ES2350179T3 - Moléculas de ácidos nucleicos del hdv, sus fragmentos y sus aplicaciones. - Google Patents
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Abstract
Moléculas de ácido nucleico aisladas, caracterizadas por que se seleccionan del grupo constituido por: - el genoma complete de la variante del HDV denominada dFr45 que presenta la secuencia SEC ID Nº: 1, y - el genoma de una variante del HDV que presenta una divergencia genética <= 15% con la secuencia SEC ID Nº: 1.
Description
La presente invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos procedentes de nuevas cepas o aislados de virus de la hepatitis D que constituyen genotipos diferentes de los genotipos I, II y III conocidos, a sus fragmentos, a las proteínas correspondientes, así como a sus aplicaciones y a los reactivos de diagnóstico.
La presente invención también se refiere a un método de diagnóstico sensible del virus de la hepatitis D (o virus de la hepatitis delta), así como a un método de seguimiento epidemiológico de infecciones por HDV.
El virus de la hepatitis D (VHD o HDV, por hepatitis Dvirus, en inglés) o delta es un virus satélite de la hepatitis B. Este virus tiene una estructura particular: estructura quimérica asociada a componentes específicos del HDV (ARN viral y proteínas HD), una envoltura que comprende las tres glicoproteínas del HBV: grande (preS1-preS2-S), mediana (preS2-S) y pequeña (S). El diámetro medio de las partículas del HDV se sitúa entre el de las partículas del HBV maduras (partículas de DANE: 42 nm) y el de las envolturas vacías del HBV (formas esféricas o filamentosas: 22 nm) y la densidad de flotación es de 1,24-1,25 g/cm3.
Dentro de los viriones, el ARN del HDV es circular y de polaridad negativa. Esta cadena monocatenaria circular cerrada, el genoma más pequeño conocido de los virus que infectan a mamíferos, tiene un porcentaje elevado de GC (60%).
El ARN del HDV se replica independientemente del HBV, cuya función se limita a proporcionar la envoltura del HDV. Las únicas proteínas encontradas (sHD y LHD) las codifica el ARN antigenómico que, en la célula infectada, es completo, circular y pseudo-bicatenario, sirve de intermediario de la replicación y sostiene la edición.
El ARN del HDV pertenece a un tipo de ribozima específica. La reacción de auto-escisión necesita el ARN y un catión divalente (Mg++). La escisión crea un extremo 2’, 3’ fosfato cíclico y un extremo 5’ hidroxilo.
Las ribozimas delta (genómica y anti-genómica) tienen una configuración secundaria de similar a pseudo-nudos. Las secuencias implicadas incluyen principal o exclusivamente las secuencias situadas en 3’ del sitio de auto-escisión (aproximadamente 84 nucleótidos).
Durante el ciclo viral, el ARNm del HDV codifica una proteína que existe en dos formas: una proteína de 194-195 aminoácidos (forma ‘s’ que indica pequeña (small)) de 240 kilodaltons (kDa) y una proteína de 214 aminoácidos (forma ‘L’ que indica grande (Large)) de 27 kDa, que existen en proporciones variables. Estas proteínas llevan la antigenicidad ‘delta’ y se detectan en el hígado o en el suero de pacientes o animales infectados (chimpancé, marmota). Estas dos proteínas virales sHD y LHD comienzan en el primer ATG de la fase de lectura abierta situada en la posición 1598 (según la numeración de Wang et al., 1986 o 1987) del ARN antigenómico. Durante la replicación, en la posición 1012 aparece una mutación, dependiente de una enzima celular, la adenosina desaminasa, dependiente del ARN bicatenario, transformando el codón de terminación ámbar (UAG) en el codón del triptófano (UGG), alargando en dirección 3’ la fase de lectura de 19 ó 20 codones y confiriendo a las dos formas sHD y LHD diferentes propiedades.
5 El ARNm acaba en una cola de poli(A), 15 nucleótidos después de la señal de poliadenilación consenso, AAUAAA (posiciones 954-959).
En el ciclo de replicación, las funciones de las proteínas de 24 y 27 Kd se oponen: sHD activa la replicación viral mientras que LHD la reprime y desempeña una función en el ensamblaje de las partículas virales. Estas proteínas se fosforilan en los restos de serina pero no se glicosilan (Tabla I).
10 Están constituidas por dominios funcionales comunes y por un dominio específico en la proteína grande LHD. Tabla I: Resumen y comparación de las funciones de las dos formas p24 y p27
- Actividades bioquímicas y biológicas
- P24 (S) P27 (L)
- Aminoácidos Transactivación de la replicación Trans-inhibición de la replicación Dimerización y polimerización Fijación al ARN Estabilización del ARN Localización nuclear Ensamblaje Fosforilación 19 aa carboxi-terminales específicos Farnesilación
- 195 + -+ + + + -+ -- 214 -+ + + + + + +(x6) + +
Brevemente, los diferentes dominios de estas dos proteínas son los siguientes:
* dominios comunes
15 -El dominio de polimerización, que comprende la secuencia entre los restos aminoacídicos 13 y 48 formada por una disposición de leucina o isoleucina, organizada en hélice α de tipo “cremallera de leucina” (leucine zipper), implicada en la polimerización de las proteínas, indispensable para (i) la transactivación de la replicación viral por el Ag-sHD, (ii) la inhibición de la replicación por el Ag-LHD y (iii) el ensamblaje de los complejos sHD-LHD en las envolturas del HBV.
20 -La señal de localización nuclear (SLN) que implica dos secuencias de localización nuclear identificadas en la región 67-68, esenciales para translocar el Ag-sHD sintetizado el citoplasma y quizá la ribonucleoproteína después de su entrada en la célula, hacia el núcleo.
-El sitio de fijación al ARN que se basa en dos secuencias ricas en arginina
localizadas entre los restos 97 y 163 que permiten la unión de las proteínas sHD sobre el ARN genómico 25 o antigenómico. Esta fijación es indispensable para que el Ag-sHD active la replicación.
* dominios específicos
Los 19-20 aminoácidos situados en el extremo COOH de la proteína grande tienen una función importante en el ciclo del HDV. En efecto, estos aminoácidos (aa 195-214), intervienen en el ensamblaje de las partículas virales (Chang et al., 1991). Esta actividad podría estar en parte relacionada con la presencia de una cisteína en la posición 211 (Glenn et al., 1992), conservada para todos los genomas virales caracterizados hasta ahora. Esta cisteína, situada 4 aminoácidos delante del extremo COOH de la proteína, forma una caja “CXXX” y fija un grupo farnesilo (Glenn et al., 1992) cadena de 15 carbonos derivada del ácido mevalónico, por acción de una farnesiltransferasa. Esta maduración postraduccional orienta las proteínas hacia las membranas celulares.
Por otro lado, la proteína pequeña y grande se han diferenciado por anticuerpos monoclonales (clon 9E4) (Hwang et Lai, 1993a). Estos anticuerpos sólo reconocen la sHD (Lai et al., 1993). Como la secuencia de aminoácidos de la proteína pequeña se incluye en la grande, estos resultados sugieren una conformación diferente entre sHD y LHD en el seno de los 30 aminoácidos carboxiterminales de la proteína pequeña sHD, lo que sugiere que el epítopo reconocido sobre la sHD debe ocultarse en la LHD en condiciones no desnaturalizantes.
El HDV se transmite sobre todo a través de agujas y sangre contaminadas, por tanto mediante los portadores del HDV o del HBV.
En América del Norte y en Europa del Oeste, la hepatitis D se localiza sobre todo en consumidores de drogas intravenosas, hemofílicos y los que reciben múltiples transfusiones.
La epidemiología y los medios de contaminación se superponen en parte. Se estima globalmente en un 5% la proporción de portadores del Ag-HB infectados por el HDV. Por lo tanto, se han constatado las disparidades de prevalencia geográfica y epidemiológica.
En determinadas regiones del globo, existe una alta prevalencia de esta enfermedad, en los portadores del virus de la hepatitis B, incluyendo la cuenca amazónica de América del Sur, África central, sur de Italia y los países del Oriente Medio.
Alrededor del Mediterráneo, más particularmente en el sur de Italia, Grecia y en Oriente Medio donde la frecuencia del portador crónico del HBV es intermedia (1% al 5%), la infección por HDV es elevada. En estas regiones, se ha sugerido la transmisión intrafamiliar, argumentada por estudios filogenéticos del virus que infecta a miembros de una misma familia (Niro et al., 1999). En el sur de Italia, la prevalencia en el sujeto Ag-HBs positivo disminuye, pasando del 23% en el año 1987 al 8% en el año 2000 (Gaeta et al., 2000).
En África y en Asia, donde el portador crónico del HBV es de frecuencia elevada (del 10% al 20%), así como en América del Sur y en las islas del Pacífico, donde es intermedia (del 1% al 5%), la distribución del HDV es paradójicamente disparatada. En África, los estudios de seroprevalencia muestran una distribución muy heterogénea de pacientes que tienen anticuerpos anti-HD, mientras que la prevalencia global de la infección por HBV, calculada para la detección del Ag-HBs, se estabiliza entre el 12 y el 14% (Roingeard et al., 1992). De esta manera, tasas variables del 4% (zona Norte de Senegal) al 44% (suburbios de Dakar) hacen aflorar probables factores socioeconómicos implicados en la transmisión.
Los estudios de prevalencia del HDV deben interpretarse prudentemente. De hecho, en las poblaciones estudiadas, existe una inclusión preferencial de pacientes que padecen hepatopatías. En los pacientes que padecen hepatitis aguda o crónica, la prevalencia de la infección por el HDV es más importante que en los portadores crónicos asintomáticos del HBV. Además, la investigación serológica de una infección HDV se basa en la detección del Ag-HD y de los Ac anti-HD totales en el suero. Debido a esto, infecciones agudas benignas, en el transcurso de las cuales se desarrollaría una producción transitoria aislada de IgM anti-HD, no se volverían a censar.
El HDV es responsable de hepatitis agudas y crónicas. Estas infecciones son particularmente graves y evolucionan más rápidamente hacia la cirrosis que las hepatitis B solas. Es una de las razones por las que el diagnóstico fiable del HDV asociado a HBV es crucial.
La infección por un HDV es dependiente del HBV. Los aislados del HDV de regiones geográficas diferentes muestran una variabilidad genética. Actualmente se identifican tres genotipos y se denominan genotipo I, II y III.
El genotipo se utiliza en la epidemiología de las transmisiones virales, permite estudiar la distribución geográfica y podría correlacionarse con el poder patogénico.
El HDV sólo se desarrolla en los pacientes también infectados por el HBV. Esta doble infección deriva de una co-infección o de una sobreinfección:
- la co-infección es la causante de una hepatitis aguda. El diagnóstico, evocado en el transcurso de una citólisis hepática, se basa en la detección de marcadores del HDV asociada a la presencia de IgM anti-HBc. El Ag-HBs, generalmente presente sería excepcionalmente negativo, justificando repetir las muestras para seguir la cinética de evolución de los marcadores. Es clásico constatar una inhibición de replicación del HBV por el HDV. Las IgM anti-HBc demuestran la infección reciente por el HBV. El Ag-HD, muy precoz, se detecta raramente, teniendo en cuenta su fugacidad. Los anticuerpos aparecen de 2 a 3 semanas después del inicio de los síntomas: las IgM anti-HD predominan, pero guardan una titulación moderada (<1:1000). Se observan dos picos de elevación de transaminasas, separados de dos a cinco semanas, en el 10 al 20% de las co-infecciones, reflejando probablemente diferentes cinéticas de replicación de virus. La co-infección se caracteriza por tanto por una gravedad de la hepatitis aguda a menudo superior a la ocasionada por el HBV aislado. De esta manera, se describen hepatitis fulminantes en América del Sur y en África subsahariana o en determinadas poblaciones. La evolución está generalmente marcada por una resolución de la hepatitis después de la base aguda y a la vista de la historia natural del HBV, sólo el 5% de los pacientes co-infectados evolucionan hacia la cronicidad.
