JP2016505539A - 標的治療用ライソゾーム酵素融合タンパク質およびその使用 - Google Patents

標的治療用ライソゾーム酵素融合タンパク質およびその使用 Download PDF

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Abstract

本発明は基本的に、ライソゾーム蓄積症の治療に有用な治療用融合タンパク質およびそのような疾患の治療方法に関する。例示的な治療用融合タンパク質は、ライソゾーム酵素、ライソゾーム標的化部分、例えばＩＧＦ−ＩＩペプチド、およびスペーサーペプチドを含む。また、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）、ライソゾーム標的化部分、例えばＩＧＦ−ＩＩペプチド、およびスペーサーペプチドを含んでいる標的治療用融合タンパク質を含んでいるムコ多糖症ＩＩＩＢ型（Ｂ型サンフィリポ症候群）を治療するための組成物および治療方法も提供する。【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１２年１１月２７日に出願の米国仮特許出願第６１／７３０，３７８号および２０１３年３月１５日に出願の米国仮特許出願第６１／７８８，９６８号の優先権を主張し、これらの全体は参照することにより本明細書に組み込まれる。
本発明は基本的に、ライソゾーム蓄積症の治療に有用な治療用融合タンパク質およびそのような障害の治療方法に関する。治療用融合タンパク質の例としては、ライソゾーム酵素、ライソゾーム標的化部分、例えば、ＩＧＦ−ＩＩペプチド、およびスペーサーペプチドが挙げられる。ライソゾーム酵素がα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）であり、障害がムコ多糖症ＩＩＩＢ型（サンフィリポＢ症候群）であることを想定する。
通常哺乳類のライソゾーム酵素はサイトゾルで合成されてＥＲを横断し、そこでＮ結合型の高マンノース型炭水化物によってグリコシル化される。ゴルジ体では、高マンノース型炭水化物はライソゾーム酵素上で、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）が付加されることによって修飾され、このことにより、これらのタンパク質はライソゾームを標的とするようになる。Ｍ６Ｐ−修飾型タンパク質は、２つあるＭ６Ｐ受容体のうちの１方との相互作用を介してライソゾームに運ばれる。修飾形態のうち、高マンノース型炭水化物に２つのＭ６Ｐが付加される形態が最も有利である。
４０種を上回るライソゾーム蓄積症（ＬＳＤ）が、直接または間接的に、ライソゾーム中に１種類以上のライソゾーム酵素が欠損していることによって引き起こされる。ＬＳＤの酵素補充療法が盛んに研究されている。治療には通常、ＬＳＤタンパク質を取り除き、様々な細胞型のライソゾームをＭ６Ｐに依存的な様式で送達することが必要とされる。利用可能なアプローチの１つは、ＬＳＤタンパク質を精製し、Ｍ６Ｐを使って炭水化物を組み入れるように修飾することを伴う。この修飾した物質は、細胞表面で起こるＭ６Ｐ受容体との相互作用によって、未修飾のＬＳＤタンパク質よりも効率的に細胞に取り込まれると考えられる。
本出願の発明者らはこれまでに、治療用酵素をライソゾームにより効率的に送達することを可能にする、ペプチドを利用した標的化技術を開発してきた。この専有技術は、ライソゾームを標的とする部分としてＭ６Ｐの替わりにペプチドタグを使用していることから、グリコシル化非依存性ライソゾーム標的化（ＧＩＬＴ）と呼ばれている。ＧＩＬＴ技術の詳細は、米国特許出願第２００３−００８２１７６号、同第２００４−０００６００８号、同第２００３−００７２７６１号、同第２００５−０２８１８０５号、同第２００５−０２４４４００号、および国際出願第０３／０３２９１３号、同第０３／０３２７２７号、同第０２／０８７５１０号、同第０３／１０２５８３号、同第２００５／０７８０７７号に記載されており、これらすべての開示は、ここで参照することにより本明細書に組み込まれる。
米国特許出願公開第２００３／００８２１７６号明細書 米国特許出願公開第２００４／０００６００８号明細書 米国特許出願公開第２００３／００７２７６１号明細書 米国特許出願公開第２００５／０２８１８０５号明細書 米国特許出願公開第２００５／０２４４４００号明細書 国際公開第０３／０３２９１３号 国際公開第０３／０３２７２７号 国際公開第０２／０８７５１０号 国際公開第０３／１０２５８３号 国際公開第２００５／０７８０７７号
本発明は、さらに改良した組成物と、ＧＩＬＴ技術に基づいて効率的にライソゾームを標的とするための方法を提供する。本発明はなかでも、ライソゾーム標的化ペプチドを使用してライソゾーム酵素をライソゾームに標的化するための方法および組成物を提供する。また本発明は、ＩＧＦ−Ｉ受容体との結合親和性が弱いもしくはＩＧＦ−Ｉ受容体との結合親和性をもたない、および／またはインスリン受容体との結合親和性が弱いもしくはインスリン受容体との結合親和性をもたない、および／またはフューリン分解抵抗性のライソゾーム標的化ペプチドを使用してライソゾーム酵素をライソゾームに標的化するための方法および組成物も提供する。本発明はさらに、ライソゾーム酵素およびＩＧＦ−ＩＩ、ならびに高い生産性とライソゾーム酵素融合タンパク質のライソゾームへの取り込みを高めるためのスペーサーペプチドを含んでいるライソゾーム酵素融合タンパク質も提供する。一定の態様では、ライソゾーム酵素はα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）である。
一側面において本発明は、ライソゾーム酵素、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグ、およびライソゾーム酵素とＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間にスペーサーペプチドを含んでいる、標的治療用融合タンパク質を提供する。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＰＳ（配列番号１４）またはＧＧＧＳＰ（配列番号１５）アミノ酸配列を１つ以上含み、場合により、さらに、（ｉ）ＧＡＰ（配列番号９）、（ｉｉ）ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、（ｉｉｉ）ＧＧＧＳ（配列番号１６）、（ｉｖ）ＡＡＡＡＳ（配列番号１７）、（ｖ）ＡＡＡＳ（配列番号１８）、（ｖｉ）ＰＡＰＡ（配列番号１９）、（ｖｉｉ）ＴＰＡＰＡ（配列番号２０）、（ｖｉｉｉ）ＡＡＡＫＥ（配列番号２１）または（ｉｘ）ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）を１つ以上含む。
本明細書で想定するライソゾーム酵素の例としては、表１に示す酵素がある。
様々な態様において標的治療用融合タンパク質は、ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列（図１、配列番号１）、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグおよびＮａｇｌｕアミノ酸配列とＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチドを含む。様々な態様においてスペーサーは、ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＰＳ（配列番号１０）、またはＧＧＳ（配列番号１１）アミノ酸配列を含む。様々な態様においてスペーサー配列は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸とヒトＮａｇｌｕのアミノ酸との間にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＧＰＳ）アミノ酸（配列番号１０）を含む。
様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）またはＧＧＧＳ（配列番号１６）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＰＳ（配列番号１４）またはＧＧＧＳＰ（配列番号１５）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＡＡＡＡＳ（配列番号１７）またはＡＡＡＳ（配列番号１８）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＰＡＰＡ（配列番号１９）またはＴＰＡＰＡ（配列番号２０）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＡＡＡＫＥ（配列番号２１）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）アミノ酸配列を１つ以上含む。
様々な態様においてスペーサーペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２、５６、５８、９１〜９４）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３６、９５〜１００）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号１０１〜１０７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３７、１０８〜１１３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１１４〜１６２）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１６３〜１６９）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号１７０〜２１８）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２１９〜２６７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２６８〜３１６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５４４〜５５１）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ（配列番号６０、７９、８１、３１７〜３２０）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２１〜３２６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２７〜３３３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３３４〜３４０）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３４１〜３８９）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３９０〜３９６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号３９７〜４４５）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４４６〜４９４）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４９５〜５４３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５５２〜５５９）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、ｎは１〜７である。様々な態様においてｎは１〜４である。
様々な態様において本発明は、ペプチドまたはペプチドを含んでいる融合タンパク質が哺乳類のライソゾームを標的とするためのペプチドタグとして使用するＩＧＦ−ＩＩペプチドを提供する。様々な態様において本発明は、ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質を提供する。様々な態様において本発明は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩ（ＡＹＲＰＳＥＴＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡＳＲＶＳＲＲＳＲＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ）（配列番号５）と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列と、フューリンプロテアーゼ切断部位を少なくとも１つ消失させる変異を有するフューリン抵抗性のＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質を提供する。
いくつかの態様において本発明は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含んでいる、ＩＧＦ−ＩＩの変異型タンパク質を提供する。様々な態様においてこのＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質ペプチドタグは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸を含む。様々な態様においてＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、インスリン受容体に対する結合親和性を、野生型ヒトＩＧＦ−ＩＩと比較して、低下させるまたは減少させる変異を含む。
いくつかの態様においてＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−Ｉ受容体対する親和性よりも低い、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合親和性を有する。
様々な態様において本発明は、ライソゾーム酵素および成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質を含有する標的治療用融合タンパク質を提供し、ここでＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質はフューリン分解抵抗性であり、かつ、マンノース−６−リン酸非依存性の様式で、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体に結合する。
いくつかの態様において本発明は、ライソゾーム酵素および、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有し、かつ、天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩのインスリン受容体に対する親和性よりも低いインスリン受容体への結合親和性を有するＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質を含有する標的治療用融合タンパク質を提供する。関連の態様においてこのＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質はフューリン分解抵抗性であり、マンノース−６−リン酸非依存性の様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体に結合する。
様々な態様では、本発明に好適なＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの３０〜４０番目のアミノ酸に相当する領域内に変異を含む。いくつかの態様では、本発明に好適なＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの３４〜４０番目のアミノ酸に相当する領域内に変異を含み、そのような変異によって、フューリンプロテアーゼ切断部位の少なくとも１つが消失している。いくつかの態様において好適な変異は、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入である。いくつかの態様において変異は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのＡｒｇ３７またはＡｒｇ４０に相当する位置でのアミノ酸置換である。いくつかの態様においてこのアミノ酸置換は、ＬｙｓまたはＡｌａへの置換である。
いくつかの態様において好適な変異は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの３０〜４０、３１〜４０、３２〜４０、３３〜４０、３４〜４０、３０〜３９、３１〜３９、３２〜３９、３４〜３７、３３〜３９、３４〜３９、３５〜３９、３６〜３９、３７〜４０番目、およびその組み合わせからなる群より選択される位置に相当するアミノ酸残基の欠失または置換である。
様々な態様において本発明によるＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの２〜７番目に相当するアミノ酸の欠失または置換をさらに含有する。様々な態様において本発明によるＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの１〜７番目に相当するアミノ酸の欠失または置換をさらに含む。様々な態様において本発明によるＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの６２〜６７番目に相当するアミノ酸の欠失または置換をさらに含む。様々な態様において本発明によるＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのＴｙｒ２７、Ｌｅｕ４３、またはＳｅｒ２６に相当する位置にアミノ酸置換をさらに含む。様々な態様において本発明によるＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、Ｔｙｒ２７Ｌｅｕ、Ｌｅｕ４３Ｖａｌ、Ｓｅｒ２６Ｐｈｅおよびその組み合わせからなる群より選択されるアミノ酸置換を少なくとも１つ含む。様々な態様において本発明によるＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの４８〜５５番目に相当するアミノ酸を含有する。様々な態様において本発明によるＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８、４８、４９、５０、５４、および５５番目に相当するアミノ酸からなる群より選択されるアミノ酸を少なくとも３つ含有する。様々な態様において本発明のＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの５４および５５番目に相当する位置に、このいずれもが、ｐＨ７．４の場合に帯電していないまたは負に帯電しているアミノ酸を含有する。様々な態様においてＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質のＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合親和性は、天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−Ｉ受容体に対する親和性よりも低い。様々な態様においてＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、ＩＧＦ２ Δ８−６７ Ｒ３７Ａである（つまり、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸を有しているが、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの３７番目の位置にあるＡｒｇがＡｌａで置換されている）。
様々な態様においてペプチドタグは、ライソゾーム酵素のＮ末端またはＣ末端に結合されており、そのため、それぞれがＮ末端タグまたはＣ末端タグである。様々な態様においてペプチドタグはＣ末端タグである。
いくつかの態様において本発明に好適なライソゾーム酵素は、ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）（図１）、またはその機能性断片もしくは変異体である。いくつかの態様において本発明に好適なライソゾーム酵素は、シグナル配列を欠失しているヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの１〜７４３番目のアミノ酸またはヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの２４〜７４３番目のアミノ酸を含む。
様々な態様において本発明の標的治療用融合タンパク質はさらに、ライソゾーム酵素とＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質との間にスペーサーを含む。
様々な態様においてスペーサーは、αらせん構造または強固な構造を含む。
様々な態様においてスペーサーは、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＧＡＰ）（配列番号９）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＧＰＳ）（配列番号１０）、またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＧＳ）（配列番号１１）アミノ酸配列を１つ以上含む。
いくつかの態様においてスペーサーは、ＥＦＧＧＧＧＳＴＲ（配列番号２２）、ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＰＳＧＳＰＧ（配列番号２３）、ＧＰＳＧＳＰＧＴ（配列番号２４）、ＧＰＳＧＳＰＧＨ（配列番号２５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＴ（配列番号２６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＨ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号２８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３４）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４３）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５９）、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＴ（配列番号６１）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号７９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号８１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳ］（配列番号８３）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳ］（配列番号８５）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８６）、ＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８７）、ＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号８８）、ＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８９）、およびＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号９０）からなる群より選択される。
いくつかの態様においてスペーサーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択される。
いくつかの態様においてスペーサーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択される。
様々な態様において融合タンパク質は、薬学上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む。
本発明はまた、上記様々な態様で説明したＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質または標的治療用融合タンパク質をコードしている核酸も提供する。本発明はさらに、本発明の核酸を含有している様々な細胞を提供する。
本発明は、ライソゾーム蓄積症の治療に好適な、治療上有効量の本発明の標的治療用融合タンパク質を含有している医薬組成物を提供する。本発明はさらに、治療を必要としている対象に本発明による標的治療用融合タンパク質を投与することを含む、ライソゾーム蓄積症の治療方法も提供する。いくつかの態様では、ライソゾーム蓄積症はムコ多糖症ＩＩＩＢ型（サンフィリポＢ症候群）である。
別の側面において本発明は、細胞培養用の培地中で哺乳類細胞を培養する工程を含む標的治療用融合タンパク質の生産方法を提供し、ここで、この哺乳類細胞は本発明の核酸、具体的には本明細書の様々な態様で説明した核酸を保持し、かつ、培養する工程は標的治療用融合タンパク質の発現を許容する条件で行われる。
一層さらに別の側面において本発明は、フューリン欠損細胞（例えば、フューリンを欠損している哺乳類細胞）を細胞培養用の培地中で培養する工程を含む標的治療用融合タンパク質の生産方法を提供し、ここでこのフューリン欠損細胞は、ライソゾーム酵素と、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩと少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有しているＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質とを含んでいる融合タンパク質をコードしている核酸を保持し、ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質はマンノース−６−リン酸非依存性の様式でヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体に結合し、かつ、培養する工程は標的治療用融合タンパク質の発現を許容する条件で行われる。
様々な態様において、本明細書に記載のスペーサーを含んでいる特定の標的治療用タンパク質を組換え的に発現させた場合には、別のスペーサーペプチドを含んでいる標的治療用タンパク質と比較して、活性なタンパク質がより高いレベルで発現されることが想定される。また様々な態様では、本明細書に記載の標的治療用タンパク質は、本明細書に記載の他の標的治療用タンパク質よりも高い活性を有する可能性があることも想定される。別のスペーサーペプチドを含んでいる他の標的治療用タンパク質と比較して、活性なタンパク質を高レベルで発現しているおよび／または活性の高い標的治療用タンパク質を詳細な実験に用いることを想定している。
別の側面において本発明は、ライソゾーム酵素、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグおよび、ライソゾーム酵素のアミノ酸配列とＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチドを含んでいる融合タンパク質を含んでいる治療上有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるライソゾーム蓄積症の治療方法を提供する。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＰＳ（配列番号１４）またはＧＧＧＳＰ（配列番号１５）アミノ酸配列を１つ以上含み、場合により、さらに、（ｉ）ＧＡＰ（配列番号９）、（ｉｉ）ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、（ｉｉｉ）ＧＧＧＳ（配列番号１６）、（ｉｖ）ＡＡＡＡＳ（配列番号１７）、（ｖ）ＡＡＡＳ（配列番号１８）、（ｖｉ）ＰＡＰＡ（配列番号１９）、（ｖｉｉ）ＴＰＡＰＡ（配列番号２０）、（ｖｉｉｉ）ＡＡＡＫＥ（配列番号２１）または（ｉｘ）ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）を１つ以上含む。
様々な態様においてスペーサーペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２、５６、５８、９１〜９４）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３６、９５〜１００）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号１０１〜１０７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３７、１０８〜１１３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１１４〜１６２）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１６３〜１６９）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号１７０〜２１８）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２１９〜２６７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２６８〜３１６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５４４〜５５１）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ（配列番号６０、７９、８１、３１７〜３２０）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２１〜３２６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２７〜３３３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３３４〜３４０）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３４１〜３８９）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３９０〜３９６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号３９７〜４４５）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４４６〜４９４）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４９５〜５４３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５５２〜５５９）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここでｎは１〜７であり、場合によって、ｎは１〜４である。
