JP5498637B2

JP5498637B2 - Ｃ型肝炎ウイルス抗原免疫アッセイ検出システム

Info

Publication number: JP5498637B2
Application number: JP2001514569A
Authority: JP
Inventors: デイビッドワイ．チエン，; フィリップアーカンジェル，
Original assignee: ノバルティスバクシンズアンドダイアグノスティックス，インコーポレーテッド
Priority date: 1999-07-28
Filing date: 2000-07-25
Publication date: 2014-05-21
Anticipated expiration: 2020-07-25
Also published as: DE60033190T2; JP2010048830A; CY1106349T1; WO2001009609A2; CA2380777C; DE60033190D1; ATE352785T1; CA2380777A1; EP1295126A2; PT1295126E; JP2003529744A; EP1295126B1; WO2001009609A3; ES2279766T3; DK1295126T3

Description

（発明の分野）
本発明は、一般的に、Ｃ型肝炎ウイルスを検出するための免疫アッセイ、および詳細には、生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルスを検出する方法、Ｃ型肝炎ウイルスについて血液製剤をスクリーニングする方法、およびそのためのキットに関する。

（発明の背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらにより、最初に同定され、そして輸血後非Ａ、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の主な原因として特徴付けられた。ＨＣＶに関する実質的な情報を提供するのに加えて、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらおよび彼らの協力者は、多数の一般的かつ特異的な、免疫学的試薬および方法を開示した。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，欧州公開番号３１８，２１６号；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，欧州公開番号３８８，２３２；Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４，３５９−３６２；Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４，３６２−３６４；Ｔａｋｅｕｃｈｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、１９９０，７１，３０２７−３０３３；Ｔａｋｅｕｃｈｉら，Ｇｅｎｅ，１９９０，９１，２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９０，１８，４６２６；Ｍｉｙａｍｕｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７，９８３−９８７；Ｓａｉｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７，６５４７−６５４９；Ｃｈｏｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，２４５１−２４５５；Ｈａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１７１１−１７１５；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９１，１４，３８１−３８８；およびＷｅｉｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，３４６８−３４７２を参照のこと。これらの刊行物は、一般的に、ＨＣＶに関する広い背景技術、ならびにＨＣＶポリペプチド免疫学的試薬の製造および使用を提供する。従って、略して、これらの刊行物の開示は詳細に、本明細書中にその全体が参考として援用される。

他者が、Ｈｏｕｇｈｔｏｎらの研究を、容易に応用しかつ広げた。例えば、Ｈｉｇｈｆｉｅｌｄら，英国特許出願２，２３９，２４５（ＴｈｅＷｅｌｃｏｍｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＬｔｄ．）；Ｗａｎｇ，欧州公開番号４４２，３９４（ＵｎｉｔｅｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＩｎｃ．）；Ｌｅｕｎｇら，欧州公開番号４４５，４２３（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；Ｈａｂｉｔｓら，欧州公開番号４５１，８９１（ＡｋｚｏＮ．Ｖ．）；Ｒｅｙｅｓら，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１５５１６（ＧｅｎｅｌａｂｓＩｎｃ．）；Ｍａｋｉら，欧州公開番号４６８，６５７（ＴｏｎｅｎＣｏｒｐ．）；およびＫａｍａｄａら，欧州公開番号４６９，３４８（ＳｈｉｏｎｏｇｉＳｅｉｙａｋｕＫ．Ｋ．）を参照のこと。また、Ｍａｔｓｕｕｒａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９２，６６，１４２５；Ｋａｔｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７，９５２４−９５２８；Ｔａｋａｍｉｚａｗａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，６５，１１０５−１１１３；Ｃｈｉｂａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，４６４１−４６４５；Ｈａｒａｄａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９０，６５，３０１５−３０２１；Ｈｉｊｉｋａｔａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，５５４７−５５５１；Ｏｋａｍｏｔｏら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９０，６０，１６７−１７７：Ｙｕａｓａら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９１，７２，２０２１−２０２４；およびＷａｔａｎａｂｅら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９１，４８，３４０−３４３を参照のこと。

ＨＣＶのキャリアおよびＨＣＶに汚染された血液または血液製剤をスクリーニングし、そして同定し、ならびに処置を受けている患者をモニターするための、感度の高い、特定の方法は、医学において重要な進歩である。輸血後肝炎（ＰＴＨ）は、輸血を受けた約１０％の患者に生じ、そしてＨＣＶが、これらの場合の９０％までの割合を占めた。この疾患における主な問題は、他の肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）と比較して、慢性的な肝臓損傷への頻繁な進行（２５〜５５％）である。

患者の世話ならびに血液および血液製剤によるか、または近接したヒトとの接触によるＨＣＶの伝染の予防は、信頼できる診断手段および予後手段（例えば、ＨＣＶ感染に関連するタンパク質を検出するためのＨＣＶ抗体など）を必要とする。このような抗体はまた、ＨＣＶを有する患者の処置レジメンをモニターするための薬剤として有用である。ＨＣＶは、比較的新しい因子なので、疾患の臨床過程および集団におけるＨＣＶの疫学の研究をさらに可能にするさらなる免疫学的試薬を規定するための継続した必要性が存在する。

ＨＣＶを検出するための現在の方法論は、ＨＣＶ特異的抗体を検出することに注目する。例えば、Ｈａｄａら，ＡｃｔａＭｅｄ．Ｏｋａｙａｍａ，１９９２，４６，３６５−７０；Ｍｉｙａｍｕｒａら，欧州公開番号０５３７６２６；Ｌｏｋら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９３，１８，４９７−５０２；Ｗａｎｇら，ＶｏｘＳａｎｇ，１９９２，６２，２１−４；Ｋｌｅｉｎｍａｎら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ，１９９２，３２，８０５−８１３；Ｌｅｏｎら，ＶｏｘＳａｎｇ，１９９６，７０，２１３−１６；Ｌｅｓｎｉｅｗｓｋｉら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９５，４５，４１５−２２；およびＩｎｏｕｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９２，７３，２１５１−５４を参照のこと。ＨＣＶと反応する抗体を検出する主な不都合は、セロコンバージョンがすでに生じ、そして患者がすでに十分に確立されたウイルス感染を有し得ることである。あるいは、個体がＨＣＶ抗体反応性であることを決定される場合、個体が過去にときどきＨＣＶに曝露されて、そして現在は感染していないかもしれないことを簡単に意味し得る。

ＨＣＶを検出するための他の方法は、ＰＣＲを使用することを含む。例えば、Ｆｒａｎｃｏｉｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９３，３１，１１８９−９３を参照のこと。ＨＣＶエンベロープタンパク質はまた、慢性的な肝臓疾患を有する患者における肝細胞の免疫組織化学的分析により検出されている。しかし、これらのアッセイは、容易には、臨床的な設定に役立たない（Ｈｉｒａｍａｔｓｕら，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９９２，１６，３０６−３１１）。

