JP2002529092A - Ｓｅｎｖ遺伝子型の同定 - Google Patents

Ｓｅｎｖ遺伝子型の同定

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JP2002529092A JP2000581206A JP2000581206A JP2002529092A JP 2002529092 A JP2002529092 A JP 2002529092A JP 2000581206 A JP2000581206 A JP 2000581206A JP 2000581206 A JP2000581206 A JP 2000581206A JP 2002529092 A JP2002529092 A JP 2002529092A
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ジャンフランコ フィオダリスィ
ジョヴァンニ ロレンゾ マンテロ
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アレッサンドラ ソッチーニ
ファブリツィオ ボネッリ
ラウラ ヴァグリニ
パオロ オリヴェロ
コルソ アンドレア ダル
マルコ ボネッリ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウイルス／ウイルス因子のゲノムを表わす核酸分子であって、少なくとも1 つの下記の特徴を有する核酸分子に関する：(a) 核酸分子は、本明細書中に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ORF ）を少なくとも1 つ含む；(b) 核酸分子は、本明細書中に記載されたDNA 配列を含有する；(c) 核酸分子は、好ましくはストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載された核酸分子の相補鎖にはハイブリダイズするが、TTウイルスのゲノムの相補鎖にはハイブリダイズしない；(d) 核酸分子は、ハイブリダイズする核酸分子に関して縮重している；(e) 核酸分子は、本発明のウイルス／ウイルス因子のゲノムを表す核酸分子と少なくとも60％の同一性を有する；および(f) 核酸分子の一部は、本明細書中に規定されるプライマーを用いるPCR により適する条件下で増幅させることができる。本発明はさらに、前記の核酸分子を含有するベクター、前記の核酸分子によってコードされる（ポリ）ペプチドの製造方法、前記の核酸分子によって表されるゲノムを保有するウイルス／ウイルス因子、ならびに前記の（ポリ）ペプチドおよび／または前記のウイルス／ウイルス因子に対する抗体に関する。さらに、本発明は、本発明の化合物を含むか、または本発明の化合物を用いる組成物（好ましくは、医薬組成物）、ワクチン、診断薬および診断キットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 多数の文書が本明細書中に引用されている。すべての文書の内容はそれにより
参考として援用される。
【０００２】 （技術分野） 本発明は、ウイルス／ウイルス因子のゲノムを表わす核酸分子であって、少な
くとも1 つの下記の特徴を有する核酸分子に関する：（a ）核酸分子は、本明細
書中に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするオープンリー
ディングフレーム（ORF ）を少なくとも1 つ含む；（b ）核酸分子は、本明細書
中に記載されたDNA 配列を含む；（c ）核酸分子は、好ましくはストリンジェン
トな条件下で、本明細書中に記載された核酸分子の相補鎖にはハイブリダイズす
るが、TTウイルスのゲノムの相補鎖にはハイブリダイズしない；（d ）核酸分子
は、ハイブリダイズしている核酸分子に関して縮重している；（e ）核酸分子は
、本発明のウイルス／ウイルス因子のゲノムを表す核酸分子と少なくとも60％の
同一性を有する；および（f ）核酸分子の一部は、本明細書中に規定されるプラ
イマーを用いるPCR により適する条件下で増幅させることができる。本発明はさ
らに、前記の核酸分子を含むベクター、前記の核酸分子によってコードされる（
ポリ）ペプチドの製造方法、前記の核酸分子によって表されるゲノムを保有する
ウイルス／ウイルス因子、ならびに前記の（ポリ）ペプチドおよび／または前記
のウイルス／ウイルス因子に対する抗体に関する。さらに、本発明は、本発明の
化合物を含むか、または本発明の化合物を用いる組成物（好ましくは、医薬組成
物）、ワクチン、診断薬および診断キットに関する。
【０００３】 （背景技術） 1980年代の初期から、非経口的に伝染するますます多くのウイルス因子が記載
されている（例えば、HIV 、G 型肝炎ウイルス、TTウイルスなど）。しかし、明
確な疾患とそのようなウイルスとの直接的な原因関係は、多くの場合、確立され
ていない。
【０００４】 このような疾患の1 つに肝炎がある。肝障害は、血液製剤の輸注または他の投
与によって、臓器移植または血液透析によって供与者から受容者に伝染する最も
重要な疾患の1 つである。肝炎はまた、汚染された水または栄養物を摂取するこ
とによっても伝染し、集団獲得型であり得る（人から人への接触）。そのような
肝障害を引き起こすと考えられるウイルス因子には、A 型肝炎ウイルス（HAV ）
、B 型肝炎ウイルス（HBV ）、C 型肝炎ウイルス（HCV ）、D 型肝炎ウイルス（
HDV ）、E 型肝炎ウイルス（HEV ）またはG 型肝炎ウイルス（HGV/HGBV-C）、な
らびにサイトメガロウイルス（CMV ）およびエプスタイン−バールウイルス（EB
V ）が含まれる。高感度で特異的な試験を、既知の肝炎ウイルスを検出するため
に利用することができるが、輸血後肝炎（Alter 他、W.Eng.J.Med.321(1989) 、
1494）および集団獲得型肝炎（Alter 他、N.Eng.J.Med.327(1989) 、1899）の相
当割合は病因が不明である。
【０００５】 多数の考えられる病原体が、これらのいわゆる非A 非B 非C 非D 非E 非G 肝障
害の病因因子として提案されている（Prince、 Annu.Rev.Microbiol.37(1983)
、217;Feinstone およびHoofnagle 、N.Eng.J.Med.311(1984) 、185;Overby、Cu
rr,Hepatol.7(1987)、35;Iwarson、 British Medical J.295(1987) 、949;Alter
他、N.Eng.J.Med.336(1997) 、747 に総説または記載されている）。しかし、
特に、劇症肝炎の患者は大部分が肝炎ウイルス感染のマーカーを示さない（Fera
y 他、Gastroenterology、104(1993) 、549;Wright、 Gastroenterology、104(1
993)、640 ）ため、これらのウイルス因子がこれらの肝臓障害の原因的な病原体
であるという証拠は得られていない。これは、A 型〜E 型の既知の肝炎ウイルス
に感染していないと考えられる慢性肝臓疾患の患者が報告されているからである
（Kodali他、Am.J.Gastroenterol.89(1994) 、1836；NANE肝炎）。さらなる輸血
後肝炎が輸血患者の約10％で生じているが、病因源が分からない肝炎がこれらの
患者の90％までを占めている。
【０００６】 特に、C 型肝炎ウイルス（HCV ）が発見されたことにより、急性肝炎および慢
性肝炎に関する一部の患者は、すべての既知のウイルスマーカーについて依然と
して陰性であることが明らかにされた（Alter 他、Semi.Liver Dis.15(1995) 、
110 〜120 ）。これにより、新しい肝炎原因因子を探索する研究が促進された。
それ以降、かなりの努力が、HCV を原因としない輸血後の非A ／非B 型肝炎、原
因不明の劇症肝障害（FHF ）および慢性肝炎の残りの患者に関与する他の感染性
因子の探索において続けられている。
【０００７】 さらに、最近の発見により、G 型肝炎ウイルス（HGV/HGBV-C;WO95/21922 ）に
よる感染は、広範囲に及んでいるが、肝炎の上記の臨床例の大多数における病因
因子ではないことが示されている（Alter 、N.Eng.J.Med.334(1996) 、1536〜15
37;Alter他、N.Eng.J.Med.336(1997) 、747 〜754 ）。
【０００８】 1997年に、日本の研究者が、病因が不明な輸血後肝炎の患者から得られた血清
サンプルの表現−差分析を使用して、TTV と名付けられた新規なヒトウイルスの
DNA クローンを単離した（「患者TT」；これは「輸血伝染ウイルス」とも呼ばれ
ている：Nishizawa 他、Biochem.Biophys.Res.Commun.241(1997)、92〜97）。
【０００９】 予備的な結果は、TTV が、エンベロープを持たない3739ヌクレオチドの一本鎖
DNA ウイルスであることを明らかにしている（Okamoto 他、Hepatology Res.10(
1998) 、1 〜16）。このウイルスの2 つの遺伝子群が同定されており、それらは
ヌクレオチド配列が30％異なっている。TTV のDNA が、A 型〜G 型でない劇症肝
炎患者の47％で検出され、そして原因が分からない慢性的な肝疾患患者の46％で
検出された。このことは、TTV が原因不明の一部の肝疾患の原因であり得ること
を示唆している。しかし、より最近の発見は、TTV の病原性の可能性に対する疑
いを抱かせている。
【００１０】 Naumov他（Lancet、352(1998)、159 〜197 ）は、TTV （Alter 、 N.Eng.J.Me
d.334(1996) 、1536〜1537;Alter他、N.Eng.J.Med.336(1997) 、747 〜754 ）が
、日本の場合と類似する罹患率および同じウイルス遺伝子型で英国に存在するこ
とを明らかにしている。このことは、TTV が世界中に分布していることを示唆し
ている。しかし、TTV 陽性症例の大多数は正常な肝機能試験を有し、肝臓組織学
において小さな変化を有しているだけであった。英国および日本の両国の一般住
民におけるTTV 感染の大きな罹患率、および著しい肝障害がないことにより、TT
V は、G 型肝炎ウイルス（HGV ）と類似して、明らかな疾患との関連を有しない
ウイルスであることが示唆された。
【００１１】 正常で健康な住民のTTV 感染率は、一般住民のHGV 因子の罹患率よりも少なく
とも3 倍大きく、米国では1.7 ％であり（Linnen他、Science 、271(1996) 、50
5 〜508 ）、スコットランドでは3.2 ％である（Jarvis他、Lancet、348(1996)
、1352〜1355）と見られている。TTV 感染患者の大多数は、非経口的な伝染経路
の重要性を裏付ける輸血または静脈注射薬使用の経歴を有していたが、この因子
はまた、「集団獲得型」感染者の大きな割合で検出されている（38％）。従って
、TTV の同様な非経口的伝染をさらに調べなければならない。
【００１２】 Naumov他（上記）は、TTV 感染の罹患率が、非B 非C 型の病因の肝疾患患者に
おいて、健康な対照群よりもわずかに大きいことを示したが、この結果は、TTV
陽性症例の大多数が正常な肝機能試験を有し、肝臓組織学においてほんの小さな
変化を有していたために、肝障害誘導因子としてのTTV の原因的な役割を必ずし
も意味していない。これらの結果は、TTV が、病因が不明の慢性的な肝疾患の原
因因子ではないことを示唆している。さらに、TTV は、HBV またはHCV との同時
感染の後における肝損傷の程度に影響しないかのように考えられている。
【００１３】 従って、TTV の状況は、この因子による感染の臨床的意味がますます疑われて
いるので、HGB ウイルスC ／HGV の場合と類似しているようである。73％の症例
において、HGV 感染は肝細胞障害を伴っておらず、さらに16％がアラニンアミノ
トランスフェラーゼの小さな上昇のみを伴っていた（Alter 、N.Eng.J.Med.334(
1996) 、1536〜1537;Alter他、N.Eng.J.Med.336(1997) 、747 〜754 ）。従って
、TTV が肝疾患の明らかな病原的役割を有していないという発見は、明らかな疾
患との関連を有しないヒトウイルスの別の例である。1999年に、TTV が、輸血お
よび明らかでない院内経路によって伝染する非常に一般的で、多くの場合には持
続的な感染であることが、Matsumoto 他（Matsumoto 他、Hepatology、30(1999)
、283 〜288 ）により結論された。しかし、TTV とA 型〜E 型でない肝炎との関
連性は見出されず、この著者らは、併発しているC 型肝炎の重篤度および持続期
間に対するTTV の影響を認めることができなかった。TTV は原発的な肝炎ウイル
スとは考えられないと結論された。
【００１４】 輸血患者または静脈注射薬常用者において、非経口的に伝染し、起源が不明な
上記に記載された肝障害または他の疾患を生じさせる病原体であり得る原因的な
病因因子は知られていないため、本発明の基礎をなす技術的問題は、従って、そ
のような肝障害または他の疾患の発症において暗示されるか、またはそのような
発症に関連するか、またはそのような発症に関与する新規な因子を提供すること
であった。
【００１５】 前記の技術的問題に対する解決は、請求項において特徴づけられる実施形態を
提供することによって達成される。
【００１６】 従って、本発明は、ウイルス／ウイルス因子のゲノムを表し、かつ少なくとも
1 つの下記の特徴を有する核酸分子に関する： （a ）核酸分子は、下記のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするORF
を少なくとも1 つ含有する： （aa）配列番号21、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号35、配列
番号36、配列番号37、配列番号80、配列番号82、配列番号83、配列番号91、配列
番号92、配列番号93、配列番号123 、配列番号124 、配列番号180 、配列番号18
2 、配列番号189 、配列番号190 、配列番号196 、配列番号197 、配列番号198
、または （ab）配列番号81、配列番号122 、配列番号181 、配列番号188 ； （b ）核酸分子は下記のDNA 配列を含有する：配列番号2 、配列番号4 、配列番
号5 、配列番号6 、配列番号8 、配列番号9 、配列番号14、配列番号15、配列番
号16、配列番号17、配列番号20、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番
号30、配列番号31、配列番号34、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番
号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番
号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番
号55、配列番号56、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番
号79、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号94、配列番
号95、配列番号96、配列番号116 、配列番号117 、配列番号118 、配列番号119
、配列番号120 、配列番号121 、配列番号125 、配列番号177 、配列番号179 、
配列番号183 、配列番号184 、配列番号185 、配列番号186 、配列番号187 、配
列番号191 、配列番号192 、配列番号193 、配列番号194 、配列番号195 、配列
番号199 、配列番号200 、配列番号201 または配列番号202 ； （c ）核酸分子は、配列番号26、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番
号125 、配列番号186 、配列番号191 、配列番号199 の核酸分子の相補鎖に（ス
トリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする少なくとも80ヌクレオチド、好
ましくは少なくとも100 ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも500 ヌクレオ
チド、最も好ましくは少なくとも2000ヌクレオチドの部分を含有する； （d ）核酸分子は、（c ）の核酸分子に関して縮重しているが、TTV ウイルスの
ゲノムの相補鎖にハイブリダイズしない； （e ）核酸分子は、配列番号26、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番
号125 または配列番号186 、配列番号191 、配列番号199 の核酸分子と少なくと
も50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％の同一性を
有し、配列番号24、配列番号34、配列番号75、配列番号87、配列番号118 または
配列番号179 、配列番号187 、配列番号195 の核酸分子と少なくとも60％、好ま
しくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％の同一性を有し、あるい
は、 核酸分子は、配列番号28、配列番号39、配列番号89、配列番号184 または配列番
号193 の核酸分子と少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましく
は少なくとも75％の同一性を有するORF またはその断片を含み、配列番号77、配
列番号120 、配列番号177 または配列番号201 の核酸分子と少なくとも60％、好
ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％の同一性を有するORF
またはその断片を含み、配列番号30、配列番号40、配列番号78、配列番号90、配
列番号121 、配列番号185 、配列番号194 または配列番号202 の核酸分子と少な
くとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも75％の同一
性を有するORF またはその断片を含み、配列番号79の核酸分子と少なくとも50％
、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも75％の同一性を有する
ORF またはその断片を含み、または配列番号31、配列番号38、配列番号76、配列
番号88、配列番号119 、配列番号183 、配列番号192 または配列番号200 の核酸
分子と少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも
75％の同一性を有するORF またはその断片を含み、あるいは 核酸分子は、配列番号21、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号35、
配列番号36、配列番号37、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、
配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、
配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号80、配列番号82、
配列番号83、配列番号91、配列番号92、配列番号93または配列番号123 、配列番
号124 、配列番号180 、配列番号182 、配列番号189 、配列番号190 、配列番号
196 、配列番号197 または配列番号198 と少なくとも35％、好ましくは少なくと
も40％、より好ましくは少なくとも50％、最も好ましくは少なくとも75％の同一
性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子を含有する核酸分子であり、ある
いは、 核酸分子は、配列番号81、配列番号122 、配列番号181 または配列番号188 と少
なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、最も好ましくは少なくとも75％の同
一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子である； （f ）核酸分子の一部は、プライマーとして、配列番号41および配列番号42に規
定されるオリゴヌクレオチド、および／または配列番号115 および配列番号71に
規定されるオリゴヌクレオチド、または配列番号11、配列番号12、配列番号13、
配列番号18、配列番号19、配列番号22、配列番号23、配列番号32、配列番号73、
配列番号84、配列番号85、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100
、配列番号101 、配列番号102 、配列番号126 、配列番号127 、配列番号128 、
配列番号129 、配列番号130 、配列番号131 、配列番号132 、配列番号135 、配
列番号136 、配列番号172 、配列番号173 、配列番号174 、配列番号175 、配列
番号176 または配列番号203 、配列番号204 または配列番号205 に規定されるオ
リゴヌクレオチド、またはそのようなオリゴヌクレオチドの相補鎖を用いるPCR
によって適する条件下で増幅することができる；そして （g ）核酸分子は、挿入、置換、逆位、欠失、重複、組換え、付加またはその組
合せによって上記分子のいずれかから生じる。
【００１７】 本発明の範囲において、用語「ゲノム」は、タンパク質、ポリペプチドまたは
ペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（ORF ）である配列を意味
するだけでなく、非コード配列をもいう。従って、用語「核酸分子」は、コード
配列を含み、そして適用される場合には常に非コード配列を含む。本発明の核酸
分子はさらに、上記の核酸配列と縮重している核酸配列を含む。本発明により、
用語「核酸分子」はまた、核酸プローブがハイブリダイズし得る核酸の任意の利
用可能な誘導体を含む。前記の核酸プローブ自身は、前記の核酸分子または前記
のその誘導体にハイブリダイズし得る核酸分子の誘導体であり得る。用語「核酸
分子」はさらに、アミドの骨格結合を有するDNA アナログを含むペプチド核酸（
PNA ）（Nielsen,P.、Science 、254(1991) 、1497〜1500）を含む。ポリペプチ
ド（好ましくは、発現ポリペプチド）をコードする用語「ORF （「オープンリー
ディングフレーム」）は、本発明に関連して、（a ）（aa）または（ab）におい
て上記に示されるポリペプチドをコードする特定のヌクレオチド配列、あるいは
（b ）（a ）のヌクレオチド配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつ1 つまたは2 つ以上のアミノ酸の置換、欠失、重複、挿入、組
換え、付加または逆位によって（a ）のポリペプチドから得られるポリペプチド
（この場合、そのアミノ酸配列は、（aa）の前記ポリペプチドのアミノ酸配列と
少なくとも35％の同一性を示す）をコードするか、あるいは1 つまたは2 つ以上
のアミノ酸の置換、欠失または逆位によって（a ）のポリペプチドから得られる
ポリペプチド（この場合、そのアミノ酸配列は、（ab）の前記ポリペプチドのア
ミノ酸配列と少なくとも40％の同一性を示す）をコードする核酸分子のいずれか
によって規定される。従って、上記の（e ）の核酸分子により含まれる核酸分子
もまたORF と見なされる。
【００１８】 好ましくは、本明細書中で規定されるウイルスのゲノムを表す核酸分子は、病
原性ウイルスのゲノムを表す核酸分子である。本明細書中で使用されている用語
「病原性ウイルス」は、ウイルス性病原を可能にするウイルスを意味する。この
場合、そのような病原は、前記のウイルス／ウイルス因子が宿主における疾患を
生じさせるか、または宿主における疾患に寄与する手段として規定される。病原
の用語は、本明細書中では、ヒトまたは他の宿主で生じる急性および／または慢
性の感染をいう。従って、病原は、前記のウイルスが種々の器官または任意の器
官で異なる細胞集団を傷つけて、宿主の疾患の症状および徴候をもたらす機構を
意味する。そのような疾患には、特に、肝炎または肝細胞癌のような肝障害が含
まれる。さらに、用語「病原性ウイルス」は、本発明により、疾患の明確な症状
および／または徴候を原発的に生じさせることさえなく、宿主の生理学的状態に
好ましくない影響を及ぼし得るウイルス／ウイルス因子を意味する。従って、用
語「病原性ウイルス」はまた、例えば、別の病原性生物による感染後または感染
時（ウイルス、細菌、真菌、原生生物および／または蠕虫の感染後の二次的また
は同時感染）の宿主において、あるいは衰弱して免疫低下した宿主／患者におい
て臨床的状態を悪化させるウイルス／ウイルス因子をいう。従って、用語「病原
性ウイルス」は、一次感染を生じさせ得るウイルス／ウイルス因子を含むだけで
なく、二次感染を生じさせるウイルス／ウイルス因子をも含む。さらに、用語「
病原性ウイルス」は、宿主における疾患または疾患徴候を生じさせるか、または
宿主における疾患または疾患徴候に直接寄与するウイルス／ウイルス因子を意味
するが、患者の病理学的プロセスに間接的に関与するウイルス／ウイルス因子を
も含む。従って、用語「病原性ウイルス」は、本発明の範囲において、直接的な
疾患との関連性を有し、宿主／患者の（さらには以前からの）臨床的状態を悪化
させ、かつ／または宿主／患者の病理学的状態に間接的に関与するウイルス／ウ
イルス因子を含む。
【００１９】 本発明に従って使用されている用語「ハイブリダイズする」は、ストリンジェ
ントな条件またはストリンジェントでない条件に関連し得る。さらに指定されて
いない場合、そのような条件は、好ましくはストリンジェントではない。前記の
ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、Sambrook、「Molecular Cloning,A
Laboratory Manual 」、Cold Spring Harbor Laboratory 、 N.Y.(1989);Ausube
l、「Current Protocols in Molecular Biology」、Green Publishing Associat
es and Wiley Interscience 、 N.Y.(1989) ；またはHiggins およびHames （編
）、「Nucleic acid hybridization,a practical approach 」、IRL Press Oxfo
rd、Washington DC(1985) に記載されている従来のプロトコルに従って確立する
ことができる。条件の設定は十分に当業者の範囲内であり、この分野で記載され
ているプロトコルに従って決定することができる。従って、特異的にハイブリダ
イズする配列のみを検出する際には、通常、65℃における0.1xSSC 、0.1 ％SDS
などのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件が必要と
される。相同的配列または完全に相補的でない配列を検出するためのストリンジ
ェントでない条件は、65℃での6xSSC 、1%SDS で設定することができる。よく知
られているように、プローブの長さおよび決定すべき核酸の組成はハイブリダイ
ゼーション条件のさらなるパラメーターを構成する。ハイブリダイズする核酸分
子、または上記代替の（c ）に含まれる分子は、（a ）または（b ）に同定され
る分子の断片をも含む。この場合、そのヌクレオチド配列は、配列番号2 、4 、
5 、6 、8 、9 、14、15、16、17、20、24、26、28、30、31、34、38、39、40、
43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、75、76、77、78、
79、87、88、89、90、94、95、96、116 、117 、118 、119 、120 、121 、125
、177 、179 、183 、184 、185 、186 、187 、191 、192 、193 、194 、195
、199 、200 、201 または202 のその対応体と同一である必要はなく、その断片
はウイルスのゲノムまたはウイルスのゲノムの一部を表し、かつ少なくとも12ヌ
クレオチドを有し、好ましくは少なくとも15ヌクレオチドを有し、より好ましく
は少なくとも18ヌクレオチドを有し、より好ましくは少なくとも21ヌクレオチド
を有し、より好ましくは少なくとも30ヌクレオチドを有し、さらにより好ましく
は少なくとも40ヌクレオチドを有し、最も好ましくは少なくとも60ヌクレオチド
を有する。さらに、上記の核酸分子のいずれかとハイブリダイズする核酸分子も
また、このような分子の断片、誘導体および対立遺伝子変異体を含む。
【００２０】 用語「誘導体」は、これに関連して、これらの核酸分子のヌクレオチド配列が
、上記に記載された核酸分子の配列と、1 つまたは2 つ以上のヌクレオチド位置
において異なっていること、およびそれらが前記の核酸分子と非常に相同的であ
ることを意味する。さらに、あるいは代替的に、用語「誘導体」は、任意の化学
的または生物学的に改変された核酸と同様に、DNA 、PNA またはRNA から構成さ
れない化合物またはそれらだけから構成されない化合物を意味する。
【００２１】 相同性は、「断片」、「誘導体」または「対立遺伝子変異体」に関連して、少
なくとも55％の配列同一性、特に、少なくとも70％の同一性、好ましくは80％を
越える同一性、さらにより好ましくは90％を越える同一性をいうことが理解され
る。
【００２２】 一般に、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列同一性／相同性は、2 つのセグメ
ント間の相同的な最良のセグメントを見出すために特定のアルゴリズムが使用さ
れるBLASTIN 、BLASTP、NALIGNまたはPALIGNなどの知られているコンピューター
プログラムを使用して、慣用的に決定することができる。本発明の範囲において
、異なるORF のアミノ酸レベルにおける同一性の割合を比較する分析は、好まし
くは、下記のパラメーターを使用するPCGENEパッケージ（Intelligenetics ）の
PALIGNプログラムを使用して行われる：Open Gap Cost:10およびUnit Gap Cost:
2 。
【００２３】 さらに、本発明の範囲において、一方、異なる核酸配列のヌクレオチドレベル
における同一性の割合を比較する分析は、好ましくは、下記のパラメーターを使
用するPCGENEパッケージのNALIGNプログラムを使用して行われる：Open Gap Cos
t:100 およびUnit Gap Cost:10。これらのパラメーターは、分析された異なる配
列間での相同性の種々のレベルを特に考慮して、参照されるヌクレオチド配列ま
たはアミノ酸配列の全長にわたる同一性の割合を計算するために最もよく適して
いることが見出された。
【００２４】 上記に記載された核酸分子の配列のずれは、例えば、ヌクレオチドの置換、欠
失、付加、挿入、重複、逆位および／または組換えの単独またはその組合せの結
果であり得る。それらは自然に生じる場合があり、あるいはこの分野でよく知ら
れている組換えDNA 技術（例えば、Sambrook（上記）およびAusubel （上記）に
記載されている技術を参照のこと）によってもたらされ得る。対立遺伝子変異体
は、自然に存在する対立遺伝子変異体、ならびに合成的に作製された変異体また
は遺伝子工学的な変異体であり得る。上記に記載された核酸分子の様々な誘導体
、対立遺伝子変異体、ホモログまたはアナログによりコードされるタンパク質、
ペプチドまたはタンパク質断片は、電気泳動移動度、クロマトグラフィー挙動、
沈降係数、至適pH、至適温度、安定性、溶解性、分光学的性質などの物理的性質
と同様に、分子量、免疫学的反応性、立体配座などの特異的な共通した特徴をと
もに有し得る。
【００２５】 好ましくは、本発明の核酸分子は2 つのORF を含み、最も好ましくは3 つのOR
F を含む。さらに、ウイルスのゲノムを表し、4 つ以上のORF を含む核酸分子も
また好ましい実施形態であり、本発明の範囲に含まれる。
【００２６】 都合良いことに、本発明の核酸分子は、少なくとも、配列番号26（ウイルスの
ORF1、ORF3、およびORF2の5'末端の約15ヌクレオチドを除くORF2をコードする領
域を含む）に含まれる領域において、あるいは配列番号94、配列番号96、配列番
号125 、配列番号186 、配列番号191 および配列番号199 （さらなるウイルスOR
F1、ORF2およびORF3をコードする領域を含む）に含まれる領域において、あるい
は配列番号95（さらに別のORF1、ORF2およびORF3ならびにORF4を含む）に含まれ
る領域において、TTウイルスのゲノムの相補鎖にハイブリダイズしない。TTウイ
ルスのゲノムは、例えば、GENEBANKに、AB011482、AB011486、AB011487、AB0114
88、AB011489、AB011490、AB011491、AB008394、AB011493、AB011494、AF055897
、AF06045 、AF060546、AF060547、AF060548、AF060549、AF060550のアクセショ
ン番号で寄託されている遺伝子を含む。TTウイルスのゲノムの相補鎖にハイブリ
ダイズしない核酸分子は、例えば、Britten およびDavidson、「Nucleic acid h
ybridization」（Hames およびHiggins により編集（1985）、IRL Press Oxford
）に記載されているようなハイブリダイゼーション法を用いることにより、面倒
なことはなく当業者によって推定することができる。
【００２７】 さらに、本発明は、ウイルスのゲノムを表す核酸分子であって、上記の配列番
号26、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号125 、配列番号186 、配
列番号191 および配列番号199 に規定されるDNA 配列と少なくとも50％（好まし
くは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは80
％、特に好ましくは95％）の同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子
、上記の配列番号24、配列番号34、配列番号75、配列番号87、配列番号118 、配
列番号179 、配列番号187 または配列番号195 に規定されるDNA 配列と少なくと
も60％（好ましくは70％、より好ましくは80％、特に好ましくは95％）の同一性
を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子、あるいは配列番号31、配列番号38
、配列番号76、配列番号88、配列番号119 、配列番号183 、配列番号192 または
配列番号200 と少なくとも50％（好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少
なくとも75％、最も好ましくは少なくとも90％）の同一性を有するORF またはそ
の断片を含み、配列番号28、配列番号39、配列番号89、配列番号184 もしくは配
列番号193 の核酸分子と少なくとも50％（好ましくは少なくとも60％、より好ま
しくは少なくとも75％）の同一性を有するか、または配列番号77、配列番号120
、配列番号177 もしくは配列番号201 と少なくとも60％（好ましくは少なくとも
70％、より好ましくは少なくとも75％）の同一性を有するか、または配列番号30
、配列番号40、配列番号78、配列番号90、配列番号121 、配列番号185 、配列番
号194 もしくは配列番号202 の核酸分子と少なくとも50％（好ましくは少なくと
も60％、より好ましくは少なくとも75％）の同一性を有するか、または配列番号
79の核酸分子と少なくとも50％（好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少
なくとも75％）の同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子に関する：
上記の特徴（e ）を参照のこと。
【００２８】 本発明はまた、ウイルスのゲノムを表す核酸分子であって、配列番号21、配列
番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列
番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列
番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列
番号69、配列番号70、配列番号80、配列番号82、配列番号83、配列番号91、配列
番号92、配列番号93、配列番号123 、配列番号124 、配列番号180 、配列番号18
2 、配列番号189 、配列番号190 、配列番号196 、配列番号197 、配列番号198
と少なくとも35％（好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％
、最も好ましくは少なくとも75％）の同一性を有するアミノ酸配列をコードする
核酸分子を含む核酸分子に関する：上記の特徴（e ）を参照のこと。さらに、本
発明は、ウイルスのゲノムを表す核酸分子であって、配列番号81、配列番号121
、配列番号181 または配列番号188 と少なくとも40％（好ましくは少なくとも45
％、より好ましくは少なくとも50％、最も好ましくは少なくとも75％）の同一性
を有するアミノ酸配列をコードする核酸分子に関する：上記の特徴（e ）を参照
のこと。
【００２９】 さらに、本発明は、ウイルスのゲノムを表す核酸分子であって、そのゲノムの
一部が、プライマーとして、配列番号41および配列番号42に規定されるオリゴヌ
クレオチド、および／または配列番号115 および配列番号71に規定されるオリゴ
ヌクレオチド、あるいは配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号18、配
列番号19、配列番号22、配列番号23、配列番号32、配列番号73、配列番号84、配
列番号85、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100 、配列番号101
、配列番号102 、配列番号126 、配列番号127 、配列番号128 、配列番号129 、
配列番号130 、配列番号131 、配列番号132 、配列番号135 、配列番号136 、配
列番号172 、配列番号173 、配列番号174 、配列番号175 、配列番号176 または
配列番号203 、配列番号204 または配列番号205 に規定されるオリゴヌクレオチ
ド、あるいはそのようなオリゴヌクレオチドの相補鎖を用いるPCR によって適す
る条件下で増幅され得る核酸分子に関する。前記ゲノムに前記プライマーをハイ
ブリダイズさせるために適する条件は、当業者には知られており、好ましくはス
トリンジェントな条件を含む。本明細書中下記に記載されているように、そのよ
うな条件は、Sambrook他（上記）などの標準的な教本に記載されている。さらに
、好適な条件は、添付された実施例（特に、実施例10）に記載されている。
【００３０】 （BLAST2.0のような）コンピューターソフトウエアおよびGenBank などの利用
可能なデータベースを含む標準的な技術を使用して、当業者は、本発明の核酸配
列を特異的に認識し、および／または検出するさらなるプライマー／プローブを
工夫することが過度な負担を伴うことなくできる。このようなプライマー／プロ
ーブもまた本発明の範囲に含まれる。そのようなプライマー／プローブの例は、
その配列番号で示されている上記のプライマー／プローブと重複するプライマー
／プローブである。
【００３１】 本発明はさらに、上記に示されたゲノムおよび／またはORF の相補鎖を表す核
酸分子、または上記に示されたゲノムおよび／またはORF に対するアンチセンス
分子を表す核酸分子に関する。
【００３２】 驚くべきことに、TTウイルスとの関連が薄い新しウイルス因子の核酸分子が見
出された。これらの核酸分子は、健康な血液供与者においては最小の割合で検出
され得るだけであるが、静脈注射薬常用者の血液において、病因が分からない慢
性的な肝疾患のような非経口的伝染性疾患の罹患率がかなり大きい集団群におい
て非常に広がっている（Overby、Curr.Hepatol.7(1987)、35）。
【００３３】 このような核酸分子の最初の同定が、SEN の記号が与えられた静脈注射薬常用
者から得られた血液サンプルで行われた。このため、この新しいウイルス因子は
「SEN ウイルス」と呼ばれる。
【００３４】 本明細書中に示されているように、SEN ウイルスまたはそのサブタイプは、非
A 〜非E 型肝炎（NANE肝炎）に罹っている患者の血清で、静脈注射薬常用者の約
70％の血清で選択的に分離されるようであるが、健康な血液供与者あるいは自己
免疫疾患（慢性関節リウマチおよび原発性胆汁性肝硬変）またはB 型肝炎に罹っ
ている患者から得られた血清では検出することができない（添付された実施例6
および14、そしてさらには実施例17および19を参照のこと）。デルタ型肝炎患者
の一部がSENVについて陽性であるという事実は、両方のウイルス因子について陽
性であるスクリーニング患者の大部分が静脈注射薬常用者であるために驚くべき
ことではない。しかし、HBV 患者の一部が、SENVにも陽性としてスクリーニング
されている（添付された実施例31を参照のこと）。これらはほんの少数のB 型肝
炎患者であり、彼らは高リスク作用を有しないために選択された。より大きなB
型肝炎患者コホートをさらに調べることにより、これらの患者の一部が特定のSE
NVサブタイプと同時に感染し得ることが明らかにされた。SEN ウイルスまたはそ
のサブタイプは健康な血液供与者の間では低い罹患率であるが、起源が分からな
い進行した肝疾患に罹っている患者の大多数はこのウイルス因子（これらのウイ
ルス因子）について陽性であるようである。SEN ウイルスが種々のタイプまたは
サブタイプを含むこと、およびこれらのサブタイプの一部が他よりも病原性が大
きいことが本発明により推定される。さらに、肝障害以外の病原性発現がこのウ
イルス因子および／またはそのサブタイプによって引き起こされることがある。
そのような病原性発現には、胃腸管の異常および／または増殖異常が含まれるが
、これらに決して限定されない。このような異常には、クローン病（または他の
炎症性腸疾患）、紅斑性狼瘡、ならびに肝細胞癌および結腸癌のような癌が含ま
れる（添付された実施例17、19および26を参照のこと）。さらに、他の病原性因
子あるいは遺伝的素因または他の素因が前記肝障害の発症に関与し得る。上記に
示されたタイプおよびサブタイプのすべてが本発明により含まれる。
【００３５】 本発明はさらに、前記ウイルスのゲノムを表す核酸であって、挿入、置換、欠
失、逆位または重複によって上記に示されたゲノムから生じ、かつ上記に示され
る少なくとも1 つのORF （好ましくは2 つのORF 、最も好ましくは3 つの異なる
ORF ）を含む核酸に関する。さらに、本発明は、前記ウイルスのゲノムを表す核
酸であって、本明細書中に上記に示されている少なくとも4 つのORF を含む上記
に示されたゲノムから、挿入、置換、欠失、逆位または重複によって生じる核酸
に関する。
【００３６】 さらに、本発明は、ウイルス（ポリ）ペプチドまたはその断片をコードする核
酸分子に関する。この場合、この核酸分子は、 （a ）配列番号21、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号35、配列番
号36、配列番号37、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番
号91、配列番号92、配列番号93、配列番号122 、配列番号123 、配列番号124 、
配列番号180 、配列番号181 、配列番号182 、配列番号188 、配列番号189 、配
列番号190 、配列番号196 、配列番号197 または配列番号198 のアミノ酸配列を
有するポリペプチドまたは少なくとも6 アミノ酸のその断片をコードするORF を
少なくとも1 つ含む； （b ）配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号20、配列番
号26、配列番号28、配列番号30、配列番号31、配列番号38、配列番号39、配列番
号40、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番
号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番
号54、配列番号55、配列番号56、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番
号79、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号94、配列番
号95、配列番号96、配列番号119 、配列番号120 、配列番号121 、配列番号125
、配列番号177 、配列番号179 、配列番号183 、配列番号184 、配列番号185 、
配列番号186 、配列番号187 、配列番号191 、配列番号192 、配列番号193 、配
列番号194 、配列番号195 、配列番号199 、配列番号200 、配列番号201 または
配列番号202 に同定される配列あるいは少なくとも12ヌクレオチドのその断片を
有する； （c ）配列番号24、配列番号34、配列番号75、配列番号87、配列番号118 、配列
番号179 、配列番号187 または配列番号195 に同定される配列を有する； （d ）配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号20、配列番
号28、配列番号30、配列番号31、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番
号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番
号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番
号55、配列番号56、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番
号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号94、配列番号95、配列番
号96、配列番号119 、配列番号120 、配列番号121 、配列番号125 、配列番号17
7 、配列番号179 、配列番号183 、配列番号184 、配列番号185 、配列番号186
、配列番号187 、配列番号191 、配列番号192 、配列番号193 、配列番号194 、
配列番号195 、配列番号199 、配列番号200 、配列番号201 または配列番号202
の核酸配列の相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする； （e ）（d ）の核酸分子に関して縮重しているが、TTV のORF1および／またはTT
V のORF2をコードするTTウイルスのゲノムの相補鎖にはハイブリダイズしない； （f ）配列番号21、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号35、配列番
号36、配列番号37、配列番号80、配列番号82、配列番号83、配列番号91、配列番
号92、配列番号93、配列番号123 、配列番号124 または配列番号180 、配列番号
182 、配列番号189 、配列番号190 、配列番号196 、配列番号197 、配列番号19
8 と少なくとも35％（好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50
％、最も好ましくは少なくとも75％）の同一性を有するポリペプチドをコードす
るか、または配列番号81、配列番号122 、配列番号181 または配列番号188 と少
なくとも40％（好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、最
も好ましくは少なくとも75％）の同一性を有するポリペプチドをコードする；あ
るいは （g ）（b ）に示される配列と少なくとも50％（好ましくは少なくとも60％、よ
り好ましくは少なくとも75％、最も好ましくは少なくとも90％）の同一性を有す
るか、または（c ）に示される配列と少なくとも60％（好ましくは少なくとも70
％、より好ましくは少なくとも80％、最も好ましくは少なくとも90％）の同一性