-La sobreinfección se caracteriza por la aparición de una seroconversión HDV en el paciente portador crónico del Ag-HBs. La viremia HDV precede la aparición de anticuerpos anti-HDV en ausencia de detección de las IgM anti-HBc. La detección de estos marcadores puede preceder una elevación de transaminasas de varios meses. En fase aguda, la sobreinfección se traduce por una hepatitis fulminante en más del 10% de los casos. Además, pasada la fase aguda, la sobreinfección arrastra frecuentemente (del 60 al 70%) una hepatitis crónica activa con evolución rápida hacia la cirrosis. En la fase aguda de la sobreinfección, la detección del Ag-HD se produce rápidamente después de la aparición de anticuerpos que persisten a tasas elevadas. Contrariamente a los modelos clásicos de infección viral, la IgG anti-HD y la IgM anti-HD se detectan simultáneamente en las hepatitis B-delta crónicas.
La siguiente Tabla II resume la evolución de marcadores B y delta durante co-infecciones y sobreinfecciones.
- Co-infección por el HDV
- Fase aguda Evolución
- Crónica
- Curación
- Ag-HBs
- + + -
- IgM anti-HBc
- + - -
- Ag-HD
- +/ - -
- IgM anti-HD
- +/ + -
- IgG anti-HD
- +/ + +
- ARN HDV
- + + -
- Ag-HD intrahepática
- + + -
- Sobreinfección por el HDV
- Evolución
- Crónica
- Curación
- Ag-HBs
- + + -
- IgM anti-HBc
- - - -
- Ag-HD
- +/ - -
- IgM anti-HD
- + + -
- IgG anti-HD
- + + +
- ARN HDV
- + + -
- Ag-HD intrahepática
- + + -
La co-infección y la sobreinfección son clínicamente indistintas. El diagnóstico virológico se basa habitualmente en diferentes marcadores séricos. Más raramente, el Ag-HD puede 10 detectarse en cortes anatomopatológicos de la biopsia de hígado. Los marcadores permiten seguir la evolución de la enfermedad hacia la curación o la cronicidad, decidir el tratamiento de una enfermedad o evaluar la eficacia.
El HDV sólo se aísla en cultivos celulares si el diagnóstico se basa esencialmente en la investigación del Ag-HD (ELISA, IF) o del genoma viral (hibridación, PCR, PCR en tiempo real) 15 para las técnicas directas y en la detección de anticuerpos IgM anti-HD e IgG anti-HD para los métodos
indirectos (ELISA).
- La investigación del Ag-HD intrahepático puede discutirse en las hepatitis fulminantes teniendo en cuenta la cinética de aparición de los marcadores séricos. Este examen tiene un valor de referencia para estudiar la replicación del HDV, pero no puede utilizarse rutinariamente.
-El Ag-HD sérico se investiga en el suero en presencia de un agente disociante que expone el Ag-HD, incluido en la envoltura vial portando el Ag-HBs. La presencia de anticuerpos (Ac) anti-HD a índices elevados (hepatitis crónicas) que fijan los antígenos séricos impide la detección. Las técnicas de transferencia de Western se desarrollan con objeto de investigación. La presencia del virus en la sangre es transitoria y limitada en la fase precoz de la infección y la posibilidad de detectar el Ag-HD disminuye días después de la aparición de los síntomas.
-La inmunocaptura se utiliza para detectar los IgM anti-HD y la competición para los IgG anti-HD. Las técnicas ELISA han utilizado en primer lugar como antígeno el Ag-HD de suero o de hígado de pacientes o de animales infectados. Los nuevos ensayos se basan en Ag-HD recombinantes
o en péptidos de síntesis.
-Las técnicas de hibridación o de RT-PCR permiten la detección del ARN genómico tras la extracción de ácidos nucleicos y la desnaturalización de estructuras secundarias. Se han descrito varios sistemas de cebadores: su elección es determinante ya que la variabilidad genética en las regiones denominadas conservadas puede conducir a falsos negativos si los cebadores seleccionados no son los apropiados a las cepas virales circulantes. La elección de los cebadores de PCR debe tener en cuenta la epidemiología local de los genotipos descritos y es primordial conocer bien la distribución de estos genotipos en el mundo.
Sin embargo, también tanto en caso de co-infección como en caso de sobreinfección, el Ag-HD es en efecto difícil de detectar, ya que la viremia precede la aparición de anticuerpos.
En este contexto, y particularmente gracias a la puesta en evidencia de nuevos genotipos, son necesarios reactivos nucleicos y proteicos que permitan el diagnóstico del HDV, cualquiera que sea el genotipo.
En efecto el estudio de las secuencias de nucleótidos del HDV, por diferentes equipos en el mundo, ha permitido diferenciar, hasta ahora, sólo tres genotipos distintos:
-el genotipo-I, que es el más frecuente y el más ampliamente extendido en el mundo. Desde su descripción inicial (chimpancé infectado experimentalmente) por Wang (Wang et al., 1986; Wang et al., 1987), varios grupos han secuenciado el genoma del HDV de aislados geográficos diferentes. La primera secuencia de un HDV en el ser humano se describió en 1987, en los Estados Unidos por S. Makino et al., en un paciente toxicómano (Makino et al., 1987). El genotipo I está ampliamente extendido en Italia, en los Estados Unidos, Taiwán, Nauru, Francia, Líbano, China (Makino et al., 1987; Chao et al., 1991b; Imazeki et al., 1991; Lee et al., 1992; Niro et al., 1997; et Shakil et al., 1997). En el interior del genotipo I se describe un porcentaje de similitud de nucleótidos de más del 85%.
-Un aislado japonés (Imazeki et al., 1990; Imazeki et al., 1991) es el prototipo de un 2º subgrupo de HDV. Este genotipo II que no se había descrito en un primer momento más que en Japón y Taiwán (Imazeki et al., citados anteriormente; Lee et al., 1996b) parece tener una distribución geográfica mucho más grande. En particular, también se han caracterizado secuencias del genotipo I y del genotipo II provenientes de Yakouti (Rusia). Finalmente, algunos autores se basan en una diversidad intra-genotípica que permite la división en subtipos IIA (Imazeki et al., 1990; Imazeki et al., 1991; Lee et al., 1996b), IIB (Wu et al., 1998; Sakugawa et al., 1999) y IIC. En algunos países, la infección por virus del genotipo II se asociaría a hepatitis menos graves que las causadas por los HDV de genotipo I o III (Wu et al., 1995b).
-En 1993 se describió un 3er grupo para genomas de virus peruanos y colombianos (Casey et al., 1993a). El genotipo-III sólo se ha descrito en América del Sur, y más particularmente en la cuenca Amazónica asociado a hepatitis graves, es decir epidemias de hepatitis fulminantes con esteatosis microvesicular (Casey et al., 1993a; Casey et al., 1996b) y con una morbilidad y una mortalidad elevadas. En esta región geográfica, se observa que el HDV de genotipo-III está asociado de manera privilegiada con el HBV de genotipo F. Otros aislados de este grupo se han aislado recientemente en Venezuela (Nakano et al., 2001).
Comparando el conjunto de los genomas, se describen de dos a cuatro regiones conservadas (Chao et al., 1991b). Dos se reencuentran constantemente y están centradas alrededor de sitios de autoescisión de genomas y antigenomas implicados en las actividades autocatalíticas. Las otras dos regiones conservadas se sitúan en la fase de lectura que codifica la proteína HD (Chao et al., 1991b).
Sin embargo, las técnicas de detección dependen de la variabilidad genética del virus investigado; los reactivos conocidos, particularmente a partir de secuencias específicas de genotipo-I, II o III, sólo permiten detectar las infecciones por HDV variante y particularmente los HDV de genotipo diferente a los citados anteriormente.
En consecuencia, las técnicas de detección especificadas anteriormente corren el riesgo de llegar a resultados negativos tanto a nivel nucleico como lo que concierne a la respuesta de anticuerpos.
La puesta en evidencia y la consideración de nuevas variantes son importantes para desarrollar reactivos de detección y de diagnóstico de hepatitis D (serodiagnóstico, PCR, hibridación), lo suficientemente sensibles y específicos, es decir que no conduzcan a resultados falsamente negativos o falsamente positivos: de hecho, actualmente, en el contexto de una hepatitis grave, puede observarse una disociación IgM anti-HD positiva / ARN-HDV negativa.
En el ámbito de sus trabajos, los inventores han caracterizado ahora, de manera sorprendente, que la diversidad genética del HDV era significativamente más importante que la anteriormente descrita, lo que tiene consecuencias sobre la fiabilidad del diagnóstico.
En particular han puesto en evidencia nueve secuencias completas nuevas del HDV (tres originarias de Yakouti y seis originarias de África), que también circulan en la isla de Francia y que no pertenecen a ninguno de los genotipos conocidos. El análisis de estos nuevos aislados:
-confirma la existencia de una realidad mucho más importante del HDV que la
que se había descrito hasta ahora,
-replantea la clasificación de los HDV de solamente tres genotipos
- ha llevado a los inventores a proponer un algoritmo de PCR-RFLP, desde una región parcial de genoma para el genotipado HDV, y
-ha llevado a los inventores a desarrollar reactivos adaptados a un diagnóstico fiable de infecciones del HDV y cualquiera que sea el genotipo, mientras que anteriormente, se observaban numerosos resultados falsamente negativos (existencia de nuevos genotipos).
Los inventores se propusieron por tanto proporcionar moléculas de ácido nucleico de HDV, adecuadas para permitir la detección de una variante de HDV en relación con los tres genotipos anteriormente descritos.
Se describen moléculas de ácido nucleico aisladas, caracterizadas por que se seleccionan del grupo constituido por:
-el genoma de un HDV, que molecularmente presente, en su genoma completo, una divergencia o distancia genética ≥20% (menos del 80% de similitud) con respecto a las secuencias de un HDV de genotipo I, un HDV de genotipo II o un HDV de genotipo III,
- el genoma de un HDV, que molecularmente presenta una divergencia o distancia genética ≥25% (menos del 75% de similitud) sobre una región denominada R0, delimitada por las posiciones 889 a 1289 de genoma HDV, con respecto a las secuencias R0 correspondientes a un HDV de genotipo I, un HDV del genotipo II o un HDV de genotipo III,
-los genomas completos de aislados o variantes del HDV denominadas dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 y dFr644 que presentan la secuencias SEC ID Nº: 1, 6, 11, 16, 21 y 26, respectivamente y
-el genoma de un HDV que presenta una divergencia o distancia genética ≤15% con al menos una de las secuencias de las SEC ID Nº: 1, 6, 11, 16, 21 y 26.
De acuerdo con un modo de realización ventajoso de dichas moléculas, la región R0 se obtiene preferentemente por amplificación del ARN del HDV con los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 1280AS (SEC ID Nº: 34).
En el contexto de la presente invención, se entiende por molécula de ácido nucleico, una molécula de ADNc o de ARN que presenta una de las secuencias genómicas del HDV tales como se definen anteriormente y sus secuencias sentido y antisentido complementarias.
También se describen moléculas de ácido nucleico que comprenden al menos uno de los fragmentos de las secuencias de una variante del HDV tales como se definen anteriormente, seleccionadas en el grupo constituido por:
a) los fragmentos R0 de las siguientes variantes del HDV aisladas : dFr45, dFr47, dFr48, dFr69, dFr73, dFr644, dFr910, dFr1843, dFr1953, dFr2020 y dFr2066, que presentan las siguientes secuencias: SEC ID Nº: 48 a SEC ID Nº: 58, respectivamente,
b) el fragmento R1 que se extiende desde las posiciones 307 a 1289 del genoma del HDV,
c) el fragmento R2 que se extiende desde las posiciones 889 a 328 del genoma del HDV, d) el fragmento R3 que se extiende desde las posiciones 1486 a 452 del genoma del HDV, e) el fragmento R’1 que se extiende desde las posiciones 305 a 1161 del genoma del HDV, f) el fragmento R’2 que se extiende desde las posiciones 984 a 331 del genoma del HDV,
g) el fragmento R644 que se extiende desde las posiciones 889 a 446 del genoma del HDV,
h) el fragmento G910 que se extiende desde las posiciones 1206 a 929 del genoma del HDV,
i) el fragmento p910 que se extiende desde las posiciones 553 a 1550 del genoma del HDV,
j) los ADNc que codifican la proteína sHD, de las secuencias SEC ID Nº: 4, 9, 14, 19, 24 y 29,
k) los ADNc que codifican la proteína LHD, de las secuencias SEC ID Nº: 2, 7, 12, 17, 22 y 27 y
l) los cebadores de las secuencias SEC ID Nº: 33 a SEC ID Nº: 47.