他の方法はまた、ＨＣＶコアタンパク質を検出することに指向される。例えば、Ｏｒｉｔｏら，Ｇｕｔ，１９９６，３９，８７６−８０およびＫａｓｈｉｗａｋｕｍａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９６，１９０，７９−８９を参照のこと。これらの方法としては、組換えＨＣＶコアタンパク質と反応性のモノクローナル抗体を使用した、タンパク質捕捉蛍光酵素免疫アッセイ（ＦＥＩＡ）、伝統的なサンドウィッチＥＬＩＳＡアッセイ、を含む。この方法は、捕捉抗体として固相上にコートされる１つのモノクローナル抗体および抗原検出シグナル抗体としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合体化モノクローナル抗体を使用することからなる。しかし、これらのアッセイは、とても手間のかかる（ｔｅｄｉｏｕｓ）サンプル調製手順（例えば、ポリエチレングリコール沈降、ＮａＯＨ変性、中性ｐＨへのサンプルのレトリトレーション（ｒｅｔｒｉｔｒａｔｉｏｎ）およびアッセイ開始の前のサンプル調製物へのＴｒｉｔｏｎＸ−１００の添加を含む）を必要とする。このようなアッセイは、臨床的設定において好都合でない。事実、必要とするものは、ＨＣＶの抗原の検出のための、容易で、迅速な免疫アッセイである。

出願人は、手間のかかるサンプル調製手順なしに、ＨＣＶエンベロープ抗原（Ｅ１およびＥ２）を検出し得る免疫アッセイ系を開発した。出願人の発明は、セロコンバージョン、急性感染後の抗原消失、および／またはインターフェロン治療の前に、遊離ＨＣＶ抗原を検出する手段を提供し、そして従って、診断の手段として、ならびに血液スクリーニングのためおよび薬物処置の効力を評価するために有用である。従って、出願人の発明は、生物学的サンプルにおいてＨＣＶを検出するための有意な改善である。

（発明の要旨）
本発明は、サンプルを、抗ヒト抗体および少なくとも１つのモノクローナル抗Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と、抗体とサンプルとの間の免疫学的反応を可能にする条件下で接触させること、およびこの抗体およびこのエンベロープタンパク質の免疫複合体の存在を検出することを包含する、生物学的サンプル中のＣ型肝炎ウイルスを検出するための方法に指向される。

本発明はまた、固相に結合された抗ヒト抗体を、ポリクローナル抗Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と接触させること、ポリクローナル抗体にサンプルを接触させること、サンプルを、少なくとも１つの検出可能に標識されるモノクローナル抗Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と、この抗体とこのサンプルとの間で免疫学的反応を可能にする条件下で接触させること、そしてこの抗体およびこのエンベロープタンパク質の免疫複合体の存在ならびに／または遊離エンベロープタンパク質の存在を検出することを包含する、生物学的サンプル中のＣ型肝炎ウイルスを検出するための方法に指向される。

本発明はまた、潜在的なドナー由来の身体成分を、抗ヒト抗体および少なくとも１つのモノクローナル抗Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と、この抗体とこの身体成分との間で免疫学的反応を可能にする条件下で反応させること、この抗体とＣ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質との間で形成される免疫複合体の存在を検出すること、およびその複合体が検出される場合、ドナーからいずれの血液または血液成分も廃棄することを含む、血液製剤を調製するためのこのような血液または血液成分の使用の前に、Ｃ型肝炎ウイルスについて血液成分または血液をスクリーニングする方法に指向される。

本発明はまた、抗ヒト抗体、少なくとも１つのモノクローナル抗Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体、コントロール標準、およびキット成分の使用のための説明書を備える、生物学的サンプル中のＣ型肝炎ウイルスを検出するためのキットに指向される。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の実施には、他に示されなければ、当該分野内での、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このような技術は、これらの文献中に完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、１９８９；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩおよびＩＩ巻、Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編；ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１〜ＩＶ巻、Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；およびＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，ＩおよびＩＩ巻、Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編を参照のこと（これらの各々が、本明細書中で、その全体が参考として援用される）。さらに、抗体は、例えば以下に示される標準的な公開されたプロトコールに従って、調製される：ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（これはその全体が参考として本明細書中に援用される）。

「ＨＣＶエンベロープタンパク質」は、少なくとも１つのＨＣＶエピトープを、エンベロープタンパク質内に規定している、アミノ酸配列（および／またはアミノ酸アナログ）を含むポリペプチドまたはポリペプチドアナログ（例えば、ミミトープ（ｍｉｍｉｔｏｐｅ））をいう。代表的には、エピトープを規定する配列が、ＨＣＶタンパク質のアミノ酸配列に、（同一か、またはエピトープを破壊しないネイティブなアミノ酸残基のアナログの置換を介してのいずれかで）対応する。一般に、エピトープ規定配列は、長さが５個以上のアミノ酸、より代表的には長さが８個以上のアミノ酸、およびさらにより代表的には長さが１０個以上のアミノ酸である。

「線形（ｌｉｎｅａｒ）エピトープ」は、１連の連続アミノ酸を含むエンベロープタンパク質の１部をいう。抗体結合タンパク質は、好ましくは、５個以上の連続アミノ酸、より代表的には８個以上の連続アミノ酸、およびさらにより代表的には１０個以上の連続アミノ酸により規定されるエピトープと、相互作用する。

「線形中和抗体」は、抗体がエピトープと結合される場合、その抗体が、標的細胞のウイルス感染をブロックするような線形エピトープをいう。エンベロープタンパク質内のこれらのエピトープと反応性の抗体は、標的細胞のウイルス感染を阻害または排除し得る。

「コンフォメーション（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）エピトープ」とは、抗原の３次元形状（例えば、折り畳み）によって形成されるエピトープをいう。配列を規定するエピトーピの長さは、広範なバリエーションに供され得る。従って、エピトープを規定するアミノ酸は、比較的少ない数であるが、分子の長さに沿って（またはダイマーの場合は異なる分子に対してでさえ）広範に広がり、これにより、折り畳みを介して正確なエピトープコンフォメーションをもらし得る。エピトープを規定する残基間の抗原の部分は、このエピトープのコンフォメーション構造に重要でないかもしれない。例えば、これらの介在配列の欠失または置換は、コンフォメーションエピトープに影響を与えないかもしれない（ただし、エピトープコンフォメーションに重要な配列（例えば、ジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など）は維持される）。

本明細書中に使用される場合「Ｅ１」は、ＨＣＶポリタンパク質の最初の４００アミノ酸内で発現されるタンパク質またはポリペプチドをいい、これはときどき、Ｅタンパク質またはＳタンパク質といわれる。その天然形態において、Ｅ１は、膜との強い結合において見出される３５ｋＤの糖タンパク質である。最も天然のＨＣＶ系統において、Ｅ１タンパク質は、Ｃ（コア）タンパク質の次ぎに続くウイルスポリタンパク質においてコードされる。Ｅ１タンパク質は、全長ポリタンパク質がアミノ酸（ａａ）約１９２〜ａａ約３８３に及ぶ。本明細書中に使用される場合、用語「Ｅ１」はまた、天然のＥ１と免疫学的に交差反応性である、アナログおよび短縮形態を含む。

本明細書中に使用される場合「Ｅ２」は、ＨＣＶポリタンパク質の最初の９００アミノ酸内で発現されるタンパク質またはポリペプチドをいい、これはときどき、ＮＳ１タンパク質といわれる。その天然形態において、Ｅ２は、膜との強い結合において見出される７２ｋＤの糖タンパク質である。最も天然のＨＣＶ系統において、Ｅ２タンパク質は、Ｅ１タンパク質の次に続くウイルスポリタンパク質においてコードされる。Ｅ２タンパク質は、ａａ約３８４〜ａａ約８２０に及ぶ。本明細書中に使用される場合、用語「Ｅ２」はまた、天然のＥ２と免疫学的に交差反応性である、アナログおよび短縮形態を含む。

