TWI626250B - 靶向治療性溶小體酶融合蛋白及其用途 - Google Patents

靶向治療性溶小體酶融合蛋白及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明大體上係關於適用於治療溶小體儲積疾病之治療性融合蛋白及用於治療此等疾病之方法。示範性治療性融合蛋白包含溶小體酶、溶小體靶向部分(例如IGF-II肽)及間隔肽。亦提供治療IIIB型黏多糖病(B型山菲立普症候群(Sanfilippo B Syndrome))之組合物及方法，其包含含有α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(Naglu)、溶小體靶向部分(例如IGF-II肽)及間隔肽的靶向治療性融合蛋白。

Description

靶向治療性溶小體酶融合蛋白及其用途
本申請案主張2012年11月27日申請之美國臨時申請案第61/730,378號及2013年3月15日申請之美國臨時申請案第61/788,968號之優先權益，該等臨時申請案以全文引用的方式併入本文中。
本發明大體上係關於適用於治療溶小體儲積疾病之治療性融合蛋白及治療此等疾病之方法。示範性治療性融合蛋白包含溶小體酶、溶小體靶向部分(例如IGF-II肽)及間隔肽。意欲溶小體酶為α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(Naglu)且疾病為IIIB型黏多糖病(Mucopolysaccharidosis Type IIIB)(B型山菲立普症候群)。
通常，哺乳動物溶小體酶在胞質液中合成且橫越ER，在ER中，其經N-連接之高甘露糖型碳水化合物糖基化。在高爾基體(golgi)中，藉由添加使此等蛋白質靶向溶小體之甘露糖-6-磷酸(M6P)來修飾溶小體酶上之高甘露糖碳水化合物。經由與兩種M6P受體之任一者相互作用來使M6P修飾之蛋白質傳遞至溶小體。最有利之修飾形式為當添加兩個M6P至高甘露糖碳水化合物中時。
超過40種溶小體儲積疾病(LSD)係因在溶小體中不存在一或多種溶小體酶而直接或間接引起。正積極推行用於LSD之酶補充療法。療法通常需要LSD蛋白質以M6P依賴性方式被攝取且傳遞至多種細胞類 型之溶小體。一種可能之方法涉及純化LSD蛋白質且用M6P對其進行修飾以併入碳水化合物部分。歸因於與細胞表面上之M6P受體之相互作用，此經修飾物質可比未修飾LSD蛋白質更高效地由細胞攝取。
本申請案之發明人先前已開發一種允許將治療性酶更高效傳遞至溶小體之肽基靶向技術。此專有技術稱為糖基化非依賴性溶小體靶向(GILT)，因為肽標籤替代M6P作為靶向溶小體之部分。GILT技術之詳情描述於美國申請公開案第2003-0082176號、第2004-0006008號、第2003-0072761號、第2005-0281805號、第2005-0244400號、及國際公開案WO 03/032913、WO 03/032727、WO 02/087510、WO 03/102583、WO 2005/078077中，該等所有公開案之揭露內容據此以引用的方式併入本文中。
本發明提供用於基於GILT技術達成高效溶小體靶向之進一步改良組合物及方法。本發明尤其提供用於使用溶小體靶向肽使溶小體酶靶向溶小體之方法及組合物。本發明亦提供用於使用對IGF-I受體之結合親和力降低或減弱及/或對胰島素受體之結合親和力降低或減弱及/或對弗林蛋白酶(furin)裂解具有抗性之溶小體靶向肽使溶小體酶靶向溶小體之方法及組合物。本發明亦提供包含溶小體酶以及提供溶小體酶融合蛋白之產生及向溶小體中之攝取改良之IGF-II及間隔肽的溶小體酶融合蛋白。在某些實施例中，溶小體酶為α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(Naglu)。
在一態樣中，本發明提供一種靶向治療性融合蛋白，其包含溶小體酶、胺基酸序列與成熟人類IGF-II之胺基酸8-67至少70%一致之肽標籤、及在該溶小體酶與該IGF-II肽標籤之間的間隔肽。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個GGGPS(SEQ ID NO：14)或GGGSP(SEQ ID NO：15)胺基酸序列，且視情況進一步包含以下一或多者：(i)GAP(SEQ ID NO：9)、(ii)GGGGS(SEQ ID NO：12)、(iii)GGGS(SEQ ID NO：16)、(iv)AAAAS(SEQ ID NO：17)、(v)AAAS(SEQ ID NO：18)、(vi)PAPA(SEQ ID NO：19)、(vii)TPAPA(SEQ ID NO：20)、(viii)AAAKE(SEQ ID NO：21)或(ix)GGGGA(SEQ ID NO：60)。
本文涵蓋之示範性溶小體酶包括表1中所述者。
在各種實施例中，靶向治療性融合蛋白包含與人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(Naglu)蛋白質(圖1，SEQ ID NO：1)至少85%一致之胺基酸序列、胺基酸序列與成熟人類IGF-II之胺基酸8-67至少70%一致之肽標籤、及位於該Naglu胺基酸序列與該IGF-II肽標籤之間的間隔肽。在各種實施例中，間隔子包含胺基酸序列GAP(SEQ ID NO：9)、GPS(SEQ ID NO：10)或GGS(SEQ ID NO：11)。在各種實施例中，間隔子序列包含在成熟人類IGF-II之胺基酸與人類Naglu之胺基酸之間的胺基酸Gly-Pro-Ser(GPS)(SEQ ID NO：10)。
在各種實施例中，間隔肽包含一或多個GGGGS(SEQ ID NO：12)或GGGS(SEQ ID NO：16)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個GGGPS(SEQ ID NO：14)或GGGSP(SEQ ID NO：15)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個AAAAS(SEQ ID NO：17)或AAAS(SEQ ID NO：18)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個PAPA(SEQ ID NO：19)或TPAPA(SEQ ID NO：20)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個AAAKE(SEQ ID NO：21)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個GGGGA(SEQ ID NO：60)胺基酸序列。
在各種實施例中，間隔肽包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：(GGGGS)n(SEQ ID NO：12、56、58、91-94)、(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO：36、95-100)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO：101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO：37、108-113)、 GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO：114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO：163-169)、GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO：170-218)、GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：219-267)、GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：268-316)、GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO：544-551)、(GGGGA)n(SEQ ID NO：60、79、81、317-320)、(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO：321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO：327-333)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO：334-340)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO：341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO：390-396)、GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO：397-445)、GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：495-543)、GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO：552-559)；其中n為1至7。在各種實施例中，n為1至4。
在各種實施例中，本發明提供一種用作使肽或包含肽之融合蛋白靶向哺乳動物溶小體之肽標籤的IGF-II肽。在各種實施例中，本發明提供一種IGF-II突變蛋白質。在各種實施例中，本發明提供一種具有與成熟人類IGF-II(AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE)(SEQ ID NO：5)至少70%一致之胺基酸序列及消除至少一個弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點之突變的弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質。
在一些實施例中，本發明提供一種包含與成熟人類IGF-II至少70%一致之胺基酸序列的IGF-II突變蛋白質。在各種實施例中，IGF-II突變 蛋白質肽標籤包含成熟人類IGF-II之胺基酸8-67。在各種實施例中，IGF-II突變蛋白質包含相較於野生型人類IGF-II，降低或減弱對胰島素受體之結合親和力之突變。
在一些實施例中，相對於天然存在之人類IGF-II對IGF-I受體之親和力，IGF-II突變蛋白質對IGF-I受體之結合親和力減弱。
在各種實施例中，本發明提供一種含有溶小體酶；及胺基酸序列與成熟人類IGF-II至少70%一致之IGF-II突變蛋白質的靶向治療性融合蛋白，其中該IGF-II突變蛋白質對弗林蛋白酶裂解具有抗性且以甘露糖-6-磷酸非依賴性方式結合人類陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體。
在一些實施例中，本發明提供一種含有溶小體酶；及胺基酸序列與成熟人類IGF-II至少70%一致，且相對於天然存在之人類IGF-II對胰島素受體之親和力，對胰島素受體之結合親和力減弱之IGF-II突變蛋白質的靶向治療性融合蛋白。在一相關實施例中，IGF-II突變蛋白質對弗林蛋白酶裂解具有抗性且以甘露糖-6-磷酸非依賴性方式結合人類陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體。
在各種實施例中，適於本發明之IGF-II突變蛋白質在對應於成熟人類IGF-II之胺基酸30-40之區域內包括突變。在一些實施例中，適於本發明之IGF-II突變蛋白質在對應於成熟人類IGF-II之胺基酸34-40之區域內包括突變以使該突變消除至少一個弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點。在一些實施例中，適合突變為胺基酸取代、缺失及/或插入。在一些實施例中，突變為在對應於成熟人類IGF-II之Arg37或Arg40之位置處的胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代為Lys或Ala取代。
在一些實施例中，適合突變為缺失或置換對應於選自由以下組成之群之位置的胺基酸殘基：成熟人類IGF-II之30-40、31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40及其組合。
在各種實施例中，本發明之IGF-II突變蛋白質進一步含有對應於成熟人類IGF-II之位置2-7之胺基酸的缺失或置換。在各種實施例中，本發明之IGF-II突變蛋白質進一步包括對應於成熟人類IGF-II之位置1-7之胺基酸的缺失或置換。在各種實施例中，本發明之IGF-II突變蛋白質進一步含有對應於成熟人類IGF-II之位置62-67之胺基酸的缺失或置換。在各種實施例中，本發明之IGF-II突變蛋白質進一步在對應於成熟人類IGF-II之Tyr27、Leu43或Ser26之位置處含有胺基酸取代。在各種實施例中，本發明之IGF-II突變蛋白質含有至少一個選自由以下組成之群之胺基酸取代：Tyr27Leu、Leu43Val、Ser26Phe及其組合。在各種實施例中，本發明之IGF-II突變蛋白質含有對應於成熟人類IGF-II之位置48-55之胺基酸。在各種實施例中，本發明之IGF-II突變蛋白質含有至少三個選自由以下組成之群之胺基酸：對應於成熟人類IGF-II之位置8、48、49、50、54及55之胺基酸。在各種實施例中，本發明之IGF-II突變蛋白質在對應於成熟人類IGF-II之位置54及55之位置處含有各自在pH 7.4下不帶電荷或帶負電荷之胺基酸。在各種實施例中，相對於天然存在之人類IGF-II對IGF-I受體之親和力，IGF-II突變蛋白質對IGF-I受體之結合親和力減弱。在各種實施例中，IGF-II突變蛋白質為IGF2△8-67 R37A(亦即成熟人類IGF-II之在成熟人類IGF-II之位置37處之Arg經Ala取代的胺基酸8-67)。
在各種實施例中，肽標籤連接於溶小體酶之N末端或C末端，因此其分別為N末端標籤或C末端標籤。在各種實施例中，肽標籤為C末端標籤。
在一些實施例中，適於本發明之溶小體酶為人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(Naglu)(圖1)或其功能性片段或變異體。在一些實施例中，適於本發明之溶小體酶包括人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶之胺基酸1-743或人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶之缺乏信號序列之胺基酸 24-743。
在各種實施例中，本發明之靶向治療性融合蛋白進一步在溶小體酶與IGF-II突變蛋白質之間包括間隔子。
在各種實施例中，間隔子包含α螺旋結構或剛性結構。
在各種實施例中，間隔子包含一或多個Gly-Ala-Pro(GAP)(SEQ ID NO：9)、Gly-Pro-Ser(GPS)(SEQ ID NO：10)或Gly-Gly-Ser(GGS)(SEQ ID NO：11)胺基酸序列。
在一些實施例中，間隔子係選自由以下組成之群：EFGGGGSTR(SEQ ID NO：22)、GAP(SEQ ID NO：9)、GGGGS(SEQ ID NO：12)、GPSGSPG(SEQ ID NO：23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO：24)、GPSGSPGH(SEQ ID NO：25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID NO：26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO：27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGS GGGPS(SEQ ID NO：34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO：40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO：42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO：44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO：45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ ID NO：46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO：48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO：50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、 GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO：52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO：53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO：54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：59)、GGGGA(SEQ ID NO：60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO：61)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO：62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAG GGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO：75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO：77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO：80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO：82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO：83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO：84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO：85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO：86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO：87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO：88)、 GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO：89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO：90)。
在一些實施例中，間隔子係選自由以下組成之群：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO：44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO：45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ ID NO：46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO：48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO：50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO：52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO：53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO：54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)。
在一些實施例中，間隔子係選自由以下組成之群：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)、 GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)。
在各種實施例中，融合蛋白進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
本發明亦提供編碼如上在各種實施例中所述之IGF-II突變蛋白質或靶向治療性融合蛋白之核酸。本發明進一步提供含有本發明之核酸之各種細胞。
本發明提供適於治療溶小體儲積疾病之含有治療有效量之本發明之靶向治療性融合蛋白的醫藥組合物。本發明進一步提供治療溶小體儲積疾病之方法，其包含向需要治療之個體投與本發明之靶向治療性融合蛋白。在一些實施例中，溶小體儲積疾病為IIIB型黏多糖病(B型山菲立普症候群)。
