WO1993002193A1

WO1993002193A1 - cDNAS DERIVADOS DEL VIRUS C DE LA HEPATITIS

Info

Publication number: WO1993002193A1
Application number: PCT/ES1991/000044
Authority: WO
Inventors: Fernando Javier Bartolome Nebreda; Vicente CARREÑO GARCIA; Inmaculada Castillo Aguilar; Juan Antonio Quiroga Estevez
Original assignee: Bartolome Nebreda Fernando Jav; Carreno Garcia Vicente; Inmaculada Castillo Aguilar; Juan Antonio Quiroga Estevez
Priority date: 1991-07-19
Filing date: 1991-07-19
Publication date: 1993-02-04

Abstract

Se suministra una serie de secuencias de cDNAS derivadas del virus C de la hepatitis (VCH). La comparación de las secuencias de los cDNAS obtenidos demuestra que no tienen homologia sustancial con los virus A, B y D de la hepatitis. La comparación de estos cDNAS con las secuencias descritas del VCH aislados en Estados Unidos y Japón muestran una diferencia en esta región alrededor del 20 % con la correspondiente a la del virus aislado en Estados Unidos y de aproximadamente un 10 % con el aislado en Japón. Las secuencias de cDNAS del VCH, son útiles para el diseño de sondas y para la sintesis de polipéptidos que pueden usarse en inmunoensayos para el diagnóstico, control y seguimiento terapéutico y desarrollos de vacunas de las hepatitis por virus C. Los polipéptidos codificados por las secuencias de los cDNAS pueden usarse también para producir y purificar anticuerpos frente a antígenos del VCH, así como en inmunoensayos para detectar antígenos del virus C. Estos anticuerpos pueden usarse en la profilaxis de la infección. Antecedentes: la hepatitis C es una enfermedad que progresa en la mitad de los casos a cronicidad y es agresiva a lo largo ya que en el 20 % de los casos crónicos se desarrola una cirrosis hepática. Uno de los virus responsable de esta enfermedad fue aislado en Estados Unidos a partir de suero e hígado de chimpacé que habia sido previamente inoculado con un suero procedente de un paciente afecto de hepatitis No-A, No-B (1). Posteriormente, se ha aislado en Japón un virus relacionado (2, 3).

Description

"cDNAS DERIVADOS DEL VIRUS C DE LA HEPATITIS".

5. DESCRIPCIÓN DEL INVENTO

Aquí se describen específicamente, las secuen¬ cias cDNAS de una parte del genoma del VCH. La obten ción de estas secuencias se realiza a partir de sue-

10. ro de pacientes con hepatitis crónica No-A, o-B me¬ diente: aislamiento del genoma viral del VCH, trans¬ cripción del RNA a cDNA, amplificación génica del cDNA, clonaje del cDNA, propagación del cDNA clonado en una cepa bacteriana, selección de clones transfor-

15. mados, crecimiento de los mismos, aislamiento de se¬ cuencias especificas y secuenciación de las mismas.

Las secuencias cDNAS derivadas del VCH, o par¬ te de ellas, son útiles como sondas para el diagnósti¬ co de la presencia del virus en muestras biológicas.

20. Estos cDNAS dan lugar a secuencias polipeptídicas de antígenos codificados por el genoma del VCH, lo que permite la producción "in vivo" y/o "in vitro" de - polipéptidos útiles como reactivos en pruebas dia¬ gnósticas y/o como componentes de vacunas. Los poli-

25. péptidos derivados de estas secuencias cDNAS pueden ser inmunorreactivos y servir tanto para la detección de anticuerpos en muestras biológicas de pacientes afectos de esta enfermedad, como para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales frente a

30. epítopos contenidos en dichas secuencias polipetídi- cas. Tanto los polipéptidos codificados por los cDNAS como los anticuerpos producidos frente a ellos pueden utilizarse en el diagnóstico, profilaxis y terapéutica de la hepatitis C.

