ITMI982437A1

ITMI982437A1 - Molecole di acido nucleico che rappresentano un virus trasmissibileper via parenterale.

Info

Publication number: ITMI982437A1
Authority: IT
Inventors: Daniele Primi; Gianfranco Fiordalisi; Giovanni Lorenzo Mantero; Sonia Mattiolo; Alessandra Sottini
Original assignee: Diasorin S R L
Priority date: 1998-11-10
Filing date: 1998-11-10
Publication date: 2000-05-10
Also published as: IT1303732B1

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "MOLECOLE DI ACIDO NUCLEICO CHE RAPPRESENTANO UN VIRUS TRASMISSIBILE PER VIA PARENTERALE"

Nella descrizione vengono citati diversi riferimenti. Tutti i riferimenti vengono qui inclusi per riferimento.

La presente invenzione si riferisce a una molecola di acido nucleico che rappresenta il genoma di un virus, detta molecola di acido nucleico avendo almeno una delle seguenti caratteristiche:

(a) contiene almeno una fase di lettura aperta (Open Reading Fraine) (ORF)che codifica un polipeptide avente una sequenza amminoacidica qui descritta, (b) comprende una sequenza di DNA come qui descritta; (c) viene ibridata preferibilmente in condizioni stringenti dal filamento complementare della molecola di acido nucleico qui descritta,ma non dal filamento complementare del genoma del virus TT; (d) è degenerata rispetto alla molecola di acido nucleico che viene·ibridata; (e) è almeno per il 60% identica alla molecola di acido nucleico che rappresenta il genoma del virus dell'invenzione.L'invenzione inoltre si riferisce a vettori che comprendono detta molecola di acido nucleico, a metodi per produrre il (poli)peptide(i) codificato da detta molecola di acido nucleico, a virus che recano un genoma rappresentato da detta molecola di acido nucleico e ad anticorpi contro detto(i) (poli)peptide(i) e/o detti virus. Inoltre, l'invenzione si riferisce a composizioni farmaceutiche, vaccini, diagnostici e kit diagnostici che comprendono o che utilizzano i composti dell’invenzione.

Dai primi anni ottanta sono stati descritti molti agenti virali che vengono trasmessi per via parenterale (per esempio HIV, virus dell'epatite G, virus TT, ecc.), ma spesso non è stata stabilita una relazione causale diretta tra le diverse malattie e questi virus.

Una di queste malattie è l'epatite. Questa epatopatia è una delle malattie più importanti trasmesse da un donatore a un ricevente per trasfusione o altra somministrazione di prodotti ematici, attraverso trapianto d'organo o emodialisi. L'epatite viene inoltre trasmessa attraverso l'ingestione di acqua o alimenti contaminati e può essere contratta attraverso la comunità (contatto persona-persona). Gli agenti virali sospettati di causare tali epatopatie comprendono i virus dell'epatite A (HAV), dell’epatite B (HBV), dell'epatite C (HCV), dell'epatite D (HDV),dell'epatite E (HEV) c dell'epatite G (HGV/HGBV-C) così come il citomegalovirus (CMV) e il virus di Epstein-Barr (EBV). Sebbene siano disponibili test sensibili e specifici per la determinazione dei virus delle epatiti note, l'eziologia di una grossa parte dell'epatite post-trasfusionale (Alter et al., W. Engl. J. Med.

321 (1989), 1994) e dell'epatite "contratta dalla comunità" (Alter et al.,N. Engl.J.Med. 327 (1989), 1999) è sconosciuta.

Diversi potenziali patogeni sono stati proposti come agenti eziologici per queste cosidette epatopatie non-A, non-B, non-C, non-D, non-E,non-G (come riportato in Prince, Annu. Rev. Mocrobiol. 37 (1983) 217; Feinstone and Hoofnagle, N.Engl. J. Med. 311 (1984), 185; Overby, Curr. Hepatol. 7 (1987) , 35; Iwarson, British Medicai J. 295 (1987) , 949; Alter et al., N. Engl. J. Med. 336 (1997) 747). Tuttavia, non è dimostrato che questi agenti virali siano i patogeni che causano questi disordini epatici, specialmente in considerazione del fatto che la maggior parte dei pazienti con epatite fulminante non mostrano "marker" di infezione da virus dell'epatite (Feray et al., Gastroenterology 104 (1993), 549; Wright, Gastroenterology 104 (1993), 640). Inoltre viene riportata l'esistenza di pazienti con malattia epatica cronica i quali non sembrano essere infettati dai virus dell'epatite conosciuti (A-E) (Rodali et al., Am. J. Gastroenterol. 89 (1994), 1936). Inoltre, l'epatite post-trasfusionale si verifica in circa il 10% dei pazienti trasfusi, mentre l'epatite a eziologia sconosciuta è responsabile del 90% di questi casi.

Specialmente la scoperta del virus dell'epatite C (HCV)ha messo in evidenza che una parte dei casi di epatite acuta e cronica rimangono negativi a tutti i marcatori virali noti (Alter et al., Semi. Liver.Di 15 (1995), 110-120)la qual cosa ha indotto ricerche tese a identificare nuovi agenti causali dell'epatite. Da allora, un sostanziale sforzo è stato profuso nella ricerca di altri agenti infettivi responsabili dei casi rimanenti di epatite non-A,non-B post-trasfusionale non causata da HCV, di insufficienza epatica fulminante criptogenica (FHF) e di epatite cronica.

Inoltre, recenti scoperte indicano che l'infezione da virus dell'epatite G (HGV/HGBV-C; WO 95/21922), anche se diffusa, non è un agente eziologico nella maggior parte delle manifestazioni cliniche dell’epatite di cui sopra (Alter, N. Engl. J. Med. 334 (1996) , 1536-1537; Alter et al.,N.Engl.J.Med.336 (1997),747-754).

Nel 1997, ricercatori in Giappone hanno isolato un clone di DNA di un nuovo virus umano, designato TTV, usando un'analisi di rappresentazione differenziale da campioni di siero di un paziente ("paziente TT"; anche chiamato "virus trasmesso per trasfusione",vedere Nishizawa et al., Biochem. Biophys.Res. Coranun. 241 (1997), 92-97) con epatite post-trasfusionale di eziologia ignota.

Dati preliminari mostrano che il TTV è un virus privo di involucro virale, a singolo filamento di DNA e con 3739 nucleotidi (Okamoto, et al., Hepatology Res. 10 (1998), 1-16). Sono stati identificati due gruppi genetici di questo virus, che differiscono per il 30% nelle sequenze nucleotidiche. Il DNA di TTV è stato determinato nel 47% dei pazienti con epatite non-A-G fulminante e nel 46% di pazienti con malattie epatiche croniche di eziologia sconosciuta, suggerendo che il TTV può essere la causa di alcune malattie epatiche criptogeniche. Scoperte più recenti tuttavia hanno gettato dubbi sulla potenziale patogenicità di TTV.

Naunvov et al. (Lancet 352 (1998),159-197) hanno dimostrato che TTV (Alter, N. Engl. J. Med. 334 (1996), 1536-1537; Alter et al., N. Engl. J. Med. 336 (1997), 747-754) è presente nel Regno Unito con una diffusione simile e con gli stessi genotipi virali del Giappone, suggerendo che TTV abbia una distribuzione mondiale. Tuttavia, la maggioranza di casi TTV positivi davano test di funzionalità epatica normali e solo piccoli cambiamenti nella istologia del fegato. L'alta diffusione di infezioni da a TTV nella popolazione del Regno Unito e del Giappone e l'assenza di significative epatopatie suggerivano che TTV, simile al virus dell'epatite G (HGV), potesse essere un virus non chiaramente correiabile a una malattia.

Il livello di infezione da TTV nella popolazione sana normale è almeno tre volte superiore alla diffusione dell'agente HGV nella popolazione, che sembra essere dell'1,7% negli Stati Uniti (Linnen et al., Science 271 (1996), 505-508) e del 3,2% in Scozia (Jarvis et ed., Lancet 348 (1996), 1352-1355). Sebbene la maggior parte di pazienti con infezione da TTV avesse avuto una storia di trasfusione di sangue o di uso di droghe per via endovenosa, confermando l'importanza della via di trasmissione parenterale, l'agente viene rivelato anche in una grande porzione di individui con infezione "contratta dalla comunità" (38%). Pertanto, la probabile trasmissione di TTV per via non parenterale richiede ulteriori indagini.

Quantunque Naumov et al. (loc. cit) abbiano dimostrato che la diffusione dell'infezione da TTV era leggermente più alta nei pazienti con malattie epatiche con eziologia non-B, non-C rispetto ai controlli sani, questo risultato non implica necessariamente un ruolo causale di TTV come agente di induzione dell'epatopatia,dal momento che la maggior parte dei casi TTV positivi avevano test di funzionalità epatica normali e solo piccole differenze nell'istologia del fegato. Questi dati suggeriscono che il TTV non è l'agente causale delle malattie epatiche croniche di eziologia sconosciuta. Inoltre, sembra che il TTV non influenzi il grado di danno epatico dopo coinfezione con HBV o HCV.

Pertanto, lo scenario per TTV sembra essere simile a quello del virus HGB C/HGV visto che la rilevanza clinica dell'infezione con questo agente è sempre più diabbia.Nel 73% dei casi,le infezioni HGV non erano accompagnate da danno epatocellulare, e un aggiuntivo 16% era associato solo a un lieve incremento di alanina amminotrasferasi (Alter, N. Engl. J. Méd. 334 (1996), 1536-1537; Alter et al., N. Engl. J. Med. 336 (1997), 747-754).Pertanto, la scoperta che TTV non ha apparentemente un ruolo patogeno per le malattie del fegato costituisce un altro esempio di virus umano privo di una chiara correlazione con una malattia.

Poiché l'agente(i) eziologico e causale, che viene trasmesso per via parenterale e può essere il patogeno che porta alle epatopatie (descritte sopra) di origine ignota in pazienti trasfusi o negli utilizzatori di droga per via endovenosa, non è noto (o non sono noti), il problema tècnico della presente invenzione è dunque di fornire nuovi agenti che sono coinvolti in,associati a, o responsabili dello sviluppo di tali epatopatie.

La soluzione di detto problema tecnico è fornita dalle realizzazioni definite nelle rivendicazioni.

Pertanto, la presente invenzione si riferisce a una molecola di acido nucleico che rappresenta il genoma di un virus,detta molecola di acido nucleico avendo almeno una delle seguenti caratteristiche:

(a) contiene almeno una ORF che codifica un polipeptide avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO:29;

(b) conprende la sequenza di DNA di SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 20,SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30 o SEQ ID NO: 31;

(c) comprende porzioni di almeno 100 nucleotidi, preferibilmente almeno 500 nucleotidi e più preferibilmente almeno 2000 nucleotidi che vengono ibridati (in condizioni stringenti) al filamento complementare della molecola di acido nucleico di SEQ ID NO:26; (d) è degenerata rispetto alla molecola di acido nucleico di (c) ma non viene ibridata dal filamento complementare del genoma del virus TT;

(e) ha un’identità di almeno il 50%, preferibilmente almeno del 60% e più preferibilmente almeno del 70%, con la molecola di acido nucleico di SEQ ID NO:26, almeno il 60%,preferibilmente almeno il 70% e più preferibilmente almeno l'80% di identità con la molecola di acido nucleico di SEQ ID NO: 24, almeno il 50%, preferibilmente almeno il 60% e più preferibilmente almeno il 75% di identità con la molecola di acido nucleico di SEQ ID NO:28, almeno il 50%, preferibilmente almeno il 60% e più preferibilmente almeno il 75% di identità con la molecola di acido nucleico di SEQ ID NO:30 o ha almeno il 50%, preferibilmente almeno il 60% e più preferibilmente almeno il 75% di identità con SEQ ID NO:31 o è una molecola di acido nucleico che codifica una sequenza araminoacidica che ha almeno il 35%, preferibilmente almeno il 40%, più preferibilmente almeno il 50% e ancora più preferibilmente almeno il 75% di identità con SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27 o SEQ ID NO: 29.

Nel contesto della presente invenzione , il termine genoma definisce non solo sequenze che sono fasi di lettura aperte ("Open Reading Frames" - ORF) codificanti proteine, polipeptidi o peptidi, ma si riferisce anche a sequenze non codificanti. Pertanto, il termine "molecola di acido nucleico" comprende sequenze codificanti e, laddove applicabile, non codificanti. La molecola di acido nucleico dell'invenzione inoltre conprende sequenze di acido nucleico che sono degenerate rispetto alle sequenze di acido nucleico di sopra. Secondo la presente invenzione, il termine "molecola di acido nucleico" conprende inoltre qualsiasi possibile derivato di un acido nucleico al quale può essere ibridata una sonda di acido nucleico. Detta sonda di acido nucleico può essa stessa essere un derivato di una molecola acido nucleico capace di ibridarsi a detta molecola di acido nucleico o detto suo derivato. Il termine "molecola di acido nucleico" inoltre comprende acidi nucleici peptidici (FNA)che sono analoghi di DNA con legami ammidici (Nielsen, P.,Science 254 (1991), 1497-1500).

Il termine "ORF" che codifica un polipeptide, in relazione alla presente invenzione, è definito da (a) le specifiche sequenze nucleotidiche codificanti i polipeptidi specificati sopra o (b) dalle sequenze-di acido nucleico che vengono ibridate in condizioni stringenti dal filamento complementare delle sequenze nucleotidiche di (a) e codificanti un polipeptide che si diversifica dal polipeptide di (a)per una o più sostituzioni, delezioni o inversioni amminoacidiche e in cui la sequenza amminoacidica mostra almeno il 35% di identità con la sequenza amminoacidica di detto polipeptide.

Il termine "ibridarsi" come usato nella presente invenz oione può riferirsi a condizioni stringenti o non-stringenti. Se non diversamente specificato, le condizioni sono preferibilmente non-stringenti. Dette condizioni di ibridazione possono essere stabilite secondo protocolli convenzionali descritti,per esempio, in Sambrook, "Molecular Cloning,A Laboratory Marnai", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989), Ausbel, "Current Protocols In Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), o in Higgins and Hames (Eds) "NUcleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985). La regolazione delle condizioni rientra nelle capacità del tecnico e deve essere determinata secondo protocolli descritti.Così, la determinazione di sequenze che vengono ibridate solo in maniera specifica, normalmente richiederà condizioni di ibridazione e lavaggio stringenti, quali 0,1 x SSC, 0,1% SDS a 65°. Condizioni di ibridazione non stringenti per la determinazione di sequenze omologhe, non esattamente complementari, possono essere impostate a 6 x SSC, 1% SDS a 65eC. Come noto, la lunghezza della sonda e la composizione dell'acido nucleico da determinare costituiscono ulteriori parametri delle condizioni di ibridazione. Molecole di acido nucleico che vengono -ibridate- o molecole che rientrano nell'alternativa (c) (supra), comprendono inoltre i frammenti delle,molecole identificate in (a) o (b), in cui la sequenza nucleotidica non deve necessariamente essere identica alla sua controparte nelle SEQ ID NO: 2,4, 5, 6, 8, 9, 14,15, 16, 17, 20, 26, 28, 30 o 31, detti frammenti rappresentando il genoma o parti del genoma di un virus, e avendo una lunghezza di almeno 12 nucleotidi, preferibilmente di almeno 21 nucleotidi, più preferibilmente di almeno 30 nucleotidi, ancora più preferibilmente di almeno 40 nucleotidi,e ancora più preferibilmente di almeno 60 nucleotidi.

Preferibilmente, detta molecola di acido nucleico contiene 2 ORF e più preferibilmente contiene 3 ORF.

Convenientemente, le molecole di acido nucleico della presente invenzione non vengono ibridate dal filamento complementare del genoma del virus TT, almeno nella regione conpresa in SEQ ID NO: 26 comprendente le regioni codificanti per 0RF1, 0RF3 e ORF2 con l'esclusione dei circa 15 nucleotidi al 5' terminale di 0RF2. Il genoma del virus TT comprende, per esempio, i geni depositati in GENEBANK ai numeri di accesso AB011482,AB011486,AB011487,AB011488, AB011489, AB011490, AB011491, AB008394, AB011493, AB011494, AF 055897, AF 06045,AF060546,AF 060547,AF060548,AF060549,AF060550.

