MX2015006644A - Proteinas de fusion de enzima lisosomal terapeutica objetivo y usos de las mismas. - Google Patents

Proteinas de fusion de enzima lisosomal terapeutica objetivo y usos de las mismas.

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Melita Dvorak-Ewell
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Abstract

La presente invención se refiere en general a proteínas de fusión terapéutica útiles para tratar enfermedades de almacenamiento lisosomal y métodos para tratar tales enfermedades. Proteínas de fusión terapéutica ejemplares comprenden una enzima lisosomal, una porción de objetivo lisosomal, por ejemplo, un péptido IGF-II, y un péptido espaciador. También se proporcionan composiciones y métodos para tratar Mucopolisacaridosis Tipo IIIB (Síndrome de Sanfilippo B), que comprenden una proteína de fusión terapéutica objetivo que comprende alfa-Nacetilglucosaminidasa (Naglu), una porción de objetivo lisosomal, por ejemplo, un péptido IGF-II, y un péptido espaciador.

Description

PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE ENZIMA LISOSOMAL TERAPÉUTICA OBJETIVO Y USOS DE LAS MISMAS REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la Solicitud Provisional Estadounidense No. 61/730,378, presentada el 27 de Noviembre de 2012, y Solicitud Provisional Estadounidense No.61/788,968, presentada el 15 de Marzo de 2013, en la presente incorporada por referencia en sus totalidades.
CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere en general a proteínas de fusión terapéuticas útiles para tratar enfermedades de almacenamiento lisosomal y métodos para tratar tales enfermedades. Las proteínas de fusión terapéutica ejemplares comprenden una enzima lisosomal, una porción de objetivo lisosomal, por ejemplo, un péptido IGF-II, y un péptido espaciador. Se contempla que la enzima lisosomal sea alfa-N-acetilglucosaminidasa (Naglu) y la enfermedad sea Mucopolisacaridosis Tipo IIIB (Síndrome de Sanfilippo B).
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Normalmente, las enzimas lisosomales de mamífero son sintetizadas en el citosol y atraviesan el ER donde son glicosiladas con carbohidratos de tipo alta mañosa, ti n gados. En el aparato de golgi, el carbohidrato de alta mañosa es modificado en las enzimas lisosomales por la adición de manosa-6-fosfato (M6P) el cual dirige estas proteínas al lisosoma. Las proteínas M6P modificadas son suministradas al lisosoma vía interacción con cualquiera de los dos receptores M6P. La forma más favorable de modificación es cuando los dos M6Ps son agregados a un carbohidrato de alta mañosa.
Más de cuarenta enfermedades de almacenamiento lisosomal (LSDs) son causadas, directamente o indirectamente, por la ausencia de una o más enzimas lisosomales en el lisosoma. La terapia de reemplazo de enzima para LSDs está siendo activamente buscada. La terapia en general requiere que las proteínas LSD sean tomadas y suministradas a los lisosomas de una variedad de tipos de células en una forma dependiente de M6P. Un procedimiento posible involucra purificar una proteína LSD y modificarla para incorporar una porción de carbohidrato con M6P. Este material modificado puede ser recuperado por las células más eficientemente que las proteínas LSD no modificadas debido a la interacción con receptores M6P en la superficie celular.
Los inventores de la presente solicitud han desarrollado previamente una teenología de objetivo a base de péptido que permite suministro más eficiente de enzimas terapéuticas a los lisosomas. Esta teenología propietaria es llamada Objetivo Lisosomal Independiente de la Glicosilación (GILT) debido a que una etiqueta de péptido reemplaza la M6P conforme la porción dirige los lisosomas. Los detalles de la tecnología GILT son descritos en las Publicaciones de Solicitud Estadounidense Nos. 2003-0082176, 2004-0006008, 2003-0072761, 2005-0281805, 2005-0244400, y publicaciones internacionales WO 03/032913, WO 03/032727, WO 02/087510, WO 03/102583, WO 2005/078077, las descripciones de todas las cuales están de este modo incorporadas por referencia.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona además composiciones y métodos mejorados para el objetivo lisosomal eficiente con base en la tecnología GILT. Entre otras cosas, la presente invención proporciona métodos y composiciones para dirigir enzimas lisosomales a lisosomas usando péptidos de objetivo lisosomal. La presente invención también proporciona métodos y composiciones para dirigir enzimas lisosomales a lisosomas usando un péptido de objetivo lisosomal que tiene afinidad de unión reducida o disminuido para el receptor IGF-I y/o afinidad de unión disminuida o reducida para el receptor de insulina, y/o es resistente al desdoblamiento de furina. La presente invención también proporciona proteínas de fusión de enzima lisosomal que comprenden una enzima lisosomal e IGF-II y péptidos espaciadores que proporcionan proporción mejorada y absorción en lisosomas de la proteína de fusión enzimática lisosomal. En ciertas modalidades, la enzima lisosomal es alfa-N-acetilglucosaminidasa (Naglu).
En un aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión terapéutica objetivo que comprende una enzima lisosomal, una etiqueta de péptido que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro y un péptido espaciador . En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGPS (SEC ID NO: 14) o GGGSP (SEC ID NO: 15), y opcionalmente además comprende una o más de (i) GAP (SEC ID NO: 9), (ii) GGGGS (SEC ID NO: 12), (iii) GGGS (SEC ID NO: 16), (iv) AAAAS (SEC ID NO: 17), (v) AAAS (SEC ID NO: 18), (vi) PAPA (SEC ID NO: 19), (vii) TPAPA (SEC ID NO: 20), (viii) AAAKE (SEC ID NO: 21) o (ix) GGGGA (SEC ID NO: 60).
Enzimas lisosomales ejemplares contempladas en la presente incluyen aquellas expuestas en la Tabla 1.
En varias modalidades, la proteína de fusión terapéutica objetivo comprende una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica a la proteína humana OÍ-N-acetilglucosaminidasa (Naglu) (Figura 1A, SEC ID NO: 1), una etiqueta de péptido que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro y un péptido espaciador localizado entre la secuencia de aminoácido Naglu y la etiqueta del péptido IGF-II. En varias modalidades, el espaciador comprende la secuencia de aminoácido GAP (SEC ID NO: 9), GPS (SEC ID NO: 10), o GGS (SEC ID NO: 11). En varias modalidades, la secuencia espad adora comprende los aminoácidos Gly-Pro-Ser (GPS) (SEC ID NO: 10) entre los aminoácidos de IGF-II humano maduro y los aminoácidos de Naglu humano.
En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGGS (SEC ID NO: 12) o GGGS (SEC ID NO: 16). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGPS (SEC ID NO: 14) o GGGSP (SEC ID NO: 15). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido AAAAS (SEC ID NO: 17) o AAAS (SEC ID NO: 18). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido PAPA (SEC ID NO: 19) o TPAPA (SEC ID NO: 20). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido AAAKE (SEC ID NO: 21). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGGA (SEC ID NO: 60).
En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de: (GGGGS)n (SEC ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 163-169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 170- 218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 219-267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 268-316), GAP- (GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 544-551), (GGGGA)n (SEC ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 334- 340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n- AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 397-445), GAP- (GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT- (Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n_(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 552- 559); en donde n es 1 a 7. En varias modalidades, n es 1 a 4.
En varias modalidades, la presente invención proporciona un péptido IGF-II para uso como una etiqueta de péptido para dirigir el péptido o proteina de fusión que comprende el péptido a un lisosoma de mamífero. En varias modalidades, la presente invención proporciona una muteína IGF-II. En varias modalidades, la invención proporciona una muteina IGF-II resistente a furina que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a la IGF-II humana madura (AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYC ATPAKSE) (SEC ID NO: 5) y una mutación que abóle al menos un sitio de desdoblamiento de proteasa furina.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona una muteina IGF-II que comprende una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a la IGF-II humana madura. En varias modalidades, la etiqueta de péptido de muteina IGF-II comprende los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro. En varias modalidades, la muteina IGF-II comprende una mutación que reduce o disminuye la afinidad de unión para el receptor de insulina comparado con el IGF-II humano de tipo nativo.
En algunas modalidades, la muteina IGF-II tiene afinidad de unión disminuida para el receptor IGF-I con relación a la afinidad de IGF-II humano que se origina naturalmente para el receptor IGF-I.
En varias modalidades, la presente invención proporciona una proteina de fusión terapéutica de objetivo que contiene una enzima lisosomal; y una muteina IGF-II que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a la IGF-II humana madura, en donde la muteina IGF-II es resistente al desdoblamiento de furina y se une al receptor humano manosa-6-fosfato independiente del catión en una manera independiente de manosa-6-fosfato.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona una proteina de fusión terapéutica de objetivo que contiene una enzima lisosomal; y una muteina IGF-II que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a la IGF-II humana madura, y que tiene afinidad de unión disminuida para el receptor de insulina con relación a la afinidad de IGF-II humano que se origina naturalmente para el receptor de insulina. En una modalidad relacionada, la muteina IGF-II es resistente al desdoblamiento de furina y se une al receptor humano de manosa-6-fosfato independiente del catión en una manera independiente de manosa-6-fosfato.
En varias modalidades, una muteina IGF-II adecuada para la invención incluye una mutación dentro de una región que corresponde a los aminoácidos 30-40 de IGF-II humano maduro. En algunas modalidades, una muteina IGF-II adecuada para la invención incluye una mutación dentro de una región que corresponde a los aminoácidos 34-40 de IGF-II humano maduro de manera que la mutación abóle al menos un sitio de desdoblamiento de proteasa furina. En algunas modalidades, una mutación adecuada es una sustitución, supresión y/o inserción de aminoácido. En algunas modalidades, la mutación es una sustitución de aminoácido en una posición que corresponde a Arg37 o Arg40 de IGF-II humano maduro. En algunas modalidades, la sustitución de aminoácido es una sustitución Lys o Ala.
En algunas modalidades, una mutación adecuada es una supresión o reemplazo de residuos de aminoácido que corresponden a posiciones seleccionadas a partir del grupo que consiste de 30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 33-39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40 de IGF-II humano maduro, y combinaciones de las mismas.
En varias modalidades, una muteina IGF-II de conformidad con la invención además contiene una supresión o un reemplazo de aminoácidos que corresponden a las posiciones 2-7 de IGF-II humano maduro. En varias modalidades, una muteina IGF-II de conformidad con la invención además incluye una supresión o un reemplazo de aminoácidos que corresponden a las posiciones 1-7 de IGF-II humano maduro. En varias modalidades, una muteina IGF-II de conformidad con la invención además contiene una supresión o un reemplazo de aminoácidos que corresponden a las posiciones 62-67 de IGF-II humano maduro. En varias modalidades, una muteina IGF-II de conformidad con la invención además contiene una sustitución de aminoácido en una posición que corresponde a Tyr27, Leu43, o Ser26 de IGF-II humano maduro. En varias modalidades, una muteina IGF-II de conformidad con la invención contiene al menos una sustitución de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de Tyr27Leu, Leu43Val, Ser26Phe y combinaciones de las mismas. En varias modalidades, una muteina IGF-II de conformidad con la invención contiene aminoácidos que corresponden a las posiciones 48-55 de IGF-II humano maduro. En varias modalidades, una muteina IGF-II de conformidad con la invención contiene al menos tres aminoácidos seleccionados a partir del grupo que consiste de aminoácidos que corresponden a las posiciones 8, 48, 49, 50, 54, and 55 de IGF-II humano maduro. En varias modalidades, una muteina IGF-II de la invención contiene, en las posiciones que corresponden a las posiciones 54 y 55 de IGF-II humano maduro, aminoácidos cada uno de los cuales es no cargado o cargado negativamente a pH 7.4. En varias modalidades, la muteina IGF-II tiene afinidad de unión disminuida para el receptor IGF-I con relación a la afinidad de IGF-II humano que se origina naturalmente para el receptor IGF-I. En varias modalidades, la muteina IGF-II es IGF2 D8-67 R37A (es decir, aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro con Arg en la posición 37 de IGF-II humano maduro sustituido por Ala).
En varias modalidades, la etiqueta de péptido está unida al N-término o C-término de la enzima lisosomal, por lo tanto es una etiqueta N-terminal o una etiqueta C-terminal, respectivamente. En varias modalidades, la etiqueta de péptido es una etiqueta C-terminal.
En algunas modalidades, una enzima lisosomal adecuada para la invención es alfa-N-acetilglucosaminidasa humana (Naglu) (Figuras 1A y IB), o un fragmento funcional o variante de la misma. En algunas modalidades, una enzima lisosomal adecuada para la invención incluye aminoácidos 1-743 de alfa-N-acetilglucosaminidasa humana o aminoácidos 24-743 de alfa-N-acetilglucosaminidasa humana, los cuales carecen de una secuencia señal.
En varias modalidades, una proteina de fusión terapéutica objetivo de la invención además incluye un espaciador entre la enzima lisosomal y la muteína IGF-II.
En varias modalidades, el espaciador comprende una estructura alfa-helicoidal o una estructura rígida.
En varias modalidades, el espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido Gly-Ala-Pro (GAP) (SEC ID NO: 9), Gly-Pro-Ser (GPS) (SEC ID NO: 10), o Gly-Gly-Ser (GGS) (SEC ID NO: 11).
En algunas modalidades, el espaciador se selecciona a partir del grupo gue consiste de EFGGGGSTR (SEC ID NO: 22), GAP (SEC ID NO: 9), GGGGS (SEC ID NO: 12), GPSGSPG (SEC ID NO: 23), GPSGSPGT (SEC ID NO: 24), GPSGSPGH (SEC ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEC ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEC ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48) GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGS RARARTRARARTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50) , GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 58) , (SEC ID NO 59) GGGGA (SEC ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGRST (SEC ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEC ID NO: 62) , GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)gGGGPSH] (SEC ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)sGGGPSH] (SEC ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEC ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEC ID NO: 89), y GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 90).
En algunas modalidades, el espaciador se selecciona a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS 'SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
En algunas modalidades, el espaciador se selecciona a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
En varias modalidades, la proteina de fusión además comprende un portador, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.
La presente invención también proporciona ácidos nucleicos que codifican la muteína IGF-II o la proteina de fusión terapéutica objetivo como se describe en varias modalidades anteriormente. La presente invención además proporciona varias células que contienen el ácido nucleico de la invención.
La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas adecuadas para tratar enfermedad de almacenamiento lisosomal que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteina de fusión terapéutica objetivo de la invención. La invención además proporciona métodos para tratar enfermedades de almacenamiento lisosomal que comprenden administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento una proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la invención. En algunas modalidades, la enfermedad de almacenamiento lisosomal es Mucopolisacaridosis Tipo IIIB (Síndrome de Sanfilippo B).
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una proteína de fusión terapéutica objetivo que incluye una etapa de cultivar células de mamífero en un medio de cultivo celular, en donde las células de mamífero portan el ácido nucleico de la invención, en particular, como se describe en varias modalidades en la presente; y el cultivo se realiza bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína de fusión terapéutica objetivo.
En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una proteína de fusión terapéutica objetivo que incluye una etapa de cultivar células deficientes de furina (por ejemplo, células de mamífero deficientes de furina) en un medio de cultivo celular, en donde las células deficientes de furina portan un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende una enzima lisosomal y una muteína IGF-II que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a la IGF-II humana madura, en donde la muteína IGF-II se une al receptor humano de manosa-6-fosfato independiente del catión en una manera independiente de manosa-6-fosfato; y en donde el cultivo se realiza bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína de fusión terapéutica objetivo.
En varias modalidades, se contempla que ciertas de las proteínas terapéuticas objetivo que comprenden un espaciador como se describe en la presente, exhiben expresión incrementada de la proteína activa cuando se expresan recombinantemente comparado con las proteínas terapéuticas objetivo que comprenden un péptido espaciador diferente. En varias modalidades, también se contempla que las proteínas terapéuticas objetivo descritas en la presente pueden tener actividad incrementada comparada con otras proteínas terapéuticas objetivo de la presente. Se contempla que aquellas proteínas terapéuticas objetivo que presentan expresión incrementada de proteína activa y/o tienen actividad incrementada comparada con otras proteínas terapéuticas objetivo que comprenden un péptido espaciador diferente son usadas para experimentación adicional.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal en un sujeto que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende una proteína de fusión que comprende una enzima lisosomal, una etiqueta de péptido que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro y un péptido espaciador localizado entre la secuencia de aminoácido de la enzima lisosomal y la etiqueta del péptido IGF-II. En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGPS (SEC ID NO: 14) o GGGSP (SEC ID NO: 15), y opcionalmente además comprende una o más de (i) GAP (SEC ID NO: 9), (ii) GGGGS (SEC ID NO: 12), (iii) GGGS (SEC ID NO: 16), (iv) AAAAS (SEC ID NO: 17), (v) AAAS (SEC ID NO: 18), (vi) PAPA (SEC ID NO: 19), (vii) TPAPA (SEC ID NO: 20), (viii) AAAKE (SEC ID NO: 21) o (ix) GGGGA (SEC ID NO: 60).
En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de: (GGGGS)n (SEC ID NOs: 12, 56, 58, 91-94) , (GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 36, 95-100), GAP- (GGGGS ) n-GGGPS ( SEC ID NOs : 101-107), GAP- (GGGGS) n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs : 37, 108-113) , GAP- (GGGGS) n-GGGPS- (GGGGS) n-GAP (SEC ID NOs : 114-162), GAP-GGGPS- (GGGGS ) n-GAP (SEC ID NOs: 163-169), GAP- (GGGGS) n-AAAAS-GGGPS- (GGGGS) n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 170- 218), GAP- (GGGGS) n-PAPAP- (Xaa) n-GAP (SEC ID NOs: 219-267), GAP- (GGGGS) n-PAPAPT- (Xaa) n-GAP (SEC ID NOs: 268-316), GAP- ( GGGGS) n- (Xaa) n-PAPAP- (Xaa) n- (AAAKE) n- (Xaa) n- (GGGGS) n-GAP (SEC ID NOs: 544-551), ( GGGGA) n (SEC ID NOs: 60, 79, 81, 317-320) , (GGGGA) n-GGGPS (SEC ID NOs : 321-326), GAP- (GGGGA) n-GGGPS (SEC ID NOs: 327-333) , GAP- (GGGGA) n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 334- 340), GAP- (GGGGA) n-GGGPS- (GGGGA) n-GAP (SEC ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS- (GGGGA) n-GAP (SEC ID NOs: 390-396), GAP- (GGGGA) n- AAAAS-GGGPS- (GGGGA) n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 397-445), GAP- (GGGGA) n-PAPAP- (Xaa) n-GAP (SEC ID NOs: 446-494), GAP- (GGGGA) n-PAPAPT- (Xaa) n-GAP (SEC ID NOs: 495-543), GAP- (GGGGA) n- (Xaa) n- PAPAP- (Xaa) n- (AAAKE) n- (Xaa) n- (GGGGA) n-GAP (SEC ID NOs: 552- 559) ; en donde n es 1 a 7, opcionalmente n es 1 a 4.