在另一態樣中，本發明提供一種產生靶向治療性融合蛋白之方法，其包括在細胞培養基中培養哺乳動物細胞之步驟，其中該等哺乳動物細胞攜帶特定言之如本文各種實施例中所述之本發明之核酸；且在允許表現該靶向治療性融合蛋白之條件下進行培養。
在另一態樣中，本發明提供一種產生靶向治療性融合蛋白之方法，其包括在細胞培養基中培養缺乏弗林蛋白酶之細胞(例如缺乏弗林蛋白酶之哺乳動物細胞)，其中該等缺乏弗林蛋白酶之細胞攜帶編碼包含溶小體酶及胺基酸序列與成熟人類IGF-II至少70%一致之IGF-II突變蛋白質之融合蛋白的核酸，其中該IGF-II突變蛋白質以甘露糖-6-磷酸非依賴性方式結合人類陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體；且其中在允許表現該靶向治療性融合蛋白之條件下進行培養。
在各種實施例中，意欲某些包含如本文所述之間隔子之靶向治療 性蛋白質相較於包含不同間隔肽之靶向治療性蛋白質在重組表現時展現活性蛋白質之表現增加。在各種實施例中，亦意欲本文所述之靶向治療性蛋白質相較於本文其他靶向治療性蛋白質可具有增加之活性。意欲相較於包含不同間隔肽之其他靶向治療性蛋白質展現活性蛋白質之表現增加及/或具有增加之活性的彼等靶向治療性蛋白質用於進一步實驗。
在另一態樣中，本發明提供一種治療個體之溶小體儲積疾病之方法，其包含向該個體投與治療有效量之包含融合蛋白之醫藥組合物，該融合蛋白包含溶小體酶、胺基酸序列與成熟人類IGF-II之胺基酸8-67至少70%一致之肽標籤及位於該溶小體酶胺基酸序列與該IGF-II肽標籤之間的間隔肽。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個GGGPS(SEQ ID NO：14)或GGGSP(SEQ ID NO：15)胺基酸序列，且視情況進一步包含以下一或多者：(i)GAP(SEQ ID NO：9)、(ii)GGGGS(SEQ ID NO：12)、(iii)GGGS(SEQ ID NO：16)、(iv)AAAAS(SEQ ID NO：17)、(v)AAAS(SEQ ID NO：18)、(vi)PAPA(SEQ ID NO：19)、(vii)TPAPA(SEQ ID NO：20)、(viii)AAAKE(SEQ ID NO：21)或(ix)GGGGA(SEQ ID NO：60)。
在各種實施例中，間隔肽包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：(GGGGS)n(SEQ ID NO：12、56、58、91-94)、(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO：36、95-100)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO：101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO：37、108-113)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO：114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO：163-169)、GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO：170-218)、GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：219-267)、GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：268-316)、 GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO：544-551)、(GGGGA)n(SEQ ID NO：60、79、81、317-320)、(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO：321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO：327-333)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO：334-340)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO：341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO：390-396)、GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO：397-445)、GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：495-543)、GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO：552-559)；其中n為1至7，視情況n為1至4。
在各種實施例中，間隔肽具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：EFGGGGSTR(SEQ ID NO：22)、GAP(SEQ ID NO：9)、GGGGS(SEQ ID NO：12)、GPSGSPG(SEQ ID NO：23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO：24)、GPSGSPGH(SEQ ID NO：25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID NO：26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO：27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：31)、 GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO：40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO：42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO：44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO：45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ ID NO：46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTST GPSGAP(SEQ ID NO：47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO：48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO：50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO：52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO：53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO：54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：59)、GGGGA(SEQ ID NO：60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO：61)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO：62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：67)、 GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO：75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO：77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO：80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO：82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO：83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO：84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGG GAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO：85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO：86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO：87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO：88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO：89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO：90)。
在各種實施例中，間隔肽具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO：44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO：45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ ID NO：46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO：48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO：50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO：52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO：53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO：54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)。
在各種實施例中，間隔肽具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)。
由本文方法涵蓋之示範性溶小體儲積疾病包括表1中所述者。意欲使用包含溶小體儲積疾病中缺乏之亦揭露於表1中之酶的靶向治療性融合蛋白治療溶小體儲積疾病。
在各種實施例中，本發明提供一種治療個體之IIIB型黏多糖病(B型山菲立普症候群)之方法，其包含向該個體投與治療有效量之包含融合蛋白的醫藥組合物，該融合蛋白包含與人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(Naglu)蛋白質(SEQ ID NO：1)至少85%一致之胺基酸序列、胺基酸序列與成熟人類IGF-II之胺基酸8-67至少70%一致之肽標籤及位於該Naglu胺基酸序列與該IGF-II肽標籤之間的間隔肽。在各種實施例中，間隔子包含胺基酸序列GAP(SEQ ID NO：9)、GPS(SEQ ID NO：10)或GGS(SEQ ID NO：11)。
在各種實施例中，間隔子序列包含在成熟人類IGF-II之胺基酸與人類Naglu之胺基酸之間的胺基酸Gly-Pro-Ser(GPS)(SEQ ID NO：10)。
在各種實施例中，間隔肽包含一或多個GGGGS(SEQ ID NO：12)或GGGS(SEQ ID NO：16)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個GGGPS(SEQ ID NO：14)或GGGSP(SEQ ID NO：15)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個AAAAS(SEQ ID NO：17) 或AAAS(SEQ ID NO：18)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個PAPA(SEQ ID NO：19)或TPAPA(SEQ ID NO：20)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個AAAKE(SEQ ID NO：21)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個GGGGA(SEQ ID NO：60)胺基酸序列。
在各種實施例中，間隔肽包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：(GGGGS)n(SEQ ID NO：12、56、58、91-94)、(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO：36、95-100)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO：101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO：37、108-113)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO：114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO：163-169)、GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO：170-218)、GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：219-267)、GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：268-316)、GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO：544-551)、(GGGGA)n(SEQ ID NO：60、79、81、317-320)、(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO：321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO：327-333)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO：334-340)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO：341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO：390-396)、GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO：397-445)、GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：495-543)、GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO：552-559)；其中n為1至7，視情況其中n為1至4。
在各種實施例中，本發明提供一種降低活體內醣胺聚多醣(GAG)含量之方法，其包含向罹患IIIB型黏多糖病(B型山菲立普症候群)之個體投與有效量之融合蛋白，該融合蛋白包含i)與人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(Naglu)蛋白質(SEQ ID NO：1)至少85%一致之胺基酸序列，ii)胺基酸序列與成熟人類IGF-II之胺基酸8-67至少70%一致之肽標籤，及iii)位於該Naglu胺基酸序列與該IGF-II肽標籤之間的間隔肽。
在各種實施例中，間隔子序列包含在成熟人類IGF-II之胺基酸與人類Naglu之胺基酸之間的胺基酸Gly-Ala-Pro(GAP)(SEQ ID NO：9)之一或多個複本。
在各種實施例中，間隔肽係選自由以下組成之群：EFGGGGSTR(SEQ ID NO：22)、GAP(SEQ ID NO：9)、GGGGS(SEQ ID NO：12)、GPSGSPG(SEQ ID NO：23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO：24)、GPSGSPGH(SEQ ID NO：25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID NO：26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO：27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO：40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO：42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO：44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO：45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ ID NO：46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO：48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO： 49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO：50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO：52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO：53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO：54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：59)、GGGGA(SEQ ID NO：60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO：61)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO：62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：68)、 GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO：75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO：77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO：80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO：82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO：83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO：84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO：85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGG GAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO：86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO：87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO：88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO：89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO：90)。