Inoltre, la presente invenzione si riferisce a molecole di acido nucleico che rappresentano il genoma di un virus e che hanno una sequenza nucleotidica con almeno il 50%, preferibilmente almeno il 60%, più preferibilmente almeno il 70%, ancora più preferibilmente l'80% e con particolare preferenza il 95% di identità con le sequenze di DNA come definite in SEQ ID NO: 26, sopra, con le molecole di acido nucleico aventi una sequenza nucleotidica che è almeno per il 60%, preferibilmente il 70%, più preferibilmente l'80% e con particolare preferenza per il 95% identica alle sequenze di DNA cerne definite in SEQ ID NO:24 supra o alle molecole di acido nucleico che sono almeno per il 50%, preferibilmente almeno il per 60%, più preferibilmente almeno per il 75% e ancora più preferibilmente almeno per il 90% identiche alla SEQ ID NO: 31; si veda la caratteristica (e)sopra.

La presente invenzione inoltre si riferisce a molecole di acido nucleico che rappresentano il genoma di un virus e codificano una sequenza amminoacidica con almeno il 35%, preferibilmente almeno il 40%, più preferibilmente almeno il 50% e ancora più preferibilmente almeno il 75% di identità con SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO:29: si veda la caratteristica (e) sopra.

Sorprendentemente,sono state trovate molecole di acido nucleico di un nuovo agente virale lontanamente correlato al virus TT. Queste molecole di acido nucleico sono determinabili solo in una minima frazione di donatori di sangue sani, ma hanno una grande diffusione nel sangue di coloro che fanno uso di droghe per via endovenosa, un gruppo di popolazione con un livello piuttosto alto di diffusione di malattie trasmissibili per via parenterale, come le malattie croniche del fegato di eziologia sconosciuta (Overby,Curr.Hepatol.7 (1987), 35).

La prima identificazione di queste molecole di acido nucleico è stata attuata in un campione di sangue di un soggetto che faceva uso di droghe per via endovenosa, designato SEN. Per questa ragione, il nuovo •agente virale è stato denominato "SEN-virus".

Come qui indicato, il virus SEN o il suo sottotipo(i) sembrano essere selettivamente isolati nei sieri di pazienti affetti da epatite non-A non-E, nei sieri del 70% di utilizzatori di droghe per via endovenosa, ma non potevano essere determinati nei sieri ottenuti da donatori di sangue sani o da pazienti affetti da malattie autoimmuni {artrite reumatoide). Si presuppone in accordo con la presente invenzione che il virus SEN comprenda diversi tipi e sottotipi e che alcuni di questi sottotipi siano più patogeni di altri. Inoltre, altre patologie diverse dalle epatopatie possono essere causate da questo agente virale e/o dai suoi sottotipi. In aggiunta,altri agenti patogeni o altre disposizioni genetiche possono essere implicate nell'insorgenza di dette epatopatie. Tutti i tipi e sottotipi sopra riferiti sono compresi nella presente invenzione.

La presente invenzione inoltre si riferisce a un acido nucleico che rappresenta il genoma di detto virus che si differenzia dal genoma specificato sopra per inserzione, sostituzione, delezione, inversione o duplicazione e conprende almeno una ORF, preferibilmente due ORF e ancora più preferibilmente le tre diverse ORF specificate sopra.

Inoltre, la presente invenzione si riferisce a una molecola di acido nucleico che codifica un (poli)peptide virale o un suo frammento, in cui detta molecola di acido nucleico

(a) contiene almeno una ORF che codifica un polipeptide avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO:29 o un suo frammento di almeno 6 amminoacidi;

-(b) ha la sequenza identificata in SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:28,SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO:31 o un suo frammento di almeno 12 nucleotidi;

(c) ha la sequenza identificata in SEQ ID NO: 24;

(d) viene ibridata in condizioni stringenti dal filamento complementare della molecola di acido nucleico di SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15,

SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:26, SEQ ID

NO:28, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31;

(e) è degenerata rispetto alla molecola di acido nucleico di (d) ma non viene ibridata dal filamento complementare del genoma del virus TT che codifica ORF1 di TTV.

(f) codifica un polipeptide che ha almeno il 35%, preferibilmente almeno il 40%, più preferibilmente almeno il 50%, e ancora più preferibilmente almeno il 75% di identità con SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO:25, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO:29;o

(g) ha almeno il 50%,preferibilmente almeno il 60%,più preferibilmente almeno il 75% e ancora più preferibilmente almeno il 90% di identità con la sequenza specificata in (b) o almeno il 60%, preferibilmente almeno il 70%, più preferibilmente almeno 1*80% e ancora più preferibilmente almeno il 90% di identità con la sequenza specificata in (c). ;Preferibilmente, detta molecola di acido nucleico contiene due ORE e più preferibilmente contiene tre ORF. ;L'invenzione inoltre si riferisce a una molecola di acido nucleico che codifica il polipeptide virale di sopra o un suo frammento in cui detto polipeptide si differenzia dalla sequenza sopra identificata per la sostituzione di uno o più amminoacidi, delezione di amminoacidi, inserzioni di amminoacidi, inversioni di amminoacidi o duplicazioni di amminoacidi. ;In aggiunta, la presente invenzione fornisce una molecola di acido nucleico che viene specificamente ibridata dal filamento complementare della molecola di acido nucleico che ha la sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 26 specificata sopra o da detta molecola di acido nucleico o che è identica a detta molecola di acido nucleico o a detto suo filamento complementare in cui detta molecola di acido nucleico comprende almeno 12 nucleotidi, preferibilmente almeno 18 nucleotidi, più preferibilmente almeno 21 nucleotidi e più preferibilmente almeno 25 nucleotidi. ;Detta molecola di acido nucleico comprende sequenze codificanti, non codificanti, sequenze che. sono complementari al filamento codificante e, ogniqualvolta applicabile, sequenze antisenso. Esempi di sequenze virali non codificanti sono le sequenze ai terminali 5’ e 3', come 3'UTR o 5'IRES ("internai ribosome entry site"), o sequenze ripetute al 5'e 3*.Queste possono conprendere sequenze regolatorie per l'inizio della trascrizione. Inoltre tali regioni non codificanti possono essere sequenze di introni. La molecola di acido nucleico può inoltre estendersi al 5' o 3' della SEQ ID NO: 26 specificata sopra sia quando abbia una sequenza nucleotidica identica nelle parti sovrapposte di detta sequenza o della sequenza complementare, quando vi si è ibridata, sia quando viene ibridata dal suo filamento complementare.

In una realizzazione preferita, detto frammento della molecola di acido nucleico della presente invenzione codifica un epitopo che reagisce con anticorpi specifici per il virus SEN ma non con anticorpi specifici per il virus dell'epatite A, B, C, D, E, G, non-B, E, o il virus TT.

In ancora un'altra realizzazione preferita, la molecola di acido nucleico della presente invenzione è un "primer". Detto primer può comprendere la(e) sequenza(e) come definita(e) in SEQ ID NO:11, SEQ ID NO: 12 o SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23.

Tali primer possono essere usati in una reazione di PCR per amplificare la sequenza interposta o, in alternativa, possono essere usati come sonde per determinare direttamente il virus senza amplificazione. SEQ ID NO: 13 può inoltre essere usata per determinare il prodotto di PCR ottenuto con SEQ ,ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12. In alternativa, un primer avente SEQ ID NO: 13 o primer aventi SEQ ID NO: 18, 19, 22 o 23 possono essere usati per determinare direttamente il DNA virale, e dunque il virus, senza amplificazione.

La molecola di acido nucleico dell'invenzione può essere DNA quale cDNA o KNA quale mRNA. In aggiunta, la molecola di acido nucleico dell'invenzione può essere PNA. La sua origine può essere naturale, sintetica o semi-sintetica o può essere un derivato, quale un acido nucleico peptidico.

Inoltre, detta molecola di acido nucleico può essere una molecola di acido nucleico chimerica prodotta per via ricombinante, che comprende -una qualsiasi delle summenzionate molecole di acido,nucleico da sole o in combinazione. Preferibilmente, detta molecola di acido nucleico è parte di un vettore.

La presente invenzione pertanto si riferisce anche a un vettore che comprende la molecola di acido nucleico della presente invenzione.

Il vettore della presente invenzione può essere per esenpio un plasmide, cosmide, virus, batteriofago o un altro vettore per esempio usato convenzionalmente nell'ingegneria genetica, e può conprendere ulteriori geni come i geni marcatori che permettono la selezione di detto vettore in una opportuna cellula ospite e in opportune condizioni.

Inoltre, il vettore della presente invenzione può conprendere, in aggiunta alle sequenze di acido nucleico dell'invenzione, elementi di controllo dell'espressione, consentendo l'espressione delle regioni codificanti in opportuni ospiti. Tali elementi di controllo sono noti al tecnico del settore e possono comprendere un promotore, un codone di inizio della traduzione, un sito di inserzione e di traduzione per introdurre un inserto nel vettore.Preferibilmente, la molecola di acido nucleico dell'invenzione viene funzionalmente legata a dette sequenza di controllo dell'espressione permettendo l'espressione in cellule eucariote o procariote.

Elementi di controllo che assicurano l'espressione in cellule eucariote e procariote sono noti agli esperti dell'arte. Come detto sopra, normalmente questi comprendono sequenze regolatorie che assicurano l'inizio della trascrizione ed eventualmente segnali di poli-A che assicurano la terminazione della trascrizione e la stabilizzazione del tra--scritto.Elementi regolatori aggiuntivi possono comprendere gli intensificatori ( "enhancers") della trascrizione e della traduzione, e/o regioni promotori naturalmente associate o eterologhe. Possibili elementi regolatori che permettono l'espressione per esempio in cellule ospiti di mammifero conprendono il promotore della timidina chinasi CMV-HSV,SV40, il promotore RSV (Rous sarcoma virus), il promotore del fattore di allungamente umano 1a, l'intensificatore ("enhancer") di CMV o l'intensificatore SV40. Per l'espressione in cellule procariote, sono stati descritti numerosi promotori, compresi per esempio il promotore tac-lac o il promotore trp. Oltre agli elementi che sono responsabili dell'inizio della trascrizione, tali elementi regolatori possono inoltre comprendere segnali di terminazione della trascrizione, quali il sito poli-A di SV40 o il sito poli-A-tk, a valle del polinucleotide. In questo contesto vettori di espressione idonei sono noti nell'arte quali il vettore di espressione di cDNA di Okayama-Berg pcDVl (Pharmacia), pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (In-vitrogene), pSPORTl (GIBCO ERL), o vettori di espressione procariota, quale il lambda gtll. Oltre alle molecole di acido nucleico della presente invenzione, il vettore può inoltre comprendere sequenze di acido nucleico che codificano segnali di secrezione. Tali sequenze sono ben note agli esperti dell'arte. Inoltre, in base al sistema di espressione usato, sequenze guida ("leader") capaci di dirigere il polipeptide a un compartimento cellulare, possono essere aggiunte alla sequenza codificante delle molecole di acido nucleico dell'invenzione. Tali sequenze sono note nell'arte. La(e) sequenza(e) leader viene (vengono) assemblata(e) in opportuna fase con sequenze di traduzione, inizio e terminazione,e preferibilmente.una sequenza leader capace di dirigere la secrezione della proteina tradotta, o una sua proteina, nello spazio periplasmatico o nel terreno extra-cellulare. Eventualmente, la sequenza eterologa può codificare una proteina di fusione conprendente un peptide di identificazione al C- o all'N-terminale che conferisce le caratteristiche desiderate, per esempio stabilità o seraplicità di purificazione del prodotto ricombinante esp«resso.Dopo che il vettore è stato incorporato nell'ospite appropriato, l’ospite viene mantenuto in condizioni idonee per avere alti livelli di espressione delle sequenze nucleotidiche, e, quando desiderato, si può successivamente raccogliere e purificare il (i) (poli)peptide(i) dell'invenzione o suoi frammenti.Naturalmente il vettore può inoltre comprendere regioni regolatori ricavate dall'agente virale dell'invenzione.

Inoltre, il vettore della presente invenzione può anche essere un vettore di trasferimento genico o di "targeting". La terapia genica, che è basata sull'introduzione di geni terapeutici, per esempio per la vaccinazione di cellule attraverso tecniche ex-vivo o in-vivo, è una delle più importanti applicazioni del trasferimento genico. Vettori idonei e metodi di terapia genica in vitro o in vivo sono descritti nella letteratura e sono noti ai tecnici esperti nell'arte; si veda per esempio Giordano,Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ.Res.

79 (1996), 911-919: Anderson, Science 256, (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res.77 (1995), 1077-1086; VJang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469·; WO 97/00957 o Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640, e i riferimenti ivi citati. Le molecole di acido nucleico e i vettori dell'invenzione possono essere disegnati per l'introduzione diretta o per l'introduzione attraverso liposomi, o vettori virali (per esempio, adenovirali, retrovirali) nella cellula. In aggiunta, il sistema baculovirus può essere usato come sistema di espressione eucariota per le molecole di acido nucleico dell'invenzione.

La presente invenzione inoltre si riferisce a una cellula ospite trasfettata o trasformata con il vettore dell'invenzione o a un ospite non umano che porta il vettore della presente invenzione, cioè a una cellula ospite o un ospite che viene geneticamente modificato con una molecola di acido nucleico secondo l'invenzione o con un vettore che conprende tale molecola di acido nucleico. Il termine "geneticamente modificato" significa che la cellula ospite o l'ospite in aggiunta al suo genoma naturale conprende una molecola di acido nucleico o un vettore secondo l'invenzione che è stato introdotto nella cellula o nell'ospite o in uno dei suoi predecessori/genitori.La molecola di acido nucleico o il vettore può essere presente nella cellula ospite o nell'ospite geneticamente modificati o come molecola indipendente all'esterno del genoma,preferibilmente come molecola in grado di replicarsi,o può essere stabilmente integrata nel genoma della cellula ospite o dell'ospite.

La cellula ospite della presente invenzione può essere qualsiasi cellula procariota o eucariota. Cellule procariote idonee sono quelle che vengono generalmente usate per clonare, quali Escherichia coli o Bacillus subtilis. Inoltre, le cellule eucariote conprendono per esempio cellule di funghi o animali. Esempi di cellule fungine idonee sono cellule di lievito, preferibilmente quelle del genere Saccharomyces e più preferibilmente quelle della specie Saccharomyces cerevisiae. Cellule animali idonee sono, per esempio,cellule di insetti, cellule di vertebrati, preferibilmente cellule di mammifero, e più preferibilmente cellule non neuronali, quali per esempio CHO, Hela, NIH3T3, M0LT-4, Jurkat,K562,HepG2.

Ulteriori linee cellulari idonee note nell'arte sono ottenibili dalle collezioni di linee cellulari, come l'American Type Culture Collection (ATCC).

Inoltre, ancora in un'altra realizzazione preferita, l'invenzione si riferisce a una cellula ospite che viene trasfettata in vitro con il virus della presente invenzione.

In una realizzazione più preferita la cellula ospite che viene trasfettata in vitro con il virus dell'invenzione è una cellula epatica, un macrofago, un linfocita, una cellula epiteliale o un osteocita o una linea cellulare derivata da questi.

L'ospite può essere mammifero, più preferibilmente una scimmia o una scimmia antropomorfa. Detti mammiferi possono essere indispensabili per sviluppare una cura, preferibilmente un vaccino contro l'agente virale.

Inoltre, la presente invenzione si riferisce a un metodo per produrre un (poli)peptide codificato dalla molecola di acido nucleico dell'invenzione che comprende la coltura della cellula ospite della presente invenzione in condizioni idonee che permettano la sintesi di detto (poli)peptide e che comprende il recupero e/o l'isolamento del -(poli)peptide prodotto dalla coltura.

In aggiunta, la presente invenzione si riferisce a un (poli)peptide codificato dalla molecola di acido nucleico dell'invenzione o prodotto attraverso o ottenibile con il metodo sopra descritto. Il termine "(poli)peptide" indica sia un peptide, sia un polipeptide.

