagem que tem uma sequência de consenso Arg-X-X-Arg (SEQ ID NO: 6), X é qualquer aminoácido. O sítio de clivagem é posicionado após o resíduo de arginina do carboxi terminal (Arg) na sequência. Em algumas modalidades, um sítio de clivagem de furina tem uma sequência de consenso Lis/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO: 7), X é qualquer aminoácido. O sítio de clivagem é posicionado após o resíduo de arginina do carboxi terminal (Arg) na sequência. Tal como aqui utilizado, o termo “furina” refere-se a qualquer protease que é capaz de reconhecer e clivar o sítio de clivagem de furina protease, tal como aqui definido, incluindo furina ou proteases do tipo furina. A furina também é conhecida como enzima de clivagem de aminoácido básico pareado (PACE). A furina pertence à família da convertase pró- proteína tipo subtilisina que inclui PC3, uma protease responsável pela maturação de pró-insulina nas células das ilhotas pancreáticas. O gene que codifica furina era conhecido como FUR (região à montante de FES).

[0104]A sequência de peptídeo IGF-II humana madura é mostrada abaixo.

AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRtRSRtGIVEECCFR SCDLALLETYC ATPAKSE (SEQ ID NO: 5)

[0105]Como pode ser visto, o IGF-II maduro humano contém dois potenciais sítios de clivagem de furina de sobreposição entre os resíduos 34-40 (em negrito e sublinhado). Setas são inseridas em duas posições potenciais de clivagem de furina.

[0106]Tags GILT modificados que são resistentes à clivagem pela furina e ainda mantêm a capacidade de se ligar a CI-MPR de uma forma de independente de manose-6-fosfato são divulgados no documento US 20110223147. Especificamente, os tags GILT resistente à furina podem ser concebidos por mutação da sequência de aminoácidos em um ou mais locais de clivagem de furina, tais que a mutação suprime pelo menos um sítio de clivagem de furina. Assim, em algumas modalidades, marcador GILT resistente à furina é uma muteína de IGF-II resistente à furina contendo uma mutação que elimina, pelo menos, um sítio de clivagem de furina protease ou muda uma sequência adjacente ao sítio de clivagem da furina protease tais que a clivagem da furina está impedida, inibida, reduzida ou retardada, em comparação com um peptídeo IGF-II tipo selvagem (por exemplo, IGF-II maduro humano do tipo-selvagem). Tipicamente, uma mutação adequada não tem impacto sobre a capacidade do marcador GILT resistente à furina para se ligar ao receptor de manose-6-fosfato independente de cátions humano. Em particular, um muteína de IGF-II resistente à furina adequada para a invenção se liga ao receptor de manose-6-fosfato humano independente de cátions de uma forma independente de manose-6-fosfato com uma constante de dissociação de 10-7M ou inferior (por exemplo, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, ou menos), a pH 7,4. Em algumas modalidades, uma muteína de IGF-II resistente à furina contém uma mutação em uma região que corresponde aos aminoácidos 30-40 (por exemplo, 30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 3440, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 33-39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40) de IGF-II humano maduro. Em algumas modalidades, uma mutação apropriada elimina, pelo menos, um sítio de clivagem de furina protease. Uma mutação pode ser substituições, deleções, inserções de aminoácidos. Por exemplo, qualquer um aminoácido dentro da região que corresponde aos resíduos 30-40 (por exemplo, 30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 33-39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40) da SEQ ID NO: 5 pode ser substituído por qualquer outro aminoácido ou deletado. Por exemplo, substituições na posição 34 podem afetar o reconhecimento de furina do primeiro sítio de clivagem. A inserção de um ou mais aminoácidos dentro de cada sítio de reconhecimento pode eliminar um ou ambos os sítios de clivagem de furina. A deleção de um ou mais dos resíduos nas posições degeneradas pode também abolir ambos os sítios de clivagem de furina.

[0107]Em várias modalidades, uma muteína de IGF-II resistente à furina contém substituições de aminoácidos nas posições correspondentes a Arg37 ou Arg40 de IGF-II humano maduro. Em algumas modalidades, uma muteína de IGF-II resistente à furina contém uma substituição, Lys ou Ala nas posições Arg37 ou Arg40. Outras substituições são possíveis, incluindo combinações de Lys e/ou mutações Ala em ambas as posições 37 e 40, ou substituições de diferentes aminoácidos além de Lys ou Ala.

[0108]Em várias modalidades, uma muteína de IGF-II, adequada para utilização na presente invenção pode conter mutações adicionais. Por exemplo, até 30% ou mais dos resíduos de SEQ ID NO: l pode ser alterada (por exemplo, até 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% ou mais resíduos podem ser alterados). Assim, uma muteína de IGF-II adequada para utilização na presente invenção pode ter uma sequência de aminoácidos pelo menos 70%, incluindo, pelo menos, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais idênticos para IGF-II humano maduro.

[0109]Em várias modalidades, uma muteína de IGF-II adequada para utilização na presente invenção dirige-se especificamente para a CI-MPR. Particularmente úteis são as mutações no polipeptídeo IGF-II, que resultam em uma proteína que se liga a CI-MPR com elevada afinidade (por exemplo, com uma constante de dissociação de 10-7 M ou inferior, a pH 7,4) enquanto que a ligação a outros receptores conhecidos para ser ligada por IGF-II com afinidade reduzida relativamente ao IGF-II nativo. Por exemplo, um muteína de IGF-II resistente à furina adequada para a invenção pode ser modificada para ter afinidade diminuída para o receptor de IGF-I em relação à afinidade de IGF-II humano de ocorrência natural para o receptor do IGF-I. Por exemplo, a substituição de resíduos IGF-II Tyr27 com Leu, Leu43 com Val ou Ser26 com Phe diminui a afinidade do IGF-II para o receptor de IGF-I por 94, 56, e 4 vezes, respectivamente (Torres et al (1995) J. Mol Biol 248 (2): 385-401). A deleção de resíduos 1-7 de IGF-II humano resultou em uma diminuição de 30 vezes na afinidade para o receptor de IGF-I humano e um concomitante aumento de 12 vezes na afinidade para o receptor de IGF-II de rato (Hashimoto et al (1995) J. Biol Chem 270 (30): 18013-8). A estrutura de RMN do IGF-II mostra que Tre-7 está localizado perto de resíduos Phe-48 Phe e Ser-50, bem como perto da ponte de dissulfeto Cys-9-Cys-47. Acredita-se que a interação de Thr- 7 com estes resíduos pode estabilizar o hexapeptídeo N-terminal flexível necessário para ligação ao Receptor de IGF-I (Terasawa et al. (1994) EMBO J. 13 (23) 5590-7). Ao mesmo tempo, esta interação pode modular a ligação para o receptor de IGF-II. O truncamento do C-terminal de IGF-II (resíduos 62-67) também parece diminuir a afinidade do IGF-II para o receptor de IGF-I por 5 vezes (Roth et al. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 181 (2): 907-14).

[0110]As superfícies de ligação para o IGF-I e os receptores de M6P independentes de cátions estão em faces separadas de IGF-II. Com base em dados estruturais e mutacionais, domínios de ligação M6P independentes de cátions funcionais podem ser fabricados que são substancialmente menores do que o IGF-II humano. Por exemplo, os aminoácidos amino-terminais (por exemplo, 1-7 ou 2-7) e/ou os resíduos carboxi-terminais 62-67 podem ser eliminados ou substituídos. Além disso, os aminoácidos 29-40 podem provavelmente ser eliminados ou substituídos sem alterar a dobragem do restante do polipeptídeo ou ligação ao receptor de M6P, independente de cátions. Assim, uma fração de direcionamento incluindo os aminoácidos 8-28 e 41-61 pode ser construída. Estes trechos de aminoácidos podem, talvez, ser unidos diretamente ou separados por um ligante. Alternativamente, os aminoácidos 8-28 e 41-61 podem ser fornecidos a cadeias polipeptídicas separadas. Domínios comparáveis de insulina, que são homólogos ao IGF-II e que têm uma estrutura terciária intimamente relacionada com a estrutura de IGF-II, têm a informação estrutural suficiente para permitir a redobragem apropriada para a estrutura terciária apropriada, mesmo quando presentes em cadeias polipeptídicas separadas (Wang et al. (1991) Trends Biochem. Sci. 279-281). Assim, por exemplo, os aminoácidos 8-28, ou uma variante de substituição conservativa, podem ser fundidos com uma enzima lisossômica; a proteína de fusão resultante pode ser misturada com os aminoácidos 41-61, ou uma variante de substituição conservativa, e administrada a um paciente.

[0111]IGF-II também pode ser modificado para minimizar a ligação de proteínas de ligação a IGF sérico (Baxter (2000) Am J. Physiol Endocrinol Metab 278 (6): 967-76) para evitar o sequestro de construtos IGF-II/GILT. Um número de estudos localizou resíduos de IGF-II necessários para a ligação a proteínas de ligação a IGF. Construtos com mutações nestes resíduos podem ser triados para a retenção de ligação de elevada afinidade ao receptor M6P/IGF-II e de reduzida afinidade para as proteínas de ligação ao IGF. Por exemplo, a substituição de Phe- 26 de IGF-II com Ser é relatada para reduzir a afinidade do IGF-II para a IGFBP-1 e - 6 sem efeito na ligação ao receptor de M6P/IGF-II (Bach et al. (1993) J. Biol Chem 268 (13): 9246-54). Outras substituições, tais como Lys para Glu-9, pode também ser vantajosas. As mutações análogas, separadamente ou em combinação, em uma região de IGF-I que são altamente conservadas com IGF-II resulta em grande decréscimo na ligação de IGF-BP (Magee et al (1999) Biochemistry 38 (48): 1586370).

[0112]Uma abordagem alternativa é a de identificar regiões mínimas de IGF- II que podem se ligar com elevada afinidade ao receptor de M6P/IGF-II. Os resíduos que foram implicados na ligação de IGF-II ao receptor de M6P/IGF-II principalmente agrupar em uma face de IGF-II (Terasawa et al (1994) EMBO J. 13 (23): 5590-7). Embora a estrutura terciária de IGF-II seja normalmente mantida por três ligações dissulfeto intramoleculares, um peptídeo que incorpora a sequência de aminoácidos na superfície de ligação de receptor de M6P/IGF-II de IGF-II pode ser concebido para dobrar corretamente e ter atividade de ligação. Um dito peptídeo de ligação mínima é um domínio de direcionamento lisossômico altamente preferencial. Por exemplo, um domínio de direcionamento lisossômico preferencial é constituído pelos aminoácidos 8-67 de IGF-II humano. Peptídeos concebidos, com base na região em torno de aminoácidos 48-55, que se ligam ao receptor de M6P/IGF-II, são também domínios de direcionamento lisossômico desejáveis. Alternativamente, uma biblioteca aleatória de peptídeos pode ser triada quanto à capacidade para se ligarem ao receptor de M6P/IGF-II, através de um ensaio de dois híbridos de levedura, ou através de um ensaio tipo exibição de fago.

