JP2001515701A - Ｃ型肝炎ウイルスヘリカーゼまたはヘリカーゼ結合ポケットを含むそのフラグメントの結晶 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＣ型肝炎ウイルスヘリカーゼドメインのＸ線結晶構造に関する。さらに詳しくは、本発明はＨＣＶヘリカーゼとオリゴヌクレオチドとの結晶化複合体、ＨＣＶヘリカーゼとオリゴヌクレオチドとの結晶化可能な組成物、ならびにＨＣＶヘリカーゼ-オリゴヌクレオチド複合体の結晶化法に関する。本発明は、更にＨＣＶヘリカーゼオリゴヌクレオチド結合ポケットまたはＨＣＶヘリカーゼヌクレオチドトリホスフェートポケットの構造座標でプログラムされた当該コンピューターが、該結合ポケットの三次元画像を表示できるものである、コンピューターにも関係する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスヘリカーゼドメインのＸ線結晶構造に関する。よ
り詳しくは、本発明は、ＨＣＶヘリカーゼおよびオリゴヌクレオチドの結晶化複
合体、ＨＣＶヘリカーゼおよびオリゴヌクレオチドの結晶化可能な組成物、なら
びに、ＨＣＶヘリカーゼ-オリゴヌクレオチド複合体を結晶化させる方法に関す る。本発明は、さらに、ＨＣＶヘリカーゼオリゴヌクレオチド結合ポケットまた
はＨＣＶヘリカーゼヌクレオチドトリホスフェートポケットの構造座標でプログ
ラムした、当該コンピューターが結合ポケットの三次元画像を表示できるコンピ
ューターにも関係する。

【０００２】 （背景技術） Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)による感染は、殆どの輸血関連非Ａ型、非Ｂ型肝炎
の病因であり、また、世界中の公衆が患う肝炎において重要な割合を占めている
といえる。比較的小数のＨＣＶ感染患者が急性肝炎を経験するが、その８５％ま
でが持続的感染に進展し、しばしば慢性肝炎および肝硬変となり、終には肝細胞
癌の素因となると考えられている。現在、ワクチンはできておらず、このウイル
ス性疾患に幅広く有効な治療法もない。それゆえ、より効果的な治療法の標的と
してＨＣＶ複製酵素に多くの研究が、集中している。

【０００３】 ＨＣＶは約９．６ｋｂの一本鎖プラスセンスＲＮＡゲノムを有し、フラビウイ
ルスおよびペスチウイルス属も含まれている動物ウイルスのFlaviviridaeファミ
リー内のそれ自身の属に分類される。そのゲノムは、内部のリボソーム導入部位
として働く５’非翻訳保存配列、３０００アミノ酸を超えるポリタンパク質をコ
ードする単一のオープンリーディングフレーム、および３’非翻訳領域からなる
。３’非翻訳領域には、ポリ(Ｕ)ｎおよびポリ(ＵＣ)ｎの領域を含み、その後に
新規な９８ヌクレオチド保存配列が続く。

【０００４】 ウイルスがコードするプロテアーゼによるＨＣＶポリタンパク質のタンパク質
分解プロセッシングにより、ウイルスの複製サイクルに必須の酵素活性を有する
数種の非構造性(ＮＳ)タンパク質が生ずる[P. Neddermann et al., Biol. Chem.
, 378, pp. 469-476 (1997)]。ＮＳ２は推定メタロプロテアーゼをコードし、Ｎ
Ｓ５ＢはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであり、そしてＮＳ３はこのタンパク
質のＮ末端１８１残基に位置するセリンプロテアーゼおよびＣ末端４６５アミノ
酸にあるＲＮＡヘリカーゼを有する二機能性酵素である。ＮＳ３プロテアーゼは
、ＮＳ３／ＮＳ４Ａ連結部で分子内開裂し、残余のポリタンパク質の効果的プロ
セッシングに必要である強固な非共有結合的ＮＳ３-ＮＳ４Ａ複合体を形成する[
C. Failla et al., J. Virol., 69, pp. 1769-1777 (1995); R. Bartenschlager
et al., J. Virol., 69, pp. 7519-7528 (1995); Y. Tanji et al., J. Virol.
, 69, pp. 1575-1581 (1995) ]。今日まで、セリンプロテアーゼおよびヘリカー
ゼドメインがインビボでＮＳ３のタンパク質分解プロセッシングにより分離され
ることを示唆する如何なる証拠も存在しない。これは、これらの酵素成分の簡易
包装をもたらし得るか、または、二種のドメイン間の機能性相互依存を意味し得
る。

【０００５】 多くの研究からの説明によると、ＮＳ３のセリンプロテアーゼ[J. 1. Kim et
al., Cell, 87, pp. 343-355 (1996); W. Markland et al., J. Gen. Virol., 7
8, pp. 39- 43(1991).; C. Steinkuhler et al., J. Virol., 70, pp. 6694-670
0 (1996)]およびＲＮＡヘリカーゼドメイン[J. A. Suzich et al., J. Virol.,
67, pp. 6152-6158 (1993); C. L. Tai et al., J. Virol., 70, pp. 8477-8484
(1996); L. Jin et al., Arch. Biochem. Biophys., 323, pp. 47-53 (1995); および F. Preugschat et al., J. Biol. Chem., 271, pp. 24449-24457 (1996)
]は、独立して発現させ、触媒的に活性な種として単離し得る。しかしながら、 最近の証明によると、ＮＳ３プロテアーゼおよびヘリカーゼドメインは互いに接
触し合い、ＮＳ３の触媒活性を調節し得ることが示唆されている。ＮＳ４Ａ補因
子と複合体を形成している隣接ＮＳ３タンパク質[K. A .Morgenstern et al., J
. Virol., 71, pp. 3767-3775 (1997); Z. Hong et al., J. Virol., 70, pp. 4
261-4268 (1996)]と、単離ＮＳ３ヘリカーゼドメイン[C. L. Tai et al., J. Vi
rol., (1996), supra; L. Jin et al., Arch. Biochem. Biophys., (1995), sup
ra; F. Preugschat et al., J. Biol. Chem., (1996), supra; および Y. Gwack
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 225, pp. 654-659 (1996)]との間 において、ＡＴＰアーゼおよびＲＮＡ巻き戻し活性の最適ｐＨに顕著な違いが見
られる例がある。同様に、両タンパク質のＡＴＰアーゼ活性が、それらのポリヌ
クレオチド刺激に対する感受性において違いがある。隣接ＮＳ３は、ポリ(Ｕ)に
対し、ヘリカーゼドメインよりも見かけの解離定数が低いようである[J. A. Suz
ich et al., J. Virol., (1993), supra; F. Preugschat et al., J. Biol. Che
m., (1996), supra; K. A. Morgenstern et al., J. Virol., (1997), supra; A
. Kanai et al., FEBS Lett., 376, pp. 221-22A (1995) ]。これらの違いを除 けば、両タンパク質は、飽和ポリヌクレオチドで刺激したときのＮＴＰ加水分解
の動力学的パラメーターでは殆ど見分けのつかない[J. A. Suzich et al., J. V
irol., (1993), supra; K. A .Morgenstern et al., J. Virol., (1997), supra
]、何れのタンパク質もポリヌクレオチド基質に沿って３’-５’指向性移動を示
し、両タンパク質のヘリカーゼは二重鎖ＲＮＡ：ＲＮＡ基質を効率的に巻き戻す
[C. L. Tai et al., J. Virol., (1996), supra; Z. Hong et al., J. Virol.,
(1996), supra]。

【０００６】 ＨＣＶの他に、今日までに配列決定された全てのフラビ-およびペスチウイル スは、相同ＮＳ３タンパク質中にヘリカーゼ保存配列モチーフを含み、この酵素
がＨＣＶ複製サイクルで重要な役割を果たすことを示唆している[R. H. Miller
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp. 2057-2061 (1990)]。この可能 性に矛盾なく、ヘリカーゼがコードする配列は、他のウイルスで同定されており
、ヘリカーゼが転写およびゲノム複製に際して二本鎖核酸構造の分離を触媒する
と示唆される[G. Kadare et al., J. Virol., 71, pp. 2583- 2390 (1997)]。ポ
リオウイルス、Picornaviridaeファミリーのプラス鎖ＲＮＡウイルスに関する従
前の研究が示すことによると、２Ｃヘリカーゼ中の保存配列モチーフの変異はウ
イルスの複製および増殖を阻害する[C. Mirzayan et al., Virology, 189, pp.
547-555 (1992)]。また、単純ヘルペスウイルスＩ型およびウシパピローマウイ ルスによりコードされるヘリカーゼについての同様の変異研究が示すことによる
と、これらの酵素はウイルス複製に重要である[P. MacPherson et al., Virolog
y, 204, pp. 403-408 (1994); R. Martinez et al., J. Virol., 66, pp. 6735-
6746 (1992) ]。従って、ＨＣＶ中のヘリカーゼ活性を阻害する能力は、ＨＣＶ 感染の治療処置への大きな道筋を提供し得る。

【０００７】 残念なことに、ＡＴＰ結合および加水分解が、どのようにしてヘリカーゼによ
るＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の巻き戻しを誘発するかという詳細については殆ど知ら
れていない。ヘリカーゼの二種の構造がポリヌクレオチドのない状態で結晶化さ
れたが、残念なことに、酵素機構の仮定に必要な重要情報は得られなかった[N.
Yao et al., Nat. Struct. Biol., 4, pp. 463-467 (1997); H. S. Subramanya
et al., Nature, 384, pp. 379-383 (1996) ]。

【０００８】 そのため、オリゴヌクレオチドと複合体を形成しているヘリカーゼの結晶構造
を解明することは重要であり、特にその酵素のオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチドトリホスフェート(ＮＴＰ)結合ポケットを描画することは非常に重
要である。この情報があれば、これらの結合部位のコンピューターモデルを作成
でき、ＨＣＶヘリカーゼの強力な阻害剤を合理的に設計できる。

【０００９】 （発明の要旨） 出願人はＨＣＶのＮＳ３ヘリカーゼドメインと一本鎖オリゴヌクレオチドとの
結晶化複合体を提供することによりこの問題を解決した。この結晶は、Ｘ線結晶
学により分解能２．２Åで解明した。その結晶構造に基づき、出願人は、ヘリカ
ーゼのオリゴヌクレオチド結合ポケット形成の鍵となるアミノ酸残基を同定した
。

【００１０】 従って、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスまたはその変異体のＮＳ３ヘリカーゼド
メインとオリゴヌクレオチドとを含む結晶化複合体に関する。

【００１１】 本発明は、全長ＮＳ３ ＨＣＶタンパク質の単離ポリペプチドかまたはその一 部かの何れかとしてのＮＳ３ヘリカーゼドメインまたはそれらの単一アミノ酸変
異体と、オリゴヌクレオチドとを含む結晶化可能な組成物にも関する。そして、
そのような組成物を用いて前記結晶を生成させる方法にも関する。

【００１２】 本発明は、ＮＳ３ヘリカーゼ-オリゴヌクレオチド複合体のＸ線構造座標も提 供する。これらの座標、または少なくともオリゴヌクレオチド結合ポケットもし
くはＮＴＰ結合ポケットを定義する部分は、ＮＳ３ヘリカーゼの阻害因子を設計
する方法に有用であり、ひいてはＨＣＶ感染の処置に有用となり得る。これは本
発明の他の態様である。

【００１３】 関連するある態様では、本発明は、ＮＳ３ヘリカーゼオリゴヌクレオチド結合
ポケットまたはＮＴＰ結合ポケットの座標でプログラムされたコンピューターで
あって、それらの座標を結合ポケットの三次元画像に変換しコンピューターに連
結したディスプレイに表示できるプログラムを有するコンピューターを提供する
。

【００１４】 最後に、本発明は、少なくともＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼの構造座標の一部お よび別の分子または分子複合体のＸ線回折データ群でプログラムされるとき、ヘ
リカーゼ座標のこれら構造座標をフーリエ変換し、次いでＸ線回折データを分子
置換プロセスにより処置して別の分子または分子複合体の構造座標にするコンピ
ューターを提供する。

【００１５】 （発明の開示） 本明細書で述べる発明が十分に理解できるように、以下に詳細に記載する。

【００１６】 ある実施態様に従えば、本発明は、ＮＳ３ヘリカーゼおよびオリゴヌクレオチ
ドを含む結晶化可能な組成物を提供するものである。

【００１７】 本発明の結晶化可能な複合体中のＮＳ３ヘリカーゼタンパク質は以下のものか
ら選択される。即ち、任意の株由来の単離ヘリカーゼドメインまたはＨＣＶ Ｎ Ｓ３タンパク質の共通配列(例えば配列番号２のアミノ酸１６７-６３１)；ＨＣ Ｖの任意の株由来の全ＮＳ３タンパク質またはそのタンパク質の共通配列(例え ば配列番号２)；ＨＣＶの任意の株由来の、機能性ヘリカーゼドメイン(C. Hyun-
Soo et al., J. Biol. Chem., 273, pp. 15045-15052 (1998)によりアミノ酸１ ８３-５８２であることが示された)を含むＮＳ３タンパク質の何れかの部分、ま
たはそのタンパク質の共通配列(例えば配列番号２のアミノ酸１８３-５８２、配
列番号２のアミノ酸１６７-６３１、配列番号２のアミノ酸１８３-６３１)、な らびに上記何れかのアミノ酸変異体(配列番号２、または、配列番号２のアミノ 酸１８３-５８２を含み、さらに１種またはそれら以上の下記単一アミノ酸置換 を含むその任意の部分を含むがこれらに限定されないもの：Ｓｅｒ２３１がＡｌ
ａに、Ｔｈｒ２６９がＡｌａに、Ｓｅｒ３７０がＡｌａに、Ｔｈｒ４１１がＡｌ
ａに、Ｔｒｐ５０１がＰｈｅに、Ｔｒｐ５０１がＬｅｕもしくはＴｒｐ５０１が
Ａｌａに、Ｇｌｎ４６０がＡｌａに、Ａｒｇ４６１がＡｌａに、Ａｒｇ４６２が
Ａｌａに、Ａｒｇ４６４がＡｌａに、またはＡｒｇ４６７がＡｌａに)から選択 される。

【００１８】 本発明の結晶化可能な組成物で利用するＮＳ３タンパク質には、組換え的に産
生した場合のタンパク質精製に有用となり得るＮ-および／またはＣ-末端の付加
アミノ酸も含まれ得る。例えば、Ｃ-末端のポリヒスチジンタグが、組換え体宿 主細胞中で産生したＮＳ３タンパク質の、Ｑ-セファロース(Pharmacia, Piscata
way, NJ)のような適当な樹脂の使用による精製に有用であることが判明した。そ
れらのタグは、ＮＳ３タンパク質の溶解性の増加にも有用となり得る。

【００１９】 これら組成物の二番目の成分はオリゴヌクレオチドである。好ましくは、この
オリゴヌクレオチドは一本鎖であるが、二本鎖オリゴヌクレオチドを使用しその
後に結晶化に先立って解離させることも出来る。好ましくは、オリゴヌクレオチ
ドは、約６ないし２０塩基のポリヌクレオチドである。さらに好ましくは、オリ
ゴヌクレオチドは約６ないし１２塩基のものである。最も好ましくは、オリゴヌ
クレオチドはポリウラシルの８ヌクレオチド長(ｄＵ₈)のものである。

【００２０】 オリゴヌクレオチドに対するＮＳ３ヘリカーゼのモル比は約１：１であるべき
であるが、１：５ないし５：１であれば許容できる。

【００２１】 本願の結晶化可能な組成物中に存在する緩衝剤その他の試薬は、結晶化を促進
する、および／または、結晶化条件に相反しない任意の成分であり得る。そのよ
うな緩衝条件の例は、１５ｍＭ ＭＥＳ(ｐＨ６．５)、２．５ｍＭ β-メルカプ トエタノールである。

【００２２】 本発明は、オリゴヌクレオチドと複合体を形成したＮＳ３ヘリカーゼの結晶に
も関する。ＮＳ３ヘリカーゼ成分およびオリゴヌクレオチド成分は両方とも、結
晶化可能な組成物について上記したものと同じものである。これらの結晶は、標
準的な結晶化プロトコール、例えば、以下の実施例部で例示説明したプロトコー
ルにより上記組成物から得られる。

【００２３】 本発明は、ＮＳ３ヘリカーゼ含有結晶の調製法にも関する。その方法は、 ａ)ＮＳ３ヘリカーゼタンパク質およびオリゴヌクレオチドを１：５ないし５： １のモル比で含む、結晶化可能な組成物を得る工程、および、 ｂ)当該組成物を結晶化を促進する条件におく工程、 を含むものである。

【００２４】 また、上記結晶化法で利用するＮＳ３ヘリカーゼタンパク質およびオリゴヌク
レオチドの選択は、結晶化可能な組成物について上記したものと同様に行う。

【００２５】 上記したように、出願人は、ＮＳ３ヘリカーゼ-ｄＵ₈複合体の三次元Ｘ線結晶
構造を解明した。原子座標データを図１に示す。

【００２６】 ＮＳ３ヘリカーゼ-ｄＵ₈複合体、またはそのＮＴＰ、またはオリゴヌクレオチ
ド結合ポケット、またはそれらの部分、または同族体を表わす構造座標を使用す
るため、それらを三次元形に変換することが必要となる場合がある。これは、一
組みの構造座標から分子またはその部分の三次元画像を形成させ得る市販のソフ
トウエアを用いて実施できる。

【００２７】 本発明において結合部位としても言及した結合ポケットは、新薬創製のような
分野で重要な有用性を有する。多くの生物学的作用機構は、天然リガンドまたは
基質と、それらに対応するレセプターまたは酵素の結合ポケットとの会合に基づ
いている。同様に、多くの薬物は、レセプターおよび酵素の結合ポケットとの会
合により、生物学的効果を発揮する。そのような会合は、結合ポケットの全体で
または任意の部分で生じ得る。そのような会合の理解は、標的レセプターまたは
酵素とより有利な会合をする、それ故に生物学的効果が改善される薬物のドラッ
グデザインに役立つ。そのため、この情報は、生物学的に重要な標的の結合部位
の有望な阻害剤設計に価値を有する。

【００２８】 本明細書中で使用するとき“結合ポケット”という語は、分子または分子複合
体の領域をいい、その形状の結果として、他の化学物質または化合物と有利に会
合するものを意味する。

【００２９】 出願人は、阻害剤設計の良好な標的である三つの結合ポケットを同定した。こ
れらの結合ポケットのうち二つは、オリゴヌクレオチドが結合するヘリカーゼの
領域に在る。これらのポケットは、ＮＳ３ヘリカーゼ-ｄＵ₈複合体中のこのポケ
ットに位置するｄＵ₈のヌクレオチドに基づいて、Ｕ４およびＵ８と名付けてい る。三つ目の結合ポケットはＮＴＰ結合ポケットである。この結合ポケットは他
者[T. Yao et al., Nat. Struct. Biol., 4, pp. 463-467(1997)]により部分的 に記載されているが、出願人はさらに当分野に既知のものからは導き出されなか
った方法でこのポケットを定義した。

【００３０】 本明細書で使用するとき、“Ｕ４-、Ｕ８-およびＮＴＰ-様結合ポケット”と いう語は、共通リガンドと結合する程その形状がＮＳ３ヘリカーゼＵ４、Ｕ８お
よびＮＴＰ結合ポケットに類似している、分子または分子複合体の部分を意味す
る。これらの形状の共同物は、ＮＳ３ヘリカーゼ構造(図１に示したような)中に
これらの結合ポケットを形成するアミノ酸バックボーン原子の構造座標の平均二
乗偏差の平方根が１．５Å以下のものと定義される。この計算の実施方法は以下
に記載する。

【００３１】 オリゴヌクレオチドと複合体を形成しているＮＳ３ヘリカーゼの結晶構造の解
明において、出願人が見出したところによると、ＮＳ３アミノ酸 Ｖａｌ２３２ 、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、
Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０１およびＴｙｒ５０２は、ＮＳ３ヘリカーゼ-ｄＵ₈複
合体中のｄＵ₈のＵ８と近接して(＜４Å)接触していた。そのため、図１に示し たようにこれらのアミノ酸の構造座標により定義される結合ポケット；またはこ
れらのアミノ酸のバックボーン原子の構造座標の平均二乗偏差の平方根が１．５
Å以下の結合ポケットは、本発明のＵ８-様結合ポケットとみなせる。

【００３２】 また、出願人が見出したところによると、上記ＮＳ３アミノ酸に加えて、Ｐｒ
ｏ２３０、Ｖａｌ２５６、Ｔｈｒ２９８、Ａｌａ４９７、Ｌｙｓ５５１、Ｇｌｎ
５５２、Ｇｌｙ５５４、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６およびＰｒｏ５５８は、結
合オリゴヌクレオチドのＵ８の８Å以内にあり、そのため、基質と相互作用する
程十分に近接していた。そのため、好ましい実施態様では、図１に示すような結
合オリゴヌクレオチドのＵ８の８Å以内にあるアミノ酸の構造座標により定義さ
れる結合ポケット；またはアミノ酸のバックボーン原子の構造座標の平均二乗偏
差の平方根が１．５Å以下である結合ポケットは、本発明の好ましいＮＳ３ヘリ
カーゼＵ８-様結合ポケットとみなせる。

【００３３】 更に出願人が見出したところによると、Ｕ４オリゴヌクレオチド結合ポケット
の形状を決めるＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸は、Ｈｉｓ３６９、Ｓｅｒ３７０、Ｌ
ｙｓ３７１、Ｔｙｒ３９２、Ａｒｇ３９３、Ｔｈｒ４１１、Ａｓｐ４１２、Ａｌ
ａ４１３、Ｃｙｓ４３１、Ｖａｌ４３２、Ｇｌｎ４３４、Ｉｌｅ４４６、Ｔｈｒ
４４８、Ａｒｇ４６１、Ｇｌｕ４９３、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６およびＰｈ
ｅ５５７であった。そのため、図１に示すようなアミノ酸の構造座標により定義
される結合ポケット；またはアミノ酸のバックボーン原子の構造座標の平均二乗
偏差の平方根が１．５Å以下である結合ポケットは、本発明のＮＳ３ヘリカーゼ
Ｕ４-様結合ポケットとみなせる。