En el contexto de la presente invención, las posiciones de los fragmentos en el genoma del HDV son idénticas en el genoma circular de orientación genómica, de acuerdo con la numeración de Wang y al., 1986 ó 1987.
También se describen fragmentos de nucleótidos complementarios de los anteriores así como fragmentos modificados, con respecto a los anteriores, por supresión o adición de nucleótidos en una proporción de aproximadamente el 15%, con respecto a la longitud de los fragmentos anteriores y/o modificados a nivel de la naturaleza de nucleótidos ya que los fragmentos de nucleótidos modificados conservan una capacidad de hibridación con las secuencias genómicas o antigenómicas del ARN de aislados tales como los definidos anteriormente.
De hecho, estas diferentes cepas virales, en un mismo paciente, en un momento determinado, muestran una población heterogénea de moléculas de ARN del HDV; por otro lado, durante una infección crónica, además de las heterogeneidades observadas a nivel del sitio de edición (posición 1012), pueden aparecer mutaciones. Las secuencias virales parecen evolucionar dentro de las poblaciones virales con una tasa de sustitución variable de 3.10-2 a 3.10-3 por nucleótido y por año.
Algunos de esos fragmentos son específicos y se utilizan como sonda o como cebadores; se hibridan específicamente con una cepa de una variante del HDV tal como se define anteriormente o con una cepa emparentada; se entiende por HDV emparentada con una variante tal como se define anteriormente, un HDV que presenta una divergencia genética ≤ al 15%.
Dichos fragmentos se utilizan para la detección y el seguimiento epidemiológico de infecciones por el HDV. Por ejemplo, el fragmento R0 se utiliza para la detección (RT-PCR) y el genotipado (PCR-RFLP) del HDV. Los otros fragmentos que cubren la totalidad del genoma del HDV se utilizan para la caracterización molecular de las variantes del HDV; el análisis filogenético de la secuencia completa del genoma o fragmentos de éste que corresponden en particular a R0 o a R2 permiten relacionar los perfiles observados en PCR-RFLP con un genotipo proporcionado o caracterizar nuevos genotipos.
En consecuencia, también se describe un método de detección de una variante del HDV de acuerdo con la invención, por hibridación y/o amplificación, realizado a partir de una muestra biológica, en el que el método se caracteriza por que comprende:
- (1)
- una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar, perteneciente al genoma del virus eventualmente presente en la muestra biológica,
- (2)
- la realización de al menos una amplificación génica usando un par de cebadores seleccionado del grupo constituido por los cebadores adecuados para amplificar una de las siguientes regiones del ARN genómico del HDV: R0, R1, R2, R3, R644, G910, p910, R’1 y R’2 y
- (3)
- el análisis del producto amplificado por comparación con una de las moléculas de las secuencias SEC ID Nº: 1, 6, 11, 16, 21 y 26, que corresponden a los genomas completos de aislados o variantes denominadas dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 y dFr644, respectivamente
De manera ventajosa, la etapa (3) del análisis puede realizarse por restricción, secuenciación o hibridación; en el este último caso, la sonda utilizada (particularmente en microplacas de ADN) será ventajosamente un fragmento de 15 a 20 nucleótidos, específico de dichos fragmentos amplificados.
De acuerdo con un modo de realización ventajoso de dicho método, los cebadores específicos para la amplificación de las regiones R0, R1, R2, R3, R644, G910, p910, R’1 y R’2, realizadas en la etapa (2) se seleccionan en el grupo constituido por:
- -
- los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 1280AS (SEC ID Nº: 34), para la amplificación de R0 (aproximadamente 400 pb),
- -
- los cebadores 320S (SEC ID Nº: 39) y 1280AS (SEC ID Nº: 34), para la amplificación del fragmento R1 (aproximadamente 960 pb),
- -
- los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 320AS (SEC ID Nº: 45), para la amplificación de R2 (aproximadamente 1100 pb), que contiene el gen sHD que corresponde a las posiciones 1598-950,
- -
- los cebadores 1480S (SEC ID Nº: 46) y 440AS (SEC ID Nº: 47), para la amplificación de R3 (aproximadamente 650 pb),
- -
- los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 420AS (SEC ID Nº: 40), para la amplificación de la región R644 (aproximadamente 1250 pb) del aislado dFr644,
- -
- los cebadores 318S (SEC ID Nº: 35) y 1150AS (SEC ID Nº: 36), para la amplificación de R’1 (aproximadamente 850 pb),
- -
- los cebadores 960S (SEC ID Nº: 37) y 345AS (SEC ID Nº: 38), para la amplificación de R’2 (aproximadamente 1050 pb),
- los cebadores R910S (SEC ID Nº: 41) y R910As (SEC ID Nº: 42) para la amplificación de la región G910 (aproximadamente 1400 pb) del aislado dFr910,
- los cebadores S910R (SEC ID Nº: 43) y As1910R (SEC ID Nº: 44) para la amplificación de la región p910 (aproximadamente 650 pb) del aislado dFr910.
También se describe un método de detección y de genotipado del HDV a partir de una muestra biológica, cuyo método se caracteriza por que comprende:
- (a)
- una etapa de extracción del ácido nucleico perteneciente al genoma del virus HDV,
- (b)
- una etapa de amplificación de la región R0 delimitada por las posiciones 889 a 1289 del genoma del HDV,
- (c)
- un primer tratamiento de las moléculas de ácidos nucleicos amplificados por las enzimas de restricción SmaI y Xhol, para producir un primer conjunto de fragmentos de restricción, y
- (d)
- un segundo tratamiento de las moléculas de ácidos nucleicos por la enzima de restricción SacII, para producir un segundo conjunto de fragmentos de restricción
- (e)
- el análisis combinado de dos conjuntos de fragmentos de restricción producidos por RFLP (Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (Restriction Fragment Length Polymorphism)), para detectar la presencia y/o determinar el tipo de HDV presente en dicha muestra biológica.
De acuerdo con un modo de realización ventajosa de dicho método, la etapa (b) de amplificación se realiza ventajosamente con los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 1280AS (SEC ID Nº: 34).
El método de acuerdo con la invención permite definir nuevos perfiles de restricción y clasificar los HDV en siete genotipos distintos. De acuerdo con otro modo de realización ventajoso de dicho método, este comprende además:
- (f)
- la amplificación de las moléculas de ácido nucleico de dicha muestra por RT-PCR con los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 320AS (SEC ID Nº: 45) para amplificar la región R2 y
- (g)
- la secuenciación directa de la región R2 amplificada y la comparación con una de las moléculas de ARN de las secuencias de las SEC ID Nº: 1, 6, 11, 16, 21 y 26, que corresponden respectivamente a los genomas completos de los aislados o de las variantes denominadas dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 y dFr644 respectivamente, por ejemplo, por análisis filogenético.
Cuando se observan perfiles no habituales, esta etapa complementaria permite caracterizar nuevos genotipos. De hecho, estos análisis complementarios de la PCR-RFLP permiten relacionar el nuevo perfil observado con un genotipo proporcionado, o caracterizar un nuevo genotipo, por análisis Filogenético.
También se describe un vector recombinante, particularmente un plásmido que comprende un inserto constituido por una molécula de ácido nucleico tal como se define anteriormente.
También se describe una célula transformada por una molécula de ácido nucleico tal como se define anteriormente.
Se describen también productos de traducción codificados por una de las moléculas de ARN de las secuencias SEC ID Nº: 1, 6, 11, 16, 21 y 26 que corresponden respectivamente a los ARN genómicos completos de aislados o variantes denominadas respectivamente dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 y dFr644 o por sus secuencias sentido o antisentido complementarias
También se describen las proteínas codificadas por el genoma de una variante del HDV tal como se define anteriormente. De acuerdo con un modo de realización ventajoso de la invención, dicha proteína se selecciona del grupo constituido por:
- -
- la proteína LHD de dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 y dFr644 que presenta respectivamente las secuencias SEC ID Nº: 3, 8, 13, 18, 23 y 28 y
- -
- la proteína sHD de dFr45, dFr47, dFr73, dFr910, dFr48 y dFr644 que presenta respectivamente las secuencias SEC ID Nº: 5, 10, 15, 20, 25 y 30.
La presente invención también tiene por objeto un péptido, caracterizado por que está constituido por un fragmento de una proteína tal como se define anteriormente, seleccionado del grupo constituido por:
- -
- el péptido A constituido por los 19 aminoácidos del extremo carboxi-terminal de las secuencias SEC ID Nº: 3, 8, 13, 18, 23 y 28,
- -
- el péptido B de secuencia (código de una letra) RLPLLECTPQ (SEC ID Nº: 59) constituido por los 10 aminoácidos del extremo carboxi-terminal de las secuencias SEC ID Nº: 3, 8, 13, 18, 23 y 28, y
- -
- el péptido C constituido por los 9 aminoácidos anteriores a la secuencia SEC ID Nº: 59 (SEC ID Nº: 60 a SEC ID Nº: 65).
Dichos péptidos se utilizan para el diagnóstico indirecto (serología) de una infección por HDV, particularmente para un método inmunoenzimático (ELISA):
- -
- el péptido B, que está conservado, permite la detección del conjunto de las variantes de acuerdo con la invención y del genotipo II del HDV, y -el péptido C es específico de diferentes variantes del HDV de acuerdo con la invención.
Para la preparación de un kit de detección y del genotipado de un HDV, se describe la utilización de una molécula de ácido nucleico tal como se define anteriormente o de una proteína tal como se define anteriormente.
Además de las disposiciones anteriores, también se describen otras disposiciones, que se desprenderán de la siguiente descripción, que se refiere a ejemplos de realización de la presente invención así como a los dibujos adjuntos en los que:
- la figura 1 representa el árbol filogenético de la región R0 obtenido por el método del vecino más próximo “neighbor-joining”. Los números en cursiva indican los valores de bootstraping (BV) (valores de remuestreo) sobre 104 remuestreos y el signo π indica los BV < 50%. La escala representa el número de sustitución de nucleótidos por sitio.
-la figura 2 representa el árbol filogenético de las regiones R0 del HDV obtenido por el método de máxima parsimonia. Los aislados Perú1, Perú2 y Colombia se seleccionan como “outgroup” (“grupo externo”). Las cifras en cursiva indican los valores de remuestreo (BV) sobre 104 remuestreos,
-la figura 3 ilustra los datos clínicos de cada uno de los seis pacientes infectados por los aislados del HDV de origen africano.
* indica las PCR 6S/6As y PCR R0, respectivamente
-la figura 4 representa el árbol filogenético de genomas completos del HDV, obtenido por el método del vecino más próximo “neighbor-joining”. Los números en cursiva, a nivel de cada nudo, indican los valores de remuestreo (BV) sobre 104 remuestreos. La escala representa el número de sustitución de nucleótidos por sitio.
- -
- la figura 5 representa el árbol filogenético de genomas completos del HDV, obtenido por el método de máxima parsimonia. Los números en cursiva, a nivel de cada nudo, indican los valores de remuestreo (BV) sobre 104 remuestreos.
- -
- la figura 6 representa el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las proteínas delta de seis aislados de origen africano (líneas 7, 8, 9, 10, 11 y 12) con las secuencias conocidas del genotipo I (líneas 13, 14 y 15), genotipo II (líneas 3, 4, 5 y 6), genotipo III (línea 16) y TW2b/Miyako (líneas 1 y 2), usando el programa informático Clustal (versión 1.8). El aminoácido en la posición 196 de la proteína p27 corresponde al codón de terminación de la proteína p24 (Z) o al codón triptófano (W) que conduce a la síntesis de la proteína p27 que se extiende desde los aminoácidos 1 a 215.