本明細書中に使用される場合、用語「凝集体」とは、１つより多くのＥ１モノマーまたはＥ２モノマーを含む、Ｅ１および／またはＥ２の複合体をいう。Ｅ１：Ｅ１ダイマー、Ｅ２：Ｅ２ダイマー、およびＥ１：Ｅ２ヘテロダイマーは、全て、この定義の範囲内の「凝集体」である。凝集体はまた、より大きな形態を含み得、そして、８００ｋＤを超える分子量を有し得る。

句「生物学的サンプル」とは、抗体またはウイルス粒子を通常含む哺乳動物（例えば、類人猿、ヒト）の体液または組織をいう。このような化合物は、当該分野で公知であり、そしてこれらとしては、血液、血漿、血清、髄液、リンパ液、呼吸の分泌物、腸管または尿生殖器の管、涙、唾液、乳汁、白血球および骨髄腫が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的サンプルはまた、生物学的な液体を含む。用語「生物学的な液体」とは、生物から得られる液体をいう。いくつかの生物学的な液体は、他の生成物、例えば、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ：Ｃ因子）、血清アルブミン、増殖ホルモンなどの供給源として使用される。そのような場合、生物学的な液体の供給源は、ＨＣＶのようなウイルスによって汚染されていないことが、重要である。生物学的サンプルはまた、「体の成分」といわれる。

句「固相」とは、抗ヒト抗体が、共有結合されるかまたは非共有結合的な手段（例えば、疎水性吸着）によって結合される、固形物をいう。この固相は、サンプルを、インキュベーションの後に抗体から分離することを容易にする。使用され得る固相の好ましい例は、ニトロセルロース（例えば、膜またはマイクロタイターウェルの形態で）、ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターの形態で）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート、ポリフッ化ビニリデン（Ｉｍｍｕｎｌｏｎ^TMとして公知））、ジアゾ化ペーパー、ナイロン膜、活性化ビーズ、ＰｒｏｔｅｉｎＡビーズ、磁気ラテックス粒子（ＭＬＰ）、常磁性粒子（ＰＭＰ）、および常磁性ビーズである。例えば、ＤｙｎａｔｅｃｈＩｍｍｕｎｌｏｎ^TM１もしくはＩｍｍｕｎｌｏｎ^TM２のマクロタイタープレートまたは０．２５インチのポリスチレンビーズ（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎＰｌａｓｔｉｃＢａｌｌ）が、使用され得る。

本発明の１つの局面は、生物学的サンプル中のＣ型肝炎ウイルスを検出するための方法にむく。多数の免疫アッセイ形式が、本発明に従って使用され得る。しかし、この免疫エッセイ形式は、成分（すなわち、生物学的サンプル中に存在し得る抗体およびタンパク質）の間の相互作用を考慮しなければならない。好ましい免疫アッセイ形式は、以下により詳細に記載されるＥＬＩＳＡ抗原捕捉アッセイである。しかし、等価な免疫アッセイ形式が、当業者に公知であり、そして本発明の範囲内に含まれる。

本発明の好ましい実施形態において、患者中のＣ型肝炎ウイルスと抗体との免疫複合体を検出する方法は、生物学的サンプルを、抗ヒト抗体および少なくとも１つのモノクローナル抗Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と、この抗体とこのサンプルとの間の免疫学的反応を可能にする条件下で接触させる工程、およびこの生物学的サンプル中に存在し得る抗体およびエンベロープタンパク質の免疫複合体の存在を検出する工程を包含する。このようなアッセイ構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）の好ましい実施形態は、図１Ｂに示される。このアッセイ構成は、生物学的サンプル中に存在するＥ１および／またはＥ２タンパク質に結合したヒト抗ＨＣＶ抗体を含む免疫複合体を検出し得る。

本発明の別の好ましい実施形態において、ポリクローナル抗Ｃ型肝炎エンベロープタンパク質抗体は、生物学的サンプルと接触させる前に、抗ヒト抗体とこのポリクローナル抗Ｃ型肝炎エンベロープ抗体との間の免疫学的反応を可能にする条件下で抗ヒト抗体に接触させる。このようなアッセイ構成の好ましい実施形態は、図１Ａおよび１Ｃに示される。このアッセイ構成は、遊離のエンベロープ抗原（図１Ａ）ならびにＥ１タンパク質および／またはＥ２タンパク質に結合したヒト抗ＨＣＶ抗体を含む免疫複合体（図１Ｃ）を検出し得る。

抗ヒト抗体は、例えば、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍを含むいくつかの供給元から商業的に得られ得る。任意の抗ヒト抗体が、本発明に使用され得、そして、任意の動物から誘導され得るかまたは合成的に調製され得る。好ましい抗体は、Ｗａｌｐｏｌｅから得られるマウス抗ヒトＩｇＧＦｃである。このような抗体はまた、例えば、霊長類ポリクローナル抗Ｃ型肝炎エンベロープタンパク質抗体のような霊長類抗体に結合し得る。好ましくは、抗ヒト抗体は、当業者に公知の標準的な技術によって固相に結合される。好ましくは、固相は、マイクロタイタープレート、常磁性粒子または常磁性ビーズである。好ましくは、抗ヒト抗体は、最適な濃度にＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で希釈され、そしてＰＭＰ上にコートされる。

ポリクローナル抗Ｃ型肝炎エンベロープタンパク質抗体は、当業者に周知の標準的な抗体生成技術を用いて作製され得る。これらのポリクローナル抗体は、好ましくは、抗ヒト抗体によって認識される。従って、ポリクローナル抗体は、好ましくは、例えば、チンパンジーのような霊長類を用いて作製される。好ましくは、以下により詳細に記載されるように、霊長類は、Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーを用いて免疫される。

固相に結合された抗ヒト抗体／霊長類ポリクローナル抗ＨＣＶ抗体の複合体は、好ましくは、生物学的サンプル中に存在する場合、ポリクローナル抗ＨＣＶ抗体と遊離のＥ１タンパク質および／もしくはＥ２タンパク質またはＥ１免疫複合体またはＥ２免疫複合体との間の免疫学的反応を可能にする条件下で、生物学的サンプルと接触させる。このような条件は、好ましくは生理学的な温度、ｐＨおよびイオン強度下であり、そして、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のような培地中で起こり得る。好ましくは、サンプル希釈物において０倍〜１０００倍に希釈され得る生物学的サンプルは、約２０分間〜約１時間、３７℃で、ＰＭＰ結合抗ヒト抗体とインキュベートされ、次いで、磁気供給源による保持と共に洗浄緩衝液で洗浄される。

生物学的サンプルを抗ヒト抗体（図１Ｂ）またはポリクローナル抗ＨＣＶエンベロープタンパク質抗体（図１Ａまたは図１Ｃ）のいずれかと接触させた後、生物学的サンプルをさらに、生物学的サンプル中に存在する場合、モノクローナル抗Ｅ１／Ｅ２抗体とＥ１タンパク質および／もしくはＥ２タンパク質の間の免疫学的反応を可能にする条件下で、Ｅ１／Ｅ２のいずれかのエピトープと反応する少なくとも１つのモノクローナル抗体と接触させる。このような条件は、好ましくは、生理学的な温度、ｐＨおよびイオン強度下であり、そして、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のような培地中で起こり得る。好ましくは、このエピトープとしては、Ｅ２コンフォメーションエピトープ、Ｅ２線形エピトープ、Ｅ２中和エピトープ、Ｅ１コンフォメーションエピトープ、Ｅ１線形エピトープ、またはＥ１中和エピトープが挙げられる。この中和エピトープは、線形またはコンフォメーションのいずれかであり得る。本発明の好ましい実施形態において、生物学的サンプルは、これらのエピトープと反応性の異なるモノクローナル抗体の組み合わせで接触される。モノクローナル抗体の組み合わせは、上記のエピトープの可能な組み合わせの全てを含み得る。上記のエピトープと反応性のモノクローナル抗体は、標準的な抗体産生技術を用いて当業者によって調製され得る。結合された生物学的サンプルとモノクローナル抗体との混合物は、好ましくは、約２０分〜約１時間、３７℃でインキュベートされ、次いで、磁気供給源による保持と共に洗浄緩衝液で洗浄される。