【００３４】 従前の技術と対比して、出願人は、ＮＴＰ結合ポケットの形を決めるＮＳ３ヘ
リカーゼアミノ酸をも更に完全に決定した。それらのアミノ酸はＰｒｏ２０５、
Ｔｈｒ２０６、Ｇｌｙ２０７、Ｓｅｒ２０８、Ｇｌｙ２０９、Ｌｙｓ２１０、Ｓ
ｅｒ２１１、Ｔｈｒ２１２、Ｌｙｓ２１３、Ａｓｎ２２９、Ａｌａ２３４、Ｇｌ
ｙ２３７、Ｐｈｅ２３８、Ｔｙｒ２４１、Ａｓｐ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ
２９３、Ｔｈｒ３２２、Ａｌａ３２３、Ｔｈｒ３２４、Ｇｌｎ４６０、Ｇｌｙ４
６３、Ａｒｇ４６４およびＡｒｇ４６７である。そのため、図１に示すようなこ
れらアミノ酸の構造座標により定義される結合ポケット；またはこれらアミノ酸
のバックボーン原子の構造座標の平均二乗偏差の平方根が１．５Å以下である結
合ポケットは、本発明の好ましいＮＳ３ヘリカーゼＮＴＰ-様結合ポケットとみ なせる。

【００３５】 ＮＳ３の他のイソ形のアミノ酸に番号をつけると本発明に示すものとは異なり
得ることは当業者に容易に明らかとなる。ＮＳ３の他のイソ形の相当するアミノ
酸は、アミノ酸配列の視覚的検査によるか、または市販の相同性ソフトウエアプ
ログラムにより容易に同定される。

【００３６】 ＮＳ３ヘリカーゼの各アミノ酸は、図１に示す構造座標セットにより定義され
る。“構造座標”という語はデカルト座標をいい、結晶形のタンパク質またはタ
ンパク質-リガンド複合体の原子(散乱中心)による単色Ｘ線ビームの回折から得 られるパターンに関係する数学的方程式より得られる。回折データを使用し、結
晶の繰り返し単位の電子密度図を算出する。次いで、電子密度図を使用し、酵素
または酵素複合体の個々の原子位置を算出する。

【００３７】 当業者ならば、酵素もしくは酵素複合体またはそれらの部分についての構造座
標セットは、三次元で形状を決める関連する一組の点であると理解できる。その
ため、全く異なる一組の座標が、同様のまたは同一の形状を定義することがあり
得る。さらに、個々の座標の僅かな変化が全体の形に僅かに影響を与える。結合
ポケットに関して、これら変化により、ポケットと会合できるリガンドの性質を
顕著に変化させるとは考えにくい。

【００３８】 “と会合する”という語は、化学物質もしくは化合物またはそれらの部分と、
タンパク質上の結合ポケットまたは結合部位との間の近接状態をいう。会合は、
非共有結合(その近接位が水素結合またはファンデルワールス力または静電引力 によりエネルギー的に強められている。)であってもよいし、共有結合的であっ てもよい。

【００３９】 ＮＳ３ヘリカーゼ-オリゴヌクレオチド複合体の構造座標の数学的操作により 、上記考察した種々の座標を生成させ得る。例えば、図１に示す構造座標群は、
構造座標の結晶学的置換、構造座標の細分化、各組の構造座標への整数加算また
は減算、構造座標の逆数、または上記の任意の組み合わせにより操作することが
できる。

【００４０】 あるいは、結晶を形成する任意の成分における、アミノ酸の変異、付加、置換
および／または欠失その他の変化からなる結晶構造の修飾により、構造座標にお
ける変化も説明され得る。そのような変化がもとの座標と比較して許容される標
準的誤差範囲内ならば、得られた三次元形状は同じものであるとみなされる。従
って、例えばＮＳ３ヘリカーゼのオリゴヌクレオチド結合ポケットに結合するリ
ガンドは、それと構造座標が許容される誤差範囲内にある形状を定義する他の結
合ポケットにも結合すると予想される。

【００４１】 そのため、種々のコンピューター分析が、分子またはその結合ポケット部分が
上記ＮＳ３ヘリカーゼ結合ポケットと十分に類似しているかどうかを決定するた
めに、必要となる。そのような分析は、ＱＵＡＮＴＡ(Molecular Simulations I
nc., San Diego, CA)の分子類似性アプリケーションのバージョン４．１のよう な、よく知られたソフトウエアアプリケーションにより、添付ユーザーズガイド
の記載の通りに実施でき得る。

【００４２】 この分子類似性アプリケーションは、異なる構造間の、同じ構造の異なる配座
間の、および同じ構造の異なる部分間の比較を可能とする。分子類似性で構造を
比較するために使用する操作は、１)比較する構造のロード；２)これらの構造中
の原子当量の測定；３)フィッティング操作の実施；および４)結果の分析；の４
段階に分けられる。

【００４３】 各構造は名称をつけて同定する。ある構造を標的(即ち固定構造)として同定し
、残り全ての構造を処理構造とする(即ち、可動構造)。ＱＵＡＮＴＡ内での原子
当量がユーザー入力により決まるため、本発明の目的のために、比較する二つの
構造間の全ての保存残基について、タンパク質バックボーン原子(Ｎ、Ｃα、Ｃ およびＯ)と当量である原子を決める。正確なフィッティング操作だけを考慮す る。

【００４４】 正確なフィッティング法の使用に際しては、処理構造を直進および回転させて
標的構造にフィットする最適条件を得る。フィッティング操作はアルゴリズムを
使用するが、このアルゴリズムは、処理構造に適用して最適の直進および回転を
演算し、当量原子の特定対のフィットについての平均二乗偏差の平方根が絶対最
小値となるようにする。アルゴリズムで与えられるこの数値はＱＵＡＮＴＡによ
り報告されている。

【００４５】 本発明の目的のためには、図１に列挙した構造座標により記述されている適切
なバックボーン原子に重ね合わせるとき、保存残基バックボーン原子(Ｎ、Ｃα 、Ｃ、Ｏ)の平均二乗偏差の平方根が１．５Å未満である任意の分子もしくは分 子複合体またはそれらの結合ポケットを同一とみなす。さらに好ましくは、平均
二乗偏差の平方根は１．０Å未満である。

【００４６】 “平均二乗偏差の平方根”という語は、平均からの偏差の二乗の算術平均の二
乗根を意味する。それは、傾向または目的との偏差または変化を表わす方法であ
る。本発明の目的のためには、“平均二乗偏差の平方根”は、本明細書に記載し
たＮＳ３ヘリカーゼの構造座標によって定義されるように、ＮＳ３ヘリカーゼの
バックボーン由来のタンパク質またはその結合ポケット部分のバックボーンにお
ける変化を定義する。

【００４７】 従って、本発明の他の実施態様によれば、 ａ)当該分子または分子複合体が図１のＮＳ３アミノ酸Ｖａｌ２３２、Ｔｈｒ２ ５４、Ｇｌｙ２５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７
５、Ｔｒｐ５０１およびＴｙｒ５０２の構造座標により定義される結合ポケット
を含むものである分子または分子複合体の三次元画像、または、 ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである当該分子または分子複合体の同
族体の三次元画像、 を得るためのコンピューターであって、 (i)当該データが図１のＮＳ３アミノ酸Ｖａｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２ ５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０
１およびＴｙｒ５０２の構造座標を含むものである機械読取り可能なデータをコ
ード化したデータ記憶体を含む機械読み取り可能データ記憶媒体、 (ii)当該機械読み取り可能データを処理するための命令記憶用ワーキングメモリ
、 (iii)当該ワーキングメモリと、および当該機械読み取り可能データ記憶媒体と に連結し、当該機械読み取り可能データを処理して当該三次元画像にする中央処
理装置、ならびに (iV)当該中央処理装置と連結し、当該三次元画像を表示するディスプレイ、 を含むコンピューターが提供される。

【００４８】 好ましい実施態様では、コンピューターは、 ａ)図１の、ＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｖａｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２ ５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０
１、Ｔｙｒ５０２、Ｐｒｏ２３０、Ｖａｌ２５６、Ｔｈｒ２９８、Ａｌａ４９７
、Ｌｙｓ５５１、Ｇｌｎ５５２、Ｇｌｙ５５４、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６お
よびＰｒｏ５５８の構造座標により定義される結合ポケットを含む分子または分
子複合体、または ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
、 の三次元画像を作成するものである。その好ましい実施態様では、機械読み取り
可能データには、図１のＮＳ３アミノ酸Ｖａｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２
５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０
１、Ｔｙｒ５０２、Ｐｒｏ２３０、Ｖａｌ２５６、Ｔｈｒ２９８、Ａｌａ４９７
、Ｌｙｓ５５１、Ｇｌｎ５５２、Ｇｌｙ５５４、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６お
よびＰｒｏ５５８の構造座標を含む。

【００４９】 上記二種の実施態様では、コンピューターは、ＮＳ３ヘリカーゼＵ８-様結合 ポケットを含む分子または分子複合体の三次元的画像を生ずるものである。

【００５０】 他の実施態様では、コンピューターは、 ａ)図１の、ＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｈｉｓ３６９、Ｓｅｒ３７０、Ｌｙｓ３ ７１、Ｔｙｒ３９２、Ａｒｇ３９３、Ｔｈｒ４１１、Ａｓｐ４１２、Ａｌａ４１
３、Ｃｙｓ４３１、Ｖａｌ４３２、Ｇｌｎ４３４、Ｉｌｅ４４６、Ｔｈｒ４４８
、Ａｒｇ４６１、Ｇｌｕ４９３、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６およびＰｈｅ５５
７の構造座標により定義される結合ポケットを含む分子または分子複合体、また
は ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
、 の三次元画像を作成させる。

【００５１】 この他の実施態様では、機械読み取り可能データは、図１のＮＳ３アミノ酸Ｈ
ｉｓ３６９、Ｓｅｒ３７０、Ｌｙｓ３７１、Ｔｙｒ３９２、Ａｒｇ３９３、Ｔｈ
ｒ４１１、Ａｓｐ４１２、Ａｌａ４１３、Ｃｙｓ４３１、Ｖａｌ４３２、Ｇｌｎ
４３４、Ｉｌｅ４４６、Ｔｈｒ４４８、Ａｒｇ４６１、Ｇｌｕ４９３、Ｇｌｕ５
５５、Ａｓｎ５５６およびＰｈｅ５５７の構造座標を含む。

【００５２】 この実施態様では、コンピューターは、ＮＳ３ヘリカーゼＵ４-様結合ポケッ トを含む分子または分子複合体の三次元的画像を作成させるものである。

【００５３】 また、他の実施態様では、コンピューターは、 ａ)図１の、ＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｐｒｏ２０５、Ｔｈｒ２０６、Ｇｌｙ２ ０７、Ｓｅｒ２０８、Ｇｌｙ２０９、Ｌｙｓ２１０、Ｓｅｒ２１１、Ｔｈｒ２１
２、Ｌｙｓ２１３、Ａｓｎ２２９、Ａｌａ２３４、Ｇｌｙ２３７、Ｐｈｅ２３８
、Ｔｙｒ２４１、Ａｓｐ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ２９３、Ｔｈｒ３２２、
Ａｌａ３２３、Ｔｈｒ３２４、Ｇｌｎ４６０、Ｇｌｙ４６３、Ａｒｇ４６４およ
びＡｒｇ４６７の構造座標により定義される結合ポケットを含む分子または分子
複合体、または ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
、 の三次元画像を作成させる。

【００５４】 この他の実施態様では、機械読み取り可能データは、図１のＮＳ３アミノ酸Ｐ
ｒｏ２０５、Ｔｈｒ２０６、Ｇｌｙ２０７、Ｓｅｒ２０８、Ｇｌｙ２０９、Ｌｙ
ｓ２１０、Ｓｅｒ２１１、Ｔｈｒ２１２、Ｌｙｓ２１３、Ａｓｎ２２９、Ａｌａ
２３４、Ｇｌｙ２３７、Ｐｈｅ２３８、Ｔｙｒ２４１、Ａｓｐ２９０、Ｇｌｕ２
９１、Ｈｉｓ２９３、Ｔｈｒ３２２、Ａｌａ３２３、Ｔｈｒ３２４、Ｇｌｎ４６
０、Ｇｌｙ４６３、Ａｒｇ４６４およびＡｒｇ４６７の構造座標を含む。

【００５５】 この実施態様では、コンピューターは、ＮＳ３ヘリカーゼＮＴＰ-様結合ポケ ットを含む分子または分子複合体の三次元的画像を作成させるものである。

【００５６】 より好ましいものは、図１に示すＮＳ３アミノ酸全体の構造座標により定義さ
れる分子または分子複合体の三次元、または、当該同族体が当該アミノ酸のバッ
クボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１．５Å以下である結合ポケットを含む
ものである分子または分子複合体の同族体の三次元画像を作成させるコンピュー
ターである。この実施態様では、機械読み取り可能データにはＮＳ３すべての座
標が含まれている。

【００５７】 他の実施態様によれば、本発明は、分子または分子複合体から得られるＸ線回
折データに対応する構造座標の少なくとも一部を決定するコンピューターを提供
するものであって、当該コンピューターは、 (ａ)当該データが図１のＮＳ３ヘリカーゼの構造座標の少なくとも一部を含むも
のである機械読取り可能なデータをコード化したデータ記憶体を含む機械読み取
り可能データ記憶媒体、 (ｂ)当該データには当該分子または分子複合体のＸ線回折データを含むものであ
る機械読取り可能なデータをコード化したデータ記憶体を含む機械読み取り可能
データ記憶媒体、 (ｃ)(ａ)および(ｂ)の当該機械読み取り可能データを処理するための命令記憶用
ワーキングメモリ、 (ｄ)当該ワーキングメモリと、(ａ)および(ｂ)の当該機械読み取り可能データ記
憶媒体に連結し、(ａ)の機械読み取り可能データのフーリエ変換を実施し、(ｂ)
の当該機械読み取り可能データを処理して構造座標にする中央処理装置、ならび
に (ｅ)当該中央処理装置と連結し、当該分子または分子複合体の当該構造座標を表
示するディスプレイ、 を含むものである。

【００５８】 例えば、図１に示す構造座標のフーリエ変換を使用して、他のヘリカーゼの構
造座標の少なくとも一部を決定し得る。

【００５９】 図２は、これらの実施態様の１態様を例示説明する。システム１０は、中央処
理装置(“ＣＰＵ”)２０、ＲＡＭ(ランダムアクセスメモリ)もしくは“コア”メ
モリ等のワーキングメモリ２２、大容量記憶メモリ２４(１以上のディスクドラ イブまたはＣＤ-ＲＯＭドライブ等)、１以上の陰極線管(“ＣＲＴ”)ディスプレ
イターミナル２６、１以上のキーボード２８、１以上の入力ライン３０、および
１以上の出力ライン４０を含み、それらが全て通常の双方向性システムバス５０
に連結しているコンピューター１１を含む。

【００６０】 入力ハードウエア３６は、入力ライン３０でコンピューター１１と連結させ、
種々の方法で設置できる。本発明の機械読み取り可能データは、電話回線または
専用データライン３４で連結させたモデムまたはモデム群３２を使用し入力され
得る。他にまたは更に、入力ハードウエア３６は、ＣＤ-ＲＯＭドライブまたは ディスクドライブ２４を含み得る。ディスプレイターミナル２６との連結におい
て、キーボード２８も入力装置として使用し得る。

【００６１】 出力ハードウエア４６は、出力ライン４０でコンピューター１１と連結させ、
通常の装置により同様に設置され得る。例示すると、出力ハードウエア４６は、
本明細書で記載したＱＵＡＮＴＡ等のプログラムを用い本発明の結合ポケットの
画像表示のためのＣＲＴディスプレイターミナル２６を含み得る。出力ハードウ
エアには、ハードコピー出力させ得るプリンター４２、または後に使用するため
にシステム出力を記憶するディスクドライブ２４も含み得る。

【００６２】 操作に際しては、ＣＰＵ２０は、種々の入力および出力装置３６、４６を併用
し、大容量記憶２４からのデータアクセスならびにワーキングメモリ２２へおよ
びワーキングメモリ２２からのアクセスを統合して、データ処理段階の順番を決
定する。本発明の機械読み取り可能データは、多くのプログラムを使用して処理
し得る。それらのプログラムは、本明細書で記載されているように薬物発見のコ
ンピューター手法を参考にして考察される。ハードウエアシステム１０の構成物
については、データ記憶媒体についての下記記載において適当な場合に特記する
。

【００６３】 図３は、図２のシステム１０のようなシステムで実行し得る機械読み取り可能
データをコード化出来る磁性データ記憶媒体１００の断面図を示す。媒体１００
は通常のフロッピーディスクまたはハードディスクであり、通常のものでもよい
適切な基体１０１を有し、そして、極性または方向が磁性的に変化し得る磁性ド
メイン(目に見えず)を含む、通常のものでもよい適切なコーティング１０２を片
面または両面に有する。媒体１００は、ディスクドライブまたは他のデータ記憶
装置２４の軸を受けるオープニングも有し得る(図示せず)。

【００６４】 媒体１００のコーティング１０２の磁性ドメインには、通常のものでもよい方
法で本明細書で記載するような機械読み取り可能データのコード化を、図２のシ
ステム１０等のシステムで実行できるように極性を付与してあり、方向をもたせ
てある。

【００６５】 図４は、光学的に読み取り可能なデータ記憶媒体１１０の断面図を示しており
、それは、機械読み取り可能データまたは指令セットもコード化でき、図２のシ
ステム１０等のシステムで実行できるものである。媒体１１０は、通常のコンパ
クトディスク読出し専用記憶装置(ＣＤ-ＲＯＭ)でもよく、光学的に読み取り可 能で光磁気的に書き込み可能な光磁気ディスク等の再書き込み可能(rewritable)
媒体でもよい。好ましくは、媒体１００は通常のものでもよい適切な基体１１１
を有し、そして通常のものでもよい適切なコーティング１１２が通常は基体１１
１の片面にある。

【００６６】 ＣＤ-ＲＯＭの場合、よく知られているように、コーティング１１２は反射性 であり、機械読み取り可能データをコード化するために複数のピット１１３で印
が付けられている。ピットの配置を、コーティング１１２表面でレーザー光を反
射させて読む。好ましくは実質的に透明である保護コーティング１１４を、コー
ティング１１２の上に施す。

【００６７】 光磁気ディスクの場合、よく知られているように、コーティング１１２にピッ
ト１１３はないが、レーザー等により(図示せず)ある温度を超える温度で加熱す
ると、極性または方向が磁性的に変化し得る複数の磁性ドメインを有する。コー
ティング１１２から反射するレーザー光の偏光を測定することにより、ドメイン
の方向を読むことが出来る。ドメインの配置が上記のようなデータをコード化す
る。

【００６８】 こうして、本発明によれば、それを処理してＮＳ３ヘリカーゼ様結合ポケット
を含む分子または分子複合体の三次元画像表示させ得るＸ線座標データを、機械
読み取り可能記憶媒体に記憶させる。

【００６９】 ＮＳ３ヘリカーゼ様結合ポケットを含む分子または分子複合体の３次元構造に
変換するためのソフトウエアでプログラムしたコンピューターと共に使用すると
、ＮＳ３ヘリカーゼＸ線座標データは様々な目的、例えば薬物発見に使用し得る
。

【００７０】 例えば、データによりコード化された構造は、化学物質との会合能についてコ
ンピューターで評価され得る。ＮＳ３ヘリカーゼと会合する化学物質は、その酵
素を阻害し、有望な新薬候補となる。あるいは、データによりコード化された構
造は、三次元的画像としてコンピューターのスクリーンに表示され得る。これに
より、構造の視覚的な調査や化学物質との構造的会合の視覚的な調査が可能とな
る。

【００７１】 従って、他の実施態様によれば、本発明は、 ａ)図１のＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｖａｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２５ ５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０１
およびＴｙｒ５０２の構造座標により定義される結合ポケットを含む分子または
分子複合体、または ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
、 と会合する化学物質の効力を評価する方法に関係する。

【００７２】 この方法は、 i)化学物質と分子または分子複合体の結合ポケットとのフィッティング操作を実
施するコンピューター手段を使用する工程、および、 ii)化学物質と結合ポケットとの間の会合を定量する、当該フィッティング操作 の結果を分析する工程、 を含む。

【００７３】 本明細書中で使用するとき、“化学物質”という語は、化合物、少なくとも二
種の化合物の複合体、およびそれらの化合物もしくは複合体のフラグメントを意
味する。

【００７４】 好ましくは、この方法は、 ａ)図１の、ＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｖａｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２ ５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０
１、Ｔｙｒ５０２、Ｐｒｏ２３０、Ｖａｌ２５６、Ｔｈｒ２９８、Ａｌａ４９７
、Ｌｙｓ５５１、Ｇｌｎ５５２、Ｇｌｙ５５４、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６お
よびＰｒｏ５５８の構造座標により定義される結合ポケットを含む分子または分
子複合体、または ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
、 と会合する化学物質の効力を評価するものである。