Consecuentemente, algunos aspectos del invento son: polinucleotidos recombinantes que comprenden una secuencia derivada del genoma del VCH o de los - 5. cDNAS del VCH; polinucleotidos recombinantes que c£ difican al menos un epitopo del VCH; vector recombi- nante que contine cualquiera de los anteriores poli¬ nucleotidos recombinantes, y una célula huésped trans_ formada con cualquiera de estos vectores.

10. Otro aspecto del invento es una sonda polinu- cleotídica para el VCH.

El invento también incluye un método para de¬ tectar ácidos nucleicos del virus C en muestras bio¬ lógicas, cultivos celulares y en general en cualquier

15. material susceptible de aplicación de esta metodolo¬ gía. METODOLOGÍA DEL INVENTO

A 200 ul de suero se añaden 600 l de la solu¬ ción compuesta por 4 M isotiocianato de guanidina, °* 25 mM citrato sódico, 100 mM 2-mercaptoetanol, 0,5% sarkosyl, 600 ul de fenol: dH₂0 (1:1), 1 jαg/ml tRNA y 100 _μl de cloroformo, incubándose la mezcla 15 mi¬ nutos en hielo. Se centrifuga a 14,000 Xg, 15 minutos a 4^eC y se reextrae la fase acuosa con igual volumen ^- de cloroformo en las mismas condiciones. El genoma - viral se trata con 1 U de inhibidor de RNasas aislado de placenta humana y se precipita con un volumen igual de isopropanol a 70se durante toda la noche. Los áci¬ dos nucleicos obtenidos se recuperan por centrifuga¬ 0 ción y se disuelven en 10 ul de H2O bidestilada y es¬ téril.

El ácido nucléido obtenido se desnaturaliza por calor a 94 C durante 5 minutos. El cDNA se sintetiza utilizando el ácido nucleico desnaturalizado como molde y el oligonucleótido sintético cuya secuen¬ cia es 5' TAC CTA GTC ATA GCC TCC GTG AAG 3¹ duran¬ te la sintesis de la primera cadena del cDNA median 5. te una transcriptasa en reverso (5).

El cDNA se amplifica mediante la técnica cono¬ cida como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (6). Los oligonucleotidos sintéticos utilizados en esta reacción son: 10. 5' ATG GGG CAÁ AGG ACG TCC G 3"

5 ' TAC CTA GTC ATA GCC TCC GTG AAG 3 ' llevándose a cabo 25 ciclos consistente cada uno en:

36 segundos a 94^QC

42 segundos a 50²C 15. 180 segundos a 68^SC

Los cDNAS de doble cadena amplificados se fra¬ ccionan de acuerdo a su tamaño mediante electrofere- sis en gel de agarosa al 1.5%. Los fragmentos de cDNA se aislan del gel mediante protocolos estándar 20. descritos en la literatura (5).

Estos fragmentos se clonan en el vector pcRIOOO que forma parte del kit "TA cloning Kit" comerciali¬ zado por Invitrogen Corporation (San Diego, CA, EE.¬ UU.). Los procedimientos para el clonaje son los re- 25. comendados para la casa suministradora y están refle¬ jados en la literatura (5).

Los plásmidos recombinantes se propagaron en la cepa de E. rolo INV ly- F' . El genotipo de esta ce pa bac iana es: end Al, rec Al, hsd R17 (r-k, m + 30. k), su, 14 ,1-, thi -1, gyr A, reí Al, f 80 lac - Z ¿i m ID ¿_ (lac ZYA-arg F), deo R+, F¹.

Tras la transformación de la bacterias, las colonias de células que llevan los plásmidos recombi nantes se identifican siguiendo los métodos convencio nales descritos en la literatura (5).

Siguiendo el procedimiento descrito anteriormen te, se han aislado 4 clones positivos a los que se - denominado: c4, c!3, c!5 y c!7.

Para caracterizar estos clones se secuencian - mediante la técnica de terminación de la cadena por incorporación de dideoxinucleotidos (6), utilizando los reactivos suministrados en el kit "Sequenase

10 Versión 2.0" comercializado por United States Bioche- mical (Cleveland, OH, EE.UU.). Las secuencias obteni¬ das se detallan a continuación:

El análisis y comparación de las secuencias descritas anteriormente con las variantes del VCH aisladas en EE.UU. y Japón se realiza mediante el programa de ordenador PC(GENE (IntelliGenetics, Gi¬ nebra, Suiza). Estos análisis revelan una diferen¬ cia de alrededor del 20% con la variante de Estados Unidos y de aproximadamente un 15% con la variante japonesa.