Afinidade de ligação para o receptor de insulina

[0113]Muitas muteínas de IGF-II, incluindo muteínas de IGF-II resistentes a furina, aqui descritas têm pouca ou nenhuma afinidade de ligação diminuída para o receptor de insulina. Assim, em algumas modalidades, um marcador de peptídeo adequado para a presente invenção reduziu ou diminuiu a afinidade de ligação para o receptor da insulina relativamente à afinidade de IGF-II humano de ocorrência natural para o receptor de insulina. Em algumas modalidades, tags de peptídeos com afinidade de ligação reduzida ou diminuída para o receptor de insulina adequados para a presente invenção incluem tags de peptídeos tendo uma afinidade de ligação para o receptor de insulina, que é mais do que 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 12 vezes, 14 vezes, 16 vezes, 18 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, ou 100 vezes menos do que a do IGF-II tipo selvagem maduro humano. A afinidade de ligação para o receptor de insulina pode ser medida utilizando vários ensaios in vitro e in vivo conhecidos na técnica. Exemplos de ensaios de ligação são descritos na seção de Exemplos.

Mutagênese

[0114]Muteínas de IGF-II podem ser preparadas por introdução das alterações de nucleotídeos apropriadas no DNA de IGF-II, ou por síntese do polipeptídeo IGF-II desejado. As variações na sequência de IGF-II podem ser feitas, por exemplo, utilizando quaisquer das técnicas e orientações para mutações conservativas e não conservativas estabelecidas, por exemplo, na Pat. No. 5.364.934. As variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais códons que codificam IGF-II, que resulta em uma alteração na sequência de aminoácidos de IGF-II em comparação com uma sequência que ocorre naturalmente de IGF-II humano maduro. As substituições de aminoácidos podem ser o resultado de substituir um aminoácido com outro aminoácido tendo propriedades estruturais e/ou químicas semelhantes, tais como a substituição de uma leucina por uma serina, ou seja, substituições de aminoácidos conservativas. As substituições de aminoácidos também pode ser o resultado de substituir um aminoácido com outro aminoácido tendo propriedades estruturais dissimilares e/ou químicas, isto é, substituições de aminoácidos não conservativas. As inserções ou deleções podem opcionalmente estar na faixa de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada fazendo sistematicamente inserções, deleções ou substituições de aminoácidos na sequência e testar as variantes resultantes quanto à atividade em ensaios in vivo ou in vitro conhecidos na técnica (tais como os ensaios de ligação ao CI-MPR ou ensaios de clivagem de furina).

[0115]A análise de aminoácido por varrimento pode também ser empregada para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma sequência contígua. Entre os aminoácidos de varrimento preferenciais estão os aminoácidos neutros relativamente pequenos. Tais aminoácidos incluem alanina, glicina, serina, e cisteína. A alanina é tipicamente um aminoácido de varrimento preferencial entre este grupo porque elimina a cadeia lateral além do carbono beta e é menos provável que altere a conformação da cadeia principal da variante. A alanina é também tipicamente preferencial porque é o aminoácido mais comum. Além disso, é frequentemente encontrada em posições enterradas e expostas [Creighton, The Proteins, (WH Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]. Se a substituição por alanina não originar quantidades adequadas de variante, um aminoácido isotérico pode ser usado.

[0116]As variações podem ser feitas utilizando métodos conhecidos na técnica, tais como mutagênese mediada por oligonucleotídeos (direcionada ao sítio), varrimento de alanina e mutagênese por PCR. A mutagênese direcionada ao sítio [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)], mutagênese de cassete [Wells et al. Gene, 34: 315 (1985)], mutagênese de seleção de restrição [Wells et al, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir as muteínas de IGF-II.

Espaçador

[0117]Um marcador GILT pode ser fundido com o N terminal ou C terminal de uma enzima do lisossoma. O marcador GILT pode ser fundido diretamente com a enzima lisossômica ou pode ser separado da enzima lisossômica por um ligante ou espaçador. Um ligante aminoácidos ou espaçador de é geralmente concebido para ser rígido, flexível ou interpor uma estrutura, tal como uma alfa-hélice, entre as duas frações de proteína. Um ligante ou espaçador pode ser relativamente curto, tal como, por exemplo, a sequência Gly-Ala-Pro (GAP) (SEQ ID NO: 9), Gly-Gly-Gly- Gly-Ala (GGGGA) (SEQ ID NO: 60) ou Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS) (SEQ ID NO: 12), ou pode ser mais longo, tal como, por exemplo, 10-25 aminoácidos de comprimento, 25-50 aminoácidos de comprimento, ou 35-55 aminoácidos de comprimento. O sítio de uma junção de fusão deve ser escolhido com cuidado para promover a dobragem correta e a atividade de ambos os parceiros de fusão e para impedir a separação prematura de um marcador de peptídeo da enzima lisossômica, por exemplo, alfa-N-acetilglicosaminidase.

[0118]Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos GGGPS (SEQ ID NO: 14) ou GGGSP (SEQ ID NO: 15), e, opcionalmente, compreende ainda um ou mais de (i), GAP (SEQ ID NO: 9), (ii) GGGGS (SEQ ID NO: 12), (iii) GGGS (SEQ ID NO: 16), (iv) AAAAS (SEQ ID NO: 17), (v) AAAS (SEQ ID NO: 18), (vi) PAPA (SEQ ID NO: 19), (vii) TPAPA (SEQ ID NO: 20), (viii) AAAKE (SEQ ID NO: 21) ou (ix) GGGGA (SEQ ID NO: 60). Em várias modalidades, o espaçador compreende a sequência de aminoácidos GAP (SEQ ID NO: 9), GPS (SEQ ID NO: 10), ou GGS (SEQ ID NO: 11).

[0119]Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos GGGGS (SEQ ID NO: 12) ou GGGS (SEQ ID NO: 16). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos GGGPS (SEQ ID NO: 14) ou GGGSP (SEQ ID NO: 15). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos AAAAS (SEQ ID NO: 17) ou AAAS (SEQ ID NO: 18). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos PAPA (SEQ ID NO: 19) ou TPAPA (SEQ ID NO: 20). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos AAAKE (SEQ ID NO: 21). Em várias modalidades, o peptídeo espaçador compreende uma ou mais sequências de aminoácidos GGGGA (SEQ ID NO: 60).

[0120]Em várias modalidades, o espaçador de peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em: (GGGGS)n (SEQ ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n- GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n- GAP (SEQ ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 163169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 170218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 219-267), GAP- (GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 268-316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n- PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEQ ID NOs: 544-551), (GGGGA)n (SEQ ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEQ ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n- GGGPS-GAP (SEQ ID NOs: 334-340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEQ ID NOs: 397-445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n- PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEQ ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP- (Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEQ ID NOs: 552-559); em que n é de 1 a 7. Em várias modalidades, n é 1 a 4.

[0121]Em várias modalidades, o espaçador é selecionado a partir do grupo que consiste em EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22), GAP (SEQ ID NO: 9), GGGGS (SEQ ID NO: 12), GPSGSPG (SEQ ID NO: 23), GPSGSPGT (SEQ ID NO: 24), GPSGSPGH (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GPSGAP (SEQ ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGG GPSGAP (SEQ ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 59), GGGGA (SEQ ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [ou (GGGGA)8GGGPS] (SEQ ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [ou (GGGGA)8GGGPSH] (SEQ ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [ou (GGGGA)9GGGPS] (SEQ ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS H [ou (GGGGA)9GGGPSH] (SEQ ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 89), e GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 90).

[0122]Em várias modalidades, o espaçador é selecionado a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

[0123]Em várias modalidades, o espaçador é selecionado a partir do grupo que consiste em GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

[0124]Construções adicionais de proteínas alfa-N-acetilglicosaminidase marcadas para GILT que podem ser utilizadas nos métodos e composições da presente invenção foram descritas em detalhe na Publicação US 20050244400 e 20050281805, cujas descrições se encontram aqui incorporadas por referência.

Células

[0125]Qualquer célula de mamífero ou tipo de célula susceptível a cultura de células, e a expressão de polipeptídeos, pode ser utilizada de acordo com a presente invenção, tais como, por exemplo, células de rim embrionário humano (HEK) 293, de ovário de hamster chinês (CHO), de rim de macaco (COS), HT1080, CIO, HeLa, de rim de hamster bebê (BHK), 3T3, C127, CV-1, HaK, NS/0, e L-929. Exemplos não limitantes de células de mamífero que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção incluem, entre outras, linhagem de mieloma de camundongos BALB/c (NS0/1, ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Holanda)); linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al, J. Gen. Virol, 36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês +/-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc Natl Acad Sci USA, 77: 4216 (1980)); células de Sertoli de camundongos (TM4, Mather, Biol Reprod, 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); Células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células do pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongos (MMT 060562, ATCC CCL51); Células TRI (Mather et al, Annals NY Acad Sci, 383: 44-68 (1982)); Células MRC 5; Células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Em algumas modalidades, a proteína de fusão da presente invenção é produzida a partir de linhagens celulares de CHO.

[0126]A proteína de fusão da invenção pode também ser expressa em uma variedade de células hospedeiras não mamíferas, tais como, por exemplo, células de inseto (por exemplo, Sf-9, Sf-21, Hi5), vegetais (por exemplo, Leguminosa, cereais, ou tabaco), leveduras (por exemplo, S. cerivisae, P. pastoris), procariota (por exemplo, E. coli, B. subtilis e outras Bacillus spp., Pseudomonas spp., Streptomyces spp), ou fungos.

[0127]Em algumas modalidades, uma proteína de fusão com ou sem um marcador GILT resistente à furina pode ser produzida em células deficientes de furina. Tal como aqui utilizado, o termo “células deficientes em furina” refere-se a quaisquer células cuja atividade de furina protease é inibida, reduzida ou eliminada. As células deficientes de furina incluem ambas células de mamíferos e de não mamíferos que não produzem furina ou produzem quantidade reduzida ou furina protease defeituosa. Exemplos de células deficientes em furina que são conhecidas e disponíveis para o especialista na técnica, incluindo, entre outras, células FD11 (Gordon et al (1997) Infection and Immunity 65 (8): 3370 3375), e as células mutantes descritas em Moebring e Moehring (1983) Infection and Immunity 41 (3): 998 1009. Em alternativa, uma célula deficiente em furina pode ser obtida por exposição das células de mamífero e não mamíferos acima descritas para tratamento de mutagênese, por exemplo, irradiação, brometo de etídio, uridina bromidada (BrdU) e outros, de preferência mutagênese química, e mais preferencial mutagênese de metano sulfonato de etila, recuperando as células que sobrevivem ao tratamento e seleção para as células que demonstram ser resistentes à toxicidade da exotoxina A de Pseudomonas (ver Moehring e Moehrin (1983) Infection and Immunity 41 (3): 998 1009).

[0128]Em várias modalidades, está contemplado que certas das proteínas terapêuticas direcionadas compreendendo um espaçador, tal como aqui descrito pode exibir um aumento da expressão da proteína ativa quando expressa de forma recombinante em comparação com proteínas terapêuticas direcionadas compreendendo um espaçador de peptídeo diferente. Em várias modalidades, é também contemplado que as proteínas terapêuticas de direcionamento aqui descritas podem ter um aumento da atividade em comparação com outras proteínas terapêuticas direcionadas da presente invenção. É contemplado que estas proteínas terapêuticas de direcionamento que exibem um aumento da expressão da proteína ativa e/ou tendo um aumento da atividade em comparação com outras proteínas terapêuticas direcionadas compreendendo um peptídeo espaçador diferentes são usadas para posterior experimentação.