En varias modalidades, el peptido espaciador tiene una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de EFGGGGSTR (SEC ID NO: 22), GAP (SEC ID NO: 9), GGGGS (SEC ID NO: 12), GPSGSPG (SEC ID NO: 23), GPSGSPGT (SEC ID NO: 24) , GPSGSPGH (SEC ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEC ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEC ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO : 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP ( SEC ID NO : 41) GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEC ID NO: 46) GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 59), GGGGA (SEC ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEC ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEC ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)8GGGPSH] (SEC ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)sGGGPS] (SEC ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)sGGGPSH] (SEC ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEC ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEC ID NO: 89), y GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 90).
En varias modalidades, el péptido espaciador tiene una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
En varias modalidades, el péptido espaciador tiene una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
Enfermedades de almacenamiento lisosomal ejemplares contempladas por los métodos en la presente incluyen aquellas expuestas en la Tabla 1. Se contempla que la enfermedad de almacenamiento lisosomal sea tratada usando una proteina de fusión terapéutica objetivo que comprende la enzima deficiente en la enfermedad de almacenamiento lisosomal, también descrita en la Tabla 1.
En varias modalidades, la invención proporciona un método para tratar Mucopolisacaridosis Tipo IIIB (Síndrome de Sanfilippo B) en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende una proteina de fusión que comprende una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica a la proteina humana a-N-acetilglucosaminidasa (Naglu) (SEC ID NO: 1), una etiqueta de péptido que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro y un péptido espaciador localizado entre la secuencia de aminoácido Naglu y la etiqueta del péptido IGF-II. En varias modalidades, el espaciador comprende la secuencia de aminoácido GAP (SEC ID NO: 9), GPS (SEC ID NO: 10), o GGS (SEC ID NO: 11).
En varias modalidades, la secuencia espad adora comprende los aminoácidos Gly-Pro-Ser (GPS) (SEC ID NO: 10) entre los aminoácidos de IGF-II humano maduro y los aminoácidos de Naglu humano.
En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGGS (SEC ID NO: 12) o GGGS (SEC ID NO: 16). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGPS (SEC ID NO: 14) o GGGSP (SEC ID NO: 15). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido AAAAS (SEC ID NO: 17) o AAAS (SEC ID NO: 18). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido PAPA (SEC ID NO: 19) o TPAPA (SEC ID NO: 20). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido AAAKE (SEC ID NO: 21). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGGA (SEC ID NO: 60).
En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de: (GGGGS)n (SEC ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEC IDNOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 163-169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 170- 218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 219-267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 268-316), GAP- (GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 544-551), (GGGGA)n (SEC ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 334- 340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n- AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 397-445), GAP- (GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n- PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 552- 559); en donde n es 1 a 7, opcionalmente en donde n es 1 a 4.
En varias modalidades, la invención proporciona un método para reducir los niveles de glicosaminoglicano (GAG) in vivo que comprende administrar a un sujeto que sufre de Mucopolisacaridosis Tipo IIIB (Síndrome de Sanfilippo B) una cantidad efectiva de una proteína de fusión que comprende i) una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica a la proteina humana a-N-acetilglucosaminidasa (Naglu) (SEC ID NO: 1), ii) una etiqueta de péptido que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro, y iii) un péptido espaciador localizado entre la secuencia de aminoácido Naglu y la etiqueta del péptido IGF-II.
En varias modalidades, la secuencia espad adora comprende una o más copias de aminoácidos Gly-Ala-Pro (GAP) (SEC ID NO: 9) entre los aminoácidos de IGF-II humano maduro los aminoácidos de Naglu humano.
En varias modalidades, el péptido espaciador se selecciona a partir del grupo que consiste de EFGGGGSTR (SEC ID NO: 22), GAP (SEC ID NO: 9), GGGGS (SEC ID NO: 12), GPSGSPG (SEC ID NO: 23), GPSGSPGT (SEC ID NO: 24), GPSGSPGH (SEC ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEC ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEC ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 59), GGGGA (SEC ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEC ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEC ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 72) GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)8GGGPSH] (SEC ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)oGGGPSH] (SEC ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEC ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEC ID NO: 89), y GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 90).
En varias modalidades, el péptido espaciador se selecciona a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTE SEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
En varias modalidades, el péptido espaciador se selecciona a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
En varias modalidades, el dominio de objetivo lisosomal o etiqueta de péptido IGF-II comprende los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro (SEC ID NO: 2, 4). En varias modalidades, la etiqueta de péptido IGF-II comprende una mutación en el residuo Arg37. En varias modalidades, la mutación es una sustitución de alanina por arginina. En varias modalidades, el dominio de objetivo lisosomal o etiqueta de péptido IGF-II comprende IGF2 D8-67 R37A.
En varias modalidades, la proteina de fusión comprende aminoácidos 1-743 de Naglu humano (SEC ID NO: 1, 3). En varias modalidades, la proteina de fusión comprende aminoácidos 24-743 de Naglu humano.
En varias modalidades, la cantidad efectiva de proteina de fusión está en el intervalo de aproximadamente 0.1-1 mg/kg, aproximadamente 1-5 mg/kg, aproximadamente 2.5-20 mg/kg, aproximadamente 5-20 mg/kg, aproximadamente 10-50 mg/kg, o 20-100 mg/kg de peso corporal del sujeto. En varias modalidades, la cantidad efectiva de proteina de fusión es aproximadamente 2.5-20 mg por kilogramo de peso corporal del sujeto.
En varias modalidades, la proteina de fusión es administrada intratecalmente, intravenosamente, intramuscularmente, parenteralmente, transdermalmente, o transmucosalmente. En varias modalidades, la proteina de fusión es administrada intratecalmente. En varias modalidades, la administración intratecal opcionalmente además comprende administrar la proteina de fusión intravenosamente.
En varias modalidades, la administración intratecal comprende introducir la proteina de fusión en un ventrículo cerebral, área lumbar o cisterna magna.
En varias modalidades, la proteína de fusión es administrada bimensualmente, mensualmente, trisemanalmente, bisemanalmente, semanalmente, diariamente, o a intervalos variables.
En varias modalidades, el tratamiento resulta en reducir los niveles de glicosaminoglicano (GAG) en un tejido cerebral. Además se contempla que el tratamiento resulta en reducir los gránulos de almacenamiento lisosomal en un tejido cerebral.
También están contempladas composiciones que comprenden las proteínas de fusión terapéutica objetivo como se describe en la presente para uso en el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosomal. Enfermedades de almacenamiento lisosomal ejemplares incluyen aquellas expuestas en la Tabla 1.
Otras características, objetos y ventajas de la presente invención son aparentes en la descripción detallada que sigue. Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada, mientras indica modalidades de la presente invención, está dada por medio de ilustración solamente, sin limitación. Varios cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención llegarán a ser aparentes para aquellos expertos en la téenica a partir de la descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Los dibujos son para propósitos de ilustración solamente, no para limitación.
Las Figuras 1A Y IB representan las secuencias de aminoácido de una porción de una proteina de fusión terapéutica ejemplar que comprende (Fig.1A) Naglu y (Fig. IB) un péptido IGF-II que comprende los residuos 8-67 de IGF-II y que tiene una sustitución de aminoácido en el residuo 37, R37A (Arg37Ala).
Las Figuras 2A y 2B representan las secuencias de nucleótido de una porción de una proteina de fusión terapéutica ejemplar que comprende (Fig.2A) Naglu y (Fig.2B) un péptido IGF-II que comprende los residuos 8-67 de IGF-II y que tiene una sustitución de aminoácido en el residuo 37, R37A (Arg37Ala) .
La Figura 3 describe secuencias espadadoras ejemplares contempladas para uso en la proteína de fusión terapeutica .
DEFINICIONES Alivio: Como se usa en la presente, el término "alivio" significa la prevención, reducción o paliación de un estado o mejoramiento del estado de un sujeto. Alivio incluye, pero no requiere recuperación completa o prevención completa de una condición de enfermedad. En algunas modalidades, alivio incluye reducción de materiales acumulados dentro de los lisosomas de tejidos de enfermedades relevantes.
Muteína IGF-II resistente a f urina : Como se usa en la presente, el término "muteína IGF-II resistente a furina" se refiere a un péptido a base de IGF-II que contiene una secuencia de aminoácido alterada que abóle al menos un sitio de desdoblamiento de proteasa furina nativa o cambia un cierre de secuencia o adyacente a un sitio de desdoblamiento de proteasa furina nativa de manera que el desdoblamiento de furina es prevenido, inhibido, reducido o retardado comparado con un péptido IGF-II humano de tipo nativo. Como se usa en la presente, una muteína IGF-II resistente a furina es también referida como una muteina IGF-II que es resistente a furina.
Sitio de desdoblamiento de proteasa f urina : Como se usa en la presente, el término "sitio de desdoblamiento de proteasa furina" (también referido como "sitio de desdoblamiento de furina" o "secuencia de desdoblamiento de furina") se refiere a la secuencia de aminoácido de un péptido o proteina que sirve como una secuencia de reconocimiento para desdoblamiento de proteasa enzimática por furina o proteasas similares a furina. Típicamente, un sitio de desdoblamiento de proteasa furina tiene una secuencia consenso Arg-X-X-Arg (SEC ID NO: 6), X es cualquier aminoácido. El sitio de desdoblamiento es posicionado después del residuo arginina (Arg) carboxi-terminal en la secuencia. En algunas modalidades, un sitio de desdoblamiento de furina puede tener una secuencia consenso Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg (SEC ID NO: 7), X es cualquier aminoácido. El sitio de desdoblamiento es posicionado después del residuo arginina (Arg) carboxi-terminal en la secuencia.
Furina : Como se usa en la presente, el término "furina" se refiere a cualquier proteasa que puede reconocer y desdoblar el sitio de desdoblamiento de proteasa furina como se define en la presente, incluyendo furina o proteasa similar a furina. Furina es también conocida como enzima de desdoblamiento de aminoácido básico apareado (PACE). La Furina pertenece a la familia de convertasa de proproteina similar a subtilisina. El gen que codifica a furina se conoce como FUR (Región Corriente arriba FES).
Celulas deficientes de furina : Como se usa en la presente, el término "células deficientes de furina" se refiere a cualquiera de las células cuya actividad de proteasa furina es inhibida, reducida o eliminada. Células deficientes de furina incluyen tanto células de mamífero como no mamífero que no producen furina o producen cantidad reducida de furina o proteasa de furina defectiva.
Objetivo Lisosomal Independiente de la Glicosilación : Como se usa en la presente, el término "Objetivo Lisosomal Independiente de la Glicosilación" (también referido como "GILT") se refiere a objetivo lisosomal que es independiente de manosa-6-fosfato.
Alfa-N-acetilglucosaminidasa humana : Como se usa en la presente, el término "alfa-N-acetilglucosaminidasa humana" (también referido como "Naglu") se refiere a un precursor (es decir, que contiene la secuencia de péptido señal Naglu nativo) o forma de tipo nativa procesada (es decir, que carece de la secuencia de péptido señal Naglu nativo) de alfa-N-acetilglucosaminidasa humana, o un fragmento funcional o variante de la misma, que es capaz de reducir los niveles de glicosaminoglicano (GAG) en lisosomas de mamífero o que puede rescatar o aliviar uno o más síntomas de MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B). Como se usa en la presente, el término "funcional" como se refiere a Naglu se refiere a una enzima Naglu que es capaz de ser tomada por lisosomas de mamífero y que tiene suficiente actividad enzimática para reducir el material de almacenamiento, es decir, glicosaminoglicano (GAG), en el lisosoma de mamífero.
Muteína IGF-II: Como se usa en la presente, el término "muteína IGF-II" se refiere a un péptido a base de IGF-II que contiene una secuencia de aminoácido alterada. Como se usa en la presente, el término "muteína IGF-II resistente a furina" se refiere a un péptido a base de IGF-II que contiene una secuencia de aminoácido alterada que abóle al menos un sitio de desdoblamiento de proteasa furina nativa o cambia un cierre de secuencia o adyacente a un sitio de desdoblamiento de proteasa furina nativa de manera que el desdoblamiento de furina se previene, inhibe, reduce o retarda comparado con un péptido IGF-II humano de tipo nativo. Como se usa en la presente, una muteína IGF-II resistente a furina es también referida como una muteína IGF-II que es resistente a furina.
Mejora , incrementa , o reduce: Como se usa en la presente, los términos "mejora," "incrementa" o "reduce," o equivalentes gramaticales, indican valores que están con relación a una medición de valor de referencia, tal como una medición en el mismo individuo previo al inicio del tratamiento descrito en la presente, o una medición en un individuo de control (o individuos de control múltiple) en la ausencia del tratamiento descrito en la presente. Un "control individual" es un individuo afligido con la misma forma de enfermedad de almacenamiento lisosomal (por ejemplo, MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B)) conforme el individuo es tratado, quien es aproximadamente de la misma edad como el individuo a ser tratado (para asegurar que las etapas de la enfermedad en el individuo tratado y los individuos de control son comparables).
Individuo , sujeto , paciente: Como se usa en la presente, los términos "sujeto," "individuo" o "paciente" se refiere a un sujeto mamífero humano o no humano. El individuo (también referido como "paciente" o "sujeto") siendo tratado es un individuo (feto, infante, niño, adolescente, o adulto humano) que sufre de una enfermedad de almacenamiento lisosomal, por ejemplo, MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B) (es decir, ya sea de tipo infantil-, juvenil-, o de comienzo en adulto o severo/clásico o tipo MPS IIIB atenuado (Síndrome de Sanfilippo B)) o que tiene el potencial para desarrollar una enfermedad de almacenamiento lisosomal (por ejemplo, MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B)).
Enfermedades de almacenamiento lisosomal : Como se usa en la presente, "enfermedades de almacenamiento lisosomal" se refiere a un grupo de trastornos genéticos que resulta de deficiencia en al menos una de las enzimas (por ejemplo, hidrolasas de ácido) que son requeridas para romper macromoléculas a péptidos, aminoácidos, monosacáridos, ácidos nucleicos y ácidos grasos en lisosomas. Como un resultado, individuos que sufren de enfermedades de almacenamiento lisosomal tienen materiales acumulados en lisosomas. Enfermedades de almacenamiento lisosomal ejemplares son listadas en la Tabla 1.
Enzima lisosomal : Como se usa en la presente, el término "enzima lisosomal" se refiere a cualquier enzima que es capaz de reducir materiales acumulados en lisosomas de mamífero o que pueden rescatar o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad de almacenamiento lisosomal. Las enzimas lisosomales adecuadas para la invención incluyen enzimas lisosomales tanto modificadas o de tipo nativo y pueden ser producidas usando métodos sintéticos y recombinantes o purificadas de fuentes naturales. Enzimas lisosomales ejemplares son listadas en la Tabla 1.
Espaciador: Como se usa en la presente, el término "espaciador" (también referido como "enlazador") se refiere a una secuencia de péptido entre dos porciones de proteína en una proteína de fusión. Un espaciador es en general diseñado para ser flexible o para interponer una estructura, tal como una hélice alfa, entre dos porciones de proteína. Un espaciador puede ser relativamente corto, tal como por ejemplo, la secuencia Gly-Ala-Pro (GAP) (SEC ID NO: 9), Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS) (SEC ID NO: 12), Gly-Gly-Gly-Gly-Ala (GGGGA) (SEC ID NO: 60) o Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro (GGGGGP) (SEC ID NO: 13), o puede ser más largo, tal como, por ejemplo, 10-25 aminoácidos en longitud, 25-50 aminoácidos en longitud o 35-55 aminoácidos en longitud. Secuencias espaciadoras ejemplares son descritas en mayor detalle en la Descripción Detallada.
Cantidad terapeuticamente efectiva : Como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de una proteina de fusión terapéutica objetivo la cual confiere un efecto terapéutico en el sujeto tratado, a una relación de riesgo/beneficio razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, medible por alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el objeto da una indicación de una sensación de un efecto). En particular, la "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad de una proteina de fusión terapéutica o composición efectiva para tratar, aliviar, o prevenir una enfermedad o condición deseada, o para exhibir un efecto terapéutico o prevenible detectable, tal como aliviando sintomas asociados con la enfermedad, prevenir o retardar el comienzo de la enfermedad, y/o también disminuir la severidad o frecuencia de síntomas de la enfermedad. Una cantidad terapéuticamente efectiva es comúnmente administrada en un régimen de dosificación que puede comprender dosis unitarias múltiples. Para cualquier proteina de fusión terapéutica particular, una cantidad terapéuticamente efectiva (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación efectivo) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la ruta de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. También, la cantidad terapéuticamente efectiva especifica (y/o dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno a ser tratado y la severidad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico especifico empleado; la composición especifica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el tiempo de administración, ruta de administración, y/o frecuencia de excreción o metabolismo de la proteina de fusión especifica empleada; la duración del tratamiento; y factores como son bien conocidos en las artes médicas.
Tratamiento: Como se usa en la presente, el término "tratamiento" (también "trata" o "tratar") se refiere a cualquier administración de una proteina de fusión terapéutica o composición farmacéutica que comprende tal proteina de fusión terapéutica que parcialmente o completamente alivia, mejora, conforta, inhibe, retarda el comienzo de, reduce la severidad de y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o condición particular. Tal tratamiento puede ser de un sujeto quien no presenta signos de la enfermedad, trastorno y/o condición relevante y/o de un sujeto quien exhibe solamente signos tempranos de la enfermedad, trastorno, y/o condición. Alternativamente o adicionalmente, tal tratamiento puede ser de un sujeto quien exhibe uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o condición relevante. Por ejemplo, el tratamiento puede ser referido a mejoramiento del estado cardiaco (por ejemplo, incremento de volúmenes de término diastólico y/o término sistólico, o reducción, alivio o prevención de la cardiomiopatía progresiva que es típicamente encontrada en, por ejemplo, enfermedad de Pompe) o de función pulmonar (por ejemplo, incremento en capacidad vital del llanto sobre la capacidad de valor de referencia, y/o normalización de desaturación de oxígeno durante el llanto); mejoramiento en el neurodesarrollo y/o habilidades motoras (por ejemplo, incremento en el registro AIMS); reducción de niveles de almacenamiento (por ejemplo, glicosaminoglicano (GAG), en el tejido del individuo afectado por la enfermedad; o cualquier combinación de estos efectos. En algunas modalidades, el tratamiento incluye mejoramiento de la separación de glicosaminoglicano (GAG), particularmente en la reducción o prevención de síntomas neuronales asociados con MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B).