Ｅ１およびＥ２に対するモノクローナル抗体を調製するために、エンベロープ抗原が調製される。Ｅ１ドメイン（これは、ウイルスエンベロープタンパク質に対応すると考えられている）は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３８３にわたると現在見積もられている（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１５７７１（これは、本明細書中にその全体が参考として援用される））。ＣＨＯ系における発現（グリコシル化）の際、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを介して決定されたように、３５Ｋｄのおおよその分子量を有すると考えられている。Ｅ２タンパク質（以前はＮＳ１と呼ばれていた）は、ポリタンパク質のアミノ酸３８４〜８００にわたり、そしてまたエンベロープタンパク質であると考えられている。ＣＨＯ系における発現（グリコシル化）の際、約７２Ｋｄの明らかなゲル分子量を有すると考えられている。これらのタンパク質の終点が近似である（例えば、Ｅ２のカルボキシ末端は、７５０〜８２０アミノ酸領域のいずれかに存在し得る）ことが理解される。上記のＰＣＴ出願において原型単離体のＨＣＶ１配列が、例示目的のためのみに引用され、そして任意のＨＣＶ単離体（例えば、「背景」の節に引用される参考文献を参照のこと）が、本発明の実施に対するＥ１配列および／またはＥ２配列の適切な供給源であることもまた、理解される。

抗体産生を誘発するための本発明に使用されるＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質は、全長ウイルスタンパク質、その実質的に全長のバージョン、またはその機能的フラグメント（例えば、コンフォメーションエピトープの形成または保持に必須である配列を欠いていないフラグメント）であり得る。本発明のＨＣＶタンパク質は、目的のエピトープを提供する任意の簡便な方法によって作製され得る。例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞における組換え発現は、「ネイティブな」コンフォメーションで分泌グリコシル化Ｅ１抗原および／または分泌グリコシル化Ｅ２抗原を提供する、好ましい方法である。しかし、タンパク質に関して公知であるように、他の組換え宿主中で抗原を発現させることおよび回収後にタンパク質を復元することがまた、可能であり得る。化学合成がまた、「ネイティブな」抗原のコンフォメーションエピトープと交差反応するコンフォメーション抗原ミミトープ（ｍｉｍｉｔｏｐｅ）を提供し得ることもまた、理解される。

１つより多くのＥ１モノマーまたはＥ２モノマーを含むＥ１および／またはＥ２の複合体（凝集体とも呼ばれる）がまた、好ましい抗原である。Ｅ１：Ｅ１ダイマー、Ｅ２：Ｅ２ダイマー、およびＥ１：Ｅ２ヘテロダイマーは、全て本発明の範囲内の抗原である。凝集体はまた、より大きな形態を含み得、そして、８００ｋＤを超える分子量を有し得る。

ＨＣＶ抗原がアミノ酸の単一連続鎖（この鎖は、天然には生じない）の一部であるポリペプチドを含む融合ポリペプチドがまた、モノクローナル抗体を調製するために使用され得る。ＨＣＶ抗原は、ペプチド結合によって互いに直接結合され得るか、または介在アミノ酸配列によって分けられ得る。融合ポリペプチドはまた、ＨＣＶに対して外因性のアミノ酸配列を含み得る。

Ｅ１抗原およびＥ２抗原を調製するための方法（ネイティブなコンフォメーションを用いる方法を含む）は、Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９２、１８８、８１９−８３０、ならびにＷＯ９２／０８７３４および米国シリアル番号０７／７５８，８８０（これらは、本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載される。一般的に、発現されるエンベロープタンパク質内のネイティブなコンフォメーションエピトープの形成を可能にする宿主細胞が選択され；これらの宿主細胞としては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞などが挙げられ得る。

発現に関して宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そしてこれらとしては、ＡｍｅｒｉｃａｎｔｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から利用可能な多くの不死化細胞株（ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、および多数の他の細胞株を含む）が挙げられる。哺乳動物細胞に適切なプロモーターはまた、当該分野で公知であり、そして、これらとしては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（Ｆｉｅｒｓ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７８，２７３，１１３）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、アデノウイルス（ＡＤＶ）、およびウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）のようなウイルスプロモーターが挙げられる。哺乳動細胞はまた、終結配列およびポリＡ付加配列を必要とし得；発現を増強するエンハンサー配列がまた含まれ得、そして遺伝子の増幅をもたらす配列がまた、所望され得る。これらの配列は、当該分野で公知である。

哺乳動物細胞における複製に適切なベクターは、当該分野で公知であり、そしてこれらとしては、ウイルスレプリコン、またはＮＡＮＢＶエピトープをコードする適切な配列の宿主ゲノムへの組み込みを確実にする配列が挙げられ得る。

外来ＤＮＡを発現するために使用されるベクター（そしてこれは、ワクチン調製において使用され得る）は、ワクシニアウイルスである。この場合、異種ＤＮＡは、ワクシニアゲノムに挿入される。外来ＤＮＡをワクシニアウイルスゲノムに挿入するための技術は、当該分野で公知であり、そして、例えば、相同組換えを用いる。異種ＤＮＡの挿入は、一般的に、全く非必須でない遺伝子（例えば、チミジンキナーゼ遺伝子（ｔｋ））中へであり、これは、選択可能なマーカーもまた提供する。組換えウイルスの構築を非常に容易にするプラスミドベクターが、記載されている（例えば、Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、１９８４、４９、８５７、Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、１９８５、５、３４０３；およびＭｏｓｓ、ＧＥＮＥＴＲＡＮＳＦＥＲＶＥＣＴＯＲＳＦＯＲＭＡＭＭＡＬＩＡＮＣＥＬＬＳ、ＭｉｌｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８７、１０頁）。次いで、ＨＣＶポリペプチドの発現は、生きた組換えワクシニアウイルスで免疫された細胞または個体中で生じる。

所望の配列をコードするＨＣＶＣＤＮＡのセグメントは、ワクシニアベクターに挿入される。ポリペプチドコード化配列は、リーダー配列に結合され得る。リーダー配列は、組織プラスミノゲン活性化因子（ＴＰＡ）に対するもの、または別の供給源（例えば、β−グロブリンに対するもの）であり得る。異種ポリヌクレオチドは、ワクシニアベクター（これは、クローニング部位を含むポリリンカー配列の付加に起因する、改変バージョンのｐＳＣ１１である）中に挿入され得る。

ＨＣＶポリペプチドがこのワクシニアベクターから発現されるか否かを検出するために、ＢＳＣ１細胞が、組換えベクターで感染され得、そして発現を可能にする条件下において顕微鏡スライド上で増殖され得る。次いで、この細胞は、アセトン固定され、そして、血清（組換え発現ベクター中のＨＣＶセグメントが誘導されるＨＣＶゲノムの領域にコードされるポリペプチドに対する抗ＨＣＶ抗体を含むことが公知である）を用いて、免疫蛍光アッセイが実施され得る。