I (poli)peptidi della presente invenzione possono essere (poli)peptidi ricombinanti espressi in cellule ospiti come batteri, lieviti,o altre cellule eucariote,come cellule di mammifero o di insetto.

In alternativa possono essere isolati da preparati virali.

In un'altra realizzazione della presente invenzione, possono essere usati (poli)peptidi sintetici. Pertanto, tale (poli)peptide può essere un (poli)peptide codificato dalla molecola di acido nucleico dell’invenzione che conprende solo residui amminoacidici presenti in natura, ma può anche essere un (poli)peptide modificato. Le modifiche includono derivati covalenti, quali esteri alitatici o ammidi di un gruppo carbossilico, O-acetil-derivati di residui contenenti idrossili e N-acil-derivati di residui contenenti amminogruppi. Tali derivati possono essere preparati mediante legame a gruppi reattivi che sono presenti nelle catene laterali di residui amminoacidici e ai terminali N- e C- della proteina. Inoltre, i (poli)peptidi possono essere radiomarcati o marcati con un gruppo rivelabile, quale un chelato di terre rare covalentemente legato, o coniugati a un gruppo fluorescente. Il (poli)peptide della presente invenzione può essere, per esempio, il prodotto di espressione di una sequenza nucleotidica codificante tale (poli)peptide, un prodotto di modificazione chimica o può essere purificato da fonti naturali, per esempio preparati virali. Inoltre,può essere il prodotto di legame covalente di domini del (poli)peptide.

In aggiunta, le sequenze amminoacidiche che rappresentano il (i) (poli)peptide(i) della presente invenzione possono essere facilmente sintetizzate chimicamente usando sintetizzatori ben noti nell'arte e commercialmente disponibili.

In ancora un'altra realizzazione preferita, la presente invenzione si riferisce a un virus che reca il genoma rappresentato dalla molecola di acido nucleico della presente invenzione.

In una ancora più preferita realizzazione, questo virus è un virus SEN. SEN virus significa un virus, o un tipo di virus, una classe di virus o un sottotipo di virus, per esempio, SEN-VB o SEN-VA che conprende un genoma avente almeno una ORF, preferibilmente due ORF e ancora più preferibilmente le tre diverse ORF sopra identificate.

Inoltre il virus SEN della presente invenzione può essere un derivato non patogeno del virus specificato sopra, preferibilmente un virus attenuato. Il virus attenuato è un ceppo selezionato di un virus virulento che non causa i sintomi clinici associati al virus originario, ma che ancora si replica abbastanza bene da indurre immunità. L'esperto del settore conosce i metodi comunemente usati per ottenere tali ceppi virali attenuati. I metodi possono seguire protocolli convenzionali come descritto in Mahy,BWJ and Kangro,H.O. "Virolpgy Method Manual",Academic Press London (1996). L'attenuazione può essere ottenuta per riscaldamento o per trattamento chimico o per ingegneria genetica in cui il virus viene privato dei suoi geni patogeni o di loro parti. I ceppi attenuati vengono solitamente ottenuti per passaggio in coltura cellulare o in un ospite diverso dall'ospite naturale. In alternativa, un ceppo attenuato può essere costruito utilizzando l'informazione genomica del virus SEN qui fornita, e sfruttando tecniche ricombinanti. Questi ceppi attenuati sono utili per vaccini o per l'isolamento di antigeni.

Inoltre, la presente invenzione si riferisce a un metodo p>er produrre il virus dell'invenzione che comprende la coltura della cellula ospite sopra menzionata in condizioni idonee e l'isolamento del virus dalla coltura. A questo scopo, i surnatanti di dette colture possono essere raccolti o le cellule infette possono essere usate per ottenere il virus prodotto. Metodi comuni sono per esempio descritti in Harden MR, "Approaches to anti-viral agents",VCH Puc. (Eds), (1986).

Nella realizzazione più preferita, il virus della presente invenzione o il virus prodotto con il metodo descritto sopra è trasmissibile attraverso il sangue.

Inoltre, l'invenzione si riferisce a un (poli)peptide isolato da preparati virali in cui detto preparato virale conprende un virus dell'invenzione.Tra l'altro, i (poli)peptidi virali possono essere isolati e/o preparati usando metodi cromatografici, come la cromatografia d'affinità sfruttando anticorpi diretti contro questi (poli)peptidi.

La presente invenzione inoltre si riferisce a un anticorpo, un frammento o un suo derivato o un aptamero che specificamente riconosce un epitopo sull'acido nucleico, sul (poli)peptide o sul virus dell'invenzione. La metodologia generale per produrre ·anticorpi è ben nota ed è stata descritta per esempio in Ktìhler and Milstein, Nature 256 (1975), 494 e illustrata in J.G.R. Hurrel, ed., "Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techniques and Applications", CRC Press Ine.,Boco Raron,FL (1982), così come insegnata da L.T. Mimms et al., Virology 176 (1990), 604-619. Secondo la presente invenzione il termine "anticorpo" si riferisce a anticorpi monoclonali o policlonali.I frammenti anticorpali o derivati comprendono i frammenti F(ab')2, Fab, Fv o scFv; vedere per esempio Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, NY. Preferibilmente, 1'anticorpo dell'invenzione è un anticorpo monoclonale. Inoltre, in accordo con la presente invenzione, i derivati dell'invenzione possono essere prodotti con la tecnica dei peptidomimetici. Nel contesto della presente invenzione, il termine "aptamero" comprende acidi nucleici quali KNA, ssDNA (ss = singolo filamento), RNA modificato, ssDNA o PNA modificati che legano le diverse sequenze bersaglio con alta specificità e affinità.

L'invenzione inoltre si riferisce a un derivato del (poli)peptide dell'invenzione che viene specificamente riconosciuto dall1anticorpo o fralimento o suo derivato o un aptamero dell'invenzione. Tali derivati possono essere prodotti per via (semi)sintetica, per esempio chimicamente. I metodi di produzione possono inoltre basarsi sulla tecnica dei peptidomimetici.Tali metodi di produzione sono noti nell'arte e possono essere applicati dagli esperti dell'arte senza sforzo.

Inoltre la presente invenzione si riferisce a un ibridoma che produce l'anticorpo della presente invenzione. La preparazione di un ibridoma è ben nota all'esperto, si veda per esempio Harlow and Lane, loc.cit..

Oltre a ciò, la presente invenzione si riferisce a un metodo per la determinazione dell'anticorpo o di frammenti o del derivato di esso o di un aptamero dell'invenzione in un campione, metodo che comprende

(a) l'incubazione di detto campione con l'acido nucleico, il virus o il (poli)peptide dell'invenzione o suoi frammenti o con un derivato del (poli)peptide descritto sopra; e

(b) la determinazione della formazione di un conplesso tra detto anticorpo, detto frammento, detto derivato di anticorpo e detto (poli)peptide, acido nucleico o virus.

Inoltre, la presente invenzione si riferisce a una proteina di fusione che conprende il (poli)peptide della presente invenzione. I (poli)peptidi della presente invenzione possono comprendere un ulteriore dominio, detto dominio essendo legato da legame covalente o noncovalente.Il legame può essere basato sulla fusione genetica secondo i metodi noti nell'arte (Sambrook et al., loc. cit., Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y. (1989))o può essere attuato,per esempio, attraverso cross-linking chimico come descritto per esempio in WO 94/04686. Il dominio aggiuntivo presente nella proteina di fusione che conprende il (poli)peptide dell'invenzione può preferibilmente essere legato da un legante flessibile,vantaggiosamente da un legante polipeptidico, in cui detto legante polipeptidico comprende amminoacidi multipli idrofili legati al peptide, di una lunghezza sufficiente a coprire la distanza tra l'estremità C-terminale di detto ulteriore dominio ,e l'estremità literminale del peptide, polipeptide o anticorpo o viceversa. La proteina di fusione sopra descritta può inoltre comprendere un legante scindibile o un sito di scissione che,per esempio,viene specificamente conosciuto e tagliato dalle proteinasi o da agenti chimici.

In aggiunta, detto ulteriore dominio può avere specificità o funzione predefinite. In questo contesto è inteso che i (poli)peptidi dell'invenzione possono essere ulteriormente modificati con metodi convenzionali noti nell'arte.Questo permette la costruzione di proteine di fusione che comprendono il (poli)peptide dell'invenzione e altre sequenze amminoacidiche funzionali, per esempio segnali di localizzazione nucleare, domini di transattivazione, domini di legame al DNA, domini di legame degli ormoni, marcature proteiche (GST, GFP, peptide h-rayc, FLAG,peptide HA)che possono essere derivati da proteine eterologhe.

In ancora un'altra realizzazione la presente invenzione si riferisce a un polipeptide mosaico che conprende almeno due epitopi del (poli)peptide dell'invenzione o virus dell'invenzione in cui detto polipeptide mosaico non ha gli amminoacidi normalmente presenti tra gli epitopi nel genoma del virus SEN nativo.

Tra l'altro, tali polipeptidi-mosaico sono utili nelle applicazioni e nei metodi qui descritti, dal momento che gli stessi possono conprendere diversi epitopi immunologicamente rilevanti all'interno di un singolo peptide o (poli)peptide,eventualmente presentati linearmente o come sistema peptidico multi-antigenico in caso di lisine. Epitopi rilevanti possono essere separati da regioni spaziatrici.

In un'altra realizzazione, la presente invenzione si riferisce alla molecola di acido nucleico, al (poli)peptide, al derivato del (poli)peptide, al virus; all'anticorpo o al suo frammento o derivato, alla proteina di fusione, al polipeptide mosaico, o al primer dell'invenzione che viene marcato in maniera rivelabile. Varie tecniche sono disponibili per la marcatura delle biomolecole, note agli esperti del settore, e sono considerate conprese nell'ambito della presente invenzione.Tali tecniche sono descritte per esempio in Tijssen, "Practice and Theory of enzyme iiranuno assays", Burden, RH and von Knippenburg (Eds), Voi. 15 (1985), "Basic methods in molecular biology"; Davis LG, Dibmer MD; Battey Elsevier (1990), Mayer et al., (Eds) "Immunocheraical methods in celi and molecular biology" Academic Press, London (1987), o nella serie "Methods in Enzymology",Academic Press, Ine.

Esistono molti diversi marcatori e metodi di marcatura noti agli esperti dell'arte. Esempi di tipi di marcature che possono essere usate nella presente invenzione comprendono enzimi, radioisotopi, metalli colloidali, conposti fluorescenti, composti chemiluminescenti, e composti bioluminescenti.

Marcatori comunemente usati comprendono, tra l'altro, fluorocromi (come fluoresceina, rodamina, Rosso Texas, ecc.), enzimi (come perossidasi di rafano, β-galattosidasi, fosfatasi alcalina), isotopi radioattivi (come 32P o 125I), biotina, digossigenina, metalli colloidali,composti chemi- o bioluminescenti (come diossetani, luminolo o acridini). Procedure di marcatura, come l'accoppiamento covalente di enzimi o grippi biotinile, iodurazione, fosforilazione, biotinilazione, "random priming", "nick-translations", "tailing" (usando trasferasi terminali)sono ben noti nell'arte.

Metodi di rivelazione comprendono, ma non.,sono limitati a, autoradiografia, microscopia di fluorescenza, reazioni enzimatiche dirette o indirette,ecc.

Inoltre, la presente invenzione si riferisce a una fase solida che viene attaccata a

(a) la molecola di acido nucleico;

(b) il (poli)peptide;

(c) il derivato di detto (poli)peptide;

(d) il virus;

(e) 1'anticorpo o frammento o suo derivato o l'aptamero;

(f) la proteina di fusione; e/o

(g) il polipeptide mosaico, tutto come sopra descritto.

Fasi solide sono note agli esperti dell'arte e possono conprendere beads di polistirene, beads di lattice, beads magnetiche, particelle di metallo colloidale, "chips" e superfici di vetro e/o silicio; strisce, membrane, fogli di nitrocellulosa; eritrociti di sangue animale o eritrociti "ghost", duraciti e le pareti di pozzetti di una piastra di reazione,provette di plastica o altre provette.

Metodi idonei di immobilizzazione di acidi nucleici, (poli)peptidi, proteine,anticoipi, virus, ecc., su fasi solide comprendono ma non sono limitati a interazioni ioniche, idrofobiche, covalenti e simili. La fase solida può trattenere uno o più recettori aggiuntivi che hanno la capacità di attirare e immobilizzare la regione come definita sopra. Tali recettori possono comprendere una sostanza con carica opposta rispetto allo stesso reagente o rispetto a una sostanza con carica coniugata al reagente di cattura, o il recettore può essere qualsiasi partner di legame specifico che viene immobilizzato su (attaccato a)la fase solida e che è in grado di immobilizzare il reagente come definito sopra.

Saggi di rivelazione normalmente usati possono conprendere metodi radio-isotopici o non-radioisotopici. Questi comprendono, tra l'altro, RIA (Radioisotopic Assay) e IRMA (Immune Radioimmunometric Assay), EIA (Enzyme Immuno Assay), ELISA (Enzyme Linked Immune Assay), FIA (Fluorescent Immuno Assay), e CLIA (Chemioluminescent Immune Assay). Altri metodi di rivelazione usati nell'arte sono quelli che non utilizzano molecole traccianti. Un prototipo di questi metodi è il saggio di agglutinazione,basato sulla proprietà di una data molecola di unire almeno due particelle.

Come è chiaro alla persona esperta nell'arte, c'è la necessità di metodi specifici e sensibili per lo screening e l'identificazione di veicoli di virus SEN e fluidi corporei o prodotti ematici contaminati. Pertanto,in un altro aspetto, la presente invenzione si riferisce a una composizione diagnostica che comprende:

(a) la fase solida;

(b) la molecola di acido nucleico;

(c) il (poli)peptide;

(d) il derivato di detto (poli)peptide;

(e) il virus;

(f) l'anticorpo o frammento o suo derivato o l'aptamero;

(g) la proteina di fusione;

(h) un primer o una coppia di primer; e/o

(i) il polipeptide mosaico della presente invenzione, tutti come descrìtti sopra.

Per la diagnosi e quantificazione di virus, frammenti virali, derivati, (poli)peptidi, polinucleotidi, ecc., in campioni clinici e/o scientifici, sono stati sviluppati diversi metodi immunologici, come descritto sopra, e pure metodi di biologia molecolare, come saggi di ibridazione di acido nucleico, saggi PCR o immunosaggi enzimatici per DNA (Mantero et al., Clinical Chemistry 37 (1991), 422-429), ben noti nell'arte. In questo contesto, si fa presente che le molecole di acido nucleico dell'invenzione possono anche comprendere i FNA, analoghi di DNA che contengono legami ammidici nella struttura. Tali PNA sono utili fra l'altro come sonde per ibridazione di DNA/ENA. Il (poli)peptide dell'invenzione può essere utile tra l'altro per la determinazione di anticorpi antivirali da campioni di test biologici di individui infetti. E' inoltre prevista la possibilità che gli anticorpi dell'invenzione possano essere utili nel discriminare le infezioni acute da quelle non acute.

La composizione diagnostica eventualmente comprende mezzi idonei di rivelazione. I (poli)peptidi e gli anticorpi o loro frammenti e derivati o aptameri descritti sopra sono adatti per esempio per l'uso in immunosaggi in cui possono essere utilizzati in fase liquida o legati a un veicolo in fase solida.Esempi di immunosaggi che possono utilizzare detti (poli)peptidi sono immunosaggi competitivi e non competitivi in forma diretta o indiretta. Esempi di tali immunosaggi, come già descritto sopra, sono il radioimmunosaggio (RIA), il saggio a sandwich (saggio immunometrico) e il Western blot. I (poli)peptidi, anticorpi, polipeptidi mosaico e/o proteine di fusione possono essere legati a differenti veicoli. Esempi di ben noti veicoli comprendono vetro, polistirene, polivinil cloruro, polipropilene, polietilene, policarbonato, destrano, nylon, amilosi, cellulose naturali e modificate, poliacrilammidi, agarosi e magnetite. Il veicolo può essere sia solubile sia insolubile per gli scopi dell'invenzione. I marcatori appropriati e i metodi per marcare sono stati identificati sopra.