様々な態様においてスペーサーペプチドはＥＦＧＧＧＧＳＴＲ（配列番号２２）、ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＰＳＧＳＰＧ（配列番号２３）、ＧＰＳＧＳＰＧＴ（配列番号２４）、ＧＰＳＧＳＰＧＨ（配列番号２５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＴ（配列番号２６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＨ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号２８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３４）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４３）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５９）、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＴ（配列番号６１）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号７９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号８１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳ］（配列番号８３）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳ］（配列番号８５）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８６）、ＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８７）、ＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号８８）、ＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８９）、およびＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号９０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する。
本明細書に記載の方法で検討するライソゾーム蓄積症の例としては表１に示す障害がある。ライソゾーム蓄積症で欠損している酵素（これも表１で開示している）を含んでいる標的治療用融合タンパク質を使用してライソゾーム蓄積症を治療することを想定する。
様々な態様において本発明は、ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグおよび、Ｎａｇｌｕアミノ酸配列とＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチドを含んでいる治療上有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるムコ多糖症ＩＩＩＢ型（サンフィリポＢ症候群）の治療方法を提供する。様々な態様においてスペーサーは、ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＰＳ（配列番号１０）、またはＧＧＳ（配列番号１１）アミノ酸配列を含む。
様々な態様においてスペーサー配列は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸とヒトＮａｇｌｕのアミノ酸との間にＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＧＰＳ）アミノ酸（配列番号１０）を含む。
様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）またはＧＧＧＳ（配列番号１６）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＰＳ（配列番号１４）またはＧＧＧＳＰ（配列番号１５）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＡＡＡＡＳ（配列番号１７）またはＡＡＡＳ（配列番号１８）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＰＡＰＡ（配列番号１９）またはＴＰＡＰＡ（配列番号２０）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＡＡＡＫＥ（配列番号２１）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）アミノ酸配列を１つ以上含む。
様々な態様においてスペーサーペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２、５６、５８、９１〜９４）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３６、９５〜１００）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号１０１〜１０７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３７、１０８〜１１３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１１４〜１６２）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１６３〜１６９）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号１７０〜２１８）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２１９〜２６７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２６８〜３１６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５４４〜５５１）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ（配列番号６０、７９、８１、３１７〜３２０）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２１〜３２６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２７〜３３３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３３４〜３４０）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３４１〜３８９）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３９０〜３９６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号３９７〜４４５）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４４６〜４９４）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４９５〜５４３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５５２〜５５９）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここでｎは１〜７であり、場合により、ｎは１〜４である。
様々な態様において本発明は、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（サンフィリポＢ症候群）に罹患している対象に、ｉ）ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質（配列番号１）と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、ｉｉ）成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグ、およびｉｉｉ）Ｎａｇｌｕアミノ酸配列とＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチドを含んでいる有効量の融合タンパク質を投与することを含む、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のインビボでのレベルを低下させる方法を提供する。
様々な態様においてスペーサー配列は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸とヒトＮａｇｌｕのアミノ酸との間に、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＧＡＰ）（配列番号９）アミノ酸を１コピー以上含んでいる。
様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＥＦＧＧＧＧＳＴＲ（配列番号２２）、ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＰＳＧＳＰＧ（配列番号２３）、ＧＰＳＧＳＰＧＴ（配列番号２４）、ＧＰＳＧＳＰＧＨ（配列番号２５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＴ（配列番号２６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＨ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号２８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３４）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４３）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５９）、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＴ（配列番号６１）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号７９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号８１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳ］（配列番号８３）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳ］（配列番号８５）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８６）、ＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８７）、ＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号８８）、ＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８９）、およびＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号９０）からなる群より選択される。
様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択される。
様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択される。
様々な態様においてライソゾーム標的化ドメインまたはＩＧＦ−ＩＩペプチドタグは、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸（配列番号２、４）を含む。様々な態様においてＩＧＦ−ＩＩペプチドタグは、Ａｒｇ３７の残基に変異を含む。様々な態様において変異は、アルギニンからアラニンへの置換である。様々な態様においてライソゾーム標的化ドメインまたはＩＧＦ−ＩＩペプチドタグは、ＩＧＦ２ Δ８−６７ Ｒ３７Ａを含む。
様々な態様において融合タンパク質は、ヒトＮａｇｌｕの１〜７４３番目のアミノ酸（配列番号１、３）を含む。様々な態様において融合タンパク質は、ヒトＮａｇｌｕの２４〜７４３番目のアミノ酸を含む。
様々な態様において有効量の融合タンパク質は、対象の体重１キログラムあたり約０．１〜１ｍｇ、約１〜５ｍｇ、約２．５〜２０ｍｇ、約５〜２０ｍｇ、約１０〜５０ｍｇ、または２０〜１００ｍｇの範囲である。様々な態様において有効量の融合タンパク質は、対象の体重１キログラム当たり約２．５〜２０ｍｇである。
様々な態様において融合タンパク質は、髄腔内に、静脈内に、筋肉内に、非経口的に、経皮的に、または経粘膜的に投与される。様々な態様において融合タンパク質は、髄腔内に投与される。様々な態様において髄腔内投与は、必要に応じて、融合タンパク質を静脈内に投与することをさらに含む。
様々な態様において髄腔内投与は、融合タンパク質を脳室、腰部、または大槽に導入することを含む。
様々な態様において融合タンパク質は、２ヶ月に１回、１ヶ月に１回、３週間に１回、２週間に１回、１週間に１回、１日１回、または様々な間隔で投与される。
様々な態様において治療は、脳組織でのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルの低下をもたらす。さらに、治療が脳組織におけるライソゾーム貯蔵顆粒の減少をもたらすことも想定される。
また、ライソゾーム蓄積症の治療に使用するための本明細書に記載した標的治療用融合タンパク質を含んでいる組成物についても検討する。ライソゾーム蓄積症の例としては表１に示すものが挙げられる。
本発明の他の特色、目的、および利点は以下の詳細な説明から明らかである。しかしながら、この詳細な説明は、本発明の態様を示しているにもかかわらず、例示する目的のためだけに提示されており、限定する意図がないと理解される。本発明の範囲に入る様々な変更形態および修正形態は、詳細な説明から、当業者には明らかであろう。
以下の図面は例示する目的のためだけに提示され、本発明を限定するものではない。
図１は、（Ａ）Ｎａｇｌｕおよび（Ｂ）ＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目の残基であって、３７番目の残基にＲ３７Ａのアミノ酸置換（Ａｒｇ３７Ａｌａ）を含むＩＧＦ−ＩＩペプチドを含んでいる例示的な治療用融合タンパク質の一部分のアミノ酸配列を示している。
図２は、（Ａ）Ｎａｇｌｕおよび（Ｂ）ＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目の残基であって、３７番目の残基にＲ３７Ａのアミノ酸置換（Ａｒｇ３７Ａｌａ）を含むＩＧＦ−ＩＩペプチドを含んでいる例示的な治療用融合タンパク質の一部分のヌクレオチド配列を示している。
図３では、治療用融合タンパク質における使用を想定している例示的なスペーサー配列を開示している。 同上 同上
定義
回復：本明細書で使用する場合「回復」という用語は、状態の予防、低減、もしくは緩和、または対象の状態の改善を意味する。回復は、病状の完全、完全な予防を含むが、これらは必須ではない。いくつかの態様では、回復には、疾患に関連する組織のライソゾーム中に蓄積された物質の減少が含まれる。
フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質：本明細書で使用する場合「フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質」という用語は、変化したアミノ酸配列を含有しているＩＧＦ−ＩＩを基礎とするペプチドを指し、ここで変化したアミノ酸配列とは、天然のフューリンプロテアーゼ切断部位を少なくとも１つ消失させるか、またはフューリンによる切断が野生型ヒトＩＧＦ−ＩＩペプチドと比較した場合に阻止、阻害、低減または遅れるように、天然のフューリンプロテアーゼ切断部位に近位のもしくは隣接した配列を変化させるものである。本明細書で使用する場合、フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質もまた、フューリン抵抗性のＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質を指す。
フューリンプロテアーゼ切断部位：本明細書で使用する場合「フューリンプロテアーゼ切断部位」（「フューリン切断部位」または「フューリン切断配列」とも呼ばれる）という用語は、フューリンまたはフューリン様プロテアーゼによる、酵素的なプロテアーゼ切断の認識配列を保持するペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を指す。通常、フューリンプロテアーゼ切断部位は、Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ（配列番号６）という共通配列を有し、ここでＸはいずれのアミノ酸であってもよい。切断部位は、配列のカルボキシ末端にあるアルギニン（Ａｒｇ）残基の下流に配置されている。いくつかの態様では、フューリン切断部位は、Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号７）の共通配列を有していてもよく、ここでＸは任意のアミノ酸である。切断部位は配列中で、カルボキシ末端のアルギニン（Ａｒｇ）残基の下流に配置されている。
フューリン：本明細書で使用する場合「フューリン」という用語は、本明細書で定義するフューリンプロテアーゼ切断部位を認識し、切断する全てのプロテアーゼを指し、フューリンまたはフューリン様プロテアーゼを含む。フューリンは、対合している塩基性アミノ酸切断酵素（ＰＡＣＥ）としても知られている。フューリンは、スブチリシン様プロタンパク質転換酵素ファミリーに属す酵素である。フューリンをコードしている遺伝子は、ＦＵＲ（ＦＥＳ上流領域）として知られていた。
フューリン欠損細胞：本明細書で使用する場合「フューリン欠損細胞」という用語は、フューリンプロテアーゼ活性が阻害されている、低下しているまたはその活性を欠いている全ての細胞を指す。フューリン欠損細胞には、フューリンを生産しない、またはフューリンの量が低下している、もしくはフューリンプロテアーゼが欠損している、哺乳類細胞および非哺乳類細胞の両方が含まれる。
グリコシル化非依存性ライソゾーム標的化：本明細書で使用する場合「グリコシル化非依存性ライソゾーム標的化」（「ＧＩＬＴ」とも呼ばれる）という用語は、マンノース−６−リン酸に依存しないライソゾームの標的化を指す。
ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ：本明細書で使用する場合「ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ」（「Ｎａｇｌｕ」とも呼ばれる）という用語は、哺乳類のライソゾームにおけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルを低下させることが可能なまたはＭＰＳ ＩＩＩＢ（サンフィリポＢ症候群）の症状のうちの１つ以上を救出もしくは回復させることが可能な、前駆形態の（つまり天然のＮａｇｌｕシグナルペプチド配列を含有している）またはプロセシングされた（つまり天然のＮａｇｌｕシグナルペプチド配列を欠いた）野生型ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、またはその機能性断面もしくは変異体を指す。本明細書で使用する場合、「機能性」という用語は、Ｎａｇｌｕに関する場合、哺乳類のライソゾームが取り込むことができ、かつ、哺乳類のライソゾーム内に貯蔵されている物質、つまりグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を減少させるのに十分な酵素活性を有しているＮａｇｌｕ酵素を指す。
ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質：本明細書で使用する場合「ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質」という用語は、ＩＧＦ−ＩＩを基礎とするが、アミノ酸配列が変化しているペプチドを指す。本明細書で使用する場合「フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質」という用語は、天然のフューリンプロテアーゼ切断部位が少なくとも１つ消失するように変化した、またはフューリンによる切断が野生型ヒトＩＧＦ−ＩＩペプチドと比較した場合に阻止、阻害、低減または遅れるように、天然のフューリンプロテアーゼ切断部位に近位のもしくは隣接した配列を変化させるアミノ酸配列を含有している、ＩＧＦ−ＩＩを基礎とするペプチドを指す。本明細書で使用する場合、フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質はフューリン抵抗性のＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質も指す。
改善、向上、または低下：本明細書で使用する場合「改善」、「向上」または「低下」という用語またはその文法的な均等物は、基準となる測定値、例えば、同じ個人における本明細書に記載の治療を開始する前の測定値、または本明細書に記載の治療を受けていない対照となる個人（または複数人の対照）における測定値と比較した値を示す。「対照となる個人」とは、治療を受けている個人と同じ型のライソゾーム蓄積症（例えば、ＭＰＳ ＩＩＩＢ（サンフィリポＢ症候群））を患っており、治療を受けている個人とおよそ同じ年齢の（治療を受けている個人と対照となる個人の疾患の段階が比較できるようにするため）個人である。
個人、対象、患者：本明細書で使用する場合「対象」、「個人」または「患者」という用語は、ヒト対象または非ヒト哺乳類対象を指す。治療を受けている個人（「患者」または「対象」とも呼ばれる）は、ライソゾーム蓄積症、例えば、ＭＰＳ ＩＩＩＢ（サンフィリポＢ症候群）（つまり小児発症性、若年発症性、もしくは成人発症性または重症型／従来型または中間型のＭＰＳ ＩＩＩＢ（サンフィリポＢ症候群））を患っている、あるいはライソゾーム蓄積症（例えば、ＭＰＳ ＩＩＩＢ（サンフィリポＢ症候群））を発症する可能性のある個人（胎児、新生児、幼児、青年、または成人のヒト）である。
ライソゾーム蓄積症：本明細書で使用する場合「ライソゾーム蓄積症」とは、ライソゾーム中で高分子をペプチド、アミノ酸、単糖、核酸および脂肪酸に分解するのに必要な酵素（例えば、酸性加水分解酵素）が少なくとも１つ欠損している結果生じる群の遺伝性障害を指す。その結果、ライソゾーム蓄積症の患者では、ライソゾーム中に成分が蓄積する。ライソゾーム蓄積症の例を表１に示している。
ライソゾーム酵素：本明細書で使用する場合「ライソゾーム酵素」という用語は、哺乳類のライソゾーム中に蓄積している成分を減らすことができる、またはライソゾーム蓄積症の兆候の１つ以上を救済するまたは回復させることができる全ての酵素を指す。本発明に好適なライソゾーム酵素には、野生型または修飾型両方のライソゾーム酵素が含まれ、また、組換え的な手法および合成によって生産すること、または天然の供給源から精製することができる。ライソゾーム酵素の例を表１に示している。
スペーサー：本明細書で使用する場合「スペーサー」（「リンカー」とも呼ばれる）という用語は、融合タンパク質の２つのタンパク質部分の間にあるペプチド配列を指す。スペーサーは通常、柔軟性をもつように、または２つのタンパク質部分の間にアルファ−ヘリックスなどの構造を挿入するように設計される。スペーサーは相対的に短くてもよく、例えば、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＧＡＰ）（配列番号９）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＧＧＧＳ）（配列番号１２）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ（ＧＧＧＧＡ）（配列番号６０）またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（ＧＧＧＧＧＰ）（配列番号１３）の配列であってよく、またはより長くても、例えば、長さが１０〜２５のアミノ酸、長さが２５〜５０のアミノ酸もしくは長さが３５〜５５のアミノ酸であってもよい。スペーサー配列の例については発明を実施するための形態の項で詳細に開示する。
治療上有効量：本明細書で使用する場合「治療上有効量」または「有効量」という用語は、いかなる医学的な治療にも適用可能な妥当なリスク対効果比で、治療した対象において治療効果を発揮する標的治療用融合タンパク質の量を指す。治療効果は客観的なものであっても（つまりいくつかの試験またはマーカーによって測定可能なものであっても）あるいは主観的なものであっても（つまり対象が指標または効果の感じを提供するものであっても）よい。具体的には、「治療上有効量」とは、所望の疾患または状態を治療する、回復させる、または予防するのに有効な、あるいは、例えば疾患に関連のある症状を回復する、疾患の発症を予防もしくは遅らせる、および／または疾患の重篤度もしくは症状が発現する頻度を下げることで検出可能な治療上もしくは予防上の効果を示す有効な、治療用融合タンパク質または組成物の量を指す。治療上有効量は一般的に、複数回投与を含み得る投与計画に従って投与される。任意の特定の治療用融合タンパク質については、治療上有効量（および／または有効な投与計画における適切な単位投与量）は、例えば、投与経路、併用される他の医薬品に応じて変わり得る。また、任意の特定の患者に特異的な治療上有効量（および／または単位投与量）は、治療する障害やその障害の重篤度；用いられる特定の医薬品の活性；用いられる特定の組成物；患者の年齢、体重、総体的な健康、性別および食事；投与時間、投与経路、および／または用いられる特定の融合タンパク質の排出速度もしくは代謝速度；治療期間；などの医学の分野においてよく知られている様々な要因に依存し得る。
治療：本明細書で使用する場合「治療」（「治療する」または「治療している」も含む）という用語は、特定の疾患、障害、および／または状態を、部分的にもしくは完全に緩和する、回復させる、軽減する、阻害する、その発症を遅らせる、その重篤度を下げる、および／またはその１つ以上の症状または特徴の頻度を下げる前記治療用融合タンパク質を含んでいる治療用融合タンパク質または医薬組成物のいかなる投与をも指す。このような治療は、関連する疾患、障害および／または状態の徴候を示していない対象、および／または疾患、障害、および／または状態のごく初期の徴候だけを示している対象への治療である場合もある。あるいはまたはこれに加えて、このような治療は、関連する疾患、障害および／または状態に関して確立されている徴候を１つ以上示している対象の治療であってもよい。例えば、治療は、心臓の状態の改善（例えば、拡張末期容積および／または収縮末期容積の増大、もしくは、例えばポンペ病に典型的に見られる進行性心筋症の低減、回復または予防）または肺機能の改善（例えば、基準となる容積に対する肺活量の増大、および／または吐いている間の酸素不飽和化の正常化）；神経発達および／または運動能力の改善（例えば、ＡＩＭＳスコアの改善）；貯蔵量の低下（例えば、疾患に罹患している個人の組織でのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルの低下）；またはこれら効果の任意の組み合わせを指す場合もある。いくつかの態様では、治療には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の排出の改善、特に、ＭＰＳ ＩＩＩＢ（サンフィリポＢ症候群）に関連するニューロンの症状の低下または予防が含まれる。
本明細書で使用する場合「約」および「およそ」という用語は同じ意味で用いられる。約／およそを伴ってあるいは伴わずに本明細書で使用される数字はいずれも、関連分野の当業者が認識する一般的なゆらぎも含むことを意味する。
本発明は、グリコシル化非依存性ライソゾーム標的化（ＧＩＬＴ）技術に基づいた、ライソゾーム酵素を標的化するための改善された方法および組成物を提供する。なかでも本発明は、フューリン抵抗性で、および／またはインスリン受容体との結合親和性が弱いもしくはインスリン受容体との結合親和性をもたず、および／またはＩＧＦ−Ｉ受容体との結合親和性が弱いもしくはＩＧＦ−Ｉ受容体との結合親和性をもたないＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質、ならびに本発明のＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質を含有している標的治療用融合タンパク質を提供する。本発明はまた、その作成方法および使用も提供する。