【００７５】 これら実施態様は、ＮＳ３ヘリカーゼＵ８-様結合ポケットと会合する化学物 質の効力の評価に関係する。

【００７６】 他の実施態様では、上記と同じ工程を、 ａ)図１の、ＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｈｉｓ３６９、Ｓｅｒ３７０、Ｌｙｓ３ ７１、Ｔｙｒ３９２、Ａｒｇ３９３、Ｔｈｒ４１１、Ａｓｐ４１２、Ａｌａ４１
３、Ｃｙｓ４３１、Ｖａｌ４３２、Ｇｌｎ４３４、Ｉｌｅ４４６、Ｔｈｒ４４８
、Ａｒｇ４６１、Ｇｌｕ４９３、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６およびＰｈｅ５５
７の構造座標により定義される結合ポケットを含む分子または分子複合体、また
は、 ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
、 と会合する化学物質の効力を評価する方法に使用する。

【００７７】 これらの実施態様は、ＮＳ３ヘリカーゼＵ４-様結合ポケットと会合する化学 物質の効力の評価に関係する。

【００７８】 さらに別の実施態様では、上記と同じ工程を、 ａ)図１の、ＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｐｒｏ２０５、Ｔｈｒ２０６、Ｇｌｙ２ ０７、Ｓｅｒ２０８、Ｇｌｙ２０９、Ｌｙｓ２１０、Ｓｅｒ２１１、Ｔｈｒ２１
２、Ｌｙｓ２１３、Ａｓｎ２２９、Ａｌａ２３４、Ｇｌｙ２３７、Ｐｈｅ２３８
、Ｔｙｒ２４１、Ａｓｐ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ２９３、Ｔｈｒ３２２、
Ａｌａ３２３、Ｔｈｒ３２４、Ｇｌｎ４６０、Ｇｌｙ４６３、Ａｒｇ４６４およ
びＡｒｇ４６７の構造座標により定義される結合ポケットを含む分子または分子
複合体、または、 ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
、 と会合する化学物質の効力を評価する方法に使用する。

【００７９】 これらの実施態様は、ＮＳ３ヘリカーゼＮＴＰ-様結合ポケットと会合する化 学物質の効力の評価に関係する。

【００８０】 さらに、より好ましくは、この方法は、図１に示すような全てのＮＳ３ヘリカ
ーゼアミノ酸の構造座標により定義される分子もしくは分子複合体と、または当
該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１．５Å以下である当
該分子もしくは分子複合体の同族体と会合する化学物質の効力を評価する。

【００８１】 他に、ＮＳ３ヘリカーゼ結合ポケットの構造座標を、ＮＳ３ヘリカーゼ-様結 合ポケットを含む分子の有望なアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法
に利用することが出来る。この方法は、 ａ．図１のＶａｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ
２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０１およびＴｙｒ５０２の原子
座標±１．５Å以下である当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平
方根、を使用して、ＮＳ３ヘリカーゼ-様結合ポケットを含む分子の三次元構造 を生成させる工程、 ｂ．当該三次元構造を使用し、当該有望なアゴニストまたはアンタゴニストを設
計しまたは選択する工程、 ｃ．当該アゴニストまたはアンタゴニストを合成する工程、および、 ｄ．当該アゴニストまたはアンタゴニストを当該分子と接触させ、当該有望なア
ゴニストまたはアンタゴニストの当該分子と相互作用する能力を決定する工程、
を含む。

【００８２】 さらに好ましいのは、図１のＶａｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２５５、Ｔ
ｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０１、Ｔｙ
ｒ５０２、Ｐｒｏ２３０、Ｖａｌ２５６、Ｔｈｒ２９８、Ａｌａ４９７、Ｌｙｓ
５５１、Ｇｌｎ５５２、Ｇｌｙ５５４、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６、およびＰ
ｒｏ５５８の原子座標±１．５Å以下である当該アミノ酸のバックボーン原子の
平均二乗偏差の平方根、を使用して、ＮＳ３ヘリカーゼ-様結合ポケットを含む 分子の三次元構造を生成させる場合である。

【００８３】 これらの方法を設計し、ＮＳ３ヘリカーゼＵ８-様結合ポケットと会合するア ゴニストおよびアンタゴニストを同定する。

【００８４】 他に、ＮＳ３ヘリカーゼＵ４結合ポケット--図１のＨｉｓ３６９、Ｓｅｒ３７
０、Ｌｙｓ３７１、Ｔｙｒ３９２、Ａｒｇ３９３、Ｔｈｒ４１１、Ａｓｐ４１２
、Ａｌａ４１３、Ｃｙｓ４３１、Ｖａｌ４３２、Ｇｌｎ４３４、Ｉｌｅ４４６、
Ｔｈｒ４４８、Ａｒｇ４６１、Ｇｌｕ４９３、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６およ
びＰｈｅ５５７--の原子座標±１．５Å以下である当該アミノ酸のバックボーン
原子の平均二乗偏差の平方根、を上記工程ａ)で使用して、ＮＳ３ヘリカーゼ-様
結合ポケットを含む分子の三次元構造を生成させ得る。

【００８５】 他の別の実施態様では、ＮＳ３ヘリカーゼＮＴＰ結合部位--図１のＰｒｏ２０
５、Ｔｈｒ２０６、Ｇｌｙ２０７、Ｓｅｒ２０８、Ｇｌｙ２０９、Ｌｙｓ２１０
、Ｓｅｒ２１１、Ｔｈｒ２１２、Ｌｙｓ２１３、Ａｓｎ２２９、Ａｌａ２３４、
Ｇｌｙ２３７、Ｐｈｅ２３８、Ｔｙｒ２４１、Ａｓｐ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈ
ｉｓ２９３、Ｔｈｒ３２２、Ａｌａ３２３、Ｔｈｒ３２４、Ｇｌｎ４６０、Ｇｌ
ｙ４６３、Ａｒｇ４６４およびＡｒｇ４６７--の原子座標±１．５Å以下である
当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根、を上記工程ａ)で使 用して、ＮＳ３ヘリカーゼ-様結合ポケットを含む分子の三次元構造を生成させ 得る。

【００８６】 最も好ましいのは、図１のＮＳ３ヘリカーゼの全アミノ酸の原子座標±１．５
Å以下である当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根を使用し
、ＮＳ３ヘリカーゼ-様結合ポケットを含む分子の三次元構造を生成させる場合 である。

【００８７】 第一に、本発明は、分子設計技術を使用して、化学物質を同定し、選択し、さ
らに設計することを可能とする。その化学物質には、ＮＳ３ヘリカーゼ-様結合 ポケット、特にＮＳ３ヘリカーゼのオリゴヌクレオチド結合ポケットと結合でき
る阻害性化合物が含まれる。

【００８８】 出願人による、ＮＳ３ヘリカーゼ上のオリゴヌクレオチド結合部位中のＵ４お
よびＵ８結合ポケットの解明、および、ＮＴＰ結合ポケットのさらなる解明から
、ＮＳ３ヘリカーゼ-様結合ポケットと相互作用し得る新規化学物質および化合 物を設計するために必要な情報の全てまたはその一部が得られる。

【００８９】 このセクションでは、物質におけるＮＳ３ヘリカーゼ-様結合ポケットとの結 合能、会合能、または阻害能についての考察は、物質単独の場合を参照して行っ
ている。化合物がＮＳ３ヘリカーゼと結合するするかどうかを調べるアッセイは
、当分野において既知であり、以下に例示説明する。

【００９０】 本発明によるＮＳ３ヘリカーゼ-様結合ポケットと結合するか、または阻害す る化合物の設計では、二つの因子を通常考慮する。第一に、この物質は、ＮＳ３
ヘリカーゼ-様結合ポケットの一部または全体と、物理的および構造的に会合で きなければならない。この会合に重要な非共有結合的分子相互作用は、水素結合
、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用および静電的相互作用を含む。

【００９１】 第二に、この物質は、ＮＳ３ヘリカーゼ-様結合ポケットと直接会合できる配 座を想定できるものでなければならない。物質のある部分がこれらの会合に直接
関係しなくとも、それでもなおこの物質のその部分が分子全体の配座に影響を与
えるものであり得る。これは交互に効力に重要なインパクトを与えるものであり
得る。そのような配位要件は、結合ポケットの全体または一部との相関における
その化学物質の三次元構造全体および配向、または、ＮＳ３ヘリカーゼ-様結合 ポケットまたはその同族体と直接相互作用する数種の化学物質を含む物質の官能
基間の空間、が含まれる。

【００９２】 ある化学物質のＮＳ３ヘリカーゼ-様結合ポケットへの阻害または結合能力は 、その実際の合成および試験前に、コンピューターモデリング技術を用いて分析
され得る。与えられた物質の理論構造が、その物質とＮＳ３ヘリカーゼ-様結合 ポケットとの相互作用および会合に不十分であると示唆するものであれば、その
物質の試験は不要となる。しかし、コンピューターモデリングが、強力な相互作
用を示すなら、そのときは分子を合成し、ＮＳ３ヘリカーゼ-様結合ポケットと の結合能を試験すればよい。これは、その分子によるＮＳ３ヘリカーゼ阻害能を
、実施例５に記載したアッセイを用いて試験して実施できる。この方法では、効
果のない化合物の合成を避けることができる。

【００９３】 ＮＳ３ヘリカーゼ-様結合ポケットの有望な阻害剤が、化学物質またはフラグ メントをＮＳ３ヘリカーゼ-様結合ポケットとの会合能でスクリーニングし選択 する一連の工程により、コンピューターで評価し得る。

【００９４】 当業者は、化学物質またはフラグメントを、ＮＳ３ヘリカーゼ様結合ポケット
と結合する能力についてスクリーンする数種の方法のいずれかを使用できる。こ
のプロセスは、例えば、図１のＮＳ３ヘリカーゼ構造座標、または、機械読取り
可能記憶媒体から生成させた類似形状を定義する他の座標に基づき、コンピュー
タースクリーン上でＮＳ３ヘリカーゼ様結合ポケットを視覚調査で開始し得る。
選択したフラグメントまたは化学物質は、上記定義の結合ポケット内で、様々な
方向に配置でき、またはドック入りさせ得る。ドッキングは、QuantaおよびSyby
l等のソフトウェアを使用し、続いてCHARMMおよびAMBERなどの標準分子力学配位
場を用いるエネルギー最低化および分子動態により実施し得る。

【００９５】 専用化したコンピュータープログラムもまた、フラグメントまたは化学物質の
選択プロセスに役立ち得る。これらは以下を含む： １．GRID (P. J. Goodford, “A Computational Procedure for Determining En
ergetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolec
ules”, J. Med. Chem., 28, pp. 849-857 (1985))。GRIDはイギリス、オックス
フォードのオックスフォード大学から入手できる。 ２．MCSS (A. Miranker et al., “Functionality Maps of Binding Sites: A M
ultiple Copy Simultaneous Search method.” Proteins: Structure, Function and Genetics , ll, pp. 29-34 (1991) )。MCSSはカリフォルニア州、サンディ エゴのMolecular Simulationsから入手できる。 ３．AUTODOCK (D. S. Goodsell et al., “Automated Docking of Substrates t
o Proteins by Simulated Annealing” Proteins: Structure, Function and Ge netics , 8, pp. 195-202 (1990)。AUTODOCKはカリフォルニア州La JollaのScrip
ps Research Instituteから入手できる。 ４．DOCK (I. D. Kuntz et al., “A Geometric Approach to Macromolecule-Li
gand Interactions”, J. Mol. Biol., 161, PP. 269-288 (1982) )。DOCKはカ リフォルニア州サンフランシスコのカリフォルニア大学から入手できる。

【００９６】 一旦、適切な化学物質またはフラグメントが選択されれば、それらを単一化合
物または複合体に組み立てることができる。組立は、ＮＳ３ヘリカーゼの構造座
標と関連させてコンピュータースクリーン上に表示させた三次元イメージ上で、
フラグメントの相互関係を視覚調査することで先行させることができる。続いて
、QuantaまたはSybyl（Tripos Associates, St. Louis, MO）などのソフトウェ アを使用する、マニュアルモデル構築を行なう。

【００９７】 個々の化学物質またはフラグメントを結合させる際、当業者に役立つ有用なプ
ログラムには下記のものがある： １． CAVEAT (P. A. Bartlett et al, “CAVEAT: A Program to Facilitate the
Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules”, in Molecul ar Recognition in Chemical and Biological Problems ”, Special Pub., Roya
l Chem. Soc., 78, pp. 182-196 (1989); G. Laurl and P. A. Bartlett, “CAV
EAT: a Program to Facilitate the Design of Organic Molecules”, J. Compu t. Aided Mol. Des. , 8, pp. 51-66 (1994) )。 CAVEATはカリフォルニア州バ ークレーのカリフォルニア大学から入手できる ２． ISIS（MDL Information Systems, San Leandro, CA）などの３Ｄデータベ ースシステム。この分野は、Y. C. Martin, “3D Database Searching in Drug
Design”, J. Med. Chem., 35, pp. 2145-2154 (1992) で概説されている。 ３．HOOK (M. B. Eisen et al, “HOOK: A Program for Finding Novel Molecul
ar Architectures that Satisfy the Chemical and Steric Requirements of a
Macromolecule Binding Site”, Proteins: Struct. , Funct., Genet. , 19, p
p.199-221 (1994)。HOOKははカリフォルニア州、サンディエゴのMolecular Simu
lationsから入手できる。

【００９８】 上述の、一度に一つのフラグメントまたは化学物質という段階的方法で、ＮＳ
３ヘリカーゼ様結合ポケットのインヒビターの構築プロセスを進めるかわりに、
空いている結合部位か、所望により既知インヒビター(類)のある部分(群)を含む
ものかの、どちらかを使用して、阻害性その他のＮＳ３ヘリカーゼ結合化合物を
、全体としてまたは“新たに”設計することができる。以下に示す、多くの新規
なリガンド設計方法がある： １．LUDI (H. -J. Bohm, “The Computer Program LUDI : A New Method for th
e De Novo Design of Enzyme Inhibitors”, J. Comp. Aid. Molec. Design, 6,
PP. 61-78 (1992) )。LUDIはカリフォルニア州、サンディエゴのMolecular Sim
ulations Incorporatedから入手できる。 ２． LEGEND (Y. Nishibata et al., Tetrahedron, 47, p. 8985 (1991) )。LEG
ENDはカリフォルニア州、サンディエゴのMolecular Simulations Incorporated から入手できる。 ３．LeapFrog (Tripos Associates, St.Louis, MOで入手できる。) ４．SPROUT (V. Gillet et al, “SPROUT: A Program for Structure Generatio
n)”, J. Comput Aided Mol. Design, 7, pp. 127-153 (1993))。SPROUT はイギ
リスのleeds大学で入手できる。

【００９９】 他の分子モデリング技術もまた、本発明に従い使用できる(例えばN. C. Cohen
et al. , “Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemis
try, J. Med. Chem., 33, pp.883-894 (1990)参照；M. A. Navia and M. A. Mur
cko,“The Use of Structural Information in Drug Design”, Current Opinio ns in Structural Biology , 2, pp. 202-210 (1992)も参照；L. M. Balbes et a
l., “A Perspective of Modern Methods in Computer-Aided Drug Design”, .
in Reviews in Computational Chemistry, Vol. 5, K. B. Lipkowitz and D. B.
Boyd, Eds., VCH, New York, pp. 337-380 (1994); W. C. Guida, “Software
For Structure-Based Drug Design”, Curr. Opin. Struct. Biology,, 4, pp.
777-781 (1994))。

【０１００】 一旦、上述方法で化合物が設計または選択されれば、その物質がＮＳ３ヘリカ
ーゼ結合ポケットと結合し得るかどうかの有効性を、コンピューター評価で試験
することができ、最適化することができる。例えば、有効なＮＳ３ヘリカーゼ結
合ポケットインヒビターは、好ましくは、その結合しているときと遊離状態との
間のエネルギー差が、比較的小さなものでなければならない（すなわち結合の変
形エネルギーが小さい）。従って、最も有効なＮＳ３ヘリカーゼ結合ポケットイ
ンヒビターは、好ましくは結合の変形エネルギーが１０kcal/mol以下となるよう
に、さらに好ましくは７kcal/molを超えないように設計されるべきである。ＮＳ
３ヘリカーゼ結合ポケットインヒビターは、総結合エネルギーが同程度である一
以上の形態で、結合ポケットと相互作用し得る。これらの場合、結合の変形エネ
ルギーは、遊離物質のエネルギーと、インヒビターがタンパク質に結合するとき
に観察される形態の平均エネルギーとの差であると解される。

【０１０１】 ＮＳ３ヘリカーゼ結合ポケットと結合するように設計されたまたは選択された
物質は、さらにコンピューターで最適化して、その結合状態で、好ましくは、標
的酵素およびその周りの水分子との反発的な静電相互作用を欠くようにすること
ができる。そのような非相補的な静電相互作用は、反発的な電荷-電荷、双極子-
双極子、および電荷-双極子の相互作用を含む。

【０１０２】 専用のコンピューターソフトウェアは、化合物変形エネルギーおよび静電相互
作用を評価するために当分野で入手できる。そのような使用向けに設計されたプ
ログラムの例証には以下のものがある：Gaussian 94, revision C (M. J. Frisc
h, Gaussian, Inc., PitIsburgh, PA (コヒ゜ーライト)l995) ; AMBER, version 4.1 (P . A. Kollman, University of California at San Francisco, (コヒ゜ーライト)l995) ；QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA (コヒ゜ーライト)l99 5)；Insight II/Discover (Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA (コヒ゜ーライト )l995); DelPhi (Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA (コヒ゜ーライト)l995)：およびAMSOL (Quantum Chemistry Program Exc hange, Indiana University)。これらのプログラムは、例えば、“IMPACT”グラ
フィックスを備えたインジゴ²のようなシリコングラフィックスワークステーシ ョンを使用して実行できる。他のハードウェアシステムやソフトウェアパッケー
ジも、当業者には知られているだろう。

【０１０３】 本発明で可能となる他のアプローチは、全体がまたは一部がＮＳ３ヘリカーゼ
結合ポケットと結合できる、化学物質または化合物用の小分子データベースのコ
ンピュータースクリーニングである。このスクリーニングでは、それらの物質の
結合部位への適合の良否を、形状相補性または相互作用エネルギーの評価により
判定できる（E. C. Meng et al., J. Comp. Chem., 13, pp. 505-524 (1992)） 。

【０１０４】 他の実施態様によれば、本発明は、上述の方法で調製した、または同定した、
ＮＳ３ヘリカーゼ様結合ポケットと会合する化合物を提供するものである。 図１に示した構造座標は、他の結晶分子または分子複合体についての構造情報
を取得するのに役立てることもできる。これは、分子置換を含む多種のよく知ら
れた技術のどれかを使用して実施できる。

【０１０５】 それゆえに、他の態様において、本発明は、分子置換を利用して構造未知の分
子または分子複合体の構造情報を得る方法であって、 ａ）当該構造未知分子または分子複合体を結晶化させる工程、 ｂ）当該結晶分子または分子複合体からＸ線解析データを得る工程、および ｃ）図１に示す構造座標の少なくとも一部をＸ線解析データに適用し、構造未知
分子または分子複合体の三次元構造電子密度図を得る工程、 を含む方法、を提供する。

【０１０６】 分子置換を使用することにより、本発明で提供され（そして図１に示す）ＮＳ
３ヘリカーゼ／オリゴヌクレオチド複合体の構造座標の全てまたは一部を、結晶
化させた構造未知分子または分子複合体の結晶の構造決定に、それらの情報を一
から決めようとするより迅速かつ効果的に使用することができる。

【０１０７】 分子置換は、未知構造の位相の的確な推定法を提供する。位相は、直接決定が
できない結晶構造を解明するのに使われる方程式の因子である。分子置換以外の
方法で位相の的確な値を得ることは、近似化および精密化の反復サイクルを含み
、結晶構造解明を大きく妨げる、時間のかかるプロセスである。しかし、少なく
とも相同部分を含むタンパク質の結晶構造が解明されれば、この既知構造由来の
位相は、未知構造の位相の十分な推定を与える。

【０１０８】 従って、この方法は、未知構造の分子または分子複合体の結晶のＸ線解説デー
タを説明できるように、未知構造の分子または分子複合体の結晶の単位細胞内で
、図１によるＮＳ３ヘリカーゼ／オリゴヌクレオチド複合体の関連部分を配向さ
せ位置決定することにより、構造座標未知分子または分子複合体の仮のモデルを
生成させることを含む。次いで、位相は、このモデルから計算でき、得られたＸ
回折データ振幅と組合わせて座標の未知構造の電子密度地図を生成させることが
できる。これは、順に、よく知られたモデル構築処理および構造精密化技術処理
し、未知結晶分子または分子複合体の、結論的な、的確な構造を与えることがで
きる（ E. Lattman, “Use of the Rotation and Translation Functions”, in
Meth. Enzymol., ll5, pp.55-77 (1985) ; M. G. Rossmann, ed. , “The Mole
cular Replacement Method”, Ini . Sci . Rev. Ser. , No. 13, Gordon & Bre
ach, New York (1972)）。

【０１０９】 本方法により、ＮＳ３ヘリカーゼ／オリゴヌクレオチド複合体の何れかの部分
と十分に相同性である任意の結晶分子または分子複合体の何れの部分の構造も解
明できる。 好ましい実施形態では、分子置換方法を、他のヘリカーゼについての構造情報
を得るのに利用する。本発明により提供されるＮＳ３ヘリカーゼの構造座標は、
ＮＳ３ヘリカーゼの他の異性型またはＮＳ３ヘリカーゼを含む他の複合体の構造
を解明するのに特に有用である。