Dette composizioni diagnostiche possono essere usate in metodi per la determinazione dell'espressione di una molecola di acido nucleico dell'invenzione attraverso la rivelazione della presenza di mRNA che codifica per un (poli)peptide o una proteina virale dell'invenzione che comprende, per esempio, l'ottenimento di mRNA da preparati virali e la messa in contatto dell'mRNA così ottenuto con una sonda/primer che conprende una molecola di acido nucleico capace di ibridare specificamente con un polinucleotide dell'invenzione in condizioni idonee (vedere anche sopra), e la rivelazione dell'mRNA ibridato alla sonda/primer. Altri metodi diagnostici che portano alla rivelazione di molecole di acido nucleico in un campione comprendono, per esempio, la reazione a catena della polimerasi (PCR), la reazione a catena della ligasi (LCR), il Southern blotting in combinazione con l'ibridazione di acido nucleico, l'ibridazione genomica comparativa (CGH) o l'analisi di rappresentazione differenziale (RDA). Questi metodi per saggiare la presenza di acido nucleico sono noti nell'arte e possono essere attuati senza alcuna sperimentazione aggiuntiva. Naturalmente la composizione diagnostica può essere sfruttata anche per la determinazione di virus, (poli)peptidi virali o altra molecola di acido nucleico dell'invenzione quale il genoma virale.

La presente invenzione inoltre si riferisce a un kit che comprende: (a) la fase solida;

(b) la molecola di acido nucleico;

(c) il (poli)peptide;

(d) il derivato del (poli)peptide;

(e) il virus;

(f) l'anticorpo o il frammento o suo derivato o l'aptamero;

(g) la proteina di fusione;

(h) un primer o una coppia di printer;e/o

(i) il polipeptide mosaico come descritto sopra.

Convenientemente, il kit della presente invenzione conprende inoltre eventuale/i tampone(i) di reazione, soluzioni di conservazione e/o altri reagenti o materiali richiesti per la conduzione di saggi scientifici o diagnostici o simili. Inoltre, parti del kit dell'invenzione possono essere confezionate individualmente in vials o bottìglie o in combinazione in contenitori o unità multicontenitori.

Il kit della presente invenzione può essere vantaggiosamente usato, tra l'altro, per attuare il metodo dì produzione di un (poli)peptide dell'invenzione e potrebbe essere sfruttato in una varietà di applicazioni qui riferite, per esempio, come kit diagnostici, "tool" di ricerca o "tool" di vaccinazione. In aggiunta, il kit dell'invenzione può contenere mezzi di rivelazione idonei per scopi scientifici, medici e/o diagnostici. La produzione del kit segue preferibilmente procedure standard che sono note all'esperto nell'arte.

Inoltre, in un’altra realizzazione, la presente invenzione si riferisce a una composizione farmaceutica che comprende:

(a) la molecola di acido nucleico;

(b) il (poli)peptide;

(c) il derivato del (poli)peptide;

(d) il virus attenuato;

(e) il derivato non patogeno;

(f) l'anticorpo o suo frammento o derivato o l'aptamero;

(g) la proteina di fusione; e/o

(h) il polipeptide mosaico della presente invenzione.

In una composizione più preferita, detta composizione è una conposizione farmaceutica.

La composizione farmaceutica della presente invenzione può inoltre comprendere un veicolo, eccipiente e/o diluente farmaceuticamente accettabili. Esempi di veicoli farmaceuticamente adatti sono ben noti nell'arte e comprendono soluzioni saline tamponate con fosfato, acqua, emulsioni, quali emulsioni olio/acqua, vari tipi di agenti umettanti, soluzioni sterili, ecc. Le composizioni che comprendono tali veicoli possono essere formulate con metodi convenzionali ben noti. Queste composizioni farmaceutiche possono essere somministrate al soggetto ad un opportuno dosaggio. La somministrazione delle composizioni adatte può essere effettuata in diversi modi, per esempio con'somministrazioni endovenose, intraperitoneali, subcutanee, intramuscolari, topiche, intradermiche, intranasali o intrabronchiali. Il regime di dosaggio sarà determinato dal medico curante e da fattori clinici. Come è noto nell'arte medica, i dosaggi per qualsiasi paziente dipendono da molti fattori, compresi il peso del paziente, l'area superficiale del corpo, l'età, il particolare composto da somministrare, il sesso, il tempo e la via di somministrazione, la salute generale e l'eventuale somministrazione contemporanea di altri farmaci.

Il materiale proteico farmaceuticamente attivo può essere presente in quantità comprese tra 1 ng e 10 mg per dose; tuttavia, sono previste dosi al di sotto o al di sopra di questo intervallo esenplificativo specialmente considerando i fattori prima menzionati. La somministrazione delle composizioni adatte può essere effettuata in diversi modi, per esempio attraverso la somministrazione endovenosa, intraperitoneale, subcutanea, intramuscolare, topica o intradermica. Se la somministrazione è un'infusione continua, tale materiale dovrebbe inoltre essere nell'intervallo di unità da 1 μg a 10 mg per chilogrammo di peso corporeo per minuto. I progressi possono essere monitorati attraverso valutazioni periodiche. Le conposizioni dell'invenzione possono essere somministrate localmente o per via sistemica. La somministrazione in generale sarà per via parenterale, per esempio, per via endovenosa. Le conposizioni dell'invenzione possono inoltre essere somministrate direttamente nel sito bersaglio, per esempio, attraverso il "delivery" biolistico a un sito bersaglio interno o esterno o attraverso un catetere in un'arteria. Le preparazioni per somministrazione parenterale conprendono soluzioni, sospensioni ed emulsioni sterili acquose o non acquose. Esempi di solventi non acquosi sono glicolpropilenico, glicolpolietilenico, olii vegetali quali olio d'oliva,e esteri organici iniettabili quale etiloleato. Veicoli acquosi conprendono acqua, soluzioni, emulsioni o sospensioni alcolico/acquose, compresi i mezzi salini e tamponati. I veicoli parenterali comprendono soluzioni di cloruro di sodio, soluzione di Ringer con destrosio, destrosio e cloruro di sodio, soluzione di Ringer con lattato, o olii fissati.

Veicoli endovenosi conprendono integratori di fluidi e di nutrienti, integratori elettrolitici (quali quelli basati sulla soluzione di Ringer con destrosio) e simili. Possono inoltre essere presenti conservanti e altri additivi quali per esempio antimicrobici, antiossidanti, agenti chelanti e gas inerti e simili. Inoltre, la composizione farmaceutica dell'invenzione può comprendere altri agenti quali interferoni o interleuchine a seconda dell'uso a cui è destinata la composizione farmaceutica.

In una realizzazione preferita, la composizione farmaceutica della presente invenzione è un vaccino. I vaccini possono essere preparati, tra l'altro, a partire da uno o più (poli)peptidi, derivati di polipeptidi, molecole di acido nucleico, polipeptidi mosaico, proteine di fusione,virus,.derivati non patogeni/attenuati dei virus, anticorpi, frammenti di detti anticorpi, derivati degli anticorpi o aptameri dell'invenzione.

Per esempio, le molecole di acido nucleico dell'invenzione possono essere usate per vaccinazioni geniche o come vaccini a DNA. Le vie di somministrazione di vaccini genici sono ben note nell’arte e la vaccinazione con DNA è stata impiegata con successo per scatenare le risposte immunologiche alloimmunitarie, antitumorali e antiidiotipiche (Tighe M.et al., Imraunology Today 19 (1998),89-97).

Inoltre,si è trovato che l'inoculazione delle molecole di acido -nucleico/DNA protegge in svariati modi dalla malattia virale (Fynan, E.F. et al, Proc. Nati.Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993) 11478-11482, Boyer, I.D., Nat. Med. 3 (1997), 526-532; Webster, R.G. et al., Vaccine 12 (1994), 1495-1498; Montgomery et al., DNA Celi Biol. 12 (1993), 777-783).

I (poli)peptidi, i derivati dei (poli)peptidi, le proteine di fusione che comprendono il (poli)peptide, o il polipeptide mosaico dell'invenzione usati in una composizione farmaceutica come vaccino, possono essere formulati per esempio in forma neutra o salificata. Sali farmaceuticamente accettabili, come sali di addizione con acidi e altri sono noti nell'arte. I vaccini possono essere usati tra l'altro per il trattamento e/o la prevenzione di un'infezione con il virus-della presente invenzione e vengono somministrati a dosaggi compatibili con il metodo di formulazione, e in quantità tali da essere farmacologicamente efficaci per i trattamenti profilattici e terapeutici. Inoltre, le molecole di acido nucleico della presente invenzione possono essere usate come vaccino. Preferibilmente, il vaccino conprende un agente virale attenuato come descritto sopra.

Il protocollo di vaccinazione può comprendere'1'immunizzazione attiva o passiva; l'immunizzazione attiva prevede la somministrazione di "un antigene o di antigeni (come per esempio il virus,i (poli)peptidi, i derivati dei (poli)peptidi, le proteine di fusione, i polipeptidi mosaico e/o le molecole di acido nucleico della presente invenzione) all'ospite/paziente nel tentativo di scatenare una risposta immunitaria protettiva. L'immunizzazione passiva prevede il trasferimento di immunoglobuline preformate o loro frammenti (per esempio gli anticorpi, Bianchetti Giuseppe ed altri i loro derivati o frammenti o gli aptameri della presente invenzione) a un ospite/paziente. Il principio e la pratica della vaccinazione e dei vaccini sono noti al tecnico esperto, si legga per esempio Paul, "Fundamental Immunology", Raven Press, New York (1989) o Cryz, S. J., "Immunotherapy and vaccines", VCH Verlagsgessellschaft (1991). Tipicamente, i vaccini vengono preparati come iniettabili, come sospensioni e soluzioni liquide. Possono essere preparate anche forme solide idonee per la soluzione o sospensione in liquidi prima dell'iniezione.La preparazione può essere emulsionata o la proteina può essere incapsulata nei liposomi. Gli ingredienti immunogeni attivi spesso vengono miscelati con eccipienti farmacologicamente accettabili compatìbili con l'ingrediente attivo. Eccipienti idonei comprendono, ma non sono limitati a acqua, soluzione salina, destrosio, glicerolo, etanolo e simili; possono inoltre essere utilizzate combinazioni di questi eccipienti in varie quantità. Il vaccino inoltre può contenere piccole quantità di sostanze ausiliarie quali, per esempio, umettanti o emulsificanti, agenti di tamponamento del pH, e/o adiuvanti che aumentano l'efficacia del vaccino. Per esempio, tali adiuvanti possono comprendere idrossido di alluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutammina (thr-DMP), N-acetil-nomuramil-L-alanil-D-isoglutammina (CGP 11687, anche riferita come nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamminil-L-alanina-2-(1'2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-idrossifosforilossi)-etilammina (CGP 198358A, anche riferita come MTP-PE) e RIBI (MPL TDM CWS) in un'emulsione al 2% squalene/Tween-80(R .

I vaccini normalmente vengono somministrati per iniezione endovenosa o intramuscolare.Altre formulazioni adatte per altri modi di somministrazione comprendono supposte e in alcuni casi formulazioni orali. Per le supposte, aggreganti e veicoli tradizionali possono conprendere, ma non sono limitati, a glicolpolialchilenico o trigliceridi. La formulazione orale comprende eccipienti normalmente usati come per esempio mannitolo, lattosio, amido, stearato di magnesio, saccarina sodica, cellulosa, carbonato di magnesio, e simili, di grado farmaceutico. Queste conposizioni possono avere la forma di soluzioni, sospensioni, tavolette, pillole, capsule, formulazioni o polveri a rilascio protratto e possono contenere da circa il 10% a circa il 95% di ingrediente attivo,preferibilmente da circa il 25% a circa il 70%.

I vaccini vengono somministrati in maniera conpatibile con la formulazione della dose, e in quantità tali da risultare profilatticamente e/o terapeuticamente efficaci. La quantità da somministrare generalmente è nell'intervallo da circa 5 μg fino a circa 250 μg di antigene per dose, e dipende dal soggetto a cui va somministrata, dalla capacità del sistema immunitario del soggetto di sintetizzare anticorpi, e dal grado di protezione ricercato. Quantità precise di ingrediente attivo richieste per la somministrazione possono dipendere anche dalla valutazione dell'operatore e possono essere individualizzate. Il vaccino può essere dato secondo uno schema di dosaggio singolo o multiplo. Il dosaggio multiplo è un dosaggio tale per cui un primo piano di vaccinazione può fornire da 1 a 10 dosi separate, seguite da altre dosi date a intervalli di tempo successivi, necessarie per mantenere e/o rinforzare la risposta immunitaria, per esempio,a un periodo da 1 a 4 mesi per la secondadose,e se richiesto dal soggetto, una successiva dose(i) dopo diversi mesi. Il regime di dosaggio inoltre sarà determinato almeno in parte dalle necessità del soggetto e dipenderà dal giudizio dell’operatore. Si prevede la possibilità che il vaccino contenente i composti immunogeni dell'invenzione possa essere somministrato in combinazione con altri agenti immunoregolatori, per esempio con immunoglobuline o con citochine.

Inoltre, la presente invenzione si riferisce a un metodo per la determinazione del virus in un campione che comprende

(a) l'ibridazione del DNA da detto campione con la molecola di acido nucleico dell'invenzione o con il vettore dell'invenzione in condizioni stringenti; e

(b) la rivelazione della formazione dell'ibrido di acido nucleico o dell'ibrido PNA acido nucleico.

Ancora un'altra realizzazione dell'invenzione è un metodo per la determinazione del virus dell'invenzione in un campione che comprende (a) l'ibridazione del DNA da un campione con una coppia di primer dell'invenzione;

(b) l'attuazione di una PCR e di un'altra tecnica di amplificazione del DNA;e

(c) la determinazione della formazione di un prodotto di PCR specifico o di un altro prodotto di amplificazione.

Ulteriori tecniche di ampiificazione del DNA idonee sono note nell'arte e comprendono tra l'altro la "Ligase Chain Reaction", la "Strand Displacement Anplification", la "Nucleic Acid Sequence based Amplification" (NASSA),o la "Q-β replicase".

Preferibilmente, l'ibridazione (e il successivo lavaggio) viene effettuata in condizioni stringenti; si veda per esempio Sambrook et. al.,loc.cit..

Inoltre l'invenzione si riferisce a un metodo per la determinazione del virus dell'invenzione in un campione che conprende

(a) l’incubazione di detto campione con 1'anticorpo o frammento o derivato o un aptamero dell'invenzione; e

(b) la rivelazione della formazione del complesso tra un (poli)peptide o virus presenti in detto campione e detto anticorpo o suo frammento o derivato o detto aptamero.

In aggiunta, l’invenzione si riferisce a un metodo per la determinazione in un campione dell'anticorpo o suo frammento o derivato o di un aptamero dell'invenzione,che conprende:

a) l'incubazione di detto campione con la molecola di acido nucleico dell'invenzione, il virus dell'invenzione o il (poli)peptide dell'invenzione.o suoi frammenti o con il derivato del (poli)peptide dell'invenzione,e

b) la rivelazione della formazione di un conplesso-tra detto anticorpo, detto frammento o detto derivato di anticorpo e detta molecola di acido nucleico, detto virus o detto (poli)peptide o detti frammenti o derivati.

Metodi di determinazione di infezioni virali sono noti nell'arte e comprendono, oltre a saggi immunologici, tecniche microscopiche, quali immunorivelazioni in microscopia ottica ed elettronica (vedere per, esempio Fields, "Virology",3a edizione,Lippincott-Raven (1996); Evans, A.S. "Virai Infections of Humans" (1989), Plenum Publishing Corporation).

.In una ancora più preferita realizzazione, l'invenzione si riferisce a un metodo come descritto sopra in cui dette molecole di acido nucleico, almeno uno di detti primer o detto anticorpo o suo frammento o derivato o aptamero vengono marcati in maniera rivelabile.