Como se usa esta solicitud, los términos "alrededor" y "aproximadamente" son usados como equivalentes. Cualesquiera de los números usados en esta solicitud con o sin alrededor/aproximadamente están significando cubrir cualquiera de las fluctuaciones normales apreciadas por uno de habilidad ordinaria en la téenica relevante.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones mejoradas para dirigir enzimas lisosomales con base en la tecnología de objetivo lisosomal independiente de la glicosilación (GILT). Entre otras cosas, la presente invención proporciona muteínas IGF-II que son resistentes a furina y/o tienen afinidad de unión disminuida o reducida para el receptor de insulina, y/o tienen afinidad de unión disminuida o reducida para el receptor IGF-I y proteínas de fusión terapéutica objetivo que contienen una muteína IGF-II de la invención. La presente invención también proporciona métodos para elaborar y usar la misma.
Varios aspectos de la invención se describen en detalle en las siguientes secciones. El uso de secciones no está significando limitar la invención. Cada sección puede aplicar a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se declare de otro modo.
Enzimas lisosomales Una enzima lisosomal adecuada para la invención incluye cualquier enzima que es capaz de reducir materiales acumulados en lisosomas de mamífero o que puede rescatar o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad de almacenamiento lisosomal. Las enzimas lisosomales adecuadas incluyen tanto enzimas lisosomales modificadas o de tipo nativo y pueden ser producidas usando métodos recombinantes o sintéticos o purificados de fuentes naturales. Enzimas lisosomales ejemplares son listadas en la Tabla 1.
Tabla 1. Enfermedades de almacenamiento lisosomal y defectos enzimáticos asociados algunas modalidades, una enzima lisosomal contemplada en la presente incluye una secuencia de polipéptido que tiene 50-100%, que incluye 50%, 55%, 60%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de polinucleótido que se origina naturalmente de una enzima humana mostrada en la Tabla 1, mientras todavía codifica una proteína que es funcional, es decir, capaz de reducir materiales acumulados, por ejemplo, glicosaminoglicano (GAG), en lisosomas de mamíferos o que puede rescatar o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad de almacenamiento lisosomal.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácido" con respecto a las secuencias de enzimas lisosomales es definido como el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos de aminoácido en la secuencia de enzima humana que se origina naturalmente, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje de identidad de secuencia máximo, y sin considerar algunas sustituciones conservativas como parte de la identidad de secuencia. La alineación para propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácido se pude lograr en varias formas que están dentro del experto en la téenica, por ejemplo, usando software de computadora públicamente disponible tal como software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Aquellos expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, que incluyen cualquiera de los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias a ser comparadas. Preferiblemente, el software WU-BLAST-2 es usado para determinar la identidad de secuencia de aminoácido (Altschul et al . , Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996). WU-BLAST-2 usa varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales son ajustados a los valores de falta. Los parámetros ajustables son expuestos dentro de los siguientes valores: trayecto de traslape=l, fracción de traslape=0.125, umbral de palabra (T)=ll. Los parámetros de registro HSP (S) y HSP S2 son valores dinámicos y son establecidos por el programa mismo, dependiendo de la composición de la secuencia particular, sin embargo, los valores mínimos pueden ser ajustados y son ajustados como se indica anteriormente.
Alfa-N-Acetilglucosaminidasa Alfa-N-acetilglucosaminidasa, Naglu, es producida como una molécula precursora que es procesada a una forma madura. Este proceso en general ocurre removiendo el péptido señal de 23 aminoácidos conforme la proteína entre al retículo endoplásmico. Típicamente, la forma precursora es también referida como proteína Naglu de longitud completa o precursor de longitud completa, la cual contiene 743 aminoácidos (SEC ID NO: 1). Los 23 aminoácidos N-terminales son desdoblados conforme la proteína precursora entra al retículo endoplásmico, resultando en una forma procesada o madura. De este modo, se contempla que los 23 aminoácidos N-terminales no son en general requeridos para la actividad de la proteína Naglu. Las secuencias de aminoácido de la forma madura y forma precursora de longitud completa de una proteína Naglu humana que se origina naturalmente o de tipo nativo típica se muestran en la Figura 1A y exponen en la SEC ID NO: 1. La secuencia de nucleótido de la región codificante de Naglu humano se expone en la SEC ID NO: 3. La secuencia de ARNm de Naglu humano se describe en el Acceso a Genbank número NM_000263. En varias modalidades, el Naglu es Naglu humano, con (aminoácidos 1-743) o sin (aminoácidos 24-743) secuencia de señal.
La Patente Estadounidense No. 6,255,096 describe que el peso molecular de alfa-N-acetilglucosaminidasa humana purificada (es decir 82 kDa y 77 kDa) y alfa-N-acetilglucosaminidasa de mamífero recombinante producidas en células CHO (es decir 89 kDa y 79 kDa) son mayores que el peso molecular deducido del polipéptido Naglu (es decir 70 kDa), sugiriendo que los polipéptidos purificado y recombinante son modificados post-traduccionalmente. Véase también Weber et al., Hum Mol Genet 5:771-777, 1996.
Macopolisacaxidosis III B (Síndrome de Sanfilippo B) Una enfermedad de almacenamiento lisosomal ejemplar es la enfermedad de Mucopolisacaridosis III B (MPS IIIB), también conocida como Síndrome de Sanfilippo Tipo B. La MPS IIIB, Síndrome de Sanfilippo B, es un trastorno genético recesivo autosomal raro que es caracterizado por una deficiencia de la enzima alfa-N-acetil-glucosaminidasa (Naglu). En la ausencia de esta enzima, los glicosaminoglicanos (GAG), por ejemplo el heparan sulfato GAG, y moléculas GAG parcialmente degradadas no pueden ser separadas del cuerpo y se acumulan en lisosomas de varios tejidos, resultando en disfunción somática de dispersión progresiva (Kakkis et al., N Engl J Med.344 (3):182-8, 2001). Se ha mostrado que las GAGs se acumulan en los lisosomas de neuronas y células gliales, con menor acumulación fuera del cerebro.
Cuatro formas distintas de MPS III, designadas MPS IIIA, B, C, y D, han sido identificadas. Cada una representa una deficiencia en una de cuatro enzimas involucradas en la degradación de heparan sulfato GAG (Tabla 1). Todas las formas incluyen grados variantes de los mismos síntomas clínicos, que incluyen características faciales gruesas, hepatoesplenomegalia, turbidez corneal y deformidades del esqueleto. Más notablemente, sin embargo, es la pérdida severa y progresiva de capacidad cognitiva, la cual está ligada no solamente a la acumulación de heparan sulfato en neuronas, sino también a la elevación subsecuente de los gangliósidos GM2, GM3 y GD2 causados por la acumulación de GAG primario (Walklcy et al., Ann N Y Acad Sci. 845:188-99,1998).
Un factor clínico característico del Síndrome de Sanfilippo B es la degeneración del sistema nervioso central (CNS), el cual resulta en pérdida de, o falla para lograr, principales hitos del desarrollo. El decline cognitivo progresivo culmina en demencia y mortalidad prematura. La enfermedad típicamente se manifiesta la misma en niños jóvenes, y el trayecto de vida de un individuo afectado en general no se extiende más allá del final de la adolescencia hasta principios de los veinte.
La enfermedad de MPS III tiene síntomas similares que típicamente se manifiestan en niños jóvenes. Los infantes afectados son aparentemente normales, aunque algún dismorfismo facial leve puede ser notable. Las articulaciones rígidas, cabello grueso y asperezas típicas de otros mucopolisacaridosis usualmente no están presentes hasta después en la enfermedad. Después de un intervalo inicial libre de síntomas, los pacientes usualmente presentes con una disminución del desarrollo y/o problemas de comportamiento, seguido por decline intelectual progresivo resultan en demencia severa y enfermedad motora progresiva. La adquisición del habla es a menudo lenta e incompleta. La enfermedad progresa para incrementar la alteración del comportamiento que incluye berrinches, hiperactividad, destructividad, comportamiento agresivo, alteraciones de pica (o ingestión de sustancias no comestibles) y sueño. Como los niños afectados tienen resistencia muscular normal y movilidad, las alteraciones del comportamiento son muy difíciles de dañar. En la fase final de la enfermedad, los niños llegan a ser cada vez más inmóviles e insensibles, a menudo requieren sillas de ruedas, y desarrollan dificultades para tragar y ataques. El trayecto de vida de un niño afectado usualmente no se extiende más allá de finales de la adolescencia hasta principios de los veinte.
Una enzima alfa-N-acetilglucosaminidasa adecuada para tratar MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B) incluye una alfa-N-acetilglucosaminidasa humana de tipo nativa (SEC ID NO: 1 o 3), o un fragmento funcional o variante de secuencia del mismo el cual retiene la capacidad para ser tomado en lisosomas de mamífero e hidrolizar enlaces 1,4-alfa en el residuo N-acetil-D-glucosamina terminal en oligosacáridos lineales.
La eficacia del tratamiento de MPS IIIB (Síndrome de Sanfilippo B) usando proteínas de fusión terapéutica objetivo recombinante como se describe en la presente puede ser medida usando téenicas conocidas en el arte, así como también por análisis de biomarcadores lisosomales y neuronales. Experimentos iniciales son conducidos en animales agénicos Naglu (véase Li et al., Proc Nati Acad Sci USA 96:14505-510, 1999). Agénicos de Naglu están presentes con grandes cantidades de heparan sulfato en el hígado y riñón y elevación de gangliósidos en el cerebro.
Los ensayos incluyen análisis de la actividad de y distribución de la enzima exógena, reducción del almacenamiento GAG en los lisosomas, particularmente en células cerebrales, y activación de astrocitos y microglia. Los niveles de varios biomarcadores neuronales o lisosomales incluyen, pero no se limitan a, proteína 1 de la membrana asociada lisosomal (LAMP1), glipicano, gangliósidos, colesterol, Subunidad c de Sinatasa ATP Mitocondrial (SCMAS), ubiquitina, P-GSK3b, beta amiloide y P-tau. Los análisis de comportamiento y supervivencia también se realizan usando técnicas conocidas en el campo.
Experimentos han mostrado que la Subunidad c de la proteína Sintasa ATP Mitocontrial se acumula en los lisosomas de animales MPS IIIB (Ryazantsev et al., Mol Genet Metab. 90(4): 393-401, 2007). LAMP-1 y GM130 también han mostrado ser elevados en animales MPS IIIB (Vitry et al., Am J Pathol. 177(6):2984-99, 2010).
En varias modalidades, el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosomal se refiere un almacenamiento lisosomal disminuido (por ejemplo, de GAG) en varios tejidos. En varias modalidades, el tratamiento se refiere a almacenamiento lisosomal disminuido en tejidos objetivo cerebrales, neuronas de médula espinal, y/o tejidos de objetivo periférico. En ciertas modalidades, el almacenamiento lisosomal es disminuido por aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% o más comparado con un control. En varias modalidades, el almacenamiento lisosomal es disminuido por al menos 1-vez, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces, 10-veces o más comparado con un control.
En varias modalidades, el tratamiento se refiere a la actividad enzimática incrementada en varios tejidos. En varias modalidades, el tratamiento se refiere a actividad enzimática incrementada en tejidos objetivo cerebrales, neuronas de la médula espinal y/o tejidos objetivo periféricos. En varias modalidades, la actividad enzimática se incrementa por aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 1000% o más comparada con un control. En varias modalidades, la actividad enzimática se incrementa por al menos 1-veces, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces, 10-veces o más comparado con un control. En varias modalidades, la actividad enzimática incrementada es al menos aproximadamente 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg o más. En varias modalidades, la enzima lisosomal es Naglu.
Terapia de Reemplazo de Enzima La terapia de reemplazo de enzima (ERT) es una estrategia terapéutica para corregir una deficiencia de enzima infusionando la enzima perdida en la corriente sanguínea. Como la sangre perfunde los tejidos del paciente, la enzima es tomada por las células y transportada al lisosoma, donde la enzima actúa para eliminar material que se ha acumulado en los lisosomas debido a la deficiencia de enzima. Para que terapia de reemplazo lisosomal de la enzima sea efectiva, la enzima terapéutica debe ser suministrada a lisosomas en las células apropiadas en tejidos donde el defecto de almacenamiento es manifiesto. Los terapéuticos de reemplazo lisosomal de enzima convencional son suministrados usando carbohidratos naturalmente unidos a la proteína para acoplar receptores específicos en la superficie de las células objetivo. Un receptor, el receptor M6P independiente del catión (CI-MPR), es particularmente útil para dirigir el reemplazo de enzimas lisosomales debido a que el CI-MPR está presente en la superficie de la mayoría de los tipos de células.
Los términos "receptor de manosa-6-fosfato independiente del catión (CI-MPR)," "receptor M6P/IGF-II" "receptor CI-MPR/IGF-II" "receptor IGF-II" o "receptor IGF2" o abreviaturas de los mismos, son usados intercambiablemente en la presente, con referencia al receptor celular el cual se une a tanto M6P como IGF-II.
Terapia de Combinación para Tolerar Sujetos a Terapia de Reemplazo de Enzima Se ha encontrado que durante la administración de de agentes tales como proteínas recombinantes y otros agentes terapéuticos, un sujeto puede montar una respuesta inmune contra estos agentes, conduciendo a la producción de anticuerpos que se unen e interfieren con la actividad terapéutica así como también provocan reacciones inmunológicas agudas o crónicas. Este problema es más significante para terapéuticos de proteina debido a que las proteínas son antígenos complejos y en muchos casos, el sujeto es inmunológicamente naive a los antigenos. De este modo, en ciertos aspectos de la presente invención, puede ser útil proporcionar el sujeto que recibe la enzima terapéutica tolerante a la terapia de reemplazo de enzima. En este contexto, la terapia de reemplazo de enzima puede ser dada al sujeto como una terapia de combinación con un régimen tolerante.
La patente Estadounidense 7,485,314 (incorporada en la presente por referencia) describe el tratamiento de trastornos de almacenamiento lisosomal usando inducción de tolerancia inmune. Brevemente, el uso de tal régimen de tolerancia puede ser útil para prevenir al sujeto de montar una respuesta inmune a la terapia de reemplazo de la enzima y de este modo disminuir o de otro modo proporcionar inefectivo los efectos benéficos potenciales de la terapia de reemplazo de enzima.
En un método, la invención contempla reducir o prevenir una respuesta inmune especifica del antigeno clínicamente significante a la proteína de fusión terapéutica recombinante, por ejemplo, que comprende Naglu, usada para tratar un trastorno de almacenamiento lisosomal, por ejemplo mucopolisacaridosis IIIB (MPS IIIB o Síndrome de Sanfilippo B), donde la proteína de fusión es administrada intratecalmente. El método emplea un régimen inicial de 30-60 días de un agente inmunosupresor de células-T tal como ciclosporina A (CsA) y un agente antiproliferativo, tal como, azatioprina (Aza), combinado con infusiones intratecales semanales de dosis bajas de la enzima, por ejemplo, Naglu. La respuesta IgG fuerte típica a infusiones semanales de la enzima llega a ser mayormente reducida o prevenida usando un régimen de 60 dias de fármacos inmunosupresores, ciclosporina A (CsA) y azatioprina (Aza), combinado con infusiones intratecales o intravenosas semanales de bajas dosis de proteina de fusión que comprende la enzima. Usando tales regímenes tolerantes, será posible proporcionar al sujeto tolerante a dosis terapéuticas superiores de proteína de fusión terapéutica por hasta 6 meses sin un incremento en el titulador de anticuerpo contra Naglu, o sin embargo cualquier otra enzima que podría ser usada para el reemplazo de la enzima de una enfermedad de almacenamiento lisosomal. Tales regímenes de tolerancia han sido descritos en la Patente Estadounidense No.7,485,314.
Glicosilación Independiente del Objetivo Lisosomal Se desarrolló una Teenología de Objetivo Lisosomal Independiente de la Glicosilación (GILT) para dirigir enzimas terapéuticas a lisosomas. Específicamente, la tecnología GILT usa una etiqueta de péptido en lugar de M6P para acoplarse a CI-MPR para objetivo lisosomal. Típicamente, una etiqueta GILT es una proteína, péptido u otra porción que se une al CI-MPR en una manera independiente de manosa-6-fosfato. Ventajosamente, esta tecnología imita el mecanismo biológico normal para absorción de enzimas lisosomales, todavía haciéndolo en una manera independiente de manosa-6-fosfato.
Una etiqueta GILT preferida es derivada del factor II de crecimiento similar a la insulina humana (IGF II). El IGF-II humano es un ligando de alta afinidad para el CI-MPR, el cual es también referido como receptor IGF-II. La unión de enzimas terapéuticas de etiqueta GILT al receptor M6P/IGF-II dirige la proteína al lisosoma vía la trayectoria endocitica. Este método tiene numerosas ventajas sobre métodos que involucran glicosilación que incluye simplicidad y efectividad en costo, debido a que una vez que la proteína es aislada, no se necesitan hacer modificaciones adicionales.
Descripción detallada de la teenología GILT y etiqueta GILT se puede encontrar en las Publicaciones Estadounidenses Nos.20030082176, 20040006008, 20040005309, y 20050281805, las enseñanzas de todas las cuales están de este modo incorporadas por referencias en sus totalidades.
Etiqueta GILT Resistente a Furina Durante el curso del desarrollo de enzimas lisosomales de etiqueta GILT para tratar enfermedad de almacenamiento lisosomal, ha llegado a ser aparente que la etiqueta GILT derivada de IGF-II puede ser sometida a desdoblamiento proteolítico por furina durante la producción en células de mamífero (véase la sección de ejemplos). La proteasa de furina típicamente reconoce y desdobla un sitio de desdoblamiento que tiene una secuencia consenso Arg-X-X-Arg (SEC ID NO: 6), X es cualquier aminoácido. El sitio de desdoblamiento es posicionado después del residuo arginina (Arg) carboxi-terminal en la secuencia. En algunas modalidades, a sitio de desdoblamiento de furina tiene una secuencia consenso Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg (SEC ID NO: 7), X es cualquier aminoácido. El sitio de desdoblamiento es posicionado después del residuo arginina (Arg) carboxi-terminal en la secuencia. Como se usa en la presente, el término "furina" se refiere a cualquier proteasa que puede reconocer y desdoblar el sitio de desdoblamiento de proteasa furina como se define en la presente, que incluye furina o proteasa similar a furina. La furina es también conocida con enzima de desdoblamiento de aminoácido básico apareado (PACE). La furina pertenece a la familia de convertasa de proproteína similar a subtilisina que incluye PC3, una proteasa sensible de maduración de proinsulina en células isleta pancreáticas. La furina que codifica el gen se conoce como FUR (Región Corriente abajo FES).
La secuencia IGF-II de péptido humano maduro se muestra abajo.
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRjRSR†GIVEECCFR SCDLALLETYC ATPAKSE (SEC ID NO: 5) Como se puede ver, el IGF-II humano maduro contiene dos sitios de desdoblamiento de furina traslapantes potenciales entre los residuos 34-40 (en negritas y subrayado). Las flechas son insertadas en dos posiciones de desdoblamiento de furina potencial.