Administração de proteínas terapêuticas

[0129]De acordo com a invenção, uma proteína terapêutica da invenção é tipicamente administrada ao indivíduo isoladamente, ou em composições ou medicamentos que compreendem a proteína terapêutica (por exemplo, na fabricação de um medicamento para o tratamento da doença), conforme aqui descrito. As composições podem ser formuladas com um veículo ou excipiente fisiologicamente aceitável para preparar uma composição farmacêutica. O transportador e a composição podem ser esterilizados. A formulação deve ser adequada ao modo de administração.

[0130]Transportadoras farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem, entre outros, água, soluções salinas (por exemplo, NaCl), salina, salina tamponada, álcoois, glicerol, etanol, goma arábica, óleos vegetais, álcoois benzílicos, polietilenoglicóis, gelatina, carboidratos tais como lactose, amilose ou amido, açúcares, tais como manitol, sacarose, ou outros, dextrose, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, óleo de perfume, ésteres de ácidos graxos, hidroximetilcelulose, polivinilpirrolidona, etc, bem como suas combinações. As preparações farmacêuticas podem, se desejado, ser misturadas com agentes auxiliares (por exemplo, lubrificantes, conservantes, estabilizantes, agentes umectantes, emulsionantes, sais para influenciar a pressão osmótica, tampões, corantes, substâncias aromatizantes e/ou aromáticas e similares), que não reagem de forma prejudicial com os compostos ativos ou interferem com a sua atividade. Em uma modalidade preferencial, um transportador solúvel em água adequada para administração intravenosa é utilizada.

[0131]A composição ou medicamento, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes umectantes ou emulsionantes, ou agentes de tamponamento do pH. A composição pode ser uma solução líquida, suspensão, emulsão, comprimido, pílula, cápsula, formulação de liberação sustentada, ou pó. A composição também pode ser formulada como um supositório, com ligantes e veículos tradicionais tais como triglicerídeos. A formulação oral pode incluir veículos padrões tais como qualidades farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, polivinilpirrolidona, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio, etc.

[0132]A composição ou medicamento pode ser formulado de acordo com os procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração a seres humanos. Por exemplo, em uma modalidade preferencial, uma composição para administração intravenosa é tipicamente uma solução em tampão aquoso isotônico estéril. Sempre que necessário, a composição pode também incluir um agente solubilizante e um anestésico local para aliviar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são fornecidos separadamente ou misturados em conjunto na forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água em um recipiente hermeticamente vedado tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Quando a composição é para ser administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água estéril de qualidade farmacêutica, solução salina ou dextrose/água. Quando a composição é administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[0133]A proteína terapêutica pode ser formulada como formas neutras ou de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os formados com grupos amino livres tais como os derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc, e os formados com grupos carboxil livres tais como os derivados de sódio, potássio, amónio, cálcio, férrico hidróxidos, isopropilamina, trietilamina, 2- etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

[0134]Uma proteína terapêutica (ou uma composição ou medicamento contendo uma proteína terapêutica) é administrada por qualquer via apropriada. Em várias modalidades, uma proteína terapêutica é administrada por via intravenosa. Em outras modalidades, uma proteína terapêutica é administrada por administração direta a um tecido alvo, tal como coração ou músculo (por exemplo, intramuscular), ou sistema nervoso (por exemplo, injeção direta no cérebro; intraventricular, intratecal). Em várias modalidades, uma proteína terapêutica é administrada por via intratecal. Alternativamente, uma proteína terapêutica (ou uma composição ou medicamento contendo uma proteína terapêutica) pode ser administrada por via parenteral, transdérmica, ou transmucosa (por exemplo, por via oral ou por via nasal). Mais do que uma via pode ser utilizada simultaneamente, se desejado, por exemplo, uma proteína terapêutica é administrada por via intravenosa e por via intratecal. Administração intravenosa e intratecal concomitante não precisam ser simultânea, mas podem ser sequencial.

[0135]Uma proteína terapêutica (ou uma composição ou medicamento contendo uma proteína terapêutica) pode ser administrada sozinha, ou em conjunto com outros agentes, tais como anti-histamínicos (por exemplo, difenidramina) ou imunossupressores ou outros agentes imunoterápicos que neutralizam anticorpos de enzima lisossômica-anti-GILT marcado. O termo, “em conjunto com”, indica que o agente é administrado antes de, mais ou menos ao mesmo tempo que, ou após a proteína terapêutica (ou uma composição ou medicamento contendo a proteína terapêutica). Por exemplo, o agente pode ser misturado a uma composição contendo a proteína terapêutica, e, assim, administrado simultaneamente com a proteína terapêutica; alternativamente, o agente pode ser administrado contemporaneamente, sem misturar (por exemplo, por liberação em “verticalização” do agente na linha intravenosa, através da qual a proteína terapêutica é também administrada, ou vice-versa). Em outro exemplo, o agente pode ser administrado separadamente (por exemplo, não misturado), mas dentro de um curto espaço de tempo (por exemplo, dentro de 24 horas) de administração da proteína terapêutica.

[0136]A proteína terapêutica (ou composição ou medicamento contendo a proteína terapêutica) é administrada em uma quantidade terapeuticamente eficaz (isto é, uma quantidade de dosagem que, quando administrada a intervalos regulares, é suficiente para tratar a doença, tal como por melhora de sintomas associados com a doença, prevenindo ou retardando o início da doença, e/ou também diminuindo a gravidade ou a frequência dos sintomas da doença, como descrito acima). A dose que será terapeuticamente eficaz para o tratamento da doença irá depender da natureza e extensão dos efeitos da doença, e pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. Além disso, ensaios in vitro ou in vivo podem opcionalmente ser empregados para ajudar a identificar os intervalos de dosagem ideais utilizando métodos conhecidos na técnica. A dose precisa sendo utilizada também dependerá da via de administração, e a gravidade da doença, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do praticante e das circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de dose-resposta derivadas de sistemas de ensaio em modelo in vitro ou animais. A quantidade de dosagem terapeuticamente eficaz pode ser, por exemplo, cerca de 0,1-1 mg/kg, cerca de 1-5 mg/kg, cerca de 2,5-20 mg/kg, cerca de 5-20 mg/kg, cerca de 20-50 mg/kg, ou cerca de 20-100 mg/kg ou cerca de 50-200 mg/kg, ou cerca de 2,5 a 20 mg/kg de peso corporal. A dose eficaz para um determinado indivíduo pode ser variada (por exemplo, aumentada ou diminuída) ao longo do tempo, dependendo das necessidades do indivíduo. Por exemplo, em períodos de doença física ou estresse, ou se agravam os sintomas da doença, a quantidade de dosagem pode ser aumentada.

[0137]A quantidade terapeuticamente eficaz da proteína terapêutica (ou composição ou medicamento contendo a proteína terapêutica) é administrada a intervalos regulares, dependendo da natureza e extensão dos efeitos da doença, e de forma contínua. A administração a um “intervalo”, tal como aqui utilizado, indica que a quantidade terapeuticamente eficaz é administrada periodicamente (em contraposição aos de uma dose de uma só vez). O intervalo pode ser determinado por técnicas clínicas padrão. Em algumas modalidades, a proteína terapêutica é administrada a cada dois meses, mensal, duas vezes por mês, três vezes por semana, bissemanalmente, semanalmente, duas vezes por semana, três vezes por semana ou diariamente. O intervalo de administração para um único indivíduo não necessita ser um intervalo fixo, mas pode ser variada ao longo do tempo, dependendo das necessidades do indivíduo. Por exemplo, em períodos de doença física ou estresse, ou se os sintomas da doença pioram, o intervalo entre doses pode ser diminuído.

[0138]Tal como aqui utilizado, o termo “bimensal” significa a administração uma vez cada dois meses (isto é, uma vez de dois em dois meses); o termo “mensal” significa a administração uma vez por mês; o termo “de três em três semanas” significa a administração uma vez por período de três semanas (ou seja, uma vez a cada três semanas); o termo “quinzenal” significa a administração uma vez por duas semanas (ou seja, uma vez a cada duas semanas); o termo “semanal” significa a administração uma vez por semana; e o termo “diário” significa a administração uma vez por dia.

[0139]A descrição refere-se adicionalmente a uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína terapêutica, tal como aqui descrito, em um recipiente (por exemplo, um frasco, garrafa, bolsa para administração intravenosa, uma seringa, etc.) com um rótulo contendo instruções para a administração da composição para o tratamento de mucopolissacaridose do tipo III-B (Síndrome de Sanfilippo B), tais como pelos métodos aqui descritos.

Administração intratecal das formulações farmaceuticamente aceitáveis

[0140]Em várias modalidades, a proteína de fusão enzimática é administrada por introdução no sistema nervoso central do sujeito, por exemplo, no fluido cerebrospinal do sujeito. Em certos aspectos da invenção, a enzima é introduzida por via intratecal, por exemplo, na região lombar, ou o magna cisterna ou intraventricular (ou intracerebroventricular) em um espaço ventrículo cerebral. Os métodos de administração por via intratecal, uma enzima lisossômica são descritos na Patente US 7.442.372, aqui incorporada por referência na sua totalidade.

[0141]Os especialistas na técnica estão cientes de que os dispositivos podem ser utilizados para realizar a administração intratecal de uma composição terapêutica. Por exemplo, a terapia pode ser administrada usando um reservatório Ommaya que é de uso comum para a administração de medicamentos por via intratecal para carcinomatose meníngea (Ommaya AK, Lancet 2: 983-84, 1963). Mais especificamente, no presente método, um tubo ventricular é inserido através de um furo formado na ponta anterior e está ligado a um reservatório Ommaya instalado sob o couro cabeludo, e o reservatório é por via subcutânea, via intratecal, perfurado para liberar a enzima particular sendo substituída, a qual é injetada para dentro do reservatório. Outros dispositivos para administração intratecal de composições terapêuticas para um indivíduo são descritos na Pat. No. 6.217.552, aqui incorporada por referência. Alternativamente, a composição pode ser administrada por via intratecal, por exemplo, por uma única injeção ou infusão contínua. Deve ser entendido que o tratamento de dosagem pode estar na forma de uma administração em dose única ou doses múltiplas.