Debe entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se proporcionan únicamente a modo de ilustración del objeto de la invención, por lo que no constituyen de modo alguno ninguna limitación. EJEMPLO 1: MATERIALES Y MÉTODOS 1- Pacientes y muestras
Se analizaron 22 sueros procedentes de sujetos sometidos a seguimiento en diferentes centros hospitalarios de la región parisina. Los pacientes eran portadores crónicos del Ag-HBs. El diagnóstico de la infección delta se efectuó investigando marcadores serológicos (Ag-HD, anti-AgHD de tipo IgM e IgG) y la detección del genoma viral del HDV por RT-PCR. En ninguno de los sueros analizados se detectó Ag-HD. En todos los pacientes se encontraron anticuerpos anti-AgHD del tipo IgM que manifiestan la cronicidad de la infección delta y de tipo IgG. En seis pacientes se caracterizó todo el genoma del HDV. Hasta la extracción del ARN viral, todos los sueros se conservaron a -80ºC. 2- Extracción del ARN del HDV
Para extraer el ARN del HDV, se añadió un volumen de 250 μl de suero a 75 μl de Reactivo TRIzol RS (Gibco BRL, Life Technologies). Después de 30 segundos de homogeneización, la mezcla se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. La extracción de los lípidos se efectuó añadiendo 200 μl de cloroformo enfriado a +4ºC. Después de otra homogeneización sometida a agitación vorticial, los tubos se incubaron y después se centrifugaron a 14000 revoluciones por minuto (rpm) durante 10 min a +4ºC. La fase acuosa se transfirió a tubos de extracción y los ARN se precipitaron por 500 μl de isopropanol frío, en presencia de 1 μg de glucógeno. Después de 15 min de homogeneización, las muestras se centrifugaron a 14000 rpm durante 10 min, a +4ºC. Después de aclarar con etanol al 70%, los tubos se centrifugaron de nuevo a 14000 rpm durante 10 min, a +4ºC. Los sedimentos se secaron en una campana a temperatura ambiente, después se volvieron a llevar a 100 μl de agua estéril que comprendía un inhibidor de ribonucleasas (RNasin, Promega). En esta etapa, se tomaron precauciones para evitar eventuales contaminaciones por parte de las ribonucleasas en los tampones y en las muestras. 3- Síntesis de un ADN complementario (ADNc)
Esta etapa consiste en sintetizar una cadena de ADN complementaria del ARN del HDV por transcripción inversa. Para eliminar la estructura secundaria del ARN del HDV, se añadieron 5 μl de ARN del extracto anterior a una mezcla de reacción que contenía 5 μl (ó 0,5 pmoles) de desoxinucleótidos
5 trifosfato (dNTP) y 1 μl (0,4 pmoles) de hexanucleótidos aleatorios. A continuación los ARN se desnaturalizan durante 3 min a 95ºC. Para fijar los ARN desnaturalizados, los tubos se congelan inmediatamente en etanol enfriado a -20ºC. Diez μl de una mezcla de reacción, que contenía 2,5 μl de ditiotreitol (DTT), 100 unidades (U) de transcriptasa inversa Superscript II, (Gibco BRL, Life Technologies) y su tampón de reacción, así como 20 U de inhibidor de ribonucleasas (RNasin, Promega)
10 se añadieron al ARN desnaturalizado. La reacción de la transcripción inversa se efectuó a 42ºC durante 45 min, después se detuvo mediante incubación a 94ºC durante 5 min. Después, los ADNc se conservaron a -80ºC.
La amplificación de los ADNc se efectúa, de manera exponencial, por PCR (Reacción en
15 Cadena de Polimerasa) (Polymerase Chain Reaction). Se utilizaron dos tipos de polimerasas: la polimerasa AmpliTaq Gold (Thermophilus aquaticus) (PE Applied Biosystems) y la polimerasa Pwo (Pyrococcus woesi) o Expand ™ High Fidelity PCR System (Roche).
La amplificación se efectuó a partir de 5 μl de ADNc que se añadieron a una mezcla de reacción de PCR que contenía: 0,25 pmoles/μl de cebador sentido y antisentido (Tabla III), 200 μmoles 20 de cada dNTP, 1,5 mM de MgCl2, 1 U de AmpliTaq Gold ó 2,6 U de polimerasa Expand ™ en presencia de los tampones PCR correspondientes. La reacción de PCR se realizó en un termociclador (PCR Sprint, Hybaid, Coger), de acuerdo con el siguiente protocolo: desnaturalización de híbridos ADNc – ARN a 94ºC durante 9 min, seguido de 40 ciclos sucesivos, comprendiendo cada uno una desnaturalización de los ADN a 94ºC durante 45 s, una hibridación de cebadores (900S/1280As o 6S/6As) a 58ºC durante 30 s,
25 síntesis de la cadena complementaria gracias a la polimerasa por elongación a 72ºC durante 45 s. Finalmente, una elongación final a 72ºC durante 4 min 30 s a 72ºC.
- 6S
- gaggaaagaaggacgcgagacgcaa SEC ID Nº: 31 904-929
- 6As
- accccctcgaaggtggatcga SEC ID Nº: 32 1141-1121
- 900S
- catgccgacccgaagaggaaag SEC ID Nº: 33 889-911
- 1280As
- gaaggaaggccctcgagaacaaga SEC ID Nº: 34 1289-1265
- 318S
- ctccagaggaccccttcagcgaac SEC ID Nº: 35 305-328
- 1150As
- cccgcgggttggggatgtgaaccc SEC ID Nº: 36 1161-1138
- 960S
- gtacactcgaggagtggaaggcg SEC ID Nº: 37 962-984
- 345As
- tctgttcgctgaaggggtcct SEC ID Nº: 38 331-311
- Cebadores Secuencia 5’ -> 3 ’ número de identificación posiciones*
- 320S ccagaggaccccttcagcgaac SEC ID Nº: 39 307-328 420As aacaccctcctgctagcccc SEC ID Nº: 40 446-427 R910S ccggagttcctcttcctcctcc SEC ID Nº: 41 1206-1227 R910AS gttcgcgtcegagtccttettte SEC ID Nº: 42 929-907 S1910R gagctttcttcgattcggac SEC ID Nº: 43 1531-1550 AS1910R gactggtcccctcatgttcc SEC ID Nº: 44 572-553
- * Según la numeración de Wang et al. (Nature, 1986, 323, 508-514; Nature, 1987, 328, 456)
4.1 – Estrategia de amplificación del genoma viral HDV La pareja de cebadores 6S y 6As permite amplificar un fragmento de ADN que corresponde al extremo carboxi-terminal del gen que codifica el antígeno delta. La región R0 comprende el extremo carboxi-terminal del gen que codifica el Ag-HD y
5 una parte de la región no codificante se ha ampliado para todas las muestras usando los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 1280As (SEC ID Nº: 34). El cebador 900S utilizado se ha delecionado de 7 nucleótidos en el extremo 5’, con respecto al utilizado por Casey et al., 1993a, citado anteriormente, para la clasificación de los genotipos del HDV.
La selección de estos cebadores permite, de manera sorprendente, la amplificación de un 10 fragmento adecuado para permitir diferenciar los genotipos conocidos (I, II y III) de los nuevos genotipos.
Se obtuvieron las secuencias completas del genoma viral HDV de cuatro muestras (dFr45, dFr47, dFr48 y dFr73) amplificando dos regiones solapantes R’1 (850 bases) y R’2 (1050 bases), respectivamente, usando los pares de cebadores 318S/1150AS y 960S/345AS.
15 Para la muestra dFr644, la variabilidad observada en la región correspondiente a los cebadores anteriormente descritos ha conducido a amplificar la región 644 (R644) usando un par de cebadores específico: 900S y 480AS. Para la muestra dFr910, la secuencia de nucleótidos R0, ha permitido definir cebadores nuevos y específicos de la muestra para amplificar el genoma completo. Se seleccionaron dos pares
20 cebadores: los cebadores R910S y R910AS, que amplifican un fragmento de 1400 bases que corresponden a la región G910. Para cubrir la totalidad del genoma, ha sido indispensable otro par de cebadores S 1910R y AS 1910 R que amplifican un fragmento de 650 bases (región p910).
La amplificación de las diferentes regiones (R1, R2, R3, R644, R’1, R’2, G910 y p910) se efectuó como se ha descrito anteriormente. En la Tabla IV, se indican las temperaturas de hibridación y 25 de elongación, así como el tiempo de elongación utilizados para cada una de las PCR.
Tabla IV: Amplificación de diferentes fragmentos del genoma
- Regiones Tamaño de los Temperatura de Temperatura
- de Temperatura de
- amplificadas fragmentos (bases) hibridación (ºC) elongación (ºC)
- elongación
- RI 960 62 72
- 1 min 15 s
- R2 1100 56 72
- 1 min 30 s
- R3 650 50 72
- 1 min
- R644 1250 58 72
- 40 s
- G910 1400 58 72
- 1 min 40 s
- p910 650 58 72
- 1 min
- R’1 850 63 72
- 1 min
- R’2 1050 60 72
- 1 min 20 s
Se depositó un volumen de 8 μl de producto PCR en presencia de 2 μl de solución de
5 depósito en un gel de agarosa al 1,3% preparado en un tampón Tris-Borato/EDTA 0,5X y que contenía 0,5 μg/ml de bromuro de etidio (BET). La electroforesis se efectuó en un tampón TBE 0,5X. La migración se efectuó, en presencia de un marcador de tamaño (Raoul™, Appligène). El fragmento amplificado se visualizó con rayos ultravioleta a 312 nm y se fotografió.
6- Clonación y secuenciación de los genomas del HDV
10 Antes de la etapa de clonación y secuenciación, los productos de amplificación se purificaron para eliminar cualquier traza de sales y de enzimas. 6.1.-Elongación mediante Taq-polimerasa convencional
Esta etapa se efectuó en el caso de haber realizado la amplificación del producto con la polimerasa Pwo. Esta permite añadir los restos de desoxiadenosinas (A) en los extremos 3’ de los 15 productos de la PCR, ya que la polimerasa Pwo, dotada de actividad exonucleásica 5’ • 3’, disminuye la
incorporación de desoxiadenosinas.
Se añadió un volumen de 10 μl de ADN purificado a una mezcla de reacción de 70 μl que contenía: 0,2 mM de dNTP, 1,5 mM de MgCl2 , tampón 1X y 2,5 U de Taq Polimerasa (Perkin Elmer). La elongación se efectuó a 72ºC, durante 30 minutos. Los productos de PCR se sometieron
20 entonces a una nueva purificación con fenol-cloroformo y a una precipitación con etanol y después se recogieron en 10 μl de agua estéril.
6.2. Clonación en el vector pCRII-TA (Invitrogen) La clonación se utilizó para confirmar la secuencia de nucleótidos del ADN amplificado. Se realizó usando el vector pCRII (Invitrogen).
25 El vector pCRII se presenta en forma lineal. Posee restos de desoxitimidina (T) que permite la clonación del producto amplificado gracias a los restos complementarios de desoxiadenosina (A) añadidos por la Taq polimerasa. También posee las secuencias promotoras Sp6 y T7, dos sitios de restricción EcoRI que flanquean el sitio de inserción del producto de la PCR y genes de resistencia a ampicilina y a kanamicina. Una fracción del gen lacZα, que codifica la β-galactosidasa, facilita la selección de recombinantes por el color de las colonias. De hecho, los plásmidos que tienen integrado el inserto no expresan el gen lacZα. Las colonias bacterianas son por tanto blancas en presencia del sustrato β-galactosidasa (X-Gal o 5-bromo 4-cloro 3-indoil β-galactósido, Roche) y de un inductor del gen (IPTG
o isopropil-tio β-D-galactósido, Roche). De esta manera, las bacterias recombinantes se seleccionan gracias a su resistencia a la ampicilina y a una selección azul-blanca.
La proporción molecular inserto/vector seleccionada es de 3/1 y el volumen del producto PCR utilizado es variable, según la cantidad de ADN calculado por electroforesis en gel de agarosa como se ha descrito anteriormente. La mezcla de reacción de 10 μl contiene 50 ng de vector pCRII, la cantidad de inserto correspondiente, 4 U de T4 ADN Ligasa, y el tampón Ligasa 1X. La reacción de ligamiento se realiza durante 18 horas a 14ºC. Después los tubos se conservan a +4ºC.
Las bacterias Escherichia coli TOP10F’ (Invitrogen), que se han hecho competentes por tratamiento con cloruro de calcio, se conservan a -80ºC, preparadas para el uso. Un volumen de 50 μl de bacterias competentes se pone en contacto con 3 μl de la solución de ligamiento durante 30 minutos, en hielo. Un choque térmico (30 s a 42ºC) hace que el ADN plasmídico penetre en las bacterias, que se colocan de nuevo inmediatamente en hielo durante algunos minutos, antes de incubarse 1 hora a 37ºC, en 250 μl de medio SOC (Triptona al 2%, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM; MgCl2 10 mM; glucosa 20 mM, extractos de levadura 5 g/l). A continuación se aíslan las colonias en placas de Petri que contienen LB agar (medio de Luria-Bertani), complementado con ampicilina (50 μl/ml), 40 μl de X-Gal (40 mg/ml) y 40 μl de IPTG (100 mM) y se distribuyen. 6.3.-Extracción plasmídica y análisis del inserto
Las colonias blancas se sembraron en caldo LB-ampicilina (50 μl/ml) y se incubaron durante 18 horas, a 37ºC, con agitación. Se conservó una colonia azul, es decir sin fragmento insertado, como control negativo de ligamiento.