在各種實施例中，間隔肽係選自由以下組成之群：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO：44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO：45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ ID NO：46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO：48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO：50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO：52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO：53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO：54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)。
在各種實施例中，間隔肽係選自由以下組成之群： GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)。
在各種實施例中，溶小體靶向域或IGF-II肽標籤包含成熟人類IGF-II(SEQ ID NO：2、4)之胺基酸8-67。在各種實施例中，IGF-II肽標籤在殘基Arg37處包含突變。在各種實施例中，突變為丙胺酸被取代成精胺酸。在各種實施例中，溶小體靶向域或IGF-II肽標籤包含IGF2△8-67 R37A。
在各種實施例中，融合蛋白包含人類Naglu(SEQ ID NO：1、3)之胺基酸1-743。在各種實施例中，融合蛋白包含人類Naglu之胺基酸24-743。
在各種實施例中，融合蛋白之有效量在每公斤個體體重約0.1-1mg、約1-5mg、約2.5-20mg、約5-20mg、約10-50mg、或20-100mg之範圍內。在各種實施例中，融合蛋白之有效量為每公斤個體體重約2.5-20mg。
在各種實施例中，融合蛋白係鞘內、靜脈內、肌肉內、非經腸、經皮或經黏膜投與。在各種實施例中，融合蛋白係鞘內投與。在各種實施例中，鞘內投藥視情況進一步包含靜脈內投與融合蛋白。
在各種實施例中，鞘內投藥包含將融合蛋白引入腦室、腰區域或大池中。
在各種實施例中，融合蛋白係每兩月、每月、每三週、每兩週、每週、每日或在可變間隔下投與。 在各種實施例中，治療導致腦組織中之醣胺聚多醣(GAG)含量降低。進一步意欲治療導致腦組織中之溶小體儲積顆粒降低。
亦涵蓋用於治療溶小體儲積疾病之包含如本文所述之靶向治療性融合蛋白的組合物。示範性溶小體儲積疾病包括表1中所述者。
本發明之其他特徵、目標及優勢在以下詳細描述中顯而易知。然而，應瞭解儘管指示本發明之實施例，但詳細描述僅藉由說明而非限制方式給出。在本發明之範疇內之各種變化及修改將根據詳細描述而變得為熟習此項技術者顯而易知。
圖式僅出於說明目的而非出於限制目的。
圖1描述包含(A)Naglu及(B)包含IGF-II之殘基8-67且在殘基37處具有胺基酸取代R37A(Arg37Ala)之IGF-II肽的示範性治療性融合蛋白之一部分的胺基酸序列。
圖2描述包含(A)Naglu及(B)包含IGF-II之殘基8-67且在殘基37處具有胺基酸取代R37A(Arg37Ala)之IGF-II肽的示範性治療性融合蛋白之一部分的核苷酸序列。
圖3揭露意欲用於治療性融合蛋白中之示範性間隔子序列。
定義
改善：如本文所用，術語「改善」意謂預防、減輕或緩解個體之狀態或改良個體之狀態。改善包括但不需要使疾病狀況完全恢復或完全預防。在一些實施例中，改善包括降低相關疾病組織之溶小體內部之物質累積。
弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質：如本文所用，術語「弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質」係指基於IGF-II之肽，其含有消除至少一個天然弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點或改變接近或鄰近於天然弗林蛋白 酶蛋白酶裂解位點之序列以使相較於野生型人類IGF-II肽，弗林蛋白酶裂解得以阻止、抑制、降低或減緩的經改變胺基酸序列。如本文所用，弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質亦稱為對弗林蛋白酶具有抗性之IGF-II突變蛋白質。
弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點：如本文所用，術語「弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點」(亦稱為「弗林蛋白酶裂解位點」或「弗林蛋白酶裂解序列」)係指充當由弗林蛋白酶或弗林蛋白酶樣蛋白酶進行酶促蛋白酶裂解之識別序列的肽或蛋白質。通常，弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點具有共同序列Arg-X-X-Arg(SEQ ID NO：6)，X為任何胺基酸。裂解位點位於序列中之羧基末端精胺酸(Arg)殘基之後。在一些實施例中，弗林蛋白酶裂解位點可具有共同序列Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg(SEQ ID NO：7)，X為任何胺基酸。裂解位點位於序列中之羧基末端精胺酸(Arg)殘基之後。
弗林蛋白酶：如本文所用，術語「弗林蛋白酶」係指可識別且裂解如本文定義之弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點之任何蛋白酶，包括弗林蛋白酶或弗林蛋白酶樣蛋白酶。弗林蛋白酶亦稱為成對鹼性胺基酸裂解酶(paired basic amino acid cleaving enzyme，PACE)。弗林蛋白酶屬於枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)樣原蛋白轉化酶家族。編碼弗林蛋白酶之基因稱為FUR(FES上游區域)。
缺乏弗林蛋白酶之細胞：如本文所用，術語「缺乏弗林蛋白酶之細胞」係指弗林蛋白酶蛋白酶活性受抑制、降低或消除之任何細胞。缺乏弗林蛋白酶之細胞包括不產生弗林蛋白酶或產生降低量之弗林蛋白酶或缺陷性弗林蛋白酶蛋白酶之哺乳動物細胞與非哺乳動物細胞兩者。
糖基化非依賴性溶小體靶向：如本文所用，術語「糖基化非依賴性溶小體靶向」(亦稱為「GILT」)係指甘露糖-6-磷酸非依賴性溶小體 靶向。
人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶：如本文所用，術語「人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶」(亦稱為「Naglu」)係指能夠降低哺乳動物溶小體中之醣胺聚多醣(GAG)含量或可救助或改善一或多種MPS IIIB(B型山菲立普症候群)症狀的前驅體(亦即含有天然Naglu信號肽序列)或經加工(亦即缺乏天然Naglu信號肽序列)野生型形式之人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶或其功能性片段或變異體。如本文所用，術語「功能性」在其涉及Naglu時係指Naglu酶能夠由哺乳動物溶小體攝取且具有足以降低哺乳動物溶小體中之儲積物質(亦即醣胺聚多醣(GAG))之酶活性。
IGF-II突變蛋白質：如本文所用，術語「IGF-II突變蛋白質」係指含有經改變胺基酸序列之基於IGF-II之肽。如本文所用，術語「弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質」係指基於IGF-II之肽，其含有消除至少一個天然弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點或改變接近或鄰近於天然弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點之序列以使相較於野生型人類IGF-II肽，弗林蛋白酶裂解得以阻止、抑制、降低或減緩的經改變胺基酸序列。如本文所用，弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質亦稱為對弗林蛋白酶具有抗性之IGF-II突變蛋白質。
改良、增加或降低：如本文所用，術語「改良」、「增加」或「降低」或語法等效形式指示相對於基線量測結果的值，該基線量測結果諸如同一個體中在啟始本文所述之治療之前的量測結果或對照個體(或多個對照個體)中在不存在本文所述之治療下的量測結果。「對照個體」為受與所治療個體相同形式之溶小體儲積疾病(例如MPS IIIB(B型山菲立普症候群))折磨的個體，其年齡與所治療個體近似相同(以確保所治療個體及對照個體之疾病階段類似)。
個體(individual/subject)、患者：如本文所用，術語「個體」或「患者」係指人類或非人類哺乳動物個體。所治療個體(亦稱為「患者」) 為罹患溶小體儲積疾病，例如MPS IIIB(B型山菲立普症候群)(亦即嬰兒、青少年或成年發作或重度/經典類型或減弱類型MPS IIIB(B型山菲立普症候群))或有可能顯現溶小體儲積疾病(例如MPS IIIB(B型山菲立普症候群))之個體(胎兒、嬰兒、兒童、青少年或成年人類)。
溶小體儲積疾病：如本文所用，「溶小體儲積疾病」係指一組由溶小體中缺乏至少一種為使巨分子斷裂成肽、胺基酸、單醣、核酸及脂肪酸所需之酶(例如酸水解酶)引起的遺傳病症。因此，罹患溶小體儲積疾病之個體在溶小體中具有累積物質。示範性溶小體儲積疾病列於表1中。
溶小體酶：如本文所用，術語「溶小體酶」係指能夠降低哺乳動物溶小體中之累積物質或可救助或改善一或多種溶小體儲積疾病症狀之任何酶。適於本發明之溶小體酶包括野生型或經修飾溶小體酶兩者且可使用重組及合成方法產生或自天然來源純化。示範性溶小體酶列於表1中。
間隔子：如本文所用，術語「間隔子」(亦稱為「連接子」)係指融合蛋白中之兩個蛋白質部分之間的肽序列。間隔子通常經設計以具有可撓性或插入兩個蛋白質部分之間的結構，諸如α螺旋。間隔子可相對較短，例如序列Gly-Ala-Pro(GAP)(SEQ ID NO：9)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)(SEQ ID NO：12)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ala(GGGGA)(SEQ ID NO：60)或Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro(GGGGGP)(SEQ ID NO：13)，或可較長，諸如長度為10-25個胺基酸、25-50個胺基酸或35-55個胺基酸。示範性間隔子序列更詳細揭露於詳細描述中。
治療有效量：如本文所用，術語「治療有效量」或「有效量」係指靶向治療性融合蛋白之在可適用於任何醫學治療之合理效益/風險比下對所治療個體賦予治療效應的量。治療效應可為客觀的(亦即可藉由某一測試或標記物量測)或主觀的(亦即個體指示或感受效應)。特定 言之，「治療有效量」係指治療性融合蛋白或組合物之有效治療、改善或預防所要疾病或病狀，或諸如藉由改善與疾病相關之症狀，預防或延遲疾病發作及/或亦減小疾病症狀之嚴重性或頻率來展現可偵測治療或預防效應的量。通常以可包含多個單位劑量之給藥方案投與治療有效量。對於任何特定治療性融合蛋白，治療有效量(及/或有效給藥方案內之適當單位劑量)可例如視投藥途徑、與其他醫藥藥劑之組合而變化。此外，用於任何特定患者之特定治療有效量(及/或單位劑量)可取決於多種因素，包括所治療病症及病症之嚴重性；所用特定醫藥藥劑之活性；所用特定組合物；患者之年齡、體重、一般健康狀況、性別及膳食；投藥時間、投藥途徑及/或所用特定融合蛋白之排泄或代謝速率；治療之持續時間；及如醫學技術中所熟知之類似因素。
治療：如本文所用，術語「治療」係指治療性融合蛋白或包含該治療性融合蛋白之醫藥組合物之部分或完全緩和、改善、減輕、抑制特定疾病、病症及/或病狀之一或多種症狀或特徵、延遲該一或多種症狀或特徵之發作、減輕該一或多種症狀或特徵之嚴重性及/或降低該一或多種症狀或特徵之發生率的任何投藥。此治療可針對不展現相關疾病、病症及/或病狀之徵象之個體及/或針對僅展現疾病、病症及/或病狀之早期徵象之個體。或者或另外，此治療可針對展現相關疾病、病症及/或病狀之一或多種確立徵象之個體。舉例而言，治療可係指改良心臟狀態(例如增加舒張末期及/或收縮末期容積、或減輕、改善或預防通常見於例如蓬佩病(Pompe disease)中之進行性心肌病)或肺功能(例如使啼哭肺活量增加超過基線量及/或使啼哭期間之氧去飽和正常化)；改良神經發育及/或運動技能(例如增加AIMS計分)；降低儲積(例如受疾病影響之個體之組織中的醣胺聚多醣(GAG)含量)；或此等效應之任何組合。在一些實施例中，治療包括改良醣胺聚多醣(GAG)清除率，特定言之減輕或預防MPS IIIB(B型山菲立普症候群)相關之神經性 症狀。
如本申請案中所用，術語「約」及「近似」作為等效物加以使用。與或不與約/近似一起用於本申請案中之任何數字皆意欲涵蓋由一般熟習相關技術者所瞭解之任何正常波動。
發明之詳細描述
本發明提供用於基於糖基化非依賴性溶小體靶向(GILT)技術達成靶向溶小體酶之改良方法及組合物。本發明尤其提供對弗林蛋白酶具有抗性及/或對胰島素受體之結合親和力降低或減弱及/或對IGF-I受體之結合親和力降低或減弱之IGF-II突變蛋白質及含有本發明之IGF-II突變蛋白質之靶向治療性融合蛋白。本發明亦提供其製備及使用方法。
本發明之態樣詳述於以下章節中。使用該等章節不意欲限制本發明。各章節可適用於本發明之任何態樣。在本申請案中，除非另外陳述，否則使用「或」意謂「及/或」。
溶小體酶
適於本發明之溶小體酶包括能夠降低哺乳動物溶小體中之累積物質或可救助或改善一或多種溶小體儲積疾病症狀之任何酶。適合溶小體酶包括野生型或經修飾溶小體酶兩者且可使用重組及合成方法產生或自天然來源純化。示範性溶小體酶列於表1中。
在一些實施例中，本文涵蓋之溶小體酶包括以下多肽序列：與表1中所示之人類酶之天然存在之聚核苷酸序列具有50-100%，包括50%、55%、60%、65%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%及100%序列一致性，同時仍然編碼具有功能性，亦即能夠降低哺乳動物溶小體中之累積物質(例如醣胺聚多醣(GAG))或可救助或改善一或多種溶小體儲積疾病症狀的蛋白質。
關於溶小體酶序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比，且不考慮任何保守性取代作為序列一致性之一部分之後，候選序列中與天然存在之人類酶序列中之胺基酸殘基相同的胺基酸殘基之百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以屬於此項技術中之技能之多種方式達成，該等方式例如使用可公開獲得之電腦軟體，諸如 BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定適用於量測比對之參數，包括為歷經所比較序列之全長，達成最大對準所需之任何算法。較佳地，WU-BLAST-2軟體用於確定胺基酸序列一致性(Altschul等人，Methods in Enzymology 266,460-480(1996)。WU-BLAST-2使用若干搜尋參數，其中大多數被設置成內定值。可調整參數設為以下值：重疊間距=1，重疊分數=0.125，字臨限值(T)=11。HSP計分(S)及HSP S2參數為動態值且由程式自身視特定序列之組成來確定，然而，最小值可經調整且如上所指示加以設置。
α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶
α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶Naglu係以加工成成熟形式之前驅體分子形式產生。此過程通常在蛋白質進入內質網時藉由移除具有23個胺基酸之信號肽來進行。通常，前驅體形式亦稱為全長前驅體或全長Naglu蛋白質，其含有743個胺基酸(SEQ ID NO：1)。當前驅體蛋白質進入內質網時，N末端23個胺基酸經裂解，從而產生經加工或成熟形式。因此，意欲N末端23個胺基酸通常不為Naglu蛋白質活性所需。典型野生型或天然存在之人類Naglu蛋白質之成熟形式及全長前驅體形式的胺基酸序列顯示於圖1中且闡述於SEQ ID NO：1中。人類Naglu之編碼區之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO：3中。人類Naglu之mRNA序列用Genbank登錄號NM_000263加以描述。在各種實施例中，Naglu為具有(胺基酸1-743)或不具有(胺基酸24-743)信號序列之人類Naglu。
美國專利第6,255,096號描述純化人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(亦即82kDa及77kDa)及於CHO細胞中產生之重組哺乳動物α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(亦即89kDa及79kDa)之分子量大於Naglu多肽之推演分子量(亦即70kDa)，表明純化及重組多肽經轉譯後修飾。亦參見Weber等人，Hum Mol Genet 5：771-777,1996。
IIIB型黏多糖病(B型山菲立普症候群)
一種示範性溶小體儲積疾病為IIIB型黏多糖病(MPS IIIB)，亦稱為B型山菲立普症候群。MPS IIIBB型山菲立普症候群為一種特徵在於缺乏酶α-N-乙醯基-葡萄胺糖苷酶(Naglu)之罕見體染色體隱性遺傳病症。在不存在此酶下，醣胺聚多醣(GAG)，例如GAG硫酸乙醯肝素及部分降解之GAG分子不能自身體清除且累積在各種組織之溶小體中，從而導致進行性廣佈體細胞功能障礙(Kakkis等人，N Engl J Med.344(3)：182-8,2001)。已顯示GAG累積在神經元及神經膠細胞之溶小體中，且較少積累在腦外部。
已鑒別四種不同形式之MPS III，稱為MPS IIIA、B、C及D。各自表示缺乏GAG硫酸乙醯肝素之降解中涉及之四種酶之一(表1)。所有形式皆包括相同臨床症狀之不同程度，包括面部特徵粗糙、肝脾腫大、角膜渾濁及骨骼變形。然而，最值得注意的是重度及進行性喪失認知能力，其不僅與硫酸乙醯肝素在神經元中積累相關，而且亦與由原發性GAG積累引起之隨後神經節苷脂GM2、GM3及GD2升高相關(Walkley等人，Ann N Y Acad Sci.845：188-99,1998)。
B型山菲立普症候群之一特徵性臨床特徵為中樞神經系統(CNS)退化，其導致損失或不能實現主要發育轉折點。進行性認知衰退以癡呆及過早死亡為頂點。疾病通常在幼小兒童中顯現其自身，且受影響個體之壽命通常不延長超過接近20歲至20歲出頭。
MPS III疾病皆具有通常在幼小兒童中顯現之類似症狀。受影響嬰兒表面上正常，但某一輕微面部形態異常可為顯而易見的。其他黏多糖病所典型之關節僵硬、多毛及毛髮粗糙通常直至疾病晚期方才存在。在初始無症狀間隔之後，患者通常呈現有發育及/或行為緩慢問題，繼之以導致重度癡呆及進行性運動疾病之進行性智力衰退。言語之獲得常為緩慢及不完全的。疾病進展至行為障礙增加，包括暴躁發脾氣、活動過度、破壞、攻擊行為、異食癖及睡眠障礙。因為受影響 兒童具有正常肌肉強度及運動性，所以行為障礙極難以管理。在疾病之末期，兒童變得日益不動及無反應，常需要輪椅，且顯現吞咽困難及癲癇發作。受影響兒童之壽命通常不延長超過接近20歲至20歲出頭。
適於治療MPS IIIB(B型山菲立普症候群)之α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶包括野生型人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(SEQ ID NO：1或3)或其保留被攝取至哺乳動物溶小體中且在直鏈寡醣中之末端N-乙醯基-D-葡糖胺殘基處水解α,1,4鍵之能力的功能性片段或序列變異體。
可使用此項技術中已知之技術以及藉由分析溶小體及神經性生物標記物來量測使用如本文所述之重組靶向治療性融合蛋白治療MPS IIIB(B型山菲立普症候群)之功效。對Naglu基因剔除動物進行初始實驗(參見Li等人，Proc Natl Acad Sci USA 96：14505-510,1999)。Naglu基因剔除物呈現有在肝及腎中之大量硫酸乙醯肝素及腦中之神經節苷脂升高。
分析包括分析外源性酶之活性及生物分佈、溶小體(特定言之腦細胞中之溶小體)中之GAG儲積降低、及星形細胞及小神經膠質細胞之活化。各含量之各種溶小體或神經性生物標記物包括但不限於溶小體相關之膜蛋白1(LAMP1)、磷脂醯肌醇蛋白聚糖(glypican)、神經節苷脂、膽固醇、粒線體ATP合成酶之次單元c(SCMAS)、泛素(ubiquitin)、P-GSK3b、β澱粉狀蛋白(beta amyloid)及P-tau。亦使用此項領域中已知之技術進行存活及行為分析。
實驗已顯示粒線體ATP合成酶之次單元c(SCMAS)蛋白質累積在MPS IIIB動物之溶小體中(Ryazantsev等人，Mol Genet Metab.90(4)：393-401,2007)。LAMP-1及GM130亦已顯示在MPS IIIB動物中升高(Vitry等人，Am J Pathol.177(6)：2984-99,2010)。
在各種實施例中，治療溶小體儲積疾病涉及各種組織中之溶小體儲積(例如GAG之儲積)降低。在各種實施例中，治療涉及腦目標組織、 脊髓神經元及/或周邊目標組織中之溶小體儲積降低。在某些實施例中，相較於對照，溶小體儲積降低約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%或100%以上。在各種實施例中，相較於對照，溶小體儲積降低至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或10倍以上。