[0142]Tal como aqui utilizado, o termo “administração intratecal” destina-se a incluir a liberação de uma composição farmacêutica diretamente no fluido cerebrospinal de um sujeito, por meio de técnicas, incluindo injeção cerebroventricular lateral (isto é, por via intracerebroventricular) através de um orifício de trepanação ou punção cisternal ou lombar ou semelhantes (descrito em Lazorthes et al Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 e Omaya et al, Cancer Drug Delivery, 1: 169-179, os conteúdos dos quais são aqui incorporadas por referência). O termo “região lombar” destina-se a incluir a área entre a terceira e quarta vértebras lombares (parte inferior das costas) e, de forma mais abrangente, a região L2-S1 da coluna vertebral. O termo “cisterna magna” destina-se a incluir o acesso ao espaço em torno e por baixo do cerebelo através da abertura entre o crânio e o topo da coluna. O termo “ventrículo cerebral” destina-se a incluir as cavidades no cérebro que são contínuas com o canal central da medula espinhal. A administração de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção para qualquer um dos locais anteriormente mencionados pode ser alcançada por injeção direta da composição ou através da utilização de bombas de infusão. Para injeção, a composição da invenção pode ser formulada em soluções líquidas, preferencialmente em tampões fisiologicamente compatíveis tais como solução de Hank, solução tampão de fosfato ou de Ringer. Além disso, a enzima pode ser formulada sob a forma sólida e novamente dissolvida ou suspensa imediatamente antes da utilização. As formas liofilizadas também estão incluídas. A injeção pode ser, por exemplo, sob a forma de uma injeção de bolus ou infusão contínua (por exemplo, utilizando bombas de infusão) da enzima.

[0143]Em várias modalidades da invenção, a enzima é administrada por injeção ventricular cerebrospinal lateral para o cérebro de um sujeito. A injeção pode ser feita, por exemplo, através de um orifício de trepanação feito no crânio do sujeito. Em outra modalidade, a enzima e/ou outra formulação farmacêutica é administrada através de uma derivação inserida cirurgicamente no ventrículo cerebral de um sujeito. Por exemplo, a injeção pode ser feita para os ventrículos laterais, que são maiores, apesar de injeção nos terceiro e quarto ventrículos menores também poderem ser feitas.

[0144]Em várias modalidades, as composições farmacêuticas usadas na presente invenção são administradas por injeção para a cisterna magna, ou zona lombar de um sujeito. Em outra modalidade do método da invenção, a formulação farmaceuticamente aceitável fornece a liberação prolongada, por exemplo, “liberação lenta” da enzima ou outra composição farmacêutica usada na presente invenção, a um sujeito durante pelo menos um, dois, três, quatro semanas ou períodos mais longos de tempo após a formulação farmaceuticamente aceitável ser administrada ao sujeito.

[0145]Em várias modalidades, uma proteína de fusão terapêutica é liberada a uma ou mais superfície rasa ou tecidos do cérebro ou da medula espinhal. Por exemplo, em várias modalidades, uma proteína de fusão terapêutica é liberada a uma ou mais superfície rasa ou tecidos do cérebro ou da medula espinhal. Em algumas modalidades, a superfície alvo ou tecidos superficiais do cérebro ou da medula espinhal estão localizadas dentro de 4 mm a partir da superfície do cérebro. Em algumas modalidades, a superfície alvo ou tecidos superficiais do cérebro são selecionadas a partir de tecidos pia-máter, tecidos corticais cerebrais fita, hipocampo, espaço Virchow Robin, vasos sanguíneos dentro do espaço VR, o hipocampo, frações do hipotálamo sobre a superfície inferior do cérebro, os nervos ópticos e intervalos, o bolbo olfativo e saliências, e respectivas combinações.

[0146]Em algumas modalidades, uma proteína de fusão terapêutica é liberada a um ou mais tecidos profundos do cérebro ou da medula espinhal. Em algumas modalidades, a superfície alvo ou tecidos superficiais do cérebro ou da medula espinhal estão localizados 4 mm (por exemplo, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, ou 10 mm) abaixo (ou interno a) da superfície do cérebro. Em algumas modalidades, tecidos profundos direcionados do cérebro incluem a fita cortical cerebral. Em algumas modalidades, tecidos profundos direcionados do cérebro incluem um ou mais do diencéfalo (por exemplo, hipotálamo, tálamo, pré-tálamo, subtálamo, etc), metencéfalo, núcleos lentiformes, o gânglio basal, caudado, putâmen, amígdala, globus pallidus, e suas combinações.

[0147]Em várias modalidades, uma superfície direcionada ou tecido da medula espinhal superficial contém pia mater e/ou os tratos de matéria branca. Em várias modalidades, um tecido profundo direcionado da medula espinhal contém matéria cinzenta da medula espinhal e/ou as células ependimais. Em algumas modalidades, uma proteína de fusão terapêutica é liberada aos neurônios da medula espinhal.

[0148]Em várias modalidades, uma proteína de fusão terapêutica é liberada a um ou mais tecidos do cerebelo. Em certas modalidades, o um ou mais tecidos direcionados do cerebelo são selecionados a partir do grupo que consiste em tecidos de camada molecular, tecidos de camada de células de Purkinje, tecidos da camada de células granulares, pedúnculos cerebelares, e combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos (por exemplo, enzimas) são liberados a um ou mais tecidos profundos do cerebelo incluindo, entre outros, tecidos de camada de células de Purkinje, tecidos da camada de células granulares, tecido matéria branca profunda do cerebelo (por exemplo, profundidade em relação à camada de células granulares), e tecido núcleos profundos do cerebelo.

[0149]Em várias modalidades, uma proteína de fusão terapêutica é liberada a um ou mais tecidos do tronco cerebral. Em algumas modalidades, os um ou mais tecidos direcionados do tronco cerebral incluem tecido do tronco cerebral e da matéria branca/ou núcleos do tecido de tronco cerebral.

[0150]Em várias modalidades, uma proteína de fusão terapêutica é liberada para vários tecidos do cérebro, incluindo, entre outros, matéria cinzenta, substância branca, as áreas periventriculares, pia-aracnóide, meninges, neocórtex, cerebelo, tecidos profundos no córtex cerebral, camada molecular, região caudado/putamen, mesencéfalo, regiões profundas da ponte ou da medula, e suas combinações.

[0151]Em várias modalidades, uma proteína de fusão terapêutica é liberada a várias células no cérebro, incluindo, entre outras, neurônios, células gliais, células perivasculares e/ou células meníngeas. Em algumas modalidades, uma proteína terapêutica é liberada para oligodendrócitos de matéria branca profunda.

Kits para utilização nos métodos da invenção

[0152]Os agentes utilizados nos métodos da invenção podem ser proporcionados em um kit, cujo kit pode ainda incluir instruções para utilização. Dito kit compreenderá uma proteína de fusão como aqui descrita compreendendo uma enzima para uso no tratamento de uma doença de armazenamento lisossômico e uma fração de direcionamento lisossômico, geralmente em uma dose e forma adequada para administração ao hospedeiro. Em várias modalidades, o kit compreenderá normalmente um dispositivo para a liberação de enzima por via intratecal.

[0153]Um kit pode também ser fornecido para a conjugação de um antígeno, particularmente um antígeno de polipeptídeo, para uma fração de elevada absorção, a fim de gerar uma composição terapêutica. Por exemplo, uma fração tal como uma muteína de IGF-II, conjugada com um ligante apropriado para a ligação de polipeptídeos, tal como descrito acima, pode ser fornecida. A fração de elevada absorção pode também ser proporcionada em uma forma não conjugada, em combinação com um ligante adequado, e instruções para utilização.

[0154]Outro kit pode compreender instruções para a administração intratecal de composições terapêuticas da presente invenção, em adição às composições terapêuticas. Em certas modalidades, os kits da invenção podem compreender os cateteres ou outros dispositivos para a administração intratecal da terapia de reposição enzimática que são pré-carregados com as composições terapêuticas da presente invenção. Por exemplo, os cateteres pré-carregados com 0,001-0,01 mg, 0,01-0,1 mg, 0,1-1,0 mg, 1,0-10 mg, 10-100 mg, ou mais de uma proteína de fusão terapêutica compreendendo uma enzima lisossômica e fração de direcionamento lisossômico, tal como Naglu e muteína de IGF-II, em uma formulação farmaceuticamente aceitável são especificamente contemplados. Cateteres exemplares podem ser cateteres de única utilização que podem ser descartados após o uso. Alternativamente, os cateteres pré-carregados podem ser recarregáveis e apresentados em kits que têm quantidades apropriadas de enzima para reenchimento de tais cateteres.

[0155]A invenção será mais e mais especificamente descrita pelos exemplos seguintes. Exemplos, no entanto, são incluídos para fins de ilustração, não para limitação.

EXEMPLO 1 -GERAÇÃO DE SEQUÊNCIAS ESPAÇADORAS

[0156]As enzimas lisossômicas compreendendo tags GILT e espaçadores foram divulgadas na Publicação de Patente US 20030082176, 20040006008, 20040005309, e 20050281805. As proteínas de fusão alfa-N-acetilglicosaminidase (Naglu) que compreendem peptídeos espaçadores são reveladas na publicação de Patente US No. 201120232021. Os peptídeos espaçadores adicionais para utilização em proteínas de fusão terapêuticas direcionadas que compreendem uma enzima lisossômica e um marcador GILT foram desenvolvidos tal como descrito abaixo.

[0157]Os espaçadores podem ser desenvolvidos para ligar ambas as muteínas de IGF-II e muteínas de IGF-II resistente à furina. Espaçadores exemplares incluem as seguintes sequências de aminoácidos: EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22) GAP (SEQ ID NO: 9), GGGGS (SEQ ID NO: 12), GGGGA (SEQ ID NO: 60), GPSGSPG (SEQ ID NO: 23), GPSGSPGT (SEQ ID NO: 24), GPSGSPH (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO: 27), e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO: 62).

[0158] Os construtos que compreendem um espaçador, Naglu de comprimento completo (incluindo a sequência de sinal) e um peptídeo IGF-II foram gerados em que a sequência do espaçador (espaçador EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22), espaçador GAP (SEQ ID NO: 9 ), espaçador GGGGS (SEQ ID NO: 12), espaçador GPSGSPG (SEQ ID NO: 23), ou espaçador GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36)) foi inserido entre Naglu de comprimento completo e IGF2 8-67 R37A (SEQ ID NOs: 560-564).

[0159]Os ligantes adicionais foram feitos com base no método XTEN como descrito em Schellenberger et al. (Nat Biotech 27: 1186-1190, 2009). Ligantes tipo XTEN podem proporcionar uma meia-vida mais longa para a proteína de fusão gerada, em comparação com outros ligantes. Exemplos de espaçadores têm as sequências de aminoácidos GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), e GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47). O espaçador pode ser inserido entre Naglu e muteína de IGF-2, opcionalmente através dos sítios ASCL sobre os construtos.

[0160]A expressão da proteína tem sido associada com o códon de DNA usado para codificar um aminoácido particular, por exemplo, alterando o códon para um aminoácido pode aumentar a expressão da proteína sem alterar a sequência de aminoácidos da proteína (Trinh et al, Mol. Immunol 40: 717-722, 2004). A alteração do códon que codifica o peptídeo resultou em um aumento dos níveis de produção de proteína de fusão recombinante. Usando esta técnica sequências de espaçador adicionais foram desenvolvidas para uso na terapêutica com proteína de fusão com enzima lisossômica, tal como GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 58) e GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 59). Sequências de espaçador adicionais são GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 81) e GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 82). Qualquer um destes espaçadores é inserido entre Naglu e muteína de IGF-II, opcionalmente através dos sítios AscI sobre os construtos.

[0161]Um ligante rígido exemplar que compreende múltiplas prolinas para contribuir para a rigidez, tem a seguinte sequência GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), ou GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), ao passo que um ligante helicoidal exemplar tem a seguinte sequência GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), ou GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55). Qualquer um destes espaçadores é inserido entre Naglu e muteína de IGF-II, opcionalmente através dos sítios AscI sobre os construtos.