を有する；あるいは （h ）挿入、置換、欠失、逆位、重複、組換え、付加またはその組合せによって
上記の分子のいずれかから生じる；あるいは （i ）核酸分子の一部は、プライマーとして、配列番号41および配列番号42に規
定されるオリゴヌクレオチド、および／または配列番号115 および配列番号71に
規定されるオリゴヌクレオチド、あるいは配列番号11、配列番号12、配列番号13
、配列番号18、配列番号19、配列番号22、配列番号23、配列番号32、配列番号73
、配列番号84、配列番号85、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号10
0 、配列番号101 、配列番号102 、配列番号126 、配列番号127 、配列番号128
、配列番号129 、配列番号130 、配列番号131 、配列番号132 、配列番号135 、
配列番号136 、配列番号172 、配列番号173 、配列番号174 、配列番号175 、配
列番号176 または配列番号203 、配列番号204 または配列番号205 に規定される
オリゴヌクレオチド、あるいはそのようなオリゴヌクレオチドの相補鎖を用いる
PCR によって適する条件下で増幅することができる。
【００３７】 好ましくは、前記の核酸分子は2 つのORF を含み、最も好ましくは3 つのORF
を含む。さらに、そして同様に好ましくは、前記の核酸分子は4 つ以上のORF を
含むことができる。
【００３８】 さらに、特徴（a ）における前記断片は少なくとも8 アミノ酸を含み、より好
ましくは少なくとも10アミノ酸を含み、より好ましくは少なくとも12アミノ酸を
含み、より好ましくは少なくとも15アミノ酸を含み、より好ましくは少なくとも
20アミノ酸を含み、さらにより好ましくは少なくとも30アミノ酸を含み、最も好
ましくは少なくとも35アミノ酸を含むことが好ましい。
【００３９】 同様に好ましくは、特徴（b ）における前記断片は少なくとも15ヌクレオチド
を含み、より好ましくは少なくとも18ヌクレオチドを含み、さらにより好ましく
は少なくとも21ヌクレオチドを含み、最も好ましくは少なくとも28ヌクレオチド
を含む。
【００４０】 本発明はまた、上記のウイルスポリペプチドまたはその断片をコードする核酸
分子に関する。この場合、前記ポリペプチドは、1 つまたは2 つ以上のアミノ酸
置換、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸逆位、アミノ酸付加、アミノ酸組
換えまたはアミノ酸重複あるいはその組合せによって上記に示された配列から生
じる。
【００４１】 さらに、本発明は、上記に示される配列番号26、配列番号94、配列番号95、配
列番号96、配列番号125 、配列番号186 、配列番号191 または配列番号199 の核
酸配列を有する核酸分子の相補鎖または前記核酸分子に特異的にハイブリダイズ
する核酸分子、あるいは前記核酸分子またはその前記相補鎖と同一である核酸分
子をもたらす。この場合、前記核酸分子は少なくとも12ヌクレオチドを含み、好
ましくは少なくとも15ヌクレオチドを含み、より好ましくは少なくとも18ヌクレ
オチドを含み、より好ましくは少なくとも21ヌクレオチドを含み、最も好ましく
は少なくとも25ヌクレオチドを含む。
【００４２】 前記の核酸分子は、コード配列、非コード配列、コード鎖に相補的な配列、お
よび適用される場合には常にアンチセンス配列を含む。ウイルスの非コード配列
の例は3'UTR または5'IRES（内部リボソーム進入部位）のような5'末端配列およ
び3'末端配列であり、あるいは5'反復配列および3'反復配列である。ウイルスの
非コード配列は、転写の開始に必要な調節配列を含むことがある。さらに、その
ような非コード領域はイントロン配列であってもよい。核酸分子はまた、前記配
列または相補配列の重複部分において同一のヌクレオチド配列を有する場合、そ
れらにハイブリダイズする場合、あるいはその相補鎖にハイブリダイズする場合
のいずれかにおいて、上記に示される配列番号26、配列番号94、配列番号95、配
列番号96、配列番号125 、配列番号186 、配列番号191 または配列番号199 の5'
または3'に広がっていることもある。
【００４３】 好ましい実施形態において、本発明の核酸分子の前記断片は、SEN ウイルスに
特異的な抗体と反応するエピトープをコードする。これは、このようなエピトー
プが、A 型肝炎、B 型肝炎、C 型肝炎、D 型肝炎、E 型肝炎、G 型肝炎、B 型〜
E 型でない肝炎またはTTウイルスに特異的な抗体と反応しないことを意味する。
【００４４】 さらに別の好ましい実施形態において、本発明の核酸分子はプローブまたはプ
ライマーである。前記のプローブまたはプライマーは、配列番号11、配列番号12
、配列番号13、配列番号18、配列番号19、配列番号22、配列番号23、配列番号32
、配列番号41、配列番号42、配列番号71、配列番号73、配列番号84、配列番号85
、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100 、配列番号101 、配列番
号102 、配列番号115 、配列番号126 、配列番号127 、配列番号128 、配列番号
129 、配列番号130 、配列番号131 、配列番号132 、配列番号135 、配列番号13
6 、配列番号172 、配列番号173 、配列番号174 、配列番号175 、配列番号176
または配列番号203 、配列番号204 または配列番号205 に規定される配列を含む
ことができる。特定のプライマーは、（特異的な）プローブとしても用いられ得
ることが本発明の範囲内において理解される。
【００４５】 これらのプライマーは、介在配列を増幅するためのPCR 反応で使用することが
でき、あるいは増幅することなく、ウイルス／ウイルス核酸を直接検出するため
のプローブとして使用することができる。配列番号13は、配列番号11および配列
番号12および／または配列番号126 および配列番号127 を用いて得られたPCR 産
物を検出するためにも使用することができる。同様に、配列番号98は、配列番号
115 および配列番号71で得られたPCR 産物を検出するために使用することができ
、配列番号130 は、配列番号128 および配列番号71で得られたPCR 産物を検出す
るために用いることができ、配列番号173 は、配列番号172 および配列番号71で
得られたPCR 産物を検出するために用いることができ、配列番号176 は、配列番
号174 および配列番号175 で得られたPCR 産物を確認するために使用することが
でき、そして配列番号205 は、配列番号203 および配列番号204 で得られたPCR
産物を検出するために使用することができる。あるいは、配列番号13を有するプ
ライマー、または配列番号18、配列番号19、配列番号22、配列番号23、配列番号
32、配列番号41、配列番号42、配列番号71、配列番号73、配列番号84、配列番号
85、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100 、配列番号101 、配列
番号102 、配列番号115 、配列番号126 、配列番号127 、配列番号128 、配列番
号129 、配列番号130 、配列番号131 、配列番号132 、配列番号135 、配列番号
136 、配列番号172 、配列番号173 、配列番号174 、配列番号175 、配列番号17
6 、配列番号203 、配列番号204 または配列番号205 を有するプライマーは、ウ
イルスDNA を直接検出するために使用することができる。従って、これらは、増
幅することなく、ウイルスを直接検出するために使用することができる。さらに
、前記プライマーまたはその相補体は、既知のウイルス配列から得られるプライ
マーと組み合わせてPCR 反応または類似する方法で使用することができる（特に
、配列番号1 、配列番号33、配列番号72、配列番号74、配列番号86または配列番
号178 に示されるプライマーなど）。
【００４６】 本発明の核酸分子は、cDNAなどのDNA 、またはmRNAなどのRNA であり得る。さ
らに、本発明の核酸分子はPNA （ペプチド核酸）であり得る。その起源は、天然
、合成または半合成であり得る。あるいは核酸分子は誘導体であり得る。
【００４７】 さらに、前記の核酸分子は、上記の核酸分子のいずれかを、単独または組み合
わせて含む組換え産生されたキメラ核酸分子であり得る。好ましくは、前記の核
酸分子はベクターの一部である。
【００４８】 従って、本発明は、本発明の核酸分子を含むベクターにも関する。
【００４９】 本発明のベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオ
ファージまたは別のベクター（これらは、例えば、遺伝子工学において従来的に
使用されている）であり得るし、そして適する宿主細胞において適する条件下で
前記ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などの遺伝子をさらに含むこと
ができる。
【００５０】 さらに、本発明のベクターは、本発明の核酸分子に加えて、適する宿主におけ
るコード領域の適正な発現を可能にする発現制御エレメントを含むことができる
。そのような制御エレメントは当業者には知られており、プロモーター、翻訳開
始コドンおよび翻訳部位を含むことができる。本発明のベクターはまた、挿入物
をベクターに導入するための挿入部位を含むことができる。好ましくは、本発明
の核酸分子は、真核生物細胞または原核生物細胞における発現を可能にする前記
発現制御配列に機能的に連結される。
【００５１】 真核生物細胞および原核生物細胞における発現を確実にする制御エレメントは
、当業者にはよく知られている。上記に言及されているように、そのようなエレ
メントは、転写の開始を確実にする調節配列を含み、そして転写の終結および転
写物の安定化を確実にするポリA シグナルを必要に応じて含む。さらなる調節エ
レメントは転写エンハンサーならびに翻訳エンハンサーを含むことができ、かつ
／または天然に関連するプロモーター領域または異種のプロモーター領域を含む
ことができる。例えば、哺乳動物宿主細胞における発現を可能にする可能な調節
エレメントは、CMV-HSV チミキン（thymikine ）キナーゼプロモーター、SV40、
RSV プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ヒト伸長因子1 αプロモーター、CM
V エンハンサーまたはSV40エンハンサーを含む。原核生物細胞における発現の場
合には、例えば、tac-lac プロモーターまたはtrp プロモーターを含む多数のプ
ロモーターが記載されている。転写の開始を担うエレメントの他に、そのような
調節エレメントはまた、転写終結シグナル（SV40ポリA 部位またはtkポリA 部位
など）をポリヌクレオチドの下流に含むことができる。これに関連して、好適な
発現ベクターはこの分野では知られており、例えば、Okayama-Berg cDNA 発現ベ
クターのpcDV1 （Pharmacia ）、pRc/CMV 、pcDNA1、pcDNA3（In-vitrogene）、
pSPORT1 （GIBCO BRL ）、または原核生物発現ベクター（ラムダgt11など）であ
る。本発明の核酸分子の他に、ベクターは、分泌シグナルをコードする核酸配列
をさらに含むことができる。そのような配列は、当業者にはよく知られている。
さらに、使用される発現システムに依存して、ポリペプチドを細胞区画に導くこ
とができるリーダー配列を本発明の核酸分子のコード配列に加えることができる
。そのようなリーダー配列はこの分野ではよく知られている。リーダー配列は、
翻訳配列、開始配列および終結配列と適切な相で一緒にされる。好ましくは、リ
ーダー配列は、翻訳させたタンパク質またはその一部をペリプラズム空間または
細胞外培地に分泌させることができる。必要な場合には、異種配列は、所望する
特性（例えば、発現させた組換え産物の安定化または簡便化された精製）をもた
らすC 末端またはN 末端の同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすること
ができる。ベクターが適切な宿主に取り込まれると、宿主は、ヌクレオチド配列
の高レベル発現に適した条件下で維持され、そして所望するときに、本発明の（
ポリ）ペプチドまたはその断片の回収または精製を行うことができる。当然のこ
とではあるが、ベクターはまた、本発明のウイルス因子に由来する調節領域を含
むことができる。
【００５２】 さらに、本発明のベクターはまた、遺伝子移入ベクターまたは標的化ベクター
でもあり得る。例えば、エクスビボ技術またはインビボ技術による細胞へのワク
チン接種のために治療用遺伝子を導入することに基づく遺伝子治療は、遺伝子移
入の最も重要な適用の1 つである。インビトロまたはインビボでの遺伝子治療に
関する好適なベクター、方法または遺伝子送達システムは文献に記載されており
、当業者には知られている；例えば、下記を参照のこと：Giordano、 Nature Me
dicine 、2(1996) 、534 〜539; Schaper、Circ.Res.79(1996) 、911 〜919; An
derson 、Science 、256(1992) 、808 〜813; Isner 、 Lancet 、348(1996)、3
70 〜374; Muhlhauser 、Circ.Res.77(1995) 、1077〜1086; Onodua、Blood 、9
1(1998)、30〜36; Verzeletti、Hum.Gene Ther.9(1998) 、2243〜2251; Verma
、Nature、389(1997) 、239 〜242; Anderson 、Nature、392 （増刊、1998）、
25〜30; Wang、Gene Therapy、4(1997) 、393 〜400; Wang 、Nature Medicine
、2(1996) 、714 〜716; WO94/29469;WO97/00957; 米国特許第5,580,859 号；米
国特許第5,589,466 号；米国特許第4,394,448 号またはSchaper 、Current Opin
ion in Biotechnology、7(1996) 、635 〜640 、ならびにそれらに引用された参
考文献。本発明の核酸分子およびベクターは、例えば弾道学的方法により細胞内
に直接導入するために、あるいはリポソームまたはウイルスベクター（例えば、
アデノウイルス、レトロウイルス）により細胞内に導入するために設計すること
ができる。さらに、バキュロウイルスシステムを本発明の核酸分子の真核生物発
現システムとして使用することができる。
【００５３】 本発明はまた、本発明のベクターでトランスフェクションまたは形質転換され
た宿主細胞、または本発明のベクターを有する非ヒト宿主にも関する。すなわち
、本発明は、本発明による核酸分子で、あるいはそのような核酸分子を含むベク
ターで遺伝子操作された宿主細胞または宿主に関する。用語「遺伝子操作された
」は、宿主細胞または宿主が、その天然のゲノムに加えて、細胞または宿主に導
入されたか、あるいはその先祖／両親の一方に導入された本発明による核酸分子
またはベクターを含むことを意味する。核酸分子またはベクターは、遺伝子操作
された宿主細胞または宿主において、ゲノムの外側に存在する独立した分子とし
て、あるいは好ましくは複製し得る分子として存在することができ、あるいは宿
主細胞または宿主のゲノムに安定に組み込まれ得る。
【００５４】 本発明の宿主細胞は、任意の原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。好
適な原核生物細胞は、大腸菌または枯草菌のようにクローニングのために一般的
に使用されている細胞である。さらに、真核生物細胞には、例えば、真菌または
動物細胞が含まれる。好適な真菌細胞の例は酵母細胞であり、好ましくはサッカ
ロマイセス属の酵母細胞であり、最も好ましくはサッカロマイセス・セレビジア
エ種の酵母細胞である。好適な動物細胞は、例えば、昆虫細胞、脊椎動物細胞（
好ましくは、哺乳動物細胞）であり、最も好ましくは非ニューロン細胞であり、
例えば、CHO 、Hela、NIH3T3、MOLT-4、Jurkat、K562、HepG2 などである。この
分野で知られているさらなる好適な細胞株を、American Type Culture Collecti
on(ATCC)のような細胞株寄託機関から得ることができる。
【００５５】 そのうえ、さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、本発明のウイル
ス／ウイルス因子によるインビトロ感染またはトランスフェクションが行われた
宿主細胞に関する。
【００５６】 より好ましい実施形態おいて、本発明のウイルスによるインビトロ感染または
トランスフェクションが行われた宿主細胞は、肝細胞、マクロファージ、リンパ
球、上皮細胞または骨細胞あるいはそれらから得られる細胞（細胞株）である。
【００５７】 宿主は哺乳動物（最も好ましくは、サルまたは類人猿）であり得る。前記の哺
乳動物は、治療法、好ましくは、ウイルス因子に対するワクチンを開発するため
には不可欠であり得る。
【００５８】 さらに、本発明は、本発明の核酸分子によってコードされる（ポリ）ペプチド
の製造方法に関する。この方法は、本発明の宿主細胞を、前記の（ポリ）ペプチ
ドの合成を可能にする適する条件下で培養すること、ならびに製造されたポリ）
ペプチドを培養から回収および／または単離することを含む。
【００５９】 形質転換された宿主は、培養装置で生育させることができ、また最適な細胞成
長を達成させるためにこの分野で知られている技術に従って培養することができ
る。本発明の（ポリ）ペプチドは、その後、生育培地、細胞溶解物または細胞膜
画分から単離することができる。発現させた場合、本発明のタンパク質は、硫酸
アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電
気泳動などを含むこの分野の標準的な手法に従って精製することができる；Scop
es、「Protein Purification」、Springer-Verlag 、N.Y.(1982)を参照のこと。
医薬用途の場合、均一性が少なくとも約90％〜95％である実質的に純粋なタンパ
ク質が好ましく、98％〜99％以上の均一性が最も好ましい。部分的に精製される
か、あるいは所望されるような均一性にまで精製された場合、タンパク質は、そ
の後、（体外を含む）治療的に使用することができ、あるいはアッセイ法の開発
および実施において使用することができる。
【００６０】 さらに、本発明は、本発明の核酸分子によってコードされる（ポリ）ペプチド
、あるいは上記に記載された方法によって製造されるか、または得ることができ
る（ポリ）ペプチドに関する。用語「（ポリ）ペプチド」は、ペプチドまたはポ
リペプチドのいずれかを意味する。
【００６１】 本発明の（ポリ）ペプチドは、細菌、酵母または他の真核生物細胞（哺乳動物
細胞または昆虫細胞など）のような宿主細胞において発現させた組換え（ポリ）
ペプチドであり得る。あるいは、本発明の（ポリ）ペプチドは、ウイルス標品か
ら単離することができる。本発明の別の実施形態において、合成された（ポリ）
ペプチドを使用することができる。従って、そのような（ポリ）ペプチドは、本
発明の核酸分子によってコードされる（ポリ）ペプチドであって、天然に存在す
るアミノ酸残基だけを含む（ポリ）ペプチドであり得るが、改変を含む（ポリ）
ペプチドであってもよい。これらには、カルボキシル基の脂肪族エステルまたは
アミド、ヒドロキシル含有残基のO −アセチル誘導体、およびアミノ基含有残基
のN −アシル誘導体などの共有結合誘導体が含まれる。そのような誘導体は、ア
ミノ酸残基の側鎖ならびにタンパク質のN 末端およびC 末端に存在する反応基に
結合させることによって調製することができる。さらに、（ポリ）ペプチドは、
放射能標識または共有結合させた希土類キレートなどの検出基で標識することが
でき、あるいは蛍光基に結合させることができる。本発明の（ポリ）ペプチドは
、例えば、そのような（ポリ）ペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現産
物、化学的改変産物であり得るか、あるいは天然起源（例えば、ウイルス標品）
から精製することができる。さらに、本発明の（ポリ）ペプチドは、（ポリ）ペ
プチドドメインの共有結合産物であり得る。
【００６２】 さらに、本発明の（ポリ）ペプチドを表すアミノ酸配列は、この分野でよく知
られ、市販されている合成機を使用して容易に化学合成することができる。
【００６３】 さらに、本発明は、本発明の核酸分子によって表されるゲノムを有するウイル
スまたはウイルス因子に関する。
【００６４】 より好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも3 つのORF を含むゲノ
ム配列を有するウイルスまたはウイルス因子に関する。この場合、前記ゲノム配
列の一部は、プライマーとして、配列番号41および配列番号42に規定されるオリ
ゴヌクレオチド、配列番号115 および配列番号71に規定されるオリゴヌクレオチ
ド、配列番号126 および配列番号127 に規定されるオリゴヌクレオチド、配列番
号128 および配列番号71に規定されるオリゴヌクレオチド、配列番号172 および
配列番号71に規定されるオリゴヌクレオチド、配列番号174 および配列番号175
に規定されるオリゴヌクレオチド、あるいは配列番号203 および配列番号204 に
規定されるオリゴヌクレオチド、あるいは配列番号11、配列番号12、配列番号13
、配列番号18、配列番号19、配列番号22、配列番号23、配列番号32、配列番号73
、配列番号84、配列番号85、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号10
0 、配列番号101 、配列番号102 、配列番号129 、配列番号130 、配列番号131
、配列番号132 、配列番号135 、配列番号136 、配列番号173 、配列番号176 ま
たは配列番号205 のいずれかに規定されるオリゴヌクレオチド、あるいは相補配
列を有するオリゴヌクレオチドを用いるPCR により適する条件下で増幅すること
ができる。
【００６５】 ゲノム配列が増幅され得る適する条件は、特に、Sambrook、 Molecular Cloni
ng A Laboratory Manual 、Cold Spring Harbor Laboratory(1989) 、N.Y.に示
されているように、あるいは添付された実施例において明らかにされているよう
に当業者にはよく知られている。
【００６６】 さらにより好ましい実施形態において、本発明のウイルスまたはウイルス因子
はSEN ウイルスである。SEN ウイルスは、上記に示された少なくとも1 つのORF
（好ましくは2 つ、最も好ましくは3 つ、および／または特に好ましくは4 つの
異なるORF ）を有するゲノムを含むウイルス、ウイルスタイプ、ウイルスクラス
、ウイルス遺伝子型またはウイルスサブタイプを意味し、例えば、SENV-A、SENV
-B、SENV-C、SENV-D、SENV-E、SENV-F、SENV-GまたはSENV-Hを意味する。
【００６７】 さらに、本発明のSEN ウイルス／ウイルス因子は、上記に示されたウイルス／
ウイルス因子の非病原性誘導体などの誘導体（好ましくは、弱毒化ウイルス）で
あり得る。弱毒化ウイルス／ウイルス因子は、親ウイルスに関連した臨床的症状
を生じさせないが、免疫性を誘導するには十分に依然として複製する毒性ウイル
スの選択された株である。当業者は、そのような弱毒化ウイルス株を得るために
広く使用されている方法について知っている。方法は、例えば、Mahy,BWJおよび
Kangro,H.O. 、「Virology Method Manual」、Academic Press London(1996) に
記載されているような従来のプロトコルに従うことができる。弱毒化は、熱処理
または化学的処理によって、あるいはウイルスからその病原性遺伝子またはその
一部が除かれる遺伝子操作によって達成することができる。弱毒化株は、通常、
細胞培養において、あるいは天然の宿主とは異なる宿主において継代することに
よって得られる。あるいは、弱毒化株は、本明細書中に提供されているSEN ウイ
ルスのゲノム情報を利用し、そして組換え技術を用いて構築することができる。
このような弱毒化株はワクチンに有用であり、あるいは抗原の単離に有用である
。さらに、本発明のSEN ウイルスは、本発明の少なくとも1 つのORF （好ましく
は2 つのORF 、より好ましくは3 つのORF 、最も好ましくは4 つの異なるORF ）
を、他のウイルス因子（特に、TTウイルスなど）に由来する1 つもしくは2 つ以
上のORF および／またはA 型肝炎、B 型肝炎、D 型肝炎、E 型肝炎、G 型肝炎、
非A 〜非E 型肝炎もしくは遺伝子操作に適した任意の他のウイルスに由来するOR
F と組み合わせて含むキメラウイルスであり得る。当業者は、現代の分子生物学
的方法（インビボおよびインビトロでの組換えなど）によって、さらには関連し
ない異なるウイルスに由来するエレメントからなる病原性ウイルスと非病原性ウ
イルスとのキメラ体を作製することができる。1 つの目的は、そのような得られ
たキメラ体（特に、免疫原ウイルス様粒子（VLP ）など）が、基礎医学研究およ
び生物学的研究と同様に医学的処置および予防において使用できるということで
ある。VLP を産生させるシステムは当業者には知られており、例えば、Ulrich、
Intervirology 、39(1996)、126 〜132 に記載されている。
【００６８】 さらに、本発明は、本発明のウイルスまたはウイルス因子を製造する方法に関
する。この方法は、上記の宿主細胞を適する条件下で培養すること、および培養
物からウイルスを単離することを含む。このためには、産生ウイルスを得るため
に、前記の培養物から得られる上清を集めることができ、あるいは感染細胞を溶
解することができる。広く使用されている方法は、例えば、Harden MR 、「Appr
oaches to anti-viral agents 」、VCH Pub.（編）(1986)に記載されている。
【００６９】 最も好ましい実施形態において、本発明のウイルス、上記に記載された方法で
得られたウイルスまたはウイルス因子は血液によって伝染し得る。
【００７０】 さらに、本発明は、本発明のウイルスを含むウイルス標品から単離された（ポ
リ）ペプチドに関する。特に、ウイルス（ポリ）ペプチドは、このような（ポリ
）ペプチドに対する抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーのようなク
ロマトグラフィー法を使用して単離および／または調製することができる。
【００７１】 本発明はさらに、本発明の核酸、（ポリ）ペプチドあるいはウイルスまたはウ
イルス因子に存在するエピトープを特異的に認識する抗体またはその断片もしく
は誘導体、あるいはアプタマーまたは別の受容体の抗血清に関する。抗体を作製
する一般的な方法はよく知られており、モノクローナル抗体の場合、例えば、Ko
hlerおよびMilstein、 Nature、256(1975) 、494 に記載されており、そしてJ.G
.R.Hurrel編、「Monoclonal Hybridoma Antibodies:Techiques and Application
s」、CRC Press Inc.、Boco Raron、 FL(1982)に総説されており、同様に、L.T.
Mimms 他、Virology、176(1990) 、604 〜619 によって教示されている。本発明
により、用語「抗体」はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体をいう。
ポリクローナル抗体（抗血清）は、従来のプロトコルに従って得ることができる
。抗体断片または誘導体には、F(ab')2 、Fab 、FvまたはscFv断片が含まれる；
例えば、HarlowおよびLane、「Antobodies,A Laboratory Manual」、CSH Press(
1988) 、Cold Spring Harbor、NYを参照のこと。好ましくは、本発明の抗体はモ
ノクローナル抗体である。さらに、本発明により、本発明の誘導体は、ペプチド
ミメティクスによって作製することができる。本発明の範囲において、用語「ア
プタマー」には、RNA 、ssDNA （ss＝一本鎖）、改変RNA 、改変ssDNA またはPN
A などの核酸であって、大きな特異性および親和性を有する多数の標的配列と結
合する核酸が含まれる。前記の他の受容体は、例えば、ペプチドミメティクスに
よって前記の抗体などから得ることができる。認識の特異性は、TTV などの他の
知られているウイルスと結合しないことを意味する。特異性を評価する好適な試
験は、本発明のエピトープを含む上記に示された化合物と、例えば、TTV に由来
する対応する化合物とを、例えば、ELISA 様式で接触させること、および本発明
の化合物に結合するだけで、前記の対応する化合物と交差反応しないか、または
著しい程度で交差反応しないそのような抗体などを同定することを意味する。
【００７２】 本発明はさらに、本発明の抗体あるいはその断片または誘導体あるいは本発明
のアプタマーによって特異的に認識される本発明の（ポリ）ペプチドの誘導体に
関する。そのような誘導体は（半）合成的であり、化学的に作製することができ
る。作製方法はペプチドミメティクスをも用いることができる。そのような作製
方法はこの分野ではよく知られており、面倒なことなく当業者によって適用する
ことができる。
【００７３】 さらに、本発明は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマに関する。ハイブ
リドーマの調製は当業者にはよく知られている；例えば、HarlowおよびLane（上
記）を参照のこと。
【００７４】 本発明はまた、本発明の（ポリ）ペプチドを含む融合タンパク質に関する。本
発明の（ポリ）ペプチドに加えて、前記の融合タンパク質は、共有結合または非
共有結合によって結合された少なくとも1 つのさらなるドメインを含むことがで
きる。結合は、この分野で知られている方法（Sambrook（上記）、Ausubel 、「
Current Protocol in Molecular Biology 」、Green Publishing Associates an
d Wiley Interscience、N.Y.(1989)）による遺伝子融合に基づくことができ、あ
るいは、例えば、化学的な架橋によって、例えば、WO94/04686に記載されている
ように行うことができる。本発明の（ポリ）ペプチドを含む融合タンパク質に存
在するさらなるドメインは、好ましくは、柔軟なリンカー（好都合には、ポリペ
プチドリンカー）によって連結させることができる。この場合、前記のポリペプ
チドリンカーは、前記のさらなるドメインのC 末端と、ペプチド、ポリペプチド
または抗体のN 末端（あるいはその逆）との距離を広げるのに十分な長さの多数
の親水性のペプチド結合したアミノ酸を含む。上記に記載された融合タンパク質
はさらに、例えば、プロテイナーゼまたは化学剤によって特異的に認識および切
断される切断可能なリンカーまたは切断部位を含むことができる。
【００７５】 さらに、前記の少なくとも1 つのさらなるドメインは、所定の特異性または機
能を有し得る。これに関連して、本発明の（ポリ）ペプチドは、この分野で知ら
れている従来の方法でさらに改変できることが理解される。これにより、本発明
の（ポリ）ペプチドと、異種タンパク質から誘導され得る他の機能的なアミノ酸
配列（例えば、核局在化シグナル、トランス活性化ドメイン、DNA 結合ドメイン
、ホルモン結合ドメイン、タンパク質標識（例えば、GST 、GFP 、h-myc ペプチ
ド、FLAG、HAペプチド））とを含む融合タンパク質を構築することができる。
【００７６】 さらに別の実施において、本発明は、本発明の（ポリ）ペプチドの少なくとも
2 つのエピトープと本発明のウイルスとを含むモザイクポリペプチドに関する。
この場合、前記のモザイクポリペプチドは、本来のSEN ウイルスゲノムのエピト
ープ間に通常介在するアミノ酸を有しない。
【００７７】 特に、そのようなモザイクポリペプチドは、リシンの場合には直線状に、また
は多抗原ペプチドシステムとして提示し得る多数の免疫学的に関連するエピトー
プを1 つのペプチドまたは（ポリ）ペプチドに含むことができるため、本明細書
中に記載されている適用および方法において有用である。関連するエピトープは
、スペーサー領域によって分離することができる。
【００７８】 別の実施形態において、本発明は、検出できるように標識された本発明の核酸
分子、（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの誘導体、ウイルス、抗体あるいは
その断片または誘導体、アプタマーまたは他の受容体、融合タンパク質、モザイ
クポリペプチドあるいはプライマーに関する。様々な技術が、生体分子を標識す
るために利用することができ、それらは当業者にはよく知られており、本発明の
範囲内であると見なされる。そのような技術は、例えば、Tijssen 、「Practice
and theory of enzyme immuno assays 」、Burden,RH およびvon Knippenburg(
編)、第15巻(1985);「 Basic methods in molecular biology 」、Davis LG、 D
ibmer MD;Battey Elsevier(1990);Mayer 他( 編)、「 Immunochemical methods
in cell and molecular biology」、Academic Press、 London(1987 ）、または
「Methods in Enzymology 」シリーズ、Academic Press,Inc. に記載されている
。
【００７９】 多くの異なる標識および標識方法が当業者には知られている。本発明において
使用され得る標識のタイプの例には、酵素、放射性同位体、金属コロイド、蛍光
化合物、化学発光化合物および生物発光化合物が含まれる。
【００８０】 広く使用されている標識には、特に、蛍光色素（フルオレセイン、ローダミン
、テキサスレッドなど）、酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、放射活性同位体（32P または125Iなど
）、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属コロイド、化学発光化合物または生物発光
化合物（ジオキセタン類、ルミノールまたはアクリジニウム類）が含まれる。酵
素またはビオチン基の共有結合、ヨウ素化、リン酸化、ビオチン化、ランダムプ
ライミング、ニックトランスレーション、（ターミナルトランスフェラーゼを使
用する）テーリング化のような標識手法がこの分野でよく知られている。検出方
法には、オートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡、直接的および間接的な酵素反応
などが含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】 さらに、本発明は、下記を結合している固相に関する： （a ）核酸分子； （b ）（ポリ）ペプチド； （c ）前記（ポリ）ペプチドの誘導体； （d ）ウイルス／ウイルス因子； （e ）抗体またはその断片もしくは誘導体またはアプタマーまたは他の受容体； （f ）融合タンパク質；および／または （g ）モザイクポリペプチド。
【００８２】 これらはすべて上記に記載されている。
【００８３】 固相は当業者には知られており、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁
気ビーズ、金属コロイド粒子、ガラスおよび／またはシリコンのチップおよび表
面、ニトロセルロースストリップ、メンブラン、シート、動物の赤血球細胞また
は赤血球細胞ゴースト、デュラサイト（duracyte）、および反応トレーのウエル
壁、プラスチックチューブまたは他の試験チューブを含むことができる。核酸、
（ポリ）ペプチド、タンパク質、抗体、ウイルスなどを固相に固定化する好適な
方法には、イオン相互作用、疎水相互作用、共有結合相互作用などが含まれるが
、これらに限定されない。固相は、上記に示されている領域を引きつけて固定化
し得る能力を有する1 つまたは2 つ以上のさらなる受容体を保持することができ
る。このような受容体は、試薬自身に対して、または捕獲試薬に結合させた荷電
物質に対して反対の電荷を有する荷電物質を含むことができ、あるいは受容体は
、固相に固定化（結合）させ、かつ上記に示されている試薬を固定化し得る任意
の特定の結合パートナーであり得る。
【００８４】 広く使用されている検出アッセイには、放射性同位体法または非放射性同位体
法が含まれる。このようなアッセイには、特に、RIA （放射免疫アッセイ）およ
びIRMA（免疫放射定量測定法）、EIA （酵素免疫アッセイ）、ELISA （酵素結合
免疫吸着アッセイ）、FIA （蛍光免疫アッセイ）およびCLIA（化学発光免疫アッ
セイ）が含まれる。この分野で使用されている他の検出方法に、トレーサー分子
を利用しない方法がある。これらの方法の1 つの原型は、少なくとも2 つの粒子
を架橋する特定分子の性質に基づく凝集アッセイである。
【００８５】 当業者には自明であるように、SEN ウイルスのキャリアおよび汚染された体液
または血液製剤をスクリーニングして同定する特異的かつ高感度な方法に対する
要求は大きい。従って、別の局面において、本発明は、本発明の下記のものを含
む診断用組成物に関する： （a ）固相； （b ）核酸分子； （c ）（ポリ）ペプチド； （d ）前記（ポリ）ペプチドの誘導体； （e ）ウイルスまたはウイルス因子； （f ）抗体またはその断片もしくは誘導体またはアプタマーまたは他の受容体； （g ）融合タンパク質； （h ）1 つのプライマーまたは1 対のプライマー；および／または （i ）モザイクポリペプチド。
【００８６】 これらはすべて上記に記載されている。
【００８７】 臨床検体および／または科学的検体におけるウイルス、ウイルス断片、誘導体
、（ポリ）ペプチド、ポリヌクレオチドなどを診断して定量するために、様々な
免疫学的方法（上記に記載されているような方法）ならびに分子生物学的方法（
核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、PCR アッセイまたはDNA 酵素免疫アッセ
イ（Mantero 他、Clinical Chemistry、37(1991)、422 〜429 ）など）が開発さ
れており、この分野ではよく知られている。これに関連して、本発明の核酸分子
はまた、アミド骨格結合を含む改変DNA アナログであるPNA を含み得ることに留
意しなければならない。そのようなPNA は、特に、DNA/RNA ハイブリダイゼーシ
ョンのプローブとして有用である。本発明の（ポリ）ペプチドは、特に、感染者
の生物学的試験試料における抗ウイルス抗体の検出に有用である。本発明の抗体
は、非急性感染者から急性を識別するときに有用であり得ることもまた考えられ
る。
【００８８】 診断用組成物は、好適な検出手段を必要に応じて含む。例えば、上記に記載さ
れている（ポリ）ペプチドならびに抗体またはその断片もしくは誘導体またはア
プタマーなどは、それらを液相で用いることができる免疫アッセイ、あるいは固
相担体に結合させることができる免疫アッセイにおける使用に好適である。前記
の（ポリ）ペプチドが用いられ得る免疫アッセイの例は、直接的または間接的な
いずれかの形式における競合的免疫アッセイまたは非競合的免疫アッセイである
。そのような免疫アッセイの例は既に上記に記載されており、放射免疫アッセイ
（RIA ）、サンドイッチ（免疫定量測定法）アッセイ、およびウエスタンブロッ
トアッセイである。（ポリ）ペプチド、抗体、モザイクポリペプチドおよび／ま
たは融合タンパク質などは、多くの種々の担体に結合させることができる。よく
知られている担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロ
ピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロー
ス、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースな
らびにマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的に対して可溶性ま
たは不溶性のいずれかであり得る。適切な標識および標識方法は上記に示されて
いる。
【００８９】 前記の診断用組成物は、本発明の（ポリ）ペプチドまたはウイルスタンパク質
をコードするmRNAの存在を検出することによって本発明の核酸分子の発現を検出
する方法において使用することができる。これは、例えば、ウイルス標品からmR
NAを得ること、およびそのようにして得られたmRNAを、適する条件（同様に上記
参照）下で本発明のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし得る核酸分子
を含むプローブ／プライマーと接触させること、およびプローブ／プライマーに
ハイブリダイズしたmRNAの存在を検出することを含む。試料中の核酸分子を検出
することに役立つさらなる診断方法には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR
）、リガーゼ連鎖反応（LCR ）、核酸ハイブリダイゼーションと組み合わせたサ
ザンブロッティング、比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH ）または表現差
分析（RDA ）が含まれる。核酸分子の存在をアッセイするこれらの方法はこの分
野では知られており、過度な実験を何ら行うことなく実施することができる。当
然のことではあるが、診断用組成物はまた、ウイルスゲノムなどの本発明のウイ
ルス、ウイルス（ポリ）ペプチドまたは他の核酸分子を検出するために用いるこ
とができる。
【００９０】 本発明はさらに、下記のものを含むキットに関する： （a ）固相； （b ）核酸分子； （c ）（ポリ）ペプチド； （d ）（ポリ）ペプチドの誘導体； （e ）ウイルスまたはウイルス因子； （f ）抗体またはその断片もしくは誘導体またはアプタマーまたは他の受容体； （g ）融合タンパク質； （h ）1 つのプライマーまたは1 対のプライマー；および／または （i ）モザイクポリペプチド。
【００９１】 これらは上記に記載されている。
【００９２】 好都合なことに、本発明のキットはさらに、科学的アッセイまたは診断アッセ
イなどを行うために必要とされる反応緩衝剤、貯蔵溶液および／または残りの試
薬もしくは材料を必要に応じて含む。さらに、本発明のキットの一部は、個々に
バイアルまたはビンにパッケージングすることができ、あるいは容器または多容
器ユニットで組み合わせてパッケージングすることができる。
【００９３】 本発明のキットは、特に、本発明の（ポリ）ペプチドを製造する方法を実施す
るために都合良く使用することができ、そして例えば、診断キットとして、ある
いは研究用用具またはワクチン接種用具として、本明細書中に示される様々な適
用において用いることができる。さらに、本発明のキットは、科学的、医学的お
よび／または診断的な目的に適した検出手段を含むことができる。キットの製造
は、好ましくは、当業者に知られている標準的な手法で行われる。
【００９４】 さらに、別の実施形態において、本発明は、本発明の下記のものを含む組成物
に関する： （a ）核酸分子； （b ）（ポリ）ペプチド； （c ）（ポリ）ペプチドの誘導体； （d ）弱毒化ウイルス； （e ）非病原性誘導体； （f ）抗体またはその断片もしくは誘導体またはアプタマーまたは他の受容体； （g ）融合タンパク質；および／または （h ）モザイクポリペプチド。
【００９５】 より好ましい実施形態において、前記の組成物は医薬組成物である。
【００９６】 本発明の医薬組成物はさらに、製薬的に受容可能なキャリア、賦形剤および／
または希釈剤を含むことができる。好適な製薬的キャリアの例はこの分野ではよ
く知られており、リン酸緩衝化生理食塩水溶液、水、乳化物（油／水乳化物など
）、様々なタイプの湿潤化剤、滅菌溶液などが含まれる。そのようなキャリアを
含む組成物は、よく知られている従来の方法で配合することができる。このよう
な医薬組成物は、好適な用量で対象者に投与することができる。好適な組成物の
投与は、種々の方法で、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投
与、局所投与、皮内投与、鼻腔内投与または気管支内投与によって行うことがで
きる。投薬法は主治医および臨床的要因により決定される。医療分野ではよく知
られているように、患者に対する投薬量は多くの要因に依存している。そのよう
な要因には、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、
投与時期および投与経路、全身の健康状態、ならびに同時に投与されている他の
薬物が含まれる。タンパク質性の製薬的に活性な物質を、1 用量あたり1ng 〜10
mgの間の量で存在させることができる。しかし、特に上記の要因を考慮して、こ
の例示的な範囲よりも少ない用量またはこの例示的な範囲よりも多い用量も含ま
れる。好適な組成物の投与は、種々の方法で、例えば、静脈内投与、腹腔内投与
、皮下投与、筋肉内投与、局所投与または皮内投与によって行うことができる。
治療法が連続的な注入である場合、投薬量はまた、それぞれ、1 μg ユニット〜
10mgユニット／キログラム体重／分の範囲内にすることができる。進捗を定期的
な評価によりモニターすることができる。本発明の組成物は局所投与または全身
投与することができる。投与は、一般には非経口的であり、例えば、静脈内であ
る。本発明の組成物はまた、例えば、体内または表面の標的部位に対する弾道学
的な送達によって、あるいは動脈内の部位へのカテーテルによって標的部位に直
接的に投与することができる。非経口的に投与される調製物には、滅菌された水
性または非水性の溶液剤、懸濁剤および乳化剤が含まれる。非水性溶媒の例は、
プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油（オリーブ油など）、
および注射可能な有機エステル（オレイン酸エチルなど）である。水性キャリア
には、水、アルコール／水の溶液、乳化物または懸濁物が含まれ、生理食塩水お
よび緩衝化媒体が含まれる。非経口性ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リン
ゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル
、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、流動性の栄養補充剤、電解質
補充剤（リンゲルのデキストロースに基づく電解質補充剤など）などが含まれる
。保存剤および他の添加剤（例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート化剤および
不活性ガスなど）もまた存在させることができる。さらに、本発明の医薬組成物
は、医薬組成物の目的とする使用に依存して、インターロイキン、インターフェ
ロンおよび／またはCpG 含有DNA 拡張物などのさらなる薬剤を含むことができる
。
【００９７】 さらに、本発明の範囲内には、ウイルス感染、肝障害、炎症性疾患、または癌
のような増殖異常の処置において使用されるさらなる薬剤を含む上記に記載され
ている医薬組成物が含まれる。
【００９８】 好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物はワクチンである。ワクチン
は、特に、本発明の1 つまたは2 つ以上の（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチド
の誘導体、核酸分子、モザイクポリペプチド、融合タンパク質、ウイルス、ウイ
ルスの非病原性／弱毒化誘導体、抗体、前記抗体の断片、抗体の誘導体、または
アプタマーまたは受容体から調製することができる。
【００９９】 例えば、本発明の核酸分子は、遺伝子ワクチン接種のために、あるいはDNA ワ
クチンとして使用することができる。遺伝子ワクチンの投与経路はこの分野では
よく知られており、DNA ワクチン接種が、同種免疫応答、抗腫瘍免疫応答および
抗イディオタイプ免疫応答を誘発させるために使用され、成功している（Tighe
M.他、Immunology Today、19(1998)、89〜97）。さらに、核酸分子／DNA の接種
は、ウイルス疾患の種々の様式において保護的であることが見出されている（Fy
nan,E.F.他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90(1993) 、11478 〜11482; Boyer,I.D.