Ｅ１およびＥ２の発現のための他の系としては、昆虫細胞およびこれらの細胞における使用に適したベクターが挙げられる。これらの系は、当該分野で公知であり、そしてこれには、例えば、バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）由来の、昆虫発現移入ベクターが挙げられ、これは、ヘルパー独立、ウイルス発現ベクターである。この系由来の発現ベクターは、通常、異種遺伝子の発現を駆動するために、強力なウイルスのポリヘドリン遺伝子プロモーターを使用する。現在、外来遺伝子をＡｃＮＰＶに導入するための最も一般的に使用される移入ベクターは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知である多くの他のベクターがまた、改善された発現のために設計されている。これらには、例えば、ｐＶＬ９８５（これは、ポリヘドリンの開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変更し、そしてこれは、このＡＴＴから３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する；ＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９８９、１７、３１を参照のこと）が挙げられる。融合されていない外来タンパク質の良好な発現は、通常、外来遺伝子（これは、ＡＴＧ開始シグナルに先行する適切な翻訳開始シグナルを含む、短いリーダー配列を申し分なく有する）を必要とする。このプラスミドはまた、Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択および増殖のための、ポリヘドリンポリアデニル化シグナルおよびアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子、および複製起点を含む。

異種ＤＮＡをバキュロウイルス中の所望の部位に導入するための方法は、当該分野で公知である。（ＳｕｍｍｅｒおよびＳｍｉｔｈ、ＴｅｘａｓＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｔａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔｉｎ第１５５５番；Ｊｕら（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．＆ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１９８３、３、２１５６−２１６５；およびＬｕｃｋｏｗおよびＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９８９、１７、３１を参照のこと）。例えば、挿入は、相同組換えによるポリヘドリン遺伝子のような遺伝子の中へであり得；挿入はまた、所望のバキュロウイルス遺伝子に操作された制限酵素部位の中へであり得る。挿入された配列は、このポリタンパク質の全てもしくは種々のセグメントをコードする配列であり得るか、またはウイルスポリペプチドをコードする他のＯＲＦであり得る。翻訳後修飾（例えば、シグナルペプチド切断、タンパク質分解性切断、およびリン酸化）のためのシグナルは、昆虫細胞によって認識されるようである。分泌および核蓄積に必要とされるシグナルはまた、無脊椎動物細胞と脊椎動物細胞との間で保存されているようである。無脊椎動物細胞において有効な脊椎動物細胞由来のシグナル配列の例は、当該分野で公知であり、例えば、細胞の外への輸送のためのシグナルであるヒトインターロイキン２シグナル（ＩＬ２_S）は、昆虫細胞において認識され、そして適切に取り除かれる。

例えば、上記のような方法によって、一旦Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質が調製されると、コンフォメーションエピトープおよび線形エピトープに対するモノクローナル抗体が、標準的なモノクローナル抗体技術を用いて調製され得る。Ｅ１およびＥ２のコンフォメーションエピトープを指向するモノクローナル抗体は、インタクトなネイティブのＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質を用いて調製される。Ｅ１およびＥ２の線形エピトープを指向するモノクローナル抗体は、変性されたＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質を用いて調製される。コンフォメーションエピトープの存在または非存在は、抗体を用いたＥ１タンパク質およびＥ２タンパク質をスクリーニングすること、ならびにその反応性を、線形エピトープのみを、存在する場合、保持する抗原の変性バージョンの反応性と比較すること、を介して容易に決定され得る。ポリクローナル抗体を用いるこのようなスクリーニングにおいて、ポリクローナル血清をまず変性Ｅ１タンパク質もしくはＥ２タンパク質と吸着させ、そしてこのポリクローナル血清がＥ１タンパク質もしくはＥ２タンパク質に対する抗体を保持するか否かを確認することが、有利であり得る。好ましくは、このモノクローナル抗体調製物は、所望の抗体が、組成物中の総タンパク質成分のうちの少なくとも３５％を含む、組成物である。所望の抗体は、好ましくは、総タンパク質成分のうちの、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、なおより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％を含む。この組成物は、本明細書中に使用される純度の割合の決定に影響を与えることなく、炭水化物、塩、脂質、溶媒などのような他の成分を含み得る。

コンフォメーションエピトープに対する好ましいモノクローナル抗体としては、Ｂｉｏ−Ｃｈｉｌｉｅから入手可能な５Ｅ５／Ｈ７（ＨｅＬａ細胞においてＥ１／Ｅ２のアミノ酸１〜９６７から調製されたＩｇＧ１抗ＨＣＶＥ２）、２Ａ３／Ｂ１２（ＨｅＬａ細胞においてＥ１／Ｅ２のアミノ酸１〜９６７から調製された抗ＨＣＶＥ２）、５Ｅ９／Ｄ１０（ＨｅＬａ細胞においてＥ１／Ｅ２のアミノ酸１〜９６７から調製された抗ＨＣＶＥ２）、３Ｆ５／Ｈ６（ＨｅＬａ細胞においてＥ１／Ｅ２のアミノ酸１〜９６７から調製された抗ＨＣＶＥ２）、および２９１／Ａ２（ＣＨＯ細胞においてＥ２のアミノ酸３８４〜７１５から調製された抗ＨＣＶＥ２）、ならびにＭｉｍｏｔｏｐｅｓから入手可能な、４７２．２．５（Ｅ２ＨＶペプチドから調製された抗ＨＣＶＥ２）、ならびにＢｉｏｃｉｎｅから入手可能な６Ａ１（ＣＨＯ細胞においてＥ１／Ｅ２のアミノ酸１〜９６７から調製されたＩｇＧ１抗ＨＣＶＥ２；ＭＯＬＴ４レセプターへの結合をブロックする）および６Ａ２１（ＩｇＧ１；ＭＯＬＴ４レセプターに対する結合をブロックする）が挙げられるが、これらに限定されない。線形エピトープに対する好ましいモノクローナル抗体としては、Ｂｉｏ−Ｃｈｉｌｉｅから入手可能な、３Ｄ５／Ｃ３（ＨｅＬａ細胞においてＥ１／Ｅ２のアミノ酸１〜９６７から調製されたＩｇＧ１抗ＨＣＶＥ１）および３Ｅ５−１および３Ｅ５−２（昆虫細胞においてＥ２のアミノ酸４０４〜６６１から調製されたＩｇＧ１抗ＨＣＶＥ２）が挙げられるが、これらに限定されない。さらなるモノクローナル抗体が、本明細書中に記載されるように当業者に周知の方法を用いて調製され得る。

生物学的サンプル中のエンベロープタンパク質とモノクローナル抗体との間の免疫複合体の存在は、当業者に周知の任意の多数の手段を使用して検出される。例えば、検出可能に標識された二次抗体は、モノクローナル抗体と反応するサンプル混合物に添加され得る。好ましくは、モノクローナル抗肝炎エンベロープタンパク質抗体は、検出可能に標識される。その標識は、例えば、酵素分子、蛍光分子、化学発光分子、放射活性分子、または色素分子であり得る。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイもまた公知であり、これらの例には、ビオチンおよびアビジンを使用するアッセイ、ならびに酵素標識および酵素媒介免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ）が挙げられる。