[0162]Os espaçadores adicionais podem ser gerados utilizando otimização de códons utilizando tecnologia desenvolvida por DNA 2.0 (Menlo Park, CA). Os espaçadores contemplados incluem GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO:28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GPSGAP (SEQ ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGG GPSGAP (SEQ ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 43), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO:64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 78), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 89), e GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 90). Qualquer um destes espaçadores é inserido entre Naglu e muteína de IGF-II, opcionalmente através dos locais AscI sobre os construtos.

[0163]Em certas modalidades, se a sequência de peptídeo de sinal da proteína de matriz extracelular 40-BM (Nischt et al, Eur J. Biochem 200: 529-536, 1991) é utilizado, o Naglu na construção não compreende sua própria sequência de peptídeo sinal. O espaçador é inserido entre a sequência Naglu e a sequência de muteína de IGF-II (por exemplo, IGF2 8-67 R37A). Uma sequência de peptídeo de sinal BM-40 exemplar é MRAWIFFLLCLAGRALA (SEQ ID NO: 8). Um peptídeo GAP pode ser adicionado ao espaçador para facilitar a clonagem e a adição de um sítio de clonagem AscI. Em certas modalidades, se a sequência de peptídeo de sinal nativa Naglu (Weber et al, Hum Mol Genet 5: 771-777, 1996) é utilizada, o Naglu é Naglu de comprimento completo e o espaçador é inserido entre Naglu de comprimento completo e a sequência de muteína de IGF-II (por exemplo, IGF2 8-67 R37A). Um peptídeo GAP pode ser adicionado ao espaçador para facilitar a clonagem e a adição de um sítio de clonagem AscI.

[0164]Em construtos exemplares, Naglu humana foi “otimizada por códon” usando tecnologia de DNA 2.0. Está contemplado que Naglu compreende os aminoácidos 1-743 ou os aminoácidos 24-743 da Naglu humana. Em um construto exemplar, o espaçador compreende, opcionalmente, um espaçador GAP (sítio de enzima de restrição AscI utilizado para a clonagem) ou qualquer uma das seguintes sequências: EFGGGGSTR (SEQ ID NO: 22), GAP (SEQ ID NO: 9), GGGGS (SEQ ID NO: 12), GPSGSPG (SEQ ID NO: 23), GPSGSPGT (SEQ ID NO: 24), GPSGSPGH (SEQ ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEQ ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEQ ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GPSGAP (SEQ ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGG GPSGAP (SEQ ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEQ ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEQ ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEQ ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEQ ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEQ ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEQ ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEQ ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEQ ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEQ ID NO: 59), GGGGA (SEQ ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEQ ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEQ ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGG GPSGAP (SEQ ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEQ ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGP SGAP (SEQ ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEQ ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEQ ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [ou (GGGGA)8GGGPS] (SEQ ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [ou (GGGGA)8GGGPSH] (SEQ ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [ou (GGGGA)9GGGPS] (SEQ ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS H [ou (GGGGA)9GGGPSH] (SEQ ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEQ ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEQ ID NO: 89), e GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEQ ID NO: 90). Os espaçadores acima são opcionalmente “otimizados por códons” utilizando tecnologia de DNA 2.0.

[0165]Qualquer uma das muteínas de IGF-II aqui descritas, que são opcionalmente “otimizadas por códons” usando tecnologia de DNA 2.0, são úteis nos presentes construtos. Em construtos exemplares, a muteína de IGF-II, é uma muteína de IGF-II resistente a furina, IGF2 Δ8-67 R37A.

EXEMPLO 2 - EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE CONSTRUTOS

[0166]Os construtos que compreendem os espaçadores acima, a enzima Naglu e o peptídeo de direcionamento IGF-II são feitos e expressos de forma recombinante. Em certas modalidades, os construtos compreendem um peptídeo de sinal. Exemplos de peptídeos de sinal incluem, por exemplo, e não por limitação, o peptídeo de sinal Naglu compreendendo os aminoácidos 1-23 de Naglu de comprimento completo (Weber et al, Hum Mol Genet 5: 771-777, 1996) ou um derivado de peptídeo sinal da proteína de matriz extracelular BM-40 (Nischt et al, Eur J Biochem 200: 529-536, 1991).

[0167]O DNA que codifica a sequência de Naglu, a muteína de IGF-II e o peptídeo espaçador são inseridos em um vetor de expressão adequado, tal como vetores de expressão pEE e PXC GS (Lonza Biologics, Berkshire, Reino Unido) e o vetor de expressão pC3B (BioMarin, in-house). Um sítio de restrição AscI (ggcgcgcc (SEQ ID NO: 570)) pode ser inserido no vetor para ajudar na clonagem de proteínas de fusão terapêuticas aqui descritas.

[0168]Um construto exemplar compreende a sequência Naglu de comprimento completo (Figura 1 e Figura 2), incluindo o peptídeo de sinal, um peptídeo espaçador (Figura 3) e um peptídeo IGF-II que compreende os resíduos 867 e tendo uma substituição de aminoácidos Ala no resíduo Arg-37, R37A (Figuras 1 e 2), que confere resistência à furina para o peptídeo IGF-II.

[0169]Várias sequências de ligante ou espaçador descritas no Exemplo 1, que ligam o peptídeo Naglu e IGF-II, são inicialmente avaliadas utilizando um sistema de expressão transiente. Plasmídeos Naglu marcados para GILT (pXC17.4, Lonza) são transfectados para células em suspensão de CHOK1SV GS KO (Lonza). 15 μg de DNA de plasmídeo são transfectados em 106 células utilizando eletroporação. O meio é completamente alterado em 24 horas após a transfecção. As células transfectadas são semeadas em frascos de agitação em 1,5 X 106 células/ml sem seleção. O crescimento celular, viabilidade, título e a produtividade específica são determinados conforme as células são cultivadas a 30°C durante até 14 dias.

[0170]Os plasmídeos Naglu marcados para GILT são transfectados para células CHOK1SV em suspensão (Lonza). As células são cultivadas em meios CDCHO (Invitrogen) com glutamina 6 mM em balões de agitação a 37°C e 8% de CO2. 30 μg de DNA de plasmídeo linearizado em 107 células é transfectado nas células utilizando eletroporação. As células são colocadas em placas a 5000 células/poço em meio CDCHO + 40 μM MSX 48 horas após a transfecção. As placas são incubadas a 37°C e 8% de CO2 durante cerca de 4-6 semanas para identificar o crescimento clonal. As colônias são então triadas pelo ensaio de atividade de 4MU para Naglu (ver Exemplo 3) e as colônias que mais expressam são transferidas para placas de 24 poços em meio CDCHO + 40 μM MSX, e, em seguida, continuou a passagem dos clones que mais expressam para placas de 6 cavidades, em seguida, para frascos de agitação para identificar os clones que mais expressam para produzir as proteínas de fusão Naglu marcadas para GILT.

[0171]A purificação é realizada utilizando técnicas de purificação de proteínas padrão. Por exemplo, em um método de purificação exemplar, o material de sobrenadante de cultura de células de mamífero de partida, tal como descrito acima, é descongelado do armazenamento a -80°C. O material é ajustado com NaCl para atingir uma concentração final de 1 M, seguido de filtração estéril em 0,2 μm.

[0172]O material filtrado é carregado em uma coluna de interação hidrofóbica butila, pré-equilibrada com tampão de carga de butila (20 mM de Tris, 1 M de NaCl, pH 7,5). Os materiais ligados são eluídos com um gradiente linear ao longo de 10 volumes de coluna, utilizando um tampão de eluição de butila (Tris 20 mM, pH 7,5). As amostras dos picos de eluição foram reunidas, trocadas de tampão para Tris 20 mM, pH 7,5, e carregadas em uma coluna de troca aniônica Q. As proteínas ligadas são, então, eluídas com um gradiente linear (10 volumes de coluna) utilizando um tampão de eluição Q (Tris 20 mM, NaCl 1 M, pH 7,5). Amostras purificadas são então trocadas em tampão utilizando concentradores centrífugos de spin e esterilizadas por filtração para armazenamento.

[0173]Construto. expressão, produção, purificação e formulação de uma proteína de fusão Naglu exemplar: Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568). Um construto de DNA que codifica Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568) foi gerado por métodos de DNA recombinante convencionais. Naglu corresponde aos aminoácidos 1-743 de Naglu humana de comprimento total e IGF-II corresponde à muteína de IGF-II que compreende os aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro com a substituição de aminoácidos R37A que confere resistência à furina. As células CHOK1SV foram transfectadas com o construto de DNA, e um clone expressando a proteína de fusão Naglu-IGF-II marcada para GILT foram isoladas como descrito acima.

[0174]As células que expressam Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568) foram cultivadas em um biorreator, e a proteína de fusão Naglu foi purificado a partir do meio de cultura como se segue. A coleta foi ajustada em sal para 1 M de NaCl, em seguida carregada em uma coluna de Butil Sepharose 4 FF. A proteína de fusão Naglu foi eluída em sal a partir da coluna de Butil Sepharose 4 FF, coletada e dialisada, e em seguida carregada em uma coluna de Heparina Sepharose 6 FF. A proteína de fusão Naglu foi coletada na fração de fluxo, e carregada em uma coluna de Q Sepharose HP. A proteína de fusão Naglu foi eluída em sal a partir da coluna de Q Sepharose HP, concentrada, e, em seguida, polida por cromatografia de exclusão de tamanho Sephacryl S300 preparativa.

[0175]Utilizando este processo de purificação, uma proteína de fusão enzimaticamente ativa Naglu altamente purificada, Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568), foi produzida. A proteína de fusão Naglu purificada foi formulada a 20 mg/mL em CSF artificial (fosfato de sódio 1 mM, 148 mM cloreto de sódio, cloreto de potássio 3 mM, cloreto de magnésio 0,8 mM, cloreto de cálcio 1,4 mM, pH 7,2).

[0176]Construto. expressão, produção, purificação e formulação de proteínas de fusão Naglu exemplares. Os construtos de DNA que codificam Naglu- (GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 569), Naglu-rígida-IGF-II (SEQ ID NO: 566), Naglu-helicoidal-IGF-II (SEQ ID NO: 567 ), e Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO: 565) foram produzidos por métodos de DNA recombinante convencionais. Naglu corresponde aos aminoácidos 1-743 de Naglu de comprimento total humana e IGF-II corresponde à muteína de IGF-II que compreende os aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro com a substituição de aminoácidos R37A que confere a resistência à furina. Exemplos de ligantes CTEN rígidos e helicoidais são descritos no Exemplo 1. As células CHOK1SV foram transfectadas com os construtos de DNA, e clones que expressam proteínas de fusão Naglu-IGF-II marcadas para GILT foram isolados como descrito acima.

[0177]As células que expressam as proteínas de fusão Naglu-IGF-II foram cultivadas em um biorreator. Em corridas de produção típicas de batelada alimentada (10-16 dias), construtos Naglu-IGF-II com os vários ligantes todos alcançaram títulos superiores a 30 mg/L, com elevada viabilidade celular superior a 80%.