【０１１０】 さらに、本発明で提供されるＮＳ３ヘリカーゼの構造座標は、アミノ酸置換、
付加および／または欠失を有するＮＳ３ヘリカーゼタンパク質（これらを、天然
に存在するＮＳ３ヘリカーゼ異性型と対比させて、ひとまとめにして“ＮＳ３ヘ
リカーゼ変異体”と称する）の構造を解明するのに有用である。これらのＮＳ３
ヘリカーゼ変異体は、所望により、非加水分解性ＮＴＰ類似体またはオリゴヌク
レオチドのような、化学物質で共複合体化させて結晶化させることができる。こ
のような一連の複合体の結晶構造は、次いで分子置換で解明し、野生型ＮＳ３ヘ
リカーゼと対比できる。このようにして、酵素の様々な結合部位中の修飾ポテン
シャル部位を定義できる。この情報は、最も有効な結合相互作用、例えば、ＮＳ
３ヘリカーゼと化学物質または化合物間の増加した疎水性相互作用を測定するた
めの付加的な手段を提供する。

【０１１１】 この構造座標は、特に、ＮＳ３ヘリカーゼまたは様々な化学物質と共複合体化
したＮＳ３ヘリカーゼ類似体の結晶構造を解明するのにも有用である。この方法
は、ＮＳ３ヘリカーゼインヒビター候補とＮＳ３ヘリカーゼとの間を含む、化学
物質間の相互作用に最適の部位の決定を可能にする。例えば、異なるタイプの溶
媒にさらした結晶から集めた高分解能Ｘ線回折データは、それぞれのタイプの溶
媒分子がどこに存在するかの決定を可能とする。かくして、これらの部位と強く
結合する小分子を設計し、合成し、それらのＮＳ３ヘリカーゼ阻害活性を試験す
ることができる。

【０１１２】 上述の複合体は全て、よく知られたＸ線回折技術を使用して研究でき、X-PLOR
のようなコンピューターソフトウェアを使用して、Ｒ値が約０.２０またはそれ 以下となるように１.５-３Å分解能Ｘ線データに対して精密にすることができる
（Yale University, (コヒ゜ーライト)l992, distributed by Molecular Simulations, Inc.；例えば Blundell & Johnson, supra; Meth. Enzymol., vol. 144 & 155, H. W. Wyckoff et al., eds., Academic Press (1985)参照）。このようにして 、この情報を、既知ＮＳ３ヘリカーゼインヒビターを最適化するのに使用でき、
さらに重要なことには、新たなＮＳ３ヘリカーゼインヒビターを設計するのに使
用することができる。

【０１１３】 以下の実施例は、本発明をさらに十分に理解できるよう示すものである。これ
らの実施例は、例示説明のみを目的とするものであり、いかなる方法においても
本発明の範囲を限定する意味のものではない。

【０１１４】 (実施例) 実施例１ ＮＳ３ヘリカーゼのクローニングおよび発現 ＨＣＶ ＮＳ３ ＲＮＡヘリカーゼドメイン(配列番号６のヌクレオチド５０ ２−１８９６によりコードされる)を、ＨＣＶ Ｈ株のｃＤＮＡからｐＥＴ発現 ベクター(Novagen, Madison, WI)にサブクローン化した[A. Grakoui et al., J.
Virol., 67, pp. 1385-95 (1993); C. Lin et al., J. Virol., 68, pp. 8147-
57 (1994)、これらの記載を引用して本明細書に包含させる]。得られたプラスミ
ドｐＥＴ−ＢＳ(＋)／ＨＣＶ／ＮＳ−Ｃ４６５−Ｈｉｓ(配列番号４)は、メチオ
ニン開始コドン、ＮＳ３ヘリカーゼドメインのＣ−末端スレオニンに結合したＧ
ｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列をコードするリンカー、および、タンパク質
精製を容易にするための、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列のＣ−末端に融
合した６ヒスチジンタグをも含んでいた。本プラスミドは、以下の修飾を施すが
、本質的には(T. A. Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, pp. 488-492 (
1985)およびC. Lin et al., Virology, 192, pp. 596-604 (1993)、これらの記 載を引用して本明細書に包含させる)の記載により、一本鎖DNA―ベース部位特異
的変異誘発の鋳型として使用した。

【０１１５】 一本鎖ファージミド(phagemid)ＤＮＡを、ＨＣＶプラス鎖に対応するヘルパー
Ｍ１３ファージの存在下、パッケージした。ｐＥＴ−ＢＳ(＋)／ＳＣＶ／ＮＳ３
−Ｃ４６５−Ｈｉｓで形質転換したＥ. ｃｏｌｉ株ＣＪ ３２６の１個のコロ ニーを、０.２５μｇ／ｍｌのウリジンおよび５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン を含むＹＴ培地で生育させた。３回連続継代後、Ｍ１３ヘルパーファージ(Ｂｉ ｏ−Ｒａｄ)をウリジル化ファージミド一本鎖ＤＮＡの救済に使用し、それを次 いでオリゴヌクレオチド−特異的変異誘発の鋳型として使用した[T. A. Kunkel
(1985), 前掲]。ＡＢＩ自動配列決定を使用して変異を同定し、他の意図してい ない変異がＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメイン配列中に存在しないことを確認し
た。変異を含む構築物を、完全長ＨＣＶ ＮＳ３タンパク質の置換残基の位置に
従って名付けた。

【０１１６】 この方法で、ＨＣＶ遺伝子型１(アミノ酸３３２にＰｒｏ；アミノ酸４０３に Ｓｅｒ；アミノ酸４１０にＡｌａ；およびアミノ酸５０５にＴｈｒ；以後、“野
性型”と呼ぶ)のコンセンサス配列に対応するＮＳ３ヘリカーゼ；ならびにコン センサスＨＣＶ遺伝子型１ＮＳ３ヘリカーゼ配列と比較して以下：Ｓｅｒ２３１
−が−Ａｌａ；Ｔｈｒ２６９−が−Ａｌａ；Ｓｅｒ３７０−が−Ａｌａ；Ｔｈｒ
４１１−が−Ａｌａ；Ｔｒｐ５０１−が−Ｐｈｅ；Ｔｒｐ５０１−が−Ｌｅｕ；
およびＴｒｐ５０１−が−Ａｌａの１個のアミノ酸変異を含むＮＳ３ヘリカーゼ
を製造した。

【０１１７】 ｐＥＴ−ＢＳ(＋)／ＨＣＶ／ＮＳ３−Ｃ４６５−Ｈｉｓプラスミドまたは上記
の１アミノ酸変異ＮＳ３ヘリカーゼをコードする類似のプラスミドで新たに形質
転換したＥ. ｃｏｌｉ ＢＬ２１(ＤＥ３)細胞を、５０μｇ／ｍｌのカルベニ シリンを添加したＬＢ培地で３０℃で生育させた。密度が１.０のＯＤ₆₀₀に到達
したとき、細胞を、最終濃度０.８ｍＭのＩＰＴＧの添加により、３時間、３０ ℃で誘導した。誘導後、細胞を回収し、精製まで−７０℃で凍結貯蔵した。

【０１１８】 タンパク質精製操作は、全て４℃で行った。典型的に、１０ｇの細胞ペースト
を、０.２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド(ＰＭＳＦ)を含む５０ｍｌ の緩衝液Ａ[５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ８)、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グ リセロール、および２.５ｍＭ β−メルカプトエタノール]に再懸濁し、マイク
ロフルイダイザーを使用して融解した。融解物を１００,０００×ｇで３５分の 遠心により浄化した。次いで、５ｍＭイミダゾール(ｐＨ８)を懸濁液に添加し、
得られた溶液を２時間、２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ−アガロース(Qiagen, Chatswort
h, CA)とインキュベートした。

【０１１９】 樹脂をカラムに充填し、１０床容量の５ｍＭおよび１５ｍＭイミダゾールを含
む緩衝液Ａで洗浄し、１００ｍＭイミダゾールを含む緩衝液Ａで溶出した。溶離
剤を、ＰＤ−１０カラム(Pharmacia)で、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂ[５
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ(ｐＨ８)、１０％グリセロールおよび２.５ｍＭ β−メル カプトエタノール]に、脱塩した。脱塩溶液をヘパリン−セファロースカラム(Ph
armacia)に充填した。次いで、フロー−スルーをＱ−セファロースカラム(Pharm
acia)に適用し、１０床容量の５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液Ｂで洗浄した。 カラムを次いで、緩衝液Ｂ中の５０ｍＭから２ＭのＮａＣｌ勾配で溶出した。

【０１２０】 ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインタンパク質を含むピークフラクションは、
ゲル−濾過クロマトグラフィーで単量体であることが示された。精製タンパク質
は、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧ Ｅ)およびクーマシーＲ−２５０着色により、９０％純粋以上であると判断され た。

【０１２１】 結晶化実験に関して、タンパク質を限外濾過により１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮し
、５容量の１５ｍＭ ＭＥＳ(ｐＨ６.５)、２.５ｍＭ β−メルカプトエタノー
ルでゆっくり希釈し、再び１０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次いで、希釈段階を２容
量のＭＥＳ緩衝液で繰り返し、１３Ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次いで、オリゴヌク
レオチド(ｄＵ８；Oligo Therapeutics, Inc., Wilsonville, OR)を添加し、タ ンパク質対核酸の１：１モル比を得た。

【０１２２】 ＮＴＰ結合ポケットにおける変異誘発実験に続いて使用する組換え完全長ＮＳ
３タンパク質を製造するために、上記と類似の方法に従った。完全長ＮＳ３コー
ド配列をまたＨＣＶ Ｈ株からサブクローン化した。これをｐＥＴ発現ベクター
内に入れ、プラスミドｐＥＴ−ＢＳ(＋)／ＨＣＶ／ＦＬＮＳ３−Ｈｉｓ(配列番 号３)を製造した。先に記載のヘリカーゼ構築物と同様に、完全長ＮＳ３コード 配列は、メチオニン開始コドンに続き、ＮＳ３コード領域のＣ−末端のフレーム
内にＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ₆をコードするコドンを有した。 このプラスミドは、上記の一本鎖ＤＮＡベースの部位特異的変異誘導の鋳型とし
て使用した。

【０１２３】 この方法で、コンセンサスＨＣＶ遺伝子型１ ＮＳ３ヘリカーゼ配列と比較し
て、以下：Ｇｌｎ４６０→Ａｌａ、Ａｒｇ４６１→Ａｌａ、Ａｒｇ４６２→Ａｌ
ａ、Ａｒｇ４６４→ＡｌａおよびＡｒｇ４６７→Ａｌａの１アミノ酸変異を含む
ＮＳ３を製造した。

【０１２４】 野性型完全長ＮＳ３および１アミノ酸変異体の両方とも上記のように精製した
。

【０１２５】 実施例２ 結晶化およびデータ収集 ＮＳ３ヘリカーゼ：ｄＵ８複合体の結晶を、０.１Ｍトリス ｐＨ８.０、０. ２Ｍ Ｌｉ₂ＳＯ₄、１８％ポリエチレングリコール６０００および８ｍＭ β−
メルカプトエタノールを含むウェルにわたり、懸滴蒸気拡散により生育させた。
滴は、配置後１２時間でマクロシードとなった。結晶は２−３週間成長し、０. ４×０.４×０.１ｍｍ³の大きさとなった。結晶は、単位細胞面積ａ＝７３.１Å
ｂ＝１１７.５Å ｃ＝６３.４Åの空間群Ｐ２₁２₁２に属し、非対称単位当り
一つのヘリカーゼ：ｄＵ８複合体を含む。

【０１２６】 重原子浸漬を、結晶を、該重原子に加えて、０.１Ｍトリス ｐＨ８.０、０. ２Ｍ Ｌｉ₂ＳＯ₄、１７％ポリエチレングリコール６０００、８ｍＭ β−メル
カプトエタノールを含む溶液に移すことにより行った。Ｋ₂ＷＯ₄での重原子浸漬
は、Ｌｉ₂ＳＯ₄非存在下で行った。

【０１２７】 結晶を、データ収集のために０.０８Ｍ トリス ｐＨ８.０、０.２Ｍ Ｌｉ₂ ＳＯ₄、１６％ポリエチレングリコール６０００、８ｍＭ β−メルカプトエタ ノールおよび１５％グリセロールを含む溶液に移し、１００Ｋの乾燥窒素ガス流
(Molecular Structure Corp., Houston, TX)中で、直ぐに凍結させた。

【０１２８】 データを、５０ｋＶおよび１００ｍＡで操作した、Ｒｉｇａｋｕ ＲＵ２００
回転アノード発生器(ＭＳＣ)上に乗せたＲｉｇａｋｕ Ｒ−ＡＸＩＳ IIＣホス
ホロイメージング領域ディテクターの振動写真により得た。ＨＫＬソフトウェア
パッケージを使用して測定された強度を統合し、評価し、結合させた[Z. Otwino
wski et al., Meth. Enzymol., 276, pp.307-326 (1997)]。

【０１２９】 実施例３ 整相、モデル構築および精密化 重原子位置を、差異パターソン図および変則的パターソン図から探し、差異フ
ーリエ合成により確認した。重原子パラメーターを精練し、相をプログラムＰＨ
ＡＳＥＳを使用して２.３Åまで計算した[W. Furey et al., Meth. Enzymol. 27
7, pp. 590-620, (1997)全引用が必要]。ＭＩＲ相は、ＣＣＰ４結晶学的パッケ
ージ[CCP4; C. C. Project, Acta Crystallogr., D50, pp. 760-763 (1994)]を 使用して、ヒストグラムマッチング[K. Y. J. Zhang et al., Acta Crystallogr
., A46, pp. 377-381 (1990)]と組合わせた溶媒平坦化[B. C. Wang, Methods En
zymol., 115, pp. 90-112 (1985)]のサイクルにより改良した。

【０１３０】 モデル構築は、ＱＵＡＮＴＡ９６(Molecular Simulations)を使用して行い、 全ての精密化を、自由Ｒ−値[A. T. Brunger, Nature, 355, pp. 472-475 (1992
)]を使用してＸＰＬＯＲ[A. T. Brunger, “X-PLOR; A System for X-Ray Cryst
allography and NMR,” Yale University Press, New Haven, Connecticut. (19
93)]で行い、精密化の進行を追跡した。６.０−２.２Åのデータを使用して精密
にした現モデルは、ＮＳ３ヘリカーゼ残基１９０−４１４および４１８−６２６
、ｄＵ８の残基３−８、１結合スルフェートイオンおよび１５９整列水分子から
なる。

【０１３１】 実施例４ ＮＳ３ヘリカーゼ−ｄＵ８複合体の構造特性 デオキシウリジン８量体(ｄＵ８)と複合体形成しているＨＣＶ ＮＳ３ヘリカ
ーゼの解明部分(配列番号１のＮＳ３残基１８９−６２６、ＨＣＶポリタンパク 質残基１２１５−１６５２に対応)の構造を、異常散乱と組合わせた多重同形体 置換により決定した。３つのドメインからなるタンパク質を、一連の割れ目によ
り分けた(図５)。

【０１３２】 ドメイン１および３は、ドメイン２との共有よりも、より広い界面を共有して
いる。この界面は、ドメイン１の螺旋α４上のドメイン３の螺旋α５およびα６
のパッキングによりほぼ説明される。その結果では、ドメイン１と２およびドメ
イン２と３の間の割れ目が最大である。ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインの公
開された結晶構造は、ドメイン２がドメイン１および３に対して、二つの結晶学
的に無関係な分子の比較において、剛体運動に付されることを証明する[N. Yao
et al., Nat. Struct. Biol., 4, pp. 463-467 (1997)]。異なる結晶形における
ＨＣＶヘリカーゼの予備的構造研究では、第１および第３に対するドメイン２の
回転を示し、このドメインが他の二つに柔軟に結合していることを確認する。

【０１３３】 保存ヘリカーゼ配列モチーフの全てを含むＨＣＶヘリカーゼのドメイン１およ
び２は、同様のトポロジーを有し(図６)、また４つのドメインＰｃｒＡおよびＲ
ｅｐ ＤＮＡヘリカーゼのドメイン１Ａおよび２Ａと類似である[H. S. Subrama
nya et al., Nature, 384, pp. 379-383 (1996); S. Korolev et al., Cell, 90
, pp. 635-647 (1997)]。ＰｃｒＡ、ＲｅｐおよびＨＣＶヘリカーゼの構造的に 相同なドメインは、各々α−螺旋に隣接した平行６本鎖β−シートを含む。加え
て、ＨＣＶヘリカーゼのドメイン１は、残りのシートに逆平行に走る第７のβ−
鎖を含む。

【０１３４】 ドメイン１および２の重層は、各ドメインのコア由来の７６Ｃ−アルファ原子
に関して２.０Åのｒｍｓ偏差となる。ドメイン３は、主にα−螺旋であり、逆 平行β−鎖の対によりドメイン２に結合している(図５)。ドメイン３の興味深い
コンポーネントは、第２の構造エレメントを欠くＣ−末端α−螺旋に先立つ４０
アミノ酸領域である。これは、ＮＳ３のＣ−末端が、ＨＣＶポリタンパク質処理
中のＮＳ３／ＮＳ４Ａジャンクションでの開裂を促進するために、それ自体のセ
リンプロテアーゼドメインの活性部位に到達することを可能とする。この開裂は
シスで起こると考えれている[R. Bartenschlager et al., J. Virol., 68, pp.
5045-5055 (1994)]。

【０１３５】 ドメイン１のＮ−末端領域は、全てのヘリカーゼに非常に保存的であり、ウォ
ーカーＡボックスまたはモチーフＩと呼ばれるホスフェート結合ループを含む[J
. E. Walker et al., EMBO J., 1, pp. 945-951 (1982)]。本明細書に示す構造 において、このループは結合したスルフェートイオンを含む(図７Ａ)。このホス
フェート結合ループは、多くの他のＡＴＰａｓｅで見られるものと構造的に類似
である[M. Saraste et al., Trends Biochem. Sci., 15, 430-434 (1990)]。ス ルフェートイオンはＧｌｙ−２０７およびＧｌｙ−２０９のアミド窒素由来の水
素結合、およびＳｅｒ−２０８、Ｌｙｓ−２１０およびＳｅｒ−２１１の側鎖に
より安定化される。Ｌｙｓ−２１０は、ＤＥＣＨモチーフ(モチーフIIまたはウ ォーカーモチーフＢ)の保存的Ａｓｐ−２９０への更なる水介在接触をする。

【０１３６】 ＤＥＣＨモチーフで最も保存的な残基であるＡｓｐ−２９０およびＧｌｕ−２
９１の側鎖は、結合したＭｇ²⁺−ＮＴＰ基質のＭｇ²⁺およびγ−ホスフェートに
より占領されているホスフェート結合ループの下の開放領域に向ける。Ｃｙｓ−
２９２はタンパク質内部に埋もれるが、Ｈｉｓ２９３側鎖はドメイン１と２の間
の分け目に向かう。この構造内のスルフェートの位置は、ＰｃｒＡヘリカーゼ：
ＡＤＰ複合体のＡＤＰのβ−ホスフェートのものと非常に類似であるように見え
る[H. S. Subramanya et al., Nature, (1996), 前掲]。従って、このスルフェ ートイオンは、ＮＴＰまたはＮＤＰがＨＣＶヘリカーゼに結合したときに、β−
ホスフェートの位置を占領するようである。

【０１３７】 ドメイン２由来の非常に保存的な残基Ｇｌｎ−４６０、Ａｒｇ−４６４および
Ａｒｇ−４６７は、ドメイン間割れ目において溶媒に曝されるが、一方Ａｒｇ−
４６１およびＡｒｇ−４６２はドメイン２中に埋もれ、内部塩架橋および水素結
合により安定化される。Ａｒｇ−４６１のこの位置は、この側鎖が溶媒暴露させ
たものでありこの割れ目に設計された一本鎖核酸のホスフェートバックボーンと
相互作用すると報告されている、ａｐｏ ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼの構造に記
載されたものと対照的である[N. Yao et al., Nat. Struct. Biol., (1997), 前
掲]。

【０１３８】 タンパク質−一本鎖ＤＮＡ相互作用 ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ一本鎖核酸結合の研究は、ポリ(ｄＵ)が、同じ長さ
のポリ(ｒＵ)よりも高い親和性でヘリカーゼに結合することを証明している[F.
Preugschat et al., J. Biol. Chem., 271 (1996), 前掲]。このデータの外挿は
、デオキシオリゴヌクレオチド８量体が、高い親和性でヘリカーゼに結合するの
に十分であり、結晶化中にタンパク質−タンパク質接触により干渉されないらし
いことを示す。従って、オリゴｄＵ８を複合体結晶化に使用した。本明細書に示
す構造において、オリゴヌクレオチドの最初の二つの残基は不規則であり、本モ
デルに包含されていない。第３のヌクレオチドの糖−ホスフェートバックボーン
は電子密度地図(図７Ｂ)に十分示されるが、塩基の密度は非常に弱い。残基４−
８の電子密度は糖−ホスフェート骨格に関して十分定義されており、塩基のより
も僅かに弱い。ｄＵ₁₀およびｄＵ₁₂オリゴヌクレオチドでの先の研究は、ＤＮＡ
に関して本質的に同じ電子密度であることを示す。

【０１３９】 結合した一本鎖ＤＮＡ(“ｓｓＤＮＡ”)は、直径約１６オングストロームの溝
に位置し、これがドメイン１と２からドメイン３を分ける(図１０)。オリゴヌク
レオチドの５'末端は、ドメイン２と３の界面およびドメイン１と３のその３'末
端の界面に存在する。このＤＮＡの配向は、ｓｓＲＮＡがドメイン１と２の間の
割れ目に置かれたａｐｏ ＨＣＶヘリカーゼ構造由来のモデルのｓｓＲＮＡのも
のと、大まかに、垂直である[N. Yao et al., Nat. Struct. Biol., (1997), 前
掲]。これは、しかし、Ｒｅｐヘリカーゼ：ＤＮＡ構造のオリゴヌクレオチド結 合部位と一致する[S. Korolev et al., Cell, (1997), 前掲]。