Las etiquetas GILT modificadas que son resistentes al desdoblamiento por furina y todavía retienen capacidad para unirse a la CI-MPR en una manera independiente de manosa-6-fosfato se describen en el documento US 20110223147. Específicamente, las etiquetas GILT resistentes a furina pueden ser diseñadas mutando la secuencia de aminoácido en uno o más sitios de desdoblamiento de furina de manera que la mutación abóle al menos un sitio de desdoblamiento de furina. De este modo, en algunas modalidades, una etiqueta GILT resistente a furina es una muteína IGF-II resistente a furina que contiene una mutación que abóle al menos un sitio de desdoblamiento de proteasa furina o cambia una secuencia adyacente al sitio de desdoblamiento de proteasa furina de manera que el desdoblamiento de furina se previene, inhibe, reduce o retarda comparado con un péptido IGF-II de tipo nativo (por ejemplo, IGF-II maduro humano de tipo nativo). Típicamente, una mutación adecuada no impacta la capacidad de la etiqueta GILT resistente a furina para unirse al receptor humano de manosa-6-fosfato independiente del catión. En particular, una muteína IGF-II resistente a furina adecuada para la invención se une al receptor humano de manosa-6- fosfato independiente del catión en una manera independiente de manosa-6-fosfato con una constante de disociación de 10~7 M o menos (por ejemplo, 10~8, 109, ÍCT10, 1011, o menos) a pH 7.4. En algunas modalidades, una muteina IGF-II resistente a furina contiene una mutación dentro de una región que corresponde a los aminoácidos 30-40 (por ejemplo, 30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 33- 39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40) de IGF-II humano maduro. En algunas modalidades, una mutación adecuada abóle al menos un sitio de desdoblamiento de proteasa furina. Una mutación pueden ser sustituciones, supresiones, inserciones de aminoácido. Por ejemplo, cualquier aminoácido dentro de la región que corresponde a los residuos 30-40 (por ejemplo, 30-40, 31-40, 32-40, 33-40, 34-40, 30-39, 31-39, 32-39, 34-37, 33-39, 34-39, 35-39, 36-39, 37-40) de la SEC ID NO:5 puede ser sustituido con cualquier otro aminoácido o suprimido. Por ejemplo, sustituciones en las posiciones 34 pueden afectar el reconocimiento de furina del primer sitio de desdoblamiento. La inserción de uno o más aminoácidos adicionales dentro de cada sitio de reconocimiento puede abolir uno o ambos sitios de desdoblamiento de furina. La supresión de uno o más de los residuos en las posiciones degeneradas puede también abolir ambos sitios de desdoblamiento de furina.
En varias modalidades, una muteina IGF-II resistente a furina contiene sustituciones de aminoácido en las posiciones que corresponden a Arg37 o Arg40 de IGF-II humano maduro. En algunas modalidades, una muteina IGF-II resistente a furina contiene una sustitución Lys o Ala en las posiciones Arg37 o Arg40. Otras sustituciones son posibles, que incluyen combinaciones de mutaciones Lys y/o Ala en ambas posiciones 37 y 40, o substituciones de aminoácidos distintos de Lys o Ala.
En varias modalidades, una muteina IGF-II adecuada para uso en la presente puede contener mutaciones adicionales. Por ejemplo, hasta 30% o más de los residuos de la SEC ID NO:l pueden ser cambiados (por ejemplo, hasta 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% o más residuos pueden ser cambiados) . De este modo, una muteina IGF-II adecuada para uso en la presente puede tener una secuencia de aminoácido al menos 70%, que incluye al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o más idéntica a IGF-II humano maduro.
En varias modalidades, una muteina IGF-II adecuada para uso en la presente es dirigida específicamente al CI-MPR. Particularmente útiles son mutaciones en el polipéptido IGF-II que resulta en una proteína que se une al CI-MPR con alta afinidad (por ejemplo, con una constante de disociación de 107M O menos a pH 7.4) mientras se une a otros receptores conocidos por estar unidos por IGF-II con afinidad reducida con relación a IGF-II naive. Por ejemplo, una muteina IGF-II resistente a furina adecuada para la invención puede ser modificada para tener afinidad de unión disminuida para el receptor IGF-I con relación a la afinidad de IGF-II humano que se origina naturalmente para el receptor IGF-I. Por ejemplo, la sustitución de residuos IGF-II Tyr 27 con Leu, Leu 43 con Val o Ser 26 con Phe disminuye la afinidad de IGF- 11 para el receptor IGF-I por 94-, 56-, y 4-veces respectivamente (Torres et al . (1995) J. Mol. Biol. 248(2):385-401). La supresión de residuos 1-7 de IGF-II humano resulta en una disminución de 30 veces en la afinidad para el receptor IGF-I humano y un incremento concomitante de 12 veces en la afinidad para el receptor IGF-II de rata (Hashimoto et al . (1995) J. Biol. Chem.270(30):18013-8). La estructura de NMR de IGF-II muestra que Thr-7 está localizado cerca de los residuos Phe-48 Phe y Ser-50 asi como también cerca del puente disulfuro Cys-9-Cys-47. Se muestra que la interacción de Thr-7 con estos residuos puede estabilizar el hexapéptido N-terminal flexible requerido para la unión al receptor IGF-I (Terasawa et al . (1994) EMBO J.13(23)5590-7). Al mismo tiempo esta interacción puede modular la unión al receptor IGF-II. La truncación del C-término de IGF-II (residuos 62-67) también parece reducir la afinidad de IGF-II para el receptor IGF-I por 5 veces (Roth et al . (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun.181(2):907-14).
Las superficies de unión para los receptores M6P independientes del catión e IGF-I están en caras separadas del IGF-II. Con base en los datos estructurales y de mutación, pueden ser construidos dominios de unión M6P independientes del catión funcionales, que son sustancialmente más pequeños que IGF-II humano. Por ejemplo, los aminoácidos amino terminales (por ejemplo, 1-7 o 2-7) y/o los residuos carboxi terminales 62-67 pueden ser suprimidos o reemplazados. Adicionalmente, los aminoácidos 29-40 pueden probablemente ser eliminados o reemplazados sin alterar el plegado del resto del polipéptido o unión al receptor M6P independiente del catión. De este modo, puede ser construida una porción objetivo que incluye aminoácidos 8-28 y 41-61. Estos estiramientos de aminoácidos podrían quizás ser unidos directamente o separados por un enlazador. Alternativamente, los aminoácidos 8-28 y 41-61 pueden ser proporcionados en cadenas de polipéptidos separados. Los dominios comparables de insulina, los cuales son homólogos a IGF-II y tienen una estructura terciaria estrechamente relacionada con la estructura de IGF-II, tienen suficiente información estructural para permitir el repliegue apropiado en la estructura terciaria apropiada, aún cuando está presente en cadenas de polipéptido separado (Wang et al . (1991) Trends Biochem. Sci. 279-281). De este modo, por ejemplo, los aminoácidos 8-28, o una variante de sustitución conservativa de los mismos, podría ser fusionada a una enzima lisosomal; la proteína de fusión resultante podría ser mezclada con los aminoácidos 41-61, o una variante de sustitución conservativa de los mismos, y administrada a un paciente.
El IGF-II puede también ser modificado para minimizar la unión a proteínas de unión IGF del suero (Baxter (2000) Am. J. Physiol Endocrinol Metab. 278(6):967-76) para evitar el secuestro de constructos IGF-II/GILT. Un número de estudios tienen residuos localizados en IGF-II necesarios para unión a las proteínas de unión IGF. Los constructos con mutaciones en estos residuos pueden ser seleccionados para retención de unión de alta afinidad al receptor M6P/IGF-II y para afinidad reducida para proteínas de unión IGF. Por ejemplo, el reemplazo de Phe-26 of IGF-II con Ser se reporta por reducir la afinidad de IGF-II para IGFBP-1 y -6 sin efecto en la unión al receptor M6P/IGF-II (Bach et al . (1993) J. Biol. Chem.268 (13):9246-54). Otras sustituciones, tales como Lys para Glu-9, pueden también ser ventajosas. Las mutaciones análogas, separadamente o en combinación, en una región de IGF-I que es altamente conservada con IGF-II resulta en gran disminución en la unión IGF-BP (Magee et al . (1999) Biochemistry 38(48):15863-70).
Un procedimiento alterno es identificar regiones mínimas de IGF-II que pueden unirse con alta afinidad al receptor M6P/IGF-II. Los residuos que han sido implicados en la unión de IGF-II al receptor M6P/IGF-II principalmente agrupada en una cara del IGF-II (Terasawa et al. (1994) EMBO J. 13 (23):5590-7). Aunque la estructura terciaria de IGF-II es normalmente mantenida por tres enlaces disulfuro intramoleculares, un péptido que incorpora la secuencia de aminoácido en la superficie de unión del receptor M6P/IGF-II de IGF-II puede ser diseñado para plegarse apropiadamente y tener actividad de unión. Tal péptido de unión mínimo es un dominio objetivo lisosomal altamente preferido. Por ejemplo, un dominio de objetivo lisosomal preferido es de aminoácidos 8-67 de IGF-II humano. Los péptidos diseñados, con base en la región alrededor de los aminoácidos 48-55, los cuales se unen al receptor M6P/IGF-II, son también dominios de objetivo lisosomal deseables. Alternativamente, una biblioteca aleatoria de péptidos puede ser seleccionada para la capacidad para unir el receptor M6P/IGF-II ya sea vía un ensayo de híbrido de dos levaduras, o vía un ensayo de tipo despliegue de fago.
Afinidad de Unión para el Receptor de Insulina Muchas muteínas de IGF-II, que incluyen la muteínas IGF-II resistentes a furina, descritas en la presente tienen afinidad de unión disminuida o reducida para el receptor de insulina. De este modo, en algunas modalidades, una etiqueta de péptido adecuada para la invención tiene afinidad de unión disminuida o reducida para el receptor de insulina con relación a la afinidad de IGF-II humano que se origina naturalmente para el receptor de insulina. En algunas modalidades, las etiquetas de péptido con afinidad de unión reducida o disminuida para el receptor de insulina adecuadas para la invención incluyen etiquetas de péptido que tienen una afinidad de unión para el receptor de insulina que es más de 1.5-veces, 2-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 6-veces, 7-veces, 8-veces, 9-veces, 10-veces, 12-veces, 14-veces, 16-veces, 18-veces, 20-veces, 30-veces, 40-veces, 50-veces, 60-veces, 70-veces, 80-veces, 90-veces, o 100-veces menos que aquella del IGF-II humano maduro de tipo nativo. La afinidad de unión para el receptor de insulina puede ser medida usando varios ensayos in vitro e in vivo conocidos en la téenica. Ensayos de unión ejemplares se describen en la sección de Ejemplos.
Matagénesls Las muteínas IGF-II pueden ser preparadas introduciendo cambios de nucleótido apropiados en el ADN de IGF-II, o por síntesis del polipéptido IGF-II deseado. Se pueden hacer variaciones en la secuencia IGF-II, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservativas y no conservativas expuestas, por ejemplo, en la Patente Estadounidense No. 5,364,934. Las variaciones pueden ser una sustitución, supresión o inserción de uno o más codones que codifican IGF-II que resulta en un cambio en la secuencia de aminoácido de IGF-II comparada con una secuencia de IGF-II humano maduro que se origina naturalmente. Las sustituciones de aminoácido pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tales como el reemplazo de una leucina con una serina, es decir , reemplazos de aminoácido conservativo. Sustituciones de aminoácido también pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas no similares, es decir, reemplazos de aminoácido no conservativo. Las inserciones o supresiones pueden opcionalmente estar en el rango de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede ser determinada haciendo sistemáticamente inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y probar las variantes resultantes para actividad en los ensayos in vivo o in vitro conocidos en la téenica (tales como ensayos de unión al CI-MPR o ensayos de desdoblamiento de furina).
Los análisis de barrido de aminoácido también pueden ser empleados para identificar uno o más aminoácidos junto con una secuencia contigua. Entre los barridos de aminoácidos preferidos están aminoácidos neutrales, pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteina. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo debido a que elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de cadena principal de la variante. La alanina es también típicamente preferida debido a que es el aminoácido más común. Además, se encuentra frecuentemente en tanto posiciones enterradas como expuestas [Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Si la sustitución de alanina no proporciona cantidades adecuadas de variantes, un aminoácido isotérico puede ser usado.
Las variaciones pueden hacerse usando métodos conocidos en la téenica tales como mutagénesis mediada por oligonucleótido (de sitio dirigido), barrido de alanina y mutagénesis por PCR. La mutagénesis de sitio dirigido [Cárter et al., Nucí. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucí. Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagénesis de casete [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagénesis de selección por restricción [Wells et al·., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] u otras técnicas conocidas pueden ser realizadas en el ADN clonado para producir muteínas IGF-II.
Espaciador Una etiqueta GILT puede ser fusionada al N-término o C-término de un enzima lisosomal. La etiqueta GILT puede ser fusionada directamente a la enzima lisosomal o puede ser separada de la enzima lisosomal por un enlazador o un espaciador. Un enlazador o espaciador de aminoácido es en general diseñado para ser rígido, flexible o interponer una estructura, tal como una hélice alfa, entre las dos porciones de proteína. Un enlazador o espaciador puede ser relativamente corto, tal como, por ejemplo, la secuencia Gly-Ala-Pro (GAP) (SEC ID NO: 9), Gly-Gly-Gly-Gly-Ala (GGGGA) (SEC ID NO: 60) o Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (GGGGS) (SEC ID NO: 12), o puede ser más largo, tal como, por ejemplo, 10-25 aminoácidos en longitud, 25-50 aminoácidos en longitud o 35-55 aminoácidos en longitud. El sitio de una unión de fusión debe ser seleccionado con cuidado para promover el plegado apropiado y la actividad de ambos patrones de fusión y prevenir la separación prematura de una etiqueta de péptido a partir de la enzima lisosomal, por ejemplo, alfa-N-acetilglucosaminidasa.
En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGPS (SEC ID NO: 14) o GGGSP (SEC ID NO: 15), y opcionalmente además comprende una o más de (i) GAP (SEC ID NO: 9), (ii) GGGGS (SEC ID NO: 12), (iii) GGGS (SEC ID NO: 16), (iv) AAAAS (SEC ID NO: 17), (v) AAAS (SEC ID NO: 18), (vi) PAPA (SEC ID NO: 19), (vii) TPAPA (SEC ID NO: 20), (viii) AAAKE (SEC ID NO: 21) o (ix) GGGGA (SEC ID NO: 60). En varias modalidades, el espaciador comprende la secuencia de aminoácido GAP (SEC ID NO: 9), GPS (SEC ID NO: 10), o GGS (SEC ID NO: 11).
En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGGS (SEC ID NO: 12) o GGGS (SEC ID NO: 16). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGPS (SEC ID NO: 14) o GGGSP (SEC ID NO: 15). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido AAAAS (SEC ID NO: 17) o AAAS (SEC ID NO: 18). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido PAPA (SEC ID NO: 19) o TPAPA (SEC ID NO: 20). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido AAAKE (SEC ID NO: 21). En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGGA (SEC ID NO: 60).
En varias modalidades, el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de: (GGGGS)n (SEC ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 163-169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 170- 218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 219-267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 268-316), GAP- (GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 544-551), (GGGGA)n (SEC ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 334- 340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 397-445), GAP- (GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n~ PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 552- 559); en donde n es 1 a 7. En varias modalidades, n es 1 a 4.
En varias modalidades, el espaciador se selecciona a partir del grupo que consiste de EFGGGGSTR (SEC ID NO: 22), GAP (SEC ID NO: 9), GGGGS (SEC ID NO: 12), GPSGSPG (SEC ID NO: 23), GPSGSPGT (SEC ID NO: 24), GPSGSPGH (SEC ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEC ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEC ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO : 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO : 39) GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS ' SEC ID NO 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP ( SEC ID NO: 41) GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS :SEC ID NO: 42) / GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 59), GGGGA (SEC ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST [SEC ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEC ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 74) GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)8GGGPS] (SEC ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)gGGGPSH] (SEC ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)gGGGPSH] (SEC ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEC ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEC ID NO: 89), y GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 90).
En varias modalidades, el espaciador se selecciona a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS ¡SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
En varias modalidades, el espaciador se selecciona a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
Constructos adicionales de proteínas alfa-N-acetilglucosaminidasa etiquetadas con GILT que pueden ser usadas en los métodos y composiciones de la presente invención se describen en detalle en las Publicaciones Estadounidenses Nos. 20050244400 y 20050281805, las descripciones completas de las cuales se incorporan en la presente por referencia.
Celulas Cualquier célula de mamífero o tipo celular susceptible a cultivo celular, y a expresión de polipéptidos, puede ser utilizado de conformidad con la presente invención, tal como, por ejemplo, células de riñón embriónico humano (HEK) 293, de ovario de hámster Chino (CHO), renal de mono (COS), HT1080, CIO, HeLa, de riñón de hámster bebé (BHK), 3T3, C127, CV-1, HaK, NS/0, y L-929. Ejemplos no limitantes de células de mamífero que pueden ser usados de conformidad con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, línea de mieloma de ratón BALB/c (NS0/1, ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, The Netherlands)); línea CVl de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embriónico humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); Células de ovario de hámster Chino +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CVl ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). En algunas modalidades, la proteína de fusión de la presente invención es producida a partir de líneas de células CHO.
La proteína de fusión de la invención también puede ser expresada en una variedad de células hospederas no de mamífero tales como, por ejemplo, células de insecto (por ejemplo, Sf-9, Sf-21, Hi5), planta (por ejemplo, Leguminosa, cereal, o tabaco), levadura (por ejemplo, S. cerivisae, P. pastoris) , procariota (por ejemplo, E. Coli , B. subtilis y otras Bacillus spp., Pseudomonas spp., Streptomyces spp), u hongos.
En algunas modalidades, una proteína de fusión con o sin una etiqueta GILT resistente a furina puede ser producida en células deficientes de furina. Como se usa en la presente, el término "células deficientes de furina" se refiere a cualquiera de las células cuya actividad de proteasa de furina es inhibida, reducida o eliminada. Células deficientes de furina incluyen células tanto de mamífero como no de mamífero que no producen furina o producen cantidad reducida o proteasa de furina defectiva. Células deficientes de furina ejemplares que se conocen y son disponibles para el experto en la téenica, incluyen pero no se limitan a células FD11 (Gordon et al (1997) Infection and Immunity 65(8):3370 3375), y aquellas células mutantes descritas en Moebring and Moehring (1983) Infection and Immunity 41(3):998 1009. Alternativamente, una célula deficiente de furina se puede obtener por exposición de las células de mamífero y no de mamífero descritas anteriormente a tratamiento de mutagénesis, por ejemplo, irradiación, bromuro de etidio, urina bromada (BrdU) y otros, preferiblemente mutagénesis química, y más preferido mutagénesis de etil metan sulfonato, recuperando las células las cuales sobreviven al tratamiento y seleccionando aquellos para las células las cuales se encuentran por ser resistentes a la toxicidad de la exotoxina A de Pseudomonas (véase Moehring and Moehrin (1983) Infection and Immunity 41(3):9981009).