Tali marcatori sono noti agli esperti nel settore e possono comprendere un "tag", un marcatore fluorescente o un marcatore radioattivo.Qualsiasi metodo di rivelazione per determinare la presenza del virus dell'invenzione o la presenza di anticorpi generati contro,il virus dell'invenzione (realizzazione descritta 'prima) può essere assistito da tecnologie informatiche. I metodi di rivelazione possono essere pertanto automatizzati .attraverso vari sistemi, comprese l'analisi dell'immagine e citometria di flusso.

Inoltre, la presente invenzione si riferisce a un metodo come descritto sopra in cui detto campione è o viene derivato da sangue, siero, sputo, feci o altri fluidi corporei. Il campione da analizzare 'può essere trattato in modo tale da estrarre, tra--l’altro, molecole di acido nucleico, (poli)peptidi o anticorpi.

In ancora un'altra realizzazione, la presente invenzione si riferisce a una preparazione di anticorpi policlonali sostanzialmente isolati con immunoreattività specifica verso la molecola di acido nucleico, il (poli)peptide dell'invenzione o il virus dell'invenzione.

Il metodo per ottenere una tale preparazione di anticorpi policlonali è ben noto all'esperto e può essere attuato senza alcuna sperimentazione ulteriore (vedere Harlow and Lane, loc. cit.). Detti anticorpi policlonali possono essere mono- o polispecifici.

Inoltre, la presente invenzione si riferisce a un metodo per produrre anticorpi contro la molecola di acido nucleico, il (poli)peptide, il derivato o il virus dell'invenzione, che comprende l'immunizzazione di un animale da esperimento con detto (poli)peptide, derivato, virus o derivato non patogeno dell'invenzione e l'isolamento degli anticorpi specifici prodotti. L'anticorpo ottenuto dall'animale può essere ulteriormente manipolato, per esempio, tagliato per ottenere frammenti idonei o può costituire il composto iniziale per produrre anticorpi geneticamente ingegnerizzati o loro derivati quali i frammenti scFv aventi la stessa specificità di legame. In alternativa, può essere il composto di partenza per la produzione di corrispondenti composti sintetici con tecniche peptidomimetiche. La produzione di anticorpi è ben nota nell'arte. Tali anticorpi possono comprendere, ma non sono limitati a, anticorpi policlonali, monoclonali, chimerici, a singola catena o frammenti quali frammenti Fab, e frammenti prodotti mediante libreria di espressione di Fab.

Per la produzione di anticorpi in animali da esperimento, vari ospiti, compresi capre, conigli, ratti, topi e altri, possono essere immunizzati per iniezione dei polipeptidi della presente invenzione o di qualsiasi loro frammento o oligopeptide o derivato che ha proprietà immunogene. Le tecniche per produrre e processare anticorpi policlonali sono note nell'arte e vengono descritte tra l'altro in Hayer and Walker, eds., "Immunochemical Methods in Celi and Molecular Bioiogy", Academic Press, London (1987). Anticorpi policlonali possono inoltre essere ottenuti da un animale, preferibilmente mammifero, precedentemente infettato con il virus dell'invenzione. Metodi per purificare anticorpi sono noti nell'arte e comprendono per esempio la cromatografia di immunoaffinità. In base alla specie dell'ospite, possono essere usati vari adiuvanti o veicoli immunologici per aumentare la risposta immunologica. Tali adiuvanti comprendono, ma non sono limitati a, gli adiuvanti completi o incompleti di Freund', gel minerali quali idrossido di alluminio e sostanze con attività di si3⁄4>erficie quali lisolecitine, polioli pluronici, polianioni, peptidi, emulsioni in olio e dinitrofenolo.Un esempio di veicolo al quale, per esempio, può essere accoppiato un peptide dell'invenzione è la "keyhole limpet hemocyanin" (KLH).

Si preferisce che i (poli)peptidi, frammenti, o oligopeptidi, derivati, usati per la produzione di anticorpi abbiano una sequenza amminoacidica che consiste di almeno 5 amminoacidi, come 6, 7, 8 o 9 e più preferibilmente almeno 10 amminoacidi. E' inoltre preferibile che siano identici a una porzione della sequenza apninoacidica di una proteina naturale e possono contenere l'intera sequenza amminoacidica di una piccola molecola presente in natura. Piccole porzioni di (poli)peptidi o loro frammenti dell'invenzione possono essere fusi con quelli di altre proteine quali la KLH e può essere prodotto un anticorpo contro la molecola chimerica. Sono compresi anticorpi specifici per il (poli)peptide dell'invenzione- Una diversa strategia può essere l'accoppiamento di piccoli peptidi quali apteni a un veicolo quale KLH o BSA usando metodi convenzionali e l'immunizzazione degli animali con tali immunoconiugati.

In un'altra realizzazione, la presente invenzione si riferisce a un metodo di immunizzazione di un soggetto contro il virus SEN che comprende la somministrazione a detto soggetto di almeno una dose del vaccino dell'invenzione. Detto individuo è preferibilmente un essere umano.

Si preferisce fornire al soggetto almeno una iniezione scatenante, come una, due o tre iniezioni scatenanti- Circa le vie di somministrazione, le dosi e gli intervalli di tempo, si fa riferimento ai precedenti passaggi nella descrizione.

In un'ulteriore realizzazione l'invenzione si riferisce a un metodo per la propagazione del virus dell'invenzione che comprende la coltura della cellula ospite dell'invenzione in condizioni idonee per promuovere la propagazione di detto virus. I metodi di propagazione virale sono generalmente noti nell'arte (si veda per esempio Flelds, "Virology", 3a ed., 1996, Lippincott Raven Publishers, Philadelphia) e possono essere adattati dall'esperto dell'arte usando una sperimentazione routinaria.

In ancora un'altra realizzazione l'invenzione si riferisce a un metodo per la propagazione del virus dell'invenzione in un animale che conprende l'inoculo in detto animale di detto virus, parte(i) di detto virus e/o materiale infettato da detto virus. La replicazione di detto virus può essere monitorata nel sangue o in vari organi. Le cellule infette possono essere isolate e utilizzate per preparati virali. Modelli animali usati per i preparati virali e per la propagazione del virus sono ben noti nell'arte e comprendono, ma non sono limitati a, topi, ratti, conigli, cavie, anatre, gatti, cani, scimpanzé, callitricidi.

Le figure mostrano:

Figura 1: prodotti di PCR ottenuti con primer TTV-1 e NG063 usando come stampo DNA estratto dai sieri dèi pazienti indicati. Le frecce indicano la grandezza delle bande ottenute.

Figura 2: allineamento di sequenze di acido nucleico ottenute con i primer TTV-1 e NG063 da pazienti SEN, 37 e 28. Le basi identiche sono indicate dagli asterischi.

Figura 3: allineamento di sequenze di acido nucleico ottenute con i primer TTV-1 e NG063 da paziente SEN e paziente 26. Le basi identiche sono indicate da linee verticali.

Figura 4: allineamento delle sequenze tradotte ottenute con i primer TTV-1 e NG063 da pazienti SEN, 37, 28 e 26. I residui conservati sono indicati dagli asterischi.

Figura 5: strategia di reazione polimerasica a catena con "cammino sul gene" per l'estensione della sequenza. Prodotti PCR ottenuti con DNA estratto dai sieri di paziente SEN e da donatori di sangue sani con i primer NG063 e CWP.La banda a 1200 bp ottenuta con un DNA estratto dal paziente SEN viene indicata con la freccia.

Figura 6: allineamento della sequenza TTV ORF1 con la sequenza tradotta CWP SEN 001 derivata dal paziente SEN. I residui identici vengono indicati con barre verticali. Sono state introdotte interruzioni per ottimizzare l'allineamento, Figura 7: analisi di immunosaggio enzimatico di DNA (DEIA) di prodotti PCR ottenuti con i primer 3S e 2AS usando DNA ottenuto dal paziente SEN (campione 1)e da 37 donatori di sangue sani (campioni 2-38). 10 μΐ di prodotto PCR sono stati ibridati con la sonda biotinilata SEN 37 in una piastra con micropozzetti e il materiale legato è stato rivelato come precedentemente descritto con un metodo colorimetrico.

Figura 8: analisi di imnrunosaggio enzimatico di DNA (DEIA) .di prodotti PCR ottenuti con i primer 3S e 2AS usando il DNA ottenuto da 41 soggetti con dipendenza da droga per via endovenosa. 10 μΐ di prodotto PCR sono stati ibridati con una sonda biotinilata SEN 37 in una piastra con micropozzetti e il materiale legato è stato rivelato come precedentemente descritto con un metodo colorimetrico, Figura 9: allineamenti delle sequenze NAE8-1, NAE35-5, NAE9-3 e NAE10-4 ottenute per PCR con i primers 2AS e 3S da quattro pazienti affetti da epatite di eziologia sconosciuta, Figura 10: allineamento della sequenza CWPSEN0001 e della sequenza NAE8-1. I nucleotidi identici sono indicati con barre verticali.

Figura 11: allineamento della sequenza CWPSEN0001 e della sequenza NAE9-3. I nucleotidi identici sono indicati con barre verticali .

Figura 12: allineamento della sequenza CWFSEN0001 e della sequenza NAE10-4. Nucleotidi identici sono indicati con barre verticali.

Figura 13: allineamento della sequenza CWPSEN0001 e della sequenza NAE35-5. Nucleotidi identici sono indicati con barre verticali.

Figura 14: allineamento delle sequenze nucleotidiche CWPSEN001 e SEN-VB. I nucleotidi identici sono indicati con barre verticali.

Figura 15: allineamento delle sequenze amminoacidiche dedotte CWPSEN001 e SEN-VB. I residui identici sono indicati con barre verticali.

Figura 16: allineamento della sequenza amminoacidica dedotta di 0RF1 di TTV e di ORFl di SEN-V. I residui identici sono indicati con barre verticali.

Figura 17: sequenza nucleotidica di SEN-VA e sua traduzione nelle tre fasi di lettura.

•Figura 18: allineamento delle sequenze nucleotidiche di SEN-VA e TTV1. I nucleotidi identici sono indicati con barre verticali.

Figura 19: allineamento delle sequenze nucleotidiche secondo le maggiori ORF di SEN-V e di TTV. I nucleotidi identici sono indicati con barre verticali.

Figura 20: allineamento delle sequenze amminoacidiche previste codificate dalle principali regioni codificanti delle sequenze TTV e SEN-V. I residui identici sono indicati con barre verticali.

Figura 21: allineamento delle sequenze proteiche dedotte dell'0RF2 di TTV e dell'0RF2 di SEN-V. I residui identici sono indicati con barre verticali.

I seguenti esempi illustrano ulteriormente la presente invenzione.

Esempio 1

Stima della diffusione e diversità di TTV nella popolazione italiana usando primers TTV specifici

A seguito della scoperta del TTV, Nishizawa, Hepatology Res 10 (1998) , 1-16, sono state studiate la diffusione e la diversità dell'agente virale nella popolazione. Il metodo PCR "nested" originariamente descritto da Okamoto et al., Hepatology Res 241 (1998), 1-16 è stato usato utilizzando i primer senso NG059 e NG061 e il primer antisenso NG063 come definito in Okamoto et al., loc.cit.

La PCR è stata condotta con una miscela di 50 μΐ contenente lo stampo, 1/10 del DNA estratto da 100 μί di siero con il kit QIAamp blood (QIAGEN), tampone PCR (Tris HCl pH 8.8, 67 m, (NH4SO416,6 mM, 0-mercaptoetanolo 10 mM, 1,5 mM MgC1), 300 ng di ciascun primer per PCR, 200 μΜ di desossiribonucleosidi trifostati (dATP, dCTP, dTTP e dGTP da Boehringer Mannheim, Germania), e 1,25 U di Taq polimerasi (Perkin Elmer). La reazione è stata condotta in un DNA thermal cylcer con olio minerale.La PCR consisteva in un pre-riscaldamento a 94eC per 5 min,45 cicli di 94°C per 1 min, 55°C per 1 min, e 72°C per 1 min, e un'incubazione a 72°C per 7 min. I prodotti di PCR sono stati caricati su un gel di agarosio al 2% con 2 μΐ di bromuro di etidio per mi, per determinare la grandezza dei prodotti amplificati.

Con questi primer, TTV è stato determinato nel 10% dei soggetti facenti uso di droga per via endovenosa e solo nell'1% dei controlli sani donatori di sangue. I campioni sono stati ottenuti dall'Unità Trasfusionale dell'Ospedale Civile di Brescia (Italia). L'analisi di sequenziamento del DNA è stata condotta su 10 campioni positivi al TTV il che ha permesso di identificare che questi ampliconi rappresentavano il genoma di TTV. Inoltre,questa analisi ha rivelato un notevole grado di variabilità tra diversi isolati di TTV italiani.

Esempio 2

PCR a singolo stadio per la valutazione della diffusione e della diversità di TTV nella popolazione italiana Considerando il livello di variabilità e la bassa incidenza di infezione rilevata con primer specifici per TTV come descritto nell'Esempio 1, è stato sviluppato un nuovo metodo di PCR a singolo stadio.

I primer PCR usati in questo saggio erano l'antisenso NG063 di Okamoto et al., loc. cit.e il primer senso TTV-1 S,dedotto sulla base delle sequenze trovate nella popolazione italiana.

La sequenza del primer TTV-1 S era:

, dove R = A o C e Y = C o T (SEQ ID NO:

1) .

La PCR è stata condotta con una miscela di 50 μΐ contenente lo stampo,1/10 del DNA estratto da 100 μΐ di siero con il kit QIAamp blood (QIAGEN), tampone PCR (Tris HCl pH 8.8, 67 nfrt, (NH4)2S0416,6 mM, βmercaptoetanolo 10 mM, 1,5 mM MgC1), 300 ng di ciascun primer PCR, 200 μΜ di desossiribonucleosidi trifosfati (dATP, dCTP, dTTP e dGTP da Boehringer Mannheim, Germania), e 1,25 U di Taq polimerasi (Perkin Elmer). La reazione è stata condotta in un DNA thermal cycler con olio minerale. La PCR consisteva di un pre-riscaldamento a 94°C per 5 min, 45 cicli di 94°C per min, 50°C per 1 min e 72"C per 1 min e un'incubazione a 72°C per 7 min. I prodotti PCR sono stati caricati su un gel di agarosio al 2% con 2 μg di bromuro di etidio per mi, per determinare la grandezza dei prodotti amplificati.

I controlli negativi contenenti tutti i reagenti ma mancanti del DNA stampo sono stati processati normalmente esattamente come descritto sopra per monitorare la contaminazione e sono risultati negativi in tutti gli esperimenti.

Con la PCR a singolo stadio sopra descritta, l'infezione da TTV è stata determinata nel 55% degli utilizzatori di droga per via endovenosa e nel 13% dei donatori di sangue,confermando quindi l'alta incidenza di questo agente virale nella popolazione normale.

Esempio 3

Isolamento e caratterizzazione di differenti prodotti di PCR La PCR è stata condotta su campioni derivati da utilizzatori di droga per via endovenosa come descritto nell'Esenpio 2 sopra.

A differenza del prodotto di PCR di 513 bp, atteso per i campioni positivi al TTV, si è osservato che gli ampliconi derivati da due utilizzatori di droga per via endovenosa (campione SEN e LIM) avevano una lunghezza di 580 bp. Inoltre, il prodotto PCR di altri due utilizzatori di droga endovenosa conteneva entrambi i frammenti di 513 bp e 580 bp (Fig.1).

Al fine di determinare la natura delle’bande di diversa grandezza, gli ampliconi contenenti code di poli A sono stati asportati dal gel di agarosio e il contenuto di DNA è statò purificato e ligato a un vettore pGEM (Promega, Madison, WI, USA). Usando DNA estratto da E. coli trasformato, entrambi i filamenti sono stati sequenziati con il kit AutoRead sequencing (Pharmacia Biotech) usando il primer universale M13 fluorescente e il primer inverso MI3 fluorescente (Pharmacia Biotech, Svezia).Le sequenze sono state determinate su tre cloni ciascuno per i rispettivi prodotti di PCR ed è stata adottata la sequenza consenso.