、 Nat.Med.3(1997)、526〜532; Webster,R.G. 他、 Vaccine 、12(1994)、1495
〜1498; Montgomery他、 DNA Cell Biol.12(1993)、777〜783; Barry 、 Nature
、311(1995)、632〜635; Xu およびLiew、 Immunology、84(1995)、173 〜176;
Zhoug 、 Eur.J.Immunol.26(1996)、2749〜2757; Luke 、 J.Inf.Dis.175(1997
)、91 〜97; Mor 、Biochem.Pharmacology、55(1998)、1151〜1153; Donelly 、
Annu.Rev.Immun.15(1997)、617 〜648; MacGregor 、 J.Infect.Dis.178(1998)
、92〜100)。 医薬組成物においてワクチンとして使用される本発明の（ポリ）ペプチド、（
ポリ）ペプチドの誘導体、（ポリ）ペプチドを含む融合タンパク質、またはモザ
イクポリペプチドは、例えば、中性または塩の形態として配合することができる
。酸付加塩などの製薬的に受容可能な塩およびその他がこの分野では知られてい
る。ワクチンは、特に、本発明のウイルスによる感染を処置および／または予防
するために使用することができ、そして配合方法と適合した投薬物において、予
防的または治療的な処置に関して薬理学的に効果であるような量で投与すること
ができる。好ましくは、ワクチンは、本明細書中上記に記載されている弱毒化ウ
イルス因子を含む。
【０１００】 ワクチン接種プロトコルには、能動的または受動的な免疫化を含むことができ
る。能動的な免疫化は、保護的な免疫応答を誘発さようとすることにおいて、1
つまたは2 つ以上の抗原（例えば、本発明のウイルス／ウイルス因子、（ポリ）
ペプチド、（ポリ）ペプチドの誘導体、融合タンパク質、モザイクポリペプチド
および／または核酸分子）を宿主／患者に投与することを伴う。能動的な免疫化
は、既に形成された免疫グロブリンもしくはその断片（例えば、上記の抗体、そ
の誘導体もしくは断片）または本発明のアプタマーを宿主／患者に移すことを伴
う。ワクチン接種の原理および実施ならびにワクチンは当業者には知られている
。例えば、Paul、「Fundamental Immunology」、Raven Press 、 New York(1989
)、またはCryz,S.J. 、「Immunotherapy and vaccines」、VCH Verlagsgessells
chaft(1991)を参照のこと。典型的には、ワクチンは、注射可能物として、液体
の溶液剤または懸濁剤のいずれかとして調製される；液体における溶液または懸
濁物に好適な注射前の固体形態もまた調製することができる。調製物を乳化する
ことができ、あるいはタンパク質をリポソームにカプセル化することができる。
活性な免疫原性成分は、活性成分と適合し得る薬理学的に受容可能な賦形剤と混
合されることが多い。好適な賦形剤には、水、生理食塩水、デキストロース、グ
リセロール、エタノールなどが含まれるが、これらに限定されない。様々な量で
これらの賦形剤を組み合わせたものもまた使用することができる。ワクチンはま
た、湿潤化剤または乳化剤、pH緩衝化剤、および／またはワクチンの有効性を増
強するアジュバントなどの補助物質を少量含むことができる。例えば、そのよう
なアジュバントには、水酸化アルミニウム、N −アセチルムラミル−L −トレオ
ニル−D −イソグルタミン（thr-DMP ）、N −アセチルノルムラミル−L −アラ
ニル−D −イソグルタミン（CGP11687、これはまたnor-MDP とも呼ばれている）
、N −アセチルムラミル−L −アラニル−D −イソグルタミニル−L −アラニン
−2 （1'2'−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3 −ヒドロキシホスホリルオキシ
）エチルアミン（CGP19835A 、これはまたMTP-PEとも呼ばれている）、および2
％スクワレン／Tween-80（登録商標）乳化物におけるRIBI（MPL+TDM+CWS ）を含
むことができる。
【０１０１】 ワクチンは、通常、静脈内注射または筋肉内注射によって投与される。他の投
与様式に適したさらなる配合物には、坐薬が含まれ、場合により経口配合物また
は鼻腔配合物が含まれる。坐薬の場合、従来的なバインダーおよびキャリアには
、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含むことができるが、これ
らに限定されない。経口配合物には、例えば、マンニトール、ラクトース、デン
プン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マ
グネシウムなどの製薬的な顆粒のような通常的に用いられている賦形剤が含まれ
る。このような組成物は、溶液剤、懸濁剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤、持続放
出配合物または粉末剤の形態を取ることができ、約10％〜約95％の活性成分を含
有し、好ましくは約25％〜約70％の活性成分を含有する。DNA ワクチンは、粒子
衝撃導入などの弾道学的な方法で投与することができる。
【０１０２】 ワクチンは、投薬配合物と適合した方法で、かつ予防的および／または治療的
に効果的であるような量で投与される。投与量は、一般に、1 用量あたりの抗原
が約5 マイクログラム〜約250 マイクログラムの範囲内にあり、投薬され得る対
象体、抗体を合成する対象体の免疫系の能力、および求められる保護の程度に依
存する。投与するために必要とされる活性成分の正確な量は実施者の判断に依存
し得るが、それぞれの対象体に対して一意的にすることができる。ワクチンは単
用量方式または多用量方式で投与することができる。多用量方式は、一次の連続
したワクチン接種が1 回〜10回の異なる用量で行われ、その後、他の用量が、免
疫応答を維持および／または強化するために必要とされる時間間隔（例えば、別
の用量に関して1 ヶ月〜4 ヶ月）で続いて投与され得る方式である。個体により
必要とされる場合には数ヶ月後にその後の用量（1 つまたは2 つ以上）が投与さ
れる。投薬法はまた、少なくとも一部は、個体の必要性によって決定され、実施
者の判断に依存する。本発明の免疫原性化合物を含むワクチンは、他の免疫調節
剤と組み合わせて、例えば、免疫グロブリンまたはサイトカインと組み合わせて
投与できることが考えられる。
【０１０３】 さらに、本発明は、試料中のウイルス／ウイルス因子の存在を検出する方法に
関する。この方法は、 （a ）前記試料から得られたDNA をストリンジェントな条件下で本発明の核酸分
子または本発明のベクターとハイブリダイズすること；および （b ）核酸ハイブリッドの形成を検出すること を含む。
【０１０４】 本発明のさらに別の実施形態は、試料中の本発明のウイルスまたはウイルス因
子の存在を検出する方法である。この方法は、 （a ）試料から得られたDNA を1 対の本発明のプライマーとハイブリダイズする
こと； （b ）PCR 増幅技法または別のDNA 増幅技法を行うこと；および （c ）特定のPCR 増幅産物または別の増幅産物の形成を検出すること； を含む。
【０１０５】 前記のプライマーは、（本明細書中上記に示されている）ストリンジェントな
条件下で前記DNA に対する安定なハイブリダイゼーションを可能にする任意の長
さであり得る。好ましい実施形態において、前記のプライマー対には、配列番号
11、配列番号12、配列番号13、配列番号18、配列番号19、配列番号22、配列番号
23、配列番号32、配列番号41、配列番号42、配列番号71、配列番号73、配列番号
84、配列番号85、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100 、配列番
号101 、配列番号102 、配列番号115 、配列番号126 、配列番号127 、配列番号
128 、配列番号129 、配列番号130 、配列番号131 、配列番号132 、配列番号13
3 、配列番号136 、配列番号172 、配列番号173 、配列番号174 、配列番号175
、配列番号176 または配列番号203 、配列番号204 または配列番号205 に規定さ
れる配列からなる群より選択されるプライマーが含まれる。特に好ましい実施形
態において、これらのプライマー対には、配列番号41および配列番号42に規定さ
れる配列、配列番号115 および配列番号71に規定される配列、配列番号126 およ
び配列番号127 に規定される配列、配列番号128 および配列番号71に規定される
配列、配列番号172 および配列番号71に規定される配列、ならびに／または配列
番号174 および配列番号175 に規定される配列が含まれる。
【０１０６】 好適なさらなるDNA 増幅技法はこの分野では知られており、特に、リガーゼ連
鎖反応、鎖置換増幅、核酸配列型増幅（NASBA ）またはQ βレプリカーゼに基づ
く技法を含む。
【０１０７】 好ましくは、ハイブリダイゼーション（およびその後の洗浄）はストリンジェ
ントな条件下で行われる；例えば、Sambrook（上記）を参照のこと。
【０１０８】 さらに、本発明は、試料中の本発明のウイルスの存在を検出する方法に関する
。この方法は、 （a ）前記の試料を本発明の抗体または断片または誘導体またはアプタマーまた
は他の受容体とインキュベーションすること；および （b ）前記試料中に存在する（ポリ）ペプチドまたはウイルスまたはウイルス因
子と前記抗体またはその断片もしくは誘導体または前記アプタマーまたは他の受
容体との複合体の形成を検出すること を含む。
【０１０９】 さらに、本発明は、試料中の本発明の抗体またはその断片もしくは誘導体また
はアプタマーまたは他の受容体を検出する方法に関する。この方法は、 （a ）前記の試料を、本発明の核酸分子、本発明のウイルスあるいは本発明の（
ポリ）ペプチドまたはその断片とインキュベーションするか、あるいは本発明の
（ポリ）ペプチドの誘導体とインキュベーションすること；および （b ）前記抗体、前記断片または前記抗体誘導体または前記アプタマーまたは他
の受容体と、前記核酸分子、前記ウイルスまたは前記（ポリ）ペプチドまたは前
記断片もしくは誘遺体との複合体の形成を検出すること を含む。
【０１１０】 上記に示された方法における検出自体は、従来のプロトコルに従って行うこと
ができる。例えば、ハイブリダイズまたは増幅したDNA は、例えば、核酸分子の
分子量を参照することによって、抗二本鎖抗体を使用することによって、あるい
は二次抗体により形成されたタンパク質性複合体を検出することによってゲル中
で検出することができる。検出工程に対する他の選択肢は当業者には直ちに明ら
かである。検出工程に関して好適な形式には、ELISA 、RIA などが含まれる。
【０１１１】 ウイルス／ウイルス感染の検出方法はこの分野ではよく知られており、免疫ア
ッセイの他に、光学顕微鏡および電子顕微鏡での免疫検出のような顕微鏡技法が
含まれる（例えば、Fields、「Virology」、第3 版、Lippincott-Raven(1996);E
vans A.S. 、「Viral Infections of Humans」(1989)、Plenum Publishing Corp
oration を参照のこと）。
【０１１２】 なお、さらにより好ましい実施形態において、本発明は、前記の核酸分子、少
なくとも1 つの前記プライマー、あるいは前記抗体またはその断片もしくは誘導
体またはアプタマーまたは他の受容体が検出できるように標識されている上記に
記載される方法に関する。
【０１１３】 そのような標識は当業者にはよく知られており、本明細書中上記に示されてお
り、タグ、蛍光マーカーまたは放射活性マーカーを含むことができる。本発明の
ウイルスの存在、あるいは本発明のウイルスに対して生じた抗体の存在を検出す
るための任意の検出方法（本明細書中前記に記載された実施形態）は、コンピュ
ーター技術によって支援され得る。従って、検出方法は、画像分析またはフロー
サイトメトリーを含む様々な手段によって自動化することができる。マーカーお
よびその好ましい実施形態をさらに理解するために、本明細書中上記の対応する
部分が参照される。
【０１１４】 さらに、本発明は、前記試料が、血液、血清、唾液、糞便または別の体液であ
るか、あるいはそれらに由来するものである上記に記載される方法に関する。分
析される試料は、特に、核酸分子、（ポリ）ペプチドまたは抗体が抽出されるよ
うに処理することができる。
【０１１５】 さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の核酸分子、（ポリ）ペプチ
ド、または本発明のウイルスと特異的に免疫反応し得る実質的に単離されたポリ
クローナル抗体の標品に関する。ポリクローナル抗体のそのような標品を得る方
法は当業者にはよく知られており、何ら過度な実験を行うことなく実施すること
ができる（HarlowおよびLane（上記）を参照のこと）。前記のポリクローナル抗
体は単一特異性または多特異性であり得る。
【０１１６】 さらに、本発明は、本発明の核酸分子、（ポリ）ペプチド、誘導体またはウイ
ルスに対する抗体の製造方法に関する。この方法は、実験動物を、前記の核酸分
子、（ポリ）ペプチド、誘導体、ウイルス／ウイルス因子、または本発明の非病
原性誘導体で免疫化すること、および得られた血清または特異的な抗体を単離す
ることを含む。動物から得られた抗体はさらに操作することができ、例えば、好
適な断片を得るために切断することができ、あるいは、遺伝子操作された抗体ま
たはその誘導体（同じ結合特異性を有するscFv断片など）の出発化合物とするこ
とができる。あるいは、動物から得られた抗体は、例えば、ペプチドミメティク
スによって製造される対応する合成化合物を合成するための出発化合物とするこ
とができる。抗体の産生はこの分野ではよく知られている。そのような抗体には
、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、またはFa
b 断片などの断片、ならびにFav 発現ライブラリーまたはscFv発現ライブラリー
により産生される断片が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】 抗体を実験動物において産生させるために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスな
どを含む様々な宿主を、本発明の核酸、（モザイク）ポリペプチド、あるいは免
疫原性を有するか、または好適なエピトープを形成するその任意の断片またはオ
リゴペプチドまたは誘導体を注射することにより免疫化することができる。ある
いは、（弱毒化）ウイルス／ウイルス因子またはその誘導体を免疫化のために使
用することができる。ポリクローナル抗体を産生して処理するための技法はこの
分野では知られており、特に、Mayer およびWalker編、「Immunochemical Metho
ds in Cell and Molecular Biology」、Academic Press、 London(1987)に記載
されている。ポリクローナル抗体はまた、本発明のウイルスを予め感染させた動
物（好ましくは、哺乳動物）から得ることができる。抗体の精製方法はこの分野
では知られており、例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーを含む。宿
主種に依存して、様々なアジュバントまたは免疫学的キャリアを、免疫学的応答
を増大させるために使用することができる。そのようなアジュバントには、フロ
イントの完全アジュバントまたは不完全アジュバント、水酸化アルミニウムなど
の無機ゲル、およびリソレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール
、ポリアニオン、ペプチド、オイル乳化物およびジニトロフェノールが含まれる
が、これらに限定されない。例えば、本発明のペプチドを結合させることができ
るキャリアの例には、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH ）がある。
【０１１８】 抗体産生のために使用される（モザイク）（ポリ）ペプチド、断片またはオリ
ゴペプチド、誘導体は、少なくとも5 個のアミノ酸（例えば、6 個、7 個、8 個
または9 個のアミノ酸）、より好ましくは少なくとも10個のアミノ酸、最も好ま
しくは少なくとも15個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有することが好ましい
。それらは、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることもまた好
ましく、そして小さな天然に存在する分子のアミノ酸配列全体を含むことができ
る。本発明の（ポリ）ペプチドまたはその断片の短い領域をキーホールリンペッ
トヘモシアニンなどの別のタンパク質の領域と融合することができ、抗体をキメ
ラ分子に対して産生させることができる。これには、本発明の（ポリ）ペプチド
に対する特異的な抗体が含まれる。異なる方法により、ハプテンのような短いペ
プチドを、従来の方法を使用してKLH またはBSA などのキャリアに結合すること
ができ、そのような免疫結合体を用いて動物の免疫化が行われる。
【０１１９】 別の実施形態において、本発明は、本発明のウイルスまたはウイルス因子（好
ましくは、SEN ウイルス）に対して個体を免疫化する方法に関する。この方法は
、前記の個体に本発明のワクチンの少なくとも1 単位用量を投与することを含む
。前記の個体は、好ましくはヒトである。
【０１２０】 個体に少なくとも1 回の追加免疫注射（例えば、1 回、2 回または3 回の追加
免疫注射）を施すことが好ましい。経路、用量および時間間隔に関しては、本明
細書中前記の部分が参照される。
【０１２１】 さらなる実施形態において、本発明は、本発明のウイルス／ウイルス因子を増
殖させる方法に関する。この方法は、本発明の宿主細胞を、前記ウイルスの増殖
を促進させるのに適する条件下で培養することを含む。ウイルスの増殖方法はこ
の分野では一般に知られており（例えば、Fields、「Virology」、第3 版、1996
年、Lippincott Raven Publishers 、 Philadelphia）、日常的な実験を使用す
るか、または日常的な実験を適合させて、当業者により適合させることができる
。
【０１２２】 さらに別の実施形態において、本発明は、動物において本発明のウイルスを増
殖させる方法に関する。この方法は、前記動物に、前記ウイルス、前記ウイルス
の一部および／または前記ウイルスの感染物を接種することを含む。前記ウイル
スの複製は、血液または様々な器官でモニターすることができる。感染細胞は単
離され、その後、感染細胞はウイルス標品のために用いることができる。ウイル
ス標品およびウイルス増殖のために使用される動物モデルはこの分野ではよく知
られており、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、アヒル、ネコ、イヌ、チン
パンジー、マーモセットを含むが、これらに限定されない。
【０１２３】 さらに、本発明は、本発明のウイルスまたはウイルス因子に関連し、および／
または本発明のウイルスまたはウイルス因子によって引き起こされる疾患を処置
するための医薬組成物を調製するための、抗ウイルス剤の使用に関する。前記の
疾患は、好ましくは、肝障害、炎症性疾患および増殖異常からなる群より選択さ
れる。
【０１２４】 抗ウイルス剤はこの分野ではよく知られており、これには、特に、インターフ
ェロン（インターフェロン−αなど）、あるいはトリバビリン、ラミブジン、ア
シクロビルおよび／またはウルソデオキシコール酸のような薬物が含まれる。ウ
イルス感染の処置において使用される他の化合物には、アマンタジン塩酸塩、シ
タラビンおよびレバミソール塩酸塩が含まれる（例えば、Martindale、「The Ex
tra Pharmacopeia」、The Royal Pharm.Soc.、London、1996年を参照のこと）。
【０１２５】 さらに別の実施形態において、本発明は、本発明のウイルスまたはウイルス因
子に関連し、および／または本発明のウイルスまたはウイルス因子によって引き
起こされる疾患を処置するための医薬組成物、好ましくは、肝障害、炎症性疾患
および／または増殖異常を処置するための医薬組成物を調製するための、本発明
の抗体またはその断片もしくは誘導体またはアプタマーまたは他の受容体の使用
に関する。
【０１２６】 前記肝障害は、特に、病因が不明な急性肝炎または慢性肝炎（NANE肝炎）であ
り得るし、前記炎症性疾患はクローン病または紅斑性狼瘡であり得るし、前記増
殖異常は、特に、肝癌または結腸癌（肝臓または結腸の悪性腫瘍）のような癌を
含む。
【０１２７】 最後に、本発明は、本発明のウイルス／ウイルス因子に感染している哺乳動物
（好ましくは、ヒト）における疾患の処置方法または予防方法に関する。これら
の方法は、前記の哺乳動物に、抗ウイルス剤、抗体、その断片もしくは誘導体、
アプタマーまたは他の受容体（これらはすべて上記に記載されている）の1 つま
たは2 つ以上の用量を投与することを含む。好ましくは、本発明の方法で処置さ
れ得る疾患もまた上記に示されている。投与法は、好ましくは、本明細書中前記
に記載されている従来の使用法である。上記の化合物は、必要に応じてさらなる
病因因子に対するさらなる医薬品と一緒に投与することができる。
【０１２８】 本明細書および添付された請求項を通して、文脈がそれ以外のものを必要とす
る場合を除き、語「含有する、または含む（comprise）」およびその変化形（「
comprises 」および「comprising」など）は、述べられた構成体または構成体の
工程もしくは群を包含することを意味するが、任意の他の構成体または構成体の
工程もしくは群または工程を除外することを意味しないことが理解される。
【０１２９】 次に、本発明を、下記の生物学的実施例を参照して説明する。下記の実施例は
単なる例示であり、本発明の範囲の限定として解釈すべきではない。
【０１３０】 実施例１ 特異的なTTV プライマーを使用することによるイタリア住民におけるTTV の罹患
率および多様性の推定 TTV （Nishizawa 、Hepatology Res、10(1988)、1 〜16）の発見後、イタリア
住民におけるこのウイルス因子の罹患率および多様性が研究された。Okamoto 他
（Hepatology Res、241(1988) 、1 〜16）によって最初に記載されたネスティッ
ドPCR 法を、Okamoto 他（上記）に示されたNG059 およびNG061 のセンスプライ
マーとNG063 のアンチセンスプライマーとを用いて使用した。
【０１３１】 PCR を、鋳型、QIAamp血液キット（QIAGEN）を用いて100 μl の血清から抽出
されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mMのTrisHCl(pH8.8)、16.6mMの(NH4)2SO4
、10mMのβ−メルカプトエタノール、1.5mM のMgCl2 ）、300ng の各PCR プライ
マー、200 μM のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（Boehringer（Mannheim、
ドイツ）から得られるdATP、dCTP、dTTPおよびdGTP）、および1.25U のTaq ポリ
メラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μl の混合物で行った。反応を、ミネラルオ
イルを用いてDNA サーマルサイクラーで行った。PCR は、94℃で5 分間の予備加
熱、94℃で1 分および55℃で1 分および72℃で1 分の45サイクル、ならびに72℃
で7 分間のインキュベーションからなった。PCR 産物を、2 μg/mlの臭化エチジ
ウムを含む2 ％アガロースゲルに負荷して、増幅産物のサイズを決定した。
【０１３２】 これらのプライマーにより、TTV が静脈注射薬常用者の10％で検出され、健康
な血液供与者コントロールではわずかに1 ％で検出された。サンプルを、イタリ
アのthe Ospedale Civile of Bresciaの輸血部から得た。DNA の配列決定分析を
、これらの増幅物がTTV ゲノムを表すことが確認された10個のTTV 陽性サンプル
で行った。さらに、この分析は、種々のイタリアTTV 単離体の間における非常に
大きな変動性を明らかにした。
【０１３３】 実施例２ イタリア住民におけるTTV の罹患率および多様性を推定するための一段階PCR 実施例１に記載されたTTV 特異的プライマーで検出された変動性レベルおよび
感染の低い発生率を考慮して、新しい一段階PCR 法を開発した。
【０１３４】 このアッセイで使用されたPCR プライマーは、NG063 アンチセンス（Okamoto
他、上記）、およびイタリア住民で見出された配列に基づいて推定されたTTV-1S
センスプライマーであった。プライマーTTV-1Sの配列は、5'ACACCTGGTACAGRGGAA
CAGYATATA3' （式中、R=A またはG 、およびY=C またはT ）（配列番号1 ）であ
った。
【０１３５】 PCR を、鋳型、QIAamp血液キット（QIAGEN）を用いて100 μl の血清から抽出
されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mMのTrisHCl(pH8.8)、16.6mMの(NH4)2SO4
、10mMのβ−メルカプトエタノール、1.5mM のMgCl2 ）、300ng の各PCR プライ
マー、200 μM のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（Boehringer（Mannheim、
ドイツ）から得られるdATP、dCTP、dTTPおよびdGTP）、および1.25U のTaq ポリ
メラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μl の混合物で行った。反応を、ミネラルオ
イルを用いてDNA サーマルサイクラーで行った。PCR は、94℃で5 分間の予備加
熱、94℃で1 分および50℃で1 分および72℃で1 分の45サイクル、ならびに72
℃で7 分間のインキュベーションからなった。PCR 産物を、2 μg/mlの臭化エチ
ジウムを含む2 ％アガロースゲルに負荷して、増幅産物のサイズを決定した。
【０１３６】 汚染をモニターするために、すべての試薬を含むが、鋳型DNA を有しない陰性
コントロールを上記に記載されたその通りに日常的に処理した。それらはすべて
の実験において陰性であった。
【０１３７】 上記に記載された一段階PCR により、TTV 感染が静脈注射薬常用者の55％で検
出され、血液供与者の13％で検出された。従って、これにより、正常な住民にお
けるこのウイルス因子の大きな発生率が確認された。
【０１３８】 実施例３ 種々のPCR 産物の単離および特徴づけ PCR を、実施例２（上記）に記載された静脈注射薬常用者から得られたサンプ
ルに対して行った。
【０１３９】 TTV 陽性サンプルについて予想される513bp のPCR 産物とは対照的に、2 名の
静脈注射薬常用者（サンプルSEN およびLIM ）に由来する増幅物は長さが580bp
であることが観測された。さらに、2 名の静脈注射薬常用者のPCR 産物は513bp
および580bp の2 つの断片を含んでいた（図1 ）。
【０１４０】 サイズが異なるこのバンドの性質を決定するために、ポリA テールを含む増幅
物をアガロースゲルから切り出し、DNA 内容物を精製し、pGEMベクター（Promeg
a 、Madison 、WI、米国）に連結した。得られたPCR 産物で形質転換された種々
の大腸菌から抽出されたDNA を使用して、両方の鎖を、蛍光M13 ユニバーサルプ
ライマーおよび蛍光M13 リバースプライマー（Pharmacia Biotech 、スウェーデ
ン）を使用してAutoRead配列決定キット（Pharmacia Biotech ）で配列決定した
。配列を、それぞれのPCR 産物について、それぞれ3 つのクローンについて決定
し、コンセンサス配列を採用した。
【０１４１】 この分析により、513bp 増幅物の配列が、GENEBANKデータベースに含まれるTT
V-1 単離体（アクセション番号：AB008394）に対して85% 〜98％の間で一致して
いた。しかし、患者SEN から得られた580bp の配列（クローンSEN8001 ；配列番
号2 ）は、BLASTN、BLASTPおよびFASTA のプログラムを使用して、GENEBANKデ
ータベースに寄託されている配列のどれとも大きな相同性を有していなかった。
ヌクレオチドレベルで最も大きな相同性（48％）がTTV 配列のいくつかの領域で
検出された。このことにより、SENVゲノムは、TTV との関連が薄い新しいウイル
スをコードしていることが示唆される。
【０１４２】 187 アミノ酸をコードし得るORF （配列番号3 ）が、2 番目のヌクレオチドか
ら始まる読み枠で配列SEN8001 において認識された。1 番目または3 番目のヌク
レオチドから始まるそれ以外の2 つの読み枠でのさらなるORF 、あるいは相補配
列における3 つの読み枠のいずれかで、>100アミノ酸をコードし得るさらなるOR
F は推定され得ない。このORF のアミノ酸配列は、データベース（GENEBANK）に
含まれるタンパク質配列のどれとも有意な相同性を有しておらず、TTV 配列によ
ってコードされるORF と32％の相同性を有しているだけであった。
【０１４３】 2 名のさらなる静脈注射薬常習者から得られた581bp の増幅物（クローンN37
（配列番号4 ）およびクローンN28 （配列番号5 ））は、患者SEN から得られた
増幅物に対する相同性が95％である配列を有していた。これにより、このウイル
ス因子が種々の個体に存在し、かつかなり保存されていることが明らかにされた
。クローンSEN8001 ならびにクローンN37 （配列番号4 ）およびクローンN28 （
配列番号5 ）の整列を図2 に示す。
【０１４４】 実施例４ SEN ウイルスサブタイプの特徴づけ クローン26A （配列番号6 ）が1 人の静脈注射薬常用者から得られたが、その
増幅物は、患者SEN で検出された580bp のバンドよりもわずかにゆっくり移動す
るようであった。図3 には、配列SEN8001 とクローン26A から得られた配列との
整列が示されている。この2 つのクローン間の相同性は81％であった。さらに、
クローン26A は15ヌクレオチドの挿入物を含んでいた。従って、クローン26A （
配列番号6 ）はSENVのサブタイプをコードする。
【０１４５】 タンパク質レベルにおいて、クローン26A はクローンSENVと76％の相同性を有
し、そして予想されるように、5 アミノ酸（配列番号7 ）にわたる挿入物を有し
ていた。図4 には、SEN8001 、N37 、N28 および26A の各クローンによってコー
ドされるORF の整列が示される。
【０１４６】 実施例5 標的化遺伝子ウォーキングPCR によるSEN ウイルスゲノムの伸長 SENVゲノムの配列を伸長させるために、Parker他、Nuc. Ac. Research 、19(1
991)、3055〜60によって最初に記載された「標的化遺伝子ウォーキングポリメラ
ーゼ連鎖反応」法を使用した。この方法は、3'末端における部分的な相同性を有
するだけの未知または特定のいずれかの標的配列においてプライマーによりPCR
が開始され得るという発見に基づいている。この技術を使用して、DNA 配列に沿
って「歩く」ことができ、あるいは使用者によって設計されたヌクレオチド配列
を探すことができる。この方法により、標的化DNA の単一領域の上流または下流
に存在する未知配列のDNA を数マイクログラム作製することができる。
【０１４７】 この方法のために、すべてが、実施例2 で使用された同じNG063 標的化プライ
マーを含む一連のPCR 反応を行った。「ウォーキングプライマー」（それぞれの
異なるPCR 反応において1 つ）として、様々な異なる標的増幅のために以前に合
成されたオリゴヌクレオチドを用いた。この実験で使用されたプライマーは、ヒ
トT 細胞受容体、G 型肝炎ウイルス、B 型肝炎ウイルスおよびC 型肝炎ウイルス
の配列から得られた。最も有用なプライマーは、下記に記載されるようにCWP と
名付けられたプライマーであった。
【０１４８】 各プライマー対について、二連のPCR 反応を設定した：一方には陽性サンプル
から抽出されたDNA が含まれ、もう一方には陰性血液供与者から抽出されたDNA
が含まれた。PCR を、鋳型、QIAamp血液キット（QIAGEN）を用いて100 μl の血
清から抽出されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mMのTrisHCl(pH8.8)、16.6mMの
(NH4)2SO4 、10mMのβ−メルカプトエタノール、1.5mM のMgCl2 ）、300ng の各
PCR プライマー、200 μM のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（Boehringer（
Mannheim、ドイツ）から得られるdATP、dCTP、dTTPおよびdGTP）、および1.25U
のTaq ポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μl の混合物で行った。反応を、
ミネラルオイルを用いてDNA サーマルサイクラーで行った。PCR は、94℃で5 分
間の予備加熱、94℃で1 分および60℃で1 分および72℃で1 分の50サイクル、な
らびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。PCR 産物を、2 μg/mlの
臭化エチジウムを含む2 ％アガロースゲルに負荷して、増幅産物のサイズを決定
した。陽性サンプルに存在し、かつ陰性サンプルを含む反応物には存在しないバ
ンドのみをアガロースゲルから切り出し、クローン化して配列決定した。しかし
、大部分のクローンは、配列決定したとき、ゲノムDNA を含んでいた。プライマ
ーNG063 （Okamaoto他、上記）およびプライマーCWP （5'CGCCTGRTANARNGGCCARC
A3' 、配列番号178 ）で得られた1200bpのバンド（図5 （配列番号8 ））は、5'
において700 塩基の伸長したSENV配列を含むことが見出された（クローンCWP SE
N001；配列番号8 ）。このCWP プライマー（配列番号178 ）は、ゲノムの5'領域
に由来する600bp のG 型肝炎ウイルスの非構造領域から得られた（式中、R=A ま
たはG 、N=A 、C 、G またはT ）。
【０１４９】 3'の配列を伸長させるために、「標的化遺伝子ウォーキング法」を用いた。し
かし、2 つのプライマーを使用する代わりに、配列SEN8001 に由来するプライマ
ー3S（5'TCC ATA TTC ATA GGC CCC AA3'、配列番号11）のみを使用した。この方
法を使用することによって、3'において200 塩基の伸長したSENV配列を含むクロ
ーンが得られた。重複する配列をPC-GENE パッケージのASSEMLGEL プログラムに
より組み立てた後、SENVゲノムの一部をコードする1353塩基のユニーク配列が得
られた。この配列をCWP SEN001（配列番号9 ）と名付けた。
【０１５０】 BLAST プログラムを用いたデータベース分析により、既知の配列との大きな相
同性は何ら明らかにされなかった。再度ではあるが、最も近い相同性（46.93 ％
）がTTV で見出された。
【０１５１】 450 アミノ酸をコードし得るORF が、配列CWPSEN001 （配列番号10）の3 番目
のヌクレオチドから始まる読み枠で認識された。1 番目または3 番目のヌクレオ
チドから始まるそれ以外の2 つの読み枠でのORF 、あるいは相補配列における3
つの読み枠のいずれかで、>100アミノ酸をコードし得るORF は見出されなかった
。このORF のアミノ酸配列は、データベース（GENEBANK）で得られるタンパク質
配列のいずれとも有意な相同性を有していなかった。最も大きな全体的な配列同
一性（29.4％）がSENV ORF（配列番号10）とTTV との間で検出された（図6 ）。
比較として、HGV とGBV-A とのポリタンパク質間の同一性が43.8％であり、これ
に対してHGV とGVB-B およびHCV のHCV-1 単離体との同一性がそれぞれ28.4およ
び26.8であること（Linnen、Science 、271(1996) 、505 〜508 ）には留意しな
ければならない。PROSITE の予測により、特徴づけられたSENV ORFは、54位およ
び233 位における2 つの可能なN-グリコシル化部位、160 位における1 つのチロ
シン硫酸化部位、89位、235 位および431 位における3 つの可能なプロテインキ
ナーゼC リン酸化部位、119 位、161 位、315 位および319 位における4 つの可
能なカゼインキナーゼIIリン酸化部位、ならびに、83位および228 位における2
つの可能なアミド化部位を含む。N-ミリソイル化部位は検出されなかった。比較
において、SENVと最も大きな相同性を有するTTV ORF1の領域（図6 ）は、175 位
、191 位、206 位および234 位における4 つのN-グリコシル化部位、275 位にお
ける1 つのチロシン硫酸化部位、77位、99位、158 位、207 位、223 位、311 位
および325 位における7 つのプロテインキナーゼC リン酸化部位、17位、119 位
、144 位、158 位、232 位、271 位、294 位および359 位における8 つのカゼイ
ンキナーゼIIリン酸化部位、103 位における1 つのチロシンキナーゼリン酸化部
位、128 位、190 位、195 位、240 位、267 位、281 位および282 位における7
つのN-ミリソイル化部位、ならびに、82位における1 つのアミド化部位を含んで
いた。潜在的に生物学的に注目される部位、領域および特徴のBLAST 検索および
配列分析検出に関して、それらの結果より、TTV およびSENVは関連が薄い異なる
ウイルスであることが明らかにされる。
【０１５２】 実施例6 イタリア住民のSENV罹患率 住民のSENV罹患率に関する正確な情報を得るために、特異的なPCR アッセイを
開発した。DNA を100 μl の血清から抽出し、CWPSEN001 配列（配列番号9 ）か
ら得られたSEN3S センスプライマー（5'TTC(A/C)ATATT(T/C)ATAGGCCCCAA3' ）（
配列番号11）およびSEN2ASアンチセンスプライマー（5'TCCAAARTTAGTGTCATAGAAW
AC3'）（配列番号12）（式中、R ＝A またはG 、W ＝A またはT ）を使用する45
サイクルのPCR に供した。
【０１５３】 PCR 産物を、2 μg/mlの臭化エチジウムを含む2 ％アガロースゲルに負荷し、
増幅産物のサイズを決定した。汚染をモニターするために、すべての試薬を含む
が、鋳型DNA を有しない陰性コントロールを上記に記載されたその通りに日常的
に処理した。それらはすべての実験で陰性であった。