本発明の好ましい実施形態において、ビオチン−ストレプトアビジンは、免疫複合体を検出するために使用される。好ましくは、マウスモノクローナル抗体は、ビオチン標識される。ＤＭＡＥに結合体化されたストレプトアビジンは、ビオチン標識したモノクローナル抗体を検出するために、生物学的サンプル混合物に添加される。本発明の他の好ましい実施形態において、検出システムの感度は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化したストレプトアビジンを添加し、そして引き続いてＨＲＰに指向され、そしてＤＭＡＥに結合体化された二次抗体を添加することによって増大され得る。好ましい二次抗体は、ＤＭＡＥに結合体化されたヤギ抗ＨＲＰである。他の適切な検出可能な標識は、当業者に公知であるように、ＤＭＡＥと置換され得る。

本発明の別の局面は、血液製剤を調製するために、血液または血液成分を使用する前に、Ｃ型肝炎ウィルスについてそのような血液成分または血液をスクリーニングするための方法に関する。本発明の好ましい実施形態において、その方法は、潜在的なドナーからの身体成分を、抗ヒト抗体および少なくとも１つのモノクローナル抗Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と、その抗体とその身体成分との間で、免疫学的反応が起こる条件下で反応させる工程と、抗体とＣ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質との間に形成された免疫複合体の存在を検出する工程とを包含する。好ましくは、そのドナーからの任意の血液または血液成分は、その複合体が検出されたら、捨てられる。血液または血液製剤をスクリーニングする方法は、本質的に、生物学的サンプル内で、ＨＣＶの存在を検出するための方法と同じである。

ＨＣＶ抗原に対して陽性の反応性の場合、擬陽性の可能性を減少させるためにその免疫アッセイを反復することが好ましい。例えば、血液製剤（例えば、輸血、血漿、第ＶＩＩＩ因子、免疫グロブリンなど）の生産のための血液の大規模スクリーニングにおいて、「スクリーニング」試験は、代表的には、特異性の代償として、感度を増大させるようにフォーマットされる；すなわち、擬陽性率が増大する。したがって、「反復して反応性」である（すなわち、提供されたサンプルについての２回以上の免疫アッセイにおいて陽性である）ドナーのみをさらなる試験にゆだねることは典型的である。

本発明はまた、ＨＣＶに感染した個体の処置をモニターするために、本明細書に記載されるＨＣＶＥ１および／またはＥ２検出システムとの関連において、本発明の抗体を使用することに関する。ＨＣＶを有する個体は、例えば、従来の治療、すなわち、インターフェロン処置を受けることができる。このような個体は、処置の経過のある時点で、例えば、その個体の身体からのインターフェロンまたはその他の薬物のクリアランスのために、ＨＣＶの再発を経験することが予想される。当業者は、上記の方法によって個体においてＨＣＶＥ１またはＥ２タンパク質の量をモニターし得、そしていつこのような再発が生じ得るかを、抗体検出に焦点を当てたＨＣＶの検出のために現在利用可能な技術を使用して可能なよりも迅速に予測し得る。したがって、当業者は、薬物治療の第２ラウンドをより早い日程で開始し得る。

本発明はまた、生物学的サンプル中のＣ型肝炎ウイルスを検出するためのキットに関する。このキットは、好ましくは、抗ヒト抗体、少なくとも１つのモノクローナル抗Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体、および抗体コントロール標準を含む。その他のキット成分、例えば、キットの成分の使用についての説明書もまた、含められ得る。好ましくは、キットは、必要に応じて、ポリクローナル抗Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体を含む。好ましくは、抗ヒト抗体は、固相に結合される。好ましいキットにおいて、モノクローナル抗体は、Ｅ２コンフォメーションエピトープ、Ｅ２線形エピトープ、Ｅ２中和エピトープ、Ｅ１コンフォメーションエピトープ、Ｅ１線形エピトープ、およびＥ１中和エピトープからなる群から選択されるエピトープと反応する。その他の好ましいキットは、Ｅ２コンフォメーションエピトープ、Ｅ２線形エピトープ、Ｅ２中和エピトープ、Ｅ１コンフォメーションエピトープ、Ｅ１線形エピトープ、Ｅ１中和エピトープ、またはこれらの組み合わせと反応する複数のモノクローナル抗体を含む。好ましくは、モノクローナル抗体は、上記のように検出可能に標識される。

以下の実施例は、本発明を例示することを意図され、そして本発明をいかなる様式においても限定することを意図されない。

（実施例）
（実施例１：ＰＳＣ５９ポリの構築）
Ｅ１およびＥ２の産生のために使用されるＨＣＶ配列を、プラスミドｐＣ５Ｐ−１から、ＳｔｕＩ部分／ＢｇｌＩＩフラグメントとして単離した。このフラグメントは、ＨＣＶ−１ポリタンパク質の第１のメチオニンから、９６６位のアスパラギン酸まで延びる。含まれるドメインには、ヌクレオカプシド、Ｃ、推定エンベロープ糖タンパク質であるＥ１およびＥ２の両方、ならびにＮＳ２の短縮形態のそれぞれである。さらに、そのフラグメントはまた、ＨＣＶゲノムの５’非翻訳領域のその部分に対応する約６０ｂｐを含む。当業者はまた、所望のＥ１およびＥ２の部分を含むその他のフラグメントを調製し得る。

そのフラグメントを、Ｋｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理し、平滑末端を作製し、次いで、ワクシニアベクターＰＳＣ５９（ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭｄのＢ．Ｍｏｓｓ博士から入手した）のＳｔｕＩ部位にクローニングした；しかし、他のベクターが使用され得る。そのベクターのポリリンカー配列への連結の結果として、ＮＳ２領域のＣ’末端は、更なるＰｒｏ−Ｔｙｒ配列を含む。

（実施例２：Ｅ１およびＥ２を含むＨＣＶポリタンパク質フラグメントをコードするワクシニアウイルスのストックの調製）
組換えワクシニアウイルスのスクリーニングは、本質的に、Ｍａｃｋｅｔｔら、ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌ．ＩＩ（Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８５、１９１−２１１頁）によって記載されるように行われた。より詳細には、アフリカミドリザル腎臓細胞であるＢＳＣ４０のコンフルエントな単層（６ｃｍのディッシュ）を、０．０５の感染多重度（ＭＯＩ）で野生型ワクシニアウイルス（ＷＲ株）に感染させた。３７度で２時間インキュベートした後、その細胞を、リン酸カルシウム法を使用して、２５μｇのＰＳＣ５９ポリＤＮＡでトランスフェクトした。４時間のインキュベーションの後、その培地を正常な培地に変更し、そしてその細胞を、さらに４８時間３７℃でインキュベートした。その細胞を、そのディッシュから掻き取ることによって回収し、そしてそのウイルスを、３サイクルの凍結解凍によって放出し、そして細胞溶解物中の放出されたウイルスを、−８０℃で保存した。

組換えウイルスについてスクリーニングするために、ヒト１４３ＴＫ^-細胞のコンフルエントな単層を、１０倍連続希釈の細胞溶解物を使用して、２時間、感染させた。接種材料を除去した後、２５μｇ／ｍｌの５−ブロモデオキシウリジンを含有する血清培地中の１％ァガロースを添加し、そしてその細胞を、７２時間３７℃でインキュベートした。その細胞層を、１％のアガロース＋０．０１％中性レッドに重層することによってプラークを可視化し、そしてその細胞を３７℃で一晩インキュベートした。次いで、そのアガロース重層を、注意深く除去し、そしてその細胞層を、マスターニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ、ＢＡ８５、０．４５μｍ）でブロットした。マスターフィルターのレプリカプレートを作製し、そして³²Ｐ標識したハイブリダイゼーションプローブでＨＣＶ配列に対してプローブした。陽性プラークをマスターフィルターから単離し、０．５ｍｌの無血清培地中に置き、そして３０秒間２回超音波処理した。スクリーニングプロセスを２回反復し、そのウイルスをプラーク精製した。