AISLAMIENTO Y SECUENCIAS DE LOS cDNAS DEL VCH DE DIFERENTES CLONES.

Los clones C-4, C-13, C-15 y C-17 se obtuvieron 5. a partir del suero de pacientes con hepatitis cróni¬ ca No-A,No-B según los métodos previamente descritos. La secuencias de nucleotidos de los cDNAS del VCH aislados de los clones C-4, C-13, C-15 y C-17, se - determinaron mediante las técnicas descritas ante- 10. riormente. Las secuencias de nucleotidos de los cDNAS del VCH se muestran en las Figuras 1, 2, 3 y 4. APLICABILIDAD INDUSTRIAL

Este invento, tiene muchos usos industriales, algunos de los cuales son los siguientes:

15, Los VCH-cDNAS pueden usarse para diseñar sondas para la detección de los ácidos nucleicos del VCH en muestras. Las sondas derivadas de los cDNAS pueden - usarse para detectar ácidos nucleicos del VCH en, - por ejemplo, reacciones químicas sintéticas. También

20, pueden usarse en el estudio de agentes antivirales - para determinar el efecto de los agentes en la inhi¬ bición de la replicación viral en cultivos celulares y modelos animales. Las sondas del polinucleotidoε del VCH también son útiles para detectar ácidos nu¬

25. cleicos virales en humanos y por tanto, pueden ser¬ vir como base para el diagnóstico de la infección por VCH en humanos.

Además de lo mencionado, los cDNAS descritos - dan información y medios para sintetizar polipépti- dos que contengan epítopos del VCH. Estos polipépti- dos son útiles para detectar anticuerpos contra antí genos del VCH. Basándose en estos polipéptidos que contienen epítopos del VCH, se pueden desarrollar - inmunoensayos que tendrian un uso comercial en el diagnóstico de la hepatitis No-A,No-B causada por el VCH, en la elección' de donantes en bancos de sangre y para detectar sangre contaminada de donantes infe- -- ^• cciosos. Los antígenos virales tendrán también uti¬ lidad en el control de la eficacia de agentes anti¬ virales en modelos animales. Además, los polipéptidos derivados de los cDNAS del VCH descritos aquí, ten¬ drán utilidad como vacunas para el tratamiento de la

10. infección por VCH.

Los polipéptidos derivados de los cDNAS del VCH además de los usos descritos, pueden ser también úti¬ les para el desarrollo de anticuerpos anti-VCH. Por lo tanto, pueden ser usados en vacunas anti-VCH. Ade- ^• más, los anticuerpos producidos como resultado de la inmunización con polipéptidos del VCH son también út_i les para detectar la presencia de antígenos virales en muestras. Así, pueden usarse para determinar la producción de polipéptidos del VCH en sistemas quimi-

²⁰" eos. Los anticuerpos anti-VCH pueden también utilizar¬ se para controlar la eficacia de agentes anti-virales en proyectos donde se prueben estos agentes en siste¬ mas de cultivo de tejidos. Otra posible aplicación es su utilización para inmunización pasiva y para diagno¡s ^*^* ticar hepatitis No-A,No-B causada por VCH permitiendo la detección de antigeno(s) virales tanto en donantes como enreceptores de sangre. Otro uso importante de - los anticuerpos anti-VCH es en cromatografía de afini¬ dad para la purificación de virus y polipéptidos vira¬ 0 les. Las preparaciones purificadas de virus y poli¬ péptidos virales pueden ser usados en vacunas. También el virus purificado puede ser útil para el desarrollo de sistemas de cultivos celulares en los quel VCH se replique.