En varias modalidades, se contempla que ciertas de las proteínas terapéuticas objetivo que comprenden un espaciador como se describe en la presente pueden presentar expresión incrementada de la proteína activa cuando se expresan recombinantemente comparado con las proteínas terapéuticas objetivo que comprenden un péptido espaciador diferente. En varias modalidades, también se contempla que las proteínas terapéuticas objetivo descritas en la presente pueden tener actividad incrementada comparada con otras proteínas terapéuticas objetivo de la presente. Se contempla que aquellas proteínas terapéuticas objetivo que presentan expresión incrementada de proteína activa y/o que tienen actividad incrementada comparada con otras proteínas terapéuticas objetivo que comprenden un péptido espaciador diferente son usadas para experimentación adicional.
Administración de Proteínas Terapéuticas De conformidad con la invención, una proteína terapéutica de la invención es típicamente administrada al individuo solo, o en composiciones o medicamentos que comprenden la proteína terapéutica (por ejemplo, en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad), como se describe en la presente. Las composiciones pueden ser formuladas con un portador o excipiente fisiológicamente aceptable para preparar una composición farmacéutica. La composición y portador pueden ser estériles. La formulación debe adecuar el modo de administración.
Portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen pero no se limitan a agua, soluciones de sal (por ejemplo, NaCl), salina, salina amortiguada, alcoholes, glicerol, etanol, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos tales como lactosa, amilosa o almidón, azúcares tales como manitol, sacarosa u otros, dextrosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, ésteres de ácido graso, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc., así como también combinaciones de los mismos. Las preparaciones farmacéuticas pueden, si se desea, ser mezcladas con agentes auxiliares (por ejemplo, lubricantes, preservativos, estabilizadores, agentes humectantes, emulsificadores, sales para influenciar la presión osmótica, amortiguadores, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares) las cuales no reaccionan deletéreamente con los compuestos activos o interfieren con su actividad. En una modalidad preferida, se usa un portador soluble en agua adecuado para administración intravenosa.
La composición o medicamento, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes amortiguadores de pH. La composición puede ser una solución líquida, suspensión, emulsión, tableta, píldora, cápsula, formulación de liberación sostenida, o polvo. La composición también puede ser formulada como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc.
La composición o medicamento puede ser formulado de conformidad con los procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración a seres humanos. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición para administración venosa típicamente es una solución en amortiguador acuoso isotónico estéril. Donde sea necesario, la composición puede también incluir un agente estabilizante y un anestésico local para aliviar el dolor en el sitio de la inyección. En general, los ingredientes son suministrados ya sea separadamente o mezclados en conjunto en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta o saquillo indicando la cantidad del agente activo. Donde la composición es administrada por infusión, puede ser dispensada con una botella de infusión que contiene agua de grado farmacéutico estéril, salina o dextrosa/agua. Donde la composición es administrada por inyección, una ampolleta de agua estéril para inyección o salina puede ser proporcionada de manera que los ingredientes pueden ser mezclados previo a la administración.
La proteina terapéutica puede ser formulada como formas de sal o neutrales. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con grupos amino libres tales como aquellos derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellos formados con grupos carboxilo libres tales como aquellos derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.
Una proteína terapéutica (o una composición o medicamento que contiene una proteína terapéutica) es administrada por cualquier ruta apropiada. En varias modalidades, una proteína terapéutica es administrada intravenosamente. En otras modalidades, una proteína terapéutica es administrada por administración directa a un tejido objetivo, tal como corazón o músculo (por ejemplo, intramuscular), o sistema nervioso (por ejemplo, inyección directa en el cerebro; intraventricularmente; intratecalmente). En varias modalidades, una proteína terapéutica es administrada intratecalmente. Alternativamente, una proteína terapéutica (o una composición o medicamento que contiene una proteína terapéutica) puede ser administrada parenteralmente, transdermalmente, o transmucosalmente (por ejemplo, oralmente o nasalmente). Más de una ruta puede ser usada concurrentemente, si se desea, por ejemplo, una proteína terapéutica es administrada intravenosamente e intratecalmente. La administración intravenosa e intratecal concurrente no necesita ser simultánea, sino puede ser secuencial.
Una proteina terapéutica (o una composición o medicamento que contiene una proteina terapéutica) puede ser administrada sola, o en conjunto con otros agentes, tales como antihistaminas (por ejemplo, difenhidramina) o inmunosupresores u otros agentes inmunoterapéuticos los cuales contrarrestan los anticuerpos lisosomales de la enzima etiquetada con anti-GILT. El término "en conjunto con", "indica que el agente es administrado previo a, en aproximadamente el mismo tiempo como, o después de la proteina terapéutica (o una composición o medicamento que contiene la proteina terapéutica). Por ejemplo, el agente puede ser mezclado en una composición que contiene la proteina terapéutica, y de este modo contemporáneamente administrada con la proteina terapéutica; alternativamente, el agente puede ser administrado contemporáneamente, sin mezclado (por ejemplo, por suministro "a cuestas" del agente en la linea intravenosa por la cual la proteina terapéutica es también administrada, o vice versa). En otro ejemplo, el agente puede ser administrado separadamente (por ejemplo, no mezclado), pero con un marco de tiempo corto (por ejemplo, dentro de 24 horas) de administración de la proteina terapéutica.
La proteina terapéutica (o composición o medicamento que contiene la proteina terapéutica) es administrada en una cantidad terapéuticamente efectiva (es decir, una cantidad de dosificación que, cuando se administra a intervalos regulares, es suficiente para tratar la enfermedad, tal como aliviando los síntomas asociados con la enfermedad, previniendo o retardando el comienzo de la enfermedad, y/o también disminuyendo la severidad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad, como se describe anteriormente). La dosis la cual será terapéuticamente efectiva para el tratamiento de la enfermedad dependerá de la naturaleza y extensión de los efectos de la enfermedad, y puede ser determinada por téenicas clínicas estándares. Además, los ensayos, in vitro o in vivo pueden ser opcionalmente empleados para ayudar a identificar los intervalos de dosificación óptimos usando métodos conocidos en la técnica. La dosis precisa a ser empleada también dependerá de la ruta de administración, y la seriedad de la enfermedad, y debe ser decidida de conformidad con el juicio de un practicante y cada circunstancia del paciente. La dosis efectiva puede ser extrapolada de curvas de respuesta de dosis derivadas de sistemas de prueba de modelo animal o in vitro. La cantidad de dosis terapéuticamente efectiva puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0.1-1 mg/kg, aproximadamente 1-5 mg/kg, aproximadamente 2.5-20 mg/kg, aproximadamente 5-20 mg/kg, aproximadamente 20-50 mg/kg, o aproximadamente 20-100 mg/kg o aproximadamente 50-200 mg/kg, o aproximadamente 2.5 a 20 mg/kg de peso corporal. La dosis efectiva para un individuo particular puede ser variada (por ejemplo, incrementada o disminuida) con el tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo. Por ejemplo, en tiempos de enfermedad física o estrés, o si los síntomas de la enfermedad empeoran, la cantidad de dosificación puede ser incrementada.
La cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína terapéutica (o composición o medicamento que contiene la proteína terapéutica) es administrada a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza y extensión de los efectos de la enfermedad, y en una base en curso. La administración a un "intervalo", como se usa en la presente, indica que la cantidad terapéuticamente efectiva es administrada periódicamente (como se distingue de una dosis en tiempo). El intervalo puede ser determinado por téenicas clínicas estándares. En algunas modalidades, la proteína terapéutica es administrada bimensualmente, mensualmente, dos veces mensualmente, trisemanalmente, bisemanalmente, semanalmente, dos veces semanalmente, tres veces semanalmente, o diariamente. El intervalo de administración para un individuo único no necesita ser un intervalo fijo, pero puede ser variado con el tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo. Por ejemplo, en tiempos de enfermedad física o estrés, si los síntomas de la enfermedad empeoran, el intervalo entre dosis puede ser disminuido.
Como se usa en la presente, el término "bimensualmente" significa administración una vez por mes (es decir , una vez cada dos meses); el término "mensualmente" significa administración una vez por mes; el término "trisemanalmente" significa administración una vez por tres semanas (es decir, una vez cada tres semanas); el término "bisemanalmente" significa administración una vez por dos semanas (es decir, una vez cada dos semanas); el término "semanalmente" significa administración una vez por semana; y el término "diariamente" significa administración una vez por día.
La descripción adicionalmente pertenece a una composición farmacéutica que comprende una proteína terapéutica, como se describe en la presente, en un contenedor (por ejemplo, un vial, botella, bolsa para administración intravenosa, jeringa, etc.) con una etiqueta que contiene instrucciones para administración de la composición para tratamiento de Mucopolisacaridosis Tipo IIIB (Síndrome de Sanfilippo B) , tal como por los métodos descritos en la presente.
Administración Intratecal de las Formulaciones Farmaceuticamente Aceptables En varias modalidades, la proteina de fusión enzimática es administrada por introducción en el sistema nervioso central del sujeto, por ejemplo, en el fluido cerebroespinal del sujeto. En ciertos aspectos de la invención, la enzima se introduce intratecalmente, por ejemplo, en el área lumbar, o la cisterna magna o intraventricularmente (o intracerebroventricularmente) en un espacio de ventrículo cerebral. Métodos para administrar una enzima lisosomal intratecalmente se describen en la Patente Estadounidense 7,442,372, incorporada en la presente por referencia en su totalidad.
Aquellos de habilidad en la téenica están conscientes de dispositivos que pueden ser usados para efectuar la administración intratecal de una composición terapéutica. Por ejemplo, la terapia puede ser dada usando un reservorio Ommaya el cual está en uso común para administrar intratecalmente fármacos para carcino atosis meningeal (Ommaya AK, Lancet 2: 983-84, 1963). Más específicamente, en este método, un tubo ventricular es insertado a través de un agujero formado en el cuerno anterior y es conectado a un reservorio Ommaya instalado bajo el cuero cabelludo, y el reservorio es subcutáneamente perforado para suministrar intratecalmente la enzima particular siendo reemplazada, la cual es inyectada en el reservorio. Otros dispositivos para la administración intratecal de composiciones terapéuticas a un individuo se describen en la Patente Estadounidense No. 6,217,552, incorporada en la presente por referencia. Alternativamente, la composición puede ser dada intratecalmente, por ejemplo, por una inyección única o infusión continua. Se debe entender que el tratamiento de dosificación puede estar en la forma de una administración de dosis única o dosis múltiple.
Como se usa en la presente, el término "la administración intratecal" se pretende incluir suministrar una composición farmacéutica directamente en el fluido cerebroespinal de un sujeto, por téenicas que incluyen inyección cerebroventricular lateral (es decir, intracerebroventricularlmente) a través de la punción lumbar, cisternal o trepanal o similares (descrita en Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 y Omaya et al., Cáncer Drug Delivery, 1: 169-179, los contenidos de las cuales están incorporados en la presente por referencia). El término "región lumbar" está propuesto para incluir el área entre la tercera y cuarta vértebra lumbar (espalda baja) y, más inclusivamente, la región L2-S1 de la columna vertebral. El término "cisterna magna" está propuesto para incluir el acceso alrededor del espacio y por debajo del cerebelo vía la apertura entre el cráneo y la parte superior de la columna vertebral. El término "ventrículo cerebral" está propuesto para incluir las cavidades en el cerebro que son continuas en el canal central de la médula espinal. La administración de una composición farmacéutica de conformidad con la invención a cualquiera de los sitios mencionados anteriormente se puede lograr por inyección directa de la composición o por el uso de bombas de infusión. Para inyección, la composición de la invención puede ser formulada en soluciones líquidas, preferiblemente en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución Hank, solución Ringer o amortiguador de fosfato. Además, la enzima puede ser formulada en forma sólida y redisuelta o suspendida inmediatamente previo al uso. Las formas liofilizadas son también incluidas. La inyección puede ser, por ejemplo, en la forma de una inyección de bolo o infusión continua (por ejemplo, usando bombas de infusión) de la enzima.
En varias modalidades de la invención, la enzima es administrada por inyección ventricular cerebro lateral en el cerebro de un sujeto. La inyección se puede hacer, por ejemplo, a través de un orificio de trépano hecho en el cráneo del sujeto. En otra modalidad, la enzima y/u otra formulación farmacéutica es administrada a través de una derivación quirúrgicamente insertada en el ventrículo cerebral de un sujeto. Por ejemplo, la inyección se puede hacer en los ventrículos laterales, los cuales son más grandes, aún a través de la inyección en el tercero y cuarto ventrículos más pequeños también se puede hacer.
En varias modalidades, las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención son administradas por inyección en la cisterna magna, o área lumbar de un sujeto. En otra modalidad del método de la invención, la formulación farmacéuticamente aceptable proporciona suministro sostenido, por ejemplo, "liberación lenta" de la enzima u otra composición farmacéutica usada en la presente invención, a un sujeto por al menos una, dos, tres, cuatro semanas o periodos de tiempo más largos después de que la formulación farmacéuticamente aceptable es administrada al sujeto.
En varias modalidades, una proteína de fusión terapéutica es suministrada a una o más superficies o tejidos huecos del cerebro o médula espinal. Por ejemplo, en varias modalidades, una proteína de fusión terapéutica es suministrada a una o más superficies o tejidos huecos del cerebelo o médula espinal. En algunas modalidades, la superficie objetivo o tejido hueco del cerebro o médula espinal están localizados dentro de 4 mm a partir de la superficie del cerebro. En algunas modalidades, la superficie de objetivo o tejido hueco del cerebro se seleccionan de tejidos de piamadre, tejidos de la cinta cortical cerebral, hipocampo, espacio Virchow Robín, recipientes sanguíneos dentro del espacio VR, el hipocampo, porciones del hipotálamo en el espacio inferior del cerebro, los nervios ópticos y tractos, el bulbo y proyecciones olfatorias, y combinaciones de los mismos.
En algunas modalidades, una proteína de fusión terapéutica es suministrada en uno o más tejidos profundos del cerebro o médula espinal. En algunas modalidades, la superficie objetivo o tejidos huecos del cerebro o médula espinal están localizados 4 mm (por ejemplo, 5 mm, 6 mm, 7 m, 8 mm, 9 mm, o 10 mm) por debajo (o interno a) la superficie del cerebro. En algunas modalidades, los tejidos profundos objetivos del cerebro incluyen la cinta cortical cerebral. En algunas modalidades, tejidos profundos objetivo del cerebro incluyen uno o más del diencéfalo (por ejemplo, el hipotálamo, tálamo, pretálamo, subtálamo, etc.), metencéfalo, núcleo Ientiforme, el ganglio basal, caudato, putamen, amígdala, globo pálido, y combinaciones de los mismos.
En varias modalidades, una superficie de objetivo o tejido hueco de la médula espinal contiene piamadre y/o los tractos de materia blanca. En varias modalidades, un tejido profundo objetivo de la médula espinal contiene materia gris de la médula espinal y/o células ependimales. En algunas modalidades una proteína de fusión terapéutica es suministrada a neuronas de la médula espinal.
En varias modalidades, una proteina de fusión terapéutica es suministrada a uno o más tejidos del cerebelo. En ciertas modalidades, uno o más tejidos de objetivo del cerebelo son seleccionados a partir del grupo que consiste de tejidos de la capa molecular, tejidos de la capa de células Purkinje, tejidos de la capa de células Granulares, pedúnculos cerebelares y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, agentes terapéuticos (por ejemplo, enzimas) son suministrados a uno o más tejidos profundos del cerebelo que incluyen, pero no se limitan a, tejidos de la capa de células Purkinje, tejidos de la capa de células Granulares, tejido de materia blanca cerebelar profunda (por ejemplo, profunda con relación a la capa de células Granulares), y tejido de núcleo cerebelar profundo.
En varias modalidades, una proteina de fusión terapéutica es suministrada a uno o más tejidos del tallo cerebral. En algunas modalidades, uno o más tejidos de objetivo del tallo cerebral incluyen tejido de materia blanca del tallo cerebral y/o tejido del núcleo del tallo cerebral.
En varias modalidades, una proteina de fusión terapéutica es suministrada a varios tejidos cerebrales que incluyen, pero no se limitan a, materia gris, materia blanca, áreas periventriculares, pia-araenoides, meninges, neocorteza, cerebelo, tejidos profundos en la corteza cerebral, capa molecular, región putamen/caudata, cerebro medio, regiones profundas del puente troncoencefálico o médula, y combinaciones de los mismos.
En varias modalidades, una proteina de fusión terapéutica es suministrada a varias células en el cerebro que incluyen, pero no se limitan a, neuronas, células gliales, células perivasculares y/o células meningeales. En algunas modalidades, una proteina terapéutica es suministrada a oligodendrocitos de la materia blanca profunda.
Kits para Uso en los Métodos de la Invención Los agentes utilizados en los métodos de la invención pueden ser proporcionados en un kit, en el cual el kit puede además incluir instrucciones para uso. Tal kit comprende una proteina de fusión como se describe en la presente que comprende una enzima para uso en el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosomal y una porción de objetivo lisosomal, usualmente en una dosis y forma adecuada para administración al hospedero. En varias modalidades, el kit usualmente comprenderá un dispositivo para suministrar la enzima intratecalmente.
Un kit también puede ser proporcionado para la conjugación de un antigeno, particularmente un antigeno de polipéptido, a una porción de alta absorción, con el fin de generar una composición terapéutica. Por ejemplo, puede ser proporcionada una porción tal como una uteína IGF-II, ya sea conjugada a un enlazador adecuado para enlazar polipéptidos. La porción de alta absorción también puede ser proporcionada en una forma no conjugada, en combinación con un enlazador adecuado, e instrucciones para uso.
Otro kit puede comprender instrucciones para la administración intratecal de las composiciones terapéuticas de la presente invención, además de las composiciones terapéuticas. En ciertas modalidades, los kits de la invención pueden comprender catéteres u otros dispositivos para la administración intratecal de la terapia de reemplazo de enzima que son precargados con las composiciones terapéuticas de la presente invención. Por ejemplo, catéteres precargados con 0.001-0.01 mg, 0.01-0.1 mg, 0.1-1.0 mg, 1.0-10 mg, 10-100 mg, o más de una proteina de fusión terapéutica que comprende una enzima lisosomal y porción de objetivo lisosomal, tal como muteina IGF-II y Naglu, en una formulación farmacéuticamente aceptable están específicamente contemplados. Catéteres ejemplares pueden usar catéteres únicos que pueden ser desechados después del uso. Alternativamente, los catéteres precargados pueden ser rellenables y presentados en kits que tienen cantidades apropiadas de la enzima para rellenar tales catéteres.