在各種實施例中，治療涉及各種組織中之酶活性增加。在各種實施例中，治療涉及腦目標組織、脊髓神經元及/或周邊目標組織中之酶活性增加。在各種實施例中，相較於對照，酶活性增加約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或1000%以上。在各種實施例中，相較於對照，酶活性增加至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或10倍以上。在各種實施例中，增加之酶活性為至少約10nmol/h/mg、20nmol/h/mg、40nmol/h/mg、50nmol/h/mg、60nmol/h/mg、70nmol/h/mg、80nmol/h/mg、90nmol/h/mg、100nmol/h/mg、150nmol/h/mg、200nmol/h/mg、250nmol/h/mg、300nmol/h/mg、350nmol/h/mg、400nmol/h/mg、450nmol/h/mg、500nmol/h/mg、550nmol/h/mg、600nmol/h/mg或600nmol/h/mg以上。在各種實施例中，溶小體酶為Naglu。
酶補充療法
酶補充療法(ERT)為一種用以藉由將丟失酶輸注至血流中來矯正酶缺乏之治療策略。當血液灌注患者組織時，酶由細胞攝取且轉運至溶小體，在溶小體中，酶起消除已由於酶缺乏而累積在溶小體中之物質的作用。為使溶小體酶補充療法有效，治療性酶必須傳遞至顯現儲積缺陷所處之組織中之適當細胞中的溶小體。習知溶小體酶補充治療 劑係使用用以嚙合目標細胞表面上之特定受體之天然連接於蛋白質的碳水化合物來傳遞。一種受體陽離子非依賴性M6P受體(CI-MPR)特別適用於靶向補充溶小體酶，因為CI-MPR存在於大多數細胞類型之表面上。
術語「陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體(CI-MPR)」、「M6P/IGF-II受體」、「CI-MPR/IGF-II受體」、「IGF-II受體」或「IGF2受體」或其縮寫可在本文中互換使用，其係指結合M6P與IGF-II兩者之細胞受體。
使個體對酶補充療法耐受之組合療法
已發現在投與諸如重組蛋白質及其他治療劑之藥劑期間，個體可發動針對此等藥劑之免疫反應，從而導致產生結合且干擾治療活性以及引起急性或慢性免疫反應之抗體。此問題對於蛋白質治療劑而言最為顯著，因為蛋白質為複雜抗原且在許多情況下，個體就抗原而言為免疫未處理的。因此，在本發明之某些態樣中，可能適用的是使接受治療性酶之個體耐受酶補充療法。在此情形下，酶補充療法可用耐受性方案以組合療法形式給與個體。
美國專利7,485,314(以引用的方式併入本文中)揭露使用免疫耐受性誘導治療溶小體儲積病症。簡言之，使用該種耐受方案可適用於防止個體發動針對酶補充療法之免疫反應且藉此降低酶補充療法之潛在有益效應或另外致使酶補充療法之潛在有益效應無效。
在一種方法中，本發明涵蓋降低或防止針對用於治療溶小體儲積病症，例如IIIB型黏多糖病(MPS IIIB或B型山菲立普症候群)之例如包含Naglu之重組治療性融合蛋白的臨床顯著抗原特異性免疫反應，其中融合蛋白係鞘內投與。該方法採用與每週鞘內輸注低劑量酶(例如Naglu)組合之T細胞免疫抑制劑(諸如環孢素A(cyclosporin A，CsA))及抗增生劑(諸如咪唑硫嘌呤(azathioprine，Aza))的初始30-60天方案。使 用與每週鞘內或靜脈內輸注低劑量之包含酶之融合蛋白組合的免疫抑制藥物環孢素A(CsA)及咪唑硫嘌呤(Aza)之60天方案，針對每週輸注酶之典型強烈IgG反應得以極大降低或防止。使用此等耐受方案，將有可能使個體耐受較高治療劑量之治療性融合蛋白多達6個月而無針對Naglu或實際上可用於溶小體儲積疾病之酶補充之任何其他酶的抗體效價增加。此等耐受方案已描述於美國專利第7,485,314號中。
糖基化非依賴性溶小體靶向
開發糖基化非依賴性溶小體靶向(Glycosylation Independent Lysosomal Targeting，GILT)技術以使治療性酶靶向溶小體。詳言之，GILT技術使用肽標籤替代M6P來嚙合CI-MPR以達成溶小體靶向。通常，GILT標籤為以甘露糖-6-磷酸非依賴性方式結合CI-MPR之蛋白質、肽或其他部分。有利的是此技術模擬攝取溶小體酶之正常生物機制，但以不依賴於甘露糖-6-磷酸方式進行。
一較佳GILT標籤源於人類胰島素樣生長因子II(IGF-II)。人類IGF-II為一種對亦稱為IGF-II受體之CI-MPR具有高親和力之配體。具有GILT標籤之治療性酶與M6P/IGF-II受體結合會經由胞吞路徑使蛋白質靶向溶小體。此方法具有超過涉及糖基化之方法之眾多優勢，包括簡單及成本效益，因為一旦分離蛋白質，即無需進行進一步修飾。
對GILT技術及GILT標籤之詳細描述可見於美國公開案第20030082176號、第20040006008號、第20040005309號及第20050281805號中，該等所有公開案之教義據此以全文引用的方式併入本文中。
弗林蛋白酶抗性GILT標籤
在開發治療溶小體儲積疾病之具有GILT標籤之溶小體酶的過程期間，已變得顯而易知的是IGF-II源性GILT標籤可在於哺乳動物細胞中產生期間經受由弗林蛋白酶進行之蛋白水解裂解(參見實例章節)。弗林蛋白酶蛋白酶通常識別且裂解具有共同序列Arg-X-X-Arg(SEQ ID NO：6)之裂解位點，X為任何胺基酸。裂解位點位於序列中之羧基末端精胺酸(Arg)殘基之後。在一些實施例中，弗林蛋白酶裂解位點具有共同序列Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg(SEQ ID NO：7)，X為任何胺基酸。裂解位點位於序列中之羧基末端精胺酸(Arg)殘基之後。如本文所用，術語「弗林蛋白酶」係指可識別且裂解如本文定義之弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點之任何蛋白酶，包括弗林蛋白酶或弗林蛋白酶樣蛋白酶。弗林蛋白酶亦稱為成對鹼性胺基酸裂解酶(PACE)。弗林蛋白酶屬於包括PC3(一種負責使胰島細胞中之胰島素原(proinsulin)成熟之蛋白酶)之枯草桿菌蛋白酶樣原蛋白轉化酶家族。編碼弗林蛋白酶之基因稱為FUR(FES上游區域)。
以下顯示成熟人類IGF-II肽序列。
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSR↑RSR↑GIVEECCFRSCDLALLETYC ATPAKSE(SEQ ID NO：5)
如可見，成熟人類IGF-II在殘基34-40之間含有兩個潛在重疊弗林蛋白酶裂解位點(粗體且加底線)。箭頭插入在兩個潛在弗林蛋白酶裂解位置處。
對由弗林蛋白酶進行之裂解具有抗性且仍然保留以甘露糖-6-磷酸非依賴性方式結合CI-MPR之能力的經修飾GILT標籤揭露於US 20110223147中。詳言之，弗林蛋白酶抗性GILT標籤可藉由在一或多個弗林蛋白酶裂解位點處使胺基酸序列突變以使突變消除至少一個弗林蛋白酶裂解位點加以設計。因此，在一些實施例中，弗林蛋白酶抗性GILT標籤為含有消除至少一個弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點或改變鄰近於弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點之序列以使相較於野生型IGF-II肽(例如野生型人類成熟IGF-II)，弗林蛋白酶裂解得以阻止、抑制、降低或減緩之突變的弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質。通常，適合突變不影響弗林蛋白酶抗性GILT標籤結合人類陽離子非依賴性甘露糖-6- 磷酸受體之能力。特定言之，適於本發明之弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質以甘露糖-6-磷酸非依賴性方式結合人類陽離子非依賴性甘露糖-6-磷酸受體，其中在pH 7.4下之解離常數為10-7M或10-7M以下(例如10-8、10-9、10-10、10-11或10-11以下)。在一些實施例中，弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質在對應於成熟人類IGF-II之胺基酸30-40(例如30-40、31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40)之區域內含有突變。在一些實施例中，適合突變消除至少一個弗林蛋白酶蛋白酶裂解位點。突變可為胺基酸取代、缺失、插入。舉例而言，在對應於SEQ ID NO：5之殘基30-40(例如30-40、31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40)之區域內的任一胺基酸皆可經任何其他胺基酸取代或皆可經缺失。舉例而言，在位置34處之取代可影響弗林蛋白酶認識第一裂解位點。在各識別位點內插入一或多個其他胺基酸可消除一個或兩個弗林蛋白酶裂解位點。缺失簡併位置中之一或多個殘基亦可消除兩個弗林蛋白酶裂解位點。
在各種實施例中，弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質在對應於成熟人類IGF-II之Arg37或Arg40之位置處含有胺基酸取代。在一些實施例中，弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質在位置Arg37或Arg40處含有Lys或Ala取代。其他取代為可能的，包括在位置37與40兩者處之Lys及/或Ala突變之組合、或除Lys或Ala以外之胺基酸之取代。
在各種實施例中，適用於本文中之IGF-II突變蛋白質可含有其他突變。舉例而言，可改變SEQ ID NO：1之多達30%或30%以上之殘基(例如可改變多達1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%或30%以上之殘基)。因此，適用於本文中之IGF-II突變蛋白質可具有與成熟人類IGF-II至少 70%，包括至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上一致之胺基酸序列。
在各種實施例中，適用於本文中之IGF-II突變蛋白質經特異性靶向CI-MPR。特別適用的是IGF-II多肽中之導致蛋白質相對於天然IGF-II以高親和力(例如在pH 7.4下，解離常數為10-7M或10-7M以下)結合CI-MPR，同時以降低之親和力結合已知由IGF-II所結合之其他受體的突變。舉例而言，適於本發明之弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質可經修飾以相對於天然存在之人類IGF-II對IGF-I受體之親和力，對IGF-I受體之結合親和力減弱。舉例而言，用Leu、Val或Phe取代IGF-II殘基Tyr 27、Leu 43或Ser 26分別使IGF-II對IGF-I受體之親和力減弱94倍、56倍及4倍(Torres等人(1995)J.Mol.Biol.248(2)：385-401)。缺失人類IGF-II之殘基1-7導致對人類IGF-I受體之親和力降低30倍及相伴對大鼠IGF-II受體之親和力增加12倍(Hashimoto等人(1995)J.Biol.Chem.270(30)：18013-8)。IGF-II之NMR結構顯示Thr-7位於殘基Phe-48 Phe及Ser-50附近以及Cys-9-Cys-47二硫橋鍵附近。認為Thr-7與此等殘基之相互作用可使為IGF-I受體結合所需之可撓性N末端六肽穩定(Terasawa等人(1994)EMBO J.13(23)5590-7)。同時，此相互作用可調節與IGF-II受體之結合。截短IGF-II之C末端(殘基62-67)亦似乎使IGF-II對IGF-I受體之親和力降低5倍(Roth等人(1991)Biochem.Biophys.Res.Commun.181(2)：907-14)。
IGF-I及陽離子非依賴性M6P受體之結合表面在IGF-II之各別面上。基於結構及突變資料，可構築實質上小於人類IGF-II之功能性陽離子非依賴性M6P結合域。舉例而言，可缺失或置換胺基末端胺基酸(例如1-7或2-7)及/或羧基末端殘基62-67。另外，胺基酸29-40可有可能 經消除或置換而不改變多肽之其餘部分之折疊或與陽離子非依賴性M6P受體之結合。因此，可構築包括胺基酸8-28及41-61之靶向部分。此等胺基酸鏈段可或許直接接合或由連接子分開。或者，胺基酸8-28及41-61可提供在各別多肽鏈上。與IGF-II同源且具有與IGF-II之結構密切相關之三級結構的胰島素之類似域具有即使當存在於各別多肽鏈中時亦足以允許適當再折疊成適當三級結構之結構資訊(Wang等人(1991)Trends Biochem.Sci.279-281)。因此，舉例而言，胺基酸8-28或其保守性取代變異體可融合於溶小體酶；所得融合蛋白可與胺基酸41-61或其保守性取代變異體混合，且向患者投與。
IGF-II亦可經修飾以使與血清IGF結合蛋白之結合最小(Baxter(2000)Am.J.Physiol Endocrinol Metab.278(6)：967-76)以避免螯合IGF-II/GILT構築體。許多研究已定位IGF-II中為結合IGF結合蛋白所必需之殘基。可篩檢保留與M6P/IGF-II受體之高親和力結合且對IGF結合蛋白之親和力降低的在此等殘基處具有突變之構築體。舉例而言，報導用Ser置換IGF-II之Phe-26會降低IGF-II對IGFBP-1及IGFBP-6之親和力而對與M6P/IGF-II受體之結合無影響(Bach等人(1993)J.Biol.Chem.268(13)：9246-54)。諸如Lys取代Glu-9之其他取代亦可為有利的。IGF-I之與IGF-II高度保守之區域中的單獨或組合類似突變會導致IGF-BP結合大大降低(Magee等人(1999)Biochemistry 38(48)：15863-70)。
一替代性方法為鑒別IGF-II之可以高親和力結合M6P/IGF-II受體之最小區域。已牽涉於IGF-II結合M6P/IGF-II受體中之殘基主要叢集在IGF-II之一個面上(Terasawa等人(1994)EMBO J.13(23)：5590-7)。儘管IGF-II三級結構通常由三個分子內二硫鍵維持，但併有IGF-II之M6P/IGF-II受體結合表面上之胺基酸序列的肽可經設計以適當折疊且具有結合活性。該種最小結合肽為高度較佳溶小體靶向域。舉例而言， 一較佳溶小體靶向域為人類IGF-II之胺基酸8-67。所設計之基於胺基酸48-55附近之區域的結合M6P/IGF-II受體之肽亦為合乎需要之溶小體靶向域。或者，可經由酵母雙雜交分析或經由噬菌體呈現型分析針對結合M6P/IGF-II受體之能力篩檢隨機肽文庫。
對胰島素受體之結合親和力
本文所述之許多IGF-II突變蛋白質(包括弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質)對胰島素受體之結合親和力降低或減弱。因此，在一些實施例中，相對於天然存在之人類IGF-II對胰島素受體之親和力，適於本發明之肽標籤對胰島素受體之結合親和力降低或減弱。在一些實施例中，適於本發明之對胰島素受體之結合親和力降低或減弱的肽標籤包括對胰島素受體之結合親和力小於野生型成熟人類IGF-II對胰島素受體之結合親和力超過1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍的肽標籤。可使用此項技術中已知之各種活體外及活體內分析量測對胰島素受體之結合親和力。示範性結合分析描述於實例章節中。
突變誘發
IGF-II突變蛋白質可藉由將適當核苷酸變化引入IGF-II DNA中，或藉由合成所要IGF-II多肽來製備。可例如使用例如於美國專利第5,364,934號中所述之針對保守性及非保守性突變之任何技術及指導方針使IGF-II序列變化。變化可為一或多個編碼IGF-II之密碼子之導致IGF-II之胺基酸序列相較於天然存在之成熟人類IGF-II序列發生變化的取代、缺失或插入。胺基酸取代可由用具有類似結構及/或化學性質之另一胺基酸置換一個胺基酸，諸如用絲胺酸置換白胺酸，亦即保守性胺基酸置換所致。胺基酸取代亦可由用具有不類似結構及/或化學性質之另一胺基酸置換一個胺基酸，亦即非保守性胺基酸置換所致。插 入或缺失可視情況在1至5個胺基酸之範圍內。所允許之變化可可藉由系統進行序列中之胺基酸之插入、缺失或取代且在此項技術中已知之活體內或活體外分析(諸如與CI-MPR之結合分析或弗林蛋白酶裂解分析)中測試所得變異體之活性來確定。
掃描胺基酸分析亦可用於沿連續序列鑒別一或多個胺基酸。尤其較佳之掃描胺基酸為相對較小之中性胺基酸。此等胺基酸包括丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸及半胱胺酸。丙胺酸通常為此組中之較佳掃描胺基酸，因為其消除超出β-碳之側鏈且使變異體之主鏈構形改變之可能性較小。丙胺酸亦通常較佳，因為其為最常見胺基酸。此外，其常見於包埋位置與暴露位置兩者中[Creighton,The Proteins,(W.H.Freeman & Co.,N.Y.)；Chothia,J.Mol.Biol.,150：1(1976)]。若丙胺酸取代不產生足量變異體，則可使用電子等排胺基酸。
可使用此項技術中已知之方法，諸如寡核苷酸介導之(定點)突變誘發、丙胺酸掃描及PCR突變誘發作出變化。可對選殖之DNA進行定點突變誘發[Carter等人，Nucl.Acids Res.,13：4331(1986)；Zoller等人，Nucl.Acids Res.,10：6487(1987)]、卡匣突變誘發[Wells等人，Gene,34：315(1985)]、限制選擇突變誘發[Wells等人，Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317：415(1986)]或其他已知技術以產生IGF-II突變蛋白質。
間隔子
GILT標籤可融合於溶小體酶之N末端或C末端。GILT標籤可直接融合於溶小體酶或可由連接子或間隔子與溶小體酶分開。胺基酸連接子或間隔子通常經設計以具有剛性、可撓性或插入兩個蛋白質部分之間的結構，諸如α螺旋。連接子或間隔子可相對較短，諸如序列Gly-Ala-Pro(GAP)(SEQ ID NO：9)、Gly-Gly-Gly-Gly-Ala(GGGGA)(SEQ ID NO：60)或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)(SEQ ID NO：12)，或可較 長，諸如長度為10-25個胺基酸、25-50個胺基酸或35-55個胺基酸。應小心選擇融合接合位點以促進兩種融合搭配物之適當折疊及活性且防止肽標籤自溶小體酶(例如α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶)過早分離。
在各種實施例中，間隔肽包含一或多個GGGPS(SEQ ID NO：14)或GGGSP(SEQ ID NO：15)胺基酸序列，且視情況進一步包含以下一或多者：(i)GAP(SEQ ID NO：9)、(ii)GGGGS(SEQ ID NO：12)、(iii)GGGS(SEQ ID NO：16)、(iv)AAAAS(SEQ ID NO：17)、(v)AAAS(SEQ ID NO：18)、(vi)PAPA(SEQ ID NO：19)、(vii)TPAPA(SEQ ID NO：20)、(viii)AAAKE(SEQ ID NO：21)或(ix)GGGGA(SEQ ID NO：60)。在各種實施例中，間隔子包含胺基酸序列GAP(SEQ ID NO：9)、GPS(SEQ ID NO：10)或GGS(SEQ ID NO：11)。
在各種實施例中，間隔肽包含一或多個GGGGS(SEQ ID NO：12)或GGGS(SEQ ID NO：16)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個GGGPS(SEQ ID NO：14)或GGGSP(SEQ ID NO：15)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個AAAAS(SEQ ID NO：17)或AAAS(SEQ ID NO：18)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個PAPA(SEQ ID NO：19)或TPAPA(SEQ ID NO：20)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個AAAKE(SEQ ID NO：21)胺基酸序列。在各種實施例中，間隔肽包含一或多個GGGGA(SEQ ID NO：60)胺基酸序列。