【０１５４】 増幅物の特異性を確認するために、20μl のPCR 産物を、3Sおよび2AS のプラ
イマーによって定められる領域の内部領域と重なるSEN37 ビオチン化プライマー
（5'TAT GCC CAT ACA CAG TTC CCC CCA TGT ACA AAC CAG GCA3' ）（配列番号13
）を使用して前記に記載されているようにDEIAアッセイ（Mantero 他、Clin. Ch
emistry 、37(1991)、422 〜429 ）においてハイブリダイズさせた。
【０１５５】 PCR を、鋳型、QIAamp血液キット（QIAGEN）を用いて100 μl の血清から抽出
されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mMのTrisHCl(pH8.8)、16.6mMの(NH4)2SO4
、10mMのβ−メルカプトエタノール、1.5mM のMgCl2 ）、300ng の各PCR プライ
マー、200 μM のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（Boehringer（Mannheim、
ドイツ）から得られるdTTP、dATP、dCTPおよびdGTP）、および1.25U のTaq ポリ
メラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μl の混合物で行った。反応を、ミネラルオ
イルを用いてDNA サーマルサイクラーで行った。PCR は、94℃で5 分間の予備加
熱、94℃で1 分および50℃で1 分および72℃で1 分の45サイクル、ならびに72℃
で7 分間のインキュベーションからなった。
【０１５６】 PCR 産物を、2 μl/mlの臭化エチジウムを含む2 ％アガロースゲルに負荷し、
増幅産物のサイズを決定した。汚染をモニターするために、すべての試薬を含む
が、DNA 鋳型を有しない陰性コントロールを上記に記載されたその通りに日常的
に処理した。それらはすべての実験で陰性であった。
【０１５７】 SENVは、37名の血液供与者のいずれにおいても検出されず（図7 ）、また試験
した32名の慢性関節リウマチ罹患患者のいずれにおいても検出されなかった。し
かし、ウイルス因子が、分析した静脈注射薬常用者の41名の内、29名（67％）に
おいて検出された。従って、これらの結果より、SENVの非経口的な伝染経路が明
らかにされる。
【０１５８】 実施例7 病因不明の肝炎に関与する病原体としてのSENVおよびSENVサブタイプ 病因不明の肝炎の伝染におけるSENVの考えられる関わりを評価するために、非
A 〜非E 型（既知の肝炎ウイルスのすべてのマーカーについて陰性）の肝炎に罹
っている20名の患者の血清から抽出されたDNA を増幅した。増幅を、3S（配列番
号11）および2AS （配列番号12）のプライマーを用いて行った。
【０１５９】 PCR を、鋳型、QIAamp血液キット（QIAGEN）を用いて100 μl の血清から抽出
されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mMのTrisHCl(pH8.8)、16.6mMの(NH4)2SO4
、10mMのβ−メルカプトエタノール、1.5mM のMgCl2 ）、300ng の各PCR プライ
マー、200 μM のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（Boehringer（Mannheim、
ドイツ）から得られるdATP、dTTP、dCTPおよびdGTP）、および1.25U のTaq ポリ
メラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μl の混合物で行った。反応を、ミネラルオ
イルを用いてDNA サーマルサイクラーで行った。PCR は、94℃で5 分間の予備加
熱、94℃で1 分および60℃で1 分および72℃で1 分の50サイクル、ならびに72℃
で7 分間のインキュベーションからなった。
【０１６０】 これらの増幅サンプルの内の9 個が、予想される330bp のサイズの弱いバンド
としてアガロースゲルで移動した。しかし、これらのPCR 産物は、DEIAアッセイ
（Mantero 他、上記）においてSEN37 ビオチン化プローブ（配列番号13）とハイ
ブリダイズしなかった。病因不明の肝炎患者（患者NAE8、NAE9、NAE10 およびNE
A35 ）の4 つの血清から得られた330bp のバンドの2 つに対応するゲルスライス
を切りだし、抽出したDNA をpGEMベクター（Promega 、Madison 、WI、米国）に
連結し、大腸菌に導入した。NAE8-1（配列番号14）、NAE9-3（配列番号15）、NA
E10-4 （配列番号16）およびNAE35-5 （配列番号17）と名付けた挿入物のDNA 配
列を、蛍光M13 ユニバーサルプライマーおよび蛍光M13 リバースプライマー（Ph
armacia Biotech ）とともにAutoRead配列決定キット（Pharmacia Biotech ）を
使用することによって決定した。
【０１６１】 図9 には、非A 〜非E 型の肝炎に罹っているこれらの4 名の患者から得られた
配列の整列が示されている。4 つの配列は98.28 ％の同一性を有する。このこと
は、この特定のゲノムによってコードされるウイルスが非A 〜非E 型の肝炎患者
に非常に広がっていることを示唆している。図10、図11、図12および図13には、
それぞれ、NAE8-1およびNAE9-3、NAE10-4 およびNAE35-5 のクローンとクローン
SEN8001 との整列が示されている。これらの配列は、65.90 ％〜69.77 ％の間で
変化するクローンSEN8001 との相同性を有する。これは、NAE8-1、NAE9-3、NAE1
0-4 およびNAE35-5 のクローンが、SENV-Bと名付けられたSENVの新しいサブタイ
プであることを示唆している。SENV-Bが非A 〜非E 型の患者血清から選択的に分
離されるようであるという事実は、このSENVサブタイプが病因不明の肝炎の伝染
に関与し得ることを示唆している。SEN37 ビオチン化プローブとSENV-B配列との
多数のミスマッチにより、非A 〜非E 型の患者に由来するPCR 産物のDEIAハイブ
リダイゼーションアッセイにおける低い反応性を説明することができ、そしてSE
NV-BはNANE型肝炎の原因因子ではないことが示される。
【０１６２】 NAE8-1配列（配列番号14）を5'および3'で伸長させるために、患者NAE8の血清
から抽出されたDNA を、配列番号14に由来するプライマーNAE2AS（配列番号18）
とCWPSEN001 配列（配列番号9 ）に由来するプライマー6S（配列番号19）とを用
いて増幅した。
【０１６３】 PCR を、鋳型、QIAamp血液キット（QIAGEN）を用いて100 μl の血清から抽出
されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mMのTrisHCl(pH8.8)、16.6mMの(NH4)2SO4
、10mMのβ−メルカプトエタノール、2mM のMgCl2 ）、300ng の各PCR プライマ
ー、200 μM のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（Boehringer（Mannheim、ド
イツ）から得られるdATP、dCTP、dTTPおよびdGTP）、および1.25U のTaq ポリメ
ラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μl の混合物で行った。反応を、ミネラルオイ
ルを用いてDNA サーマルサイクラーで行った。PCR は、94℃で5 分間の予備加熱
、94℃で1 分および60℃で1 分および72℃で1 分の45サイクル、ならびに72℃で
7 分間のインキュベーションからなった。PCR 産物を、2 μg/mlの臭化エチジウ
ムを含む2 ％アガロースゲルに負荷して、増幅産物のサイズを決定した。
【０１６４】 1100bpのバンドに対応するゲル片を切りだした。DNA を抽出し、pGEMベクター
（Promega 、Madison 、WI、米国）にクローン化し、大腸菌に導入し、標準的な
方法を使用して配列決定した。SENV-B（配列番号20）と名付けられた挿入物のDN
A 配列を、蛍光M13 ユニバーサルプライマーおよび蛍光M13 リバースプライマー
（Pharmacia Biotech ）とともにAutoRead配列決定キット（Pharmacia Biotech
）を使用することによって決定した。
【０１６５】 図14には、SENV-BおよびCWPSEN001 のヌクレオチド配列の整列が示されている
。この2 つの配列は52.11 ％の相同性を示し、ALIGN プログラムにより、6 つの
ギャップが、最高のスコアを得るためにSENV-B配列に導入された。CWPSEN001 の
アミノ酸配列とSENV-Bの予想されるアミノ酸配列（配列番号21）との整列が図15
に示されている。この2 つのタンパク質配列は、その系統発生的な関係を確認す
る大きな相同性の領域を示している。しかし、SENV-B配列のアミノ酸185 〜285
に広がる領域は、CWPSEN001 のその対応する領域と大きく異なっている。全体的
には、2 つの配列は55％の同一性を有する。
【０１６６】 図16には、SENV-Bの推定されるORF とTTV のORF1との予想アミノ鎖配列の整列
が示されている。この2 つの配列は29％の同一性を有するだけである。さらに、
いくつもの違いが、2 つのウイルスアミノ酸配列の列に沿って一様に分散してい
る。
【０１６７】 これらの結果より、SENV-BがSENVのサブタイプであり、SENVおよびSENV-Bの配
列はTTV の配列と著しく異なることが確認される。
【０１６８】 SENVの発生率が健康な住民に低いことは、健康群におけるTTV の分布とは著し
く対照的である。これまでに得られた結果は、SENVまたはそのサブタイプの一部
が公衆衛生にとって重大な結果をもたらし得ることを示唆している。さらに、さ
らに発見され得るこのウイルス因子の他の遺伝子変異体は、特に肝炎性（しかし
、これだけではない）の疾患を引き起こすその能力が異なると考えられる。
【０１６９】 実施例8 SENV配列のさらなる3'配列および5'配列の同定 CWPSEN001 （配列番号9 ）を伸長させるために、2 つの異なるPCR 反応を行っ
た。一方の反応を、PCR を、鋳型、患者SEN から得られた100 μl の血清からQI
Aamp血液キット（QIAGEN）を用いて抽出されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mM
のTrisHCl(pH8.8)、16.6mMの(NH4)2SO4 、10mMのβ−メルカプトエタノール、2m
M のMgCl2 、300ng の単一のPCR プライマー) 、200 μM のデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸（Boehringer（Mannheim、ドイツ）から得られるdATP、dCTP、dT
TPおよびdGTP）、および1.25U のTaq ポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μ
l の混合物で行った。反応を、ミネラルオイルを用いてDNA サーマルサイクラー
で行った。PCR は、94℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分および60℃で1 分およ
び72℃で1 分の45サイクル、ならびに72℃で7 分間のインキュベーションからな
った。この反応のために使用されたプライマーは、配列CWPSEN001 の3'領域から
推定されたプライマー8S（配列番号22）であった。
【０１７０】 第2 の反応を、PCR を、鋳型、患者SEN から得られた100 μl の血清からQIAa
mp血液キット（QIAGEN）を用いて抽出されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mMの
TrisHCl(pH8.8)、16.6mMの(NH4)2SO4 、10mMのβ−メルカプトエタノール、2mM
のMgCl2 ）、300ng の単一のPCR プライマー、濃度が200 μM である各デオキシ
リボヌクレオシド三リン酸（Boehringer、Mannheim、ドイツ）、および1.25U の
Taq ポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μl の混合物で行った。反応を、ミ
ネラルオイルを用いてDNA サーマルサイクラーで行った。PCR は、94℃で5 分間
の予備加熱、94℃で1 分および60℃で1 分および72℃で1 分の45サイクル、なら
びに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。この反応のために使用され
たプライマーは、配列CWPSEN001 の5'領域から推定されたプライマー7AS （配列
番号23）であった。両方の場合、PCR 産物を、2 μg/mlの臭化エチジウムを含む
2 ％アガロースゲルに負荷して、増幅産物のサイズを決定した。
【０１７１】 2 つの反応で得られた1200bpおよび1100bpのそれぞれのバンドに対応するゲル
スライスを切りだした。DNA を抽出し、pGEMベクター（Promega 、Madison 、WI
、米国）にクローン化し、大腸菌に導入し、配列決定した。挿入物のDNA 配列を
、蛍光M13 ユニバーサルプライマーおよび蛍光M13 リバースプライマー（Pharma
cia Biotech ）とともにAutoRead配列決定キット（Pharmacia Biotech ）を使用
することによって決定した。
【０１７２】 この方法により、CWPSEN001 配列と3'および5'の両方で重なる2 つのクローン
が得られた。重なる配列をASSEMLGEL プログラムで組み立てた後、SENVゲノムの
大部分をコードする3347塩基のユニーク配列が得られた。この配列をSENV-A（配
列番号24）と名付けた。3 つの可能な読み枠におけるその翻訳を図17に示す。5'
領域の配列が不完全であるために、この領域における可能なオープンリーディン
グフレームの存在を確認することができなかった。しかし、ヌクレオチド903 か
ら始まり、ヌクレオチド2831に終わる676 アミノ酸（配列番号25）のオープンリ
ーディングフレームが検出された。
【０１７３】 ヌクレオチドレベルにおいて、SENV-A配列は、TTV のヌクレオチド配列に対し
て54％の同一性を示す。図18には、この2 つの配列間の整列が示されている。こ
れらの配列は、5'末端および3'末端において非常に相同的であるが、コード領域
では実質的に異なっている。このことは、2 つのこれらのウイルスが明らかに異
なり、しかし同じファミリーに属していることを示している。配列番号26は、TT
V に対して非常に相同的である5'部分および3'部分を除く、SENV-Aのヌクレオチ
ド配列に関する。SENV-AおよびTTV の主要なORF をコードするヌクレオチド配列
の整列が図19に示されている。2 つのコード領域間の同一性は、多数のギャップ
を挿入して48％にすぎなかった。
【０１７４】 2 つのこれらのウイルス（SENV-AおよびTTV ）によってコードされる予想タン
パク質はさらに大きく異なり、33％の同一性を有するだけである（図20）。この
ことは、この2 つのウイルスもまた血清学的に異なることを示している。
【０１７５】 興味深いことに、SENV-AのORF1は、TTV のORF1には存在しないLQLVMFQLSRTQAN
LHLNPLSLのロイシンジッパーパターンを配列のC 末端（617 位〜638 位）に含む
。このことは、この2 つのタンパク質が異なる生物学的機能を有し得ることを示
唆している。これはまた、TTV のORF1のn 末端に存在するアルギニンリッチドメ
インを特徴とする高親水性領域がSENVのORF に存在しないことによっても示唆さ
れる。
【０１７６】 ORF1に加えて、SENV-Aの配列は2 つの他のORF を含む。ORF2はヌクレオチド23
1 〜730 に広がっている（配列番号28）。プロリンの多い166 アミノ酸の配列（
配列番号27）が第1 の読み枠で認識された。TTV のORF2との整列により、2 つの
タンパク質が30％の同一性を有するだけであることが明らかにされた。
【０１７７】 ヌクレオチド2545〜2801に広がるORF3（配列番号30）は、ORF1の3'端と重なっ
ているが、第1 の読み枠で認識された。このタンパク質は87アミノ酸（配列番号
29）を含むだけであるが、興味深い核結合領域を含み、そしてTATAモチーフがAT
G 開始コドンの35ヌクレオチド上流に認識された。従って、このことは、この可
能な読み枠が実際に翻訳されていることを示唆している。等価なORF は、TTV ヌ
クレオチド配列では検出されなかった。
【０１７８】 実施例9 SENV-Bゲノムの特徴づけ SENV-Bゲノムの完全な配列を得るために、SENV-Bの利用可能な配列に由来する
プライマーSENVB0S （配列番号32）およびTTV 配列の最も3'側の領域に由来する
プライマー10AS（配列番号33）、ならびにプライマーTTV155（配列番号72）およ
びプライマーL2AS（配列番号71）を使用する2 つのPCR 反応を設定した。SENVお
よびTTV はそのゲノムの5'非翻訳領域に共通配列を有する（図18）ため、配列類
似性の領域がゲノムの最も3'側の領域にも存在することが考えられた。PCR 反応
を、鋳型、患者NAE8から得られた100 μl の血清からQIAamp血液キット（QIAGEN
）を用いて抽出されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mMのTrisHCl(pH8.8)、16.6
mMの(NH4)2SO4 、10mMのβ−メルカプトエタノール、2mM のMgCl2 ）、300ng の
各PCR プライマー、濃度が200 μM である各デオキシリボヌクレオシド三リン酸
（Boehringer（Mannheim、ドイツ）から得られるdATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）
、および1.25U のTaq ポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μl の混合物で行
った。反応を、ミネラルオイルを用いてDNA サーマルサイクラーで行った。PCR
は、94℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分および60℃で1 分および72℃で1 分の
45サイクル、ならびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。陰性コン
トロールとして、鋳型を等価なPCR 反応物から除いた。増幅産物のサイズを決定
するために、PCR 産物を、2 μg/ml臭化エチジウムを含む2 ％アガロースゲルに
負荷した。この方法を使用して、約1400bpの増幅物が得られた。
【０１７９】 PCR によって得られた1400bpおよび1200bpのバンドに対応するゲルスライスを
切りだし、精製したDNA 抽出物を、標準的な製造者のプロトコル（Promega 、Ma
dison 、WI、米国）に従ってpGEMベクターに連結し、大腸菌に導入した。挿入物
のDNA 配列を、蛍光M13 ユニバーサルプライマーおよび蛍光M13 リバースプライ
マーとともにAutoRead配列決定キット（Pharmacia Biotech ）を使用することに
よって決定した。配列をそれぞれのPCR 産物の3 クローンについて決定し、コン
センサス配列を採用した。
【０１８０】 この方法により、利用可能なSENV-B配列（配列番号20）の3'領域および5'領域
と重なるクローンがいくつか得られた。重なる配列をASSEMLGEL プログラム（PC
GENE ソフトウエアシステム：ジュネーブ大学、スイス；TMIntelliGenetics In
c.）で組み立てた後、3619塩基のユニーク配列が得られた。この配列をSENV-Bと
名付けた（配列番号34）。SENV-Aのように、SENV-Bは3 つのオープンリーディン
グフレームを含む。第1 のオープンリーディングフレームであるORF2（配列番号
35）はヌクレオチド259 から始まり、ヌクレオチド727 に終わる。第2 のオープ
ンリーディングフレームであるORF1（配列番号36）はヌクレオチド831 から始ま
り、ヌクレオチド2870に終わる。もう1 つのオープンリーディングフレーム（OR
F3）（配列番号37）がヌクレオチド2598〜2847に広がっている。
【０１８１】 ヌクレオチドレベルにおいて、SENV-Bの配列は、SENV-Aのヌクレオチド配列に
対して68.12 ％の同一性を有する。図22には、2 つのこれらの配列の整列が示さ
れている。興味深いことに、これらの配列は、5'末端および3'末端で非常に相同
的であるが、そのコード領域は異なっている。SENV-Aの主要なORF （ORF1）とSE
NV-Bの全長ORF1とTTV のORF1をコードする各アミノ酸配列の整列が図23および図
24にそれぞれ示されている。SENV-AとSENV-BとのORF1の同一性は56.07 ％であり
、一方、TTV のORF1は、SENV-Bの対応する全長ORF と34.76 ％の同一性を有する
だけである。これらの結果は、TTV およびSENVが異なるウイルスであり、そして
SENV-BがSENV-Aの遺伝子型であることを強く示唆している。図25および図26には
、SENV-AおよびSENV-BのORF2配列およびORF3配列の整列が示されている。この2
つのORF2間の同一性は33.33 ％であり、一方、この2 つのORF3間の同一性は27.7
1 ％である。このことは、これらのタンパク質が特異的なサブタイプであり、そ
して遺伝子型の異なる親和性または異なる生物学的機能をこれらのSENVサブタイ
プにもたらしていることを示している。さらに、SENV-BのORF2は、TTV のORF2と
22.84 ％のアミノ酸同一性を有する。
【０１８２】 SENV-BのORF1、ORF2およびORF3をコードするヌクレオチド配列を、それぞれ、
配列番号38、配列番号39および配列番号40に示す。
【０１８３】 SENV-AおよびSENV-BのORF1領域およびORF2領域のヌクレオチド配列の整列が図
27および図28に示されている。SENV-AおよびSENV-Bの2 つのORF1は63.40 ％の同
一性を有し、一方、両方のSENVサブタイプのORF2は49.68 ％のヌクレオチド同一
性を有する。図29および図30には、それぞれ、SENV-BのORF1配列およびORF2配列
とTTV の対応領域とのヌクレオチド整列が示されている。2 つのORF1配列は49.8
5 ％の同一性を有するだけであり、最も良い整列には多数のギャップの挿入を必
要とする。2 つのウイルス因子（TTV およびSENV-B）のORF2セグメントはさらに
低い同一性（41.83 ％）を有する。従って、SENV-Bは、SENV-Aのサブタイプであ
ると見なすことができ、両方のSENVサブタイプは、TTV に対する関連が薄いだけ
である。
【０１８４】 実施例10 4 つの主要なSENV遺伝子型の同定 SENVは少なくとも2 つの異なるサブタイプを有することが明らかにされたので
、同じPCR 反応で両方のサブタイプを増幅するのに好適であると考えられるプラ
イマーL1S （配列番号41）およびプライマーL3AS（配列番号42）の2 つのプライ
マーを設計した。これらのプライマーは、SENV-AおよびSENV-BのORF1配列間の整
列に基づき、そして2 つのSENVサブタイプの保存領域を増幅するために最も良い
候補物にするそのヌクレオチド組成に基づいて設計された。これらのプライマー
の分析性能を明らかにするために、PCR 反応を、6 名の非A 、非E 型の肝炎患者
（NAE ）の血清から抽出されたDNA を使用して行った。PCR 反応を、鋳型、NAE
患者から得られた100 μl の血清からQIAamp血液キット（QIAGEN）を用いて抽出
されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mMのTrisHCl(pH8.8)、16.6mMの(NH4)2SO4
、10mMのβ−メルカプトエタノール、2mM のMgCl2 ）、300ng の各PCR プライマ
ー、濃度が200 μM である各デオキシリボヌクレオシド三リン酸（Boehringer（
Mannheim、ドイツ）から得られるdATP、dGTP、dCTPおよびdTTP）、および1.25U
のTaq ポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μl の混合物で行った。反応を、
ミネラルオイルを用いてDNA サーマルサイクラーで行った。PCR は、94℃で5 分
間の予備加熱、94℃で1 分および55℃で1 分および72℃で1 分の45サイクル、な
らびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。陰性コントロールの場合
、PCR 反応の鋳型を除いた。
【０１８５】 2 ％アガロースゲルにおいて、6 名の患者サンプルのすべてから得られたPCR
産物は、予想されるサイズ（450bp ）のバンドとして移動したが、バンドサイズ
の小さな差が検出された。
【０１８６】 PCR 産物の特異性を確認するために、PCR 反応で得られた450bp のバンドに対
応するゲルスライスを切りだし、抽出されたDNA をpGEMベクター（Promega 、Ma
dison 、WI、米国）に連結し、ベクターを大腸菌に導入した。挿入物のDNA 配列
を、蛍光M13 ユニバーサルプライマーおよび蛍光M13 リバースプライマーととも
にAutoRead配列決定キット（Pharmacia Biotech ）を使用することによって決定
した。この方法によって、SENVのORF1の14個のヌクレオチド配列（配列番号43〜
56）を得ることができる。
【０１８７】 これらの配列の翻訳産物（配列番号57〜70）の整列が図31に示されている。図
31にはまた、SENV-Aの（配列番号24のヌクレオチド1372〜1830によってコードさ
れる）対応する領域およびSENV-Bの（配列番号34のヌクレオチド1379〜1879によ
ってコードされる）対応する領域の配列も示されている。
【０１８８】 種々のウイルス間の進化的関係を、その大きなオープンリーディングフレーム
またはこれらの配列の一部の整列されたヌクレオチド配列または整列された推定
アミノ酸配列の間の系統発生的距離を計算することによって明らかにすることが
できる。図31に示されているような種々のSENV配列間の系統発生的関係を決定す
るために、進化的距離を、ORF1の分析されたセグメントのヌクレオチド配列の整
列（図31）によって決定した。SENV-AおよびSENV-Bの配列の他に、最も相同的な
TTV 配列および非関連ウイルス（HGV ）の相同的な配列を分析に含めた。分析さ
れたウイルス配列間の相対的な進化的距離は、無根系統樹（図32参照）を調べた
ときに容易に明らかであった。系統発生的距離は、PHYLIPパッケージのPROTDIST
プログラムを用いて推定された。これらの計算された距離は、プログラムNEIGHB
OR（近隣結合設定）を使用して系統樹を構築するために使用された。プログラム
DRAWTREEにより、最終的な表示が得られた。すべてのプログラムはwww.Net から
得られた。この系統発生的分析により、目視調査したときに、4 つの主要なSENV
サブタイプの存在が示唆される：配列番号24のヌクレオチド1372〜1830によって
コードされる配列を含むSENV-A、配列番号34のヌクレオチド1379〜1879ならびに
配列番号55および配列番号56によってコードされる配列を含むSENV-B、配列番号
43〜50を含むSENV-C、および配列番号51〜54を含むSENV-D。さらに、無根系統樹
は、SENV遺伝子型がTTV から大きな程度で分岐していることを図示している。
【０１８９】 実施例11 SENV-Cゲノムの特徴づけ SENV-Cゲノムの完全な配列を得るために、2 つのPCR 反応を行い、得られた配
列を3'方向および5'方向に伸長させた。一方の反応では、SENV-Cの利用可能な配
列（配列番号45）に由来するプライマーL2AS（配列番号71）と、TTV 配列の最も
5'側の領域に由来するプライマーTTV15S（配列番号72）とを使用した。第2 の反
応では、SENV-Cの利用可能な配列（配列番号45）に由来するプライマーSEN-C1S
（配列番号73）と、SENV-Aの3'配列に由来するプライマー66AS（配列番号74）と
を用いた。SENV-AおよびSENV-Bはそのゲノムの3'非翻訳領域に共通配列を有する
ので、配列類似性の類似した配列がSENV-Cのゲノムの最も3'側の領域に存在する
ことが予想された。
【０１９０】 PCR 反応を、鋳型、患者NAE8から得られた100 μl の血清からQIAamp血液キッ
ト（QIAGEN）を用いて抽出されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mMのTrisHCl(pH
8.8)、16.6mMの(NH4)2SO4 、10mMのβ−メルカプトエタノール、2mM のMgCl2 ）
、300ng の各PCR プライマー、濃度が200 μM である各デオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸（Boehringer（Mannheim、ドイツ）から得られるdATP、dGTP、dCTPお
よびdTTP）、および1.25U のTaq ポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μl の
混合物で行った。反応を、ミネラルオイルを用いてDNA サーマルサイクラーで行
った。PCR は、94℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分、60℃で1 分および72℃で
1 分の45サイクル、ならびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。こ
の方法を使用して、約1400bpおよび1500bpの2 つの増幅物が得られた。PCR 産物
を、増幅産物のサイズを決定するために、2 μg/mlの臭化エチジウムを含む2 ％
アガロースゲルに負荷した。1400bpおよび1500bpのこれらのバンドに対応するゲ
ルスライスを切りだし、DNA 抽出物をpGEMベクター（Promega 、Madison 、WI、
米国）に連結し、ベクターを大腸菌に導入した。挿入物のDNA 配列を、蛍光M13
ユニバーサルプライマーおよび蛍光M13 リバースプライマーとともにAutoRead配
列決定キット（Pharmacia Biotech ）を使用することによって決定した。再度で
はあるが、3 つのクローンを配列決定した（両鎖）。コンセンサス配列を採用し
た。
【０１９１】 この方法を使用して、利用可能なSENV-C配列の5'領域および3'領域と重なるク
ローンがいくつか得られた（配列番号43〜50）。重なる配列をASSEMLGEL プログ
ラムで組み立てた後、3313塩基のユニーク配列が得られた。この配列をSENV-Cと
名付けた（配列番号75）。SENV-AおよびSENV-Bのように、このSENV-C配列は3 つ
のオープンリーディングフレームを含むが、もう1 つのORF もまた検出された。
ORF1のヌクレオチド配列（nt579 〜2840）、ORF2のヌクレオチド配列（nt232 〜
705 ）、ORF3のヌクレオチド配列（nt2458〜2814）およびORF4のヌクレオチド配
列（nt2588〜2944）（配列番号76〜79）は、それぞれ、753 アミノ酸、157 アミ
ノ酸、88アミノ酸および118 アミノ酸（配列番号80〜83）のタンパク質をコード
する。
【０１９２】 SENV-Cの主要なORF （ORF1）をコードするアミノ酸配列と、SENV-A、SENV-Bお
よびTTV のORF1との整列が、それぞれ、図33、図34および図35に示されている。
SENV-CのORF1とSENV-AおよびSENV-BのORF1との間の同一性は、それぞれ、51.56
％および50.37 ％であり、一方、SENV-CのORF1とTTV のORF1との間の同一性は34
.93 ％である。
【０１９３】 SENV-CのORF2をコードするアミノ酸配列と、SENV-A、SENV-BおよびTTV のORF2
との整列が、それぞれ、図36、図37および図38に示されている。SENV-CのORF2と
SENV-AおよびSENV-BのORF2との間の同一性は、それぞれ、46.50 ％および34.62
％であり、一方、SENV-CのORF2とTTV のORF2との間の同一性は35.67 ％である。
【０１９４】 最後に、SENV-CのORF3と、SENV-AおよびSENV-BのORF3との比較が、それぞれ、
図39および図40に示されている。SENV-CのORF3とSENV-AのORF3およびSENV-BのOR
F3との間の同一性割合は、それぞれ、47.67 ％および36.14 ％である。
【０１９５】 全長のSENV-Cヌクレオチド配列は、SENV-AおよびSENV-Bのヌクレオチド配列と
、それぞれ、67.76 ％および66.71 ％の同一性を有する。
【０１９６】 SENV-Cの主要なORF1をコードするヌクレオチド配列と、SENV-A、SENV-Bおよび
TTV のORF1との整列が、それぞれ、図41、図42および図43に示されている。SENV
-CのORF1とSENV-AおよびSENV-BのORF1との間の同一性は、それぞれ、65.63 ％お
よび63.92 ％であり、一方、SENV-CのORF1とTTV のORF1との間の同一性は48.52
％である。
【０１９７】 SENV-CのORF2をコードするヌクレオチド配列と、SENV-A、SENV-BおよびTTV の
ORF2との整列が、それぞれ、図44、図45および図46に示されている。SENV-CのOR
F2とSENV-AおよびSENV-BのORF2との間の同一性は、それぞれ、63.27 ％および60
.93 ％であり、一方、SENV-CのORF2とTTV のORF2との間の同一性は52.02 ％であ
る。
【０１９８】 最後に、SENV-Cのヌクレオチド配列ORF3と、SENV-AおよびSENV-Bのヌクレオチ
ド配列ORF3との整列が、それぞれ、図47および図48に示されている。SENV-CのOR
F3とSENV-AのORF3およびSENV-BのORF3との間の同一性割合は、それぞれ、65.50
％および62.70 ％である。
【０１９９】 実施例12 SENV-Dゲノムの特徴づけ SENV-Dゲノムの完全な配列を得るために、2 つのPCR 反応を行い、3'方向およ
び5'方向に伸長させた配列を得た。
【０２００】 一方のPCR 反応では、SENV-Dの利用可能な配列（配列番号53）およびTTV 配列
の最も5'側の領域に由来するプライマーSENV-D 2AS（配列番号84）およびプライ
マーTTV15S（配列番号72）を使用した。第2 の反応では、SENV-Dの利用可能な配
列（配列番号53）に由来するプライマーSENV-D 1S （配列番号85）と、SENV-Cの
3'配列に由来するプライマー662AS （配列番号86）とを用いた。
【０２０１】 PCR 反応を、鋳型、患者NAE8から得られた100 μl の血清からQIAamp血液キッ
ト（QIAGEN）を用いて抽出されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mMのTrisHCl(pH
8.8)、16.6mMの(NH4)2SO4 、10mMのβ−メルカプトエタノール、2mM のMgCl2 ）
、300ng の各PCR プライマー、濃度が200 μM である各デオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸（Boehringer（Mannheim、ドイツ）から得られるdATP、dGTP、dCTPお
よびdTTP）、および1.25U のTaq ポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μl の
混合物で行った。反応を、ミネラルオイルを用いてDNA サーマルサイクラーで行
った。PCR は、94℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分および58℃で1 分および72
℃で1 分の45サイクル、ならびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった
。この方法を使用して、約1350bpおよび1614bpの2 つの増幅物が得られた。PCR
産物を、増幅産物のサイズを決定するために、2 μg/mlの臭化エチジウムを含む
2 ％アガロースゲルに負荷した。
【０２０２】 上記の1350bpおよび1914bpのバンドに対応するゲルスライスを切りだし、DNA
抽出物をpGEMベクター（Promega 、Madison 、WI、米国）に連結し、ベクターを
大腸菌に導入した。挿入物のDNA 配列を、蛍光M13 ユニバーサルプライマーおよ
び蛍光M13 リバースプライマーとともにAutoRead配列決定キット（Pharmacia Bi
otech ）を使用することによって決定した。3 つのクローンを配列決定した（両
鎖）。コンセンサス配列を採用した。
【０２０３】 利用可能なSENV-D配列の5'領域および3'領域と重なるクローンがいくつか得ら
れた（配列番号51〜54）。重なる配列をASSEMLGEL プログラムで組み立てた後、
3264塩基のユニーク配列が推定された。この配列をSENV-Dと名付けた（配列番号
87）。SENV-Dは3 つのオープンリーディングフレームを含む。ORF1のヌクレオチ
ド配列（nt584 〜2848）、ORF2のヌクレオチド配列（nt252 〜725 ）およびORF3
のヌクレオチド配列（nt2550〜2816）（配列番号88、89および90）は、それぞれ
、754 アミノ酸、157 アミノ酸および88アミノ酸（配列番号91、92および93）の
タンパク質をコードする。
【０２０４】 ヌクレオチドレベルにおいて、SENV-DのORF1配列は、SENV-A、SENV-BおよびSE
NV-CのORF1ヌクレオチド配列に対して、それぞれ、64.39 ％、58.73 ％および60
.43 ％の同一性を有する。SENV-DのORF1ヌクレオチド配列とTTV のORF1をコード
するヌクレオチド配列との同一性は49.01 ％である。SENV-DのORF2をコードする
ヌクレオチド配列と、SENV-A、SENV-B、SENV-CまたはTTV のORF2をコードするヌ
クレオチド配列との整列により、これらの配列が、それぞれ、57.59 ％、57.32
％、52.11 ％および47.47 ％の同一性を有することが明らかにされる。SENV-Dの
ORF3をコードするヌクレオチド配列と、SENV-A、SENV-BおよびSENV-CのORF3をコ
ードするヌクレオチド配列との整列により、これらの配列が、それぞれ、55.81
％、55.95 ％および57.68 ％の同一性を有することが明らかにされる。