以降の項において、本発明の様々な側面を詳細に説明する。項は本発明を限定するために使用するものではない。それぞれの項は本発明のいずれの側面にも応用可能である。本明細書では、特段の指定のない限り、「または」は「および／または」と同じ意味で使用する。
ライソゾーム酵素
本発明に好適なライソゾーム酵素には、哺乳類のライソゾーム中に蓄積された成分を減少させることが可能な、または１つ以上のライソゾーム貯蔵性の病徴を救済または回復することが可能な全ての酵素が含まれる。好適なライソゾーム酵素には、野生型または修飾型両方のライソゾーム酵素が含まれ、また、組換え的な手法または合成によって生産することができ、あるいは、天然の供給源から精製することができる。ライソゾーム酵素の例を表１に挙げる。
Figure 2016505539
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いくつかの態様では、本明細書で検討されるライソゾーム酵素には、表１に示したヒト酵素の天然に存在するポリヌクレオチド配列と５０〜１００％の配列同一性、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の配列同一性を有し、それでもなお、機能性の、つまり、哺乳類のライソゾーム中に蓄積された物質、例えばグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を減少させることができる、またはライソゾーム貯蔵性の病徴のうちの１つ以上を救済もしくは回復させることができるタンパク質をコードしている酵素が含まれる。
ライソゾーム酵素の配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させパーセント配列同一性を最大にするために必要に応じてギャップを挿入した後の候補配列中に含まれる、天然由来のヒト酵素配列のアミノ酸残基と同一のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。この場合、保存的置換はいずれも配列同一性の一部とは見なされない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的での整列は、当該分野の技術の範囲内にある様々な方法によって、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されているコンピューターソフトウェアを使って実施することができる。当業者であれば、比較する配列の完全長にわたって整列を最大にするのに必要な任意のアルゴリズムなど、整列を測定するのに適切な指標を判断することができる。アミノ酸配列同一性を決定するためには、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６，４６０−４８０ （１９９６））を使用するのが好ましい。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２では複数の検索指標が採用されており、その多くが既定値に設定されている。調整可能な指標は以下の値に設定されている：重複スパン＝１、重複画分＝０．１２５、閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰスコア（Ｓ）およびＨＳＰ Ｓ２指標は変動する値で、特定の配列組成に応じてプログラム自体によって確立される。しかしながら、最小値は調整可能であり、上述のように設定される。
α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、Ｎａｇｌｕ、は前駆分子として生産され、成熟形態へとプロセシングされる。この過程は通常、このタンパク質が小胞体に進入するのに伴って２３アミノ酸のシグナルペプチドが除去されることによって生じる。典型的には、この前駆形態は完全長前駆体または完全長Ｎａｇｌｕタンパク質とも呼ばれ、７４３個のアミノ酸を含んでいる（配列番号１）。Ｎ末端にある２３個のアミノ酸はこの前駆タンパク質が小胞体に進入するときに切断され、プロセシングされたまたは成熟した形態のタンパク質となる。従って、Ｎ末端の２３アミノ酸は基本的に、Ｎａｇｌｕのタンパク質活性には必要でないと考えられる。典型的な野生型または天然に存在するヒトＮａｇｌｕタンパク質の成熟形態および完全長前駆形態のアミノ酸配列を図１と配列番号１に示す。ヒトＮａｇｌｕのコード領域のヌクレオチド配列を配列番号３に示した。ヒトＮａｇｌｕのｍＲＮＡ配列は、ジェンバンクの受入番号ＮＭ＿０００２６３に記載されている。様々な態様においてＮａｇｌｕは、シグナル配列を含む（アミノ酸１〜７４３）またはシグナル配列を含まない（アミノ酸２４〜７４３）ヒトＮａｇｌｕである。
米国特許第６，２５５，０９６号では、精製したヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの分子量（つまり８２ｋＤａおよび７７ｋＤａ）と、ＣＨＯ細胞を使って産生した、哺乳類の組換えα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼの分子量（つまり８９ｋＤａおよび７９ｋＤａ）が推定Ｎａｇｌｕポリペプチドの分子量（つまり７０ｋＤａ）よりも大きいことが記載されており、このことから、精製したポリペプチドと組換えポリペプチドが翻訳後修飾を受けていることが示唆されている。Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：７７１−７７７，１９９６も参照のこと。
ムコ多糖症ＩＩＩ Ｂ型（サンフィリポＢ症候群）
例示的なライソゾーム蓄積症の１つに、Ｂ型サンフィリポ症候群としても知られているムコ多糖症ＩＩＩ Ｂ（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）がある。ＭＰＳ ＩＩＩＢ、Ｂ型サンフィリポ症候群、は、酵素であるα−Ｎ−アセチル−グルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）の欠損を特徴とする、希な、常染色体劣性の遺伝性障害である。この酵素が欠損していると、ＧＡＧヘパラン硫酸などのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）や、部分的に分解されたＧＡＧ分子が体外に排出されずに様々な組織のライソゾームに蓄積し、その結果、進行性で多岐にわたる、体細胞の機能不全を引き起こす可能性がある（Ｋａｋｋｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３４４（３）：１８２−８，２００１）。脳以外の組織よりも、ニューロンおよびグリア細胞でＧＡＧがより多く蓄積されることが分かっている。
ＭＰＳ ＩＩＩにはＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ型ＭＰＳ ＩＩＩと命名されている４つの形態があり、同定されている。それぞれ、ＧＡＧヘパラン硫酸の分解に関わる４つの酵素のうちの１つか欠損している（表１）。いずれの型も、同じ臨床症状、例えば、顔貌の粗大化、肝脾腫、角膜薄濁および骨格変形を様々な程度で伴う。しかしながら、特に顕著なのが重症かつ進行性の認知機能の消失であり、これはニューロンでのヘパラン硫酸の蓄積だけでなく、ＧＡＧの蓄積に続いて引き起こされたガングリオシドＧＭ２、ＧＭ３およびＧＤ２の増加にも関連している（Ｗａｌｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ． ８４５：１８８−９９，１９９８）。
Ｂ型サンフィリポ症候群の臨床兆候の特徴は中枢神経系（ＣＮＳ）の縮退であり、その結果、発達上の主要な段階が失われたり、達成されなかったりする。この進行性の認知機能の低下の結果、認知症を発症し、若年死亡に至る。この疾患は通常幼児期に顕在化し、罹患した患者の寿命は、典型的には、十代後半〜二十代前半より長くなることはない。
ＭＰＳ ＩＩＩ疾患は全て同様の症状を示し、幼児期に顕在化する。罹患した幼児の外観は正常であるが、顔面に軽度の異形症が認められる場合もある。他のムコ多糖症に一般的な関節のこわばり、多毛および顔貌粗大は疾患後期まで現れない。症状の現れない初期段階の後、患者は一般に成長の遅れおよび／または行動異常、その後、進行性の知能低下を現し、その結果、重症認知症および進行性の運動障害を生じる。言語の獲得が遅く、不完全であることが多い。疾患が進行すると、かんしゃく、多動、破壊性、攻撃行動、異食および睡眠障害などの行動障害が増える。罹患している子どもの筋肉強度や運動機能は正常であるため、このような行動障害を制御することは非常に困難である。病気の最終段階では、子どもの運動性および反応性が下がり、車いすが必要になることが多く、嚥下困難および痙攣を発症する。罹患した患者子どもの寿命は、一般的には、十代後半〜二十代前半より長くなることはない。
ＭＰＳ ＩＩＩＢ（Ｂ型サンフィリポ症候群）の治療に好適なα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ酵素には、野生型ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（配列番号１または３）、または、哺乳類のライソゾームに取り込まれて直鎖オリゴ糖の末端Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基のα−１，４結合を加水分解する能力を保持しているその機能性断片または配列変異体が含まれる。
本明細書に記載の組換え標的治療用融合タンパク質を使用したＭＰＳ ＩＩＩＢ（Ｂ型サンフィリポ症候群）の治療効果は、当該分野で知られている技術を用いることで、ならびにライソゾームやニューロンのバイオマーカーを解析することで測定可能である。初期の実験はＮａｇｌｕノックアウト動物を用いて行われている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６： １４５０５−５１０， １９９９を参照のこと）。Ｎａｇｌｕノックアウト動物では、肝臓と腎臓に多量のヘパラン硫酸が、および脳におけるガングリオシドの増加が認められる。
アッセイには、外生酵素の活性と体内分布、ライソゾーム、特に脳細胞のライソゾームにおけるＧＡＧ貯蔵量の低下、および星状細胞や小膠細胞の活性化の解析が含まれる。様々なライソゾームのバイオマーカーまたはニューロンのバイオマーカーのレベルには、これらには限定されないが、ライソゾーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、グリピカン、ガングリオシド、コレステロール、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素のサブユニットｃ（ＳＣＭＡＳ）、ユビキチン、Ｐ−ＧＳＫ３ｂ、β−アミロイドおよびＰ−タウのレベルが含まれる。当該分野で知られている技術を用い、生存および行動の解析も行う。
実験から、ＭＰＳ ＩＩＩＢ動物のライソゾーム中にミトコンドリアＡＴＰ合成酵素のサブユニットｃ（ＳＣＭＡＳ）のタンパク質が蓄積していることが分かっている（Ｒｙａｚａｎｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ． ９０（４）： ３９３−４０１， ２００７）。ＬＡＭＰ−１とＧＭ１３０がＭＰＳ ＩＩＩＢ動物で増加していることも示されている（Ｖｉｔｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ． １７７（６）： ２９８４−９９，２０１０）。
様々な態様においてライソゾーム蓄積症の治療とは、様々な組織におけるライソゾームの貯蔵性（例えば、ＧＡＧの貯蔵性）を低下させることを指す。様々な態様において治療とは、脳の標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢の標的組織におけるライソゾームの貯蔵性を低下させることを指す。一定の態様では、ライソゾームの貯蔵性は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％またはそれ以上低下する。様々な態様においてライソゾームの貯蔵性は、対照と比較して、少なくとも１分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１またはそれよりも低下する。
様々な態様において治療とは、様々な組織における酵素活性を高めることを指す。様々な態様において治療とは、脳の標的組織、脊髄ニューロン、および／または末梢の標的組織における酵素活性を高めることを指す。様々な態様において酵素活性は、対照と比較して、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％１０００％またはそれ以上高まる。様々な態様において酵素活性は、対照と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上高まる。様々な態様において、高まった酵素活性とは、少なくともおよそ１０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／時／ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／時／ｍｇまたはそれ以上である。様々な態様では、ライソゾーム酵素はＮａｇｌｕである。
酵素補充療法
酵素補充療法（ＥＲＴ）とは、欠損している酵素を血中に注入することで酵素欠損を正そうとする治療戦略である。血液が患者の組織を灌流しているため、酵素は細胞に取り込まれてライソゾームに輸送され、そこで酵素は、酵素欠損が原因でライソゾーム中に蓄積された物質を除去するように作用する。ライソゾーム酵素補充療法が有効であるためには、治療用の酵素が、貯蔵障害が現れている適切な細胞のライソゾームに送達されなければならない。標準的なライソゾーム酵素補充療法剤は、標的細胞の表面にある特定の受容体と会合させるためにタンパク質に自然に結合させた炭水化物を利用して送達される。１つの受容体、カチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）は多くの細胞型の表面に提示されているため、ライソゾーム酵素を補充するために標的とするのに特に有用である。
「カチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）」、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＣＩ−ＭＰＲ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＩＧＦ−ＩＩ受容体」もしくは「ＩＧＦ２受容体」という用語またはその略称は、本明細書においては同じ意味で用いられ、Ｍ６ＰとＩＧＦ−ＩＩの両方に結合する細胞受容体を指す。
酵素補充療法に対して対象を寛容化するための併用療法
組換えタンパク質などの薬剤や他の治療薬を投与している間に、これらの薬剤に対する免疫応答が対象の体内で高まり、結合して治療活性を干渉する抗体の生産が引き起こされる、ならびに急性または慢性の免疫応答が引き起こされる可能性があることが分かっている。この問題は、タンパク質が複雑な抗原であり、多くの場合に、対象が抗原に対して免疫学的に無感作であることから、タンパク質治療薬にもっとも顕著である。従って、本発明の特定の側面では、治療用酵素の投与を受けている対象を酵素補充療法に対して寛容化することが有用な場合がある。本明細書中においては、酵素補充療法を、寛容化計画の併用療法として処方してもよい。
米国特許第７，４８５，３１４号（参照することにより本明細書に組み込まれる）では、免疫寛容の誘導を用いたライソゾーム蓄積症の治療が開示されている。簡単に説明すると、そのような寛容化計画の使用は、対象における酵素補充療法に対する免疫応答の高まりと、それによる酵素補充療法の潜在的な有効性の低下あるいは無効化を予防するのに有用な場合がある。
一方法において本発明は、組換え治療用融合タンパク質、例えばＮａｇｌｕを含んでおり、髄腔内投与によるライソゾーム蓄積症、例えばムコ多糖症ＩＩＩＢ（ＭＰＳ ＩＩＩＢまたはＢ型サンフィリポ症候群）の治療に使用されている治療用融合タンパク質に対する臨床上有意な抗原特異的な免疫応答を低減または予防することを検討する。この方法では、低容量の酵素、例えばＮａｇｌｕを１週間に１回髄腔内注入するのと並行して、投与計画の最初の３０〜６０日間に、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）などのＴ細胞免疫抑制剤とアザチオプリン（アザ）などの抗増殖剤を使用する。酵素を含んでいる融合タンパク質を少量１週間に１回髄腔内または静脈内に注入するのと並行して、免疫抑制剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびアザチオプリン（アザ）を６０日間投与すると、１週間に１回の酵素注入に対する、一般的には強いＩｇＧ反応が大きく低下するかまたは阻害される。このような寛容化計画を利用すれば、対象を、高用量の治療用融合タンパク質に対して最長６ヶ月間、Ｎａｇｌｕ、または、実際にライソゾーム蓄積症の補充療法に使用される他の全ての酵素に対する抗体の力価を上昇させることなく寛容化することが可能である。このような寛容化計画は米国特許第７，４８５，３１４号に記載されている。
グリコシル化非依存性ライソゾーム標的化
グリコシル化非依存性ライソゾーム標的化（ＧＩＬＴ）技術は、治療用酵素をライソゾームに標的化するために開発された。具体的には、ＧＩＬＴ技術は、ライソゾーム標的化用のＣＩ−ＭＰＲを会合させるのに、Ｍ６Ｐの変わりにペプチドタグを利用する。通常ＧＩＬＴタグは、マンノース−６−リン酸−非依存性の様式でＣＩ−ＭＰＲを結合させるタンパク質、ペプチド、または他の部分である。この技術は都合のよいことに、ライソゾーム酵素を取り込む正常な生体機構を、マンノース−６−リン酸非依存性の様式で模倣している。
好ましいＧＩＬＴタグは、ヒトインスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）由来のタグである。ヒトＩＧＦ−ＩＩはＩＧＦ−ＩＩ受容体とも呼ばれるＣＩ−ＭＰＲに対する高親和性リガンドである。ＧＩＬＴ−タグ化治療用酵素がＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体に結合ことで、タンパク質がエンドサイトーシスの経路を介してライソゾームを標的とするようになる。タンパク質を一旦単離してしまえばそれ以上の修飾が必要ないため、この方法は簡便さや費用効果などの点で、グリコシル化を伴う方法より多くの利点をもつ。
ＧＩＬＴ技術およびＧＩＬＴタグの詳細な説明は、米国特許出願第２００３００８２１７６号、同第２００４０００６００８号、同第２００４０００５３０９号、および同第２００５０２８１８０５号に見ることができ、これら全ての教示は全体として、参照することによって本明細書に組み込まれる。
フューリン抵抗性ＧＩＬＴタグ
ライソゾーム蓄積症を治療するためのＧＩＬＴ−タグ化ライソゾーム酵素の開発を行うなかで、ＩＧＦ−ＩＩ由来のＧＩＬＴタグは哺乳類細胞で産生している間にフューリンによるタンパク分解の対象となる場合があることが明らかになってきた（実施例の項を参照のこと）。通常フューリンプロテアーゼは、Ｘが任意のアミノ酸であるＡｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ（配列番号６）という共通配列を有する切断部位を認識・切断する。配列中でこの切断部位は、カルボキシ末端のアルギニン（Ａｒｇ）残基の後ろに位置している。いくつかの態様においてフューリン切断部位は、Ｘが任意のアミノ酸であるＬｙｓ／Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号７）の共通配列を有する。配列中でこの切断部位はカルボキシ末端のアルギニン（Ａｒｇ）残基の後ろに位置している。本明細書で使用する場合「フューリン」という用語は、フューリンまたはフューリン様プロテアーゼなどの、本明細書で定義するフューリンプロテアーゼ切断部位を認識・切断するいかなるプロテアーゼをも指す。フューリンは対合している塩基性アミノ酸切断酵素（ＰＡＣＥ）としても知られている。フューリンは、膵島細胞におけるプロインスリンの成熟に関与するプロテアーゼであるＰＣ３などを含む、スブチリシン様プロタンパク質転換酵素のファミリーに属す酵素である。フューリンをコードしている遺伝子はＦＵＲ（ＦＥＳ上流領域）として知られていた。
成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのペプチド配列を以下に示す。
ＡＹＲＰＳＥＴＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡＳＲＶＳＲ↑ＲＳＲ↑ＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ（配列番号５）
ここに見られるように、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩは３４〜４０番目の残基（太字と下線でしめした部分）の間に、潜在的な、重複している２つのフューリン切断部位を含有している。矢印は潜在的な２つのフューリン切断位置に挿入されている。
フューリンによる切断に対する抵抗性を有し、その上、マンノース−６−リン酸−非依存性の様式でＣＩ−ＭＰＲに結合する能力を有する改変型ＧＩＬＴタグが米国特許第２０１１０２２３１４７号に開示されている。具体的には、フューリン抵抗性ＧＩＬＴタグは、１つ以上のフューリン切断部位のアミノ酸配列を、フューリン切断部位を少なくとも１つ消失させるように変異させることで設計することができる。従って、いくつかの態様においてフューリン抵抗性ＧＩＬＴタグは、フューリンプロテアーゼ切断部位を少なくとも１つ消失させるまたは、野生型ＩＧＦ−ＩＩペプチド（例えば、野生型ヒト成熟ＩＧＦ−ＩＩ）と比較して、フューリンによる切断が阻止される、阻害される、低下するまたは遅くなるようにフューリンプロテアーゼ切断部位に隣接している配列を変化させる変異を含有するフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質である。好適な変異は通常、フューリン抵抗性ＧＩＬＴタグがヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体に結合する能力には影響を及ぼさない。具体的には、本発明に好適なフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、ヒトカチオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体にマンノース−６−リン酸−非依存性の様式で、ｐＨが７．４の場合に１０−７Ｍ以下（例えば、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、またはそれ以下）の解離定数で結合する。いくつかの態様においてフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの３０〜４０番目（例えば、３０〜４０、３１〜４０、３２〜４０、３３〜４０、３４〜４０、３０〜３９、３１〜３９、３２〜３９、３４〜３７、３３−３９、３４〜３９、３５〜３９、３６〜３９、３７〜４０番目）のアミノ酸に相当する領域内に変異を含有する。いくつかの態様では、好適な変異は少なくとも１つのフューリンプロテアーゼ切断部位を消失させる。変異は、アミノ酸の置換、欠失、挿入であってよい。例えば、配列番号５の３０〜４０番目（例えば、３０〜４０、３１〜４０、３２〜４０、３３〜４０、３４〜４０、３０〜３９、３１〜３９、３２〜３９、３４〜３７、３３〜３９、３４〜３９、３５〜３９、３６〜３９、３７〜４０番目）の残基に相当する領域に含まれているどれか１つのアミノ酸を別の任意のアミノ酸で置換してもあるいは欠失させてもよい。例えば、３４番目の位置を置換すると、第一の切断部位をフューリンが認識する能力に影響を及ぼすだろう。それぞれの認識部位に１つ以上のアミノ酸をさらに挿入することで、一方または両方のフューリン切断部位が消失し得る。縮重している位置の残基を１つ以上欠失させることで、両方のフューリン切断部位が消失し得る。
様々な態様においてフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのＡｒｇ３７またはＡｒｇ４０に相当する位置にアミノ酸置換を含有する。いくつかの態様においてフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、Ａｒｇ３７またはＡｒｇ４０の位置にＬｙｓまたはＡｌａ置換を含有する。３７および４０番目の両方にＬｙｓおよび／またはＡｌａ突然変異を組み合わせて入れること、またはＬｙｓもしくはＡｌａ以外のアミノ酸による置換など、他の置換を行うことも可能である。
様々な態様において本明細書の使用に好適なＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、さらなる変異を含有していてもよい。例えば、配列番号１の３０％までの残基または３０％以上の残基を変化させてもよい（例えば、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％までまたはそれ以上の残基を変化させることができる）。従って、本明細書における使用に好適なＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩと少なくとも７０％、例えば少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一のアミノ酸配列を含む場合がある。
様々な態様において本明細書における使用に好適なＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、ＣＩ−ＭＰＲを特異的に標的とする。特に有用なのは、ＣＩ−ＭＰＲに高い親和性（例えば、ｐＨが７．４のときに１０〜７Ｍ以下の解離定数）で結合するが、ＩＧＦ−ＩＩが結合することが知られている他の受容体に対する結合の親和性が天然のＩＧＦ−ＩＩより弱いＩＧＦ−ＩＩポリペプチドタンパク質を生じる突然変異である。例えば、本発明に好適なフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、ＩＧＦ−Ｉ受容体に対する結合親和性が、天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−Ｉ受容体に対する親和性よりも弱くなるように改変することができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩの残基のうち、２７番目のＴｙｒをＬｅｕに、４３番目のＬｅｕをＶａｌに、または２６番目のＳｅｒをＰｈｅに置換すると、ＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−Ｉ受容体に対する親和性がそれぞれ、９４分の１、５６分の１、および４分の１に下がる（Ｔｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２４８（２）： ３８５−４０１）。ヒトＩＧＦ−ＩＩの１〜７番目の残基を欠失させるとヒトＩＧＦ−Ｉ受容体に対する親和性が３０分の１に低下し、同時に、ラットＩＧＦ−ＩＩ受容体に対する親和性が１２倍に高まる（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（３０）： １８０１３−８）。ＩＧＦ−ＩＩのＮＭＲ構造は、７番目のＴｈｒが、Ｐｈｅ−４８とＳｅｒ−５０残基、およびＣｙｓ−９−Ｃｙｓ−４７ジスルフィド架橋のそばに位置していることを示している。Ｔｈｒ−７とこれら残基との相互作用によってＩＧＦ−Ｉ受容体との結合に必要な、可動性のＮ末端ヘキサペプチドを安定化することができるのだろうと考えられる（Ｔｅｒａｓａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＥＭＢＯ Ｊ． １３ （２３） ５５９０−７）。同時にこの相互作用は、ＩＧＦ−ＩＩ受容体との結合を調節することができる。また、ＩＧＦ−ＩＩのＣ末端（残基６２〜６７）を切断しても、ＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦ−Ｉ受容体に対する親和性が５分の１に低下するようである（Ｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １８１ （２）： ９０７−１４）。
ＩＧＦ−Ｉおよびカチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体の結合表面は、ＩＧＦ−ＩＩ上の別々の表面である。構造および突然変異のデータに基づいて、ヒトＩＧＦ−ＩＩよりも実質的に小さい、機能性のカチオン非依存性Ｍ６Ｐ結合ドメインを構築することができる。例えば、アミノ末端のアミノ酸（例えば、１〜７番目または２〜７番目）および／またはカルボキシ末端の６２〜６７番目の残基を欠失させるまたは置換することができる。加えて、２９〜４０番目のアミノ酸も、ポリペプチドの残りの部分の折り畳み構造またはカチオン非依存性Ｍ６Ｐ受容体への結合を変化させることなく、除去または置換することができるようである。従って、８〜２８番目および４１〜６１番目のアミノ酸を含む標的化部分を構築することができる。これら一連のアミノ酸は、おそらく、直接連結させるかまたはリンカーによって分離させることができるだろう。あるいは、８〜２８番目および４１〜６１番目のアミノ酸を別々のポリペプチド鎖として提供することもできる。ＩＧＦ−ＩＩと相同で、ＩＧＦ−ＩＩの構造と密接に関連した三次構造を有するインスリンの対応するドメインについては、それらが別々のポリペプチド鎖として存在していても、適切な三次構造に再折り畳みすることが可能なほどに十分な構造情報がある（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２７９−２８１）。従って、例えば、８〜２８番目のアミノ酸またはその保存的置換変異体をライソゾーム酵素に融合させてもよく；生じた融合タンパク質を４１〜６１番目のアミノ酸またはその保存的置換変異体と混合して、患者に投与してもよい。