【０１４０】 ｓｓＤＮＡと酵素の間の相互作用は、非特異的タンパク質−核酸複合体に関し
て予期されるように、ＤＮＡバックボーンに殆ど限定され、オリゴヌクレオチド
の二つの末端で凝集されている。タンパク質接触は、殆どドメイン１と２の第２
の構造エレメントの間のループから出る(図６Ａ、Ｂ)。興味深いことに、これら
の接触はこれら二つのドメインの対称的な同等な残基から発生し、ｄＵ４および
ｄＵ５バックボーンホスフェートに接触したタンパク質が、ｄＵ７およびｄＵ８
ホスフェートへのものと殆ど同一である。

【０１４１】 ＤＮＡの３'末端において、ｄＵ８ホスフェートが、次ぎにＬｙｓ−２７２の バックボーンＮＨ由来の水素結合を受け入れるＴｈｒ−２６９ Ｏγとの水素結
合により、およびＧｌｙ−２５５のバックボーンＮＨに結合する水素結合により
安定化される。ｄＵ５ホスフェートへの同等の接触がＡｒｇ−３９３バックボー
ンＮＨおよびＴｈｒ−４１１ Ｏγにより形成され、これはＡｌａ−４１３ Ｎ
Ｈからの水素結合を受け入れる。ｄＵ７ホスフェートは、Ｖａｌ−２３２ ＮＨ
からの水素結合を受け入れ、Ａｌａ−２３３ ＮＨおよびＳｅｒ−２３１ Ｏγ
と架橋水分子を介して相互作用する。直接および水介在バックボーン相互作用は
、Ｌｙｓ−３７１およびＬｙｓ−３７２によりドメイン２からｄＵ４まで２倍に
される。ドメイン２でＳｅｒ−２３１に同等な残基であるＳｅｒ−３７０は、ｄ
Ｕ４よりもむしろｄＵ３ホスフェートへの水介在接触をする。ＨＣＶヘリカーゼ
のドメイン１および２の重層は、ホスフェート接触に関与する残基が構造的に同
等であることを確認する(図６)。これは、これらの二つのドメインの乏しい配列
相同性を基本にして予期されない発見であった。更に、ホスフェートバックボー
ンと相互作用する４つの残基、Ｓｅｒ−２３１、Ｔｈｒ−２６９、Ｓｅｒ−３７
０およびＴｈｒ−４１１は今日まで既知の全てのＨＣＶ ＮＳ３配列で保存され
ている。これらの発見は、これらの二つのドメインが遺伝子重複事象に起因し得
ることを示す。

【０１４２】 残基ｄＵ４−ｄＵ８は各末端での疎水性側鎖との相互作用により覆われている
。Ｔｒｐ−５０１はｄＵ８の塩基と積み重なっているが、一方Ｖａｌ−４３２は
ｄＵ４塩基と相互作用する(図１０)。これらの二つの側鎖は、ブックエンドの対
として作用し、５ヌクレオチドにより占領された中心結合空洞を定義する。Ｖａ
ｌ−４３２およびＴｒｐ−５０１は、ＨＣＶ ＮＳ３配列で非常に保存的である
が、核酸結合または二本鎖巻き戻しにも包含されない。Ｖａｌ−４３２：ｄＵ４
塩基相互作用は、塩基が完全に重積しないように、ｄＵ３とｄＵ４の間のホスフ
ェート骨格に関する明らかな回転を誘導する(図１０)。Ｔｒｐ−５０１とｄＵ８
塩基の重積は、同様に続くヌクレオチドのホスフェートに関する大きな回転が同
様に必要である。得られるＤＮＡの配座は、中心結合空洞の中心の外に位置する
ドメイン１由来のＡｒｇ−２５３およびＬｙｓ−２７２およびドメイン２由来の
Ｌｙｓ−３７２およびＬｙｓ−３７３との相互作用により安定化される。

【０１４３】 ドメイン２は、オリゴヌクレオチドの５'末端の結合に関与する、残基４３０ −４５２を含む伸びた逆平行鎖の対を含む(図５)。他の二つの一本鎖ポリヌクレ
オチド結合タンパク質、ＳＳＢおよびｔＲＮＡシンセターゼは、核酸結合部位を
形成すると考えられるそれらのタンパク質コアから伸びる逆平行鎖を含む[S. Ra
ghunathan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, pp. 6652-6657 (1997);
M. Ruff et al., Science, 252, pp. 1682-1689 (1991)]。この領域は、本クラ スの核酸結合タンパク質ではＬ₄₅ループと呼ばれる。ＨＣＶヘリカーゼ構造にお
いて、複製プロテインＡ(ＲＰＡ)で見られるのと大まかに同じ方法で、二つのタ
ンパク質ドメインを繋ぐ溝に結合する[A. Bochkarev et al., Nature, 385, pp.
176-181 (1997)]。両方の構造において、オリゴヌクレオチドは最も密接に３' および５'末端で、中心ヌクレオチドと数個の接触で結合する。ＲＰＡはまたＬ_{4 5} ループを含み、それはオリゴヌクレオチドの５'末端に結合する。

【０１４４】 ＨＣＶヘリカーゼの中心結合空洞を占領する５個の残基は、ＴＢＰ−ＴＡＴＡ
ボックス複合体構造のＤＮＡの中心塩基対の立体懐古(reminiscent)を取る[Y. K
im et al., Nature, 365, pp. 512-520 (1993); J. L. Kim et al., Nature, 36
5, pp. 520-527 (1993)]。両方の場合、ＤＮＡは相対的にアンダーウォンド(und
erwound)であり、バックボーンは滑らかに曲がっており、塩基の端を圧縮する。
本明細書のＤＮＡ構造と、ＴＡＴＡボックスＤＮＡの中心ピリミジン構造伸張の
比較は、本ＤＮＡが、ＴＢＰ−ＴＡＴＡボックス複合体で見られるよりも、より
アンダーウォンドであることを確認する。

【０１４５】 我々のヘリカーゼ：ｄＵ８複合体の構造は、なぜ酵素が、他のホモポリマーＤ
ＮＡｓよりも高い親和性でポリ(ｄＵ)に結合するかという簡単な説明を提供しな
い[F. Preugschat et al., J. Biol. Chem., 271 (1996), 前掲]。ＤＮＡ塩基と
の配列特異的相互作用は、ヘリカーゼの中心結合空洞では観察されていない。こ
の場合の異なる配列間のＤＮＡ結合親和性における差異は、塩基特異的水素結合
パターンよりむしろＤＮＡ湾曲および塩基の積み重なりのエネルギーの差の結果
であり得る。

【０１４６】 保存的配列モチーフの位置 ＮＳ３ ＲＮＡヘリカーゼドメインにおいて、種々のＨＣＶ株の間で、４５６
アミノ酸ポリペプチドにわたり＞８０％配列同一性の非常に高い配列保存性が存
在する。これらのドメインで最も高い保存セグメントは、標準的ヘリカーゼ配列
モチーフに対応する(図８、９Ａ)[A. Gorbalenya et al., Curr. Opin. Struct.
Biol., 3, pp. 419-429 (1993)]。三次元構造において、これらのモチーフ由来
の残基は、最初の二つのドメインの間に界面を形成する(図９Ｂ)。Bacillus ste
arothermophilus由来のＰｃｒＡ ＤＮＡヘリカーゼ[H. S. Subramanya et al.,
Nature, (1996), 前掲]およびE. coli Rep DNAヘリカーゼ[S. Korelev et al.,
Cell (1997), 前掲；対応は利用可能ではない]の構造の可視的試験は、これら のＤＮＡヘリカーゼのドメイン１Ａおよび２ＡならびにＨＣＶヘリカーゼのドメ
イン１および２の間の全ての構造類似性を示す。ＨＣＶヘリカーゼのものと重な
る保存ＤＮＡヘリカーゼ配列モチーフの位置は、これらのモチーフの明白なアラ
インメントを可能にする。ＨＣＶヘリカーゼまたは他のＲＮＡヘリカーゼにおけ
るこれらのモチーフ内の個々の残基の変異は、それらが酵素活性に必須であるこ
とを証明している。これらの変異体の個々の表現型は、酵素構造を使用して、以
下に更に完全に説明できる。

【０１４７】 ＨＣＶヘリカーゼのドメイン１は、アデニレートおよびチミジンキナーゼのよ
うなアデノシントリホスフェートトランスホスホリラーゼの多くに見られるのと
同様の折りたたみを有する。特に、モチーフＩ(ＧＳＧＫＴ)により形成されるホ
スフェート結合ループは、キナーゼの対応するループと実質的に同一である。こ
れらのキナーゼにおいて、本ループはＡＴＰのβホスフェートの結合に関与する
。ＨＣＶヘリカーゼはこの正確な位置にスルフェート結合を有する(図７Ａ)。他
のヘリカーゼのＨＣＶヘリカーゼＬｙｓ−２１０に対応する残基の変異は、常に
不活性化を導く[J. W. George et al., J. Mol. Biol., 235, 424-435 (1994);
T. W. Seeley et al., J. Biol. Chem., 265, pp. 7158-7165 (1990)]。

【０１４８】 モチーフII(ＤＥｘＨ)は、ＧＳＧＫＴホスフェート結合ループに近接し、Ｍｇ ²⁺ −ＡＴＰ基質の結合に関与すると考えれる。アデニレートおよびチミジンキナ
ーゼにおいて、保存的アスパルテートはＭｇ²⁺を結合し、これはＡＴＰの求核性
攻撃への志向を助ける[M. E. Black et al., J. Biol. Chem., 267, pp. 6801-6
806 (1992); H. G. Yan et al., Biochemistry, 30, pp. 5539-5546 (1991)]。 これらのキナーゼまたは他のヘリカーゼにおける同等なアスパルテート残基の変
異は、ＡＴＰ加水分解を不活性化する[M. E. Black et al., J. Biol. Chem., (
1992), 前掲; C. H. Gross et al., J. Virol., 69, pp. 4727-4736 (1995); R.
M. Brosh Jr., et al., J. Bacteriol., 177, pp. 5612-562 (1995); A. Pause
et al., EMBO J., 11, pp. 5643-2654 (1992)]。Ｈｉｓ−２９３はドメイン間 割れ目の底に位置し、Ｖａｌ−４５６およびＧｌｎ−４６０から約４Å離れてい
る。このヒスチジンはＡＴＰａｓｅ活性とポリヌクレオチド結合が合わさるのに
必須であるように見える；ＨＣＶ ＮＳ３およびワクシニアＮＰＨ−IIヘリカー
ゼにおけるこのヒスチジンの変異は、ヘリカーゼ活性を有しない機能的ＡＰＴａ
ｓｅをもたらす[C. H. Gross et al., J. Virol., (1995), 前掲; G. M. Heilek
et al., J. Virol., 71, 6264-6266 (1997)]。不幸なことに、本明細書に提示 の構造は、なぜこの残基がＮＴＰａｓｅと巻き戻し活性を組合わせるかの明白な
説明をしない。

【０１４９】 数個のヘリカーゼでの研究は、モチーフＶＩ(ＱＲｘＧＲｘＧＲ)における変異
の作用を調べたが、まだこのモチーフの役割は明白に定義されていない。ＨＣＶ
ヘリカーゼにおいて、本モチーフの残基は１：２ドメイン間割れ目に位置する。
Ｇｌｎ−４６０はＨｉｓ−２９３と逆の割れ目の底に位置する。ワクシニアウイ
ルスヘリカーゼおよびｅＩＦ−４Ａにおける対応するグルタミンの変異は、ＡＴ
Ｐａｓｅ活性の有意な減少をもたらす[A. Pause et al., EMBO J., (1992), 前 掲；C. H. Gross et al., J. Virol., 70, pp. 1706-1716 (1996)]。ドメイン１
と２の間の割れ目における一本鎖RNAの結合に関与する、N. Yao et al., Nat. S
truct. Biol. (1997), 前掲に提案された、モチーフVI中の３つの保存的アルギ ニンが存在する。ヘリカーゼ：ｄＵ８複合体の我々の構造は、この解釈が正しく
なさそうであることを証明する。

【０１５０】 次ぎに、Ａｒｇ−４６１は、割れ目から遠くに向かい、Ａｓｐ−４１２および
Ａｓｐ−４２７と水素結合する。ワクシニアウイルスヘリカーゼにおける本残基
の変異は、おそらくポリヌクレオチド結合溝に並ぶＡｓｐ−４１２の構造の置換
の結果として、ＲＮＡ結合の減少をもたらす[C. H. Gross et al., J. Virol.,
(1996), 前掲]。アルギニン４６４および４６７は、ドメイン間割れ目まで伸び 、直接ＡＴＰのγおよびαホスフェートの仮定される位置を横切る。これらの残
基は、このドメイン間割れ目の閉鎖により、ＡＴＰホスフェートの接触と釣り合
うと考えられる。これは、アデニレートキナーゼの第２ドメインの保存的塩基性
残基の機能と類似である。

【０１５１】 Ａｒｇ−４６４およびＡｒｇ−４６７が直接ＡＴＰ結合に関与するという可能
性と一致して、ワクシニアＮＰＨ−IIまたはｅＩＦ−４Ａにおける対応する残基
のＡｌａまたはＧｌｎへの変異は、野性型レベルの＜２０％まで、ＡＴＰａｓｅ
活性を減少する[C. H. Gross et al., J. Virol., (1996), 前掲; A. Pause et
al., Mol. Cell, Biol., 13, pp. 6789-6798 (1993)]。Arg−467は、全ての３つ
のヘリカーゼスーパーファミリーで保存的であると考えられる(図９Ａ)[A. Gorb
alenya et al., Curr. Opin. Struct. Biol. (1993), 前掲]。

【０１５２】 モチーフIIIはドメイン１と２を接続し、柔軟なリンカーであると考えられる[
N. Yao et al., Nat. Struct. Biol. (1997), 前掲]。モチーフＩａはドメイン １のコアのβシートの部分を形成するが、またオリゴヌクレオチドに伸びる。モ
チーフＶの残基は両方オリゴヌクレオチドと接触し、最初の二つのドメインの間
の界面に並ぶ。特に、Ｔｈｒ−４１１はオリゴヌクレオチドのｄＵ３のホスフェ
ートへ水素結合を形成する。

【０１５３】 現在の構造は、ヘリカーゼのスーパーファミリーＩクラスのメンバーであるＲ
ｅｐおよびＰｃｒＡヘリカーゼのモチーフIVに対応する領域を欠く[H. S. Subra
manya et al., Nature (1996), 前掲; S. Korolev et al., Cell, (1997), 前掲
]。モチーフIV内でスーパーファミリーＩとIIヘリカーゼの間の類似性が見られ た先の配列アラインメントは、むしろ弱い特徴であり、重要でない可能性があっ
た。ＤＮＡヘリカーゼにおいて、モチーフIVはＡＴＰのアデニン環の結合を担う
[H. S. Subramanya et al., Nature (1996), 前掲; S. Korolev et al., Cell,
(1997), 前掲]。ＵｖｒＤにおける本モチーフの保存的アルギニンの変異は、３ ７倍までＡＴＰ Ｋｍを増加させる[M. C. Hall et al., J. Biol. Chem., 272,
pp. 18614-18620 (1997)]。

【０１５４】 ＨＣＶヘリカーゼにおいて、現在の構造にはない他のタンパク質セグメントが
、モチーフIVまたはどこかのアデノシン環結合を置換する。ＨＣＶヘリカーゼに
おける推定のモチーフIV由来の残基は、Ｓｅｒ−３７０およびＬｙｓ−３７１を
含み、これは各々水介在水素結合およびバックボーン相互作用を介してＤＮＡと
接触する。従って、スーパーファミリーＩおよびスーパーファミリーIIヘリカー
ゼにおけるモチーフIVに対応する配列は、異なる領域を占領し、異なる機能を有
するように見える。我々は、IVａと命名した新規モチーフを推定ＨＣＶヘリカー
ゼモチーフIVに対応する残基を記載するのに使用することを示す。Ｅ. ｃｏｌ ｉ ＵｖｒＤにおいて、モチーフIVａは配列ＲＳＮＡＱＳＲＶＬ(残基３５５− ３６３)に対応し得る。

【０１５５】 提案されたドメイン閉鎖および転座 モチーフＶＩ由来の保存的塩基性残基は、ＨＣＶヘリカーゼにおけるＡＴＰγ
ホスフェートに予期される位置から、ドメイン間割れ目を横切って位置する。非
常に類似の状況が、アデニレートキナーゼの構造で観察され、塩基性残基はＡＴ
Ｐ結合部位からの割れ目を横切って位置する。これらのキナーゼへのＡＴＰ(ま たはアナログ)の結合は、酵素の配座変化を導き、先に溶媒に曝されたホスフェ ートの埋没をもたらす[T. Bilderback et al., Biochemistry, 35, pp. 6100-61
06 (1996)]。アデニレートキナーゼのこれらの保存的塩基性残基の変異は、触媒
活性が乏しい開放構造をもたらす[G. E. Schulz, Faraday Discuss., 93, pp. 8
5-93 (1992)]。

【０１５６】 我々は、類似の閉鎖が、ＡＴＰ結合により、ＨＣＶヘリカーゼのドメイン１と
２の間で起こることを提案する。この閉鎖は、モチーフＶＩ中の塩基性残基とＡ
ＴＰホスフェートの相互作用によりもたらされる。スーパーファミリーＩおよび
IIヘリカーゼでのモチーフＶＩ中のこれらの塩基性残基の配列および構造的保存
は、ＡＴＰ結合により閉鎖するドメインがこれらの酵素の一般的特性であること
を示す。

【０１５７】 各々モチーフＶＩおよびII由来のＧｌｎ−４６０およびＨｉｓ−２９３は、ド
メイン間割れ目の逆側に位置し、恐らくポリヌクレオチドの結合に基づいた開放
および閉鎖形の間の平衡を変え、門番として働く。これらの位置での残基の相互
作用の可能性は、ＤＥｘＨモチーフII配列を有するヘリカーゼが、通常モチーフ
ＶＩにグルタミンを含むが、ＤＥＡＤ配列を有するものはヒスチジンを含むとい
う観察により予測される[A. Gorbalenya et al., Curr. Opin. Struct. Biol. (
1993), 前掲]。

【０１５８】 ＨＣＶヘリカーゼの第２ドメインと残りのタンパク質への結合が柔軟性である
という構造的証拠がある。N. Yao et al., Nat. Struct. Biol. (1997), 前掲に
より報告されたＨＣＶヘリカーゼ構造において、非対称単位内の二つの分子の間
の差異は、数度までのドメイン２の回転によりもたらされ得る。ドメイン２の、
その構造で観察される小さい移動は、おそらく結晶における局所環境の変化を反
映する。我々は、酵素がＡＴＰまたは適当なアナログと結合したとき、より実質
的な配座変化が起こることを提案する。我々の結晶学的結果は、異なる結晶形に
おいて、本ドメインの明白な移動があることを示す。配座変化は、急速な最初の
結合に続いてより遅い段階となり、密接な結合をもたらす、Ｒｅｐに結合したＡ
ＴＰの観察される２段階動態を説明する[K. J. Moore et al., Biochemistry, 3
3, pp. 14550-14564 (1994)]。配座変化の証拠は、ＲｅｐおよびヘリカーゼIIで
、ヌクレオチド結合によるプロテアーゼ感受性の変化に基づいて観察されている
[K. Chao et al., J. Biol. Chem., 265, pp. 1067-1076 (1990)]。ＡＴＰのＰ ｃｒＡヘリカーゼへの結合は、また酵素の配座変化をもたらすと提案されている
[H. S. Subramanya et al., Nature (1996), 前掲]。

【０１５９】 ＤＮＡ代謝酵素における大きな配座変化は、ＧＴＰ存在下のｍＲＮＡキャッピ
ング酵素の構造でも見られるように、独特ではない[K. Hakansson et al., Cell
, 89, pp. 545-553 (1997)]。これらの構造において、グアノシンヌクレオチド は、Ｃ−末端ドメインとの界面の近くに位置するホスフェートでＮ−末端ドメイ
ンに結合する。“開放”配座において、これらのドメインは１０−１３Å割れ目
により分けられる。ｍＲＮＡキャッピング酵素で非常に保存的な数個の残基が、
Ｃ−末端ドメインに位置し、Ａｒｇ−２９５およびＡｒｇ−２９８を含む。

【０１６０】 “閉鎖”配座において、これらの残基は約１０Åまでに再配置され、ＧＴＰβ
およびγホスフェートと結合する。大きなドメイン間割れ目の閉鎖は、また構造
的に相同の、一つの構造が開放配座と解釈されているＡＴＰ−依存的ＤＮＡでも
提案されている[H. S. Subramanya et al., Cell, 85, pp. 607-615 (1996)]。

【０１６１】 ＨＣＶヘリカーゼの第２ドメインはまた一本鎖ポリヌクレオチドと相互作用す
る。このドメインの移動が、タンパク質に比例して核酸基質の同時の移動をもた
らすことを想像する。Ｖａｌ−４３２およびＴｈｒ−４４８のようなドメイン２
の残基と一本鎖核酸結合部位の５'末端の塩基の相互作用は、ドメイン２閉鎖の ような５'から３'方向でのポリヌクレオチドの転座を導く。

【０１６２】 ドメイン３のＴｒｐ−５０１は、一本鎖オリゴヌクレオチドの３'末端近くの 塩基と積み重なり、近くの塩基との積み重なりを中断させる。ドメイン間割れ目
の閉鎖は、数個の塩基がＴｒｐ−５０１を通りすぎるようにする。ＡＴＰの加水
分解は、次いで、割れ目の開放とＡＤＰの放出をもたらす。Ｔｒｐ−５０１の配
向は、割れ目の開放が、３'から５'方向でのドメイン２の正味の移動をもたらす
ように、ポリヌクレオチドの５'から３'方向のみの移動を助力する。この機構に
より、ヘリカーゼの転座反応は、つめ車装置に似ている。一般的なつめ車様機構
は、プロテアーゼマッピングにより観察される配座変化に基づいたＲｅｃＢヘリ
カーゼで提案されている[R. J. Phillips et al., Mol. Gen. Genet., 254, pp.
319-329 (1997)]。