組換えワクシニアウイルスを増殖させるために、ＢＳＣ４０細胞の１０個のディッシュ（１５０ｃｍ²）をウイルスストックに０．５のＭＯＩで感染させた。その感染を、２時間３７℃で行い、そしてウイルスストックを新鮮な培地に配置した。７２時間の後、その細胞を回収し、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ９．０）中で懸濁し、そしてＷｈｅａｔｏｎｄｏｕｎｃｅ組織グラインダーにおいてホモジナイズした。細胞細片を遠心分離により除去し、その上清をトリプシン処理し、超音波処理し、そしてそのウイルス懸濁物のアリコートを−８０℃で保存した。

（実施例３：Ｅ１／Ｅ２抗原の産生）
１リットルのＨｅｌａＳ３スピナー細胞を、スピナーフラスコ中で、１ｍｌあたり１０⁶細胞の密度まで褐色であった。その細胞を、ＨＣＶポリタンパク質フラグメントをコードする組換えワクシニアウイルスで、１．０のＭＯＩを使用して感染させ、一晩インキュベートし、回収し、そして細胞ペレットとして−８０℃で保存した。

Ｅ１／Ｅ２発現産物を、その細胞を、低浸透圧性の緩衝液中で溶解し、次いで非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液中で抽出することによって精製した。細胞抽出物を、レクチン（ＧＮＡ）アガロースカラムを通してクロマトグラフィーにかけた。所望のタンパク質を、メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（ＳｉｇｍａＣｏｒｐ．）を使用してカラムから溶出した。その溶出した画分を、ウエスタンブロットによって、Ｅ１またはＥ２に対して惹起した特異的な抗血清を使用して、Ｅ１およびＥ２についてモニターした。抗原を含む画分をプールし、そしてＳ−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で濃縮した。その最終産物の純度は、約７０％であった。

Ｅ１（１３０ａａ）およびＥ２（２５１ａａ）タンパク質もまた、酵母Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ内の内部抗原として、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）とのＣ末端融合物として、Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４，３６２−３６４、およびＣｏｕｓｅｎｓら、Ｇｅｎｅ、１９８７、６１，２６５−２７２（これらの各々が、本明細書において、その全体が参考として援用される）によって以前に記載された方法を使用して、発現され得る。細胞破壊および遠心分離の後、不溶性ＳＯＤ融合ポリペプチドを細胞ペレットから５Ｍ尿素または１％ＳＤＳのいずれかを使用して抽出し、そしてゲル濾過、またはイオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−およびＳ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）とゲル濾過クロマトグラフィー（ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００ＨＲ）との組み合わせのいずれかを使用して精製した。

ＨＣＶのネイティブなＥ１およびＥ２抗原もまた、全長ＨＣＶＥ１およびＥ２遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルス（ｒｖｖ）感染細胞の小胞体から精製され得る。精製を、アフィニティークロマトグラフィ−、続いて、例えば、ＷＯ９２／０８７３４および米国特許出願番号０７／７５８，８８０（これらの各々が、本明細書中で参考としてその全体が援用される）において記載される非変性条件下でのイオン交換クロマトグラフィーによって達成され得る。

ネイティブなＨＣＶＥ２抗原、ＣＨＯ−Ｅ２はまた、本質的に、Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９２，１８８，８１９−８３０（これは、その全体が本明細書中で参考として援用される）に従って、調製され得る。より詳細には、ＣＨＯ−Ｅ２抗原を産生する哺乳動物ＣＨＯ細胞株は、Ａｌａ３８３からＧｌｕ６６１をコードするＨＣＶ−１配列を含有するプラスミドから構築される。次いで、そのプラスミドは、ＣＨＯ細胞中にトランスフェクトされ、全長Ｅ２（Ｅ２／ｎｓ１とも呼ばれる）抗原を発現する安定な株を生成する。高発現を示すクローンを選択し、そして１０％透析化ウシ胎仔血清およびその通常の補充物＋１．６μＭのメトトレキサートを有するＤＭＥ／Ｈ２１中での増殖によってローラーボトル中で拡大した。その培養培地補充物を回収し、そしてＣＨＯ−Ｅ２抗原の精製のために使用した。その精製スキームには、非変性条件下でのアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。

ネイティブなＥ２推定コンフォメーションエピトープを妨害するために、変性ＣＨＯ−Ｅ２をＤＬ−ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を最終濃度１０ｍＭ、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）にまで添加し、１００℃で５分間ボイルすることによって調製した。全ての精製した組換えＨＣＶ抗原は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル分析およびクマシーブルーでの染色によって、少なくとも９０％純粋である。

（実施例４：組換えＣＨＯ−Ｅ２抗原についての検出アッセイ）
好ましい検出アッセイの感度を、組換えＣＨＯ−Ｅ２抗原を使用して測定した。簡単には、ポリクローナルチンパンジー抗ＨＣＶＥ１／Ｅ２抗体／マウス抗ヒトＩｇＧ／ＰＭＰ複合体を、上記のようにＣＨＯ細胞中で産生した組換えＨＣＶＥ２と接触させた。複数のモノクローナル抗体抗ＨＣＶエンベロープタンパク質抗体（２９１／Ａ２、抗Ｅ２コンフォメーション；１Ｇ２Ａ７、抗Ｅ２中和および３Ｅ５−２、抗Ｅ２線形）をアッセイあたり１００ｎｇで、その複合体と接触させた。そのモノクローナル抗体を、ビオチンで標識し、そしてストレプトアビジンシステムを使用して結合を測定した。代表的な結果を、表１に示す。このデータは、そのアッセイがＣＨＯＥ２抗原を１．９５ｎｇ／ｍｌ程度の低い濃度で検出し得ることを示す。

ｓ／ｎは、平均陰性値（０ｎｇ／ｍｌのＥ２でのｓ）で割った相対的光単位（Ｒ
ＬＵ）での感度である。

（実施例５：臨床的生物学的サンプルでのＨＣＶについての検出アッセイ）
ＨＣＶＥ２を検出する好ましい検出アッセイは、抗ＨＣＶ抗体を検出する検出アッセイと比較された。生物学的サンプル（連続採血）を二人の患者から、いくつかの時点で（例えば、４／１７（Ｉ−１）、５／１０（Ｉ−２）、５／２４（Ｉ−３）、５／２４（Ｉ−３）、６／８（Ｉ−４）、６／２８（Ｉ−５）、７／１９（Ｉ−６）、および１２／２８（Ｉ−７）において）、得た。患者Ｉは、セロコンバージョンしていない個体であった。患者Ｙは、すでにセロコンバージョンしていた。各サンプルを、ＨＣＶＥ２タンパク質（タンパク質アッセイ）の存在について、または抗ＨＣＶ抗体（抗体アッセイ）の存在について、試験した。抗体アッセイについて、固相に結合させたＣＨＯＥ２タンパク質を使用して、生物学的サンプル中に存在するヒト抗ＨＣＶ抗体を捕捉した。ビオチン標識したモノクローナル抗ヒトＩｇＧ／ストレプトアビジンシステムを使用して、ヒト抗ＨＣＶ抗体の存在を検出した。タンパク質アッセイのために、上記のように、ポリクローナル抗Ｅ１Ｅ２抗体に結合させた抗ヒトＩｇＧに結合させた固相を、生物学的サンプルに接触させた。そのシステムは遊離のＨＣＶ抗原ならびにＨＣＶ抗原／ヒトＩｇ免疫複合体を検出し得る。ビオチン標識した抗Ｅ２抗体（例えば、３Ｅ５−２および２９１／Ａ２の組み合わせ）を、ストレプトアビジンとともに、ＨＣＶＥ２タンパク質の存在を検出するために使用した。代表的な結果を、表２（抗体アッセイ）、表３（タンパク質アッセイ）、および表４（標準コントロール）に示す。