Questa analisi ha rivelato che le sequenze degli ampliconi di 513 bp erano tra l'85% e il 98% identiche agli isolati di TTV-1 contenuti nel database GENERANE (Numero di Accesso: AB008394). La sequenza di 580 bp derivata dal paziente SEN (clone SEN 8001; SEQ ID NO: 2), tuttavia, non aveva alcuna omologia con nessuna delle sequenze depositate nel database GENERANE usando i programmi BLASTN,BLASTP e FASTA.La più alta omologia a livello nucleotidico (48%) è stata rilevata per alcune porzioni della sequenza TTV suggerendo che il genoma SEN-V codifica per un nuovo virus lontanamente correlato a TTV.

E' stata riconosciuta una ORF capace di codificare 187 amminoacidi (SEQ ID NO: 3) nella sequenza SEN 8001 in una fase di lettura che parte al secondo nucleotide.Nessuna ulteriore ORF poteva essere dedotta nelle altre due fasi di lettura a partire dal primo o terzo nucleotide, o in alcuna delle tre fasi di lettura nella sequenza complementare in grado di codificare per più di 100 amminoacidi. La sequenza amminoacidica di questa ORF non aveva omologia significativa con nessuna delle sequenze proteiche contenute nel database (GENERANE) e aveva solo il 32% di omologia con l'ORF codificata dalla sequenza TTV.

L'amplicone di 580 bp derivato da due ulteriori soggetti facenti uso di droga per endovena (cloni N37) (SEQ ID NO: 4) e N28 (SEQ ID NO: 5)) aveva una sequenza che era per il 95% omologa a quella derivata dal paziente SEN,dimostrando che questo agente virale è presente in diversi soggetti e che è piuttosto conservato.L'allineamento del clone SEN 8001 e dei cloni N37 e N28 (SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5) è documentato in Fig.2.

Esempio 4

Caratterizzazione di un sottotipo di virus SEN Il Clone 26A (SEQ ID NO:6)è stato derivato da un soggetto facente uso di droga per via endovenosa il cui amplicone sembrava migrare leggermente più piano della banda di 580 bp determinata nel paziente SEN. La figura 3 mostra l'allineamento della sequenza SEN 8001 con quella ottenuta dal clone 26A.L'omologia tra i due cloni era dell·'81%, inoltre il clone 26A conteneva un inserto di 15 nucleotidi. Dunque il clone 26A (SEQ ID NO:6)codifica per un sottotipo di SEN-V.

A livello di proteina il clone 26A aveva il 76% di omologia con il clone SEN-V e, come atteso,un inserto di 5 amminoacidi (SEQ ID NO: 7).

La fig. 4 mostra l'allineamento tra gli ORF codificati dai cloni SEN 8001,N37 (SEQ ID NO: 4),N28 (SEQ. ID.NO:5)e 26A.

Estensione del genoma del virus SKN per mezzo di PCR con cammino sul gene bersaglio ( "Targeted gene walking PCR") Allo scopo di estendere la sequenza del genoma SEN-V, la strategia di "targeted gene walking polymerase Chain reaction" è stata usata come originariamente descritto da Parker et al.,Nuc. Ac.Research 19 (1991), 3055-60. Il metodo è basato sull'osservazione che un primer può iniziare una PCR sia su sequenze sconosciute sia su sequenze bersaglio specifiche che hanno solo parziale omologia al terminale 3'. La tecnica può essere usata per "camminare" lungo la sequenza di DNA o per cercare sequenze nucleotidiche che sono state disegnate dall'operatore. Il metodo permette la produzione di microgrammi di DNA di sequenze ignote poste a monte o a valle di una singola regione di DNA bersaglio.

Per questo approccio, è stata approntata una serie di reazioni PCR tutte contenenti lo stesso primer bersaglio NG063 come usato nell'Esempio 2. Come "walking primer" (uno in ciascuna-diversa reazione di PCR) sono stati utilizzati oligonucleotidi che erano stati precedentemente sintetizzati per altre applicazioni. I primer usati in questi esperimenti sono stati derivati da sequenze del recettore delle cellule T umane, dal virus dell'epatite G, dal virus dell’epatite B e dal virus dell'epatite C. Il primer più utile è stato il primer noto come CWP, come descritto sotto.

Per ciascuna coppia di primer, sono state preparate reazioni PCR doppie, una contenente il DNA estratto dal campione positivo e l'altra contenente il DNA estratto dal donatore di sangue negativo. La PCR è stata condotta con uno stampo contenente 50 μl di miscela, 1/10 del DNA estratto da 100 μΐ di siero con il kit QIAamp blood (QIAGEN), tampone PCR (Tris HC1 pH 8.8, 67 mM, (NH4SO416,6 mM, 13-mercaptoetanolo mM, 1,5 mM MgC12), 300 ng di ciascun primer PCR, 200 μΜ di desossiribonucleoside trifosfato (dATP, dCTP, dTTP, dGTP da Boehringer, Mannheim, Germania), e 1,25 U di Taq polimerasi (Perkin Elmer). La rea2ione è stata condotta in un DNA thermal cycler con olio minerale.La PCR consisteva di un pre-riscaldamento a 94°C per 5 min, 50 cicli di 94°C per 1 min, 60°C per 1 min, e 72°C per 1 min, e un'incubazione a 72°C per 7 min. I prodotti di PCR sono stati caricati su un gel!di agarosio al 2% con 2 μg di bromuro di etidio per mi per determinare le grandezze dei prodotti amplificati. Solo le bande presenti nel campione positivo e assenti nella reazione contenente il campione negativo sono state asportate dal gel di agarosio, clonate e sequenziate. La maggior parte dei cloni conteneva DNA genomico, tuttavia, dopo sequenziamento, si è trovato che una banda di 1200 bp (Fig. 5 (SEQ ID NO: 8)),ottenuta con i primer NG063 (Okamoto et al., loc. cit.) e CWP 5'CGCCTG(G/A)TANA(G/A)NGGCCA(G/A)CA 3'. conteneva -una sequenza SEN-V estesa di 700 basi in 5' (clone CWP SEN 01; SEQ ID NO:8).Il primer CWP è stato derivato dalla regione non strutturale del virus dell'epatite G 600 bp dalla regione 5'del genoma.

Per estendere la sequenza in 3' è stata sfruttata la "strategia di cammino sul gene bersaglio". Tuttavia, invece di usare due primer, è stato utilizzato solo il primer 3S (5'TCC ATA TTC ATA GGC CCC AA3' SEQ ID NO:11)derivato dalla sequenza SEN8001.Usando questa strategia si è ottenuto un clone contenente la sequenza SEN-V estesa di 200 basi in 3'. Dopo aver assemblato le sequenze sovrapponentesi con il programma ASSEMLGEL del pacchetto PC-GENE, abbiamo ottenuto un'unica sequenza di 1354 basi codificante per parte del genoma SEN-V. Questa sequenza è stata chiamata CWP SEN001 (SEQ ID NO: 9).

L'analisi del database con il programma BLAST non ha rivelato alcuna rilevante omologia con sequenze note e, ancora, l'omologia più vicina (46,93%)è stata trovata con TTV.

Una ORE capace di codificare per 450 amminoacidi è stata riconosciuta in una fase di lettura che parte al nucleotide 3' della sequenza CWP SEN001 (SEQ ID NO: 10). Non è stata trovata alcuna ORF nelle altre due fasi di lettura che partono al primo o al terzo nucleotide o in alcuna delle tre fasi di lettura nella sequenza complementare che potevano codificare per più di 100 amminoacidi. La sequenza amminoacidica di questa ORF non aveva significativa omologia con alcuna delle sequenze proteiche contenute nel database (GENERANE). La maggior identità di sequenza globale (29,4%) è stata rilevata tra l'ORF di SEN-V (SEQ ID NO: 10) e TTV (Fig. 6). Come confronto, bisogna notare che l'identità tra le poliproteine di HGV e GBV-A è del 43,8%, mentre l'identità di HGV con GVB-B e l'isolato HCV-1 di HCV è del 28,4 e 26,8, rispettivamente (Linnen, Science 271 (1996), 505-508). Secondo la previsione PROSITE, l'ORF di SEN-V caratterizzata contiene due potenziali siti di N-glicosilazione alle posizioni 54 e 233,un sito di tirosin-solforilazione alla posizione 160, tre potenziali siti di fosforilazione di chinasi C alle posizioni 89, 235 e 431, quattro potenziali siti di fosforilazione di caseina chinasi II alle posizioni 119,161, 315 e 319 e due potenziali siti di ammidazione alle posizioni 83 e 228. Non sono stati determinati siti di N-mirisoilazione. In confronto, la regione di maggior omologia con SEN-V della ORF 1 di TTV (Fig.6) conteneva 4 siti di N-glicosilazione alle posizioni 175, 191, 206 e 234, un sito di tirosin-solforilazione alla posizione 275, sette siti di fosforilazione di protein chinasi C alle posizioni 77, 99, 158, 207, 223, 311 e 325, otto siti di fosforilazione di casein chinasi II alle posizioni 17, 119, 144, 158, 232, 271, 294 e 359, un sito di fosforilazione di tirosin chinasi alla posizione 103, sette tipi di N-mirisoilazione alle posizioni 128, 190, 195, 240, 267, 281 e 282 e un sito di ammidazione alla posizione 82. Rispetto alla ricerca BLAST e alla determinazione di siti, regioni e "signatures" di potenziale interesse biologico,con analisi di sequenza, i risultati dimostrano che TTV e SEN-V sono virus diversi che possono essere lontanamente correlati.

Esempio 6

Diffusione di SEN-V nella popolazione italiana

Per ottenere precise informazioni sulla diffusione di SEN-V nella popolazione,è stato sviluppato un saggio PCR specifico. Il DNA è stato estratto da 100 μl di siero e sottoposto a 45 cicli di PCR usando i primer SEN 3S senso (SEQ ID NO: 11) e il primer 2AS come antisenso (SEQ ID NO:12)derivati dalla sequenza CWP SEN001 (SEQ ID NO: 9).

I prodotti PCR sono stati caricati in gel di agarosio al 2% con 2 μg di bromuro di etidio per mi, per determinare la grandezza dei prodotti amplificati. Controlli negativi contenenti tutti i reagenti ma senza il DNA stampo sono stati processati normalmente esattamente come descritto sopra per monitorare la contaminazione e sono risultati negativi in tutti gli esperimenti.

Per verificare la specificità degli ampliconi, 20 μl di prodotti PCR sono stati ibridati in un saggio di DEIA Mantero et al., Clin. Chemistry 37 (1991), 422-429, come precedentemente descritto, usando la sonda biotinilata SEN 375'TAT GCC CAT ACA CAG TTC CCC CCA TGT ACA AAC CAG GCA3' (SEQ ID NO: 13) che copre una regione interna a quella delimitata dai primer 3S e 2AS.

La PCR è stata condotta con una miscela di 50 μl contenente lo stampo, 1/10 del DNA estratto da 100 μl di siero con il kit di QIAamp blood (QIAGEN), tampone PCR (Tris HC1 pH 8.8, 67 mM, (NH4SO416,6 mM, β-mercaptoetanolo 10 mM, 2 mM MgC12), 300 ng di ciascun primer per PCR, 200 μΜ di desossiribonucleoside trifosfati (dTTP, dATP, dCTP, dGTP da Boehringer Mannheim, Germania), e 1,25 U di Taq polimerasi (Perkin Elmer). La reazione è stata condotta in un DNA thermal cycler con olio minerale.La PCR è consistita di un pre-riscaldamento a 94°C per 5 min, 45 cicli a 94°C per 1 min, 50°C per 1 min, 72°C per 1 min, e un'incubazione a 72°C per 7 min.

I prodotti di PCR sono stati caricati su un gel di agarosio al 2% con 2 μΐ di bromuro di etidio per ml, per determinare la grandezza dei prodotti amplificati. I controlli negativi contenenti tutti i reagenti ma senza il DNA stampo sono stati processati normalmente esattamente come descritto sopra, per monitorare la contaminazione, ed erano negativi in tutti gli esperimenti.

Il SEN-V non è stato determinato in nessuno dei 37 donatori di sangue (Fig. 7) e in nessuno dei 32 pazienti affetti da artrite reumatoide esaminati. Tuttavia l'agente virale è stato rilevato in 29 dei 41 (67%) utilizzatori di droghe per via endovenosa analizzati (Fig. 8). Pertanto,questi dati documentano la via parenterale di trasmissione del SEN-V.

Esempio 7

SEN-V e sottotipi di SEN-V come patogeni coinvolti nell'epatite di eziologia ignota

Per valutare la possibile implicazione di SEN-V nella trasmissione dell’epatite dì eziologia sconosciuta, abbiamo amplificato DNA estratto dai sieri di 20 pazienti affetti da epatite non-A non-E (negativi per tutti i marcatori di virus di epatite noti). L'amplificazione è stata condotta con i primer 3S (SEQ ID NO:11)e 2AS (SEQ ID NO:12).

La PCR è stata condotta con una miscela di 50 μΐ contenente lo 'stampo,1/10 del DNA estratto da 100 μΐ di siero con il kit QIAamp blood (QIAGEN), tampone PCR (Tris HC1 pH 8.8, 67 mM, (NH4SO416,6 πιΜ, βmercaptoetanolo 10 mM, 15 mM MgC1), 300 ng di ciascun primer per PCR, 200 μΜ di desossiribonucleoside trifosfati (dATP, dTTP, dCTP, dGTP da Boehringer Mannheim, Germania), e 1,25 U dì Taq polimerasi (Perkin Elmer). La reazione è stata condotta in un DNA thermal cylcer con olio minerale.La PCR è consistita di un pre-riscaldamento a 94 °C per 5 min, 50 cicli a 94°C per 1 min, 60°C per 1 min, 72°C per 1 min, e un'incubazione a 72‘C per 7 min. I prodotti di PCR sono stati caricati su un gel di agarosio al 2% con 2 μl di bromuro di etidio per ml, per determinare la grandezza dei prodotti amplificati.

Nove di questi campioni amplificati migravano in gel di agarosio come bande deboli, di dimensione attesa di 330 bp; tuttavia, questi prodótti PCR non ibridavano con la sonda biotinilata SEN 37 (SEQ ID NO: 13) in un saggio DEIA (Maniero et al., loc.cit.). Sezioni di gel corrispondenti a due delle bande di 330 bp ottenute da 4 sieri di pazienti con epatite di eziologia sconosciuta (pazienti NAE8, NAE9, NAE10 e NAE35) sono state tagliate via, il DNA estratto è stato inserito in un vettore pGEM (Promega,Madison, WI, USA) e introdotto in E.cali. Le sequenze di DNA degli inserti,chiamate NAE8-1 (SEQ ID NO: 14),NAE9-3 (SEQ ID NO: 15), NAE10-4 (SEQ ID NO: 16),e NAE 35-5 (SEQ ID NO:17), sono state determinate usando il kit di sequenziamento AutoRead (Pharmacia Biotech) con il primer universale MI3 fluorescente e il primer inverso M13 fluorescente (Pharmacia Biotech).

La Figura 9 nostra gli allineamenti delle sequenze derivate da questi quattro pazienti affetti da epatite non-A - non-E. Le quattro sequenze hanno il 98,28% di identità, suggerendo che il virus codificato da questo particolare genoma è altamente diffuso nei pazienti con epatite non-A non-E. Le Figure 10, 11, 12 e 13 mostrano rispettivamente gli allineamenti dei cloni NAE8-1, ΝΆΕ9-3, NAE10-4 e NAE35-5 con il clone SEN8001. Queste sequenze hanno un'omologia con il clone SEN8001 che varia dal 65,90% al 69,77%, suggerendo che i cloni NAE8-1, NAE9-3, NAE10-4 e NAE35-5 sono un nuovo sottotipo di SEN-V che viene chiamato SEN-V B. Il fatto che SEN-V B sembra essere selettivamente separato nei sieri di pazienti non-A non-E suggerisce che questo sottotipo di SEN-V possa essere coinvolto nella trasmissione di epatite di eziologia sconosciuta. Numerosi "mismatch" (mancate corrispondenze) tra la sonda biotinilata SEN 37 e le sequenze SEN-V B possono rendere conto della bassa reattività dei prodotti di PCR derivati da pazienti non-A non-E nel saggio di ibridazione DEIA.