Los cultivos celulares que contengan células infectadas por VCH pueden tener muchos usos. Pueden utilizarse para la producción, a relativamente gran 5. escala, de. VCH, que es un virus que normalmente se encuentra a muy bajo título. Estos sistemas serán de ayuda también para la elucidación de la biología molecular del virus y llevar al desarrollo de agen¬ tes antivirales, Los sistemas de cultivos celulares 10. serán también de utilidad en la determinación de la eficacia de agentes antivirales. Además, los siste¬ mas de cultivo celulares permisivos para el VCH se¬ rán útiles para la producción de variantes atenuadas del VCH.

Para mayor comodidad, los anticuerpos anti-VCH 15. y los polipéptidos del VCH tanto naturales como re- combinantes, pueden ser empaquetados en "Kits".

El método utilizado para el aislamiento de - cDNAs del VCH que consiste en preparar cDNAs por - transcripción en reverso, amplificarlos por PCR y - 20. clonarlos en vectores apropiados puede también apli¬ carse para el aislamiento de cDNAs de otros agentes asociados a la enfermedad hasta ahora no caracteriza¬ dos y que tengan un componente genómico. Esto lleva¬ rla al aislamiento y caracterización de estos agentes 25. a reactivos para el diagnóstico así como a vacunas para estos otros agentes asociados a la enfermedad.

30. SECUENCIA PARCIAL (5'-3') DEL CLON C-4

Secuencia C-4.1

TAT GGGGGAAAGGACGTCCGGAACCTATCC ATACCCCCTTTCCTGCAGGCCTTGGATAGG

31 GGCAAGGCCGTCAACCACATCCGCTCCGTG CCGTTCCGGCAGTTGGTGTAGGCGAGGCAC

61 TGGAAGGACTCGCTGGAAGACACTGAGACA ACCTTCCTGAGCGACCTTCTGTGACTCTGT

1 CCAATT AATACCACCATCATGGCAAAGAAC GGTTAATTA TGGTGGTAGTACCGTTTCTTG

121 GAGGTCTTCTGTGTCCAGCCAGAGAAAGGA CTCCAGAAGACACAGGTCGGTCTCTTT CCT

151 GGCCGCAAGCCAGCCCGCTTCATCGTATTC CCGGCGTTCGGTCGGGCGAAGTAGCATAAG

181 CCAGACTTGGGGGTTCGTGTATGCGAGAAA GGTCTGAACCCCCAAGCACATACGCTCTTT

11 ATGGCCCTTTACGATGTGGTCTCCAACCTT TACCGGGAAATGCTACACCAGAGGTTGGAA

41 CCCCAGGCCGTGATGGGCTCCTCATACGGA GGGGTCCGGCACTACCCGAGGAGTATGCCT

71 TTCCAATACTCTTCTGGGCAG AAGGTTATGAGAAGACCCGTC (CONTINUACIÓN)

Secuencia C-4.2

TTT GACTCAACGGTCACTGAGAGTGACATC AAACTGAGTTGCCAGTGACTCTCACTGTAG

1 CGTGTTGAGGAGTCAATTTAT CAATGTTGT GCACAACTCCTCAGTTAAATAGTTACAACA

1 GACTTG GCCCCCGAGGCCAGACAAGCCATA CTGAACCGGGGGCTCCGGTCTGTTCGGTAT

1 AAGTCACTCACAGAGCGGCTTTACATCGGG TTCAGTGAGTGTCTCGCCGAAATGTAGCCC

21 GGTCCT CCAGGA

(CONTINUACIÓN)