【０２０５】 さらに、SENV-DのORF1のアミノ酸配列と、SENV-A、SENV-B、SENV-CおよびTTV
のORF1との整列により、これらのタンパク質配列が、それぞれ、56.07 ％、49.4
8 ％、52.32 ％および34.62 ％の同一性を有することが明らかにされる（図50A
を参照のこと）。SENV-DのORF2のアミノ酸配列と、SENV-A、SENV-B、SENV-Cおよ
びTTV のORF2との整列により、これらの配列が、それぞれ、40.13 ％、45.51 ％
、34.39 ％および20.38 ％の同一性を有することが明らかにされる（図50B を参
照のこと）。
【０２０６】 最後に、SENV-DのORF3と、SENV-AおよびSENV-BおよびSENV-CのORF3との比較に
より、これらの配列が、それぞれ、38.37 ％、31.33 ％および29.55 ％の同一性
を有することが明らかにされる（図50C もまた参照のこと）。
【０２０７】 実施例13 SENV配列の比較分析 図49A には、SENV-A、SENV-B、SENV-C、SENV-Dの全ゲノム（図49A ）または種
々のORF をコードする配列（図49C 、図49D および図49E ）とTTV のゲノムとの
間におけるヌクレオチド同一性割合がまとめられている。同じ分析（図49B ）を
、SENVの完全なコード領域（配列番号26、94、95および96）のみを考慮して同様
に行った。従って、SENVとTTV との保存された5'非翻訳領域および3'非翻訳領域
のみを考慮した場合でさえ、これらの2 つのウイルス因子のヌクレオチド配列は
、60％を越える同一性を決して有しない。
【０２０８】 図50には、SENV-A、SENV-B、SENV-C、SENV-DおよびTTV のゲノムによってコー
ドされるORF のアミノ酸レベルにおける同一性割合がまとめられている。
【０２０９】 SENVの推定されたORF1のすべてとTTV のORF1とのアミノ酸配列同一性が同じ範
囲内（33.18 ％〜34.93 ％の間）にあり、これに対してSENVサブタイプ間のORF1
同一性はさらに大きな範囲内（49.48 ％〜56.07 ％の間）にあることは注目され
る。このことは、SENVがTTV から独立して進化してきたこと、およびTTV とSENV
の先祖との系統発生的分離は、種々のSENV遺伝子型が進化する前に生じたことを
示唆している。
【０２１０】 さらに、SENVのORF2およびORF3は、SENVのORF1よりも保存されていない。
【０２１１】 種々のSENV配列間の関係をよりよく評価するために、ORF1およびORF2のアミノ
酸配列の進化分析を行った。
【０２１２】 種々のウイルス間の進化的関係は、大きなオープンリーディングフレームまた
はこれらの配列の一部の整列されたヌクレオチド配列または整列された推定アミ
ノ酸配列の間における系統発生的距離を計算することによって調べることができ
る。種々のSENV配列間の系統発生的距離を決定するために、進化的距離を、ORF1
およびORF2のアミノ酸配列の整列について決定した。
【０２１３】 図51には、この分析の結果が示されている。分析されたウイルス配列の間にお
ける相対的な進化的距離は、数値から容易に明らかである。ORF1に関して、図52
には、アミノ酸配列の整列に由来する無根系統樹も示されている。
【０２１４】 本質的には、この分析により、少なくともORF1の場合、すべてのSENV配列は、
TTV よりも大きく相互に関連していること、および同一性割合を分析することに
よって既に推定されているように、すべてのSENV配列はTTV から同じ系統発生的
距離を有することが明らかにされる。
【０２１５】 まとめると、すべてのこれらの結果より、SENVおよびTTV は、共通の祖先から
おそらくは進化したと考えられる異なるウイルスであることが明らかにされる。
【０２１６】 実施例14 臨床研究におけるSEN ウイルスの検出 臨床的な情報が得られる種々の個体群におけるSEN ウイルスの累積罹患率を評
価した。
【０２１７】 このために、SENV-A、SENV-B、SENV-CおよびSENV-Dの配列を同時に増幅するこ
とができるPCR 法を開発した。
【０２１８】 このようなPCR のために、SENV-A、SENV-B、SENV-CおよびSENV-Dにおける保存
領域に由来するプライマーBCD 1S（配列番号97）およびプライマーL2AS（配列番
号71）を使用した。PCR 反応を、鋳型、100 μl の血清からQIAamp血液キット（
QIAGEN）を用いて抽出されたDNA の1/10量、PCR 緩衝液（67mMのTrisHCl(pH8.8)
、16.6mMの(NH4)2SO4 、10mMのβ−メルカプトエタノール、2mM のMgCl2 ）、30
0ng の各PCR プライマー、濃度が200 μM である各デオキシリボヌクレオシド三
リン酸（Boehringer（Mannheim、ドイツ）から得られるdATP、dGTP、dCTPおよび
dTTP）、および1.25U のTaq ポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含む50μl の混合
物で行った。反応を、ミネラルオイルを用いてDNA サーマルサイクラーで行った
。PCR は、94℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分および54℃で1 分および72℃で
1 分の40サイクル、ならびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。PC
R 産物を2 ％アガロースゲルで分析した。
【０２１９】 増幅産物の特異性を評価するために、各増幅産物の5 μl 部分を、下記のビオ
チン化プローブを用いてDEIAアッセイ（DNA 酵素免疫アッセイ：Mantero 、Chem
ical Chemistry、37(1991)、422 〜429 ）においてハイブリダイズさせた： 増幅DNA の中央部にある保存配列に特異的なSEN プローブ（配列番号98）、 SENV-A配列に特異的なLA（配列番号99）、 SENV-B配列に特異的なLB（配列番号100 ）、 SENV-C配列に特異的なLC（配列番号101 ）、 SENV-D配列に特異的なLD（配列番号102 ）。
【０２２０】 このようにして、各増幅産物を、すべてのSENV配列ならびにそれぞれの特定の
遺伝子型／サブタイプの存在について同時に調べることができる。
【０２２１】 この方法を使用して、種々の個体群から得られた血清を分析した。その結果を
図53に示す。
【０２２２】 SENVは血液供与者の間で罹患率が低く、一方、驚くべきことに、起源が不明の
進行した肝疾患患者の大多数がこの（これらの）ウイルス因子について陽性であ
ることが見出されたことが明らかにされ得る。さらに、静脈注射薬常用者におけ
るSEN ウイルスの罹患率が大きいことは、このウイルスが血液とともに伝染し得
ることも示唆している。
【０２２３】 実施例15 SEN ウイルスの分子的構成 種々のSEN 間の関係をさらに理解するために、これらのウイルスのゲノムによ
ってコードされる種々の仮想的なタンパク質における生物学的に重要な部位およ
び特徴の存在を分析した。
【０２２４】 PROSITE 予測（PC GENE ソフトウエアシステム（ジュネーブ大学、スイス；TM
IntelliGenetics Inc.））により、SENV-A、SENV-B、SENV-CおよびSENV-DのORF1
は、それぞれ、2 個、1 個、1 個および1 個の可能なN-グリコシル化部位、1 個
、1 個、4 個および1 個のチロシン硫酸化部位、6 個、11個、9 個および10個の
プロテインキナーゼC リン酸化部位、9 個、5 個、9 個および6 個のカゼインキ
ナーゼIIリン酸化部位、2 個、1 個、4 個および3 個のアミド化部位、ならびに
、2 個、5 個、4 個および5 個のN-ミリストイル化部位を含む。SENV-AおよびSE
NV-CのORF1はまた、それぞれ、617 位〜638 位および729 位〜750 位に広がるロ
イシンパターンの存在を特徴とした。さらに、SENV-CのORF1には、751 位〜753
位に広がるミクロボディーC 末端シグナルも含まれた。最後に、SENV-CおよびSE
NV-Dには、20個および21個の2 分（bipartite ）核標的化配列がN 末端に含まれ
た。これらの配列はSENV-AおよびSENV-BのORF1には見出されなかった。
【０２２５】 同じタイプの分析をORF2に適用して、SENV-A、SENV-B、SENV-CおよびSENV-Dの
ORF2は、それぞれ、0 個、0 個、0 個および1 個の可能なN-グリコシル化部位、
0 個、1 個、1 個および0 個のチロシン硫酸化部位、1 個、0 個、0 個および2
個のプロテインキナーゼC リン酸化部位、1 個、1 個、0 個および1 個のカゼイ
ンキナーゼIIリン酸化部位、ならびに、1 個、6 個、7 個および3 個のN-ミリス
トイル化部位を含むことが明らかにされた。SENV-AおよびSENV-CのORF1はまた、
それぞれ、617 位〜638 位および729 位〜750 位に広がるロイシンパターンの存
在を特徴としたが、これはTTV のORF1では検出することができない。
【０２２６】 SENV-A、SENV-B、SENV-CおよびSENV-DのORF3は、それぞれ、1 個、4 個、3 個
および0 個のcAMP依存性およびcGMP依存性のプロテインキナーゼリン酸化部位、
1 個、4 個、6 個および4 個のプロテインキナーゼC リン酸化部位、2 個、2 個
、1 個および3 個のカゼインキナーゼIIリン酸化部位、1 個、0 個、1 個および
1 個のアミド化部位の存在を特徴とし、そして2 個、2 個、4 個および4 個の2
分核標的化配列を特徴としていた。
【０２２７】 実施例16 組換えSENV-Aタンパク質のクローン化および発現 pGEM* -T Easy （Promega ）のEcoRI 制限部位にクローン化されたSENV-AのOR
F1を、5'末端および3'末端に2 つの制限部位配列を加えるためにPCR により増幅
した。上流プライマー（TTG GAT CCA TGA ACT ATG CCA TGC ACT GCG ：配列番号
109 ）は非相補的なBamHI 認識配列を5'末端を有し、一方、下流プライマー（AT
G AAT TCT TAC GTG AGG TGT GCT AAA GAT AGT GGG ：配列番号110 ）はEcoRI 認
識配列を5'末端に有する。
【０２２８】 得られた増幅物を、ヒスチジンテールをN 末端に有する融合タンパク質として
ORF1を発現させるためにpET-30a 大腸菌発現ベクター（Novagen ）にクローン化
した。このテールは、金属キレート化カラム（HI TRTAPキレート化、Pharmacia
、＃17-0409-01、製造者のプロトコルに従って使用）での精製をより容易にする
。
【０２２９】 形質転換された大腸菌BL21株の誘導プロトコルをpET システムのマニュアル（
Novagen ）に従って行った。簡単に記載すると、組換え大腸菌の一晩培養物を新
しい培地に1 ：50の希釈で接種した。細胞を、OD600 が0.5 〜0.6 の吸光度に培
養物が達するまで振とう器において37℃でインキュベーションした。その後、IP
TGを100mM 貯蔵溶液から1mM の最終濃度に加えることによって細胞を誘導した。
経時変化実験おいて、誘導時間に関わらず、誘導後の標的タンパク質発現の発現
レベルは極めて低いままであることが明らかにされた。従って、3 時間の誘導時
間を、予備的な免疫反応性分析のために精製して使用することができるタンパク
質サンプルを得るために組換えORF1について設定した。発現したタンパク質の溶
解性を評価するために、3 つの工程を含む抽出プロトコルを行った。最初に、細
胞ペレットをTris緩衝液（50mM Tris-HCl 、100mM NaCl、pH8.0 ）に再懸濁して
超音波処理した。遠心分離工程の後、ペレットを尿素緩衝液（8M尿素、50mM Tri
s-HCl 、100mM NaCl、pH8.0 ）に再懸濁し、70℃で加熱し、不溶性タンパク質画
分を回収した。（存在する場合には）残留ペレットをSDS-PAGE負荷緩衝液に再懸
濁した。
【０２３０】 組換えORF1タンパク質の大部分は尿素画分に見出され、金属キレート化樹脂で
のアフィニティークロマトグラフィーによって精製された。分子量が80354 ダル
トンの部分精製された融合タンパク質が得られた（テーブル1 を参照のこと；配
列番号103 および配列番号104 ）。
【０２３１】 テーブル1 組換えORF1 A ヌクレオチド配列：
【化１】 太字：配列の最初のATG 。
【０２３２】 ORF1のタンパク質配列：
【化２】 下線部：ヒスチジンテール、S ：Tag 配列 太字：ORF1配列の最初のメチオニン。
【０２３３】 pGEM* -T Easy ベクター（Promega ）のEcoRI 部位にクローン化されたSENV-A
のORF2を、配列の5'末端および3'末端に2 つの制限部位認識配列を挿入するため
にPCR 増幅した。順方向プライマー（ATG GAT CCG GGC TAT GGG CAA GGC TCT TA
G GG：配列番号111 ）はBamHI 部位を5'末端を有し；逆方向プライマー（TAG AA
T TCT TAC TGT TGG TCG TCT TCT TCG ACG G ：配列番号112 ）はEcoRI 認識配列
を5'末端に有する。得られた配列をpET-30c 大腸菌発現ベクター（Novagen ）に
クローン化して、ヒスチジンテールをN 末端に有する融合タンパク質として発現
させた。標的タンパク質の発現の経時変化研究の後、3 時間の誘導時間を設定し
た。SENV-Aの組換えORF1の場合と同じ抽出を用いた。SENV-Aの組換えORF2は尿素
画分に回収された。金属キレート化カラム（上記参照）で精製された融合タンパ
ク質は、分子量が24000 ダルトンである（テーブル2 を参照のこと；配列番号10
5 および配列番号106 ）。
【０２３４】 テーブル2 組換えORF2 A ヌクレオチド配列：
【化３】 太字：ORF2の最初のATG 。
【０２３５】 ORF2のタンパク質配列：
【化４】 下線部：ヒスチジンテールおよびS.Tag 配列 太字：ORF2の最初のメチオニン。
【０２３６】 SENV-AのORF3を組換えpGEM* -T Easy ベクターのEcoRI 部位から切り出して、
5'末端および3'末端に2 つのユニーク制限部位認識配列を加えるためにPCR によ
り増幅した。順方向プライマー（ATG GAT CCC CAA CAG TAG ATG AAC TCT ATC TT
C AAA AAC C ：配列番号113 ）はBamHI 認識部位を5'末端を有し；逆方向プライ
マー（TAG AAT TCT GGA ACA TGT CAT ACT TTA CGT GAG GTG TGC ：配列番号114
）はEcoRI 結合配列を5'末端に有する。増幅産物をpET-30b 大腸菌発現ベクター
にクローン化し、そして3 時間の誘導を行った後、細菌を集めた。タンパク質抽
出プロトコルはORF1の場合と同じであり、組換えタンパク質は可溶性のTris画分
に見出された。金属キレート化カラムで精製された組換えタンパク質は、分子量
が15000 ダルトンである（テーブル3 を参照のこと；配列番号107 および配列番
号108 ）。
【０２３７】 テーブル3 組換えORF3 A ヌクレオチド配列：
【化５】 太字：ORF3の最初のATG 。
【０２３８】 ORF3のタンパク質配列：
【化６】 下線部：ヒスチジンテールおよびS-Tag 配列 太字：ORF3の最初のメチオニン。
【０２３９】 実施例17 臨床サンプルにおけるSEN ウイルスの検出 いくつかの病理学的状態におけるSENVの可能な役割が明らかにされたので、さ
らに拡大された臨床研究を行った。選択された臨床サンプルはPCR によりスクリ
ーニングされた。最初に、SENV-A、SENV-B、SENV-CおよびSENV-Dの配列を同時に
増幅し得るPCR を最適化した。
【０２４０】 このために、プライマーBCD 1S（配列番号97）を改変し、得られたプライマー
NEW BCD 1S（配列番号115 ）を、SENV-A、SENV-B、SENV-CおよびSENV-Dにおける
保存配列に由来するプライマーL 2AS （配列番号71）とそれぞれ組み合わせて使
用した。これらの反応を、前記（実施例9 を参照のこと）に記載されているよう
に行った。PCR は、94℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分および52℃で1 分およ
び72℃で1 分の40サイクル、ならびに72℃で7 分間のインキュベーションからな
った。増幅産物の特異性を評価するために、各増幅産物の5 μl 部分を、下記の
ビオチン化プローブを用いてDEIAアッセイ（Mantero 、上記）においてハイブリ
ダイズさせた： 増幅DNA の中央部にある保存配列に特異的なSEN 特異的プローブ（配列番号98）
、 SENV-A配列に特異的なLA（配列番号99）、 SENV-B配列に特異的なLB（配列番号100 ）、 SENV-C配列に特異的なLC（配列番号101 ）、 SENV-D配列に特異的なLD（配列番号102 ）。
【０２４１】 このようにして、各増幅産物を、すべてのSENV配列ならびにそれぞれの特定の
遺伝子型／サブタイプの存在について同時に調べることができる。
【０２４２】 特定の高度に選択された患者群から得られた血清を分析した。結果を図54に示
す。1 つの群（患者番号1 〜12）は、1 回の輸血の後に急性の非A 〜非E 型（NA
NE、輸血後）の肝炎を発症した個体を含んだ。第2 の群（患者番号13〜22）は慢
性の非A 〜非E 型肝炎（NANE、慢性肝炎）の個体を含み、第3 の群（患者番号23
〜31）（HCV 陽性供与者）は、C 型肝炎（HCV ）ウイルスに感染した血液供与者
からなった。最後に、20名の健康な血液供与者を分析に含めた（患者番号32〜52
）。
【０２４３】 図54の結果は、NEW BCD 1S（配列番号115 ）およびL 2AS （配列番号71）のプ
ライマーを用いたサンプルの増幅により得られた値を示している。値は、吸光度
値として表されている。非常に強い相関がSENVと肝炎伝染との間に存在するが、
非常に少数の血液供与者もまたSENVについて陽性の結果をもたらしたことが結果
から明かである。
【０２４４】 SENVウイルスの不均一性を考慮して、一部のSENVサブタイプは病原性が他より
も大きいという可能性が考えられる。この仮説を確認するために、急性の非A 〜
非E 型の患者（NANE）から得られた数個のPCR 増幅物ならびに健康な血液供与者
から得られた増幅物を配列決定した。
【０２４５】 興味深いことに、3 つのSENVについて陽性である健康な血液供与者はすべて、
SENV-B配列をもっぱら有し、その状況は、急性肝炎患者の場合と非常に異なって
いた。その内の3 名（患者2 、7 および9 ）はSENV-Dウイルスに感染しており、
患者5 はSENV-A配列をもっぱら含んでいた。
【０２４６】 患者6 、8 、10および12（図54を参照のこと）は同一のSENV配列を含んでいた
。しかし、この配列（配列番号116 ）は、既知のSENVサブタイプのいずれにも合
致し得ない。従って、配列番号116 により、新しいSENV変異体が同定される。患
者1 もまた、新しいSENV変異体を有していたが、その配列（配列番号117 ）は、
患者6 、8 、10および12で検出された配列とは異なっていた。
【０２４７】 これらの結果は、SENVが輸血によって肝炎を伝染し得ることを明らかにしてい
る。さらに、これらの結果は、一部のSENVサブタイプは病原性が他よりも大きい
ことを示している。例えば、SENV-Bが健康な血液供与者に見出されており、従っ
て、疾患を伝染させる際のその潜在的な役割は非常に小さいと考えられる。対照
的に、SENV-A、SENV-DおよびSENV-Eは健康な血液供与者ではほとんど検出されて
いないが、それらは肝炎伝染に関連していると考えられる。
【０２４８】 実施例18 SENV-Eの同定および分子的特徴づけ 患者7 で検出されたSENV配列の大多数はSENV-Aサブタイプに属するが、新しい
異なるSENV配列を含むクローンがこの患者で同定された。SENV-Eと名付けられた
この新しいSEN ウイルスの完全な配列を得るために、2 つの異なるPCR 反応を行
った： 最初に、L 2AS （配列番号71）およびTTV15S（配列番号72）のプライマーをそ
れぞれ使用した。これらは、SENV-Dの利用可能な配列（配列番号53）およびTTV
配列の最も5'側の領域から得られた。第2 に、SEN-D の利用可能な配列（配列番
号53）に由来するプライマーNEW BCD 1S（配列番号115 ）およびSENV-Cの3'配列
に由来するプライマー662AS （配列番号86）を使用した。SENV-A、SENV-Bおよび
SENV-Cはそのゲノムの3'非翻訳領域に共通配列を有するため、配列類似性の領域
がSENV-CおよびSENV-Eのゲノムの最も3'側の領域にも存在することが考えられた
。
【０２４９】 PCR を本明細書中上記に記載されているように行い、94℃で5 分間の予備加熱
、94℃で1 分および58℃で1 分および72℃で1 分の45サイクル、ならびに72℃で
7 分間のインキュベーションからなった。この方法を用いて、約1350bpおよび16
14bpの2 つの増幅物が得られた。
【０２５０】 本明細書中上記に記載されているように、これらの1350bpおよび1914bpのバン
ドに対応するゲルスライスを切りだし、精製したDNA 抽出物を標準的なプロトコ
ルに従ってpGEMベクター（Promega 、Madison 、WI、米国）に連結し、大腸菌に
導入した。挿入物のDNA 配列を、蛍光M13 ユニバーサルプライマーおよび蛍光M1
3 リバースプライマーとともにAutoRead配列決定キット（Pharmacia Biotech ）
を使用することによって決定した。配列を、それぞれのPCR 産物の3 つのクロー
ンについて配列決定し、コンセンサス配列を採用した。
【０２５１】 この方法を使用して、利用可能なSENV-E配列の5'領域および3'領域と重なるク
ローンがいくつか得られた。重なる配列をASSEMLGEL プログラムで組み立てた後
、3263塩基のユニーク配列が得られた。この配列をSENV-Eと名付けた（配列番号
118 ）。すべてのそれ以外のSEN ウイルスのように、SENV-Eは、それぞれが743
アミノ酸、152 アミノ酸および97アミノ酸（配列番号122 、123 および124 ）の
3 つのオープンリーディングフレーム（ORF1、ORF2およびORF3）を含む。配列番
号125 は、TTV に対して非常に相同的な5'部分および3'部分を除き、SENV-Eのヌ
クレオチド配列に関する。
【０２５２】 SENV-Eの主要なORF （ORF1）をコードするアミノ酸配列と、SENV-A、SENV-B、
SENV-CおよびSENV-DならびにTTV のアミノ酸配列との整列により、これらのタン
パク質配列が、それぞれ、47.35 ％、42.86 ％、44.68 ％、44.82 ％および35.5
3 ％の同一性を有することが明らかにされた。ヌクレオチドレベルにおいて、こ
のORF1の同一性は、それぞれ、53.97 ％、54.17 ％、53.40 ％、54.00 ％および
48.12 ％である。
【０２５３】 SENV-EのORF2をコードするアミノ酸配列と、SENV-A、SENV-B、SENV-CおよびSE
NV-DならびにTTV のORF2との整列により、これらの配列が、それぞれ、45.39 ％
、34.21 ％、46.71 ％、33.55 ％および31.58 ％の同一性を有することが明らか
にされた。ヌクレオチドレベルにおいて、これらの同一性は、それぞれ、61.32
％、54.73 ％、57.58 ％、53.63 ％および52.09 ％である。
【０２５４】 最後に、SENV-EのORF3と、SENV-A、SENV-B、SENV-CおよびSENV-DのORF3との比
較により、これらの配列が、それぞれ、30.23 ％、27.71 ％、31.82 ％および25
.00 ％の同一性を有することが明らかにされた。ヌクレオチドレベルにおいて、
これらの同一性は、それぞれ、52.19 ％、56.22 ％、52.43 ％および54.68 ％で
ある。
【０２５５】 これらの結果は、SENV-Eが実際にSENVファミリーのメンバーであることを示し
ているが、これまでに同定されたこのファミリーのそれ以外のメンバーとの関連
はさらに薄いようである。PHYLIPパッケージのPROTDISTプログラムによって推定
されたORF1タンパク質間の系統発生的距離（図55）により、SENV-Eは、これまで
に同定されたSEN ウイルスの中で最も離れていることが明らかにされた。しかし
、SENV-Eは、依然として、TTV よりもそれ以外の4 つの同定されたSENV（A 〜D
）に近い（図55を参照のこと）。
【０２５６】 実施例19 SENVサブタイプの種々の生物学的作用 これまでに同定されたSENVサブタイプにおける高レベルの構造的多様性が得ら
れたので、そのような多様性はまた種々の生物学的作用をもたらし得るかどうか
を調べた。このために、種々の疾患に罹っている種々の患者群におけるSENV-A、
SENV-B、SENV-CおよびSENV-Dの発生率を調べた。
【０２５７】 （種々の患者から抽出された）DNA サンプルを、プライマーNEW BCD 1S（配列
番号115 ）およびプライマーL 2AS （配列番号71）を用いたPCR により増幅した
。再度ではあるが、このPCR 反応を本明細書中上記に記載されているように行い
、94℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分および54℃で1 分および72℃で1 分の40
サイクル、ならびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。
【０２５８】 増幅産物の特異性を、下記のビオチン化プローブを用いたDEIAアッセイ（Mant
ero 、上記）において、上記に記載されているように調べた： SENV-A配列に特異的なLA（配列番号96）、 SENV-B配列に特異的なLB（配列番号97）、 SENV-C配列に特異的なLC（配列番号98）、 SENV-D配列に特異的なLD（配列番号99）。
【０２５９】 図56の結果は、SENV-Aを有する患者の割合を示している。SENV-Aは、神経学的
異常および慢性関節リウマチのようないくつかの疾患に罹っている患者では検出
されず、そして健康な血液供与者でも検出されなかった。しかし、このウイルス
は、外部の血液を受けた患者群に大きな割合で存在していた。このことは、この
因子の非経口的な伝染経路を明らかにしている。驚くべきことに、SENV-Aは、ク
ローン病および肝細胞ガンに罹っている患者に大きな割合で存在していることも
見出された。従って、この特定のウイルス因子は、クローン病、伝染性因子の関
与が疑われる病因不明の病理に関与していることが考えられる。
【０２６０】 図57は、種々の患者群におけるSENV-Bの発生率を示している。陽性サンプルの
プロフィルが、SENV-Aから得られたプロフィルとは非常に異なることが明かであ
る。例えば、HIV+の静脈注射薬常用者（IVDU）におけるSENV-B陽性サンプルの割
合が、SENV-Aと比較してはるかに低いことは驚くべきことである。さらに、SENV
-Bは、外部の血液に曝されていない患者群にもランダムに存在しているようであ
る。
【０２６１】 図58および図59の結果は、患者サンプルにおけるSENV-CおよびSENV-Dの分布を
示している。再度ではあるが、種々の群におけるこれらのウイルスサブタイプの
分布はかなり変動していた。SENV-CおよびSENV-Dの両方が、紅斑性狼瘡の患者に
おいて相当な割合で検出された。しかし、興味深いことに、これらの2 つのウイ
ルスサブタイプは、実際には、慢性関節リウマチ患者のコホートには存在してい
ない。従って、SENV-CおよびSENV-Dが、狼瘡状態の伝染または維持に関与し得る
ことが考えられる。
【０２６２】 SENVファミリーのメンバーは種々の生物学的または生物医学的な関わりを有す
ると結論することができる。最も重要なことに、それらが関連し得る疾患のタイ
プはかなり多様であるようである。
【０２６３】 SENV-AおよびSENV-Dは、病因不明の肝炎の伝染に強く関連しているようである
。さらに、SENV-Aはクローン病にも関連してようである。一方、SENV-CおよびSE
NV-Dは、紅斑性狼瘡において重要な役割を果たしているようである。
【０２６４】 最後に、外部の血液に曝された患者群で認められた陽性サンプルの種々の割合
はまた、種々のSENVサブタイプが異なる伝染経路を有しているか、あるいはそれ
らが、異なるタイプの免疫応答を宿主において誘導することを示し得る。SENV-B
は、スクリーニングされた病理学的状態のいずれにも関連しないと考えられるこ
とは注目される。
【０２６５】 実施例20 SENV-AおよびSENV-Dに特異的なPCR の開発 種々のSENVサブタイプが種々の病因論的な特徴を示すことが明らかにされたの
で、それらを個々に分析および検出する特異的な試験を開発することが重要であ
った。
【０２６６】 実施例6 には、SENV-Aを選択的に増幅および検出するための方法が記載されて
いる。さらなるSENV-A配列を整列することによって、新しいプライマー組もまた
、SENV-Aの増幅に好適であることが見出された。この新しいプライマー組をNEW
SEN 3S（配列番号126 ）およびNEW SEN 2AS （配列番号127 ）と名付けた。これ
らのプライマーを、実施例6 に記載されるPCR 反応（反応1 ）において使用した
。増幅産物の特異性を、SEN37 ビオチン化プローブ（配列番号13）を使用してDE
IAアッセイにおいて評価した。
【０２６７】 さらに、SENV-Dを選択的に増幅および検出する方法を開発した。このために、
すべての利用可能なSENV配列を整列し、SENV-Dに対するプライマーおよび特異的
なプローブを同定した。
【０２６８】 SENV-A、SENV-B、SENV-CおよびSENV-Dに感染している種々の患者から抽出され
たDNA を、プライマーD10S（配列番号128 ）およびプライマーL 2AS （配列番号
71）を用いるPCR （反応2 ）により、あるいはプライマーD10S（配列番号128 ）
およびプライマーD2AS（配列番号129 ）を用いるPCR （反応3 ）により増幅した
。PCR を本明細書中上記に記載されているように行い、94℃で5 分間の予備加熱
、94℃で1 分および58℃で1 分および72℃で1 分の40サイクル、ならびに72℃で
7 分間のインキュベーションからなった。
【０２６９】 増幅産物の特異性を確認するために、各増幅産物の5 μl 部分を、反応2 およ
び反応3 の両方によって得られた増幅物に対する内部のビオチン化プローブNEW
D Biot（配列番号130 ）を用いて上記に記載されたDEIAアッセイにおいてハイブ
リダイズさせた。
【０２７０】 図60の結果は、反応1 により、SENV-B、SENV-CおよびSENV-Dを含むサンプルで
はなく、SENV-A陽性サンプルが選択的に増幅されたことを示している。これに対
して、反応2 および反応3 は、SENV-D陽性サンプルを選択的に増幅したが、SENV
-A、SENV-BおよびSENV-Cについて陽性のサンプルは増幅しなかった。これらの結
果は、非常に特異的なプライマーおよびプローブ（例えば、配列番号126 〜130
）を使用することにより、任意の試験サンプルにおけるSENV-AおよびSENV-Dの特
異的な検出が可能になることを示している。
【０２７１】 実施例21 SENV-AのORF1タンパク質のクローン化および発現工程 組換え発現プラスミドの構築：SENV-AのORF1をpGEM（登録商標）-T Easy にク
ローン化し、2 つの一意的な制限部位配列を5'末端および3'末端に加えるために
PCR により増幅した。これにより、配列をpET-30a 発現ベクター（Novagen ）に
クローン化することができた。PCR 反応を、10mMのTris-HCl（pH8.3 ）、50mMの
KCl 、1.5mM のMgCl2 、0.001 ％のゼラチン、0.2mM のdNTP混合物ならびに40pm
olの順方向プライマー（TTG GAT CCA TGA ACT ATG CCA TGC ACT GCG ：配列番号
109 ）および40pmolの逆方向プライマー（ATG AAT TCT TAC GTG AGG TGT GCT AA
A GAT AGT GGG ：配列番号110 ）を含むPerkin-Elmer GeneAmp（登録商標）キッ
トを使用して100 μl の容量で行った。PCR 反応を、Perkin-Elmer DNAサーマル
サイクラー480 で行い、増幅反応は、94℃で3'、57℃で1'、72℃で3'の1 サイク
ル、および94℃で1'、57℃で1'、72℃で3'の30サイクルであった。得られた増幅
物はサイズが1930bpであり、これをpET30a大腸菌発現ベクター（Novagen ）のEc
oRI-BamHI 部位にクローン化した。
【０２７２】 組換えタンパク質の発現および精製：大腸菌XL1 Blue細胞（Stratageneカタロ
グ＃200249）において組換えプラスミドの増幅を行った最初の工程の後、pET30a
ORF1プラスミドをタンパク質産生のために大腸菌BL21(DE3) 株に移した。誘導プ
ロトコルをpET システムのマニュアル（Novagen ）に従って行った：組換え大腸
菌の一晩培養物を新しいLuria 培養液＋カナマイシン（30μg/ml）に1 ：50の希
釈で接種した；細胞を、培養液が0.6 のOD600 に達するまで振とうしながら37℃
でインキュベーションした。その後、IPTGを100mM の貯蔵溶液から1mM の最終濃
度に加えることによって細胞を誘導した。3 時間の誘導を行った後、細胞を遠心
分離し、そして細胞ペレットを-20 ℃で一晩置いた後、タンパク質抽出工程を行
った。
【０２７３】 タンパク質の抽出を、可溶性および不溶性のタンパク質画分を分離するために
3 つの工程で行った：最初の工程には、リン酸塩緩衝液（20mM NaH2PO4；0.5M N
aCl 、pH7.4 ）および超音波処理（250Wで1 分を4 回）による可溶性タンパク質
の抽出が含まれた。4 ℃において9000g で30分間遠心分離した後、上清を可溶性
のタンパク質画分として保存し、そしてペレットを尿素緩衝液（8M尿素、100mM
NaCl；20mM Na2HPO4、pH7.0 ）に再懸濁し、250Wで1 分の超音波処理を2 回行い
、70℃で10分間加熱して、その後、4 ℃において9000g で30分間遠心分離した。
残留したペレットを再び8M尿素で可溶化し、再度遠心分離し、そして（存在する
場合には）残留ペレットを、0.1 ％のSDS を含むSDS-PAGE負荷緩衝液に再懸濁し
た。組換えORF1タンパク質は、主として尿素画分に回収され、精製するためにニ
ッケルカラム（HI TRAP キレート化、Pharmacia ＃17-0409-01、製造者のプロト
コルに従って使用）に負荷した。500mM の濃度のイミダゾールを使用して、8035
4 ダルトンの部分精製された融合タンパク質を得た（配列番号103 および配列番
号104 ）。
【０２７４】 プールした画分は、500mM のイミダゾール溶液の直線勾配を用いてカラムを溶
出することによって得られた。
【０２７５】 抗原調製物を、ドデシル硫酸ナトリウムを使用する10％アクリルアミドスラブ
ゲルで電気泳動した。ゲルを、追跡用色素がゲルの下端に達するまで室温におい
て130Vで泳動した。その後、ゲルをニトロセルロース紙に移した。電気泳動ブロ
ットを、0.05％のカゼインを含有するPBS で最初に20分間浸漬し、その後、0.05
％カゼインを含有するPBS で1 ：100 で希釈された血清番号2174（SENV-Aについ
てPCR 陽性で、多数の輸血を受けた血友病患者から得られた血清）と37℃で1 時
間インキュベーションした。ニトロセルロースシートをPBS で3 回洗浄し、0.05
％のカゼインを含有するPBS で1 ：500 で希釈された西洋ワサビペルオキシダー
ゼ結合ヤギ抗ヒトIgG と37℃で1 時間インキュベーションした。
【０２７６】 ブロットを再びPBS で3 回洗浄した。発色を4-Cl- ナフトールで行い、メタノ
ールで洗浄することによって停止させた。ニトロセルロースを遮光して保存した
。2174血清に存在する抗ORF1 SENV-A IgG 抗体は、分子量が81000 のタンパク質
と強く反応した。このウエスタンブロット法により検出された組換えSENV-A ORF
1 （pORF1 ）を含む画分を集め、ELISA アッセイを開発するためにさらに使用し
た。
【０２７７】 実施例22 SENV-AのORF2タンパク質のクローン化および発現工程 組換え発現プラスミドの構築：SENV-AのORF2をpGEM（登録商標）-T Easy にク
ローン化し、2 つのユニーク制限部位配列を5'末端および3'末端に加えるために
PCR により増幅した。これにより、配列をpET-30a 発現ベクター（Novagen ）に
クローン化することができた。PCR 反応を、10mMのTris-HCl（pH8.3 ）、50mMの
KCl 、1.5mM のMgCl2 、0.001 ％のゼラチン、0.2mM のdNTP混合物ならびに40pm
olの順方向プライマー（ATG GAT CCG GGC TAT GGG CAA GGC TCT TAG GG：配列番
号111 ）および40pmolの逆方向プライマー（TAG AAT TCT TAC TGT TGG TCG TCT
TCT TCG ACG G ：配列番号112 ）を含むPerkin-Elmer GeneAmp（登録商標）キッ
トを使用して100 μl の容量で行った。PCR 反応を、Perkin-Elmer DNAサーマル
サイクラー480 で行い、増幅反応は、94℃で3'、60℃で1'、72℃で3'の1 サイク
ル、および94℃で1'、60℃で1'、72℃で1'の30サイクルであった。得られた増幅
物はサイズが1930bpであり、これをpET30a大腸菌発現ベクター（Novagen ）のEc
oRI-BamHI 部位にクローン化した。
【０２７８】 組換えタンパク質の発現および精製：大腸菌XL1 Blue細胞（Stratageneカタロ
グ＃200249）において組換えプラスミドの増幅を行った最初の工程の後、pET30c
ORF2プラスミドをタンパク質産生のために大腸菌BL21(DE3) 株に移した。誘導プ
ロトコルをpET システムのマニュアル（Novagen ）に従って行った：組換え大腸
菌の一晩培養物を新しいLuria 培養液＋カナマイシン（30μg/ml）に1 ：50の希
釈で接種した；細胞を、培養液が0.6 のOD600 に達するまで振とうしながら37℃
でインキュベーションした。その後、IPTGを100mM の貯蔵溶液から1mM の最終濃
度に加えることによって細胞を誘導した。3 時間の誘導を行った後、細胞を遠心
分離し、そして細胞ペレットを-20 ℃で一晩置いた後、タンパク質抽出工程を行
った。
【０２７９】 タンパク質の抽出を、可溶性および不溶性のタンパク質画分を分離するために
3 つの工程で行った：最初の工程には、リン酸塩緩衝液（20mM NaH2PO4；0.5M N