また、ＩＧＦ−ＩＩを、血清ＩＧＦ−結合タンパク質への結合を最小限に抑えて（Ｂａｘｔｅｒ （２０００） Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ． ２７８ （６）： ９６７−７６）ＩＧＦ−ＩＩ／ＧＩＬＴ構築物が分離するのを回避するように改変することもできる。複数の研究では、ＩＧＦ結合タンパク質との結合に必須のＩＧＦ−ＩＩ中の残基を限局させた。これらの残基中に突然変異を有する構築物を、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体への高い結合親和性の保持およびＩＧＦ結合タンパク質に対する低い親和性に関してスクリーニングすることができる。例えば、ＩＧＦ−ＩＩのＰｈｅ−２６をＳｅｒに置換すると、ＩＧＦ−ＩＩのＩＧＦＢＰ−１および−６に対する親和性が低下し、かつ、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体への結合には何ら影響がないことが報告されている（Ｂａｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８ （１３）： ９２４６−５４）。他の置換、例えばＧｌｕ−９をＬｙｓに置き換えることも有効な場合がある。これとは別にまたは組み合わせて、ＩＧＦ−ＩＩにも高度に保存されているＩＧＦ−Ｉの領域中に類似した変異を加えることもＩＧＦとＢＰとの結合を大きく低下させる（Ｍａｇｅｅ ｅｔ ａｌ． （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３８（４８）： １５８６３−７０）。
別のアプローチでは、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体と高い親和性で結合することが可能なＩＧＦ−ＩＩの最小領域を同定する。Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体との結合に関与していたＩＧＦ−ＩＩの残基の多くは、ＩＧＦ−ＩＩの１つの表面に集まっている（Ｔｅｒａｓａｗａ ｅｔ ａｌ． （１９９４） ＥＭＢＯ Ｊ． １３ （２３）： ５５９０−７）。ＩＧＦ−ＩＩの三次構造は通常、３つの分子間ジスルフィド結合によって保たれているが、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体の結合表面にくるアミノ酸配列を含んでいるペプチドを、正確に折りたたまれかつ結合活性をもつように設計することができる。このような最小結合ペプチドが非常に好ましいライソゾーム標的化ドメインである。例えば、好ましいライソゾーム標的化ドメイン、ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸である。４８〜５５番目のアミノ酸の周辺領域に基づいて設計されたＭ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体に結合するペプチドも望ましいライソゾーム標的化ドメインである。あるいは、ペプチドの無作為なライブラリーを、酵母２ハイブリッドアッセイまたはファージディスプレー型のアッセイによって、Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体への結合能に関してスクリーニングすることができる。
インスリン受容体に対する結合親和性
フューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質を含む本明細書に記載の多くのＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、インスリン受容体との結合親和性が弱いもしくはインスリン受容体との結合親和性をもたない。従って、いくつかの態様において本発明に好適なペプチドタグは、天然に存在するヒトＩＧＦ−ＩＩのインスリン受容体に対する親和性と比較して、インスリン受容体との結合親和性が弱いもしくはインスリン受容体との結合親和性をもたない。いくつかの態様では、インスリン受容体との結合親和性が弱いもしくはインスリン受容体との結合親和性をもたない本発明に好適なペプチドタグとしては、野生型成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのインスリン受容体に対する結合親和性の１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、１８倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍を上回るかまたは１００倍未満のインスリン受容体に対する結合親和性を有するペプチドタグが挙げられる。インスリン受容体に対する結合親和性は、当該分野で知られている様々なインビトロおよびインビボアッセイによって測定することができる。結合アッセイの例を実施例の項に記載している。
突然変異生成
ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質は、ＩＧＦ−ＩＩのＤＮＡに適切なヌクレオチドの変更を導入するか、または所望のＩＧＦ−ＩＩポリペプチドを合成することによって調製することができる。ＩＧＦ−ＩＩ配列の変異型も、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号などに示されている保存的および非保存的突然変異生成の技術および指針のいずれかを使用して作成することができる。変異型は、ＩＧＦ−ＩＩをコードしているコドンの１つ以上の置換、欠失または挿入であってよく、これらの置換、欠失または挿入は、ＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列を天然に存在する成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの配列とは異なるものにする変異である。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸で置き換えた結果、例えばロイシンをセリンで置き換えた結果、つまり保存的アミノ酸置換である可能性がある。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を異なる構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸で置き換えた結果、つまり非保存的アミノ酸置換である可能性もある。挿入または欠失は、必要に応じて、１〜５個の範囲のアミノ酸であってよい。許容される変異は、配列中にアミノ酸の挿入、欠失または置換を体系的に作成し、得られた変異体の活性を当該分野で知られているインビボまたはインビトロアッセイ（例えばＣＩ−ＭＰＲへの結合アッセイもしくはフューリン切断アッセイ）で試験することによって決定することができる。
スキャニング型のアミノ酸解析を利用して、連続した配列に沿って、１つ以上のアミノ酸を同定することもできる。スキャニングするのに好ましいアミノ酸は、相対的に小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸としてはアラニン、グリシン、セリン、およびシステインが挙げられる。アラニンはこの群の中でもスキャニングに特に好ましいアミノ酸である。これは、アラニンがβ炭素を超えた場所に側鎖をもたず、かつ、変異体の主鎖の高次構造を変化させない傾向にあるためである。また、アラニンが最も一般的なアミノ酸であることからも特に好ましい。さらに、アラニンは覆われた部位にも露出した部位にも頻繁に見られる［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， （Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．）； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５０：１ （１９７６）］。アラニン置換によって十分な量の変異体が得られない場合には、アミノ酸異性体を使用することができる。
変異型は、オリゴヌクレオチド介在性（部位特異的）突然変異生成、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ突然変異生成などの当該分野で知られている方法によって作出することができる。クローニングしたＤＮＡに対し、部位特異的突然変異生成［Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３：４３３１ （１９８６）； Ｚｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １０：６４８７ （１９８７）］、カセット突然変異生成［Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ３４：３１５ （１９８５）］、制限選択的突然変異生成［Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ， ３１７：４１５ （１９８６］または他の既知の技術を適用してＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質を作成することができる。
スペーサー
ＧＩＬＴタグは、ライソゾーム酵素のＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。ＧＩＬＴタグは、ライソゾーム酵素に直接融合させることも、またはリンカーまたはスペーサーを使ってライソゾーム酵素から分離させることもできる。アミノ酸リンカーまたはスペーサーは通常、堅固である、柔軟性をもつ、あるいは２つのタンパク質部分の間にアルファ−ヘリックスなどの構造を挿入するように設計される。リンカーまたはスペーサーは相対的に短くてもよく、例えば、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＧＡＰ）（配列番号９）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ（ＧＧＧＧＡ）（配列番号６０）もしくはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ＧＧＧＧＳ）（配列番号１２）の配列であってよく、またはより長くても、例えば、長さが１０〜２５のアミノ酸、長さが２５〜５０のアミノ酸または長さが３５〜５５のアミノ酸であってもよい。融合させるための結合部分は、折り畳みが正確に進むように、融合パートナー双方の活性、およびペプチドタグがライソゾーム酵素、例えば、α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼから成熟前に分離するのを防ぐことを考慮にいれて選択される。
様々な態様においてスペーサーペプチドはＧＧＧＰＳ（配列番号１４）またはＧＧＧＳＰ（配列番号１５）アミノ酸配列を１つ以上含み、場合により、さらに、（ｉ）ＧＡＰ（配列番号９）、（ｉｉ）ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、（ｉｉｉ）ＧＧＧＳ（配列番号１６）、（ｉｖ）ＡＡＡＡＳ（配列番号１７）、（ｖ）ＡＡＡＳ（配列番号１８）、（ｖｉ）ＰＡＰＡ（配列番号１９）、（ｖｉｉ）ＴＰＡＰＡ（配列番号２０）、（ｖｉｉｉ）ＡＡＡＫＥ（配列番号２１）または（ｉｘ）ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーは、ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＰＳ（配列番号１０）、またはＧＧＳ（配列番号１１）アミノ酸配列を含む。
様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）またはＧＧＧＳ（配列番号１６）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＰＳ（配列番号１４）またはＧＧＧＳＰ（配列番号１５）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＡＡＡＡＳ（配列番号１７）またはＡＡＡＳ（配列番号１８）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＰＡＰＡ（配列番号１９）またはＴＰＡＰＡ（配列番号２０）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＡＡＡＫＥ（配列番号２１）アミノ酸配列を１つ以上含む。様々な態様においてスペーサーペプチドは、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）アミノ酸配列を１つ以上含む。
様々な態様においてスペーサーペプチドは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２、５６、５８、９１〜９４）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３６、９５〜１００）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号１０１〜１０７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３７、１０８〜１１３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１１４〜１６２）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１６３〜１６９）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号１７０〜２１８）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２１９〜２６７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２６８〜３１６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５４４〜５５１）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ（配列番号６０、７９、８１、３１７〜３２０）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２１〜３２６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２７〜３３３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３３４〜３４０）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３４１〜３８９）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３９０〜３９６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号３９７〜４４５）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４４６〜４９４）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４９５〜５４３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５５２〜５５９）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここでｎは１〜７である。様々な態様においてｎは１〜４である。
様々な態様においてスペーサーは、ＥＦＧＧＧＧＳＴＲ（配列番号２２）、ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＰＳＧＳＰＧ（配列番号２３）、ＧＰＳＧＳＰＧＴ（配列番号２４）、ＧＰＳＧＳＰＧＨ（配列番号２５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＴ（配列番号２６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＨ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号２８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３４）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４３）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５９）、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＴ（配列番号６１）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号７９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号８１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳ］（配列番号８３）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳ］（配列番号８５）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８６）、ＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８７）、ＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号８８）、ＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８９）、およびＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号９０）からなる群より選択される。
様々な態様においてスペーサーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択される。
様々な態様においてスペーサーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択される。
本発明の方法および組成物で使用することができる他のＧＩＬＴ−タグ化α−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼタンパク質の構築物については米国特許公開第２００５０２４４４００号および同第２００５０２８１８０５号に記載されており、この両方の開示は参照することにより本明細書に組み込まれる。
細胞
細胞培養およびポリペプチドの発現に感受性のある哺乳類の細胞または細胞型はいずれも、例えば、ヒト胎生腎細胞（ＨＥＫ）２９３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル腎（ＣＯＳ）細胞、ＨＴ１０８０細胞、Ｃ１０細胞、ヒーラ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＶ−１細胞、ＨａＫ細胞、ＮＳ／０細胞、およびＬ−９２９細胞は、本発明に従って利用することができる。本発明に従って使用することができる哺乳類細胞の非限定的な例としては、これらには限定されないが、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫系統（ＮＳ０／１、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞腫（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ、ライデン、オランダ））；ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎生腎臓系（懸濁培養にサブクローニングした２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９ （１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３：２４３−２５１ （１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１ ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ヒーラ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ３８３：４４−６８ （１９８２）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌系（Ｈｅｐ Ｇ２）が挙げられる。いくつかの態様において本発明の融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞株から生産する。
本発明の融合タンパク質は、様々な非哺乳類の宿主細胞中で、例えば、昆虫細胞（Ｓｆ−９、Ｓｆ−２１、Ｈｉ５など）、植物細胞（マメ、穀類、またはタバコなど）、酵母（出芽酵母、ピキア酵母など）、原核生物（大腸菌、枯草菌や他のバチルス属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属など）、または真菌細胞中でも発現させることができる。
いくつかの態様では、フューリン抵抗性ＧＩＬＴタグを含むもしくは含まない融合タンパク質をフューリン欠損細胞内で生産することができる。本明細書で使用する場合「フューリン欠損細胞」という用語は、フューリンプロテアーゼ活性が阻害されている、低下しているまたは除去されているいかなる細胞をも指す。フューリン欠損細胞には、フューリンを産生しないか、または少量のもしくは抑えられた量のフューリンプロテアーゼしか生産しない細胞であれば、哺乳類細胞および非哺乳類細胞の両方が含まれる。当業者に知られており、利用可能なフューリン欠損細胞の例としてはこれらには限定されないが、ＦＤ１１細胞（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６５（８）：３３７０ ３３７５）、およびそれらの変異型細胞（Ｍｏｅｂｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍｏｅｈｒｉｎｇ （１９８３） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１（３）：９９８ １００９で記載されている）が挙げられる。あるいは、上述した哺乳類細胞および非哺乳類細胞に突然変異生成処理を施し、処理しても生存した細胞を回収し、および緑膿菌外毒素Ａに抵抗性をもつ細胞を選択することでフューリン欠損細胞を得ることもできる。突然変異生成処理としては、例えば、放射線、エチジウムブロマイド、臭素化ウリジン（ＢｒｄＵ）などへの暴露があり、好ましくは化学突然変異生成であり、より好ましくはメタンスルホン酸エチル突然変異生成である（Ｍｏｅｈｒｉｎｇ ａｎｄ Ｍｏｅｈｒｉｎ （１９８３） Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１（３）：９９８ １００９を参照のこと）。
様々な態様では、本明細書に記載のスペーサーを含んでいる特定の標的治療用タンパク質を組換え的に発現させた場合には、異なるスペーサーペプチドを含んでいる標的治療用タンパク質よりも高レベルで活性タンパク質を発現するだろうと想定される。また様々な態様では、本明細書に記載の標的治療用タンパク質は本明細書において、他の標的治療用タンパク質よりも高い活性を有するだろうと想定される。異なるスペーサーペプチドを含んでいる他の標的治療用タンパク質よりも高レベルの活性タンパク質の発現を示すおよび／または高い活性を有している標的治療用タンパク質を以降の実験に用いることを想定している。
治療用タンパク質の投与
本発明によれば、本発明の治療用タンパク質は通常、本明細書に記載したように、単独で、または治療用タンパク質を含んでいる組成物もしくは医薬品として個人に投与される（例えば、疾患の治療用薬物の生産中に）。組成物は、医薬組成物を調製するための生理学的に許容可能な担体または賦形剤と共に製剤化することができる。担体および組成物は無菌的であってもよい。製剤は投与経路に適したものである。
好適な薬学上許容可能な担体としては、これらには限定されないが、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（乳糖、アミロースもしくはデンプンなど）、糖（マンニトール、ショ糖、その他など）、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、流動パラフィン、芳香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、およびそれらの組み合わせが挙げられる。所望ならば、医薬製剤を、活性成分と有害な反応を起こさず、それらの活性を干渉もしない助剤（例えば、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に作用する塩、緩衝剤、着色料、香味料および／または芳香性の物質など）と混合することもできる。好ましい態様では、静脈内投与に好適な水溶性の担体を使用する。
所望ならば、組成物または薬物に少量の湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝剤を加えることができる。組成物は、液体溶液、懸濁駅、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出性製剤、または粉末であってよい。組成物は、従来型の結合剤やトリグリセリドなどの担体と共に座剤として製剤化することもできる。経口製剤には、標準的な担体、例えば医薬品等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを加えることができる。
組成物または薬物は、慣習的な手法に従って、ヒトへの投与に適した医薬組成物として製剤化することができる。例えば好ましい態様では、静脈内投与用の組成物は通常、無菌的な等張水性緩衝液を溶剤とした溶液である。必要であれば、組成物に可溶化剤や、注入部位に生じる痛みを緩和するための局部麻酔薬を含めることもできる。一般的に成分は、別々にまたは単位容量形態として混合された形で、例えば、凍結乾燥した粉末もしくは水分を含まない濃縮剤として、密閉した容器、例えばアンプルもしくは活性薬剤の量が示されている小袋に入った状態で供給される。組成物が点滴によって投与される場合には、滅菌した医薬品等級の水、生理食塩水またはデキストロース／水の入った注入用の瓶の中に、成分を分配することができる。組成物が注入によって投与される場合には、投与の前に成分を混合するように、注入用の滅菌水または生理食塩水の入ったアンプルを提供することもできる。
治療用タンパク質は、中性または塩の形態で製剤化することができる。薬学上許容可能な塩としては、遊離アミノ基を含む形で形成された塩、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来する塩、および遊離カルボキシル基を含む形で形成された塩、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来する塩が挙げられる。
治療用タンパク質（または治療用タンパク質を含有している組成物もしくは薬物）は、任意の適切な経路によって投与される。様々な態様において治療用タンパク質は、静脈内に投与される。他の態様では、治療用タンパク質は標的組織、例えば心臓もしく筋肉または神経系に直接投与される（例えば筋内、脳内、脳室内、髄腔内投与）。様々な態様において治療用タンパク質は、髄腔内に投与される。あるいは、治療用タンパク質（または治療用タンパク質を含有している組成物もしくは薬物）を、非経口的に、経皮的に、または経粘膜的に（例えば、経口的にまたは経鼻的に）投与することもできる。所望ならば、２つ以上の経路を同時に利用してもよい。例えば、治療用タンパク質を静脈内におよび髄腔内に投与する。静脈内および髄腔内の同時投与は、同時に行う必要はなく、順次行ってもよい。
治療用タンパク質（または治療用タンパク質を含有している組成物もしくは薬物）は単独で投与してもよく、または他の薬剤、例えば抗ヒスタミン剤（例えば、ジフェンヒドラミン）または抗ＧＩＬＴ−タグ化ライソゾーム酵素抗体を相殺する免疫抑制剤もしくは他の免疫治療薬と共に投与してもよい。「と共に」という用語は、その薬剤が、治療用タンパク質（または治療用タンパク質を含有している組成物もしくは薬物）の前に、それらとほぼ同時に、またはそれらの後に投与されることを示している。例えば薬剤を、治療用タンパク質を含有している組成物と混合し、それによって治療用タンパク質と同時に投与してもよく；あるいは、薬剤を混合せずに同時期に投与することもできる（例えば、治療用タンパク質を投与したのと同じ静脈ラインを使って薬剤を「便乗した（ｐｉｇｇｙｂａｃｋｉｎｇ）」形で送達する。逆もまた同じ）。別の例では、拓剤を、治療用タンパク質の投与から短時間のうちに（例えば２４時間以内に）、けれども別々（例えば混合しないで）に投与することができる。
治療用タンパク質（または治療用タンパク質を含有している組成物もしくは薬物）は治療上有効量で（つまり、定期的に投与すれば、例えば前述したように、疾患に関連のある症状を回復させる、疾患の発症を阻止もしくは遅らせる、および／または疾患症状の重篤度もしくは頻度を低減することによって、疾患を治療するのに十分な用量で）投与される。疾患の治療に効果的な用量は、疾患の作用の特性および程度に依存し、または、標準的な臨床技術によって決定することができる。また場合によっては、当該分野で知られている方法を用いたインビトロまたはインビボアッセイを利用することも、最適な用量範囲の同定に役立つ場合がある。使用する正確な用量もまた、投与経路および疾患の重篤度に依存し、また、主治医の判断や各患者の環境によって決定される。有効な用量は、インビトロでのまたは動物モデルを使った試験システムによって得られた用量反応曲線から補外してもよい。治療上有効な投与量は、例えば、体重１キログラム当たり約０．１〜１ｍｇ、約１〜５ｍｇ、約２．５〜２０ｍｇ、約５〜２０ｍｇ、約２０〜５０ｍｇ、または約２０〜１００ｍｇまたは約５０〜２００ｍｇ、または約２．５〜２０ｍｇになる可能性がある。特定の個人に対する有効な用量は、その個人の必要に応じて、時間と共に変化する可能性がある（例えば、増加するまたは減少する場合がある）。例えば、身体的な症状もしくはストレスの時期には、または病徴が悪化した場合には、投与量を増やすことができる。