在各種實施例中，間隔肽包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：(GGGGS)n(SEQ ID NO：12、56、58、91-94)、(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO：36、95-100)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS(SEQ ID NO：101-107)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO：37、108-113)、GAP-(GGGGS)n-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO：114-162)、GAP-GGGPS-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO：163-169)、 GAP-(GGGGS)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGS)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO：170-218)、GAP-(GGGGS)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：219-267)、GAP-(GGGGS)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：268-316)、GAP-(GGGGS)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGS)n-GAP(SEQ ID NO：544-551)、(GGGGA)n(SEQ ID NO：60、79、81、317-320)、(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO：321-326)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS(SEQ ID NO：327-333)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-GAP(SEQ ID NO：334-340)、GAP-(GGGGA)n-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO：341-389)、GAP-GGGPS-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO：390-396)、GAP-(GGGGA)n-AAAAS-GGGPS-(GGGGA)n-AAAA-GAP(SEQ ID NO：397-445)、GAP-(GGGGA)n-PAPAP-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：446-494)、GAP-(GGGGA)n-PAPAPT-(Xaa)n-GAP(SEQ ID NO：495-543)、GAP-(GGGGA)n-(Xaa)n-PAPAP-(Xaa)n-(AAAKE)n-(Xaa)n-(GGGGA)n-GAP(SEQ ID NO：552-559)；其中n為1至7。在各種實施例中，n為1至4。
在各種實施例中，間隔子係選自由以下組成之群：EFGGGGSTR(SEQ ID NO：22)、GAP(SEQ ID NO：9)、GGGGS(SEQ ID NO：12)、GPSGSPG(SEQ ID NO：23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO：24)、GPSGSPGH(SEQ ID NO：25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID NO：26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO：27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGPS(SEQ ID NO：30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO：40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO：42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO：44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS GAP(SEQ ID NO：45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ ID NO：46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO：48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO：50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO：52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO：53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO：54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：59)、GGGGA(SEQ ID NO：60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO：61)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO：62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：65)、 GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO：75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO：77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO：80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO：82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGG PS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO：83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO：84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO：85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO：86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO：87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO：88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO：89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO：90)。
在各種實施例中，間隔子係選自由以下組成之群：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO：44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO：45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ ID NO：46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO：48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO：50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO：52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO：53)、 GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO：54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)。
在各種實施例中，間隔子係選自由以下組成之群：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)。
可用於本發明之方法及組合物中之具有GILT標籤之α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶蛋白質的其他構築體詳述於美國公開案第20050244400號及第20050281805號中，該等公開案之全部揭露內容以引用的方式併入本文中。
細胞
可根據本發明利用易經受細胞培養及多肽表現之任何哺乳動物細胞或細胞類型皆，諸如人類胚腎(HEK)293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、猴腎(COS)細胞、HT1080細胞、C10細胞、HeLa細胞、幼小倉鼠腎(BHK)細胞、3T3細胞、C127細胞、CV-1細胞、HaK細胞、NS/0細胞及L-929細胞。可根據本發明使用之哺乳動物細胞之非限制性實例包括但不限於BALB/c小鼠骨髓瘤株系(NS0/1，ECACC編號：85110503)；人類視網膜母細胞(PER.C6(CruCell,Leiden,The Netherlands))；由SV40轉型之猴腎CV1株系(COS-7，ATCC CRL 1651)； 人類胚腎株系(293細胞或經次選殖以達成懸浮培養生長之293細胞，Graham等人，J.Gen Virol.,36：59(1977))；幼小倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)；中國倉鼠卵巢細胞+/-DHFR(CHO，Urlaub及Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77：4216(1980))；小鼠賽托利細胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251(1980))；猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人類宮頸癌細胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)；人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.,383：44-68(1982))；MRC 5細胞；FS4細胞；及人類肝細胞瘤株系(Hep G2)。在一些實施例中，本發明之融合蛋白係自CHO細胞株產生。
本發明之融合蛋白亦可在多種非哺乳動物宿主細胞中表現，該等宿主細胞諸如昆蟲(例如Sf-9、Sf-21、Hi5)、植物(例如豆科(Leguminosa)、穀類(cereal)或菸草(tobacco))、酵母(例如釀酒酵母(S.cerivisae)、畢赤酵母(P.pastoris))、原核生物(例如大腸桿菌(E.Coli)、枯草桿菌(B.subtilis)及其他桿菌屬(Bacillus spp.)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、鏈黴菌屬(Streptomyces spp))或真菌。
在一些實施例中，可在缺乏弗林蛋白酶之細胞中產生有或無弗林蛋白酶抗性GILT標籤之融合蛋白。如本文所用，術語「缺乏弗林蛋白酶之細胞」係指弗林蛋白酶蛋白酶活性受抑制、降低或消除之任何細胞。缺乏弗林蛋白酶之細胞包括不產生弗林蛋白酶或產生降低量之弗林蛋白酶或缺陷性弗林蛋白酶蛋白酶之哺乳動物細胞與非哺乳動物細胞兩者。為熟練技術人員已知且可用之示範性缺乏弗林蛋白酶之細胞包括但不限於FD11細胞(Gordon等人(1997)Infection and Immunity 65(8)：3370 3375)以及Moebring及Moehring(1983)Infection and Immunity 41(3)：998 1009中所述之彼等突變細胞。或者，缺乏弗林蛋白酶之細胞可藉由以下方式獲得：使上述哺乳動物及非哺乳動物細胞暴露於突變誘發處理，例如輻射、溴化乙錠、溴化尿苷(BrdU)及其他處理，較佳化學突變誘發，且更佳甲烷磺酸乙酯突變誘發，使在處理中存活之細胞恢復且選擇發現對假單胞菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)之毒性具有抗性之彼等細胞(參見Moehring及Moehrin(1983)Infection and Immunity 41(3)：998 1009)。
在各種實施例中，意欲某些包含如本文所述之間隔子之靶向治療性蛋白質相較於包含不同間隔肽之靶向治療性蛋白質在重組表現時可展現活性蛋白質之表現增加。在各種實施例中，亦意欲本文所述之靶向治療性蛋白質相較於本文其他靶向治療性蛋白質可具有增加之活性。意欲相較於包含不同間隔肽之其他靶向治療性蛋白質展現活性蛋白質之表現增加及/或具有增加之活性的彼等靶向治療性蛋白質用於進一步實驗。
治療性蛋白質之投藥
根據本發明，通常單獨或以包含如本文所述之治療性蛋白質之組合物或藥劑形式(例如在製造治療疾病之藥劑時)向個體投與本發明之治療性蛋白質。組合物可與生理可接受之載劑或賦形劑一起調配以製備醫藥組合物。載劑及組合物可為無菌的。調配物應適合投藥模式。
適合醫藥學上可接受之載劑包括但不限於水、鹽溶液(例如NaCl)、生理食鹽水、緩衝生理食鹽水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯膠(gum arabic)、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明膠、碳水化合物(諸如乳糖、直鏈澱粉或澱粉、糖(諸如甘露糖醇、蔗糖或其他糖、右旋糖))、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、黏稠石蠟、芳香油、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮等以及其組合。必要時，醫藥製劑可與不有害地與活性化合物反應或干擾其活性之助劑(例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、濕 潤劑、乳化劑、用於影響滲透壓之鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑及/或芳族物質及其類似物)混合。在一較佳實施例中，使用適於靜脈內投藥之水溶性載劑。
必要時，組合物或藥劑亦可含有少量濕潤劑或乳化劑或pH值緩衝劑。組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或散劑。組合物亦可用傳統黏合劑及載劑(諸如三酸甘油酯)調配成栓劑。經口調配物可包括標準載劑，諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯吡咯啶酮、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。
可根據常規程序將組合物或藥劑調配成適合於向人類投與之醫藥組合物。舉例而言，在一較佳實施例中，用於靜脈內投藥之組合物通常為於無菌等張水性緩衝液中之溶液。必要時，組合物亦可包括增溶劑及局部麻醉劑以減輕注射部位之疼痛。通常，分開或以單位劑型混合在一起來將成分供應於諸如安瓿或藥囊之指示活性藥劑之量的氣密容器中，該單位劑型例如呈乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式。當組合物欲藉由輸注投與時，其可用含有無菌醫藥級水、生理食鹽水或右旋糖/水之輸注瓶分配。當組合物係藉由注射投與時，可提供含無菌注射用水或生理食鹽水之安瓿以使成分可在投藥之前加以混合。
治療性蛋白質可調配成中性形式或鹽形式。醫藥學上可接受之鹽包括以游離胺基形成之鹽，諸如源於鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等者；及以游離羧基形成之鹽，諸如源於鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因(procaine)等者。
藉由任何適當途徑投與治療性蛋白質(或含有治療性蛋白質之組合物或藥劑)。在各種實施例中，靜脈內投與治療性蛋白質。在其他實施例中，藉由直接向目標組織，諸如心臟或肌肉(例如肌肉內)或神經 系統(例如直接注射至腦中；室內；鞘內)投藥來投與治療性蛋白質。在各種實施例中，鞘內投與治療性蛋白質。或者，可非經腸、經皮或經黏膜(例如經口或經鼻)投與治療性蛋白質(或含有治療性蛋白質之組合物或藥劑)。必要時可併行使用一種以上途徑，例如靜脈內及鞘內投與治療性蛋白質。併行靜脈內及鞘內投藥無需為同時的，但可為連續的。
治療性蛋白質(或含有治療性蛋白質之組合物或藥劑)可單獨或連同其他藥劑一起投與，該等其他藥劑諸如抗組胺劑(例如苯海拉明(diphenhydramine))或免疫抑制劑或抵抗抗具有GILT標籤之溶小體酶抗體之其他免疫治療劑。術語「連同...一起」指示藥劑係在治療性蛋白質(或含有治療性蛋白質之組合物或藥劑)之前、近似同時或之後投與。舉例而言，藥劑可混入含有治療性蛋白質之組合物中，且藉此與治療性蛋白質同時投與；或者，藥劑可在不混合之情況下同時投與(例如藉由在投與治療性蛋白質亦所用之靜脈內管線上「借道(piggybacking)」傳遞藥劑，或反之亦然)。在另一實例中，藥劑可分開(例如不混合)，但在投與治療性蛋白質之短時段內(例如在24小時內)投與。
治療性蛋白質(或含有治療性蛋白質之組合物或藥劑)係以治療有效量(亦即在規則間隔下投與時，足以諸如藉由如上所述改善與疾病相關之症狀，預防或延遲疾病發作及/或亦減小疾病之症狀之嚴重性或頻率來治療疾病之劑量)投與。對治療疾病而言將為治療有效之劑量將取決於疾病影響之性質及程度，且可藉由標準臨床技術加以確定。此外，活體外或活體內分析可視情況用於幫助使用此項技術中已知之方法鑒別最佳劑量範圍。欲採用之準確劑量亦將取決於投藥途徑及疾病之嚴重性，且應根據從業者之判斷及各患者之情況來決定。有效劑量可自由活體外或動物模型測試系統獲得之劑量-反應曲線外推。治療有效劑 量可為例如每公斤體重約0.1-1mg、約1-5mg、約2.5-20mg、約5-20mg、約20-50mg、或約20-100mg或約50-200mg、或約2.5至20mg。視個體之需要而定，用於特定個體之有效劑量可隨時間變化(例如增加或降低)。舉例而言，在身體疾病或應激時，或若疾病症狀惡化，則可增加劑量。
視疾病影響之性質及程度而定且在持續基礎上，在規則間隔下投與治療有效量之治療性蛋白質(或含有治療性蛋白質之組合物或藥劑)。如本文所用，在某一「間隔」下投藥指示定期投與(不同於一次性給藥)治療有效量。可藉由標準臨床技術確定間隔。在一些實施例中，每兩月、每月、每月兩次、每三週、每兩週、每週、每週兩次、每週三次或每日投與治療性蛋白質。視個體之需要而定，用於單一個體之投藥間隔無需為固定間隔，但可隨時間變化。舉例而言，在身體疾病或應激時，或若疾病症狀惡化，則可減小劑量之間的間隔。
如本文所用，術語「每兩月」意謂每兩個月投與一次(亦即每兩個月一次)；術語「每月」意謂每個月投與一次；術語「每三週」意謂每三週投與一次(亦即每三週一次)；術語「每兩週」意謂每兩週投與一次(亦即每兩週一次)；術語「每週」意謂每週投與一次；且術語「每日」意謂每天投與一次。
本揭露內容另外係關於一種於容器(例如小瓶、瓶、用於靜脈內投藥之袋、注射器等)中之包含如本文所述之治療性蛋白質的醫藥組合物，該容器伴有含有諸如藉由本文所述之方法投與治療IIIB型黏多糖病(B型山菲立普症候群)之組合物之說明書的標籤。
醫藥學上可接受之調配物之鞘內投藥
在各種實施例中，藉由引入個體之中樞神經系統中，例如引入個體之腦脊髓液中來投與酶融合蛋白。在本發明之某些態樣中，以鞘內方式將酶引入例如腰區域或大池中或以室內方式(或以腦室內方式)將 酶引入腦室間隙中。鞘內投與溶小體酶之方法描述於美國專利7,442,372中，該專利以全文引用的方式併入本文中。
熟習此項技術者瞭解可用於實現鞘內投與治療性組合物之裝置。舉例而言，療法可使用常用於鞘內投與用於腦膜癌病之藥物之Ommaya儲集囊給與(Ommaya AK,Lancet 2：983-84,1963)。更詳言之，在此方法中，將腦室管穿過前角中形成之孔插入且連接至安裝在頭皮下方之Ommaya儲集囊，且儲集囊經皮下穿刺以鞘內傳遞注射至儲集囊中之所補充之特定酶。用於向個體鞘內投與治療性組合物之其他裝置描述於美國專利第6,217,552號中，該專利以引用的方式併入本文中。或者，可例如藉由單次注射或連續輸注來鞘內給與組合物。應瞭解劑量治療可呈單次劑量投藥或多次劑量形式。
如本文所用，術語「鞘內投藥」意欲包括藉由包括經由鑽孔或池或腰椎穿刺或其類似方式進行側向腦室注射(亦即腦室內)(描述於Lazorthes等人Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery,143-192及Omaya等人，Cancer Drug Delivery,1：169-179中，該等文獻之內容以引用的方式併入本文中)之技術直接傳遞醫藥組合物至個體之腦脊髓液中。術語「腰區」意欲包括第三腰椎與第四腰椎(下背)之間的區域，且更包括脊柱之L2-S1區域。術語「大池」意欲包括經由頭骨與脊柱頂部之間的開口到達小腦附近及下部間隙的通路。術語「腦室」意欲包括腦中與脊髓之中心管相連之空腔。向以上提及之部位投與本發明之醫藥組合物可藉由直接注射組合物或藉由使用輸注泵達成。對於注射，本發明之組合物可於液體溶液中調配，較佳於生理相容緩衝液，諸如亨克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或磷酸鹽緩衝液中調配。此外，酶可以固體形式調配且在使用之前即刻再溶解或懸浮。亦包括凍乾形式。注射液可例如呈酶之團式注射液或連續輸液(例如使用輸注泵)形式。
在本發明之各種實施例中，藉由側向腦室注射至個體之腦中來投與酶。可例如經由在個體之頭骨中產生之鑽孔進行注射。在另一實施例中，酶及/或其他醫藥調配物係經由將分路以手術方式插入個體之腦室中來投與。舉例而言，可向較大之側腦室中進行注射，儘管亦可向第三及第四較小腦室中進行注射。