Secuencia C-4.3

GTGCTGACGACCAGCTGCGGTAATACCCTC CACGACTGCTGGTCGACGCCATTA TGGGAG

1 ACATGTTCATTGAAGGCCTCTGCGGCCTGT TGTACAATGAACTTC CGGAGACGCCGGACA

1 CGAGATGCAAAGCTCCAGGACTGCACAATG GCTCTACGTTTCGAGGTCCTGACGTGTTAC

1 CTCGTGAACGCAGGCAACCTTGTCGTTATC GAGCACTTGCGTCCGTTGGAACAGCAATAG

21 TGTGAGAGCGCGGGAACCCAAGAGGATGCG ACACTCTCGCGCCCTTGGGTTCTCCTACGC

51 GCGAGCCTACGAGTCTTCACGGAGGCTATG CGCTCGGATGCTCAGAAGTGCCTCCGATAC

80 ACT AG G TGATCC

SECUENCIA PARCIAL (5'-3') DEL CLON C-13

SECUENCIA C-13.1

GGGGGAAAGGACGCCGGAACCATCCAGCAAGGCCGTTAACTACA CCCCCTTTCCTGCGGCCTTGGTAGGTCGTTCCGGCAATTGATGT

TTCGCTCCGTGTGGTAGGACTGCGGATGACACTGAGTCACCAGA AAGCGAGGCACACCATCCTGACGCCTACTGTGACTCAGTGGTCT

CACCA GTGGT

SECUENCIA PARCIAL (5'-3') DEL CLON C-15

SECUENCIA C-15.1

1 ATGGGGGAAAGGACGTCCGGAACCTATCCGGCAAGGCCGTCAAC TACCCCCTTTCCTGCAGGCCTTGGATAGGCCGTTCCGGCAGTTG

45 CACATCCGCTCCGTGTGGAAGGACCTGCTGGAAGACACTGAGAC GTGTAGGCGAGGCACACCTTCCTGGACGACCTTCTGTGACTCTG

89 ACCAATTGACACCACCATACTGG TGGTTAACTGTGGTGGTATGACC

SECUENCIA C-15.2

1 AAGCCAGCTCGCCTTATCGTGTTCCCAGACTTGGGGGTTCGTGT TTCGGTCGAGCGGAATAGCACAAGGGTCTGAACCCCCAAGCACA

45 GTGCGAGAAAATGGCCCTTTACGACGTGGTCTCCACTCTTCCTC CACGCTCTTTTACCGGGAAATGCTGCACCAGAGGTGAGAAGGAG

89 AGGCCGTGATGGGCTCTTCATACGGATTCC TCCGGCACTACCCGAGAAGTATGCCTAAGG

SECUENCIA C-15.3

1 TGTTACTTGAAAGCAACTGCGGCCTGTCGAGCTGCAAAGCTCCG ACAATGAACTTTCGAAGACGCCGGACAGCTCGACGTTTCGAGGC

45 GGACTGACCGATGCTCGTGTGCGGAGACGACCTCGTCGTTATCT CCTGACTGGCTACGAGCACACGCCTCTGCTGGAGCAGCAATAGA

89 GTGAGAGTGCGGGAACCCAAGAGGATGC CACTCTCACGCCCTTGGGTTCTCCTACG

SECUENCIA C-15.

TGAGGAGTCAATTTACCAATGTTGTGACTTGGCCCCCGAAGCCA ACTCCTCAGTTAAATGGTTACAACACTGAACCGGGGGCTTC GT

45 GACAGGTTATAAGGTCACTCACAGAGCGGCTTTATATCGGGGG CTGTCCAATATTCCAGTGAGTGTCTCGCCGAAATATAGCCCCC SECUENCIA PARCIAL (5'-3') DEL CLON C-17

SECUENCIA C-17.1

1 GTGATGCCGTCAACGAGGATAAAGCAGCCCTGGGAGCCTTCACG CACTACGGCAGTTGCTCCTATTTCGTCGGGACCCTCGGAAGTGC

,5 GGGGCTATGACTAGGT CCCCGATACTGATCCA

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S

1.- Polinucleótidos recombinantes que comprenden una secuencia derivada del genoma del VCH o de los cDN del VCH.

2.- Polinucleótidos recombinantes, de acuerdo co la reivindicación 1, que codifican al menos un epitopo del VCH.

3.- Vector recombinante que contiene cualquiera de los polinucleótidos de las reivindicaciones anterio res.

4.- Célula huésped transformada con cualquiera d los vectores de la reivindicación 3.

5.- Una sonda polinucleotídica para el VCH.

6.- Método para detectar ácidos nucleicos del vi rus C de la hepatitis en nuestras biológicas, cultivos celulares y en cualquier otro material apropiado.