La invención será además y más específicamente descrita por los siguientes ejemplos. Los Ejemplos, sin embargo, están incluidos para propósitos de ilustración, no para limitación.
EJEMPLO 1 - GENERACIÓN DE SECUENCIAS ESPACIADORAS Enzimas lisosomales que comprenden etiquetas GILT y espaciadores han sido descritas en las Publicaciones de Patentes Estadounidenses Nos. 20030082176, 20040006008, 20040005309, y 20050281805. Las proteínas de fusión alfa-N-acetilglucosaminidasa (Naglu) que comprenden péptidos espaciadores se describen en la Publicación de Patente Estadounidense No. 201120232021. Péptidos espaciadores adicionales para uso en proteínas de fusión terapéutica de objetivo que comprenden una enzima lisosomal y una etiqueta GILT se desarrollaron como se describe abajo.
Los espaciadores pueden ser desarrollados para enlazar tanto muteínas IGF-II como muteína IGF-II resistente a furinas. Espaciadores ejemplares incluyen las siguientes secuencias de aminoácido: EFGGGGSTR (SEC ID NO: 22) GAP (SEC ID NO: 9), GGGGS (SEC ID NO: 12), GGGGA (SEC ID NO: 60), GPSGSPG (SEC ID NO: 23), GPSGSPGT (SEC ID NO: 24), GPSGSPH (SEC ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEC ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEC ID NO: 27), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEC ID NO: 62).
Se generaron constructos que comprenden un espaciador, Naglu de longitud completa (que incluyen la secuencia señal) y un péptido IGF-II, en los cuales la secuencia espad adora (espaciador EFGGGGSTR (SEC ID NO: 22), espaciador GAP (SEC ID NO: 9), espaciador GGGGS (SEC ID NO: 12), espaciador GPSGSPG (SEC ID NO: 23), o espaciador GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36)) se insertó entre el Naglu de longitud completa e IGF2 8-67 R37A (SEC ID NOs: 560-564).
Se hicieron enlazadores adicionales con base en el método XTEN como se describe en Schellenberger et al. (Nat Biotech 27:1186-1190, 2009). Enlazadores similares a XTEN pueden proporcionar una vida media más larga para la proteina de fusión generada comparada con otros enlazadores. Espaciadores ejemplares tienen las secuencias de aminoácido GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEC ID NO: 46), y GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47). El espaciador puede ser insertado entre la muteina IGF-2 y Naglu, opcionalmente vía los sitios AscI en los constructos.
La expresión de la proteina ha sido asociada con el codón de ADN usado para codificar un aminoácido particular, por ejemplo, cambiando el codón para un aminoácido se puede incrementar la expresión de la proteina sin cambiar la secuencia de aminoácido de la proteina (Trinh et al, Mol. Imunol 40:717-722, 2004). Alterar el codón que codifica el péptido resulta en niveles incrementados de producción de proteina de fusión recombinante. Usando esta téenica secuencias espad adoras adicionales fueron desarrolladas para uso en la proteina de fusión terapéutica con la enzima lisosomal, tal como GGGGSGGGGSGGGGS (SEC XD NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 58) y GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 59). Secuencias espaciadoras adicionales son GGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 81) y GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 82). Cualquiera de estos espaciadores es insertado entre la muteina IGF-II y Naglu, opcionalmente vía los sitios AscI en los constructos.
Un enlazador rígido ejemplar el cual comprende prolíneas múltiples para contribuir a la rigidez, tiene la siguiente secuencia GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), o GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), mientras un enlazador helicoidal ejemplar tiene la siguiente secuencia GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), o GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55). Cualquiera de estos espaciadores es insertado entre la muteína IGF-II y Naglu, opcionalmente vía los sitios AscI en los constructos.
Espaciadores adicionales pueden ser generados usando optimización de codón usando teenología desarrollada por ADN 2.0 (Menlo Park, CA). Los espaciadores contemplados incluyen GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEC ID NO:28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 43), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO:64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 78), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEC ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEC ID NO: 89), y GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 90). Cualquiera de estos espaciadores es insertado entre la muteina IGF-II y Naglu, opcionalmente vía los sitios AscI en los constructos.
En ciertas modalidades si la secuencia de péptido señal de la proteína de matriz extracelular BM-40 (Nischt et al., Eur J. Biochem 200:529-536, 1991) se usa, el Naglu en el constructo no comprende su propia secuencia de péptido señal. El espaciador es insertado entre la secuencia Naglu y la secuencia de muteina IGF-II (por ejemplo, IGF2 8-67 R37A). Una secuencia de péptido señal BM-40 ejemplar es MRAWIFFLLCLAGRALA (SEC ID NO: 8). Un péptido GAP puede ser agregado al espaciador para facilitar la clonación y adición de un sitio de clonación AscI. En ciertas modalidades, si la secuencia de péptido señal Naglu nativo (Weber et al., Hum Mol Genet. 5:771-777, 1996) se usa, el Naglu es Naglu de longitud completa y el espaciador es insertado entre el Naglu de longitud completa y la secuencia de muteina IGF-II (por ejemplo, IGF2 8-67 R37A). Un péptido GAP puede ser agregado al espaciador para facilitar la clonación y adición de un sitio de clonación AscI.
En constructos ejemplares, el Naglu humano ha sido "de codón optimizado" usando teenología de ADN 2.0. Se contempla que el Naglu comprenda los aminoácidos 1-743 o aminoácidos 24-743 de Naglu humano. En un constructo ejemplar, el espaciador opcionalmente comprende un espaciador GAP (sitio de enzima de restricción AscI usado para clonación) o cualquiera de las siguientes secuencias: EFGGGGSTR (SEC ID NO: 22), GAP (SEC ID NO: 9), GGGGS (SEO ID NO: 12), GPSGSPG (SEC ID NO: 23), GPSGSPGT (SEC ID NO: 24), GPSGSPGH (SEC ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEC ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEC ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 59), GGGGA (SEC ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEC ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEC ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS 'SEC ID NO: 75) GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)8GGGPSH] (SEC ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)gGGGPSH] (SEC ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEC ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEC ID NO: 89), y GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 90). Los espaciadores anteriores son opcionalmente de "codón optimizado" usando teenología de ADN 2.0.
Cualquiera de las muteinas IGF-II descritas en la presente, las cuales son opcionalmente de ''codón optimizado" usando tecnología de ADN 2.0, son útiles en los presentes constructos. En constructos ejemplares, la muteína IGF-II es una muteína IGF-II resistente a furina, IGF2 D8-67 R37A.
EJEMPLO 2 - EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DE CONSTRUCTOS DE EXPRESIÓN Los constructos de expresión que comprenden los espaciadores anteriores, la enzima Naglu y el péptido de objetivo IGF-II son elaborados y expresados recombinantemente. En ciertas modalidades, los constructos comprenden un péptido señal. Péptidos señal ejemplares incluyen, por ejemplo y sin limitación, el péptido señal Naglu que comprende aminoácidos 1-23 de Naglu de longitud completa (Weber et al., Hum Mol Genet 5:771-777, 1996) o un péptido señal derivado de la proteina de matriz extracelular BM-40 (Nischt et al., Eur J Biochem 200:529-536, 1991).
El ADN que codifica la secuencia Naglu, la muteína IGF-II y el péptido espaciador son insertados en un vector de expresión apropiado, tal como los vectores de expresión pEE y pXC GS (Lonza Biologics, Berkshire, UK) y el vector de expresión pC3B (BioMarin, in-house). Un sitio de restricción AscI (ggcgcgcc) (SEC ID NO: 570) puede ser insertado en el vector para ayudar en la clonación de las proteínas de fusión terapéutica descritas en la presente.
Un constructo ejemplar comprende la secuencia Naglu de longitud completa (Figuras 1A, IB, 2A y 2B), que incluye el péptido señal, un péptido espaciador (Figura 3) y un péptido IGF-II que comprende los residuos 8-67 y que tiene una sustitución de aminoácido Ala en el residuo Arg-37, R37A (Figuras 1 y 2), que confiere resistencia furina al péptido IGF-II.
Varias secuencias enlazadoras o espad adoras descritas en el Ejemplo 1, que conectan el péptido IGF-II y Naglu son inicialmente evaluadas usando un sistema de expresión temporal. Los plásmidos Naglu de objetivo GILT (pXC17.4, Lonza) son transfectados en células CHOK1SV GS KO en suspensión (Lonza). 15 mg de ADN de plásmido son transfectados en células 106 usando electroporación. El medio es completamente intercambiado a 24 horas post-transfección. Las células transfectadas son sembradas en matraces sacudidores a 1.5 x 106 células/ml sin selección. El crecimiento celular, viabilidad, titulador y productividad especifica son determinados conforme las células se hacen crecer a 30°C por hasta 14 dias.
Los plásmidos Naglu de objetivo GILT son transfectados en células CHOK1SV en suspensión (Lonza). Las células se hacen crecer en medio CDCHO (Invitrogen) con 6 mM de glutamina en matraces sacudidos a 37°C y 8% CO2.30 pg of ADN de plásmido linealizado en 1 xlO7 células son transfectados en las células usando electroporación. Las células son plaqueadas a 5000 células/cavidad en medio CDCHO + 40 pM MSX 48 horas después de la transfección. Las placas son incubadas a 37°C y 8% C02 por aproximadamente 4-6 semanas para identificar el crecimiento clonal. Las colonias son entonces seleccionadas por el ensayo de actividad 4MU para Naglu (véase Ejemplo 3) y las colonias de expresión más alta son transfectadas a placas de 24 cavidades en medio CDCHO + 40 pM MSX, y después continúan su pasaje a los clones de expresión más alta a placas de 6 cavidades, después los matraces se sacuden para identificar los clones de expresión más alta para producir las proteínas de fusión Naglu etiquetadas con GILT.
La purificación se lleva a cabo usando téenicas de purificación de proteína estándar. Por ejemplo, en un método de purificación ejemplar, el material de partida del sobrenadante de cultivo celular de mamífero, como se describe anteriormente, es descongelado del almacenamiento a -80°C. El material es ajustado con NaCl para alcanzar una concentración final de 1 M, seguido por 0.2 mm de filtración estéril.
El material filtrado es cargado en una columna de interacción hidrofóbica de butilo, pre-equilibrada con amortiguador de carga de butilo (20 mM de Tris, 1 M de NaCl, pH 7.5). Los materiales unidos son eluídos con un gradiente lineal sobre 10 volúmenes de columna, usando el amortiguador de elución de butilo (20 mM de Tris, pH 7.5). Las muestras de los picos de elución son combinadas, intercambiadas de amortiguador en 20 mM de Tris, pH 7.5, y cargadas en una columna de intercambio aniónico Q. Las proteínas unidas son entonces eluidas con un gradiente lineal (10 volúmenes de columna) usando amortiguador de elución Q (20 mM de Tris, 1 M de NaCl, pH 7.5). Las muestras purificadas son entonces intercambiadas de amortiguador usando concentradores de giro centrífugo y filtradas estériles para almacenamiento.
Construcción , expresión, producción,· purificación y formulación de una proteína de fusión Naglu ejemplar : Naglu- (GGGGS) 4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 568) . Se generó un constructo de ADN que codifica Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 568) por métodos de ADN recombinantes estándar. Naglu corresponde a aminoácidos 1-743 Naglu humano de longitud completa y IGF-II corresponde a la muteina IGF-II que comprende aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro con la sustitución de aminoácido R37A que confiere resistencia a furina. Las células CHOK1SV son transíectadas con el constructo de ADN, y se aísla una proteína de fusión Naglu-IGF-II de etiqueta GILT estable como se describe anteriormente.
Las células que expresan Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 568) se hacen crecer en un biorreactor, y la proteína de fusión Naglu se purificó del medio de cultivo como sigue. La recolecta fue se ajustó a salina con NaCl 1M, después se cargó en una columna 4FF Butil Sefarosa. La proteína de fusión Naglu fue eluida salina de la columna 4FF Butil Sefarosa, se recolectó y dializó, y después se cargó en una columna 6 FF Heparina Sefarosa. La proteína de fusión Naglu se recolectó la fracción a través del flujo, y se cargó en una columna HP Q Sefarosa. La proteína de fusión Naglu se eluyó con sal a partir de la columna HP Q Sefarosa, se concentró, y después se pulió por cromatografía de exclusión de tamaño Sephacryl S300 preparativa.
Usando este procedimiento de purificación, se produjo una proteina de fusión Naglu altamente purificada, enzimáticamente activa, Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 568). La proteina de fusión Naglu purificada se formuló en 20 mg/mL en CSF artificial (fosfato de sodio 1 mM, cloruro de sodio 148 mM, cloruro de potasio 3 mM, cloruro de magnesio 0.8 mM, 1.4 mM cloruro de calcio, pH 7.2).
Construcción, expresión , producción , purificación y formulación de Proteínas de fusión Naglu ejemplar. Se generaron constructos de ADN que codifica Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 569), Naglu-Rigido-IGF-II (SEC ID NO: 566), Naglu-Helicoidal-IGF-II (SEC ID NO: 567), y Naglu-XTEN-IGF-II (SEC ID NO: 565) por métodos de ADN recombinantes estándar. Naglu corresponde a aminoácidos 1-743 de Naglu humano de longitud completa y IGF-II corresponde a la muteina IGF-II que comprende aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro con la sustitución de aminoácido R37A que confiere resistencia a furina. Se describen enlazadores Rígido, Helicoidal y XTEN Ejemplares en el Ejemplo 1. Las células CHOK1SV son transíectadas con el constructo de ADNs, y proteina de fusión Naglu-IGF-II de etiqueta GILT estable que expresan clones se aislaron como se describe anteriormente.
Las células que expresan las proteínas de fusión Naglu-IGF-II se hacen crecer en un biorreactor. En corridas de producción de lote de alimentación típicas (10~16 días), constructos Naglu-IGF-II con varios enlazadores todos alcanzaron tituladores por arriba de 30 mg/L con alta viabilidad celular por arriba de 80%.
Las proteínas de fusión Naglu se purificaron del medio de cultivo como se describe anteriormente. Usando este procedimiento de purificación, proteína de fusión Naglu y Naglu-IGF-II enzimáticamente activa no etiquetada, tal como Naglu-Rígido-IGF-II (SEC ID NO: 566), Naglu-Helicoidal-IGF-II (SEC ID NO: 567), Naglu-XTEN-IGF-II (SEC ID NO: 565) y Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 569), se purificaron a -99% pureza, como se determinó por HPLC de fase inversa. La Proteína de fusión Naglu y Naglus purificada no etiquetada se formularon a 20 mg/mL en CSF artificial (fosfato de sodio 1 mM, cloruro de sodio 148 mM, cloruro de potasio 3 mM, cloruro de magnesio 0.8 mM, cloruro de calcio 1.4 mM, pH 7.2).
Se contempla que las proteínas de fusión como se describe en la presente que demuestran niveles superiores de expresión recombinante de proteína activa y/o actividad enzimática incrementada comparada con proteínas de fusión que comprenden un péptido espaciador diferente pueden ser usadas en experimentación adicional, tal como ensayos de actividad, ensayos de unión, en sayos de absorción y ensayos de actividad in vivo como se describe además abajo.
EJEMPLO 3 - ENSAYOS DE ACTIVIDAD Para determinar la actividad enzimática de la proteínas de fusión Naglu, un ensayo de actividad Naglu in vitro se llevó a cabo usando un sustrato sintético etiquetado fluorescente.
Los materiales usados en el ensayo incluyen: 4-Metilumbeliferil-N-acetil-a-D-glucosaminida (Sustrato 4MU-NaGlu) (Calbiochem, Cat# 474500) preparado a una concentración final de 20 mM en DMSO al 10% en el amortiguador de ensayo (Acetato de Sodio 0.2 M, con o sin 1 mg/ml de BSA, y Tween 20 al 0.005%, pH 4.3-4.8) y se almacenó -80°C. Solución base de 4-Metilumbeliferona (Estándar 4-MU) (Sigma, Cat# M1381) se preparó a 10 mM en DMSO y se almacenó a -20°C en alícuotas pequeñas. Un control rhNaglu-His6 (0.5 mg/ml, R&D Systems, Cat #7096-GH) se diluyó a 10 mg/ml en Tris 25 mM, NaCl 125 mM, Tween 20 al 0.001%, pH7.5 y se almacenó a -80°C en alícuotas pequeñas.
En una placa de dilución de 96 cavidades clara (Granger), se usaron 2x diluciones seriales de estándares en Amortiguador de Dilución (1 x PBS, con o sin 1 mg/ml de BSA, Tween 20 al 0.005%, pH 7.4, de 200 mM a 1.563 mM más un blanco. En una placa de dilución clara, se prepararon muestras en varias diluciones (en Amortiguador de Dilución) para asegurar que están dentro de la curva estándar. 10 ml de estándares (200 mM a 1.563 mM), control y muestras de trabajo son transferidos a una placa de 96 cavidades de poliestireno no tratadas negras (Costar, Cat# 3915). Se agregó 75 ml del sustrato (2 mM) a cada cavidad, seguido por incubación por 30 minutos a 37°C. La reacción después se apagó por la adición de 200 m? del amortiguador de detención (Glicina/NaOH 0.5 M, pH 10.7). Las placas se lcyeron en un Ex355 Em460 con 455 valor limite un lector de placa fluorescente de 96 cavidades.
Usando este ensayo, Proteínas de fusión Naglu ejemplares, que incluyen Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 568), Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 569), Naglu-Rígido-IGF-II (SEC ID NO: 566), Naglu-Helicoidal-IGF-II (SEC ID NO: 567) y Naglu-XTEN-IGF-II (SEC ID NO: 565), se muestran por tener actividad enzimática in vitro, con actividad especificas hacia el sustrato 4MU-Naglu sintético que varia de ~175,000 a ~220,000 nmol/hr/mg. La actividad enzimática de la proteínas de fusión Naglu es comparable a la de proteína Naglu no etiquetada (-190,000 nmol/hr/mg). Datos de actividad enzimática para Proteínas de fusión Naglu ejemplares se proporcionan en la Tabla 1.