在各種實施例中，藉由注射至個體之大池或腰區域中來投與本發明中使用之醫藥組合物。在本發明之方法之另一實施例中，在向個體投與醫藥學上可接受之調配物之後，醫藥學上可接受之調配物提供本發明中使用之酶或其他醫藥組合物持續至少1週、2週、3週、4週或4週以上時期向個體持續傳遞，例如「緩慢釋放」。
在各種實施例中，使治療性融合蛋白傳遞至腦或脊髓之一或多個表面或淺表組織。舉例而言，在各種實施例中，使治療性融合蛋白傳遞至大腦或脊髓之一或多個表面或淺表組織。在一些實施例中，大腦或脊髓之靶向表面或淺表組織位於離大腦之表面4mm內。在一些實施例中，大腦之靶向表面或淺表組織係選自軟膜組織、腦皮層條帶組織、海馬、維喬羅賓間隙(Virchow Robin space)、VR間隙內之血管、海馬、下視丘之在腦之下表面上之部分、視神經及視束、嗅球及突出部分及其組合。
在一些實施例中，使治療性融合蛋白傳遞至大腦或脊髓之一或多種深層組織。在一些實施例中，大腦或脊髓之靶向表面或淺表組織位於大腦之表面下方(或內部)4mm(例如5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm)。在一些實施例中，大腦之靶向深層組織包括腦皮層條帶。在一些實施例中，大腦之靶向深層組織包括以下一或多者：間腦(例如下視丘、視丘、腹視丘、丘腦底部等)、後腦、豆狀核、基底神經節、尾狀核、殼、杏仁核、蒼白球及其組合。
在各種實施例中，脊髓之靶向表面或淺表組織含有軟膜及/或白質 束。在各種實施例中，脊髓之靶向深層組織含有脊髓灰質及/或室管膜細胞。在一些實施例中，使治療性融合蛋白傳遞至脊髓之神經元。
在各種實施例中，使治療性融合蛋白傳遞至小腦之一或多種組織。在某些實施例中，小腦之靶向一或多種組織係選自由分子層之組織、浦肯雅細胞層(Purkinje cell layer)之組織、顆粒細胞層之組織、小腦腳及其組合組成之群。在一些實施例中，使治療劑(例如酶)傳遞至小腦之一或多種深層組織，包括但不限於浦肯雅細胞層之組織、顆粒細胞層之組織、深層小腦白質組織(例如相對於顆粒細胞層較深)及深層小腦核組織。
在各種實施例中，使治療性融合蛋白傳遞至腦幹之一或多種組織。在一些實施例中，腦幹之靶向一或多種組織包括腦幹白質組織及/或腦幹核組織。
在各種實施例中，使治療性融合蛋白傳遞至各種腦組織，包括但不限於灰質、白質、室周區域、軟膜蜘蛛膜、腦脊髓膜、新皮質、小腦、腦皮質中之深層組織、分子層、尾狀核/殼區域、中腦、橋腦或髓質之深層區域及其組合。
在各種實施例中，使治療性融合蛋白傳遞至腦中之各種細胞，包括但不限於神經元、神經膠細胞、血管周細胞及/或腦膜細胞。在一些實施例中，使治療性蛋白質傳遞至深層白質之寡樹突細胞。
用於本發明方法中之套組
本發明之方法中使用之藥劑可提供於套組中，該套組可進一步包括使用說明書。該種套組將包含如本文所述之包含用於治療溶小體儲積疾病之酶及溶小體靶向部分的融合蛋白，其通常呈適於向宿主投與之劑量及形式。在各種實施例中，套組將通常包含用於鞘內傳遞酶之裝置。
亦可提供用於使抗原(特定言之多肽抗原)結合於高攝取部分以產 生治療性組合物之套組。舉例而言，可提供或者結合於如上所述之適於連接多肽之連接子的部分，諸如IGF-II突變蛋白質。亦可與適合連接子及使用說明書組合提供呈未結合形式之高攝取部分。
除治療性組合物之外，另一套組亦可包含鞘內投與本發明之治療性組合物之說明書。在某些實施例中，本發明之套組可包含用於鞘內投與酶補充療法之用本發明之治療性組合物預裝載的導管或其他裝置。舉例而言，明確涵蓋用呈醫藥學上可接受之調配物形式之0.001-0.01mg、0.01-0.1mg、0.1-1.0mg、1.0-10mg、10-100mg或100mg以上治療性融合蛋白預裝載的導管，該治療性融合蛋白包含溶小體酶及溶小體靶向部分，諸如Naglu及IGF-II突變蛋白質。示範性導管可為可在使用之後丟棄之單次使用導管。或者，預裝載導管可再填充且提供於具有用於再填充此等導管之適量酶之套組中。
本發明將藉由以下實例進一步且更明確加以描述。然而，實例係出於說明而非限制目的被包括。
實例1-產生間隔子序列
包含GILT標籤及間隔子之溶小體酶已揭露於美國專利公開案第20030082176號、第20040006008號、第20040005309號及第20050281805號中。包含間隔肽之α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(Naglu)融合蛋白揭露於美國專利公開案第201120232021號中。如下所述開發用於包含溶小體酶及GILT標籤之靶向治療性融合蛋白中之其他間隔肽。
可開發用以連接IGF-II突變蛋白質與弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質兩者之間隔子。示範性間隔子包括以下胺基酸序列：EFGGGGSTR(SEQ ID NO：22)、GAP(SEQ ID NO：9)、GGGGS(SEQ ID NO：12)、GGGGA(SEQ ID NO：60)、GPSGSPG(SEQ ID NO：23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO：24)、GPSGSPH(SEQ ID NO：25)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID NO：26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO：27)及GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO：62)。
產生包含間隔子、全長Naglu(包括信號序列)及IGF-II肽之構築體，其中間隔子序列(EFGGGGSTR間隔子(SEQ ID NO：22)、GAP間隔子(SEQ ID NO：9)、GGGGS間隔子(SEQ ID NO：12)、GPSGSPG間隔子(SEQ ID NO：23)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS間隔子(SEQ ID NO：36))插入在全長Naglu與IGF2 8-67 R37A(SEQ ID NO：560-564)之間。
基於如Schellenberger等人(Nat Biotech 27：1186-1190,2009)中所述之XTEN方法製備其他連接子。相較於其他連接子，XTEN樣連接子可提供所產生之融合蛋白之較長半衰期。示範性間隔子具有胺基酸序列GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO：44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO：45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ ID NO：46)及GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)。間隔子可視情況經由構築體上之AscI位點插入在Naglu與IGF-2突變蛋白質之間。
蛋白質表現已與用於編碼特定胺基酸之DNA密碼子相關聯，例如改變胺基酸之密碼子可增加蛋白質之表現而不改變蛋白質之胺基酸序列(Trinh等人，Mol.Immunol 40：717-722,2004)。改變編碼肽之密碼子導致重組融合蛋白產生量增加。使用此技術，開發用於具有溶小體酶 之治療性融合蛋白中之其他間隔子序列，諸如GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：58)及GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：59)。其他間隔子序列為GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO：80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：81)及GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO：82)。此等間隔子之任一者視情況經由構築體上之AscI位點插入在Naglu與IGF-II突變蛋白質之間。
包含多個脯胺酸以有助於剛性之一示範性剛性連接子具有以下序列：GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO：48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO：50)或GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)，而一示範性螺旋連接子具有以下序列：GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO：52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO：53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO：54)或GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)。此等間隔子之任一者視情況經由構築體上之AscI位點插入在Naglu與IGF-II突變蛋白質之間。
可利用由DNA 2.0(Menlo Park,CA)開發之技術，使用密碼子最佳化產生其他間隔子。涵蓋之間隔子包括 GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO：40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：41)、GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO：42)、 GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：43)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO：75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：76)、 GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO：77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：78)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO：87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO：88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO：89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO：90)。此等間隔子之任一者視情況經由構築體上之AscI位點插入在Naglu與IGF-II突變蛋白質之間。
在某些實施例中，若使用BM-40細胞外基質蛋白質信號肽序列(Nischt等人，Eur J.Biochem 200：529-536,1991)，則構築體中之Naglu不包含其自身信號肽序列。間隔子插入在Naglu序列與IGF-II突變蛋白質序列(例如IGF2 8-67 R37A)之間。一示範性BM-40信號肽序列為MRAWIFFLLCLAGRALA(SEQ ID NO：8)。GAP肽可添加至間隔子中以有助於選殖及添加AscI選殖位點。在某些實施例中，若使用天然Naglu信號肽序列(Weber等人，Hum Mol Genet.5：771-777,1996)，則Naglu為全長Naglu且間隔子插入在全長Naglu與IGF-II突變蛋白質序列(例如IGF2 8-67 R37A)之間。GAP肽可添加至間隔子中以有助於選殖及添加AscI選殖位點。
在示範性構築體中，已使用DNA 2.0技術使人類Naglu經「密碼子最佳化」。意欲Naglu包含人類Naglu之胺基酸1-743或胺基酸24-743。在一示範性構築體中，間隔子視情況包含GAP間隔子(用於選殖之AscI限制酶位點)或任何以下序列：EFGGGGSTR(SEQ ID NO：22)、GAP(SEQ ID NO：9)、GGGGS(SEQ ID NO：12)、GPSGSPG(SEQ ID NO：23)、GPSGSPGT(SEQ ID NO：24)、GPSGSPGH(SEQ ID NO：25)、 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPST(SEQ ID NO：26)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSH(SEQ ID NO：27)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：28)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：29)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：30)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：31)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：32)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：33)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：34)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：36)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：37)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPS(SEQ ID NO：38)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGPSGAP(SEQ ID NO：39)、GGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO：40)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：41)、 GGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPS(SEQ ID NO：42)、GAPGGGGSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGGGGSAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：43)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPS(SEQ ID NO：44)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPGPSGAP(SEQ ID NO：45)、GGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPS(SEQ ID NO：46)、GAPGGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPGTSTEPSEGSAPGSPAGSPTSTGPSGAP(SEQ ID NO：47)、GGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPS(SEQ ID NO：48)、GAPGGGSPAPTPTPAPTPAPTPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：49)、GGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPS(SEQ ID NO：50)、GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)、GGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPS(SEQ ID NO：52)、GAPGGGSAEAAAKEAAAKEAAAKAGGPSGAP(SEQ ID NO：53)、GGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGG(SEQ ID NO：54)、GAPGGGSPAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAPSGGGGAP(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：57)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：58)、GAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGAP(SEQ ID NO：59)、GGGGA(SEQ ID NO：60)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPST(SEQ ID NO：61)、 GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH(SEQ ID NO：62)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：63)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：64)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：65)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：66)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：67)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：68)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：69)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：70)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：71)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：72)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPS(SEQ ID NO：73)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGPSGAP(SEQ ID NO：74)、GGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPS(SEQ ID NO：75)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：76)、GGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAA SGGGPS(SEQ ID NO：77)、GAPGGGGAGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGGGGAAAAASGGGPSGAP(SEQ ID NO：78)、GGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：79)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO：80)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGA(SEQ ID NO：81)、GAPGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGAP(SEQ ID NO：82)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)8GGGPS](SEQ ID NO：83)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)8GGGPSH](SEQ ID NO：84)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPS[或(GGGGA)9GGGPS](SEQ ID NO：85)、GGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGGAGGGPSH[或(GGGGA)9GGGPSH](SEQ ID NO：86)、GGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPS(SEQ ID NO：87)、GAPGGGGPAPGPGPAPGPAPGPAGGGPGGAP(SEQ ID NO：88)、GGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPS(SEQ ID NO：89)及GAPGGGGPAPAPGPAPAPGPAPAGGGPGGAP(SEQ ID NO：90)。視情況使用DNA 2.0技術使以上間隔子經「密碼子最佳化」。