治療上有効量の治療用タンパク質（または治療用タンパク質を含有している組成物もしくは薬物）を、疾患の作用の特性および程度によって定期的な投与間隔で、かつ、継続的に投与する。本明細書で使用する場合「間隔をおいて」投与するとは、治療上有効量を周期的に投与することを表す（単回投与と区別する）。間隔は、標準的な臨床技術によって決定することができる。いくつかの態様では、治療用タンパク質を２ヶ月に１回、１ヶ月に１回、１ヶ月に２回、３週間に１回、２週間に１回、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、または１日１回投与する。一人の個人に関する投与間隔は固定されている必要はなく、個人への必要性に応じて、時間と共に変更してもよい。例えば、身体的な症状もしくはストレスの時期には、または病徴が悪化した場合には、投与間隔を短くすることができる。
本明細書で使用する場合「２ヶ月に１回」という用語は２月に１回（つまり２ヶ月毎に１回）投与することを意味し；「１ヶ月に１回」という用語は１ヶ月に１回投与することを意味し；「３週間に１回」という用語は３週間に１回（つまり３週間毎に１回）投与することを意味し；「２週間に１回」という用語は２週間に１回（つまり２週間毎に１回）投与することを意味し；「１週間に１回」という用語は１週間に１回投与することを意味し；および「１日１回」という用語は１日に１回投与することを意味する。
本開示はさらに、表示のある容器（例えば、バイアル、瓶、静脈内投与用の袋、シリンジなど）に、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（Ｂ型サンフィリポ症候群）を治療するための、例えば本明細書に記載の方法による、組成物の投与方法に関する説明書と共に入った、本明細書に記載の治療用タンパク質を含む医薬組成物に関する。
薬学上許容可能な製剤の髄腔内投与
様々な態様において酵素融合タンパク質は、対象の中枢神経系、例えば脳脊髄液に導入することによって、投与される。本発明の特定の側面では、酵素は髄腔内に、例えば、腰部もしくは大槽に、または脳室内（または側脳室内）的に脳室へと導入される。ライソゾーム酵素を髄腔内投与する方法は米国特許第７，４４２，３７２号に記載されており、その全体は参照することにより本明細書に組み込まれる。
当業者であれば、治療用組成物を髄腔内に投与するために使用することができる装置が分かるだろう。例えば、髄膜癌腫症用の薬剤を髄腔内投与するのに一般的に使用されているオンマヤ・リザーバーを使って治療を施してもよい（Ｏｍｍａｙａ ＡＫ， Ｌａｎｃｅｔ ２： ９８３−８４， １９６３）。より具体的には、この方法では、前角にあけた穴から脳室チューブを挿入し、頭皮の下に設置したオンマヤ・リザーバーに接続する。リザーバーは皮下に埋め込まれ、リザーバーに注入される補充用酵素を髄腔内に送達する。個人に治療用組成物を髄腔内投与するための他の装置は米国特許第６，２１７，５５２号に記載されており、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。あるいは、組成物を例えば単回注射または持続注入によって髄腔内投与することもできる。当然のことながら、投与治療は単回投与の形態であってもまたは複数回投与の形態であってもよい。
本明細書で使用する場合「髄腔内投与」という用語は、頭蓋穿孔または大槽もしくは腰部穿刺などを介した側脳室（つまり脳室内）注入などの技術によって（Ｌａｚｏｒｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ， １４３−１９２およびＯｍａｙａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， １： １６９−１７９に記載されており、これらの内容は参照することにより本明細書に組み込まれる）、医薬組成物を対象の脳脊髄液に直接送達することを含むことを意図している。「腰部領域」という用語は、第三腰椎と第四腰椎の間の領域（背下部）を含むことを意図しており、より広義には、脊椎のＬ２〜Ｓ１の領域を含む。「大槽」という用語は、頭蓋と脊椎上部との間の開口から、小脳の周辺および小脳下面の領域を利用することを含むことを意図している。「脳室」という用語は、脊髄の中心管につながっている脳内の空洞を含むことを意図している。医薬組成物を直接注入すること、または注入ポンプを利用することにより、医薬組成物を本発明に従って前述した部位のいずれかに投与することができる。注入用に、本発明の組成物を液体溶液の形態で、好ましくは生理学的に適合する緩衝液、例えばハンクス液、リンガー液またはリン酸緩衝液を使って製剤化することができる。加えて、酵素を固形物として製剤化し、使用直前に再溶解または懸濁することもできる。凍結乾燥した形態もまた含まれる。注入は、例えば、酵素のボーラス注入であってもまたは持続注入（例えば注入ポンプを使った）であってもよい。
本発明の様々な態様では、酵素は対象の脳内への側脳室注入によって投与される。注入は、例えば、対象の頭蓋にあけられた穿孔を介して行うことができる。別の態様では、酵素および／または他の医薬製剤は、対象の脳室に外科的に挿入されたシャンを介して投与される。例えば注入は、より大きな側脳室から行っても良いが、より小さな第三脳室および第四脳室から行うこともできる。
様々な態様において本発明で使用される医薬組成物は、対象の大槽または腰部への注入によって投与される。本発明の方法の別の態様では、薬学上許容可能な製剤によって、持続的な送達が提供される。例えば、酵素または本発明で使用される他の医薬組成物が、対象に薬学上許容可能な製剤を投与した後、少なくとも１、２、３、４週間、またはそれ以上の期間送達される「徐放」が提供される。
様々な態様において治療用融合タンパク質は、脳または脊髄の表面または浅部組織の１カ所以上に送達される。例えば、様々な態様において治療用融合タンパク質は、大脳または脊髄の表面または浅部組織の１カ所以上に送達される。いくつかの態様では、大脳または脊髄のうちの標的とする表面または浅部組織は、大脳表面から４ｍｍ以内の場所に位置している。いくつかの態様では、大脳のうちの標的とする表面または浅部組織は、軟膜組織、大脳皮質リボン状組織、海馬、ウィルヒョウ・ロビン腔、ＶＲ腔内の血管、海馬、脳下面の視床下部の一部、視神経および視索、嗅球および嗅神経突起、およびそれらの組み合わせから選択される。
いくつかの態様において治療用融合タンパク質は、大脳または脊髄の深部組織の１カ所以上に送達される。いくつかの態様では、大脳または脊髄の中の標的とする表面または浅部組織は大脳表面から４ｍｍを超えて（例えば、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、または１０ｍｍ）深い（つまり内側の）部分に位置している。いくつかの態様では、大脳の中の標的とする深部組織には、大脳皮質のリボンが含まれる。いくつかの態様では、大脳の中の標的とする深部組織には、間脳（例えば、視床下部、視床、腹側視床、視床腹部など）、後脳、レンズ核、基底核、尾状核、被殻、扁桃体、淡蒼球のうちの１カ所以上、およびそれらの組み合わせが含まれる。
様々な態様において脊髄の中の標的とする表面または淡い組織には、軟膜および／または白質の索が含まれる。様々な態様において脊髄の中の標的とする深部組織には、灰白質および／または上衣細胞が含まれる。いくつかの態様において治療用融合タンパク質は、脊髄のニューロンに送達される。
様々な態様において治療用融合タンパク質は、小脳の１カ所以上の組織に送達される。一定の態様では、小脳の中で標的とする１カ所以上の組織は、分子層の組織、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、脳脚、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、治療薬（例えば酵素）は、小脳の深部組織のうちの１カ所以上に送達され、そのような組織には、これらには限定されないが、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織（例えば、顆粒細胞層よりも深い部分にある組織）、および深部小脳核組織が含まれる。
様々な態様において治療用融合タンパク質は、脳幹の１カ所以上の組織に送達される。いくつかの態様では、脳幹の中で標的とされる１カ所以上の組織には、脳幹白質組織および／または脳幹核組織が含まれる。
様々な態様において治療用融合タンパク質は、灰白質、白質、質周囲、軟−くも膜、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質の深部組織、分子層、尾状核／被殻領域、中脳、脳橋もしくは髄質の深部領域、およびそれらの組み合わせを含むがこれらには限定されない、脳の様々な組織に送達される。
様々な態様において治療用融合タンパク質は、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞を含むがこれらには限定されない、脳の様々な細胞に送達される。いくつかの態様では、治療用タンパク質は深部白質の乏突起膠細胞に送達される。
本発明の方法において使用されるキット
本発明の方法で使用する薬剤をキットとして提供してもよく、このキットはさらに使用説明書を含んでいてもよい。そのようなキットは、ライソゾーム蓄積症の治療に使用するための酵素を含んでいる本明細書に記載の融合タンパク質およびライソゾーム標的化部分を、一般に、宿主への投与に好適な用量および形態で含んでいるだろう。様々な態様においてキットは、通常、酵素を髄腔内送達するための装置を含むだろう。
またキットは、治療用組成物を生成する目的で、抗原、特にポリペプチド抗原を高取り込み部分に抱合させるために提供される場合もある。例えば、上述したような、ポリペプチドを連結するのに好適なリンカーに抱合されたＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質などの部分を提供することができる。高取り込み部分は抱合していない形で、好適なリンカーと、使用説明書と共に提供することもできる。
別のキットには、治療用組成物に加えて、本発明の治療用組成物を髄腔内投与するための説明を含めてもよい。一定の態様において本発明のキットは、本発明の治療用組成物を予め充填しておいた、酵素補充療法の髄腔内投与用のカテーテルまたは他の装置を含んでいる場合がある。具体的には、例えば、ライソゾーム酵素とライソゾーム標的化部分、例えばＮａｇｌｕとＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質を薬学上許容可能な製剤中に含んでいる治療用融合タンパク質を０．００１〜０．０１ｍｇ、０．０１〜０．１ｍｇ、０．１〜１．０ｍｇ、１．０〜１０ｍｇ、１０〜１００ｍｇ、またはそれ以上の量、予め充填しておくカテーテルを検討する。例示的なカテーテルは、使用後に廃棄することができる使い捨てのカテーテルであってもよい。あるいは、充填済みカテーテルは再充填が可能で、それらのカテーテルに再充填するのに適切な量の酵素が入ったキットに含まれているものであってもよい。
以下の実施例によって、本発明をさらにかつより具体的に説明する。しかしながら実施例は例示する目的のために含まれるのであって、本発明を限定するものではない。
実施例１−スペーサー配列の生成
ＧＩＬＴタグとスペーサーを含んでいるライソゾーム酵素は、米国特許出願第２００３００８２１７６号、同第２００４０００６００８号、同第２００４０００５３０９号および同第２００５０２８１８０５号で開示されている。スペーサーペプチドを含んでいるα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）融合タンパク質は米国特許出願第２０１１２０２３２０２１号で開示されている。ライソゾーム酵素を含んでいる標的治療用融合タンパク質で使用するためのさらなるスペーサーペプチドおよびＧＩＬＴタグを以下のように開発した。
ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質とフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質を連結するためにスペーサーを開発することができる。スペーサーの例としては以下のアミノ酸配列が挙げられる：ＥＦＧＧＧＧＳＴＲ（配列番号２２）ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）、ＧＰＳＧＳＰＧ（配列番号２３）、ＧＰＳＧＳＰＧＴ（配列番号２４）、ＧＰＳＧＳＰＨ（配列番号２５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＴ（配列番号２６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＨ（配列番号２７）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ（配列番号６２）。
スペーサー、完全長Ｎａｇｌｕ（シグナル配列を含む）およびＩＧＦ−ＩＩペプチドを含んでいる構築物を生成した。ここで、スペーサー配列（ＥＦＧＧＧＧＳＴＲスペーサー（配列番号２２）、ＧＡＰスペーサー（配列番号９）、ＧＧＧＧＳスペーサー（配列番号１２）、ＧＰＳＧＳＰＧスペーサー（配列番号２３）、またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳスペーサー（配列番号３６））を完全長ＮａｇｌｕとＩＧＦ２ ８〜６７ Ｒ３７Ａ（配列番号５６０〜５６４）との間に挿入した。
Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒら（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２７：１１８６−１１９０， ２００９）によって記載されているＸＴＥＮ方法に基づき、さらなるリンカーを作成した。ＸＴＥＮ様リンカーを使用すると、他のリンカーを使用した場合と被殻して、生成された融合タンパク質の半減期が長くなる場合がある。スペーサーの例は、以下のアミノ酸配列を有する：ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、およびＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）。スペーサーはＮａｇｌｕとＩＧＦ−２変異型タンパク質との間に挿入することができる。場合により、構築物のＡｓｃＩ部位を介して挿入することができる。
タンパク質の発現は、特定のアミノ酸をコード化するのに使用したＤＮＡコドンと関連していた。例えば、あるアミノ酸に関するコドンを変更すると、タンパク質のアミノ酸配列を変えることなく、そのタンパク質の発現量を増やすことができる（Ｔｒｉｎｈ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０：７１７−７２２， ２００４）。ペプチドをコードしているコドンを変更することで、組換え融合タンパク質の生産レベルが高まった。この技術を利用して、治療用融合タンパク質で使用するためのさらなるスペーサー配列、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５８）およびＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５９）。Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌスペーサー配列ａｒｅＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号７９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号８１）およびＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８２）を開発した。これらのスペーサーのうちのいずれか１つをＮａｇｌｕとＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質の間に、場合により構築物のＡｓｃＩ部位を介して、挿入する。
硬性に着よする複数のプロリンを含む強固なリンカーの例としては、以下の配列を有するリンカーが挙げられる：ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、またはＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）。一方、らせん状リンカーの例としては、以下の配列を有するリンカーが挙げられる：ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、またはＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）。これらのスペーサーのうちのいずれか１つをＮａｇｌｕとＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質の間に、場合により構築物のＡｓｃＩ部位を介して、挿入する。
ＤＮＡ ２．０（メンロパーク、カリフォルニア）によって開発された技術を利用したコドン最適化を使い、さらなるスペーサーを生成することができる。想定されるスペーサーとしては、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号２８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３４）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４３）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７８）、ＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８７）、ＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号８８）、ＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８９）、およびＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号９０）が挙げられる。これらのスペーサーのうちのいずれか１つをＮａｇｌｕとＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質の間に、場合により構築物のＡｓｃＩ部位を介して、挿入する。
一定の態様においてＢＭ−４０細胞外マトリックスタンパク質シグナルペプチド配列（Ｎｉｓｃｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００：５２９−５３６， １９９１）が使用される場合、構築物中のＮａｇｌｕは、Ｎａｇｌｕのシグナルペプチド配列を含まない。スペーサーが、Ｎａｇｌｕ配列とＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質配列（例えば、ＩＧＦ２ ８〜６７ Ｒ３７Ａ）との間に挿入される。ＢＭ−４０シグナルペプチド配列の例にはＭＲＡＷＩＦＦＬＬＣＬＡＧＲＡＬＡ（配列番号８）がある。クローニングとＡｓｃＩ部位の付加を促進するために、ＧＡＰペプチドをスペーサーに付加することもできる。一定の態様において天然のＮａｇｌｕシグナルペプチド配列（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． ５：７７１−７７７， １９９６）が使用される場合には、Ｎａｇｌｕは完全長Ｎａｇｌｕであり、かつ、スペーサーが完全長ＮａｇｌｕとＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質配列（例えば、ＩＧＦ２ ８〜６７ Ｒ３７Ａ）との間に挿入される。クローニングとＡｓｃＩ部位の付加を促進するために、ＧＡＰペプチドをスペーサーに付加することができる。
例示的な構築物では、ＤＮＡ ２．０技術を利用してヒトＮａｇｌｕの「コドン最適化」を行った。ＮａｇｌｕはヒトＮａｇｌｕの１〜７４３番目のアミノ酸または２４〜７４３番目のアミノ酸を含んでいると想定している。例示的な構築物では、スペーサーは場合によって、ＧＡＰスペーサー（クローニングにＡｓｃＩ制限酵素部位を使用する）または以下の配列のうちのいずれかを含む：ＥＦＧＧＧＧＳＴＲ（配列番号２２）、ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＰＳＧＳＰＧ（配列番号２３）、ＧＰＳＧＳＰＧＴ（配列番号２４）、ＧＰＳＧＳＰＧＨ（配列番号２５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＴ（配列番号２６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＨ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号２８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３４）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４３）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５９）、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＴ（配列番号６１）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号７９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号８１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳ］（配列番号８３）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳ］（配列番号８５）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８６）、ＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８７）、ＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号８８）、ＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８９）、およびＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号９０）。必要に応じ上述したスペーサーを、ＤＮＡ ２．０技術を使って「コドン最適化」する。
ＤＮＡ ２．０技術を利用し、必要に応じて「コドン最適化」した本明細書に記載のＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質はいずれも、本構築物において有用である。例示的な構築物では、ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質はフューリン抵抗性ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質、ＩＧＦ２ Δ８−６７ Ｒ３７Ａである。
実施例２−構築物の発現および精製
上述のスペーサー、Ｎａｇｌｕ酵素およびＩＧＦ−ＩＩ標的化ペプチドを含んでいる構築物を作成し、組換え的に発現させる。一定の態様では、この構築物はシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドの例としては、例えば、完全長Ｎａｇｌｕの１〜２３番目のアミノ酸を含んでいるＮａｇｌｕシグナルペプチド（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：７７１−７７７， １９９６）またはＢＭ−４０細胞外マトリックスタンパク質由来のシグナルペプチド（Ｎｉｓｃｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００：５２９−５３６， １９９１）が挙げられるがこれらには限定されない。
Ｎａｇｌｕ配列、ＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質およびスペーサーペプチドをコードしているＤＮＡを適切な発現ベクターに、例えばｐＥＥおよびｐＸＣ ＧＳ発現ベクター（ＬｏｎｚａＢｉｏｌｏｇｉｃｓ、バークシャー、英国）およびｐＣ３Ｂ（ＢｉｏＭａｒｉｎ、社内）発現ベクターに挿入する。本明細書に記載の治療用融合タンパク質のクローニングを補助する目的で、ＡｓｃＩ制限酵素部位（ｇｇｃｇｃｇｃｃ（配列番号５７０））を１つ、ベクターに挿入してもよい。
例示的な構築物は、シグナルペプチドとスペーサーペプチド（図３）を含む完全長Ｎａｇｌｕ配列（図１および図２）ならびに８〜６７番目の残基を含むＩＧＦ−ＩＩペプチドを含む。ここでＩＧＦ−ＩＩペプチドには、このＩＧＦ−ＩＩペプチドにフューリン抵抗性を付与するＲ３７Ａの置換を、つまり３７番目のアルギニンがアラニンになるアミノ酸置換を含んでいる（図１および２）。
実施例１に示した、ＮａｇｌｕとＩＧＦ−ＩＩペプチドを繋いでいる様々なリンカーまたはスペーサー配列を最初に、一過的な発現系を使って評価する。ＧＩＬＴ−タグ化Ｎａｇｌｕプラスミド（ｐＸＣ１７．４、Ｌｏｎｚａ）を、懸濁培養しておいたＣＨＯＫ１ＳＶ ＧＳ ＫＯ細胞（Ｌｏｎｚａ）に導入する。エレクトロポレーションにより、１５μｇのプラスミドＤＮＡを１０６個の細胞に導入する。導入の２４時間後に、培地を全て交換する。導入した細胞を選別せずに、１．５×１０６個細胞／ｍｌずつ、振とう培養用のフラスコに播種する。３０℃で培養した細胞の増殖、生存率、力価および特定の生産性を１４日間測定する。
ＧＩＬＴ−タグ化Ｎａｇｌｕプラスミドを懸濁培養しておいたＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ）に導入する。細胞を、６ｍＭのグルタミンを添加したＣＤＣＨＯ培地（インビトロジェン）を入れたフラスコ中、３７℃、８％ＣＯ２の条件で振とう培養する。エレクトロポレーションにより、３０μｇの直線化したプラスミドＤＮＡを１×１０７個の細胞に導入する。導入の４８時間後に、細胞を、４０μＭのＭＳＸを添加したＣＤＣＨＯ培地を入れた１ウェルにつき、５０００個細胞ずつプレーティングする。プレートを３７℃、８％ＣＯ２の条件でおよそ４〜６週間インキュベートし、クローンの成長を同定する。その後、Ｎａｇｌｕに関する４ＭＵ活性アッセイ（実施例３を参照のこと）でコロニーをスクリーニングし、最も発現量の高いコロニーを、４０μＭのＭＳＸを添加したＣＤＣＨＯ培地の入った２４ウェルプレートに移し、最も発現量の高いクローンを６ウェルプレートに継代し続け、その後、振とう培養用フラスコに継代して、ＧＩＬＴ−タグ化Ｎａｇｌｕ融合タンパク質を生産するために、最も発現量の高いクローンを同定する。
標準的なタンパク質精製技術により、精製を行う。例えば、例示的な精製法では、上述したもののような、−８０℃で保存しておいた哺乳類の細胞培養上清などの出発材料を解凍する。この材料をＮａＣｌで最終濃度が１Ｍになるように調製し、その後、０．２μｍのフィルターを用いて濾過滅菌する。
濾過した材料を、予めブチルローディング緩衝液（２０ｍＭのトリス、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化しておいたブチル疎水性相互作用カラムに負荷する。結合した材料を、カラムの１０倍容量のブチル溶出緩衝液（２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５）で、直線勾配をかけて溶出する。溶出ピーク由来の試料をたくわえ、緩衝液を２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）に置換して、Ｑ陰イオン交換カラムに負荷する。次いで、結合したタンパク質をカラムの１０倍容量のＱ溶出緩衝液（２０ｍＭのトリス、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で直線勾配をかけて溶出する。その後、遠心濃縮機を使って精製した試料の緩衝液を交換し、濾過滅菌して保存する。
例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質（Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ、配列番号５６８）の構築、発現、生産、精製および製剤化。Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６８）をコードしているＤＮＡ構築物を標準的な組換えＤＮＡ法で生成した。Ｎａｇｌｕは完全長ヒトＮａｇｌｕの１〜７４３番目のアミノ酸に相当し、ＩＧＦ−ＩＩは成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸を含み、フューリン抵抗性を付与するＲ３７Ａアミノ酸置換を有するＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質に相当する。上述したようにＣＨＯＫ１ＳＶ細胞にこのＤＮＡ構築物を導入し、安定なＧＩＬＴ−タグ化Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質を発現しているクローンを単離した。
Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６８）を発現している細胞をバイオリアクター中で生育させ、以下のように培地からＮａｇｌｕ融合タンパク質を精製した。回収した細胞の塩濃度を１ＭのＮａＣｌに調整し、ブチルセファロース４ＦＦカラムに負荷した。ブチルセファロース４ＦＦカラムからＮａｇｌｕ融合タンパク質を塩で溶出し、回収・透析し、その後、ヘパリンセファロース６ＦＦカラムに負荷した。Ｎａｇｌｕ融合タンパク質をフロースルーの画分に回収し、ＱセファロースＨＰカラムに負荷した。Ｎａｇｌｕ融合タンパク質をＱセファロースＨＰカラムから塩で溶出・濃縮し、その後、分取セファクリルＳ３００サイズ排除クロマトグラフィーで仕上げた。
この精製手順により、高度に精製し、酵素活性を有するＮａｇｌｕ融合タンパク質、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６８）、を生産した。人工ＣＳＦ（１ｍＭのリン酸ナトリウム、１４８ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭの塩化カリウム、０．８ｍＭの塩化マグネシウム、１．４ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．２）を使い、精製したＮａｇｌｕ融合タンパク質を２０ｍｇ／ｍＬの濃度に製剤化した。