【０１６３】 このようなモデルは、一つのＡＴＰ加水分解事象が、ポリヌクレオチド伝いに
数個の塩基のタンパク質転座をもたらし得ることを示す。ＵｖｒＤ ＤＮＡヘリ
カーゼでの実験は、酵素が反応サイクル当り１個以上の塩基を転座できることを
証明しているが[J. A. Ali et al., Science, 275, pp. 377-380 (1997)]、観察
された反応サイクル当りのATP加水分解事象の数は本実験では未知であった。我 々のモデルは、ヘリカーゼが二本鎖基質を能動的に巻き戻す必要がないが、分岐
点で熱変動により発生する一本鎖領域の捕獲により機能できるという予測と一致
する[Y. Z. Chen et al., J. Biomol. Struct. Dyn., 10, pp. 415-427 (1992)]
。本明細書で提案されている転座法は、従って、分岐点での二本鎖構造の融解が
受動的であるが、能動的方法と見なされる。

【０１６４】 我々が提案する機構は、WongおよびLohman[I. Wong et al., Science, 256, p
p. 350-355 (1992)]および一本鎖ＤＮＡに結合するＲｅｐの３.０および３.２Å
構造を記載する[S. Korolev et al., Cell (1997), 前掲]最近雑誌に提出された
Ｒｅｐヘリカーゼに関する記載と実質的に異なる。我々が先に記したように、Ｈ
ＣＶヘリカーゼのドメイン１と２およびＲｅｐのドメイン１Ａと２Ａの間に全体
的構造類似性が存在する。我々の提案した機構に重要なのは、これらの二つのド
メインが図９Ａに記載したＤＮＡ／ＲＮＡヘリカーゼ配列で保存的な全てのモチ
ーフを含む。ＨＣＶヘリカーゼにおいて、能動的回転機構で重要な役割を有する
と提案されているＲｅｐドメイン２Ｂの構造的相同物がない[S. Korolev et al.
, Cell (1997), 前掲]。

【０１６５】 実施例５ アッセイ Ａ．ヘリカーゼアッセイ 標準３'−末端で終わった二本鎖ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを下記のように 製造した。長い９８−ヌクレオチド(“ｎｔ”)ＲＮＡ鋳型をＢｓｒＢｉ−消化プ
ラスミドｐＳＰ６５(Promega, Madison, WI)から、[α−³²Ｐ−ＧＴＰ](New Eng
land Nuclear, Boston, MA)存在下で転写した。短い３４−ｎｔ ＤＮＡはＢａ ｍＨＩ−消化ｐＳＰ６４(Promega)由来のＳＰ６ ＲＮＡ転写物に対応する鎖を 放出する。

【０１６６】 標準ヘリカーゼ反応(２０μｌ)は、下記のように行った。ＨＣＶ ＮＳ３ヘリ
カーゼ(０.３または１ｎＭ)を、２５ｍＭモルホリンプロパンスルホン酸(ＭＯＰ
Ｓ)−ＮａＯＨ(ｐＨ６.５)、１ｍＭ ＡＴＰ、０.５ｍＭ ＭｎＣｌ₂、２ｍＭジ
チオスレイトール(ＤＴＴ)、１ｍｌ当り０.１Ｍｇウシ血清アルブミン(ＢＳＡ) 、４単位のＲＮａｓｉｎ(Promega)、および５ｎＭの３'末端で終わった二本鎖Ｒ
ＮＡ／ＤＮＡハイブリッド基質の混合物に添加した。混合物を２０分、３７℃で
インキュベートし、５リットルの５×充填緩衝液[１００ｍＭ トリス−Ｃｌ(ｐ
Ｈ７.５)、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０％グリセロール、０.５％ ＳＤＳ、０.１
％ ＮＰ−４０、０.１％ブロモフェノールブルーおよび０.１％キシレンシアノ
ール]の添加により停止した。次いで、反応物を、０.５×ＴＢＥおよび０.１％ ＳＤＳ添加１０％ＰＡＧＥで電気泳動した。ゲルを乾燥させ、Ｆｕｊｉ １５０
０ホスホロイメージャー(Fuji, Stamford, CT)を使用して露光させた。ヘリカー
ゼ活性を二本鎖基質および一本鎖鋳型での放射活性により測定した。

【０１６７】 第１に、我々は精製野性型ＮＳ３ヘリカーゼドメインタンパク質の巻き戻し活
性を、以下のパラメーターに関して特徴付けした：タンパク質濃度、インキュベ
ーション時間経過、インキュベーション温度、ＡＴＰ濃度、ｐＨ、１価カチオン
(Ｎａ⁺)および２価カチオン(Ｍｎ²⁺およびＭｇ²⁺)(図１１)。

【０１６８】 ヘリカーゼ巻き戻し活性は、タンパク質濃度またはインキュベーション時間の
増加につれて増加した(図１１Ａ)。ＮＳ３ヘリカーゼ０.１ｎＭでは、反応は３ ０分までのインキュベーション時間に関して殆ど直線であった(図１１Ａ)。同じ
クロマトグラフィー法により精製された数個のＮＳ３ヘリカーゼ変異体は巻き戻
し活性を示さず(下記表１および図６参照)、ここで示される巻き戻し活性がＥ. ｃｏｌｉ由来の不純タンパク質ではなく、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼによるも
のであることを示す。

【０１６９】 高いインキュベーション温度はまた、恐らく高い温度で二つの鎖の間の水素結
合の破壊に必要な低いエネルギーのために、基質のより急速な巻き戻しを導く( 図１１Ｂ)。本ＮＳ３ヘリカーゼドメインの巻き戻し活性は、ｐＨ６.５で最適で
あり、活性であるのは非常に狭いｐＨ域であった(図１１Ｃ)。

【０１７０】 加えて、巻き戻し活性はＮａ⁺のような１価カチオンに非常に感受性であった(
図１１Ｄ)。２５ｍＭ ＮａＣｌの添加は、余分なＮａＣｌが無いときの約１５ ％に巻き戻し活性を減少させた。

【０１７１】 このヘリカーゼ活性は、ＡＴＰ(図１１Ｅ)または他のタイプのヌクレオチドト
リホスフェート(ＮＴＰ)(データは示していない)の存在に完全に依存していた。
巻き戻し活性は、ＡＴＰの濃度が１ｍＭまで上昇するにつれ、殆ど直線的に上昇
した(図１１Ｅ)。しかし、５ｍＭのＡＴＰで、巻き戻し活性は、恐らくＡＴＰに
よりもたらされる余分なＮａ⁺のために、１ｍＭのＡＴＰよりも低い。

【０１７２】 ヘリカーゼ活性はまたＭｎ²⁺またはＭｇ²⁺のような２価カチオンの存在も完全
に必要とする(図１１Ｆ)。しかし、２価カチオンの濃度がＡＴＰよりも高い場合
、ヘリカーゼ活性の阻害が観察された。ＡＴＰと２価カチオンの同等な濃度(１ ｍＭまたは５ｍＭ)で、Ｍｎ²⁺はＭｇ²⁺より高い巻き戻し活性を示した(図１１Ｆ
)。

【０１７３】 Ｂ．一本鎖ＲＮＡ結合アッセイ 一本鎖ＲＮＡ(“ｓｓＲＮＡ”)のＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼへの結合を、ニト
ロセルロースフィルター結合アッセイで測定した。３４−ｎｔ ＲＮＡ転写物を
、[α−³²Ｐ−ＧＴＰ]存在下でＳＰ６ ＲＮＡを使用して、ＢａｍＨＩ−消化ｐ
ＳＰ６４プラスミドから産生した。標準ｓｓＲＮＡ結合反応(４０μｌ)を下記の
ように行った。

【０１７４】 ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼドメインタンパク質(６.２５ｎＭ)を、２５ｍＭモ ルホリンプロパンスルホン酸(ＭＯＰＳ)−ＮａＯＨ(ｐＨ７.０)、２ｍＭジチオ スレイトール(ＤＴＴ)、１ｍｌ当り０.１ｍｇのウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、 ４単位のＲＮａｓｉｎ(Promega)および５ｎＭの[³²Ｐ]−ｓｓＲＮＡ基質の混合 物に添加した。混合物を１５分、３０℃でインキュベートし、予め湿らせたニト
ロセルロース膜で濾過した。フィルターを２回洗浄緩衝液[５０ｍＭ ＭＯＰＳ −ＮａＯＨ(ｐＨ７.０)および１ｍＭ ＥＤＴＡ]で洗浄し、乾燥させ、シンチレ
ーションカウンターで定量した。

【０１７５】 次ぎに、我々はフィルター結合アッセイを使用して、精製ＮＳ３ヘリカーゼに
結合するｓｓＲＮＡの数個のパラメーターを測定する(図１２)。³²Ｐ−標識ｓｓ
ＲＮＡのＮＳ３ヘリカーゼへの会合は非常に速く、通常数分のインキュベーショ
ンで殆ど完了する(データは示していない)。図１２Ａに示すように、ｓｓＲＮＡ
のＮＳ３ヘリカーゼへの結合はタンパク質濃度依存的である。８ｎＭのＮＳ３ヘ
リカーゼ下で、ｓｓＲＮＡ結合の量はタンパク質濃度の直線関数であり(図１２ Ａ、挿入)、反応に存在するＮＳ３ヘリカーゼの分子毎に０.４４５分子のｓｓＲ
ＮＡの結合が存在する。本反応で達成されるｓｓＲＮＡ結合の最大量は、約９４
％である。ｓｓＲＮＡ−ＮＳ３ヘリカーゼ複合体は５.１８ｎＭと計算され、そ の点でｓｓＲＮＡのＮＳ３ヘリカーゼドメインへの最大結合の５０％が観察され
た。

【０１７６】 我々はまた前もって形成されたｓｓＲＮＡ−ＮＳ３ヘリカーゼ複合体の解離速
度定数も測定した(図１２Ｂ)。この場合に、³²Ｐ−標識ｓｓＲＮＡをＮＳ３ヘリ
カーゼタンパク質とインキュベートし、１５分、共にインキュベートして³²Ｐ−
ｓｓＲＮＡ−ＮＳ３ヘリカーゼ複合体の形成をさせた。次いで、５０倍過剰の同
じ配列を有する³Ｈ−標識ｓｓＲＮＡを反応に添加し、ＮＳ３ヘリカーゼとの複 合体から解離した³²Ｐ−標識ｓｓＲＮＡが、再びＮＳ３タンパク質と再会合する
機会を非常に少なくした。解離速度は、１.５２×１０^-2分と決定された。

【０１７７】 我々は、またｐＨ、１価(Ｎａ⁺)および２価(Ｍｎ²⁺)カチオンの、ＮＳ３ヘリ カーゼのｓｓＲＮＡ結合への作用も試験した。巻き戻し活性と対称的に、ＮＳ３
ヘリカーゼのｓｓＲＮＡ結合は、ｐＨ変化にあまり感受性でない(図１２Ｃ)。最
適結合はｐＨ７.０で観察されるが、ｓｓＲＮＡ結合はｐＨ６.５から８.０の間 で有意な変化はない。ＮａＣｌ(図１２Ｄ)およびＭｇＣｌ₂(図１２Ｅ)は、ｓｓ ＲＮＡ結合に阻害作用を有したが、塩濃度の関数としてのこの阻害曲線は巻き戻
し活性のものほど鮮明ではない。

【０１７８】 Ｃ．ＡＴＰａｓｅアッセイ ＡＴＰａｓｅをＡＴＰからＡＤＰへの加水分解により、薄層クロマトグラフィ
ー法を使用して測定した[J. K. Tamura et al., Virology, 193, pp. 1-10 (199
3)]。標準ｓｓＲＮＡ結合反応(１０μｌ)を、下記のように行った。ＨＣＶ Ｎ Ｓ３ヘリカーゼドメインタンパク質(２ｎＭ)を、５０ｍＭモルホリンプロパンス
ルホン酸(ＭＯＰＳ)−ＮａＯＨ(ｐＨ７.０)、０.１ｍＭ ＡＴＰ、２.５μＣｉ の[α−³²Ｐ−ＡＴＰ](ＮＥＮ)、０.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭジチオスレイト
ール(ＤＴＴ)、１ｍｌ当り０.１ｍｇのウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)の混合物に 、５μＭポリＵ(ウリジン濃縮物)(Pharmacia)存在下または非存在下に添加した 。混合物を３０分、３７℃でインキュベートし、最終濃度２０ｍＭのＥＤＴＡの
添加により停止させた。反応物０.５μｌをポリエチレンイミン−セルロースプ レートにスポットし、ＡＴＰおよびＡＤＰを３７５ｍＭリン酸カリウム(ｐＨ３.
５)で分離し、Ｆｕｊｉホスホロイメージャーで定量した。

【０１７９】 精製ＮＳ３ヘリカーゼのＡＴＰａｓｅ活性を、本方法を使用して試験した。図
１３に示されるように、本ＮＳ３ヘリカーゼドメインは、ポリヌクレオチド非存
在下で基底ＡＴＰａｓｅ活性を有し、ＡＴＰａｓｅ活性はポリ(Ｕ)の存在下で１
１倍まで刺激された。ポリヌクレオチドによるＡＴＰａｓｅ刺激の順番はポリ( Ｕ)＞ポリ(Ｃ)＞ポリ(Ａ)＞ポリ(Ｇ)である(データは示していない)。

【０１８０】 実施例６ ＮＳ３ヘリカーゼのＲＮＡ結合残基の構造ベースの変異誘発研究 変異誘発実験は、複合体の結晶構造を基本にして、ＮＳ３ヘリカーゼ：オリゴ
ヌクレオチド相互作用に重要であると予測された数個の残基の役割の試験のため
に行った。 Ｓｅｒ２３１、Ｔｈｒ２６９、Ｓｅｒ３７０およびＴｈｒ４１１は結合したオ
リゴヌクレオチドのホスフェート基と直接水介在水素結合を形成した。我々はこ
れらのアミノ酸の一つずつを個々にアラニンに置換し(実施例１参照)、種々のヘ
リカーゼ活性におけるこれらの変異の作用を観察した。Ｓｅｒ２３１またはＳｅ
ｒ３７０のアラニン置換は、基底またはポリＵ刺激ＡＴＰａｓｅ活性、巻き戻し
活性またはｓｓＲＮＡ結合活性に、野性型ヘリカーゼと比較して、観察される作
用を有しなかった(下記表１参照)。従って、これらのアミノ酸がＮＳ３ヘリカー
ゼのオリゴヌクレオチド結合ポケットの定義に必須でないと結論付けた。

【０１８１】 比較して、Ｔｈｒ２６９またはＴｈｒ４１１でのアラニン置換は、野性型レベ
ルの２０％までｓｓＲＮＡ結合を減少させ、ポリＵ−刺激ＡＴＰａｓｅ活性およ
び巻き戻し活性を殆ど無くした。興味深いことに、基底ＡＴＰａｓｅ活性はこれ
らの変異のいずれにも影響されなかった。

【０１８２】 結晶構造はまたＴｒｐ５０１の側鎖が結合したオリゴヌクレオチドと相互作用
することを示した。本ＴｒｐのＡｌａまたはＬｅｕへの置換は、ｓｓＲＮＡ結合
の減少およびポリＵ−刺激ＡＴＰａｓｅ活性および巻き戻し活性の廃止をもたら
したが、基底ＡＴＰａｓｅ活性は影響されなかった。比較して、Ｔｒｐ５０１−
から−Ｐｈｅ変異は基底ＡＴＰａｓｅ、巻き戻しおよびｓｓＲＮＡ結合活性に影
響しなかった。この変異体は、しかしながら、ＡＴＰａｓｅ活性のポリＵ−刺激
に、野性型ヘリカーゼと比較して感受性が低かった。驚くべきことに、本変異体
のＡＴＰａｓｅ活性は、ポリＣのような他のポリヌクレオチドにより刺激された
場合、野性型のものと同様であった。

【０１８３】 第１表 ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼのＲＮＡ結合部位におけるアミノ酸変異研究

【表１】

【０１８４】 これらの研究を基本にして、Ｔｈｒ２６９、Ｔｈｒ４１１およびＴｒｐ５０１
はオリゴヌクレオチド結合に重要な残基であることが明白である。上記のように
、Ｔｈｒ２６９およびＴｒｐ５０１はｄＵ８と直接接触する。ｄＵ８が位置する
ポケットを定義する最少ヘリカーゼアミノ酸は、Ｖａｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、
Ｇｌｙ２５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔ
ｒｐ５０１およびＴｙｒ５０２である。従って、これらのアミノ酸のバックボー
ン原子から±１.５Åまたはそれ以下の自乗平均と同等であるポケットに適当な 化合物は、ＮＳ３ヘリカーゼの阻害剤の可能性がある。

【０１８５】 ｄＵ８ポケットから４Åから８Å内に位置する付加的アミノ酸は、Ｐｒｏ２３
０、Ｖａｌ２５６、Ｔｈｒ２９８、Ａｌａ４９７、Ｌｙｓ５５１、Ｇｌｎ５５２
、Ｇｌｙ５５４、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６およびＰｒｏ５５８である。従っ
て、これらのアミノ酸と上記の組合わせは、更にｄＵ８ポケットを定義する。 結晶構造およびこれらの変異誘発実験を基本にして、Ｔｈｒ４１１はｄＵ４と
直接接触し、Ｕ４結合ポケットで重要な残基であることが明らかである。その形
を定義するのに、Ｕ４ポケットから十分に近い他のアミノ酸は、Ｈｉｓ３６９、
Ｓｅｒ３７０、Ｌｙｓ３７１、Ｔｙｒ３９２、Ａｒｇ３９３、Ａｓｐ４１２、Ａ
ｌａ４１３、Ｃｙｓ４３１、Ｖａｌ４３２、Ｇｌｎ４３４、Ｉｌｅ４４６、Ｔｈ
ｒ４４８、Ａｒｇ４６１、Ｇｌｕ４９３、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６およびＰ
ｈｅ５５７である。

【０１８６】 実施例７ ＮＳ３ヘリカーゼのＡＴＰ結合残基の構造ベースの変異誘発研究 変異誘発実験は、複合体の結晶構造を基本にして、ＮＳ３ヘリカーゼ：ＡＴＰ
相互作用に重要であると予測された数個の残基の役割の試験のために行った。 変異は、実施例１記載の方法で達成した。

【０１８７】 第２表 ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼのＡＴＰ結合部位におけるアミノ酸変異研究

【表２】

【０１８８】 我々のモデルにおいて、Ｒ４６４およびＲ４６７は、各々ＮＴＰのγ−および
α−ホスフェート基に結合すると予測された。これは、これらの残基がＲＮＡ結
合に関与すると予測された当分野で先に報告されていたものと対称的である[T.
Yao et al., Nat. Struct. Biol., 4, pp. 463-467 (1997); C. Hyun-Soo et al
., J. Biol. Chem., 273, pp. 15045-15052 (1998)]。

【０１８９】 二つの別々の変異であるＲ４６４→ＡおよびＲ４６７→Ａは、非常に低い基底
およびポリＵ−刺激ＡＴＰａｓｅ活性を示した。それらは、変異タンパク質が適
切に折りたたまれていることを示す通常のＲＮＡ結合能を有するが、恐らく、Ｎ
ＴＰａｓｅ活性の損失のため、これらの二つの変異タンパク質でヘリカーゼ巻き
戻し活性は殆ど存在しない。これらの結果は、これら二つのＡｒｇ残基がＡＴＰ
ａｓｅ活性に重要であることを示す。

【０１９０】 Ｑ４６０→Ａ変異は、上記の二つのＡｒｇ−から−Ａｌａ変異と同様の作用を
有した。本Ｇｌｎは、ＤＥＣＨモチーフのＨｉｓ−２９３のイミダゾール環と相
互作用し、適切な配座を維持すると予測された。 Ｒ４６１→Ａ変異は、低いＲＮＡ結合およびＡＴＰａｓｅ活性の低いポリＵ刺
激を導き、これは非常に低いヘリカーゼ巻き戻し活性をもたらした。 Ｒ４６２→Ａ変異は予測されたように、これら４種の活性に重大な作用をもた
らさなかった。

【０１９１】 我々は、前記で多くの本発明の態様を提示しているが、私の基本的解釈は、本
発明の方法を使用する他の態様を提供するために変えることができることは明白
である。従って、本発明の範囲は、実施例の形で前記に提示してある具体的な態
様ではなく、添付の特許請求の範囲により定義されるものであることは明白であ
る。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ｄＵ₈と複合体を形成しているＮＳ３ヘリカーゼの、該 複合体の結晶のＸ線回折により得られた原子構造座標を列挙したものである。以
下の略語を図１で用いる： “原子タイプ”は、その座標が測定されている元素を示す。縦列中の最初の文
字は元素を示す。“Ｘ、Ｙ、Ｚ”は、測定された元素の原子位置を結晶学的に示
す。 “Ｂ”は原子中心周辺の原子の移動を測定する熱因子である。 “Ｏｃｃ”は、分子中で各原子が座標で特定される位置を占めている割合を示
す占有因子である。“ｌ”の値は、各原子が結晶の全分子中で同じ配座を有して
いること、即ち、同じ位置にあることを示す。

【図２】 図２は、本発明の分子または分子複合体の三次元画像表示を生成
させるのに用いた。

【図３】 図３は、磁性記憶媒体の断面を示す。

【図４】 図４は、光学的に読み取り可能なデータ記憶媒体の断面を示す。

【図５】 図５は、結合ｄ(Ｕ)₈を有するＮＳ３ヘリカーゼの全体的な折り たたみのステレオリボンダイアグラムを示す。ドメイン１は青色であり、ドメイ
ン２は赤色、そしてドメイン３は緑色である。スルフェートおよびＤＮＡは黄色
である。