La extracción plasmídica se realizó usando un kit comercial QIAprep® Spin Miniprep (Qiagen). En breve, después de la centrifugación (3000 revoluciones por minuto a +4ºC) y la eliminación del sobrenadante, el sedimento bacteriano se suspendió en 250 μl de tampón (Tris-HCl 50 mM pH 8, EDTA 10 mM, RNasa A 100 μl/ml) y se realizó la lisis añadiendo 250 μl de tampón alcalino ((NaOH 200 mM, SDS al 1 %). Después de 5 min de homogeneización, se añadieron 350 μl de tampón (acetato de potasio 3 M, pH 5,5). A continuación, el sobrenadante que contenía el ADN plasmídico se transfirió a una colonia QIAprep. Una centrifugación eliminó el eluado en el tubo colector.
La colonia se lavó usando un tampón de etanol, se secó, y después el ADN se eluyó en 50 μl de agua estéril.
Para verificar la inserción del fragmento de interés, el plásmido se digirió entonces mediante la enzima de restricción EcoRI. La digestión se efectuó en una mezcla de reacción de 30 μl que contenía: 2 μl de la solución plasmídica, 10 U de enzima EcoRI (Appligène) y tampón de reacción 1X. La digestión duró 2 horas a 37ºC y el resultado se visualizó por electroforesis en gel de agarosa.
6.4.-Secuenciación por el método BigDye Terminator
La secuenciación se realizó sobre los productos PCR previamente purificados sobre colonias Microcon 50 (Amicon) o sobre el ADN plasmídico. Los fragmentos se secuenciaron directamente con los cebadores de PCR (fragmento R0 secuenciado con los cebadores 900S y 1280As) o después de la
5 clonación en el vector pCRII utilizando cebadores universales (Sp6 y T7). Para cada una de las regiones amplificadas se conservaron dos clones diferentes, con objeto de eliminar eventuales ambigüedades durante la lectura de las secuencias nucleotídicas. La secuenciación se efectuó usando el reactivo BigDye Terminator (PE, Applied Biosystems). El principio de secuenciación consiste en una electroforesis vertical en gel de poliacrilamida del ADN
10 marcado por cuatro fluorocromos diferentes. Las matrices del ADN se depositan sobre el gel y se separan según su tamaño, antes de someter el gel a un haz de láser continuo. El láser excita los fluorocromos emitiendo cada uno a una longitud de onda diferente, detectada por un espectrógrafo. Un programa informático, acoplado al secuenciador, permite el análisis automático y la conversión de los datos en secuencias nucleotídicas.
15 La mezcla de reacción de 10 μl comprende: 4 μl de la solución de marcado (desoxinucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, dUTP), AmpliTaq ADN polimerasa, MgCl2, Tampón Tris-HCI pH 9), 20 pmoles de cebador (sentido o antisentido) y 500 ng de plásmido purificado en las colonias de tipo Centricon. Las reacciones de las secuencias (sentido y antisentido) se efectúan en un termociclador de tipo Perkin 9600, con 25 ciclos (96ºC durante 10 s; 50ºC durante 5 s; 60ºC durante 4 min). Les productos
20 se precipitan a continuación en 40 μl de etanol al 70%, se depositan en gel y se analizan usando un secuenciador automático de tipo ABI PRISM 377. Las secuencias brutas obtenidas se presentan en forma de electroforegramas. La validación y el aprovechamiento de las secuencias se realizan usando el programa informático Séquence Navigator (PE, Applied Biosystems). Con la finalidad de minimizar errores, éstas son objeto al menos de una doble
25 lectura, por dos cebadores de secuenciación diferentes (Sentido y Antisentido). A continuación estas secuencias se introducen en un ordenador utilizando el programa informático DNA Strider 1.3 que permite un análisis rápido de las secuencias.
30 Las secuencias leídas y corregidas se comparan y se someten a diferentes algoritmos filogenéticos. Las secuencias obtenidas (22 secuencias) se han comparado con 21 secuencias genómicas completas del HDV disponibles en el GenBank (Tabla V) Tabla V: Números de acceso de diferentes aislados
Números de acceso (GenBank) Nombre del aislado Origen geográfico 1 X04451 Italia 1 (A20) Italia 2 M84917 Lebanon 1 Líbano 3 X85253 Paciente A. Cagliari (Italia)
- Números de acceso (GenBank)
- Nombre del aislado Origen geográfico
- 4 X60193
- 18/7/83 (paciente S) (paciente S) Japón
- 5 M92448
- Taiwán Taiwán
- 6 L22061
- Columbia Colombia
- 7 X77627
- Suero humano China central
- Chino
- 8 L22064
- Perú-2 Perú
- 9 L22063
- Perú-1 Perú
- 10 L22066
- US-2 Estados Unidos
- 11 M58629
- Nauru Isla de Nauru
- 12 U81988
- Somalia Somalia
- 13 U81989
- Etiopía 1 Etiopía
- 14 AF098261
- Canadá Canadá (Quebec)
- 15 U19598
- Taiwán 3 Taiwán
- 16 AF018077
- TW2b Taiwán
- 17 L22062
- Japón 3 Japón
- 18 AF309420
- Miyako Isla de Miyako (Okinawa, Japón)
- 19 D01075
- Us- 1 Estados Unidos
- 20 M21012
- W15 Transmisión experimental
- (Marmotte)
- 21 AJ307077
- W5 Transmisión experimental
- (Marmotte)
- 22 AJ309868 a AJ309881
- Aislados de Yakouti (Rusia)
- Yakouti
La primera etapa consiste, en general, en alinear las secuencias de interés con las secuencias HDV de referencia descritas y catalogadas en el banco de datos (Genbank), utilizando el programa CLUSTAL W1.8 (Thompson et al., N.A.R, 1994, 22, 4673-4680). Han sido necesarias
5 correcciones manuales menores usando el programa informático SeqPup para optimizar el alineamiento.
Se han seguido dos enfoques: la utilización del alineamiento de proteínas para el gen HD y el estudio de la estabilidad de las posiciones alineadas usando un programa informático de alineamiento adaptado.
A partir de este alineamiento de secuencias nucleotídicas, se construyen árboles
10 filogenéticos mediante diferentes algoritmos. Los análisis están basados en matrices de distancias (enfoque fenético), cálculos de máxima parsimonia (MP; enfoque cladístico) y de máxima verosimilitud (ML; enfoque estadístico).
- -
- enfoque fenético (distancia genética)
El principio de este método es encontrar pares de secuencias vecinas, minimizando la longitud total de las ramas del árbol. Este enfoque permite reconstruir una filogenia sobre la base de cálculo de la similitud global entre las secuencias comparadas dos a dos que se expresa por una distancia. Es un método que permite convertir los datos de las secuencias en valores numéricos de distancias, dispuestos en matrices. La topología del árbol se construye para reagrupar las secuencias que poseen la mayoría de los caracteres en común, utilizando uno de los métodos de reagrupamiento como el método del vecino más próximo o “neighbor-joining” (Saitou et al., 1987).
- -
- enfoque cladístico (máxima parsimonia)
El principio de este método consiste en establecer relaciones de parentesco entre las secuencias mediante la búsqueda de bases nucleotídicas compartidas, minimizando los sucesos genéticos. El algoritmo de máxima parsimonia construye un árbol filogenético de tal manera que implica el mínimo de mutaciones. El árbol aceptado es el que necesita menos cambios. Este método es sensible a las diferentes tasas de mutaciones a lo largo de las ramas. Los grupos de secuencias que comparten un ancestro común constituyen los “clados” o “grupos monofiléticos, excluyendo cualquier otra secuencia.
-enfoque estadístico
El método de máxima verosimilitud se considera como un enfoque estadístico. El programa calcula la probabilidad para que una secuencia evolucione hacia otra a lo largo del tiempo. En otras palabras, se trata de considerar los cambios a nivel de cada sitio o carácter como sucesos probabilísticos independientes. Este algoritmo de verosimilitud se acumula en todos los sitios y la suma se maximiza para calcular la longitud de la rama del árbol. Este método necesita un tiempo de cálculo considerable para buscar el árbol filogenético, el más verosímil, que corresponde a las secuencias observadas de manera que tiene en cuenta la probabilidad de cambio de cada carácter.
Todos los análisis filogenéticos se han realizado utilizando los programas informáticos Phylip 3.75 (PHY Logenetic Inference Package) (Felsenstein et al., 1989) y Paup * versión 4. Obêta6 (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) (Swofford et al., 1998).
El análisis de distancia se ha calculado por el método de Kimura de dos parámetros, que considera como diferentes los índices de transición (mutaciones T <-> C et G <-> A) en cada sitio, y de transversión (mutaciones « A o G » <---> « T o C ») en cada sitio.
La fiabilidad y la robustez de los grupos de secuencias (o topologías) se evalúan estadísticamente por el enfoque de remuestreo (o bootstrap) sobre 103y 104 remuestreos.
Los resultados obtenidos se presentan en forma de un árbol filogenético visualizado por el programa Treeview (versión 1.6.5), que propone diferentes presentaciones del árbol (cladograma, radial y filograma). También permite visualizar los valores de remuestreo (bootstrap), en cada nudo y determinar un taxón como grupo externo (secuencias del genotipo-III).
La traducción en aminoácidos del gen delta se efectúa usando el programa DNAStrider versión 1.3. El alineamiento de las secuencias proteicas se realiza como se ha descrito anteriormente.
8- Análisis genotípico del HDV por polimorfismo de restricción (RFLP)
El genotipado del HDV se efectúa por PCR-RFLP de la región R0, según las siguientes
etapas:
- -
- Etapa 1: Las dos enzimas de restricción SmaI y XhoI (New England Biolabs) digieren los productos PCR: 5 U de enzimas SmaI o XhoI, digieren por separado, en dos tubos, 10 ?1 de producto amplificado, a 30ºC y 37ºC, respectivamente durante 3 horas en un volumen final de 50 μl en presencia de tampón apropiado y agua estéril. Los productos de digestión se visualizan con rayos ultravioleta como se ha descrito anteriormente y se determinan los tamaños de los fragmentos por comparación con un marcador de tamaño (50 pb escala de ADN o marcadores V y VI, Life Technologies GibcoBRL).
- -
- Etapa 2: Otra enzima, SacII (New England Biolabs), digiere durante 3 horas a 37ºC , las muestras que presentan un perfil distinto al perfil del genotipo I, y los productos de digestión se visualizan como en la etapa 1.
- -
- Etapa 3: el genotipo del virus se determina a partir del análisis de la combinación de perfiles de restricción SmaI, XhoI y SacI.
9- Algoritmo de genotipado del HDV por PCR-RFLP
El algoritmo de genotipado del HDV por PCR-RFLP comprende al menos dos etapas:
- la primera, consiste en la escisión del fragmento R0, amplificado por RT-PCR a partir de los ARN
extraídos de sueros de pacientes, por dos enzimas de restricción, Smal y Xhol; -la segunda, para los pacientes de “perfil no-I”, consiste en una escisión de R0 por la enzima SacII; -la secuenciación de la región R0 o de la región que codifica la p24 (o si es necesario la totalidad del
genoma), seguido de análisis filogenético sólo se realizará en segundo lugar si se obtienen perfiles de restricción no habituales.
EJEMPLO 2: DEMOSTRACIÓN DE NUEVOS GENOTIPOS DEL HDV
1- Análisis filogenético de la región R0
Se analizaron 22 muestras de pacientes infectados por HBV y HDV. La región R0 se amplificó por PCR y después el fragmento obtenido se secuenció utilizando los cebadores 900S y 1280As.
