JP2010048830A - C型肝炎ウイルス抗原免疫アッセイ検出システム - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生物学的サンプルにおいて、C型肝炎ウイルスタンパク質ならびにC型肝炎ウイルスタンパク質と抗体との間の免疫複合体を検出するための免疫アッセイ、C型肝炎ウイルスについて血液製剤をスクリーニングする方法、およびそのために使用されるキットが提供される。このC型肝炎ウイルスを検出するための方法は、生物学的なサンプルを、抗ヒト抗体および少なくとも1つのモノクローナル抗C型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と接触させる工程、ならびにこの抗体およびエンベロープタンパク質の免疫複合体の存在を検出する工程、を包含する。
【選択図】図1A
Description
本発明は、一般的に、C型肝炎ウイルスを検出するための免疫アッセイ、および詳細には、生物学的サンプルにおけるC型肝炎ウイルスを検出する方法、C型肝炎ウイルスについて血液製剤をスクリーニングする方法、およびそのためのキットに関する。
C型肝炎ウイルス(HCV)が、Houghtonらにより、最初に同定され、そして輸血後非A、非B型肝炎(NANBH)の主な原因として特徴付けられた。HCVに関する実質的な情報を提供するのに加えて、Houghtonらおよび彼らの協力者は、多数の一般的かつ特異的な、免疫学的試薬および方法を開示した。例えば、Houghtonら,欧州公開番号318,216号;Houghtonら,欧州公開番号388,232;Chooら,Science,1989,244,359−362;Kuoら,Science,1989,244,362−364;Takeuchiら,J.Gen.Virol.、1990,71,3027−3033;Takeuchiら,Gene,1990,91,287−291;Takeuchiら,Nucl.Acids Res.,1990,18,4626;Miyamuraら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87,983−987;Saitoら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87,6547−6549;Chooら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88,2451−2455;Hanら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,1711−1715;Houghtonら,Hepatology,1991,14,381−388;およびWeinerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89,3468−3472を参照のこと。これらの刊行物は、一般的に、HCVに関する広い背景技術、ならびにHCVポリペプチド免疫学的試薬の製造および使用を提供する。従って、略して、これらの刊行物の開示は詳細に、本明細書中にその全体が参考として援用される。
K.K.)を参照のこと。また、Matsuuraら,J.Virology,1992,66,1425;Katoら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87,9524−9528;Takamizawaら,J.Virol.,1991,65,1105−1113;Chibaら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88,4641−4645;Haradaら,J.Virol.,1990,65,3015−3021;Hijikataら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88,5547−5551;Okamotoら,Jpn.J.Exp.Med.,1990,60,167−177;Yuasaら,J.Gen.Virol.,1991,72,2021−2024;およびWatanabeら,Int.J.Cancer,1991,48,340−343を参照のこと。
本発明は、サンプルを、抗ヒト抗体および少なくとも1つのモノクローナル抗C型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と、抗体とサンプルとの間の免疫学的反応を可能にする条件下で接触させること、およびこの抗体およびこのエンベロープタンパク質の免疫複合体の存在を検出することを包含する、生物学的サンプル中のC型肝炎ウイルスを検出するための方法に指向される。
(項目1) 生物学的なサンプルにおけるC型肝炎ウイルスを検出するための方法であって、上記方法は、以下の工程:
上記サンプルを、抗ヒト抗体および少なくとも1つのモノクローナル抗C型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と、上記抗体と上記サンプルとの間で免疫学的反応を可能にする条件下で、接触させる工程;ならびに
上記抗体および上記エンベロープタンパク質の免疫複合体の存在を検出する工程、を包含する、方法。
(項目2) 上記抗ヒト抗体が、固相に結合される、項目1に記載の方法。
(項目3) 上記固相が、マイクロタイタープレート、常磁性粒子、および常磁性ビーズからなる群より選択される、項目2に記載の方法。
(項目4) 上記モノクローナル抗体が、e2コンフォメーションエピトープ、e2線形エピトープ、e2線形中和エピトープ、e1コンフォメーションエピトープ、e1線形エピトープ、およびe1線形中和エピトープからなる群より選択されるエピトープと反応する、項目1に記載の方法。