Tabla 2. Actividad de Proteínas de fusión Naglu ‘Proteínas de fusión Naglu y Naglu no etiquetada se construyeron, expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 2; enlazadores Rígido, Helicoidal y XTEN ejemplares se describen en el Ejemplo 1 2SEC ID NO: de enlazadores en las proteínas de fusión Naglu probadas en el Ejemplos 3 a 5 3Actividad específica (nmol/hr/mg) para proteínas Naglu se midió como se describe en el Ejemplo 3 4IC50 para proteínas Naglu para enlace competitivo IGF2R se midió como se describe en el Ejemplo 4 5Kabsorción y vida media (ti/2) para proteínas Naglu en fibroblastos MPS-IIIB se midieron como se describe en el Ejemplo 5 EJEMPLO 4 - ENSAYOS DE UNIÓN Ensayos de unión para determinar la unión de las proteínas de fusión Naglu a IGF-I, IGF-II y receptores de insulina se llevaron a cabo generalmente como se describe en US 20120213762. Brevemente, los constructos de proteína de fusión son probados para afinidad de unión para el receptor de insulina en un ensayo midiendo la competencia de unión insulina biotinilada a insulina unida a la placa. Se condujo un ensayo de unión de receptor insulina por competencia de insulina, IGF-II, y proteína de fusión con unión de insulina biotinilada al receptor de insulina (Insulina-R).
Específicamente, placas Reacti-Bind blancas son recubiertas con Insulina-R a una concentración de 1 pg/cavidad/100 ml (38.4 nM). Las placas recubiertas se incubaron durante la noche a temperatura ambiente, después se lavaron 3x con amortiguador de lavado (300 ml/cavidad). Las placas se bloquearon con amortiguador de bloqueo (300 m?/cavidad) por 1 hora. Las etapas de lavado se repitieron y cualquier resto de solución en las placas se retiró. Se mezcló insulina biotinilada a 20 nM con diferentes concentraciones de insulina, IGF-II, o proteína de fusión, por diluciones seriales. Se agregaron 100 m? de Insulina diluida, IGF-II, o Proteína de fusión Naglu en Insulina-biotina 20 nM en las placas recubiertas y las placas se incubaron a temperatura ambiente por 2 horas. Las placas después se lavaron 3 veces con amortiguador de lavado. Se agregó 100 m? de solución de trabajo estreptavidina-HRP (50 m? estreptavidina-HRP en 10 mi del amortiguador de bloqueo) en las placas y las placas se incubaron a temperatura ambiente por 30 minutos. Se agregó 100 ml de solución de trabajo Elisa-Pico que contiene Elisa-Pico sustrato quimioluminiscente y la quimioluminiscencia se midió a 425 nm.
Ensayo de unión competitiva IGF2R Para medir la capacidad de los constructos de proteina de fusión Naglu para unir el receptor IGF-II, se llevó a cabo un ensayo de unión competitiva. Un fragmento del IGFIIR involucrado con la unión IGF-II (dominios 10-13, denominado proteína 1288) se recubrió en placas de 96 cavidades. Se incubó IGF-II Biotinilada con el receptor en la presencia de cantidades incrementadas de competidores: ya sea control IGF-II (no biotinilada), o muestra proteina de fusión (que contiene una etiqueta epitope GILT derivada de IGF-II). Se detectó IGF-II biotinilada unida al receptor con estreptavidina conjugada peroxidasa de rábano picante (HRP) y un sustrato HRO quimioluminiscente. La capacidad de la proteina de fusión para inhibir la unión de IGF-II biotinilada a la IGFIIR se calculó a partir de curvas de inhibición y reportadas como un valor IC50 (concentración requerida para lograr 50% inhibición de unión).
Para el ensayo, se recubrió IGFIIR en una placa Reacti-bind blanca (Pierce, Cat# 437111) a 0.5 gg/cavidad en un volumen de 100 ml (69.6 n /per cavidad) en amortiguador de recubrimiento. La placa se selló y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. La placa después se lavó 3X con amortiguador de lavado, se bloqueó con amortiguador de bloqueo y después se lavó nuevamente 3X con amortiguador de lavado (300 ml/cavidad).
Después, se mezcló IGF-II-biotina 8 nM con diferentes concentraciones de competidores (IGF-II (no biotinilada), Proteina de Referencia, o muestras de Proteina de fusión Naglu, y se agregó en una placa recubierta con IGFIIR en 2X diluciones seriales.
La placa se incubó a temperatura ambiente por 2 horas, seguido por lavado de la placa 3X con amortiguador de lavado. Se preparó Estreptavidina-HRP en amortiguador de bloqueo (dilución 1:200), y se agregó 100 ml/cavidad a la placa. Se detectó actividad de unión de IGF-II-Biotina vía estreptavidina-HRP usando reactivos Pico-Elisa. Brevemente, la solución de trabajo Pico-Elisa preparada se agregó por cavidad (100 m?/cavidad), y se incubó a temperatura ambiente por 5 minutos con suave balanceo, después se midió la quimioluminiscencia a 425nm.
Las IC50 de las muestras se calcularon usando el porcentaje de Unión IGF-II-Biotina para cada concentración de inhibidor.
Usando este ensayo de unión IGFIIR competitivo, una proteina de fusión Naglu ejemplar, que incluye Naglu- (GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 568), Naglu-(GGGGA)4GGGPS- IGF-II (SEC ID NO: 569), Naglu-Rigido-IGF-II (SEC ID NO: 566), Naglu-Helicoidal-IGF-II (SEC ID NO: 567) y Naglu-XTEN- IGF-II (SEC ID NO: 565), se muestran por tener un valor IC50 de 0.23-0.36 nM. La proteína Naglu no etiquetada no tiene unión detectable en este ensayo. Datos unión competitiva IGF2R para Proteínas de fusión Naglu ejemplares se proporcionan en la Tabla 1.
EJEMPLO 5 - ENSAYOS DE ABSORCIÓN Para medir la capacidad de una enzima de la Enfermedad de Almacenaje Lisosomal para ingresar a las células vía endocitosis mediada por el receptor, se llevó a cabo un ensayo de absorción el cual mide la absorción enzimática usando el receptor CI-MPR en células L6 de mioblastos de rata o en fibroblastos MPS IIIB humanos. Se usaron Manosa-6-fosfato (M6P) y IGF-II como inhibidores para determinar el sitio de unión al receptor CI-MPR. Se recolectaron datos para generar una curva de saturación para absorción enzimática y determinar los parámetros de cinética, ^absorción/ del proceso.
Antes del ensayo de absorción (24 horas), son colocados en placas células L6 (Mioblastos de Rata L6, ATCC# CRL-1458) o fibroblastos MPS IIIB humanos a una densidad de lxlO5 células por cavidad en placas de 24 cavidades (VWR #62406-183) y se sembraron 0.5 mi por cavidad. En la mañana del ensayo, la enzima se mezcló con medio de absorción (1 L de DMEM, 1.5 g de Bicarbonato de Sodio.0.5 g de Albúmina Suero de Bovino, 20 mi de L-glutamina (200 mM (Gibco #25030-081)), 20 mi de HEPES 1M (Gibco #1563080)) (20 mM final), pH 7.2) en una campana de cultivo de tejido. Las cantidades enzimáticas pueden variar a partir de 2-500 nM. El volumen final del medio de absorción + enzima es 0.5 mi por cavidad. M6P (concentración final 5 mM) y/o IGF-II (concentración final 2.4 mM o 18 mg/ml) se agregaron a muestras apropiadas. Para inhibición de absorción, se agregó 18 ml de solución base IGF-II (1 mg/ml, 133.9 mM) por mL de medio de absorción.
El medio de crecimiento es aspirado de las células y se agregó 0.450 mi de enzima en amortiguador de absorción a cada cavidad. Se toma nota del tiempo y el regreso de las células a la incubadora por 18 horas. La placa se removió de la incubadora y amortiguador de absorción aspiró las células. Las placas se lavaron 4x por la adición de 0.5 mi de PBS de Dulbecco y aspiración. Se agregó 200 ml de amortiguador de lisis M CelLytic (Sigma) a las placas y se sacudió a temperatura ambiente por 20-30 minutos. Lo lisado se removió de las células y se almacenó en una placa de 96 cavidades clara cubierta con cinta (VWR) a -80°C hasta el momento del ensayo.
Para el ensayo enzimático, se agregó 5 m? de cada U sado por duplicado agregando a 15 ml de la mezcla de reacción enzimática (por ejemplo, ensayos Naglu+4MU) en placa de 96 cavidades negra (VWR) (véase anteriormente) y enzima/unidades/ml/hr determinado en cada lisado.
Para ensayo de proteina lisada, 10 ml de cada lisado por duplicado se sometieron a ensayo usando un kit de ensayo de proteína BCA Pierce de conformidad con las instrucciones del fabricante. Para medir la absorbancia, la absorbancia se lcyó a 562 nm con un lector de placa (lector de placa FluoStar Optima BMG) y concentración determinada a ug/ml.
Para cada carga enzimática, la absorción es unidades de actividad enzimática/mg del lisado. Para determinar la absorción, las unidades enzimáticas/ml se dividieron por ug/ml de proteína y multiplicadas por 1000 (absorción a partir de cavidades en blanco restadas). Los resultados de los ensayos con o sin inhibidores se compararon para determinar especificidad de absorción del receptor.
Para curvas de saturación, se usaron 10 concentraciones de carga enzimática que varia de 0.2-100 nM para generar una curva de saturación usando los ensayos descritos anteriormente.
Usando este ensayo, una proteina de fusión Naglu ejemplar, Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 568), se mostró por tener una Kabsorción de 7-9 nM en fibroblastos MPS- IIIB.
Alternativamente, antes del ensayo de absorción (24 horas), Células L6 o fibroblastos MPS IIIB humanos son colocados en placas a una densidad de lxlO5 células por 0.5 mi por cavidad en las placas de 24 cavidades. Se prepararon muestras enzimáticas a 1.6-50 nM en medio de absorción: 1 L de DMEM, 1.5 g de Bicarbonato de Sodio. Se agregaron 0.5 g de Albúmina Suero de Bovino, 20 mi de L-glutamina 200 mM y 20 mi de HEPES1M, pH7.2. Para inhibición de absorción, M6P (hasta 5.0 mM final) y/o IGF-II (hasta 1.0 mM final) a muestras apropiadas.
El medio de crecimiento es aspirado de las células y reemplazado por 0.5 mi de la preparación enzimática en amortiguador de absorción por cavidad. Después de 4 horas de incubación, las placas se lavaron 2 veces con 0.5 mi de PBS de Dulbecco. Se agregó 100 ml de amortiguador de lisis M-PER (Pierce) a las placas y se sacudió a temperatura ambiente por 10 minutos. Lo lisado se almacenó a -80°C hasta el momento del ensayo.
Para el ensayo enzimático, 10 ml de cada lisado se agregó por duplicado a la placa de 96 cavidades negra (véase anteriormente).
Para el ensayo de proteina U sada, 10 m? de cada lisado por duplicado se sometieron a ensayo usando un Kit de ensayo de proteina BCA Pierce de conformidad con las instrucciones del fabricante. La absorbancia se lcyó a 562 nm con un lector de placa (lector de placa FluoStar Optima BMG) y mg/ml concentración determinada usando BSA como un estándar.
Para cada carga enzimática, la absorción se expresó como nmoles de 4-MU liberado en 30 minutos. Para curvas de saturación, se usaron concentraciones enzimáticas que varían de 1.6-50 nM para generar una curva de saturación usando los ensayos descritos anteriormente.
Estabilidad celular de la proteínas de fusión Naglu se determinó monitoreando actividad de Naglu intracelular durante el periodo de ~8 días. Fibroblastos MPS IIIB humanos colocados en placa a una densidad de lxlO5 células por cavidad en placas de 24 cavidades (VWR #62406-183) se trataron con Proteína de fusión Naglu a concentración final 20 nM por 4 horas. Después de 4 horas de incubación, las células se cambiaron al medio de crecimiento sin Proteína de fusión Naglu. Para cada punto de tiempo (4 horas, 28 horas, 4 días, 6 días & 8 días), las células se lisaron en 100 ml de amortiguador de lisis M-PER (Pierce) a temperatura ambiente por 10 minutos, y se sometieron a ensayo para actividad enzimática usando un sustrato etiquetado 4-MU. La reducción de actividad Naglu durante un periodo de muestra de 8 días puede ser establecido para cinéticos de primer orden para aproximar una vida media celular de la proteína.
Usando este ensayo, Proteínas de fusión Naglu ejemplar, que incluyen Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 568), Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 569), Naglu-Rígido-IGF-II (SEC ID NO: 566), Naglu-Helicoidal-IGF-II (SEC ID NO: 567) y Naglu-XTEN-IGF-II (SEC ID NO: 565), se muestran por ser internalizadas en fibroblastos MPS IIIB con valores Kabsorción de ~2.3-6.3 nM. La proteína Naglu no etiquetada, en contraste, no se absorbió por las células bajo estas condiciones experimentales. Además, la absorción observada de Proteína de fusión Naglu se inhibió por IGF-II, pero no por M6P. Después de la absorción, las proteínas de fusión Naglu ejemplares se encontraron ser estables con una vida media estimada de ~9.5 días, en base a la actividad enzimática (sustrato 4-MU) medida en lisados celulares. Los datos de absorción y vida media para proteínas de fusión Naglu ejemplares se proporcionan en la Tabla 1.
EJEMPLO 6 - ACTIVIDAD DE PROTEÍNA DE FUSIÓN NAGLU IN VIVO Para determinar la actividad de proteínas de fusión Naglu in vivo, las proteínas de fusión son administradas a animales agónicos Naglu (véase Li et al., Proc Nati Acad Sci USA 96:14505-510, 1999). Los animales agónicos Naglu presentan grandes cantidades de heparan sulfato en el cerebro, hígado y riñón, incremento de la actividad de beta-hexosaminidasa y tinción en el cerebro por la proteína 2 de membrana asociada a lisosomal (LAMP-2) y elevación de gangliósidos en el cerebro.
La actividad y biodistribución de las enzimas exógenas son determinadas después de 4 inyecciones ICV (intracerebroventricular) durante un periodo de dos semanas (100 mg/inyección) de (rh) Naglu-IGF2 recombinante humano. Una cánula permanente se implantó en el ratón (n=12/gp, 8-12 semanas de edad al inicio) y se ajustó para cubrir aquellos ratones cuya cánula no está en el ventrículo. Las mediciones de los puntos finales incluyen biodistribución de Naglu, reducción de GAG, por ejemplo, heparan sulfato, se almacenaron en los lisosomas de células cerebrales, y la activación de astrocitos y microglia. Los niveles de varios lisosomas o biomarcadores neuronales (Ohmi et al., PLoS One 6:e27461, 2011) se midieron en niveles de grupos de control tratados y de control incluyendo, pero no se limitan a, proteína 1 de membrana asociada a Lisosomal (LAMP-1), LAMP-2, glipicano 5, extremos no reductores específicos a Naglu (NREs) de heparan sulfato, gangliósidos, colesterol, Subunidad c de Sintasa ATP Mitocondrial (SCMAS), ubiquitina, P-GSK3beta, beta amiloide, P-tau (Tau fosforilado), GFAP (activación de astrocito) y CD68 (activación microglial).
Se llevaron a cabo experimentos adicionales para determinar la supervivencia comportamiento usando ratones que recibieron 4 inyecciones ICV durante un periodo de dos semanas de rhNaglu-IGF2 (n=12/gp, 5 meses de edad al inicio, 100 gg/inyección). Los puntos finales a ser medidos incluyen tiempo de supervivencia, actividad de campo abierto, biodistribución de Naglu, reducción de GAG, por ejemplo, heparan sulfato, almacenaje en lisosomas, niveles de lisosoma o biomarcadores neuronales, tal como LAMP-1, LAMP-2, glipicano 5, gangliósidos, colesterol, SCMAS, ubiquitina, P-GSK3beta, beta amiloide, P-tau, GFAP y CD68.
Se han desarrollado ratones agónicos Naglu (Naglu -/-) que tienen una mutación en exon 6 del gen naglu (Li et al., Proc Nati Acad Sci U S A. 96:14505-10, 1999). El sitio de exón 6 se eligió porque este es el sitio de muchas mutaciones en humanos. No se detectó actividad de Naglu en ratones homocigotos, y existe una reducción en actividad Naglu en heterocigotos. Los ratones Naglu -/- han reducido los tiempos de supervivencia (6 - 12 meses), y pueden tener otros niveles de actividad reducida igual a fenotipos funcionales. Los efectos de proteínas de fusión Naglu en los ratones Naglu -/- se sometieron a ensayo.
Ratones Naglu -/- (n=8) y 8 ratones Naglu -/- de vehículo de control (n=8 heterocigotos compañeros de camada) son administrados con 4 dosis por ICV (100 gg Naglu-IGF2/dosis) durante 2 semanas. En el día -2, los ratones son anestesiados y canulados por el ventrículo lateral izquierdo. Los ratones se dejaron recuperar. A los días 1, 5, 10 y 14, los ratones son anestesiados (Benedryl, 5 mg/kg IP) 15 minutos antes de la dosis por ICV. La dosis por ICV es infundida vía cánula, 5 ml de volumen durante 15 minutos, y los ratones se dejaron recuperar. Al dia 15, los ratones se sacrificaron, desangraron y el suero se congeló. Los cerebros se recolectaron y se inyectó tinte IR en la cánula y la cánula forma imágenes.
Los siguientes ensayos se llevaron a cabo para determinar los efectos de Proteínas de fusión Naglu: valoración de peso corporal, formación de imagen por colocación de cánula, valoración de niveles de Naglu-IGF2, GFAP, LAMP-1 y LAMP-2 en el cerebro usando im unohistoquímica, ensayo bioquímico para actividad Naglu, niveles y actividad de b-hexosaminadasa, ensayo SensiPro para detectar extremos no reductores de glicosaminoglicanos acumulados (GAGs) específicos para Mucopolisacaridosis Illb (MPS-IIIb) (WO 2010/078511A2), niveles de gangliósido GM3 medidos por ensayo bioquímico, así como inmunoteñido para SCMAS, A-beta, glipicano 5, CD68, GFAP y Naglu en corteza entorrinal medio (Li et al., supra) .
El tratamiento efectivo con Naglu-IGF2 se espera que resulte en una disminución de niveles de LAMP-1, LAMP-2, GFAP, CD68, SCMAS, A-beta, glipicano 5, b-hexosaminadasa, gangliósido GM3, y GAGs específicos a MPS-IIIb.
La eficacia In vivo de Proteínas de fusión Naglu ejemplares en un modelo de ratón MPS Illb. Se administraron cuatro dosis ICV (100 mg/dosis) de proteina de fusión Naglu-IGF-II, ya sea Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 568) o Naglu-Rígido-IGF-II (SEC ID NO: 566), durante un periodo de dos semanas a ratones Naglu -/- (n=8). Ratones Naglu -/- (n=8) y ocho heterocigoto o compañeros de camada de tipo nativos (n=8) son proporcionados solo con el vehículo como un control. En el día -5, los ratones son anestesiados; el ventrículo lateral izquierdo del cerebro es canulado. Los ratones se dejaron recuperar. En los días 1, 5, 10 y 14, los ratones son anestesiados con isoflourano inhalado. Se administró Benadryl (5 mg/kg IP) a cada ratón 15 minutos antes de la dosis ICV para reducir cualquier liberación de histamina potencial en respuesta al tratamiento con Naglu-IGF-II. La dosis por ICV se infundió vía la cánula implantada, 5 ml de volumen durante 15-20 minutos, y los ratones se dejaron recuperar. A los días 1, 7, 14, y 28 después de la dosis final, los ratones se sacrificaron. Los cerebros se recolectaron y se dividieron sagitalmente en 5 secciones para distribución a varios ensayos.