aCl 、pH7.4 ）および超音波処理（250Wで1 分を4 回）による可溶性タンパク質
の抽出が含まれた。4 ℃において9000g で30分間遠心分離した後、上清を可溶性
のタンパク質画分として保存し、そしてペレットを尿素緩衝液（8M尿素、100mM
NaCl；20mM Na2HPO4、pH7.0 ）に再懸濁し、250Wで1 分の超音波処理を2 回行い
、70℃で10分間加熱して、その後、4 ℃において9000g で30分間遠心分離した。
得られたペレットを再び8M尿素で可溶化して、再びペレット化した。（存在する
場合には）残留ペレットをSDS-PAGE負荷緩衝液に再懸濁した。組換えORF1タンパ
ク質は、主として尿素画分に回収され、精製するためにニッケルカラム（HI TRA
P キレート化、Pharmacia ＃17-0409-01、製造者のプロトコルに従って使用）に
負荷した。500mM の濃度のイミダゾールを使用して、分子量が24000 ダルトンの
部分精製された融合タンパク質を得た（配列番号105 および配列番号106 ）。
【０２８０】 プールした画分は、500mM のイミダゾール溶液の直線勾配を用いてカラムを溶
出することによって得られた。
【０２８１】 抗原調製物を、ドデシル硫酸ナトリウムを使用する10％アクリルアミドスラブ
ゲルで電気泳動した。ゲルを、追跡用色素がゲルの下端に達するまで室温におい
て130Vで泳動した。その後、ゲルをニトロセルロース紙に移した。電気泳動ブロ
ットを、0.05％のカゼインを含有するPBS で最初に20分間浸漬し、その後、0.05
％のカゼインを含有するPBS で1 ：100 で希釈された血清番号2174（SENV-Aにつ
いてPCR 陽性）と37℃で1 時間インキュベーションした。ニトロセルロースシー
トをPBS で3 回洗浄し、0.05％のカゼインを含有するPBS で1 ：500 で希釈され
た西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG と37℃で1 時間インキュベー
ションした。
【０２８２】 ブロットを再びPBS で3 回洗浄した。発色を4-Cl- ナフトールで行い、メタノ
ールで洗浄することによって停止させた。ニトロセルロースを遮光して保存した
。
【０２８３】 図61には、免疫化学的分析の結果が示されている。血清に存在するIgG 抗体は
、分子量が30000 のタンパク質と強く反応した。
【０２８４】 このウエスタンブロット技法により規定されたpORF2 含有画分を集め、ELISA
アッセイを開発するためにさらに使用した。
【０２８５】 実施例23 SENV-AのORF3タンパク質のクローン化および発現工程 組換え発現プラスミドの構築：SENV-AのORF3をpGEM（登録商標）-T Easy にク
ローン化し、2 つのユニーク制限部位配列を5'末端および3'末端に加えるために
PCR により増幅した。これにより、配列をpET-30b 発現ベクター（Novagen ）に
クローン化することができた。PCR 反応を、10mMのTris-HCl（pH8.3 ）、50mMの
KCl 、1.5mM のMgCl2 、0.001 ％のゼラチン、0.2mM のdNTP混合物ならびに40pm
olの順方向プライマー（ATG GAT CCC CAA CAG TAG ATG AAC TCT ATC TTC AAA AA
C C （配列番号113 ）および40pmolの逆方向プライマー（TAG AAT TCT GGA ACA
TGT CAT ACT TTA CGT GAG GTG TGC ：配列番号114 ）を含むPerkin-Elmer GeneA
mp（登録商標）キットを使用して100 μl の容量で行った。PCR 反応を、Perkin
-Elmer DNAサーマルサイクラー480 で行い、増幅反応は、94℃で3'、64℃で1'、
72℃で3'の1 サイクル、および94℃で1'、64℃で1'、72℃で1'の30サイクルであ
る。このようにした得られた増幅物はサイズが321bp であり、これをpET30b大腸
菌発現ベクター（Novagen ）のEcoRI-BamHI 部位にクローン化した。
【０２８６】 組換えタンパク質の発現および精製：大腸菌XL1 Blue細胞（Stratageneカタロ
グ＃200249）において組換えプラスミドの増幅を行った最初の工程の後、pET30a
ORF1プラスミドをタンパク質産生のために大腸菌BL21(DE3) 株に移した。誘導プ
ロトコルをpET システムのマニュアル（Novagen ）に従って行った：組換え大腸
菌の一晩培養物を新しいLuria 培養液＋カナマイシン（30μg/ml）に1 ：50の希
釈で接種した；細胞を、培養が0.6 のOD600 に達するまで振とうしながら37℃で
インキュベーションした。その後、IPTGを100mM の貯蔵溶液から1mM の最終濃度
に加えることによって細胞を誘導した。3 時間の誘導を行った後、細胞を遠心分
離し、そして細胞ペレットを-20 ℃で一晩置いた後、タンパク質抽出工程を行っ
た。
【０２８７】 タンパク質の抽出を、可溶性および不溶性のタンパク質画分を分離するために
3 つの工程で行った：最初の工程には、リン酸塩緩衝液（20mM NaH2PO4；0.5M N
aCl 、pH7.4 ）および超音波処理（250Wで1 分を4 回）による可溶性タンパク質
の抽出が含まれた。4 ℃において9000g で30分間遠心分離した後、上清を可溶性
のタンパク質画分として保存し、そしてペレットを尿素緩衝液（8M尿素、100mM
NaCl；20mM Na2HPO4、pH7.0 ）に再懸濁し、250Wで1 分の超音波処理を2 回行い
、70℃で10分間加熱して、その後、4 ℃において9000g で30分間遠心分離した。
8M尿素で再び可溶化した後、ペレット画分を再度遠心分離し、そして（存在する
場合には）残留ペレットをSDS-PAGE負荷緩衝液に再懸濁した。組換えORF1タンパ
ク質は、主として尿素画分に回収され、精製するためにニッケルカラム（HI TRA
P キレート化、Pharmacia ＃17-0409-01、製造者のプロトコルに従って使用）に
負荷した。500mM の濃度のイミダゾールを使用して、分子量が15000 ダルトンの
部分精製された融合タンパク質を得た（配列番号107 および配列番号108 ）。
【０２８８】 抗原調製物を、ドデシル硫酸ナトリウムを使用する10％アクリルアミドスラブ
ゲルで電気泳動した。ゲルを、追跡用色素がゲルの下端に達するまで室温におい
て130Vで泳動した。その後、ゲルをニトロセルロース紙に移した。電気泳動ブロ
ットを、0.05％のカゼインを含有するPBS で最初に20分間浸漬し、その後、0.05
％のカゼインを含有するPBS で1 ：100 で希釈された血清番号2174（PCR アッセ
イでSENV-A陽性）と37℃で1 時間インキュベーションした。ニトロセルロースシ
ートをPBS で3 回洗浄し、0.05％のカゼインを含有するPBS で1 ：500 で希釈さ
れた西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトIgG と37℃で1 時間インキュベ
ーションした。
【０２８９】 ブロットを再びPBS で3 回洗浄した。発色を4-Cl- ナフトールで行い、メタノ
ールで洗浄することによって停止させた。ニトロセルロースを遮光して保存した
。
【０２９０】 このウエスタンブロット技法により決定されたSENV-Aの組換えORF3（pORF3 ）
を含む画分を、ELISA アッセイを開発するためにさらに使用した。
【０２９１】 実施例24 SENV-DのORF2タンパク質のクローン化および発現工程 組換え発現プラスミドの構築： pGEM（登録商標）-T Easy にクローン化されたSENV-DのORF2を、配列のpET-24
a 発現ベクター（Novagen ）へのクローン化を可能にする2 つのユニーク制限部
位配列を5'末端および3'末端に加えるためにPCR により増幅した。順方向プライ
マー（GGG AAT TCG GGC TCT GGG CAA GGC TCT T ：配列番号131 ）は5'末端に非
相補的なEcoRI 認識配列を有し、一方、逆方向プライマー（TTC AAG CTT ACT GT
T GGT CTT CTT CGA CGG CG：配列番号132 ）は5'末端に非相補的なHindIII 認識
配列を有した。PCR 反応を、貯蔵緩衝液A （Promega ）中のTaq DNA ポリメラー
ゼ、マグネシウムを含まないThermophilic DNAポリメラーゼ10x 緩衝液（Promeg
a −これは、10mMのTris-HCl（25℃でpH9 ）、50mMのKCl および0.1 ％のTriton
（登録商標）X-100 の組成を有する）、1.5mM の塩化マグネシウム溶液（Promeg
a ）、0.2mM のdNTP混合物（Perkin-Elmer GeneAmp（登録商標）キット）、およ
び20pmolの両プライマーを使用して100 μl の容量で行った。PCR を35サイクル
（94℃で1'、59℃で1'、72℃で1'、最後のサイクルはさらに20' ）行った。増幅
産物は512bp であった。
【０２９２】 PCR 産物をEcoRI およびHindIII の制限酵素（New England Biolab）で消化し
、pET-24a 発現ベクター（Novagen ）に連結した。配列番号133 をテーブル4 に
示す。
【０２９３】 テーブル4 組換えORF2 D ヌクレオチド配列（配列番号133 ）
【化７】 Y ＝C またはT 太字で下線部：ORF2配列の最初のATG 下線部：ORF2配列の停止コドン。
【０２９４】 組換えタンパク質の発現および精製： 大腸菌XL1 Blue株のコンピテント細胞（Stratageneカタログ＃200249）におい
て組換えプラスミドの増幅を行った最初の工程の後、pET24a-ORF2 プラスミドを
組換えタンパク質産生のために大腸菌BL21(DE3) 株（F - ompT hsdS B (rB - m B - ) gal dcm (DE3) 、Novagen ）コンピテント細胞に移した。
【０２９５】 形質転換された大腸菌BL21(DE3) 株の誘導プロトコルをpET システムのマニュ
アル（Novagen ）に従って行った：組換え大腸菌の一晩培養物を新しいLuria- B
ertani培養液（Molecular Cloning - A Laboratory Manual - Sambrook, Fritch
, Maniatis）＋カナマイシン（30μg/ml）に1 ：50の希釈で接種した；細胞を、
培養液が0.7 のOD590 に達するまで振とうしながら37℃でインキュベーションし
た。その後、IPTGを100mM の貯蔵溶液から1mM の最終濃度に加えることによって
細胞を誘導した。3 時間の誘導を行った後、細胞を遠心分離し、そして細胞ペレ
ットを-80 ℃で一晩置いた後、タンパク質抽出工程を行った。
【０２９６】 タンパク質の抽出を、不溶性（「封入体」）の形態で産生された組換え融合タ
ンパク質ORF2を分離するために、下記に記載された手順に従って行った。この組
換えORF2タンパク質は8M尿素画分（緩衝液C ：50mM TRIS-HCl ；pH9 、1mM EDTA
、8M尿素、14mMβOH、100mM NaCl）に回収された。
【０２９７】 3 時間の誘導後、細胞を4 ℃において4000rpm で30分間遠心分離し、上清を捨
てた。大腸菌BL21ペレットの重量を測定し、1 グラム（湿重量）の大腸菌につい
て、10mlのSTET緩衝液（スクロース、10mM Tris 、1mM EDTA、5 ％ Triton-X
）を、ペレットを再懸濁するために加えた；1 グラム（湿重量）の大腸菌ペレッ
トについて130 μl のリゾチーム（10mg/ml ）を加えたSTET緩衝液における細胞
の懸濁液を4 ℃で一晩攪拌した。細胞溶解物を4 ℃において14,000rpm で20分間
遠心分離して、封入体を細胞断片から分離した。この工程の後、上清を除き、OR
F2タンパク質の封入体ペレットを、多段階の洗浄技法を使用して精製した。
【０２９８】 ペレットを緩衝液A （50mM TRIS-HCl （pH8 ）容量＝容量緩衝液STET）に再懸
濁し、4 ℃において14,000rpm で20分間遠心分離して、上清を除いた。
【０２９９】 ペレットを緩衝液A に再懸濁した；1ml の緩衝液A あたり10μl のベンゾナ−
ゼおよび1mM の最終濃度にされた100mM 貯蔵溶液からのMgCl2 を含む緩衝液A に
おける封入体の懸濁物を37℃で3 時間攪拌した。3 時間攪拌した後、細胞溶解物
を4 ℃において14,000rpm で20分間遠心分離した；上清を捨て、ペレットを緩衝
液A に再懸濁して、4 ℃において14,000rpm で20分間遠心分離した。上清を捨て
、ペレットを緩衝液B （100mM TRIS-HCl；pH9 ；4M尿素、（87％）10％グリセロ
ール、14mMβOH；1 グラムの大腸菌ペレットについて5ml を加える）に再懸濁し
、4 ℃で一晩攪拌した。その後、細胞溶解物を4 ℃において14,000rpm で20分間
遠心分離した；上清を捨て、ペレットを緩衝液C （50mM TRIS-HCl ；pH9 ；8M尿
素、（87％）10％グリセロール、14mMβOH、1mM EDTA；1 グラムの大腸菌ペレッ
トについて5ml を加える）に再懸濁した。すべての工程から、サンプル（10μl
）をそれぞれ10μl の2X SDSゲル負荷緩衝液と混合して、SDS-ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動により分析した。
【０３００】 テーブル5 組換えORF2 D タンパク質配列（配列番号134 ）
【化８】 太字：ORF2のタンパク質配列 X ：S またはP 。
【０３０１】 実施例25 SENV-DのORF3タンパク質のクローン化および発現工程 組換え発現プラスミドの構築： pGEM（登録商標）-T Easy にクローン化されたSENV-DのORF3を、配列のpET-24
a 発現ベクター（Novagen ）へのクローン化を可能にする2 つのユニーク制限部
位配列を5'末端および3'末端に加えるためにPCR により増幅した。順方向プライ
マー（GGA ATT CAC GAT GAA CAG ATT GAT GTT CCA GAC TTT ACA GA：配列番号13
5 ）は5'末端に非相補的なEcoRI 認識配列を有し、一方、逆方向プライマー（CC
C AAG CTT AAT GTA AAT TTG CTTT GGT TTT CTG GAG TTG G：配列番号136 ）は5'
末端に非相補的なHindIII 認識配列を有した。PCR 反応を、貯蔵緩衝液A （Prom
ega ）中のTaq DNA ポリメラーゼ、マグネシウムを含まないThermophilic DNAポ
リメラーゼ10X 緩衝液（Promega −これは、10mMのTris-HCl（25℃でpH9 ）、50
mMのKCl および0.1 ％のTriton（登録商標）X-100 の組成を有する）、1.5mM の
塩化マグネシウム溶液（Promega ）、0.2mM のdNTP混合物（Perkin-Elmer GeneA
mp（登録商標）キット）、および20pmolの両プライマーを使用して100 μl の容
量で行った。PCR を35サイクル（94℃で1'、59℃で1'、72℃で1'、最後のサイク
ルはさらに20' ）行った。増幅産物は512bp であった。
【０３０２】 PCR 産物をEcoRI およびHindIII の制限酵素（New England Biolab）で消化し
、pET 24a 発現ベクター（Novagen ）に連結した。配列番号137 をテーブル7 に
示す。
【０３０３】 テーブル7 組換えORF3 D ヌクレオチド配列（配列番号137 ）
【化９】 下線を付けた太字：ORF3配列の最初のATG 下線部：ORF3配列の停止コドン。
【０３０４】 組換えタンパク質の発現および精製： 大腸菌XL1 Blue株のコンピテント細胞（Stratageneカタログ＃200249）におい
て組換えプラスミドの増幅を行った最初の工程の後、pET24a-ORF3 プラスミドを
組換えタンパク質産生のために大腸菌BL21(DE3) 株（F - ompT hsdS B (rB - m B - ) gal dcm (DE3) 、Novagen ）コンピテント細胞に移した。
【０３０５】 形質転換された大腸菌BL21(DE3) 株の誘導プロトコルをpET システムのマニュ
アル（Novagen ）に従って行った。
【０３０６】 テーブル8 組換えORF3 D タンパク質配列（配列番号138 ）
【化１０】 太字：ORF3のタンパク質配列。
【０３０７】 実施例26 血清学的方法によるSENV-A抗体の検出 抗SENV-A抗体を検出するために使用された方法は間接的なサンドイッチ免疫ア
ッセイであった；プレートを、炭酸塩緩衝液（2.93g/l のNaHCO3、1.56g/l のNa 2 CO3、pH9.6 ＋0.2 ）を使用して3 つの組換えSENV-A抗原（ORF1、ORF2およびOR
F3）で受動的にコーティングした；150 μl のコーティング溶液をマイクロプレ
ートのウエルに加え、一晩インキュベーションした。コーティング溶液を除いた
後、300 μl の後コーティング溶液を分注した（0.1MのTris-HCl、6.7ml/l のBS
A （30％）、pH7.4 ）。1 時間〜3 時間のインキュベーションを行った後、300
μl の固定液（40g/l のPVP 、100g/lのスクロース）をウエルに加え、室温で1
時間〜3 時間さらにインキュベーションした。
【０３０８】 最後に、コーティングされたプレートを密封して、使用するまで4 ℃で保存し
た。
【０３０９】 血清サンプルを、1.15g/l のNa2HPO4,2H2O、0.16g/l のKH2PO4、6.40g/l のNa
Cl、0.16g/l のKCl 、2ml/l のProclin 300 、200U/ml のペニシリン−ストレプ
トマイシン、32g/l のウシ血清アルブミンV 画分、2ml/l のTween 20、2g/lのTr
iton X705 、1g/lのEDTANa2 を含むサンプル希釈液（pH7.4 ）を使用して試験前
に1 ：101 で希釈した。
【０３１０】 血清サンプルを37℃＋1 ℃で1 時間＋5 分間インキュベーションし、その後、
プレートを洗浄緩衝液（9g/lのNaCl、0.01g/l のTween 20）で5 回洗浄した。
【０３１１】 ネズミモノクローナル抗体HP6017抗ヒトIgG-HRP （Public Health Science Ce
nter for Disease Control and Prevention 、ATLANTA 、米国）結合体成分を、
12.24g/lのTrizma、84.4ml/lのHCl （1N）、8g/lのNaCl、0.16g/l のKCl 、100g
/lのスクロース、2ml/l のProclin 300 、0.01g/l のゲンタマイシン、20mg/lの
HRP 、2.20g/l のCaCl2 、0.5g/lのチトクロム（Citocrome ）C 、40g/l のBSA
結晶を含む溶液（pH7.4 ）で使用直前に調製する。
【０３１２】 100 μl の結合液を分注して、37℃±1 ℃で1 時間±5 分間インキュベーショ
ンした。
【０３１３】 インキュベーションが終了する前に、発色体／基質溶液を、発色体の溶液（テ
トラメチルベンジジン誘導体を含むクエン酸塩緩衝液）を基質（過酸化水素を含
むクエン酸塩緩衝液）と1 ：1 の量で混合することによって調製した。
【０３１４】 第2 のインキュベーションが完了したとき、液体を吸引し、すべてのウエルを
、0.3ml 〜0.37mlの範囲の洗浄緩衝液（9g/lのNaCl、0.01g/l のTween 20）で5
回リンスした。この洗浄工程の後、100 μl の発色体／基質を、陰性コントロー
ルのブランクウエルを含むウエルに分注した。マイクロプレートを、直射光また
は強い光から隔離して室温で30分間＋2 分間インキュベーションした。
【０３１５】 インキュベーションが終了したとき、100 μl の停止試薬（1N H2SO4）をすべ
てのウエルに加え、吸光度を、停止試薬を加えた後、1 時間以内に、450/630nm
において光度計で測定した。
【０３１６】 血清サンプルを570 名の患者から集め、このSENV-A ELISAアッセイで分析した
。284 サンプルは米国赤十字社（Rockville 、MD）で集められた健康な血液供与
者であり、43サンプルは（Bioclinical Partners（MA、米国）から集められた）
アルコール性肝硬変患者であり、51サンプルは結腸ガン患者（Istituto di Fisi
ologia Clinica、Pisa、イタリア）から得られたサンプルであり、48サンプルは
血友病患者に由来し、49サンプルは（Bioclinical Partners（MA）から集められ
た）HIV-HCV 陽性患者に由来し、68サンプルは結腸直腸疾患患者（憩室炎または
良性腺腫、Bioclinical Partners（MA）から集められた）に由来し、29サンプル
は他のガン患者（乳ガン、胃ガン、膵臓ガン、Istituto di Fisiologia Clinica
、Pisa、イタリアから集められた）に由来した。
【０３１７】 SENV-A陽性サンプルの割合は下記の通りであった：血液供与者では3.2 ％であ
り、他のガンでは0.0 ％であり、HIV-HCV 陽性患者では2.0 ％であり、結腸直腸
疾患では3.0 ％であった。また、この割合は、血友病患者では8.3 ％にまで、肝
硬変患者では11.6％にまで、そして結腸ガン患者では33.3％にまで上昇した。
【０３１８】 テーブル9 に示されているように、様々な患者群で認められた陽性サンプルの
割合を、自由度が1 のχ2 検定（PRIMER、「Statistica per discipline biomed
iche: programma applicativo 」、Stanton A. Glantz 、著作権、1987年、McGr
aw-Hill ）を使用することによって、血液供与者集団で認められた陽性被験体の
割合と比較した。血友病患者、HCV-HIV 陽性患者、他のガン患者、結腸直腸患者
は血液供与者とは有意に異なっていない（0.20〜0.74の範囲のP ）が、わずかな
差が肝硬変患者（P ＝0.032 ）で見られ、有意な差が結腸ガン患者（P ＝0.000
）で見られた。まとめると、これらの結果は、結腸ガン患者コホートにおける抗
SENV-A抗体の存在の関連性を示していた。
【０３１９】 テーブル9 ELISA 試験で得られた血清学的データのχ2 検定による統計分析（
ウエルはSENV-Aの3 つのすべてのORF の混合物でコーティングされた）。
【０３２０】
【表１】 実施例27 SENV-AのORF2のエピトープマッピング 特定のアミノ酸配列の免疫学的な反応性領域を特定するために、Jerini BioTo
ols （Berlin、ドイツ）によって行われたPepscan 分析を用いた。タンパク質配
列を78個の重複するペプチドに分割した。これらのセグメントは、長さが13mer
であり、11アミノ酸の重複領域を有する。ペプチドの完全な集合体を、本明細書
下記に記載されている固相ペプチド合成法を使用して1 枚のセルロースメンブラ
ン上に作製した。その後、メンブランを、適切な反応性血清を含む溶液と接触さ
せた。発色工程の後、タンパク質の反応性領域を、メンブラン上の反応スポット
を検出することによって同定した。
【０３２１】 セルロース上でペプチド合成を行うための、Novabiochem （Bad Soden 、ドイ
ツ）およびBachem（Bubendoerf、スイス）から購入したアミノ酸は、9-フルオレ
ニルメトキシカルボニル（Fmoc）で保護されていた。下記の側鎖保護基を使用し
た：C 、H 、N およびQ にはトリチル；D 、E 、S およびT にはt-ブチル；K に
はt-ブトキシカルボニル；そしてR にはペンタメチルクロマンスルホニル。
【０３２２】 セルロースメンブランWathman540ペーパー（Maidstone 、英国）を使用した。
ジメチルホルムアミド（DMF ）、ジイソプロピルカルボジイミド（DCI ）、N-メ
チルイミダゾール（NMI ）、N-メチルピロリドン（NMP ）、メタノール、ジイソ
プロピルエチルアミン（DIPA）をFluka （Buchs 、スイス）から購入した。2-(1
H-ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムトラフルオロ
ボラート（TBTU）をNovabiochem から購入した。
【０３２３】 乾燥したペーパーシートを、その後のペプチド合成に好適なアンカー官能基を
導入するために化学修飾した。最初の工程において、メンブランを、（0.24M の
DIC および0.40M のNMI を含むDMF で活性化された）0.20M のFmoc- β- アラニ
ン溶液の12mlで、振とうすることなく3 時間処理し、セルロースのヒドロキシル
基に対して活性化β- アラニンをエステル化することによってアミノ官能基をさ
らに分布させた。
【０３２４】 DMF で、5 分間、3 回洗浄した後、Fmoc保護基を、20％ピペリジンを含むDMF
で20分間処理することによって切断した。メンブランをDMF （5 回）およびメタ
ノール（2 回）で洗浄して乾燥した。
【０３２５】 その後の工程において、0.5 μl 〜0.7 μl の0.3MのFmoc保護アミノ酸（0.3M
のTBTUで活性化、NMP において1 ：1 ）を、ガラスまたは金属のキャピラリーを
使用してメンブラン上の所定位置にスポットした（15分の反応時間）。残ってい
るアミノ官能基を、2 ％無水酢酸を含むDMF でメンブランの面を下向きにして2
分間処理し、その後、2 ％無水酢酸／1 ％DIPAを含むDMF で面を上向きにして30
分間処理することによってアセチル化した。その後、メンブランをDMF で4 回洗
浄し、Fmoc保護基を、20％のピペリジンを含むDMF で20分間処理することによっ
て除いた。メンブランをDMF で（5 回）洗浄し、次回の適切なFmocアミノ酸によ
るカップリング／脱保護工程を繰り返した。
【０３２６】 最後の工程を行った後、メンブランをDMF で4 回洗浄し、メタノールで2 回洗
浄して乾燥した。
【０３２７】 重複するペプチド、および陽性コントロールとして使用される組換えORF2 SEN
V-A 抗原でコーティングされたセルロースメンブランを80％メタノールで洗浄し
て、すべてのポリペプチドを固定した。その後、メンブランを、0.5 ％のカゼイ
ン、0.02％のProclin-300 および0.05g/mlのスクロースを含むPBS 緩衝液で室温
において1 時間ブロッキングし、使用するまで-20 ℃で保存した。
【０３２８】 エピトープマッピングアッセイを行うために、0.5 ％のカゼインを含むPBS で
1 ：5000希釈された抗ORF2 SENV-A 血清を振とうしながらメンブランと3 時間イ
ンキュベーションし、その後、溶液を吸引により除き、メンブランを洗浄緩衝液
（0.01g/mlのTween を含むTris緩衝生理食塩水）で、10分間、3 回洗浄した。洗
浄したメンブランを、12.24g/lのTrizma、84.4ml/lのHCl （1N）、8g/lのNaCl、
0.16g/l のKCl 、2ml/l のProclin 300 、40g/l のBSA 結晶を含む溶液（pH7.4
）で使用直前に調製され、0.5 ％のカゼインを含むPBS で1 ：10000 希釈された
ネズミモノクローナル抗体HP6017抗ヒトIgG-HRP 結合体成分で処理した。
【０３２９】 20mlの結合液を分注し、室温において1 時間±5 分間インキュベーションし、
その後、上記のように3 回リンスした。
【０３３０】 メンブランを透明なバッグに入れ、200 μl の発色体／基質（BM化学発光ブロ
ッティング基質（POD ）、Boehringer Mannheim ）を加え、バッグを閉め、反応
を1 分間行った。その後、液体を吸引し、メンブランを入れたバッグを暗所に置
き、写真感光板（Kodak Biomax）を35秒間かぶせた。感光板をGBX 発色剤（Sigm
a ＃108h1394）で2 分間洗浄し、続いて水でリンスし、攪拌しながら固定液（Si
gma ＃98h1050 ）で5 分間洗浄した。
【０３３１】 反応性は、ORF2組換えタンパク質（全長）で非常に強く、そして下記の配列に
対応するペプチド第61号、第62号、第63号および第64号で非常に強かった： ペプチド61 PQWPGANDNTNTR 配列番号139 ペプチド62 WPGANDNTNTRAP 配列番号140 ペプチド63 GANDNTNTRAPTA 配列番号141 ペプチド64 NDNTNTRAPTAGE 配列番号142 これらのペプチドの共通配列は、SENV-AのORF2タンパク質の線状エピトープに対
応するNDNTNTR （配列番号143 ）である。
【０３３２】 同じ手順を陰性血清（陰性コントロール）について使用したが、シグナルは得
られなかった。
【０３３３】 実施例28 SENV-AのORF2の変異分析 マッピングされたエピトープ内のいわゆる「鍵残基」を同定するために、変異
分析を行った。マッピングされたエピトープの各アミノ酸を、ペプチド結合性に
関する詳細な情報を得るために20個のすべてのL 型アミノ酸で置換した。これら
のペプチドを、実施例27に記載されているようにセルロースメンブラン上で合成
し、溶液中の抗体とインキュベーションすることができる。その後、結合した抗
体を、標準的な免疫アッセイ反応（実施例27の同じ手順）を使用してセルロース
メンブラン上で検出する。
【０３３４】 反応性は野生型エピトープのNDNTNTR （配列番号143 ）で非常に強かった。鍵
残基は、アミノ末端におけるアスパラギン、2 位におけるアスパラギン酸、およ
び3 位におけるアスパラギンであった。これらの残基は置換させることができな
い。
【０３３５】 4 位のT は、K およびF を除くアミノ酸のすべての組で置換することができる。
【０３３６】 5 位のN は、A 、F 、G 、K 、L 、M 、N 、F 、R 、S 、T 、Q 、V 、W 、Y で
置換することができる。
【０３３７】 6 位のT は、A 、C 、D 、E 、F 、R およびS で置換することができる。
【０３３８】 7 位のR は、D 、E 、K で置換することができる。
【０３３９】 実施例29 SENV-AのORF1のエピトープマッピング 実施例27の同じ手順をペプチド合成およびELISA 試験に使用した。
【０３４０】 反応性は、下記の配列に対応するペプチド第88号で非常に強かった： NKVIGFPMKGEEA （配列番号144 ） 陽性シグナルが、下記の配列に対応するペプチド第156 号、第157 号、第158
号でも得られた： ペプチド第156 号 RYNTQFRPAYYDV 配列番号145 ペプチド第157 号 NTQFRPAYYDVTY 配列番号146 ペプチド第158 号 QFRPAYYDVTYNP 配列番号147 共通配列はQFRPAYYDV （配列番号148 ）である。
【０３４１】 他の陽性シグナルが、下記の配列に対応するペプチド第262 号、第263 号から
得られた： ペプチド第262 号 FHKFDTRRGFYSS 配列番号149 ペプチド第263 号 KFDTRRGFYSSAS 配列番号150 共通配列はKFDTRRGFYSS （配列番号151 ）である。
【０３４２】 陽性シグナルが、下記の配列に対応するペプチド第235 号、第236 号、第237
号、第238 号で得られた： ペプチド第235 号 LCAMYSFKFLFGG 配列番号152 ペプチド第236 号 AMYSFKFLFGGDL 配列番号153 ペプチド第237 号 YSFKFLFGGDLLY 配列番号154 ペプチド第238 号 FKFLFGGDLLYPQ 配列番号155 共通配列はFKFLFGG （配列番号156 ）である。
【０３４３】 陽性シグナルが、下記の配列に対応するペプチド第206 号、第207 号で再び得
られた： ペプチド206 YVFYDTNFGNGKM 配列番号157 ペプチド207 FYDTNFGNGKMPS 配列番号158 共通配列はFYDTNFGNGKM （配列番号159 ）である。
【０３４４】 従って、SENV-AのORF1から得られる抗原の主要なエピトープは、 NKVIGFPMKGEEA （配列番号144 ） QFRPAYYDV （配列番号148 ） KFDTRRGFYSS （配列番号151 ） FKFLFGG （配列番号156 ） FYDTNFGNGKM （配列番号159 ） である。
【０３４５】 実施例30 SENV-DのORF2のエピトープマッピング 実施例27の同じ手順をペプチド合成およびELISA 試験に使用した。
【０３４６】 反応性は、下記の配列に対応するペプチド第43号、第44号、第45号、第46号、
第47号で非常に強かった： ペプチド43 SQPPTRPPSRLRP 配列番号160 ペプチド44 PPTRPPSRLRPLG 配列番号161 ペプチド45 TRPPSRLRPLGAL 配列番号162 ペプチド46 PPSRLRPLGALPA 配列番号163 ペプチド47 SRLRPLGALPAPP 配列番号164 共通配列はSRLRP （配列番号165 ）である。
【０３４７】 陽性反応性が、下記の配列に対応するペプチド第34号、第35号、第36号、第37
号、第38号で得られた： ペプチド34 NIATRFNYLPTAN 配列番号166 ペプチド35 ATRFNYLPTANPP 配列番号167 ペプチド36 RFNYLPTANPPVG 配列番号168 ペプチド37 NYLPTANPPVGPS 配列番号169 ペプチド38 LPTANPPVGPSQP 配列番号170 共通配列はLPTAN （配列番号171 ）である。
【０３４８】 従って、SENV-Dの主要なエピトープは、SRLRP （配列番号165 ）およびLPTAN
（配列番号171 ）である。
【０３４９】 実施例31 臨床サンプルのSENV-CおよびSENV-Eに特異的なPCR およびスクリーニングの開発 種々のSENVサブタイプの臨床的関係が得られたので、SENV-CおよびSENV-Eを選
択的に増幅および検出するための方法を開発した。最初に、すべての利用可能な
SENV配列を整列して、SENV-CおよびSENV-Eに対する特異的なプライマーおよび特
異的なプローブを同定した。
【０３５０】 5 名のSENV-A感染患者、5 名のSENV-B感染患者、5 名のSENV-C感染患者、5 名
のSENV-D感染患者および5 名のSENV-E感染患者から抽出されたDNA を、プライマ
ーSENV-C5S（配列番号172 ）およびプライマーL 2AS （配列番号71）を用いるPC
R により増幅した。PCR 反応を本明細書中上記に記載されているように行い、94
℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分および62℃で1 分および72℃で1 分の40サイ
クル、ならびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。
【０３５１】 増幅産物の特異性を確認するために、各増幅産物の5 μl 部分を、増幅物に対
する内部のビオチン化プローブNEW C Biot（配列番号173 ）を用いてDEIAアッセ
イにおいてハイブリダイズさせた。5 個のSENV-C患者サンプルだけが陽性の結果
をもたらし、それ以外のすべてのサンプルは陰性であった。このことは、このPC
R 法によりSENV-C配列が選択的に増幅されたことを示していた。
【０３５２】 さらに、5 名のSENV-A感染患者、5 名のSENV-B感染患者、5 名のSENV-C感染患
者、5 名のSENV-D感染患者および5 名のSENV-E感染患者から抽出されたDNA を、
プライマーEK2S（配列番号174 ）およびプライマーEK4AS （配列番号175 ）を用
いてPCR により増幅した。PCR 反応を本明細書中上記に記載されているように再
び行い、94℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分および55℃で1 分および72℃で1
分の40サイクル、ならびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。
【０３５３】 増幅産物の特異性を確認するために、各増幅産物の5 μl 部分を、増幅物に対
する内部のビオチン化プローブNEW E Biot（配列番号176 ）を用いてDEIAアッセ
イにおいてハイブリダイズさせた。5 個のSENV-E患者サンプルだけが陽性の結果
をもたらし、これに対してそれ以外のすべてのサンプルは陰性であった。このこ
とは、この方法によりSENV-E配列が選択的に増幅されたことを示していた。
【０３５４】 SENVサブタイプを特異的に検出するこの方法論により、どのSENVサブタイプが
肝炎（特に、NANE肝炎）の伝染に特異的に関与しているかを解明するために、特
定の患者サンプルをスクリーニングすることが可能になった。従って、非常に選
択された血清を、本明細書中上記に記載された方法を使用して、SENVファミリー
の存在ならびにそれぞれの各サブタイプの存在について調べた。
【０３５５】 図62A には、健康な血液供与者（60名のイタリア人および20名の米国市民）、
HIV+の静脈注射薬常用者（IVDU）およびサラセミア患者における陽性サンプルの
割合が示されている。
【０３５６】 これらの結果は、SEN ウイルスが血液を介して伝染し得ること、しかし、大き
な差が種々のサブタイプ間に存在することを示している。例えば、SENV-Bが健康
な集団において非常に広く認められ、従って、このことは、SENV-Bは非病原性で
あると考えられることを示唆している。SENV-Aは、IVDUにおいて非常に広く認め
られ、サラセミア患者ではあまり認められない。理論によりとらわれないが、SE
NV-Aのこの異常な分布に対する1 つの考えられる解釈は、SENV-Aが、空気性因子
に対して、それ以外のSENVサブタイプよりも大きな耐性を有し得るということで
ある。
【０３５７】 図62B では、アルコール性肝炎罹患患者、米国の慢性NANE肝炎患者、および日
本の慢性NANE肝炎患者におけるSENV罹患率が比較されている。
【０３５８】 これらの結果は、SENV-CおよびSENV-Dが米国における少なくとも一部の慢性NA
NE肝炎の原因であり得ることを示している。興味深いことに、SENV-Cサブタイプ
は、日本の患者には全く存在していないようである。しかし、これらの日本の患
者では、非常に優勢なSENV-Dが検出され得る。日本の患者の1 人はSENV-Aにも同
時に感染していた。
【０３５９】 図62C には、輸血を受けることなく心臓手術を受けた患者、輸血を伴う心臓手
術を受け、かつ肝炎を発症していない患者、および1 回の輸血を受けた後に肝炎
を発症した患者におけるSENVの罹患率が比較されている。
【０３６０】 この結果は、SENV-CおよびSENV-Dが輸血後肝炎の伝染に関連していることを明
瞭に示している。
【０３６１】 まとめると、これらの結果はまた、SEN ウイルスファミリーは、構造的多様性
の点だけでなく、生物学的作用の点でも非常に不均一であることを示している。
SENV-DおよびSENV-Cは肝炎の伝染に関連しているようであるが、それ以外のサブ
タイプは、この病理には何ら役割を果たしていない。特に、SENV-Bは、正常な集
団において非常に広く認められるようである。理論によりとらわれることなく、