例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質の構築、発現、生産、精製および製剤化。Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＡ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６９）、Ｎａｇｌｕ−強固な構造−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６６）、Ｎａｇｌｕ−らせん−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６７）、およびＮａｇｌｕ−ＸＴＥＮ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６５）をコードしているＤＮＡ構築物を標準的な組換えＤＮＡ法で生成した。Ｎａｇｌｕは完全長ヒトＮａｇｌｕの１〜７４３番目のアミノ酸に相当し、ＩＧＦ−ＩＩは成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸を含み、フューリン抵抗性を付与するＲ３７Ａアミノ酸置換を有するＩＧＦ−ＩＩ変異型タンパク質に相当する。らせん、強固な構造およびＸＴＥＮリンカーの例は実施例１に記載している。上述したように、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞にこれらのＤＮＡ構築物を導入し、安定なＧＩＬＴ−タグ化Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質を発現しているクローンを単離した。
Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質を発現している細胞をバイオリアクター中で生育させた。典型的な生産バッチでは（１０〜１６日間）、様々なリンカーを有するＮａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩ構築物は全て、３０ｍｇ／Ｌを上回る力価と、８０％を超える生存率に達した。
上述したように、Ｎａｇｌｕ融合タンパク質を培地から精製した。この精製手順により、酵素活性を有するタグ化の無いＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質、例えばＮａｇｌｕ−強固な構造−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６６）、Ｎａｇｌｕ−らせん−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６７）、Ｎａｇｌｕ−ＸＴＥＮ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６５）およびＮａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＡ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６９）を、逆相ＨＰＬＣで測定した場合におよそ９９％の純度で精製することができた。精製した未タグ化ＮａｇｌｕおよびＮａｇｌｕ融合タンパク質を人工ＣＳＦ（１ｍＭのリン酸ナトリウム、１４８ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭの塩化カリウム、０．８ｍＭの塩化マグネシウム、１．４ｍＭの塩化カルシウム、ｐＨ７．２）を使い、２０ｍｇ／ｍＬの濃度に製剤化した。
異なるスペーサーペプチドを含んでいる融合タンパク質と比較した場合に、より高レベルで活性タンパク質の組換え的な発現を示すおよび／または向上した酵素活性を示す本明細書に記載の融合タンパク質を、以後の実験、例えば以下に示す活性アッセイ、結合アッセイ、取り込みアッセイおよびインビボでの活性アッセイに用いてもよいことが想定される。
実施例３−活性アッセイ
Ｎａｇｌｕ融合タンパク質の酵素活性を決定するために、インビトロにおけるＮａｇｌｕ活性アッセイを蛍光標識した合成基質を用いて行う。
アッセイには以下の材料を使用した：１０％のＤＭＳＯを含むアッセイ緩衝液（０．２Ｍの酢酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡは含む場合と含まない場合がある、および０．００５％のツイーン２０、ｐＨ４．３〜４．８）で最終濃度が２０ｍＭになるように調整し、−８０℃で保存した４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド（４ＭＵ−ＮａＧｌｕ基質）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号４７４５００）。４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ標準物質）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｍ１３８１）のストック溶液はＤＭＳＯを溶媒として１０ｍＭになるように調整し、小分けにして−２０℃で保存する。ｒｈＮａｇｌｕ−Ｈｉｓ６対照（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号７０９６−ＧＨ）は２５ｍＭのトリス、１２５ｍＭのＮａＣｌ、０．００１％のツイーン２０、ｐＨ７．５で１０μｇ／ｍｌに希釈し、小分けにして−８０℃で保存する。
透明な９６ウェルの希釈プレート中で（Ｇｒａｎｇｅｒ）、希釈緩衝液（１×ＰＢＳ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡは含む場合と含まない場合がある、０．００５％のツイーン２０、ｐＨ７．４）を用い、標準物質を２００μＭから１．５６３μＭに２倍段階希釈し、ブランクを１つ用意する。透明な希釈プレート中で、試料を段階希釈して（希釈緩衝液を使う）、検量線の範囲内に確実に入るようにする。
１０μｌの標準物質（２００μＭ〜１．５６３μＭ）、対照および見本試料を黒色の未加工ポリスチレン９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３９１５）に移す。７５μｌの基質（２ｍＭ）をそれぞれのウェルに加え、３７℃で３０分間インキュベートする。その後、２００μｌの停止緩衝液（０．５Ｍのグリシン／ＮａＯＨ、ｐＨ１０．７）を加えることで反応を停止させる。９６ウェルの蛍光プレートリーダーを使い、励起３５５、発光４６０、カットオフ４５５でプレートを測定する。

このアッセイによりＮａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６８）、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＡ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６９）、Ｎａｇｌｕ−強固な構造−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６６）、Ｎａｇｌｕ−らせん−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６７）、およびＮａｇｌｕ−ＸＴＥＮ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６５）などの例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質がインビトロで酵素活性を有すること、人工の４ＭＵ−Ｎａｇｌｕ基質に対するＮａｇｌｕ融合タンパク質の特異的な活性はおよそ１７５，０００〜およそ２２０，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇであることが示された。これらＮａｇｌｕ融合タンパク質の酵素活性は未タグ化Ｎａｇｌｕタンパク質の活性（およそ１９０，０００ｎｍｏｌ／時／ｍｇ）と同等であった。例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質に関する酵素活性データを表１に示す。
Figure 2016505539
 実施例４−結合アッセイ
Ｎａｇｌｕ融合タンパク質とＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩおよびインスリン受容体との結合を測定するために、基本的には米国特許第２０１２０２１３７６２号に記載されている方法に従って、結合アッセイを行う。簡単に説明すると、プレートに結合させたインスリンとビオチン化インスリンとの結合に関する競合を測定するアッセイで、融合タンパク質構築物のインスリン受容体への結合親和性を試験する。インスリン受容体結合アッセイは、インスリン受容体（インスリン−Ｒ）とビオチン化インスリンとの結合をインスリン、ＩＧＦ−ＩＩ、および融合タンパク質を使って競合することで実施する。
具体的には、白色のリアクチバインド（Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ）プレートを濃度１μｇ／ウェル／１００μｌ（３８．４ｎＭ）のインスリン−Ｒでコーティングする。コーティングしたプレートを室温で一晩インキュベートし、その後、洗浄用緩衝液（３００μｌ／ウェル）で３回洗浄する。次いでプレートをブロッキング緩衝液（３００μｌ／ウェル）で１時間ブロッキングする。洗浄の工程を繰り返し、溶液からの残留物を全て除去する。２０ｎＭのビオチン化インスリンと、段階希釈による種々の濃度のインスリン、ＩＧＦ−ＩＩ、または融合タンパク質を混合する。２０ｎＭのインスリン−ビオチンで希釈したインスリン、ＩＧＦ−ＩＩ、またはＮａｇｌｕ融合タンパク質１００μｌをコーティングしたプレートに加え、プレートを室温で２時間インキュベートする。その後、プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄する。１００μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ作業溶液（１０ｍｌのブロッキング緩衝液に５０μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰを溶解したもの）をプレートに加え、プレートを室温で３０分間インキュベートする。Ｅｌｉｓａ−Ｐｉｃｏ化学発光基質を含むＥｌｉｓａ−Ｐｉｃｏ作業溶液（１００μｌ）を加え、化学発光を４２５ｎｍで測定する。
ＩＧＦ２Ｒ競合結合アッセイ
Ｎａｇｌｕ融合タンパク質構築物がＩＧＦ−ＩＩ受容体に結合する能力を測定するために競合結合アッセイを行う。ＩＧＦ−ＩＩの結合に関与するＩＧＦＩＩＲの断片（ドメイン１０〜１３、タンパク質１２８８と命名する）で９６ウェルプレートをコーティングする。ビオチン化ＩＧＦ−ＩＩを過剰量の競合剤（対照のＩＧＦ−ＩＩ（ビオチン化されていない）またはＩＧＦ−ＩＩ−由来のＧＩＬＴエピトープタグを有する融合タンパク質試料のいずれか）存在下で受容体と共にインキュベートする。受容体に結合したビオチン化ＩＧＦ−ＩＩを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合型ストレプトアビジンおよび化学発光ＨＲＰ基質で検出する。融合タンパク質がビオチン化ＩＧＦ−ＩＩとＩＧＦＩＩＲとの結合を阻害する能力を阻害曲線から算出し、ＩＣ５０値（５０％結合阻害を達成するのに必要とされる濃度）として報告する。
このアッセイを行うために、白色のリアクチバインド（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号４３７１１１）を、コーティング緩衝液に溶解したＩＧＦＩＩＲ（０．５μｇ／ウェル、容量１００μｌ、１ウェルあたり６９．６ｎＭ）でコーティングする。プレートを密閉し、室温で一晩インキュベートする。その後プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液でブロッキングし、さらに３回洗浄用緩衝液で洗浄する（３００μｌ／ウェル）。
次に、８ｎＭのＩＧＦ−ＩＩ−ビオチンを種々の濃度の競合剤（ＩＧＦ−ＩＩ（非ビオチン化）、参照タンパク質、またはＮａｇｌｕ融合タンパク質試料と混合し、２倍段階希釈しながらＩＧＦＩＩＲをコーティングしたプレートに加える。
プレートを室温で２時間インキュベートし、その後、洗浄用緩衝液で３回洗浄する。ブロッキング緩衝液でストレプトアビジン−ＨＲＰを調整し（１：２００希釈）、プレートの１ウェル当たり１００μｌを加える。Ｐｉｃｏ−Ｅｌｉｓａ試薬を使用し、ストレプトアビジン−ＨＲＰを介してＩＧＦ−ＩＩビオチン結合活性を検出する。簡単に説明すると、調整したＰｉｃｏ−Ｅｌｉｓａ作業溶液をウェルに加え（１ウェルあたり１００μｌ）、室温で５分間、ゆっくりと振とうしながらインキュベートし、その後、４２５ｎｍで化学発光を測定する。
各試料のＩＣ５０を、種々の濃度の阻害剤に関するＩＧＦ−ＩＩ−ビオチン結合のパーセンテージから算出する。
この競合ＩＧＦＩＩＲ結合アッセイから、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６８）、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＡ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６９）、Ｎａｇｌｕ−強固な構造−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６６）、Ｎａｇｌｕ−らせん−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６７）、およびＮａｇｌｕ−ＸＴＥＮ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６５）などの例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質が０．２３〜０．３６ｎＭのＩＣ５０値を有することが分かった。このアッセイでは、未タグ化Ｎａｇｌｕタンパク質の結合は検出できなかった。例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質のＩＧＦ２Ｒ競合結合データを表１に示す。
実施例５−取り込みアッセイ
ライソゾーム蓄積症酵素が受容体介在性エンドサイトーシスによって細胞に進入する能力を測定するために、ＣＩ−ＭＰＲ受容体を使用し、ラットＬ６筋芽細胞またはヒトＭＰＳ ＩＩＩＢ線維芽細胞での酵素の取り込みを測定する取り込みアッセイを行う。ＣＩ−ＭＰＲ受容体との結合部位を決定するための阻害剤として、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）とＩＧＦ−ＩＩを使用する。データを収集して、酵素の取り込みに関する飽和曲線を生成し、その過程における動力学的指標、Ｋ取り込みを決定する。
取り込みアッセイの前に（２４時間）、Ｌ６細胞（Ｌ６ラット筋芽細胞、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１４５８）またはヒトＭＰＳ ＩＩＩＢ線維芽細胞を２４−ウェルプレート（ＶＷＲ＃６２４０６〜１８３）の１ウェルにつき、１×１０５個細胞の密度でプレーティングし、１ウェルあたり０．５ｍｌずつ播種する。アッセイ当日の朝クリーンベンチで、酵素を取り込み培地（１ＬのＤＭＥＭ、１．５ｇ重炭酸ナトリウム、０．５ｇウシ胎仔血清、２０ｍｌのＬ−グルタミン（２００ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ＃２５０３０〜０８１））、１ＭのＨＥＰＥＳ（２０ｍｌ、Ｇｉｂｃｏ＃１５６３０８０））（２０ｍＭ最終濃度）、ｐＨ７．２）と混合する。酵素量は２〜５００ｎＭの範囲になり得る。取り込み培地と酵素を合わせた最終量は１ウェルあたり０．５ｍｌである。Ｍ６Ｐ（最終濃度５ｍＭ）および／またはＩＧＦ−ＩＩ（最終濃度２．４μＭまたは１８μｇ／ｍｌ）を適切な試料に加える。取り込みを阻害するには、１８μｌのＩＧＦ−ＩＩストック（１ｍｇ／ｍｌ、１３３．９μＭ）を１ｍｌの取り込み培地に加える。
細胞の入ったウェルから成長培地を吸引し、取り込み緩衝液に溶解した０．４５０ｍｌの酵素を各ウェルに加える。時間を記録し、細胞をインキュベーターに戻して１８時間置く。プレートをインキュベーターから取り出し、取り込み緩衝液を細胞から吸引して除去する。０．５ｍｌのダルベッコＰＢＳを加え、その後吸引する工程をくり替えし、プレートを４回洗浄する。２００μｌのＣｅｌＬｙｔｉｃ Ｍ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）をプレートに加え、室温で２０〜３０分間撹拌する。溶解物を細胞から除去し、テープで覆った透明の９６ウェルプレート（ＶＷＲ）中、−８０℃でアッセイの準備ができるまで保存する。
酵素アッセイには、１５μｌの酵素反応混合物（例えば、Ｎａｇｌｕ＋４ＭＵアッセイ）を黒色の９６ウェルプレート（ＶＷＲ）に加えることで、それぞれの溶解物５μｌを２つ組にして加え（上記参照）、各溶解物について、酵素／単位／ｍｌ／時間を決定する。
溶解タンパク質アッセイでは、各溶解物を１０μｌずつ２つ組にし、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキットを製造業者の説明に従って使用してアッセイを行う。吸光度を測定するために、プレートリーダー（ＢＭＧ ＦｌｕｏＳｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー）を使って５６２ｎｍの吸光度を測定し、ｕｇ／ｍｌ濃度を決定する。
負荷した各酵素について、取り込みは溶解物の酵素活性／ｍｇの単位となる。取り込みを決定するためには、酵素単位／ｍｌをタンパク質ｕｇ／ｍｌで除算し、１０００をかける（ブランクのウェルの取り込みの値は引いておく）。阻害剤を入れたまたは入れていないアッセイの結果を比較し、受容体の取り込み特性を決定する。
飽和曲線を作成するためには、０．２〜１００ｎＭの範囲の１０種類の濃度の酵素を負荷し、上述したアッセイによって飽和曲線を生成する。
このアッセイから、例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６８）、のＭＰＳ ＩＩＩＢ線維芽細胞中でのＫ取り込みが７〜９ｎＭであることが分かった。
あるいは、取り込みアッセイの前に（２４時間）、Ｌ６細胞またはヒトＭＰＳ ＩＩＩＢ線維芽細胞を２４ウェルプレートに１×１０５個細胞の密度で、１ウェルあたり０．５ｍｌずつプレーティングする。酵素試料を１．６〜５０ｎＭになるように、取り込み培地（１ＬのＤＭＥＭ、１．５ｇ重炭酸ナトリウム、０．５ｇウシ胎仔血清、２０ｍｌの２００ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび２０ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）を使って調整する。取り込みの阻害をアッセイするには、Ｍ６Ｐ（最終的に５．０ｍＭまで）および／またはＩＧＦ−ＩＩ（最終的に１．０μＭまで）を適切な試料に加える。
成長培地を細胞から吸引し、取り込み緩衝液に溶解して調整した酵素０．５ｍｌと置き換える。４時間インキュベートした後、０．５ｍｌのダルベッコＰＢＳでプレートを２回洗浄する。プレートに１００μｌのＭ−ＰＥＲ溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、室温で１０分間撹拌する。アッセイの準備ができるまで、溶解物を−８０℃で保存する。
酵素アッセイ、各溶解物を１０μｌずつ２つ組にして黒色の９６ウェルプレートに入れる（上記参照）。
溶解タンパク質アッセイでは、各溶解物を１０μｌずつ２つ組にし、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキットを製造業者の説明に従って使用してアッセイを行う。プレートリーダー（ＢＭＧ ＦｌｕｏＳｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー）を使って５６２ｎｍの吸光度を測定し、ＢＳＡを基準としてμｇ／ｍｌ濃度を決定する。
負荷した各酵素について、取り込みは、３０分間の間に遊離した４−ＭＵのナノモル（ｎｍｏｌｅ）で表される。飽和曲線を作成するためには、１．６〜５０ｎＭの範囲の濃度の酵素を用い、上述したアッセイによって飽和曲線を生成する。
Ｎａｇｌｕ融合タンパク質の細胞内での安定性を、Ｎａｇｌｕの細胞内活性をおよそ８日間追跡することで決定した。ヒトＭＰＳ ＩＩＩＢ線維芽細胞を２４ウェルプレート（ＶＷＲ＃６２４０６〜１８３）に１ウェルあたり１×１０５個細胞の密度でプレーティングし、最終濃度２０ｎＭのＮａｇｌｕ融合タンパク質で４時間処理する。４時間インキュベートした後、細胞をＮａｇｌｕ融合タンパク質の入っていない成長培地に入れ替える。各時点で（４時間目、２８時間目、４日目、６日目および８日目）、細胞を１００μｌのＭ−ＰＥＲ溶解緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）にいれ、室温で１０分溶解し、４−ＭＵで標識した基質を使って酵素活性をアッセイした。８日間にわたって見られたＮａｇｌｕ活性の低下を一次速度側にあてはめ、このタンパク質の細胞内での半減期を概算することができる。
このアッセイにより、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６８）、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＡ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６９）、Ｎａｇｌｕ−強固な構造−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６６）、Ｎａｇｌｕ−らせん−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６７）、およびＮａｇｌｕ−ＸＴＥＮ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６５）などの例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質が、およそ２．３〜６．３ｎＭのＫ取り込み値でＭＰＳ ＩＩＩＢ線維芽細胞に取り込まれることが分かった。対照的に未タグ化Ｎａｇｌｕタンパク質は、これらの実験条件では細胞には取り込まれなかった。さらに、観察されたＮａｇｌｕ融合タンパク質の取り込みはＩＧＦ−ＩＩによって阻害されたが、Ｍ６Ｐでは阻害されなかった。取り込まれた後の例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質は安定で、予測される半減期がおよそ９．５日であることが、細胞溶解物について測定した酵素活性（４−ＭＵ基質）から分かった。例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質の取り込みおよび半減期のデータを表１に示す。
実施例６−インビボにおけるＮＡＧＬＵ融合タンパク質の活性
インビボでのＮａｇｌｕ融合タンパク質の活性を決定するためには、融合タンパク質をＮａｇｌｕノックアウト動物に投与する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：１４５０５−５１０， １９９９を参照のこと）。Ｎａｇｌｕノックアウト動物では、脳、肝臓および腎臓に多量のヘパラン硫酸が蓄積され、脳で高いβ−ヘキソサミニダーゼ活性およびライソゾーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ−２）の染色が見られ、さらに、脳中のガングリオシドが増加している。
組換えヒト（ｒｈ）Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦ２を２週間かけて４回ＩＣＶ（脳室内）注入（１００μｇ／注入）した後、外生の酵素の活性と体内分布を決定する。耐久性のあるカニューレをマウス（ｎ＝１２／群、開始時に８〜１２週齢）に埋め込み、調整して、カニューレが脳室内に入らないように覆う。エンドポイントで、Ｎａｇｌｕの体内分布、ＧＡＧ（例えばヘパラン硫酸）の減少、脳細胞のライソゾームにおける貯蔵、および星状膠細胞と小膠細胞の活性化を測定する。治療群および対照群におけるライソゾームまたはニューロンの様々なバイオマーカー（Ｏｈｍｉ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６：ｅ２７４６１， ２０１１）のレベルを測定する。測定するバイオマーカーには、これらには限定されないが、ライソゾーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）、ＬＡＭＰ−２、グリピカン５、ヘパラン硫酸のＮａｇｌｕ特異的非還元末端（ＮＲＥ）、ガングリオシド、コレステロール、ミトコンドリアＡＴＰ合成酵素のサブユニットｃ（ＳＣＭＡＳ）、ユビキチン、Ｐ−ＧＳＫ３β、βアミロイド、Ｐ−タウ（リン酸化タウ）、ＧＦＡＰ（星状膠細胞の活性化）およびＣＤ６８（小膠細胞の活性化）が含まれる。
ｒｈＮａｇｌｕ−ＩＧＦ２を２週間かえて４回ＩＣＶ注入したマウス（ｎ＝１２／群、開始時に５ヶ月齢、１００μｇ／注入）を使い、生存解析および挙動解析を決定するための実験をさらに行う。測定する評価項目には、生存期間、オープンフィールド活性、Ｎａｇｌｕの体内分布、ＧＡＧ（例えばヘパラン硫酸）の減少、ライソゾームにおける貯蔵、ライソゾームまたはニューロンのバイオマーカー（例えばＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、グリピカン５、ガングリオシド、コレステロール、ＳＣＭＡＳ、ユビキチン、Ｐ−ＧＳＫ３β、βアミロイド、Ｐ−タウ、ＧＦＡＰおよびＣＤ６８）のレベルが含まれる。
ｎａｇｌｕ遺伝子のエクソン６に変異の入ったＮａｇｌｕノックアウトマウス（Ｎａｇｌｕ−／−）が開発されている（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９６：１４５０５−１０， １９９９）。ヒトではエクソン６のこの部位に多くの突然変異があるため、この部位が変異生成位置として選ばれた。ホモ接合マウスではＮａｇｌｕの活性は検出されず、また、ヘテロ接合マウスではＮａｇｌｕ活性が低下している。Ｎａｇｌｕ−／−マウスでは生存期間が短くなり（６〜１２ヶ月）、活性レベルの低下など、他の機能性な表現型が現れる場合がある。Ｎａｇｌｕ−／−マウスに及ぼすＮａｇｌｕ融合タンパク質の効果を試験する。
Ｎａｇｌｕ−／−マウス（ｎ＝８）および８匹の媒体対照Ｎａｇｌｕ−／−マウス（ｎ＝８、同腹のヘテロ接合マウス）にＮａｇｌｕ−ＩＧＦ２を２週間かけて４回ＩＣＶ投与（１００μｇ／投与）する。試験の２日前に、マウスに麻酔をかけ、側脳室にカニューレを埋め込み、マウスを回復させる。１、５、１０および１４日目、ＩＣＶ投与する１５分前にマウスに麻酔をかける（ベネドリル、５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）。カニューレを介し、１５分間かけて５μｌをＩＣＶ投与し、その後マウスを回復させる。１５日目、マウスを安楽死させ、失血させて血清を凍結する。脳を摘出し、ＩＲ色素をカニューレに注入して、カニューレを画像化する。
Ｎａｇｌｕ融合タンパク質の効果を決定するために、以下のアッセイを行う：体重測定、カニューレ設置に関するＮＩＲ造影、免疫組織化学による脳におけるＮａｇｌｕ−ＩＧＦ２、ＧＦＡＰ、ＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２のレベルの評価、Ｎａｇｌｕ活性に関する生化学的アッセイ、β−ヘキソサミニダーゼのレベルおよび活性、蓄積されたムコ多糖症ＩＩＩｂ（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）特異的なグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の非還元末端を検出するためのＳｅｎｓｉＰｒｏアッセイ（国際公開第２０１０／０７８５１１Ａ２号）、生化学的アッセイで測定されるＧＭ３ガングリオシドレベル、ならびに内側嗅内皮質でのＳＣＭＡＳ、Ａ−ベータ、グリピカン５、ＣＤ６８、ＧＦＡＰおよびＮａｇｌｕに関する免疫染色（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、前掲）。
Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦ２による治療が有効であれば、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＧＦＡＰ、ＣＤ６８、ＳＣＭＡＳ、Ａ−ベータ、グリピカン５、β−ヘキソサミニダーゼ、ＧＭ３ガングリオシド、およびＭＰＳ ＩＩＩＢ特異的ＧＡＧのレベルが低下すると予想される。
ＭＰＳ ＩＩＩＢのマウスモデルにおけるインビボでの例示的なＮａｇｌｕ融合タンパク質の効力。Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６８）またはＮａｇｌｕ−強固構造−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６６）いずれかのＮａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質を、２週間かけて、Ｎａｇｌｕ−／−マウス（ｎ＝８）に４回ＩＣＶ投与（１００μｇ／投与）した。Ｎａｇｌｕ−／−マウス（ｎ＝８）および８匹のヘテロ接合または野生型同腹仔（ｎ＝８）には対照として媒体のみを投与した。試験開始の５日前、マウスに麻酔をかけ、脳の左側脳室にカニューレを埋め込み、マウスを回復させた。１、５、１０および１４日目、イソフルランを吸入させてマウスに麻酔をかけた。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩの処理に反応して起こる可能性のあるヒスタミン放出を低減するために、ＩＣＶ投与の１５分前に、各マウスにベナドリル（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）を投与した。ＩＣＶ投与は埋め込んでおいたカニューレを介して、５μｌの投与量を１５〜２０分間かえて注入し、その後、マウスを回復させた。最終投与の１、７、１４、および２８日後、マウスを安楽死させた。脳を摘出し、矢状に５つの切片に分割して様々なアッセイに供した。
Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩ融合タンパク質の効果を決定するための以下のアッセイを行った：Ｎａｇｌｕの免疫組織化学的評価、脳におけるＬＡＭＰ−２、ＧＦＡＰおよびＣＤ６８のレベル、Ｎａｇｌｕおよびβ−ヘキソサミニダーゼ活性の生化学的アッセイ、総ヘパラン硫酸とムコ多糖症ＩＩＩＢ（ＭＰＳ ＩＩＩＢ）特異的なヘパラン硫酸のＮＲＥを検出するためのＳｅｎｓｉＰｒｏアッセイ（Ｄｅａｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １８：４８３， ２００８； Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ． ８：１９７， ２０１２； Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２８３：３３６７４， ２００８）（国際公開第２０１０／０７８５１１Ａ２）、ならびに内側嗅内皮質でのＳＣＭＡＳ、β−アミロイド（Ａ−ベータ）、ｐ−Ｔａｕ、Ｐ−ＧＳＫ３β、グリピカン５、ＧＦＡＰおよびＣＤ６８の免疫蛍光染色（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、前掲）。
最終投与の２４時間後に評価した場合には、Ｎａｇｌｕ−（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＰＳ−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６８）またはＮａｇｌｕ−強固な構造−ＩＧＦ−ＩＩ（配列番号５６６）融合タンパク質のいずれを処理した場合にもＮａｇｌｕの酵素活性が顕著に高まり、同時に、βーヘキソサミニダーゼの活性ならびに総ヘパラン硫酸、ヘパラン硫酸のＮａｇｌｕ特異的ＮＲＥ、およびＬＡＭＰ−２のレベルが低下した。Ｎａｇｌｕ酵素は、皮質、海馬、歯状回および視床だけでなく、扁桃体、鼻周囲皮質および視床下部などの脳の末端も含めた脳組織で容易に検出可能であった。Ｎａｇｌｕ−ＩＧＦ−ＩＩを処理したＮａｇｌｕ−／−の脳でも、ＣＤ６８、ＳＣＭＡＳ、β−アミロイド（Ａ−ベータ）、ｐ−タウ、Ｐ−ＧＳＫ３β、およびグリピカン５のレベルが有意に低下したことが観察された。最終投与から２４時間後にもＧＦＡＰの染色は変化しなかった。免疫組織化学からは、脳の多くの領域、ニューロンの内側およびグリア細胞でＮａｇｌｕ酵素がＬＡＭＰ−２と共に局在していることが示された。
最終投与した時点から７、１４、および２８日目にかけて、ヘパラン硫酸、Ｎａｇｌｕ特異的ＮＲＥ、およびβ−ヘキソサミニダーゼ活性のレベルは継続して低下した。２８日目には、全ての分析物のレベルは正常なマウスの対照の値と同じであるかほとんど同じであった。
均等物
当業者であれば、通常の実験によって、本明細書に記載の発明の具体的な態様の多数の均等物を理解し、または確かめることができるだろう。本発明の範囲は、上述の明細書によって制限されるとはみなされず、添付の請求項に示す通りである。本明細書および請求項で使用する場合「１つ」、「１種」および「この」という冠詞は、そうでないことが明示されていない限り、複数の参照物を含むと理解される。ある群の１つ以上の要素の間に「または」を含む請求項または記載は、そうでないことが明示されているか、あるいはそうでないことが文脈から明らかでないかぎり、その群の要素のうちの１つ、１つ以上、または全てが含まれる、使用される、あるいは、所与の製品または過程に関連していると見なされる。本発明には、その群の要素のうちの１つだけが含まれる、使用される、あるいは、所与の製品または過程に関連している態様も含まれる。さらに、当然のことながら本発明は、別段の指定のない限りまたは矛盾もしくは不一致が生じることが当業者に明らか出ない限り、１つ以上の請求項に由来する１つ以上の制限、構成要素、節、記述用語などが、同じ基本請求項に依存して別の請求項（つまり、関連のある他の任意の請求項）に納入されている変更形態、組み合わせ形態、および並べ替え形態を包含する。構成要素が列挙されている場合、例えばマーカッシュ形式や類似の形式で列挙されている場合、その構成要素の各小集団についても開示されており、また、いずれの要素をその群から排除することができると理解される。当然のことながら、基本的には、本発明または本発明の側面は特定の構成要素や特徴などを含んでいると記載されている場合、本発明の特定の態様または本発明の側面は、そのような構成要素、特徴などからなるか、または本質的にそれらからなる。簡潔にする目的で、本明細書ではこれらの態様を、全ての例について具体的に記載してはいない。また、いずれかの本発明の態様、例えば先行技術に見られるいずれかの態様は原則的に、そのような特定の除外が明細書中に記載されているか否かに関わらず、請求項から除外することができる。
また、そうでないことが明示されていない限り、２つ以上の作業を含む本明細書で請求したいずれの方法においても、方法中の作業の順序は、方法の作業を記載している順序に限定される必要はないが、本発明には、作業の順序がそのように制限されている態様も含まれると理解される。さらに、組成物について記載している請求項では、本発明は、そのような組成物の使用方法およびそのような組成物の製造方法も包含する。組成物について記載している請求項では、当然のことながら本発明はそのような組成物の使用方法およびそのような組成物の製造方法も包含する。
本出願で引用した全ての出版物および特許文書は、あたかも個々の出版物または特許文書の内容がそれぞれ本明細書に組み込まれたとの同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (61)

  1. 標的タンパク質であって、
    （ａ）ライソゾーム酵素、
    （ｂ）成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグ、および
    （ｃ）ライソゾーム酵素とＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチド、を含み、
    ここで前記スペーサーペプチドは、ＧＧＧＰＳ（配列番号１４）またはＧＧＧＳＰ（配列番号１５）アミノ酸配列を１つ以上含み、場合によりさらに、（ｉ）ＧＡＰ（配列番号９）、（ｉｉ）ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、（ｉｉｉ）ＧＧＧＳ（配列番号１６）、（ｉｖ）ＡＡＡＡＳ（配列番号１７）、（ｖ）ＡＡＡＳ（配列番号１８）、（ｖｉ）ＰＡＰＡ（配列番号１９）、（ｖｉｉ）ＴＰＡＰＡ（配列番号２０）、（ｖｉｉｉ）ＡＡＡＫＥ（配列番号２１）または（ｉｘ）ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）のうちの１つ以上を含む、標的タンパク質。
  2. スペーサーペプチドが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２、５６、５８、９１〜９４）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３６、９５〜１００）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号１０１〜１０７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３７、１０８〜１１３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１１４〜１６２）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１６３〜１６９）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号１７０〜２１８）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２１９〜２６７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２６８〜３１６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５４４〜５５１）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ（配列番号６０、７９、８１、３１７〜３２０）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２１〜３２６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２７〜３３３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３３４〜３４０）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３４１〜３８９）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３９０〜３９６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号３９７〜４４５）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４４６〜４９４）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４９５〜５４３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５５２〜５５９）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここでｎが１〜７である、請求項１の標的治療用融合タンパク質。
  3. ｎが１〜４である、請求項２の標的治療用融合タンパク質。
  4. 前記スペーサーペプチドが、ＥＦＧＧＧＧＳＴＲ（配列番号２２）、ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＰＳＧＳＰＧ（配列番号２３）、ＧＰＳＧＳＰＧＴ（配列番号２４）、ＧＰＳＧＳＰＧＨ（配列番号２５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＴ（配列番号２６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＨ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号２８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３４）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４３）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５９）、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＴ（配列番号６１）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号７９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号８１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳ］（配列番号８３）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳ］（配列番号８５）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８６）、ＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８７）、ＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号８８）、ＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８９）、およびＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号９０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１の標的治療用融合タンパク質。
  5. 前記スペーサーペプチドが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４の標的治療用融合タンパク質。
  6. 前記スペーサーペプチドが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５の標的治療用融合タンパク質。
  7. ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、
    成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグ、および
    Ｎａｇｌｕアミノ酸配列とＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチド、ここで前記スペーサーがアミノ酸配列ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＰＳ（配列番号１０）、またはＧＧＳ（配列番号１１）を含む、
    を含んでいる標的治療用融合タンパク質。
  8. 前記スペーサー配列が成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸とヒトＮａｇｌｕのアミノ酸との間にアミノ酸Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＧＰＳ）（配列番号１０）を含む、請求項７の標的治療用融合タンパク質。
  9. 前記スペーサーペプチドがＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）またはＧＧＧＳ（配列番号１６）アミノ酸配列を１つ以上含む、請求項７〜８のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
  10. 前記スペーサーペプチドが、ＧＧＧＰＳ（配列番号１４）またはＧＧＧＳＰ（配列番号１５）アミノ酸配列を１つ以上含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
  11. 前記スペーサーペプチドがＡＡＡＡＳ（配列番号１７）またはＡＡＡＳ（配列番号１８）アミノ酸配列を１つ以上含む、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
  12. スペーサーペプチドがＰＡＰＡ（配列番号１９）またはＴＰＡＰＡ（配列番号２０）アミノ酸配列を１つ以上含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
  13. スペーサーペプチドがＡＡＡＫＥ（配列番号２１）アミノ酸配列を１つ以上含む、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
  14. スペーサーペプチドが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２、５６、５８、９１〜９４）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３６、９５〜１００）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号１０１〜１０７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３７、１０８〜１１３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１１４〜１６２）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１６３〜１６９）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号１７０〜２１８）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２１９〜２６７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２６８〜３１６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５４４〜５５１）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ（配列番号６０、７９、８１、３１７〜３２０）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２１〜３２６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２７〜３３３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３３４〜３４０）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３４１〜３８９）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３９０〜３９６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号３９７〜４４５）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４４６〜４９４）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４９５〜５４３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５５２〜５５９）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、ここでｎが１〜７である、請求項７〜８のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
  15. ｎが１〜４である、請求項１４の標的治療用融合タンパク質。
  16. 前記スペーサーペプチドが、ＥＦＧＧＧＧＳＴＲ（配列番号２２）、ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＰＳＧＳＰＧ（配列番号２３）、ＧＰＳＧＳＰＧＴ（配列番号２４）、ＧＰＳＧＳＰＧＨ（配列番号２５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＴ（配列番号２６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＨ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号２８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３４）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４３）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５９）、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＴ（配列番号６１）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号７９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号８１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳ］（配列番号８３）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳ］（配列番号８５）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８６）、ＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８７）、ＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号８８）、ＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８９）、およびＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号９０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７の標的治療用融合タンパク質。
  17. 前記スペーサーペプチドが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６の標的治療用融合タンパク質。
  18. 前記スペーサーペプチドが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７の標的治療用融合タンパク質。
  19. 前記ペプチドタグがＮ末端タグかまたはＣ末端タグである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
  20. 前記ペプチドタグがＣ末端タグである、請求項１９の標的治療用融合タンパク質。
  21. 前記スペーサーがＧｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＧＡＰ）（配列番号９）またはＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＧＰＳ）（配列番号１０）アミノ酸配列を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
  22. 前記ライソゾーム標的化ドメインが成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
  23. 前記スペーサーがαらせん構造または強固な構造を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
  24. 前記ＩＧＦ−ＩＩペプチドタグがＡｒｇ３７の残基に変異を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
  25. 前記変異がアルギニンからアラニンへの置換である、請求項２３の標的治療用融合タンパク質。
  26. 薬学上許容可能な担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでいる、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質。
  27. ライソゾーム蓄積症の治療に好適な請求項１〜２６のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質を含んでいる医薬組成物。
  28. 請求項１〜２７のいずれか１項に記載の標的治療用融合タンパク質をコードしている核酸。
  29. 請求項２７の核酸を含有している細胞。
  30. 請求項２８の核酸を保持している哺乳類細胞を細胞培養用の培地中で培養する工程を含み、ここで前記培養する工程が前記標的治療用融合タンパク質の発現を許容する条件で実施される、標的治療用融合タンパク質の生産方法。
  31. ライソゾーム酵素、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグおよび前記ライソゾーム酵素アミノ酸配列と前記ＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチド、ここで前記スペーサーペプチドはＧＧＧＰＳ（配列番号１４）またはＧＧＧＳＰ（配列番号１５）アミノ酸配列を１つ以上含み、場合によりさらに、（ｉ）ＧＡＰ（配列番号９）、（ｉｉ）ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、（ｉｉｉ）ＧＧＧＳ（配列番号１６）、（ｉｖ）ＡＡＡＡＳ（配列番号１７）、（ｖ）ＡＡＡＳ（配列番号１８）、（ｖｉ）ＰＡＰＡ（配列番号１９）、（ｖｉｉ）ＴＰＡＰＡ（配列番号２０）、（ｖｉｉｉ）ＡＡＡＫＥ（配列番号２１）または（ｉｘ）ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）を１つ以上含んでいる、を含んでいる融合タンパク質を含んでいる治療上有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、前記対象におけるライソゾーム蓄積症の治療方法。
  32. スペーサーペプチドが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２、５６、５８、９１〜９４）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３６、９５〜１００）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号１０１〜１０７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３７、１０８〜１１３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１１４〜１６２）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１６３〜１６９）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号１７０〜２１８）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２１９〜２６７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２６８〜３１６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５４４〜５５１）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ（配列番号６０、７９、８１、３１７〜３２０）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２１〜３２６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２７〜３３３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３３４〜３４０）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３４１〜３８９）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３９０〜３９６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号３９７〜４４５）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４４６〜４９４）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４９５〜５４３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５５２〜５５９）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；ここでｎが１〜７である、請求項３１の方法。
  33. ｎが１〜４である、請求項３２の方法。
  34. ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグおよびＮａｇｌｕアミノ酸配列とＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチド、ここで前記スペーサーはアミノ酸配列ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＰＳ（配列番号１０）、またはＧＧＳ（配列番号１１）を含む、を含んでいる融合タンパク質を含んでいる治療上有効量の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、前記対象におけるムコ多糖症ＩＩＩＢ型（Ｂ型サンフィリポ症候群）の治療方法。
  35. 前記スペーサー配列が成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩのアミノ酸とヒトＮａｇｌｕのアミノ酸との間にアミノ酸Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ＧＰＳ）（配列番号１０）を含む、請求項３４の方法。