El estudio filogenético se efectuó a partir de un alineamiento de secuencias de 336 bases de R0 (las regiones ambiguas se eliminaron), incluyendo, además de las 22 secuencias estudiadas, 15 secuencias de referencia y 6 secuencias R0 del HDV de Yakouti (Pt13, 26 (SEC ID Nº: 66), 29, 62 (SEC ID Nº: 67), 63 y 704). El nombre proporcionado a las secuencias corresponde a dFr (por “delta Francia”) seguido de un número de suero del paciente. a) análisis de la distancia genética
En la figura 1 se presenta el árbol filogenético, obtenido por reconstrucción a partir de distancias genéticas de la región R0.
La topología del árbol individualiza los genotipos I y III, representados respectivamente por siete y tres secuencias nucleotídicas de referencia. Las otras secuencias de referencia se representan por las secuencias de tipo II (Japón, Taiwán-3 y las secuencias de Yakouti) y un grupo de dos secuencias (TW2b, Miyako) descritas respectivamente cada una como prototipo de « sub-tipos IIB y IIC ».
Este árbol demuestra que las secuencias virales que provienen de 22 muestras analizadas corresponden a dos situaciones:
- -
- 11 secuencias están afiliadas a las secuencias del genotipo I, a excepción de la secuencia dFr46, que parece estar emparentada con la secuencia Us-1 descrita por Makino (Makino et al., 1987); todas estas secuencias se distribuyen de manera heterogénea dentro del genotipo-L. -las 11 secuencias restantes están muy alejadas del genotipo-I y del genotipo-III. Además, ninguna de estas secuencias se reagrupa directamente con las secuencias de tipo-II (Japón, Taiwán-3, Yakouti 13, 26, 29, 62, 63, 704) o con el grupo de secuencias (TW2b, Miyako); estas secuencias de referencia forman en sí mismas dos grupos distintos.
La topología del árbol, obtenido por reconstrucción a partir de distancias genéticas de la región R0, muestra que las moléculas nucleicas aisladas a partir de diversos HDV variantes se distribuyen dentro de cuatro sub-grupos (figura 1): la molécula dFr644 que aparece aislada; posee sin embargo, con un grupo de tres moléculas (dFr45, dFr2066 y dFr1843), un nudo que se sostiene por un valor de remuestreo de solamente el 66,7%,
- -
- en cambio, la rama que une las moléculas dFr45, dFr2066, dFr1843 es robusta, al sostenerse por un valor de remuestreo (BV) del 99,9%. -un conjunto de cinco moléculas: dFr47, dFr910, dFr69, dFr73 y dFr1953 se sostiene por un valor BV
del 100% y -un par de moléculas dFr48 y dFr2020, que también se sostiene por un BV del 100 %. b) análisis de máxima parsimonia
En la figura 2 se presenta el árbol filogenético, obtenido por reconstrucción a partir de la máxima parsimonia de la región R0.
El análisis de máxima de parsimonia sostiene la misma topología que el análisis de la distancia genética. La reconstrucción demuestra la existencia dentro de 11 secuencias variantes, de los mismos tres grupos monofiléticos; por ejemplo, con este enfoque, el grupo de cinco moléculas dFr47, dFr910, dFr69, dFr73 y dFrl953 también se sostiene por un BV del 97% (Figura 2).
Las 11 moléculas variantes, las moléculas del genotipo II y el conjunto [TW2b, Miyako] parecen derivar de una rama común que podría, por comparación con las secuencias del genotipo I y del genotipo III, individualizar el conjunto de las secuencias del genotipo II. Por lo tanto, los valores de remuestreo que sostienen esta ramificación son relativamente modestos: 88,5 % en NJ y 64,5 % en MP (remuestreo efectuado sobre 104 muestras) en comparación con las del genotipo-I (BV = 99.8 %) y el genotipo-III (BV= 100 %). Además, la distancia media entre los diferentes subgrupos definidos dentro de las 11HDV variantes o entre estas variantes y las secuencias del genotipo II, parece más elevado que entre el conjunto de aislados del genotipo I o dentro de las tres moléculas que definen el genotipo III.
El conjunto de estos resultados destacan la caracterización de nuevos genotipos del HDV.
a) Reconstrucción del genoma completo a partir de fragmentos amplificados
Con objeto de estudiar el genoma completo de estas variantes y, en el caso de precisar su afiliación, se amplificaron varias regiones del genoma HDV (Tabla II) a partir de 6 muestras que incluyen al menos un miembro de cada uno de los 4 sub-grupos y se seleccionaron tres representantes del grupo
5 mayoritario: dFr45, dFr47, dFr48, dFr73, dFr644 y dFr910. De manera más precisa, se han amplificado los siguientes fragmentos por PCR (Tabla IV):
- fragmentos de 850 pb (R’I) y 1050 pb (R’2) solapados en sus extremos por dFr45, dFr47, dFr48 y dFr73, 10 - dos fragmentos solapantes de 960 pb y de 1250 pb para dFr644, y -dos fragmentos de 1400 pb y 650 pb para dFr910.
Todas estas regiones genómicas amplificadas se han clonado en un vector pCRII (Tabla IV). Se han secuenciado dos clones correspondientes a cada uno de los fragmentos amplificados. La reconstrucción de las secuencias completas consenso de ADNc del HDV se ha efectuado después del
15 alineamiento de las regiones solapantes y el alineamiento con las secuencias de referencia. Tabla VI: Clones de pcRII que contienen los diferentes insertos
- R0
- R’1 R’2 G910 R1
- dFr45
- - dFr45R’1 clon 2 dFr45R’1 clon 4 dFr45R2 clon 8 dFr45R2 clon 10 - -
- dFr47
- - dFr47R’1 clon 13 dFr47R’1 clon 16 dFr47R2 clon 19 dFr47R2 clon 22 - -
- dFr48
- - dFr48R’1 clon 23 dFr48R’1 clon 28 dFr48R2 clon 19 dFr48R2 clon 22 - -
- dFr73
- - dFr73R’1 clon 36 dFr73R’1 clon 39 DFr73R2 clon 29 dFr48R2 clon 33 - -
- dFr644
- - - - - 644R1 clon 4 644R1 clon 8
- dFr910
- 910R0-clon 4 910R0-clon 4 - - R910 clon R910 clon 31 29 910R1 clon 4 910R1 clon 5
b) Análisis de seis nuevas secuencias genómicas completas del HDV, de origen africano
20 b1) Características clínicas de 6 pacientes Cinco pacientes son originarios del África del Oeste, y un paciente ha pasado temporadas en Camerún. En el momento de la extracción, esos pacientes residían en la región parisina desde al menos dos años. Todos estos pacientes padecían hepatitis grave y en la figura 3 se resumen los datos clínicos.
25 b2) Organización genómica de nuevas secuencias del HDV
El análisis comparativo de las regiones R0 de 22 pacientes infectados por HDV y HBV con las disponibles en las bases de datos demuestra la gran diversidad genética del genoma viral del HDV.
El tamaño de los genomas completos es diferente en las seis secuencias de los seis aislados del HDV de origen africano, lo que confirma la variabilidad del HDV:
- -
- el genoma viral de los aislados dFr910, dFr47 y dFr73 que comprende 1697 nucleótidos es el más largo jamás descrito para el HDV.
- -
- el genoma del aislado dFr45 aparece entre los más pequeños (1672 nt), y
- las secuencias genómicas de los virus dFr644 y dFr48 son respectivamente de 1680 nt y 1687 nt.
El análisis después del alineamiento de las diferentes secuencias estudiadas, revela un grado elevado de conservación en las regiones del genoma HDV correspondiente a las ribozimas responsables de las escisiones de los ARN genómicos y antigenómicos. Asimismo, la fase de lectura que codifica el antígeno delta se encuentra en la cadena antigenómica. Un codón triptófano (UGG) es el único caracterizado por dos secuencias (dFr47, dFr910) y una ambigüedad (G/A) encontrada para las otras cuatro secuencias indica que probablemente la pequeña y gran proteína delta están muy probablemente sintetizadas. Las regiones variables comprenden la parte no codificante así como los extremos 5’ y 3’ del gen LDH. De manera notable, existe una inserción de 7 nucleótidos en la secuencia dFr48. Esta inserción está presente en un bucle correspondiente a uno de los extremos del genoma en su forma pseudo doble cadena (en la posición 797 de la secuencia de referencia italiana (Wang et al., 1987)). c) Comparación de seis secuencias HDV de origen africano con las secuencias representativas de diferentes genotipos
La comparación de seis nuevas moléculas con las moléculas conocidas, representativas de tres genotipos conocidos, indica una similitud nucleotídica que se sitúa entre el 71,7% (dFr45 frente a Líbano) y el 80,0% (dFr73 frente a Yakouti p26) en relación con las moléculas de los genotipos I, II y las moléculas TW2b y Miyako. De hecho, para cada uno de los seis aislados, el promedio de similitud nucleotídica es del orden del 73,3% al 74,6% con las moléculas del genotipo I, del 74,5% al 78,8% con las del genotipo II y del orden del 74,6% al 77,8% con las moléculas TW2b/Miyako. En cambio, la similitud nucleotídica con el asilado de Perú (genotipo III), sólo es del 63,9% al 66,0% lo que confirma el distanciamiento particular de esta molécula (Tabla VII). Además, cuando se comparan entre sí, las seis moléculas que corresponden a estos genomas completos y que definen las seis variantes dFr45, dFr47, dFr48, dFr73, dFr644 yt dFr910, sólo el grupo de moléculas dFr73, dFr910 y dFr47 presentan una similitud de secuencia del orden del 90%. Las moléculas de dFr45, dFr48 y dFr644 también están distanciadas entre sí con respecto a los genotipos I, II, las secuencias TW2b / Miyako y el grupo de moléculas dFr73, dFr910 y dFr47 (del orden del 73,2% al 78%) (Tabla VIII). Tabla VII: Porcentaje de similitud de las secuencias completas HDV africanas con los diferentes genotipos conocidos (Cálculo de la media).
- Aislados HDV*
- Tipo I Tipo II TW2b/Miyako Tipo III
- dFr45
- 73,3 71,7 - 74,6 74,5 73,2 - 75,5 74,6 66
- dFr47
- 74,2 73,0 - 75,0 78,6 78,2 - 79,9 77,4 65,5
- dFr48
- 73,3 72,0 - 74,0 77,1 76,6 - 77,7 75,5 74,4 - 76,6 65,4
- dFr73
- 74,1 73,0 - 75,0 78,8 77,7 - 80,0 77,8 77,5 - 78,0 65,9
- dFr644
- 73,6 72,2 - 74,6 76,8 76,2 - 77,2 77,0 76,9 - 77,2 63,9
- dFr910
- 74,6 73,0 - 75,8 77,9 77,0 - 78,6 77,2 77,0 - 77,5 64,6
- * Los aislados HDV de referencia corresponden a los genomas completos estudiados en el ejemplo 2.1.
- dFr47
- dFr48 dFr73 dFr644 dFr9/0
- dFr45
- 74,8 73,2 75 78 74,7
- dFr47
- 77,1 90 76,3 89
- dFr48
- 77,7 75,5 76,1
- dFr73
- 76,3 89
- dFr644
- 76,1
d) Análisis filogenético de seis moléculas del HDV de origen africano y moléculas representativas de diferentes genotipos El análisis filogenético se ha realizado en las seis secuencias completas de origen africano,
5 dieciséis secuencias de referencia y dos secuencias de Yakouti (Pt26 y Pt62). La Figura 4 ilustra los resultados obtenidos por análisis de distancia. El árbol filogenético reconstruido por el "vecino más próximo" (“Neighbor-Joining”) (NJ)) muestra que ninguna de las seis secuencias estudiadas (dFr45, dFr47, dFr48, dFr73, dFr644 y dFr9l0) se reagrupa con las secuencias de referencia de genotipo I o de genotipo III. La afiliación de estas secuencias africanas con las secuencias de los genotipos II (de las
10 secuencias TW2b y Miyako descritas respectivamente como los sub-tipos IIB y IIC) no se sostiene, por valores de remuestreo elevados (<70%) (Wu et al., 1998). Además, las secuencias TW2b y Miyako parecen formar un grupo distinto y monofilético con un BV del 100%. Estas dos secuencias parecen constituir por sí mismas un “clado” que representa un genotipo diferente del tipo II. En los análisis de distancia, las seis secuencias africanas se subdividen en 3 subgrupos distintos
15 (soportados por BV superiores al 90,3% para 104 remuestreos). Las secuencias dFr47, dFr73 y dFr910 constituyen un grupo cuya rama se basa en un valor de bootstrap del 100%. Para reafirmar estos resultados, se realizó el estudio de máxima parsimonia en el mismo juego de secuencias (Figura 5).