【図６】 図６は、ＮＳ３ヘリカーゼのドメイン１(青色)および２(赤色)の
重なりを示し、その重なりは２．０Å Ｃ-アルファＲＭＳ偏差を有し７８残基を
超える保存二次構造モチーフに基づいている。オリゴヌクレオチドの３’末端へ
の結合に対応する残基を太線で示す。またＴｒｐ-５０１の位置を示している。

【図７】 図７、パネルＡは、八つのデオキシヌクレオシドモノホスフェー
トキナーゼからなるリン酸結合ループ上に重なる結合スルフェート周囲の残基を
示す。パネルＢは、結合ＤＮＡ基質を含む電子密度を示す。オレンジ色は、ＤＮ
Ａまたは水分子がモデル中に形成する前に計算した差フーリエ(Ｆｏ-Ｆｃ)電子 密度図を示す。青色は、精密なモデルを用い分解能２．２Åで計算した最終的な
２Ｆｏ-Ｆｃ電子密度図を示す。

【図８】 図８は、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼの二次構造を示す(配列は上記
した)。保存配列モチーフに下線を引いた。クローニング時に加えた非ＨＣＶ Ｎ
末端およびＣ末端残基を小文字で示す。密度が観察されなかった残基をイタリッ
クで示す。残基はＮＳ３タンパク質の位置に基づき番号をつけている。

【図９】 図９、パネルＡは、他のヘリカーゼ由来の保存モチーフの配列を
並べ示したものである。このモチーフは、ＰｃｒＡヘリカーゼとして以前に報告
されたものと同様に色付けし、スーパーファミリーＩおよびＩＩ由来酵素の構造
との比較の便に供している。パネルＢは保存モチーフの位置を示す。

【図１０】 図１０は、ＮＳ３ヘリカーゼドメインの中心結合の裂け目の中
の様子を示す。

【図１１】 図１１、パネルＡは、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼへの酵素濃度 およびインキュベーション時間の影響を示す。パネルＢは、ヘリカーゼ活性への
インキュベーション温度の影響を示す。パネルＣは、ヘリカーゼ活性へのｐＨの
影響を示す。パネルＤは、ヘリカーゼ活性への一価陽イオンの影響を示す。パネ
ルＥは、ヘリカーゼ活性へのＡＴＰの影響を示す。パネルＦは、酵素活性への二
価陽イオンの影響を示す。

【図１２】 図１２、パネルＡは、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼに[³²Ｐ]-ｓｓ
ＲＮＡ基質が結合するときの酵素濃度の影響を示す。パネルＢは、[³Ｈ]-ラベル
ｓｓＲＮＡによる予め形成させたＮＳ３ヘリカーゼ／[³²Ｐ]-ラベルｓｓＲＮＡ 複合体の経時的解離を示す。パネルＣは、ヘリカーゼにｓｓＲＮＡが結合すると
きのｐＨの影響を示す。パネルＤは、ヘリカーゼにｓｓＲＮＡが結合するときの
一価陽イオンの影響を示す。パネルＥは、ヘリカーゼにｓｓＲＮＡが結合すると
きの二価陽イオンの影響を示す。

【図１３】 図１３、パネルＡは、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼのＡＴＰアー ゼ活性へのポリ(Ｕ)の影響を示す。パネルＢは、ポリ(Ｕ)の存在下または非存在
下のＡＴＰアーゼ活性への酵素濃度の影響を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年２月２５日（２０００．２．２５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１９１

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１９１】 我々は、前記で多くの本発明の態様を提示しているが、私の基本的解釈は、本
発明の方法を使用する他の態様を提供するために変えることができることは明白
である。従って、本発明の範囲は、実施例の形で前記に提示してある具体的な態
様ではなく、添付の特許請求の範囲により定義されるものであることは明白であ
る。 (配列表) SEQUENCE LISTING <110> Kim, Jospeh L Morgenstern, Kurt A Caron, Paul R Lin, Chao Vertex Pharmaceuticals Inc. <120> CRYSTAL STRUCTURE OF THE HCV NS3 HELICASE DOMAIN <130> Sequence listing for VPI/97-101 <140> <141> <150> 60/055,772 <151> 1997-08-13 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1932 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <220> <221> CDS <222> (4)..(1896) <223> Full length HCV NS3 coding sequence <220> <221> misc_feature <222> (504)..(1896) <223> Helicase domain <400> 1 atg gcg ccc atc acg gcg tac gcc cag cag acg aga ggc aag ctt ggg 48
Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ala Gln Gln Thr Arg Gly Lys Leu Gly 1 5 10 15 tgt ata atc acc agc ctg act ggc cgg gac aaa aac caa gtg gag ggt 96
Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val Glu Gly 20 25 30 gag gtc cag atc gtg tca act gct acc caa acc ttc ctg gca acg tgc 144
Glu Val Gln Ile Val Ser Thr Ala Thr Gln Thr Phe Leu Ala Thr Cys 35 40 45 atc aat ggg gta tgc tgg act gtc tac cac ggg gcc gga acg agg acc 192
Ile Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Thr Arg Thr 50 55 60 atc gca tca ccc aag ggt cct gtc atc cag atg tat acc aat gtg gac 240
Ile Ala Ser Pro Lys Gly Pro Val Ile Gln Met Tyr Thr Asn Val Asp 65 70 75 caa gac ctt gtg ggc tgg ccc gct cct caa ggt tcc cgc tca ttg aca 288
Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Gln Gly Ser Arg Ser Leu Thr 80 85 90 95 ccc tgc acc tgc ggc tcc tcg gac ctt tac ctg gtt acg agg cac gcc 336
Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg His Ala 100 105 110 gac gtc atc ccg gtt cgc cgt cgc ggt gat agc cgt ggt agc ctg ctg 384
Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Ser Arg Gly Ser Leu Leu 115 120 125 tct ccg cgt ccg att tcc tac ctg aaa ggc tcc tcg ggg ggt ccg ctg 432
Ser Pro Arg Pro Ile Ser Tyr Leu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Pro Leu 130 135 140 ttg tgc ccc gcg gga cac gcc gtg ggc cta ttc agg gcc gcg gtg tgc 480
Leu Cys Pro Ala Gly His Ala Val Gly Leu Phe Arg Ala Ala Val Cys 145 150 155 acc cgt gga gtg gcc aag gcg gtg gac ttt atc cct gtg gag aac ctg 528
Thr Arg Gly Val Ala Lys Ala Val Asp Phe Ile Pro Val Glu Asn Leu 160 165 170 175 gag acc acc atg cgt tcc ccg gtg ttc acg gac aac tcc tct cca cca 576
Glu Thr Thr Met Arg Ser Pro Val Phe Thr Asp Asn Ser Ser Pro Pro 180 185 190 gct gtt ccc cag agc ttc cag gtg gcc cac ctg cat gct ccc acc ggc 624
Ala Val Pro Gln Ser Phe Gln Val Ala His Leu His Ala Pro Thr Gly 195 200 205 agt ggt aag agc acc aag gtc ccg gct gcg tac gca gcc cag ggc tac 672
Ser Gly Lys Ser Thr Lys Val Pro Ala Ala Tyr Ala Ala Gln Gly Tyr 210 215 220 aag gtg ttg gtg ctc aac ccc tct gtt gct gca acg ctg ggc ttt ggt 720
Lys Val Leu Val Leu Asn Pro Ser Val Ala Ala Thr Leu Gly Phe Gly 225 230 235 gct tac atg tcc aag gcc cat ggg gtc gat cct aat atc cgc acc ggt 768
Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Val Asp Pro Asn Ile Arg Thr Gly 240 245 250 255 gtg cgt aca att acc act ggc agc ccc atc acg tac tcc acc tac ggc 816
Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ser Pro Ile Thr Tyr Ser Thr Tyr Gly 260 265 270 aag ttc ctt gcc gac ggc ggg tgc tca ggt ggc gct tat gat atc atc 864
Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp Ile Ile 275 280 285 att tgt gac gag tgc cac tcc acg gat gcc aca tcc atc ttg ggc atc 912
Ile Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ala Thr Ser Ile Leu Gly Ile 290 295 300 ggc act gtc ctt gac caa gca gag act gcg ggg gcg aga ttg gtt gtg 960
Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu Val Val 305 310 315 ctc gcc act gct acc cct ccg ggc tcc gtc acg gta ccg cat cct aac 1008
Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His Pro Asn 320 325 330 335 atc gag gag gtt gct ctg tcc acc acc gga gag atc cct ttc tac ggc 1056
Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Thr Thr Gly Glu Ile Pro Phe Tyr Gly 340 345 350 aag gct atc ccc ctc gag gtg atc aag ggc ggc cgt cat ctc atc ttc 1104
Lys Ala Ile Pro Leu Glu Val Ile Lys Gly Gly Arg His Leu Ile Phe 355 360 365 tgt cac tca aag aag aag tgc gac gag ctc gcc gcg aag ctg gtc gca 1152
Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu Val Ala 370 375 380 ttg ggc atc aat gcc gtg gcc tac tac cgc gga ctt gac gtg tct gtc 1200
Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val Ser Val 385 390 395 atc ccg acc agc ggc gat gtt gtc gtc gtg gcg acc gat gct ctc atg 1248
Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala Leu Met 400 405 410 415 act ggc ttt acc ggc gac ttc gac tct gtg ata gac tgc aac acg tgt 1296
Thr Gly Phe Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn Thr Cys 420 425 430 gtc act cag aca gtc gat ttc agc ctt gac cct acc ttt acc att gag 1344
Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr Ile Glu 435 440 445 aca acc acg ctc ccc cag gat gct gtc tcc agg act cag cgc cgt ggt 1392
Thr Thr Thr Leu Pro Gln Asp Ala Val Ser Arg Thr Gln Arg Arg Gly 450 455 460 cgt acc ggc cgt ggg aag cca ggc atc tac aga ttt gtg gca ccg ggg 1440
Arg Thr Gly Arg Gly Lys Pro Gly Ile Tyr Arg Phe Val Ala Pro Gly 465 470 475 gag cgc ccc tcc ggc atg ttc gac tcg tcc gtc ctc tgt gag tgc tat 1488
Glu Arg Pro Ser Gly Met Phe Asp Ser Ser Val Leu Cys Glu Cys Tyr 480 485 490 495 gac gcg ggc tgt gct tgg tat gag ctc acg ccg gcg gag act aca gtt 1536
Asp Ala Gly Cys Ala Trp Tyr Glu Leu Thr Pro Ala Glu Thr Thr Val 500 505 510 cgt ctg cgc gcg tac atg aac acc ccg ggg ctt ccc gtg tgc cag gac 1584
Arg Leu Arg Ala Tyr Met Asn Thr Pro Gly Leu Pro Val Cys Gln Asp 515 520 525 cat ctt gaa ttt tgg gag ggc gtc ttt acg ggc ctc acc cat atc gat 1632
His Leu Glu Phe Trp Glu Gly Val Phe Thr Gly Leu Thr His Ile Asp 530 535 540 gcc cac ttt ctg tcc cag aca aag cag agt ggg gag aac ttt cct tac 1680
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Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala Pro Pro 560 565 570 575 cca tcg tgg gac cag atg tgg aag tgt ttg atc cgc ctt aaa ccc acc 1776
Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys Pro Thr 580 585 590 ctc cat ggg cca aca ccg ctc ctg tac cgt ctg ggc gct gtt cag aat 1824
Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val Gln Asn 595 600 605 gaa gtc acc ctg acg cac cca atc acc aaa tac atc atg aca tgc atg 1872
Glu Val Thr Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Thr Cys Met 610 615 620 tcg gcc gac ctg gag gtc gtc acg ggatctggct cgcatcatca tcatcatcac 1926
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tgccgccggc ttccattcag gtcgaggtgg cccggctcca tgcaccgcga cgcaacgcgg 6060 ggaggcagac aaggtatagg gcggcgccta caatccatgc caacccgttc catgtgctcg 6120 ccgaggcggc ataaatcgcc gtgacgatca gcggtccagt gatcgaagtt aggctggtaa 6180 gagccgcgag cgatccttga agctgtccct gatggtcgtc atctacctgc ctggacagca 6240 tggcctgcaa cgcgggcatc ccgatgccgc cggaagcgag aagaatcata atggggaagg 6300 ccatccagcc tcgcgtcgcg aacgccagca agacgtagcc cagcgcgtcg gccgccatgc 6360 cggcgataat ggcctgcttc tcgccgaaac gtttggtggc gggaccagtg acgaaggctt 6420 gagcgagggc gtgcaagatt ccgaataccg caagcgacag gccgatcatc gtcgcgctcc 6480 agcgaaagcg gtcctcgccg aaaatgaccc agagcgctgc cggcacctgt cctacgagtt 6540 gcatgataaa gaagacagtc ataagtgcgg cgacgatagt catgccccgc gcccaccgga 6600 aggagctgac tgggttgaag gctctcaagg gcatcggtcg agatcccggt gcctaatgag 6660 tgagctaact tacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 6720 cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 6780 gccagggtgg tttttctttt caccagtgag acgggcaaca gctgattgcc cttcaccgcc 6840 tggccctgag agagttgcag caagcggtcc acgctggttt gccccagcag gcgaaaatcc 6900 tgtttgatgg tggttaacgg cgggatataa catgagctgt cttcggtatc gtcgtatccc 6960 actaccgaga tatccgcacc aacgcgcagc ccggactcgg taatggcgcg cattgcgccc 7020 agcgccatct gatcgttggc aaccagcatc gcagtgggaa cgatgccctc attcagcatt 7080 tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca ctccagtcgc cttcccgttc cgctatcggc 7140 tgaatttgat tgcgagtgag atatttatgc cagccagcca gacgcagacg cgccgagaca 7200 gaacttaatg ggcccgctaa cagcgcgatt tgctggtgac ccaatgcgac cagatgctcc 7260 acgcccagtc gcgtaccgtc ttcatgggag aaaataatac tgttgatggg tgtctggtca 7320 gagacatcaa gaaataacgc cggaacatta gtgcaggcag cttccacagc aatggcatcc 7380 tggtcatcca gcggatagtt aatgatcagc ccactgacgc gttgcgcgag aagattgtgc 7440 accgccgctt tacaggcttc gacgccgctt cgttctacca tcgacaccac cacgctggca 7500 cccagttgat cggcgcgaga tttaatcgcc gcgacaattt gcgacggcgc gtgcagggcc 7560 agactggagg tggcaacgcc aatcagcaac gactgtttgc ccgccagttg ttgtgccacg 7620 cggttgggaa tgtaattcag ctccgccatc gccgcttcca ctttttcccg cgttttcgca 7680 gaaacgtggc tggcctggtt caccacgcgg gaaacggtct gataagagac accggcatac 7740
tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc acattcacca ccctgaattg actctcttcc 7800 gggcgctatc atgccatacc gcgaaaggtt ttgcgccatt cgatggtgtc cgggatctcg 7860 acgctctccc ttatgcgact cctgcattag gaagcagccc agtagtaggt tgaggccgtt 7920 gagcaccgcc gccgcaagga atggtgcatg caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc 7980 cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc 8040 ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc 8100 ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta gaggatcgag atctcgatcc cgcgaaa 8157 <210> 4 <211> 7659 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Genetically engineered plasmid containing helicase domain of HCV NS3 <400> 4 ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct agaaataatt 60 ttgtttaact ttaagaagga gatataccat ggtggacttt atccctgtgg agaacctgga 120 gaccaccatg cgttccccgg tgttcacgga caactcctct ccaccagctg ttccccagag 180 cttccaggtg gcccacctgc atgctcccac cggcagtggt aagagcacca aggtcccggc 240 tgcgtacgca gcccagggct acaaggtgtt ggtgctcaac ccctctgttg ctgcaacgct 300 gggctttggt gcttacatgt ccaaggccca tggggtcgat cctaatatcc gcaccggtgt 360 gcgtacaatt accactggca gccccatcac gtactccacc tacggcaagt tccttgccga 420 cggcgggtgc tcaggtggcg cttatgatat catcatttgt gacgagtgcc actccacgga 480 tgccacatcc atcttgggca tcggcactgt ccttgaccaa gcagagactg cgggggcgag 540 attggttgtg ctcgccactg ctacccctcc gggctccgtc acggtaccgc atcctaacat 600 cgaggaggtt gctctgtcca ccaccggaga gatccctttc tacggcaagg ctatccccct 660 cgaggtgatc aagggcggcc gtcatctcat cttctgtcac tcaaagaaga agtgcgacga 720 gctcgccgcg aagctggtcg cattgggcat caatgccgtg gcctactacc gcggacttga 780 cgtgtctgtc atcccgacca gcggcgatgt tgtcgtcgtg gcgaccgatg ctctcatgac 840 tggctttacc ggcgacttcg actctgtgat agactgcaac acgtgtgtca ctcagacagt 900 cgatttcagc cttgacccta cctttaccat tgagacaacc acgctccccc aggatgctgt 960
ctccaggact cagcgccgtg gtcgtaccgg ccgtgggaag ccaggcatct acagatttgt 1020 ggcaccgggg gagcgcccct ccggcatgtt cgactcgtcc gtcctctgtg agtgctatga 1080 cgcgggctgt gcttggtatg agctcacgcc ggcggagact acagttcgtc tgcgcgcgta 1140 catgaacacc ccggggcttc ccgtgtgcca ggaccatctt gaattttggg agggcgtctt 1200 tacgggcctc acccatatcg atgcccactt tctgtcccag acaaagcaga gtggggagaa 1260 ctttccttac ctggtagcgt accaagccac cgtgtgcgct cgtgcgcaag cccctccgcc 1320 atcgtgggac cagatgtgga agtgtttgat ccgccttaaa cccaccctcc atgggccaac 1380 accgctcctg taccgtctgg gcgctgttca gaatgaagtc accctgacgc acccaatcac 1440 caaatacatc atgacatgca tgtcggccga cctggaggtc gtcacgggat ctggctcgca 1500 tcatcatcat catcactaat agaattcgga tccggctgct aacaaagccc gaaaggaagc 1560 tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa ccccttgggg cctctaaacg 1620 ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc ggatatcccg caagaggccc 1680 ggcagtaccg gcataaccaa gcctatgcct acagcatcca gggtgacggt gccgaggatg 1740 acgatgagcg cattgttaga tttcatacac ggtgcctgac tgcgttagca atttaactgt 1800 gataaactac cgcattaaag cttatcgata ccgtcgacct cgaggggggg cccggtaccc 1860 aattcgccct atagtgagtc gtattacgcg cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 1920 gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 1980 agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 2040 aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg 2100 cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct 2160 tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta 2220 gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt 2280 tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg 2340 ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat 2400 tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt 2460 taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt 2520 ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 2580 atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 2640 tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 2700
tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 2760 gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 2820 aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 2880 gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 2940 ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 3000 gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 3060 gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 3120 atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 3180 ctgcagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 3240 cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 3300 cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 3360 gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 3420 cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 3480 cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 3540 taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 3600 ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 3660 aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 3720 caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 3780 taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 3840 gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 3900 cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 3960 taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 4020 agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 4080 ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 4140 gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 4200 acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 4260 acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 4320 tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 4380 ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 4440
agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatatg 4500 gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta 4560 tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 4620 tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 4680 tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc 4740 tcatcagcgt ggtcgtgaag cgattcacag atgtctgcct gttcatccgc gtccagctcg 4800 ttgagtttct ccagaagcgt taatgtctgg cttctgataa agcgggccat gttaagggcg 4860 gttttttcct gtttggtcac tgatgcctcc gtgtaagggg gatttctgtt catgggggta 4920 atgataccga tgaaacgaga gaggatgctc acgatacggg ttactgatga tgaacatgcc 4980 cggttactgg aacgttgtga gggtaaacaa ctggcggtat ggatgcggcg ggaccagaga 5040 aaaatcactc agggtcaatg ccagcgcttc gttaatacag atgtaggtgt tccacagggt 5100 agccagcagc atcctgcgat gcagatccgg aacataatgg tgcagggcgc tgacttccgc 5160 gtttccagac tttacgaaac acggaaaccg aagaccattc atgttgttgc tcaggtcgca 5220 gacgttttgc agcagcagtc gcttcacgtt cgctcgcgta tcggtgattc attctgctaa 5280 ccagtaaggc aaccccgcca gcctagccgg gtcctcaacg acaggagcac gatcatgcgc 5340 acccgtggcc aggacccaac gctgcccgag atgcgccgcg tgcggctgct ggagatggcg 5400 gacgcgatgg atatgttctg ccaagggttg gtttgcgcat tcacagttct ccgcaagaat 5460 tgattggctc caattcttgg agtggtgaat ccgttagcga ggtgccgccg gcttccattc 5520 aggtcgaggt ggcccggctc catgcaccgc gacgcaacgc ggggaggcag acaaggtata 5580 gggcggcgcc tacaatccat gccaacccgt tccatgtgct cgccgaggcg gcataaatcg 5640 ccgtgacgat cagcggtcca gtgatcgaag ttaggctggt aagagccgcg agcgatcctt 5700 gaagctgtcc ctgatggtcg tcatctacct gcctggacag catggcctgc aacgcgggca 5760 tcccgatgcc gccggaagcg agaagaatca taatggggaa ggccatccag cctcgcgtcg 5820 cgaacgccag caagacgtag cccagcgcgt cggccgccat gccggcgata atggcctgct 5880 tctcgccgaa acgtttggtg gcgggaccag tgacgaaggc ttgagcgagg gcgtgcaaga 5940 ttccgaatac cgcaagcgac aggccgatca tcgtcgcgct ccagcgaaag cggtcctcgc 6000 cgaaaatgac ccagagcgct gccggcacct gtcctacgag ttgcatgata aagaagacag 6060 tcataagtgc ggcgacgata gtcatgcccc gcgcccaccg gaaggagctg actgggttga 6120 aggctctcaa gggcatcggt cgagatcccg gtgcctaatg agtgagctaa cttacattaa 6180
ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat 6240 gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgccagggt ggtttttctt 6300 ttcaccagtg agacgggcaa cagctgattg cccttcaccg cctggccctg agagagttgc 6360 agcaagcggt ccacgctggt ttgccccagc aggcgaaaat cctgtttgat ggtggttaac 6420 ggcgggatat aacatgagct gtcttcggta tcgtcgtatc ccactaccga gatatccgca 6480 ccaacgcgca gcccggactc ggtaatggcg cgcattgcgc ccagcgccat ctgatcgttg 6540 gcaaccagca tcgcagtggg aacgatgccc tcattcagca tttgcatggt ttgttgaaaa 6600 ccggacatgg cactccagtc gccttcccgt tccgctatcg gctgaatttg attgcgagtg 6660 agatatttat gccagccagc cagacgcaga cgcgccgaga cagaacttaa tgggcccgct 6720 aacagcgcga tttgctggtg acccaatgcg accagatgct ccacgcccag tcgcgtaccg 6780 tcttcatggg agaaaataat actgttgatg ggtgtctggt cagagacatc aagaaataac 6840 gccggaacat tagtgcaggc agcttccaca gcaatggcat cctggtcatc cagcggatag 6900 ttaatgatca gcccactgac gcgttgcgcg agaagattgt gcaccgccgc tttacaggct 6960 tcgacgccgc ttcgttctac catcgacacc accacgctgg cacccagttg atcggcgcga 7020 gatttaatcg ccgcgacaat ttgcgacggc gcgtgcaggg ccagactgga ggtggcaacg 7080 ccaatcagca acgactgttt gcccgccagt tgttgtgcca cgcggttggg aatgtaattc 7140 agctccgcca tcgccgcttc cactttttcc cgcgttttcg cagaaacgtg gctggcctgg 7200 ttcaccacgc gggaaacggt ctgataagag acaccggcat actctgcgac atcgtataac 7260 gttactggtt tcacattcac caccctgaat tgactctctt ccgggcgcta tcatgccata 7320 ccgcgaaagg ttttgcgcca ttcgatggtg tccgggatct cgacgctctc ccttatgcga 7380 ctcctgcatt aggaagcagc ccagtagtag gttgaggccg ttgagcaccg ccgccgcaag 7440 gaatggtgca tgcaaggaga tggcgcccaa cagtcccccg gccacggggc ctgccaccat 7500 acccacgccg aaacaagcgc tcatgagccc gaagtggcga gcccgatctt ccccatcggt 7560 gatgtcggcg atataggcgc cagcaaccgc acctgtggcg ccggtgatgc cggccacgat 7620 gcgtccggcg tagaggatcg agatctcgat cccgcgaaa 7659 本件国際出願日における明細書に配列表が含まれていますが、翻訳文提出時に
その標題である（配列表）の記載を欠落しましたので、今回、これを補充するも
のです。なお、前後の関連性を示すために、右標題につづく配列表を原文どおり
追加致します。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 130 Ｗａｖｅｒｌｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃａｍｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓ ｅｔｔｓ 02139−4242， Ｕ．Ｓ．Ａ. (72)発明者 カート・モーゲンスターン アメリカ合衆国03038ニューハンプシャー 州デリー、ボニー・レイン17ビー番 (72)発明者 ポール・キャロン アメリカ合衆国02148マサチューセッツ州 モールデン、メイプル・ストリート85番 (72)発明者 チャオ・リン アメリカ合衆国02445マサチューセッツ州 ブルックライン、スタントン・ロード・ナ ンバー２、42番 【要約の続き】