本文所述之視情況使用DNA 2.0技術加以「密碼子最佳化」之任何IGF-II突變蛋白質皆適用於本發明構築體中。在示範性構築體中，IGF-II突變蛋白質為弗林蛋白酶抗性IGF-II突變蛋白質IGF2△8-67 R37A。
實例2-表現及純化構築體
製備且重組表現包含以上間隔子、Naglu酶及IGF-II靶向肽之構築體。在某些實施例中，構築體包含信號肽。示範性信號肽包括例如且 不限於包含全長Naglu之胺基酸1-23之Naglu信號肽(Weber等人，Hum Mol Genet 5：771-777,1996)或源於BM-40細胞外基質蛋白質之信號肽(Nischt等人，Eur J Biochem 200：529-536,1991)。
將編碼Naglu序列、IGF-II突變蛋白質及間隔肽之DNA插入適當表現載體，諸如pEE及pXC GS表現載體(Lonza Biologics,Berkshire,UK)及pC3B(BioMarin，內部)表現載體中。AscI限制位點(ggcgcgcc(SEQ ID NO：570))可插入載體中以有助於選殖本文所述之治療性融合蛋白。
一示範性構築體包含包括信號肽之全長Naglu序列(圖1及圖2)、間隔肽(圖3)及包含殘基8-67且在殘基Arg-37處具有對IGF-II肽賦予弗林蛋白酶抗性之Ala胺基酸取代R37A的IGF-II肽(圖1及2)。
初始使用短暫表現系統評估實例1中所述之連接Naglu與IGF-II肽之各種連接子或間隔子序列。將具有GILT標籤之Naglu質體(pXC17.4，Lonza)轉染至懸浮CHOK1SV GS KO細胞(Lonza)中。使用電穿孔使15μg質體DNA轉染至106個細胞中。在轉染後24小時完全交換培養基。將經轉染細胞在不經選擇下在1.5×106個細胞/毫升下接種於振盪器燒瓶中。當細胞在30℃下生長直至14天時，測定細胞生長、活力、效價及比生產力。
使具有GILT標籤之Naglu質體轉染至懸浮CHOK1SV細胞(Lonza)中。使細胞在37℃及8% CO2下在振盪燒瓶中於含6mM麩醯胺酸之CDCHO培養基(Invitrogen)中生長。使用電穿孔使1×107個細胞中之30μg線性化質體DNA轉染至細胞中。在轉染之後48小時將細胞於CDCHO培養基+40μM MSX中在5000個細胞/孔下接種。在37℃及8% CO2下培育各盤約4-6週以鑒別純系生長。接著藉由針對Naglu之4MU活性分析(參見實例3)篩檢菌落且將最高表現性菌落於CDCHO培養基+40μM MSX中轉移至24孔盤中，且接著繼續使最高表現性純系繼代至6孔盤中，接著振盪燒瓶以鑒別最高表現性純系來產生具有GILT標籤之Naglu 融合蛋白。
使用標準蛋白質純化技術進行純化。舉例而言，在一示範性純化方法中，自-80℃下儲積物解凍如上所述之哺乳動物細胞培養上清液起始物質。用NaCl調整物質以達到最終濃度1M，隨後進行0.2μm無菌過濾。
將經過濾物質裝載於用丁基裝載緩衝液(20mM Tris、1M NaCl，pH 7.5)預平衡之丁基疏水性相互作用管柱上。使用丁基溶離緩衝液(20mM Tris，pH 7.5)，用歷經10管柱體積之線性梯度溶離結合物質。匯合來自溶離峰之樣品，經緩衝液交換至20mM Tris(pH 7.5)中，且裝載於Q陰離子交換管柱上。接著使用Q溶離緩衝液(20mM Tris、1M NaCl，pH 7.5)，用線性梯度(10管柱體積)溶離結合蛋白質。接著使用離心旋轉濃縮器使純化樣品經緩衝液交換且無菌過濾以供儲積。
構築、表現、產生、純化及調配一示範性Naglu融合蛋白：Naglu-(GGGGS) 4 GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：568)。藉由標準重組DNA方法產生編碼Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：568)之DNA構築體。Naglu對應於全長人類Naglu之胺基酸1-743且IGF-II對應於包含成熟人類IGF-II之胺基酸8-67，且具有賦予弗林蛋白酶抗性之R37A胺基酸取代的IGF-II突變蛋白質。用DNA構築體轉染CHOK1SV細胞，且如上所述分離穩定之具有GILT標籤之Naglu-IGF-II融合蛋白表現性純系。
使表現Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：568)之細胞在生物反應器中生長，且如下自培養基純化Naglu融合蛋白。用鹽調整收集物至1M NaCl，接著裝載於丁基瓊脂糖4 FF管柱上。用鹽自丁基瓊脂糖4 FF管柱溶離Naglu融合蛋白，收集並透析，且接著裝載於肝素瓊脂糖6 FF管柱上。Naglu融合蛋白收集於流過(flow-through)溶離份中，且裝載於Q瓊脂糖HP管柱上。用鹽自Q瓊脂糖HP管柱溶離Naglu融合蛋 白，濃縮，且接著藉由製備型聚丙烯醯胺葡聚糖S300粒徑排阻層析精製。
使用此純化程序，產生高度純化之酶活性Naglu融合蛋白Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：568)。以20mg/mL將純化Naglu融合蛋白調配於人工CSF(1mM磷酸鈉、148mM氯化鈉、3mM氯化鉀、0.8mM氯化鎂、1.4mM氯化鈣，pH 7.2)中。
構築、表現、產生、純化及調配示範性Naglu融合蛋白。藉由標準重組DNA方法產生編碼Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：569)、Naglu-剛性-IGF-II(SEQ ID NO：566)、Naglu-螺旋-IGF-II(SEQ ID NO：567)及Naglu-XTEN-IGF-II(SEQ ID NO：565)之DNA構築體。Naglu對應於全長人類Naglu之胺基酸1-743且IGF-II對應於包含成熟人類IGF-II之胺基酸8-67，且具有賦予弗林蛋白酶抗性之R37A胺基酸取代的IGF-II突變蛋白質。示範性剛性、螺旋及XTEN連接子描述於實例1中。用DNA構築體轉染CHOK1SV細胞，且如上所述分離穩定之具有GILT標籤之Naglu-IGF-II融合蛋白表現性純系。
使表現Naglu-IGF-II融合蛋白之細胞在生物反應器中生長。在典型饋料批式產生操作(10~16天)中，具有各種連接子之Naglu-IGF-II構築體皆達到高於30mg/L之效價及高於80%之高細胞活力。
如上所述自培養基純化Naglu融合蛋白。使用此純化程序，酶活性未加標籤之Naglu及Naglu-IGF-II融合蛋白，諸如Naglu-剛性-IGF-II(SEQ ID NO：566)、Naglu-螺旋-IGF-II(SEQ ID NO：567)、Naglu-XTEN-IGF-II(SEQ ID NO：565)及Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：569)經純化至約99%純度，如藉由逆相HPLC所測定。以20mg/mL將純化未加標籤之Naglu及Naglu融合蛋白調配於人工CSF(1mM磷酸鈉、148mM氯化鈉、3mM氯化鉀、0.8mM氯化鎂、1.4mM氯化鈣，pH 7.2)中。
意欲如本文所述之相較於包含不同間隔肽之融合蛋白，顯示較高重組活性蛋白質表現量及/或酶活性增加之融合蛋白可用於如下進一步所述之進一步實驗，諸如活性分析、結合分析、攝取分析及活體內活性分析中。
實例3-活性分析
為測定Naglu融合蛋白之酶活性，使用螢光標記之合成受質進行活體外Naglu活性分析。
分析中使用之物質包括：於含10% DMSO之分析緩衝液(0.2M乙酸鈉，有或無1mg/ml BSA，及0.005%吐溫20(Tween 20)，pH 4.3-4.8)中製備成最終20mM濃度且儲積在-80℃下的4-甲基傘酮-N-乙醯基-α-D-葡萄胺糖苷(4MU-NaGlu受質)(Calbiochem，目錄號474500)。以10mM在DMSO中製備4-甲基傘酮(4-MU標準物)(Sigma，目錄號M1381)之儲備溶液且以小等分試樣儲積在-20℃下。rhNaglu-His6對照(0.5mg/ml，R&D Systems，目錄號7096-GH)於25mM Tris、125mM NaCl、0.001%吐溫20(pH 7.5)中稀釋至10μg/ml且以小等分試樣儲積在-80℃下。
在透明96孔稀釋盤(Granger)上，使用標準物於稀釋緩衝液(1×PBS，有或無1mg/ml BSA，0.005%吐溫20，pH 7.4)中之2×連續稀釋液，自200μM至1.563μM，加一個空白。在透明稀釋盤上，以若干稀釋度(於稀釋緩衝液中)製備樣品以確保其在標準曲線內。
將10μl標準物(200μM至1.563μM)、對照及操作樣品轉移至黑色非處理聚苯乙烯96孔盤(Costar，目錄號3915)中。添加75μl受質(2mM)至各孔中，隨後在37℃下培育30分鐘。接著藉由添加200μl終止緩衝液(0.5M甘胺酸/NaOH，pH 10.7)來淬滅反應。在96孔螢光盤讀取器上在Ex355 Em460，以455為截斷值下讀取各盤。
使用此分析，顯示示範性Naglu融合蛋白，包括Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：568)、Naglu-(GGGGA)4GGGPS- IGF-II(SEQ ID NO：569)、Naglu-剛性-IGF-II(SEQ ID NO：566)、Naglu-螺旋-IGF-II(SEQ ID NO：567)及Naglu-XTEN-IGF-II(SEQ ID NO：565)具有活體外酶活性，其中對合成4MU-Naglu受質之比活性在約175,000至約220,000nmol/h/mg之範圍內。Naglu融合蛋白之酶活性與未加標籤之Naglu蛋白質之酶活性(約190,000nmol/h/mg)類似。示範性Naglu融合蛋白之酶活性資料提供於表2中。
1如實例2中所述構築、表現且純化未加標籤之Naglu及Naglu融合蛋白；示範性剛性、螺旋及XTEN連接子描述於實例1中2實例3至5中測試之Naglu融合蛋白中之連接子的SEQ ID NO：3如實例3中所述量測Naglu蛋白質之比活性(nmol/h/mg)4如實例4中所述量測Naglu蛋白質對IGF2R競爭性結合之IC50 5如實例5中所述量測Naglu蛋白質在MPS-IIIB纖維母細胞中之K攝取及半衰期(t1/2)
實例4-結合分析
大體上如US 20120213762中所述進行用以測定Naglu融合蛋白與IGF-I、IGF-II及胰島素受體之結合之結合分析。簡言之，在量測生物素化胰島素結合盤結合之胰島素之競爭的分析中測試融合蛋白構築體對胰島素受體之結合親和力。藉由使胰島素、IGF-II及融合蛋白與生物素化胰島素競爭結合胰島素受體(胰島素-R)來進行胰島素受體結合 分析。
詳言之，白色Reacti-Bind盤用胰島素-R在1μg/孔/100μl(38.4nM)之濃度下塗佈。將經塗佈盤在室溫下培育隔夜，接著用洗滌緩衝液(300μl/孔)洗滌3次。接著用阻斷緩衝液(300μl/孔)阻斷各盤1小時。重複洗滌步驟且取出各盤中任何痕量之溶液。使生物素化胰島素在20nM下與藉由連續稀釋獲得之不同濃度之胰島素、IGF-II或融合蛋白混合。添加100μl含稀釋胰島素、IGF-II或Naglu融合蛋白之20nM胰島素-生物素至經塗佈盤中且在室溫下培育各盤2小時。接著用洗滌緩衝液洗滌各盤3次。添加100μl抗生蛋白鏈菌素(strepavidin)-HRP操作溶液(50μl抗生蛋白鏈菌素-HRP於10ml阻斷緩衝液中)至各盤中且在室溫下培育各盤30分鐘。添加100μl含有Elisa-Pico化學發光受質之Elisa-Pico操作溶液且在425nm下量測化學發光。
IGF2R競爭性結合分析
為量測Naglu融合蛋白構築體結合IGF-II受體之能力，進行競爭性結合分析。將IGFIIR之涉及IGF-II結合之片段(域10-13，稱為蛋白質1288)塗佈在96孔盤上。將生物素化IGF-II與受體一起在遞增量之競爭劑：對照IGF-II(非生物素化)或融合蛋白樣品(含有IGF-II源性GILT抗原決定基標籤)存在下培育。用結合於辣根過氧化酶(HRP)之抗生蛋白鏈菌素及化學發光HRP受質偵測受體結合之生物素化IGF-II。由抑制曲線計算融合蛋白抑制生物素化IGF-II結合IGFIIR之能力且報導為IC50值(為達成50%結合抑制所需之濃度)。
對於分析，將IGFIIR於塗佈緩衝液中在0.5μg/孔下以100μl體積(69.6nM/孔)塗佈於白色Reacti-bind盤(Pierce，目錄號437111)中。將盤密封且在室溫下培育隔夜。接著用洗滌緩衝液將盤洗滌3次，用阻斷緩衝液阻斷且接著再次用洗滌緩衝液(300μl/孔)洗滌3次。
接著，使8nM IGF-II-生物素與不同濃度之競爭劑(IGF-II(非生物 素化)、參照蛋白或Naglu融合蛋白樣品)混合，且以2倍連續稀釋度添加至IGFIIR塗佈之盤中。
在室溫下將盤培育2小時，隨後用洗滌緩衝液將盤洗滌3次。於阻斷緩衝液中製備抗生蛋白鏈菌素-HRP(1：200稀釋)，且添加每孔100μl至盤中。使用Pico-Elisa試劑，經由抗生蛋白鏈菌素-HRP偵測IGF-II-生物素結合活性。簡言之，每孔添加製備之Pico-Elisa操作溶液(100μl/孔)，且在室溫下在溫和搖動下培育5分鐘，接著量測425nm下之化學發光。
使用在各抑制劑濃度下結合之IGF-II-生物素之百分比來計算樣品之IC50。
使用此競爭性IGFIIR結合分析，顯示示範性Naglu融合蛋白，包括Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：568)、Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：569)、Naglu-剛性-IGF-II(SEQ ID NO：566)、Naglu-螺旋-IGF-II(SEQ ID NO：567)及Naglu-XTEN-IGF-II(SEQ ID NO：565)具有0.23-0.36nM之IC50值。未加標籤之Naglu蛋白質在此分析中不具有可偵測結合。示範性Naglu融合蛋白之IGF2R競爭性結合資料提供於表2中。
實例5-攝取分析
為量測溶小體儲積疾病酶經由受體介導之胞吞作用進入細胞之能力，進行使用CI-MPR受體量測大鼠肌母細胞L6細胞或人類MPS IIIB纖維母細胞中之酶攝取的攝取分析。甘露糖-6-磷酸(M6P)及IGF-II用作抑制劑以確定結合CI-MPR受體之位點。收集資料以產生酶攝取之飽和曲線且確定過程之動力學參數K攝取。
在攝取分析之前(24小時)，在每孔1×105個細胞之密度下將L6細胞(L6大鼠肌母細胞，ATCC# CRL-1458)或人類MPS IIIB纖維母細胞接種於24孔盤(VWR #62406-183)中且每孔接種0.5ml。在分析之早晨，在 組織培養通風櫥中使酶與攝取培養基(1L DMEM、1.5g碳酸氫鈉、0.5g牛血清白蛋白、20ml L-麩醯胺酸(200mM(Gibco #25030-081))、20ml 1M HEPES(Gibco #1563080)(20mM最終)，pH 7.2)混合。酶量可在2-500nM之範圍內。攝取培養基+酶之最終體積為每孔0.5ml。添加M6P(5mM最終濃度)及/或IGF-II(2.4μM或18μg/ml最終濃度)至適當樣品中。對於攝取抑制，每毫升攝取培養基添加18μl IGF-II儲備物(1mg/ml，133.9μM)。
自細胞吸出生長培養基且添加0.450ml含酶之攝取緩衝液至各孔中。注意時間且使細胞返回至培育箱持續18小時。自培育箱移除盤且自細胞吸出攝取緩衝液。藉由添加0.5ml杜貝卡氏PBS(Dulbecco’s PBS)且吸出來將各盤洗滌4次。添加200μl CelLytic M溶解緩衝液(Sigma)至各盤中且在室溫下振盪20-30分鐘。自細胞移除溶解產物且在-80℃下儲積於經膠帶覆蓋之透明96孔盤(VWR)中直至準備分析。
對於酶分析，藉由一式兩份添加至於黑色96孔盤(VWR)(參見上文)中之15μl酶反應混合物(例如Naglu+4MU分析物)中來添加5μl各溶解產物且測定各溶解產物中之酶/單位/ml/h。
對於溶解產物蛋白質分析，根據製造商說明書使用Pierce BCA蛋白質分析套組分析一式兩份10μl各溶解產物。為量測吸光度，用盤讀取器(BMG FluoStar Optima盤讀取器)在562nm下讀取吸光度且測定ug/ml濃度。
對於各酶裝載量，攝取量為每毫克溶解產物之酶活性單位數。為測定攝取量，每毫升之酶單位數除以ug/ml蛋白質且乘以1000(減去來自空白孔之攝取量)。比較有或無抑制劑之分析之結果以測定受體攝取特異性。
對於飽和曲線，在0.2-100nM之範圍內之10個酶裝載濃度用於使用上述分析產生飽和曲線。
使用此分析，顯示示範性Naglu融合蛋白Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：568)在MPS-IIIB纖維母細胞中之K攝取為7-9nM。
或者，在攝取分析之前(24小時)，在1×105個細胞/0.5ml/孔之密度下將L6細胞或人類MPS IIIB纖維母細胞接種於24孔盤中。於攝取培養基：1L DMEM、1.5g碳酸氫鈉、0.5g牛血清白蛋白、20ml 200mM L-麩醯胺酸及20ml 1M HEPES(pH 7.2)中製備1.6~50nM之酶樣品。對於攝取抑制，添加M6P(直至最終5.0mM)及/或IGF-II(直至最終1.0μM)至適當樣品中。
自細胞吸出生長培養基且用每孔0.5ml含酶製劑之攝取緩衝液替換。在培育4小時之後，用0.5ml杜貝卡氏PBS洗滌各盤2次。添加100μl M-PER溶解緩衝液(Pierce)至各盤中且在室溫下振盪10分鐘。溶解產物儲積在-80℃下直至準備分析。
對於酶分析，一式兩份添加10μl各溶解產物至黑色96孔盤(參見上文)中。
對於溶解產物蛋白質分析，根據製造商說明書使用Pierce BCA蛋白質分析套組分析一式兩份10μl各溶解產物。用盤讀取器(BMG FluoStar Optima盤讀取器)在562nm下讀取吸光度且使用BSA作為標準物測定μg/ml濃度。
對於各酶裝載量，攝取量表示為30分鐘內釋放之4-MU之奈莫耳數。對於飽和曲線，在1.6-50nM之範圍內之酶濃度用於使用上述分析產生飽和曲線。
藉由歷經約8天之時期監測細胞內Naglu活性來測定Naglu融合蛋白之細胞穩定性。在每孔1×105個細胞之密度下接種於24孔盤(VWR #62406-183)中之人類MPS IIIB纖維母細胞用Naglu融合蛋白在20nM最終濃度下處理4小時。在培育4小時之後，使細胞切換至無Naglu融合 蛋白之生長培養基中。對於各時間點(4小時、28小時、4天、6天及8天)，在室溫下於100μl M-PER溶解緩衝液(Pierce)中溶解細胞10分鐘，且使用4-MU標記之受質分析酶活性。歷經8天取樣時期之Naglu活性降低可相對於一級動力學加以擬合以估計蛋白質之細胞半衰期。
使用此分析，顯示示範性Naglu融合蛋白，包括Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：568)、Naglu-(GGGGA)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：569)、Naglu-剛性-IGF-II(SEQ ID NO：566)、Naglu-螺旋-IGF-II(SEQ ID NO：567)及Naglu-XTEN-IGF-II(SEQ ID NO：565)以K攝取值約2.3-6.3nM內化至MPS IIIB纖維母細胞中。相反，在此等實驗條件下，未加標籤之Naglu蛋白質未由細胞攝取。此外，Naglu融合蛋白之觀測攝取量受IGF-II而非受M6P抑制。在攝取之後，發現示範性Naglu融合蛋白為穩定的，基於在細胞溶解產物中量測之酶活性(4-MU受質)的估計半衰期為約9.5天。示範性Naglu融合蛋白之攝取及半衰期資料提供於表2中。
實例6-活體內NAGLU融合蛋白活性
為測定Naglu融合蛋白活體內活性，向Naglu基因剔除動物投與融合蛋白(參見Li等人，Proc Natl Acad Sci USA 96：14505-510,1999)。Naglu基因剔除物呈現有在腦、肝及腎中之大量硫酸乙醯肝素、腦中β-己醣胺酶活性及溶小體相關之膜蛋白2(LAMP-2)染色增加、及腦中之神經節苷脂升高。
在歷經兩週時期ICV(腦室內)注射重組人類(rh)Naglu-IGF2 4次(每次注射100μg)之後測定外源性酶之活性及生物分佈。將永久導管植入小鼠(n=12/組，開始時為8-12週齡)中且調整以覆蓋導管不在腦室中之彼等小鼠。終點量測結果包括Naglu生物分佈、腦細胞之溶小體中之GAG(例如硫酸乙醯肝素)儲積降低、及星形細胞及小神經膠質細胞之活化。在治療及對照組層面上量測之各含量之各種溶小體或神經性生 物標記物(Ohmi等人，PLoS One 6：e27461,2011)包括但不限於溶小體相關之膜蛋白1(LAMP-1)、LAMP-2、磷脂醯肌醇蛋白聚糖5、硫酸乙醯肝素之Naglu特異性非還原性末端(NRE)、神經節苷脂、膽固醇、粒線體ATP合成酶之次單元c(SCMAS)、泛素、P-GSK3β、β澱粉狀蛋白及P-tau(磷酸化Tau)、GFAP(星形細胞活化)及CD68(小神經膠質細胞活化)。
使用歷經兩週時期接受4次rhNaglu-IGF2 ICV注射之小鼠(n=12/組，開始時為5個月大，每次注射100μg)進行測定存活及行為分析之其他實驗。欲量測之終點包括存活時間、開放場地活動性、Naglu生物分佈、溶小體中之GAG(例如硫酸乙醯肝素)儲積降低、溶小體或神經性生物標記物(諸如LAMP-1、LAMP-2、磷脂醯肌醇蛋白聚糖5、神經節苷脂、膽固醇、SCMAS、泛素、P-GSK3β、β澱粉狀蛋白、P-tau、GFAP及CD68)之含量。