Los siguientes ensayos se llevaron a cabo para determinar los efectos de la proteína de fusión Naglu-IGF-II: medición immunohisoquímica de niveles Naglu, LAMP-2, GFAP y CD68 en el cerebro, ensayos bioquímicos para Naglu y actividad beta-hexosaminadasa, ensayo SensiPro (Deakin et al., Glycobiology 18:483, 2008; Lawrence et al., Nat Chem Biol. 8:197, 2012; Lawrence et al., J Biol Chem.283:33674, 2008) para detectar heparan sulfato total y NREs de heparan sulfato específico para Mucopolisacaridosis IIIB (MPS-IIIB) (WO 2010/078511A2), y teñido immunoflourescente para SCMAS, beta-amiloide (A-beta), p-Tau, P-GSK3beta, glipicano 5, GFAP y CD68 en corteza entorrinal media (Li et al., supra) .
Cuando se evaluó 24 horas después de la dosis final, el tratamiento con ya sea proteína de fusión Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II (SEC ID NO: 568) o Naglu-Rígido-IGF-II (SEC ID NO: 566) resultó en un incremento marcado en actividad enzimática Naglu, con una disminución concomitante en actividad de beta-hexosaminadasa y niveles de heparan sulfato total, NREs de heparan sulfato específicos a Naglu, y LAMP-2. La enzima Naglu es fácilmente detectable en tejidos cerebrales, no solamente en la corteza, hipocampo, giro dentado y tálamo, pero también en ubicaciones geográficas remotas distantes, que incluyen amígdala, corteza perirrinal e hipotálamo. También se observaron disminuciones significantes en los niveles de CD68, SCMAS, beta-amiloide (A-beta), p-Tau, P-GSK3beta, y glipicano 5 en cerebros Naglu -/- en tratamiento con Naglu-IGF-II. El teñido GFAP no cambió por 24 horas después de la última dosis. La Immunohistoquímica demostró la presencia de la enzima Naglu en muchas áreas del cerebro, dentro de neuronas y células glial, co-localizadas con LAMP-2.
Los niveles de heparan sulfato, NREs específicos a Naglu, y actividad de beta-hexosaminidasa continuó para disminuir durante los puntos de tiemp7, 14, y 28 días después de la última dosis. A los 28 días, todos los analitos están en o cerca de los valores de control del ratón normal.
EQUIVALENTES Aquellos expertos en la téenica reconocerán, o serán capaces de evaluar usando no más que experimentación de rutina, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención descrita en la presente. El campo de la presente invención no está propuesto para ser limitado a la Descripción anterior, sino preferiblemente es como se expone en las reivindicaciones adjuntas. Los artículos "un", "uno", y "el" como se usan en la presente en la especificación y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, se debe entender incluir los referentes plurales. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo son consideradas satisfechas si uno, más de uno, o todo los miembros del grupo están presentes en, se emplean en, o de otro modo relevantes a un producto o proceso dado a menos que se indique lo contrario o de otro modo evidente del contexto. La invención incluye modalidades en las cuales exactamente un miembro del grupo está presente en, empleado en, o de otro modo relevante a un producto o proceso dado. La invención también incluye modalidades en las cuales más de uno, o todo, los miembros del grupo están presentes en, empleados en, o de otro modo relevantes a un producto o proceso dado. Además, se entiende que la invención abarca variaciones, combinaciones y permutaciones en las cuales una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc., de una o más de las reivindicaciones se introduce en otra reivindicación dependiente de la misma reivindicación base (o, como es relevante, cualquier otra reivindicación) a menos que se indique de otro modo o a menos que podría ser evidente para uno de habilidad ordinaria en la téenica que una contradicción o consistencia podría originarse. Donde los elementos son presentados como listas, por ejemplo, en un grupo Markush o formato similar, se entiende que cada subgrupo de los elementos es también descrito, cualquiera de los elementos puede ser eliminado del grupo. Se debe entender que, en general, donde la invención, o aspectos de la invención, es/son referidos como que comprende elementos particulares, características, etc., ciertas modalidades de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente de, tales elementos, características, etc. Para propósitos de simplicidad estas modalidades no han sido en cualquier caso específicamente expuestas en la presente. Se debe entender también que cualquier modalidad de la invención, por ejemplo, cualquier modalidad encontrada dentro de la téenica anterior, puede ser explícitamente excluida de las reivindicaciones, con respecto de si la exclusión específica es mencionada en la especificación.
Se debe entender también que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquiera de los métodos reivindicados en la presente que incluyen más de un acto, el orden de los actos del método no es necesariamente limitado al orden en el cual los actos del método son mencionados, sino la invención incluye modalidades en las cuales el orden es asi limitado. Además, donde las reivindicaciones mencionan una composición, la invención abarca métodos para usar la composición y métodos para elaborar la composición. Donde las reivindicaciones mencionan una composición, se debe entender que la invención abarca métodos para usar la composición y métodos para elaborar la composición.
Todas las publicaciones y documentos de patente citados en esta solicitud están incorporados por referencia en su totalidad en la misma extensión como si los contenidos de cada publicación individual o documento de patente fueran incorporados en la presente.

Claims (61)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.
1. Una proteina de fusión terapéutica objetivo caracterizada porque comprende (a) una enzima lisosomal, (b) una etiqueta de péptido que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro y (c) un péptido espaciador entre la enzima lisosomal y la etiqueta del péptido IGF-II, en donde el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGPS (SEC ID NO: 14) o GGGSP (SEC ID NO: 15), y opcionalmente además comprende una o más de (i) GAP (SEC ID NO: 9), (ii) GGGGS (SEC ID NO: 12), (iii) GGGS (SEC ID NO: 16), (iv) AAAAS (SEC ID NO: 17), (v) AAAS (SEC ID NO: 18), (vi) PAPA (SEC ID NO: 19), (vii) TPAPA (SEC ID NO: 20), (viii) AAAKE (SEC ID NO: 21) o (ix) GGGGA (SEC ID NO: 60).
2. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de: (GGGGS)n (SEC ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 101-107), GAP- (GGGGS)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n~ GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n- GAP (SEC ID NOs: 163-169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 170-218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 219-267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 268-316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n- (Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 544-551), (GGGGA)n (SEC ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 321- 326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 334-340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 397-445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n~GAP (SEC ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 495- 543), GAP- (GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n- (GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 552-559); en donde n es 1 a 7.
3. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque n es 1 a 4.
4. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de EFGGGGSTR (SEC ID NO: 22), GAP (SEC ID NO: 9), GGGGS (SEC ID NO: 12), GPSGSPG (SEC ID NO: 23), GPSGSPGT (SEC ID NO: 24), GPSGSPGH (SEC ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEC ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEC ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 59), GGGGA (SEC ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEC ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEC ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)8GGGPSH] (SEC ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)gGGGPSH] (SEC ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEC ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEC ID NO: 89), y GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 90).
5. La proteína de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
6. La proteína de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36) GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
7. Una proteína de fusión terapéutica objetivo caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica a la proteína humana a-N-acetilglucosaminidasa (Naglu), una etiqueta de péptido que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro y un péptido espaciador localizado entre la secuencia de aminoácido Naglu y la etiqueta del péptido IGF-II, en donde el espaciador comprende la secuencia de aminoácido GAP (SEC ID NO: 9), GPS (SEC ID NO: 10), o GGS (SEC ID NO: 11).
8. La proteína de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la secuencia espad adora comprende los aminoácidos Gly-Pro-Ser (GPS) (SEC ID NO: 10) entre los aminoácidos de IGF-II humano maduro y los aminoácidos de Naglu humano.
9. La proteína de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGGS (SEC ID NO: 12), GGGGA (SEC ID NO: 60) o GGGS (SEC ID NO: 16).
10. La proteína de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGPS (SEC ID NO: 14) o GGGSP (SEC ID NO: 15).
11. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido AAAAS (SEC ID NO: 17) o AAAS (SEC ID NO: 18).
12. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido PAPA (SEC ID NO: 19) o TPAPA (SEC ID NO: 20).
13. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido AAAKE (SEC ID NO: 21).
14. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de: (GGGGS)n (SEC ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 163-169), GAP- (GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 170-218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 219-267), GAP- (GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 268-316), GAP- (GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 544-551), (GGGGA)n (SEC ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 334- 340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n- AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 397-445), GAP- (GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 552- 559); en donde es 1 a 7.
15. La proteína de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque n es 1 a 4.
16. La proteína de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de EFGGGGSTR (SEC ID NO: 22), GAP (SEC ID NO: 9), GGGGS (SEC ID NO: 12), GPSGSPG (SEC ID NO: 23), GPSGSPGT (SEC ID NO: 24), GPSGSPGH (SEC ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEC ID NO: 26) GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEC ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS SEC ID NO 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 59), GGGGA (SEC ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEC ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEC ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 68) GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS (SEC ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)gGGGPSH] (SEC ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)gGGGPSH] (SEC ID NO: 86), GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEC ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEC ID NO 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEC ID NO: 89), y GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 90)
17. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS 'SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
18. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
19. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la etiqueta de péptido es una etiqueta N-terminal o una etiqueta C-terminal.
20. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la etiqueta de péptido es una etiqueta C-terminal.
21. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el espaciador comprende una secuencia de aminoácido Gly-Ala-Pro (GAP) (SEC ID NO: 9) o Gly-Pro-Ser (GPS) (SEC ID NO: 10).
22. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el dominio de objetivo lisosomal comprende los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro.
23. La proteina de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque el espaciador comprende una estructura alfa-helicoidal o una estructura rígida.
24. La proteína de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la etiqueta de péptido IGF-II comprende una mutación en el residuo Arg37.
25. La proteína de fusión terapéutica objetivo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la mutación es una sustitución de alanina por arginina.
26. La proteína de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, además que comprende un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
27. Una composición farmacéutica adecuada para tratar enfermedad de almacenamiento lisosomal caracterizada porque comprende una proteína de fusión terapéutica objetivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
28. Un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión terapéutica objetivo, caracterizado porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
29. Una célula caracterizada porque contiene el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27.
30. Un método para producir una proteína de fusión terapéutica objetivo caracterizada porque comprende una etapa de: cultivar células de mamífero en un medio de cultivo celular, en donde las células de mamífero portan el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 28; y el cultivo se realiza bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína de fusión terapéutica objetivo.
31. Un método para tratar una enfermedad de almacenamiento lisosomal en un sujeto caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende una proteina de fusión que comprende una enzima lisosomal, una etiqueta de péptido que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro y un péptido espaciador localizado entre la secuencia de aminoácido de la enzima lisosomal y la etiqueta del péptido IGF-II, en donde el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGPS (SEC ID NO: 14) o GGGSP (SEC ID NO: 15), y opcionalmente además comprende una o más de (i) GAP (SEC ID NO: 9), (ii) GGGGS (SEC ID NO: 12), (iii) GGGS (SEC ID NO: 16), (iv) AAAAS (SEC ID NO: 17), (v) AAAS (SEC ID NO: 18), (vi) PAPA (SEC ID NO: 19), (vii) TPAPA (SEC ID NO: 20), (viii) AAAKE (SEC ID NO: 21) o (ix) GGGGA (SEC ID NO: 60).
32. El método de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de: (GGGGS)n (SEC ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 163-169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 170-218), GAP- (GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 219-267), GAP- (GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 268-316), GAP- (GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 544-551), (GGGGA)n (SEC ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 334- 340), GAP-(GGGGA)„-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n- AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 397-445), GAP- (GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 552- 559); en donde n es 1 a 7.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque n es 1 a 4.
34. Un método para tratar Mucopolisacaridosis Tipo IIIB (Síndrome de Sanfilippo B) en un sujeto caracterizado porque comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende una proteina de fusión que comprende una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica a la proteina humana a-N-acetilglucosaminidasa (Naglu), una etiqueta de péptido que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro y un péptido espaciador localizado entre la secuencia de aminoácido Naglu y la etiqueta del péptido IGF-II, en donde el espaciador comprende la secuencia de aminoácido GAP (SEC ID NO: 9), GPS (SEC ID NO: 10), o GGS (SEC ID NO: 11).
35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la secuencia espad adora comprende los aminoácidos Gly-Pro-Ser (GPS) (SEC ID NO: 10) entre los aminoácidos de IGF-II humano maduro y los aminoácidos de Naglu humano.
36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 35, caracterizado porque el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGGS (SEC ID NO: 12), GGGGA (SEC ID NO: 60) o GGGS (SEC ID NO: 16).
37. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, caracterizado porque el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido GGGPS (SEC ID NO: 14) o GGGSP (SEC ID NO: 15).
38. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 37, caracterizado porque el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido AAAAS (SEC ID NO: 17) o AAAS (SEC ID NO: 18).
39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 38, caracterizado porque el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido PAPA (SEC ID NO: 19) o TPAPA (SEC ID NO: 20).
40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 39, caracterizado porque el péptido espaciador comprende una o más secuencias de aminoácido AAAKE (SEC ID NO: 21).
41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 o 34, caracterizado porque el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de: (GGGGS)n (SEC ID NOs: 12, 56, 58, 91-94), (GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 36, 95-100), GAP-(GGGGS)n-GGGPS (SEC ID NOs: 101-107), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 37, 108-113), GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 114-162), GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 163-169), GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 170-218), GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 219-267), GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 268-316), GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP (SEC ID NOs: 544-551), (GGGGA)n (SEC ID NOs: 60, 79, 81, 317-320), (GGGGA)n-GGGPS (SEC IDNOs: 321-326), GAP-(GGGGA)n-GGGPS (SEC ID NOs: 327-333), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP (SEC ID NOs: 334-340), GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 341-389), GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 390-396), GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP (SEC ID NOs: 397-445), GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 446-494), GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP (SEC ID NOs: 495-543), GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP (SEC ID NOs: 552-559); en donde n es 1 a 7.
42. El método caracterizado porque es de conformidad con la reivindicación 41 en donde n es 1 a 4.
43. Un método para reducir los niveles de glicosaminoglicano in vivo, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto que sufre de Mucopolisacaridosis Tipo IIIB (Síndrome de Sanfillippo B) una cantidad efectiva de una proteina de fusión que comprende i) una secuencia de aminoácido al menos 85% idéntica a la proteína humana a-N-acetilglucosaminidasa (Naglu), ii) una etiqueta de péptido que tiene una secuencia de aminoácido al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro, y iii) un péptido espaciador localizado entre la secuencia de aminoácido Naglu y la etiqueta del péptido IGF-II.
44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31, 34 o 43, caracterizado porque el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de EFGGGGSTR (SEC ID NO: 22), GAP (SEC ID NO: 9), GGGGS (SEC ID NO: 12), GPSGSPG (SEO ID NO: 23), GPSGSPGT (SEC ID NO: 24), GPSGSPGH (SEC ID NO: 25), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST (SEC ID NO: 26), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH (SEC ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 28), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 29), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 30), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 31), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 32), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 33), GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 34), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 35), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 37), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 38), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP (SEC ID NO: 39), GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 40), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 41), GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS (SEC ID NO: 42), GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 43), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS (SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 56), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 57), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID NO: 58), GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP (SEC ID NO: 59), GGGGA (SEC ID NO: 60), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST (SEC ID NO: 61), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH (SEC ID NO: 62), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 63), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 64), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 65), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO:66), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 67), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 68), GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 69), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 70), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS SEC ID NO: 71), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO 72), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 73), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP (SEC ID NO: 74), GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS !SEC ID NO: 75), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 76), GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS SEC ID NO: 77), GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP (SEC ID NO: 78), GGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 79), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 80), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA (SEC ID NO: 81), GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP (SEC ID NO: 82), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)sGGGPS] (SEC ID NO: 83), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)gGGGPSH] (SEC ID NO: 84), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS [o (GGGGA)gGGGPS] (SEC ID NO: 85), GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH [o (GGGGA)gGGGPSH] (SEC ID NO: 86) GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS (SEC ID NO: 87), GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 88), GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS (SEC ID NO: 89), y GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP (SEC ID NO: 90).
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS (SEC ID NO: 44), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP (SEC ID NO: 45), GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS ¡SEC ID NO: 46), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS (SEC ID NO: 48), GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 49), GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS (SEC ID NO: 50), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS (SEC ID NO: 52), GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP (SEC ID NO: 53), GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG (SEC ID NO: 54), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el péptido espaciador comprende una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS (SEC ID NO: 36), GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP (SEC ID NO: 47), GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP (SEC ID NO: 51), GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP (SEC ID NO: 55), y GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS (SEC ID NO: 71).
47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 46, caracterizado porque la secuencia espad adora comprende las secuencias de aminoácidos Gly-Ala-Pro (GAP) (SEC ID NO: 9).
48. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 47, caracterizado porque la etiqueta de péptido es una etiqueta N-terminal o una etiqueta C-terminal.
49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la etiqueta de péptido es una etiqueta C-terminal.
50. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 49, caracterizado porque el espaciador comprende una estructura alfa-helicoidal o una estructura rígida.
51. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 50, caracterizado porque el dominio de objetivo lisosomal comprende los aminoácidos 8-67 de IGF-II humano maduro.
52. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 51, caracterizado porque la etiqueta de péptido IGF-II comprende una mutación en el residuo Arg37.
53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la mutación es una sustitución de alanina por arginina.
54. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 53, caracterizado porque la proteina de fusión comprende aminoácidos 1-743 o aminoácidos 24-743 de Naglu humano (Figuras 1A y IB).
55. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 54, caracterizado porque la cantidad efectiva está en el rango de 2.5-20 mg por kilogramo de peso corporal del sujeto.
56. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 55, caracterizado porque la proteina de fusión es administrada intratecalmente, opcionalmente además que comprende administrar la proteina de fusión intravenosamente.
57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la administración comprende introducir la proteina de fusión en un ventrículo cerebral, área lumbar o cisterna magna.
58. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 55, caracterizado porque la proteina de fusión es administrada intravenosamente.
59. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 58, caracterizado porque la proteina de fusión es administrada bimensualmente, mensualmente, trisemanalmente, bisemanalmente, semanalmente, diariamente, o a intervalos variables.
60. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 59, caracterizado porque el tratamiento resulta en reducir los niveles de glicosaminoglicano (GAG) en un tejido cerebral.
61. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31 a 60, caracterizado porque el tratamiento resulta en reducir los gránulos de almacenamiento lisosomal en un tejido cerebral.
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