ｓ／ｎは、平均陰性値（Ｅ２の０ｎｇ／ｍｌでのｓ）で割った相対的光単位（ＲＬＵ）における感度（ｓ）である。ＳＡＣは、ＨＣＶに感染したことが知られている患者由来の生物学的サンプルであり、陽性コントロールとして機能する。
ＮＨＳは、正常ヒト血清であり、陰性コントロールとして機能する。

表２および３からわかるように、上記のＨＣＶエンベロープタンパク質検出システムを使用する当業者は、ＨＣＶＥ２タンパク質を、ヒト抗ＨＣＶ抗体（採血７）の検出よりも早期に（採血６）検出し得る。

図２は、上記の患者Ｉについての処置レジメンを表すグラフである。血液サンプルをまた、ＡＳＴおよびＡＬＴ（肝臓の損傷の存在を示す肝臓酵素）の存在を検出するために採取した。生物学的サンプル（採血）を、ＨＣＶタンパク質（破線）およびヒト抗ＨＣＶ抗体（実線）の存在について検査した。図２にまた示されているのは、βインターフェロンおよびαインターフェロンでの処置のタイミングである。御覧のように、肝臓の損傷がＡＳＴおよびＡＬＴのレベルをモニターすることによって検出されるとすぐに、患者は、βインターフェロン（３００１Ｕを１日２回）を示される期間受けた。しかし、その患者が、もはやβインターフェロン処置を受けない場合、ＡＬＴおよびＡＳＴのレベルの上昇の存在、ならびにＨＣＶエンベロープタンパク質の検出の劇的な増大により示されるようにＨＣＶの再感染が起こった。対照的に、ヒト抗ＨＣＶ抗体のレベルの増大は劇的に遅れた。ＨＣＶエンベロープタンパク質の検出に際して、その患者は、即座にαインターフェロンで処置され、これにより、ＨＣＶ感染が鎮静した。したがって、図２に示される結果は、ＨＣＶエンベロープタンパク質の検出が、生物学的中のヒト抗ＨＣＶ抗体の検出に対して劇的に改善し、そしてまた従来のＨＣＶ処置をモニターする検出システムの衝撃を示す。

（実施例６：免疫複合体ＨＣＶについての検出アッセイ）
本明細書に記載される検出システムはまた、免疫複合体化ＨＣＶエンベロープ抗原を検出するために使用され得る。好ましい検出アッセイを、いくつかの生物学的サンプル中の種々の量の免疫複合体化ＨＣＶエンベロープ抗原の量を検出するために行った。生物学的サンプルには、Ｉ−６（実施例５から；免疫複合体なし）、ＳＡＣ（実施例５から；軽い程度の免疫複合体）、Ｙ−７（実施例５から；中程度の免疫複合体）、およびＪＰ（高セロコンバージョンの患者由来のサンプル；重程度の免疫複合体）が含まれていた。各サンプルを、上記実施例５のようにＨＣＶＥ２タンパク質（タンパク質アッセイ）の存在について、または上記実施例５に記載のように抗ＨＣＶ抗体（抗体アッセイ）の存在について検査した。代表的な結果を表５に示す。

ｓ／ｎは、平均陰性値（Ｅ２の０ｎｇ／ｍｌでのｓ）で割った相対的光単位（Ｒ
ＬＵ）における感度（ｓ）である。

（実施例７：ＨＣＶエンベロープタンパク質についての増幅検出アッセイ）
本明細書に記載したその検出システムのアッセイ感度は、シグナルの増幅を、現在のアッセイフォーマットに適用することによって増幅され得る。例えば、超常磁性ラテックス粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ）に結合させたＨＣＶＥ２タンパク質（５Ｅ５／Ｈ＆吸収された）に対するマウスモノクローナル抗体は、種々の量のＣＨＯＥ２タンパク質を捕捉するために使用された。ＨＣＶＥ１Ｅ２に対するビオチン標識ポリクローナル抗体を使用して、ＣＨＯＥ２タンパク質を検出した。ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｒｐ）複合体を使用して、ＨＣＶＥ１Ｅ２に対するビオチン標識ポリクローナル抗体に結合させた。さらに、ＤＭＡＥ結合体化抗ｈｒｐ抗体（種々の動物由来）を使用して、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｒｐ）複合体を検出し、斯くしてシグナルを増幅した。代表的な結果を表６に示す。

ｓ／ｎは、平均陰性値（Ｅ２の０ｎｇ／ｍｌでのｓ）で割った相対的光単位（ＲＬＵ）における感度である。

その感度は、磁性ラテックス粒子（ＭＬＰ）の代わりに常磁性粒子（ＰＭＰ）を、およびより高親和性の抗ｈｒｐ二次抗体結合体（ＤＭＡＥ）を使用することによってさらに増大され得る。

図１Ａ、１Ｂ、１Ｃは、本発明の好ましいアッセイ構成を示す。図１Ｄは、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃにおける好ましい成分を示す。図１Ａ、１Ｂ、１Ｃは、本発明の好ましいアッセイ構成を示す。図１Ｄは、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃにおける好ましい成分を示す。図１Ａ、１Ｂ、１Ｃは、本発明の好ましいアッセイ構成を示す。図１Ｄは、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃにおける好ましい成分を示す。図１Ａ、１Ｂ、１Ｃは、本発明の好ましいアッセイ構成を示す。図１Ｄは、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃにおける好ましい成分を示す。図２は、ＨＣＶを有する患者の処置レジメンを示すグラフである。

Claims

生物学的なサンプルに存在するＣ型肝炎ウイルスとヒト抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体との免疫複合体を検出することによって、インビトロで該生物学的なサンプルにおけるＣ型肝炎ウイルスを検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
該サンプルを、固相に結合された抗ヒト抗体および少なくとも１つの検出可能に標識されたモノクローナル抗Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体と接触させて、該抗ヒト抗体および該検出可能に標識されたモノクローナル抗Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質抗体の両抗体と該サンプルとの間で結合反応を可能にする工程；ならびに
該Ｃ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質と該モノクローナル抗体との免疫複合体の存在を検出する工程、を包含する、方法。
請求項１に記載の方法であって、前記生物学的サンプルは、潜在的なドナー由来の血液または血液成分であり、該血液または血液成分は、血液製剤を調製するための該血液または血液成分の使用の前に、Ｃ型肝炎ウイルスについてスクリーニングされ、該方法はさらに、前記Ｃ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質と前記モノクローナル抗体との免疫複合体が検出される場合、該ドナー由来のいずれの血液または血液成分も廃棄する工程、を包含する、方法。
前記固相が、マイクロタイタープレート、常磁性粒子、および常磁性ビーズからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
前記モノクローナル抗体が、Ｅ２コンフォメーションエピトープ、Ｅ２線形エピトープ、Ｅ２線形中和エピトープ、Ｅ１コンフォメーションエピトープ、Ｅ１線形エピトープ、およびＥ１線形中和エピトープからなる群より選択されるエピトープと反応する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。