Al fine di estendere la sequenza NAE 8-1 (SEQ ID NO: 14) in 5' e in 3',il DNA estratto dal siero del paziente NAE 8 è stato amplificato con il primer NAE 2AS (SEQ ID NO: 18)derivato da SEQ ID NO: 14 e il primer 6S (SEQ ID NO:19)derivato dalla sequenza CWPSEN001 (SEQ ID NO:9).

La PCR è stata condotta con una miscela di 50 pi contenente lo stampo,un decimo del DNA estratto da 100 μΐ di siero con il kit QIAamp blood (QIAGEN), tampone per PCF (67 mM Tris HCl 018.8, 16,6 mM (NH4.)2S0410 mM β-mercaptoetanolo, 2 mM mgCl2), 300 ng di ciascun primer per PCR, 200 μM di desossiribonucleoside trifosfati (dATP, dCTP, dTTP e dGTP da Boehringer Mannheim, Germania), e 1,25 U di Taq polimerasi (Perkin Elmer). La reazione è stata condotta in un DNA thermal cylcer con olio minerale. La PCR consisteva in un pre-riscaldamento a 94°C per 5 min, 45 cicli di 94°C per 1 min, 60°C per 1 min,e 72°C per 1 min, e un'incubazione a 72°C per 7 min. I prodotti di PCR sono stati caricati su un gel di agarosio al 2% con 2 pg di bromuro di etidio per mi, per determinare la grandezza dei prodotti amplificati.

Un pezzo di gel corrispondente alla banda di 1100 bp è stato tagliato. Il DNA è stato estratto e clonato in un vettore pGEM (Promega, Madison, WI, USA), introdotto in E. coli e sequenziato usando metodi standard.E' stata determinata la sequenza di DNA dell'inserto chiamato SEN-VB (SEQ ID NO: 20) usando il kit di sequenziamento AutoRead (Pharmacia Biotech) con il primer universale M13 fluorescente e il primer inverso Mi3 fluorescente (Pharmacia Biotech).

La figura 14 nostra l'allineamento di SEN-VB e delle sequenze nucleotidiche CWPSEN001.Le due sequenze mostrano un'omologia del 52,11% e il programma ALI® ha inserito 6 vuoti nella sequenza di SEN-VB al fine di ottenere il miglior risultato. Nella figura 15 è mostrato l'allineamento della sequenza amminoacidica di CWPSEN001 e le sequenze amminoacidiche previste per SEN-VB (SEQ ID NO: 21). Le due sequenze . proteiche mostrano regiorni di alta omologia, confermando la loro relazione filogenica. Tuttavia, la regione che va dall’amminoacido 185 al 285 della sequenza di SEN-VB differisce ampiamente dalla sua controparte di CWP SENV001. In totale, le due sequenze hanno in comune il 55% di identità.

La Figura 16 mostra l'allineamento della sequenza amminoacidica prevista dell'ORF dedotto di SEN-VB con l’ORF di TTV. Le due sequenze ' mostrano solo il 29% di identità. Inoltre, le differenze sono uniformemente distribuite lungo l’allineamento delle due sequenze amminoacidiche virali.

Questi dati confermano che SEN-VB è un sottotipo di SEN-V e che le sequenze di SEN-V e di SEN-VB differiscono significativamente da quella del TTV.

La bassa incidenza di SEN-V nella popolazione sana e in forte contrasto con la distribuzione di TTV nelle coorti sane. I dati fin qui ottenuti suggeriscono che SEN-V o alcuni suoi sottotipi possono avere importanti conseguenze per la salute pubblica. Inoltre, altre varianti genetiche di questo agente virale, ancora da scoprire, possono variare nella loro capacità di causare malattie particolarmente, ma non esclusivamente,di natura epatica.

Esempio 8

Identificazione di sequenze aggiuntive al 3' e 5' della sequenza di SEN-V

Al fine di estendere la CWP SEN001 (SEQ ID NO: 9) sono state condotte due diverse reazioni PCR.Una reazione è stata condotta con una miscela di 50 μl contenente lo stampo,un decimo del DNA estratto da 100 μl di siero di un paziente SEN con il kit QIAamp blood (QIAGEN),tampone PCR (Tris HC1 pH 8.8, 67 mM, (NH4SO4 16,6 mM, β-mercaptoetanolo 10 mM, 1,5 mM MgC1), 300 ng di ciascun primer per PCR, .200 μΜ di desossiribonucleosidi trifosfati (dATP, dCTP, dTTP e dGTP da Boehringer Mannheim, Germania), e 1,25 U di Taq polimerasi (Perkin Elmer). La reazione è stata condotta in un DNA thermal cylcer con olio minerale.La PCR consisteva in un pre-riscaldamento a 94°C per 5 min, 45 cicli di 94°C per 1 min, 60°C per 1 min, e 72°C per 1 min, e un'incubazione a 72°C per 7 min. Il primer usato per questa reazione era il primer 8S (SEQ ID NO:22)dedotto dalla regione 3’della sequenza CWPSEN001.

La seconda reazione è stata condotta con una miscela di 50 μΐ contenente lo stampo, un decimo del DNA estratto da 100 pi di siero di un paziente SEN con il kit QIAamp blood (QIAGEN),tampone PCR (Tris HC1 pH 8.8, 67 raM, (NH4SO416,6 mM,β-mercaptoetanolo 10 raM, 2 mM MgC1), 300 ng di un singolo printer per PCR, concentrazione di 200 pM di ciascun desossiribonucleoside trifosfato (Boehringer Mannheim,Germania), e 1,25 U di Taq polimerasi (Perkin Elmer). La-reazione è stata condotta in un DNA thermal cylcer con olio minerale. La PCR consisteva in un preriscaldamento a 94°C per 5 min, 45 cicli di 94°C per 1 min, 60°C per 1 min, e 72°C per 1 min, e un'incubazione a 72°C per 7 min. Il primer usato per questa reazione era il primer 7AS (SEQ ID NO: 23) dedotto dalla regione 5'della sequenza CWPSEN001. In entrambi i casi i prodotti PCR sono stati caricati su un gel di agarosio al 2% con 2 pg di etidio bromuro per mi per determinare la grandezza dei prodotti amplificati.

Fette di gel corrispondenti rispettivamente alle bande a 1200 e 1100 bp, ottenute con le due reazione sono state tagliate. Il DNA è statò estratto, clonato in uh vettore pGEM (Promega, Madison, WI, USA) introdotto in E. Coli e sequenziato. Le sequenze di DNA degli inserti sono state determinate usando il kit di sequenziamento AutoRead (Pharmacia Biotech) con il primer universale M13 fluorescente e il primer inverso MI3 fluorescente (Pharmacia Biotech)..

Con questa strategia sono stati ottenuti due cloni sovrapponentisi alla sequenza CWPSENQG1 sia al 31 che al 5'. Dopo aver assemblato le sequenze sovrapponentesi col programma ASSEMLGEL, si è ottenuta un'unica sequenza di 3350 basi codificante per la maggior parte del genoma di SEN-V. La sequenza è stata chiamata SEN-VA (SEQ ID NO: .

24). La sua traduzione in tre possibili fasi di lettura viene mostrata in Figura 17. L'incompletezza della sequenza alla regione del 5' non permetteva la verifica della presenza di possibili fasi di lettura aperte in questa regione. Tuttavia, è stata determinata una fase di lettura aperta di 676 amminoacidi (SEQ ID NO: 25) che inizia al nucleotide 903 e termina al nucleotide 2831.

A livello nucleotidico, la sequenza SEN-VA mostra un'identità del 54% con la sequenza nucleotidica di TTV. La Figura 18 mostra l'allineamento tra queste due sequenze. Le sequenze sono altamente omologhe ai terminali 5' e 3', tuttavia, si differenziano sostanzialmente nelle regioni codificanti, mostrando che i due virus sono chiaramente distinti ma appartengono alla stessa famiglia. L'allineamento delle sequenze nucleotidiche codificanti per la maggiore ORF di SEN-VA e TTV viene mostrata in Figura 19. L'identità tra le due regioni codificanti è solo del 48% con inserimento di numerose interruzioni.

Le proteine previste codificate da questi due virus (SEN-VA e TTV) sono ancora più divergenti e condividono solo il 33% di identità (Figura 20)mostrando che i due virus sono inoltre sierologicamente distinti.

Di particolare interesse, l'ORFl di SEN-VA contiene all'N terminale della sequenza (posizione 617-638) il "leucine zipper pattern"

che è assente nell'ORF1 di TTV,suggerendo che le

due proteine possono avere diverse funzioni biologiche.

Questo viene anche suggerito dall'assenza nellORF di SEN-V della regione altamente idrofila caratterizzata da un dominio ricco in arginina presente all'N terminale di ORF1 di TTV.

In aggiunta all'ORFl la sequenza SEN-VA contiene altre due ORF, lORF2 si estende dal nucleotide 231 al nucleotide 730 (SEQ ID NO: 28). Questa sequenza di 166 amminoacidi (SEQ ID NO:27), ricca in prolina, è stata riconosciuta nella prima fase di lettura e il suo allineamento con lORF2 di TTV ha dimostrato che le due proteine hanno solo il 30% di identità.

L'ORF3,che si estende tra i nucleotidi 2545 e 2801 (SEQ ID NO: 30) si sovrappone al terminale 3' di ORF1 ma è stata riconosciuta sulla prima fase di lettura. La proteina comprende solo 87 amminoacidi (SEQ ID NO: 29) ma contiene una regione di legame nucleare interessante, e un motivo TATA è stato riconosciuto 35 nucleotidi a monte del codone di inizio ATG, suggerendo pertanto che questa potenziale fase di lettura in realtà viene tradotta. Non è stata determinata alcuna OKF equivalente nella sequenza nucleotidica di TTV.

LISTA DI SEQUENZA

(1) INFORMAZIONI GENERALI:

(ii) TITOLO DELL'INVENZIONE:Molecole di acido nucleico che rappresentano un virus trasmissibile per via parenterale

(ili)NUMERO DELLE SEQUENZE:31

(V)FORMA LEGGIBILE CON COMPUTER

(A) TIPO DI SUPPORTO:Floppy Disk

(B) COMPUTER: IBM PC conpatibile

(C) SISTEMA OPERATIVO:PC-DOS/MS-DOS

(D) PROGRAMMA:Patentin Release #1.0,Versione #1.30 (EPO) (2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 1

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A)LUNGHEZZA: 27 bp

(B) TIPO:acido nucleico

(C)TIPO DI FILAMENTO:singolo

(D) TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:altro acido nucleico

(A)DESCRIZIONE: /desc = "oligonucleotide"

(ili) IPOTETICO: si

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ. ID.N.1

R = A or G

Y = C or T

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.:2

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 581 bp

(B)TIPO:acido nucleico

(C)TIPO DI FILAMENTO:doppio

(D)TOPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ. ID.N.2

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.:3

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 185 amminoacidi

(B)TIPO:amminoacido

(C)TIPO DI FILAMENTO:singolo

(D)TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:,proteina

(iii) IPOTETICO:si

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ. ID.N.3

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.:4

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A)LUNGHEZZA: 581 bp

(B) TIPO: acido nucleico

(C)TIPO DI FILAMENTO:doppio

(D)TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA: DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ. ID.N.4

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 5

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A)LUNGHEZZA: 581 bp

(B)TIPO: acido nucleico

(C)TIPO DI FILAMENTO:doppio

(D)TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA: DNA (genomico)

(ili) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ. ID.N.5

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 6

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A)LUNGHEZZA: 596 bp

(B)TIPO: acido nucleico

(C)TIPO DI FILAMENTO:doppio

(D)TOPOLOGIA:lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ. ID.N.6

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N. : 7

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA:198 amminoacidi

(B)TIPO: amminoacido

(C) TIPO DI FILAMENTO: singolo

(D)TOPOLOGIA:lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:proteina

(ili) IPOTETICO:si

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ. ID.N.7

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.:8

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 1153 bp

(B) TIPO:acido nucleico

(C) TIPO DI FILAMENTO:doppio

(D) TOPOLOGIA:lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ. ID.N.8

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 9

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA:1353 bp

(B)TIPO: acido nucleico

(C) TIPO DI FILAMENTO:doppio

(D) TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ. ID.N.9

o

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 10

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A)LUNGHEZZA:450 amminoacidi

(B)TIPO:aminoacido

(C)TIPO DI FILAMENTO:singolo

(D)TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:proteina

{iii) IPOTETICO:si

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ. ID.N.10

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 11

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA:19 bp

(B) TIPO:acido nucleico

(C) TIPO DI FILAMENTO:singolo

(D) TOPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA:altro acido nucleico

(A)DESCRIZIONE: /desc = "oligonucleotide" (ili) IPOTETICO:si

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ.ID.N.11

19

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.:12

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA:23 bp

(B) TIPO:acido nucleico

(C) TIPO DI FILAMENTO:singolo

(D) TOPOLOGIA:lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:altro acido nucleico

(A)DESCRIZIONE: /desc = ''oligonucleotide" (iii) IPOTETICO: si

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ. ID.N.12-

23

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.:13

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 39 bp

(B) TIPO:acido nucleico

(C) TIPO DI FILAMENTO:singolo

(D) TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:altro acido nucleico

(A)DESCRIZIONE: /desc = "oligonucleotide"

(iii)IPOTETICO:si

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ. ID.N.13

39

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.:14

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA:349 bp

(B)TIPO:acido nucleico

(C) TIPO DI FILAMENTO:doppio

(D) TOPOLOGIA:lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ. ID.N.14

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 15

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 349 bp

(B) TIPO:acido nucleico

(C) TIPO DI FILAMENTO:doppio

(D)TOPOLOGIA:lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ. ID.N.15

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 16

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 346 bp

(B) TIPO: acido nucleico

(C) TIPO DI FILAMENTO:doppio

(D) TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ. ID.N.16

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.:17

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A)LUNGHEZZA: 349 bp

(B) TIPO: acido nucleico

..(C)TIPO DI FILAMENTO:doppio

(D) TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ. ID.N.17

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.:18

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 29 bp

(B)TIPO:acido nucleico

(C) TIPO DI FILAMENTO:singolo

(D)TOPOLOGIA:lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:altro acido nucleico

(A) DESCRIZIONE: /desc = "oligonucleotide"

(iii) IPOTETICO:si

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ.ID.N.18

29

W = A OR T

R = A or G .

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 19

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A)LUNGHEZZA: 21 bp

(B)TIPO:acido nucleico

(C)TIPO DI FILAMENTO: singolo

(D)TOPOLOGIA:lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:altro acido nucleico

(A) DESCRIZIONE: /desc = "oligonucleotide"

'(ili) IPOTETICO:si

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ. ID.N.19

21 (2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.:20

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA:1138 bp

(B)TIPO:acido nucleico

(C)TIPO DI FILAMENTO:doppio

(D)TOPOLOGIA:lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ. ID.N.20

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N. : 21

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 379 amminoacidi

(B) TIPO: amminoacido

(C) TIPO DI FILAMENTO: singolo

(D) TOPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA: proteina

(iii) IPOTETICO: no

(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ. ID. N. 21

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 22

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A)LUNGHEZZA: 24 bp

(B)TIPO:acido nucleico

(C)TIPO DI FILAMENTO: singolo

(D)TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:altro acido nucleico

(A)DESCRIZIONE: /desc = "oligonucleotide"

(ili) IPOTETICO:si

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ. ID.N.22

24

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 23

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A)LUNGHEZZA:28 bp

(B) TIPO:acido nucleico

(C)TIPO DI FILAMENTO: singolo

(D) TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA: altro acido nucleico

(A)DESCRIZIONE: /desc = "oligonucleotide"

(ili) IPOTETICO:si

(xi) DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ. ID.N.23

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 24

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 3350bp

(B) TIPO:acido nucleico

(C) TIPO DI FILAMENTO: doppio

.(D) TOPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA genomico

(ili) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ. ID.N.24

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 25

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA

(A) LUNGHEZZA: 642 amminoacidi

(B)TIPO: amminoacido

(C)TIPO DI FILAMENTO: singolo

(D)TOPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA:proteina

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ. ID.N.25

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 26

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA:

(A)LUNGHEZZA:2646 bp

(B)TIPO: acido nucleico

(C)TIPO FILAMENTO:doppio

(D) TIPOLOGIA: lineare

(li) TIPO DI MOLECOLA: DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO:26:

.