(項目5) 上記少なくとも1つのモノクローナル抗体が、e2コンフォメーションエピトープ、e2線形エピトープ、e2線形中和エピトープ、e1コンフォメーションエピトープ、e1線形エピトープ、e1線形中和エピトープ、またはそれらの組み合わせと反応する、項目1に記載の方法。
(項目6) 上記モノクローナル抗体が、検出可能に標識される、項目1に記載の方法。
(項目7) 上記抗ヒト抗体が、生物学的サンプルとの接触の前に、ポリクローナル抗C型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と接触する、項目1に記載の方法。
(項目8) 生物学的サンプルにおけるC型肝炎ウイルスを検出するための方法であって、以下:
固相に結合される抗ヒト抗体を、ポリクローナル抗C型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と接触させる工程;
上記サンプルを、上記ポリクローナル抗体に接触させる工程;
上記サンプルを、少なくとも1つの検出可能に標識された、モノクローナル抗C型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と、上記抗体と上記サンプルとの間で免疫学的反応を可能にする条件下で、接触させる工程;および
上記抗体および上記エンベロープタンパク質の免疫複合体の存在を検出する工程、を包含する、方法。
(項目9) 血液製剤を調製するための血液または血液成分の使用の前に、C型肝炎ウイルスについてこのような血液成分または血液をスクリーニングする方法であって、以下:
潜在的なドナー由来の身体成分を、抗ヒト抗体および少なくとも1つのモノクローナル抗C型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と、上記抗体と上記身体成分との間の免疫学的反応を可能にする条件下で反応させる工程;
上記抗体とC型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質との間に形成される免疫複合体の存在を検出する工程;ならびに
上記複合体が検出される場合、上記ドナー由来のいずれの血液または血液成分も廃棄する工程、
を包含する、方法。
(項目10) 生物学的サンプルにおけるC型肝炎ウイルスを検出するためのキットであって、以下:
抗ヒト抗体;
少なくとも1つのモノクローナル抗C型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体;
コントロール標準;および
上記キットの成分の使用のための説明書、
を備える、キット。
(項目11) ポリクローナル抗C型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体をさらに備える、項目10に記載のキット。
(項目12) 上記抗ヒト抗体が固相に結合される、項目10に記載のキット。
(項目13) 上記モノクローナル抗体が、e2コンフォメーションエピトープ、e2線形エピトープ、e2線形中和エピトープ、e1コンフォメーションエピトープ、e1線形エピトープ、およびe1線形中和エピトープからなる群より選択されるエピトープと反応する、項目10に記載のキット。
(項目14) e2コンフォメーションエピトープ、e2線形エピトープ、e2線形中和エピトープ、e1コンフォメーションエピトープ、e1線形エピトープ、e1線形中和エピトープ、またはそれらの組み合わせと反応する、複数のモノクローナル抗体を備える、項目10に記載のキット。
(項目15) 上記モノクローナル抗体が検出可能に標識される、項目10に記載のキット。
本発明の実施には、他に示されなければ、当該分野内での、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えDNA技術の従来の方法を使用する。このような技術は、これらの文献中に完全に説明される。例えば、Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、1989;DNA Cloning:A Practical Approach,IおよびII巻、D.Glover編;Methods In Enzymology、S.ColowickおよびN.Kaplan編,Academic Press,Inc.;Handbook of Experimental Immunology,I〜IV巻、D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編,Blackwell Scientific Publications;およびFundamental Virology,第2版,IおよびII巻、B.N.FieldsおよびD.M.Knipe,編を参照のこと(これらの各々が、本明細書中で、その全体が参考として援用される)。さらに、抗体は、例えば以下に示される標準的な公開されたプロトコールに従って、調製される:HarlowおよびLane,1988,Antibodies: A laboratory manual,Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press(これはその全体が参考として本明細書中に援用される)。
E1およびE2の産生のために使用されるHCV配列を、プラスミドpC5P−1から、StuI部分/BglIIフラグメントとして単離した。このフラグメントは、HCV−1ポリタンパク質の第1のメチオニンから、966位のアスパラギン酸まで延びる。含まれるドメインには、ヌクレオカプシド、C、推定エンベロープ糖タンパク質であるE1およびE2の両方、ならびにNS2の短縮形態のそれぞれである。さらに、そのフラグメントはまた、HCVゲノムの5’非翻訳領域のその部分に対応する約60bpを含む。当業者はまた、所望のE1およびE2の部分を含むその他のフラグメントを調製し得る。