已開發在naglu基因之外顯子6中具有突變之Naglu基因剔除小鼠(Naglu-/-)(Li等人，Proc Natl Acad Sci U S A.96：14505-10,1999)。選擇外顯子6位點，因為此為人類中之許多突變之位點。在同型接合小鼠中未偵測到Naglu活性，且在異型接合子中存在Naglu活性降低。Naglu-/-小鼠具有降低之存活時間(6-12個月)，且可具有其他功能性表型，如活動性程度降低。分析Naglu融合蛋白對Naglu-/-小鼠之影響。
歷經2週向Naglu-/-小鼠(n=8)及8只Naglu-/-小鼠(n=8個同窩異型接合子)投與4次ICV劑量(每劑100μg Naglu-IGF2)。在第-2天時，使小鼠麻醉且將導管插入左側腦室。使小鼠恢復。在第1、5、10及14天，在ICV給藥之前15分鐘使小鼠麻醉(苯乃爾(Benedryl)，5mg/kg IP)。歷經15分鐘經由導管輸注5μl體積之ICV劑量，且使小鼠恢復。在第15天，處死小鼠，放血且冷凍血清。收集腦且將IR染料注射至導管中並使導管成像。
進行以下分析以測定Naglu融合蛋白之影響：體重評估、導管置放之NIR成像、使用免疫組織化學評估腦中之Naglu-IGF2、GFAP、LAMP-1及LAMP-2含量、針對Naglu活性、β-己醣胺酶含量及活性之生物化學分析、用以偵測累積醣胺聚多醣(GAG)之為IIIb型黏多糖病(MPS-IIIb)所特有之非還原性末端的SensiPro分析(WO 2010/078511A2)、如藉由生物化學分析量測之GM3神經節苷脂含量、以及對內側內嗅皮質中之SCMAS、A-β、磷脂醯肌醇蛋白聚糖5、CD68、GFAP及Naglu之免疫染色(Li等人，上文)。
預期用Naglu-IGF2有效治療會導致LAMP-1、LAMP-2、GFAP、CD68、SCMAS、A-β、磷脂醯肌醇蛋白聚糖5、β-己醣胺酶、GM3神經節苷脂及MPS-IIIb特異性GAG之含量降低。
示範性Naglu融合蛋白在小鼠MPS IIIb模型中之活體內功效。歷經兩週時期向Naglu-/-小鼠(n=8)投與4次ICV劑量(每劑100μg)之Naglu-IGF-II融合蛋白Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：568)或Naglu-剛性-IGF-II(SEQ ID NO：566)。對Naglu-/-小鼠(n=8)及8個異型接合或野生型同窩出生者(n=8)給與單獨媒劑作為對照。在第-5天時，使小鼠麻醉；將導管插入腦之左側腦室。使小鼠恢復。在第1、5、10及14天，用吸入異氟烷使小鼠麻醉。在ICV給藥之前15分鐘向各小鼠投與苯乃爾(5mg/kg IP)以降低反應於Naglu-IGF-II治療之任何潛在組胺釋放。歷經15-20分鐘經由植入導管輸注5μl體積之ICV劑量，且使小鼠恢復。在最終劑量之後1、7、14及28天，處死小鼠。收集腦且徑向分成5段以分配給各種分析。
進行以下分析以測定Naglu-IGF-II融合蛋白之影響：免疫化學評估腦中之Naglu、LAMP-2、GFAP及CD68含量、針對Naglu及β-己醣胺酶活性之生物化學分析、用以偵測總硫酸乙醯肝素及硫酸乙醯肝素之為所IIIB型黏多糖病(MPS-IIIB)特有之NRE的SensiPro分析(Deakin等人， Glycobiology 18：483,2008；Lawrence等人，Nat Chem Biol.8：197,2012；Lawrence等人，J Biol Chem.283：33674,2008)(WO 2010/078511A2)、及對內側內嗅皮質中之SCMAS、β-澱粉狀蛋白(A-β)、p-Tau、P-GSK3β、磷脂醯肌醇蛋白聚糖5、GFAP及CD68之免疫螢光染色(Li等人，上文)。
當在最終劑量之後24小時評估時，用Naglu-(GGGGS)4GGGPS-IGF-II(SEQ ID NO：568)或Naglu-剛性-IGF-II(SEQ ID NO：566)融合蛋白治療導致Naglu酶活性顯著增加，伴有β-己醣胺酶活性及總硫酸乙醯肝素、硫酸乙醯肝素之Naglu特異性NRE以及LAMP-2之含量降低。Naglu酶可易於在腦組織中偵測，不僅在皮質、海馬、齒狀回及視丘中，而且亦在遠端地理位置，包括杏仁核、鼻周皮質及下視丘中可偵測。在用Naglu-IGF-II治療後，亦觀測到Naglu-/-腦中之CD68、SCMAS、β-澱粉狀蛋白(A-β)、p-Tau、P-GSK3β及磷脂醯肌醇蛋白聚糖5之含量顯著降低。截至末次劑量後24小時，GFAP染色不變化。免疫組織化學顯示在腦之許多區域中，在神經元及神經膠細胞內部存在與LAMP-2共定位之Naglu酶。
歷經末次劑量後7、14及28天時間點，硫酸乙醯肝素含量、Naglu特異性NRE含量及β-己醣胺酶活性程度持續降低。在28天，所有分析物皆處於或接近正常小鼠對照值。
等效物
熟習此項技術者將僅使用常規實驗即會認識到或能夠確定本文所述之本發明之特定實施例的許多等效物。本發明之範疇不意欲限於以上描述，而是如隨附申請專利範圍中所述。除非明確相反地指示，否則如本文在說明書及申請專利範圍中所用之冠詞「一」及「該」應理解成包括複數個指示物。除非相反地指示或另外根據上下文顯而易知，否則若一個、一個以上或全部群組成員存在於、用於既定產品或 過程中或另外與既定產品或過程相關，則在某一群組之一或多個成員之間包括「或」的申請專利範圍或描述被視為符合。本發明包括群組之恰好一個成員存在於、用於既定產品或過程中或另外與既定產品或過程相關之實施例。本發明亦包括一個以上或全部群組成員存在於、用於既定產品或過程中或另外與既定產品或過程相關之實施例。此外，應瞭解除非另外指示或除非將為一般技藝人士顯而易知將出現矛盾或不一致，否則本發明涵蓋來自一或多個申請專利範圍之一或多個限制、要素、條款、描述性術語等的變化形式、組合及排列引入依賴於同一基礎申請專利範圍(或當相關時任何其他申請專利範圍)之另一申請專利範圍中。當要素以清單形式，例如以馬庫西(Markush)群組或類似形式呈現時，應瞭解亦揭露該等要素之各子組，且可自群組移除任何要素。應瞭解一般而言，當本發明或本發明之態樣被提及為包含特定要素、特徵等時，本發明之某些實施例或本發明之某些態樣由或基本上由此等要素、特徵等組成。出於簡化目的，彼等實施例尚未在每一情況下皆在本文中明確闡述。亦應瞭解本發明之任何實施例，例如見於先前技術內之任何實施例可明確自申請專利範圍排除，無論是否在說明書中敘述特定排除。
亦應瞭解除非明確相反地指示，否則在本文主張之包括一個以上舉動之任何方法中，方法之舉動之順序不必限於敘述方法之舉動所依之順序，但本發明包括如此限制順序之實施例。此外，當申請專利範圍敘述組合物時，本發明涵蓋使用該組合物之方法及製備該組合物之方法。當申請專利範圍敘述組合物時，應瞭解本發明涵蓋使用該組合物之方法及製備該組合物之方法。
本申請案中引用之所有公開案及專利文件皆以全文引用的方式併入本文中，該引用的程度就如同將各個別公開案或專利文件之內容併入本文中一般。
<110> AOYAGI-SCHARBER等人
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<221> misc_feature
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<213> 人工序列
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<221> misc_feature
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<212> PRT
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<212> PRT
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<400> 543
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<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
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<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<221> misc_feature
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Glu或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Ala或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Lys或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (82)..(82)
<223> Xaa為Glu或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Ala或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Lys或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Glu或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (93)..(93)
<223> Xaa為任何胺基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (94)..(99)
<223> Xaa為任何胺基酸或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (105)..(108)
<223> Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (110)..(113)
<223> Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Ser或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Ser或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (120)..(123)
<223> Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Ser或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Ser或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa為Gly或不存在
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 552
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
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<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
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<221> misc_feature
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<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
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<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
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<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> misc_feature
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<223> 合成肽
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<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (33)..(36)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (57)..(60)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)..(33)
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<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (69)..(73)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 556
<210> 557
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (34)..(39)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(50)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (81)..(86)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 557
<210> 558
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(45)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (51)..(57)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(99)
<223> Xaa可為任何天然存在之胺基酸
<400> 558
<210> 559
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (130)..(133)
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (134)..(134)
<223> Xaa為Ala或不存在
<400> 559
<210> 560
<211> 812
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
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<211> 806
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 561
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 562
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<211> 810
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 563
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<211> 828
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 564
<210> 565
<211> 859
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 565
<210> 566
<211> 834
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 566
<210> 567
<211> 846
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 567
<210> 568
<211> 828
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 568
<210> 569
<211> 828
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 569
<210> 570
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AscI限制位點
<400> 570
<210> 571
<211> 60
<212> PRT
<213> 智人
<400> 571

Claims (20)

  1. 一種靶向治療性融合蛋白，其包含(a)人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(Naglu)蛋白質，其包含與SEQ ID NO：1之胺基酸1-743或胺基酸24-743至少90%一致之胺基酸序列，(b)胺基酸序列與SEQ ID NO：5(成熟人類IGF-II)之胺基酸8-67至少90%一致之肽標籤及(c)在該Naglu蛋白質與該IGF-II肽標籤之間的間隔肽，其中該間隔肽包含胺基酸序列GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)。
  2. 如請求項1之靶向治療性融合蛋白，其中該溶小體酶係人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(Naglu)蛋白質(SEQ ID NO：1)。
  3. 如請求項2之靶向治療性融合蛋白，其中該溶小體靶向域包含成熟人類IGF-II(SEQ ID NO：5)之胺基酸8-67。
  4. 如請求項3之靶向治療性融合蛋白，其中該IGF-II肽標籤在殘基Arg37處包含突變。
  5. 如請求項4之靶向治療性融合蛋白，其中該突變為精胺酸被取代成丙胺酸。
  6. 如請求項1至5中任一項之靶向治療性融合蛋白，其進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  7. 一種核酸，其編碼如請求項1至5中任一項之靶向治療性融合蛋白。
  8. 一種細胞，其含有如請求項7之核酸。
  9. 一種產生靶向治療性融合蛋白之方法，其包含以下步驟：在允許表現該靶向治療性融合蛋白之條件下培養如請求項8之細胞。
  10. 一種用於治療個體之IIIB型黏多糖病(B型山菲立普症候群)之醫藥組合物，該醫藥組合物包含融合蛋白，該融合蛋白包含與人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(Naglu)蛋白質，其包含與SEQ ID NO：1之胺基酸1-743或胺基酸24-743至少90%一致之胺基酸序列、胺基酸序列與SEQ ID NO：5(成熟人類IGF-II)之胺基酸8-67至少90%一致之肽標籤及位於該Naglu蛋白質胺基酸序列與該IGF-II肽標籤之間的間隔肽，其中該間隔子包含胺基酸序列GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)。
  11. 一種用於降低罹患IIIB型黏多糖病(B型山菲立普症候群)之個體活體內醣胺聚多醣含量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含有效量之融合蛋白，該融合蛋白包含i)人類α-N-乙醯基葡萄胺糖苷酶(Naglu)蛋白質，其包含與SEQ ID NO：1之胺基酸1-743或胺基酸24-743至少90%一致之胺基酸序列，ii)胺基酸序列與SEQ ID NO：5(成熟人類IGF-II)之胺基酸8-67至少90%一致之肽標籤，及iii)位於該Naglu蛋白質胺基酸序列與該IGF-II肽標籤之間的間隔肽，其中該間隔肽包含胺基酸序列GAPGGGSPAPAPTPAPAPTPAPAGGGPSGAP(SEQ ID NO：51)。
  12. 如請求項10或11之醫藥組合物，其中該溶小體靶向域包含成熟人類IGF-II之胺基酸8-67。
  13. 如請求項12之醫藥組合物，其中該IGF-II肽標籤在殘基Arg37處包含突變。
  14. 如請求項13之醫藥組合物，其中該突變為精胺酸被取代成丙胺酸。
  15. 如請求項10或11之醫藥組合物，其中該融合蛋白包含人類Naglu(SEQ ID NO：1)之胺基酸1-743或胺基酸24-743。
  16. 如請求項14之醫藥組合物，其中該融合蛋白包含人類Naglu(SEQ ID NO：1)之胺基酸1-743或胺基酸24-743。
  17. 如請求項10或11之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係以鞘內投與。
  18. 如請求項16之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係以鞘內投與。
  19. 如請求項17之醫藥組合物，其中該鞘內投與包含將該融合蛋白引入腦室(cerebral ventricle)、腰區域(lumbar area)或大池(cisterna magna)中。
  20. 如請求項18之醫藥組合物，其中該鞘內投與包含將該融合蛋白引入腦室、腰區域或大池中。
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