[0178]As proteínas de fusão Naglu foram purificadas a partir do meio de cultura, tal como descrito acima. Utilizando este procedimento de purificação, as proteínas de fusão Naglu-IGF-II enzimaticamente ativas e não marcadas para Naglu, tal como Naglu-rígida-IGF-II (SEQ ID NO: 566), Naglu-helicoidal-IGF-II (SEQ ID NO: 567), Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO: 565) e Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 569), foram purificadas a ~99% de pureza, conforme determinado por HPLC de fase reversa. As proteínas de fusão Naglu não marcadas purificadas e Naglu foram formuladas em 20 mg/mL em CSF artificial (fosfato de sódio 1 mM, 148 mM cloreto de sódio, cloreto de potássio 3 mM, cloreto de magnésio 0,8 mM, cloreto de cálcio 1,4 mM, pH 7,2).

[0179]É contemplado que as proteínas de fusão tal como aqui descrito demonstram que os níveis mais elevados de expressão recombinante da proteína ativa e/ou aumento da atividade enzimática em comparação com proteínas de fusão compreendendo um peptídeo espaçador diferente pode ser utilizada em experiências adicionais, tais como ensaios de atividade, ensaios de ligação, ensaios de absorção e em ensaios de atividade in vivo como descrito mais abaixo.

EXEMPLO 3 - ENSAIOS DE ATIVIDADE

[0180]Para determinar a atividade enzimática das proteínas de fusão Naglu, em um ensaio de atividade de Naglu in vitro é realizada cabo usando um substrato sintético marcado fluorescente.

[0181]Os materiais utilizados no ensaio incluem: 4-metil-N-acetil-α-D- glicosaminida (Substrato 4MU-NaGlu) (Calbiochem, Cat#474500), preparada a concentração final de 20 mM em DMSO a 10% no tampão de ensaio (0,2 M acetato de sódio, com ou sem 1 mg/ml de BSA, e 0,005% de Tween 20, pH 4,3-4,8) e armazenado a -80°C. A solução estoque de 4-metilumbeliferona (Padrão 4-MU) (Sigma, Cat# M1381) é preparada a 10 mM em DMSO e armazenado a -20°C em pequenas alíquotas. Um controle rhNaglu-His6 (0,5 mg/ml, R & D Systems, Cat#7096-GH) é diluído a 10 μg/ml em Tris 25 mM, NaCl 125 mM, 0,001% de Tween 20, pH 7,5 e armazenado a -80°C em pequenas alíquotas.

[0182]Em uma placa clara de 96 poços de diluição (Granger), diluições em série 2x de padrões em tampão de diluição (1 x PBS, com ou sem 1 mg/mL de BSA, 0,005% de Tween 20, pH 7,4 são utilizadas, de 200 μM a 1,563 μM mais um branco. Em uma placa de diluição clara, as amostras são preparadas em várias diluições (em tampão de diluição) para garantir que estão dentro da curva padrão.

[0183]10 μl de padrões (200 μM a 1,563 μM), controle e amostras de trabalho são transferidos para uma placa preta de 96 poços de poliestireno não tratada (Costar, Cat#3915). 75 μl de substrato (2 mM) é adicionado a cada poço, seguido de incubação durante 30 minutos a 37°C. A reação é então extinta por adição de 200 μl de tampão de parada (0,5 M de glicina/NaOH, pH 10,7). As placas são lidas em um EX355 Em460 com cutoff de 455 em um leitor de placas de 96 cavidades fluorescente.

[0184]Utilizando este ensaio, as proteínas de fusão exemplificativas Naglu, incluindo Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568), Naglu- (GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 569), Naglu-rígida-IGF-II (SEQ ID NO: 566), Naglu-helicoidal-IGF-II (SEQ ID NO: 567), e Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO: 565), demonstraram ter atividade enzimática in vitro, com atividades específicas em direção ao substrato 4MU-Naglu sintético variando ~175.000 a ~220.000 nmol/h/mg. A atividade enzimática das proteínas de fusão Naglu foi comparável à da proteína Naglu não marcada (~190.000 nmol/h/mg). Os dados da atividade enzimática das proteínas de fusão exemplificativas Naglu são fornecidos na Tabela 1. Tabela 2. Atividade de Proteínas de Fusão Naglu

1Proteínas de fusão Naglu e Naglu não marcada foram construídas, expressas e purificadas como descrito no Exemplo 2; exemplos de ligantes XTEN rígidos e helicoidais são descritos no Exemplo 1 2SEQ ID NO: de ligantes nas proteínas de fusão Naglu testados nos Exemplos 3-5 3A atividade específica (nmol/h/mg) para proteínas Naglu foi medida como descrito no Exemplo 3 4IC50 para proteínas Naglu para ligação competitiva a IGF2R foi medida como descrito no Exemplo 4 5Kabsorção e meia-vida (t1/2) para proteínas Naglu em fibroblastos de MPS-IIIB foram medidos tal como descrito no Exemplo 5

EXEMPLO 4 - ENSAIOS DE LIGAÇÃO

[0185]Os ensaios de ligação para determinar a ligação das proteínas de fusão Naglu para IGF-I, IGF-II e receptores de insulina são geralmente realizados tal como descrito no documento US 20120213762. Resumidamente, os construtos de proteínas de fusão são testados quanto à afinidade de ligação para o receptor de insulina em um ensaio que mede a concorrência de ligação de insulina biotinilada para insulina ligada em placa. Um ensaio de ligação ao receptor da insulina é conduzida pela insulina concorrente, IGF-II, e proteína de fusão com ligação a insulina biotinilada ao receptor de insulina (insulina-R).

[0186]Especificamente, placas brancas Reacti-Bind são revestidas com insulina-R, a uma concentração de 1 μg/poço/100 μl (38,4 nM). As placas revestidas foram incubadas durante a noite em temperatura ambiente, em seguida, lavadas 3x com tampão de lavagem (300 μl/poço). As placas são então bloqueadas com tampão de bloqueio (300 μl/poço) durante 1 hora. As etapas de lavagem são repetidas e qualquer traço de solução nas placas retirado. A insulina biotinilada é misturada a 20 nM com concentrações diferentes de insulina, IGF-II, ou a proteína de fusão, por diluições em série. 100 μl de insulina diluída, IGF-II, ou a proteína de fusão Naglu em 20 nM de insulina-biotina são adicionados a placas revestidas e as placas são incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas. As placas são então lavadas três vezes com tampão de lavagem. 100 μl de solução de trabalho de estreptavidina-HRP (50 μl estreptavidina-HRP, em 10 ml de tampão de bloqueio) são adicionados para as placas e as placas são incubadas em temperatura ambiente durante 30 minutos. 100 μl de solução de trabalho de Elisa-Pico contendo substrato quimioluminescente Elisa-Pico são adicionados e a quimioluminescência é medida a 425 nm.

Ensaio de ligação competitiva a IGF2R

[0187]Para medir a capacidade de construtos da proteína de fusão Naglu em ligar ao receptor de IGF-II um ensaio de ligação competitiva é realizado. Um fragmento do IGFIIR envolvido com a ligação de IGF-II (domínios 10-13, proteína denominado 1288) é revestido em placas de 96 poços. IGF-II biotinilado foi incubado com o receptor na presença de quantidades crescentes de competidores: o controle de IGF-II (não biotinilada), ou amostra de proteína de fusão (contendo um marcador de epítopo GILT derivado de IGF-II). IGF-II biotinilado ligado ao receptor é detectado com estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (HRP) e um substrato de HRP quimioluminescente. A capacidade da proteína de fusão para inibir a ligação de IGF-II biotinilado ao IGFIIR é calculada a partir das curvas de inibição e relatada como um valor de IC50 (concentração necessária para atingir 50% de inibição de ligação).

[0188]Para o ensaio, IGFIIR é revestido em uma placa branca Reacti-Bind (Pierce, Cat#437111) a 0,5 μg/poço em um volume de 100 μl (69,6 nM/por poço) em tampão de revestimento. A placa foi vedada e incubada durante a noite em temperatura ambiente. A placa é então lavada 3x com tampão de lavagem, bloqueada com tampão de bloqueio e, em seguida, lavada novamente 3 x com tampão de lavagem (300 μl/poço).

[0189]Em seguida, 8 nM de IGF-II-biotina é misturado com diferentes concentrações de concorrentes (IGF-II (não biotinilado), proteína de referência, ou amostras de proteínas de fusão Naglu, e adicionados a uma placa revestida com IGFIIR em diluições em série 2X.

[0190]A placa é incubada em temperatura ambiente durante 2 horas, seguido por lavagem da placa 3 X com tampão de lavagem. A estreptavidina-HRP é preparada em tampão de bloqueio (diluição 1: 200), e 100 μl/poço adicionados à placa. A atividade de ligação de IGF-II-Biotina é detectada através de estreptavidina- HRP utilizando reagentes de Pico-Elisa. Resumidamente, a solução de trabalho Pico-Elisa preparada é adicionada por poço (100 μl/poço) e incubada em temperatura ambiente durante 5 minutos, com agitação suave, em seguida, a quimioluminescência em 425nm é medida.

[0191]As IC50 das amostras são calculadas utilizando a percentagem de IGF-II-biotina ligada para cada concentração de inibidor.

[0192]Usando este ensaio de ligação competitiva IGFIIR, um exemplo de proteínas de fusão Naglu, incluindo Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568), Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 569), Naglu-rígida-IGF-II (SEQ ID NO: 566), Naglu-helicoidal-IGF-II (SEQ ID NO: 567), e Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO: 565), mostraram ter um valor IC50 de 0,23-0,36 nM. A proteína Naglu não marcada não tinha ligação detectável neste ensaio. Os dados de ligação competitiva de IGF2R para as proteínas de fusão Naglu exemplificativas são fornecidos na Tabela 1.

EXEMPLO 5 - ENSAIOS DE ABSORÇÃO

[0193]Para medir a capacidade de uma enzima de doença de armazenamento lisossômico para entrar nas células através de endocitose mediada pelo receptor um ensaio de absorção é realizado, que mede a absorção de enzima usando o receptor de CI-MPR em células L6 de mioblastos de rato ou em fibroblastos humanos de MPS IIIB. Manose-6-fosfato (M6P) e IGF-II são usados como inibidores para determinar o sítio de ligação ao receptor de CI-MPR. Os dados são coletados para gerar uma curva de saturação para absorção de enzima e determinar o parâmetro cinético, Kabsorção, do processo.

[0194]Antes do ensaio de absorção (24 horas), células L6 (mioblastos L6 de ratos, ATCC#CRL-1458) ou fibroblastos humanos MPS IIIB são colocadas em placas a uma densidade de 1x105 células por poço em placas de 24 poços (VWR#62406-183) e semeadas 0,5 ml por poço. Na manhã do dia do ensaio, a enzima é misturada com os meios de absorção (1 L DMEM, 1,5 g de bicarbonato de sódio, 0,5 g de Albumina Bovino sérica, 20 mL de L-glutamina (200 mM (Gibco#25030-081)), 20 ml de 1M de HEPES (Gibco#1563080)) (20 mM final), pH 7,2) em uma capela de cultura de tecidos. Quantidades de enzimas podem variar de 2-500 nM. O volume final de meio de absorção + enzima é de 0,5 mL por poço. M6P (Concentração final de 5 mM) e/ou IGF-II (2,4 μM ou 18 g/ml de concentração final) são adicionados às amostras apropriadas. Para inibição da absorção, 18 μl de IGF-II estoque (1 mg/ml, 133,9 μM) é adicionado por mL de meio de absorção.