このことは、SENV-Bが病原的な役割を有していないと考えられることを示唆して
いる。
【０３６２】 輸血肝炎におけるSENV-CおよびSENV-Dの役割をさらに明らかにするために、多
数の疾患に罹っている患者から得られた多数のコントロール血清を調べた。図63
には、486 サンプルで得られた結果が示されている。この結果は、SENV-Cまたは
SENV-Dについて陽性な血清の累積割合を示している。SENV-DおよびSENV-Cが、NA
NE肝炎患者において大きな割合で選択的に見出されたが、他の疾患に感染してい
る患者では見出されなかった。この2 つのウイルスはまた、C 型肝炎またはB 型
肝炎に感染している患者において、小さいが、有意な割合で見出された。このこ
とは、SENV-CおよびSENV-Dの伝染経路が他の肝炎ウイルスの伝染経路と類似して
いることを示唆している。
【０３６３】 配列番号177 は、C5S （配列番号172 ）および2AS （配列番号71）のプライマ
ーで得られ、NANE患者血清で検出された広く認められるSENV-C配列に関し、上記
に記載されたSENV-C配列（配列番号75）に対して大きな類似性を示している。こ
の配列はSENV-Cと類似するが、いくつかのミスマッチが基準配列によって同定さ
れ、従って、SENV-Cに対するその関連は、その点で、依然として単に推定的であ
る。
【０３６４】 実施例32 SENV-F、SENV-GおよびSENV-Hの同定 SENVウイルスがリンパ球にも見出され得るかどうかを調べるために、精製され
たリンパ球から抽出されたDNA に対するPCR 反応を行った。これらのリンパ球は
、静脈注射薬常用者でHIV 陽性の4 名の患者から得られた。これらの患者は、VI
R 18、VIR 16、VIR 12およびVIR 10と識別された。その血清はSENV陽性であった
。
【０３６５】 PCR 反応のために、プライマーNEW BCD 1S（配列番号115 ）を、プライマーL
2AS （配列番号71）と組み合わせて使用した。PCR 反応を、前記（特に実施例9
を参照のこと）に記載されているように50μl のPCR 反応混合物に希釈された1
μg の単離されたリンパ球DNA に対して行った。PCR 反応を、ミネラルオイルを
用いてDNA サーマルサイクラーで行い、94℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分お
よび54℃で1 分および72℃で1 分の40サイクル、ならびに72℃で7 分間のインキ
ュベーションからなった。
【０３６６】 増幅産物の特異性を調べるために、各増幅産物の5 μl 部分を、保存配列に特
異的なSENV特異的プローブ（配列番号98）を用いて、前記に記載されたDEIAアッ
セイにおいてハイブリダイズさせた。4 つのサンプルはすべて陽性であった。こ
のことは、実際に、ヒトの末梢血細胞（PBL ）がSENVウイルスを保有しているこ
とを示唆している。これらのサンプルに存在するSENVサブタイプを同定するため
に、単離されたPBL のDNA を、実施例20および実施例31に記載されている方法を
使用して調べた。SENV-Bの存在は、実施例17に記載されている方法を使用して分
析した。VIR 18、VIR 16およびVIR 12は、それぞれ、SENV-A、SENV-DおよびSENV
-Cについて陽性の結果をもたらした。しかし、VIR 10は、既知のSENVサブタイプ
すべての存在について陰性の結果をもたらした。このことは、新しいウイルス単
離体の存在を示唆している。
【０３６７】 この新しいSEN ウイルスの完全な配列を得るために、2 つの異なるPCR 反応を
設定した。最初に、L 2AS （配列番号71）およびTTV15S（配列番号72）のプライ
マーを使用した。これらは、SENV-Dの利用可能な配列（配列番号53）およびTTV
配列の最も5'側の領域に由来した。第2 の反応において、プライマーNEW BCD 1S
（配列番号115 ）およびプライマー662AS （配列番号86）を使用した。
【０３６８】 PCR 反応を、本明細書中上記に記載されているように、鋳型を含む50μl の混
合物を用いて行った。PCR 反応を、ミネラルオイルを用いてDNA サーマルサイク
ラーで行い、94℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分および58℃で1 分および72℃
で1 分の45サイクル、ならびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。
この方法を使用して、約1350bpおよび1614bpの増幅物が得られた。
【０３６９】 増幅バンドに対応するゲル片を切りだし、抽出し、抽出物をpGEMベクター（Pr
omega 、Madison 、WI、米国）に連結し、さらに大腸菌に導入した。挿入物のDN
A 配列を、本明細書中上記に記載されているように決定した。
【０３７０】 5'領域および3'領域で重なるクローンがいくつか得られ、ASSEMLGEL プログラ
ムを用いて組み立てた。3 つの新しいSENVゲノムのすべてではない場合でも、そ
の大部分をコードする約3340塩基の3 つのユニーク配列が得られた。第1 の配列
をSENV-F（配列番号179 ）と名付けた。SENV-Fは、それぞれが、758 アミノ酸、
160 アミノ酸および182 アミノ酸（配列番号180 、配列番号181 および配列番号
182 ）の3 つのオープンリーディングフレーム（ORF1、ORF2およびORF3）を含む
。
【０３７１】 驚くべきことに、SEN-F のORF3は、平均して80アミノ酸を含むだけであるそれ
以外のSENVのORF3よりもはるかに長い（185 アミノ酸）。これは、それ以外のす
べての単離体に存在する2 つの連続したメチオニンの上流にメチオニンが存在す
るためである。
【０３７２】 これらのタンパク質と、それ以外のSENVおよびTTV のタンパク質との同一性の
割合を図64に示す。ヌクレオチドレベルにおいて、SENV-Fのゲノム全体と、SENV
-A、SENV-B、SENV-C、SENV-D、SENV-EおよびTTV のゲノム全体との同一性は、66
.23 、62.54 、63.54 、75.21 、61.66 および56.59 である。SENV-FのORF1、OR
F2およびORF3をコードするヌクレオチド配列（配列番号183 、配列番号184 およ
び配列番号185 ）と、SENV-A、SENV-B、SENV-C、SENV-D、SENV-EおよびTTV の相
同的な領域との同一性を図65に示す。最後に、SENV-Fのヌクレオチドコード領域
全体（配列番号186 ）と、TTV の対応する領域との同一性は、45.92 ％であるこ
とが見出された。まとめると、これらの結果は、SENV-FがSENVファミリーのさら
なるメンバーであり、そしてこのファミリー内で、SENV-Dに非常に近いようであ
ることを示している。
【０３７３】 第2 の配列をSENV-G（配列番号187 ）と名付けた。それ以外のすべてのSEN ウ
イルスのように、SENV-Gは、それぞれが、763 アミノ酸、146 アミノ酸および82
アミノ酸（配列番号188 、配列番号189 および190 ）の3 つのオープンリーディ
ングフレーム（ORF1、ORF2およびORF3）を含む。
【０３７４】 これらのタンパク質と、それ以外のSENVおよびTTV のタンパク質との同一性の
割合を図64に示す。ヌクレオチドレベルにおいて、SENV-Gのゲノム全体と、SENV
-A、SENV-B、SENV-C、SENV-D、SENV-E、SENV-FおよびTTV のゲノム全体との同一
性は、66.23 、62.54 、63.54 、75.21 、61.66 および56.59 であり、一方、SE
NV-Gのコード領域（配列番号191 ）とTTV のコード領域との同一性は43.27 ％で
ある。SENV-GのORF1、ORF2およびORF3をコードするヌクレオチド配列（配列番号
192 、配列番号193 および配列番号194 ）と、SENV-A、SENV-B、SENV-C、SENV-D
、SENV-E、SENV-FおよびTTV の相同的な領域との同一性を図65に示す。まとめる
と、これらの結果は、SENV-GがSENVファミリーのさらなるメンバーであり、そし
てこのファミリー内で、それ以外のすべてのSENVメンバーと等しく離れているよ
うであることを示している。
【０３７５】 第3 の配列をSENV-H（配列番号195 ）と名付けた。SENV-Hは、それぞれが、76
2 アミノ酸、156 アミノ酸および87アミノ酸（配列番号196 、配列番号197 およ
び198 ）の3 つのオープンリーディングフレーム（ORF1、ORF2およびORF3）を含
む。
【０３７６】 これらのタンパク質と、それ以外のSENVおよびTTV のタンパク質との同一性の
割合を図64に示す。ヌクレオチドレベルにおいて、SENV-Hのゲノム全体と、SENV
-A、SENV-B、SENV-C、SENV-D、SENV-E、SENV-F、SENV-GおよびTTV のゲノム全体
との同一性は、63.77 ％、59.87 ％、81.03 ％、60.89 ％、58.88 ％、59.72 ％
、62.00 ％および53.50 ％であり、一方、SENV-Hのコード領域（配列番号199 ）
とTTV のコード領域との同一性は48.97 ％である。SENV-HのORF1、ORF2およびOR
F3をコードするヌクレオチド配列（配列番号200 、配列番号201 および配列番号
202 ）と、SENV-A、SENV-B、SENV-C、SENV-D、SENV-E、SENV-F、SENV-GおよびTT
V の相同的な領域との同一性を図65に示す。これらの結果は、SENV-HがSENVファ
ミリーのさらなるメンバーであり、そしてこのファミリー内で、SENV-Cに非常に
近いようであることを示している。
【０３７７】 実施例33 SENVウイルス血症の持続性 SENVウイルス血症が一時的であるか、あるいは生涯にわたって持続し得るかど
うかを解明するために、高活性抗ウイルス療法（HAART ）に登録されている1 人
のHIV 患者を選び、血清サンプルを、HAART を開始したとき、その4 週間後、8
週間後、16週間後、24週間後、30週間後、32週間後および40週間後に集めた。HI
V ウイルス血症をAmplicore HIV 定量試験（Roche Diagnostics ）によってモニ
ターし、同時に、SENVウイルス血症を、プライマーNEW BCD 1S（配列番号115 ）
をプライマーL 2AS （配列番号71）と組み合わせて使用するPCR アッセイによっ
てモニターした。PCR 反応を、比較用鋳型、前記の患者から得られた100 μl の
血清から抽出されたDNA の1/10量を含む50μl の混合物を用い、本明細書中上記
に記載されているPCR 条件を用いて行った。反応を、ミネラルオイルを用いてDN
A サーマルサイクラーで行い、94℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分および54℃
で1 分および72℃で1 分の40サイクル、ならびに72℃で7 分間のインキュベーシ
ョンからなった。
【０３７８】 増幅産物の特異性を確認するために、各増幅産物の5 μl 部分を、保存配列に
特異的なSENV特異的プローブ（配列番号98）を用いてDEIAアッセイにおいてハイ
ブリダイズさせた。これらの研究の結果を図66に示す。HIV ウイルス血症は開始
時に極めて高かったが、HAART を開始した4 週間後では既に劇的に減少し始めて
おり、24週間目までにほぼ検出できなくなるまで連続的に低下し続けた。これに
対して、SENV血症もまた、開始時には非常に高かったが、HAART 処置によって影
響を受けなかった。従って、SENVは、慢性状態に至らせると考えられる持続的な
感染を誘導し得る。従って、これらの結果は、SENVがHIV 療法に対して不感性で
あることを明らかにしている。
【０３７９】 実施例34 末梢血リンパ球におけるSENVの検出 末梢血細胞を4 名のSENV陽性患者および4 名のSENV陰性患者からフィコール密
度勾配によって単離した。細胞を単離した後、細胞を繰り返し洗浄し、2x106 細
胞に由来するDNA を、QIAamp DNA血液キット（QIAGEN）を使用して単離した。
【０３８０】 SENVの存在を、プライマーNEW BCD 1S（配列番号115 ）をプライマーL 2AS （
配列番号71）と組み合わせて使用するPCR アッセイでモニターした。PCR 反応を
、実施例31に記載されているように行った。すなわち、本明細書中上記に記載さ
れているようにして得られた1 μg の出発DNA を50μl のPCR 反応緩衝液で希釈
した。反応を、ミネラルオイルを用いてDNA サーマルサイクラーで行い、94℃で
5 分間の予備加熱、94℃で1 分および54℃で1 分および72℃で1 分の40サイクル
、ならびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。
【０３８１】 増幅産物の特異性を確認するために、各増幅産物の5 μl 部分を、保存配列に
特異的なSENV特異的プローブ（配列番号98）を用いてDEIAアッセイにおいてハイ
ブリダイズさせた。
【０３８２】 図67に示されている結果は、SENV陽性患者の末梢血リンパ球はこのウイルスを
有することを明らかにしている。これらの細胞で検出されたウイルスが残留する
血液の汚染のためであるという可能性は、細胞が徹底的に洗浄されているために
ほとんど考えられない。
【０３８３】 実施例35 インビトロでのSENVの培養 末梢血細胞におけるSENVの存在は、ウイルスをインビトロで培養することがで
きるという可能性を大きくさせた。この可能性を調べるために、そして、末梢血
細胞におけるウイルスの存在は細胞膜におけるウイルスの単なる受動的な接着の
ためであるという可能性を除くために、末梢血細胞を、実施例34に記載されてい
るようにSENV陽性患者から単離した。細胞を、10％ウシ胎児血清（FCS ）が補充
されたRPMI1640培地（Life technologies ）の0.5x106/mlの開始密度の5ml で、
1 μg/mlのフィトアグルチニン（PHA ）の存在下で培養した。200 μl の上清を
、培養の1 日目、2 日目、3 日目、4 日目および5 日目に注意深く取り出した。
DNA を、遠心分離した上清部分から抽出し、プライマーNEW BCD 1S（配列番号11
5 ）をプライマーL 2AS （配列番号71）と組み合わせて使用して増幅した。PCR
反応を、本明細書中上記に記載されているように行った。PCR 反応を、ミネラル
オイルを用いてDNA サーマルサイクラーで行い、94℃で5 分間の予備加熱、94℃
で1 分および54℃で1 分および72℃で1 分の40サイクル、ならびに72℃で7 分間
のインキュベーションからなった。
【０３８４】 増幅産物の特異性を確認するために、各増幅産物の5 μl 部分を、保存配列に
特異的なSENV特異的プローブ（配列番号98）を用いてDEIAアッセイにおいてハイ
ブリダイズさせた。
【０３８５】 図68は、既に培養の1 日目において、SENVウイルスが細胞上清中に検出できる
こと、しかし、より重要なことに、ウイルスのレベルが、その後の3 日間の培養
の期間中、上清中に一定して増大したことを示している。培養の5 日目の上清に
認められるウイルスレベルの低下は、おそらくは死細胞の影響、ならびにプロテ
アーゼおよびDNアーゼのその後の放出を反映している。まとめると、これらの実
験により、ウイルスを、感染者から得られた細胞を培養することによってインビ
トロで得ることができることが明らかにされる。これにより、ウイルス抗原の供
給源として使用され得る大量のビリオンを得ることができる可能性が増大する。
【０３８６】 実施例36 肝臓組織におけるSENV RNAの検出 SEN ウイルスが肝臓で複製し得るかどうかを調べるために、肝ガンのために手
術を受けた2 名のSENV陽性患者を選んだ。RNA を、腫瘍周辺領域および臓器の形
質転換肝組織から得られた25mgの組織から、少し変更した製造者の説明書に従っ
てS.N.A.P.TM全RNA 単離キット（Invitrogen）を使用して抽出した。この変更は
、溶出された核酸を、製造者により示された10分間のインキュベーションを行う
代わりに、Rnアーゼを含まないDnアーゼで37℃で30分間インキュベーションする
ことからなった。
【０３８７】 溶出されたRNA （125 μl ）を、2 倍容量のエタノールおよび1/10量の酢酸ナ
トリウム（pH5.2 ；3M）を用いてー20 ℃で1 時間沈殿させた。ペレット化RNA を
500ul の75％エタノールで洗浄し、遠心分離し、Rnアーゼを含まない25ulの水に
再懸濁した。
【０３８８】 10μl のRNA を、SUPERSCRIPT TM II Rnアーゼ H逆転写酵素（Gibco BRL ）
および500ng のプライマーL3AS（配列番号42）を20ulの最終容量において使用し
て一本鎖DNA に逆転写した。5ul のcDNAおよび2.5ul のRNA （コントロールとし
て）を、プライマーNEW BCD 1S（配列番号115 ）をプライマーL 2AS （配列番号
71）と組み合わせて使用して増幅した。PCR 反応を、本明細書中上記に記載され
ている50mlのPCR 反応緩衝液に希釈された4 μl の単離cDNAに対して行った。PC
R 反応を、ミネラルオイルを用いてDNA サーマルサイクラーで行い、94℃で5 分
間の予備加熱、94℃で1 分および54℃で1 分および72℃で1 分の40サイクル、な
らびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。
【０３８９】 増幅産物の特異性を確認するために、各増幅産物の5 μl 部分を、保存配列に
特異的なSENV特異的プローブ（配列番号98）を用いてDEIAアッセイにおいてハイ
ブリダイズさせた。
【０３９０】 図69には、RNA ではなく、すべてのcDNAがSENVプライマーで特異的に増幅され
得ることが示されている。このことは、DNA ウイルスは複製時にRNA 中間体を有
しなければならないため、SEN ウイルスが肝臓で複製し得ることを明らかにして
いる。
【０３９１】 実施例37 SENV配列のDSMZ（Braunschweig、ドイツ）における寄託 SENV配列に対応する挿入物を含むプラスミドは、Deutsche Sammlung von Mikr
oorganismen und Zellkulturen（DSMZ）GmbH（German Collection of Microorga
nisms and Cell Cultures ）（Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweig、ド
イツ）に寄託されている。寄託は、ブダペスト条約に従って、1999年7 月28日（
DSM 12941 、DSM 12942 、DSM 12943 、DSM 12944 、DSM 12957 、DSM 12945 、
DSM 12958 、DSM 12946 、DSM 12947 、DSM 12950 、DSM 12951 、DSM 12952 、
DSM 12953 、DSM 12959 、DSM 12954 ）に、そして1999年10月13日（DSM 13092
、DSM 13093 、DSM 13094 、DSM 13095 、DSM 13096 、DSM 13097 、DSM 13098
）に行われた。
【０３９２】 （種々のSENVサブタイプの部分配列を表す）種々の挿入物を含む、pGEM-Teasy
ベクターで形質転換された大腸菌細菌XL1-blue（Sup E + 、Lac - 、hsdR17、re
cA1 、F'proAB 、Lac Ia 、Lac ZAM 1s）または pCRR 2.1-TOPOベクターで形質
転換された大腸菌TOP10 （TOPO TA クローニングキット、Invitrogen、Carlsbad
、CA、米国）を含む22個の「スタブ」（ガラス管内に細菌コロニーを含む固化寒
天）の複製物を寄託した。下記のスタブを寄託した： SENV-A： A1（寄託番号：DSM 12941 ）：挿入物は、塩基1813〜塩基2340の配列番号24の
527bp 断片である。
【０３９３】 A2（寄託番号：DSM 12942 ）：挿入物は、配列番号24の最も5'側の配列に対応
する1082bp断片（塩基1 〜塩基1082）である。
【０３９４】 A3（寄託番号：DSM 12943 ）：挿入物は、配列番号24の最も3'側の配列に対応
する1136bp断片（塩基2215〜塩基3350）である。
【０３９５】 A4（寄託番号：DSM 12944 ）：挿入物は、配列番号24の塩基1008から塩基2340
まで広がる1353bp断片である。
【０３９６】 A5（寄託番号：DSM 12957 ）：挿入物は、ORF1をコードする全配列を含む、塩
基850 から塩基3046まで広がる配列番号24の2196bp断片である。
【０３９７】 SENV-B： B1（寄託番号：DSM 12945 ）：挿入物は、配列番号34の最も5'側の配列に対応
する1798bp断片（塩基1 〜塩基1798）である。
【０３９８】 B2（寄託番号：DSM 12958 ）：挿入物は、配列番号34の最も3'側の配列に対応
する1563bp断片（塩基2056〜塩基3619）である。
【０３９９】 B3（寄託番号：DSM 12946 ）：挿入物は、配列番号34の塩基1042から塩基2190
まで広がる1148bp断片である。
【０４００】 SENV-C： C1（寄託番号：DSM 12947 ）：挿入物は、配列番号75の最も5'側の配列に対応
する1536bp断片（塩基1 〜塩基1536）である。
【０４０１】 C4（寄託番号：DSM 13092 ）：挿入物は、配列番号75の塩基576 から塩基2861
まで広がり、ORF1をコードする全配列を含む2285bp断片である。
【０４０２】 SENV-D： D1（寄託番号：DSM 12950 ）：挿入物は、配列番号87の最も5'側の配列に対応
する1798bp断片（塩基1 〜塩基1798）である。
【０４０３】 D2（寄託番号：DSM 12951 ）：挿入物は、配列番号87の最も3'側の配列に対応
する1714bp断片（塩基1550〜塩基3264）である。
【０４０４】 D3（寄託番号：DSM 12952 ）：挿入物は、配列番号87の塩基584 から塩基2846
まで広がり、ORF1をコードする全配列を含む2262bp断片である。
【０４０５】 SENV-E： E1（寄託番号：DSM 12953 ）：挿入物は、配列番号118 の最も5'側の配列に対
応する890bp 断片（塩基175 〜塩基1065）である。
【０４０６】 E2（寄託番号：DSM 12959 ）：挿入物は、配列番号118 の最も3'側の配列に対
応する2231bp断片（塩基1042〜塩基3273）である。
【０４０７】 E3（寄託番号：DSM 12954 ）：挿入物は、配列番号118 の最も5'側の配列に対
応する1358bp断片（塩基1 〜塩基1358）である。
【０４０８】 SENV-F： F1（寄託番号：DSM 13093 ）：挿入物は、配列番号179 の最も5'側の配列に対
応する1565bp断片（塩基1 〜塩基1565）である。
【０４０９】 F3（寄託番号：DSM 13094 ）：挿入物は、配列番号179 の最も3'側の配列に対
応する2054bp断片（塩基1286〜塩基3340）である。
【０４１０】 SENV-G： G2（寄託番号：DSM 13095 ）：挿入物は、配列番号187 の最も5'側の配列に対
応する1453bp断片（塩基1 〜塩基1453）である。
【０４１１】 G3（寄託番号：DSM 13096 ）：挿入物は、配列番号187 の最も3'側の配列に対
応する1936bp断片（塩基1313〜塩基3249）である。
【０４１２】 SENV-H： H2（寄託番号：DSM 13097 ）：挿入物は、配列番号195 の最も5'側の配列に対
応する1439bp断片（塩基1 〜塩基1439）である。
【０４１３】 H1（寄託番号：DSM 13098 ）：挿入物は、配列番号195 の最も3'側の配列に対
応する1957bp断片（塩基1275〜塩基3232）である。
【０４１４】 すべての寄託クローンのマップを図70に示す。
【０４１５】 実施例38 SENV-Gに特異的なPCR の開発 SENV-Gを選択的に増幅および検出する方法を開発した。このために、すべての
利用可能なSENV配列を整列して、SENV-Gについて特異的と考えられるプライマー
およびプローブを同定した。
【０４１６】 5 名のSENV-A感染患者、5 名のSENV-B感染患者、5 名のSENV-C感染患者、5 名
のSENV-D感染患者、5 名のSENV-E感染患者、および1 名のSENV-G感染患者から抽
出されたDNA を、プライマーVIR 17-1S （配列番号203 ）およびプライマーSENV
G-4AS （配列番号204 ）を用いてPCR により増幅した。本明細書中上記に記載さ
れているように、PCR 反応混合物における、血清から抽出されたDNA に対するPC
R 反応を、ミネラルオイルを用いてDNA サーマルサイクラーで行った。このPCR
は、94℃で5 分間の予備加熱、94℃で1 分および60℃で1 分および72℃で1 分の
40サイクル、ならびに72℃で7 分間のインキュベーションからなった。
【０４１７】 増幅産物の特異性を確認するために、各増幅産物の5 μl 部分を、特異的なビ
オチン化プローブ「G-Biot」（配列番号205 ）を用いて上記に記載されたDEIAア
ッセイにおいてハイブリダイズさせた。1 個のサンプル（SENV-G感染患者）だけ
が、このプローブを用いて陽性の結果をもたらした。それ以外のすべてのサンプ
ルは陰性であった。このことは、この方法によりSENV-G配列が選択的に増幅され
たことを示している。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1 は、示された患者の血清から抽出されたDNA を鋳型として使用してTTV-1
およびNG063 のプライマーを用いて得られたPCR 産物を示す。矢印は、得られた
バンドのサイズを示す。
【図２】 図2 は、TTV-1 およびNG063 のプライマーを用いてSEN 、37および28の患者か
ら得られた核酸配列の整列である。同一塩基はアステリスクにより示される。
【図３】 図3 は、TTV-1 およびNG063 のプライマーを用いて患者SEN および患者26から
得られた核酸配列の整列である。同一塩基は垂直線により示される。
【図４】 図4 は、TTV-1 およびNG063 のプライマーを用いて、SEN 、37、28および26の
患者から得られた翻訳配列の整列である。保存された残基はアステリスクにより
示される。
【図５】 図5 は、配列を伸長させるための遺伝子ウォーキングポリメラーゼ連鎖反応法
を示す。NG063 およびCWP のプライマーとともに、患者SEN および健康な血液供
与者の血清から抽出されたDNA を用いて得られたPCR 産物である。患者SEN から
抽出されたDNA を用いて得られた1200bpのバンドを矢印により示す。
【図６】 図6 は、TTV のORF1配列と患者SEN に由来する翻訳されたCWP SEN001配列との
整列である。同一残基は垂直線により示される。ギャップが、整列を最適化する
ために導入された。
【図７】 図7 は、患者SEN （サンプル1 ）および37名の健康な血液供与者（サンプル2
〜38）から得られたDNA を使用して3Sおよび2AS のプライマーを用いて得られた
PCR 産物のDNA 酵素免疫アッセイ（DEIA）分析を示す。10μl のPCR 産物をマイ
クロウエルプレートにおいてビオチン化プローブSEN37 とハイブリダイズさせ、
結合した物質を、比色測定法を用いて上記のように明らかにした。
【図８】 図8 は、41名の静脈注射薬常用者患者から得られたDNA を使用して3Sおよび2A
S のプライマーを用いて得られたPCR 産物のDNA 酵素免疫アッセイ（DEIA）分析
を示す。10μl のPCR 産物をマイクロウエルプレートにおいてビオチン化プロー
ブSEN37 とハイブリダイズさせ、結合した物質を、比色測定法を用いて上記のよ
うに明らかにした。
【図９】 図9 は、病因が不明な肝炎に罹っている4 名の患者から2AS および3Sのプライ
マーを用いたPCR により得られた配列NAE8-1、NAE35-5 、NAE9-3およびNAE10-4
の整列を示す。
【図１０】 図10は、配列CWPSEN001 および配列NAE8-1の整列を示す。同一ヌクレオチド
は垂直線により示される。
【図１１】 図11は、配列CWPSEN001 および配列NAE9-3の整列を示す。同一ヌクレオチド
は垂直線により示される。
【図１２】 図12は、配列CWPSEN001 および配列NAE10-4 の整列を示す。同一ヌクレオチド
は垂直線により示される。
【図１３】 図13は、配列CWPSEN001 および配列NAE35-5 の整列を示す。同一ヌクレオチド
は垂直線により示される。
【図１４】 図14は、CWPSEN001 およびSENV-Bのヌクレオチド配列の整列を示す。同一ヌク
レオチドは垂直線により示される。
【図１５】 図15は、CWPSEN001 およびSENV-Bの推定されるアミノ酸配列の整列を示す。同
一残基は垂直線により示される。
【図１６】 図16は、TTV のORF1およびSENVのORF1の推定されるアミノ酸配列の整列を示す
。同一残基は垂直線により示される。
【図１７】 図17は、SENV-Aのヌクレオチド配列ならびにその翻訳および3 つの読み枠を示
す。
【図１８】 図18は、SENV-AおよびTTV1のヌクレオチド配列の整列を示す。同一ヌクレオチ
ドは垂直線により示される。
【図１９】 図19は、SENV-AおよびTTV1の主要なORF によるヌクレオチド配列の整列を示す
。同一ヌクレオチドは垂直線により示される。
【図２０】 図20は、TTV 配列およびSENV-A配列の主要なコード領域によってコードされる
予想アミノ酸配列の整列を示す。同一残基は垂直線により示される。
【図２１】 図21は、TTV のORF2およびSENV-AのORF2の推定されるタンパク質配列の整列を
示す。同一残基は垂直線により示される。
【図２２】 図22は、SENV-AおよびSENV-Bをコードするヌクレオチド配列の整列を示す。太
字は、3 つの異なるオープンリーディングフレーム（ORF ）の開始コドンおよび
終結コドンを示す。
【図２３】 図23は、SENV-AおよびSENV-Bの推定されるORF1タンパク質配列の整列を示す。
【図２４】 図24は、SENV-BおよびTTV の推定されるORF1タンパク質配列の整列を示す。
【図２５】 図25は、SENV-AおよびSENV-Bの推定されるORF2タンパク質配列の整列を示す。
【図２６】 図26は、SENV-AおよびSENV-Bの推定されるORF3タンパク質配列の整列を示す。
【図２７】 図27は、SENV-AおよびSENV-B（のORF1領域）をコードするヌクレオチド配列の
整列を示す。
【図２８】 図28は、SENV-AおよびSENV-B（のORF2領域）をコードするヌクレオチド配列の
整列を示す。
【図２９】 図29は、TTV およびSENV-B（のORF1領域）をコードするヌクレオチド配列の整
列を示す。
【図３０】 図30は、TTV およびSENV-B（のORF2領域）をコードするヌクレオチド配列の整
列を示す。
【図３１】 図31は、L1S およびL3ASのプライマーを用いて増幅されたDNA 断片によってコ
ードされる推定タンパク質配列の整列を示す。保存されたアミノ酸はアステリス
クにより示される。
【図３２】 図32は、L1A およびL3ASのプライマーを用いて増幅されたDNA 断片によってコ
ードされる推定タンパク質配列の整列から得られる無根系統樹を示す。TTV およ
びSENV-Aの最も相同的な領域ならびにHGV に由来するランダムな配列が分析に含
まれる。
【図３３】 図33は、SENV-AおよびSENV-Cの推定されるORF1タンパク質配列の整列を示す。
【図３４】 図34は、SENV-BおよびSENV-Cの推定されるORF1タンパク質配列の整列を示す。
【図３５】 図35は、SENV-CおよびTTV の推定されるORF1タンパク質配列の整列を示す。
【図３６】 図36は、SENV-CおよびSENV-Aの推定されるORF2タンパク質配列の整列を示す。
【図３７】 図37は、SENV-CおよびSENV-Bの推定されるORF2タンパク質配列の整列を示す。
【図３８】 図38は、SENV-CおよびTTV の推定されるORF2タンパク質配列の整列を示す。
【図３９】 図39は、SENV-CおよびSENV-Aの推定されるORF3タンパク質配列の整列を示す。
【図４０】 図40は、SENV-CおよびSENV-Bの推定されるORF3タンパク質配列の整列を示す。
【図４１】 図41は、SENV-CおよびSENV-A（のORF1領域）をコードするヌクレオチド配列の
整列を示す。
【図４２】 図42は、SENV-CおよびSENV-B（のORF1領域）をコードするヌクレオチド配列の
整列を示す。
【図４３】 図43は、TTV およびSENV-C（のORF1領域）をコードするヌクレオチド配列の整
列を示す。
【図４４】 図44は、SENV-CおよびSENV-AをコードするORF2ヌクレオチド配列の整列を示す
。
【図４５】 図45は、SENV-CおよびSENV-BをコードするORF2ヌクレオチド配列の整列を示す
。
【図４６】 図46は、SENV-CおよびTTV をコードするORF2ヌクレオチド配列の整列を示す。
【図４７】 図47は、SENV-CおよびSENV-AをコードするORF3ヌクレオチド配列の整列を示す
。
【図４８】 図48は、SENV-CおよびSENV-BをコードするORF3ヌクレオチド配列の整列を示す
。
【図４９】 図49は、示された配列間のヌクレオチド同一性割合の分析を示す。
【図５０】 図50は、示された配列間のアミノ酸同一性割合の分析を示す。
【図５１】 図51は、示されたアミノ酸配列の整列に基づいて計算された系統発生的距離を
示す。
【図５２】 図52は、SENV-A、SENV-B、SENV-CおよびTTV の推定されるORF1タンパク質配列
の整列に由来する無根系統樹を示す。
【図５３】 図53は、臨床サンプルにおけるSENVの存在を示す。
【図５４】 図54は、示された臨床サンプルから抽出され、SENVに特異的なプライマーで増
幅されたDNA を用いて得られた吸光度値を示す。
【図５５】 図55は、種々のSENV-ORF1 タンパク質配列について計算された系統発生的距離
を示す。
【図５６】 図56は、種々の患者群のSENV-A陽性サンプルの割合を示す。括弧内の数字は、
各群について分析された患者数を示す。
【図５７】 図57は、種々の患者群のSENV-B陽性サンプルの割合を示す。括弧内の数字は、
各群について分析された患者数を示す。
【図５８】 図58は、種々の患者群のSENV-C陽性サンプルの割合を示す。括弧内の数字は、
各群について分析された患者数を示す。
【図５９】 図59は、種々の患者群のSENV-D陽性サンプルの割合を示す。括弧内の数字は、
各群について分析された患者数を示す。
【図６０】 図60は、SENV-A、SENV-B、SENV-CまたはSENV-Dのいずれかについて陽性である
血清サンプルから抽出されたDNA を、反応1 、反応2 または反応3 を用いて調べ
た（3 つの異なる反応の詳細な情報については実施例20を参照のこと）。結果は
、DEIAアッセイの吸光度として表されている。陽性の値が太字で示されている。
【図６１】 図61は、SENV-Aの組換えORF2タンパク質（分子量：30k ）のウエスタンブロッ
トを示す。血清番号2174を用いたウエスタンブロット（1:100 希釈）、トレーサ
ー抗ヒトIgG-HRP （1:500 希釈）。 レーン1 ：低分子量マーカー；レーン2 ：負荷ORF2；レーン3 ：素通り画分；レ
ーン4 ：4 〜11のプール画分；レーン5 ：19〜25のプール画分；レーン6 ：33〜
39のプール画分；レーン7 ：48〜54のプール画分；レーン8 ：61〜64のプール画
分。
【図６２】 図62は、種々の示された患者コホート間の異なるSENVサブタイプの罹患率を示
す。
【図６３】 図63は、示された患者コホート間のSENV-CサブタイプおよびSENV-Dサブタイプ
の累積罹患率を示す。
【図６４】 図64は、種々のORF のアミノ酸レベルにおける同一性割合の比較分析を示す。
整列は、下記のパラメーターを使用するPCGENEパッケージのPALIGNプログラムを
使用して得られた：Open Gap Cost ：10およびUnit Gap Cost ：2 。
【図６５】 図65は、種々のORF のヌクレオチドレベルにおける同一性割合の比較分析を示
す。整列は、下記のパラメーターを使用するPCGENEパッケージのPALIGNプログラ
ムを使用して得られた：Open Gap Cost ：100 およびUnit Gap Cost ：10。
【図６６】 図66は、HAART 治療を受けている患者におけるHIV およびSENVのウイルス血症
の検出を示す。HIV ウイルス血症（四角）はビリオン数/ml として示され、SENV
ウイルス血症（ドット）は吸光度値として示されている。
【図６７】 図67は、4 名の陽性患者（右側の棒、「+ 」を付ける）および4 名の陰性患者
（左側の棒、「- 」を付ける）の末梢血細胞におけるSENVの検出を示す。結果は
吸光度値として示されている。
【図６８】 図68は、PBC 培養上清におけるSENVの検出を示す。SENV陽性患者から得られた
PBC をPHA の存在下で5 日間培養した。上清画分を、示された日数で採取して、
SEN の存在について試験した。結果は吸光度値として示されている。
【図６９】 図69は、肝組織におけるSENV RNAの検出を示す。2 名の肝細胞ガン患者から得
られた新生物（TT）および腫瘍周辺（TS）の外科的肝組織に由来するRNA および
cDNAを使用してSENVプライマーで得られたPCR 産物の反応性を示す。
【図７０】 図70は、DSMZ（Mascheroder Weg 1b、D-38124 Braunschweig、ドイツ）に寄託
されたクローンのマップを示す。太線は、TTV ウイルスおよびすべてのSEN ウイ