Arraigando, el árbol de manera artificial gracias a la secuencia 'Perú 1', se individualiza, como en todos los análisis realizados anteriormente, el conjunto de secuencias del genotipo-I (BV = 100%). La topología de otras secuencias sostiene la distribución de los aislados africanos y asiáticos en varios grupos; lo que muestra el interés de la utilización de la región R0. El genotipo II reagrupa las secuencias de Yakouti, Taiwán-3 y Japón con un BV del 99,9 % en 104 remuestreos. Asimismo, se confirma la individualización de TW2b y Miyako (BV = 100%). Por último, las secuencias africanas indican la existencia de al menos 3 subgrupos. La monofilia de las secuencias dFr47, dFr73, dFr9l0 (BV =100 %) sostiene la afiliación de estas secuencias en un subgrupo. En cambio, la secuencia dFr48, que posee con los aislados del grupo anterior (dFr910, dFr47, dFr73) una similitud nucleotídica respectiva de 76,1, 77,1 y 77,7% se reagrupa con estas secuencias solamente en el 55,4% de los remuestreos, lo que sugiere su posible individualización. Aunque que aparecen distantes entre sí, el grupo dFr45 y dFr644, se observa con un BV elevado (NJ = 96,5 / MP = 88,6) en el contexto estudiado.
Por consiguiente, a la vez que los análisis filogenéticos de las regiones R0 y las secuencias completas de las secuencias africanas indican que los grupos difieren entre sí y podrían constituir tres (incluso cuatro) genotipos distintos; estos resultados demuestran la existencia de al menos siete genotipos del HDV.
El Ag-HD está representado por las dos formas p24 (sHD) y p27 (LHD) de la proteína delta. La secuencia proteica de 1 a 194-195 aminoácidos corresponde a la pequeña proteína delta (sHD) o forma p24. La gran proteína delta (LHD) o forma p27 posee el mismo extremo amino-terminal y una extensión de 19 a 20 aminoácidos en su extremo carboxi - terminal.
En la figura 6 se presenta el alineamiento de la secuencia del antígeno HD de seis secuencias africanas con las secuencias de las proteínas HD conocidas.
El análisis de secuencias demuestra que los seis aislados de origen africano tienen una identidad de aminoácidos del orden del 69 al 77% con las secuencias del genotipo I, del 71 al 79% con los aislados del genotipo II, del 72 al 78% con las secuencias TW2b / Miyako y del 63% con el aislado de Perú (genotipo III).
El tamaño de las proteínas que corresponden a los nuevos aislados varía entre 213 y 214 aminoácidos. Todas estas proteínas tienen el mismo perfil de hidrofobicidad. La forma p24 posee 2 pequeñas regiones hidrófobas, una situada cerca de los aminoácidos 50-60 (entre el sitio de polimerización y el SLN) y la otra entre las posiciones 160 y 172 (en frente de un motivo extremadamente conservado). Entre los diferentes genotipos otros dos dominios se encuentran bien conservados: se trata del dominio de fijación al ARN y del dominio de localización nuclear. Como se ha descrito en la bibliografía, en el extremo carboxi-terminal de la proteína delta (entre los aminoácidos 195 y 215) constituye una región hipervariable. Solamente se conservan dos aminoácidos de los 19-20. Se trata de la cisteína (C) que corresponde al sitio de farnesilación de la forma grande de la proteína HD y la glicina (G) carboxi-terminal. Además, se encuentran las secuencias firma específicas de los aislados del mismo genotipo, por ejemplo, los 19 aminoácidos específicos de la proteína grande del genotipo 1 o los 20 aminoácidos del genotipo III.
En cambio, para las secuencias proteicas de los aislados de origen africano, los aislados del genotipo II y de TW2b/Miyako, el extremo carboxi-terminal parece subdividido en dos dominios. El 5 dominio variable se representa por los aminoácidos 197 a 205 y el dominio conservado que va de los
aminoácidos 206 a 215 (RLPLLECTPQ) (Figura 5).
4- Definición de 5 clados del HDV
El análisis de secuencias completas de seis aislados de África permite definir siete clados del HDV correspondientes a los siguientes genotipos (Tabla IX): 10 Tabla IX: Correspondencia Clado/Genotipo
- Clado
- Genotipo Aislados
- 1
- I Italia, W5, W15, Us 1, Us2, Líbano, Etiopía, Somalia, Nauru, China, Cagliari, Canadá...
- 2
- IIA Japón, Taiwán3, Yakouti 26, Yakouti 62
- 3
- III Perú 1
- 4
- IIB, IIC TW2b, Miyako
- 5
- ? dFr9l 0, dFr73, dFr47
- 6
- ? dFr 48
- 7
- ? dFr45, dFr644
EJEMPLO 3: MÉTODO DE GENOTIPADO DEL HDV-1 a HDV-7 por PCR-RFLP
El genotipado se efectúa de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 1.8.
1- Pérdida de sensibilidad de la PCR 6A/6S
Inicialmente, tres pacientes Ag-HBs positivos, han planteado un problema de diagnóstico
15 de infección delta. De hecho en estos pacientes se observa una hepatitis grave asociada con la presencia de IgM anti-HDV pero una ausencia de replicación del HDV por RT-PCR usando los cebadores 6A-6S descritos en Deny et al. (1991, 1993, 1994, citados anteriormente) para el diagnóstico rutinario de la infección por HDV. La PCR 6A/6S amplifica un fragmento del ADNc de 234 pb que corresponden a la parte del extremo carboxi-terminal del gen LHD (posiciones 904 a 1141 en el genoma viral).
20 Los ARN extraídos del suero de estos mismos pacientes se reamplificaron usando un par de cebadores 900S y 1280AS que definen la región R0. Los resultados obtenidos a partir de muestras de estos tres pacientes demuestran la presencia reproductible de una banda de 400 pb (R0) con los cebadores 900S y 1280AS, mientras que la PCR 6A-6S permanece negativa.
25 Estos resultados se confirmaron en una serie de muestras de suero de pacientes que se analizaron en paralelo con el par de cebadores 6A-6S y 900S-1280AS. En 286 muestras, 14 son positivas únicamente con la PCR de R0.
Estos resultados demuestran una especificidad más grande y una mejor sensibilidad de los cebadores 900S y 1280AS, en comparación con los cebadores 6S y 6A, para la detección del ARN del HDV en el suero de pacientes infectados.
2- Perfiles de restricción esperados para HDV-1 a HDV-7
5 Los métodos clásicamente utilizados de PCR-RFLP (Wu et. al., 1995a; Wu et al., 1995b; Casey et al., 1996) permiten distinguir tres genotipos delta diferentes. La utilización de la enzima de restricción SmaI no diferencia todos los genotipos -I, -IIA, -IIB reconocidos actualmente y la enzima Xhol se ha utilizado para diferenciar el «sub-tipo IIA» del «sub-tipo IIB» (Wu et al., 1995b).
La asociación de dos enzimas SmaI y XhoI en una primera etapa revela siete perfiles
10 distintos (de P1 a P7) (Tabla X). Estos siete perfiles no se superponen exactamente con los siete clados (HDV-1 a HDV-7). Como consecuencia, las muestras de perfil «no-P1» se escinden en una segunda etapa mediante la enzima SacII, dando como resultado de esta manera la obtención, de manera combinada, de diez perfiles delta distintos (de D1 a D10) (Tabla XI) que pueden unirse específicamente con los diferentes clados descritos, gracias a los análisis de filogenia.
15 Tabla X: Perfiles de restricción escindidos de la Región R0, por las enzimas SmaI et XhoI. ETAPA 1 Fragmentos Perfil Fragmentos Perfil Perfil Genotipos SmaI Tamaño SmaI XhoI Tamaño XhoI Combinado descritos (pb) (pb) SmaI -XhoI I 220,179 S1 383,16 X1 S1 X1 P1 IIA 397 S2 303,78,16 X2 S2 X2 P2 IIB 397 S2 319,79 X3 S2 X3 P3 IIC (Miyako) 397 S2 157,162,79 X4 S2 X4 P4 III 298,107 S3 405 X5 S3 X5 P5
II Yakouti 178,117,110 S4 303,78,16 X2 S4 X2 P6 dFr45 217,179 S1 303,78,16 X2 S1 X2 P7 dFr644 217,179 S1 303,78,16 X2 S1 X2 P7 dFr47, 73, 910 179,111,107 S4 303,78,16 X2 S4 X2 P6 dFr48 397 S2 303,78,16 X2 S2 X2 P2
- ETAPA
- 2 Genotipos Fragmentos Perfil Perfil Combinado
- descritos
- SacII SacII SmaI-XhoI/SacII
- Tamaño (pb)
- I
- 362,38 sc1 S1 X1 Sc1 D1
- IIA
- 266,92,38 Sc2 S2 X2 Sc2 D2
- IIB
- 268,130 Sc3 S2 X3 Sc3 D3
- IIC (Miyako)
- 268,130 Sc3 S2 X4 Sc3 D4
Tamaño (pb)
II Yakouti 266,92,38 Sc2 S4 X2 Sc2 D6 dFr45 268,130 Sc3 S1 X2 Sc3 D7 dFr644 397 Sc4 S1 X2 Sc4 D8 dFr47, 73, 910 268,130 Sc3 S4 X2 Sc3 D9 dFr48 268,130 Sc3 S2 X2 Sc3 D10
3- Genotipado de muestras de pacientes por PCR-RFLP
A partir del análisis de muestras por PCR-RFLP (más de 50): -no se ha encontrado ningún genotipo-II ó –III. -el 89,7% de los pacientes presentaban un perfil D1 (genotipo I) y el 10,3% un perfil « no-I »
- se detectaron dos nuevos perfiles XhoI (X6 y X7) que conllevan tres combinaciones nuevas (D11, D12 y D13) complementarias (Tablas XII y XIII).
- ETAPA 1
- Fragmentos SmaI Perfil Fragmentos XhoI Perfil Perfil Combinado
- PACIENTES
- Tamaño (pb) SmaI Tamaño (pb) XhoI SmaI-XhoI
- dFr1843
- 218, 179 S1 303, 78, 16 X2 S1 X2 P7
- dFr1953
- 218, 179 S1 303, 78, 16 X2 S1 X2 P7
- dFr2020
- 392 S1 303, 73, 16 X2 S2 X2 P2
- dFr2088
- 220, 179 S1 242, 171, 16 X6 S1 X6 P8
- dFr2066
- 217, 179 S1 237, 66, 16 X7 S1 X7 P9
Tabla XIII: Nuevos perfiles de restricción XhoI, SmaI, SacII, obtenidos en cinco pacientes 10 originarios de África del Oeste
- ETAPA 2 PACIENTES
- Fragmentos SacII Tamaño (pb) Perfi l SacII Perfil Combinado (SmaI-XhoI / SacII)
- dFr1843 dFr1953 dFr2020 dFr2088 dFr2066
- 267, 130 267, 92, 38 262, 130 396 396 Sc3 Sc2 Sc3 Sc4 Sc4 S1 X2 Sc3 S1 X2 Sc2 S2 X2 Sc3 S1 X6 Sc4 S1 X7 Sc4 D7 D11 D10 D12 D13
La correspondencia entre los perfiles combinados y los genotipos identificados por el análisis filogenético se presenta en la Tabla XIV.