[0195]O meio de crescimento é aspirado das células e 0,450 ml de enzima em tampão de absorção adicionadas a cada poço. Anotar o tempo e devolver células para incubadora durante 18 horas. Placa é removida da incubadora e tampão de absorção por aspirado das células. As placas são lavadas 4x por adição de 0,5 ml de PBS de Dulbecco e aspiradas. 200 μl de tampão de lise CelLytic M (Sigma) é adicionada às placas e agitada em temperatura ambiente durante 20-30 minutos. O lisado é removido das células e armazenado em uma placa clara de 96 poços coberta com fita (VWR) a -80°C até estar pronta para ensaio.

[0196]Para o ensaio de enzima, 5 μl de cada lisado é adicionado em duplicata por adição de 15 μl de mistura de reação enzimática (por exemplo, Naglu + 4MU) em ensaios de placa preta de 96 poços (VWR) (ver acima) e enzima/unidades/ml/h determinada em cada lisado.

[0197]Para o ensaio de proteína de lisado, 10 μl de cada lisado em duplicata foram testadas utilizando um kit de ensaio de proteínas Pierce BCA de acordo com as instruções do fabricante. Para medir a absorbância, a absorbância é lida a 562 nm com um leitor de placas (Leitor de placas com BMG Fluostar Optima) e concentração ug/ml determinada.

[0198]Para cada carga de enzima, a absorção é unidades de atividade enzimática/mg de lisado. Para determinar a absorção, as unidades de enzima/ml são divididas por ug de proteína/ml e multiplicado por 1000 (absorção a partir de poços em branco foi subtraída). Os resultados dos ensaios com ou sem inibidores são comparados para determinar a especificidade do receptor de absorção.

[0199]Para as curvas de saturação, 10 concentrações de carga de enzima que variam de 0,2-100 nM são utilizadas para gerar uma curva de saturação utilizando os ensaios descritos acima.

[0200]Utilizando este ensaio, uma proteína de fusão Naglu exemplar, Naglu- (GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568), mostrou ter uma Kabsorção de 7-9 nM em fibroblastos MPS-IIIB.

[0201]Em alternativa, antes do ensaio de absorção (24 horas), as células L6 ou fibroblastos humanos MPS IIIB são colocadas em placas a uma densidade de 1x105 células por 0,5 ml por poço em placas de 24 poços. As amostras de enzima a 1,6~50 nM são preparadas em meio de absorção: 1 L DMEM, 1,5 g de bicarbonato de sódio. 0,5 g de albumina bovina sérica, 20 ml de 200 mM de L-glutamina e 20 ml de HEPES 1M, pH 7,2. Para inibição da absorção, M6P (até 5,0 mM final) e/ou IGF-II (até 1,0 μM final) são adicionados às amostras apropriadas.

[0202]O meio de crescimento é aspirado das células e substituído por 0,5 ml da preparação de enzima em tampão de absorção por poço. Após 4 horas de incubação, as placas são lavadas 2 vezes com 0,5 ml de PBS de Dulbecco. 100 μl de tampão de lise de M-PER (Pierce) é adicionada às placas e agitada em temperatura ambiente durante 10 minutos. O lisado é armazenado a -80°C até estar pronto para ensaio.

[0203]Para o ensaio de enzima, 10 μl de cada lisado é adicionado em duplicata à placa preta de 96 poços (ver em cima).

[0204]Para o ensaio de proteína de lisado, 10 μl de cada lisado em duplicata foram testados usando um Kit de Ensaio de Proteínas Pierce BCA de acordo com as instruções do fabricante. A absorbância é lida a 562 nm com um leitor de placas (Leitor de placas BMG Fluostar Optima) e concentração ug/ml determinada utilizando BSA como um padrão.

[0205]Para cada carga de enzima, a absorção é expressa como nmol de 4- MU liberado em 30 minutos. Para as curvas de saturação, as concentrações de enzimas que variam 1,6-50 nM são utilizadas para gerar uma curva de saturação utilizando os ensaios descritos acima.

[0206]A estabilidade celular das proteínas de fusão Naglu foi determinada por monitoramento da atividade Naglu intracelular ao longo do período de ~8 dias. Os fibroblastos humanos de MPS IIIB plaqueados a uma densidade de 1x105 células por poço em placas de 24 poços (VWR#62406-183) foram tratados com proteína de fusão Naglu a 20 nM de concentração final durante 4 horas. Depois de 4 horas de incubação, as células foram transferidas para meio de crescimento sem proteína de fusão Naglu. Para cada ponto de tempo (4 horas, 28 horas, 4 dias, 6 dias e 8 dias), as células foram lisadas em 100 μl de M-PER de tampão de lise (Pierce) em temperatura ambiente durante 10 minutos, e analisadas quanto à atividade enzimática utilizando um substrato 4-MU marcado. A redução da atividade Naglu ao longo do período de amostra 8 dias pode ser ajustada para a cinética de primeira ordem para aproximar uma meia-vida da proteína celular.

[0207]Utilizando este ensaio, as proteínas de fusão exemplificativas Naglu, incluindo Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568), Naglu- (GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 569), Naglu-rígida-IGF-II (SEQ ID NO: 566), Naglu-helicoidal-IGF-II (SEQ ID NO: 567), e Naglu-XTEN-IGF-II (SEQ ID NO: 565), demonstraram ser internalizadas em fibroblastos MPS IIIB com valores Kabsorção de ~2,3-6,3 nM. Proteína Naglu não marcada, em contrapartida, não foi absorvida pelas células sob estas condições experimentais. Além disso, a absorção de proteína de fusão Naglu observada foi inibida por IGF-II, mas não por M6P. Após a absorção, as proteínas de fusão Naglu exemplificativas demonstraram ser estáveis, com uma meia-vida estimada de ~9,5 dias, com base na atividade enzimática (substrato 4- MU), medido nos lisados celulares. Dados de absorção e de meia-vida para proteínas de fusão Naglu exemplares são apresentado na Tabela 1.

EXEMPLO 6 - ATIVIDADE DE PROTEÍNA DE FUSÃO NAGLU IN VIVO

[0208]Para determinar a atividade de proteínas de fusão Naglu in vivo, as proteínas de fusão são administradas a animais knock-out Naglu (ver Li et al, Proc Natl Acad Sci USA 96: 14505-510, 1999). Knockouts Naglu apresentam grandes quantidades de sulfato de heparano no cérebro, fígado e rim, aumento da atividade de beta-hexosaminidase e coloração em cérebro de proteína associada à membrana lisossômica-2 (LAMP-2), e elevação de gangliosídeos no cérebro.

[0209]Atividade e biodistribuição da enzima exógena são determinados após 4 injeções ICV (intracerebroventricular) ao longo de um período de duas semanas (100 ug/injeção) de Naglu-IGF2 humana recombinante (rh). A cânulas permanente é implantada no camundongo (n = 12/gp, 8-12 semanas de idade no início) e ajustada para cobrir os camundongos cujas cânulas não estão no ventrículo. As medições de ponto de extremidade incluem biodistribuição de Naglu, redução de GAG, por exemplo, sulfato de heparano, o armazenamento nos lisossomas de células cerebrais, e ativação de astrócitos e microglia. Os níveis de vários biomarcadores lisossômicas ou neuronais (Ohmi et al, PLoS One 6:e27461, 2011) medidos em grupos tratados e de controle de níveis incluem, entre outros, proteína da membrana associado a lisossoma-1 (LAMP-1), LAMP-2, glipicano 5, extremidades não redutoras específicas para Naglu (NREs) de sulfato de heparano, gangliosídeos, colesterol, Subunidade c de ATP sintase Mitocondrial (SCMAS), ubiquitina, P- GSK3beta, amiloide beta, P-tau (Fosforilada-Tau), GFAP (ativação de astrócitos) e CD68 (ativação da microglia).

[0210]As experiências adicionais para determinar a sobrevivência e análise comportamental são realizadas utilizando camundongos que receberam 4 injeções ICV durante um período de duas semanas de rhNaglu-IGF2 (n = 12/gp, 5 meses de idade no início, 100 μg/injeção). Pontos de avaliação a serem medidos incluem o tempo de sobrevivência, atividade em campo aberto, biodistribuição Naglu, a redução de GAG, por exemplo, sulfato de heparano, armazenamento em lisossomas, os níveis de biomarcadores lisossômicas ou neuronais, como LAMP-1, LAMP-2, glipicano 5, gangliosídeos, colesterol, SCMAS, ubiquitina, P-GSK3beta, beta amiloide, P-tau, GFAP e CD68.

[0211]Os camundongos knockout Naglu (Naglu -/-), tendo uma mutação no éxon 6 do gene naglu foram desenvolvidos (Li et al, Proc Natl Acad Sci USA. 96: 14505-10, 1999). O sítio de éxon 6 foi escolhido porque este é o local de muitas mutações em seres humanos. Nenhuma atividade Naglu é detectada em camundongos homozigóticos, e há redução da atividade Naglu em heterozigotos. Camundongos Naglu -/- têm reduzido o tempo de sobrevivência (6-12 meses), e podem ter outros fenótipos funcionais, como os níveis de atividade reduzidos. Os efeitos das proteínas de fusão Naglu em camundongos Naglu -/- são ensaiados.

[0212]Os camundongos Naglu -/-(n = 8) e 8 controle de veículo de camundongos Naglu -/- (n = 8 heterozigotos da mesma ninhada) são administrados com 4 doses ICV (100 μg Naglu-IGF2/dose) ao longo de 2 semanas. No dia -2, os camundongos são anestesiados e o ventrículo lateral esquerdo canulado. Os camundongos são deixados recuperar. Nos dias 1, 5, 10 e 14, os camundongos são anestesiados (Benedryl, 5 mg/kg IP) 15 minutos antes da dose ICV. A dose ICV é infundida através de uma cânula, 5 μl de volume ao longo de 15 minutos, e os camundongos são deixados recuperar. No dia 15, os camundongos são sacrificados, sangrados e o soro congelado. Os cérebros são coletados e corante IV é injetado para dentro da cânula e a cânula trabalhada.

[0213]Os seguintes ensaios são realizados para determinar os efeitos das proteínas de fusão Naglu: avaliação do peso corporal, imagem NIR para a colocação de uma cânula, avaliação de níveis de Naglu-IGF2, GFAP, LAMP-1 e LAMP-2 no cérebro usando imunohistoquímica, ensaios bioquímicos para a atividade de Naglu, níveis β-hexosaminadase e atividade, ensaio SensiPro para detectar extremidades não redutoras dos glicosaminoglicanos (GAGs acumulados) específicos para Mucopolissacaridose IIIb (MPS-IIIb) (WO 2010/078511A2), os níveis de gangliosídeos GM3, conforme medido por ensaio bioquímico, bem como para a imunocoloração SCMAS, A-beta, glipicano 5, CD68, GFAP e Naglu no córtex entorrinal medial (Li et al., supra).