·

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 27:

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA:

(A)LUNGHEZZA: 166 amminoacidi

(B)TIPO:amminoacido

(C)TIPO DI FILAMENTO: singolo

(D)TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:proteina

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO:27:

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N. : 28:

(i) CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA:

(A) LUNGHEZZA: 498 bp

(B) TIPO: acido nucleico

(C) TIPO FILAMENTO: doppio

(D) TOPOLOGIA: lineare

(ii) TIPO DI MOLECOLA: DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ ID NO:28:

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.:29:

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA:

(A)LUNGHEZZA:86 amminoacidi

(B)TIPO:amminoacido

(C)TIPO FILAMENTO: singolo

(D)TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:proteina

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ ID NO:29:

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 30:

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA:

(A) LUNGHEZZA: 258 bp

(B)TIPO: acido nucleico

(C)TIPO FILAMENTO:doppio

(D) TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA: DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA:SEQ ID NO: 30:

(2) INFORMAZIONI PER SEQUENZA N.: 31

(i)CARATTERISTICHE DELLA SEQUENZA:

(A)LUNGHEZZA: 1926 bp

(B)TIPO: acido nucleico

(C)TIPO FILAMENTO: doppio

(D)TOPOLOGIA: lineare

(ii)TIPO DI MOLECOLA:DNA (genomico)

(iii) IPOTETICO:no

(xi)DESCRIZIONE DELLA SEQUENZA: SEQ ID NO: 31:

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Molecola di acido nucleico che rappresenta il genoma di un virus, detta molecola di acido nucleico avendo almeno una delle seguenti caratteristiche: (a) contiene almeno,una ORF che codifica un polipeptide avente la sequenza amrainoacidica di SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:25,o SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 29; (b) comprende la sequenza di DNA di SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31; (c) conprende porzioni di almeno 100 nucleotidi, preferibilmente almeno 500 nucleotidi, e più preferibilmente almeno 2000 nucleotidi che vengono ibridati (in condizioni stringenti) dal filamento complementare della molecola di acido nucleico di SEQ ID NO:26; (d) è degenerata rispetto alla molecola di acido nucleico (c) ma non viene ibridata dal filamento complementare del genoma del virus TT; e (e) ha un'identità di almeno il 50%, preferibilmente di almeno il 60% e più preferibilmente di almeno il 70%, con la molecola di acido nucleico di SEQ ID NO: 26, almeno il 60%, preferibilmente almeno il 70% e più preferibilmente almeno l'80% di identità con la molecola di acido nucleico di SEQ ID NO:24, almeno il 50%,preferibilmente almeno il 60% e più preferibilmente almeno il 75% di identità con la molecola di acido nucleico di SEQ ID NO:28,almeno il 50%, preferibilmente almeno il 60% e più preferibilmente almeno il 75% di identità con la molecola di acido nucleico di SEQ ID NO:30 o ha almeno il 50%, preferibilmente almeno il 60% e più preferibilmente almeno il 75% di identità con SEQ ID NO:31 o è una molecola di acido nucleico che codifica una sequenza amminoacidica che ha almeno il 35%,preferibilmente almeno il 40%, più preferibilmente almeno il 50% e ancora più preferibilmente almeno il 75% di identità con SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:25,SEQ ID N0:27 o SEQ ID NO:29.
2. Molecola di acido nucleico codificante un (poli)peptide virale o un suo frammento, in cui detta molecola di acido nucleico (a) contiene una ORF che codifica un polipeptide avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:21,SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, o SEQ · ID NO:29 o un suo frammento di almeno 6 amminoacidi; (b) ha la sequenza identificata in SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31 o un suo frammento di almeno 12 nucleotidi; (c) ha la sequenza identificata in SEQ ID NO:24; (d) viene ibridata in condizioni stringenti dal filamento complementare della molecola di acido nucleico di SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30 o SEQ ID NO: 31; (e) è degenerata rispetto alla molecola di acido nucleico di (d) ma non viene ibridata dal filamento complementare del genoma del virus TT che codifica ORF1 di TTV; (f) codifica un polipeptide con almeno il 35%,preferibilmente almeno il 40%,più preferibilmente almeno il 50% e ancora più preferibilmente almeno il 75% di identità con SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO:29; o (g) ha almeno il 50%,preferibilmente almeno il 60%,più preferibilmente almeno il 75% e ancora più preferibilmente almeno il 90% di identità con la sequenza specificata in (b)o almeno il 60%,preferibilmente almeno il 70%, più preferibilmente almeno l'80% e ancora più preferibilmente almeno il 90% di identità con la sequenza specificata in (c).
3. Molecola di acido nucleico che viene specificamente ibridata dal filamento complementare della molecola di acido nucleico avente la sequenza di acido nucleico di SEQ ID NO: 26 specificata sopra o da detta molecola di acido nucleico o che è identica a detta molecola di acido nucleico o a detto suo filamento complementare in cui detta molecola di acido nucleico comprende almeno 12 nucleotidi.
4. Molecola di acido nucleico della rivendicazione 3, in cui detto frammento comprende almeno 18 nucleotidi.
5. Molecola di acido nucleico della rivendicazione 4, in cui detto frammento conprende almeno 21 nucleotidi.
6. Molecola di acido nucleico della rivendicazione 5, in cui detto frammento conprende almeno 25 nucleotidi.
7. Molecola di acido nucleico di una qualsiasi delle rivendicazioni da 3 a 6, in cui detto frammento codifica un epitopo che reagisce con anticorpi specifici per il virus SEN ma non con anticorpì specifici per il virus dell'epatite A,B,C,D,E,G,non-B,E,o il virus ΓΓ.
8. Molecola di acido nucleico di una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7 che è un primer.
9. Molecola di acido nucleico della rivendicazione 8, in cui detto primer ha la sequenza SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ 1D NO: 13, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22 o SEQ ID NO:23.
10. Molecola di acido nucleico di una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 8, che è DNA o RNA.
11. Molecola di acido nucleico della rivendicazione 10 che è cDNA.
12. Vettore conprendente la molecola di acido nucleico di una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11.
13. Cellula ospite trasfettata o trasformata con il vettore della rivendicazione 12.
14. Metodo per produrre un (poli)peptide codificato dalla molecola di acido nucleico di una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11, comprendente la coltura della cellula ospite della rivendicazione 13 in opportune condizioni e l'isolamento del (poli)peptide prodotto dalla coltura.
15. (Poli)peptide codificato dalla molecola di acido nucleico di una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 11 o prodotto con il metodo della rivendicazione 14.
16. Virus recante il genoma rappresentato dalla molecola di acido nucleico della rivendicazione 1.
17. Virus della rivendicazione 16 che è un virus SEN.
18. Virus della rivendicazione 16 che è un virus attenuato.
19. Cellula ospite trasfettata in vitro con il virus della rivendicazione 16, 17,o 18.
20. Cellula ospite della rivendicazione 19 che è una cellula epatica,un macrofago, un linfocita, una cellula epiteliale o un osteocita o una linea cellulare derivata da questi.
21. Metodo per la produzione del virus delle rivendicazioni 16, 17 o 18 che comprende la coltura della cellula ospite della rivendicazione 19 in opportune condizioni e l’isolamento del virus dalla coltura.
22. Virus della rivendicazione 16, 17, o 18, o prodotto con il metodo della rivendicazione 21, che è trasmissibile attraverso il sangue.
23. (Poli)peptide isolato da preparati virali, in cui détto preparato virale comprende un virus di una qualunque delle rivendicazioni 16, 17, 18 o 22.
24. Anticorpo o suo frammento o derivato o un aptamero che specificamente riconosce un epitopo sul (poli)peptide della rivendicazione 15 o della rivendicazione 23 o sul virus di una qualunque delle rivendicazioni 16, 17, 18 o 22.
25. Anticorpo della rivendicazione 24 che è un anticorpo monoclonale.
26. Derivato dell'anticorpo della rivendicazione 24 che è un frammento scFv.
27.'Derivato del (poli)peptide della rivendicazione 15 o della rivendicazione 23 che viene specificamente riconosciuto dall’anticorpo o suo frammento o derivato o aptamero di una qualunque delle rivendicazioni da 24 a 26.
28. Derivato della rivendicazione 27 che viene prodotto (semi)sinteticamente,per esempio chimicamente.
29. Derivato della rivendicazione 28 che viene prodotto mediante la tecnica dei peptidomimetici.
30. Ibridoma che produce 1’anticorpo della rivendicazione 25.
31. Proteina di fusione che comprende il (poli)peptide della rivendicazione 15.
32. Polipeptide mosaico che conprende almeno 2 epitopi del (poli)peptide della rivendicazione 15 o del virus di una qualunque delle rivendicazioni 16, 17, 18 o 22, in cui detto polipeptide mosaico manca degli amminoacidi normalmente presenti tra gli epitopi del genoma del virus SEN nativo.
33. Molecola di acido nucleico di una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11,.(poli)peptide della rivendicazione 15 o 23, derivato di una qualunque delle rivendicazioni da 27 a 29, virus di una qualunque delle rivendicazioni 16, 17, 18 o 22; o anticorpo o suo frammento o derivato di una qualunque delle rivendicazioni da 24 a 26, proteina di fusione della rivendicazione 31, polipeptide mosaico della rivendicazione 32 o primer della rivendicazione 8 o 9 che viene marcato in maniera rivelabile.
34. Fase solida che viene attaccata a: (a)'la molecola di acido nucleico di una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11; (b) il (poli)peptide della rivendicazione 15 o 23; (c) il derivato di una qualunque delle rivendicazioni da 27 a 29; (d) il virus di una qualunque delle rivendicazioni 16,17, 18 o 22; (e) l'anticorpo o suo frammento o derivato o aptamero di una qualunque delle rivendicazioni da 24 a 26; (f) la proteina di.fusione della rivendicazione 31; e/o (g) il polipeptide mosaico della rivendicazione 32.
35. Composizione diagnostica che comprende almeno uno di: (a) la fase solida della rivendicazione 34; (b) la molecola di acido nucleico di una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11; (c) il (poli)peptide della rivendicazione 15 o 23; (d) il derivato di una qualunque delle rivendicazioni da 27 a 29; (e) il virus di una qualunque delle rivendicazioni 16, 17, 18 o 22;o (f) l'anticorpo o suo frammento o derivato o aptamero di una qualunque delle rivendicazioni da 24 a 26; (g) la proteina di fusione della rivendicazione 31; (h) un primer o una coppia di primer della rivendicazione 8 o 9; o (i) il polipeptide mosaico della rivendicazione 32.
36. Kit che comprende almeno uno di (a) la fase solida della rivendicazione 34; (b) la molecola di acido nucleico di una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11; (c) il (poli)peptide della rivendicazione 15 o 23; (d) il derivato di una qualunque delle rivendicazioni da 27 a 29; (e) il virus di una qualunque delle rivendicazioni 16,17, 18 o 22; o (f) l'anticorpo o suo frammento o derivato o aptamero di una qualunque delle rivendicazioni da 24 a 26; (g) la proteina di fusione della rivendicazione 31; (h) un primer o una coppia di primer della rivendicazione 8 o 9; o (i) il polipeptide mosaico della rivendicazione 32.
37. Un derivato non patogeno del virus di una qualunque delle rivendicazioni 16, 17, 18 o 22.
38. Composizione conprendente (a) la molecola di acido nucleico di una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11; (b) il (poli)peptide della rivendicazione 15 o 23; (c) il derivato di una qualunque delle rivendicazioni da 27 a 29; (d) il virus della rivendicazione 18; (e) il derivato non patogeno della rivendicazione 37; (f) l'anticorpo o suo frammento o derivato o aptamero di una qualunque delle rivendicazioni da 24 a 26; (g) la proteina di fusione della rivendicazione 31; e/o (h) il polipeptide mosaico della rivendicazione 32.
39. Conposizione della rivendicazione 38 che è una conposizione farmaceutica.
40. Conposizione farmaceutica della rivendicazione 39 che è un vaccino.
41. Metodo per la rivelazione della presenza del virus di una qualunque delle rivendicazioni 16, 17,18 o 22 in un campione,che comprende (a) l’ibridazione dei DNA da detto campione con la molecola di acido nucleico di una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11 o il vettore della rivendicazione 12 in condizioni stringenti; e (b) la rivelazione della formazione dell’ibrido di acido nucleico.
42. Metodo per la rivelazione della presenza del virus di una qualunque delle rivendicazioni 16, 17,18 o 22 in un campione che comprende (a) l'ibridazione del DNA da un campione con una coppia dì primer della rivendicazione 7 o 8; (b) l'attuazione di una PCR o di un'altra tecnica di amplificazione del DNA; e (c) la rivelazione della formazione di uno specifico prodotto PCR o di un altro prodotto di amplificazione.
43. Metodo per la rivelazione della presenza del virus di tana qualunque delle rivendicazioni 16, 17, 18 o 22 in un campione, che comprende {a) l'incubazione di detto campione con l1anticorpo o suo frammento o derivato o un aptamero di una qualunque delle rivendicazioni da 24 a 26; e (b) la rivelazione della formazione di un complesso tra un (poli)peptide o virus presente in detto campione e detto anticorpo o suo frammento o derivato o detto aptamero.
44. Metodo per la rivelazione dell'anticorpo o suo frammento o derivato o un aptamero di una qualunque delle rivendicazioni da 24 a 26 in un campione, che comprende (a) l'incubazione di detto campione con la molecola di acido nucleico di una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11, il virus di una qualunque delle rivendicazioni 16, 17, 18 o 22 o il (poli)peptide della rivendicazione 15 o 23 o suoi frammenti o con il derivato del (poli)peptide della rivendicazione 27, e (b) la rivelazione della formazione del complesso tra detto anticorpo e detto frammento o detto derivato di anticorpo e detta molecola di acido nucleico, detto virus o detto (poli)peptide o detti frammenti o derivati.
45. Metodo di una qualunque·delle rivendicazioni da 41 a 44 in cui dette molecole di acido nucleico, almeno uno di detti primer o detto anticorpo o suo frammento o derivato o detto aptamero sono marcati in maniera rivelabile.
46. Metodo della rivendicazione 45 in cui detta marcatura è un "tag",un marcatore fluorescente o un marcatore radioattivo.
47. Metodo di una qualunque delle rivendicazioni da 41 a 46 in cui detto campione è, o è derivato da, sangue, siero, sputo e/o feci o altro fluido corporeo.
48. Preparazione sostanzialmente isolata di anticorpi policlonali con specifica immunoreattività verso le molecole di acido nucleico di una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11, il (poli)peptide della rivendicazione 15 o 23 o il virus di una qualunque delle rivendicazioni 16,17, 18 o 22.
49. Metodo per la produzione di anticorpi contro la molecola di acido nucleico di una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 11, il (poli)peptide della rivendicazione 15 o 23, il derivato di una qualunque delle rivendicazioni da 24 a 26 o il virus di ..una qualunque delle rivendicazioni 16, 17, 18 o 22, che comprende l'immunizzazione di animali da esperimento con detti molecola di acido nucleico, (poli)peptide, derivato, virus o il derivato non patogeno della rivendicazione 37 e l'isolamento degli anticorpi specifici prodotti.
50. Metodo di immunizzazione di un soggetto contro i virus SEN, che conprende la somministrazione a detto soggetto di almeno una dose del vaccino della rivendicazione 40.
51. Metodo di propagazione del virus della rivendicazione 16, 17, 18 o 22 che comprende la coltura della cellula ospite della rivendicazione 19 o 20 in condizioni idonee a promuovere la propagazione di detto virus.
52. Metodo di propagazione del virus della rivendicazione 16, 17, 18 o 22 in un animale, che comprende l'inoculo in detto animale di detto virus, di parti di detto virus e/o di materiale infettato da detto virus.