組換えワクシニアウイルスのスクリーニングは、本質的に、Mackettら、DNA Cloning、Vol.II(D.M.Glover編,IRL Press,Oxford,England、1985、191−211頁)によって記載されるように行われた。より詳細には、アフリカミドリザル腎臓細胞であるBSC40のコンフルエントな単層(6cmのディッシュ)を、0.05の感染多重度(MOI)で野生型ワクシニアウイルス(WR株)に感染させた。37度で2時間インキュベートした後、その細胞を、リン酸カルシウム法を使用して、25μgのPSC59ポリDNAでトランスフェクトした。4時間のインキュベーションの後、その培地を正常な培地に変更し、そしてその細胞を、さらに48時間37℃でインキュベートした。その細胞を、そのディッシュから掻き取ることによって回収し、そしてそのウイルスを、3サイクルの凍結解凍によって放出し、そして細胞溶解物中の放出されたウイルスを、−80℃で保存した。
1リットルのHela S3スピナー細胞を、スピナーフラスコ中で、1mlあたり106細胞の密度まで褐色であった。その細胞を、HCVポリタンパク質フラグメントをコードする組換えワクシニアウイルスで、1.0のMOIを使用して感染させ、一晩インキュベートし、回収し、そして細胞ペレットとして−80℃で保存した。
好ましい検出アッセイの感度を、組換えCHO−e2抗原を使用して測定した。簡単には、ポリクローナルチンパンジー抗HCV e1/e2抗体/マウス抗ヒトIgG/PMP複合体を、上記のようにCHO細胞中で産生した組換えHCV e2と接触させた。複数のモノクローナル抗体抗HCVエンベロープタンパク質抗体(291/A2、抗e2コンフォメーション;1G2A7、抗e2中和および3E5−2、抗e2線形)をアッセイあたり100ngで、その複合体と接触させた。そのモノクローナル抗体を、ビオチンで標識し、そしてストレプトアビジンシステムを使用して結合を測定した。代表的な結果を、表1に示す。このデータは、そのアッセイがCHO e2抗原を1.95ng/ml程度の低い濃度で検出し得ることを示す。
HCV e2を検出する好ましい検出アッセイは、抗HCV抗体を検出する検出アッセイと比較された。生物学的サンプル(連続採血)を二人の患者から、いくつかの時点で(例えば、4/17(I−1)、5/10(I−2)、5/24(I−3)、5/24(I−3)、6/8(I−4)、6/28(I−5)、7/19(I−6)、および12/28(I−7)において)、得た。患者Iは、セロコンバージョンしていない個体であった。患者Yは、すでにセロコンバージョンしていた。各サンプルを、HCV e2タンパク質(タンパク質アッセイ)の存在について、または抗HCV抗体(抗体アッセイ)の存在について、試験した。抗体アッセイについて、固相に結合させたCHO e2タンパク質を使用して、生物学的サンプル中に存在するヒト抗HCV抗体を捕捉した。ビオチン標識したモノクローナル抗ヒトIgG/ストレプトアビジンシステムを使用して、ヒト抗HCV抗体の存在を検出した。タンパク質アッセイのために、上記のように、ポリクローナル抗e1e2抗体に結合させた抗ヒトIgGに結合させた固相を、生物学的サンプルに接触させた。そのシステムは遊離のHCV抗原ならびにHCV抗原/ヒトIg免疫複合体を検出し得る。ビオチン標識した抗e2抗体(例えば、3E5−2および291/A2の組み合わせ)を、ストレプトアビジンとともに、HCV e2タンパク質の存在を検出するために使用した。代表的な結果を、表2(抗体アッセイ)、表3(タンパク質アッセイ)、および表4(標準コントロール)に示す。
SACは、HCVに感染したことが知られている患者由来の生物学的サンプルであり、陽性コントロールとして機能する。
NHSは、正常ヒト血清であり、陰性コントロールとして機能する。
本明細書に記載される検出システムはまた、免疫複合体化HCVエンベロープ抗原を検出するために使用され得る。好ましい検出アッセイを、いくつかの生物学的サンプル中の種々の量の免疫複合体化HCVエンベロープ抗原の量を検出するために行った。生物学的サンプルには、I−6(実施例5から;免疫複合体なし)、SAC(実施例5から;軽い程度の免疫複合体)、Y−7(実施例5から;中程度の免疫複合体)、およびJP(高セロコンバージョンの患者由来のサンプル;重程度の免疫複合体)が含まれていた。各サンプルを、上記実施例5のようにHCV e2タンパク質(タンパク質アッセイ)の存在について、または上記実施例5に記載のように抗HCV抗体(抗体アッセイ)の存在について検査した。代表的な結果を表5に示す。
本明細書に記載したその検出システムのアッセイ感度は、シグナルの増幅を、現在のアッセイフォーマットに適用することによって増幅され得る。例えば、超常磁性ラテックス粒子(Estapor)に結合させたHCV e2タンパク質(5E5/H&吸収された)に対するマウスモノクローナル抗体は、種々の量のCHO e2タンパク質を捕捉するために使用された。HCV e1e2に対するビオチン標識ポリクローナル抗体を使用して、CHO e2タンパク質を検出した。ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ(hrp)複合体を使用して、HCV e1e2に対するビオチン標識ポリクローナル抗体に結合させた。さらに、DMAE結合体化抗hrp抗体(種々の動物由来)を使用して、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ(hrp)複合体を検出し、斯くしてシグナルを増幅した。代表的な結果を表6に示す。
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