ルスの間で保存されている非コードヌクレオチド配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 31/12 ４Ｃ０８４ 29/00 35/00 ４Ｃ０８５ 31/12 Ｃ０７Ｋ 14/005 ４Ｃ０８７ 35/00 16/08 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/005 19/00 16/08 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 7/00 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 7/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/53 Ｄ 21/08 Ｍ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/536 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/536 Ｃ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｂ (31)優先権主張番号 ９９８３０２９８．８ (32)優先日 平成11年５月14日(1999．5．14) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (31)優先権主張番号 ９９１１３９３２．０ (32)優先日 平成11年７月16日(1999．7．16) (33)優先権主張国 欧州特許庁（ＥＰ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 マンテロ ジョヴァンニ ロレンゾ イタリア国 （ブレッシャ）ミルザノ 25020、ヴィア ヴェスコヴァド ７／ジ ー (72)発明者 マッチオリ ソニア イタリア国 ブレッシャ 25126、ヴィア ミラノ ２／ビー (72)発明者 ソッチーニ アレッサンドラ イタリア国 ブレッシャ 25121、ヴィア カッレガリ 17 (72)発明者 ボネッリ ファブリツィオ イタリア国 （アレッサンドリア）カサー レ エム．ティーオー 15033、ヴィア ムッソ ２ (72)発明者 ヴァグリニ ラウラ イタリア国 （トリノ）キエリ 10023、 ヴィア グラン サッソ ２ (72)発明者 オリヴェロ パオロ イタリア国 トリノ 10126、ヴィア フ ィナルマリナ ９／ビス (72)発明者 ダル コルソ アンドレア イタリア国 （トリノ）ピネロロ 10064、 ヴィア ラヴィオロ ８ (72)発明者 ボネッリ マルコ イタリア国 トリノ 10141、シー．エス オー ロッセッリ 155／ディー Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB20 BB50 CA26 CB04 CB07 FB02 FB03 4B024 AA01 AA14 BA33 BA51 BA80 CA02 CA07 CA09 CA12 CA20 DA02 DA06 EA02 EA04 GA03 GA11 GA19 HA03 HA13 HA14 HA19 HA20 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ03 QQ10 QQ42 QQ52 QQ79 QQ96 QR08 QR32 QR35 QR39 QR42 QR48 QR56 QR62 QS16 QS25 QS32 QS33 QS34 QX02 QX07 QX10 4B064 AG01 AG27 CA02 CA10 CA19 CA20 CC01 CC24 CE12 DA01 DA13 4B065 AA01X AA26X AA58X AA72X AA87X AA96X AA96Y AB01 AB05 AC14 BA01 BA08 BC01 BC03 BC26 BD01 BD14 BD15 BD16 CA24 CA25 CA44 CA45 CA46 4C084 AA02 AA03 AA06 AA07 AA13 BA01 BA02 BA22 CA53 NA14 ZA752 ZB112 ZB262 ZB332 4C085 AA14 DD62 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 CA12 NA14 ZA66 ZA75 ZB11 ZB26 ZB33 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 BA60 BA70 BA71 CA02 DA50 DA75 DA76 EA20 EA50 FA20 FA71 FA72 FA74 GA01 GA15 GA26

Claims (60)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ウイルス／ウイルス因子のゲノムを表す核酸分子であって、
    以下の特徴の少なくとも1 つを有する核酸分子： (a) (aa)配列番号：21、配列番号：25、配列番号：27、配列番号：29、配列番号
    ：35、配列番号：36、配列番号：37、配列番号：80、配列番号：82、配列番号：
    83、配列番号：91、配列番号：92、配列番号：93、配列番号：123 、配列番号：
    124 、配列番号：180 、配列番号：182 、配列番号：189 、配列番号：190 、配
    列番号：196 、配列番号：197 、配列番号：198 もしくは、 (ab)配列番号：81、配列番号：122 、配列番号：181 、配列番号：188 のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする少なくとも1 つのORF を含む
    核酸分子； (b) 配列番号：2 、配列番号：4 、配列番号：5 、配列番号：6 、配列番号：
    8 、配列番号：9 、配列番号：14、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17
    、配列番号：20、配列番号：24、配列番号：26、配列番号：28、配列番号：30、
    配列番号：31、配列番号：34、配列番号：38、配列番号：39、配列番号：40、配
    列番号：43、配列番号：44、配列番号：45、配列番号：46、配列番号：47、配列
    番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配列番号：52、配列番
    号：53、配列番号：54、配列番号：55、配列番号：56、配列番号：75、配列番号
    ：76、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：87、配列番号：
    88、配列番号：89、配列番号：90、配列番号：94、配列番号：95、配列番号：96
    、配列番号：116 、配列番号：117 、配列番号：118 、配列番号：119 、配列番
    号：120 、配列番号：121 、配列番号：125 、配列番号：177 、配列番号：179
    、配列番号：183 、配列番号：184 、配列番号：185 ，配列番号：186 、配列番
    号：187 、配列番号：191 、配列番号：192 、配列番号：193 、配列番号：194
    、配列番号：195 、配列番号：199 、配列番号：200 、配列番号：201 もしくは
    配列番号：202 のＤＮＡ配列を含有する核酸分子； (c) 配列番号：26、配列番号：94、配列番号：95、配列番号：96もしくは配列
    番号：125 、配列番号：186 、配列番号：191 、配列番号：199 の核酸分子の相
    補鎖に（ストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズする少なくとも80ヌクレ
    オチド、好ましくは100 ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも500 ヌクレオ
    チド、および最も好ましくは少なくとも2000ヌクレオチドの部分を含有する核酸
    分子； (d) 前記c)の核酸分子に関しては縮重しているが、TTウイルスのゲノムの相補
    鎖とはハイブリダイズしない核酸分子； (e) 配列番号：26、配列番号：94、配列番号：95、配列番号：96、配列番号：
    125 、配列番号：186 、配列番号：191 、配列番号：199 の核酸分子とは少なく
    とも50％、好ましくは少なくとも60％、およびより好ましくは少なくとも70％同
    一、配列番号：24、配列番号：34、配列番号：75、配列番号：87、配列番号：11
    8 もしくは配列番号：179 、配列番号：187 、配列番号：195 の核酸分子とは少
    なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、およびより好ましくは少なくとも80
    ％同一である核酸分子、 配列番号：28、配列番号：39、配列番号：89、配列番号：184 もしくは配列番号
    ：193 の核酸分子とは少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、およびより
    好ましくは少なくとも75％同一である、配列番号：77、配列番号：120 、配列番
    号：177 もしくは配列番号：201 の核酸分子とは少なくとも60％、好ましくは少
    なくとも70％、およびより好ましくは少なくとも75％同一である、配列番号：30
    、配列番号：40、配列番号：78、配列番号：90、配列番号：121 、配列番号：18
    5 、配列番号：194 もしくは配列番号：202 の核酸分子とは少なくとも50％、好
    ましくは少なくとも60％、およびより好ましくは少なくとも75％同一である、配
    列番号：79の核酸分子とは少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、および
    より好ましくは少なくとも75％同一である、または配列番号：31、配列番号：38
    、配列番号：76、配列番号：88、配列番号：119 、配列番号：183 、配列番号：
    192 もしくは配列番号：200 の核酸分子とは少なくとも50％、好ましくは少なく
    とも60％、およびより好ましくは少なくとも75％同一であるORF またはその断片
    を含む核酸分子、または 配列番号：21、配列番号：25、配列番号：27、配列番号：29、配列番号：35、配
    列番号：36、配列番号：37、配列番号：57、配列番号：58、配列番号：59、配列
    番号：60、配列番号：61、配列番号：62、配列番号：63、配列番号：64、配列番
    号：65、配列番号：66、配列番号：67、配列番号：68、配列番号：69、配列番号
    ：70、配列番号：80、配列番号：82、配列番号：83、配列番号：91、配列番号：
    92、配列番号：93、配列番号：123 、配列番号：124 、配列番号：180 、配列番
    号：182 、配列番号：189 、配列番号：190 、配列番号：196 、配列番号：197
    もしくは配列番号：198 とは少なくとも35％、好ましくは少なくとも40％、より
    好ましくは少なくとも50％、および最も好ましくは少なくとも75％同一であるア
    ミノ酸配列をコードする核酸分子を含有する核酸分子である核酸分子、または 配列番号：81、配列番号：122 、配列番号：181 もしくは配列番号：188 とは少
    なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、および最も好ましくは少なくとも75
    ％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸分子である核酸分子； (f) 配列番号：41と配列番号：42に規定される、および／または配列番号：11
    5 と配列番号：71に規定される、または配列番号：11、配列番号：12、配列番号
    ：13、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：22、配列番号：23、配列番号：
    32、配列番号：73、配列番号：84、配列番号：85、配列番号：97、配列番号：98
    、配列番号：99、配列番号：100 、配列番号：101 、配列番号：102 、配列番号
    ：126 、配列番号：127 、配列番号：128 、配列番号：129 、配列番号：130 、
    配列番号：131 、配列番号：132 、配列番号：135 、配列番号：136 、配列番号
    ：172 、配列番号：173 、配列番号：174 、配列番号：175 、配列番号：176 も
    しくは配列番号：203 、配列番号：204 もしくは配列番号：205 に規定されるオ
    リゴヌクレオチドまたはそのようなオリゴヌクレオチドの相補鎖をプライマーと
    して用いるPCR により適する条件下で増幅可能な核酸分子の一部；ならびに (g) 挿入、置換、欠失、逆位、重複、組換え、付加もしくはそれらの組合せに
    より前記分子のいずれかから生じる核酸分子。
  2. 【請求項２】 ウイルス（ポリ）ペプチドまたはその断片をコードする核酸
    分子であって、前記核酸分子は、 (a) 配列番号：21、配列番号：25、配列番号：27、配列番号：29、配列番号：
    35、配列番号：36、配列番号：37、配列番号：80、配列番号：81、配列番号：82
    、配列番号：83、配列番号：91、配列番号：92、配列番号：93、配列番号：122
    、配列番号：123 、配列番号：124 、配列番号：180 、配列番号：181 、配列番
    号：182 、配列番号：188 、配列番号：189 、配列番号：190 、配列番号：196
    、配列番号：197 もしくは配列番号：198 のアミノ酸配列またはその少なくとも
    6 アミノ酸の断片を有するポリペプチドをコードする少なくとも1 つのORF を含
    む； (b) 配列番号：14、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：
    20、配列番号：26、配列番号：28、配列番号：30、配列番号：31、配列番号：38
    、配列番号：39、配列番号：40、配列番号：43、配列番号：44，配列番号：45、
    配列番号：46、配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配
    列番号：51、配列番号：52、配列番号：53、配列番号：54、配列番号：55、配列
    番号：56、配列番号：76、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番
    号：87、配列番号：88、配列番号：89、配列番号：90、配列番号：94、配列番号
    ：95、配列番号：96、配列番号：119 、配列番号：120 、配列番号：121 、配列
    番号：125 、配列番号：177 、配列番号：179 、配列番号：183 、配列番号：18
    4 、配列番号：185 、配列番号：186 、配列番号：187 、配列番号：191 、配列
    番号：192 、配列番号：193 、配列番号：194 、配列番号：195 、配列番号：19
    9 、配列番号：200 、配列番号：201 もしくは配列番号：202 に同定された配列
    またはその少なくとも12ヌクレオチドの断片を有する； (c) 配列番号：24、配列番号：34、配列番号：75、配列番号：87、配列番号：
    118 、配列番号：179 、配列番号：187 もしくは配列番号：195 に同定された配
    列を有する； (d) 配列番号：14、配列番号：15、配列番号：16、配列番号：17、配列番号：
    20、配列番号：28、配列番号：30、配列番号：31、配列番号：38、配列番号：39
    、配列番号：40、配列番号：43、配列番号：44，配列番号：45、配列番号：46、
    配列番号：47、配列番号：48、配列番号：49、配列番号：50、配列番号：51、配
    列番号：52、配列番号：53、配列番号：54、配列番号：55、配列番号：56、配列
    番号：76、配列番号：77、配列番号：78、配列番号：79、配列番号：87、配列番
    号：88、配列番号：89、配列番号：90、配列番号：94、配列番号：95、配列番号
    ：96、配列番号：119 、配列番号：120 、配列番号：121 、配列番号：125 、配
    列番号：177 、配列番号：179 、配列番号：183 、配列番号：184 、配列番号：
    185 、配列番号：186 、配列番号：187 、配列番号：191 、配列番号：192 、配
    列番号：193 、配列番号：194 、配列番号：195 、配列番号：199 、配列番号：
    200 、配列番号：201 もしくは配列番号：202 の核酸分子の相補鎖にストリンジ
    ェントな条件下でハイブリダイズする； (e) 前記(d) の核酸分子に関しては縮重しているが、TTV ORF1および／または
    TTV ORF2をコードするTTウイルスのゲノムの相補鎖とはハイブリダイズしない； (f) 配列番号：21、配列番号：25、配列番号：27、配列番号：29、配列番号：
    35、配列番号：36、配列番号：37、配列番号：80、配列番号：82、配列番号：83
    、配列番号：91、配列番号：92、配列番号：93、配列番号：123 、配列番号：12
    4 もしくは配列番号：180 、配列番号：182 、配列番号：189 、配列番号：190
    、配列番号：196 、配列番号：197 、配列番号：198 とは少なくとも35％、好ま
    しくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、および最も好ましくは
    少なくとも75％同一であるポリペプチドをコードする、または、配列番号：81、
    配列番号：122 、配列番号：181 もしくは配列番号：188 とは少なくとも40％、
    好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、および最も好まし
    くは少なくとも75％同一であるポリペプチドをコードする； (g) 前記(b) に規定される配列とは少なくとも50％、好ましくは少なくとも60
    ％、より好ましくは少なくとも75％、および最も好ましくは少なくとも90％同一
    である、もしくは 前記(c) に規定される配列とは少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、よ
    り好ましくは少なくとも80％、および最も好ましくは少なくとも90％同一である
    ；または (h) 挿入、置換、欠失、逆位、重複、組換え、付加もしくはそれらの組合せに
    より前記分子のいずれかにより生じる；または (i) その一部は、配列番号：41と配列番号：42に規定される、および／または
    配列番号：115 と配列番号：71に規定される、または配列番号：11、配列番号：
    12、配列番号：13、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：22、配列番号：23
    、配列番号：32、配列番号：73、配列番号：84、配列番号：85、配列番号：97、
    配列番号：98、配列番号：99、配列番号：100 、配列番号：101 、配列番号：10
    2 、配列番号：126 、配列番号：127 、配列番号：128 、配列番号：129 、配列
    番号：130 、配列番号：131 、配列番号：132 、配列番号：135 、配列番号：13
    6 、配列番号：172 、配列番号：173 、配列番号：174 、配列番号：175 、配列
    番号：176 もしくは配列番号：203 、配列番号：204 もしくは配列番号：205 に
    規定されるオリゴヌクレオチドまたはそのようなオリゴヌクレオチドの相補鎖を
    プライマーとして用いるPCR により適する条件下で増幅することができる。
  3. 【請求項３】 前記配列番号：26、配列番号：94、配列番号：95、配列番号
    ：96、配列番号：125 、配列番号：186 、配列番号：191 もしくは配列番号：19
    9 の核酸配列を有する核酸分子の相補鎖もしくは前記核酸分子に特異的にハイブ
    リダイズする、または前記核酸分子もしくは前記その相補鎖と同一な核酸分子で
    あって、少なくとも12ヌクレオチドを含有する核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記断片が少なくとも18ヌクレオチドを含有する請求項３に
    記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記断片が少なくとも21ヌクレオチドを含有する請求項４に
    記載の核酸分子。
  6. 【請求項６】 前記断片が少なくとも25ヌクレオチドを含有する請求項５に
    記載の核酸分子。
  7. 【請求項７】 前記断片がSEN ウイルスに特異的な抗体と反応するエピトー
    プをコードする請求項３〜６いずれかに記載の核酸分子。
  8. 【請求項８】 プライマーまたはプローブである請求項１〜７いずれかに記
    載の核酸分子。
  9. 【請求項９】 前記プライマーまたはプローブが配列番号：11、配列番号：
    12、配列番号：13、配列番号：18、配列番号：19、配列番号：22、配列番号：23
    、配列番号：32、配列番号：41、配列番号：42、配列番号：71、配列番号：73、
    配列番号：84、配列番号：85、配列番号：97、配列番号：98、配列番号：99、配
    列番号：100 、配列番号：101 、配列番号：102 、配列番号：115 、配列番号：
    126 、配列番号：127 、配列番号：128 、配列番号：129 、配列番号：130 、配
    列番号：131 、配列番号：132 、配列番号：135 、配列番号：136 、もしくは配
    列番号：172 、配列番号：173 、配列番号：174 、配列番号：175 、配列番号：
    176 もしくは配列番号：203 、配列番号：204 もしくは配列番号：205 の配列を
    有する請求項８に記載の核酸分子。
  10. 【請求項１０】 DNA またはRNA である請求項１〜８いずれかに記載の核酸
    分子。
  11. 【請求項１１】 cDNAである請求項１０に記載の核酸分子。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜１１いずれかに記載の核酸分子を含有するベク
    ター。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載のベクターでトランスフェクトされたま
    たは形質転換された宿主細胞。
  14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の宿主細胞を適当な条件下で培養する工
    程および前記培養物から製造された（ポリ）ペプチドを単離する工程を含む、請
    求項１〜１１いずれかに記載の核酸分子によりコードされる（ポリ）ペプチドの
    製造方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜１１いずれかに記載の核酸分子によりコードさ
    れるまたは請求項１４に記載の方法により製造される（ポリ）ペプチド。
  16. 【請求項１６】 請求項１に記載の核酸分子により示されるゲノムを保有す
    るウイルスまたはウイルス因子。
  17. 【請求項１７】 少なくとも3 つのORF を含有するゲノム配列を有するウイ
    ルスまたはウイルス因子であって、前記ゲノム配列の一部は、配列番号：41と配
    列番号：42、配列番号：115 と配列番号：71、配列番号：126 と配列番号：127
    、配列番号：128 と配列番号：71、配列番号：172 と配列番号：171 、配列番号
    ：174 と配列番号：175 に規定される、または配列番号：203 と配列番号：204
    に規定される、または配列番号：11、配列番号：12、配列番号：13、配列番号：
    18、配列番号：19、配列番号：22、配列番号：23、配列番号：32、配列番号：73
    、配列番号：84、配列番号：85、配列番号：97、配列番号：98、配列番号：99、
    配列番号：100 、配列番号：101 、配列番号：102 、配列番号：129 、配列番号
    ：130 、配列番号：131 、配列番号：132 、配列番号：135 、配列番号：136 、
    配列番号：173 、配列番号：176 もしくは配列番号：205 に規定されるオリゴヌ
    クレオチドまたは相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドのいずれか 1つに規
    定されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるPCR により適する条件下
    で増幅することができるウイルスまたはウイルス因子。
  18. 【請求項１８】 SEN ウイルスである請求項１６または１７に記載のウイル
    スまたはウイルス因子。
  19. 【請求項１９】 弱毒ウイルスまたはキメラウイルスである請求項１６また
    は１７に記載のウイルスまたはウイルス因子。
  20. 【請求項２０】 請求項１６、１７、１８または１９に記載のウイルスで感
    染またはトランスフェクトされた宿主細胞。
  21. 【請求項２１】 肝細胞、マクロファージ、リンパ球、上皮細胞もしくは骨
    細胞またはそれから派生した細胞（株）である請求項２０に記載の宿主細胞。
  22. 【請求項２２】 請求項２０に記載の宿主細胞を適当な条件下で培養する工
    程および前記培養物からウイルスを単離する工程を含む、請求項１６、１７、１
    ８または１９に記載のウイルスまたはウイルス因子の製造方法。
  23. 【請求項２３】 請求項１６、１７、１８もしくは１９に記載の、または請
    求項２２に記載の方法により製造された、血液により伝達されうるウイルスまた
    はウイルス因子。
  24. 【請求項２４】 ウイルス標品から単離される（ポリ）ペプチドであって、
    前記ウイルス標品が請求項１６、１７、１８、１９または２３いずれかに記載の
    ウイルスまたはウイルス因子を含有する（ポリ）ペプチド。
  25. 【請求項２５】 請求項１５もしくは請求項２４に記載の（ポリ）ペプチド
    上または請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３いずれかに記載のウイルス
    またはウイルス因子上のエピトープを特異的に認識する抗体またはその断片また
    はその誘導体またはアプタマーまたは他の受容体。
  26. 【請求項２６】 モノクローナル抗体である請求項２５に記載の抗体。
  27. 【請求項２７】 scFv断片である請求項２５に記載の抗体誘導体。
  28. 【請求項２８】 請求項２５〜２７いずれかに記載の抗体またはその断片ま
    たはその誘導体またはアプタマーまたは他の受容体により特異的に認識される請
    求項１５または請求項２４に記載の（ポリ）ペプチドの誘導体。
  29. 【請求項２９】 （半）合成、例えば化学的に製造された請求項２８に記載
    の誘導体。
  30. 【請求項３０】 ペプチドミメティクスにより製造された請求項２９に記載
    の誘導体。
  31. 【請求項３１】 請求項２６に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
  32. 【請求項３２】 請求項１５に記載の（ポリ）ペプチドを含有する融合タン
    パク質。
  33. 【請求項３３】 請求項１５に記載の（ポリ）ペプチドの少なくとも２つの
    エピトープまたは請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３のいずれかに記載
    のウイルスもしくはウイルス因子を含有するモザイクポリペプチドであって、天
    然のSEN ウイルスゲノム中のエピトープ間に正常に介在するアミノ酸を欠くモザ
    イクポリペプチド。
  34. 【請求項３４】 検出可能に標識された請求項１〜１１のいずれかに記載の
    核酸分子、請求項１５もしくは２４に記載の（ポリ）ペプチド、請求項２７〜２
    ９のいずれかに記載の誘導体、請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３のい
    ずれかに記載のウイルスもしくはウイルス因子、請求項２５〜２７のいずれかに
    記載の抗体もしくはその断片もしくはその誘導体もしくはアプタマーもしくは他
    の受容体、請求項３２に記載の融合タンパク質、請求項３３に記載のモザイクポ
    リペプチドまたは請求項８もしくは９に記載のプライマー。
  35. 【請求項３５】 (a) 請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子； (b) 請求項１５もしくは２４に記載の（ポリ）ペプチド； (c) 請求項２８〜３０のいずれかに記載の誘導体； (d) 請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３のいずれかに記載のウイルス
    もしくはウイルス因子； (e) 請求項２５〜２７のいずれかに記載の抗体もしくはその断片もしくはその
    誘導体もしくはアプタマーもしくは他の受容体、； (f) 請求項３２に記載の融合タンパク質；および／または (g) 請求項３３に記載のモザイクポリペプチド を結合させた固相。
  36. 【請求項３６】 (a) 請求項３５に記載の固相； (b) 請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子； (c) 請求項１５もしくは２４に記載の（ポリ）ペプチド； (d) 請求項２８〜３０のいずれかに記載の誘導体； (e) 請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３のいずれかに記載のウイルス
    もしくはウイルス因子；または (f) 請求項２５〜２７のいずれかに記載の抗体もしくはその断片もしくはその
    誘導体もしくはアプタマーもしくは他の受容体； (g) 請求項３２に記載の融合タンパク質； (h) 請求項８もしくは９に記載のプライマーもしくはプライマー対；および／
    または (i) 請求項３３に記載のモザイクポリペプチド の少なくとも１つを含有する診断組成物。
  37. 【請求項３７】 (a) 請求項３５に記載の固相； (b) 請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子； (c) 請求項１５もしくは２４に記載の（ポリ）ペプチド； (d) 請求項２８〜３０のいずれかに記載の誘導体； (e) 請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３のいずれかに記載のウイルス
    もしくはウイルス因子；または (f) 請求項２５〜２７のいずれかに記載の抗体もしくはその断片もしくはその
    誘導体もしくはアプタマーもしくは他の受容体； (g) 請求項３２に記載の融合タンパク質； (h) 請求項８もしくは９に記載のプライマーもしくはプライマー対；および／
    または (i) 請求項３３に記載のモザイクポリペプチド の少なくとも１つを含有するキット。
  38. 【請求項３８】 請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３のいずれかに
    記載のウイルスまたはウイルス因子の非病原性誘導体。
  39. 【請求項３９】 (a) 請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子； (b) 請求項１５もしくは２４に記載の（ポリ）ペプチド； (c) 請求項２８〜３０のいずれかに記載の誘導体； (d) 請求項１９に記載のウイルス； (e) 請求項３８に記載の非病原性誘導体； (f) 請求項２５〜２７のいずれかに記載の抗体もしくはその断片もしくはその
    誘導体もしくはアプタマーもしくは他の受容体； (g) 請求項３２に記載の融合タンパク質；および／または (h) 請求項３３に記載のモザイクポリペプチド を含有する組成物。
  40. 【請求項４０】 さらに製薬的に許容されうる担体を任意に含有する医薬組
    成物である請求項３９に記載の組成物。
  41. 【請求項４１】 ワクチンである請求項４０に記載の医薬組成物。
  42. 【請求項４２】 請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３のいずれかに
    記載のウイルスまたはウイルス因子の試料中の存在を検出する方法であって、 (a) 請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子もしくは請求項１２に記載の
    ベクターと前記試料由来のＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズ
    する工程；および (b) 核酸ハイブリッドの形成を検出する工程 を含む方法。
  43. 【請求項４３】 請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３のいずれかに
    記載のウイルスまたはウイルス因子の試料中の存在を検出する方法であって、 (a) 請求項８もしくは９に記載のプライマー対と試料由来のＤＮＡをハイブリ
    ダイズする工程； (b) PCR または他のＤＮＡ増幅技術を行う工程；および (c) 特異的なPCR または他の増幅産物の生成を検出する工程 を含む方法。
  44. 【請求項４４】 請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３のいずれかに
    記載のウイルスまたはウイルス因子の試料中の存在を検出する方法であって、 (a) 請求項２５〜２７のいずれかに記載の抗体もしくはその断片もしくはその
    誘導体もしくはアプタマーもしくは他の受容体と前記試料をインキュベートする
    工程；および (b) 前記試料中に存在する（ポリ）ペプチドもしくはウイルスと前記抗体もし
    くはその断片もしくはその誘導体もしくは前記アプタマーもしくは他の受容体と
    の複合体の形成を検出する工程 を含む方法。
  45. 【請求項４５】 試料中の請求項２５〜２７のいずれかに記載の抗体もしく
    はその断片もしくはその誘導体もしくはアプタマーもしくは他の受容体を検出す
    る方法であって、 (a) 請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子、請求項１６、１７、１８、
    １９もしくは２３のいずれかに記載のウイルスまたは請求項１５もしくは２４に
    記載の（ポリ）ペプチドもしくはその断片と、または請求項２８に記載の（ポリ
    ）ペプチドの誘導体と前記試料とをインキュベートする工程；および (b) 前記抗体、前記断片もしくは前記抗体誘導体もしくは前記アプタマーもし
    くは他の受容体と前記核酸分子、前記ウイルスもしくは前記（ポリ）ペプチドも
    しくは前記断片もしくは誘導体との間の複合体の形成を検出する工程 を含む方法。
  46. 【請求項４６】 前記核酸分子、前記プライマーの少なくとも１つ、または
    前記抗体もしくはその断片もしくはその誘導体もしくはアプタマーもしくは他の
    受容体が検出可能に標識されている請求項４２〜４５いずれかに記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記標識がタグ、蛍光マーカーまたは放射性マーカーであ
    る請求項４６に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記試料が血液、血清、唾液および／または糞便その他の
    体液であるかそれらに由来するものである請求項４２〜４７いずれかに記載の方
    法。
  49. 【請求項４９】 請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子、請求項１５
    もしくは２４に記載の（ポリ）ペプチドまたは請求項１６、１７、１８、１９も
    しくは２３のいずれかに記載のウイルスと特異的に免疫反応するポリクローナル
    抗体の実質的に単離された標品。
  50. 【請求項５０】 請求項１〜１１のいずれかに記載の核酸分子、請求項１５
    もしくは２３に記載の（ポリ）ペプチド、請求項２５〜２７のいずれかに記載の
    誘導体または請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３のいずれかに記載のウ
    イルスもしくはウイルス因子に対する抗体を製造する方法であって、前記核酸分
    子、（ポリ）ペプチド、誘導体、ウイルス／ウイルス因子または請求項３８に記
    載の非病原性誘導体で実験動物を免疫する工程および産生された血清または特異
    的抗体を単離する工程を含む方法。
  51. 【請求項５１】 請求項４１に記載のワクチンの少なくとも１単位用量を個
    体に投与することを含む、請求項１６〜１９のいずれかに記載のウイルスまたは
    ウイルス因子に対して個体を免疫する方法。
  52. 【請求項５２】 請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３のいずれかに
    記載のウイルスまたはウイルス因子を増殖させる方法であって、前記ウイルス／
    ウイルス因子の増殖を促進するのに適する条件下で、請求項１９または２０に記
    載の宿主細胞を培養する工程を含む方法。
  53. 【請求項５３】 動物において請求項１６、１７、１８、１９もしくは２３
    のいずれかに記載のウイルスまたはウイルス因子を増殖させる方法であって、前
    記ウイルス／ウイルス因子、前記ウイルス／ウイルス因子の一部および／または
    前記ウイルス／ウイルス因子により感染した材料で前記動物を接種する工程を含
    む方法。
  54. 【請求項５４】 請求項１６〜１８もしくは２３のいずれかに記載のウイル
    スまたはウイルス因子に関連する疾患および／または前記ウイルス／ウイルス因
    子により生じる疾患の処置用医薬組成物の調製のための抗ウイルス因子の使用。
  55. 【請求項５５】 請求項１６〜１８もしくは２３のいずれかに記載のウイル
    スまたはウイルス因子に関連する疾患および／または前記ウイルス／ウイルス因
    子により生じる疾患の処置用医薬組成物の調製のための、請求項２５〜２７のい
    ずれかに記載の抗体もしくはその断片もしくはその誘導体またはアプタマーまた
    は他の受容体の使用。
  56. 【請求項５６】 前記疾患が肝障害、炎症性疾患および増殖性障害からなる
    群より選ばれる請求項５４または５５に記載の使用。
  57. 【請求項５７】 前記肝障害が原因不明の急性または慢性肝炎（NANE- 肝炎
    ) である請求項５６に記載の使用。
  58. 【請求項５８】 前記炎症性疾患がクローン病または紅斑性狼瘡である請求
    項５６に記載の使用。
  59. 【請求項５９】 前記増殖性障害が癌、好ましくは肝癌または結腸癌である
    請求項５６に記載の使用。
  60. 【請求項６０】 前記先行する請求項のいずれかに同定されたウイルス／ウ
    イルス因子に苦しむ哺乳動物、好ましくはヒトの疾患を処置または予防する方法
    であって、前記先行する請求項のいずれかに規定された抗ウイルス因子、抗体、
    その断片もしくはその誘導体、アプタマーまたは他の受容体の１または複数の用
    量を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
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