Tabla XIV: Resumen de los diferentes resultados basados en los análisis filogenéticos y los diferentes perfiles correspondientes
- Clados
- Genotipos Aislados Perfiles Combinados (SmaI-XhoI / SacII)
- HDV-1
- I Italia dFr2088 D1A D1B
- HDV-2
- IIA Japón aislados de Yakouti D2A D2B
- HDV-3
- III Perú1 D3
- HDV-4
- IIB IIC TW2b Miyako D4A D4B
- HDV-5
- V dFr47, dFr73 et dFr910 dFr1953 D5A D5B
- HDV-6
- VI dFr48, dFr2020 D6
- HDV-7
- VII dFr45, dFr1843 dFr2066 dFr644 D7A D7B D7C
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<130> S1020FR17
<140>
<141>
<160> 67
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1672
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<220>
<221> cepa
<222> (1)..(1672)
<223> secuencia genómica completa de dFr45
<400> 1 <210> 2
<211> 642
5 <212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(692)
<223> ADNc de LHD
<400> 2
<210> 3
<211> 213
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 3
<210> 4
<211> 585
<212> ADN 10 <213> virus de la hepatitis D
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(585)
<223> ADNc de sHD
<400> 4
<210> 5
<211> 194
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 5
<211> 1697
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
15 <220>
<221> cepa
<222> (1)..(1697)
<223> secuencia genómica completa de dFr47
<400> 6
<210> 7
<211> 645 10 <212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<220>
<221> CDS 15 <222> (1)..(645)
<223> ADNc de LHD
<400> 7
<210> 8
<211> 214
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 8
<210> 9
<211> 588
<212> ADN 10 <213> virus de la hepatitis D
<220> <221> CDS
<222> (1)..(588)
<223> ADNc de sHD
5 <400> 9
<210> 10
<211> 195
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
- <400>
- 10
- <400>
- 11
- 5
- <210> 11
- <211> 1697
- <212> ADN
- <213> virus de la hepatitis D
- 10
- <220>
- <221> cepa
- <222> (1)..(1697)
- <223> secuencia genómica completa de dFr73
- 5
- <210> 12
- <211> 645
- <212> ADN
- <213> virus de la hepatitis D
- 10
- <220>
- <221> CDS
- <222> (1)..(695)
- <223> ADNc de LHD
- 15
- <400> 12
<210> 13
<211> 214
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 13
<211> 588
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(588)
<223> ADNc de sHD
<400> 14
<210> 15
<211> 195
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 15
<210> 16
<211> 1697
- <212>
- ADN 10 <213> virus de la hepatitis D
<220>
<221> cepa
<222> (1) .. (1697)
<223> secuencia genómica completa de dFr910
<400> 16
<210> 17
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- <212>
- ADN 10 <213> virus de la hepatitis D
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(645) 15 <223> ADNc de LHD
<400> 17
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<211> 214
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 18
<210> 19 10 <211> 588
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(588)
<223> ADNc de sHD
<400> 19
<210> 20
<211> 195
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 20
<210> 21
<211> 1687 10 <212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<220>
<221> cepa
<222> (1)..(1687)
<223> secuencia genómica completa de dFr48
<400> 21
<210> 22
<211> 642
<212> ADN 10 <213> virus de la hepatitis D
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(692) 15 <223> ADNc de LHD
<400> 22
<210> 23
<211> 213
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 23
- 5
- <210> 24
- <211> 585
- <212> ADN
- <213> virus de la hepatitis D
- 10
- <220>
- <221> CDS
- <222> (1)..(585)
- <223> ADNc de sHD
<400> 24
<210> 25
<211> 194
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 25
<210> 26
<211> 1680
<212> ADN 10 <213> virus de la hepatitis D
<220>
<221> cepa
<222> (1) .. (1680) 15 <223> secuencia genómica completa de dFr644
<400> 26
- 5
- <210> 27
- <211> 645
- <212> ADN
- <213> virus de la hepatitis D
- 10
- <220>
- <221> CDS
- <222> (1)..(645)
- <223> ADNc de LHD
- 15
- <400> 27
<210> 28
<211> 214
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 28
<210> 29 10 <211> 588
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(588)
<223> ADNc de sHD
<400> 29
<210> 30
<211> 195
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 30
- 5 10
- <210> 31 <211> 25 <212> ADN <213> virus de la hepatitis D <400> 31
- gaggaaagaa ggacgcgaga cgcaa
<210> 32
<211> 21
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 32 accccctcga aggtggatcg a 21
<210> 33
<211> 22
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 33 catgccgacc cgaagaggaa ag 22
<210> 34
<211> 24
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 34 gaaggaaggc cctcgagaac aaga 24
<210> 35
<211> 24
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 35 ctccagagga ccccttcagc gaac 24
<210> 36
<211> 24
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 36 cccgcgggtt ggggatgtga accc 24
<210> 37
<211> 23 .
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 37 gtacactcga ggagtggaag gcg 23
<210> 38
<211> 21
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 38 tctgttcgct gaaggggtcc t 21
<210> 39 <211> 22 <212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 39 ccagaggacc ccttcagcga ac 22
<210> 40
<211> 20
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 40 aacaccctcc tgctagcccc 20
<210> 41
<211> 22
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 41 ccggagttcc tcttcctcct cc 22
<210> 42
<211> 23
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 42 gttcgcgtcc gagtccttct ttc 23
<210> 43
<211> 20
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 43 gagctttctt cgattcggac 20
<210> 44
<211> 20
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 44 gactggtccc ctcatgttcc 20
<210> 45
<211> 22
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 45 gttcgctgaa ggggtcctct gg 22
<210> 46
<211> 24
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
5
10
15
<400> 46 tcatcctcga gtctcttgat ggtc 24
<210> 47
<211> 20
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 47 aacatccact cgctagcccc 20
<210> 48
<211> 396
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 48
<210> 49
<211> 397
<212> ADN 25 <213> virus de la hepatitis D
<400> 49
<210> 50
<211> 397
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 50
<211> 410
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
15 <400> 51
<210> 52 20 <211> 397
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 52 25
<210> 53
<211> 399
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 53
<210> 54
<211> 397
<212> ADN 15 <213> virus de la hepatitis D
<400> 54
- 20
- <210> 55
- <211> 397
- <212> ADN
- <213> virus de la hepatitis D
- 25
- <400> 55
<210> 56
5 <211> 397
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 56 10
<210> 57
<211> 396 15 <212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<400> 57
<210> 58
<211> 398
<212> ADN 25 <213> virus de la hepatitis D
<400> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
10 <400> 59
<210> 60 15 <211> 9
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 60 20
<210> 61
<211> 9 25 <212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 61
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 62
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 63
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 64
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> virus de la hepatitis D
<400> 65
5 <210> 66
<211> 1685
<212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<221> cepa
<222> (1)..(1685)
<223> secuencia genómica completa de Pt26
15 <400> 66 <212> ADN
<213> virus de la hepatitis D
<220>
5 <221> cepa
<222> (1)..(1688)
<223> secuencia genómica completa de Pt62
<400> 67 10
Claims (15)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Moléculas de ácido nucleico aisladas, caracterizadas por que se seleccionan del grupo constituido por: -el genoma complete de la variante del HDV denominada dFr45 que presenta la secuencia SEC ID Nº:
1, y -el genoma de una variante del HDV que presenta una divergencia genética ≤ 15% con la secuencia SEC ID Nº: 1. -
- 2.
- Moléculas de ácido nucleico, caracterizadas por que comprenden al menos uno de los fragmentos de la secuencia de un HDV variante de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionadas del grupo constituido por: a) los fragmentos R0 que presenta la secuencia SEC ID Nº: 48 b) el fragmento R1 que se extiende desde las posiciones 307 a 1289 del genoma del HDV, c) el fragmento R2 que se extiende desde las posiciones 889 a 328 del genoma del HDV, d) el fragmento R3 que se extiende desde las posiciones 1486 a 452 del genoma del HDV, e) el fragmento R’1 que se extiende desde las posiciones 305 a 1161 del genoma del HDV, f) el fragmento R’2 que se extiende desde las posiciones 984 a 331 del genoma del HDV, g) el ADNc que codifica la proteína sHD, de secuencia SEC ID Nº: 4, h) el ADNc que codifica la proteína LHD de secuencia SEC ID Nº: 2, y i) los cebadores de la secuencia SEC ID Nº: 38 y SEC ID Nº: 47
-
- 3.
- Método de detección de un HDV variante tal como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, por hibridación y/o amplificación, realizado a partir de una muestra biológica, cuyo método se caracteriza por que comprende:
- (1)
- una etapa de extracción del ácido nucleico a detectar que pertenece al genoma del virus, eventualmente presente en la muestra biológica,
- (2)
- la realización de al menos una amplificación génica usando un par de cebadores seleccionado en el grupo constituido por los cebadores adecuados para amplificar una de las siguientes regiones del ARN genómico del HDV: R0, R1, R2, R3, R’1 y R’2 y
- (3)
- el análisis del producto amplificado por comparación con la molécula de secuencia SEC ID Nº: 1.
- 4. Método de detección de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que la etapa(3) de análisis puede realizar por restricción, secuenciación o hibridación
- 5. Método de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4, caracterizado por que los cebadores específicos para la amplificación de las regiones R0, R1, R2, R3, R’1 y R’2, usados en la etapa(2) se seleccionan del grupo constituido por:
- -
- los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 1280AS (SEC ID Nº: 34), para la amplificación de R0 (aproximadamente 400 pb),
- los cebadores 320S (SEC ID Nº: 39) y 1280AS (SEC ID Nº: 34), para la amplificación del fragmento R1 (aproximadamente 960 pb),- -
- los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 320AS (SEC ID Nº: 45), para la amplificación de R2 (aproximadamente 1100 pb), que contiene el gen sHD correspondiente a las posiciones 1598-950,
- -
- los cebadores 1480S (SEC ID Nº: 46) y 440AS (SEC ID Nº: 47), para la amplificación de R3 (aproximadamente 650 pb),
- -
- los cebadores 318S (SEC ID Nº: 35) y 1150AS (SEC ID Nº: 36), para la amplificación de R’1 (aproximadamente 850 pb),
- -
- los cebadores 960S (SEC ID Nº: 37) y 345AS (SEC ID Nº: 38), para la amplificación de R’2 (aproximadamente 1050 pb),
- 6. Método de de detección y de genotipado del HDV a partir de una muestra biológica, cuyo método se caracteriza por que comprende:
- (a)
- una etapa de extracción del ácido nucleico que pertenece al genoma del virus HDV,
- (b)
- una etapa de amplificación de la región R0 delimitada por las posiciones 889 a 1289 del genoma del HDV,
- (c)
- un primer tratamiento de moléculas de ácidos nucleicos amplificadas por las enzimas de restricción Smal y Xhol, para producir un primer conjunto de fragmentos de restricción,
- (d)
- un segundo tratamiento de moléculas de ácidos nucleicos por la enzima de restricción SacII, para producir un segundo conjunto de fragmentos de restricción
- (e)
- el análisis combinado, por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism (Polimorfismo de Longitud de Fragmentos de Restricción )), de los dos conjuntos de fragmentos restricción producidos, para detectar la presencia y/o determinar el tipo de HDV presente en dicha muestra biológica.
-
- 7.
- Método de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado por que la etapa (b) de amplificación, de las moléculas de ácido nucleico de dicha muestra, por RT-PCR se realiza ventajosamente con los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 1280AS (SEC ID Nº: 34).
-
- 8.
- Método de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, caracterizado por que también comprende:
- (a)
- la amplificación de las moléculas de ácido nucleico de dicha muestra por RT-PCR con los cebadores 900S (SEC ID Nº: 33) y 320AS (SEC ID Nº: 45) para amplificar la región R2, y
- (b)
- la secuenciación directa de la región R2 amplificada y la comparación con la molécula de ARN de la secuencia SEC ID Nº: 1
-
- 9.
- Vector recombinante, particularmente un plásmido que comprende un inserto constituido por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
-
- 10.
- Célula transformada por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.
-
- 11.
- Productos de traducción codificados por la molécula de ARN de secuencia SEC ID Nº: 1
o por secuencias complementarias sentido o antisentido. -
- 12.
- Proteínas, caracterizadas por que una de las moléculas de ácido de nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, las codifican.
-
- 13.
- Proteína de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizada por que se selecciona del grupo constituido por: -la proteína LHD de dFr45, que presenta la secuencia SEC ID Nº: 3, y -la proteína sHD de dFr45, que presenta la secuencia SEC ID Nº: 5
-
- 14.
- Péptido, caracterizado por que está constituido por un fragmento de una proteína de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, seleccionado del grupo constituido por:
- -
- el péptido A constituido por los 19 aminoácidos del extremo carboxi-terminal de la secuencia SEC ID Nº: 3,
- -
- el péptido B de secuencia (código de una letra) RLPLLECTPQ (SEC ID Nº: 59) constituido por los 10 aminoácidos del extremo carboxi-terminal de la secuencia SEC ID Nº: 3, y
- -
- el péptido C constituido por los 9 aminoácidos anteriores a la secuencia SEC ID Nº: 59 (SEC ID Nº: 60)
- 15. El uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o de una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 para la preparación de un kit de detección y genotipado de un HDV.
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