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼタンパク質およびオリゴヌクレオ チドを含む結晶化可能な組成物。
2. 【請求項２】 当該ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼが配列番号１のアミノ酸１６ ７-６３１を含むものであり、当該オリゴヌクレオチドが長さ６から１２ヌクレ オチドの一本鎖ポリヌクレオチドである、請求項１に記載の組成物。
3. 【請求項３】 ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼタンパク質およびオリゴヌクレオ チドを含む結晶化複合体。
4. 【請求項４】 当該オリゴヌクレオチドが長さ６から１２ヌクレオチドの一
   本鎖ポリヌクレオチドである、請求項３に記載の結晶化複合体。
5. 【請求項５】 ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼおよびオリゴヌクレオチドを含む 結晶化複合体の製法であって、 ａ)ＮＳ３ヘリカーゼタンパク質およびオリゴヌクレオチドを１：５から５：１ の間のモル比で含む結晶化可能な組成物を得る工程、および、 ｂ)当該組成物を、結晶化を進める条件におく工程、 の工程を含む方法。
6. 【請求項６】 当該ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼが配列番号１のアミノ酸１６ ７-６３１を含むものであり、当該オリゴヌクレオチドが長さ６から１２ヌクレ オチドの一本鎖ポリヌクレオチドである、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 ａ)当該分子または分子複合体が図１のＮＳ３アミノ酸Ｖａ ｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ
   ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０１およびＴｙｒ５０２の構造座標によって定
   義される結合ポケットを含むものである分子または分子複合体、または、 ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
   、 の三次元画像を作成するコンピューターであって、 (i)当該データが図１のＮＳ３アミノ酸Ｖａｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２ ５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０
   １およびＴｙｒ５０２の構造座標を含むものである機械読取り可能なデータをコ
   ード化したデータ記憶体を含む機械読み取り可能データ記憶媒体、 (ii)当該機械読み取り可能データを処理するための命令記憶用ワーキングメモリ
   、 (iii)当該ワーキングメモリと、当該機械読み取り可能データ記憶媒体とに連結 し、当該機械読み取り可能データを処理して当該三次元画像にする中央処理装置
   、ならびに (iV)当該中央処理装置と連結し、当該三次元画像を表示するディスプレイ、 を含んでなる当該コンピューター。
8. 【請求項８】 当該コンピューターが、 ａ)図１の、ＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｖａｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２ ５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０
   １、Ｔｙｒ５０２、Ｐｒｏ２３０、Ｖａｌ２５６、Ｔｈｒ２９８、Ａｌａ４９７
   、Ｌｙｓ５５１、Ｇｌｎ５５２、Ｇｌｙ５５４、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６お
   よびＰｒｏ５５８の構造座標により定義される結合ポケットを含む分子または分
   子複合体、または ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
   、 の三次元画像を作成するものであり、さらに、 当該機械読み取り可能データが図１のＮＳ３アミノ酸Ｖａｌ２３２、Ｔｈｒ２５
   ４、Ｇｌｙ２５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５
   、Ｔｒｐ５０１、Ｔｙｒ５０２、Ｐｒｏ２３０、Ｖａｌ２５６、Ｔｈｒ２９８、
   Ａｌａ４９７、Ｌｙｓ５５１、Ｇｌｎ５５２、Ｇｌｙ５５４、Ｇｌｕ５５５、Ａ
   ｓｎ５５６およびＰｒｏ５５８の構造座標を含むものである、 請求項７に記載のコンピューター。
9. 【請求項９】 ａ)図１の、ＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｈｉｓ３６９、Ｓｅ ｒ３７０、Ｌｙｓ３７１、Ｔｙｒ３９２、Ａｒｇ３９３、Ｔｈｒ４１１、Ａｓｐ
   ４１２、Ａｌａ４１３、Ｃｙｓ４３１、Ｖａｌ４３２、Ｇｌｎ４３４、Ｉｌｅ４
   ４６、Ｔｈｒ４４８、Ａｒｇ４６１、Ｇｌｕ４９３、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５
   ６およびＰｈｅ５５７の構造座標により定義される結合ポケットを含む分子また
   は分子複合体、または ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
   、 の三次元画像を作成するコンピューターであって、 (i)当該データが図１のＮＳ３アミノ酸Ｈｉｓ３６９、Ｓｅｒ３７０、Ｌｙｓ３ ７１、Ｔｙｒ３９２、Ａｒｇ３９３、Ｔｈｒ４１１、Ａｓｐ４１２、Ａｌａ４１
   ３、Ｃｙｓ４３１、Ｖａｌ４３２、Ｇｌｎ４３４、Ｉｌｅ４４６、Ｔｈｒ４４８
   、Ａｒｇ４６１、Ｇｌｕ４９３、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６およびＰｈｅ５５
   ７の構造座標を含むものである機械読取り可能なデータをコード化したデータ記
   憶体を含む機械読み取り可能データ記憶媒体、 (ii)当該機械読み取り可能データを処理するための命令記憶用ワーキングメモリ
   、 (iii)当該ワーキングメモリと、当該機械読み取り可能データ記憶媒体とに連結 し、当該機械読み取り可能データを処理して当該三次元画像にする中央処理装置
   、ならびに (iV)当該中央処理装置と連結し、当該三次元画像を表示するディスプレイ、 を含んでなるコンピューター。
10. 【請求項１０】 ａ)図１の、ＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｐｒｏ２０５、Ｔ ｈｒ２０６、Ｇｌｙ２０７、Ｓｅｒ２０８、Ｇｌｙ２０９、Ｌｙｓ２１０、Ｓｅ
    ｒ２１１、Ｔｈｒ２１２、Ｌｙｓ２１３、Ａｓｎ２２９、Ａｌａ２３４、Ｇｌｙ
    ２３７、Ｐｈｅ２３８、Ｔｙｒ２４１、Ａｓｐ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ２
    ９３、Ｔｈｒ３２２、Ａｌａ３２３、Ｔｈｒ３２４、Ｇｌｎ４６０、Ｇｌｙ４６
    ３、Ａｒｇ４６４およびＡｒｇ４６７の構造座標により定義される結合ポケット
    を含む分子または分子複合体、または ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
    、 の三次元画像を作成するコンピューターであって、 (i)当該データが図１のＮＳ３アミノ酸Ｐｒｏ２０５、Ｔｈｒ２０６、Ｇｌｙ２ ０７、Ｓｅｒ２０８、Ｇｌｙ２０９、Ｌｙｓ２１０、Ｓｅｒ２１１、Ｔｈｒ２１
    ２、Ｌｙｓ２１３、Ａｓｎ２２９、Ａｌａ２３４、Ｇｌｙ２３７、Ｐｈｅ２３８
    、Ｔｙｒ２４１、Ａｓｐ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ２９３、Ｔｈｒ３２２、
    Ａｌａ３２３、Ｔｈｒ３２４、Ｇｌｎ４６０、Ｇｌｙ４６３、Ａｒｇ４６４およ
    びＡｒｇ４６７の構造座標を含むものである機械読取り可能なデータをコード化
    したデータ記憶体を含む機械読み取り可能データ記憶媒体、 (ii)当該機械読み取り可能データを処理するための命令記憶用ワーキングメモリ
    、 (iii)当該ワーキングメモリと、および当該機械読み取り可能データ記憶媒体と に連結し、当該機械読み取り可能データを処理して当該三次元構造にする中央処
    理装置、ならびに (iV)当該中央処理装置と連結し、当該三次元画像を表示するディスプレイ、 を含んでなるコンピューター。
11. 【請求項１１】 当該コンピューターが、 ａ．図１に示すＮＳ３アミノ酸全体の構造座標により定義される分子または分子
    複合体、または ｂ．当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１
    ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
    、 の三次元画像を作成するものであり、さらに、 当該機械読み取り可能データが図１に示すＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸全体の座標
    を含むものである、 請求項７から１０の何れかに記載のコンピューター。
12. 【請求項１２】 分子または分子複合体から得られるＸ線回折データに対応
    する構造座標の少なくとも一部を決定するコンピューターであって、 (ａ)当該データが図１のＮＳ３ヘリカーゼの構造座標の少なくとも一部を含むも
    のである機械読取り可能なデータをコード化したデータ記憶体を含む機械読み取
    り可能データ記憶媒体、 (ｂ)当該データが当該分子または分子複合体のＸ線回折データを含むものである
    機械読取り可能なデータをコード化したデータ記憶体を含む機械読み取り可能デ
    ータ記憶媒体、 (ｃ)(ａ)および(ｂ)の当該機械読み取り可能データを処理するための命令記憶用
    ワーキングメモリ、 (ｄ)当該ワーキングメモリと、(ａ)および(ｂ)の当該機械読み取り可能データ記
    憶媒体とに連結し、(ａ)の機械読み取り可能データのフーリエ変換を実施し、( ｂ)の当該機械読み取り可能データを処理して構造座標にする中央処理装置、な らびに (ｅ)当該中央処理装置と連結し、当該分子または分子複合体の当該構造座標を表
    示するディスプレイ、 を含んでなる当該コンピューター。
13. 【請求項１３】 当該分子または分子複合体が、ヘリカーゼ活性を有するポ
    リペプチドを含むものである、請求項１２に記載のコンピューター。
14. 【請求項１４】 ａ)図１のＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｖａｌ２３２、Ｔｈ ｒ２５４、Ｇｌｙ２５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ
    ２７５、Ｔｒｐ５０１およびＴｙｒ５０２の構造座標により定義される結合ポケ
    ットを含む分子または分子複合体、または ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
    、 と会合する化学物質の効力を評価する方法であって、 i)コンピューター手段を使用して化学物質と、分子または分子複合体の結合ポケ
    ットとのフィッティング操作を実施する工程、および、 ii)当該フィッティング操作の結果を分析して化学物質と結合ポケットとの会合 を定量する工程、 を含んでなる方法。
15. 【請求項１５】 当該方法が、 ａ)図１の、ＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｖａｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２ ５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０
    １、Ｔｙｒ５０２、Ｐｒｏ２３０、Ｖａｌ２５６、Ｔｈｒ２９８、Ａｌａ４９７
    、Ｌｙｓ５５１、Ｇｌｎ５５２、Ｇｌｙ５５４、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６お
    よびＰｒｏ５５８の構造座標により定義される結合ポケットを含む分子または分
    子複合体、または ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
    、 と会合する化学物質の効力を評価するものである、請求項１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 ａ)図１のＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｈｉｓ３６９、Ｓｅ ｒ３７０、Ｌｙｓ３７１、Ｔｙｒ３９２、Ａｒｇ３９３、Ｔｈｒ４１１、Ａｓｐ
    ４１２、Ａｌａ４１３、Ｃｙｓ４３１、Ｖａｌ４３２、Ｇｌｎ４３４、Ｉｌｅ４
    ４６、Ｔｈｒ４４８、Ａｒｇ４６１、Ｇｌｕ４９３、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５
    ６およびＰｈｅ５５７の構造座標により定義される結合ポケットを含む分子また
    は分子複合体、または ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
    、 と会合する化学物質の効力を評価する方法であって、 i)コンピューター手段を使用して化学物質と、分子または分子複合体の結合ポケ
    ットとのフィッティング操作を実施する工程、および ii)当該フィッティング操作の結果を分析して化学物質と結合ポケットとの会合 を定量する工程、 を含む方法。
17. 【請求項１７】 ａ)図１のＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸Ｐｒｏ２０５、Ｔｈ ｒ２０６、Ｇｌｙ２０７、Ｓｅｒ２０８、Ｇｌｙ２０９、Ｌｙｓ２１０、Ｓｅｒ
    ２１１、Ｔｈｒ２１２、Ｌｙｓ２１３、Ａｓｎ２２９、Ａｌａ２３４、Ｇｌｙ２
    ３７、Ｐｈｅ２３８、Ｔｙｒ２４１、Ａｓｐ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ２９
    ３、Ｔｈｒ３２２、Ａｌａ３２３、Ｔｈｒ３２４、Ｇｌｎ４６０、Ｇｌｙ４６３
    、Ａｒｇ４６４およびＡｒｇ４６７の構造座標により定義される結合ポケットを
    含む分子または分子複合体、または ｂ)当該同族体が当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１ ．５Å以下である結合ポケットを含むものである分子または分子複合体の同族体
    、 と関連させて化学物質の効力を評価する方法であって、 i)コンピューター手段を使用して化学物質と、分子または分子複合体の結合ポケ
    ットとのフィッティング操作を実施する工程、および ii)当該フィッティング操作の結果を分析して化学物質と結合ポケットとの会合 を定量する工程、 を含む方法。
18. 【請求項１８】 当該方法が、 ａ．図１のＮＳ３ヘリカーゼアミノ酸全体の構造座標により定義される分子また
    は分子複合体、または ｂ．当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根が１．５Å以下で
    ある分子または分子複合体の同族体、 と会合する化学物質の効力を評価するものである、請求項１４から１７の何れか
    に記載の方法。
19. 【請求項１９】 ａ．図１のＶａｌ２３２、Ｔｈｒ２５４、Ｇｌｙ２５５、
    Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ２７５、Ｔｒｐ５０１およ
    びＴｙｒ５０２の原子座標±１．５Å以下である当該アミノ酸のバックボーン原
    子の平均二乗偏差の平方根、を使用して、ＮＳ３ヘリカーゼＵ８-様結合ポケッ トを含む分子の三次元構造を生成させる工程、 ｂ．当該三次元構造を使用し、当該有望なアゴニストまたはアンタゴニストを設
    計しまたは選択する工程、 ｃ．当該アゴニストまたはアンタゴニストを合成する工程、および、 ｄ．当該アゴニストまたはアンタゴニストを当該分子と接触させ、当該有望なア
    ゴニストまたはアンタゴニストの当該分子と相互作用する能力を決定する工程、
    を含む、ＮＳ３ヘリカーゼＵ８-様結合ポケットを含む分子の有望なアゴニスト またはアンタゴニストを同定する方法。
20. 【請求項２０】 工程ａで使用する原子座標が、図１のＶａｌ２３２、Ｔｈ
    ｒ２５４、Ｇｌｙ２５５、Ｔｈｒ２６９、Ｇｌｙ２７１、Ｌｙｓ２７２、Ａｌａ
    ２７５、Ｔｒｐ５０１、Ｔｙｒ５０２、Ｐｒｏ２３０、Ｖａｌ２５６、Ｔｈｒ２
    ９８、Ａｌａ４９７、Ｌｙｓ５５１、Ｇｌｎ５５２、Ｇｌｙ５５４、Ｇｌｕ５５
    ５、Ａｓｎ５５６およびＰｒｏ５５８の原子座標±１．５Å以下である当該アミ
    ノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の平方根、を含むものである、請求項１
    ９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 ａ．図１のＨｉｓ３６９、Ｓｅｒ３７０、Ｌｙｓ３７１、
    Ｔｙｒ３９２、Ａｒｇ３９３、Ｔｈｒ４１１、Ａｓｐ４１２、Ａｌａ４１３、Ｃ
    ｙｓ４３１、Ｖａｌ４３２、Ｇｌｎ４３４、Ｉｌｅ４４６、Ｔｈｒ４４８、Ａｒ
    ｇ４６１、Ｇｌｕ４９３、Ｇｌｕ５５５、Ａｓｎ５５６およびＰｈｅ５５７の原
    子座標±１．５Å以下である当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗偏差の
    平方根、を使用して、ＮＳ３ヘリカーゼＵ８-様結合ポケットを含む分子の三次 元構造を生成させる工程、 ｂ．当該三次元構造を使用し、当該有望なアゴニストまたはアンタゴニストを設
    計しまたは選択する工程、 ｃ．当該アゴニストまたはアンタゴニストを合成する工程、および ｄ．当該アゴニストまたはアンタゴニストを当該分子と接触させ、当該有望なア
    ゴニストまたはアンタゴニストの当該分子と相互作用する能力を決定する工程、
    を含む、ＮＳ３ヘリカーゼＵ４-様結合ポケットを含む分子の有望なアゴニスト またはアンタゴニストを同定する方法。
22. 【請求項２２】 ａ．図１のＰｒｏ２０５、Ｔｈｒ２０６、Ｇｌｙ２０７、
    Ｓｅｒ２０８、Ｇｌｙ２０９、Ｌｙｓ２１０、Ｓｅｒ２１１、Ｔｈｒ２１２、Ｌ
    ｙｓ２１３、Ａｓｎ２２９、Ａｌａ２３４、Ｇｌｙ２３７、Ｐｈｅ２３８、Ｔｙ
    ｒ２４１、Ａｓｐ２９０、Ｇｌｕ２９１、Ｈｉｓ２９３、Ｔｈｒ３２２、Ａｌａ
    ３２３、Ｔｈｒ３２４、Ｇｌｎ４６０、Ｇｌｙ４６３、Ａｒｇ４６４およびＡｒ
    ｇ４６７の原子座標±１．５Å以下である当該アミノ酸のバックボーン原子の平
    均二乗偏差の平方根、を使用して、ＮＳ３ヘリカーゼＵ８-様結合ポケットを含 む分子の三次元構造を生成させる工程、 ｂ．当該三次元構造を使用し、当該有望なアゴニストまたはアンタゴニストを設
    計しまたは選択する工程、 ｃ．当該アゴニストまたはアンタゴニストを合成する工程、および ｄ．当該アゴニストまたはアンタゴニストを当該分子と接触させ、当該有望なア
    ゴニストまたはアンタゴニストの当該分子と相互作用する能力を決定する工程、
    を含む、ＮＳ３ヘリカーゼＡＴＰ-様結合ポケットを含む分子の有望なアゴニス トまたはアンタゴニストを同定する方法。
23. 【請求項２３】 上記工程ａにおいて、図１のＮＳ３ヘリカーゼの全アミノ
    酸の原子座標±１．５Å以下である当該アミノ酸のバックボーン原子の平均二乗
    偏差の平方根、を使用する、請求項１９から２２の何れかに記載の方法。
24. 【請求項２４】 構造未知分子または分子複合体ついての構造情報を得る方
    法であって、 ａ)当該構造未知分子または分子複合体を結晶化させる工程、 ｂ)当該結晶化分子または分子複合体からＸ線回折データを生成させる工程、お よび、 ｃ)図１に示す構造座標の少なくとも一部をＸ線回折データに適用し、構造未知 分子または分子複合体の三次元電子密度図を得る工程、 を含む方法。