[0214]O tratamento eficaz com Naglu-IGF2 é esperado para resultar em uma diminuição nos níveis de LAMP-1, LAMP-2, GFAP, CD68, SCMAS, A-beta, glipicano 5, β-hexosaminadase, GM3 gangliosídeo, e MPS-GAGs IIIb-específicas.

[0215]Eficácia in vivo de proteínas de fusão exemplares Naglu em um modelo de camundongos de MPS IIIB. Quatro doses ICV (100 μg/dose) de proteína de fusão Naglu-IGF-II, Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568) ou Naglu- rígida-IGF-II (SEQ ID NO: 566), foram administradas ao longo de um período de duas semanas para camundongos Naglu -/- (n = 8). Camundongos Naglu -/- da mesma ninhada (n = 8) e oito de tipo selvagem ou heterozigóticos (n = 8) receberam veículo sozinho como controle. No dia -5, os camundongos foram anestesiados; o ventrículo lateral esquerdo do cérebro foi canulado. Os camundongos foram deixados recuperar. Nos dias 1, 5, 10 e 14, os camundongos foram anestesiados com isoflurano inalado. Benedril (5 mg/kg, IP) foi administrado a cada camundongo 15 minutos antes da dose ICV para reduzir qualquer potencial liberação de histamina em resposta ao tratamento com Naglu-IGF-II. A dose ICV foi infundida através da cânula implantada, o volume de 5 μl ao longo de 15-20 minutos, e os camundongos foram deixados recuperar. No 1, 7, 14, e 28 dias após a última dose, os camundongos foram sacrificados. Os cérebros foram coletados e divididos de modo sagital em 5 secções para distribuição a vários ensaios.

[0216]Os ensaios seguintes foram realizados para determinar os efeitos da proteína de fusão Naglu-IGF-II: avaliação imunohistoquímica de níveis de Naglu, LAMP-2, GFAP e CD68 em cérebro, ensaios bioquímicos para a atividade Naglu e beta-hexosaminadase, ensaio SensiPro (Deakin et al, Glycobiology 18: 483, 2008; Lawrence et al, Nat Biol Chem 8: 197, 2012; Lawrence et al, J Biol Chem 283: 33674, 2008) para detectar o sulfato de heparano total e NREs de sulfato de heparano específico para Mucopolissacaridose IIIB (MPS-IIIB) (WO 2010/078511A2) e coloração imunoflourescente para SCMAS, beta-amiloide (A-beta), p-tau, P- GSK3beta, glipicano 5, GFAP e CD68 em córtex entorrinal medial (Li et al., supra).

[0217]Quando avaliados 24 horas após a dose final, o tratamento com proteína de fusão Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEQ ID NO: 568) ou Naglu- rígida-IGF-II (SEQ ID NO: 566) resultou em um aumento acentuado da atividade da enzima Naglu, com uma concomitante diminuição da atividade de beta- hexosaminadase e os níveis de sulfato de heparano administrados, NREs específicas de Naglu de sulfato de heparano, e LAMP-2. A enzima Naglu foi facilmente detectável em tecidos cerebrais, não só no córtex, hipocampo, tálamo e giro dentado, mas também em locais geográficos distais remotos, incluindo amídala, córtex perirrinal e hipotálamo. Diminuições significativas nos níveis de CD68, SCMAS, beta-amiloide (A-beta), p-tau, P-GSK3beta, e glipicano 5 também foram observados em cérebros Naglu -/- após tratamento com Naglu-IGF-II. Coloração GFAP não se alterou por 24 horas após a última dose. A imunohistoquímica demonstrou a presença de enzima Naglu em muitas áreas do cérebro, dentro de neurônios e células gliais, co-localizado com LAMP-2.

[0218]Os níveis de sulfato de heparano, NREs específicas de Naglu, e a atividade beta-hexosaminidase continuou a diminuir ao longo dos pontos de tempo após a última dose de 7, 14 e 28 dias. Em 28 dias, todos os analitos estavam em ou perto dos valores normais de controle do camundongo.

EQUIVALENTES

[0219]Os especialistas na técnica reconhecerão, ou serão capazes de determinar usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas da invenção aqui descritas. O escopo da presente invenção não se destina a ser limitado à descrição acima, mas em vez é conforme estabelecido nas reivindicações anexas. Os artigos “um”, “uma”, e “o”, como aqui utilizado na especificação e nas reivindicações, a menos que expressamente indicado em contrário, devem ser entendidos como incluindo os referentes plurais. Reivindicações ou descrições que incluem “ou” entre um ou mais membros de um grupo são considerados satisfeitos se um, mais do que um, ou todos os membros do grupo estão presentes em, empregados em, ou de outra forma relevantes para um determinado produto ou processo, a menos que indicado ao contrário ou de outra forma evidente a partir do contexto. A invenção inclui modalidades em que exatamente um membro do grupo se encontra presente em, empregado em, ou de outra forma relevantes para um determinado produto ou processo. A invenção também inclui modalidades em que mais do que um, ou todos, os membros do grupo se encontram presentes em, empregados em, ou de outra forma relevantes para um determinado produto ou processo. Além disso, deve ser compreendido que a invenção inclui variações, combinações e permutações no qual uma ou mais limitações, elementos, disposições, termos descritivos, etc., a partir de uma ou mais das reivindicações são introduzidos na outra reivindicação dependente da mesma reivindicação base (ou, conforme o caso, qualquer outra reivindicação) a menos que indicado de outra forma, ou que seria evidente para um especialista na técnica que surgiria uma contradição ou incoerência. Quando os elementos são apresentados como listas, por exemplo, do grupo de Markush ou formato semelhante, deve ser entendido que cada um dos subgrupos dos elementos também é revelado, e nenhum elemento pode ser removido do grupo. Deve ser entendido que, em geral, onde a invenção, ou aspectos da invenção, são referidos como compreendendo elementos particulares, características, etc., certas modalidades da invenção ou aspectos da invenção consistem, ou consistem essencialmente em, tais elementos, recursos, etc. Para fins de simplicidade essas realizações não foram em todos os casos expressamente previstas aqui. Deve também ser entendido que qualquer modalidade da invenção, por exemplo, qualquer modalidade encontrada dentro da técnica anterior, pode ser explicitamente excluída das reivindicações, independentemente do fato de a exclusão específica ser mencionada na especificação.

[0220]Também deve ser entendido que, a menos que expressamente indicado em contrário, em quaisquer métodos aqui reivindicados que incluam mais do que um ato, a ordem dos atos do método não é necessariamente limitada à ordem em que os atos do método são mencionados, mas a invenção inclui modalidades em que a ordem é assim limitada. Além disso, onde as reivindicações mencionam uma composição, a invenção engloba métodos de utilização da composição e dos métodos de preparação da composição. Onde as reivindicações mencionam uma composição, deve ser entendido que a invenção abrange métodos para a utilização da composição e dos métodos de preparação da composição.

[0221]Todas as publicações e documentos de patente citados neste pedido são aqui incorporados por referência na sua totalidade na mesma extensão como se o conteúdo de cada documento de publicação ou patente individual fosse aqui incorporado.

Claims

1. Proteína de fusão terapêutica direcionada CARACTERIZADA pelo fato de que compreende (a) uma enzima lisossomal, (b) um marcador de peptídeo compreendendo os aminoácidos 8 a 67 de SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (c) um peptídeo espaçador entre a enzima lisossomal e o marcador de peptídeo, em que o peptídeo espaçador compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55) e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

2. Proteína de fusão terapêutica direcionada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo espaçador é a sequência de aminoácidos GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36).

3. Proteína de fusão terapêutica direcionada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo espaçador é a sequência de aminoácidos GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47).

4. Proteína de fusão terapêutica direcionada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo espaçador é a sequência de aminoácidos GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51).

5. Proteína de fusão terapêutica direcionada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo espaçador é a sequência de aminoácidos GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55).

6. Proteína de fusão terapêutica direcionada, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo espaçador é a sequência de aminoácidos GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

7. Proteína de fusão terapêutica direcionada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que a enzima lisossomal compreende uma proteína α-N-acetilglicosaminidase (Naglu) humana.

8. Proteína de fusão terapêutica direcionada, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADA pelo fato de que a enzima lisossomal é proteína α-N- acetilglicosaminidase (Naglu) humana.

9. Proteína de fusão terapêutica direcionada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o marcador de peptídeo compreende aminoácidos 8 a 67 de SEQ ID NO: 5.

10. Proteína de fusão terapêutica direcionada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADA pelo fato de que o marcador de peptídeo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

11. Proteína de fusão terapêutica direcionada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende ainda um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

12. Ácido nucleico CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 e codifica a proteína de fusão terapêutica direcionada como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e 10.

13. Método para produzir uma proteína de fusão terapêutica direcionada, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma etapa de: cultivar uma célula que contém o ácido nucleico, como definido na reivindicação 12, sob condições que permitem expressão da proteína de fusão terapêutica direcionada.

14. Uso de uma proteína de fusão compreendendo uma enzima lisossomal, um marcador de peptídeo compreendendo os aminoácidos 8 a 67 de SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e um peptídeo espaçador localizado entre a enzima lisossomal e o marcador de peptídeo, em que o peptídeo espaçador compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), o dito uso CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica para tratar uma doença de armazenamento lisossomal em um indivíduo.

15. Uso de uma proteína de fusão compreendendo uma proteína α-N- acetilglicosaminidase (Naglu) humana, um marcador de peptídeo compreendendo aminoácidos 8 a 67 de SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e um peptídeo espaçador localizado entre a proteína Naglu e o marcador de peptídeo, em que o espaçador compreende a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71), o dito uso CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de uma composição farmacêutica para tratar Mucopolissacaridose Tipo IIIB (Síndrome de Sanfilippo B).

16. Uso, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o marcador de peptídeo compreende os aminoácidos 8 a 67 da SEQ ID NO: 5.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o marcador de peptídeo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão compreende aminoácidos 1 a 743 ou aminoácidos 24 a 743 de Naglu humana.

19. Composição farmacêutica para reduzir níveis de glicosaminoglicano in vivo em um indivíduo sofrendo de Mucopolissacaridose Tipo IIIB (Síndrome de Sanfillippo B), CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma proteína de fusão compreendendo i) uma proteína α-N-acetilglicosaminidase (Naglu) humana, ii) um marcador de peptídeo compreendendo os aminoácidos 8 a 67 de SEQ ID NO: 5 ou uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e iii) um peptídeo espaçador localizado entre a proteína Naglu e o marcador de peptídeo.

20. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADA pelo fato de que o peptídeo espaçador compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEQ ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGA P (SEQ ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEQ ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEQ ID NO: 55), e GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEQ ID NO: 71).

21. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, CARACTERIZADA pelo fato de que o marcador de peptídeo compreende os aminoácidos 8 a 67 da SEQ ID NO: 5.

22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, CARACTERIZADA pelo fato de que o marcador de peptídeo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

23. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, CARACTERIZADA pelo fato de que a proteína de fusão compreende aminoácidos 1 a 743 ou aminoácidos 24 a 743 de Naglu humana.

24. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, CARACTERIZADA pelo fato de que uma concentração da proteína de fusão é de pelo menos 20 mg/ml.