  36. 前記スペーサーペプチドがＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）またはＧＧＧＳ（配列番号１６）アミノ酸配列を１つ以上含む、請求項３４〜３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記スペーサーペプチドがＧＧＧＰＳ（配列番号１４）またはＧＧＧＳＰ（配列番号１５）アミノ酸配列を１つ以上含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記スペーサーペプチドがＡＡＡＡＳ（配列番号１７）またはＡＡＡＳ（配列番号１８）アミノ酸配列を１つ以上含む、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. スペーサーペプチドがＰＡＰＡ（配列番号１９）またはＴＰＡＰＡ（配列番号２０）アミノ酸配列を１つ以上含む、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. スペーサーペプチドがＡＡＡＫＥ（配列番号２１）アミノ酸配列を１つ以上含む、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. スペーサーペプチドが、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１２、５６、５８、９１〜９４）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３６、９５〜１００）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号１０１〜１０７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３７、１０８〜１１３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１１４〜１６２）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号１６３〜１６９）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号１７０〜２１８）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２１９〜２６７）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号２６８〜３１６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＳ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５４４〜５５１）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ（配列番号６０、７９、８１、３１７〜３２０）、（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２１〜３２６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ（配列番号３２７〜３３３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−ＧＡＰ（配列番号３３４〜３４０）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３４１〜３８９）、ＧＡＰ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号３９０〜３９６）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡＳ−ＧＧＧＰＳ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＡＡＡＡ−ＧＡＰ（配列番号３９７〜４４５）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４４６〜４９４）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＰＡＰＡＰＴ−（Ｘａａ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号４９５〜５４３）、ＧＡＰ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−ＰＡＰＡＰ−（Ｘａａ）ｎ−（ＡＡＡＫＥ）ｎ−（Ｘａａ）ｎ−（ＧＧＧＧＡ）ｎ−ＧＡＰ（配列番号５５２〜５５９）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；ここでｎが１〜７である、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
  42. ｎが１〜４である、請求項４１の方法。
  43. ｉ）ヒトα−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Ｎａｇｌｕ）タンパク質と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、ｉｉ）成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有するペプチドタグ、およびｉｉｉ）Ｎａｇｌｕアミノ酸配列とＩＧＦ−ＩＩペプチドタグとの間に配置されているスペーサーペプチドを含んでいる有効量の融合タンパク質を、ムコ多糖症ＩＩＩＢ型（Ｂ型サンフィリポ症候群）を患っている対象に投与することを含む、インビボでのグリコサミノグリカンレベルを低減させる方法。
  44. 前記スペーサーペプチドが、ＥＦＧＧＧＧＳＴＲ（配列番号２２）、ＧＡＰ（配列番号９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２）、ＧＰＳＧＳＰＧ（配列番号２３）、ＧＰＳＧＳＰＧＴ（配列番号２４）、ＧＰＳＧＳＰＧＨ（配列番号２５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＴ（配列番号２６）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＨ（配列番号２７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号２８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号２９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３４）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号３９）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４０）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号４２）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＳＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４３）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５６）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５７）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５８）、ＧＡＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＰ（配列番号５９）、ＧＧＧＧＡ（配列番号６０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＴ（配列番号６１）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ（配列番号６２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号６８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号６９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７３）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７５）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７６）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳ（配列番号７７）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＧＧＧＡＡＡＡＡＳＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号７８）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号７９）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡ（配列番号８１）、ＧＡＰＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＰ（配列番号８２）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳ］（配列番号８３）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）８ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８４）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳ］（配列番号８５）、ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳＨ［または（ＧＧＧＧＡ）９ＧＧＧＰＳＨ］（配列番号８６）、ＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８７）、ＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＧＰＧＰＡＰＧＰＡＰＧＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号８８）、ＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号８９）、およびＧＡＰＧＧＧＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＰＧＰＡＰＡＧＧＧＰＧＧＡＰ（配列番号９０）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３１、３４または４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 前記スペーサーが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳ（配列番号４４）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＧＰＳＧＡＰ（配列番号４５）、ＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳ（配列番号４６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号４８）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＴＰＴＰＡＰＴＰＡＰＴＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号４９）、ＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳ（配列番号５０）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳ（配列番号５２）、ＧＡＰＧＧＧＳＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５３）、ＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧ（配列番号５４）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４４の方法。
  46. 前記スペーサーペプチドが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＰＳ（配列番号３６）、ＧＡＰＧＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＧＰＳＧＡＰ（配列番号４７）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＰＴＰＡＰＡＧＧＧＰＳＧＡＰ（配列番号５１）、ＧＡＰＧＧＧＳＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡＰＳＧＧＧＧＡＰ（配列番号５５）、およびＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＰＳ（配列番号７１）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４５の方法。
  47. 前記スペーサー配列がアミノ酸Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＧＡＰ）（配列番号９）の配列を含む、請求項３１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記ペプチドタグがＮ末端タグまたはＣ末端タグである、請求項３１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記ペプチドタグがＣ末端タグである、請求項４８の方法。
  50. 前記スペーサーがαらせん構造または強固な構造を含む、請求項３１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
  51. 前記ライソゾーム標的化ドメインが成熟ヒトＩＧＦ−ＩＩの８〜６７番目のアミノ酸を含む、請求項３１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記ＩＧＦ−ＩＩペプチドタグがＡｒｇ３７の残基に変異を含む、請求項３１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記変異がアルギニンのアラニンへの置換である、請求項５２の方法。
  54. 前記融合タンパク質がヒトＮａｇｌｕの１〜７４３番目のアミノ酸または２４〜７４３番目のアミノ酸（図１）を含む、請求項３１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記有効量が前記対象の体重１キログラムにつき、２．５〜２０ｍｇの範囲である、請求項３１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記融合タンパク質を髄腔内に投与することを含む、必要に応じて、前記融合タンパク質静脈内に投与することをさらに含む、請求項３１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  57. 前記投与が、前記融合タンパク質を脳室、腰部、または大槽に導入することを含む、請求項５６の方法。
  58. 前記融合タンパク質を静脈内に投与する、請求項３１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
  59. 前記融合タンパク質を２ヶ月に１回、１ヶ月に１回、３週間に１回、２週間に１回、１週間に１回、１日１回、または様々な間隔で投与する、請求項３１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
  60. 前記治療の結果、脳組織でのグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）レベルが低下する、請求項３１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. 前記治療の結果、脳組織でのライソゾーム貯蔵顆粒が減少する、請求項３１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021521851A (ja) * 2018-04-30 2021-08-30 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド 遺伝子治療構築物及び使用方法

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2279210T3 (pl) * 2008-05-07 2017-10-31 Biomarin Pharm Inc Lizosomalne peptydy kierujące i ich zastosowania
KR102262882B1 (ko) 2012-11-27 2021-06-10 바이오마린 파머수티컬 인크. 표적화된 치료적 리소좀 효소 융합 단백질들 및 그들의 용도들
CN115120746A (zh) * 2013-05-15 2022-09-30 明尼苏达大学董事会 腺相关病毒介导的基因向中枢神经系统转移
EP3185889B1 (en) * 2014-08-11 2020-07-15 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mannose-6-phosphate bearing peptides fused to lysosomal enzymes
WO2016049510A2 (en) * 2014-09-25 2016-03-31 The General Hospital Corporation Cell-based targeted delivery of pseudonomas exotoxin
MA40791A (fr) 2014-10-24 2017-09-27 Shire Human Genetic Therapies Ciblage lysosomal d'enzymes et utilisations associées
TWI752907B (zh) 2015-05-08 2022-01-21 美商拜奧馬林製藥公司 用於治療cln2疾病之tpp1調配物及方法
CA3003750A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Biomarin Pharmaceutical Inc. Cell-based assays for detection of antibodies or other factors that neutralize uptake of lysosomal enzymes
AU2017222620B2 (en) * 2016-02-24 2022-06-16 Biomarin Pharmaceutical Inc. Targeted therapeutic lysosomal enzyme fusion proteins, associated formulations and uses thereof
JP7171439B2 (ja) 2016-04-15 2022-11-15 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア ムコ多糖症ｉｉ型を処置するための遺伝子療法
CL2016003282A1 (es) 2016-12-21 2017-08-18 Univ Chile Virus aav/igf2, método de tratamiento genético y su uso en enfermedades relacionadas con mal plegamiento de proteínas tal como la enfermedad de huntington
US11819539B2 (en) 2017-09-22 2023-11-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Gene therapy for treating Mucopolysaccharidosis type II
MA50746A (fr) 2017-10-02 2020-08-12 Denali Therapeutics Inc Protéines de fusion comprenant des enzymes d'enzymothérapie substitutive
AU2019231889A1 (en) * 2018-03-09 2020-10-01 Avrobio, Inc. Compositions and methods for treating Parkinson's disease
CN112243444A (zh) 2018-06-08 2021-01-19 豪夫迈·罗氏有限公司 具有减少的翻译后修饰的肽接头
US11097015B2 (en) 2018-10-10 2021-08-24 Amicus Therapeutics, Inc. Disulfide bond stabilized polypeptide compositions and methods of use
AU2019381803A1 (en) * 2018-11-16 2021-06-10 Asklepios Biopharmaceutical, Inc. Vectors comprising a nucleic acid encoding lysosomal enzymes fused to a lysosomal targeting sequence
CN115087458A (zh) * 2019-10-10 2022-09-20 阿米库斯治疗学公司 变体igf2构建体
WO2021183895A1 (en) 2020-03-13 2021-09-16 Biomarin Pharmaceutical Inc. Treatment of fabry disease with aav gene therapy vectors
CN115975039A (zh) * 2021-10-15 2023-04-18 中山大学 重组融合抗体和抗体-药物偶联物及其用途

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004535791A (ja) * 2001-04-30 2004-12-02 シンビオンティクス， インコーポレイテッド 治療的タンパク質の亜細胞標的化
JP2007521818A (ja) * 2004-02-10 2007-08-09 ザイストール セラピューティクス， インコーポレイテッド 酸性αグルコシダーゼおよびそのフラグメント
WO2010148253A2 (en) * 2009-06-17 2010-12-23 Zystor Therapeutics, Inc. Formulations for lysosomal enzymes
JP2011521627A (ja) * 2008-05-07 2011-07-28 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド リソソーム標的化ペプチドおよびその使用
WO2011163652A2 (en) * 2010-06-25 2011-12-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Treatment of sanfilippo syndrome type b
WO2012088461A2 (en) * 2010-12-23 2012-06-28 Biogen Idec Inc. Linker peptides and polypeptides comprising same
WO2012122042A2 (en) * 2011-03-04 2012-09-13 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
AUPN674895A0 (en) 1995-11-23 1995-12-14 Women's And Children's Hospital Synthetic mammalian alpha-N-acetylglucosaminidase and genetic sequences encoding same
US6217552B1 (en) 1999-03-01 2001-04-17 Coaxia, Inc. Medical device for selective intrathecal spinal cooling in aortic surgery and spinal trauma
DE10035433C2 (de) 2000-07-20 2002-07-18 Tuma Wolfgang Schonende Hochanreicherung von fetalen Zellen aus pripherem Blut und Verwendung derselben
US7629309B2 (en) 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US7560424B2 (en) 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US20040005309A1 (en) 2002-05-29 2004-01-08 Symbiontics, Inc. Targeted therapeutic proteins
WO2003102583A1 (en) 2002-05-29 2003-12-11 Symbiontics, Inc. Targeted therapeutic proteins
AU2002347910A1 (en) 2001-10-16 2003-04-28 Symbiontics Inc. Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
US20030072761A1 (en) 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
US7485314B2 (en) 2002-05-06 2009-02-03 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Induction of antigen specific immunologic tolerance
SI1641823T1 (sl) 2003-06-12 2011-12-30 Lilly Co Eli Fuzijski proteini analogni glp-1
US7442372B2 (en) 2003-08-29 2008-10-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
CA2600929A1 (en) 2005-03-04 2006-09-14 Biogen Idec Ma Inc. Methods of humanizing immunoglobulin variable regions through rational modification of complementarity determining residues
US8697654B2 (en) * 2008-12-18 2014-04-15 E I Du Pont De Nemours And Company Peptide linkers for effective multivalent peptide binding
US9029530B2 (en) 2009-01-02 2015-05-12 Biomarin Pharmaceutical Inc. Detection of oligosaccharides
ES2773071T3 (es) 2010-06-25 2020-07-09 Amcor Rigid Plastics Usa Llc The Corp Trust Company Sistema de extracción de oxígeno para un recipiente
US8580922B2 (en) 2011-03-04 2013-11-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
WO2012122477A1 (en) * 2011-03-10 2012-09-13 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
KR102262882B1 (ko) 2012-11-27 2021-06-10 바이오마린 파머수티컬 인크. 표적화된 치료적 리소좀 효소 융합 단백질들 및 그들의 용도들

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004535791A (ja) * 2001-04-30 2004-12-02 シンビオンティクス， インコーポレイテッド 治療的タンパク質の亜細胞標的化
JP2007521818A (ja) * 2004-02-10 2007-08-09 ザイストール セラピューティクス， インコーポレイテッド 酸性αグルコシダーゼおよびそのフラグメント
JP2011521627A (ja) * 2008-05-07 2011-07-28 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド リソソーム標的化ペプチドおよびその使用
WO2010148253A2 (en) * 2009-06-17 2010-12-23 Zystor Therapeutics, Inc. Formulations for lysosomal enzymes
WO2011163652A2 (en) * 2010-06-25 2011-12-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Treatment of sanfilippo syndrome type b
WO2012088461A2 (en) * 2010-12-23 2012-06-28 Biogen Idec Inc. Linker peptides and polypeptides comprising same
WO2012122042A2 (en) * 2011-03-04 2012-09-13 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2021521851A (ja) * 2018-04-30 2021-08-30 アミカス セラピューティックス インコーポレイテッド 遺伝子治療構築物及び使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
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